CN102337327A - 乳腺癌预后28基因阵列检测系统 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种乳腺癌预后28基因阵列检测系统，通过收集特定乳腺癌病人样本，提取其中的RNA，然后进一步采用实时定量RT-PCR技术对靶基因mRNA进行特异性放大，经计算机软件分析，即可读出28基因的检测结果。本发明采用精准快速的实时定量RT-PCR技术，能对即使降解后的靶基因的mRNA片段进行特异性放大；并对结果进行独特的加权算法处理分析，能有效地排除假阳性与假阴性。

Description

乳腺癌预后28基因阵列检测系统

技术领域

本发明涉及一种乳腺癌预后28基因阵列检测系统。

背景技术

癌症影响着世界上1/3的人口。乳腺癌则是女性发病率最高的恶性肿瘤，全世界每年约有120万妇女蒙患乳腺癌，同时，50万人死于乳腺癌。中国是乳腺癌发病率增长最快的国家之一，国家抗癌协会公布的统计数字显示，近年来乳癌已占女性恶性肿瘤的32％，跃为城市中死亡率增长最快的癌症，尤以北京、上海、广州等大城市的发病率高居不下。

以上海为例，1972年，女性乳腺癌的发病率为每10万人中有17人；1992年，上升到每10万人中有34人；2000年，迅速上升至每10万人中有56.2人；2008年.已迅速上升至每10万人中有62.5人。统计显示：从1992年～2000年的短短8年间，已超过了1972～1992年20年的上升幅度。北京从1978年开始，乳腺癌亦成为妇女发病率最高的恶性肿瘤，近年来还在以每年2.4％的速度上升，现年发病率亦已经达到每10万人中有54人。简言之，中国主要城市10年来乳腺癌发病率增长了37％，死亡率增长了38.9％，农村死亡率更增长了39.7％。

西方乳腺癌的发病人数高峰期为50～55岁，随着妇女年龄的增长，发病率也越高。中国女性的乳腺癌发病年龄，要比西方妇女小10岁左右。显而易见，对乳腺癌的早期诊断与个性化的有效治疗，具有极其重要的全球意义.

尽管肿瘤发病的机理尚未清楚，但相关基因突变或其他环境因素所致表达水平异常，是致癌转变的根本原因已被广泛接受。癌症基因的突变和表达异常，在许多早期恶性肿瘤时就可出现。而对早期恶性肿瘤实现分子诊断，是以组织学观察作为主要诊断依据的现有病理分析方法的革命性飞跃，不仅可以确认各种肿瘤的分型和确诊，而且可以根据每个病人的肿瘤的生物学特点，预测其未来的病情发展并据此指导临床治疗方案。因此，建立迅速、有效，可靠、价廉的肿瘤标记物的分子诊断学技术，是当今肿瘤治疗的主要方向。

2007年2月，美国FDA批准了挪威Agendia Co.，Ltd的对乳腺癌预后70个基因表达进行测量的Mamma Print上市，该产品是基于基因芯片杂交技术，因此对样本的RNA质量要求很高，只能用新鲜组织来提取RNA。此外，该产品对样本的处理和信号读出设备要求也比较高，价格昂贵，而且由于杂交处理过程复杂，容易污染而产生假阳性，因而在临床上很难做到广泛推广。

近年来，美国国家肿瘤中心资助了多个大规模的实验。其中，美国加州Genomic Health Inc公司的Oncotype DX，对乳腺癌病人的术后肿瘤组织进行基因表达的检测，由于用了实时定量PCR技术，对组织的RNA保存要求大大降低，可从福尔马林固定甚至石蜡包埋后的肿瘤组织中测定相应的目标基因，并以此制定个性化的早期治疗方案，取得成功。

但是，Oncotype DX仅强调对乳腺癌的复发与转移的预后进行评估，未能为具有高复发转移风险的病人的化疗提供任何指导信息。Mamma Print则因为技术平台的复杂性与相对较高的假阳性率。而且两者都价格昂贵，一次检验需要4000美金以上因而难以在我国临床上有效推广。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种乳腺癌预后28基因阵列检测系统，以解决上述现有技术的缺陷。本发明采用精准快速的实时定量RT-PCR技术，能够对完整或降解后的靶基因mRNA片段进行特异性放大；并对结果进行独特的加权算法处理分析，能有效地排除假阳性与假阴性。

所述乳腺癌预后28基因阵列检测系统，首先通过收集特定乳腺癌病人样本，提取其中的RNA，然后进一步采用实时定量RT-PCR技术对靶基因mRNA片段进行特异性放大，经计算机软件分析，即可读出28基因的检测结果。

所述28基因具体如下：

a.细胞增殖相关基因：Ki67，STK15(丝氨酸/苏氨酸激酶-15)，Survivin，CCNB1(细胞周期蛋白B 1)，MYBL2(成髓细胞血症致病因子2)。

b.生长因子相关基因：GRB7(生长因子受体结合蛋白7)，HER2(人类表皮生长因子受体2)。

c.雌激素相关基因：ER(雌激素受体)，PGR(孕酮受体)，BCL2，SCUBE2(Signal peptide-CUB-epidermal growth factor-like domain-containing protein 2，信号肽CUB表皮生长因子类似结构域包含蛋白2)。

d.肿瘤转移相关基因：MMP11(基质金属蛋白酶-11)，CTSL2(组织蛋白酶L2)。

e.肿瘤耐药相关基因：MDR-1(多药耐药蛋白1)，SPARC(酸性富含胱氨酸分泌型蛋白)，BCRP(乳腺癌耐药蛋白)，MRP2(多药耐药相关蛋白2)，MLH1(错配修复基因1)，PTEN(Phosphatase and tensin homolog deleted on chromosometen)。

f.肿瘤易感及其他标记基因：GSTM1(谷胱甘肽硫转移酶M1)，CD68(分化族68)，BAG1(Bcl-2结合抗凋亡基因1)

g.管家基因：UBC(泛素结合酶)，GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)，HPRT1(次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶1)，RPLPO(核糖体蛋白基因)，GUS(转β-葡糖醛酸酶基因)，TFRC(转铁蛋白受体基因)。

本发明采用实时定量RT-PCR对上述28个基因的测量结果进行下述计算并得到相应的风险分析指标。

首先由管家基因的实时定量RT-PCR值(Ct值)的几何平均得到背景Ct值，其余目标基因表达水平的净值(Nvalue)由下列公式得到：

净值(Nvalue)＝背景Ct值-目标基因Ct值

取2-5孔重复测量的平均净值作为该基因的平均表达值(Mean)，各基因相关计分(Score)均用该基因的平均表达值计算。

1)细胞增殖相关基因分值(Score)的计算方法：(a×Ki67+b×STK15+c×Survivin+d×CCNB1+e×MYBL2)/5，其中a-e为各个基因的加权系数，各自取值范围可从0.1-10的任何数值。

2)生长因子相关基因分值(Score)的计算方法：

a×GRB7+b×HER2，其中a和b各自为两个基因的加权系数，其各自取值可以从0.1-10之间的任何数值。

3)雌激素相关基因分值(Score)的计算方法：

-a×ER-b×PGR+c×BCL2-d×SCUBE2，其中a-c各自为不同基因的加权系数，其取值范围可是0.1至10间的任何数值。

4)肿瘤转移相关基因分值(Score)的计算方法：

(a×MMP11+b×CTSL2)/2其中a-b各自为不同基因的加权系数，其取值范围可是0.1至10间的任何数值。

5)肿瘤耐药相关基因分值(Score)的计算方法：(a×MDR-1-b×SPARC+c×BCRP+d×MRP2-e×MLH1-f×PTEN)/6，其中a-f各自为不同基因的加权系数，其取值范围可是0.1至10间的任何数值。

6)肿瘤易感及其他标记基因分值(Score)的计算方法：

(a×GSTM1+b×CD68+c×BAG1)/3，其中a-c各自为不同基因的加权系数，其取值范围可是0.1至10间的任何数值。

7)CAF(环磷酰胺-阿霉素-氟尿嘧啶合剂，cyclophosphamide，Adriamycinand 5-fluorouracil)耐药分值(Score)的计算方法：

a×MDR-1+b×BCRP+c×MRP2-d×PTEN，其中a-d各自为不同基因的加权系数，其取值范围可是0.1至10间的任何数值。

8)综合指数的计算方法：

-1(a×细胞增殖分+b×生长因子分+c×雌激素受体分+d×转移相关分+e×肿瘤易感分)×f，其中a-e各自为不同基因的加权系数，其取值范围可是0.1至10间的任何数值，f为增量系数，其取值范围可是1-1000范围内的任何整数值。

9)复发指数：定义F为复发指数阈值，其取值范围为10-1000，如综合指数＞F，复发指数＝F；否则等于综合指数。

10)综合耐药指数：定义R为耐药指数阈值，其取值范围为-1到+10，如耐药分＜R，则综合耐药指数＝R，否则等于耐药分。

11)CAF耐药指数：定义Rcaf为CAF耐药指数阈值，其取值范围为-1到+10，如CAF耐药分＜Rcaf，则CAF耐药指数＝Rcaf，否则等于CAF耐药分。

所述28基因在乳腺癌病人肿瘤组织中的表达用于对乳腺癌术后病人的长期预后预测。

所述雌激素受体阳性在尚未出现淋巴转移的侵润性乳腺癌病人的预后预测中的应用。

所述肿瘤耐药相关基因表达对于上述乳腺癌病人进行肿瘤化疗药物耐药性预测中的应用。

所述的肿瘤化疗药物中的以多药耐药蛋白1MDR-1在表达相关的肿瘤化疗药物的耐药性预测中的应用。

所述肿瘤化疗药物中的与酸性富含胱氨酸分泌型蛋白SPARC在表达相关的肿瘤化疗药物的耐药性预测中的应用。

所述肿瘤化疗药物中的与乳腺癌耐药蛋白BCRP在表达相关的肿瘤化疗药物的耐药性预测中的应用。

所述肿瘤化疗药物中的与多药耐药相关蛋白2MRP2在表达相关的肿瘤化疗药物的耐药性预测中的应用。

所述肿瘤化疗药物中的与错配修复基因1MLH1在表达相关的肿瘤化疗药物的耐药性预测中的应用。

所述肿瘤化疗药物中的与PTEN在异常表达相关的肿瘤化疗药物的耐药性预测中的应用。

所述的肿瘤化疗药物包括但不限于氮芥、环磷酰胺cyclophosphamide、噻替哌、环己亚硝脲、马利兰、氮烯米胺、甲基苄肼。

所述的肿瘤化疗药物包括但不限于甲氨喋呤、氟脲嘧啶、双呋啶、阿糖胞苷、硫唑嘌呤、轻基脲。

所述的肿瘤化疗药物包括但不限于博来霉素、更生霉素、光辉霉素、正定霉素、阿霉素Adriamycin、丝裂霉素C、放线菌素D。

所述的肿瘤化疗药物包括但不限于长春新碱vinblastine、秋水仙碱、三尖杉酯碱、喜树碱、靛玉红、鬼臼乙叉贰，紫杉醇taxol。

所述的肿瘤化疗药物包括但不限于顺铂，诺维本，塞替派。

所述的肿瘤化疗药物包括权利要求12-16所述药物的联合用药。

所述28基因阵列检测系统特指28基因产物的水平检测。

所述的基因产物包括用定量PCR方法检测其mRNA的表达水平。

所述的定量PCR方法是用病人的乳腺癌术后新鲜组织，福尔马林或其他固定液固定后的组织，和石蜡包埋的组织。

所述的定量PCR方法包括对定量PCR检测的管家基因的表达用几何平均得到整个基因表达背景的估测，用于对其他目标基因表达水平的校正。

所述的定量PCT方法包括每个基因选用多对引物来同时提高检测灵敏度和可靠性的方法。

所述预后预测采用综合风险指数，复发指数的计算预估病人的复发预后。

所述的耐药性预测采用综合耐药指数和特定化疗方案的耐药指数的计算预估病人对化疗的耐药性。

所述的特定药物治疗耐药指数的计算包括但不限于对于CAF联合化疗方案的耐药性预测。

与现有技术相比，本发明的乳腺癌预后28基因阵列检测系统具有以下创新点：

1.具有我国妇女特色的乳癌预后估测：由于不同人种具有不同的基因背景，因此在肿瘤的预后方面，不同人种的基因表达谱就有所不同。目前，前述国外比较成熟的两个乳癌预后诊断方法，都是以非中国人为基础的病人样本进行开发的。因此，我国乳癌病人亟需有适合本国妇女基因背景的预后估测系统。本发明以中国乳癌病人为样本人群进行基因谱分析与加权评估，具有独特性。

2.低偏差的基因表达统计方法：在用实时定量RT-PCR(qPCR)技术对靶基因的表达进行定量时，必须对其qPCR结果，用肿瘤内的管家基因表达水平，作为内参来进行校正。大部分现行的方法，都是用简单的算术平均，对若干管家基因的表达进行处理后，得到一平均值，再将靶基因表达水平做归一化处理，而得到校正后的基因表达值。近来有研究表明，算术平均得到的管家基因表达水平，受不同组织及各种因素的干扰比较大，从而造成对最后的靶基因表达水平的校正出现很大误差；本专利使用几何平均法对内参基因表达进行归一，该方法能够显著减少管家基因的表达量的随机波动，从而提高对目标基因水平的估测准确度。

3.对治疗方案能够提供指导的高精准的肿瘤预后评分方法：本发明根据包括有6个肿瘤耐药相关基因的表达水平对乳腺癌化疗的耐药性进行预测，其中不仅有对化疗药物普遍耐药性相关的基因，也有对某类化疗药物耐药的特征基因。因此，本发明不仅对乳腺癌所反映的肿瘤增殖速度与转移复发风险能够进行评估，而且能评估肿瘤对化疗药物的耐药程度与抉择合适的化疗药物。

具体实施方式

以下结合具体实施例进一步详细描述本发明的技术方案，但实施例并不限制本发明的保护范围。

实施例1

刘XX，女，53岁。左侧乳房部分切除，肿瘤呈侵润性，尺寸：3×7×5公分，无淋巴转移，雌激素受体检测阳性。

RNA提取：病人的术后样本取自所在医院病理科的石蜡包埋材料，3立方毫米左右的组织置入1.5ml离心管，内置200μl TRIzol(Gibco BRL)，混合后加热至65℃，然后置冰上1分钟。加入10μg E.coli tRNA和20μlChloroform，充分混匀后室温孵育3分钟。该样品用台式离心机4℃离心15分钟后，取100μl上清液转至另一个空离心管，加入100μl isoproponal室温孵育10分钟后，12,000转/分4℃离心10分钟。将沉淀的RNA用100μl 75％酒精洗涤后，真空干燥5分钟，加入50微升重蒸馏水。

实时定量RT-PCR：取10μl，含1μg上述RNA样本加入384孔板中，用ABI PRISM 7900 Sequence Detection System(Perkin-Elmer-AppliedBiosystems)或其他类似的实时定量PCR仪进行放大。该384孔板还包含有产家提供的配套实时定量RT-PCR反应溶液混合物及相对应于28个基因的不同引物对。仪器的操作按照产家推荐的参数进行，并经配套的计算机软件完成实时定量PCR的数据读出。

实时定量PCR对上述28个基因所得结果与分析参见表1。

首先由管家基因的定量PCR值(Ct值)的几何平均得到背景Ct值。其余目标基因表达水平的净值(Nvalue)由下列公式得到：

净值(Nvalue)＝背景Ct值-目标基因Ct值

取两孔重复测量的净值作为该基因的平均表达值(Mean)，各基因相关计分均用该基因的平均表达值计算。

细胞增殖相关基因分值(Score)的计算方法：(Ki67+STK15+Survivin+CCNB1+MYBL2)/5

生长因子相关基因分值(Score)的计算方法：1.56×GRB7+0.44×HER2

雌激素相关基因分值(Score)的计算方法：-0.8×ER-1.2PGR+BCL2-SCUBE2

肿瘤转移相关基因分值(Score)的计算方法：(MMP11+CTSL2)/2

肿瘤耐药相关基因分值(Score)的计算方法：(MDR-1-SPARC+BCRP+MRP2-MLH1-PTEN)/6

肿瘤易感及其他标记基因分值(Score)的计算方法：(GSTM1+CD68+BAG1)/3

CAF(环磷酰胺-阿霉素-氟尿嘧啶合剂，cyclophosphamide，Adriamycinand 5-fluorouracil)耐药分计算方法：2×MDR-1+BCRP+MRP2-PTEN

综合指数计算方法：-1(1.75×细胞增殖分+生长因子分+雌激素受体分+1.37×转移相关分+0.83×肿瘤易感分)x500

复发指数：如综合指数＞500，复发指数＝500，否则等于综合指数。

综合耐药指数：如耐药分＜0，则综合耐药指数＝0，否则等于耐药分。

CAF耐药指数：如CAF耐药分＜0，则CAF耐药指数＝0，否则等于CAF耐药分。

表1

根据该病人的28个基因检测结果，其复发指数为117.85，综合耐药指数为1.1276，对于最常用的一线乳腺癌化疗方案CAF的耐药指数为4.73。根据表2的评价标准，可见该病人具有高度的复发风险，因此需要进行化疗。该病人对于CAF化疗方案极度耐药，但其综合耐药指数尚属中度耐药，因此应该考虑采用其他非CAF组合的化疗方案。

表2

	复发指数	综合耐药指数	CAF耐药指数
				低度	＞＝500	＜0.5	＜0.25
中度	150-500	0.5-1.5	0.25-3.75
				高度	＜150	＞1.5	＞3.75

实施例2

吴某，女，62岁，右侧乳房部分切除，由于肿瘤较小，未涉及乳腺管外，因此未能确认是否侵润性.尺寸：0.5×1×3.5公分，无淋巴转移，雌激素受体检测阳性。样本RNA提取与实时定量RT-PCR操作同实施例1。

实时定量RT-PCR对上述28个基因所得结果参见表3。该病人的复发指数为500，综合耐药指数为0，CAF治疗耐药指数为0。根据表2，该病人的乳腺癌属于低复发风险，对化疗高度敏感，医生可选择手术后不予化疗或者用CAF常规化疗方案治疗。

表3

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。

Claims (25)

1.一种乳腺癌预后28基因阵列检测系统，其特征在于，通过收集特定乳腺癌病人样本，提取其中的RNA，然后进一步采用实时定量RT-PCR技术对靶基因mRNA进行特异性放大，经计算机软件分析，即可读出28基因的检测结果。

2.根据权利要求1所述的检测系统，其特征在于，所述28基因如下：

a.细胞增殖相关基因：Ki67，丝氨酸/苏氨酸激酶-15STK15，Survivin，细胞周期蛋白B1 CCNB1，成髓细胞血症致病因子2MYBL2；

b.生长因子相关基因：生长因子受体结合蛋白7GRB7，人类表皮生长因子受体2HER2；

c.雌激素相关基因：雌激素受体ER，孕酮受体PGR，BCL2，信号肽CUB表皮生长因子类似结构域包含蛋白2SCUBE2；

d.肿瘤转移相关基因：基质金属蛋白酶-11 MMP11，组织蛋白酶L2CTSL2；

e.肿瘤耐药相关基因：多药耐药蛋白1MDR-1，酸性富含胱氨酸分泌型蛋白SPARC，乳腺癌耐药蛋白BCRP，多药耐药相关蛋白2MRP2，错配修复基因1MLH1，PTEN；

f.肿瘤易感及其他标记基因：谷胱甘肽硫转移酶M1 GSTM1，分化族68CD68，Bcl-2结合抗凋亡基因1BAG1；

g.管家基因：泛素结合酶UBC，甘油醛-3-磷酸脱氢酶GAPDH，次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶1HPRT1，核糖体蛋白基因RPLPO，转β-葡糖醛酸酶基因GUS，转铁蛋白受体基因TFRC。

3.所述28基因在乳腺癌病人肿瘤组织中的表达对乳腺癌术后病人的长期预后预测中的应用。

4.所述雌激素受体阳性尚未出现淋巴转移的侵润性乳腺癌病人的预后预测中的应用。

5.所述肿瘤耐药相关基因表达对于权利要求3所述乳腺癌病人进行肿瘤化疗药物耐药性预测中的应用。

6.权利要求5所述的肿瘤化疗药物中的以多药耐药蛋白1MDR-1在表达相关的肿瘤化疗药物的耐药性预测中的应用。

7.权利要求5所述的肿瘤化疗药物中的与酸性富含胱氨酸分泌型蛋白SPARC在表达相关的肿瘤化疗药物的耐药性预测中的应用。

8.权利要求5所述的肿瘤化疗药物中的与乳腺癌耐药蛋白BCRP在表达相关的肿瘤化疗药物的耐药性预测中的应用。

9.权利要求5所述的肿瘤化疗药物中的与多药耐药相关蛋白2MRP2在表达相关的肿瘤化疗药物的耐药性预测中的应用。

10.权利要求5所述的肿瘤化疗药物中的与错配修复基因1MLH1在表达相关的肿瘤化疗药物的耐药性预测中的应用。

11.权利要求5所述的肿瘤化疗药物中的与PTEN在异常表达相关的肿瘤化疗药物的耐药性预测中的应用。

12.权利要求6-11任一项所述的肿瘤化疗药物包括但不限于氮芥、环磷酰胺cyclophosphamide、噻替哌、环己亚硝脲、马利兰、氮烯米胺、甲基苄肼。

13.权利要求6-11任一项所述的肿瘤化疗药物包括但不限于甲氨喋呤、氟脲嘧啶、双呋啶、阿糖胞苷、硫唑嘌呤、轻基脲。

14.权利要求6-11任一项所述的肿瘤化疗药物包括但不限于博来霉素、更生霉素、光辉霉素、正定霉素、阿霉素Adriamycin、丝裂霉素C、放线菌素D。

15.权利要求6-11任一项所述的肿瘤化疗药物包括但不限于长春新碱vinblastine、秋水仙碱、三尖杉酯碱、喜树碱、靛玉红、鬼臼乙叉贰，紫杉醇taxol。

16.权利要求6-11任一项所述的肿瘤化疗药物包括但不限于顺铂，诺维本，塞替派。

17.权利要求6-11任一项所述的肿瘤化疗药物包括权利要求12-16所述药物的联合用药。

18.权利要求1所述的28基因阵列检测系统特指28基因产物的水平检测。

19.权利要求18所述的基因产物包括用定量PCR方法检测其mRNA的表达水平。

20.权利要求18所述的定量PCR方法是用病人的乳腺癌术后新鲜组织，固定后的组织，和石蜡包埋的组织。

21.权利要求18所述的定量PCR方法包括对定量PCR检测的管家基因的表达用几何平均得到整个基因表达背景的估测，用于对其他目标基因表达水平的校正。

22.权利要求18所述的定量PCT方法包括每个基因选用多对引物来同时提高检测灵敏度和可靠性的方法。

23.权利要求3所述预后预测采用综合风险指数，复发指数的计算预估病人的复发预后。

24.权利要求5所述的耐药性预测采用综合耐药指数和特定化疗方案的耐药指数的计算预估病人对化疗的耐药性。

25.权利要求24所述的特定药物治疗耐药指数的计算包括但不限于对于CAF联合化疗方案的耐药性预测。