CN107287345B - 用于急性髓系白血病精准诊疗的检测试剂盒及tsen34临床应用 - Google Patents

用于急性髓系白血病精准诊疗的检测试剂盒及tsen34临床应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种患者预后风险标记物及其应用，该标记物可用于诊断、检测及临床预后评估来自血液系统恶性肿瘤、白血病、特别是急性髓系白血病，本发明还公开了该标记物的检测物，以及用于诊断、检测及临床预后评估来自血液系统恶性肿瘤、白血病、特别是急性髓系白血病的方法、试剂盒及其应用。本发明通过计算机算法及生物学实验验证，TSEN34基因是血液系统恶性肿瘤、白血病，特别是急性髓系白血病的独立危险因素，可以用于单独或与其他标记物一起在分层诊断和预后评估中发挥重大作用，也可为临床治疗提供决策支持，为选择或确定治疗方案提供依据。

Description

用于急性髓系白血病精准诊疗的检测试剂盒及TSEN34临床 应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及血液系统白血病、急性髓系白血病基因的检测、急性髓系白血病危险度分层或临床预后评估，特别是涉及成人急性髓系白血病基因的检测、基因芯片和试剂盒。
背景技术
白血病也称作血癌，是常见的全球性恶性疾病，起源于髓系或淋巴系造血祖细胞的一组遗传异质性疾病，主要表现为丧失正常功能的白血病细胞的异常分化与增生，根据白血病细胞的成熟程度和自然病程可分为急性白血病(acute leukemia,AL)和慢性白血病(chronic leukemia,CL)两大类。急性白血病分为急性髓系白血病(acute myeloidleukemia,AML)和急性淋巴系白血病(acute myeloid leukemia,ALL)。
急性髓系白血病是一种异质性极强的恶性血液病，占成人急性白血病的80％左右，它包括许多具有不同遗传异常状况和临床特征的实体，主要特征为骨髓与外周血中原始和幼稚髓性细胞异常增生。在美国国立综合癌症网络(NationalComprehensive CancerNetwork，NCCN) 危险度分层指南中，约有一半以上的急性髓系白血病被分在中危组(包括全部的正常核型急性髓系白血病Cytogenetically Normal AML,正常核型急性髓系白血病)。
美国食品与药品监督管理局(FDA)已经将生物标志定义为分子特征，它被客观测量和评价并且指示正常生物过程、致病过程或对治疗干预的药理学响应。这样的生物标志可以由肿瘤自身或身体对正常细胞转化成癌症的恶性压力作出响应而产生。根据美国国立癌症研究所(NCI)，生物标志可以用于癌症筛查、风险度评估、疾病的早期诊断、监测、预后评价、作出治疗决定和预测对疗法的响应。现有技术中缺乏用于危险度分层和临床预后评估的有效标志物，所以，目前临床上AML的分层诊断及个体化治疗非常困难，亟待找到有效的预后标志物来确定此类患者治疗的强度，以实现精准的个体化治疗。
虽然，现有技术中公开了急性髓系白血病的一些致病相关的基因突变，这些基因突变可能作为患者危险度分层和临床预后评估的标志物，但仍需通过大量的计算机算法及生物学实验才能验证。
现有技术WHITMAN S P,MAHARRY K,RADMACHERM D,et al.FLT3internal tandemduplication associates with adverse outcome and gene-and microRNA-expressionsignatures in patients 60years of age or older with primary cytogeneticallynormal acute myeloid leukemia:a Cancer and Leukemia Group B study[J].Blood,2010,116(18):3622-6中将携带FLT3-ITD基因的正常核型急性髓系白血病患者定义为高危组；现有技术DOHNER K,SCHLENK R F, HABDANK M,et al.Mutant nucleophosmin(NPM1)predicts favorable prognosis in younger adults with acute myeloid leukemiaand normal cytogenetics:interaction with other gene mutation[J].Blood,2005,106(12):3740-6将携带NPM1基因突变的患者定义为相对较低的危险度和较好预后；现有技术PASTORE F,KLING D,HOSTER E,et al.Long-term follow-up of cytogeneticallynormal CEBPA-mutated AML[J].Journal of hematology&oncology,2014,7.将携带CEBPA基因双突变的患者定义为相对较低的危险度和较好预后；现有技术CN104508143A 公开了用于诊断、预测、治疗和处理急性髓系白血病的方法，该方法分析从所述患者分离的遗传样品中是否存在细胞遗传学异常，以及在基因FLT3、NPMI、DNMT3A、NRAS、CEBPA、 TET2、WTI、IDHI、IDH2、KIT、RUNXI、MLL-PTD、ASXLI、PHF6、KRAS、PTEN、P53、 HRAS和EZH2中的至少一者中是否存在突变，以此来预测患有急性髓系白血病患者的生存率。
为了实现精准化医疗的目的，临床医学上亟待找到有效的急性髓系白血病患者预后标志物来对患者进行精准的治疗，而这些标志物的发现和验证将为更加有效的治疗急性髓系白血病及预后评估提供帮助。
发明内容
本发明的目的是提供一种敏感性高，通用性好，特异性强的标志物，来检测成人(<60 岁)急性髓系白血病细胞或组织样品，来辅助判断成人AML患者的危险度分层或异基因造血干细胞移植前评估或临床预后评估，是基于以下的考虑：(1)基因突变不能覆盖所有的AML，而基因表达可以覆盖所有的AML患者；(2)AML发生、发展的分子机理目前仍不清楚，寻求新的临床预后标志物有助于理解AML的发病机理，并且能为AML的精准靶向治疗奠定基础。
本发明人发现TSEN34基因高表达的AML患者具有较高的危险度分层和较差的临床预后，TSEN34基因低表达的AML患者具有较低的危险度分层和较好的临床预后。因此，本发明提供TSEN34基因作为标志物，用来诊断成人急性髓系白血病患病与否或患病风险度或检测成人急性髓系白血病危险度分层或成人急性髓系白血病异基因造血干细胞移植前评估或成人急性髓系白血病预后评估，其敏感性高，通用性好，特异性强，因此能用来制备用于诊断成人急性髓系白血病患病与否或成人急性髓系白血病危险度分层或异基因造血干细胞移植前评估或临床预后评估的基因芯片或试剂盒，帮助诊断是否患有成人急性髓系白血病或成人急性髓系白血病患者的危险度分层或异基因造血干细胞移植前评估或临床预后评估。在本发明中“成人”指年龄小于60岁的成人。
一方面，本发明提供一种用于诊断成人急性髓系白血病患病与否或患病风险度或检测成人急性髓系白血病危险度分层或成人急性髓系白血病异基因造血干细胞移植前评估或成人急性髓系白血病预后评估或为临床治疗提供决策支持的试剂盒。
进一步的，所述试剂盒中包含TSEN34基因的检测物。
更进一步的，所述的TSEN34基因的检测物为TSEN34基因的引物对和/或探针，所述的引物对和/或探针的序列为以下任一项所示：(1)SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3；(2)SEQ IDNO：4和SEQ ID NO：5；(3)SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7；(4)SEQ ID NO：8 和SEQ ID NO：9；(5)SEQ ID NO：10或其互补序列；(6)序列为SEQ ID NO：11或其互补序列；(7)序列为SEQ IDNO：12或其互补序列。
本发明所提供的试剂盒还包括实现如下功能的模块：
(1)在成人急性髓系白血病患者的样本组中检测TSEN34基因的表达量，取样本组表达量中位值，将患者分为TSEN34基因低表达组和TSEN34基因高表达组；
(2)将TSEN34基因低表达组定义为急性髓系白血病预后低风险组，将TSEN34基因高表达组定义为急性髓系白血病预后中高风险组。
TSEN34基因高表达的成人AML具有较高的危险度分层和较差的临床预后，有进行异基因造血干细胞移植的预期。TSEN34基因低表达的成人AML具有较低的危险度分层和较好的临床预后，不需要进行异基因造血干细胞移植治疗。
第二方面，本发明提供一种用于诊断成人急性髓系白血病患病与否或患病风险度或检测成人急性髓系白血病危险度分层或成人急性髓系白血病异基因造血干细胞移植前评估或成人急性髓系白血病预后评估或为临床治疗提供决策支持的芯片。
进一步的，所述芯片固定有TSEN34基因的检测物。
更进一步的，所述的TSEN34基因的检测物为TSEN34基因的引物对和/或探针，所述的引物对和/或探针的序列为以下任一项所示：(1)SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3；(2)SEQ IDNO：4和SEQ ID NO：5；(3)SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7；(4)SEQ ID NO：8 和SEQ ID NO：9；(5)序列为SEQ ID NO：10或其互补序列；(6)序列为SEQ ID NO： 11或其互补序列；(7)序列为SEQ ID NO：12或其互补序列。
本发明所提供的芯片还包括实现如下功能的模块：
(1)在成人急性髓系白血病患者的样本组中检测TSEN34基因的表达量，取样本组表达量中位值，将患者分为TSEN34基因低表达组和TSEN34基因高表达组；
(2)将TSEN34基因低表达组定义为急性髓系白血病预后低风险组，将TSEN34基因高表达组定义为急性髓系白血病预后中高风险组。
TSEN34基因高表达的成人AML具有较高的危险度分层和较差的临床预后，有进行异基因造血干细胞移植的预期。TSEN34基因低表达的成人AML具有较低的危险度分层和较好的临床预后，不需要进行异基因造血干细胞移植治疗。
第三方面，本发明还提供一种核酸或者核酸组合物，其包括：
(1)所述核酸或者核酸组合物为TSEN34基因的检测物，序列为以下任一项所示：1)SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3；2)SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5；3)SEQ ID NO：6 和SEQ IDNO：7；4)SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9。
或，(2)所述核酸或者核酸组合物为TSEN34基因的探针：1)序列为SEQ ID NO：10或其互补序列；2)序列为SEQ ID NO：11或其互补序列；3)序列为SEQ ID NO：12或其互补序列。
第四方面，本发明还提供一种组合物，所述组合物为MAP7、CPNE3、CPT1A、NR1H3和/或TSEN34基因的检测物组成的组。
第五方面，本发明还提供TSEN34基因的检测物的用途，所述检测物的用途是：
(1)制备用于诊断成人急性髓系白血病患病与否或患病风险度或检测成人急性髓系白血病危险度分层或成人急性髓系白血病异基因造血干细胞移植前评估或成人急性髓系白血病预后评估或为临床治疗提供决策支持的产品；
或，(2)制备用于诊断成人急性髓系白血病患病与否或患病风险度或检测成人急性髓系白血病危险度分层或成人急性髓系白血病异基因造血干细胞移植前评估或成人急性髓系白血病预后评估或为临床治疗提供决策支持的试剂盒；
或，(3)制备用于诊断成人急性髓系白血病患病与否或患病风险度或检测成人急性髓系白血病危险度分层或成人急性髓系白血病异基因造血干细胞移植前评估或成人急性髓系白血病预后评估或为临床治疗提供决策支持的芯片；
或，(4)制备诊断成人急性髓系白血病患病与否或患病风险度或用于检测成人急性髓系白血病危险度分层或成人急性髓系白血病异基因造血干细胞移植前评估或成人急性髓系白血病预后评估或为临床治疗提供决策支持的检测物、制剂或药物。
本发明所提供的TSEN34基因的检测物的用途，所述的TSEN34基因检测物包含如下所示核酸或者核酸组合物：
1)SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3；2)SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5；3)SEQ ID NO： 6和SEQ ID NO：7；4)SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9；5)序列为SEQ ID NO：10或其互补序列；6)序列为SEQ ID NO：11或其互补序列；7)序列为SEQ ID NO：12或其互补序列。
在很多方面能利用成人AML细胞或组织中TSEN34基因表达高低的检测和鉴定信息。例如，可辅助评估特定的治疗方案，例如，确定化疗药物是否改善特定患者的长期预后，是否进行异基因造血干细胞移植等。此外，TSEN34基因表达谱(或个体基因)允许筛选抑制成人AML表达谱或将不良预后谱转变成更好的预后谱的药物候选物。
在本发明的一个具体实施方案中，提供一种检测成人急性髓系白血病细胞或组织中 TSEN34基因表达高低的方法，其使用TSEN34基因的引物。
附图说明
图1所示是TSEN34基因在AML和正常人的CD34+细胞中的差异表达。
图2所示是TSEN34基因在全部AML患者组织样品中的预后分析。
其中，图2A所示是在全部AML患者中对TSEN34基因表达水平进行总生存率分析。纵坐标是总生存率，横坐标是生存时间(月)。
其中，图2B所示是在全部AML患者中对TSEN34基因表达水平进行无事件发生生存率分析。纵坐标是无事件发生生存率，横坐标是生存时间(月)。
图3所示是TSEN34基因在全部AML患者NCCN中危组中的预后分析。
其中，图3A所示是在全部AML患者NCCN中危组中对TSEN34基因表达水平进行总生存率分析。纵坐标是总生存率，横坐标是生存时间(月)。
其中，图3B所示是在全部AML患者NCCN中危组中对TSEN34基因表达水平进行无事件发生生存率分析。纵坐标是无事件发生生存率，横坐标是生存时间(月)。
图4所示是TSEN34基因在全部CN-AML患者中的预后分析。
其中，图4A所示是在全部CN-AML患者中对TSEN34基因表达水平进行总生存率分析。纵坐标是总生存率，横坐标是生存时间(月)。
其中，图4B所示是在全部CN-AML患者中对TSEN34基因表达水平进行无事件发生生存率分析。纵坐标是无事件发生生存率，横坐标是生存时间(月)。
图5所示是TSEN34基因在全部CN-AML患者ELN中危-I组中的预后分析。
其中，图5A所示是在全部CN-AML患者ELN中危-I组中对TSEN34基因表达水平进行总生存率分析。纵坐标是总生存率，横坐标是生存时间(月)。
其中，图5B所示是在全部CN-AML患者ELN中危-I组中对TSEN34基因表达水平进行无事件发生生存率分析。纵坐标是无事件发生生存率，横坐标是生存时间(月)。
图6所示是TSEN34基因在成人AML患者组织样品中的预后分析。
其中，图6A所示是在成人AML患者中对TSEN34基因表达水平进行总生存率分析。纵坐标是总生存率，横坐标是生存时间(月)。
其中，图6B所示是在成人AML患者中对TSEN34基因表达水平进行无事件发生生存率分析。纵坐标是无事件发生生存率，横坐标是生存时间(月)。
图7所示是TSEN34基因在成人AML患者NCCN中危组组织样品中的预后分析。
其中，图7A所示是在成人AML患者NCCN中危组中对TSEN34基因表达水平进行总生存率分析。纵坐标是总生存率，横坐标是生存时间(月)。
其中，图7B所示是在成人AML患者NCCN中危组中对TSEN34基因表达水平进行无事件发生生存率分析。纵坐标是无事件发生生存率，横坐标是生存时间(月)。
图8所示是TSEN34基因在成人CN-AML患者中的预后分析。
其中，图8A所示是在成人CN-AML患者中对TSEN34基因表达水平进行总生存率分析。纵坐标是总生存率，横坐标是生存时间(月)。
其中，图8B所示是在成人CN-AML患者中对TSEN34基因表达水平进行无事件发生生存率分析。纵坐标是无事件发生生存率，横坐标是生存时间(月)。
图9所示是TSEN34基因在成人CN-AML患者ELN中危-I组中的预后分析。
其中，图9A所示是在成人CN-AML患者ELN中危-I组中对TSEN34基因表达水平进行总生存率分析。纵坐标是总生存率，横坐标是生存时间(月)。
其中，图9B所示是在成人CN-AML患者ELN中危-I组中对TSEN34基因表达水平进行无事件发生生存率分析。纵坐标是无事件发生生存率，横坐标是生存时间(月)。
图10所示是TSEN34基因高表达的86例AML患者的化疗与异基因移植两种治疗方案的预后分析。
其中，图10A所示是TSEN34基因高表达的AML患者采用异基因移植可获得相比化疗更好的总生存率。纵坐标是总生存率，横坐标是生存时间(月)。
其中，图10B所示是TSEN34基因高表达的AML患者采用异基因移植可获得相比化疗更好的无事件发生生存率。纵坐标是总生存率，横坐标是生存时间(月)。
具体实施方式
实施例1TSEN34基因在成人急性髓系白血病患者和正常人CD34+细胞中的差异表达
数据集：利用Illumina BeadChip Arrays(HT12v3)芯片的77例AML患者数据。
1、采集患者的骨髓组织，对每份组织样本筛选CD34+细胞，共获得46例成人急性髓系白血病患者CD34+细胞。
2、采集正常人的骨髓组织，对每份组织样本筛选CD34+细胞，作为阴性对照，共获得 31例健康志愿者的CD34+细胞。
3、利用Illumina BeadChip Arrays(HT12v3)芯片检测TSEN34基因在46例成人急性髓系白血病患者和31例正常人的CD34+细胞中的表达水平，结果见图1。
结果：TSEN34基因在46例成人急性髓系白血病患者的CD34+细胞中的表达中位值为 10.9，TSEN34基因在31例正常人的CD34+细胞中的表达中位值为10.6，P＝0.019。上述结果显示，TSEN34基因在AML患者样本中显著高表达，可以用于AML的诊断和检测。
实施例2筛选与成人急性髓系白血病诊断及预后评估相关的基因
数据集：利用Affymetrix Human Genome U133Plus 2.0Array芯片获得具有随访信息的344例急性髓系白血病(AML)的全基因组表达谱数据。
以Affymetrix Human Genome U133Plus 2.0Array芯片作为筛选对象，该芯片中共有344 例成人急性髓系白血病患者的基因的表达谱实验数据。通过R语言进行分析整合，寻找与急性髓系白血病诊断及预后评估相关的基因。
以整个患者样本群体的基因表达中位值为基础，将成人急性髓系白血病患者样本分成两组，将高于中位值的患者定义为该基因高表达的群体，将低于中位值的患者定义为该基因低表达的群体，比较这两组成人急性髓系白血病患者的总体生存率、无事件发生生存率。经统计，如果P值小于0.05，则认为该基因与成人急性髓系白血病患者的预后相关。通过比较分析，得到如下与成人急性髓系白血病患者的预后相关的几组基因，MAP7、CPNE3、CPT1A、 NR1H3及TSEN34。
实施例3总RNA的提取
1.采集患者骨髓5ml，置于乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管中抗凝，加入FicoII-Hypaque 淋巴细胞分离液，应用密度梯度离心法提取单个核细胞。
2.裂解细胞：向收集的细胞沉淀中加入1ml的QIAZOL试剂，振荡器震荡混匀，室温作用15分钟以上使其充分裂解。若加入QIAZOL试剂后不能立刻提取RNA，可将其放入-20℃保存，短期内可用。
3.按照氯仿:QIAZOL体积比为1:4的比例，加入约300μl氯仿，上下颠倒混匀1分钟，室温静置5-10分钟，低温离心：4℃，12600rpm离心10分钟。
4.离心完毕后，EP管内液体分三层，上层为含有RNA的上清液，中下层为DNA和蛋白质。然后，将上清液转移至新的EP管中，并加入等体积的异丙醇，上下颠倒混匀，低温静置10分钟，离心：4℃，12600rpm离心15分钟。
5.弃上清，白色沉淀即为RNA，加入1ml的75％乙醇(DEPC水配制)，轻轻颠倒混匀，常温离心：8000rpm离心5分钟。
6.溶解RNA：去上清，并将EP管倒扣于吸水纸上，吸干管口。再于离心机上空甩几秒，用加样枪将剩余的酒精全部吸出，风干3-5分钟。加入一定体积的无核酸酶的水溶解RNA。
7.紫外分光光度计检测RNA浓度。提取得到的RNA放-20℃保存，一个月内可用；置于 -80℃则可保存相对较长时间。
实施例4RNA反转录
1、按照表1配制反转录体系，总反应体积为25μl(总RNA量为1μg)。以下操作均在冰上进行：
表1反转录体系各组分体积表
Figure BDA0001388500010000081
2、将以上各反应组分配制到0.2ml的PCR反应管中后，放入PCR仪中进行逆转录反应，程序为37℃，2h；4℃，forever。反应结束后得到的产物即为cDNA，将反应产物取出后放于 -20℃保存待用。
为验证TSEN34基因的表达，采用4对不同的PCR引物进行实时荧光定量PCR，分别为实施例5-8。
实施例5实时荧光定量PCR检测-引物对1
1、按照表2配制实时荧光定量PCR反应体系。
表2实时荧光定量PCR反应体系各组分体积表
Figure BDA0001388500010000082
2、反应管中先配制2倍体积的2×SYBR GreenⅠ，无RNA酶水，模板cDNA以及ROXⅡ混合物，混匀后分装至两个0.2ml的PCR反应管中，再分别加入目的基因TSEN34基因SEQ IDNO：1的引物对的上下游引物对：
引物对1：
5’-CCCAAGCAGGACCCTCAAAT(SEQ ID NO：2)
3’-AGAAAGTTGGGCAAACCCAGG(SEQ ID NO：3)
与内参GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶，glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase)的引物，轻轻混匀。其中，TSEN34引物委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。本发明的实时荧光定量PCR中主要采用SYBR Green I进行检测，SYBRGreen I是一种荧光染料，可以和任意的双链DNA结合，通过荧光信号的收集，反映模板拷贝数的多少。
3、将反应管放入实时荧光定量PCR仪中进行PCR扩增，反应程序为95℃，1分钟；95℃， 5s；60℃，20s；共40个循环。然后95℃，1分钟；60℃，1分钟，95℃，30s。荧光收集点在60℃，反应结束后PCR扩增产物结果与预期一致。
4、将获得的数据进行统计分析，以GAPDH作为内参照。
实施例6实时荧光定量PCR检测-引物对2
1、按照表3配制实时荧光定量PCR反应体系。
表3实时荧光定量PCR反应体系各组分体积表
Figure BDA0001388500010000091
2、反应管中先配制2倍体积的2×SYBR GreenⅠ，无RNA酶水，模板cDNA以及ROXⅡ混合物，混匀后分装至两个0.2ml的PCR反应管中，再分别加入目的基因TSEN34基因SEQ IDNO：1的引物对的上下游引物对：
引物对2：
5’-GGACCCTCAAATGGGGTAGC(SEQ ID NO：4)
3’-AAAGTTGGGCAAACCCAGG(SEQ ID NO：5)
与内参GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶，glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase)的引物，轻轻混匀。其中，TSEN34基因引物委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。本发明的实时荧光定量PCR中主要采用SYBR Green I进行检测，SYBRGreen I是一种荧光染料，可以和任意的双链DNA结合，通过荧光信号的收集，反映模板拷贝数的多少。
3、将反应管放入实时荧光定量PCR仪中进行PCR扩增，反应程序为95℃，1分钟；95℃， 5s；60℃，20s；共40个循环。然后95℃，1分钟；60℃，1分钟，95℃，30s。荧光收集点在60℃，反应结束后PCR扩增产物结果与预期一致。
4、将获得的数据进行统计分析，以GAPDH作为内参照。
实施例7实时荧光定量PCR检测-引物对3
1、按照表4配制实时荧光定量PCR反应体系。
表4实时荧光定量PCR反应体系各组分体积表
Figure BDA0001388500010000101
2、反应管中先配制2倍体积的2×SYBR GreenⅠ，无RNA酶水，模板cDNA以及ROXⅡ混合物，混匀后分装至两个0.2ml的PCR反应管中，再分别加入目的基因TSEN34基因SEQ IDNO：1的引物对的上下游引物对：
引物对3：
5’-CTAGAACAGGCTTCAGGGGC(SEQ ID NO：6)
3’-TACAAGAAAGTTGGGCAAACCC(SEQ ID NO：7)
与内参GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶，glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase)的引物，轻轻混匀。其中，TSEN34基因引物委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。本发明的实时荧光定量PCR中主要采用SYBR Green I进行检测，SYBRGreen I是一种荧光染料，可以和任意的双链DNA结合，通过荧光信号的收集，反映模板拷贝数的多少。
3、将反应管放入实时荧光定量PCR仪中进行PCR扩增，反应程序为95℃，1分钟；95℃， 5s；60℃，20s；共40个循环。然后95℃，1分钟；60℃，1分钟，95℃，30s。荧光收集点在60℃，反应结束后取出PCR产物，PCR扩增产物结果与预期一致。
4、将获得的数据进行统计分析，以GAPDH作为内参照。
实施例8实时荧光定量PCR检测-引物对4
1、按照表5配制实时荧光定量PCR反应体系。
表5实时荧光定量PCR反应体系各组分体积表
Figure BDA0001388500010000111
2、反应管中先配制2倍体积的2×SYBR GreenⅠ，无RNA酶水，模板cDNA以及ROXⅡ混合物，混匀后分装至两个0.2ml的PCR反应管中，再分别加入目的基因TSEN34基因SEQ IDNO：1的引物对的上下游引物对：
引物对4：
5’-ACTAAAAAGTTGGCATGCTGGT(SEQ ID NO：8)
3’-CCAGGAAGTCACCTCCGAAC(SEQ ID NO：9)
与内参GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶，glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase)的引物，轻轻混匀。其中，TSEN34引物委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。本发明的实时荧光定量PCR中主要采用SYBR Green I进行检测，SYBRGreen I是一种荧光染料，可以和任意的双链DNA结合，通过荧光信号的收集，反映模板拷贝数的多少。
3、将反应管放入实时荧光定量PCR仪中进行PCR扩增，反应程序为95℃，1分钟；95℃， 5s；60℃，20s；共40个循环。然后95℃，1分钟；60℃，1分钟，95℃，30s。荧光收集点在60℃，反应结束后取出PCR产物，PCR扩增产物结果与预期一致。
4、将获得的数据进行统计分析，以GAPDH作为内参照。
实施例9TSEN34基因表达水平与成人急性髓系白血病患者(剔除M3)和NCCN中危组成人急性髓系白血病患者(剔除M3)的生存分析曲线
说明：M3为早幼粒细胞白血病，是一种特殊类型的急性髓系白血病。
实验方法：
1、采集成人急性髓系白血病患者(剔除M3)骨髓组织样本，共获得329例骨髓组织样本。
2、检测TSEN34基因表达水平，并按照TSEN34基因表达中位值将其分为TSEN34基因低表达组和TSEN34基因高表达组，其中，TSEN34基因低表达组数据为165例，TSEN34基因高表达组数据为164例。
3、比较TSEN34基因低表达组和TSEN34基因高表达组的总生存率和无事件发生生存率，结果如图2A和2B。
实验结果：
其中，图2A是在全部AML患者中对TSEN34基因表达水平进行总生存率分析，纵坐标是总生存率，横坐标是生存时间(月)。图2B是在全部AML患者中对TSEN34基因表达水平进行无事件发生生存率分析，纵坐标是无事件发生生存率，横坐标是生存时间(月)。
实验结果显示，TSEN34基因低表达组的总生存率和无事件发生生存率均显著高于TSEN34基因高表达组。因此，TSEN34基因的表达水平可以用于提示急性髓系白血病的预后水平。
实验方法：
1、采集NCCN中危组成人急性髓系白血病患者(剔除M3)骨髓组织样本，共获得173例骨髓组织样本。
2、按照TSEN34基因表达水平的中位值，将其分为TSEN34基因低表达组和TSEN34基因高表达组，其中，TSEN34基因低表达组数据为87例，TSEN34基因高表达组数据为86例.
3、比较TSEN34基因低表达组和TSEN34基因高表达组的总生存率和无事件发生生存率，结果如图3A和3B。
实验结果：
其中，图3A所示是在全部AML患者NCCN中危组中对TSEN34基因表达水平进行总生存率分析，纵坐标是总生存率，横坐标是生存时间(月)。图3B所示是在全部AML患者 NCCN中危组中对TSEN34基因表达水平进行无事件发生生存率分析，纵坐标是无事件发生生存率，横坐标是生存时间(月)。
实验结果显示，TSEN34基因低表达组的总生存率和无事件发生生存率均显著高于TSEN34基因高表达组。因此，TSEN34基因的表达水平可以用于提示急性髓系白血病的预后水平。
实施例10TSEN34基因表达水平与成人正常核型急性髓系白血病(CN-AML)患者(剔除 M3)和ELN中危-I组成人正常核型急性髓系白血病患者(剔除M3)的生存分析曲线
说明：ELN，即European Leukmia Net，欧洲白血病网；CN-AML，即正常核型急性髓系白血病。
实验方法：
1、采集正常核型急性髓系白血病患者(剔除M3)骨髓组织样本，共获得156例骨髓组织样本。
2、检测TSEN34基因表达水平，并按照TSEN34基因表达中位值将其分为TSEN34基因低表达组和TSEN34基因高表达组，其中，TSEN34基因低表达组数据为78例，TSEN34基因高表达组数据为78例。
3、比较TSEN34基因低表达组和TSEN34基因高表达组的总生存率和无事件发生生存率，结果如图4A和4B。
实验结果：
其中，图4A是在全部CN-AML患者中对TSEN34基因表达水平进行总生存率分析。纵坐标是总生存率，横坐标是生存时间(月)。图4B是在全部CN-AML患者中对TSEN34基因表达水平进行无事件发生生存率分析。纵坐标是无事件发生生存率，横坐标是生存时间 (月)。
实验结果显示，TSEN34基因低表达组的总生存率和无事件发生生存率均显著高于TSEN34基因高表达组。因此，TSEN34基因的表达水平可以用于提示急性髓系白血病的预后水平。
实验方法：
1、采集ELN中危-I组成人正常核型急性髓系白血病患者(剔除M3)骨髓组织样本，共获得121例骨髓组织样本。
2、检测TSEN34基因表达水平，并按照TSEN34基因表达中位值将其分为TSEN34基因低表达组和TSEN34基因高表达组，其中，TSEN34基因低表达组数据为61例，TSEN34基因高表达组数据为60例。
3、比较TSEN34基因低表达组和TSEN34基因高表达组的总生存率和无事件发生生存率，结果如图5A和5B。
实验结果：
其中，图5A是在全部CN-AML患者ELN中危-I组中对TSEN34基因表达水平进行总生存率分析。纵坐标是总生存率，横坐标是生存时间(月)。图5B所示是在全部CN-AML患者ELN中危-I组中对TSEN34基因表达水平进行无事件发生生存率分析。纵坐标是无事件发生生存率，横坐标是生存时间(月)。
实验结果显示，TSEN34基因低表达组的总生存率和无事件发生生存率均显著高于TSEN34基因高表达组。因此，TSEN34基因的表达水平可以用于提示急性髓系白血病的预后水平。
实施例11TSEN34基因表达水平与成人急性髓系白血病患者(＜60岁)(剔除M3)和NCCN 中危组成人急性髓系白血病患者(＜60岁)(剔除M3)的生存分析曲线
实验方法：
1、采集成人急性髓系白血病患者(＜60岁，剔除M3)骨髓组织样本，共获得272例骨髓组织样本。
2、检测TSEN34基因表达水平，并按照TSEN34基因表达中位值将其分为TSEN34基因低表达组和TSEN34基因高表达组，其中，TSEN34基因低表达组数据为136例，TSEN34基因高表达组数据为136例。
3、比较TSEN34基因低表达组和TSEN34基因高表达组的总生存率和无事件发生生存率，结果如图6A和6B。
实验结果：
其中，6A是在成人AML患者中对TSEN34基因表达水平进行总生存率分析。纵坐标是总生存率，横坐标是生存时间(月)。6B是在成人AML患者中对TSEN34基因表达水平进行无事件发生生存率分析。纵坐标是无事件发生生存率，横坐标是生存时间(月)。
实验结果显示，TSEN34基因低表达组的总生存率和无事件发生生存率均显著高于TSEN34基因高表达组。因此，TSEN34基因的表达水平可以用于提示急性髓系白血病的预后水平。
实验方法：
1、采集NCCN中危组成人急性髓系白血病患者(＜60岁，剔除M3)骨髓组织样本，共获得135例骨髓组织样本。
2、检测TSEN34基因表达水平，并按照TSEN34基因表达中位值将其分为TSEN34基因低表达组和TSEN34基因高表达组，其中，TSEN34基因低表达组数据为68例，TSEN34基因高表达组数据为67例。
3、比较TSEN34基因低表达组和TSEN34基因高表达组的总生存率和无事件发生生存率，结果如图7A和7B。
实验结果：
其中，图7A所示是在成人AML患者NCCN中危组中对TSEN34基因表达水平进行总生存率分析。纵坐标是总生存率，横坐标是生存时间(月)。图7B所示是在成人AML患者 NCCN中危组中对TSEN34基因表达水平进行无事件发生生存率分析。纵坐标是无事件发生生存率，横坐标是生存时间(月)。
实验结果显示，TSEN34基因低表达组的总生存率和无事件发生生存率均显著高于TSEN34基因高表达组。因此，TSEN34基因的表达水平可以用于提示急性髓系白血病的预后水平。
实施例12TSEN34基因表达水平与成人急性髓系白血病患者(＜60岁，剔除M3)和ELN 中危-I组成人急性髓系白血病患者的生存分析曲线
实验方法：
1、采集成人急性髓系白血病患者(＜60岁，剔除M3)骨髓组织样本，共获得129例骨髓组织样本。
2、检测TSEN34基因表达水平，并按照TSEN34基因表达中位值将其分为TSEN34基因低表达组和TSEN34基因高表达组，其中，TSEN34基因低表达组数据为65例，TSEN34基因高表达组数据为64例。
3、比较TSEN34基因低表达组和TSEN34基因高表达组的总生存率和无事件发生生存率，结果如图8A和8B。
实验结果：
其中，图8A是在成人CN-AML患者中对TSEN34基因表达水平进行总生存率分析。纵坐标是总生存率，横坐标是生存时间(月)。图8B是在成人CN-AML患者中对TSEN34基因表达水平进行无事件发生生存率分析。纵坐标是无事件发生生存率，横坐标是生存时间 (月)。
实验结果显示，TSEN34基因低表达组的总生存率和无事件发生生存率均显著高于TSEN34基因高表达组。因此，TSEN34基因的表达水平可以用于提示急性髓系白血病的预后水平。
实验方法：
1、采集ELN中危-I组成人急性髓系白血病患者(＜60岁，剔除M3)骨髓组织样本，共获得99例骨髓组织样本。
2、检测TSEN34基因表达水平，并按照TSEN34基因表达中位值将其分为TSEN34基因低表达组和TSEN34基因高表达组，其中，TSEN34基因低表达组数据为50例，TSEN34基因高表达组数据为49例。
3、比较TSEN34基因低表达组和TSEN34基因高表达组的总生存率和无事件发生生存率，结果如图9A和9B。
实验结果：
其中，图9A所示是在成人CN-AML患者ELN中危-I组中对TSEN34基因表达水平进行总生存率分析。纵坐标是总生存率，横坐标是生存时间(月)。图9B所示是在成人CN-AML 患者ELN中危-I组中对TSEN34基因表达水平进行无事件发生生存率分析。纵坐标是无事件发生生存率，横坐标是生存时间(月)。
实验结果显示，TSEN34基因低表达组的总生存率和无事件发生生存率均显著高于TSEN34基因高表达组。因此，TSEN34基因的表达水平可以用于提示急性髓系白血病的预后水平。
实施例13TSEN34基因高表达AML患者的化疗与异基因移植两种治疗方案的预后分析
实验方法：
1、采集成人急性髓系白血病患者(剔除M3)骨髓组织样本，共获得TSEN34基因高表达的86例骨髓组织样本。
2、选择其中36例采用异基因移植的治疗方案，选择其中50例采用化疗的治疗方案，比较两者的总生存率差异。实验结果显示：TSEN34基因高表达的AML患者采用异基因移植可获得相比化疗更好的总生存率。纵坐标是总生存率，横坐标是生存时间(月)，具体参见图10A。
3、选择其中36例采用异基因移植的治疗方案，选择其中50例采用化疗的治疗方案，比较两者的无事件生存率差异。实验结果显示：TSEN34基因高表达的AML患者采用异基因移植可获得相比化疗更好的无事件发生生存率。纵坐标是总生存率，横坐标是生存时间(月)，具体参见图10B。
实验结论：
1、TSEN34基因高表达是急性髓系白血病患者的预后不良标志物；
2、TSEN34基因高表达在AML患者的NCCN中危组、CN-AML及ELN中危-Ⅰ组中均是预后不良标志物；
3、TSEN34基因高表达是成人急性髓系白血病患者的预后不良标志物；
4、TSEN34基因高表达在成人NCCN中危组、成人CN-AML及成人ELN中危-Ⅰ组中均是预后不良标志物；
5、TSEN34基因高表达患者选择异基因移植可获得相比化疗更好的总生存率和无事件发生生存率，TSEN34基因可用于急性髓系白血病的临床治疗决策支持。
因此TSEN34基因高表达可以作为预后标志物进一步细化这三类患者危险度分层和预后评估。TSEN34基因高表达的成人AML样品具有较高的危险度分层和较差的临床预后，有采用异基因造血干细胞移植治疗的需要。TSEN34基因低表达的成人AML样品具有较低的危险度分层和较好的临床预后，不需要采用异基因造血干细胞移植治疗，只需化疗即可。
上述实施例只是为了详细说明本发明，而不是在任何方面限制本发明的保护范围。
序列表
<110> 中国人民解放军总医院
<120> 用于急性髓系白血病精准诊疗的检测试剂盒及TSEN34临床应用
<130> 20170714
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1302
<212> DNA/RNA
<213> Human
<400> 1
gttcgttgca acaaattgat gagcaatgct tttttataat gccaactttg tactaaaaag 60
ttggcatgct ggtggtggag gtggcgaacg gccgctccct ggtgtgggga gccgaggcgg 120
tgcaggccct ccgggagcgc ctgggtgtgg ggggccgcac ggtaggcgcc ctgccccgcg 180
ggccccgcca gaactcgcgc ctgggcctcc cgctgctgct gatgcccgaa gaggcgcggc 240
tcttggccga gatcggcgcc gtgactctgg tcagcgcccc gcgtccagac tctcggcacc 300
acagcctggc cctgacatcc ttcaagcgcc agcaagagga gagcttccag gagcagagcg 360
ccttggcagc tgaggcccgg gagacccgtc gtcaggaggt cctggagaag attacggagg 420
gccaggctgc taagaagcag aaactagaac aggcttcagg ggccagctca agccaggagg 480
ccggctcgag ccaggctgcc aaagaggatg agaccagtga tggccaggct tcgggagagc 540
aggaggaagc tggcccctcg tcttcccaag caggaccctc aaatggggta gcccccttgc 600
ccagatctgc tctccttgtc cagctggcca ctgccaggcc tcgaccggtc aaggccaggc 660
ccctggactg gcgtgtccag tctaaagact ggccccacgc cggccgccct gcccacgagc 720
tgcgctacag tatctacaga gacctgtggg agcgaggctt cttcctcagt gcggctggca 780
agttcggagg tgacttcctg gtctatcctg gtgaccccct ccgcttccac gcccattata 840
tcgctcagtg ctgggcccct gaggacacct cccactccaa gacctggttg ctgctgggcg 900
ccttggaacc agcgtcagaa agaccctgct cctctgttct ccgcagcctg atggtaaggt 960
ggtctacacc tccctgcaat gggccagcct gcagtgaact ccagagacct aggggatgtg 1020
gctgtgtcgg cagcaagagc ctttctggat gttccccagc tcttctctgg gagtctagaa 1080
catcctccta cctttctccg cggttagttt ttgattccag gttttcgaac actacatctt 1140
ttttatgttc ttccttgttt caaagcactt attggctgtg tttttgtagt tacctatttt 1200
cacactgtga gcttcccgag aatggggcct gggtttgccc aactttcttg tacaaagttg 1260
gcattataag aaagcattgc ttatcaattt gttgcaacga ac 1302
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cccaagcagg accctcaaat 20
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
agaaagttgg gcaaacccag g 21
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggaccctcaa atggggtagc 20
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aaagttgggc aaacccagg 19
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ctagaacagg cttcaggggc 20
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tacaagaaag ttgggcaaac cc 22
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
actaaaaagt tggcatgctg gt 22
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ccaggaagtc acctccgaac 20
<210> 10
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
aaggccaggc ccctggactg gcgtgtccag 30
<210> 11
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ggccccgcca gaactcgcgc ctgggcctcc 30
<210> 12
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tcagcgcccc gcgtccagac tctcggcacc 30

Claims (5)

1.TSEN34基因的检测物的用途，其特征在于：所述用途是
(1)制备用于检测成人急性髓系白血病危险度分层或成人急性髓系白血病异基因造血干细胞移植前评估或成人急性髓系白血病预后评估的产品；
或，(2)制备用于检测成人急性髓系白血病危险度分层或成人急性髓系白血病异基因造血干细胞移植前评估或成人急性髓系白血病预后评估的试剂盒；
或，(3)制备用于检测成人急性髓系白血病危险度分层或成人急性髓系白血病异基因造血干细胞移植前评估或成人急性髓系白血病预后评估的芯片；
或，(4)制备用于检测成人急性髓系白血病危险度分层或成人急性髓系白血病异基因造血干细胞移植前评估或成人急性髓系白血病预后评估的检测物、制剂或药物。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于：所述的TSEN34基因的检测物为TSEN34基因的引物对和/或探针，其序列为以下任一项所示：
(1)SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3；
(2)SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5；
(3)SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7；
(4)SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9；
(5)SEQ ID NO：10或其互补序列；
(6)SEQ ID NO：11或其互补序列；
(7)SEQ ID NO：12或其互补序列。
3.如权利要求1所述的用途，其特征在于：所述试剂盒还包括实现如下功能的模块：
(1)在成人急性髓系白血病患者的样本组中检测TSEN34基因的表达量，取样本组表达量中位值，将患者分为TSEN34基因低表达组和TSEN34基因高表达组；
(2)将TSEN34基因低表达组定义为急性髓系白血病预后低风险组，将TSEN34基因高表达组定义为急性髓系白血病预后中高风险组。
4.如权利要求1所述的用途，其特征在于：所述芯片还包括实现如下功能的模块：
(1)在成人急性髓系白血病患者的样本组中检测TSEN34基因的表达量，取样本组表达量中位值，将患者分为TSEN34基因低表达组和TSEN34基因高表达组；
(2)将TSEN34基因低表达组定义为急性髓系白血病预后低风险组，将TSEN34基因高表达组定义为急性髓系白血病预后中高风险组。
5.如权利要求1所述的用途，其特征在于：所述的TSEN34基因的检测物包含核酸或者核酸组合物，所述的核酸或者核酸组合物为：
(1)其为TSEN34基因的检测物，其序列为以下任一项所示：
1)SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3；
2)SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5；
3)SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7；
4)SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9；
或，(2)其为TSEN34基因的探针：
1)序列为SEQ ID NO：10或其互补序列；
2)序列为SEQ ID NO：11或其互补序列；
3)序列为SEQ ID NO：12或其互补序列。
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