CN111455074B - 用于评估胰腺癌化疗疗效的微生物菌群标志物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了用于评估胰腺癌化疗疗效的微生物菌群标志物及其应用，属于医学检测技术领域，本发明通过获取微生物标志物的相对丰度含量，通过模型计算给出预测概率，可作为协助评估胰腺癌化疗疗效，减少不恰当的化疗周期，为患者有效治疗争取时间。

Description

用于评估胰腺癌化疗疗效的微生物菌群标志物及其应用
技术领域
本发明属于医学检测技术领域，涉及基于肠道微生物菌群的肿瘤检测方向，具体的，涉及一种用于评估胰腺癌化疗疗效的微生物菌群标志物及其应用。
背景技术
近些年来，随着生物领域研究的进展，越来越多的研究表明，人类体内的微生物菌群，尤其是肠道微生物菌群，与人体自身各类疾病都存在着息息相关的联系，包括心脑血管疾病、类风湿性关节炎、糖尿病、肥胖症以及肿瘤。在肠道微生物菌群与肿瘤关系的研究中，研究者们逐渐发现，肠道微生物菌群在肝癌、胰腺癌、黑色素瘤、血液系统肿瘤、乳腺癌等肿瘤的发生、发展、治疗中扮演着重要的角色。然而由于微生物菌群数量较大且多样、受试者因素复杂，肠道微生物菌群与肿瘤的发生及治疗之间的关系尚未完全明了，现有的各个研究也较为零散，尚缺乏系统性。
在肿瘤中，胰腺癌是最常见的一种，实际中大多数患者往往在确诊时即处于晚期，临床进展中只有9％的人能活到5年。早期胰腺癌虽然可以通过手术切除，但复发率高，中位生存期为24-30个月。因此胰腺癌素来被冠以“癌症之王”的称号。从生理结构上来说，胰腺通过胰管与胃肠道进行解剖连接，并通过胆总管与肝脏沟通，胰腺与胃肠道(微生物菌群)有着密切的关系。目前对肠道微生物菌群的研究也已经延伸到了胰腺疾病。例如Jandhyala等通过16S测序研究人慢性胰腺炎患者和正常组的粪便样本中微生物菌群，发现厚壁菌门丰度上升，拟杆菌门丰度下降；Zhang等研究发现，急性胰腺炎患者相对正常人而言，其粪便中拟杆菌门和变形菌门丰度提升，厚壁菌门和放线菌门丰度下降；Farrell等通过16S基因芯片测序研究胰腺导管腺癌患者和正常组的口腔微生物菌群，发现胰腺导管腺癌患者口腔中长链球菌和细菌性链球菌的丰度下降；Michaud研究人血浆中的微生物菌群，发现胰腺导管腺癌患者较正常人而言，牙龈卟啉单胞菌(ATTC53978)的丰度有所上升；Riquelme等的研究，通过16S测序样本，发现胰腺导管腺癌长期幸存者与胰腺导管腺癌短期幸存者中的微生物菌群存在差异，表现为Alpha多样性上升，糖多孢菌、假黄单胞菌和链霉菌丰度下降。目前有关微生物菌群在胰腺癌中作用的相关研究显示，微生物菌群变化引起的炎症和免疫抑制被认为是与胰腺癌发展相关的机制。
在胰腺癌治疗中，化疗仍是所有阶段胰腺癌的一线治疗，既往推荐的一线化疗方案多为吉西他滨、氟尿嘧啶类单药或者联合化疗方案，但在个体患者中治疗效果差异很大。Geller等人(2019)研究发现：在结肠癌小鼠模型中，细菌可将化疗药物吉西他滨(2',2'-difluorodeoxycytidine)代谢成为一种无活性的产物(2',2'-difluorodeoxyuridine)；肿瘤内的γ变形菌门可使肿瘤产生对吉西他滨的耐药性，而利用抗生素环丙沙星处理后可消除耐药性；进一步的在113名PDAC患者中研究发现，有76％的患者的肿瘤中存在细菌，且大多数为γ变形菌门。这表明微生物菌群在决定化疗的疗效和副作用方面起着重要的作用，化疗也可能通过多种机制影响微生物菌群。
虽然在胰腺癌这一领域已经取得了一些进展，但微生物-宿主-药物之间的相互作用仍未得到充分了解，生物复杂性仍然是精确治疗的巨大障碍，需要更多的研究来了解微生物菌群在胰腺癌化疗耐药中的作用。
发明内容
针对上述现有技术的不足及目前关于胰腺癌化疗治疗有效性实际的检测需求，本发明提供一种用于评估胰腺癌化疗疗效的微生物菌群标志物及其应用，通过获取微生物标志物的相对丰度含量，通过模型计算给出预测概率，可作为协助评估胰腺癌化疗疗效，减少不恰当的化疗周期，为患者有效治疗争取时间。
具体的，本发明公开了以下技术方案：
首先，本发明公开了用于评估胰腺癌化疗疗效的微生物菌群标志物，所属微生物菌群标志物包括不动杆菌属(Acinetobacter)、拟杆菌属(Bacteroides)、Peptoclostridium属、Blautia属、魏斯氏菌属(Weissella)、Faecalibacterium属、巨单胞菌属(Megamonas)、乳球菌属(Lactoccus)、肠球菌属(Enterococcus)、链球菌属(Streptococcus)、短小芽孢杆菌属(Lysinibacillus)、普雷沃菌属(Prevotella 9)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、库特氏菌属(Kurthia)、假单胞菌属(Pseudomonas)。
本发明的微生物菌群标志物组合可以用于评估胰腺癌化疗是否有效，检测患者个体对于化疗药物是否存在耐药性，该标志物组合的评估模型，特异性好，灵敏度高；本发明所选微生物菌群标志物均为菌属，同时细菌属水平丰度大于>1％，临床检测可用性好。
其次，本发明公开了上述微生物菌群标志物的应用，该应用包括如下任意一种，所述用途包括基于上述微生物菌群标志物构建预测评估胰腺癌化疗药物疗效模型，或者基于上述微生物菌群标志物评价化合物对于胰腺癌治疗的有效性，或者制备用于评估胰腺癌化疗疗效的检测试剂盒。
此外，本发明还公开了用于评估胰腺癌化疗疗效的模型的构建方法，所述方法包括分别检测胰腺癌化疗有效患者和失效患者粪便中的上述微生物菌群标志物的丰度的步骤和丰度数据输入学习模型或训练模型得到用于评估胰腺癌化疗疗效模型的步骤。
进一步的，本发明还公开了用于评估胰腺癌化疗疗效的检测试剂盒。
与现有技术相比，本发明的上述一个或多个技术方案取得了如下有益效果：
(1)针对胰腺癌化疗的疗效和化疗药物敏感性，本发明的微生物标志物用于评估时，特异性好，灵敏度高，最优集微生物菌群标志物组合应用时判别效能为：AUC＝89.76％，95％置信区间CI＝75.03-100％；
(2)本发明的微生物菌群标志物的组合应用，可以用于评价化合物对于胰腺癌治疗的有效性，此外也有利于发现新的胰腺癌化疗药物。
(3)本发明所提供的基于微生物菌群标志的检测试剂盒，所检测菌群细化到菌属，且菌属丰度较高，避免了极低丰度检测的误判率，更便于实际临床应用。
附图说明
构成本发明的说明书附图用来提供对本发明方案的进一步理解，其示意性说明用于解释，并不构成对本发明的不当限定。
图1实施例1中化疗有效组和化疗失效组样本微生物物种图谱
具体实施方式
应该指出，以下具体实施方式说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的阐述。除非另有指明，本发明中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。若未特别指明，实施例中所采用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，可以参照《分子克隆实验指南》第三版或者相关产品进行，所采用的试剂和产品也均为可商业获得的。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作和/或它们的组合。应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。
为了更好地理解本发明，对一些定义和相关术语的解释如下：
“标志物”，有时也称生物标志物，是指可以标记系统、器官、组织、细胞及亚细胞结构或功能的改变或可能发生的改变的生化指标，具有非常广泛的用途，生物标志物可用于疾病诊断、判断疾病分期或者用来评价新药或新疗法在目标人群中的安全性及有效性。本发明中微生物菌群标志物相对更侧重于微生物菌群，或者可以显示微生物菌群存在含量的标志性基因、代谢物、抗原/抗体等。
本发明用于评估胰腺癌化疗疗效，通常是指针对胰腺癌确诊患者采用化疗药物治疗时的治疗有效性，或称患者针对化疗药物起作用的敏感性。具体的，本发明中评估胰腺癌化疗有效包括完全缓解和部分缓解的情形，对于胰腺癌化疗失效包括稳定和进展的情形，对于完全缓解、部分缓解、稳定、进展的标准可以参考本发明实施例1，但不限于此，本领域技术人员可以理解的化疗有效的标准都可以纳入。
本发明公开了用于评估胰腺癌化疗疗效的微生物菌群标志物，所述微生物菌群标志物包括不动杆菌属(Acinetobacter)、拟杆菌属(Bacteroides)、Peptoclostridium属、Blautia属、魏斯氏菌属(Weissella)、Faecalibacterium属、巨单胞菌属(Megamonas)、乳球菌属(Lactoccus)、肠球菌属(Enterococcus)、链球菌属(Streptococcus)、短小芽孢杆菌属(Lysinibacillus)、普雷沃菌属(Prevotella 9)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、库特氏菌属(Kurthia)、假单胞菌属(Pseudomonas)。
本发明中所述微生物菌群标志物均已细分到菌属，所述菌属是指按照分类学方法-界、门、纲、目、科、属、种，细分到属的微生物，例如针对不动杆菌属(Acinetobacter)，包括该属下的所有微生物种，也包括与不动杆菌属(Acinetobacter)的基因组比对相似度在85％以上的可以根据分子生物学归类的该属的微生物，如85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％和100％的对比相似度；通常情况下，不动杆菌属(Acinetobacter)的微生物涵盖与不动杆菌属的16SrDNA比对相似度在85％以上的可以根据分子生物学归类的该属微生物，如85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％和100％的对比相似度；更为具体的实施例中，不动杆菌属(Acinetobacter)的微生物可以是与不动杆菌属的16SrDNA基因V3-V4区比对相似度在85％以上的可以根据分子生物学归类的该属微生物，如85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％和100％的对比相似度。本发明其他微生物菌群标志物的菌属含义类似。
应当理解的是，本发明中微生物菌群标志物也可以涵盖显示上述微生物菌群存在含量的标志性基因、代谢物、抗原/抗体等，只要其能够确认上述微生物菌属存在含量即可。
本发明优选的实施方式中，用于评估胰腺癌化疗疗效的微生物菌群标志物，所述微生物菌群标志物包括不动杆菌属(Acinetobacter)、拟杆菌属(Bacteroides)、Peptoclostridium属、Blautia属、魏斯氏菌属(Weissella)、Faecalibacterium属、巨单胞菌属(Megamonas)。
针对胰腺癌化疗的疗效和化疗药物敏感性，与上述包含15种微生物菌群标志物的评估效能(AUC＝69.37％)相比，优选的实施方式中，最优集7种微生物菌群标志物组合用于评估时，特异性更好，灵敏度更高，应用时判别效能为：AUC＝89.76％，95％置信区间CI＝75.03-100％。
进一步的，本发明的具体实施方式公开了上述微生物菌群标志物的应用，通过将筛选到的微生物菌属结合临床样本(所述临床样本可以述区域性的、按性别区分的、按照年龄段区分的等等)，获取临床样本的对应微生物菌属丰度(相对丰度)，结合常用的机器学习模型或训练模型可以获得基于上述微生物菌群标志物的胰腺癌化疗药物疗效评估模型。
应当理解的是，本领域内常用的用于风险或概率评估的学习模型或训练模型，包括但不限于随机森林模型和ROC曲线方法、logistic回归模型。
进一步的，本发明的具体实施方式公开了上述微生物菌群标志物的应用，通过将上述微生物菌群标志物结合临床样本构建胰腺癌化疗药物疗效评估模型，或者利用本发明具体实施例中已经形成的胰腺癌化疗药物疗效评估模型(7个物种的最优集)，用来评价化合物对于胰腺癌治疗的有效性，所化合物包括但不限于吉西他滨单药或氟尿嘧啶类药物，例如包括替吉奥以及5-氟尿嘧啶/亚叶酸钙、醛氢叶酸(LⅣ)、顺铂(DDP)、吉西他滨、吉西他滨与5-氟尿嘧啶联用等。当然可以理解的是，本发明上述微生物菌群标志物的应用也包括用来评价新的化合物对于胰腺癌治疗的有效性，或者用来评价尚未应用到胰腺癌化疗的其他已知化合物对于胰腺癌治疗的有效性。
进一步的，本发明的具体实施方式公开了上述微生物菌群标志物的应用，通过针对该微生物菌属的标志性基因、蛋白、标志性代谢物等，设计制备用于评估胰腺癌化疗疗效的检测试剂盒。上述微生物菌群标志物丰度的测定方法包括宏基因组测序、16SrDNA测序或qPCR检测中的任意一种或至少两种的组合，优选为qPCR检测。对于微生物丰度的检测，技术人员通常选择高通量测序的方式进行检测，这样做会增加整体检测的时间和经济成本，优选的实施方案中本发明通过选择特定种属数量的微生物作为标志物，既可以保证检测灵敏度，同时可以兼容多种检测手段如实时荧光定量核酸扩增检测(qPCR)，操作更简便，多数医院或检测机构均可进行操作。
进一步的，本发明的具体实施方式公开了一种用于评估胰腺癌化疗疗效的模型的构建方法，所述方法包括：
(1)分别检测胰腺癌化疗有效患者和失效患者粪便中的上述微生物菌群标志物的丰度；
(2)将丰度数据输入学习模型或训练模型得到用于评估胰腺癌化疗疗效的模型。
具体的实施例中，步骤(1)所述微生物标志物的相丰度的检测方法包括宏基因组测序、16S rDNA测序或qPCR检测中的任一种或至少两种的组合；优选的实施例中，采用宏基因组测序，并进一步采用宏基因组关联分析(Metagenome-Wide Association Study,MWAS)的分析方法，分析粪便样本的菌群组成，功能差异获取丰度值(相对丰度值)。
具体的实施例中，步骤(2)中学习模型或训练模型，包括但不限于随机森林模型和ROC曲线方法、logistic回归模型。
应当理解的是，为了便于评估胰腺癌化疗疗效的模型的实际应用，无需特殊限定，通过训练模型得到预测效果最佳的模型，存储后可直接用于未知样本的预测分析。
进一步的，本发明的具体实施方式还公开了用于评估胰腺癌化疗疗效的检测试剂盒及其应用。
具体实施例中，所述检测试剂盒包括用于上述微生物菌群标志物丰度检测16SrDNA测序试剂或qPCR检测试剂等。例如，针对16sRNA的V3-V4区(引物对：338F-806R),合成的带有barcode特异性引物。
应当理解的是，所述检测试剂盒的应用也同于上述微生物菌群标志的应用，可以用于构建预测评估胰腺癌化疗药物疗效模型，或者用于评价化合物对于胰腺癌治疗的有效性。
以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。
实施例1
1.1临床样本纳入及治疗方案
选取山东省肿瘤医院2017年8月-2O19年2月胰腺癌患者63例，所有患者均检查确诊(检查确诊方法B超、CT等)。纳入患者年龄区间32-73岁，其中男性患者39例，女性患者24例。
患者化疗治疗方案：患者单药治疗：GEM(吉西他滨)1000mg/m2，静脉滴注30分钟；联用：GEM 1000mg/m2静脉滴注30分钟后给予5-Fu(5-氟尿嘧啶)600mg/m2，静脉滴注；所有患者均间隔7天给药，患者每28天为1个治疗周期，连续2个周期评价临床化疗效果。
化疗疗效标准：完全缓解：肿瘤消失，并可持续>1个月；部分缓解：相互垂直肿瘤的两个直径相乘减小超过5O％，并可持续>1个月；稳定：相互垂直肿瘤的两个直径相乘减小>30％，但<50％，并可持续>1个月；进展：相互垂直两个最大的肿瘤的直径相乘增大>25％。
纳入临床样本统计化疗疗效如下表1所示。
化疗有效组(完全缓解和部分缓解)和失效组(稳定和进展)在年龄、性别和化疗方式差异无统计学意义(P>0.05)。
表1实施例1纳入临床样本统计化疗疗效
Figure BDA0002444356310000081
1.2粪便样本采集
所有患者在进行化疗治疗1周期(28天)后进行粪便取样，采集粪便时避免尿液和其他杂物污染，粪便样本进行编号，并立即置于-80℃保存。
1.3 Illumina MiSeq测序平台分析
样本总DNA提取：使用omega ezna试剂盒，抽提样本基因组，基因组DNA抽提完成后，琼脂糖凝胶电泳和核酸检测仪检测总DNA质量。
PCR扩增：针对16sRNA的V3-V4区(引物对：338F-806R),合成带有barcode特异性引物,每个样本设置3个重复，进行PCR扩增，PCR扩增产物混合后，琼脂糖凝胶电泳检测产物质量，PCR产物质量合格后，使用凝胶回收试剂盒切胶回收PCR产物。
荧光定量:利用QuantiFluorTM-ST蓝色荧光定量系统(Promega公司)定量检测PCR产物。
Miseq文库构建及测序：通过PCR链接“Y”字形接头，去除自连片段，PCR扩增进行文库模板富集，氢氧化钠变性，产生单链DNA片段。测序和生物信息学分析工作在上海美吉生物完成。
生物信息学分析：测序后的数据进行统计优化分析，OTU聚类分析，计算菌群丰度指数-Chao和Ace指数，进行稀释性曲线和Shannon指数曲线菌群多样性分析，并从分类水平上进行物种组成分析。
1.4微生物菌群标志物筛选
将该63例样本中，取20例化疗有效组患者样本(5例完全缓解和15例部分缓解)和35例化疗失效组患者样本(20例稳定、15例进展)作为筛选集，进行Illumina MiSeq测序平台分析和筛选微生物菌群标志物；余下样本作为验证集。
根据生物信息学分析结果，获得样本在各分类水平上的分类学比对情况：微生物菌群种类和各微生物的丰度值(相对丰度)。物种差异性分析模块的内容包括：组间差异显著性检验、Lefse多级物种差异判别分析。
本发明利用Lefse多级物种差异来鉴定差异的微生物，并综合秩和检验方法和线性判别方法对55个样本的物种图谱进行分析。共得到15个物种标志物(线性判别分析效应大于2.4)其在化疗有效组或失效组中显著富集，如图1所示。令人意外的是，本发明中并未发现γ变形菌在化疗有效组或失效组中差异性的显著富集。
进一步的，本发明利用随机森林方法从关联的15个物种中鉴定强相关微生物菌群标志物，将物种输入随机森林分类器,对分类器进行5次10折交叉验证，利用RF模型筛选的物种相对丰度对每一个体计算，绘制ROC曲线，并计算出AUC作为判别模型效能评价参数。发明人利用随机森林方法鉴定出与用于评估胰腺癌化疗(有效和失效)强相关的7个物种的最优集，如表2所示。7个标志物组合对筛选集样本的判别效能为：AUC＝89.76％，95％置信区间CI＝75.03-100％。
表2化疗有效组和化疗失效组样本微生物物种最优集
Figure BDA0002444356310000091
1.5利用验证集数据验证筛选得到的生物标志物
本发明使用验证集对上述微生物菌群标志物进行验证，概率≥0.5预测个体胰腺癌化疗有效。验证集中8个临床患者的生物标志物预测及临床结果如表3所示。
表3验证集生物标志物预测及临床结果
临床样本编号 预测有效概率 2周期临床化疗效果
PCYX-17-021 0.767 有效
PCYX-18-022 0.823 有效
PCYX-19-023 0.677 有效
PCSX-17-036 0.225 失效
PCSX-18-037 0.327 失效
PCSX-18-038 0.464 失效
PCSX-18-039 0.191 失效
PCSX-19-040 0.473 失效
以上结果表明，本发明公开的微生物菌群标志物具有较高的准确度和特异性，具有良好的市场开发前景。
应注意的是，以上实例仅用于说明本发明的技术方案而非对其进行限制。尽管参照所给出的实例对本发明进行了详细说明，但是本领域的普通技术人员可根据需要对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。

Claims (2)

1.微生物菌群标志物的应用，其特征在于，所述应用为在制备评估胰腺癌化疗疗效的检测试剂盒中的应用；评估胰腺癌化疗化合物包括但不限于吉西他滨单药或氟尿嘧啶类药物；
所述微生物菌群为不动杆菌属、拟杆菌属、Peptoclostridium属、Blautia属、魏斯氏菌属、Faecalibacterium属、巨单胞菌属、乳球菌属、肠球菌属、链球菌属、短小芽孢杆菌属、普雷沃菌属、葡萄球菌属、库特氏菌属和假单胞菌属；微生物菌群标志物的丰度的检测方法包括宏基因组测序、16S rDNA测序或qPCR检测中的任一种或至少两种的组合。
2.如权利要求1所述的微生物菌群标志物的应用，其特征在于，所述微生物菌群标志物为不动杆菌属、拟杆菌属、Peptoclostridium属、Blautia属、魏斯氏菌属、Faecalibacterium属和巨单胞菌属。
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