CN114214419A - 用于肺癌诊断的试剂盒、装置及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种用于肺癌诊断的试剂盒、装置和方法，其中试剂盒包括检测外泌体长RNA标志物和miRNA标志物组合的引物和探针，所述长RNA标志物包括ARPC5、MBOAT2、IL1B中的一种或多种，所述miRNA标志物包括miR‑450b‑5p、miR‑let‑7f、miR‑3615、miR‑885‑5p、miR‑106b‑3p、miR‑30e‑5p、miR‑4746‑5p、miR‑125a‑5p中的一种或多种。本发明的基于外泌体的无创的早期肺癌诊断的方法，在早期肺癌中具有高灵敏度及高特异性，为肺癌的早期诊断提供了重要价值。对我国肺癌的防治有很大的帮助。

Description

用于肺癌诊断的试剂盒、装置及方法
本申请为分案申请，其母案申请的申请号为202111109658.2，申请日为2020年05月11日，发明名称为“用于肺癌诊断的试剂盒、装置及方法”。
技术领域
本发明涉及医学诊断领域，具体涉及一种用于早期肺癌的诊断试剂盒、装置及方法。
背景技术
肺癌是我国乃至全球主要癌种之一。根据2018年最新全球癌症统计数据，肺癌在所有癌种中发病率及致死率均居于首位。而根据2019年中国肿瘤登记数据，中国2015年新增390.2万癌症病例，癌症的死亡病例约为233.8万，其中肺癌是中国癌症死亡的主要原因。因此，为提升我国肺癌诊疗行为，改善肺癌患者预后，早期诊断成为肺癌诊治的重要问题。
随着低剂量螺旋CT的应用，越来越多的影像学表现为肺结节(肺间质内<3cm的单一病变、而且无相关的肺不张或淋巴结病)被发现。然而并非所有的肺结节都是恶性，肺结节良恶性鉴别一直以来是胸外科临床诊疗的难点。目前也有采用血浆循环肿瘤细胞、循环肿瘤游离DNA等的无创检测手段，但其在早期肺癌诊断中检测的灵敏度并不高；因此，亟待开发一种高灵敏度的无创肺癌早期检测的方法。
发明内容
本发明的提供了一种基于外泌体的无创的早期肺癌诊断的试剂、装置和方法。
本发明一方面提供一种用于肺癌诊断的试剂盒，包括检测外泌体长RNA标志物和miRNA标志物组合的引物和探针，所述长RNA标志物包括ARPC5、MBOAT2、IL1B中的一种或多种，所述miRNA标志物包括miR-450b-5p、miR-let-7f、miR-3615、miR-885-5p、miR-106b-3p、miR-30e-5p、miR-4746-5p、miR-125a-5p中的一种或多种。
优选，所述标志物为miR-450b-5p、let-7f-2-3p和ARPC5三者的组合。
优选，所述标志物为miR-106b-3P、miR-30e-5p和MBOAT2三者的组合。
优选，所述标志物为miR-106b-3P、miR-30e-5p、miR-3615、miR-885-5p和ARPC5五者的组合。
优选，所述标志物为miR-106b-3P、miR-125a-5p、miR-3615、miR-450b-5p和IL1B五者的组合。。
优选，外泌体来源包括血液、唾液及痰液的一种或多种。
优选，所述引物和探针包括：
用于检测内参ACTB的引物和探针：所述RNA的上游引物如序列号1所示的核苷酸序列，下游引物如序列号2所示的核苷酸序列，探针如序列号3所示的核苷酸序列；
用于检测ARPC5的引物和探针：所述RNA的上游引物如序列号4所示的核苷酸序列，下游引物如序列号5所示的核苷酸序列，探针如序列号6所示的核苷酸序列；
用于检测IL1B的引物和探针：所述RNA的上游引物如序列号7所示的核苷酸序列，下游引物如序列号8所示的核苷酸序列，探针如序列号9所示的核苷酸序列；
用于检测MBOAT2的引物和探针：所述RNA的上游引物如序列号10所示的核苷酸序列，下游引物如序列号11所示的核苷酸序列，探针如序列号12所示的核苷酸序列；
用于检测let-7f-2的逆转录引物、PCR引物和探针：所述的逆转录引物如序列号13所示的核苷酸序列，PCR上游引物如序列号14所示的核苷酸序列，下游引物如序列号41所示的核苷酸序列，探针如序列号15所示的核苷酸序列；
用于检测miR-106b-3p的逆转录引物、PCR引物和探针：所述的逆转录引物如序列号16所示的核苷酸序列，PCR上游引物如序列号17所示的核苷酸序列，下游引物如序列号41所示的核苷酸序列，探针如序列号18所示的核苷酸序列；
用于检测miR-125a-5p的逆转录引物、PCR引物和探针：所述的逆转录引物如序列号19所示的核苷酸序列，PCR上游引物如序列号20所示的核苷酸序列，下游引物如序列号41所示的核苷酸序列，探针如序列号21所示的核苷酸序列；
用于检测miR-30e-5p的逆转录引物、PCR引物和探针：所述的逆转录引物如序列号22所示的核苷酸序列，PCR上游引物如序列号23所示的核苷酸序列，下游引物如序列号41所示的核苷酸序列，探针如序列号24所示的核苷酸序列；
用于检测miR-3615的逆转录引物、PCR引物和探针：所述的逆转录引物如序列号25所示的核苷酸序列，PCR上游引物如序列号26所示的核苷酸序列，下游引物如序列号41所示的核苷酸序列，探针如序列号27所示的核苷酸序列；
用于检测miR-450b-5p的逆转录引物、PCR引物和探针：所述的逆转录引物如序列号28所示的核苷酸序列，PCR上游引物如序列号29所示的核苷酸序列，下游引物如序列号41所示的核苷酸序列，探针如序列号30所示的核苷酸序列；
用于检测miR-4746-5p的逆转录引物、PCR引物和探针：所述的逆转录引物如序列号31所示的核苷酸序列，PCR上游引物如序列号32所示的核苷酸序列，下游引物如序列号41所示的核苷酸序列，探针如序列号33所示的核苷酸序列；
用于检测miR-885-5p的逆转录引物、PCR引物和探针：所述的逆转录引物如序列号34所示的核苷酸序列，PCR上游引物如序列号35所示的核苷酸序列，下游引物如序列号41所示的核苷酸序列，探针如序列号36所示的核苷酸序列；
用于检测内参U6的逆转录引物、PCR引物和探针：所述U6的逆转录引物如序列号39所示的核苷酸序列，PCR上游引物如序列号37所示的核苷酸序列，下游引物如序列号38所示的核苷酸序列，探针如序列号40所示的核苷酸序列。
本发明另一方面提供一种用于肺癌诊断的装置，包括检测外泌体长RNA标志物和miRNA标志物组合的引物和探针，所述长RNA标志物包括ARPC5、MBOAT2、IL1B中的一种或多种，所述miRNA标志物包括miR-450b-5p、miR-let-7f、miR-3615、miR-885-5p、miR-106b-3p、miR-30e-5p、miR-4746-5p、miR-125a-5p中的一种或多种。
本发明另一方面提供一种用于肺癌诊断的方法，包括检测外泌体长RNA标志物和miRNA标志物组合的特异性，所述长RNA标志物包括ARPC5、MBOAT2、IL1B中的一种或多种，所述miRNA标志物包括miR-450b-5p、miR-let-7f、miR-3615、miR-885-5p、miR-106b-3p、miR-30e-5p、miR-4746-5p、miR-125a-5p中的一种或多种。
本发明提供了一种基于外泌体的无创的早期肺癌诊断的方法，在早期肺癌中具有高灵敏度及高特异性，为肺癌的早期诊断提供了重要价值。对我国肺癌的防治有很大的帮助。更进一步，其中灵敏度最高的组合可达到100％的灵敏度，特异性最高的组合可以实现96.67％的特异性，具有较好的性能。
附图说明
图1是miR-450b-5p+let-7f-2-3p+ARPC5组合检测肺癌的ROC曲线。
图2是miR-106b-3P+miR-30e-5p+MBOAT2组合检测肺癌的ROC曲线。
图3是miR-106b-3P+miR-30e-5p+miR-450b-5p+miR-885-5p+ARPC5组合检测肺癌的ROC曲线。
图4是miR-106b-3P+miR-30e-5p+miR-4746-5p+miR-885-5p+ARPC5组合检测肺癌的ROC曲线。
图5是miR-106b-3P+miR-30e-5p+miR-3615+miR-885-5p+ARPC5组合检测肺癌的ROC曲线。
图6是miR-106b-3P+miR-125a-5p+miR-3615+miR-450b-5p+IL1B组合检测肺癌的ROC曲线。
具体实施方式
细胞外囊泡(Extracellular Vesicles，EVs；以下囊泡均代表细胞外囊泡)是指从细胞膜上脱落或由细胞分泌的具有双层膜结构的囊泡状小体，直径从30-1000nm不等，胞外囊泡主要由微囊泡(MicroVesicles，MVs)和外泌体(exosomes)组成，微囊泡是细胞激活或损伤后从细胞膜脱落的小囊泡。由于细胞外囊泡独特的生物学特征，其在疾病诊断中有着重要的意义，特别是其中的外泌体。
外泌体是一种由细胞内多泡体与细胞膜融合后分泌到细胞外环境中粒径介于30～150nm的膜性小囊泡，是细胞间信息传递的重要媒介，在抗原呈递、细胞凋亡、炎症反应、肿瘤发生发展及转移过程中发挥了重要作用。其在体液中分布广泛，包括血液、唾液、尿液、乳汁和胸腹水等；包含DNA、RNA及蛋白质等多种内含物，可以作为肿瘤等多种疾病的无创诊断标志物。而miRNA则是外泌体中含量最为丰富的核酸组分，因而外泌体miRNA具备作为肺癌早期诊断的潜力。
本发明提供的试剂盒、装置和方法，以通过实验研究发现在患有早期肺癌患者的外泌体中呈现显著差异表达的长RNA与miRNA的组合作为诊断早期肺癌的标志物。
在实施方案中，诊断肺癌的标志物组合至少包含一种长RNA及一种miRNA。其中长RNA包括：ARPC5、MBOAT2、IL1B。MiRNA包括：miR-450b-5p、miR-let-7f、miR-3615、miR-885-5p、miR-106b-3p、miR-30e-5p、miR-4746-5p、miR-125a-5p。
在一些优选的实施方案中，其中较优的组合是：miR-450b-5p+let-7f-2-3p+ARPC5、miR-106b-3P+miR-30e-5p+MBOAT2、miR-106b-3P+miR-30e-5p+miR-450b-5p+miR-885-5p+ARPC5miR-106b-3P+miR-30e-5p+miR-4746-5p+miR-885-5p+ARPC5、miR-106b-3P+miR-30e-5p+miR-3615+miR-885-5p+ARPC5和miR-106b-3P+miR-125a-5p+miR-3615+miR-450b-5p+IL1B。上述组合可为肺癌的早期诊断提供更好的依据，预示疾病风险。
另外，本发明的用于肺癌诊断的试剂盒包括检测上述外泌体长RNA标志物的引物和探针。检测外泌体标志物的引物和探针包括：
用于检测内参ACTB的引物和探针：所述RNA的上游引物具体如序列号1所示的核苷酸序列，下游引物具体如序列号2所示的核苷酸序列，探针具体如序列号3所示的核苷酸序列；
用于检测ARPC5的引物和探针：所述RNA的上游引物具体如序列号4所示的核苷酸序列，下游引物具体如序列号5所示的核苷酸序列，探针具体如序列号6所示的核苷酸序列；
用于检测IL1B的引物和探针：所述RNA的上游引物具体如序列号7所示的核苷酸序列，下游引物具体如序列号8所示的核苷酸序列，探针具体如序列号9所示的核苷酸序列；
用于检测MBOAT2的引物和探针：所述RNA的上游引物具体如序列号10所示的核苷酸序列，下游引物具体如序列号11所示的核苷酸序列，探针具体如序列号12所示的核苷酸序列；
用于检测let-7f-2的逆转录引物、PCR引物和探针：所述的逆转录引物具体如序列号13所示的核苷酸序列，PCR上游引物具体如序列号14所示的核苷酸序列，下游引物具体如序列号41所示的核苷酸序列，探针具体如序列号15所示的核苷酸序列；
用于检测miR-106b-3p的逆转录引物、PCR引物和探针：所述的逆转录引物具体如序列号16所示的核苷酸序列，PCR上游引物具体如序列号17所示的核苷酸序列，下游引物具体如序列号41所示的核苷酸序列，探针具体如序列号18所示的核苷酸序列；
用于检测miR-125a-5p的逆转录引物、PCR引物和探针：所述的逆转录引物具体如序列号19所示的核苷酸序列，PCR上游引物具体如序列号20所示的核苷酸序列，下游引物具体如序列号41所示的核苷酸序列，探针具体如序列号21所示的核苷酸序列；
用于检测miR-30e-5p的逆转录引物、PCR引物和探针：所述的逆转录引物具体如序列号22所示的核苷酸序列，PCR上游引物具体如序列号23所示的核苷酸序列，下游引物具体如序列号41所示的核苷酸序列，探针具体如序列号24所示的核苷酸序列；
用于检测miR-3615的逆转录引物、PCR引物和探针：所述的逆转录引物具体如序列号25所示的核苷酸序列，PCR上游引物具体如序列号26所示的核苷酸序列，下游引物具体如序列号41所示的核苷酸序列，探针具体如序列号27所示的核苷酸序列；
用于检测miR-450b-5p的逆转录引物、PCR引物和探针：所述的逆转录引物具体如序列号28所示的核苷酸序列，PCR上游引物具体如序列号29所示的核苷酸序列，下游引物具体如序列号41所示的核苷酸序列，探针具体如序列号30所示的核苷酸序列；
用于检测miR-4746-5p的逆转录引物、PCR引物和探针：所述的逆转录引物具体如序列号31所示的核苷酸序列，PCR上游引物具体如序列号32所示的核苷酸序列，下游引物具体如序列号41所示的核苷酸序列，探针具体如序列号33所示的核苷酸序列；
用于检测miR-885-5p的逆转录引物、PCR引物和探针：所述的逆转录引物具体如序列号34所示的核苷酸序列，PCR上游引物具体如序列号35所示的核苷酸序列，下游引物具体如序列号41所示的核苷酸序列，探针具体如序列号36所示的核苷酸序列；
用于检测内参U6的逆转录引物、PCR引物和探针：所述U6的逆转录引物具体如序列号39所示的核苷酸序列，PCR上游引物具体如序列号37所示的核苷酸序列，下游引物具体如序列号38所示的核苷酸序列，探针具体如序列号40所示的核苷酸序列。引物和探针的核苷酸序列如表1所示。
表1
Figure BDA0003508208110000041
Figure BDA0003508208110000051
进一步地，外泌体来源包括血液、唾液及痰液的一种或多种。
本发明的试剂盒、装置和方法适用个体可以为肺癌高危的人群、正常个体及肺癌术后的患者。
下面结合实施案例对本发明的技术方案进行完整清晰的描述，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实例。基于本发明的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的其他实施例，都属于本发明保护的范围。
为了筛选到与结肺癌诊断相关的外泌体标志物，早期肺癌患者50例和对照各72例，取血液不少于10ml并分离血浆，用于经典超速离心方法分离血浆中的外泌体并提取RNA，得到的RNA分别进行RNA建库测序。得到的数据进行生物信息学的分析，比较早期肺癌患者及对照中差异表达的RNA。这些来自外泌体的RNA层面标志物可以用于肺癌早期诊断。
进一步的针对其中RNA标志物进应用分析，其方法所述如下：(1)采集待检测个体的体液样本(包括血液、痰液和唾液)；(2)分离体液中的外泌体；(3)利用两步法检测目标RNA表达水平；(4)使用内参基因对检测目标RNA的表达水平进行归一化；(5)将归一化后的基因表达水平代入判定模型得到输出值；(6)根据模型的输出值及判定阈值对待测个体是否为肺癌。
试剂盒包括检测外泌体长RNA标志物的PCR引物、探针、标准品及PCR的两步法检测体系。
本发明包括选用内参β-Actin(ACTB)进行长RNA的定量，以U6为内参进行miRNA定量。其中选用参照时目标RNA的定量根据检测Ct值使用定量公式2ΔΔCt计算标志物的表达水平。得到目标RNA表达水平后，使用ROC特征曲线和AUC来评估单个RNA或联合多个RNA检测肺癌的准确度。
实施例1基于高通量测序筛选与早期肺癌相关的外泌体mRNA及LncRNA标志物
为了筛选到与早期肺癌诊断相关的外泌体标志物，早期肺癌诊断患者72和对照各50例，取血液不少于10ml并分离血浆，用于经典超速离心方法分离血浆中的外泌体并采用qiagen miRNeasy mini kit提取RNA，得到的RNA进行微量去核糖体链特异性RNA建库测序及small RNA建库测序。得到的数据进行生物信息学的分析，比较早期肺癌患者及对照中差异表达的长RNA及miRNA，得到显著差异的长RNA如miRNA下表2所示。这些来自外泌体的RNA层面标志物可以用于肺癌早期诊断。
表2
RNA类型 ID Pvalue log2FC regulated
mRNA MBOAT2 4.23E-05 1.023772461 up
mRNA IL1B 0.000162055 1.050636789 up
mRNA ARPC5 0.000871259 1.066858402 up
miRNA hsa-let-7f-2-3p 0.00027664 -0.446890593 down
miRNA hsa-miR-450b-5p 0.000293888 -0.402238286 down
miRNA hsa-miR-106b-3p 0.001429894 0.189007463 up
miRNA hsa-miR-885-5p 0.001455856 -0.589409694 down
miRNA hsa-miR-30e-5p 0.001592304 -0.329476279 down
miRNA hsa-miR-3615 0.00283095 0.419677035 up
miRNA hsa-miR-4746-5p 0.003524579 0.315578167 up
miRNA hsa-miR-125a-5p 0.004298578 -0.492462437 down
实施例2基于荧光定量PCR平台miRNA检测体系
1、miRNA逆转录反应体系
miRNA反转录试剂、酶和oligdT从TAKARA采购，标准品从上海英潍捷基合成，特异性反转的引物由苏州泓迅合成。采用20ul的反转录体系，如下表3所示。
表3
Figure BDA0003508208110000071
2、PCR反应体系
PCR反应混合液从TAKARA采购，上游引物、探针即通用下游引物由苏州泓迅合成、荧光定量PCR仪为ABI7500。PCR反应体系，如下表4所示：
表4
Figure BDA0003508208110000072
PCR程序为95℃10min，(95℃15s；55℃30s)15个循环不采集荧光，(95℃15s；55℃30s)35个循环采集荧光。
实施例3基于荧光定量PCR平台mRNA及LncRNA检测体系
1、mRNA及LncRNA反转录
采用takara公司的PrimeScriptTM RT reagent Kit(Perfect Real Time)和Premix Ex TaqTM(Probe qPCR)试剂盒进行反转录和qPCR检测。
按下列组份配制反转录反应体系(反应液配制在冰上进行)，然后放入PCR仪进行反应，反应条件为37℃60min，85℃5s，12℃∞，反转录结束后加入50ulDEPC-H2O稀释,取3ul作为模板，进行PCR反应。反转录反应体系如下表5所示。
表5
Figure BDA0003508208110000081
2、mRNA及LncRNA qPCR
按下列组分配制qPCR反应体系(反应液配制在冰上进行)，设置无模板对照作为阴性对照。然后放入实时荧光PCR仪(ABI7500)按如下反应条件进行扩增检测。qPCR反应体系如下表6所示，qPCR反应条件如下表7所示。
表6
Figure BDA0003508208110000082
表7
Figure BDA0003508208110000083
实施例4单标志物肺癌早期诊断检测效果评估
1、样本采集
收集经医院确诊的早期(I期和II期)肺结节肺癌患者，良性肺结节病人、健康人等对照样本的血液10ml，并分离成血浆。
2、外泌体RNA提取
采用超速离心或Echobiotech(北京恩泽康泰)的Exosupur进行血浆外泌体分离，分离后的外泌体用Qiagen miReasy mini kit试剂盒提取外泌体中的长RNA，并利用Agilent 2100检测RNA浓度和质量，记录RNA浓度。
3、RNA两步法检测体系
采用实施例1中基于PCR平台mRNA的两步法检测体系，对早期肺癌病人30例和30例对照样本(健康人和良性结节)的血浆外泌体mRNA和LncRNA进行检测，检测目标长RNA的Ct值，根据Ct值和相对定量公式计算相对表达量。
4、外泌体RNA单标志物诊断早期肺癌性能评估
如下表所示，对早期肺癌病人30例和30例对照样本(健康人和良性病变)的血浆外泌体，检测目标基因的Ct值，其中长RNA以内参β-Actin为参照，miRNA以内参U6为参照；根据Ct值，得出RNA的相对表达水平。使用相对定量公式值，计算联合标志物相对表达量的倍数变化，进而得出RNA相对表达量。对检测结果采用R语言进行统计分析。单个标志物的性能评估如下表8，其中miR-450b-5p、miR-3615具有较好的灵敏度，let-7f-2-3p具有良好的特异性。
表8
Figure BDA0003508208110000091
实施例5长RNA与miRNA组合肺癌早期诊断效果评估
1、三标志物组合性能评估
按照实施例3中的方法计算每个长RNA的相对表达量，利用逻辑回归对三个标志物组合进行训练，得到的三标志物组合AUC在0.76以上的组合如下表9所示。其中miR-450b-5p+let-7f-2-3p+ARPC5组合性能最优，准确性均为76.67％，其AUC曲线分别如图1所示；miR-106b-3P+miR-30e-5p+MBOAT2具有较好的特异性(80％)，其AUC曲线如下图1所示。
表9
Figure BDA0003508208110000101
2、五标志物组合性能评估
按照实施例3中的方法计算每个长RNA的相对表达量，利用逻辑回归对五个标志物组合进行训练，得到的五标志物组合AUC在0.85以上的组合如下表10所示。其中miR-106b-3P+miR-30e-5p+miR-450b-5p+miR-885-5p+ARPC5和miR-106b-3P+miR-30e-5p+miR-4746-5p+miR-885-5p+ARPC5等两个组合具有良好的灵敏度，分别为93.33％和100％，其AUC曲线如图3、图4；miR-106b-3P+miR-30e-5p+miR-3615+miR-885-5p+ARPC5和miR-106b-3P+miR-125a-5p+miR-3615+miR-450b-5p+IL1B具有良好的特异性分别为90％和96.67％，其AUC曲线如图5、图6。
表10
Figure BDA0003508208110000102
通过以上数据可以看出，本发明的基于外泌体的无创的早期肺癌诊断的方法，在早期肺癌中具有高灵敏度及高特异性，为肺癌的早期诊断提供了重要价值。对我国肺癌的防治有很大的帮助。其中灵敏度最高的组合可达到100％的灵敏度，特异性最高的组合可以实现96.67％的特异性，具有较好的性能。
以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为所述的具体实施方式。显然，根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。
序列表
<110> 中国医学科学院肿瘤医院
<120> 用于肺癌诊断的试剂盒、装置及方法
<130> 2000003
<160> 41
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cctcgccttt gccgatcc 18
<210> 2
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
catgcccacc atcacgc 17
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
acccgccgcc agctcacca 19
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cgaggtggac tcctgcct 18
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ctgcccggtc cttcactg 18
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
actcttggtg ttgatagggg ggttc 25
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gccctaaaca gatgaagtgc tc 22
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gaagcccttg ctgtagtggt 20
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tctgccctct ggatggcggc at 22
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
tctgctgatt tttcaggccc a 21
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gcatgcgcct tacagctaaa 20
<210> 12
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tggcttgcga aattcatgat gggatgt 27
<210> 13
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgacggaaag 50
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
agcgcctata cagtctactg t 21
<210> 15
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
tcgcactgga tacgacggaa agac 24
<210> 16
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgacgcagca 50
<210> 17
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
accgcactgt gggtact 17
<210> 18
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
tcgcactgga tacgacgcag ca 22
<210> 19
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgactcacag 50
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
cgtccctgag accctttaac 20
<210> 21
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
tcgcactgga tacgactcac aggt 24
<210> 22
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgaccttcca 50
<210> 23
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
accgctgtaa acatccttga c 21
<210> 24
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
tcgcactgga tacgaccttc ca 22
<210> 25
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgacgagccg 50
<210> 26
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
cctctctcgg ctcctcg 17
<210> 27
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
tcgcactgga tacgacgagc cg 22
<210> 28
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgactattca 50
<210> 29
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
tccgcttttg caatatgttc c 21
<210> 30
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
ttcgcactgg atacgactat tcagga 26
<210> 31
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgactctgca 50
<210> 32
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
ccggtcccag gagaacc 17
<210> 33
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
tcgcactgga tacgactctg ca 22
<210> 34
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgacagaggc 50
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
acgctccatt acactaccct 20
<210> 36
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
tcgcactgga tacgacagag gc 22
<210> 37
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
ctcgcttcgg cagcaca 17
<210> 38
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
aacgcttcac gaatttgcgt 20
<210> 39
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
aacgcttcac gaatttgcgt 20
<210> 40
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
agaagattag catggcccct gcgca 25
<210> 41
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
gtgcagggtc cgaggt 16

Claims (4)

1.一种检测外泌体长RNA标志物和miRNA标志物的引物和探针在制备肺癌诊断试剂盒中的应用，其特征在于，所述标志物为miR-3615、ARPC5和MBOAT2三者的组合。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，外泌体来源包括血液、唾液及痰液的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述引物和探针包括：
用于检测ARPC5的引物和探针：所述RNA的上游引物如序列号4所示的核苷酸序列，下游引物如序列号5所示的核苷酸序列，探针如序列号6所示的核苷酸序列；
用于检测MBOAT2的引物和探针：所述RNA的上游引物如序列号10所示的核苷酸序列，下游引物如序列号11所示的核苷酸序列，探针如序列号12所示的核苷酸序列；
用于检测miR-3615的逆转录引物、PCR引物和探针：所述的逆转录引物如序列号25所示的核苷酸序列，PCR上游引物如序列号26所示的核苷酸序列，下游引物如序列号41所示的核苷酸序列，探针如序列号27所示的核苷酸序列。
4.一种检测外泌体长RNA标志物和miRNA标志物的引物和探针在制备肺癌诊断装置中的应用，其特征在于，所述标志物为miR-3615、ARPC5和MBOAT2三者的组合。
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