WO2024096467A1 - 종양주변 정상조직을 이용한 대장암 예후 예측용 마커 - Google Patents

종양주변 정상조직을 이용한 대장암 예후 예측용 마커 Download PDF

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WO2024096467A1
WO2024096467A1 PCT/KR2023/016964 KR2023016964W WO2024096467A1 WO 2024096467 A1 WO2024096467 A1 WO 2024096467A1 KR 2023016964 W KR2023016964 W KR 2023016964W WO 2024096467 A1 WO2024096467 A1 WO 2024096467A1
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WO
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gene
colon cancer
agent
expression level
predicting
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Application number
PCT/KR2023/016964
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English (en)
French (fr)
Inventor
박경희
최지혜
방영학
박웅양
김영준
이홍석
이진영
심혜란
Original Assignee
사회복지법인 삼성생명공익재단
연세대학교 산학협력단
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer

Definitions

  • This invention was made under project number 1711156086 under the support of the Ministry of Science and ICT, the research management agency of the project is the National Research Foundation of Korea, the research project name is "Bio and Medical Technology Development Project”, and the research project name is "Colorectal Cancer Single Cell Transduction Project” “Development of a cadaver-based prognosis-treatment prediction biomarker”, the host institution is Samsung Seoul Hospital, and the study period is 2022.01.01 to 2022.12.31.
  • the present invention relates to a marker for predicting the prognosis of colon cancer using normal tissue surrounding a tumor, and more specifically, predicting the prognosis of colon cancer including an agent that measures the expression level of a gene from normal tissue surrounding a tumor in a patient with locally advanced colon cancer. It relates to a composition, a kit, and a method of providing information on colorectal cancer prognosis prediction using the same.
  • Colon cancer is the most commonly occurring cancer in Korea (12.6% as of 2020), and according to domestic literature, in the case of locally advanced colon cancer, stages 2 and 3, approximately 20% to 40% of patients will develop colon cancer within 5 years. Recurrence has been reported (5-year disease-free survival rate; stage 2: 79.8%, stage 3: 63.3%, 5-year survival rate; stage 2: 88.4%, stage 3: 74.4%).
  • the present inventors have made research efforts to develop a biomarker for predicting the prognosis of colorectal cancer with accurate and improved performance.
  • the normal tissue surrounding the tumor obtained during surgery is targeted at patients with locally advanced colorectal cancer who are eligible for surgery.
  • a model was established that can accurately predict whether recurrence will occur during the future treatment process.
  • the purpose of the present invention is to provide a composition for predicting colon cancer prognosis, which includes an agent for measuring the expression level of genes from normal tissue surrounding the tumor of patients with locally advanced colon cancer.
  • Another object of the present invention is to provide a kit for predicting colon cancer prognosis, which includes an agent for measuring the expression level of genes from normal tissue surrounding the tumor of patients with locally advanced colon cancer.
  • Another object of the present invention is to provide an information provision method for predicting colon cancer prognosis, which includes a measurement step of measuring the expression level of a gene from normal tissue surrounding the tumor of a patient with locally advanced colon cancer.
  • Another object of the present invention is to provide a use for predicting colon cancer prognosis using an agent that measures the expression level of genes from normal tissue surrounding the tumor of patients with locally advanced colon cancer.
  • the present invention relates to a composition for predicting the prognosis of colorectal cancer using normal tissue surrounding a tumor.
  • the composition and kit for predicting the prognosis of colorectal cancer include an agent for measuring the expression level of genes from normal tissue surrounding the tumor.
  • the kit is an existing clinical marker, MSI. It can predict the prognosis of colon cancer patients more accurately than markers.
  • the present inventors measure the expression level of the marker gene for predicting colorectal cancer prognosis according to the present invention, and can predict recurrence during the patient's post-surgery treatment with higher accuracy than the MSI marker, which is an existing clinical marker, Accordingly, the present invention was completed by confirming that a customized treatment method suitable for the patient could be selected.
  • composition for predicting colon cancer prognosis which includes an agent for measuring the expression level of the CXCL8 gene from normal tissue surrounding the tumor of a patient with locally advanced colon cancer.
  • the term “locally advanced colorectal cancer patient” in this specification refers to a colorectal cancer patient for whom surgery is possible and may refer to a patient with stage 2 or 3 disease, but is not limited thereto.
  • the subject of the “patient” is a patient with locally advanced colon cancer, and may refer to a subject for whom the prognosis of colon cancer is to be predicted, and may be a mammal including a human, for example, a human or a monkey.
  • Animals that can develop locally advanced colorectal cancer, such as cattle, horses, sheep, pigs, cats, dogs, mice, rats, rabbits, or guinea pigs, can be included without limitation.
  • normal tissue around the tumor in this specification refers to the fact that during surgery for patients with locally advanced colon cancer, the adjacent colon, including the tumor, is resected at a sufficient safe distance to prevent cancer from remaining in accordance with surgical principles, and the adjacent colon, which is the path through which the cancer spreads, is also used in this specification. If lymph nodes and blood vessels are also resected, tissue surrounding the tumor can be secured at the same time as the tumor tissue.
  • the tissue removed surgically refers to tissue that is judged to be microscopically normal under the judgment of a pathologist. It may be.
  • normal tissue surrounding the tumor is tissue removed through all types of curative colon cancer surgery such as right colectomy, transverse colectomy, and left colectomy in accordance with the principle of ensuring safety, and is examined under a microscope at the judgment of a pathologist. It may mean an organization that is judged to be normal.
  • the term “surgery for patients with locally advanced colon cancer” in this specification may refer to a full range of curative colon cancer surgeries, such as right colectomy, transverse colectomy, and left colectomy, but is not limited thereto.
  • the CXCL8 gene may refer to the C-X-C motif chemokine ligand 8 or Interleukin 8 gene.
  • marker in this specification may refer to a gene that can predict the prognosis of patients with locally advanced colon cancer, but is not limited thereto.
  • agent for measuring the expression level of a gene refers to an agent used in a method for measuring the expression level of a target gene contained in normal tissue surrounding the tumor.
  • the agent for measuring the expression level of a gene may be a gene expression detection agent known in the art, for example, polymerase chain reaction (PCR), reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR), competitive reverse transcription polymerase chain reaction.
  • RRBS Reduced representation bisulfite sequencing
  • MBDseq Methylated DNA binding domain sequencing
  • prognosis in this specification refers to the act of predicting in advance the course of a disease and the outcome of death or survival. More specifically, prognosis or prognosis prediction refers to the fact that the course of a disease may vary depending on the patient's physiological or environmental condition, and all activities that predict the course of the disease before and after treatment by comprehensively considering the patient's condition. It can be interpreted to mean. For the purpose of the present invention, prognosis can be interpreted as the act of predicting the disease-free survival rate or survival rate of a patient with colon cancer by predicting the course of the disease and recurrence after surgery for locally advanced colon cancer, but is not limited to this.
  • predicting a “good prognosis” indicates a high level of disease-free survival or survival rate of a colon cancer patient, an improved level of indicators related to colon cancer, or a low level of possibility of recurrence, which indicates the possibility that the colon cancer patient will be cured.
  • This can mean that the prognosis is high, and predicting a “poor prognosis” can mean that the disease-free survival rate or survival rate of colon cancer patients is low, indicators related to colon cancer are at a worsening level, or the possibility of recurrence is high. there is.
  • MSI Melatonin shortening indicator
  • DFS disease-free survival
  • survival rate in this specification refers to the proportion of cancer patients who survive a certain period of time after starting treatment. For example, 1-year survival rate or 5-year survival rate may be used.
  • all survival in this specification refers to a number tracking the period from the start of treatment to the moment of death of a cancer patient, and is generally based on the median value, not the average value, due to large patient variation. It can mean a value measured by .
  • one type of gene expression marker (CXCL8 gene) was evaluated in the SMC cohort to determine the accuracy of recurrence prediction for patients with locally advanced colon cancer, and as a result, recurrence was predicted with AUC>0.7. It was confirmed that the performance was excellent.
  • the agent may further include an agent for measuring the expression level of the IGF2 gene.
  • the IGF2 gene may refer to the insulin like growth factor 2 gene.
  • the two types of gene expression markers (CXCL8 + IGF2 gene) were evaluated in the SMC cohort to determine the accuracy of recurrence prediction for patients with locally advanced colorectal cancer, and as a result, AUC>0.7. It was confirmed that recurrence prediction performance was excellent.
  • the agent may further include an agent for measuring the expression level of the KRT17 gene.
  • the KRT17 gene may refer to the keratin 17 gene.
  • the three types of gene expression markers (CXCL8 + KRT17 + IGF2 gene) were evaluated in the SMC cohort to determine the accuracy of predicting recurrence for patients with locally advanced colorectal cancer. As a result, AUC> It was confirmed that the recurrence prediction performance was excellent at 0.7.
  • the agent further comprises an agent for measuring the expression level of COL10A1, NOTUM, CST1, TCN1, WNT2, PPBP, COL11A1, MMP7, CLDN2, REG3A, SLCO1B3, S100A2, HCAR3, and SPP1 genes. You can.
  • the COL10A1 gene may refer to a collagen type
  • the NOTUM gene may refer to the notum, palmitoleoyl-protein carboxylesterase gene.
  • the CST1 gene may refer to the cystatin SN gene.
  • the TCN1 gene may refer to the transcobalamin 1 gene.
  • the WNT2 gene may refer to the Wnt family member 2 gene.
  • the PPBP gene may refer to a pro-platelet basic protein gene.
  • the COL11A1 gene may refer to a collagen type XI alpha 1 chain gene.
  • the MMP7 gene may refer to the matrix metallopeptidase 7 gene.
  • the CLDN2 gene may refer to the claudin 2 gene.
  • the REG3A gene may refer to the regenerating family member 3 alpha gene.
  • the SLCO1B3 gene may refer to the solute carrier organic anion transporter family member 1B3 gene.
  • the S100A2 gene may refer to the S100 calcium binding protein A2 gene.
  • the HCAR3 gene may refer to the hydroxycarboxylic acid receptor 3 gene.
  • the SPP1 gene may refer to the secreted phosphoprotein 1 gene.
  • the 17 gene expression markers (CXCL8 + COL10A1 + NOTUM + CST1 + TCN1 + WNT2 + PPBP + COL11A1 + MMP7 + CLDN2 + REG3A + SLCO1B3 + S100A2 + HCAR3 + KRT17 + IGF2 + SPP1 gene)
  • CXCL8 + COL10A1 + NOTUM + CST1 + TCN1 + WNT2 + PPBP + COL11A1 + MMP7 + CLDN2 + REG3A + SLCO1B3 + S100A2 + HCAR3 + KRT17 + IGF2 + SPP1 gene In order to determine the accuracy of recurrence prediction for patients with locally advanced colorectal cancer, this was evaluated in the SMC cohort and TCGA cohort, respectively. As a result, it was confirmed that the recurrence prediction performance was excellent with AUC>0.7 in all cases.
  • the agent regulates the expression levels of COL10A1, NOTUM, REG1B, KRT6B, CST1, TCN1, KRT23, WNT2, PPBP, COL11A1, MMP7, CLDN2, REG3A, SLCO1B3, S100A2, CXCL5, HCAR3, KRT17, and DSG3 genes. It may additionally include an agent that measures .
  • the REG1B gene may refer to a regenerating family member 1 beta gene.
  • the KRT6B gene may refer to the keratin 6B gene.
  • the KRT23 gene may refer to the keratin 23 gene.
  • the CXCL5 gene may refer to the C-X-C motif chemokine ligand 5 gene.
  • the DSG3 gene may refer to the desmoglein 3 gene.
  • the 20 gene expression markers (CXCL8 + COL10A1 + NOTUM + REG1B + KRT6B + CST1 + TCN1 + KRT23 + WNT2 + PPBP + COL11A1 + MMP7 + CLDN2 + REG3A + SLCO1B3 + S100A2 + CXCL5 + HCAR3 + KRT17 + DSG3 gene) was evaluated in the SMC cohort, Yonsei cohort, and TCGA cohort to determine the accuracy of recurrence prediction for patients with locally advanced colorectal cancer. As a result, all AUC>0.7 showed excellent recurrence prediction performance. Confirmed.
  • the agent for measuring the expression level of the gene consists of a primer, a probe, an antisense oligo nucleotide, and an aptamer that specifically binds to the gene. It may be one or more types selected from the group, but is not limited thereto.
  • primer in this specification includes any combination of primer pairs consisting of forward and reverse primers that recognize (or recognize) the target gene sequence, but preferably provides analysis results with specificity and sensitivity. It may mean a pair of primers. High specificity can be granted when the nucleic acid sequence of the primer is a sequence that is inconsistent with the non-target sequence present in the sample, so that the primer amplifies only the target gene sequence containing the complementary primer binding site and does not cause non-specific amplification. .
  • probe in this specification refers to a substance that can specifically bind to a target substance to be detected in a sample, and a substance that can specifically confirm the presence of the target substance in the sample through said binding. It could mean something.
  • the type of probe molecule is not limited as it is a material commonly used in the art, but is preferably PNA (peptide nucleic acid), LNA (locked nucleic acid), peptide, polypeptide, protein, RNA or DNA.
  • the probe is a biomaterial that is derived from or similar to living organisms or includes those produced in vitro, such as enzymes, proteins, antibodies, microorganisms, animal and plant cells and organs, nerve cells, DNA, and RNA.
  • DNA includes cDNA, genomic DNA, and oligonucleotides
  • RNA includes genomic RNA, mRNA, and oligonucleotides
  • proteins include antibodies, antigens, enzymes, and peptides.
  • antisense oligo nucleotide in this specification refers to DNA or RNA or derivatives thereof containing a nucleic acid sequence complementary to the sequence of a specific mRNA, which binds to the complementary sequence in the mRNA and converts the mRNA into a protein. It acts to inhibit translation.
  • the antisense oligonucleotide sequence may refer to a DNA or RNA sequence that is complementary to the mRNA of the genes and can bind to the mRNA.
  • the length of the antisense oligonucleotide may be 6 to 100 bases, preferably 8 to 60 bases, and more preferably 10 to 40 bases, but is not limited thereto.
  • the antisense oligonucleotide can be synthesized in vitro using a conventional method and administered in vivo, or the antisense oligonucleotide can be synthesized in vivo.
  • One example of synthesizing antisense oligonucleotides in vitro would be using RNA polymerase I.
  • One example of allowing antisense RNA to be synthesized in vivo would be to allow antisense RNA to be transcribed using a vector with the origin of the multiple cloning site (MCS) in the opposite direction. It may be desirable to prevent the antisense RNA from being translated into a peptide sequence by having a translation stop codon within the sequence.
  • MCS multiple cloning site
  • aptamer in this specification refers to a single-stranded nucleic acid (DNA, RNA, or modified nucleic acid) that has a stable tertiary structure and binds to the target molecule with high affinity and specificity. It could be.
  • the aptamer may refer to an aptamer that specifically binds to the marker gene, and the aptamer can be easily produced using techniques well known in the art.
  • the primers, probes, antisense oligonucleotides, and aptamers are not limited to specific sequences as long as they can detect the gene or its mRNA.
  • gene expression level can be measured using primer pairs, probes, antisense oligonucleotides, and aptamers that specifically bind to the mRNA of the gene, and the agent for measuring the expression of the mRNA is described above. It may be selected from the group consisting of gene-specific primer pairs, probes, antisense oligonucleotides, aptamers, and combinations thereof. That is, detection of nucleic acid may be performed by an amplification reaction using one or more oligonucleotide primers that bind complementary to a nucleic acid molecule encoding a gene or a transcript of the nucleic acid molecule, but is not limited thereto.
  • detection of mRNA using primers can be performed by amplifying the gene sequence using an amplification method such as PCR and then confirming amplification using a method known in the art, such as polymerase chain reaction (PCR). , reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR), competitive reverse transcription polymerase chain reaction (competitive RT-PCR), real time quantitative RT-PCR, multiplex reverse transcription polymerase chain reaction (Multi- plex RT-PCR, real time PCR, RNase protection method, Northern blotting, DNA chip technology assay, methylated DNA binding domain sequencing It may be measured by one or more methods selected from the group consisting of (MBDseq: Methylated DNA binding domain sequencing) analysis method and RRBS (Reduced representation bisulfite sequencing) analysis method, but is not limited thereto.
  • MBDseq Methylated DNA binding domain sequencing
  • RRBS Reduced representation bisulfite sequencing
  • gene expression level in this specification may be used interchangeably with “gene expression level.”
  • kits for predicting colon cancer prognosis which includes an agent for measuring the expression level of the CXCL8 gene from normal tissue surrounding the tumor of a patient with locally advanced colon cancer.
  • the kit for predicting prognosis may be composed of one or more different component compositions, solutions, or devices suitable for the analysis method, and may include a reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) kit, real-time polymerase chain reaction ( It may be a qPCR) kit or a DNA chip (DNA chip) kit, but is not limited thereto.
  • RT-PCR reverse transcription polymerase chain reaction
  • qPCR real-time polymerase chain reaction
  • DNA chip DNA chip
  • a reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) kit contains, in addition to each primer pair specific for a marker gene, a test tube or other suitable container, reaction buffer, deoxynucleotides (dNTPs), and Taq-polymerase ( It may include, but is not limited to, enzymes such as Taq-polymerase and reverse transcriptase, DNase, RNase inhibitor, DEPC-water, sterilized water, etc.
  • dNTPs deoxynucleotides
  • Taq-polymerase It may include, but is not limited to, enzymes such as Taq-polymerase and reverse transcriptase, DNase, RNase inhibitor, DEPC-water, sterilized water, etc.
  • a kit for DNA chip analysis may include a substrate to which cDNA corresponding to a gene or its fragment is attached as a probe, reagents, agents, and enzymes for producing a fluorescent marker probe, and the substrate may include a quantitative control gene or It may include cDNA corresponding to its fragment, but is not limited thereto.
  • the kit may include a container, instructions, and a preparation for measuring the expression level of the gene.
  • the container may serve to package the measurement agent, and may also serve to store and secure the measurement agent.
  • the material of the container may take the form of, for example, a bottle, tub, sachet, envelope, tube, ampoule, etc., which are partially or entirely made of plastic, It can be formed from glass, paper, foil, wax, etc.
  • the kit may include an external package, and the external package may include, but is not limited to, instructions for use of the components.
  • the agent may further include an agent for measuring the expression level of the IGF2 gene.
  • the agent may further include an agent for measuring the expression level of the KRT17 gene.
  • the agent further comprises an agent for measuring the expression level of COL10A1, NOTUM, CST1, TCN1, WNT2, PPBP, COL11A1, MMP7, CLDN2, REG3A, SLCO1B3, S100A2, HCAR3, and SPP1 genes. You can.
  • the agent regulates the expression levels of COL10A1, NOTUM, REG1B, KRT6B, CST1, TCN1, KRT23, WNT2, PPBP, COL11A1, MMP7, CLDN2, REG3A, SLCO1B3, S100A2, CXCL5, HCAR3, KRT17, and DSG3 genes. It may additionally include an agent that measures .
  • the agent for measuring the expression level of the gene consists of a primer, a probe, an antisense oligo nucleotide, and an aptamer that specifically binds to the gene. It may be one or more types selected from the group, but is not limited thereto.
  • Another aspect of the present invention relates to a method of providing information for predicting the prognosis of colon cancer, including a measurement step of measuring the expression level of the CXCL8 gene from normal tissue surrounding the tumor of a patient with locally advanced colon cancer.
  • the expression level of one gene expression marker (CXCL8 gene) was measured and evaluated in the SMC cohort to determine the accuracy of recurrence prediction for patients with locally advanced colorectal cancer. As a result, AUC> It was confirmed that the recurrence prediction performance was excellent at 0.7.
  • the expression level of the gene is determined by polymerase chain reaction (PCR), reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR), competitive reverse transcription polymerase chain reaction (competitive RT-PCR), real-time reverse transcription polymerase chain reaction ( real time quantitative RT-PCR, multiplex reverse transcription polymerase chain reaction (Multi-plex RT-PCR), real time polymerase chain reaction (real time PCR), RNase protection method, Northern blotting ), DNA chip technology assay, Methylated DNA binding domain sequencing (MBDseq) analysis method, and Reduced representation bisulfite sequencing (RRBS) analysis method. It can be measured by a method that measures the expression level of one or more genes, but is not limited to this.
  • PCR polymerase chain reaction
  • RT-PCR reverse transcription polymerase chain reaction
  • competitive RT-PCR competitive reverse transcription polymerase chain reaction
  • real-time reverse transcription polymerase chain reaction real time quantitative RT-PCR, multiplex reverse transcription polymerase chain reaction (Multi-plex RT-PCR), real time polymerase
  • the measurement step may additionally measure the expression level of the IGF2 gene.
  • the expression levels of the two gene expression markers (CXCL8 + IGF2 gene) were measured and evaluated in the SMC cohort to determine the accuracy of recurrence prediction for patients with locally advanced colorectal cancer, and the results It was confirmed that recurrence prediction performance was excellent with AUC>0.7.
  • the measurement step may be to additionally measure the expression level of the KRT17 gene.
  • the expression levels of the three gene expression markers were measured and evaluated in the SMC cohort to determine the accuracy of recurrence prediction for patients with locally advanced colorectal cancer, As a result, it was confirmed that recurrence prediction performance was excellent with AUC>0.7.
  • the measurement step may be to additionally measure the expression levels of the COL10A1, NOTUM, CST1, TCN1, WNT2, PPBP, COL11A1, MMP7, CLDN2, REG3A, SLCO1B3, S100A2, HCAR3, and SPP1 genes.
  • the 17 gene expression markers CXCL8 + COL10A1 + NOTUM + CST1 + TCN1 + WNT2 + PPBP + COL11A1 + MMP7 + CLDN2 + REG3A + SLCO1B3 + S100A2 + HCAR3 + KRT17 + IGF2 + SPP1 gene
  • the measurement step is the expression of COL10A1, NOTUM, REG1B, KRT6B, CST1, TCN1, KRT23, WNT2, PPBP, COL11A1, MMP7, CLDN2, REG3A, SLCO1B3, S100A2, CXCL5, HCAR3, KRT17, and DSG3 genes. It may be an additional measure of level.
  • the 20 gene expression markers (CXCL8 + COL10A1 + NOTUM + REG1B + KRT6B + CST1 + TCN1 + KRT23 + WNT2 + PPBP + COL11A1 + MMP7 + CLDN2 + REG3A + SLCO1B3 + S100A2 + CXCL5 + HCAR3 + KRT17 + DSG3 gene) was measured in the SMC cohort, Yonsei cohort, and TCGA cohort to determine the accuracy of recurrence prediction for patients with locally advanced colorectal cancer. As a result, recurrence prediction performance was all AUC>0.7. This was confirmed to be excellent.
  • the measurement step is one selected from the group consisting of a primer, a probe, an antisense oligo nucleotide, and an aptamer that specifically binds to the gene.
  • the expression level of the gene may be measured using the above, but is not limited to this.
  • the step of calculating the possibility of recurrence of colon cancer using the expression level of the gene measured after the measurement step may be additionally included, but is not limited to this.
  • probability of recurrence in this specification may mean “predicted probability of recurrence” calculated using the expression level of the marker gene for predicting colorectal cancer prognosis according to the present invention, and may be used interchangeably with “predicted probability of recurrence”. You can.
  • the step of comparing the calculated recurrence possibility with a reference value may be additionally included after the step of calculating the recurrence possibility, but is not limited thereto.
  • the predicted probability of recurrence is calculated using the marker for predicting colon cancer prognosis according to the present invention, and based on this, patients with locally advanced colon cancer are divided into high risk / low risk group. Separately, it was confirmed that the prognosis of patients classified as high-risk group was worse than that of patients classified as low-risk group, and it was confirmed that there was a statistically significant difference in survival probability, so the marker for predicting colorectal cancer prognosis according to the present invention was confirmed.
  • the marker for predicting colorectal cancer prognosis according to the present invention was confirmed.
  • the present invention relates to a composition for predicting the prognosis of colorectal cancer using normal tissue surrounding a tumor.
  • the composition and kit for predicting the prognosis of colorectal cancer include an agent for measuring the expression level of genes from normal tissue surrounding the tumor.
  • the kit is an existing clinical marker, MSI. It has the effect of predicting the prognosis of colon cancer patients more accurately than markers.
  • the expression level of the marker gene for predicting colorectal cancer prognosis according to the present invention, it is possible to predict recurrence during the patient's post-surgery treatment process more accurately than the MSI marker, which is an existing clinical marker, with higher accuracy, and thus, the patient You can choose a customized treatment method that suits you.
  • Figure 1 shows the tumor periphery using ssGSEA (single sample gene set enrichment analysis), which is a method of expressing the expression level of 17 gene expression markers (model number 23) in the SMC cohort as one score, according to an embodiment of the present invention.
  • ssGSEA single sample gene set enrichment analysis
  • a score is assigned to each sample of normal tissue, and the results of the relapse-free survival analysis based on the average value of these scores are shown in a Kaplan-Meier plot.
  • Figure 2 shows the recurrence prediction performance of MSI markers, which are existing clinical markers, in patients with locally advanced colon cancer in terms of ROC (Receiver Operating Characteristic) curve and AUC (area under the curve) values, according to an embodiment of the present invention.
  • ROC Receiveiver Operating Characteristic
  • Figure 3 shows the recurrence prediction performance of one type of gene expression marker (model number 1) measured in the SMC cohort in patients with locally advanced colorectal cancer, according to an embodiment of the present invention, using ROC (Receiver Operating Characteristic) curve and AUC (under the curve). area) is expressed as a value.
  • ROC Receiveiver Operating Characteristic
  • Figure 4 shows the recurrence prediction performance of two types of gene expression markers (model number 6) measured in the SMC cohort in patients with locally advanced colorectal cancer, according to an embodiment of the present invention, using ROC (Receiver Operating Characteristic) curve and AUC (under the curve). area) is expressed as a value.
  • ROC Receiveiver Operating Characteristic
  • Figure 5 shows the recurrence prediction performance of three types of gene expression markers (model number 10) measured in the SMC cohort in patients with locally advanced colorectal cancer, according to an embodiment of the present invention, using ROC (Receiver Operating Characteristic) curve and AUC (under the curve). area) is expressed as a value.
  • ROC Receiveiver Operating Characteristic
  • Figure 6 shows the recurrence prediction performance of 17 types of gene expression markers (model number 23) measured in the SMC cohort in patients with locally advanced colorectal cancer, according to an embodiment of the present invention, using ROC (Receiver Operating Characteristic) curve and AUC (under the curve). area) is expressed as a value.
  • ROC Receiveiver Operating Characteristic
  • Figure 7 shows the recurrence prediction performance of 20 types of gene expression markers (model number 30) measured in the SMC cohort in patients with locally advanced colorectal cancer, according to an embodiment of the present invention, using ROC (Receiver Operating Characteristic) curve and AUC (under the curve). area) is expressed as a value.
  • ROC Receiveiver Operating Characteristic
  • Figure 8 shows the tumor periphery using ssGSEA (single sample gene set enrichment analysis), which is a method of expressing the expression level of 20 gene expression markers (model number 30) in the SMC cohort as one score, according to an embodiment of the present invention.
  • ssGSEA single sample gene set enrichment analysis
  • Figure 9 shows the recurrence prediction performance of 20 types of gene expression markers (model number 30) measured in the Yonsei cohort in patients with locally advanced colorectal cancer, according to an embodiment of the present invention, using ROC (Receiver Operating Characteristic) curve and AUC (under the curve). area) is expressed as a value.
  • ROC Receiveiver Operating Characteristic
  • Figure 10 shows the ROC (Receiver Operating Characteristic) prediction performance of recurrence in patients with locally advanced colorectal cancer of 20 types of gene expression markers (model number 30) measured in the TCGA (The Cancer Genome Atlas) cohort, according to an embodiment of the present invention. It is expressed as curve and AUC (area under the curve) values.
  • Figure 11 shows the tumor periphery using ssGSEA (single sample gene set enrichment analysis), which is a method of expressing the expression level of 20 gene expression markers (model number 30) in the Yonsei cohort as one score, according to an embodiment of the present invention.
  • ssGSEA single sample gene set enrichment analysis
  • a score is assigned to each sample of normal tissue, and the results of the relapse-free survival analysis based on the average value of these scores are shown in a Kaplan-Meier plot.
  • the present invention relates to a composition for predicting colon cancer prognosis, which includes an agent for measuring the expression level of the CXCL8 gene from normal tissue surrounding the tumor of patients with locally advanced colon cancer.
  • % used to indicate the concentration of a specific substance means (weight/volume)% for solid/solid, (weight/volume)% for solid/liquid, and Liquid/liquid is (volume/volume)%.
  • Example 1 Selection of markers for predicting colorectal cancer prognosis
  • Tumor tissue and normal tissue surrounding the tumor were obtained from 125 patients with locally advanced colon cancer (stage 2 and 3) eligible for surgery. Specifically, during surgery on patients with colon cancer, according to surgical principles, the adjacent colon, including the tumor, must be resected at a sufficient safe distance to ensure that no cancer remains, and nearby lymph nodes and blood vessels, which are the routes through which the cancer spreads, must also be resected. Therefore, it is possible to secure tumor tissue and normal tissue around the tumor at the same time.
  • Normal tissue around the tumor is tissue removed by all types of radical colon cancer surgery such as right colectomy, transverse colectomy, and left colectomy in accordance with the principle of ensuring safety, and is microscopically removed under the judgment of a pathologist. It refers to a tissue that is judged to be normal.
  • RNA extracted from tumor tissue and normal tissue surrounding the tumor was created using the TruSeq RNA Library Prep Kit v2 (Illumina Inc.) according to the manufacturer's protocol. Paired-end sequencing was performed on Illumina's HiSeq 2500 Sequencing Platform to convert the RNA library into sequencing reads and produce a FASTQ file.
  • the sequencing reads were aligned to the human reference genome (hg19) using STAR (v2.5.2b) software, and the expression level of the entire gene was calculated using RSEM software (v1.3). Measured (counted).
  • a gene that is more expressed in the tumor tissue is also expressed more in the normal tissue around the tumor, it is expected that the prognosis will be poor because the normal tissue around the tumor has many characteristics of the tumor tissue, and the gene expression level between the tumor tissue and the normal tissue around the tumor is expected to be poor.
  • DEGs differentially expressed genes
  • 1,111 genes that were statistically significantly overexpressed in tumor tissue were derived.
  • the top 22 genes were selected as marker candidates considering logFC and expression level and are shown in Table 1 below.
  • ssGSEA single sample gene set enrichment analysis
  • SMC cohort 17 types of markers (model number 23), relapse-free survival analysis (Figure 1);
  • SMC cohort 20 types of markers (model number 30), relapse-free survival analysis (Figure 8); and
  • Yonsei cohort 20 types of markers (model number 30), Relapse-free survival analysis ( Figure 11).
  • the expression level of the marker candidate according to the present invention is high in the normal tissue surrounding the tumor, the probability of recurrence is high, and accordingly, it is concluded that it is possible to predict the prognosis of colorectal cancer patients by measuring the expression level of 22 genes in the normal tissue surrounding the tumor. And from the above results, 22 marker candidates shown in Table 1 below were finally selected.
  • a prognosis prediction model suitable for clinical application was constructed from a group of 22 recurrence prognosis marker candidates.
  • the patient's prognosis was judged by whether the cancer recurred during the post-surgery treatment period, and a recurrence prediction model was created using the generalized logistic regression analysis method using the logCPM value of the gene expression level in normal tissue surrounding the tumor. was built.
  • ROC Receiveiver Operating Characteristic
  • Model number marker Count Marker constituent genes AUC p-value SMC cohort SMC cohort One One CXCL8 0.701 0.00011 6 2 CXCL8 + IGF2 0.721 0.0026 10 3 CXCL8 + KRT17 + IGF2 0.752 0.00087 23 17 CXCL8 + COL10A1 + NOTUM + CST1 + TCN1 + WNT2 + PPBP + COL11A1 + MMP7 + CLDN2 + REG3A + SLCO1B3 + S100A2 + HCAR3 + KRT17 + IGF2 + SPP1 0.831 0.0022 30 20 CXCL8 + COL10A1 + NOTUM + REG1B + KRT6B + CST1 + TCN1 + KRT23 + WNT2 + PPBP + COL11A1 + MMP7 + CLDN2 + REG3A + SLCO1B3 + S100A2 + CXCL5 + HCAR3 + KRT17 + DSG3 0.82 0.0062
  • Example 2 Specific performance evaluation of recurrence prediction markers in patients with locally advanced colorectal cancer
  • the AUC area under the curve
  • a performance evaluation index of diagnostic markers was measured using the ROC curve (Receiver Operating Characteristic curve), which is a graph expressing the relationship between the sensitivity and specificity of a specific diagnostic method.
  • ROC curve Receiveiver Operating Characteristic curve
  • Colon cancer is known to occur in two ways. One consists of mutations in oncogenes and a series of inactivations of tumor suppressor genes (APC, p53, DCC, Smad2, Smad4), and the other involves accumulation of mutations in repeated arrays called microsatellites. In this case, it corresponds to a tumor with microsatellite instability (MSI), and the prognosis for such tumors is known to be relatively good, so it is used as a differentiation point. In order to differentiate these tumors, they are primarily differentiated through the degree of inactivation of the mismatch repair (MMR) gene.
  • MMR mismatch repair
  • MMR The degree of deletion of the proteins MLH1, MSH2, and MSH6 can be confirmed, and if there is no loss of protein expression, it can be broadly classified as MSS, and if there is loss of protein expression, it can be broadly classified as MSI.
  • the AUC of the MSI marker was 0.554, which indicated that the accuracy of the recurrence prediction model for locally advanced colorectal cancer was low, confirming the need for a marker with higher accuracy.
  • the model that showed the highest prediction model performance included 17 genes (CXCL8 + COL10A1 + NOTUM + CST1 + TCN1 + WNT2 + PPBP + COL11A1 + MMP7 + CLDN2 + REG3A + SLCO1B3 + S100A2 + HCAR3 + KRT17 + IGF2 + SPP1) This is the model used, and the results are shown in Figure 6.
  • the formula for the recurrence prediction model for 17 types of markers is as follows, through which the recurrence prediction probability ( y) can be calculated.
  • the model that showed the highest performance along with the model using 17 markers in Example 3-3 above was 20 genes (CXCL8 + COL10A1 + NOTUM + REG1B + KRT6B + CST1 + TCN1 + KRT23 + WNT2 + PPBP + COL11A1 + MMP7 + CLDN2 + REG3A + SLCO1B3 + S100A2 + CXCL5 + HCAR3 + KRT17 + DSG3), and the results are shown in Figures 7, 9, and 10.
  • the formula is as follows, through which the recurrence prediction probability (y) can be calculated.
  • normal tissue around the tumor refers to tissue that is obtained from surgically removed tissue in accordance with this principle of ensuring safety and is determined to be microscopically normal under the judgment of a pathologist.
  • Normal tissue around the tumor is tissue removed by all types of radical colon cancer surgery such as right colectomy, transverse colectomy, and left colectomy in accordance with the principle of ensuring safety, and is microscopically removed under the judgment of a pathologist. It refers to a tissue that is judged to be normal.
  • RNA is extracted from normal tissue around the tumor using the Qiagen RNeasy Mini Kit, and RNA quality is checked using RNA yield and RIN (RNA integrity number) for use in subsequent processes.
  • RNA extracted from normal tissue around the tumor Create a sequencing library using TruSeq RNA Library Prep Kit v2 (Illumina, Inc.) according to the manufacturer's protocol. Paired-end sequencing is performed on Illumina's HiSeq 2500 Sequencing Platform to convert RNA libraries into sequencing reads and produce FASTQ files. After removing quality defects from the FASTQ file, the sequencing reads were aligned to the human reference genome (hg19) using STAR (v2.5.2b) software, and the expression level of the entire gene was calculated (counted) using RSEM software (v1.3). ) is measured.
  • the predicted probability of recurrence for each patient is calculated by substituting the gene expression level measured from normal tissue around the patient's tumor into the colorectal cancer recurrence prediction model and recurrence prediction model formula according to the present invention, and the calculated recurrence prediction probability for each patient is calculated. Using this method, a patient-tailored treatment method can be appropriately selected depending on the risk of recurrence.
  • the treatment currently used as adjuvant therapy after surgery is based on cytotoxic anticancer drugs of the 5FU and platinum series.
  • the combination therapy with Bevacizumab was not used because it was not effective in adjuvant therapy.
  • it is reasonable to interpret this as because the problems caused by bevacizumab side effects are greater compared to the effect of increasing the survival of patients, which may have some effect.
  • bevacizumab a targeted anticancer treatment for the VEGF genome, an angiogenic factor, is used in combination with the 5FU and Platinum series.
  • Combination adjuvant therapy of therapeutic agents may be considered, and in addition, for high-risk groups, use of triple-drug (three-drug) chemotherapy, which is more powerful than the double-drug chemotherapy currently used, or chemotherapy after surgery for a longer period than currently used. It is possible to select a treatment method tailored to the patient.
  • the recurrence prediction biomarker according to the present invention has a significantly higher performance in predicting recurrence in patients with locally advanced colorectal cancer compared to the existing MSI marker.
  • the present invention relates to a composition, a kit, and a method for providing information for predicting the prognosis of colon cancer, including an agent for measuring the expression level of a gene from normal tissue surrounding the tumor of a patient with locally advanced colon cancer.

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Abstract

본 발명은 종양주변 정상조직을 이용한 대장암 예후 예측용 마커에 관한 것으로, 종양주변 정상조직을 이용한 대장암 예후 예측용 마커, 이를 포함하는 키트는 정확하게 대장암 환자의 예후를 기존의 임상마커인 MSI 마커보다 정확하게 예측할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 대장암 예후 예측용 마커 유전자의 발현 수준을 측정하여, 수술 후 바로 높은 정확도로 환자의 수술 후 치료과정에서의 재발 여부를 기존의 임상마커인 MSI 마커보다 정확하게 예측할 수 있고, 이에 따라 환자에게 적합한 맞춤형 치료 방법을 선택할 수 있다.

Description

종양주변 정상조직을 이용한 대장암 예후 예측용 마커
본 발명은 과학기술정보통신부 지원 하에서 과제번호 1711156086에 의해 이루어진 것으로서, 상기 과제의 연구관리전문기관은 한국연구재단, 연구사업명은 "바이오·의료기술개발사업", 연구과제명은 "대장암 단일세포 전사체 기반 예후-치료예측 바이오마커 개발", 주관기관은 삼성서울병원, 연구기간은 2022.01.01 ~ 2022.12.31이다.
본 특허출원은 2022년 10월 31일에 대한민국 특허청에 제출된 대한민국 특허출원 제 10-2022-0142489호에 대하여 우선권을 주장하며, 상기 특허출원의 개시 사항은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
본 발명은 종양주변 정상조직을 이용한 대장암 예후 예측용 마커에 관한 것으로, 더욱 상세하게는, 국소진행형 대장암 환자의 종양주변 정상조직으로부터 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 대장암 예후 예측용 조성물, 키트, 및 이를 이용한 대장암 예후 예측에 대한 정보제공방법에 관한 것이다.
대장암은 국내에서 가장 흔하게 발병되는 암(2020년 기준 12.6%)으로 국내 문헌에 따르면, 국소진행형 대장암인 2기, 3기의 경우 5년 내에 약 20% 내지 40%의 환자에서 대장암의 재발이 보고되고 있다(5년 무병생존률; 2기: 79.8%, 3기: 63.3%, 5년 생존률; 2기: 88.4%, 3기: 74.4%).
이러한 대장암의 경우 병기가 올라갈수록 재발률이 올라가며, 현재 2기 이상의 대장암 환자에서는 수술 후 보조 항암요법이 권유되고 있다. 하지만, 대장암이 재발된 이후 즉, 4기에서는 예후가 훨씬 안 좋아지기 때문에(5년 무병생존률: 31.5%, 5년 생존률: 18.9%) 재발하기 전에 더 강한 또는 더 장기간의 보조요법을 하는 것이 일부 환자에게서 필요할 수 있다.
그러나, 현재 표준치료로 사용되는 2제 보조요법인 FOLFOX 요법(5FU + oxaliplatin)의 경우 10% 전후의 그레이드 3(grade 3) 이상의 부작용이 보고되며, 이리노테칸(irinotecan)을 추가한 요법의 경우, 그레이드 3 이상의 부작용이 유의하게 증가됨을 고려할 때, 일관되게 더 강한 항암치료를 하는 것은 오히려 환자에게 해가 될 수도 있다.
이와 같이 대장암의 재발여부에 따라 치료 방법의 선택이 달라지기 때문에, 환자에게 더 좋은 치료 계획을 수립하기 위해서는, 재발 가능성을 예측할 수 있는 정확한 바이오 마커가 필요하다.
한편, 유전체 분석 기술의 발전으로 대장암 유전체에 대해 엑솜데이터 분석(DNA sequencing, whole exome sequencing)부터 전사체 분석(RNA sequencing, whole transcriptome sequencing)까지 다양한 분야의 연구가 이루어졌고, 현재도 활발하게 진행되고 있다.
하지만, 대부분 치료 방법 결정의 차이를 보이는 변이(mutation)는 전이성 대장암에 국한된 경우가 많고, 최근에 유전체 변이 정보에 따라 대장암을 4가지 카테고리로 나눈 CMS consensus criteria의 경우 예후 예측을 위한 마커는 아니며, 국소진행형 대장암만을 타겟으로 한 분류가 아니기 때문에 임상적 효용성이 떨어지므로 잘 사용하지 않고 있다.
또한, 국소진행형 대장암에서 환자 맞춤형 치료 방법 또는 약물 선택에 활용할 수 있는 바이오 마커는 현재 없는 실정이므로, 재발 가능성을 예측할 수 있도록 정확하고 개선된 성능의 재발 예측용 바이오 마커가 필요한 실정이다.
이와 같은 배경하에, 본 발명자들은 대장암의 정확하고 개선된 성능의 예후 예측용 바이오 마커를 개발하기 위해 연구 노력한 결과, 수술이 가능한 국소진행형 대장암 환자를 대상으로, 수술 시 획득한 종양주변 정상조직으로부터 유전자의 발현 수준을 측정하고, 대장암 예후 예측에 대한 성능을 확인하여 향후 치료 과정 중에 재발이 일어날지 여부를 정확하게 예측할 수 있는 모델을 확립하였다.
또한, 선정된 유전자들로 구성된 바이오 마커를 사용하여, 국소진행형 대장암 환자를 대상으로 재발 여부를 분석한 결과, 기존 임상마커인 MSI 마커보다 대장암 재발 예측 성능이 현저히 우수한 것을 확인하였다.
이에, 본 발명의 목적은, 국소진행형 대장암 환자의 종양주변 정상조직으로부터, 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 대장암 예후 예측용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은, 국소진행형 대장암 환자의 종양주변 정상조직으로부터, 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 대장암 예후 예측용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 국소진행형 대장암 환자의 종양주변 정상조직으로부터, 유전자의 발현 수준을 측정하는 측정 단계를 포함하는, 대장암 예후 예측을 위한 정보제공방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 국소진행형 대장암 환자의 종양주변 정상조직으로부터, 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제의 대장암 예후 예측 용도를 제공하는 것이다.
본 발명은 종양주변 정상조직을 이용한 대장암 예후 예측용 조성물에 관한 것으로, 종양주변 정상조직으로부터 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 대장암 예후 예측용 조성물, 키트는 기존의 임상마커인 MSI 마커보다 대장암 환자의 예후를 더욱 정확하게 예측할 수 있다.
본 발명자들은 이에, 본 발명에 따른 대장암 예후 예측용 마커 유전자의 발현 수준을 측정하여, 높은 정확도로 환자의 수술 후 치료과정에서의 재발 여부를 기존의 임상마커인 MSI 마커보다 정확하게 예측할 수 있고, 이에 따라 환자에게 적합한 맞춤형 치료 방법을 선택할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
이하 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.
본 발명의 일 양태는, 국소진행형 대장암 환자의 종양주변 정상조직으로부터, CXCL8 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 대장암 예후 예측용 조성물에 관한 것이다.
본 명세서 상의 용어 "국소진행형 대장암 환자"는 수술이 가능한 대장암 환자로서, 2기 또는 3기의 병기를 가진 환자를 의미하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서, 상기 "환자"의 대상은 국소진행형 대장암 환자로서, 대장암의 예후를 예측하고자 하는 대상을 의미할 수 있고, 인간을 포함하는 포유동물일 수 있으며, 예를 들면, 인간, 원숭이, 소, 말, 양, 돼지, 고양이, 개, 마우스, 래트, 토끼 또는 기니아 피그 등 국소진행형 대장암이 발병될 수 있는 동물이라면 제한 없이 포함될 수 있다.
본 명세서 상의 용어 "종양주변 정상조직"은, 국소진행형 대장암 환자의 수술 시에 수술원칙에 따라 종양을 포함한 인접 대장을 암이 남지 않도록 충분한 안전 거리를 두고 절제하고, 더불어 암이 퍼지는 경로인 인근 림프절 및 혈관도 같이 절제한 경우 종양조직과 동시에 종양주변의 조직을 확보할 수 있으며, 이러한 안전확보의 원칙에 따라 수술로 제거된 조직에서, 병리학자의 판단 하에 현미경적으로 정상으로 판단되는 조직을 의미하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명에서 정의하는 종양주변 정상조직은 이러한 안전확보의 원칙에 따라 우측결장절제술, 횡행결장절제술, 좌측결장절제술 등 모든 범위의 근치적 대장암 수술로 제거된 조직에서, 병리학자의 판단 하에 현미경적으로 정상으로 판단되는 조직을 의미하는 것일 수 있다.
본 명세서 상의 용어 "국소진행형 대장암 환자의 수술"은 우측결장절제술, 횡행결장절제술, 좌측결장절제술 등 모든 범위의 근치적 대장암 수술을 의미하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 CXCL8 유전자는 C-X-C motif chemokine ligand 8 또는 Interleukin 8 유전자를 의미하는 것일 수 있다.
본 명세서 상의 용어 "마커(marker)"는 국소진행형 대장암 환자의 예후 예측을 할 수 있는 유전자를 의미하는 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 명세서 상의 용어 "유전자의 발현 수준을 측정하는 제제"는, 상기 종양주변 정상조직에 포함된 표적 유전자의 발현 수준을 측정하는 방법에 사용되는 제제를 의미한다. 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제는 당업계에 공지된 유전자 발현 검출 제제일 수 있으며, 예를 들면, 중합효소연쇄반응(PCR), 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소연쇄반응(competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소연쇄반응(real time quantitative RT-PCR), 멀티플렉스 역전사 중합효소연쇄반응(Multi-plex RT-PCR), 실시간 중합효소연쇄반응(real time PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection method), 노던 블랏팅(Northern blotting), DNA칩 분석법(DNA chip technology assay), 메틸화된 DNA 결합 도메인 시퀀싱(MBDseq: Methylated DNA binding domain sequencing) 분석 방법, 및 중아황산염 처리 시퀀싱(RRBS: Reduced representation bisulfite sequencing) 분석 방법으로 이루어진 그룹에서 선택되는 1종 이상의 유전자 발현 수준을 측정하는 방법에 사용되는 제제를 의미하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서 상의 용어 "예후"는 질환의 경과 및 사망 또는 생존의 결과를 미리 예측하는 행위를 의미한다. 보다 구체적으로는, 예후 또는 예후 예측이란, 질환의 경과는 환자의 생리적 또는 환경적 상태에 따라 달라질 수 있으며, 이러한 환자의 상태를 종합적으로 고려하여 치료 전/후 질환의 경과를 예측하는 모든 행위를 의미하는 것으로 해석될 수 있다. 본 발명의 목적상 예후는 국소진행형 대장암의 수술 후, 질환의 경과 및 재발 여부를 미리 예측하여 대장암 환자의 무병생존율 또는 생존율을 예측하는 행위로 해석될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
예를 들면, "예후가 좋다"라고 예측하는 것은 대장암 환자의 무병생존율 또는 생존율이 높은 수준, 대장암과 관련된 지표가 개선된 수준 또는 재발 가능성이 낮은 수준을 나타내어, 대장암 환자가 치료될 가능성이 높다는 것을 의미할 수 있고, "예후가 나쁘다"라고 예측하는 것은 대장암 환자의 무병생존율 또는 생존율이 낮은 수준, 대장암과 관련된 지표가 악화된 수준 또는 재발 가능성이 높은 수준을 나타내는 것을 의미할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 본 발명에 따른 대장암의 예후 예측용 마커 유전자의 발현 수준을 측정하는 경우, 기존 임상마커인 MSI 마커 보다 대장암의 재발 예측 여부를 더욱 정확하게 파악할 수 있음을 확인하였다.
본 명세서 상의 용어 "MSI(Microsatellite instability) 마커"는 정상조직과 종양조직 사이의 DNA 서열 변화를 기반으로 종양의 불안정성이 높은지 여부를 판단하는 기존의 임상마커를 의미하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서 상의 용어 "무병생존(Disease-free survival, DFS)"은 암 환자에 대하여 1차 항암치료 등이 끝난 후 해당 암의 징후나 증상 없이 생존하는 기간을 의미하며, "무재발생존(Relapse-free survival, RFS)"과 상호교환적으로 사용될 수 있다.
본 명세서 상의 용어 "생존율(survival rate)"은 암 환자가 치료를 시작한 후 일정 기간이 지난 때 생존한 환자의 비율을 의미하며, 예를 들면, 1년 생존율 또는 5년 생존율 등이 사용될 수 있다.
본 명세서 상의 용어 "전체생존(overall survival)"은 암 환자가 치료를 시작한 후 사망하는 순간까지의 기간을 추적한 수치를 의미하며, 일반적으로 환자의 편차가 크기 때문에 평균값이 아닌, 중간값을 기준으로 측정한 수치를 의미할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 유전자 발현 마커 1종(CXCL8 유전자)을 이용하여 국소진행형 대장암 환자에 대한 재발 예측의 정확도 판단을 위하여 SMC cohort에서 이를 평가하였으며, 그 결과 AUC>0.7로 재발 예측 성능이 우수한 것을 확인하였다.
본 발명에 있어서, 상기 제제는 IGF2 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 추가로 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 IGF2 유전자는 insulin like growth factor 2 유전자를 의미하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 유전자 발현 마커 2종(CXCL8 + IGF2 유전자)을 이용하여 국소진행형 대장암 환자에 대한 재발 예측의 정확도 판단을 위하여 SMC cohort에서 이를 평가하였으며, 그 결과 AUC>0.7로 재발 예측 성능이 우수한 것을 확인하였다.
본 발명에 있어서, 상기 제제는 KRT17 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 추가로 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 KRT17 유전자는 keratin 17 유전자를 의미하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 유전자 발현 마커 3종(CXCL8 + KRT17 + IGF2 유전자)을 이용하여 국소진행형 대장암 환자에 대한 재발 예측의 정확도 판단을 위하여 SMC cohort에서 이를 평가하였으며, 그 결과 AUC>0.7로 재발 예측 성능이 우수한 것을 확인하였다.
본 발명에 있어서, 상기 제제는 COL10A1, NOTUM, CST1, TCN1, WNT2, PPBP, COL11A1, MMP7, CLDN2, REG3A, SLCO1B3, S100A2, HCAR3, 및 SPP1 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 추가로 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 COL10A1 유전자는 collagen type X alpha 1 chain 유전자를 의미하는 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 NOTUM 유전자는 notum, palmitoleoyl-protein carboxylesterase 유전자를 의미하는 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 CST1 유전자는 cystatin SN 유전자를 의미하는 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 TCN1 유전자는 transcobalamin 1 유전자를 의미하는 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 WNT2 유전자는 Wnt family member 2 유전자를 의미하는 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 PPBP 유전자는 pro-platelet basic protein 유전자를 의미하는 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 COL11A1 유전자는 collagen type XI alpha 1 chain 유전자를 의미하는 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 MMP7 유전자는 matrix metallopeptidase 7 유전자를 의미하는 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 CLDN2 유전자는 claudin 2 유전자를 의미하는 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 REG3A 유전자는 regenerating family member 3 alpha 유전자를 의미하는 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 SLCO1B3 유전자는 solute carrier organic anion transporter family member 1B3 유전자를 의미하는 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 S100A2 유전자는 S100 calcium binding protein A2 유전자를 의미하는 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 HCAR3 유전자는 hydroxycarboxylic acid receptor 3 유전자를 의미하는 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 SPP1 유전자는 secreted phosphoprotein 1 유전자를 의미하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 유전자 발현 마커 17종(CXCL8 + COL10A1 + NOTUM + CST1 + TCN1 + WNT2 + PPBP + COL11A1 + MMP7 + CLDN2 + REG3A + SLCO1B3 + S100A2 + HCAR3 + KRT17 + IGF2 + SPP1 유전자)을 이용하여 국소진행형 대장암 환자에 대한 재발 예측의 정확도 판단을 위하여 SMC cohort, TCGA cohort에서 각각 이를 평가하였으며, 그 결과 모두 AUC>0.7로 재발 예측 성능이 우수한 것을 확인하였다.
본 발명에 있어서, 상기 제제는 COL10A1, NOTUM, REG1B, KRT6B, CST1, TCN1, KRT23, WNT2, PPBP, COL11A1, MMP7, CLDN2, REG3A, SLCO1B3, S100A2, CXCL5, HCAR3, KRT17, 및 DSG3 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 추가로 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 REG1B 유전자는 regenerating family member 1 beta 유전자를 의미하는 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 KRT6B 유전자는 keratin 6B 유전자를 의미하는 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 KRT23 유전자는 keratin 23 유전자를 의미하는 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 CXCL5 유전자는 C-X-C motif chemokine ligand 5 유전자를 의미하는 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 DSG3 유전자는 desmoglein 3 유전자를 의미하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 유전자 발현 마커 20종(CXCL8 + COL10A1 + NOTUM + REG1B + KRT6B + CST1 + TCN1 + KRT23 + WNT2 + PPBP + COL11A1 + MMP7 + CLDN2 + REG3A + SLCO1B3 + S100A2 + CXCL5 + HCAR3 + KRT17 + DSG3 유전자)을 이용하여 국소진행형 대장암 환자에 대한 재발 예측의 정확도 판단을 위하여 SMC cohort, Yonsei cohort 및 TCGA cohort에서 각각 이를 평가하였으며, 그 결과 모두 AUC>0.7로 재발 예측 성능이 우수한 것을 확인하였다.
본 발명에 있어서, 상기 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머(primer), 프로브(probe), 안티센스 올리고 뉴클레오티드(antisense oligo nucleotide), 및 압타머(aptamer)로 이루어진 그룹에서 선택되는 1종 이상인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서 상의 용어 "프라이머(primer)"는 표적 유전자 서열을 인지(또는 인식)하는 정방향 및 역방향의 프라이머로 이루어진 모든 조합의 프라이머쌍을 포함하나, 바람직하게는, 특이성 및 민감성을 가지는 분석 결과를 제공하는 프라이머 쌍을 의미하는 것일 수 있다. 프라이머의 핵산 서열이 시료 내에 존재하는 비-표적 서열과 불일치하는 서열이어서, 상보적인 프라이머 결합 부위를 함유하는 표적 유전자 서열만 증폭하고 비특이적 증폭을 유발하지 않는 프라이머일 때, 높은 특이성을 부여할 수 있다.
본 명세서 상의 용어 "프로브(probe)"는 시료 내의 검출하고자 하는 표적 물질과 특이적으로 결합할 수 있는 물질을 의미하며, 상기 결합을 통하여 특이적으로 시료 내 표적 물질의 존재를 확인할 수 있는 물질을 의미하는 것일 수 있다. 프로브 분자의 종류는 당업계에서 통상적으로 사용되는 물질로서 제한은 없으나, 바람직하게는 PNA(peptide nucleic acid), LNA(locked nucleic acid), 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질, RNA 또는 DNA인 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 프로브는 바이오 물질로서 생물에서 유래되거나 이와 유사한 것 또는 생체 외에서 제조된 것을 포함하는 것으로 예를 들면, 효소, 단백질, 항체, 미생물, 동식물 세포 및 기관, 신경세포, DNA, 및 RNA일 수 있으며, DNA는 cDNA, 게놈 DNA, 올리고 뉴클레오티드를 포함하며, RNA는 게놈 RNA, mRNA, 올리고 뉴클레오티드를 포함하며, 단백질의 예로는 항체, 항원, 효소, 펩타이드 등을 포함할 수 있다.
본 명세서 상의 용어 "안티센스 올리고 뉴클레오티드(antisense oligo nucleotide)"는 특정 mRNA의 서열에 상보적인 핵산 서열을 함유하고 있는 DNA 또는 RNA 또는 이들의 유도체로서, mRNA 내의 상보적인 서열에 결합하여 mRNA의 단백질로의 번역을 저해하는 작용을 한다. 안티센스 올리고 뉴클레오티드 서열은 상기 유전자들의 mRNA에 상보적이고 상기 mRNA에 결합할 수 있는 DNA 또는 RNA 서열을 의미하는 것일 수 있다. 안티센스 올리고 뉴클레오티드의 길이는 6 내지 100 염기, 바람직하게는 8 내지 60 염기, 보다 바람직하게는 10 내지 40 염기일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 안티센스 올리고 뉴클레오티드는 통상의 방법으로 시험관 내에서 합성되어 생체 내로 투여하거나 생체 내에서 안티센스 올리고 뉴클레오티드가 합성되도록 할 수 있다. 시험관 내에서 안티센스 올리고 뉴클레오티드를 합성하는 한가지 예는, RNA 중합효소 I를 이용하는 것일 수 있다. 생체 내에서 안티센스 RNA가 합성되도록 하는 한 가지 예는, 다중클로닝부위(MCS)의 기원이 반대 방향에 있는 벡터를 사용하여 안티센스 RNA가 전사되도록 하는 것일 수 있다. 상기 안티센스 RNA는 서열 내에 번역 중지 코돈이 존재하도록 하여 펩타이드 서열로 번역되지 않도록 하는 것이 바람직할 수 있다.
본 명세서 상의 용어 "압타머(aptamer)"는 그 자체로 안정된 삼차(3차) 구조를 가지면서 표적 분자에 높은 친화성과 특이성으로 결합하는 단일가닥 핵산(DNA, RNA, 또는 변형핵산)을 의미하는 것일 수 있다. 본 발명의 목적상, 상기 압타머는 상기 마커 유전자에 대하여 특이적으로 결합하는 압타머를 의미할 수 있으며, 압타머의 생성은 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 프라이머, 프로브, 안티센스 올리고 뉴클레오티드 및 압타머는 상기 유전자 또는 이의 mRNA를 검출할 수 있는 것이라면 특정 서열로 한정되지 않는다.
본 명세서 상의 용어 "유전자의 발현 수준"은 유전자의 mRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍, 프로브, 안티센스 올리고 뉴클레오티드 및 압타머를 이용하여 측정할 수 있으며, 상기 mRNA의 발현 여부를 측정하는 제제는 상기 유전자에 특이적인 프라이머 쌍, 프로브, 안티센스 올리고 뉴클레오티드, 압타머 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹에서 선택될 수 있다. 즉, 핵산의 검출은 유전자를 암호화하는 핵산 분자 또는 상기 핵산 분자의 전사체에 상보적으로 결합하는 하나 이상의 올리고 뉴클레오티드 프라이머를 사용하는 증폭 반응에 의해 수행될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들면, 프라이머를 이용한 mRNA의 검출은 PCR과 같은 증폭 방법을 사용하여 유전자 서열을 증폭한 다음, 당업계에 공지된 방법으로 증폭 여부를 확인함으로써 수행될 수 있으며, 중합효소연쇄반응(PCR), 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소연쇄반응(competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소연쇄반응(real time quantitative RT-PCR), 멀티플렉스 역전사 중합효소연쇄반응(Multi-plex RT-PCR), 실시간 중합효소연쇄반응(real time PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection method), 노던 블랏팅(Northern blotting), DNA칩 분석법(DNA chip technology assay), 메틸화된 DNA 결합 도메인 시퀀싱(MBDseq: Methylated DNA binding domain sequencing) 분석 방법, 및 중아황산염 처리 시퀀싱(RRBS: Reduced representation bisulfite sequencing) 분석 방법으로 이루어진 그룹에서 선택되는 1종 이상의 방법에 의해 측정될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서 상의 용어 "유전자의 발현 수준"은 "유전자의 발현량"과 상호교환적으로 사용될 수 있다.
본 발명의 다른 일 양태는, 국소진행형 대장암 환자의 종양주변 정상조직으로부터, CXCL8 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 대장암 예후 예측용 키트에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 예후 예측용 키트는 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치로 구성될 수 있고, 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR) 키트, 실시간 중합효소연쇄반응(qPCR) 키트 또는 DNA 칩(DNA Chip) 키트일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 예를 들면, 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR) 키트는 마커 유전자에 대하여 특이적인 각각의 프라이머 쌍 이외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 데옥시뉴클레오티드(dNTPs), Taq-폴리머라아제(Taq-polymerase) 및 역전사 효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제, DEPC-수, 멸균수 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 정량 대조군으로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 포함할 수 있다. DNA 칩(Chip) 분석용 키트는 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA가 프로브로 부착되어 있는 기판, 형광 표식 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제 및 효소 등을 포함할 수 있으며, 기판은 정량 대조군 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA를 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서, 상기 키트는 컨테이너, 지시서, 및 상기 유전자의 발현 수준 측정 제제를 포함할 수 있다. 상기 컨테이너는 상기 측정 제제를 포장하는 역할을 할 수 있고, 보관 및 고정하는 역할을 할 수도 있다. 상기 컨테이너의 재질은 예를들면, 병, 통(tub), 작은 봉지(sachet), 봉투(envelope), 튜브(tube), 앰플(ampoule) 등과 같은 형태를 취할 수 있고, 이들은 부분적 또는 전체적으로 플라스틱, 유리, 종이, 호일, 왁스 등으로부터 형성될 수 있다. 상기 키트는 외부 패키지를 포함할 수 있으며, 외부 패키지는 구성 요소들의 사용에 관한 지시서를 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 제제는 IGF2 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 추가로 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 제제는 KRT17 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 추가로 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 제제는 COL10A1, NOTUM, CST1, TCN1, WNT2, PPBP, COL11A1, MMP7, CLDN2, REG3A, SLCO1B3, S100A2, HCAR3, 및 SPP1 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 추가로 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 제제는 COL10A1, NOTUM, REG1B, KRT6B, CST1, TCN1, KRT23, WNT2, PPBP, COL11A1, MMP7, CLDN2, REG3A, SLCO1B3, S100A2, CXCL5, HCAR3, KRT17, 및 DSG3 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 추가로 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머(primer), 프로브(probe), 안티센스 올리고 뉴클레오티드(antisense oligo nucleotide), 및 압타머(aptamer)로 이루어진 그룹에서 선택되는 1종 이상인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 일 양태는, 국소진행형 대장암 환자의 종양주변 정상조직으로부터, CXCL8 유전자의 발현 수준을 측정하는 측정 단계를 포함하는, 대장암 예후 예측을 위한 정보제공방법에 관한 것이다.
본 발명의 일 구현예에서, 본 발명에 따른 대장암의 예후 예측용 마커 유전자의 발현 수준을 측정하는 경우, 기존 임상마커인 MSI 마커 보다 대장암의 재발 예측 여부를 더욱 정확하게 파악할 수 있음을 확인하였다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 유전자 발현 마커 1종(CXCL8 유전자)의 발현 수준을 측정하여, 국소진행형 대장암 환자에 대한 재발 예측의 정확도 판단을 위하여 SMC cohort에서 이를 평가하였으며, 그 결과 AUC>0.7로 재발 예측 성능이 우수한 것을 확인하였다.
본 발명에 있어서, 상기 유전자의 발현 수준은 중합효소연쇄반응(PCR), 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소연쇄반응(competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소연쇄반응(real time quantitative RT-PCR), 멀티플렉스 역전사 중합효소연쇄반응(Multi-plex RT-PCR), 실시간 중합효소연쇄반응(real time PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection method), 노던 블랏팅(Northern blotting), DNA칩 분석법(DNA chip technology assay), 메틸화된 DNA 결합 도메인 시퀀싱(MBDseq: Methylated DNA binding domain sequencing) 분석 방법, 및 중아황산염 처리 시퀀싱(RRBS: Reduced representation bisulfite sequencing) 분석 방법으로 이루어진 그룹에서 선택되는 1종 이상의 유전자 발현 수준을 측정하는 방법에 의하여 측정될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 측정 단계는 IGF2 유전자의 발현 수준을 추가로 측정하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 유전자 발현 마커 2종(CXCL8 + IGF2 유전자)의 발현 수준을 측정하여, 국소진행형 대장암 환자에 대한 재발 예측의 정확도 판단을 위하여 SMC cohort에서 이를 평가하였으며, 그 결과 AUC>0.7로 재발 예측 성능이 우수한 것을 확인하였다.
본 발명에 있어서, 상기 측정 단계는 KRT17 유전자의 발현 수준을 추가로 측정하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 유전자 발현 마커 3종(CXCL8 + KRT17 + IGF2 유전자)의 발현 수준을 측정하여, 국소진행형 대장암 환자에 대한 재발 예측의 정확도 판단을 위하여 SMC cohort에서 이를 평가하였으며, 그 결과 AUC>0.7로 재발 예측 성능이 우수한 것을 확인하였다.
본 발명에 있어서, 상기 측정 단계는 COL10A1, NOTUM, CST1, TCN1, WNT2, PPBP, COL11A1, MMP7, CLDN2, REG3A, SLCO1B3, S100A2, HCAR3, 및 SPP1 유전자의 발현 수준을 추가로 측정하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 유전자 발현 마커 17종(CXCL8 + COL10A1 + NOTUM + CST1 + TCN1 + WNT2 + PPBP + COL11A1 + MMP7 + CLDN2 + REG3A + SLCO1B3 + S100A2 + HCAR3 + KRT17 + IGF2 + SPP1 유전자)의 발현 수준을 측정하여 국소진행형 대장암 환자에 대한 재발 예측의 정확도 판단을 위하여 SMC cohort, TCGA cohort에서 각각 이를 평가하였으며, 그 결과 모두 AUC>0.7로 재발 예측 성능이 우수한 것을 확인하였다.
본 발명에 있어서, 상기 측정 단계는 COL10A1, NOTUM, REG1B, KRT6B, CST1, TCN1, KRT23, WNT2, PPBP, COL11A1, MMP7, CLDN2, REG3A, SLCO1B3, S100A2, CXCL5, HCAR3, KRT17, 및 DSG3 유전자의 발현 수준을 추가로 측정하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 유전자 발현 마커 20종(CXCL8 + COL10A1 + NOTUM + REG1B + KRT6B + CST1 + TCN1 + KRT23 + WNT2 + PPBP + COL11A1 + MMP7 + CLDN2 + REG3A + SLCO1B3 + S100A2 + CXCL5 + HCAR3 + KRT17 + DSG3 유전자)의 발현 수준을 측정하여 국소진행형 대장암 환자에 대한 재발 예측의 정확도 판단을 위하여 SMC cohort, Yonsei cohort 및 TCGA cohort에서 각각 이를 평가하였으며, 그 결과 모두 AUC>0.7로 재발 예측 성능이 우수한 것을 확인하였다.
본 발명에 있어서, 상기 측정 단계는 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머(primer), 프로브(probe), 안티센스 올리고 뉴클레오티드(antisense oligo nucleotide), 및 압타머(aptamer)로 이루어진 그룹에서 선택되는 1종 이상을 이용하여 상기 유전자의 발현 수준을 측정하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 측정 단계 이후 측정된 유전자의 발현 수준을 이용하여 대장암의 재발 가능성을 계산하는 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서 상의 용어 "재발 가능성"은 본 발명에 따른 대장암 예후 예측용 마커 유전자의 발현 수준을 이용하여 계산된 "재발 예측 확률"을 의미할 수 있으며, "재발 예측 확률"과 상호교환적으로 사용될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 재발 가능성을 계산하는 단계 이후 계산된 재발 가능성을 기준값(reference)과 비교하는 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에서, 본 발명에 따른 대장암 예후 예측용 마커를 사용하여 재발 예측 확률을 계산하고, 이를 기반으로 국소진행형 대장암 환자를 고위험군(high risk) / 저위험군(low risk)으로 각각 구분하여, 고위험군으로 구분된 환자의 예후가 저위험군으로 구분된 환자의 예후보다 나쁜 것을 확인하였고, 생존확률에서 통계적으로 유의미한 차이가 있음을 확인하였으므로, 본 발명에 따른 대장암 예후 예측용 마커의 발현 수준을 측정하여 수술 후 재발 여부를 정확하게 예측할 수 있고, 이에 따라 환자에게 적합한 맞춤형 치료 방법을 선택할 수 있도록 대장암 예후 예측을 위한 정보를 제공할 수 있다.
본 발명에 있어서, "포함하는"이라는 용어가 사용될 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 발명은 종양주변 정상조직을 이용한 대장암 예후 예측용 조성물에 관한 것으로, 종양주변 정상조직으로부터 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 대장암 예후 예측용 조성물, 키트는 기존의 임상마커인 MSI 마커보다 대장암 환자의 예후를 더욱 정확하게 예측할 수 있는 효과가 있다.
이에, 본 발명에 따른 대장암 예후 예측용 마커 유전자의 발현 수준을 분석하여, 높은 정확도로 환자의 수술 후 치료과정에서의 재발 여부를 기존의 임상마커인 MSI 마커보다 정확하게 예측할 수 있고, 이에 따라 환자에게 적합한 맞춤형 치료 방법을 선택할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라, SMC cohort에서 유전자 발현 마커 17종(모델번호 23)의 발현량을 하나의 점수로 나타내는 방법인 ssGSEA(single sample gene set enrichment analysis)를 이용하여 종양주변 정상조직의 각 샘플마다 점수를 부여하고, 이 점수의 평균값을 기준으로 분석한 무재발생존(Relapse-free survival) 분석 결과를 Kaplan-Meier plot 그래프로 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라, 기존 임상마커인 MSI 마커의 국소진행형 대장암 환자의 재발 예측 성능을 ROC(Receiver Operating Characteristic) curve 및 AUC(곡선 아래 면적) 값으로 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라, SMC cohort에서 측정한 유전자 발현 마커 1종(모델번호 1)의 국소진행형 대장암 환자의 재발 예측 성능을 ROC(Receiver Operating Characteristic) curve 및 AUC(곡선 아래 면적) 값으로 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라, SMC cohort에서 측정한 유전자 발현 마커 2종(모델번호 6)의 국소진행형 대장암 환자의 재발 예측 성능을 ROC(Receiver Operating Characteristic) curve 및 AUC(곡선 아래 면적) 값으로 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라, SMC cohort에서 측정한 유전자 발현 마커 3종(모델번호 10)의 국소진행형 대장암 환자의 재발 예측 성능을 ROC(Receiver Operating Characteristic) curve 및 AUC(곡선 아래 면적) 값으로 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따라, SMC cohort에서 측정한 유전자 발현 마커 17종(모델번호 23)의 국소진행형 대장암 환자의 재발 예측 성능을 ROC(Receiver Operating Characteristic) curve 및 AUC(곡선 아래 면적) 값으로 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따라, SMC cohort에서 측정한 유전자 발현 마커 20종(모델번호 30)의 국소진행형 대장암 환자의 재발 예측 성능을 ROC(Receiver Operating Characteristic) curve 및 AUC(곡선 아래 면적) 값으로 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따라, SMC cohort에서 유전자 발현 마커 20종(모델번호 30)의 발현량을 하나의 점수로 나타내는 방법인 ssGSEA(single sample gene set enrichment analysis)를 이용하여 종양주변 정상조직의 각 샘플마다 점수를 부여하고, 이 점수의 평균값을 기준으로 분석한 무재발생존(Relapse-free survival) 분석 결과를 Kaplan-Meier plot 그래프로 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따라, Yonsei cohort에서 측정한 유전자 발현 마커 20종(모델번호 30)의 국소진행형 대장암 환자의 재발 예측 성능을 ROC(Receiver Operating Characteristic) curve 및 AUC(곡선 아래 면적) 값으로 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따라, TCGA(The Cancer Genome Atlas) cohort에서 측정한 유전자 발현 마커 20종(모델번호 30)의 국소진행형 대장암 환자의 재발 예측 성능을 ROC(Receiver Operating Characteristic) curve 및 AUC(곡선 아래 면적) 값으로 나타낸 것이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따라, Yonsei cohort에서 유전자 발현 마커 20종(모델번호 30)의 발현량을 하나의 점수로 나타내는 방법인 ssGSEA(single sample gene set enrichment analysis)를 이용하여 종양주변 정상조직의 각 샘플마다 점수를 부여하고, 이 점수의 평균값을 기준으로 분석한 무재발생존(Relapse-free survival) 분석 결과를 Kaplan-Meier plot 그래프로 나타낸 것이다.
국소진행형 대장암 환자의 종양주변 정상조직으로부터, CXCL8 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 대장암 예후 예측용 조성물에 관한 것이다.
이하, 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 도면을 참고하여 구체적으로 설명한다. 본 명세서에서 사용되는 용어는 따로 정의하지 않는 한, 해당 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 일반적으로 이해하는 내용으로 해석되어야 할 것이다.
본 명세서의 도면 및 실시예는 통상의 기술자가 본 발명을 쉽게 이해하고 실시하기 위한 것으로 도면 및 실시예에서 발명의 요지를 흐릴 수 있는 내용은 생략될 수 있으며, 본 발명이 도면 및 실시예로 한정되는 것은 아니다.
본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 "%"는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량)%, 고체/액체는 (중량/부피)%, 그리고 액체/액체는 (부피/부피)%이다.
실시예 1: 대장암 예후 예측을 위한 마커의 선정
1-1. 수술 시 환자의 종양조직 및 종양주변 정상조직 확보
수술이 가능한 국소진행형 대장암 환자(2, 3기) 125명의 종양조직과 종양주변 정상조직을 수득하였다. 구체적으로, 대장암 환자의 수술 시에는 수술원칙에 따라 종양을 포함한 인접 대장을 암이 남지 않도록 충분한 안전 거리를 두고 절제하고, 더불어 암이 퍼지는 경로인 인근 림프절 및 혈관도 같이 절제해야 한다. 따라서 종양조직과 동시에 종양주변 정상조직을 함께 확보할 수 있다.
본 발명에서 정의하는 종양주변 정상조직은 이러한 안전확보의 원칙에 따라 우측결장절제술, 횡행결장절제술, 좌측결장절제술 등 모든 범위의 근치적 대장암 수술로 제거된 조직에서, 병리학자의 판단 하에 현미경적으로 정상으로 판단되는 조직을 의미한다.
1-2. 종양조직 및 종양주변 정상조직에서 RNA 추출
종양조직과 종양주변 정상조직 각각에서 Qiagen RNeasy Mini Kit를 사용하여 RNA를 추출하였고, RNA 수득양, RIN(RNA integrity number) 등으로 RNA 품질을 확인하여 이후 실험에 사용하였다.
1-3. NGS로 유전자 발현량 측정
종양조직과 종양주변 정상조직 각각에서 추출한 RNA를 대상으로 전체 전사체 염기서열분석(whole transcriptome sequencing)을 진행하였다. 제조사의 프로토콜에 따라 TruSeq RNA Library Prep Kit v2(Illumina Inc.)를 사용하여 시퀀싱 라이브러리(Sequencing library)로 제작하였다. Illumina 사의 HiSeq 2500 Sequencing Platform에서 양쪽으로 읽는 paired-end sequencing을 실시하여 RNA 라이브러리를 시퀀싱 리드(sequencing read)로 변환한 후, FASTQ 파일을 생산하였다.
그리고, FASTQ 파일에서 품질 불량을 제거한 후 시퀀싱 리드를 인간 표준유전체(hg19)에 STAR(v2.5.2b) 소프트웨어를 이용해서 정렬하고, RSEM 소프트웨어(v1.3)을 사용하여 전체 유전자의 발현량을 측정(카운트)하였다.
1-4. 종양조직과 종양주변 정상조직에서 발현량이 차이나는 유전자 선별 (DEG 분석, differentially expressed genes)
종양조직에서 더 많이 발현되는 유전자가 종양주변 정상조직에서도 많이 발현된다면, 종양주변의 정상조직이지만 종양조직의 특성을 많이 가지고 있어서 예후가 나쁠 것으로 예상하여, 종양조직과 종양주변 정상조직 간의 유전자 발현량 차이를 분석하여 종양조직에서 종양주변 정상조직보다 통계적으로 유의하게 더 많이 발현되는 유전자(DEG, differentially expressed genes)를 선별하였다.
구체적으로, 통계분석 소프트웨어인 R edgeR package를 활용하여 발현량이 매우 낮은 카운트를 제외하고 TMM 방법을 사용하여 정규화(normalization)한 후, 일반화된 선형 모델(generalized linear model, GLM) 분석방법을 적용하여 DEG를 식별하였다.
이때, 통계적으로 유의미한 차이를 보이는 DEG는 logCPM(log scale로 변환된 평균 유전자 발현량, log-counts per million)이 3보다 크고, 보정된 p값인 FDR(false discovery rate, multiple testing corrected p-value)이 1보다 큰 경우로 정의하였다.
결과적으로, 위의 기준을 적용하여 통계적으로 유의미하게 종양조직에서 과발현된 유전자 1,111개가 도출되었고, 이 중 logFC와 발현량을 고려하여 상위 22개 유전자를 마커 후보군으로 선별하여 하기 표 1에 나타내었다.
1-5. 선별된 후보 유전자를 대상으로 생존분석 시행
유전자의 발현량을 하나의 점수로 나타내는 방법인 ssGSEA(single sample gene set enrichment analysis)를 이용하여 종양주변 정상조직의 각 샘플마다 점수를 부여하고, 이 점수의 평균값을 기준으로, 샘플을 점수가 평균보다 높은 고위험군(High-risk)과 점수가 평균보다 낮은 저위험군(Low-risk)으로 나누어 하기와 같이 생존분석을 실시하였다.
SMC cohort: 마커 17종(모델번호 23), 무재발생존(Relapse-free survival) 분석(도 1);
SMC cohort: 마커 20종(모델번호 30), 무재발생존(Relapse-free survival) 분석(도 8); 및
Yonsei cohort: 마커 20종(모델번호 30), 무재발생존(Relapse-free survival) 분석(도 11).
분석결과, 도 1에 제시된 바와 같이, SMC cohort에서 마커 17종(모델번호 23)의 경우 추적관찰기간 3년 시점에서, 저위험군의 무재발생존(recurrence-free survival)확률은 79.1%이고, 고위험군의 무재발생존확률은 53.6%로 나타났으며, 생존분석 방법인 log-rank test 결과 p-value = 0.0022로 통계적으로 유의미한 무재발생존확률의 차이가 있음을 확인하였다.
그리고, 도 8에 제시된 바와 같이, SMC cohort에서 마커 20종(모델번호 30)의 경우 추적관찰기간 3년 시점에서, 저위험군의 무재발생존(recurrence-free survival)확률은 78.8%(95% 신뢰구간 (69.8%, 89.0%))이고, 고위험군의 무재발생존확률은 54.7%(95% 신뢰구간 (41.5%, 72.2%))로 나타났으며, 생존분석 방법인 log-rank test 결과 p-value = 0.0062로 통계적으로 유의미한 무재발생존확률의 차이가 있음을 확인하였다.
또한, 도 11에 제시된 바와 같이, Yonsei cohort에서 마커 20종(모델번호 30) 추적관찰기간 3년 시점에서, 저위험군의 무재발생존(recurrence-free survival)확률은 74.5%(95% 신뢰구간 (66.3%, 83.6%))이고, 고위험군의 무재발생존확률은 55.3%(95% 신뢰구간 (43.9%, 69.5%))로 나타났으며, 생존분석 방법인 log-rank test 결과 p-value = 0.045로 통계적으로 유의미한 무재발생존확률의 차이가 있음을 확인하였다.
따라서, 종양주변 정상조직에서 본 발명에 따른 마커 후보군의 발현량이 높으면 재발 확률이 높고, 이에 따라서 종양주변 정상조직으로부터 22개 유전자의 발현량을 측정하여 대장암 환자의 예후 예측이 가능하다는 결론을 도출하고, 상기 결과로부터 하기 표 1의 마커 후보 22종을 최종적으로 선정하였다.
서열번호 SYMBOL ENTREZID GENENAME REFSEQ
1 CLDN2 9075 claudin 2 NM_020384
2 COL10A1 1300 collagen type X alpha 1 chain NM_000493
3 COL11A1 1301 collagen type XI alpha 1 chain NM_001854
4 CST1 1469 cystatin SN NM_001898
5 CXCL5 6374 C-X-C motif chemokine ligand 5 NM_002994
6 CXCL8 3576 C-X-C motif chemokine ligand 8 NM_000584
7 DSG3 1830 desmoglein 3 NM_001944
8 HCAR3 8843 hydroxycarboxylic acid receptor 3 NM_006018
9 KRT17 3872 keratin 17 NM_000422
10 KRT23 25984 keratin 23 NM_015515
11 KRT6B 3854 keratin 6B NM_005555
12 MMP7 4316 matrix metallopeptidase 7 NM_002423
13 NOTUM 147111 notum, palmitoleoyl-protein carboxylesterase NM_178493
14 PPBP 5473 pro-platelet basic protein NM_002704
15 REG1B 5968 regenerating family member 1 beta NM_006507
16 REG3A 5068 regenerating family member 3 alpha NM_002580
17 S100A2 6273 S100 calcium binding protein A2 NM_005978
18 SLCO1B3 28234 solute carrier organic anion transporter family member 1B3 NM_019844
19 TCN1 6947 transcobalamin 1 NM_001062
20 WNT2 7472 Wnt family member 2 NM_003391
21 IGF2 3481 insulin like growth factor 2 NM_000612
22 SPP1 6696 secreted phosphoprotein 1 NM_000582
1-6. 재발 예후 예측 모델 구축 (logistic regression 방법 적용)
22개의 재발 예후 예측용 마커 후보군으로부터 보다 임상에서 적용하기 적합한 예후 예측 모델을 구축하였다.
환자의 예후는 수술 후 치료 기간 동안 암이 재발(recurrence) 되었는지 여부로 판단하였고, 종양주변 정상조직에서 유전자 발현량의 logCPM 값을 이용하여 일반화된 선형모델(generalized logistic regression) 분석방법으로 재발 예측 모델을 구축하였다.
이때, 종속변수가 재발 유무이기 때문에 binomial 분포를 이용하여 모델을 구축하였고, 유전자 22개를 가지고 가능한 모든 조합을 확인하여 총 222-1개의 모델 중 최적의 예측 모델을 선정하였다.
1-7. 재발 예후 예측용 바이오 마커 선정
마커 성능평가 지표로는 AUC>=0.7을 적용하여 마커를 선정하였다. 구체적으로, 유전자 발현 마커의 국소진행형 대장암 환자의 재발 예측 성능을 ROC(Receiver Operating Characteristic) curve 그래프를 이용하여 AUC 값을 측정하였다.
그 결과 CXCL8이 핵심 마커로, 해당 유전자 하나만 사용했을 시에도 재발 예측 모델의 성능이 AUC>0.7로 우수하게 나타났다(도 3). 다른 마커들은 단독으로 사용 시 AUC<0.7로 예측 모델의 성능이 기준값에 미치지 못하였고, CXCL8을 제외한 예측 모델보다 CXCL8이 포함된 예측 모델이 동일 개수의 마커를 사용할 때 더 좋은 성능을 보였다. 따라서 CXCL8를 포함하면서 다른 마커들의 가능한 모든 조합에 대한 재발 예후 예측 모델의 성능을 확인하였고, 그 중 적은 수의 마커로도 AUC>0.7 이상의 성능을 낼 수 있는 모델을 선정하였다.
또한, AUC>0.7인 동일 개수의 마커를 사용한 모델 중에서는 종양주변 정상조직에서 발현량이 일정 수준 이상으로 향후 진단 키트 개발 시 검출이 용이한 유전자가 포함된 모델을 최종 모델로 선정하였다. 주요 예후 예측 모델과 각 모델의 AUC 및 p-value를 하기 표 2에 나타내었다.
모델
번호		 마커
개수		 마커 구성 유전자 AUC p-value
SMC cohort SMC cohort
1 1 CXCL8 0.701 0.00011
6 2 CXCL8 + IGF2 0.721 0.0026
10 3 CXCL8 + KRT17 + IGF2 0.752 0.00087
23 17 CXCL8 + COL10A1 + NOTUM + CST1 + TCN1 + WNT2 + PPBP + COL11A1 + MMP7 + CLDN2 + REG3A + SLCO1B3 + S100A2 + HCAR3 + KRT17 + IGF2 + SPP1 0.831 0.0022
30 20 CXCL8 + COL10A1 + NOTUM + REG1B + KRT6B + CST1 + TCN1 + KRT23 + WNT2 + PPBP + COL11A1 + MMP7 + CLDN2 + REG3A + SLCO1B3 + S100A2 + CXCL5 + HCAR3 + KRT17 + DSG3 0.82 0.0062
실시예 2: 국소진행형 대장암 환자의 재발 예측 마커의 구체적인 성능 평가
국소진행형 대장암 환자의 수술을 통해 획득된 종양주변 정상조직에서 재발 예측 바이오 마커 유전자의 발현량을 분석하여, 수술 후 바로 높은 정확도로 환자의 수술 후 치료과정에서의 재발 여부를 예측할 수 있고, 이에 따라 환자에게 적합한 맞춤형 치료 방법을 선택할 수 있는지 확인하기 위해 마커의 구체적인 성능을 평가하였다.
구체적으로, 특정 진단 방법의 민감도와 특이도가 어떤 관계를 가지고 있는지 표현한 그래프인 ROC curve(Receiver Operating Characteristic curve)로, 진단 마커의 성능 평가 지표인 AUC(area under the curve)를 측정하였다. 일반적으로 예측모델의 성능 평가 시, AUC>=0.7이면 높은 정확도를 가진 모델로 간주하였다.
또한, 이하의 실시예에서 종양조직과 종양주변 정상조직의 확보, RNA 추출 및 유전자 발현량의 측정 방법은 상기 실시예 1에 기재된 바와 같다.
2-1. 기존 MSI 마커의 재발 예측 성능 평가
대장암은 두 가지 경로로 발생한다고 알려져 있다. 하나는, 종양 유전자의 돌연변이와 종양억제 유전자(APC, p53, DCC, Smad2, Smad4)에 대한 일련의 불활성화로 이루어지며, 다른 하나는 미소위성체(microsatellite)라 불리는 반복된 배열에 돌연변이가 축적되는 경우 미소위성체 불안정성(microsatellite instability, MSI) 종양에 해당하며, 이러한 종양의 경우 예후가 상대적으로 좋다고 알려져 있어 감별 포인트로써 사용되고 있다. 이러한 종양을 감별하기 위해서는 오류교정(mismatch repair, MMR) 유전자의 불활성화 정도를 통해서 일차적으로 감별하게 되는데, 이를 감별하기 위해서는 면역조직화학염색(Immunohistochemistry, IHC) 등을 통해서 복제오류교정(mismatch repair, MMR) 단백인 MLH1, MSH2, MSH6의 결실 정도를 확인하고, 단백 발현의 손실이 없는 경우 MSS, 있는 경우 MSI로 크게 분류할 수 있다.
조금 더 세분화하면, MSI인 환자는 PCR을 통해 BAT-25, BAT-26, D2S123, D5S346, D17S250의 마커 중,
2개 이상의 마커에서 불안정성(instability)을 보이는 경우에는 MSI-H; 및
1개의 마커에서 불안정성(instability)을 보이는 경우에는 MSI-L;로 분류한다.
본 연구에서는 기존 임상마커인 MSI 마커의 국소진행형 대장암 환자에서의 재발 예측 성능을 평가하였다.
구체적으로, 125명의 국소진행형 대장암 환자 중, MSI 마커가 확인되지 않은 unknown 3명, MSI-L 2명을 제외한 총 120명 대장암 환자(MSI-H 24명, MSS 96명)를 대상으로, MSI 마커로 재발 여부를 예측하는 모델을 generalized logistic regression 분석을 통해 구축하였으며, MSI 마커를 이용한 재발 예측 모델의 성능을 ROC(Receiver Operating Characteristic) curve로 도 2에 나타내었다.
분석결과, 도 2에 제시된 바와 같이, MSI 마커의 AUC는 0.554로 국소진행형 대장암의 재발 예측 모델의 정확도가 낮은 것으로 평가되어, 더욱 정확도가 높은 마커의 필요성을 확인할 수 있었다.
2-2. 유전자 발현 마커 1, 2 및 3종의 재발 예측 성능 평가
유전자 발현 마커 1, 2 및 3종으로 국소진행형 대장암 환자에서의 재발 예측 모델 성능을 평가하였다.
먼저, 유전자 각각을 예측변수로 놓고 재발여부를 종속변수로 하여 generalized logistic regression 방법으로 재발 예측 모델을 구축했을 때, 도 3에 제시된 바와 같이 CXCL8 하나의 마커만으로도 AUC가 0.7 이상의 성능을 나타냈다. 마커 1종 재발 예측 모델의 수식은 하기과 같으며, 이를 통해 재발 예측 확률(y)을 계산할 수 있다.
[수식 1]
y = -1.976 + 0.42*CXCL8
그리고, CXCL8과 다른 유전자들의 조합을 통해 가능한 모든 모델의 성능을 모두 확인하였고, 유전자 개수에 따라 가장 좋은 성능을 나타내는 모델들을 선별하였다. 동일 개수의 마커로 구성된 비슷한 성능의 모델 중에서는 유전자 발현량이 높은 마커가 포함된 모델을 선별하였다.
CXCL8에 IGF2 유전자를 추가해서 2개 유전자를 사용했을 때 모델 성능(AUC)이 0.701에서 0.721로 개선되는 것을 확인하였고, 이를 도 4에 나타내었다.
도 4에 제시된 바와 같이, CXCL8 및 IGF2, 2개 마커 사용 시 AUC는 0.721로 마커의 성능이 AUC>=0.7 이므로 정확하게 재발 여부를 예측할 수 있음을 확인하였고, 마커 2종 재발 예측 모델의 수식은 하기과 같으며, 이를 통해 재발 예측 확률(y)을 계산할 수 있다.
[수식 2]
y= 0.4164*CXCL8 -0 .5288*IGF2 -0.8559
또한 CXCL8에 IGF2와 KRT17, 2개 유전자를 추가해서 3개 유전자를 사용했을 때 모델 성능(AUC)이 0.701에서 0.752로 크게 개선되는 것을 확인하였고, 적은 수의 마커로 높은 성능을 구현할 수 있어서 최적모델로 선정하였으며, 그 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5에 제시된 바와 같이, CXCL8, IGF2, 및 KRT17 3개 마커 사용 시 AUC는 0.752로 마커의 성능이 AUC>=0.7 이므로 정확하게 재발 여부를 예측할 수 있음을 확인하였고, 마커 3종 재발 예측 모델의 수식은 하기과 같으며, 이를 통해 재발 예측 확률(y)을 계산할 수 있다.
[수식 3]
y = -1.567+ 0.455*CXCL8 -0.172*KRT17 -0.457*IGF2
2-3. 유전자 발현 마커 17종의 재발 예측 성능 평가
유전자발현 마커 17종(CXCL8 + COL10A1 + NOTUM + CST1 + TCN1 + WNT2 + PPBP + COL11A1 + MMP7 + CLDN2 + REG3A + SLCO1B3 + S100A2 + HCAR3 + KRT17 + IGF2 + SPP1)을 이용하여 국소진행형 대장암 환자에서의 재발 예측 모델 성능을 평가하였다.
구체적으로, 22개 마커 후보군의 유전자 발현량을 예측변수로 놓고 재발여부를 종속변수로 하는 binomial 분포의 generalized logistic regression 분석을 수행했는데, 가능한 모든 마커 조합에 대해 분석하였다.
그 중에서 가장 높은 예측 모델 성능을 나타낸 모델은 17개 유전자 (CXCL8 + COL10A1 + NOTUM + CST1 + TCN1 + WNT2 + PPBP + COL11A1 + MMP7 + CLDN2 + REG3A + SLCO1B3 + S100A2 + HCAR3 + KRT17 + IGF2 + SPP1)를 사용한 모델이고, 그 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6에 제시된 바와 같이, AUC는 0.831으로 마커의 성능이 AUC>=0.7 이므로 정확하게 재발 여부를 예측할 수 있음을 확인하였고, 마커 17종 재발 예측 모델의 수식은 하기과 같으며, 이를 통해 재발 예측 확률(y)을 계산할 수 있다.
[수식 4]
y = -2.637 +0.614*CXCL8 -0.066*COL10A1 +0.193*NOTUM -0.055*CST1 +0.205*TCN1 +0.074*WNT2 -0.091*PPBP -0.169*COL11A1 -0.006*MMP7 -0.289*CLDN2 +0.084*REG3A -0.165*SLCO1B3 -0.164*S100A2 -0.008*HCAR3 -0.121*KRT17 -0.271*IGF2 +0.063*SPP1
2-4. 유전자 발현 마커 20종의 재발 예측 성능 평가
유전자 발현 마커 20종(CXCL8 + COL10A1 + NOTUM + REG1B + KRT6B + CST1 + TCN1 + KRT23 + WNT2 + PPBP + COL11A1 + MMP7 + CLDN2 + REG3A + SLCO1B3 + S100A2 + CXCL5 + HCAR3 + KRT17 + DSG3)을 이용하여 국소진행형 대장암 환자에서의 재발 예측 모델 성능을 평가하였다.
구체적으로, 22개 마커 후보군의 유전자 발현량을 예측변수로 놓고 재발여부를 종속변수로 하는 binomial 분포의 generalized logistic regression 분석을 수행했는데, 가능한 모든 마커 조합에 대해 분석하였다.
그 중에서 상기 실시예 3-3.의 17개 마커를 사용한 모델과 함께 가장 높은 성능을 나타낸 모델은 20개 유전자(CXCL8 + COL10A1 + NOTUM + REG1B + KRT6B + CST1 + TCN1 + KRT23 + WNT2 + PPBP + COL11A1 + MMP7 + CLDN2 + REG3A + SLCO1B3 + S100A2 + CXCL5 + HCAR3 + KRT17 + DSG3)를 사용한 모델이고, 그 결과를 도 7, 도 9 및 도 10에 나타내었다.
도 7, 도 9 및 도 10에 제시된 바와 같이, 각 cohort 별로 AUC는 0.820, 0.727 및 1.000으로 마커의 성능이 AUC>=0.7 이므로 정확하게 재발 여부를 예측할 수 있음을 확인하였고, 마커 20종 재발 예측 모델의 수식은 하기과 같으며, 이를 통해 재발 예측 확률(y)을 계산할 수 있다.
[수식 5]
y = -3.937 -0.234*COL10A1 +0.343*NOTUM -0.046*REG1B -0.229*KRT6B -0.261*CST1 +0.389*TCN1 -0.104*PPBP -0.171*KRT23 +0.278*WNT2 +0.181*REG3A -0.294*COL11A1 +0.122*CXCL5 +0.055*MMP7 -0.421*CLDN2+0.636*CXCL8 -0.243*SLCO1B3 -0.026*S100A2 -0.243*KRT17 -0.074*HCAR3 +0.108*DSG3
실시예 3: 마커를 이용한 재발 예측 과정 및 맞춤형 치료 방법의 선택
3-1. 검사대상의 종양주변 정상조직 확보
대장암 환자의 수술 시 수술원칙에 따라 종양을 포함한 인접 대장을 암이 남지 않도록 충분한 안전 거리를 두고 절제하고, 더불어 암이 퍼지는 경로인 인근 림프절 및 혈관도 같이 절제해야 한다. 종양주변 정상조직은 이러한 안전확보의 원칙에 따라 제거된 수술로 제거된 조직에서 확보하여, 병리학자의 판단 하에 현미경적으로 정상으로 판단되는 조직을 의미한다.
본 발명에서 정의하는 종양주변 정상조직은 이러한 안전확보의 원칙에 따라 우측결장절제술, 횡행결장절제술, 좌측결장절제술 등 모든 범위의 근치적 대장암 수술로 제거된 조직에서, 병리학자의 판단 하에 현미경적으로 정상으로 판단되는 조직을 의미한다.
3-2. 종양주변 정상조직에서 RNA 추출
종양주변 정상조직에서 Qiagen RNeasy Mini Kit를 사용하여 RNA를 추출하고, RNA 수득양, RIN (RNA integrity number) 등으로 RNA 품질을 확인하여 이후 과정에 사용한다.
3-3. 유전자의 발현 수준(=발현량) 측정
종양주변 정상조직에서 추출한 RNA를 대상으로 전체 전사체 염기서열분석 (whole transcriptome sequencing)을 진행한다. 제조사의 프로토콜에 따라 TruSeq RNA Library Prep Kit v2 (Illumina, Inc.)을 사용하여 시퀀싱 라이브러리(Sequencing library)로 만든다. Illumina 사의 HiSeq 2500 Sequencing Platform에서 양쪽으로 읽는 paired-end sequencing을 실시하여 RNA 라이브러리를 시퀀싱 리드(sequencing read)로 변환, FASTQ 파일을 생산한다. FASTQ 파일에서 품질 불량을 제거한 후 시퀀싱 리드를 인간 표준유전체 (hg19)에 STAR (v2.5.2b) 소프트웨어를 이용해서 정렬하고, RSEM 소프트웨어 (v1.3)을 사용하여 전체 유전자의 발현량을 (카운트)을 측정한다.
3-4. 바이오 마커를 이용하여 재발 예후 예측모델 적용
본 발명에 따른 대장암 재발 예측 모델 및 재발 예측 모델 수식에, 환자의 종양주변 정상조직으로부터 측정한 유전자 발현량을 대입하여 각 환자의 재발 예측 확률을 계산하고, 계산된 각 환자의 재발 예측 확률을 이용하여, 재발 위험도에 따라 환자 맞춤형 치료방법을 적절하게 선택할 수 있다.
3-5. 재발 위험도에 따른 환자 맞춤형 치료방법 선택
현재 수술 후 보조요법으로 사용되는 치료제는 상기 언급한 바와 같이 5FU와 플래티넘 계열인 세포독성 항암제를 근간으로 한다. 수술 후 보조요법의 경우, S-AVANT 임상시험에서 베바시주맙(Bevacizumab)의 병합요법이 보조요법에서 효과를 보지 못하여 사용되지 않고 있는데, 모든 환자에서 일관되게 베바시주맙 병합이 효과가 없다기 보다는, 일부 효과가 있을 환자의 생존 증가 효과에 대비하여 베바시주맙 부작용으로 인한 문제가 더 크기 때문으로 해석하는 것이 타당하다. 재발한 환자의 경우는 혈관 형성 인자인 VEGF 유전체의 표적항암치료제인 베바시주맙을 5FU와 플래티넘 계열에 붙여서 쓰고 있기 때문이다.
또한, 재발 고위험군으로 판단된 환자들의 종양주변 조직에서 혈관 형성 인자인 VEGF 유전체와 관련된 역할을 하는 CXCL8 유전자 및 관련 유전자 세트의 발현량이 높음을 확인하였다. 따라서 베바시주맙을 포함한 VEGF 타겟 치료제의 병합 보조요법을 본 발명의 마커 후보군을 기반으로 NGS 패널 등 진단 키트를 개발한다면, 패널 검사를 통해 환자의 재발여부를 예측하여 재발확률이 높은 환자에게 VEGF 타겟 치료제의 병합 보조요법을 고려할 수 있을 것이며, 그 외에도 고위험군에게 현재 사용중인 이제(2제) 항암화학요법보다 강력한 삼제(3제) 항암화학요법을 쓰거나 현재보다 더 오랜 기간 동안 수술 후 항암화학요법을 실시하는 등 환자 맞춤형 치료방법을 선택할 수 있다.
소결.
상기 구체적인 실시예의 결과로부터, 대장암의 재발 가능성 예측 인자로서, 본 발명에 따른 재발 예측 바이오 마커는 기존 MSI 마커와 비교하여, 국소진행형 대장암 환자에서 재발 예측의 성능이 현저히 높으므로, 국소진행형 대장암 환자의 수술을 통해 획득된 종양주변 정상조직에서 본 발명에 따른 재발 예측 바이오 마커 유전자의 발현 수준을 측정하여 수술 후 높은 정확도로 환자의 이후 치료과정에서의 재발 여부를 예측할 수 있고, 이에 따라 환자에게 적합한 맞춤형 치료 방법을 선택할 수 있음을 시사한다.
국소진행형 대장암 환자의 종양주변 정상조직으로부터, 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 대장암 예후 예측용 조성물, 키트 및 정보제공방법에 관한 것이다.

Claims (19)

  1. 국소진행형 대장암 환자의 종양주변 정상조직으로부터, CXCL8 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 대장암 예후 예측용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 제제는 IGF2 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 추가로 포함하는 것인, 대장암 예후 예측용 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 제제는 KRT17 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 추가로 포함하는 것인, 대장암 예후 예측용 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 제제는 COL10A1, NOTUM, CST1, TCN1, WNT2, PPBP, COL11A1, MMP7, CLDN2, REG3A, SLCO1B3, S100A2, HCAR3, 및 SPP1 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 추가로 포함하는 것인, 대장암 예후 예측용 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 제제는 COL10A1, NOTUM, REG1B, KRT6B, CST1, TCN1, KRT23, WNT2, PPBP, COL11A1, MMP7, CLDN2, REG3A, SLCO1B3, S100A2, CXCL5, HCAR3, KRT17, 및 DSG3 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 추가로 포함하는 것인, 대장암 예후 예측용 조성물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머(primer), 프로브(probe), 안티센스 올리고 뉴클레오티드(antisense oligo nucleotide), 및 압타머(aptamer)로 이루어진 그룹에서 선택되는 1종 이상인 것인, 대장암 예후 예측용 조성물.
  7. 국소진행형 대장암 환자의 종양주변 정상조직으로부터, CXCL8 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 대장암 예후 예측용 키트.
  8. 제7항에 있어서, 상기 제제는 IGF2 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 추가로 포함하는 것인, 대장암 예후 예측용 키트.
  9. 제8항에 있어서, 상기 제제는 KRT17 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 추가로 포함하는 것인, 대장암 예후 예측용 키트.
  10. 제9항에 있어서, 상기 제제는 COL10A1, NOTUM, CST1, TCN1, WNT2, PPBP, COL11A1, MMP7, CLDN2, REG3A, SLCO1B3, S100A2, HCAR3, 및 SPP1 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 추가로 포함하는 것인, 대장암 예후 예측용 키트.
  11. 제7항에 있어서, 상기 제제는 COL10A1, NOTUM, REG1B, KRT6B, CST1, TCN1, KRT23, WNT2, PPBP, COL11A1, MMP7, CLDN2, REG3A, SLCO1B3, S100A2, CXCL5, HCAR3, KRT17, 및 DSG3 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 추가로 포함하는 것인, 대장암 예후 예측용 키트.
  12. 제7항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머(primer), 프로브(probe), 안티센스 올리고 뉴클레오티드(antisense oligo nucleotide), 및 압타머(aptamer)로 이루어진 그룹에서 선택되는 1종 이상인 것인, 대장암 예후 예측용 키트.
  13. 국소진행형 대장암 환자의 종양주변 정상조직으로부터, CXCL8 유전자의 발현 수준을 측정하는 측정 단계를 포함하는, 대장암 예후 예측을 위한 정보제공방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 측정 단계는 IGF2 유전자의 발현 수준을 추가로 측정하는 것인, 대장암 예후 예측을 위한 정보제공방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 측정 단계는 KRT17 유전자의 발현 수준을 추가로 측정하는 것인, 대장암 예후 예측을 위한 정보제공방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 측정 단계는 COL10A1, NOTUM, CST1, TCN1, WNT2, PPBP, COL11A1, MMP7, CLDN2, REG3A, SLCO1B3, S100A2, HCAR3, 및 SPP1 유전자의 발현 수준을 추가로 측정하는 것인, 대장암 예후 예측을 위한 정보제공방법.
  17. 제13항에 있어서, 측정 단계는 COL10A1, NOTUM, REG1B, KRT6B, CST1, TCN1, KRT23, WNT2, PPBP, COL11A1, MMP7, CLDN2, REG3A, SLCO1B3, S100A2, CXCL5, HCAR3, KRT17, 및 DSG3 유전자의 발현 수준을 추가로 측정하는 것인, 대장암 예후 예측을 위한 정보제공방법.
  18. 제13항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 측정 단계는 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머(primer), 프로브(probe), 안티센스 올리고 뉴클레오티드(antisense oligo nucleotide), 및 압타머(aptamer)로 이루어진 그룹에서 선택되는 1종 이상을 이용하여 상기 유전자의 발현 수준을 측정하는 것인, 대장암 예후 예측을 위한 정보제공방법.
  19. 제13항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 측정 단계 이후 측정된 유전자의 발현 수준을 이용하여 대장암의 재발 가능성을 계산하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 대장암 예후 예측을 위한 정보제공방법.
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