WO2018169145A1 - 진행성 위암 환자의 수술 후 예후 또는 항암제 적합성 예측 시스템 - Google Patents

진행성 위암 환자의 수술 후 예후 또는 항암제 적합성 예측 시스템 Download PDF

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WO2018169145A1
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anticancer drug
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wars
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정재호
노성훈
허용민
김현기
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(주) 노보믹스
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Definitions

  • the present invention relates to a system capable of predicting prognosis or anticancer drug suitability using quantitative test values of mRNA expression levels of a prognostic or anticancer drug marker group and a reference gene group in patients with advanced gastric cancer.
  • Gastric cancer is the third highest cancer death rate worldwide, and is the most common cancer except thyroid cancer, which is known to have a relatively good prognosis.
  • the survival rate of gastric cancer patients has improved a lot by early detection, standardization of surgery, and the discovery of anticancer drugs through national health examinations.However, despite the standardized treatment, about half of stage 2 and 3 advanced gastric cancers still survive. A degree of patient experiences a relapse.
  • Cancer is recognized as a genome disease, and according to the development of genome testing technology such as NGS (Next Generation Sequencing), there is an effort to classify cancer according to molecular biological characteristics, not classification according to existing anatomical and pathological phenotypes. come.
  • NGS Next Generation Sequencing
  • the Cancer Genome Atlas (TCGA) project has recently reported that gastric cancer can be divided into four types according to its various molecular characteristics. This means that even in anatomically identical stages, the prognosis and response to anticancer drugs may differ according to molecular biological characteristics.
  • gastric cancer was: 1 EBV positive gastric cancer (Epstein-Barr virus positive, EBV positive) 2 Microsatellite instability-high (MSI-H), 3 Chromosome Chromosomal instability (CIN) 4 Genomeically stable gastric cancer (Genomically stable, GS) is divided into four.
  • This massive cancer genome sequencing shows that gastric cancer is not divided into a single carcinoma but is divided into heterogeneous, subgroups of molecular genetics. Therefore, in order to realize personalized treatment of gastric cancer, it is necessary to identify and apply each target gene by distinguishing subtypes based on molecular genetic and pathological characteristics.
  • the prognosis has been reported according to the subtype of gastric cancer.
  • the patient's prognosis can be predicted after chemotherapy following gastric cancer surgery, it will be the basis for establishing a treatment strategy according to each prognosis.
  • postoperative adjuvant chemotherapy is used in all patients in stages 2 and 3 of advanced gastric cancer. This may be undertreatment for a poor prognosis group. In other words, it can be said that it has a clinical meaning to develop a strategy for an additional treatment method in addition to the current standard treatment for a group of patients with poor prognosis.
  • Predictive Cluster S anti-cancer drug group
  • Predictive Cluster R anti-cancer drug group
  • the Predictive Cluster R and the Prognostic Cluster I can prevent the overtreatment of continuing use of the existing anticancer drugs, while the Predictive Cluster S can use the conventional treatment.
  • the Predictive Cluster R and the Prognostic Cluster III may be segmented to induce the development of aggressive renal therapies.
  • the purpose of the present invention is to predict the prognosis or anticancer agent suitability of advanced gastric cancer through the quantification of the marker gene group and the reference gene group which can predict the prognosis or anticancer drug suitability after surgery in patients with advanced gastric cancer (2nd-3rd stage: AJCC 6th edition). It is to provide a composition for.
  • Another object of the present invention is to provide a method for providing information for predicting prognosis or anticancer drug suitability in terms of survival rate of patients through the quantification of marker gene group and reference gene group that can predict the prognosis or anticancer drug suitability after surgery in patients with advanced gastric cancer. To provide.
  • compositions for predicting prognosis or anticancer drug suitability in stages 2 and 3 of gastric cancer including an agent for measuring the expression level of mRNA of a reference gene group including ACTB, ATP5E, GPX1, UBB, and HPRT1.
  • the present invention also provides a kit for predicting the prognosis or anticancer drug suitability of the second and third gastric cancer, comprising the composition for predicting the prognosis or anticancer drug suitability of the second and third gastric cancer.
  • the invention also relates to the invention.
  • mRNAs of the prognostic or anticancer drug marker gene family including WARS, GZMB, CDX1, and SFRP4, and the reference gene family, including ACTB, ATP5E, GPX1, UBB, and HPRT1, in biological samples from stage 2 and 3 tumors Measuring levels and calculating ⁇ Cq values of each prognostic or anticancer drug marker gene according to Equation 1 below;
  • the ⁇ Cq values of the GZMB and WARS of the biological sample are higher than the final thresholds of the preset baseline GZMB and WARS, then they are classified as Prognostic Cluster I and at least one ⁇ Cq value of the GZMB and WARS of the biological sample is If lower than the final threshold of the set baseline GZMB or WARS, the ⁇ Cq value of the SFRP4 of the biological sample is compared to the final threshold of the preset baseline SFRP4, and if the ⁇ Cq value is lower, it is classified as a Prognostic Cluster II, and the ⁇ Cq value. This higher case includes a classification as a Prognostic Cluster III,
  • the predetermined baseline final thresholds of the prognostic or anticancer drug marker genes are -2.14, -5.18, -2.69 and -3.63 for WARS, GZMB, CDX1 and SFRP4, respectively.
  • the final threshold is to obtain the ⁇ Cq value of the prognostic or anticancer drug marker markers, including WARS, GZMB, CDX1 and SFRP4 in stage 2 and 3 tumor tissue samples, and using the ⁇ Cq value adaptive regression number for each gene ( an adaptive regression value is calculated, and a final threshold value for each gene is calculated by adding a correction value for each gene to the adaptive regression value, and the adaptive regression values for the WARS, GZMB, CDX1, and SFRP4 are calculated. It provides a way to provide information for predicting prognosis for stages 2 and 3 of gastric cancer, with -2.54, -5.58, -3.59 and -4.53, respectively, with corrections of +0.4, +0.4, +0.9 and +0.9, respectively:
  • ⁇ Cq (Cq value of reference gene group)-(Cq value of prognostic or anticancer drug marker gene)
  • the Cq value of the reference gene group represents the average Cq value of the reference genes including ACTB, ATP5E, GPX1, UBB, and HPRT1.
  • the invention also relates to the invention.
  • mRNAs of the prognostic or anticancer drug marker gene family including WARS, GZMB, CDX1, and SFRP4, and the reference gene family, including ACTB, ATP5E, GPX1, UBB, and HPRT1, in biological samples from stage 2 and 3 tumors Measuring levels and calculating ⁇ Cq values of each prognostic or anticancer drug marker gene according to Equation 1 below;
  • the ⁇ Cq values of GZMB and WARS of the biological sample are higher than the final thresholds of the predetermined baseline GZMB and WARS, they are classified as Predictive Cluster R, and at least one ⁇ Cq value of the GZMB and WARS of the biological sample is If lower than the final threshold of the set baseline GZMB or WARS, the ⁇ Cq value of the CDX1 of the biological sample is compared to the final threshold of the preset baseline CDX1, and if the ⁇ Cq value is lower, classify it as a Predictive Cluster R, and ⁇ Cq. If the value is higher comprises the step of classifying anti-cancer drug response group (Predictive Cluster S),
  • the predetermined baseline final thresholds of the prognostic or anticancer drug marker genes are -2.14, -5.18, -2.69 and -3.63 for WARS, GZMB, CDX1 and SFRP4, respectively.
  • the final threshold is to obtain the ⁇ Cq value of the prognostic or anticancer drug marker markers, including WARS, GZMB, CDX1 and SFRP4 in stage 2 and 3 tumor tissue samples, and using the ⁇ Cq value adaptive regression number for each gene ( an adaptive regression value is calculated, and a final threshold value for each gene is calculated by adding a correction value for each gene to the adaptive regression value, and the adaptive regression values for the WARS, GZMB, CDX1, and SFRP4 are calculated.
  • ⁇ Cq (Cq value of reference gene group)-(Cq value of prognostic or anticancer drug marker gene)
  • the Cq value of the reference gene group represents the average Cq value of the reference genes including ACTB, ATP5E, GPX1, UBB, and HPRT1.
  • the present invention develops an algorithm for predicting prognosis and anticancer drug suitability in terms of overall survival rate and disease-free survival rate by using quantitative test results of mRNA expression levels of advanced gastric cancer or anticancer drug marker gene group and reference gene group. It can be used as an aid in determining the treatment of gastric cancer patients.
  • Figure 1 shows the results of confirming the expression amount of the target gene in the paraffin embedding sample for selection of the reference gene.
  • FIG. 2 is a ⁇ Cq value representing the adaptive regression value of the prognostic and anticancer agent marker genes, with corrections of +0.4, +0.4, +0.9, and +0.9 of WARS, GZMB, CDX1, and SFRP4. Add to determine the final threshold.
  • Figure 3 is a result showing the classification of a good prognosis (Prognostic Cluster I) classified in the immunity axis (Immune Axis) in the first-class classification of the discretization-based bilayer classification system of the present invention.
  • Figure 4 is a result showing the classification of anticancer drug (Predictive Cluster R) classified in the immune axis (Immune Axis) during the first-class classification of the discretization-based bilayer classification system of the present invention.
  • Figure 5 is a result showing the classification of intermediate and poor prognosis (Prognostic Cluster II & III) in the stem-like axis (Stem-like Axis) in the two-layer classification of the discretization-based bilayer classification system of the present invention.
  • Figure 6 is a result showing the classification of anticancer drug response group (Predictive Cluster S & R) in the epithelial axis (Epithelail Axis) during the bilayer classification of the discretization-based bilayer classification system of the present invention.
  • Figure 7 is a schematic diagram of a discretization-based two-layer classification system of the prognostic cluster (Prognostic Cluster I, II, III) and anti-cancer drug classification (Predictive Cluster R & S) of the present invention.
  • FIG. 8 shows Kaplan-Meir Curve (a) and log rank test results thereof for the 5-year overall survival rate of the prognostic group by an algorithm capable of predicting the prognosis of the advanced gastric cancer according to the present invention and anticancer drug suitability. It is shown.
  • Figure 9 shows the Kaplan-Meir Curve (a) and its log rank test results (b) for the 5-year disease-free survival rate of the prognostic group by an algorithm that can predict the prognosis and advanced anticancer drug suitability of advanced gastric cancer of the present invention.
  • FIG. 10 shows p value (a) of Kaplan-Meier curves and log rank test and overall disease-free survival for 5-year overall survival in gastric cancer patients treated with chemotherapy (CTX) or not (Surgery only). Kaplan-Meier curves for and p value (b) of the log rank test is indicated.
  • CTX chemotherapy treatment
  • Predictive Cluster S chemotherapy of the anticancer drug response group
  • Kaplan Meier curves and p- rank of the log rank test for the 5-year overall survival rate are given in.
  • CTX chemotherapy treatment
  • Predictive Cluster S chemotherapy of the anticancer drug response group
  • Kaplan-Meier curves for the five-year disease free survival rate and the p- value of the log rank test are shown.
  • Figure 13 is a gastric cancer patient who received chemotherapy treatment (CTX) or not (Curge) or chemotherapy of anticancer drug refractory group (Predictive Cluster R) by an algorithm that can predict the anticancer response potential of advanced gastric cancer of the present invention (CTX). Kaplan-Meier curves and log-rank test p- values for overall 5-year survival rates are given in.
  • CTX chemotherapy treatment
  • Dege chemotherapy of anticancer drug refractory group
  • Predictive Cluster R Predictive Cluster R
  • CTX chemotherapy treatment
  • Determinive Cluster R chemotherapy of the anticancer drug refractory group
  • Kaplan-Meier curves for the five-year disease free survival rate and the p- value of the log rank test are shown.
  • FIG. 15 shows p of Kaplan-Meier curves and roguerank test for 5-year overall survival of XELOX (Xeloda + Oxaliplatin) chemotherapy treatment group (CTX) and Surgery only group in Classic Trial sample. The value is written.
  • FIG. 16 shows Kaplan-Meir Curve (a) and log rank test results for the 5-year overall survival rate of the prognostic taxon in the classical clinical trial sample by an algorithm for predicting the prognosis and anticancer drug suitability of advanced gastric cancer according to the present invention. (b) is shown.
  • FIG. 17 shows p of Kaplan-Meier curves and logrank test for 5-year disease free survival of patients receiving XELOX (Xeloda + Oxaliplatin) chemotherapy treatment (CTX) and Surgery only in classic clinical trial samples. The value is written.
  • XELOX Xeloda + Oxaliplatin
  • CTX chemotherapy treatment
  • 19 is an algorithm for predicting the anticancer response potential of advanced gastric cancer according to the present invention, and a group of patients who received XELOX (Xeloda + Oxaliplatin) chemotherapy treatment in XELOX anti-cancer drug response group (Predictive Cluster S) in classical clinical trial samples Kaplan-Meier curves and log-rank test p- values for the five-year overall survival of CTX and Surgery only.
  • XELOX Xeloda + Oxaliplatin
  • XELOX anti-cancer drug response group Predictive Cluster S
  • 20 is an algorithm predicting the anticancer response potential of advanced gastric cancer according to the present invention, and a group of patients who received XELOX (Xeloda + Oxaliplatin) chemotherapy treatment in the XELOX anti-cancer drug response group (Predictive Cluster S) in classical clinical trial samples Kaplan-Meier curves and log-rank test p- values for the 5-year disease-free survival of CTX and Surgery only.
  • XELOX Xeloda + Oxaliplatin
  • FIG. 21 is an algorithm predicting the anticancer response potential of advanced gastric cancer according to the present invention. ) And the p- value of the Kaplan-Meier curves and the log rank test for the 5-year overall survival rate of the Surgery only group.
  • FIG. 22 is an algorithm for predicting the anticancer response potential of advanced gastric cancer according to the present invention. ) And the p- value of the Kaplan-Meier curves and the log rank test for the 5-year disease free survival rate of the Surgery only group.
  • Figure 23 shows the Kaplan-Meier curves for the overall 5-year survival rate of the prognosis group when evaluating the clinical performance of the algorithm for predicting the prognosis of advanced gastric cancer of the present invention.
  • the present invention is a.
  • the present invention relates to a composition for predicting prognosis or anticancer drug suitability in stages 2 and 3 of gastric cancer, including an agent for measuring the expression level of mRNA of a reference gene group including ACTB, ATP5E, GPX1, UBB, and HPRT1.
  • composition for predicting the prognosis or anticancer drug suitability of the second and third stages of the gastric cancer of the present invention is characterized in that it can be used for predicting the prognosis and anticancer drug suitability of patients with advanced gastric cancer.
  • progressive gastric cancer refers to gastric cancer corresponding to stages 2 to 3 on the basis of AJCC 6 edition.
  • the term “prognostic or anticancer drug marker gene” refers to a marker that can distinguish between normal or pathological conditions, predict 5-year survival after treatment, or objectively measure predictive response to treatment.
  • the genes that can be used to predict the prognosis and the anticancer drug suitability of advanced gastric cancer, genes that show differential mRNA expression levels that increase or decrease with respect to the prognosis or anticancer drug response.
  • Four marker genes (WARS, GZMB) representing the Immune module and four marker genes (SFRP4 and CDX1) representing the Stem-like module and Epithelial module were selected.
  • the term "reference gene” refers to a gene that always stably expresses. That is, it is used to examine the expression level of the marker gene by comparing the expression level of the reference gene with the expression level of the reference gene as a gene that is constantly expressed in any tissue. That is, since there is a quality difference and a variation depending on the storage organ for each sample, it is difficult to determine the measured amount as a biological variation even when the gene expression level is measured. Therefore, the gene expression amount ( ⁇ Cq) between samples is determined through normalization.
  • the standardization method includes a method by a quantile, a global normalization method, a method by a reference gene, and the like, but the present invention uses standardization by a reference gene.
  • a single gene as a reference gene can be less accurate, it is possible to select a plurality of genes and examine the variability to select a reference gene suitable for the characteristics of the tissue.
  • genes disclosed in the literature related to gastric cancer or used in existing commercialized products are selected, and whether or not the genes are qualified for the selected genes are used as reference genes.
  • a gene having the smallest variance through qPCR is selected as a reference gene by comparing cancer tissues and normal tissues of esophageal cancer, pancreatic cancer, gastric cancer, and colon cancer with 21 reference genes disclosed in the literature. It was.
  • ACTB ACTB
  • ATP5E HPRT1
  • PGK1 GPX1
  • RPL29 UBB
  • VDAC2 VDAC2
  • a gene group consisting of ACTB, ATP5E, GPX1, UBB, and HPRT1 was used as a reference gene to predict.
  • the term "measurement of expression level of mRNA” refers to a process of confirming the mRNA expression of prognostic or anticancer drug marker genes or reference genes in a biological sample to predict the possibility of recurrence or anticancer reaction of advanced gastric cancer. It means to measure.
  • Analytical methods for this purpose include reverse transcriptase (RT-PCR), competitive reverse transcriptase (RT) PCR, real-time reverse transcriptase (Real-time RT-PCR), RNase protection assay (RPA). assays, Northern blotting, DNA chips, etc., but are not limited thereto.
  • the agent for measuring the expression level of the prognostic or anticancer drug marker gene and the reference gene mRNA comprises a primer, a probe or an antisense nucleotide that specifically binds to the prognostic or anticancer drug marker gene and the mRNA of the reference gene.
  • a primer a probe or an antisense nucleotide that specifically binds to the prognostic or anticancer drug marker gene and the mRNA of the reference gene.
  • the term “primer” is a fragment that recognizes a target gene sequence, which includes primer pairs in the forward and reverse directions, but is preferably a primer pair that provides an analysis result with specificity and sensitivity. High specificity can be imparted when the nucleic acid sequence of the primer is a sequence that is inconsistent with the non-target sequence present in the sample so that only the target gene sequence containing the complementary primer binding site is amplified and does not cause nonspecific amplification. .
  • the primer set described in SEQ ID NOS: 1-18 can be used.
  • SFRP4 refers to primer sets of SEQ ID NOs: 1 and 2 with reference to 1298-1361 of NM_003014.2
  • GZMB refers to primer sets of SEQ ID NOs: 3 and 4 with reference to 213-277 of NM_004131.3
  • WARS refers to primer sets of SEQ ID NOs: 5 and 6 with reference to 408-480 of NM_173701.1
  • CDX1 refers to primer sets of SEQ ID NOs: 7 and 8 with reference to 1319-1385 of NM_001804.2
  • ACTB refers to the primer set of NM_001101
  • ATP5E refer to 531-597 of NM_000194.1 with reference to 278-349
  • GPX1 refer to 308-378 of NM
  • the term "probe” refers to a substance that can specifically bind to a target substance to be detected in a sample, and means a substance that can specifically confirm the presence of the target substance in the sample through the binding.
  • the type of probe is a material commonly used in the art, but is not limited.
  • the probe may be a peptide nucleic acid (PNA), a locked nucleic acid (LNA), a peptide, a polypeptide, a protein, an RNA, or a DNA.
  • the probes are biomaterials, including those derived from or similar to organisms or produced in vitro, for example, enzymes, proteins, antibodies, microorganisms, animal and plant cells and organs, neurons, DNA, and It may be RNA, DNA includes cDNA, genomic DNA, oligonucleotides, RNA includes genomic RNA, mRNA, oligonucleotides, examples of proteins may include antibodies, antigens, enzymes, peptides and the like.
  • the probe of SEQ ID NOS: 19-27 for qPCR measurement can be used.
  • the probe may be fluorescently labeled.
  • antisense refers to the nucleotide base of an antisense oligomer that hybridizes with a target sequence in RNA by Watson-Crick base pairing, typically allowing formation of mRNA and RNA: oligomeric heterodimers within the target sequence. Oligomer with backbone between sequence and subunit. The oligomer may have exact sequence complementarity or approximate complementarity to the target sequence.
  • the term “prognostic or predictive of anticancer drug suitability” refers to determining the susceptibility of a subject to a particular disease or condition, prognosis (eg, pre-metastasis) of the subject with a particular disease or condition. Or determining the metastatic cancer state, determining the stage of the cancer or determining the responsiveness of the cancer to treatment), or therametrics (eg, monitoring the state of the subject to provide information about the efficacy of the treatment). It includes.
  • the prognosis of gastric cancer patients after surgery and the suitability of anticancer drugs are predicted in terms of survival rates such as overall survival and disease free survival.
  • Gastric cancer stage 2 and 3 prognosis or anticancer drug predictive composition may further comprise a pharmaceutically acceptable carrier.
  • Such pharmaceutically acceptable carriers include carriers and vehicles commonly used in the pharmaceutical arts, and in particular, ion exchange resins, alumina, aluminum stearate, lecithin, serum proteins (eg, human serum albumin), buffer materials (eg, Various phosphates, glycine, sorbic acid, potassium sorbate, partial glyceride mixtures of saturated vegetable fatty acids), water, salts or electrolytes (e.g.
  • protamine sulfate disodium hydrogen phosphate, carbohydrogen phosphate, sodium chloride and zinc salts
  • gelatinous Silica magnesium trisilicate
  • polyvinylpyrrolidone polyvinylpyrrolidone
  • cellulosic substrates polyethylene glycols, sodium carboxymethylcellulose, polyarylates, waxes, polyethylene glycols or wool, and the like.
  • composition of the present invention may further include a lubricant, a humectant, an emulsifier, a suspending agent, or a preservative in addition to the above components.
  • the present invention also relates to a kit for predicting prognosis or anticancer drug suitability of stages 2 and 3 of gastric cancer comprising a composition for predicting prognosis or anticancer drug suitability of stages 2 and 3 of gastric cancer.
  • the kit may be an RT-PCR kit, a DNA chip kit, or the like.
  • the kit for predicting prognosis or anticancer drug suitability of stages 2 and 3 of gastric cancer may further include one or more types of other component compositions, solutions or devices suitable for analytical methods.
  • the diagnostic kit may further include essential elements necessary to perform reverse transcriptase.
  • the reverse transcription polymerase kit includes primer pairs specific for the gene encoding the marker protein.
  • the primer is a nucleotide having a sequence specific to the nucleic acid sequence of the gene, it may have a length of about 7 bp to 50 bp, more preferably about 10 bp to 30 bp. It may also include primers specific for the nucleic acid sequence of the control gene.
  • reverse transcriptase kits include test tubes or other suitable containers, reaction buffers (pH and magnesium concentrations vary), deoxynucleotides (dNTPs), enzymes such as Taq-polymerase and reverse transcriptase, DNase, RNase inhibitor DEPC - May include DEPC-water, sterile water, and the like.
  • the kit for predicting the prognosis or anticancer drug suitability of the second and third gastric cancer stage of the present invention may include the necessary elements necessary to perform the DNA chip.
  • the DNA chip kit may include a substrate on which a cDNA or oligonucleotide corresponding to a gene or a fragment thereof is attached, and a reagent, a preparation, an enzyme, or the like for preparing a fluorescent label probe.
  • the substrate may comprise cDNA or oligonucleotide corresponding to the control gene or fragment thereof.
  • the invention also relates to the invention.
  • mRNAs of the prognostic or anticancer drug marker gene family including WARS, GZMB, CDX1, and SFRP4, and the reference gene family, including ACTB, ATP5E, GPX1, UBB, and HPRT1, in biological samples from stage 2 and 3 tumors Measuring levels and calculating ⁇ Cq values of each prognostic or anticancer drug marker gene according to Equation 1 below;
  • the ⁇ Cq values of the GZMB and WARS of the biological sample are higher than the final thresholds of the preset baseline GZMB and WARS, then they are classified as Prognostic Cluster I and at least one ⁇ Cq value of the GZMB and WARS of the biological sample is If lower than the final threshold of the set baseline GZMB or WARS, the ⁇ Cq value of the SFRP4 of the biological sample is compared to the final threshold of the preset baseline SFRP4, and if the ⁇ Cq value is lower, it is classified as a Prognostic Cluster II, and the ⁇ Cq value. This higher case includes a classification as a Prognostic Cluster III,
  • the predetermined baseline final thresholds of the prognostic or anticancer drug marker genes are -2.14, -5.18, -2.69 and -3.63 for WARS, GZMB, CDX1 and SFRP4, respectively.
  • the final threshold is to obtain the ⁇ Cq value of the prognostic or anticancer drug marker markers, including WARS, GZMB, CDX1 and SFRP4 in stage 2 and 3 tumor tissue samples, and using the ⁇ Cq value adaptive regression number for each gene ( an adaptive regression value is calculated, and a final threshold value for each gene is calculated by adding a correction value for each gene to the adaptive regression value, and the adaptive regression values for the WARS, GZMB, CDX1, and SFRP4 are calculated. It relates to a method for providing information for prognostic prediction of stages 2 and 3 of gastric cancer, with -2.54, -5.58, -3.59 and -4.53, respectively, with correction values of +0.4, +0.4, +0.9 and +0.9, respectively:
  • ⁇ Cq (Cq value of reference gene group)-(Cq value of prognostic or anticancer drug marker gene)
  • the Cq value of the reference gene group represents the average Cq value of the reference genes including ACTB, ATP5E, GPX1, UBB, and HPRT1.
  • mRNAs of the prognostic or anticancer drug marker gene family including WARS, GZMB, CDX1, and SFRP4, and the reference gene family, including ACTB, ATP5E, GPX1, UBB, and HPRT1, in biological samples from stage 2 and 3 tumors Measuring levels and calculating ⁇ Cq values of each prognostic or anticancer drug marker gene according to Equation 1 below;
  • the ⁇ Cq values of GZMB and WARS of the biological sample are higher than the final thresholds of the predetermined baseline GZMB and WARS, they are classified as Predictive Cluster R, and at least one ⁇ Cq value of the GZMB and WARS of the biological sample is If lower than the final threshold of the set baseline GZMB or WARS, the ⁇ Cq value of the CDX1 of the biological sample is compared to the final threshold of the preset baseline CDX1, and if the ⁇ Cq value is lower, classify it as a Predictive Cluster R, and ⁇ Cq. If the value is higher comprises the step of classifying anti-cancer drug response group (Predictive Cluster S),
  • the predetermined baseline final thresholds of the prognostic or anticancer drug marker genes are -2.14, -5.18, -2.69 and -3.63 for WARS, GZMB, CDX1 and SFRP4, respectively.
  • the final threshold is to obtain the ⁇ Cq value of the prognostic or anticancer drug marker markers, including WARS, GZMB, CDX1 and SFRP4 in stage 2 and 3 tumor tissue samples, and using the ⁇ Cq value adaptive regression number for each gene ( an adaptive regression value is calculated, and a final threshold value for each gene is calculated by adding a correction value for each gene to the adaptive regression value, and the adaptive regression values for the WARS, GZMB, CDX1, and SFRP4 are calculated.
  • ⁇ Cq (Cq value of reference gene group)-(Cq value of prognostic or anticancer drug marker gene)
  • the Cq value of the reference gene group represents the average Cq value of the reference genes including ACTB, ATP5E, GPX1, UBB, and HPRT1.
  • the first step is to calculate the ⁇ Cq values of the prognostic or anticancer drug marker genes by measuring the expression level of the prognostic or anticancer drug marker gene group and the reference gene group in the biological samples obtained from stage 2 and 3 tumors. Steps.
  • MRNA levels of the prognostic or anticancer compatibility marker gene group and the reference gene group were determined by reverse transcriptase polymerase reaction, competitive reverse transcriptase polymerase reaction, real-time reverse transcriptase polymerase reaction, RNase protection assay, Northern blotting or DNA chip. Can be measured through More preferably, it can be measured by real time RT-PCR, and mRNA expression level can be obtained as a cycle quantitation value.
  • ⁇ Cq values are calculated according to Equation 1 below using the Cq values of the prognostic or anticancer drug marker groups and the reference gene group obtained above.
  • ⁇ Cq (Cq value of reference gene group)-(Cq value of prognostic or anticancer drug marker gene)
  • the Cq value of the reference gene group represents the average Cq value of the reference genes including ACTB, ATP5E, GPX1, UBB, and HPRT1.
  • the ⁇ Cq value is a standardized expression level of the marker gene. The larger the ⁇ Cq value, the higher the gene expression.
  • the second step is to classify the prognostic group of the biological sample as compared to a predetermined baseline final threshold of the prognostic or anticancer drug marker genes.
  • the final threshold on which the prognostic or anticancer drug marker genes are based is preset for the prognostic group.
  • Cq values according to the mRNA expression level of prognostic or anticancer drug marker genes including WARS, GZMB, CDX1 and SFRP4 in stage 2 and 3 tumor tissue samples and normal tissue samples were obtained and the ⁇ Cq values according to Equation 1 above.
  • ARV adaptive regression value
  • the values taken from the array process the data based on median or average, but the adaptive regression algorithm divides the data when an arbitrary point in the whole data is used as a break point. Set the point where the variance of the value mean is greatest to the adaptive regression number (or threshold).
  • the threshold is a reference point for distinguishing high and low expression of biological significance in the normal and cancerous tissues of the gene.
  • the adaptive regression number is obtained as follows.
  • p-value corresponding to tail-probability of F-distribution is as follows.
  • the method of the present invention uses the one step method above when a random point is selected from the total data for each gene.
  • the point that maximizes statistics is determined by ARV, and the final value is determined by adding the correction value.
  • the ARS value obtained by analyzing the ⁇ Cq value and the WARS, GZMB, SFRP4 constituting the Prognosis Axis and the WARS, GZMB, CDX1 constituting the Predictive Axis, WARS, GZMB is 0.4 ⁇ 0.5, SFRP4 based on the ⁇ Cq.
  • the adaptive regression values of WARS, GZMB, CDX1 and SFRP4 are -2.54, -5.58, -3.59, -4.53 and correction values are +0.4, +0.4, +0.9 and +0.9, respectively.
  • the final thresholds of the marker genes, ie WARS, GZMB, CDX1 and SFRP4, obtained by adding the correction value to the adaptive regression value are -2.14, -5.18, -2.69 and -3.63, respectively.
  • a prognostic cluster and a predictive cluster classification of anticancer drugs are performed by a binary signal based two tier system. That is, group classification according to an algorithm for predicting the possibility of recurrence or anticancer reaction of advanced gastric cancer of the present invention is shown in detail in FIG. 7.
  • ⁇ Cq values of the GZMB and WARS of the biological sample are higher than the final thresholds of the preset baseline GZMB and WARS, then they are classified as a good prognostic cluster (Prognostic Cluster I).
  • the ⁇ Cq value of the SFRP4 of the biological sample is lower than the final threshold of the preset reference SFRP4. It can be classified as a Prognostic Cluster II, and can be classified as a Prognostic Cluster III if the value of ⁇ Cq is higher.
  • the ⁇ Cq values of the GZMB and WARS of the biological sample are higher than the final thresholds of the predetermined baseline GZMB and the WARS, they are classified as Predictive Cluster R and at least one ⁇ Cq value of the GZMB and WARS of the biological sample. If it is lower than the final threshold of the preset baseline GZMB or WARS, the ⁇ Cq value of the CDX1 of the biological sample is compared to the final threshold of the preset baseline CDX1, and if the ⁇ Cq value is lower, then it is classified as a predictive cluster R. If the ⁇ Cq value is higher, it can be classified as anti-cancer drug response group (Predictive Cluster S).
  • the biological sample may be a fresh tumor tissue, a fresh frozen tumor tissue, a paraffin embedded tumor tissue, fine needle aspirating fluid, ascites, tubular lavage fluid or pleural fluid, and preferably a paraffin embedded tumor tissue.
  • the expression level of mRNA of the prognostic or anticancer drug marker group and the reference gene group may be measured by reverse transcriptase polymerase reaction, competitive reverse transcriptase polymerase reaction, real time reverse transcriptase polymerase reaction, RNase protection assay, Northern blotting or DNA.
  • reverse transcriptase polymerase reaction competitive reverse transcriptase polymerase reaction
  • real time reverse transcriptase polymerase reaction RNase protection assay
  • Northern blotting or DNA can be performed by a chip.
  • it may be a real time RT-PCR.
  • RT-qPCR experiments were performed using the nProfiler I kit, using the patient's total RNA (400 ng / 18 ⁇ l) and dispersing Gene Specific Primer (GSP) MIX (3 ⁇ l) in the sample.
  • GSP Gene Specific Primer
  • the 2720 thermal cycler (Applied Biosystems) was raised to 50 ° C. and samples were loaded. RNA samples were denatured at 65 ° C. for 5 minutes and the thermal cycler was stopped.
  • RT Buffer (6 ⁇ l) and 2 ⁇ l of RT MIX were added for RT, synthesized at 37 ° C. for 60 minutes and then held at 70 ° C. for 15 minutes.
  • cDNA MIX 3 ⁇ L
  • each of 9 primer-probe MIX 2 ⁇ L, Gene-1 to Gene-9 from Kit
  • the sample was subjected to one cycle for 120 seconds at 95 ° C as an enzyme activation step, and 40 cycles of denaturation at 95 ° C for 10 seconds and detection at 60 ° C for 30 seconds.
  • the extracted data was analyzed by nDxI program (Novomics Co., Ltd.).
  • RT and qPCR processes are prepared by nProfiler I, which is an mRNA based qPCR Kit consisting of nine genes for gastric cancer.
  • the reagents used are shown in Table 1.
  • the nine genes above are four marker genes and five reference genes with statistical significance in microarray and RT-qPCR data of fresh frozen tissue and RT-qPCR data in paraffin-embedded samples.
  • nProfiler I stomach cancer assay a diagnostic kit that can classify prognosis by expression level of these selected genes.
  • Marker genes distinguish heterogeneity of gastric cancer and can be stably measured in cancer tissues, that is, marker genes (WARS and GZMB) that can represent the immune axis (WARS, GZMB) and similar stem cells (Stem-) four marker genes (SFRP4) and epidermal axis (CDX1).
  • WARS and GZMB marker genes
  • WARS, GZMB immune axis
  • Stem- stem cells
  • SFRP4 marker genes
  • CDX1 epidermal axis
  • Prognostic Cluster I good prognosis
  • Prognostic Cluster II intermediate prognosis
  • Prognostic Cluster III bad prognosis
  • Predictive Cluster S anti-cancer drug response group
  • Predictive Cluster R anti-cancer drug rejection group
  • Prognostic cluster and Predictive Cluster classification based on Binary signal based two tier system were used to prepare this divisional framework.
  • ⁇ Cq values of the respective marker genes were calculated as shown in Equation 1 below to normalize mRNA expression levels:
  • the Cq value of the reference gene group represents the average Cq value of the reference genes consisting of ACTB, ATP5E, GPX1, UBB, and HPRT1.
  • the ⁇ Cq value was applied to adaptive regression to calculate the adaptive regression value (A.R.V.).
  • the values taken from the array process the data based on median or average, but the adaptive regression algorithm divides the data when an arbitrary point in the whole data is used as a break point. Set the point where the variance of the value mean is greatest to the adaptive regression number (or threshold).
  • the threshold is a reference point for distinguishing high and low expression of biological significance in the normal and cancerous tissues of the gene.
  • the adaptive regression number is obtained as follows.
  • p-value corresponding to tail-probability of F-distribution is as follows.
  • the method of the present invention uses the one step method above when a random point is selected from the total data for each gene.
  • the point that maximizes statistics is determined by ARV, and the final value is determined by adding the correction value.
  • the adaptive regression values were composed of 310 tumor paraffin embedding samples and 108 normal paraffin embedding sample tissues, and normalized normal tissue samples and gastric cancer tissue samples. Samples from normal and gastric cancer tissues were calculated for each gene using adaptive regression techniques, and the final threshold was met by applying the above standard correction values. In addition, when the gene's Cq level was calculated as N / A or Undetermined, the gene of this sample was excluded from the adaptive regression value.
  • Final threshold values of the marker genes calculated according to the above method are shown in Table 3 below (see FIG. 2).
  • the discretized bilayer classification system by four marker genes is classified as follows.
  • the prognostic cluster I Prognostic Cluster I, thick line region in Fig. 3
  • the anticancer drug refractory group by the two marker genes WARS, GZMB
  • the marker genes (WARS, GZMB) were named the immune axis.
  • the second classification is performed on the remaining gastric cancer patients who are not classified in the first tier, using the other two marker genes, CDX1 and SFRP4. .
  • the prognostic difference is a group with low expression by a marker gene (SFRP4) representing a cancer stem cell axis (Stem-like Axis) is classified as a group with a medium prognosis (Prognostic Cluster II (left thick line region in Figure 5)).
  • the group with high expression is named as a group with a poor prognosis (Prognostic Cluster III, a thick line region on the right in FIG. 5).
  • the anticancer drug suitability is classified into a group with high expression by a marker gene (CDX1) representing the epithelial axis, and is classified as an anticancer drug response group (Predictive Cluster S (upper thick line region in FIG. 6)), and the expression is low. Groups are classified into anticancer drug refractory groups (Predictive Cluster R (lower thick line region in FIG. 6)) along with the groups (bold line region in FIG. 4) classified in the first tier.
  • a marker gene CDX1 representing the epithelial axis
  • Predictive Cluster S upper thick line region in FIG. 6
  • Groups are classified into anticancer drug refractory groups (Predictive Cluster R (lower thick line region in FIG. 6)) along with the groups (bold line region in FIG. 4) classified in the first tier.
  • the classification of the prognostic cluster is not only a prognosis but also an independent prognostic predictor.
  • Prognostic Cluster I and Prognostic Cluster III were prognostically different, and Prognostic Cluster II was set as a buffer zone.
  • Prognostic results were verified in terms of disease free survival. As shown in the Kaplan-Meir curve of FIG. 9, there is a difference in disease free survival between the three groups (Prognostic Cluster I, Prognostic Cluster II, and Prognostic Cluster III) in the same manner as the overall survival rate and the result. The 5-year disease-free survival rates were 75.8%, 66.9%, and 48.2%, respectively, indicating that Prognostic Cluster I had the best prognosis among the three groups and Prognostic Cluster III had the worst prognosis.
  • the prognostic cluster can be distinguished from the prognosis in terms of disease-free survival as well as an independent prognostic predictor. have.
  • the prognostic predictions of the prognostic cluster I and the prognostic cluster III classified by the algorithm of the present invention showed that there was a significant difference in the overall 5-year survival rate and disease-free survival rate.
  • the benefits of surgery, chemotherapy and chemotherapy were statistically significant in the anti-cancer drug group (Predictive Cluster S), but not in the anti-cancer drug group (Predictive Cluster R).
  • Predictive Cluster S the anti-cancer drug group
  • Predictive Cluster R anti-cancer drug group classification and anticancer drug treatment.
  • XELOX Xeloda + Oxaliplatin
  • the Cq values of a total of nine genes were measured by the kit of nProfiler I and the ⁇ Cq values according to equation 1 were calculated.
  • the calculated ⁇ Cq values were divided into groups as shown in FIG. 7 of Example 1 by applying a reference point of classification according to a preset value as shown in Table 3 of Example 1.
  • the result of the disease free survival is as follows. As a result of the overall survival rate, there is a difference in prognosis among the three groups (Prognostic Cluster I, Prognostic Cluster II, and Prognostic Cluster III) as shown in the Kaplan-Meir curve of FIG. The 5-year disease-free survival rates were 76.9, 65.0, and 55.3%, respectively, indicating that Prognostic Cluster I had the best prognosis among the three groups and Prognostic Cluster III had the worst prognosis.
  • each subtype is an independent prognostic predictor in COX univariate and multivariate analysis.
  • Prognostic Cluster I and Prognostic Cluster III were prognostically different, and Prognostic Cluster II was set as a buffer zone.
  • Example 3 This validates the results of Example 3 and shows that the benefits of XELOX chemotherapy occurred in the anti-cancer drug group (Predictive Cluster S), not in the anti-cancer drug group (Predictive Cluster R).
  • FFPE routine residual samples after surgery in stage 2 and 3 (AJCC 6th edition) gastric cancer patients We evaluated the clinical performance of the algorithm to measure the ⁇ Cq of genes and predict the patient's prognosis through real-time polymerase chain reaction. Specifically, 1) the 5-year survival rate of two prognostic clusters (Prognostic Cluster I, Prognostic Cluster III) derived from the test set by Kaplan-Meier curves was examined to evaluate the predictive performance of the algorithm. 2) Prognostic Cluster I is the best prognosis among the three groups, and Prognostic Cluster III has the most prognosis. We tried to test for bad group. 3) The risk ratio analysis of the prognostic group by the multivariate Cox proportional hazard model was performed to test that the prognostic group was an independent prognostic factor.
  • the total number of samples in this trial was 684, and 18 samples were removed from screening due to insufficient RNA and quality criteria during the screening phase.
  • a total of 666 samples were screened in this trial except for 18 screened dropouts.
  • a total of 126 specimens out of 666 were retested to meet the QC elimination criteria, and as a result, 12 specimens out of a total of 126 specimens were finally “dropped out” by the QC elimination criteria. . Therefore, 654 samples were selected from the 684 samples, except for a screening dropout sample (18) and a dropout test sample (12).
  • the prognostic group was classified by applying the ⁇ Cq value for each sample to the algorithm, and the survival rates for the prognostic groups were calculated using Kaplan-Meier curves (FIG. 23 and Table 20). Reference).
  • prognostic group I, II, and using the log-rank test for the III recognize a statistically significant difference, statistic calculation methods calculate the chi-square value to the second degree of freedom p value Was calculated. If there is no difference in the effectiveness of the comparison prognoses, the occurrence of events (deaths) in all intervals should occur at a frequency proportional to the number of observations (O) of the three prognostic groups in each interval. In the log-rank test, the entire group of three prognostic groups was arranged in the order of observation period, and the cut-off items were deleted, and only the section in which the event (death) occurred was arranged.
  • Expected frequency (E) for each prognosis was calculated for each interval.
  • the relationship between the overall observed frequency (O) and the expected frequency (E) for death for each prognostic group has a chi-square distribution with 2 degrees of freedom, so the value (X 2 ) is 5.99.
  • the three prognostic groups were judged to have significant difference.
  • the null hypothesis was as follows.
  • the prognostic difference between the prognostic groups is interpreted.
  • the p-value for the statistics is greater than 0.05, the prognostic difference between the prognostic groups is interpreted.
  • the risk ratio analysis is performed to determine whether there is a difference in the survival rate by prognostic risk factors by correcting the effects of other risk factors of gastric cancer (age, sex, stage of TNM, and chemotherapy). It was evaluated through.
  • Cox's Cox Proportional Hazard Model analysis was used to determine whether the prognostic group was an independent prognostic factor affecting the prognosis of gastric cancer.
  • prognostic Cluster I prognostic Cluster II
  • Prognostic Cluster III prognostic Cluster III
  • Example 1 The prediction algorithm and the threshold of the algorithm obtained in Example 1 were applied to verify the clinical efficacy evaluation results of the prognosis.
  • the risk ratio was calculated by analyzing the multivariate Cox proportional risk model using age, sex, anticancer drugs, and stage as covariates.
  • Prognostic Cluster I has the best prognosis
  • Prognostic Cluster III has the worst prognosis.
  • the classification of Prognostic Cluster by this algorithm in gastric cancer was independent prognostic factor.
  • the present invention can be used as auxiliary information in determining the treatment method of gastric cancer patients.

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Abstract

본 발명은 진행성 위암 환자의 수술 후 예후 또는 항암제 적합성 예측 시스템에 관한 것으로, 진행성 위암의 예후 또는 항암제 적합성 마커 유전자군과 참고유전자군의 mRNA 발현 수준의 정량적 검사 결과를 이용하여 예후 및 항암제 적합성을 예측할 수 있는 알고리즘을 개발하여 위암 환자의 치료방법을 결정하는데 보조적 정보로 활용할 수 있다.

Description

진행성 위암 환자의 수술 후 예후 또는 항암제 적합성 예측 시스템
본 발명은 진행성 위암 환자의 예후 또는 항암제 적합성 마커 유전자군과 참고유전자군의 mRNA 발현 수준의 정량적 검사치를 이용하여 예후 또는 항암제 적합성을 예측할 수 있는 시스템에 관한 것이다.
전 세계적으로 위암은 암으로 인한 사망률 중 세 번째로 높은 암이며, 특히 국내에서는 예후가 비교적 좋은 것으로 알려진 갑상선암을 제외하고 가장 흔한 암이다. 국내에서는 국가차원의 건강검진을 통한 조기 발견과 수술의 표준화 및 항암치료제의 발견 등으로 위암환자의 생존율이 많이 향상되었으나, 현재 표준화된 치료에도 불구하고 여전히 2기, 3기 진행성 위암의 경우 약 절반 정도의 환자가 재발을 경험한다.
암은 유전체 질환으로 인식되고 있으며, NGS(Next Generation Sequencing) 등의 유전체 검사 기술 발전에 따라 암을 기존의 해부학적, 병리학적 표현형에 따른 분류가 아닌, 분자적 생물학적 특성에 따라 분류하려는 노력이 있어 왔다. TCGA(The Cancer Genome Atlas) 프로젝트에서 위암이 그 다양한 분자적 특징에 따라 크게 4가지 형태로 나누어질 수 있음이 최근 보고된 바 있다. 이는 해부학적으로 동일한 병기라고 하더라도 분자적 생물학적 특징에 따라 예후와 항암제에 대한 반응 정도가 다를 수 있음을 의미한다.
최근에 발표된 295명 위암 환자의 TCGA project 결과를 보면, 위암은 ① EBV 양성 위암(Epstein-Barr virus positive, EBV positive) ② 현미부수체 불안정형(Microsatellite instability-high, MSI-H), ③ 염색체 불안정형(Chromosomal instability, CIN) ④ 유전체 안정형 위암(Genomically stable, GS)의 4가지로 구분된다. 이러한 방대한 Cancer Genome Sequencing을 통하여 위암도 한 가지 단일한 암종이 아닌, 분자유전학적으로 구별되는 이질적인 소그룹으로 나누어진다는 점을 알 수 있다. 따라서, 위암의 개인맞춤 치료를 실현하기 위해서는 분자유전학적 특징 및 병리학적 특징에 기반한 서브타입을 구별하여 각각의 타겟 유전자를 발굴, 적용이 필요함을 시사한다. 또한, 위암의 연구 측면에서 위암의 아형 구분에 따라 예후가 구분될 수 있는 결과가 보고되고 있다.
위암 수술에 따른 항암제 치료 후 환자의 예후를 예측할 수 있다면 각 예후에 따라서 이에 맞는 치료전략을 수립할 수 있는 근거자료가 될 것이다. 현재 표준화된 치료 관행상 2, 3기의 진행성 위암에서는 수술 후 보조 항암요법을 모든 환자에게 사용되고 있다. 이는 예후가 나쁜 군에 대해서는 과소치료(undertreatment)일 수 있다. 즉, 예후가 좋지 않은 환자군에 대해서 현재의 표준 치료 이외에 다른 추가적인 치료 방법에 대한 전략을 개발할 수 있는 임상학적인 의미를 가진다고 할 수 있다.
또한, 항암제 반응군(Predictive Cluster S)과 항암제 불응군(Predictive Cluster R)을 구분함으로써 위의 예후 정보와 결부하여 기존 치료법에 대한 정보를 제공하여 환자 치료 전략 설정에 대한 자세한 근거자료를 제공할 수 있다. 즉, 항암제 불응군(Predictive Cluster R)이면서 예후가 좋은 군(Prognostic Cluster I)은 기존 항암제를 계속 사용하는 과잉치료(overtreatment)를 방지할 수 있으며 항암제 반응군(Predictive Cluster S)은 기존 치료법의 사용을 권고할 수 있고, 항암제 불응군(Predictive Cluster R)면서 예후가 나쁜 군(Prognostic Cluster III)은 적극적인 신 치료법의 개발을 유도할 수 있는 세분화가 가능한 것이다.
2010년 이후 현재 2기, 3기 진행성 위암의 경우 표준화된 D2 위절제술 이후 보조 항암요법이 위암 환자의 생존율을 높인다는 것을 발견하였고, 현재 이는 표준 치료법에 해당된다. 전통적으로 위암은 그 해부학적 병리학적 표현형에 따라 분류하였고, TNM 병기 분류법에 따라 2기 이상의 경우 항암치료를 하고 있으나 항암치료에 따른 예후를 예측할 수 있는 방법이 TNM 병기 이외에는 없는 상황이다.
본 발명의 목적은 진행성 위암(2기-3기: AJCC 6판 기준) 환자의 수술 후 예후 또는 항암제 적합성을 예측할 수 있는 마커 유전자군과 참고유전자군의 정량치를 통해 진행성 위암의 예후 또는 항암제 적합성 예측용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 진행성 위암 환자의 수술 후 예후 또는 항암제 적합성을 예측할 수 있는 마커 유전자군과 참고유전자군의 정량치를 통해 환자의 생존율 측면에서 예후 또는 항암제 적합성을 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
WARS, GZMB, CDX1 및 SFRP4를 포함하는 예후 또는 항암제 적합성 마커 유전자군의 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제; 및
ACTB, ATP5E, GPX1, UBB 및 HPRT1를 포함하는 참고유전자군의 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 위암 2기 및 3기의 예후 또는 항암제 적합성 예측용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 상기 위암 2기 및 3기의 예후 또는 항암제 적합성 예측용 조성물을 포함하는 위암 2기 및 3기의 예후 또는 항암제 적합성 예측용 키트를 제공한다.
본 발명은 또한
위암 2기 및 3기 종양에서 얻은 생물학적 샘플에서 WARS, GZMB, CDX1 및 SFRP4를 포함하는 예후 또는 항암제 적합성 마커 유전자군과, ACTB, ATP5E, GPX1, UBB 및 HPRT1를 포함하는 참고유전자군의 mRNA의 발현 수준을 측정하고, 하기 식 1에 따라 각 예후 또는 항암제 적합성 마커 유전자들의 ΔCq 값을 계산하는 단계; 및
상기 예후 또는 항암제 적합성 마커 유전자들의 기 설정된 기준 최종 임계치와 비교하여,
생물학적 샘플의 GZMB 및 WARS의 ΔCq 값이 기 설정된 기준 GZMB 및 WARS의 최종 임계치보다 더 높은 경우, 좋은 예후군(Prognostic Cluster I)으로 분류하고, 생물학적 샘플의 GZMB 및 WARS의 적어도 하나의 ΔCq 값이 기 설정된 기준 GZMB 또는 WARS의 최종 임계치보다 낮은 경우, 생물학적 샘플의 SFRP4의 ΔCq 값을 기 설정된 기준 SFRP4의 최종 임계치와 비교하여 ΔCq 값이 더 낮은 경우 중간 예후군(Prognostic Cluster II)으로 분류하고, ΔCq 값이 더 높은 경우 나쁜 예후군(Prognostic Cluster III)로 분류하는 단계를 포함하고,
상기 예후 또는 항암제 적합성 마커 유전자들의 기 설정된 기준 최종 임계치는 WARS, GZMB, CDX1 및 SFRP4에 대해 각각 -2.14, -5.18, -2.69 및 -3.63이며,
상기 최종 임계치는 위암 2기 및 3기 종양 조직 샘플에서 WARS, GZMB, CDX1 및 SFRP4를 포함하는 예후 또는 항암제 적합성 마커 유전자들의 ΔCq 값을 얻고, 상기 ΔCq 값을 이용하여 각 유전자별 적응적 회귀 수치(adaptive regression value)를 산출하며, 상기 적응적 회귀 수치에 각 유전자별 보정값을 가산하여 각 유전자별 최종 임계치(final threshold value)를 산출하며, 상기 WARS, GZMB, CDX1 및 SFRP4의 적응적 회귀수치는 각각 -2.54, -5.58, -3.59, -4.53이며 보정값은 각각 +0.4, +0.4, +0.9 및 +0.9인, 위암 2기 및 3기의 예후 예측을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다:
[식 1]
ΔCq = (참고유전자군의 Cq 값) - (예후 또는 항암제 적합성 마커 유전자의 Cq 값)
여기서, 참고유전자군의 Cq 값은 ACTB, ATP5E, GPX1, UBB 및 HPRT1를 포함하는 참고 유전자들의 평균 Cq 값을 나타낸다.
본 발명은 또한
위암 2기 및 3기 종양에서 얻은 생물학적 샘플에서 WARS, GZMB, CDX1 및 SFRP4를 포함하는 예후 또는 항암제 적합성 마커 유전자군과, ACTB, ATP5E, GPX1, UBB 및 HPRT1를 포함하는 참고유전자군의 mRNA의 발현 수준을 측정하고, 하기 식 1에 따라 각 예후 또는 항암제 적합성 마커 유전자들의 ΔCq 값을 계산하는 단계; 및
상기 예후 또는 항암제 적합성 마커 유전자들의 기 설정된 기준 최종 임계치와 비교하여,
생물학적 샘플의 GZMB 및 WARS의 ΔCq 값이 기 설정된 기준 GZMB 및 WARS의 최종 임계치 보다 더 높은 경우, 항암제 불응군(Predictive Cluster R)으로 분류하고, 생물학적 샘플의 GZMB 및 WARS의 적어도 하나의 ΔCq 값이 기 설정된 기준 GZMB 또는 WARS의 최종 임계치보다 더 낮은 경우, 생물학적 샘플의 CDX1의 ΔCq 값을 기 설정된 기준 CDX1의 최종 임계치와 비교하여 ΔCq 값이 더 낮은 경우 항암제 불응군(Predictive Cluster R)으로 분류하고, ΔCq 값이 더 높은 경우 항암제 반응군(Predictive Cluster S)으로 분류하는 단계를 포함하고,
상기 예후 또는 항암제 적합성 마커 유전자들의 기 설정된 기준 최종 임계치는 WARS, GZMB, CDX1 및 SFRP4에 대해 각각 -2.14, -5.18, -2.69 및 -3.63이며,
상기 최종 임계치는 위암 2기 및 3기 종양 조직 샘플에서 WARS, GZMB, CDX1 및 SFRP4를 포함하는 예후 또는 항암제 적합성 마커 유전자들의 ΔCq 값을 얻고, 상기 ΔCq 값을 이용하여 각 유전자별 적응적 회귀 수치(adaptive regression value)를 산출하며, 상기 적응적 회귀 수치에 각 유전자별 보정값을 가산하여 각 유전자별 최종 임계치(final threshold value)를 산출하며, 상기 WARS, GZMB, CDX1 및 SFRP4의 적응적 회귀수치는 각각 -2.54, -5.58, -3.59, -4.53이며 보정값은 각각 +0.4, +0.4, +0.9 및 +0.9인, 위암 2기 및 3기의 항암제 적합성 예측을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다:
[식 1]
ΔCq = (참고유전자군의 Cq 값) - (예후 또는 항암제 적합성 마커 유전자의 Cq 값)
여기서, 참고유전자군의 Cq 값은 ACTB, ATP5E, GPX1, UBB 및 HPRT1를 포함하는 참고 유전자들의 평균 Cq 값을 나타낸다.
본 발명은 진행성 위암의 예후 또는 항암제 적합성 마커 유전자군과 참고유전자군의 mRNA 발현 수준의 정량적 검사 결과를 이용하여 예후 및 항암제 적합성을 전체 생존율과 무병 생존율 등의 생존율 측면에서 예측할 수 있는 알고리즘을 개발하여 위암 환자의 치료방법을 결정하는데 보조적 정보로 활용할 수 있다.
도 1은 참고유전자 선정을 위해 파라핀포매 샘플에서 대상 유전자의 발현양을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 예후 및 항암제 예측 마커 유전자의 적응적 회귀 수치(adaptive regression value)를 나타내는 ΔCq 값으로, 이 수치에 WARS, GZMB, CDX1 및 SFRP4의 보정치 +0.4, +0.4, +0.9, +0.9의 보정치를 더하여 최종 임계치를 결정한다.
도 3은 본 발명의 이산화기반이층분류시스템의 일층 분류 시 면역 축(Immune Axis)에서 분류된 좋은 예후군(Prognostic Cluster I) 분류를 보여주는 결과이다.
도 4는 본 발명의 이산화기반이층분류시스템의 일층 분류 시 면역 축(Immune Axis)에서 분류된 항암제 불응군(Predictive Cluster R) 분류를 보여주는 결과이다.
도 5는 본 발명의 이산화기반이층분류시스템의 이층 분류 시 유사 암줄기세포 축(Stem-like Axis)에서 중간 및 나쁜 예후군(Prognostic Cluster II & III) 분류를 보여주는 결과이다.
도 6은 본 발명의 이산화기반이층분류시스템의 이층 분류 시 상피 축(Epithelail Axis)에서 항암제 반응군 및 불응군(Predictive Cluster S & R) 분류를 보여주는 결과이다.
도 7은 본 발명의 예후군 (Prognostic Cluster I, II, III) 및 항암제 적합성(Predictive Cluster R & S) 분류 방식인 이산화기반이층분류시스템의 모식도이다.
도 8은 본 발명의 진행성 위암의 예후 및 항암제 적합성을 예측할 수 있는 알고리즘에 의한 예후군의 5년 전체 생존율에 대한 Kaplan-Meir Curve(a) 및 이의 로그랭크테스트(log rank test) 결과(b)를 도시한 것이다.
도 9는 본 발명의 진행성 위암의 예후 및 항암제 적합성을 예측할 수 있는 알고리즘에 의한 예후군의 5년 무병 생존율에 대한 Kaplan-Meir Curve(a) 및 이의 로그랭크테스트 결과(b)를 도시한 것이다.
도 10은 항암 화학요법 치료를 받거나(CTX) 그렇지 않은(Surgery only), 위절제술을 받은 위암 환자에서 5년 전체 생존율에 대한 Kaplan-Meier curves 및 로그랭크테스트의 p value(a) 및 이의 무병 생존율에 대한 Kaplan-Meier curves 및 로그랭크테스트의 p value(b)를 표기한 것이다.
도 11은 본 발명의 진행성 위암의 항암제 반응 가능성을 예측할 수 있는 알고리즘에 의한 항암제 반응군(Predictive Cluster S)의 항암 화학요법 치료를 받거나(CTX) 그렇지 않은(Surgery only), 위절제술을 받은 위암 환자에서 5년 전체 생존율에 대한 Kaplan Meier curves 및 로그랭크테스트의 p value를 표기한 것이다.
도 12는 본 발명의 진행성 위암의 항암제 반응 가능성을 예측할 수 있는 알고리즘에 의한 항암제 반응군(Predictive Cluster S)의 항암 화학요법 치료를 받거나(CTX) 그렇지 않은(Surgery only), 위절제술을 받은 위암 환자에서 5년 무병 생존율에 대한 Kaplan-Meier curves 및 로그랭크테스트의 p value를 표기한 것이다.
도 13은 본 발명의 진행성 위암의 항암제 반응 가능성을 예측할 수 있는 알고리즘에 의한 항암제 불응군(Predictive Cluster R)의 항암 화학요법 치료를 받거나(CTX) 그렇지 않은(Surgery only), 위절제술을 받은 위암 환자에서 5년 전체 생존율에 대한 Kaplan-Meier curves 및 로그랭크테스트의 p value를 표기한 것이다.
도 14는 본 발명의 진행성 위암의 항암제 반응 가능성을 예측할 수 있는 알고리즘에 의한 항암제 불응군(Predictive Cluster R)의 항암 화학요법 치료를 받거나(CTX) 그렇지 않은(Surgery only), 위절제술을 받은 위암 환자에서 5년 무병 생존율에 대한 Kaplan-Meier curves 및 로그랭크테스트의 p value를 표기한 것이다.
도 15는 클래식 임상시험 샘플에서 XELOX (Xeloda+Oxaliplatin) 항암 화학요법 치료를 받은 환자군(CTX)과 관찰만 한 군(Surgery only)의 5년 전체 생존율에 대한 Kaplan-Meier curves 및 로그랭크테스트의 p value를 표기한 것이다.
도 16은 본 발명의 진행성 위암의 예후 및 항암제 적합성을 예측할 수 있는 알고리즘에 의해서 클래식 임상시험 샘플을 대상으로 한 예후 분류군의 5년 전체 생존율에 대한 Kaplan-Meir Curve(a) 및 이의 로그랭크테스트 결과(b)를 도시한 것이다.
도 17은 클래식 임상시험 샘플에서 XELOX(Xeloda+Oxaliplatin) 항암 화학요법 치료를 받은 환자군(CTX)과 관찰만 한 군(Surgery only)의 5년 무병 생존율에 대한 Kaplan-Meier curves 및 로그랭크테스트의 p value를 표기한 것이다.
도 18은 본 발명의 진행성 위암의 예후 및 항암제 적합성을 예측할 수 있는 알고리즘에 의해서 클래식 임상시험 샘플을 대상으로 한 예후 분류군의 5년 무병 생존율에 대한 Kaplan-Meir Curve(a) 및 이의 로그랭크테스트 결과(b)를 도시한 것이다.
도 19는 본 발명의 진행성 위암의 항암제 반응 가능성을 예측할 수 있는 알고리즘에 의한 것으로 클래식 임상시험 샘플을 대상으로 XELOX 항암제 반응군(Predictive Cluster S)에서 XELOX (Xeloda+Oxaliplatin) 항암 화학요법 치료를 받은 환자군(CTX)과 관찰만 한 군(Surgery only)의 5년 전체 생존율에 대한 Kaplan-Meier curves 및 로그랭크테스트의 p value를 표기한 것이다.
도 20은 본 발명의 진행성 위암의 항암제 반응 가능성을 예측할 수 있는 알고리즘에 의한 것으로 클래식 임상시험 샘플을 대상으로 XELOX 항암제 반응군(Predictive Cluster S)에서 XELOX(Xeloda+Oxaliplatin) 항암 화학요법 치료를 받은 환자군(CTX)과 관찰만 한 군(Surgery only)의 5년 무병 생존율에 대한 Kaplan-Meier curves 및 로그랭크테스트의 p value를 표기한 것이다.
도 21은 본 발명의 진행성 위암의 항암제 반응 가능성을 예측할 수 있는 알고리즘에 의한 것으로 클래식 임상시험 샘플의 XELOX 항암제 불응군(Predictive Cluster R)에서 XELOX(Xeloda+Oxaliplatin) 항암 화학요법 치료를 받은 환자군(CTX)과 관찰만 한 군(Surgery only)의 5년 전체 생존율에 대한 Kaplan-Meier curves 및 로그랭크테스트의 p value를 표기한 것이다.
도 22는 본 발명의 진행성 위암의 항암제 반응 가능성을 예측할 수 있는 알고리즘에 의한 것으로 클래식 임상시험 샘플의 XELOX 항암제 불응군(Predictive Cluster R)에서 XELOX(Xeloda+Oxaliplatin) 항암 화학요법 치료를 받은 환자군(CTX)과 관찰만 한 군(Surgery only)의 5년 무병 생존율에 대한 Kaplan-Meier curves 및 로그랭크테스트의 p value를 표기한 것이다.
도 23은 본 발명의 진행성 위암의 예후를 예측하는 알고리즘의 임상적 성능 평가 시 예후군의 5년 전체 생존율에 대한 Kaplan-Meier curves를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명의 구성을 구체적으로 설명한다.
본 발명은
WARS, GZMB, CDX1 및 SFRP4를 포함하는 예후 또는 항암제 적합성 마커 유전자군의 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제; 및
ACTB, ATP5E, GPX1, UBB 및 HPRT1를 포함하는 참고유전자군의 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 위암 2기 및 3기의 예후 또는 항암제 적합성 예측용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 위암 2기 및 3기의 예후 또는 항암제 적합성 예측용 조성물은 진행성 위암 환자의 예후 및 항암제 적합성을 생존율 측면에서 예측하기 위한 용도로 사용할 수 있는 것을 특징으로 한다.
본 명세서에서, 용어 "진행성 위암"은 AJCC 6판 기준으로 2기 내지 3기에 해당하는 위암을 의미한다.
본 명세서에서, 용어 "예후 또는 항암제 적합성 마커 유전자"는 정상이나 병적인 상태를 구분할 수 있거나, 치료 후 5년 생존율을 예측하거나 치료반응 예측을 객관적으로 측정할 수 있는 표지자를 의미한다. 본 발명에서는, 진행성 위암의 예후 및 항암제 적합성을 예측하는데 사용할 수 있는 유전자로, 예후 또는 항암제 반응에 대해 증가하거나 감소하는 차등적인 mRNA 발현 수준을 나타내는 유전자이다. 본 발명의 일 구체예에 따르면, 이형질성을 갖는 위암에 대해 신선동결조직의 마이크로어레이 데이터와 RT-qPCR 데이터, 그리고 파라핀포매 샘플 검체의 RT-qPCR 데이터에서 통계적 유의성을 확보하여 안정적으로 측정이 가능한 Immune 모듈을 대표할 수 있는 마커 유전자(WARS, GZMB)와 Stem-like 모듈 & Epithelial 모듈을 대표할 수 있는 마커 유전자(SFRP4, CDX1) 총 4개를 선정하였다.
본 명세서에서, 용어 "참고유전자, reference gene"는 항상 안정적으로 발현하는 유전자를 지칭한다. 즉 어떤 조직에서든 일정하게 발현하는 유전자로서 참고유전자의 발현양과 마커 유전자의 발현양을 비교함으로써 마커 유전자의 발현양을 조사할 때 사용한다. 즉, 샘플마다 정성(quality)적 차이, 보관 기관에 따른 변이가 존재하므로 유전자 발현량을 측정하더라도 그 측정량이 생물학적 변이라고 판단하기 어렵다. 따라서, 표준화(normalization)를 통해 샘플간 유전자 발현량(ΔCq)을 결정한다. 통상 표준화 방법에는 Quantile에 의한 방법, Global Normalization 방법, 참고유전자에 의한 방법 등이 있으나, 본 발명은 참고유전자에 의한 표준화를 사용한다. 또한, 단일 유전자를 참고유전자로 활용하는 것은 정확도가 떨어질 수 있어 다수의 유전자를 선정하고 변이도를 조사하여 조직의 특성에 적합한 참고유전자를 선정할 수 있다. 본 발명에서는 위암과 관련하여 문헌에 개시되어 있거나, 기존 상용화 제품에서 활용되고 있는 유전자를 선정하고, 선정된 유전자를 대상으로 적격 여부를 입증하여 참고유전자로 사용한다. 본 발명의 일 구체예에 따르면, 문헌에 개시된 21개의 참고유전자를 대상으로 식도암, 췌장암, 위암, 대장암 등의 암조직과 정상조직을 비교하여 qPCR을 통해 가장 변이도가 작은 유전자를 참고유전자로 선정하였다. 다음으로, 상용화 제품에서 사용하는 참고유전자로, ACTB, ATP5E, HPRT1, PGK1, GPX1, RPL29, UBB 및 VDAC2를 선정하여 qPCR을 수행하여, 최종적으로, 본 발명의 진행성 위암의 재발 또는 항암제 반응 가능성을 예측하는데 사용하는 참고유전자로 ACTB, ATP5E, GPX1, UBB 및 HPRT1로 이루어진 유전자군을 사용하였다.
본 명세서에서, 용어 "mRNA의 발현 수준 측정"이란 진행성 위암의 재발 또는 항암제 반응 가능성을 예측하기 위하여 생물학적 시료에서 예후 또는 항암제 적합성 마커 유전자 또는 참고유전자들의 mRNA 발현 정도를 확인하는 과정으로 mRNA의 양을 측정하는 것을 의미한다. 이를 위한 분석 방법으로는 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting), DNA 칩 등이 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 조성물에서, 예후 또는 항암제 적합성 마커 유전자와 참고유전자의 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제는 예후 또는 항암제 적합성 마커 유전자와 참고유전자의 mRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오티드를 포함한다. 본 발명에 따른 예후 또는 항암제 적합성 마커 유전자와 참고유전자의 정보는 GenBank, UniProt 등에 알려져 있으므로, 당업자라면 이를 바탕으로 유전자의 mRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오티드를 용이하게 디자인할 수 있을 것이다.
본 명세서에서, 용어 "프라이머"는 표적 유전자 서열을 인지하는 단편으로서, 정방향 및 역방향의 프라이머 쌍을 포함하나, 바람직하게는, 특이성 및 민감성을 가지는 분석 결과를 제공하는 프라이머 쌍이다. 프라이머의 핵산 서열이 시료 내 존재하는 비-표적 서열과 불일치하는 서열이어서, 상보적인 프라이머 결합 부위를 함유하는 표적 유전자 서열만 증폭하고 비특이적 증폭을 유발하지 않는 프라이머일 때, 높은 특이성이 부여될 수 있다. 본 발명의 일 구체예에 따르면, SEQ ID NOS: 1 내지 18에 기재된 프라이머 세트를 사용할 수 있다. 더 구체적으로, SFRP4는 NM_003014.2의 1298-1361을 참고하여 SEQ ID NO: 1 및 2의 프라이머 세트, GZMB는 NM_004131.3의 213-277을 참고하여 SEQ ID NO: 3 및 4의 프라이머 세트, WARS는 NM_173701.1의 408-480을 참고하여 SEQ ID NO: 5 및 6의 프라이머 세트, CDX1는 NM_001804.2의 1319-1385를 참고하여 SEQ ID NO: 7 및 8의 프라이머 세트, ACTB는 NM_001101의 278-349를 참고하여 SEQ ID NO: 9 및 10의 프라이머 세트, ATP5E는 NM_006886의 117-189를 참고하여 SEQ ID NO: 11 및 12의 프라이머 세트, HPRT1는 NM_000194.1의 531-597을 참고하여 SEQ ID NO: 13 및 14의 프라이머 세트, GPX1는 NM_000581.2의 308-378을 참고하여 SEQ ID NO: 15 및 16의 프라이머 세트, UBB는 NM_018955.2의 61-138을 참고하여 SEQ ID NO: 17 및 18의 프라이머 세트를 사용하여 측정할 수 있다.
본 명세서에서, 용어 "프로브"란 시료 내의 검출하고자 하는 표적 물질과 특이적으로 결합할 수 있는 물질을 의미하며, 상기 결합을 통하여 특이적으로 시료 내의 표적 물질의 존재를 확인할 수 있는 물질을 의미한다. 프로브의 종류는 당업계에서 통상적으로 사용되는 물질로서 제한은 없으나, 바람직하게는 PNA(peptide nucleic acid), LNA(locked nucleic acid), 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질, RNA 또는 DNA 일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 프로브는 바이오 물질로서 생물에서 유래되거나 이와 유사한 것 또는 생체 외에서 제조된 것을 포함하는 것으로, 예를 들어, 효소, 단백질, 항체, 미생물, 동식물 세포 및 기관, 신경세포, DNA, 및 RNA일 수 있으며, DNA는 cDNA, 게놈 DNA, 올리고뉴클레오티드를 포함하며, RNA는 게놈 RNA, mRNA, 올리고뉴클레오티드를 포함하며, 단백질의 예로는 항체, 항원, 효소, 펩타이드 등을 포함할 수 있다. 본 발명의 일 구체예에 따르면, qPCR 측정용 SEQ ID NOS: 19-27의 프로브를 사용할 수 있다. 바람직하게는, 상기 프로브는 형광 표지된 것일 수 있다.
본 명세서에서, 용어 "안티센스"는 안티센스 올리고머가 왓슨-크릭 염기쌍 형성에 의해 RNA 내의 표적 서열과 혼성화되어, 표적서열 내에서 전형적으로 mRNA와 RNA:올리고머 헤테로이중체의 형성을 허용하는, 뉴클레오티드 염기의 서열 및 서브유닛간 백본을 갖는 올리고머를 의미한다. 올리고머는 표적 서열에 대한 정확한 서열 상보성 또는 근사 상보성을 가질 수 있다.
본 명세서에서, 용어 "예후 또는 항암제 적합성 예측"은 특정 질병 또는 질환에 대한 대상(subject)의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 대상의 예후(prognosis; 예컨대, 전-전이성 또는 전이성 암 상태의 동정, 암의 단계 결정 또는 치료에 대한 암의 반응성 결정)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics; 예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링하는 것)을 포함한다. 본 발명의 목적상, 수술 후 위암 환자의 예후 및 항암제 적합성 여부를 전체 생존율(Overall Survival)과 무병 생존율(Disease Free Survival) 등의 생존율 측면에서 예측하는 것이다.
본 발명의 위암 2기 및 3기의 예후 또는 항암제 적합성 예측용 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함할 수 있다.
상기 약제학적으로 허용 가능한 담체는 의약 분야에서 통상 사용되는 담체 및 비히클을 포함하며, 구체적으로 이온 교환 수지, 알루미나, 알루미늄 스테아레이트, 레시틴, 혈청 단백질(예, 사람 혈청 알부민), 완충 물질(예, 각종 인산염, 글리신, 소르브산, 칼륨 소르베이트, 포화 식물성 지방산의 부분적인 글리세라이드 혼합물), 물, 염 또는 전해질(예, 프로타민 설페이트, 인산수소이나트륨, 인산수소캄륨, 염화나트륨 및 아연 염), 교질성 실리카, 마그네슘 트리실리케이트, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로즈계 기질, 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 카르복시메틸셀룰로즈, 폴리아릴레이트, 왁스, 폴리에틸렌 글리콜 또는 양모지 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 유화제, 현탁제, 또는 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 또한, 위암 2기 및 3기의 예후 또는 항암제 적합성 예측용 조성물을 포함하는 위암 2기 및 3기의 예후 또는 항암제 적합성 예측용 키트에 관한 것이다.
바람직하게, 상기 키트는 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트 등일 수 있다.
상기 위암 2기 및 3기의 예후 또는 항암제 적합성 예측용 키트는 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치를 더 포함할 수 있다. 바람직하게, 상기 진단용 키트는 역전사 중합효소반응을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 더 포함할 수 있다. 역전사 중합효소반응 키트는 마커 단백질을 암호화하는 유전자에 대해 특이적인 프라이머 쌍을 포함한다. 프라이머는 상기 유전자의 핵산서열에 특이적인 서열을 가지는 뉴클레오티드로서, 약 7 bp 내지 50 bp의 길이, 보다 바람직하게는 약 10 bp 내지 30 bp의 길이를 가질 수 있다. 또한 대조군 유전자의 핵산 서열에 특이적인 프라이머를 포함할 수 있다. 그 외 역전사 중합효소반응 키트는 테스트 튜브 또는 다른 적절한 용기, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오티드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제 DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 위암 2기 및 3기의 예후 또는 항암제 적합성 예측용 키트는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함할 수 있다. DNA 칩 키트는 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)가 부착되어 있는 기판, 및 형광표지 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제, 효소 등을 포함할 수 있다. 또한, 기판은 대조군 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
본 발명은 또한
위암 2기 및 3기 종양에서 얻은 생물학적 샘플에서 WARS, GZMB, CDX1 및 SFRP4를 포함하는 예후 또는 항암제 적합성 마커 유전자군과, ACTB, ATP5E, GPX1, UBB 및 HPRT1를 포함하는 참고유전자군의 mRNA의 발현 수준을 측정하고, 하기 식 1에 따라 각 예후 또는 항암제 적합성 마커 유전자들의 ΔCq 값을 계산하는 단계; 및
상기 예후 또는 항암제 적합성 마커 유전자들의 기 설정된 기준 최종 임계치와 비교하여,
생물학적 샘플의 GZMB 및 WARS의 ΔCq 값이 기 설정된 기준 GZMB 및 WARS의 최종 임계치보다 더 높은 경우, 좋은 예후군(Prognostic Cluster I)으로 분류하고, 생물학적 샘플의 GZMB 및 WARS의 적어도 하나의 ΔCq 값이 기 설정된 기준 GZMB 또는 WARS의 최종 임계치보다 낮은 경우, 생물학적 샘플의 SFRP4의 ΔCq 값을 기 설정된 기준 SFRP4의 최종 임계치와 비교하여 ΔCq 값이 더 낮은 경우 중간 예후군(Prognostic Cluster II)으로 분류하고, ΔCq 값이 더 높은 경우 나쁜 예후군(Prognostic Cluster III)로 분류하는 단계를 포함하고,
상기 예후 또는 항암제 적합성 마커 유전자들의 기 설정된 기준 최종 임계치는 WARS, GZMB, CDX1 및 SFRP4에 대해 각각 -2.14, -5.18, -2.69 및 -3.63이며,
상기 최종 임계치는 위암 2기 및 3기 종양 조직 샘플에서 WARS, GZMB, CDX1 및 SFRP4를 포함하는 예후 또는 항암제 적합성 마커 유전자들의 ΔCq 값을 얻고, 상기 ΔCq 값을 이용하여 각 유전자별 적응적 회귀 수치(adaptive regression value)를 산출하며, 상기 적응적 회귀 수치에 각 유전자별 보정값을 가산하여 각 유전자별 최종 임계치(final threshold value)를 산출하며, 상기 WARS, GZMB, CDX1 및 SFRP4의 적응적 회귀수치는 각각 -2.54, -5.58, -3.59, -4.53이며 보정값은 각각 +0.4, +0.4, +0.9 및 +0.9인, 위암 2기 및 3기의 예후 예측을 위한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다:
[식 1]
ΔCq = (참고유전자군의 Cq 값) - (예후 또는 항암제 적합성 마커 유전자의 Cq 값)
여기서, 참고유전자군의 Cq 값은 ACTB, ATP5E, GPX1, UBB 및 HPRT1를 포함하는 참고 유전자들의 평균 Cq 값을 나타낸다.
또한, 본 발명은
위암 2기 및 3기 종양에서 얻은 생물학적 샘플에서 WARS, GZMB, CDX1 및 SFRP4를 포함하는 예후 또는 항암제 적합성 마커 유전자군과, ACTB, ATP5E, GPX1, UBB 및 HPRT1를 포함하는 참고유전자군의 mRNA의 발현 수준을 측정하고, 하기 식 1에 따라 각 예후 또는 항암제 적합성 마커 유전자들의 ΔCq 값을 계산하는 단계; 및
상기 예후 또는 항암제 적합성 마커 유전자들의 기 설정된 기준 최종 임계치와 비교하여,
생물학적 샘플의 GZMB 및 WARS의 ΔCq 값이 기 설정된 기준 GZMB 및 WARS의 최종 임계치 보다 더 높은 경우, 항암제 불응군(Predictive Cluster R)으로 분류하고, 생물학적 샘플의 GZMB 및 WARS의 적어도 하나의 ΔCq 값이 기 설정된 기준 GZMB 또는 WARS의 최종 임계치보다 더 낮은 경우, 생물학적 샘플의 CDX1의 ΔCq 값을 기 설정된 기준 CDX1의 최종 임계치와 비교하여 ΔCq 값이 더 낮은 경우 항암제 불응군(Predictive Cluster R)으로 분류하고, ΔCq 값이 더 높은 경우 항암제 반응군(Predictive Cluster S)으로 분류하는 단계를 포함하고,
상기 예후 또는 항암제 적합성 마커 유전자들의 기 설정된 기준 최종 임계치는 WARS, GZMB, CDX1 및 SFRP4에 대해 각각 -2.14, -5.18, -2.69 및 -3.63이며,
상기 최종 임계치는 위암 2기 및 3기 종양 조직 샘플에서 WARS, GZMB, CDX1 및 SFRP4를 포함하는 예후 또는 항암제 적합성 마커 유전자들의 ΔCq 값을 얻고, 상기 ΔCq 값을 이용하여 각 유전자별 적응적 회귀 수치(adaptive regression value)를 산출하며, 상기 적응적 회귀 수치에 각 유전자별 보정값을 가산하여 각 유전자별 최종 임계치(final threshold value)를 산출하며, 상기 WARS, GZMB, CDX1 및 SFRP4의 적응적 회귀수치는 각각 -2.54, -5.58, -3.59, -4.53이며 보정값은 각각 +0.4, +0.4, +0.9 및 +0.9인, 위암 2기 및 3기의 항암제 적합성 예측을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다:
[식 1]
ΔCq = (참고유전자군의 Cq 값) - (예후 또는 항암제 적합성 마커 유전자의 Cq 값)
여기서, 참고유전자군의 Cq 값은 ACTB, ATP5E, GPX1, UBB 및 HPRT1를 포함하는 참고 유전자들의 평균 Cq 값을 나타낸다.
본 발명의 위암 2기 및 3기의 예후 또는 항암제 적합성 예측을 위한 정보를 제공하는 방법을 단계별로 구체적으로 설명하면 다음과 같다.
제1단계로, 위암 2기 및 3기 종양에서 얻은 생물학적 샘플에서 예후 또는 항암제 적합성 마커 유전자군과, 참고유전자군의 mRNA의 발현 수준을 측정하여 각 예후 또는 항암제 적합성 마커 유전자들의 ΔCq 값을 계산하는 단계를 포함한다.
예후 또는 항암제 적합성 마커 유전자군과 참고유전자군의 mRNA의 발현 수준은 역전사효소 중합효소 반응, 경쟁적 역전사효소 중합효소반응, 실시간 역전사효소 중합효소반응, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅 또는 DNA 칩 등의 방법을 통해 측정할 수 있다. 보다 바람직하게는, 실시간 역전사효소 중합효소반응(real time RT-PCR)을 통해 측정할 수 있고, mRNA 발현 수준을 Cq 값(cycle quantitation value)으로 얻을 수 있다.
상기에서 얻은 예후 또는 항암제 적합성 마커 유전자군과 참고유전자군의 Cq 값을 이용하여 하기 식 1에 따라 ΔCq 값을 계산한다.
[식 1]
ΔCq = (참고유전자군의 Cq 값) - (예후 또는 항암제 적합성 마커 유전자의 Cq 값)
여기서, 참고유전자군의 Cq 값은 ACTB, ATP5E, GPX1, UBB 및 HPRT1를 포함하는 참고 유전자들의 평균 Cq 값을 나타낸다.
상기 ΔCq 값은 마커 유전자의 발현량을 표준화시킨 값으로, 상기 ΔCq 값이 클수록, 유전자 발현이 높음을 의미한다.
제2단계는, 상기 예후 또는 항암제 적합성 마커 유전자들의 기 설정된 기준 최종 임계치와 비교하여 생물학적 샘플의 예후군을 분류하는 단계이다.
상기 예후군 분류를 위해 상기 예후 또는 항암제 적합성 마커 유전자들의 기준이 되는 최종 임계치를 미리 설정한다.
이를 위해, 위암 2기 및 3기 종양 조직 샘플과 정상조직 샘플에서 WARS, GZMB, CDX1 및 SFRP4를 포함하는 예후 또는 항암제 적합성 마커 유전자들의 mRNA 발현 수준에 따른 Cq 값을 얻고 상기 식 1에 따라 ΔCq 값을 계산하며, 상기 ΔCq 값을 적응적 회귀기법(adaptive regression)에 적용하여 적응적 회귀 수치(A.R.V.)를 산출한다. 통상적으로, 어레이에서 취하는 값은 중앙값(median)이나 평균값(average)을 기준으로 데이터를 처리하나, 적응적 회귀기법에 의한 알고리즘은 전체 데이터에서 임의의 한 점을 구분점으로 삼았을 때 구분된 구간값 평균의 분산이 가장 큰 포인트를 적응적 회귀 수치(또는 임계치)로 설정한다. 즉 임계치는 해당 유전자의 정상 및 암조직 전체에서 생물학적 의의가 있는 고발현과 저발현을 구분하는 기준점이 된다. 적응적 회귀 수치는 다음과 같이 구한다.
① 적응적 회귀 방식을 통한 피팅
Figure PCTKR2017008781-appb-I000001
이때, F-distribution의 tail-probability에 상응하는 p-value는 다음과 같다.
Figure PCTKR2017008781-appb-I000002
위 과정에서 p value가 작을수록 피팅이 잘 되었다고 볼 수 있다.
② 스텝 함수 결정
Figure PCTKR2017008781-appb-I000003
③ 본 발명의 방식은 위의 one step 방식을 이용하여 각 유전자별로 전체 데이터에서 임의의 한 점을 구분점으로 삼았을 때
Figure PCTKR2017008781-appb-I000004
statistics를 최대로 하는 포인트를 A.R.V.로 결정하고, 이 값을 가지고 보정값을 가산하여 최종 임계치를 정한다.
상기 마커 유전자들의 보정값은 임상적 유용성과 안전성에 근거하여 얻을 수 있다. 즉 ΔCq 값을 대상으로 분석적인 성능인 A.R.V 값을 획득하고 Prognosis Axis를 구성하는 WARS, GZMB, SFRP4와 Predictive Axis를 구성하는 WARS, GZMB, CDX1을 대상으로 WARS, GZMB는 ΔCq 기준 0.4~0.5, SFRP4는 ΔCq 기준 0.8~0.9, CDX1은 ΔCq 기준 0.8~0.9의 조합을 스크리닝하여 예후 측면에서 최적의 위험비를 구성하는 조합과 항암제 적합성 측면에서 항암제 치료 여부와 Predictive Cluster 간의 상관관계를 구성하는 조합을 선별하여 결정하였다.
바람직하게는, 상기 WARS, GZMB, CDX1 및 SFRP4의 적응적 회귀수치는 각각 -2.54, -5.58, -3.59, -4.53이며 보정값은 각각 +0.4, +0.4, +0.9 및 +0.9이다.
상기 적응적 회귀 수치에 보정값을 가산하여 얻은 상기 마커 유전자들, 즉 WARS, GZMB, CDX1 및 SFRP4의 최종 임계치는 각각 각각 -2.14, -5.18, -2.69 및 -3.63이다.
상기 기준 마커 유전자들의 최종 임계치가 정해지면 이산화기반이층분류시스템(Binary signal based two tier system)에 의해 예후군(Prognostic Cluster) 및 항암제 적합 예측군(Predictive Cluster) 분류를 수행한다. 즉, 본 발명의 진행성 위암의 재발 또는 항암제 반응 가능성을 예측하기 위한 알고리즘에 따른 그룹 분류는 도 7에 구체적으로 도시되어 있고, 이를 참고하여 보면,
생물학적 샘플의 GZMB 및 WARS의 ΔCq 값이 기 설정된 기준 GZMB 및 WARS의 최종 임계치보다 더 높은 경우, 좋은 예후군(Prognostic Cluster I)으로 분류하고
생물학적 샘플의 GZMB 및 WARS의 적어도 하나의 ΔCq 값이 기 설정된 기준 GZMB 또는 WARS의 최종 임계치보다 낮은 경우, 생물학적 샘플의 SFRP4의 ΔCq 값을 기 설정된 기준 SFRP4의 최종 임계치와 비교하여 ΔCq 값이 더 낮은 경우 중간 예후군(Prognostic Cluster II)으로 분류하고, ΔCq 값이 더 높은 경우 나쁜 예후군(Prognostic Cluster III)로 분류할 수 있다.
또한, 생물학적 샘플의 GZMB 및 WARS의 ΔCq 값이 기 설정된 기준 GZMB 및 WARS의 최종 임계치보다 더 높은 경우, 항암제 불응군(Predictive Cluster R)으로 분류하며, 생물학적 샘플의 GZMB 및 WARS의 적어도 하나의 ΔCq 값이 기 설정된 기준 GZMB 또는 WARS의 최종 임계치보다 더 낮은 경우, 생물학적 샘플의 CDX1의 ΔCq 값을 기 설정된 기준 CDX1의 최종 임계치와 비교하여 ΔCq 값이 더 낮은 경우 항암제 불응군(Predictive Cluster R)으로 분류하고, ΔCq 값이 더 높은 경우 항암제 반응군(Predictive Cluster S)으로 분류 할 수 있다.
상기 생물학적 샘플은 신선종양조직, 신선동결종양조직, 파라핀포매종양조직, 세침흡인액, 복수, 관 세정액 또는 흉막액 등일 수 있으며, 바람직하게는 파라핀포매종양조직일 수 있다.
또한, 상기 예후 또는 항암제 적합성 마커 유전자군 및 참고 유전자군의 mRNA의 발현 수준 측정은 역전사효소 중합효소 반응, 경쟁적 역전사효소 중합효소반응, 실시간 역전사효소 중합효소반응, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅 또는 DNA 칩에 의해 수행될 수 있다. 바람직하게는, 실시간 역전사효소 중합효소반응(real time RT-PCR)일 수 있다.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.
<실시예 1> 진행성 위암의 예후 또는 항암제 반응 가능성을 예측하는 알고리즘의 개발
진행성 위암의 파라핀포매에 50% 이상 종양을 포함하는 3mm 구멍을 뚫고, 이를 이용하여 프로토콜에 따라 RNA를 추출하였다. 최소 400ng의 전체 RNA를 얻었다. 필요한 Q.C 요소는 A260/A280 = >1.8이었다.
RT-qPCR 실험은 nProfiler I 키트를 사용하였으며, 환자의 전체 RNA(400 ng/18㎕)를 사용하고, GSP(Gene Specific Primer) MIX(3㎕)를 샘플에 분산시켰다. 2720 thermal cycler(Applied Biosystems)를 50℃까지 올리고, 샘플을 넣었다. RNA 샘플을 65℃에서 5분간 변성하고, 상기 thermal cycler를 멈추었다. RT를 위해 RT Buffer(6㎕) 및 2㎕의 RT MIX를 첨가하고, 37℃에서 60분간 합성한 다음 70℃에서 15분간 유지하였다. qPCR을 수행하기 위해, cDNA MIX(3㎕) 및 각 9개의 프라이머-프로브 MIX (2㎕, Gene-1~Gene-9 from Kit)를 혼합하였다. 샘플을 효소 활성화 단계로 95℃에서 120초 동안 1 사이클을 작동시키고, 95℃에서 10초 동안의 변성 과정 및 60℃에서 30초 동안의 검출 과정을 40 사이클 수행하였다. 추출된 데이터는 nDxⅠ 프로그램(Novomics Co., Ltd.)에서 분석하였다.
RT 및 qPCR 과정은 nProfiler I에 의해 준비되며, nProfiler I은 위암용 9개 유전자로 구성된 mRNA 기반 qPCR Kit이다. 사용된 시약은 표 1과 같다.
Figure PCTKR2017008781-appb-T000001
위의 9개 유전자는 신선동결조직의 microarray 데이터와 RT-qPCR 데이터, 그리고 파라핀포매 샘플 검체의 RT-qPCR 데이터에서 통계적 유의성을 갖는 마커유전자 4개와 참고유전자 5개이다. 최종 선정된 이들 유전자들의 발현량에 의해 예후를 분류할 수 있는 진단 키트인 nProfiler I stomach cancer assay를 개발하였다.
참고유전자를 선정과정은 다음과 같다.
참고유전자는 위암에 구체적으로 기 적용되는 참고유전자(reference gene)에 대해서 논문을 통해 문헌조사를 실시하였다:
RT-qPCR에 의한 위암에서 유전자 발현 연구를 위한 적절한 참고유전자의 파악(Identification of valid reference genes for gene expression studies of human stomach cancer by reverse transcription-qPCR. Rho et al. BMC Cancer 2010, 10:240); 대장암, 식도암, 위암 조직에서 참고유전자에서 참고유전자의 변화(Housekeeping gene variability in normal and cancerous colorectal, pancreatic, esophageal, gastric and hepatic tissues. Claudia Rubie et al. Mol Cell Probes. 2005); qPCR을 이용한 미국 유사제품 참조 유전자 사례: 유방암 참고유전자(A Multigene Assay to Predict Recurrence of Tamoxifen-Treated, Node-Negative Breast Cancer. Paik S et al. N Engl J Med . 2004 Dec); 대장암 참고유전자(Relationship Between Tumor Gene Expression and Recurrence in Four Independent Studies of Patients With Stage II/III Colon Cancer Treated With Surgery Alone or Surgery Plus Adjuvant Fluorouracil Plus Leucovorin. O'Connell et al. J Clin Oncol. 2010).
또한, 현재 상용화된 고형암 관련 제품에서 활용되고 있는 참고유전자를 조사하였다. 이들을 근거로 선정된 유전자가 임상샘플의 참고유전자로서 적격한지의 여부를 선행연구에서 검증하여 최종 선정하였다.
위의 근거를 바탕으로 일차적으로 총 8개의 참고유전자를 후보로 선정하였다.
파라핀포매 샘플(30개)에서 조합하였을 때 가장 변이도가 작은 유전자를 선정하여(geNorm 이용) 최종 5개의 참고유전자를 선정하였다(도 1 참조): ACTB / ATP5E / GPX1 / UBB / HPRT1
다음으로, 알고리즘 개발을 위해, 2006~2010년 연세대학교 세브란스 병원에서 위암 수술을 받은 2기~3기 환자 310개의 파라핀포매 샘플 잔여 검체(3mm Core)를 대상으로 실시간 중합효소연쇄반응(real time RT PCR)을 수행하였다.
마커유전자는 위암의 이형질성을 구분하며 암조직에서 안정적으로 측정할 수 있는 유전자들, 즉, 면역 축(Immune Axis)을 대표할 수 있는 마커 유전자(WARS, GZMB)와 유사 암줄기세포 축(Stem-like Axis)을 대표할 수 있는 마커유전자(SFRP4) 및 상피 축(Epithelial Axis)를 대표할 수 있는 마커 유전자(CDX1) 총 4개이다.
이로부터 개발된 마커 유전자 및 참고유전자는 하기 표 2와 같다.
Figure PCTKR2017008781-appb-T000002
다음으로, 상기 예후 또는 항암제 적합성 마커 유전자군과 참고유전자군의 유전자별 임계치를 결정하여 예후와 관련된 군(Prognostic Cluster I:좋은 예후군, Prognostic Cluster II:중간 예후군 및 Prognostic Cluster III:나쁜 예후군)과 항암제 적합성과 관련된 군(Predictive Cluster S:항암제 반응군 및 Predictive Cluster R:항암제 불응군)의 구분 틀을 마련하고자 하였다.
이러한 구분 틀을 마련하기 위해 이산화기반이층분류시스템(Binary signal based two tier system)에 의한 예후군(Prognostic Cluster) 및 항암제 적합 예측군 (Predictive Cluster) 분류를 사용하였다.
상기 실시간 RT-PCR을 통해 얻은 예후 또는 항암제 적합성 마커 유전자군과 참고유전자군의 Cq 값을 이용하여 하기 식 1과 같이 각 마커 유전자들의 ΔCq 값을 산출하여 mRNA 발현양을 표준화하였다:
[식 1]
ΔCq = 참고유전자군의 Cq 값 - 마커 유전자의 Cq 값
여기서, 참고유전자군의 Cq 값은 ACTB, ATP5E, GPX1, UBB 및 HPRT1로 이루어진 참고 유전자들의 평균 Cq 값을 나타낸다.
상기 ΔCq 값이 클수록 유전자 발현이 높다.
상기 ΔCq 값을 적응적 회귀기법(adaptive regression)에 적용하여 적응적 회귀 수치(A.R.V.)를 산출하였다. 통상적으로, 어레이에서 취하는 값은 중앙값(median)이나 평균값(average)을 기준으로 데이터를 처리하나, 적응적 회귀기법에 의한 알고리즘은 전체 데이터에서 임의의 한 점을 구분점으로 삼았을 때 구분된 구간값 평균의 분산이 가장 큰 포인트를 적응적 회귀 수치(또는 임계치)로 설정한다. 즉 임계치는 해당 유전자의 정상 및 암조직 전체에서 생물학적 의의가 있는 고발현과 저발현을 구분하는 기준점이 된다. 적응적 회귀 수치는 다음과 같이 구한다.
① 적응적 회귀 방식을 통한 피팅
Figure PCTKR2017008781-appb-I000005
이때, F-distribution의 tail-probability에 상응하는 p-value는 다음과 같다.
Figure PCTKR2017008781-appb-I000006
위 과정에서 p value가 작을수록 피팅이 잘 되었다고 볼 수 있다.
② 스텝 함수 결정
Figure PCTKR2017008781-appb-I000007
③ 본 발명의 방식은 위의 one step 방식을 이용하여 각 유전자별로 전체 데이터에서 임의의 한 점을 구분점으로 삼았을 때
Figure PCTKR2017008781-appb-I000008
statistics를 최대로 하는 포인트를 A.R.V.로 결정하고, 이 값을 가지고 보정값을 가산하여 최종 임계치를 정한다. 상기 적응적 회귀 수치는 310개의 종양조직(tumor) 파라핀포매 샘플과 108개의 정상조직(normal) 파라핀포매 샘플 조직을 대상으로 이루어지며, 정상 조직 샘플과 위암 조직 샘플을 정량하여 표준화하였다. 정상 조직과 위암 조직의 샘플을 대상으로 유전자별로 적응적 회귀기법을 이용하여 산출한 수치를 구하고 위의 시험기준 보정값을 적용하여 아래 기준에 부합하는 최종 임계치를 결정하였다. 또한, 유전자의 Cq 수치가 N/A 혹은 Undetermined가 산출될 경우 이 샘플의 해당유전자는 적응적 회귀 수치에서 제외하였다. 상기의 방법에 따라 산출된 마커 유전자들의 최종 임계치는 하기 표 3에 나타낸 바와 같다(도 2 참조).
Figure PCTKR2017008781-appb-T000003
4개 마커유전자에 의한 이산화기반이층분류시스템은 다음과 같이 분류하였다.
우선, 일층 분류(first tier) 단계로, Boolean 방법 중 로직 게이트를 활용하여 두 개의 마커 유전자(WARS, GZMB)에 의하여 예후가 좋은 군(Prognostic Cluster I, 도 3에 굵은 선 영역)이면서 항암제 불응군(Predictive Cluster R, 도 4에 굵은 선 영역)을 분류할 수 있다. 이때 마커유전자(WARS, GZMB)를 면역 축(Immune Axis)이라 명명하였다.
다음은, 이층 분류(second tier) 단계로, 일층 분류(first tier)에서 분류되지 않은 나머지 위암 환자군을 대상으로 두 번째 분류를 진행하는데, 이때 나머지 두 개의 마커 유전자인 CDX1과 SFRP4를 사용하여 분류한다.
여기서, 예후적 차이는 암줄기세포 축(Stem-like Axis)을 대표하는 마커 유전자(SFRP4)에 의해 발현이 낮은 군은 예후가 중간인 군(Prognostic Cluster II, 도 5에 왼쪽 굵은 선 영역)으로 분류되고, 발현이 높은 군은 예후가 나쁜 군(Prognostic Cluster III, 도 5에 오른쪽 굵은 선 영역)으로 명명한다.
다음으로, 항암제 적합성은 상피 축(Epithelial Axis)을 대표하는 마커 유전자(CDX1)에 의해 발현이 높은 군은 항암제 반응군(Predictive Cluster S, 도 6에 위쪽 굵은 선 영역)으로 분류되고, 발현이 낮은 군은 일층 분류(first tier)에서 분류된 군(도 4에 굵은 선 영역)과 함께 항암제 불응군(Predictive Cluster R, 도 6에 아래쪽 굵은 선 영역)으로 분류된다.
상기와 같은 분류 알고리즘은 도 7에 도시하였다.
<실시예 2> 진행성 위암의 재발 및 항암제 반응 가능성의 예측 알고리즘의 검증
상기 실시예 1에서 얻은 예측 알고리즘에 의한 예후와 항암제 적합성을 Kaplan-Meir curve 및 COX 단변량/다변량 분석을 통해 유의성을 검증하였다(n=307, 3개 샘플은 QC 탈락).
도 8의 Kaplan-Meir curve에서 드러나듯이 세 개의 예후군(Prognostic Cluster I, II & III) 사이에 예후의 차이가 있음이 알 수 있다. 5년 전체 생존율은 각각 83.3, 71.8, 58.2 %로 Prognostic Cluster I이 세 개의 군 사이에 가장 예후가 좋고, Prognostic Cluster III가 가장 예후가 나쁘다는 것이 드러난다.
Figure PCTKR2017008781-appb-T000004
표 4에서와 같이, 본 발명에 의한 예후군에 대한 COX 단변량과 다변량 분석에서 예후군(Prognostic Cluster) 구분이 예후를 구분할 수 있을 뿐만 아니라 독립적인 예후 예측 인자임이 드러났다. 특히, Prognostic Cluster I과 Prognostic Cluster III가 예후적으로 차이가 났고, Prognostic Cluster II는 완충지대(buffer zone)로 설정하였다.
예후에 관한 결과를 무병 생존율 관점에서 검증하였다. 도 9의 Kaplan-Meir curve에서 드러나듯이 전체 생존율과 결과와 동일하게 세 개의 군(Prognostic Cluster I, Prognostic Cluster II, Prognostic Cluster III) 사이에 무병 생존율 측면에서 차이가 있음이 알 수 있다. 5년 무병 생존율은 각각 75.8 %, 66.9 %, 48.2 %로 Prognostic Cluster I이 세 개의 군 사이에 가장 예후가 좋고, Prognostic Cluster III가 가장 예후가 나쁘다는 것이 드러난다.
또한, 표 5에서와 같이, 본 발명에 의한 예후군에 대한 COX 단변량과 다변량 분석에서 예후군(Prognostic Cluster) 구분이 무병 생존율 측면에서도 예후를 구분할 수 있을 뿐만 아니라 독립적인 예후 예측 인자임을 알 수 있다.
Figure PCTKR2017008781-appb-T000005
다음으로, 전체 검체(n=307)에서 항암화학요법을 받지 않은 환자(Surgery only)와, 위암절제술을 받은 후 항암 화학요법(adjuvant chemotherapy, CTX)을 받은 환자의 전체 생존율 측면에서 예후를 비교하였을 때, 도 10의 Kaplan-Meir curve에서와 같이 그룹 간의 유의적인 차이는 없었다. 이 검체는 후향적 샘플로 수집되었고, 환자의 항암 화학요법 여부의 결정에 BIAS가 개입되었기 때문에 이러한 결과를 얻은 것으로 보인다. 따라서 본 <실시예 2> 에서는 성별, 나이, TNM 병기, 항암제 치료여부 등의 요소로 COX 다변량 분석을 시행하여 데이터를 분석한다.
본 발명에 의한 항암제 반응군(Predictive Cluster S)(n=145)에서 항암요법을 받거나 그렇지 않은 환자의 예후를 비교한 결과, 도 11에 나타난 바와 같이, COX 단변량 분석에서 항암요법을 받은 그룹과 받지 않는 그룹 사이의 차이가 유의미하게 나타나지 않으나, 이는 샘플 집단의 BIAS에 인한 것으로 판단된다. 그러나 성별, 나이, TNM 병기 요소로 COX 다변량 분석에서 항암요법을 받은 그룹이 항암요법을 받지 않은 그룹에 비해 항암 효과가 있는, 통계적으로 유의미한 결과를 보이고 있다(표 6, 도 11 참조).
Figure PCTKR2017008781-appb-T000006
본 예후를 무병 생존율 측면에서 검증해보아도 전체 생존율 결과와 동일한 결과를 관찰할 수 있다. 본 발명에 의한 Predictive Cluster S (n=145)에서 화학요법을 받거나 그렇지 않은 환자의 예후를 무병 생존율 측면에서 비교한 결과, 도 12에 나타난 바와 같이, COX 단변량 분석에서 항암요법을 받은 그룹과 받지 않는 그룹 사이의 차이가 유의미하게 나타나지 않으나, 성별, 나이, TNM 병기 요소로 COX 다변량 분석에서 항암요법을 받은 그룹이 항암요법을 받지 않은 그룹에 비해 항암효과가 있는 것으로 보이고 있으나 marginal 한 측면을 보이고 있다. 무병생존률은 <실시예 4> 에서 추가 검증되었다(표 7, 도 12 참조).
Figure PCTKR2017008781-appb-T000007
다음으로, Predictive Cluster R (n=162)에서 항암화학요법을 받거나 그렇지 않은 환자의 예후를 전체 생존율 측면에서 비교한 결과, 도 13에 나타난 바와 같이, 항암요법을 받은 그룹과 받지 않은 그룹이 COX 단변량, 다변량 분석에서 생존 차이가 유의미하지 않은 결과를 보인다(표 8, 도 13 참조).
마지막으로, Predictive Cluster R (n=162)에서 항암화학요법을 받거나 그렇지 않은 환자의 예후를 무병 생존율 측면에서 비교한 결과, 도 14에 나타난 바와 같이, 항암요법을 받은 그룹과 받지 않은 그룹이 COX 단변량, 다변량 분석에서 생존 차이가 유의미하지 않은 결과를 보인다(표 9, 도 14 참조).
Figure PCTKR2017008781-appb-T000008
Figure PCTKR2017008781-appb-T000009
<실시예 3> 항암제 적합성(Predictive Cluster S & R) 군 구분과 항암요법의 여부에 대한 상관관계 검증
항암제 적합성(Predictive Cluster)과 항암제 투여 여부에 대한 상관관계(interaction)를 비교하였을 때, 항암화학요법으로 유익한 효과를 받은 그룹 간의 직접적인 상관관계가 없음을 관찰하였으나 후향적 샘플 편향을 고려하여, COX 다변량 분석을 하였을 때 항암제 적합성(Predictive Cluster)과 항암화학요법 간의 상관관계가 있음을 관찰하였다. 이는 나이, 성별, TNM 병기 요소로 COX 다변량으로 보았을 때, 항암 화학요법의 이점은 항암제 반응군(Predictive Cluster S)에서 예상되나, 항암제 불응군(Predictive Cluster R)에서는 그렇지 않음을 지시한다(표 10 참조, Predictive Clusters Multiple COX p-value=0.039).
Figure PCTKR2017008781-appb-T000010
이를 무병 생존율 측면에서 검증해 보았을 때도 전체 생존율과 동일한 결과가 나타난다. 이는 항암 화학요법의 이점은 항암제 반응군(Predictive Cluster S)에서 예상되나, 항암제 불응군(Predictive Cluster R)에서는 그렇지 않음을 지시한다(표 11 참조, Predictive Clusters Multiple COX p-value=0.048).
Figure PCTKR2017008781-appb-T000011
상기 결과로부터 본 발명의 알고리즘에 의해 분류된 좋은 예후군(Prognostic Cluster I)과 나쁜 예후군(Prognostic Cluster III)의 예후 예측 결과, 5년 전체 생존율과 무병 생존율에 유의적인 차이를 가짐을 알 수 있었고, 수술 및 항암제 치료의 이점은 5년 전체 생존율과 비교한 결과, 항암제 반응군(Predictive Cluster S)에서 통계적으로 유의하나, 항암제 불응군(Predictive Cluster R)에서는 유의하지 않았다. 또한, 항암제 적합성 군 구분과 항암제 치료 여부의 상관관계가 있음을 통계적으로 보여준다.
<실시예 4> 클래식(CLASSIC) 임상시험 샘플을 이용한 예후군(Prognostic Cluster I, II, III) 및 표준치료요법인 XELOX (Xeloda+Oxaliplatin) 항암치료 적합성(Predictive Cluster R & S)의 XELOX 보조 항암요법의 이점에 대한 상관관계 검증
클래식(CLASSIC, Capecitabine and oxaLiplatin Adjuvant Study in Stomach Cancer) 임상시험이란 위암 병기 6판 기준 2기, 3기 환자들을 대상으로 수술 후(D2 dissection) XELOX(Xeloda + Oxaliplatin)의 항암요법을 검증하기 위하여 한국 일본 중국의 37개 병원을 대상으로 진행한 무작위 3상 국제 임상시험이다. 총 1037명이 참가하였으며 이중 515명은 수술 후 관찰만 시행하였고, 520명은 xeloda 와 Oxaliplatin (이하 XELOX)을 투약하였으며, 최종 결론은 XELOX 투여군이 관찰군에 비해 15% 예후 증진 효과를 보인 것으로 보고되어 현재 2기, 3기 환자들의 표준항암치료요법으로 시행되고 있다.
본 실시예에서는 상기 표 1의 nProfiler I의 키트를 이용하여 위 클래식 임상시험에 참여한 환자의 샘플 629명의 샘플을 대상으로 예후 및 항암제 적합성에 대한 효과를 검증한 것이다.
629개의 샘플을 대상으로 실시예 1과 같이 RNA를 추출하고 nProfiler I Stomach Cancer Assay kit를 사용하여 qPCR을 시행하였다. 품질관리는 nProfiler I의 키트에서 규정되어 있는 바와 같이 시행하여 총 4개의 샘플이 중도탈락되었다.
nProfiler I의 키트에 의해 총 9개의 유전자의 Cq 값을 측정하고 식 1에 따른 ΔCq 값은 계산하였다. 계산된 ΔCq 값을 실시예 1의 표 3과 같이 사전에 설정된 값에 따라서 분류의 기준점을 적용하여 실시예 1의 도 7과 같이 군을 구분하였다.
군 분류 이전에 수술 후 XELOX(Xeloda+Oxaliplatin)을 투여한 군과 관찰만 한 군 사이의 예후는 도 15와 같다.
전체 검체(n=625)에서 수술 후 관찰만 한 환자군(Surgery only)과, 위암절제술을 받은 후 XELOX를 받은 환자(CTX)의 예후를 비교하였을 때, 도 15의 Kaplan-Meir curve에서와 같이 그룹 간의 유의적인 차이는 있음을 알 수 있다. 상기 실시예 1, 2 및 3과는 달리 <실시예 4>에서 검체는 무작위 임상 3상 임상시험의 환자 샘플에서 수집된 것이기 때문에 XELOX 치료 선택에 BIAS가 없을 것으로 판단되며 이에 따라 <실시예 4>는 단변량과 다변량 분석을 실시하였다. 분석결과 COX 단변량 분석 및 Kaplan Meir plot 에서 XELOX 처방군(CTX)과 관찰군(Surgery only) 사이의 예후가 유의미하게 차이가 있으며 이는 기존에 발표된 논문의 결과와 동일하다(도 15 참조). 이는 무병 생존율에서도 동일한 결과를 보여주고 있다(도 17 참조).
상기 실시예 1의 예측 알고리즘을 통해 예후 및 항암제 적합성을 Kaplan-Meir curve 및 COX 단변량 및 다변량 분석을 통해 유의성을 검증하였다.
도 16의 Kaplan-Meir curve에서 드러나듯이 세 개의 군(Prognostic Cluster I, Prognostic Cluster II, Prognostic Cluster III) 사이에 예후의 차이가 있음이 알 수 있다. 5년 전체 생존율은 각각 83.2, 74.8, 66.0%로 Prognostic Cluster I이 세 개의 군 사이에 가장 예후가 좋고, Prognostic Cluster III가 가장 예후가 나쁘다는 것이 드러난다.
또한, 표 12에서와 같이, COX 단변량과 다변량 분석에서 각 아형(subtype)이 독립적인 예후 예측 인자임이 드러났다. 특히, Prognostic Cluster I와 Prognostic Cluster III가 예후적으로 차이가 났고, Prognostic Cluster II는 완충지대(buffer zone)으로 설정하였다.
Figure PCTKR2017008781-appb-T000012
이를 무병 생존율에서 검증한 결과는 아래와 같다. 전체 생존율의 결과와 같이 무병 생존율에서도 도 18의 Kaplan-Meir curve에서 드러나듯이 세 개의 군(Prognostic Cluster I, Prognostic Cluster II, Prognostic Cluster III) 사이에 예후의 차이가 있음이 알 수 있다. 5년 무병 생존율은 각각 76.9, 65.0, 55.3%로 Prognostic Cluster I이 세 개의 군 사이에 가장 예후가 좋고, Prognostic Cluster III가 가장 예후가 나쁘다는 것이 드러난다.
또한, 표 13에서와 같이, 무병 생존율에서 검증해보았을 때 COX 단변량과 다변량 분석에서 각 아형(subtype)이 독립적인 예후 예측 인자임이 드러났다. 특히, Prognostic Cluster I와 Prognostic Cluster III가 예후적으로 차이가 났고, Prognostic Cluster II는 완충지대로 설정하였다.
Figure PCTKR2017008781-appb-T000013
Predictive Cluster S(n=281)에서 XELOX 항암요법을 받은 환자군(CTX)과 관찰만 한 환자군(Surgery only)의 전체 생존율 측면에서 예후를 비교한 결과, 도 19에 나타난 바와 같이, COX 단변량 분석에서 XELOX 항암요법을 받은 그룹과 받지 않는 그룹 사이의 차이가 유의미하게 나타난다. COX 다변량 분석에서 성별, 나이, TNM 병기를 조정하였을 때 XELOX 치료를 받은 그룹이 관찰만 한 그룹에 비해 단변량 분석과 동일하게 예후가 좋은, 통계적으로 유의미한 결과를 보이고 있다(표 14, 도 19).
Figure PCTKR2017008781-appb-T000014
위의 결과를 무병 생존율 측면에서 검증하였을 시에도 Predictive Cluster S (n=281)에서 XELOX 항암요법을 받은 환자군과 관찰만 한 환자군의 예후를 비교한 결과, 도 20에 나타난 바와 같이, COX 단변량 분석에서 XELOX 항암요법을 받은 그룹과 받지 않는 그룹 사이의 차이가 유의미하게 나타난다. COX 다변량 분석에서 성별, 나이, TNM 병기를 조정하였을 때 XELOX 치료를 받은 그룹이 관찰만 한 그룹에 비해 단변량 분석과 동일하게 예후가 좋은, 통계적으로 유의미한 결과를 보이고 있다(표 15, 도 20).
다음으로, Predictive Cluster R (n=344)에서 XELOX 항암요법을 받은 환자군과 관찰만 한 환자군 사이의 예후를 비교한 결과, 도 21에 나타난 바와 같이, 두 군사이의 생존차이가 유의미하지 않은 결과를 보인다. 이는 COX 단변량, 다변량 분석에서도 동일한 결과를 보이고 있다(표 16, 도 21 참조).
Figure PCTKR2017008781-appb-T000015
Figure PCTKR2017008781-appb-T000016
다음으로, 이를 무병 생존율 측면에서 검증하였을 시에도 전체 생존율과 같은 동일한 결과를 관찰할 수 있다. Predictive Cluster R (n=344)에서 XELOX 항암요법을 받은 환자군과 관찰만 한 환자군 사이의 예후를 비교한 결과, 도 22에 나타난 바와 같이, 두 군 사이의 생존차이가 유의미하지 않은 결과를 보인다. 이는 COX 단변량, 다변량 분석에서도 동일한 결과를 보이고 있다(표 17, 도 22 참조).
Figure PCTKR2017008781-appb-T000017
다음으로, 항암제 적합성(Predictive Cluster)과 XELOX 항암 요법 처리 여부에 대한 상관관계를 전체 생존율 측면에서 검증해 보았을 때 직접적인 상관관계가 있음을 관찰하였다(표 18).
Figure PCTKR2017008781-appb-T000018
무병 생존율의 측면에서 예후를 검증하였을 때 전체 생존율과 같이 항암제 적합성(Predictive Cluster)과 XELOX 항암요법 처리 여부에 대한 상관관계를 검증해 보았을 때 직접적인 상관관계가 있음을 관찰하였다(표 19).
이는 실시예 3의 결과를 검증한 것으로 XELOX 항암화학요법의 이점은 항암제 반응군(Predictive Cluster S)에서 발생하였고, 항암제 불응군(Predictive Cluster R)에서는 발생하지 않았음을 보여준다.
상기 결과로부터 본 발명의 알고리즘에 의해 분류된 좋은 예후군(Prognostic Cluster I)과 나쁜 예후군(Prognostic Cluster III)의 예후 예측 결과, 5년 생존율에 유의적인 차이를 가짐을 알 수 있다. 또한, 수술 후 XELOX 항암요법의 효과는 항암제 반응군(Predictive Cluster S)에서 유의미하게 발생하고, 항암제 불응군(Predictive Cluster R)에서는 치료 효과가 나타나지 않으며 항암제 적합성과 XELOX 치료 여부의 상관관계가 유의미함을 보여준다.
Figure PCTKR2017008781-appb-T000019
<실시예 5> 진행성 위암 2기와 3기 환자 수술 후 FFPE 일상적 잔여 검체를 이용한 예후군(Prognostic Cluster I, II 및 III)의 임상적 성능 평가
상기 실시예 1에서 얻은 위암 환자의 예후 예측 알고리즘(nProfiler I stomach cancer assay 의료기기)의 임상적 성능 평가를 검증하기 위해, 2기와 3기 (AJCC 6판 기준) 위암 환자의 수술 후 FFPE 일상적 잔여 검체를 대상으로 실시간중합효소연쇄반응을 통해 유전자의 ΔCq 값을 측정하고 환자의 예후를 예측하는 알고리즘의 임상적 성능을 새로운 피험자군으로 검정하였다. 구체적으로, 1) Kaplan-Meier curves으로 검증 세트에서 도출된 두 예후군(Prognostic Cluster I, Prognostic Cluster III)의 5년 생존율을 확인하여 알고리즘의 예측 성능을 평가하고자 하였다. 2) 로그랭크테스트로 예후군 간의 예후 차이를 통계적 유의성 수준으로 비교 검정하여 예후군 별 차이의 안정성을 평가하여, Prognostic Cluster I이 세 개의 군 중에서 가장 예후가 좋은 군이고 Prognostic Cluster III는 가장 예후가 나쁜 군임을 검정하고자 하였다. 3) 다변량 콕스의 비례위험모형에 의한 예후군의 위험비 분석으로 예후군이 독립된 예후인자임을 검정하고자 하였다.
본 임상시험의 총 검체 수는 684개로 진행하였으며, 검체 스크리닝 단계에서 RNA 양과 질의 기준 미달로 18개의 검체가 스크리닝에서 탈락되었다. 스크리닝 탈락된 18개의 검체를 제외한 666개의 검체가 본 임상시험에서 검체로 등록되었다. 최초 시험 및 분석단계에서 666개 중 총 126개의 검체가 QC 탈락기준에 해당하여 1회 재시험을 진행하였으며, 그 결과 총 126개의 검체 중 12개의 검체가 QC 탈락기준에 의해 최종 “중도탈락” 처리되었다. 따라서, 대상검체 684개 중 스크리닝 탈락 검체(18개) 및 재시험 기준에 의한 탈락 검체(12개) 총 30개를 제외한, 654개의 검체를 유효성 평가 분석군으로 선정하였다.
본 임상시험에서 항암제 적합성(Predictive Cluster R,S)에 대한 평가는 이루어지지 않았는데, 그 이유는 654개의 환자 검체 중에서 97.7%의 환자가 항암제 치료를 받았으므로 항암제 적합군(Predictive Cluster R,S)에 의한 아형구분에서 항암 치료를 받은 환자와 그렇지 않은 환자 사이의 예후 차이를 비교하기에는 항암 치료를 받지 않은 환자의 수가 부족하기 때문이다.
우선, 예후군의 5년 생존율 예측 성능을 측정하기 위해, 검체별 △Cq 값을 알고리즘에 적용하여 예후군을 구분하고, 이를 Kaplan-Meier curves로 예후군 별 생존율을 산출하였다(도 23, 표 20 참조).
Figure PCTKR2017008781-appb-T000020
더불어, 예후군 I과 예후군 III, 두 예후군의 95% 신뢰구간 간에 중복 여부를 검증한 결과 아래의 표 21에서와 같이 중복되지 않음을 확인하였다.
Figure PCTKR2017008781-appb-T000021
예후군 별 차이의 안정성을 확인하기 위해, 예후군 I, II, III에 대해서 로그랭크테스트를 사용하여 통계적으로 유의한 차이를 알아보고, 통계량 산출 방법은 자유도 2에 카이제곱값을 계산하여 p value를 산출하였다. 비교하는 예후군의 효과에 차이가 없다면 모든 구간에서의 사건(사망)의 발생은 각 구간의 세 예후군의 관찰대상수(O)에 비례한 빈도로 일어나야 할 것이다. 로그랭크테스트에서는 세 예후군을 합한 전체 집단을 관찰기간 순으로 배열하고 이중 절단된 항목은 지우고 사건(사망)이 발생한 구간만 남겨 정리하였다. 그리고 구간마다 각 예후군의 사망에 대한 기대빈도(E)를 계산하였다. 각 예후군 별 사망에 대한 전체 관찰빈도(O)와 기대빈도(E)의 관계는 자유도 2인 카이제곱 분포를 띄므로 값(X2)이 5.99 (p value < 0.05)보다 큰 경우에 세 개의 예후군은 유의한 차이를 보인다고 판단하였다. 로그랭크테스트에서 귀무가설은 다음과 같았다.
Figure PCTKR2017008781-appb-I000009
로그랭크테스트의 통계량에 대한 p value가 0.05보다 작게 나올 경우에는 예후군 간의 예후 차이가 있다고 해석하고, 반대로 통계량에 대한 p value가 0.05보다 크게 나올 경우에는 예후군 간의 예후 차이가 없다고 해석하였다.
그 결과, 자유도 2에서 카이제곱값(X2)이 24.7 (p value = 4.39e-06)로 산출되어 통계적으로 유의한 차이가 있음을 확인하였다(표 22 참조). 따라서 세 개의 군(Prognostic Cluster I, II, III) 사이에는 예후의 차이가 있음을 알 수 있었다.
Figure PCTKR2017008781-appb-T000022
세 개의 예후군 사이의 차이가 어디에서 유래하는지 파악하기 위해서 로그랭크테스트를 사용하여 각각 자유도 1에서 카이제곱 분포를 가지는 사후분석(Post-hoc test)을 시행한 결과, 모두 유의미한 p value가 산출되어 예후의 차이가 있음을 알 수 있었다. 즉, 세 개의 예후군은 각 예후군 사이의 차이가 명확한 것으로 나타나므로 [예후군별 차이의 안정성] 결과를 충족시킨 것으로 판단하였다.
Figure PCTKR2017008781-appb-T000023
예후군의 위험정도 및 독립성을 확인하기 위해, 위암의 다른 위험인자들(나이, 성별, TNM 병기, 항암제 치료 여부)의 영향을 보정하여 예후군이라는 위험인자에 의해서도 생존율에 차이가 있는지 위험비 분석을 통해서 평가하였다. 콕스의 비례위험모형(Cox Proportional Hazard Model) 분석 방법을 사용하여 기존 예후인자를 공변인으로 한 다변량 분석을 통해 본 알고리즘에 의한 예후군이 위암의 예후에 영향을 미치는 독립적인 예후 인자인지 파악하였다.
콕스의 비례위험모형에서 귀무가설은 다음과 같았다.
Figure PCTKR2017008781-appb-I000010
다음은 유효성 평가 분석군으로 선정된 654개 샘플 중에서 항암제 여부가 불분명한 22개의 샘플은 분석에서 제외하였고, 632개의 샘플을 다변량 콕스의 비례위험모형으로 분석하여 위험비(hazard ratio)와 이에 대한 95% 신뢰구간 및 p value를 산출하였다.
다변량 콕스의 비례위험모형 분석 결과에 의해 두 개의 예후집단 (Prognostic Cluster I vs. Prognostic Cluster III) 간 위험비가 통계적으로 유의하게(p value < 0.05) 나올 경우 알고리즘에 의한 예후군이 독립적인 예후인자라고 해석하였다.
Figure PCTKR2017008781-appb-T000024
콕스의 비례위험모형을 사용하여 분석한 결과, 위암의 예후에 영향을 미치는 위험인자(독립변수)로는 나이(p value = 0.000112), TNM 병기(p value = 1.67e-08)와 예후군이 통계적으로 유의한 것으로 나타났다.
본 임상시험의 평가 변수인 예후군(Prognostic Cluster)의 경우, Prognostic Cluster I을 해당 독립변수의 레퍼런스로 하여 Prognostic Cluster II와 III의 위험비를 산출하였다. 따라서 진단 시 Prognostic Cluster I인 경우에 비해, Prognostic Cluster II(p value = 0.001475)인 경우는 2.04배 그리고 Prognostic Cluster III(p value = 1.40e-05)인 경우는 2.58배 위험하며 통계적으로 유의미하였다.
따라서 위험인자들(나이, 성별, TNM 병기, 항암제 치료 여부)로 조정(adjusted)되었을 시에도 위암에서 본 알고리즘에 의한 Prognostic Cluster 구분이 독립된 예후인자임을 알 수 있었다.
상기 임상시험의 안전성 평가 결과, 해당 기간 동안 시험자는 검사실 생물학적 안전 수칙에 따라 검체를 보관 및 취급하였다. 임상시험 기간 중 관찰한 결과, 검체를 다루는 시험자에게서 검체로부터 이상사례 및 감염 등의 부작용에 관한 안전성 문제는 발생하지 않았다.
본 임상시험을 통하여 상기 실시예 1에서 얻은 예측 알고리즘 및 알고리즘의 임계치를 적용하여 예후의 임상적 유효성 평가 결과를 검증하였다. 유효성 평가변수로 예후군 I(Prognostic Cluster I)과 예후군 III(Prognostic Cluster III)의 5년 생존율을 확인한 결과 각각 81.98%(95% CI, 74.12% ~ 90.67%), 55.74 (95% CI, 50.52% ~ 61.49%)로, 임상시험계획서에서 설정한 평가기준에 부합하였으며 또한 예후군 I과 예후군 III의 5년 생존율의 95% CI가 서로 중복되지 않음을 확인할 수 있었다.
그리고, 구분된 세 예후군 사이에 예후 차이가 있는지 평가하기 위하여 로그랭크테스트를 실시한 결과, 세 개 군 간에는 유의미한 차이가 있음을 확인할 수 있었다. 또한, 사후분석 결과에 의하면 모두 유의미한 p value가 산출되어 예후의 차이가 있음을 알 수 있었다. 즉, 세 개의 예후군은 각 예후군 사이의 차이가 명확한 것으로 나타나므로 [예후군별 차이의 안정성] 결과를 충족시켰다.
마지막으로 나이, 성별, 항암제 여부, 병기 등을 공변인으로 다변량 콕스의 비례위험모형 분석을 실시하여 위험비를 산정한 결과, Prognostic Cluster I인 경우에 비해 Prognostic Cluster II (p value = 0.001475)인 경우는 2.04배 그리고 Prognostic Cluster I인 경우에 비해 Prognostic Cluster III (p value = 1.40e-05) 인 경우는 2.58배 위험하며 통계적으로 유의미하였다. 즉, Prognostic Cluster I은 예후가 가장 좋으며, Prognostic Cluster III 은 예후가 가장 나쁜 것을 확인하였다. 즉, 위험인자들(나이, 성별, TNM 병기, 항암제 치료 여부)로 조정(adjusted)되었을 시에도 위암에서 본 알고리즘에 의한 Prognostic Cluster 구분이 독립된 예후인자임을 알 수 있었다.
결론적으로, 본 임상시험의 평가결과에서 보여주듯이, 상기 실시예 1에서 얻은 위암 환자의 예후 예측 알고리즘 및 nProfiler I stomach cancer assay 의료기기의 임상적 성능이 성공적으로 평가되었다고 볼 수 있다.
본 발명은 위암 환자의 치료방법을 결정하는데 보조적 정보로 활용할 수 있다.

Claims (12)

  1. WARS, GZMB, CDX1 및 SFRP4를 포함하는 예후 또는 항암제 적합성 마커 유전자군의 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제; 및
    ACTB, ATP5E, GPX1, UBB 및 HPRT1를 포함하는 참고유전자군의 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 위암 2기 및 3기의 예후 또는 항암제 적합성 예측용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    예후 또는 항암제 적합성 마커 유전자군 또는 참고유전자군의 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 mRNA에 상보적인 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 위암 2기 및 3기의 예후 또는 항암제 적합성 예측용 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    예후 또는 항암제 적합성 마커 유전자군 또는 참고유전자군의 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제는 SEQ ID NOS: 1 내지 18에 기재된 프라이머 세트; 또는 SEQ ID NOS: 19 내지 27에 기재된 프로브를 포함하는, 위암 2기 및 3기의 예후 또는 항암제 적합성 예측용 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    조성물은 위암 2기 및 3기 환자의 재발 또는 항암제 반응 가능성을 전체 생존율(Overall Survival) 또는 무병 생존율(Disease Free Survival) 측면에서 예측하는 용도로 사용하는 것인, 위암 2기 및 3기의 예후 또는 항암제 적합성 예측용 조성물.
  5. 제1항의 조성물을 포함하는 위암 2기 및 3기의 예후 또는 항암제 적합성 예측용 키트.
  6. 제5항에 있어서,
    키트는 RT-PCR(Reverse transcription polymerase chain reaction) 키트 또는 DNA 칩 키트인, 위암 2기 및 3기의 예후 또는 항암제 적합성 예측용 키트.
  7. 위암 2기 및 3기 종양에서 얻은 생물학적 샘플에서 WARS, GZMB, CDX1 및 SFRP4를 포함하는 예후 또는 항암제 적합성 마커 유전자군과, ACTB, ATP5E, GPX1, UBB 및 HPRT1를 포함하는 참고유전자군의 mRNA의 발현 수준을 측정하고, 하기 식 1에 따라 각 예후 또는 항암제 적합성 마커 유전자들의 ΔCq 값을 계산하는 단계; 및
    상기 예후 또는 항암제 적합성 마커 유전자들의 기 설정된 기준 최종 임계치와 비교하여,
    생물학적 샘플의 GZMB 및 WARS의 ΔCq 값이 기 설정된 기준 GZMB 및 WARS의 최종 임계치보다 더 높은 경우, 좋은 예후군(Prognostic Cluster I)으로 분류하고,
    생물학적 샘플의 GZMB 및 WARS의 적어도 하나의 ΔCq 값이 기 설정된 기준 GZMB 또는 WARS의 최종 임계치보다 낮은 경우, 생물학적 샘플의 SFRP4의 ΔCq 값을 기 설정된 기준 SFRP4의 최종 임계치와 비교하여 ΔCq 값이 더 낮은 경우 중간 예후군(Prognostic Cluster II)으로 분류하고, ΔCq 값이 더 높은 경우 나쁜 예후군(Prognostic Cluster III)로 분류하는 단계를 포함하고,
    상기 예후 또는 항암제 적합성 마커 유전자들의 기 설정된 기준 최종 임계치는 WARS, GZMB, CDX1 및 SFRP4에 대해 각각 -2.14, -5.18, -2.69 및 -3.63이며,
    상기 최종 임계치는 위암 2기 및 3기 종양 조직 샘플에서 WARS, GZMB, CDX1 및 SFRP4를 포함하는 예후 또는 항암제 적합성 마커 유전자들의 ΔCq 값을 얻고, 상기 ΔCq 값을 이용하여 각 유전자별 적응적 회귀 수치(adaptive regression value)를 산출하며, 상기 적응적 회귀 수치에 각 유전자별 보정값을 가산하여 각 유전자별 최종 임계치(final threshold value)를 산출하며, 상기 WARS, GZMB, CDX1 및 SFRP4의 적응적 회귀수치는 각각 -2.54, -5.58, -3.59, -4.53이며 보정값은 각각 +0.4, +0.4, +0.9 및 +0.9인, 위암 2기 및 3기의 예후 예측을 위한 정보를 제공하는 방법:
    [식 1]
    ΔCq = (참고유전자군의 Cq 값) - (예후 또는 항암제 적합성 마커 유전자의 Cq 값)
    여기서, 참고유전자군의 Cq 값은 ACTB, ATP5E, GPX1, UBB 및 HPRT1를 포함하는 참고 유전자들의 평균 Cq 값을 나타낸다.
  8. 제7항에 있어서,
    생물학적 샘플은 신선종양조직, 신선동결종양조직, 파라핀포매종양조직, 세침흡인액, 복수, 관 세정액 및 흉막액으로 구성되는 군에서 선택되는, 위암 2기 및 3기의 예후 예측을 위한 정보를 제공하는 방법.
  9. 제7항에 있어서,
    예후 또는 항암제 적합성 마커 유전자군 및 참고유전자군의 mRNA의 발현 수준 측정은 역전사효소 중합효소 반응, 경쟁적 역전사효소 중합효소반응, 실시간 역전사효소 중합효소반응, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅, 또는 DNA 칩에 의해 수행되는, 위암 2기 및 3기의 예후 예측을 위한 정보를 제공하는 방법.
  10. 위암 2기 및 3기 종양에서 얻은 생물학적 샘플에서 WARS, GZMB, CDX1 및 SFRP4를 포함하는 예후 또는 항암제 적합성 마커 유전자군과, ACTB, ATP5E, GPX1, UBB 및 HPRT1를 포함하는 참고유전자군의 mRNA의 발현 수준을 측정하고, 하기 식 1에 따라 각 예후 또는 항암제 적합성 마커 유전자들의 ΔCq 값을 계산하는 단계; 및
    상기 예후 또는 항암제 적합성 마커 유전자들의 기 설정된 기준 최종 임계치와 비교하여,
    생물학적 샘플의 GZMB 및 WARS의 ΔCq 값이 기 설정된 기준 GZMB 및 WARS의 최종 임계치 보다 더 높은 경우, 항암제 불응군(Predictive Cluster R)으로 분류하고,
    생물학적 샘플의 GZMB 및 WARS의 적어도 하나의 ΔCq 값이 기 설정된 기준 GZMB 또는 WARS의 최종 임계치보다 더 낮은 경우, 생물학적 샘플의 CDX1의 ΔCq 값을 기 설정된 기준 CDX1의 최종 임계치와 비교하여 ΔCq 값이 더 낮은 경우 항암제 불응군(Predictive Cluster R)으로 분류하고, ΔCq 값이 더 높은 경우 항암제 반응군(Predictive Cluster S)으로 분류하는 단계를 포함하고,
    상기 예후 또는 항암제 적합성 마커 유전자들의 기 설정된 기준 최종 임계치는 WARS, GZMB, CDX1 및 SFRP4에 대해 각각 -2.14, -5.18, -2.69 및 -3.63이며,
    상기 최종 임계치는 위암 2기 및 3기 종양 조직 샘플에서 WARS, GZMB, CDX1 및 SFRP4를 포함하는 예후 또는 항암제 적합성 마커 유전자들의 ΔCq 값을 얻고, 상기 ΔCq 값을 이용하여 각 유전자별 적응적 회귀 수치(adaptive regression value)를 산출하며, 상기 적응적 회귀 수치에 각 유전자별 보정값을 가산하여 각 유전자별 최종 임계치(final threshold value)를 산출하며, 상기 WARS, GZMB, CDX1 및 SFRP4의 적응적 회귀수치는 각각 -2.54, -5.58, -3.59, -4.53이며 보정값은 각각 +0.4, +0.4, +0.9 및 +0.9인, 위암 2기 및 3기의 항암제 적합성 예측을 위한 정보를 제공하는 방법:
    [식 1]
    ΔCq = (참고유전자군의 Cq 값) - (예후 또는 항암제 적합성 마커 유전자의 Cq 값)
    여기서, 참고유전자군의 Cq 값은 ACTB, ATP5E, GPX1, UBB 및 HPRT1를 포함하는 참고 유전자들의 평균 Cq 값을 나타낸다.
  11. 제10항에 있어서,
    생물학적 샘플은 신선종양조직, 신선동결종양조직, 파라핀포매종양조직, 세침흡인액, 복수, 관 세정액 및 흉막액으로 구성되는 군에서 선택되는, 위암 2기 및 3기의 항암제 적합성 예측을 위한 정보를 제공하는 방법.
  12. 제10항에 있어서,
    예후 또는 항암제 적합성 마커 유전자군 및 참고유전자군의 mRNA의 발현 수준 측정은 역전사효소 중합효소 반응, 경쟁적 역전사효소 중합효소반응, 실시간 역전사효소 중합효소반응, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅, 또는 DNA 칩에 의해 수행되는, 위암 2기 및 3기의 항암제 적합성 예측을 위한 정보를 제공하는 방법.
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