WO2023063562A1 - 세포 유리 dna를 이용한 대장암 진단을 위한 메틸화 마커 유전자 및 이의 용도 - Google Patents

세포 유리 dna를 이용한 대장암 진단을 위한 메틸화 마커 유전자 및 이의 용도 Download PDF

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WO2023063562A1
WO2023063562A1 PCT/KR2022/012598 KR2022012598W WO2023063562A1 WO 2023063562 A1 WO2023063562 A1 WO 2023063562A1 KR 2022012598 W KR2022012598 W KR 2022012598W WO 2023063562 A1 WO2023063562 A1 WO 2023063562A1
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WO
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nxph1
dab1
gene
methylation
colorectal cancer
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PCT/KR2022/012598
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허혜진
문서윤
김윤경
이선미
문재우
김원섭
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주식회사 엔도믹스
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B40/00—ICT specially adapted for biostatistics; ICT specially adapted for bioinformatics-related machine learning or data mining, e.g. knowledge discovery or pattern finding
    • G16B40/20—Supervised data analysis

Definitions

  • the present invention relates to a methylation marker gene for diagnosing colorectal cancer and its use.
  • Colorectal cancer is the second most common cancer in Korea after gastric cancer, and has a good prognosis with a 5-year survival rate of 94.5% when detected early. Recently, for early diagnosis of cancer, a molecular diagnosis method using liquid biopsy is attracting attention as an alternative to invasive diagnosis and examination methods.
  • DNA methylation is an epigenetic modification that plays a pivotal role in regulating gene expression, and is modified into 5-methylcytosine by attaching a methyl group (-CH 3 ) to carbon 5 of cytosine.
  • DNA methylation mainly occurs at the cytosine group of CpG dinucleotides, and is frequently found in DNA regions where CpGs are concentrated, called CpG islands.
  • DNA methylation is recognized to play an important role in the carcinogenesis process of various solid cancers including colorectal cancer. During the course of cancer progression, DNA hypomethylation appears throughout the genome, and it is known that local hypermethylation frequently occurs in some regions of CpG islands. In addition, it was confirmed that DNA methylation shows a tissue-specific pattern.
  • DNA methylation patterns are clinically meaningful information in the diagnosis of various cancers.
  • cancer cells when the CpG site of the promoter region of a tumor suppressor gene is abnormally hypermethylated, the expression of this gene is suppressed, causing cancer.
  • NGS Next-Generation Sequencing
  • Patent Document 1 Korean Patent Registration No. 10-2046668
  • the object of the present invention is to solve all the problems of the prior art described above.
  • Another object of the present invention is to provide methylated marker genes for diagnosing colorectal cancer.
  • Another object of the present invention is to provide a method for diagnosing colon cancer or a method for providing information for diagnosing colon cancer.
  • Another object of the present invention is to provide a method for diagnosing and treating colorectal cancer.
  • Another object of the present invention is to provide a composition, kit, or panel for detecting methylation marker genes for the diagnosis of colorectal cancer.
  • the present inventors completed the present invention by discovering specific genes or gene combinations whose methylation levels are differentially changed in colorectal cancer patient groups.
  • NXPH1 Neuronal growth factor 1
  • ZNF559-ZNF177 Zinc Finger Protein 559-Zinc Finger Protein 177
  • ANKMY1 Alkyrin Repeat And MYND Domain Containing 1
  • AVPR1A Argonal Vasopressin Receptor 1A
  • CAPS2 Calcyphosine 2
  • DAB Adaptor Protein 1 DAB Adaptor Protein 1
  • HTR1A 5-Hydroxytryptamine Receptor 1A
  • PCDH8 Protocadherin 8
  • PENK Proenkephalin
  • Solute Carrier Family 12 Member 5 SLC12A5
  • Solute Carrier Family 32 Member 1 SLC32A1
  • a genetic marker for diagnosis and/or treatment of colorectal cancer comprising at least one gene selected from the group consisting of or a CpG region thereof is provided.
  • a genetic marker for diagnosing colorectal cancer comprising at least one gene selected from the group consisting of NXPH1 gene and ZNF559-ZNF177 gene or a CpG region thereof is provided.
  • At least one gene selected from the group consisting of the NXPH1 gene and the ZNF559-ZNF177 gene or a CpG region thereof is included, and ANKMY1 (Ankyrin Repeat And MYND Domain Containing 1), AVPR1A (Arginine Vasopressin Receptor 1A) , Calcyphosine 2 (CAPS2), DAB Adaptor Protein 1 (DAB1), 5-Hydroxytryptamine Receptor 1A (HTR1A), Protocadherin 8 (PCDH8), Proenkephalin (PENK), Solute Carrier Family 12 Member 5 (SLC12A5), and Solute Carrier SLC32A1
  • a genetic marker for diagnosing colorectal cancer further comprising at least one gene selected from the group consisting of Family 32 Member 1 or a CpG region thereof is provided.
  • a genetic marker for diagnosing colorectal cancer comprising any one or more of the genes or CpG regions thereof in the combination described in (i) to (vii) below is provided: (i) HTR1A, NXPH1 and DAB1; (ii) AVPR1A, ANKMY1, CAPS2, HTR1A, NXPH1, PENK and DAB1; (iii) AVPR1A, PCDH8, ANKMY1, CAPS2, NXPH1, PENK and DAB1; (iv) ANKMY1, ZNF559-ZNF177, SLC32A1 and DAB1; (v) HTR1A, NXPH1, ZNF559-ZNF177 and DAB1; (vi) NXPH1 and DAB1; or (vii) NXPH1 and SLC12A5.
  • a method for diagnosing colorectal cancer or a method for providing information for diagnosing colorectal cancer comprising the step of measuring the methylation status of the genetic marker in a nucleic acid isolated from a biological sample of an individual is provided do.
  • a method for treating colorectal cancer or a method for providing information for colorectal cancer treatment comprising measuring the methylation status of the genetic marker in a nucleic acid isolated from a biological sample of an individual do.
  • compositions for diagnosing or treating colorectal cancer using a nucleic acid isolated from a biological sample, including an agent that specifically amplifies the genetic marker are provided.
  • an agent specifically amplifying the genetic marker for the preparation of an agent for diagnosing colon cancer is provided.
  • composition for diagnosing or treating colorectal cancer comprising an agent for measuring the methylation level of the CpG region of the genetic marker.
  • the use of an agent for measuring the methylation level of the CpG region of the genetic marker for the preparation of a agent for diagnosing colon cancer is provided.
  • kits for diagnosing or treating colorectal cancer or a panel for detecting methylation marker genes using nucleic acid isolated from a biological sample of an individual containing the composition is provided.
  • the method, composition, kit or panel based on a blood sample is provided.
  • a new methylation marker gene whose methylation level is differentially changed in a colon cancer patient group was discovered.
  • Colon cancer can be diagnosed with excellent sensitivity, specificity and/or accuracy by using the genetic marker.
  • the methylation marker gene is useful in that colorectal cancer can be diagnosed using a blood-based biological sample.
  • FIG. 1 shows a process for establishing a colorectal cancer identification model according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 shows a color chart showing differences in methylation levels between samples of a colorectal cancer patient group (26 cases) and a normal control group (28 cases) in the DMR of the methylation marker gene discovered in the present invention.
  • Figure 3 shows the sensitivity values obtained by performing a leave-one-out test on samples of patient groups (26 cases) and normal controls (28 cases) based on the combination of HTR1A, NXPH1 and DAB1 among the methylation marker genes discovered in the present invention. It shows the results sorted by cancer radix.
  • methylation means that a methyl group is attached to a base constituting DNA.
  • CpG region is also called a CpG island, and means a DNA region or part thereof in which CpG is concentrated.
  • cfDNA refers to cell free or cell free DNA.
  • primer refers to a nucleic acid sequence capable of forming a base pair with a complementary template of a gene in a sample and serving as a starting point for copying a template strand.
  • probe refers to a substance capable of specifically binding to a gene to be detected in a sample, and through the binding, a substance capable of specifically confirming the presence of a gene in a sample.
  • antisense nucleotide refers to a nucleic acid-based molecule that has a complementary sequence to a target gene and can form a dimer with the target gene.
  • NXPH1 Neuronal Component 1
  • ZNF559-ZNF177 Zinc Finger Protein 559-Zinc Finger Protein 177
  • ANKMY1 Alkyrin Repeat And MYND Domain Containing 1
  • AVPR1A as methylation marker genes for colorectal cancer diagnosis
  • CAPS2 Calcyphosine 2
  • DAB1 DAB Adaptor Protein 1
  • HTR1A 5-Hydroxytryptamine Receptor 1A
  • PCDH8 Protocadherin 8
  • PENK Proenkephalin
  • SLC12A5 Solute Carrier Family 12 Member 5
  • Solute Carrier Family 32 Member 1 SLC32A1
  • the gene NXPH1 is a member of the neurexophilin family and encodes a secreted protein with a variable N-terminal domain, a highly conserved N-glycosylated central domain, a short linker region, and a cysteine-rich C-terminal domain. do.
  • This protein forms a very tight complex with alpha neurexins, a group of proteins that promote attachment between dendrites and axons.
  • the genes ZNF559-ZNF177 may be involved in transcriptional regulation and belong to the krueppel C2H2 type zinc finger protein family.
  • the gene ANKMY1 is also known as ZMYND13, and diseases related thereto include venous hemangioma and sleeping sickness.
  • the protein encoded by the gene AVPR1A acts as a receptor for arginine vasopressin. This receptor mediates cell contraction and proliferation, platelet aggregation, release of coagulation factors and glycogenolysis.
  • the gene CAPS2 is a protein coding gene, and its related Gene Ontology includes calcium ion binding.
  • the gene DAB1 encodes a key regulator of Reelin signaling.
  • Lilin is a large glycoprotein secreted by neurons in the developing brain, particularly Cajal-Retzius cells.
  • DAB1 functions downstream of rillin in signaling pathways that control cell positioning in the developing brain and during adult neurogenesis.
  • HTR1A encodes the serotonin 1A receptor in humans.
  • Diseases associated with HTR1A include cyclical fever (menstrual cycle-dependent) and generalized anxiety disorder.
  • the gene PCDH8 belongs to the protocadherin gene family, which is a subfamily of the cadherin superfamily. This gene encodes an integral membrane protein that is thought to function CNS-specifically in cell adhesion.
  • the gene PENK encodes a preproprotein that is proteolytically processed to produce several proteins. These products include the pentapeptide opioids Met-enkephalin and Leu-enkephalin, which are stored in synaptic vesicles and released synaptically to bind mu and delta-opioid receptors to modulate pain perception.
  • the protein encoded by the gene SLC12A5 is an integral membrane K-Cl cotransporter that can function in net efflux or inflow pathways depending on the chemical concentration gradient of potassium and chloride.
  • the encoded protein acts either as a homomultimer or as a heteromultimer with other K-Cl cotransporters to help maintain chloride homeostasis in neurons.
  • the gene SLC32A1 also known as VGAT or VIAAT, encodes a vesicular inhibitory amino acid transporter in humans.
  • the methylation marker gene can diagnose colorectal cancer with excellent sensitivity, specificity and/or accuracy based on a biological sample isolated from a subject, such as a liquid sample, or can provide information on colorectal cancer diagnosis.
  • the methylation marker gene enables non-invasive diagnosis in that it shows excellent diagnostic accuracy when liquid samples such as blood, plasma, and serum are used.
  • NXPH1 Neuronal Activin 1
  • ZNF559-ZNF177 Zinc Finger Protein 559- Zinc Finger Protein 177
  • Ankyrin Repeat And MYND Domain Containing 1 ANKMY1
  • AVPR1A Arginine Vasopressin Receptor 1A
  • CAS2 Calcyphosine 2
  • DAB Adaptor Protein 1 DAB Adaptor Protein 1
  • HTR1A 5-Hydroxytryptamine Receptor 1A
  • PCDH8 Protocadherin 8
  • PENK Proenkephalin
  • Solute Carrier Family 12 Member 5 SLC12A5
  • Solute Carrier Family 32 Member 1 SLC32A1 Measuring the methylation state of one or more genes or CpG regions thereof A method is provided.
  • the "methylation status" may mean whether or not methylation occurs in cytosine of a specific CpG region of a specific gene or the degree of methylation.
  • methylation occurs, binding of transcription factors is hindered by the methylation, and expression of the corresponding gene may be suppressed. Expression inhibition can occur relatively depending on the degree of methylation.
  • DNA methylation is an epigenetic modification that plays a pivotal role in regulating gene expression, and is transformed into 5-methylcytosine by attaching a methyl group (-CH 3 ) to carbon 5 of cytosine.
  • DNA methylation mainly occurs at the cytosine group of CpG dinucleotides, and is frequently found in DNA regions where CpGs are concentrated, called CpG islands or CpG regions.
  • the CpG region of the methylation marker gene NXPH1, ZNF559-ZNF177, ANKMY1, AVPR1A, CAPS2, DAB1, HTR1A, PCDH8, PENK, SLC12A5, or SLC32A1 refers to a CpG region present on the DNA of the gene.
  • the CpG region may be present in a transcription control region such as a promoter region, a protein coding region (open reading frame, ORF), or a terminator region.
  • the CpG site of the gene may be a sequence of 200 bp or more in which C and G are linked by phosphate, and may have an arbitrary size in the range of 0.4 kb to 10 kb.
  • the CpG site of the gene may be located between +/- 2000 bases (2 kb) from the transcription start site (TSS) of the gene.
  • the CpG site of the gene may be the methylation state of the CpG site of the gene listed in Table 1 below or a part of cytosine included therein.
  • CpG sites are indicated as DMRs (Differentially Methylated Regions).
  • the nucleotide sequence of the human genomic chromosomal region was expressed according to GRCh37 (Genome Reference Consortium Human Build 37), but the specific sequence of the human genomic chromosomal region may change slightly as the genome sequence research results are updated. , Expression of the human genomic chromosomal region of the present invention may be different depending on these changes. Therefore, even if the human genomic chromosome region expressed according to GRCh37 of the present invention is changed differently from now because the human reference sequence is updated after the filing date of the present invention, the present invention It will be apparent that the range of extends to the altered human genomic chromosomal region. These changes can be easily recognized by anyone having ordinary knowledge in the art to which the present invention belongs.
  • a method for diagnosing colon cancer or providing information for diagnosing colon cancer in nucleic acids isolated from a biological sample of an individual, NXPH1 (Neurexophilin 1) gene and ZNF559-ZNF177 (Zinc Finger Protein 559-Zinc Finger Protein 177), a method comprising measuring the methylation state of one or more genes or CpG regions thereof selected from the group consisting of genes is provided.
  • the one or more genes may include NXPH1.
  • the one or more genes may include ZNF559-ZNF177.
  • the one or more genes may include NXPH1 and ZNF559-ZNF177.
  • the method comprises measuring the methylation status of at least one gene selected from the group consisting of ANKMY1, AVPR1A, CAPS2, DAB1, HTR1A, PCDH8, PENK, SLC12A5 and SLC32A1 or a CpG region thereof in the nucleic acid may additionally include.
  • the step of measuring the methylation status is the following (i), (ii), (iii), (iv), (v), (vi) or (vii) gene combination or CpG region thereof It may be to measure methylation status:
  • the biological sample may be blood, plasma or serum, but is not limited thereto.
  • the nucleic acid isolated from the biological sample may be cfDNA.
  • the step of measuring the methylation state comprises i) an agent for detecting the methylation state of the one or more genes or CpG regions thereof and/or ii) primers specifically amplifying the one or more genes.
  • DNA processing may be included.
  • the agent for detecting (or measuring) the methylation state may be a compound that modifies cytosine bases or a methylation-sensitive restriction enzyme.
  • the compound that modifies the cytosine base may be a compound that modifies unmethylated cytosine or methylated cytosine. Specifically, it may be any one selected from the group consisting of bisulfite, hydrogen sulfite, disulfite, salts thereof, and combinations thereof. In addition, it may be a TET protein that modifies methylated cytosine, but is not limited thereto.
  • a method of detecting methylation of a CpG region by modifying a cytosine base is well known in the art.
  • the methylation-sensitive restriction enzyme is a restriction enzyme capable of specifically detecting methylation of the CpG region, and may be a restriction enzyme containing CG as a recognition site of the restriction enzyme. Examples include, but are not limited to, SmaI, SacII, EagI, HpaII, MspI, BssII, BstUI, and NotI. Cleavage by the restriction enzyme depends on methylation or unmethylation at C of the restriction enzyme recognition site, and this can be detected through PCR or Southern blot analysis. Other methylation sensitive restriction enzymes other than the above restriction enzymes are well known in the art.
  • the primers may include primers specific for methylated allelic sequences of the one or more genes and/or primers specific for unmethylated allelic sequences.
  • the step of measuring the methylation state is a methylation-specific polymerase chain reaction (methylation-specific polymerase chain reaction), real time methylation-specific polymerase chain reaction (real time methylation-specific polymerase chain reaction), methylation PCR using a DNA specific binding protein, quantitative PCR, pyrosequencing, or bisulfite sequencing may be performed, but is not limited thereto.
  • PCR or sequencing listed above include MethyLight PCR, MehtyLight digital PCR, EpiTYPER, CpG island microarrays, and the like.
  • TET protein ten-eleven translocation protein
  • the TET protein is an enzyme that acts on DNA and is involved in chemical changes of bases. When bisulfite is treated, all Cs except methylated Cs are changed to T bases. detection is possible
  • the method may further include comparing the measured methylation level with the methylation level of the CpG region of the same gene in a control sample.
  • the step of measuring the methylation status may further include comparing a control methylation profile generated from a result of measuring methylation of a corresponding marker in a control sample.
  • control methylation profile constitutes a model constructed by machine learning the obtained methylation patterns of one or more genes, and may be used to identify a colorectal cancer patient group-specific methylation pattern different from a normal control group.
  • the machine learning may be performed by one or more algorithms selected from the group consisting of random forest, logistic regression analysis, support vector machine, decision tree, association rule mining, neural network, and deep learning.
  • control sample may be a sample from a normal subject.
  • control sample may be a sample of a colorectal cancer patient, and the colorectal cancer patient may be a patient having various stages of colorectal cancer.
  • the colorectal cancer may be early colorectal cancer, metastatic colorectal cancer, or relapsed or refractory colorectal cancer. At this time, each colorectal cancer may have various stages.
  • the method for diagnosing colorectal cancer or providing information for diagnosing colorectal cancer according to the present invention includes (a) isolating nucleic acid from a biological sample of an individual, (b) extracting nucleic acid from the isolated nucleic acid, treating any one selected from the group consisting of pite, hydrogen sulfite, disulfite, salts thereof, and combinations thereof, (c) at least one gene selected from the group consisting of NXPH1 gene and ZNF559-ZNF177 gene Amplifying the nucleic acid using primers specific for, and (d) methylation specific polymerase chain reaction, real-time methylation specific polymerase chain reaction, PCR using methylated DNA specific binding protein, quantitative PCR, pyro It may be implemented by measuring methylation levels of one or more CpG regions of the NXPH1 gene and the ZNF559-ZNF177 gene by sequencing or bisulfite sequencing.
  • NXPH1 Neuronal Activated kininogen activator 1
  • ZNF559-ZNF177 Zinc Finger Protein 559 -Zinc Finger Protein 177
  • Ankyrin Repeat And MYND Domain Containing 1 ANKMY1
  • AVPR1A Arginine Vasopressin Receptor 1A
  • HTR1A 5-Hydroxytryptamine Receptor 1A
  • PCDH8 Protocadherin 8
  • PENK Proenkephalin
  • Solute Carrier SLC12A5) Family 12 Member 5
  • CpG regions of one or more genes selected from the group consisting of SLC32A1 (Solute Carrier Family 32 Member 1) are overmethylated compared to normal controls, (ii) CAPS2 (Calcyphosine 2) and DAB1 (DAB Adaptor Protein) 1)
  • CAPS2 Calcyphosine 2
  • DAB1 DAB1
  • the treatment for colorectal cancer may include surgical operation, radiation therapy, chemotherapy, targeted therapy, or a combination thereof, depending on the stage.
  • compositions for diagnosing colorectal cancer using nucleic acid isolated from a biological sample wherein one or more genes selected from the group consisting of NXPH1 gene and ZNF559-ZNF177 gene or CpG region thereof are specifically amplified or A composition comprising an agent capable of hybridizing therewith is provided.
  • the composition comprises an agent capable of specifically amplifying or hybridizing one or more genes selected from the group consisting of ANKMY1, AVPR1A, CAPS2, DAB1, HTR1A, PCDH8, PENK, SLC12A5 and SLC32A1 or a CpG region thereof. can be further included.
  • composition comprises a gene combination of (i), (ii), (iii), (iv), (v), (vi) or (vii) or an agent that amplifies the CpG region thereof can:
  • the biological sample may be blood, plasma or serum, but is not limited thereto.
  • the nucleic acid isolated from the biological sample may be cfDNA.
  • the agent may include a primer, probe or antisense nucleotide that binds complementary to the gene.
  • the sequence of the primer does not necessarily have to be exactly the same as the sequence of the template, but is sufficiently complementary to allow hybridization with the template.
  • the primer can initiate DNA synthesis in the presence of an agent for polymerization and four different nucleoside triphosphates in an appropriate buffer solution and temperature. PCR conditions and lengths of sense and antisense primers can be modified based on those known in the art.
  • the probe may be prepared in the form of an oligonucleotide probe, a single-stranded DNA probe, a double-stranded DNA probe, or an RNA probe. Selection of suitable probes and hybridization conditions can be modified based on those known in the art.
  • the antisense nucleotide can be used to detect a target gene, and an appropriate length can be selected to increase detection specificity.
  • primers, probes, or antisense nucleotides may be preferably designed using known knowledge and techniques known in the art according to the sequence of a specific CpG region to be analyzed for methylation status.
  • the composition may further include an agent for detecting the methylation state of the CpG region of the gene.
  • Agents for detecting the methylation status are referred to as previously described.
  • the agent may be bisulfite, hydrogen sulfite, disulfite, a salt thereof, or a combination thereof.
  • the formulation is not limited thereto.
  • Compounds that modify unmethylated cytosine bases, such as bisulfite, hydrogen sulfite, and disulfite, and methods for detecting methylation of genes by modifying unmethylated cytosine residues using the compounds are well known in the art. (WO 01/26536; US 2003/0148326 A1).
  • NGS can be used to determine the degree of methylation and the degree of methylation by checking the degree of conversion of the nucleotide sequence of the target gene region. Sequence analysis by NGS was performed using Illumina's MiSeq, NextSeq500, NextSeq550, Hiseq 2500, Hiseq 4000, Hiseq X Ten, NovaSeq 6000, Thermo Fisher Scientific's Ion PGM, Ion Proton, Ion S5, BGI's BGI-500, MGISEQ-2000, It may be performed using MGISEQ-T7 or the like, but is not limited thereto.
  • composition for diagnosing colorectal cancer using nucleic acid isolated from a biological sample comprising measuring the methylation state of at least one gene selected from the group consisting of NXPH1 gene and ZNF559-ZNF177 gene or its CpG region
  • a composition comprising the agent is provided.
  • the composition may further include an agent for measuring the methylation status of at least one gene selected from the group consisting of ANKMY1, AVPR1A, CAPS2, DAB1, HTR1A, PCDH8, PENK, SLC12A5 and SLC32A1 or its CpG region there is.
  • an agent for measuring the methylation status of at least one gene selected from the group consisting of ANKMY1, AVPR1A, CAPS2, DAB1, HTR1A, PCDH8, PENK, SLC12A5 and SLC32A1 or its CpG region there is.
  • composition is a combination of the following (i), (ii), (iii), (iv), (v), (vi) or (vii) or an agent for measuring the methylation status of the CpG region thereof may include:
  • the biological sample, nucleic acid, gene, CpG region, agent for measuring methylation status is referred to above.
  • kits for diagnosing colorectal cancer using a nucleic acid isolated from a biological sample of an individual, including the composition is provided.
  • the kit consists of one or more other component compositions, solutions or devices suitable for the assay method.
  • the kit may be a reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) kit, a DNA chip kit, an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kit, a protein chip kit, or a rapid kit.
  • RT-PCR reverse transcription polymerase chain reaction
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • composition included in the kit may be in the form of a panel, but is not limited thereto.
  • a panel for detecting methylation marker genes comprising the above composition
  • a panel for detecting methylation marker genes for diagnosing colorectal cancer using nucleic acids isolated from a biological sample of an individual is provided.
  • the panel for detecting methylation marker genes is a methylation region of the CpG region of one or more genes selected from the group consisting of NXPH1, ZNF559-ZNF177, ANKMY1, AVPR1A, CAPS2, DAB1, HTR1A, PCDH8, PENK, SLC12A5 and SLC32A1 or an agent capable of amplifying or hybridizing to an unmethylated region.
  • the agent may include primers, probes or antisense nucleotides that complementarily bind to the gene.
  • the specimens were classified into a colon cancer patient group (diagnosed as colon cancer or precancerous adenoma) and a normal control group with reference to actual colonoscopy results.
  • gastroenterologists classified colorectal cancer from stage 0 to stage 4 according to the TNM staging system and AJCC (American Joint Committee on Cancer) staging method.
  • the test results were judged to be normal.
  • the process shown in FIG. 1 was performed using the thus classified specimen.
  • 11 methylation marker genes ANKMY1, AVPR1A, CAPS2, DAB1, HTR1A, NXPH1, PCDH8, PENK, SLC12A5, SLC32A1, and ZNF559-ZNF177, whose methylation levels were differentially changed in the colorectal cancer patient group, were identified.
  • a colorectal cancer identification model was established by a machine learning algorithm based on the information related to the 11 methylation marker genes discovered in this way, and this model was verified.
  • each sample was centrifuged at 3000 rpm for 15 minutes to separate plasma. Extraction of cell-free DNA from the separated plasma was performed using MagMAX TM Cell-Free DNA Isolation Kit (Thermo fisher scientific). The extraction method was performed according to the manufacturer's manual. The extracted cell-free DNA was quantified using a fluorescence intensity meter (Qubit Flex, Invitrogen), and DNA degradation and size were confirmed using automated electrophoresis equipment (4150 Tapestation system, Agilent). .
  • Example 2 Cell-free DNA extracted in Example 2 was treated with bisulfite using the EZ DNA methylation-Lightning TM kit (Zymo Research, USA).
  • Bisulfite treatment of cell-free DNA converts unmethylated cytosine to uracil, leaving methylated cytosine unchanged.
  • the bisulfite-treated DNA was eluted with 20 ⁇ l of sterile distilled water to prepare a library for next-generation sequencing analysis.
  • Accel-NGS® Methyl-Seq DNA Library Kit (Swift Biosciences, USA) was used. This process includes methylated adapter ligation, library indexing, and pure isolation of ligated DNA using AMPure XP beads.
  • the bisulfite-library was designed as a single mixed reaction using the fabricated panel, and the library was completed using the SureSelectXT Human Methyl Seq Kit (Agilent, USA). This process includes library hybridization, hybrid capture using streptavidin beads, library amplification, and pure separation using AMPure XP beads.
  • the length and quantity of the library were measured using an Agilent Bioanalyzer 2200 (Agilent, USA) instrument and High Sensitivity chip, and the quality control (QC) conditions suggested by the manufacturer were met. Satisfactory libraries were used for sequencing.
  • Bisulfite sequencing was performed on the library prepared in Example 3 using next-generation sequencing equipment (NovaSeq 6000, Illumina). Quantity of bases produced from sequencing equipment, quality score (Q30), on-target ratio, average number of reads required for analysis by target region, Unique Molecular Identifier (UMI) overlap ratio, mapping The quality of the generated data was evaluated by checking the amount of data generated. Thereafter, a total of 3.7 million CpG sites among 84 million bases of cell-free DNA were targeted and their methylation levels were analyzed.
  • the degree of DNA methylation was measured for a total of 3.7 million CpG loci, which are the target regions captured in Example 4.
  • the calculated degree of methylation is represented by a value ranging from 0 to 1, where a value of 0 means that the corresponding CpG locus is not completely methylated, and a value of 1 means that the corresponding CpG locus is completely methylated.
  • DMRs differentially methylated regions
  • the significance was evaluated using t-test, wald test, and z-score methods for each CpG locus. . Thereafter, the optimal combination was selected after evaluating various values of various factors for regions that appeared significantly (p value ⁇ 0.05) in each CpG locus. Examples of the various factors included in the optimization test include a minimum number of CpGs, a minimum length of a DMR section, a p-value threshold, and a window size.
  • the evaluation was conducted by gene and DMR units, and proceeded with a leave-one-out test using several machine learning algorithms. At this time, support vector machines, random forests, neural networks, and deep learning were used as machine learning algorithms.
  • a general modeling program is created by explicit programming, in which a developer pre-programs to output a final result when certain conditions are met in an initial input value.
  • machine learning a computer is trained to find a condition in which a result becomes a specific value when an initial input value comes in. This learning process is a process of finding optimal parameters so that output values are properly derived for input values, and the output of learning is an optimal parameter or weight value.
  • Models established using machine learning algorithms such as deep learning or neural networks identify methylation patterns specific to colon cancer patients different from those of normal controls by learning the methylation patterns of marker gene regions obtained from multiple normal control and colon cancer patient samples. It can be said that it is a formula model designed to do this. Using this model, it is possible to infer and predict new patterns of data. Accordingly, the established model evaluates whether a given test sample exhibits a methylation pattern that appears in a colorectal cancer patient group sample, and derives a judgment result as to whether the subject from which the test sample is derived is normal or has colorectal cancer.
  • Deep learning algorithm is a type of machine learning that performs learning using multiple layers of artificial neural networks.
  • data analysts have to be directly involved in what features should be extracted from the training data, whereas in the case of deep learning, the computer automatically extracts features from the training data and performs self-learning.
  • Table 3 The results of these deep learning tests are shown in Table 3.
  • Table 3 shows the sensitivity, specificity, and accuracy values calculated for the model established based on 3 to 7 of the 11 marker genes discovered in the present invention, as well as the corresponding values calculated when these genes are applied as single markers. Figures are presented together.
  • Table 4 shows the sensitivity calculated for the model established based on 3 of the 11 marker genes discovered in the present invention. and specificity values, as well as corresponding values calculated for previously reported single markers and marker combinations.
  • colorectal cancer can be diagnosed with excellent sensitivity, specificity and/or accuracy.
  • the methylation marker gene is expected to have great industrial value in that colorectal cancer can be diagnosed using a blood-based biological sample.

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Abstract

본 발명은 대장암 진단을 위한 메틸화 마커 유전자 및 이의 용도에 관한 것이다. 종래의 분변 기반 검사에 비해 검사 순응도가 높은 혈액을 이용함으로써 검사자의 편의성을 증대시키고자 하였다. 본 발명에 따르면, 대장암 환자군에서 차별적으로 메틸화 수준이 변화되어 있는 메틸화 마커 유전자가 발굴되었다. 따라서, 본 발명의 메틸화 마커 유전자는 대장암의 진단에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

세포 유리 DNA를 이용한 대장암 진단을 위한 메틸화 마커 유전자 및 이의 용도
본 발명은 대장암 진단을 위한 메틸화 마커 유전자 및 이의 용도에 관한 것이다.
본 출원은 2021년 10월 14일에 출원된 대한민국 특허출원 제10-2021-0136287호에 기초한 우선권을 주장하며, 해당 출원의 명세서 및 도면에 개시된 모든 내용은 본 출원에 원용된다.
대장암은 위암에 이어 국내 암 발병률 2위를 차지하는 질환으로, 조기 발견 시 5년 생존율이 94.5%에 달할 정도로 예후가 좋은 암이다. 최근, 암 조기 진단을 위해, 침습적인 진단 및 검사 방법의 대안으로 액체 생체 검사를 이용한 분자진단법이 주목받고 있다.
DNA 메틸화(methylation)는 유전자 발현 조절에 중추적인 역할을 하는 후성유전적 변형으로서, 사이토신(cytosine)의 5번 탄소에 메틸기(-CH3)가 붙어 5-메틸사이토신 형태로 변형되는 것이다. DNA 메틸화는 주로 CpG 디뉴클레오티드의 사이토신 기에서 발생하며, CpG 섬(island)이라고 불리는 CpG 가 집중적으로 몰려있는 DNA 영역에서 많이 나타난다. 특히, DNA 메틸화는 대장암을 비롯한 각종 고형암의 발암 과정에서 중요한 역할을 하는 것으로 인식되고 있다. 암이 진행되는 과정 동안 게놈 전반적으로는 DNA 저메틸화가 나타나고, CpG 섬의 일부 영역에서 국소적인 과메틸화가 빈번하게 일어나는 것으로 알려져 있다. 또한, DNA 메틸화는 조직 특이적인 패턴을 보이는 것이 확인되었는데, 이러한 이유로 DNA 메틸화 패턴은 각종 암의 진단에 있어 임상적으로 의미 있는 정보라는 사실이 일반적으로 받아들여 지고 있다. 예를 들어, 암세포에서는 암 억제 유전자(tumor suppressor gene)의 프로모터 영역의 CpG 부위가 비정상적으로 과메틸화(hypermethylation)되면 이 유전자의 발현이 억제되어 암을 일으킬 수 있다.
현재 상용화된 대장암 조기 진단 기술들은 주로 real-time PCR 기법을 이용하며 검체 처리가 용이한 장점이 있지만, 단일 유전자 마커(예를 들어, SEPTIN9 유전자 영역의 메틸화)에 기반하므로 민감도 및 특이도에 한계가 있다. 해외에서 상용화된 다중 마커 기반 조기 진단 방법(예를 들어, Exact Sciences 사의 Cologuard 서비스)은 여러 종류의 마커(분자 마커, 메틸화 마커 및 단백질 마커)를 보다 정교한 방법으로 조합하여 대장암 여부를 결정하지만, 검사 비용이 고가라는 단점이 있다. 또한, 이러한 방법은 분변 검체를 사용함으로써 검사자의 편의성 면에서 개선이 필요한 상황이다.
차세대 염기서열 분석(Next-Generation Sequencing, NGS)이라 불리는 기술은 긴 서열을 짧은 단편으로 잘라서 대규모로 병렬 서열분석을 행함으로써 뛰어난 처리량, 확장성 및 속도를 바탕으로 이전에는 불가능했던 수준의 다양한 연구를 가능하게 만들었다. NGS 기술은 현재 게놈 전체 프로파일링을 통해 단일 뉴클레오티드 혹은 단일 세포 수준에서의 메틸화 마커의 식별을 가능하게 한다. 이는 PCR 기반의 종래 검사 방법에 비해 높은 해상도, 정량화 성능 및 마커의 확장성(여러 마커를 유연하게 적용하는 것이 가능함)을 제공함으로써, 질환 관련 마커 발굴, 진단 예후 및 치료에 대한 반응 예측, 환자 맞춤형 치료의 새로운 타겟 발굴을 위한 후성유전학 프로파일링에 널리 이용되고 있다.
[선행기술문헌]
(특허문헌 1) 한국 등록특허공보 제10-2046668호
본 발명은 상술한 종래 기술의 문제점을 모두 해결하는 것을 그 목적으로 한다.
본 발명은 대장암 진단을 위한 메틸화 마커 유전자(methylated marker genes)를 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.
본 발명은 대장암 진단 방법 또는 대장암 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
본 발명은 대장암의 진단 및 치료 방법을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
본 발명은 대장암 진단을 위한 조성물, 키트 또는 메틸화 마커 유전자 검출용 패널을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
본 발명자들은 대장암 진단을 위한 혈액 기반 메틸화 마커 유전자를 확보하기 위해 연구한 결과, 대장암 환자군에서 차별적으로 메틸화 수준이 변화되어 있는 특정 유전자 또는 유전자 조합을 발굴함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 대표적인 구성은 다음과 같다.
본 발명의 일 태양에 따르면, NXPH1(Neurexophilin 1), ZNF559-ZNF177(Zinc Finger Protein 559-Zinc Finger Protein 177), ANKMY1(Ankyrin Repeat And MYND Domain Containing 1), AVPR1A(Arginine Vasopressin Receptor 1A), CAPS2(Calcyphosine 2), DAB1(DAB Adaptor Protein 1), HTR1A(5-Hydroxytryptamine Receptor 1A), PCDH8(Protocadherin 8), PENK(Proenkephalin), SLC12A5(Solute Carrier Family 12 Member 5) 및 SLC32A1(Solute Carrier Family 32 Member 1)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자 또는 이의 CpG 영역을 포함하는 대장암 진단 및/또는 치료를 위한 유전자 마커가 제공된다.
본 발명의 다른 태양에 따르면, NXPH1 유전자 및 ZNF559-ZNF177 유전자로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자 또는 이의 CpG 영역을 포함하는 대장암 진단을 위한 유전자 마커가 제공된다.
본 발명의 또 다른 태양에 따르면, NXPH1 유전자 및 ZNF559-ZNF177 유전자로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자 또는 이의 CpG 영역을 포함하고, ANKMY1(Ankyrin Repeat And MYND Domain Containing 1), AVPR1A(Arginine Vasopressin Receptor 1A), CAPS2(Calcyphosine 2), DAB1(DAB Adaptor Protein 1), HTR1A(5-Hydroxytryptamine Receptor 1A), PCDH8(Protocadherin 8), PENK(Proenkephalin), SLC12A5(Solute Carrier Family 12 Member 5), 및 SLC32A1(Solute Carrier Family 32 Member 1)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자 또는 이의 CpG 영역을 추가로 포함하는 대장암 진단을 위한 유전자 마커가 제공된다.
본 발명의 또 다른 태양에 따르면, 하기 (i) 내지 (vii)에 기재된 조합의 유전자 또는 이의 CpG 영역 중 어느 하나 이상을 포함하는 대장암 진단을 위한 유전자 마커가 제공된다: (i) HTR1A, NXPH1 및 DAB1; (ii) AVPR1A, ANKMY1, CAPS2, HTR1A, NXPH1, PENK 및 DAB1; (iii) AVPR1A, PCDH8, ANKMY1, CAPS2, NXPH1, PENK 및 DAB1; (iv) ANKMY1, ZNF559-ZNF177, SLC32A1 및 DAB1; (v) HTR1A, NXPH1, ZNF559-ZNF177 및 DAB1; (vi) NXPH1 및 DAB1; 또는 (vii) NXPH1 및 SLC12A5.
본 발명의 또 다른 태양에 따르면, 개체의 생물학적 시료로부터 분리된 핵산에서, 상기 유전자 마커의 메틸화 상태를 측정하는 단계를 포함하는, 대장암 진단 방법 또는 대장암 진단을 위한 정보를 제공하는 방법이 제공된다.
본 발명의 또 다른 태양에 따르면, 개체의 생물학적 시료로부터 분리된 핵산에서, 상기 유전자 마커의 메틸화 상태를 측정하는 단계를 포함하는, 대장암 치료 방법 또는 대장암 치료를 위한 정보를 제공하는 방법이 제공된다.
본 발명의 또 다른 태양에 따르면, 상기 유전자 마커를 특이적으로 증폭하는 제제를 포함하는, 생물학적 시료로부터 분리된 핵산을 이용한 대장암 진단 또는 치료를 위한 조성물이 제공된다.
본 발명의 또 다른 태양에 따르면, 상기 유전자 마커를 특이적으로 증폭하는 제제의 대장암 진단용 제제의 제조를 위한 용도가 제공된다.
본 발명의 또 다른 태양에 따르면, 상기 유전자 마커의 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 제제를 포함하는 대장암 진단 또는 치료를 위한 조성물이 제공된다.
본 발명의 또 다른 태양에 따르면, 상기 유전자 마커의 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 제제의 대장암 진단용 제제의 제조를 위한 용도가 제공된다.
본 발명의 또 다른 태양에 따르면, 상기 조성물을 포함하는 개체의 생물학적 시료로부터 분리된 핵산을 이용한 대장암 진단 또는 치료용 키트 또는 메틸화 마커 유전자 검출용 패널이 제공된다.
본 발명의 또 다른 태양에 따르면, 혈액 시료를 기반으로 한 상기 방법, 조성물, 키트 또는 패널이 제공된다.
본 발명에 따르면, 대장암 환자군에서 차별적으로 메틸화 수준이 변화되어 있는 새로운 메틸화 마커 유전자가 발굴되었다. 상기 유전자 마커를 사용하면 우수한 민감도, 특이도 및/또는 정확도로 대장암을 진단할 수 있다. 특히, 상기 메틸화 마커 유전자는 혈액에 기반한 생물학적 시료를 이용하여 대장암 진단이 가능하다는 점에서 유용하다.
도 1은 본 발명의 일 구체예에 따른 대장암 식별 모델을 수립하기 위한 과정을 나타낸다.
도 2는 본 발명에서 발굴된 메틸화 마커 유전자의 DMR에서 대장암 환자군(26례) 및 정상 대조군(28례) 샘플 간의 메틸화 수준 차이를 컬러로 표시한 차트를 나타낸다.
도 3은 본 발명에서 발굴된 메틸화 마커 유전자 중 HTR1A, NXPH1 및 DAB1의 조합을 기반으로 환자군(26례) 및 정상 대조군(28례) 샘플에 대해 leave-one-out 테스트를 수행하여 얻은 민감도 수치를 암 기수별로 정리한 결과를 나타낸다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
후술하는 본 발명에 대한 상세한 설명은, 본 발명이 실시될 수 있는 특정 구현예에 관하여 특정 도면을 참조하여 기술될 것이지만, 본 발명은 이에 한정되지 않고, 적절하게 설명된다면, 그 청구항들이 주장하는 것과 균등한 모든 범위와 더불어 첨부된 청구항에 의해서만 한정된다. 본 발명의 다양한 구현예/실시예는 서로 다르지만 상호 배타적일 필요는 없음이 이해되어야 한다. 예를 들어, 본 명세서에 기재되어 있는 특정 형상, 구조 및 특성은 본 발명의 기술적 사상과 범위를 벗어나지 않으면서 일 구현예/실시예에서 다른 구현예/실시예로 변경되거나 구현예/실시예들이 조합되어 구현될 수 있다. 본 명세서에 사용된 기술 및 학술 용어들은, 달리 정의되지 않는 한, 본 발명이 속하는 분야에서 일반적으로 사용되는 것과 같은 의미를 갖는다. 본 명세서를 해석할 목적으로 하기 정의들이 적용될 것이고, 단수로 사용된 용어는 적절한 경우에는 복수형을 포함할 것이며 그 반대도 마찬가지이다.
정의
본 명세서 사용되는 용어 "메틸화"는 DNA를 구성하는 염기에 메틸기가 부착되는 것을 의미한다.
용어 "CpG 영역"은 CpG 섬이라고도 불리며, CpG 가 집중적으로 몰려있는 DNA 영역 또는 그의 일부를 의미한다.
용어 "cfDNA"는 세포 유리 또는 무세포(cell free) DNA를 의미한다.
용어 "프라이머"는 시료 내의 유전자의 상보적인 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고, 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 핵산 서열을 의미한다.
용어 "프로브"는 시료 내의 검출하고자 하는 유전자와 특이적으로 결합할 수 있는 물질로서, 상기 결합을 통하여 특이적으로 시료 내의 유전자의 존재를 확인할 수 있는 물질을 의미한다.
용어 "안티센스 뉴클레오티드"는 표적하는 유전자에 대한 상보적인 서열을 가지고 있어 표적 유전자와 이합체를 형성할 수 있는 핵산 기반의 분자를 의미한다.
대장암 진단용 메틸화 마커 유전자
본 발명의 일 태양에 따르면, 대장암 진단을 위한 메틸화 마커 유전자로서 NXPH1(Neurexophilin 1), ZNF559-ZNF177(Zinc Finger Protein 559-Zinc Finger Protein 177), ANKMY1(Ankyrin Repeat And MYND Domain Containing 1), AVPR1A(Arginine Vasopressin Receptor 1A), CAPS2(Calcyphosine 2), DAB1(DAB Adaptor Protein 1), HTR1A(5-Hydroxytryptamine Receptor 1A), PCDH8(Protocadherin 8), PENK(Proenkephalin), SLC12A5(Solute Carrier Family 12 Member 5), SLC32A1(Solute Carrier Family 32 Member 1), 또는 이들의 조합이 제공된다.
상기 유전자 NXPH1은 뉴렉소필린(neurexophilin) 패밀리의 구성원으로, 가변 N-말단 도메인, 고도로 보존된 N-글리코실화된 중심 도메인, 짧은 링커 영역, 및 시스테인-풍부 C-말단 도메인을 갖는 분비 단백질을 암호화한다. 이 단백질은 수상돌기와 축색돌기 사이의 부착을 촉진하는 단백질 그룹인 알파 뉴렉신(neurexin)과 매우 단단한 복합체를 형성한다.
상기 유전자 ZNF559-ZNF177은 전사 조절에 관여할 수 있으며, 크루펠(krueppel) C2H2형 징크 핑거 단백질 패밀리에 속한다.
상기 유전자 ANKMY1은 ZMYND13로도 알려져 있으며, 이와 관련된 질병에는 정맥 혈관종 및 수면병이 포함된다.
상기 유전자 AVPR1A에 의해 암호화된 단백질은 아르기닌 바소프레신에 대한 수용체로 작용한다. 이 수용체는 세포 수축과 증식, 혈소판 응집, 응고 인자의 방출 및 글리코겐 분해를 매개한다.
상기 유전자 CAPS2는 단백질 코딩 유전자로 관련된 Gene Ontology에는 칼슘 이온 결합이 포함된다.
상기 유전자 DAB1은 릴린(Reelin) 신호전달의 핵심 조절인자를 암호화한다. 릴린은 발달 중인 뇌의 뉴런, 특히 Cajal-Retzius 세포에서 분비되는 거대 당단백질이다. DAB1은 발달 중인 뇌에서 및 성인 신경발생 동안 세포 위치설정을 제어하는 신호전달 경로에서 릴린의 다운스트림에서 기능한다.
상기 유전자 HTR1A은 인간에서 세로토닌 1A 수용체를 암호화한다. HTR1A와 관련된 질병에는 주기적 발열(월경주기-의존성) 및 범불안 장애가 포함된다.
상기 유전자 PCDH8은 cadherin 슈퍼패밀리의 서브패밀리인 protocadherin 유전자 패밀리에 속한다. 이 유전자는 CNS-특이적으로 세포 부착에서 기능하는 것으로 생각되는 통합 막 단백질을 인코딩한다.
상기 유전자 PENK는 여러 단백질 생성을 위해 단백분해 처리되는 전전구단백질(preproprotein)을 인코딩한다. 이러한 생성물에는 펜타펩티드 오피오이드인 Met-enkephalin 및 Leu-enkephalin이 포함되며, 이들은 시냅스 소포에 저장된 후 시냅스로 방출되어 뮤 및 델타-오피오이드 수용체에 결합하여 통증 인식을 조절한다.
상기 유전자 SLC12A5에 의해 암호화된 단백질은 칼륨과 염화물의 화학적 농도 구배에 따라 순 유출 또는 유입 경로에서 기능할 수 있는 통합 막 K-Cl 공동수송체이다. 암호화된 단백질은 동종다량체로서 또는 다른 K-Cl 공동수송체와 함께 이종다량체로서 작용하여 뉴런에서 염화물 항상성을 유지할 수 있도록 한다.
상기 유전자 SLC32A1은 VGAT 또는 VIAAT로도 알려져 있으며, 인간에서 수포 억제성 아미노산 수송체(vesicular inhibitory amino acid transporter)를 암호화한다.
대장암의 진단 방법
상기 메틸화 마커 유전자는 개체로부터 분리된 생물학적 시료, 예컨대 액체 시료에 기반하여 우수한 민감도, 특이도 및/또는 정확도로 대장암을 진단하거나 대장암 진단에 관한 정보를 제공할 수 있다. 상기 메틸화 마커 유전자는 혈액, 혈장, 혈청과 같은 액체 시료를 이용한 경우, 우수한 진단 정확도를 나타낸다는 점에서 비침습적 진단을 가능하게 한다.
본 발명의 다른 태양에 따르면, 대장암 진단 방법 또는 대장암 진단을 위한 정보를 제공하는 방법으로서, 개체의 생물학적 시료로부터 분리된 핵산에서, NXPH1(Neurexophilin 1), ZNF559-ZNF177(Zinc Finger Protein 559-Zinc Finger Protein 177), ANKMY1(Ankyrin Repeat And MYND Domain Containing 1), AVPR1A(Arginine Vasopressin Receptor 1A), CAPS2(Calcyphosine 2), DAB1(DAB Adaptor Protein 1), HTR1A(5-Hydroxytryptamine Receptor 1A), PCDH8(Protocadherin 8), PENK(Proenkephalin), SLC12A5(Solute Carrier Family 12 Member 5) 및 SLC32A1(Solute Carrier Family 32 Member 1)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자 또는 이의 CpG 영역의 메틸화 상태를 측정하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
일 구현예에서, 상기 "메틸화 상태"는 특정 유전자의 특정 CpG 영역의 사이토신에서 일어나는 메틸화 여부 또는 메틸화 정도를 의미할 수 있다. 메틸화가 일어난 경우 그로 인하여 전사인자의 결합이 방해를 받아 해당 유전자의 발현이 억제될 수 있다. 발현 억제는 메틸화 정도에 따라 상대적으로 일어날 수 있다. 이러한 이유로 DNA 메틸화는 유전자 발현 조절에 중추적인 역할을 하는 후성유전적 변형으로서, 사이토신의 5번 탄소에 메틸기(-CH3)가 붙어 5-메틸사이토신 형태로 변형된다. DNA 메틸화는 주로 CpG 디뉴클레오티드의 사이토신 기에서 발생하며, CpG 섬 또는 CpG 영역이라고 불리는 CpG가 집중적으로 몰려 있는 DNA 영역에서 많이 나타난다.
암이 진행되는 과정 동안 게놈 전반적으로는 DNA 저메틸화가 나타나고, CpG 섬의 일부 영역에서 국소적인 과메틸화가 빈번하게 일어나는 것으로 알려져 있다. 예를 들어, 암세포에서는 암 억제 유전자의 프로모터 영역의 CpG 부위가 비정상적으로 과메틸화되면 이 유전자의 발현이 억제되어 암을 일으킬 수 있다. CpG 부위의 메틸화는 암 발생의 초기에 일어나기 때문에 암의 조기 진단에 유용하다.
일 구현예에서, 상기 메틸화 마커 유전자 NXPH1, ZNF559-ZNF177, ANKMY1, AVPR1A, CAPS2, DAB1, HTR1A, PCDH8, PENK, SLC12A5, 또는 SLC32A1의 CpG 영역은 상기 유전자의 DNA 상에 존재하는 CpG 영역을 의미한다. 예컨대, 상기 CpG 영역은 프로모터 영역 등 전사 조절 영역, 단백질 코딩 영역(open reading frame, ORF) 또는 터미네이터 영역 등에 존재할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 유전자의 CpG 부위는 C와 G가 포스페이트로 연결된 서열이 200bp 이상 연속된 부분일 수 있고, 0.4kb에서 10kb 정도의 범위에서 임의의 크기를 가질 수 있다.
다른 구현예에서, 상기 유전자의 CpG 부위는 유전자의 전사 시작 부위(transcription start site, TSS)로부터 +/- 2000 염기(2kb) 사이에 위치할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 유전자의 CpG 부위는 하기 표 1에 기재된 유전자의 CpG 부위 또는 그에 포함된 일부의 사이토신의 메틸화 상태일 수 있다. 하기 표 1에서 CpG 부위는 DMR(Differentially Methylated Region)이라고 표시한다.
유전자 명칭 염색체 번호 DMR 위치 (GRCh37) DMR 크기
시작 끝
ANKMY1 chr2 241,458.915 241,459,750 835
AVPR1A chr12 63,543,442 63,544,839 1,397
CAPS2 chr12 75,784,889 75,785,496 407
DAB1 chr1 57,470,779 57,475,926 5,148
HTR1A chr5 63,256,482 63,257,699 1,217
NXPH1 chr7 8,473,845 8,483,010 9,166
PCDH8 chr13 53,421,876 53,422,991 1,115
PENK chr8 57,358,026 57,360,893 2,867
SLC12A5 chr20 44,685,680 44,686,309 629
SLC32A1 chr20 37,356,005 37,357,473 1,468
ZNF559-ZNF177 chr19 9,473,590 9,474,099 509
본 발명에서 인간 게놈 염색체 부위의 염기서열은GRCh37(Genome Reference Consortium Human Build 37)에 따라 표현하였지만, 상기 인간 게놈 염색체 부위의 구체적 서열은 게놈 서열 연구 결과가 업데이트됨에 따라서 그 표현이 다소 변경될 수 있으며, 이러한 변경에 따라 본 발명의 상기 인간 게놈 염색체 부위의 표현이 상이해질 수 있다. 따라서, 본 발명의GRCh37에 따라 표현된 인간 게놈 염색체 부위는 본 발명의 출원일 이후 인간 표준 염기서열(human reference sequence)이 업데이트되어 상기 인간 게놈 염색체 부위의 표현이 지금과 다르게 변경된다고 하여도, 본 발명의 범위가 상기 변경된 인간 게놈 염색체 부위에 미치게 됨은 자명하다고 할 것이다. 이러한 변경 내용은 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자라면 누구라도 용이하게 알 수 있는 사항이다.
본 발명의 또 다른 태양에 따르면, 대장암 진단 방법 또는 대장암 진단을 위한 정보를 제공하는 방법으로서, 개체의 생물학적 시료로부터 분리된 핵산에서, NXPH1(Neurexophilin 1) 유전자 및 ZNF559-ZNF177(Zinc Finger Protein 559-Zinc Finger Protein 177) 유전자로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자 또는 이의 CpG 영역의 메틸화 상태를 측정하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
일 구현예에서, 상기 하나 이상의 유전자는 NXPH1을 포함할 수 있다.
다른 구현예에서, 상기 하나 이상의 유전자가 ZNF559-ZNF177을 포함할 수 있다.
또 다른 구현예에서, 상기 하나 이상의 유전자는 NXPH1 및 ZNF559-ZNF177을 포함할 수 있다.
또 다른 구현예에서, 상기 방법은, 상기 핵산에서, ANKMY1, AVPR1A, CAPS2, DAB1, HTR1A, PCDH8, PENK, SLC12A5 및 SLC32A1 로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자 또는 이의 CpG 영역의 메틸화 상태를 측정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 이때, ANKMY1, AVPR1A, CAPS2, DAB1, HTR1A, PCDH8, PENK, SLC12A5 및 SLC32A1으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자 또는 이의 CpG 영역의 메틸화 상태를 측정하는 단계는, NXPH1 유전자 및 ZNF559-ZNF177 유전자로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자 또는 이의 CpG 영역의 메틸화 상태를 측정하는 단계와 동시에 수행되거나, 임의의 순서로 순차적으로 수행될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 상기 메틸화 상태를 측정하는 단계는 하기 (i), (ii), (iii), (iv), (v), (vi) 또는 (vii)의 유전자 조합 또는 이의 CpG 영역의 메틸화 상태를 측정하는 것일 수 있다:
(i) HTR1A, NXPH1 및 DAB1;
(ii) AVPR1A, ANKMY1, CAPS2, HTR1A, NXPH1, PENK 및 DAB1;
(iii) AVPR1A, PCDH8, ANKMY1, CAPS2, NXPH1, PENK 및 DAB1;
(iv) ANKMY1, ZNF559-ZNF177, SLC32A1 및 DAB1;
(v) HTR1A, NXPH1, ZNF559-ZNF177 및 DAB1;
(vi) NXPH1 및 DAB1; 또는
(vii) NXPH1 및 SLC12A5.
또 다른 구현예에서, 상기 생물학적 시료는 혈액, 혈장 또는 혈청일 수 있지만 이에 제한되지 않는다.
또 다른 구현예에서, 상기 생물학적 시료로부터 분리된 핵산은 cfDNA일 수 있다.
또 다른 구현예에서, 상기 메틸화 상태를 측정하는 단계는, i) 상기 하나 이상의 유전자 또는 이의 CpG 영역의 메틸화 상태를 검출하는 제제 및/또는 ii) 상기 하나 이상의 유전자를 특이적으로 증폭하는 프라이머로 상기 DNA를 처리하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 메틸화 상태를 검출(또는 측정)하는 제제는 사이토신 염기를 변형시키는 화합물 또는 메틸화 민감성 제한 효소일 수 있다. 상기 사이토신 염기를 변형시키는 화합물은 비메틸화 사이토신 또는 메틸화 사이토신을 변형시키는 화합물일 수 있다. 구체적으로, 바이설파이트, 하이드로젠 설파이트, 다이설파이트, 이들의 염, 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다. 또한, 메틸화 사이토신을 변형시키는 TET 단백질일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 사이토신 염기를 변형시켜 CpG 영역의 메틸화 여부를 검출하는 방법은 당 업계에 널리 공지되어 있다. 또한, 상기 메틸화 민감성 제한효소는 CpG 영역의 메틸화를 특이적으로 검출할 수 있는 제한효소로서 제한효소의 인식부위로 CG를 함유하는 제한효소일 수 있다. 예를 들면, SmaI, SacII, EagI, HpaII, MspI, BssII, BstUI, NotI 등이 있으며 이에 제한되지 않는다. 상기 제한효소 인식부위의 C에서의 메틸화 또는 비메틸화에 따라 제한효소에 의한 절단 여부가 달라지고, 이를 PCR 또는 서던블롯(Southern Blot) 분석을 통해 검출할 수 있게 된다. 상기 제한효소 이외의 다른 메틸화 민감성 제한효소는 당 업계에 잘 알려져 있다.
상기 프라이머는 상기 하나 이상의 유전자의 메틸화된 대립형질 서열에 특이적인 프라이머 및/또는 비메틸화된 대립형질 서열에 특이적인 프라이머를 포함할 수 있다.
또 다른 구현예에서, 상기 메틸화 상태를 측정하는 단계는 메틸화 특이적 중합효소 연쇄 반응(methylation-specific polymerase chain reaction), 실시간 메틸화 특이적 중합효소 연쇄 반응(real time methylation-specific polymerase chain reaction), 메틸화 DNA 특이적 결합 단백질을 이용한 PCR, 정량 PCR, 파이로시퀀싱, 또는 바이설파이트 시퀀싱에 의해 수행될 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 상기에 나열된 PCR 또는 시퀀싱의 다른 예로는 MethyLight PCR, MehtyLight 디지털 PCR, EpiTYPER, CpG 섬 마이크로어레이 등이 포함된다. 또한, TET 단백질(ten-eleven translocation protein)을 이용한 검출법을 이용하여 측정할 수 있다. 상기 TET 단백질은 DNA에 작용하는 효소로 염기의 화학적 변화에 관여하며, 바이설파이트를 처리할 경우 메틸화된 C를 제외한 모든 C가 T 염기로 바뀌는 것과 달리 TET 단백질은 메틸화된 C만이 T로 바뀌어 효율적인 검출이 가능하다.
또 다른 구현예에서, 상기 방법은 상기 측정된 메틸화 수준을 대조군 시료의 상기 동일한 유전자의 CpG 부위의 메틸화 수준과 비교하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
또 다른 구현예에서, 상기 메틸화 상태를 측정하는 단계는 대조군 시료의 해당 마커의 상응하는 메틸화 측정 결과로부터 생성된 대조 메틸화 프로파일과 비교하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
또 다른 구현예에서, 상기 대조 메틸화 프로파일은, 상기 획득된 하나 이상의 유전자의 메틸화 패턴을 기계학습시킴으로써 구축된 모델을 구성하며, 정상 대조군과 상이한 대장암 환자군 특이적 메틸화 패턴을 식별하기 위한 것일 수 있다.
또 다른 구현예에서, 상기 기계학습은 랜덤 포레스트, 로지스틱 회귀 분석, 서포트 벡터 머신, 의사결정나무, 연관성 규칙 마이닝, 신경망 네트워크 및 딥러닝으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 알고리즘에 의해 수행될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 상기 대조군 시료는 정상 개체의 시료일 수 있다. 또한, 상기 대조군 시료는 대장암 환자의 시료일 수 있으며, 상기 대장암 환자는 다양한 대장암 병기를 갖는 환자일 수 있다.
또 다른 구현예에서, 상기 대장암은 조기 대장암, 전이성 대장암, 또는 재발성 또는 난치성 대장암일 수 있다. 이때, 각각의 대장암은 다양한 병기를 가질 수 있다.
상술한 복수의 구현예는 본 발명의 목적을 달성할 수 있는 한, 제한 없이 상호 조합되어 다양한 형태로 구현될 수 있다.
예를 들어, 본 발명에 따른 대장암 진단 방법 또는 대장암 진단을 위한 정보를 제공하는 방법은, (a) 개체의 생물학적 시료로부터 핵산을 분리하는 단계, (b) 상기 분리된 핵산에서, 바이설파이트, 하이드로젠 설파이트, 다이설파이트, 이들의 염, 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나를 처리하는 단계, (c) NXPH1 유전자 및 ZNF559-ZNF177 유전자로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자에 특이적인 프라이머를 사용하여 상기 핵산을 증폭하는 단계, 및 (d) 메틸화 특이적 중합효소 연쇄 반응, 실시간 메틸화 특이적 중합효소 연쇄 반응, 메틸화 DNA 특이적 결합 단백질을 이용한 PCR, 정량 PCR, 파이로시퀀싱, 또는 바이설파이트 시퀀싱에 의해 NXPH1 유전자 및 ZNF559-ZNF177 유전자에 대한 하나 이상의 CpG 영역의 메틸화 수준을 측정하는 단계를 포함하여 구현될 수 있다.
한편, 본 발명의 또 다른 태양에 따르면, 대장암의 진단 및 치료 방법으로서, (a) 개체의 생물학적 시료로부터 분리된 핵산에서, (i) NXPH1(Neurexophilin 1), ZNF559-ZNF177(Zinc Finger Protein 559-Zinc Finger Protein 177), ANKMY1(Ankyrin Repeat And MYND Domain Containing 1), AVPR1A(Arginine Vasopressin Receptor 1A), HTR1A(5-Hydroxytryptamine Receptor 1A), PCDH8(Protocadherin 8), PENK(Proenkephalin), SLC12A5(Solute Carrier Family 12 Member 5) 및 SLC32A1(Solute Carrier Family 32 Member 1)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자의 CpG 영역이 정상 대조군에 비해 과메틸화된 상태, (ii) CAPS2(Calcyphosine 2) 및 DAB1(DAB Adaptor Protein 1)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자의 CpG 영역이 정상 대조군에 비해 저메틸화된 상태, 또는 (iii) 상기 (i)에 따른 과메틸화 상태 및 (ii)에 따른 저메틸화 상태를 검출하여 상기 개체가 대장암이 있는 것으로 진단하는 단계; 및 (b) 상기 개체에서 대장암에 대한 치료요법을 시행하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
일 구현예에서, 상기 대장암에 대한 치료요법은 병기에 따라, 외과적 수술, 방사선 요법, 화학 요법, 표적 요법 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
상기 각 유전자, "생물학적 시료", "CpG 영역", "메틸화", 메틸화 상태를 검출하는 방법 등 동일 구성에 대한 구체적인 설명은 상기를 참조한다.
대장암 진단용 조성물
본 발명의 또 다른 태양에 따르면, 생물학적 시료에서 분리된 핵산을 이용하는 대장암 진단을 위한 조성물로서, NXPH1 유전자 및 ZNF559-ZNF177 유전자로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자 또는 이의 CpG 영역을 특이적으로 증폭하거나 이와 혼성화(hybridization)할 수 있는 제제를 포함하는 조성물이 제공된다.
일 구현예에서, 상기 조성물은 ANKMY1, AVPR1A, CAPS2, DAB1, HTR1A, PCDH8, PENK, SLC12A5 및 SLC32A1 로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자 또는 이의 CpG 영역을 특이적으로 증폭하거나 이와 혼성화할 수 있는 제제를 추가로 포함할 수 있다.
다른 구현예에서, 상기 조성물은 하기 (i), (ii), (iii), (iv), (v), (vi) 또는 (vii)의 유전자 조합 또는 이의 CpG 영역을 증폭하는 제제를 포함할 수 있다:
(i) HTR1A, NXPH1 및 DAB1;
(ii) AVPR1A, ANKMY1, CAPS2, HTR1A, NXPH1, PENK 및 DAB1;
(iii) AVPR1A, PCDH8, ANKMY1, CAPS2, NXPH1, PENK 및 DAB1;
(iv) ANKMY1, ZNF559-ZNF177, SLC32A1 및 DAB1;
(v) HTR1A, NXPH1, ZNF559-ZNF177 및 DAB1;
(vi) NXPH1 및 DAB1; 또는
(vii) NXPH1 및 SLC12A5.
또 다른 구현예에서, 상기 생물학적 시료는 혈액, 혈장 또는 혈청일 수 있지만 이에 제한되지 않는다.
또 다른 구현예에서, 상기 생물학적 시료로부터 분리된 핵산은 cfDNA일 수 있다.
또 다른 구현예에서, 상기 제제는 상기 유전자에 상보적으로 결합하는 프라이머, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
상기 프라이머의 서열은 반드시 주형의 서열과 정확히 같을 필요는 없으며, 충분히 상보적이어서 주형과 혼성화될 수 있으면 된다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 제제 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 3인산(nucleoside triphosphate)의 존재하에 DNA 합성을 개시할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당 업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.
상기 프로브는 올리고뉴클레오티드 프로브, 단쇄 DNA 프로브, 이중쇄 DNA 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 적당한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당 업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.
상기 안티센스 뉴클레오티드는 타겟 유전자를 검출하는 데 사용될 수 있으며, 검출 특이성을 증가시키기 위하여 적절한 길이를 선택할 수 있다.
본 발명에서, 프라이머, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오티드는 메틸화 상태를 분석하는 대상이 되는 특정 CpG 영역의 서열에 따라 당 업계에 알려진 공지된 지식 및 기술을 사용하여 바람직하게 디자인될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 상기 조성물은 상기 유전자의 CpG 영역의 메틸화 상태를 검출하기 위한 제제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 메틸화 상태를 검출하기 위한 제제는 앞서 설명한 바를 참조한다. 예컨대, 상기 제제는 바이설파이트, 하이드로겐 설파이트, 다이설파이트, 이들의 염, 또는 이들의 조합일 수 있다. 그러나, 상기 제제는 이로 한정되지 않는다. 바이설파이트, 하이드로겐 설파이트, 다이설파이트와 같은 비메틸화 사이토신 염기를 변형시키는 화합물 및 이를 이용하여 비메틸화 사이토신 잔기를 변형시켜 유전자의 메틸화 여부를 검출하는 방법은 당 업계에 잘 알려져 있다(WO 01/26536; US 2003/0148326 A1).
또한, 타겟 유전자 부위의 염기서열의 변환된 정도로 확인하여 메틸화 여부 및 정도를 알아보기 위해 NGS가 이용될 수 있다. NGS에 의한 서열 분석은 Illumina사의 MiSeq, NextSeq500, NextSeq550, Hiseq 2500, Hiseq 4000, Hiseq X Ten, NovaSeq 6000, Thermo Fisher Scientific사의 Ion PGM, Ion Proton, Ion S5, BGI사의 BGI-500, MGISEQ-2000, MGISEQ-T7 등을 이용하여 수행될 수 있지만 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 태양에 따르면, 생물학적 시료에서 분리된 핵산을 이용하는 대장암 진단을 위한 조성물로서, NXPH1 유전자 및 ZNF559-ZNF177 유전자로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자 또는 이의 CpG 영역의 메틸화 상태를 측정하는 제제를 포함하는 조성물이 제공된다.
일 구현예에서, 상기 조성물은 ANKMY1, AVPR1A, CAPS2, DAB1, HTR1A, PCDH8, PENK, SLC12A5 및 SLC32A1 로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자 또는 이의 CpG 영역의 메틸화 상태를 측정하는 제제를 추가로 포함할 수 있다.
다른 구현예에서, 상기 조성물은 하기 (i), (ii), (iii), (iv), (v), (vi) 또는 (vii)의 유전자 조합 또는 이의 CpG 영역의 메틸화 상태를 측정하는 제제를 포함할 수 있다:
(i) HTR1A, NXPH1 및 DAB1;
(ii) AVPR1A, ANKMY1, CAPS2, HTR1A, NXPH1, PENK 및 DAB1;
(iii) AVPR1A, PCDH8, ANKMY1, CAPS2, NXPH1, PENK 및 DAB1;
(iv) ANKMY1, ZNF559-ZNF177, SLC32A1 및 DAB1;
(v) HTR1A, NXPH1, ZNF559-ZNF177 및 DAB1;
(vi) NXPH1 및 DAB1; 또는
(vii) NXPH1 및 SLC12A5.
상기 구현예에서, 생물학적 시료, 핵산, 유전자, CpG 영역, 메틸화 상태를 측정하는 제제는 상술한 바를 참조한다.
키트 및 패널
본 발명의 또 다른 태양에 따르면, 상기 조성물을 포함하는, 개체의 생물학적 시료로부터 분리된 핵산을 이용하여 대장암 진단을 위한 키트를 제공한다.
구체적으로, 상기 키트는 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치로 구성된다. 예를 들어, 상기 키트는 RT-PCR(Reverse transcription polymerase chain reaction) 키트, DNA 칩 키트, ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay) 키트, 단백질 칩 키트 또는 래피드(rapid) 키트일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 키트에 포함된 상기 조성물은 패널(panel) 형태일 수 있지만 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 태양에 따르면, 상기 조성물을 포함하는 메틸화 마커 유전자 검출용 패널로서, 개체의 생물학적 시료로부터 분리된 핵산을 이용하는 대장암 진단을 위한 메틸화 마커 유전자 검출용 패널이 제공된다.
일 구현예에서, 상기 메틸화 마커 유전자 검출용 패널은 NXPH1, ZNF559-ZNF177, ANKMY1, AVPR1A, CAPS2, DAB1, HTR1A, PCDH8, PENK, SLC12A5 및 SLC32A1로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자의 CpG 영역의 메틸화 영역 또는 비메틸화 영역을 증폭하거나 이와 혼성화할 수 있는 제제를 포함할 수 있다. 상기 제제는 상기 유전자에 상보적으로 결합하는 프라이머, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.
실시예
실시예 1. 임상 연구 개요
2020년 3월부터 12월까지 강북삼성병원 예방건진센터에서 국민건강보험공단 일반검진과 암검진을 받은 수검자들 중 대장내시경 검사를 받은 수검자들의 기존 혈액 검사 이후 남은 검체를 제공받았다. 이때, 수검자들의 개인 정보는 일체 수집되지 않았다.
실제 대장내시경 결과를 참조하여 상기 검체를 대장암 환자군(대장암 또는 전암성 선종으로 진단됨)과 정상 대조군으로 분류하였다. 대장암 환자군의 경우, 대장암은 소화기 전문의에 의해 TNM 병기 체계 및 AJCC(American Joint Committee on Cancer, 미국암연합회) 병기 분류법에 따라 0기부터 4기까지 분류되었고, 정상 대조군은 대장내시경 수검자들 중 검사결과 정상으로 판정된 군이었다.
이렇게 분류된 검체를 이용하여 도 1에 제시된 과정을 수행하였다. 그 결과, 대장암 환자군에서 차별적으로 메틸화 수준이 변화되어 있는 11종의 메틸화 마커 유전자 ANKMY1, AVPR1A, CAPS2, DAB1, HTR1A, NXPH1, PCDH8, PENK, SLC12A5, SLC32A1, 및 ZNF559-ZNF177을 발굴하였다. 또한, 이렇게 발굴된 11종의 메틸화 마커 유전자와 관련된 정보에 기반하여 기계학습 알고리즘에 의해 대장암 식별 모델을 수립하고, 이러한 모델을 검증하였다.
이하의 실시예에서는 이러한 과정을 상세히 설명한다.
실시예 2. 무세포 DNA 추출
차세대 염기서열 분석을 위한 준비 과정으로서, 각 검체를 3000 rpm에서 15분간 원심분리하여 혈장을 분리하였다. 분리된 혈장으로부터 무세포 DNA의 추출은 MagMAXTM Cell-Free DNA Isolation Kit(Thermo fisher scientific)를 이용하여 수행하였다. 추출 방법은 제조사의 매뉴얼에 따라 진행하였다. 추출된 무세포 DNA는 형광 강도 측정기(Fluorometer)(Qubit Flex, Invitrogen)를 이용하여 정량하였으며, DNA 상태는 자동화된 전기영동 장비(4150 Tapestation system, Agilent)를 이용하여 DNA degradation 여부 및 크기를 확인하였다.
실시예 3. 라이브러리 제작 및 정도관리(QC)
실시예 2에서 추출된 무세포 DNA에 EZ DNA methylation-LightningTM kit(Zymo Research, USA)를 이용하여 바이설파이트를 처리하였다.
무세포 DNA에 바이설파이트를 처리하면, 비메틸화된 사이토신은 우라실로 변형되고, 메틸화된 사이토신은 변화없이 남게 된다. 상기 바이설파이트가 처리된 DNA를 멸균 증류수 20㎕로 용출시켜 차세대 염기서열 분석을 위한 라이브러리를 제작하였다.
라이브러리 제작용 준비 제제로서 Accel-NGS® Methyl-Seq DNA Library Kit(Swift Biosciences, USA)을 사용하였다. 이 과정은 메틸화 어댑터 라이게이션, 라이브러리의 인덱싱, AMPure XP 비드를 이용한 라이게이션된 DNA의 순수 분리 과정을 포함한다.
바이설파이트-라이브러리는 제작된 패널을 사용하는 단일 혼합 반응으로 설계하였고, SureSelectXT Human Methyl Seq Kit(Agilent, USA)를 이용하여 라이브러리를 완성하였다. 이 과정은 라이브러리 하이브리드화, 스트렙트아비딘 비드를 이용한 하이브리드 캡쳐, 라이브러리 증폭, AMPure XP 비드를 이용한 순수 분리 과정을 포함한다.
제작된 라이브러리가 염기서열 분석에 적합한지 확인하기 위하여, Agilent Bioanalyzer 2200(Agilent, USA) 기기 및 High Sensitivity chip을 이용하여 라이브러리의 길이와 양을 측정하였고, 제조사가 제시하는 정도 관리(QC) 조건에 만족하는 라이브러리를 서열분석에 사용하였다.
실시예 4. 차세대 염기서열 분석 수행
실시예 3에서 제작된 라이브러리에 대해 차세대 염기서열 분석 장비(NovaSeq 6000, Illumina)를 이용하여 바이설파이트 염기서열 분석을 수행하였다. 서열분석 장비로부터 생산된 염기량, 퀄리티 스코어(Q30), 온-타겟(on-target) 비율, 타겟 영역별 분석에 필요한 평균 리드 갯수, 고유한 분자 식별자(Unique Molecular Identifier, UMI) 중복 비율, 매핑된 데이터량 등을 확인하여 생성된 데이터의 퀄리티를 평가하였다. 이후, 무세포 DNA의 8,400만개 염기 가운데 총 370만개 CpG 부위를 타겟하여 그 메틸화 수준을 분석하였다.
실시예 5. DNA 메틸화 분석 및 메틸화 마커 유전자 발굴
실시예 4에서 캡쳐된 타겟 영역인 총 370만개 CpG 좌위에 대하여 DNA 메틸화 정도를 측정하였다.
DNA 메틸화 정도는 실시예 4에서 수행된 차세대 염기서열 분석 결과에 기반하여 측정하였다. 각각의 CpG 좌위에서 메틸화된 염기서열 단편(리드(read))과 메틸화되지 않은 리드를 각각 카운트하고 그 값을 아래의 식에 대입하여 계산하였다:
Figure PCTKR2022012598-appb-img-000001
상기 식에서,
Figure PCTKR2022012598-appb-img-000002
는 메틸화 정도를 나타내고,
Figure PCTKR2022012598-appb-img-000003
는 메틸화된 리드의 수를 나타내고,
Figure PCTKR2022012598-appb-img-000004
는 메틸화되지 않은 리드의 수를 나타낸다.
계산된 메틸화 정도는 0 내지 1 범위의 값으로 표시되며, 값 0은 해당 CpG 좌위가 완전히 메틸화되지 않은 것을 의미하며, 1은 해당 CpG 좌위가 완전히 메틸화된 것을 의미한다.
대장암 환자군과 정상 대조군에서 차별적으로 메틸화되어 있는 유전자 영역(Differentially methylated region, DMR)을 발굴하기 위하여 우선 개개의 CpG 좌위에 대해 t-test, wald test, z-score 방법을 사용하여 유의성을 평가하였다. 이후, 개개의 CpG 좌위에서 유의하게 나타난(p 값 < 0.05) 영역들에 대해 다양한 인자의 여러 값에 대해 평가한 후에 최적의 조합을 선정하였다. 최적화 테스트에 포함된 상기 다양한 인자의 예로는 최소 CpG 수, DMR 구간의 최소 길이, p 값 한계치, 윈도우(window) 크기 등이 있다.
평가는 유전자와 DMR 단위로 진행하였고, 여러 기계학습 알고리즘을 사용하여 leave-one-out 테스트로 진행하였다. 이때, 기계학습 알고리즘으로는 서포트 벡터 머신(Support Vector Machine), 랜덤 포레스트(Random Forest), 신경망 네트워크(Neural Network), 딥러닝(Deep Learning)을 사용하였다.
그 결과, 대장암 환자군에서 차별적으로 메틸화 수준이 변화되어 있는 11종의 유전자 및 각 유전자에 포함된 DMR을 선별하였다(표 2). 표 2에는 또한 각 유전자의 메틸화 상태가 표시되어 있다.
유전자 명칭 염색체 번호 DMR 위치 (GRCh37) DMR 크기 메틸화 상태
+:과메틸화
-:저메틸화
시작 끝
ANKMY1 chr2 241,458.915 241,459,750 835 +
AVPR1A chr12 63,543,442 63,544,839 1,397 +
CAPS2 chr12 75,784,889 75,785,496 407 -
DAB1 chr1 57,470,779 57,475,926 5,148 -
HTR1A chr5 63,256,482 63,257,699 1,217 +
NXPH1 chr7 8,473,845 8,483,010 9,166 +
PCDH8 chr13 53,421,876 53,422,991 1,115 +
PENK chr8 57,358,026 57,360,893 2,867 +
SLC12A5 chr20 44,685,680 44,686,309 629 +
SLC32A1 chr20 37,356,005 37,357,473 1,468 +
ZNF559-ZNF177 chr19 9,473,590 9,474,099 509 +
상기 11종의 유전자의 DMR에서 대장암 환자군 26례와 정상 대조군 28례의 샘플을 이용한 메틸화 수준을 타겟 영역 기반 바이설파이트 시퀀싱을 통해 분석하였고, 그 결과를 도 2에 도시하였다.
실시예 6. 기계학습 모델 수립 및 평가
실시예 5에서 발굴된 마커 유전자 내에 존재하는 DMR 영역에서의 메틸화 수치를 기반으로 기계학습 알고리즘을 이용하여 대장암 식별 모델을 수립하였다.
일반적인 모델링 프로그램은 초기 입력값에 어떤 조건이 만족되면 최종 결과를 내보내도록 개발자가 미리 프로그래밍하는 명시적 프로그래밍에 의해 만들어진다. 반면, 기계학습에서는 초기 입력값이 들어왔을 때 결과가 특정 값이 되는 조건을 찾도록 컴퓨터를 학습시킨다. 이러한 학습 과정은 입력값에 대해 결과값이 제대로 도출되도록 최적의 매개변수를 찾는 과정이며, 학습의 결과물은 최적의 매개변수 혹은 가중치 값이다.
딥러닝 혹은 신경망 네트워크와 같은 기계학습 알고리즘을 이용하여 수립된 모델은 다수의 정상 대조군과 대장암 환자군 샘플에서 얻은 마커 유전자 영역의 메틸화 패턴을 학습시킴으로써 정상 대조군과 상이한 대장암 환자군 특이적 메틸화 패턴을 식별할 수 있도록 만들어진 수식 모델이라고 할 수 있다. 이렇게 만들어진 모델을 활용하면 새로운 패턴의 데이터에 대해 추론하고 예측할 수 있게 된다. 따라서, 상기 수립된 모델은 주어진 테스트 샘플이 대장암 환자군 샘플에서 나타나는 메틸화 패턴을 보이는지 여부를 평가하여, 그러한 테스트 샘플이 유래된 대상체가 정상인지 대장암이 있는지에 대한 판정 결과를 도출해 낸다.
이렇게 11종의 마커 유전자를 기반으로 수립된 모델을 평가하기 위한 일례로, 딥러닝 알고리즘을 이용하여 leave-one-out 테스트를 실시하였다. 딥러닝 알고리즘은 여러 층의 인공신경망(Artificial Neural Network)을 이용하여 학습을 수행하는 기계학습의 한 종류이다. 기존 기계학습 알고리즘의 경우 데이터 분석자가 학습 데이터에서 어떤 특징을 추출해야 하는지 직접 관여해야 하는 반면, 딥러닝의 경우 컴퓨터가 자동으로 학습 데이터에서 특징을 추출하여 자가 학습을 한다. 이러한 딥러닝 테스트 결과를 표 3에 나타낸다.
표 3에는, 본 발명에서 발굴된 11종 마커 유전자 중 3종 내지 7종을 기반으로 수립된 모델에 대해 계산된 민감도, 특이도 및 정확도 수치와 함께, 이들 유전자를 단일 마커로 적용시 계산된 해당 수치가 함께 제시되어 있다.
유전자 타겟 조합/단일 마커 민감도 (%) 특이도 (%) 정확도 (%)
HTR1A, NXPH1, DAB1 92.31 92.86 92.59
AVPR1A, ANKMY1, CAPS2, HTR1A, NXPH1, PENK, DAB1 92.31 92.86 92.59
AVPR1A, PCDH8, ANKMY1, CAPS2, NXPH1, PENK, DAB1 92.31 92.86 92.59
ANKMY1, ZNF559-ZNF177, SLC32A1, DAB1 88.46 92.86 90.74
HTR1A, NXPH1, ZNF559-ZNF177, DAB1 92.31 89.29 90.74
NXPH1, DAB1 80.77 85.71 83.33
NXPH1, SLC12A5 76.92 89.29 83.33
ANKMY1 57.69 64.29 61.11
AVPR1A 61.54 71.43 66.67
CAPS2 73.08 75.00 74.07
DAB1 19.23 78.57 50.00
HTR1A 88.46 85.71 87.04
NXPH1 76.92 85.71 81.48
PCDH8 73.08 71.43 72.22
PENK 76.92 82.14 79.63
SLC12A5 69.23 75.00 72.22
SLC32A1 69.23 82.14 75.93
ZNF559-ZNF177 76.92 78.57 77.78
본 발명에 포함된 11종의 유전자를 기반으로 수립된 모델을 평가하기 위한 또 다른 예로, 표 4에는 본 발명에서 발굴된 11종의 마커 유전자 중 3종을 기반으로 수립된 모델에 대해 계산된 민감도 및 특이도 수치와 함께, 기존에 보고된 단일 마커 및 마커 조합에 대해 계산된 해당 수치가 함께 제시되어 있다.
유전자 타겟 민감도(%) 특이도(%) 참고문헌
HTR1A, NXPH1, DAB1 92.31 92.86 일 구현예
ALX4 83.30 70.00 [1]
ALX4 23.00 100.00 [2]
APC 57.00 86.00 [3]
APC, HLTF, MLH1 57.00 90.00 [4]
APC, MGMT, RASSF2, WIF1 86.50 92.10 [5]
C9orf50, KCNQ5, CLIP4 85.00 99.00 [6]
CDKN2A 70.00 100.00 [7]
HLTF 32.70 92.70 [4]
IKZF1, BCAT1 66.00 94.00 [8]
MLH1 42.90 97.60 [4]
NEUROG1 61.00 91.00 [9]
NGFR 51.00 84.00 [10]
RUNX3 60.00 82.50 [11]
RUNX3, SFRP1, CEA 89.40 84.70 [11]
SDC2 71.20 95.60 [12]
SEPTIN9 73.00 95.60 [12]
SEPTIN9, ALX4 71.00 95.00 [13]
SEPTIN9, SDC2 86.50 92.10 [14]
SFRP1 77.70 70.00 [11]
TMEFF2 65.00 69.00 [10]
VIM 59.00 93.00 [15]
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또한, 상기 메틸화 마커 유전자 HTR1A, NXPH1 및 DAB1의 조합 모델에 대해 대장암 환자군 26례와 정상 대조군 28례의 샘플을 이용하여 leave-one-out 테스트를 수행하여 얻은 민감도 수치를 대장암 기수별로 정리한 결과를 도 3에 도시하였다. 도 3으로부터 알 수 있는 바와 같이, 상기 모델은 0기의 경우에는 67%, 1기의 경우에는 88%, 그리고 2기 내지 4기의 경우에는 100%의 민감도를 나타내었다.
본 발명에 따른 메틸화 마커 유전자를 사용하면 우수한 민감도, 특이도 및/또는 정확도로 대장암을 진단할 수 있다. 특히, 상기 메틸화 마커 유전자는 혈액에 기반한 생물학적 시료를 이용하여 대장암 진단이 가능하다는 점에서 산업적 이용 가치가 클 것으로 예상된다.

Claims (31)

  1. 대장암 진단을 위한 정보를 제공하는 방법으로서,
    개체의 생물학적 시료로부터 분리된 핵산에서, NXPH1(Neurexophilin 1) 유전자 및 ZNF559-ZNF177(Zinc Finger Protein 559-Zinc Finger Protein 177) 유전자로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자의 CpG 영역의 메틸화 상태를 측정하는 단계를 포함하는
    방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 하나 이상의 유전자가 NXPH1을 포함하는
    방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 하나 이상의 유전자가 ZNF559-ZNF177을 포함하는
    방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 핵산에서, ANKMY1(Ankyrin Repeat And MYND Domain Containing 1), AVPR1A(Arginine Vasopressin Receptor 1A), CAPS2(Calcyphosine 2), DAB1(DAB Adaptor Protein 1), HTR1A(5-Hydroxytryptamine Receptor 1A), PCDH8(Protocadherin 8), PENK(Proenkephalin), SLC12A5(Solute Carrier Family 12 Member 5), 및 SLC32A1(Solute Carrier Family 32 Member 1)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자의 CpG 영역의 메틸화 상태를 측정하는 단계를 추가로 포함하는
    방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 메틸화 상태를 측정하는 단계는 하기 (i), (ii), (iii), (iv), (v), (vi) 또는 (vii)의 유전자의 CpG 영역의 메틸화 상태를 측정하는 것을 포함하는
    방법:
    (i) HTR1A, NXPH1 및 DAB1;
    (ii) AVPR1A, ANKMY1, CAPS2, HTR1A, NXPH1, PENK 및 DAB1;
    (iii) AVPR1A, PCDH8, ANKMY1, CAPS2, NXPH1, PENK 및 DAB1;
    (iv) ANKMY1, ZNF559-ZNF177, SLC32A1 및 DAB1;
    (v) HTR1A, NXPH1, ZNF559-ZNF177 및 DAB1;
    (vi) NXPH1 및 DAB1; 또는
    (vii) NXPH1 및 SLC12A5.
  6. 제4항에 있어서,
    상기 유전자의 CpG 영역은 다음의 특징을 갖는
    방법:
    Figure PCTKR2022012598-appb-img-000005
  7. 제1항에 있어서,
    상기 생물학적 시료는 혈액, 혈장 또는 혈청인
    방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 생물학적 시료로부터 분리된 핵산은 cfDNA인
    방법.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 메틸화 상태를 측정하는 단계는, i) 상기 하나 이상의 유전자의 CpG 영역의 메틸화 상태를 검출하는 제제 또는 ii) 상기 하나 이상의 유전자를 특이적으로 증폭하는 프라이머로 상기 유전자를 처리하는 단계를 포함하는
    방법.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 메틸화 상태를 측정하는 단계는 메틸화 특이적 중합효소 연쇄 반응(methylation-specific polymerase chain reaction), 실시간 메틸화 특이적 중합효소 연쇄 반응(real time methylation-specific polymerase chain reaction), 메틸화 DNA 특이적 결합 단백질을 이용한 PCR, 정량 PCR, 파이로시퀀싱, 또는 바이설파이트 시퀀싱에 의해 수행되는
    방법.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 메틸화 상태를 측정하는 단계는 대조군 시료의 해당 유전자의 상응하는 메틸화 측정 결과로부터 생성된 대조 메틸화 프로파일과 비교하는 단계를 추가로 포함하는
    방법.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 대조 메틸화 프로파일은, 상기 획득된 하나 이상의 유전자의 메틸화 패턴을 기계학습시킴으로써 구축된 모델을 구성하며, 정상 대조군과 상이한 대장암 환자군 특이적 메틸화 패턴을 식별하기 위한 것인
    방법.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 기계학습은 랜덤 포레스트, 로지스틱 회귀 분석, 서포트 벡터 머신, 의사결정나무, 연관성 규칙 마이닝, 신경망 네트워크 및 딥러닝으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 알고리즘에 의해 수행되는
    방법.
  14. 제11항에 있어서,
    상기 대조군 시료는 정상 개체의 시료인
    방법.
  15. 제1항에 있어서,
    상기 대장암은 조기 대장암, 전이성 대장암, 또는 재발성 또는 난치성 대장암인
    방법.
  16. 생물학적 시료에서 분리된 핵산을 이용하는 대장암 진단을 위한 조성물로서,
    NXPH1(Neurexophilin 1) 유전자 및 ZNF559-ZNF177(Zinc Finger Protein 559-Zinc Finger Protein 177) 유전자로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자의 CpG 영역을 특이적으로 증폭하거나 이와 혼성화할 수 있는 제제를 포함하는
    조성물.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 조성물은 ANKMY1(Ankyrin Repeat And MYND Domain Containing 1), AVPR1A(Arginine Vasopressin Receptor 1A), CAPS2(Calcyphosine 2), DAB1(DAB Adaptor Protein 1), HTR1A(5-Hydroxytryptamine Receptor 1A), PCDH8(Protocadherin 8), PENK(Proenkephalin), SLC12A5(Solute Carrier Family 12 Member 5), 및 SLC32A1(Solute Carrier Family 32 Member 1)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자의 CpG 영역을 특이적으로 증폭하거나 이와 혼성화할 수 있는 제제를 추가로 포함하는
    조성물.
  18. 제16항에 있어서,
    상기 조성물은 하기 (i), (ii), (iii), (iv), (v), (vi) 또는 (vii)의 유전자의 CpG 영역을 증폭하거나 이와 혼성화할 수 있는 제제를 포함하는
    조성물:
    (i) HTR1A, NXPH1 및 DAB1;
    (ii) AVPR1A, ANKMY1, CAPS2, HTR1A, NXPH1, PENK 및 DAB1;
    (iii) AVPR1A, PCDH8, ANKMY1, CAPS2, NXPH1, PENK 및 DAB1;
    (iv) ANKMY1, ZNF559-ZNF177, SLC32A1 및 DAB1;
    (v) HTR1A, NXPH1, ZNF559-ZNF177 및 DAB1;
    (vi) NXPH1 및 DAB1; 또는
    (vii) NXPH1 및 SLC12A5.
  19. 제17항에 있어서,
    상기 유전자의 CpG 영역은 다음의 특징을 갖는
    조성물:
    Figure PCTKR2022012598-appb-img-000006
  20. 제16항에 있어서,
    상기 생물학적 시료는 혈액, 혈장 또는 혈청인
    조성물.
  21. 제20항에 있어서,
    상기 생물학적 시료로부터 분리된 핵산은 cfDNA인
    조성물.
  22. 제16항에 있어서,
    상기 제제는 상기 유전자에 상보적으로 결합하는 프라이머, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오티드를 포함하는
    조성물.
  23. 제16항에 있어서,
    상기 하나 이상의 유전자의 CpG 영역의 메틸화 상태를 검출하기 위한 제제를 추가로 포함하는
    조성물.
  24. 제23항에 있어서,
    상기 제제는 바이설파이트, 하이드로겐 설파이트, 다이설파이트, 이들의 염, 또는 이들의 조합인
    조성물.
  25. 생물학적 시료에서 분리된 핵산을 이용하는 대장암 진단을 위한 조성물로서,
    NXPH1 유전자 및 ZNF559-ZNF177 유전자로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자의 CpG 영역의 메틸화 상태를 측정하는 제제를 포함하는 조성물.
  26. 제25항에 있어서,
    상기 조성물은 ANKMY1(Ankyrin Repeat And MYND Domain Containing 1), AVPR1A(Arginine Vasopressin Receptor 1A), CAPS2(Calcyphosine 2), DAB1(DAB Adaptor Protein 1), HTR1A(5-Hydroxytryptamine Receptor 1A), PCDH8(Protocadherin 8), PENK(Proenkephalin), SLC12A5(Solute Carrier Family 12 Member 5), 및 SLC32A1(Solute Carrier Family 32 Member 1)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자의 CpG 영역의 메틸화 상태를 측정하는 제제를 추가로 포함하는
    조성물.
  27. 제25항에 있어서,
    상기 조성물은 하기 (i), (ii), (iii), (iv), (v), (vi) 또는 (vii)의 유전자의 CpG 영역의 메틸화 상태를 측정하는 제제를 포함하는
    조성물:
    (i) HTR1A, NXPH1 및 DAB1;
    (ii) AVPR1A, ANKMY1, CAPS2, HTR1A, NXPH1, PENK 및 DAB1;
    (iii) AVPR1A, PCDH8, ANKMY1, CAPS2, NXPH1, PENK 및 DAB1;
    (iv) ANKMY1, ZNF559-ZNF177, SLC32A1 및 DAB1;
    (v) HTR1A, NXPH1, ZNF559-ZNF177 및 DAB1;
    (vi) NXPH1 및 DAB1; 또는
    (vii) NXPH1 및 SLC12A5.
  28. 제16항 내지 제27항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는 키트로서,
    개체의 생물학적 시료로부터 분리된 핵산을 이용하는 대장암 진단을 위한 키트.
  29. 제16항 내지 제27항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는 메틸화 마커 유전자 검출용 패널로서,
    개체의 생물학적 시료로부터 분리된 핵산을 이용하는 대장암 진단을 위한 메틸화 마커 유전자 검출용 패널.
  30. 대장암의 진단 및 치료 방법으로서,
    (a) 개체의 생물학적 시료로부터 분리된 핵산에서,
    (i) NXPH1(Neurexophilin 1), ZNF559-ZNF177(Zinc Finger Protein 559-Zinc Finger Protein 177), ANKMY1(Ankyrin Repeat And MYND Domain Containing 1), AVPR1A(Arginine Vasopressin Receptor 1A), HTR1A(5-Hydroxytryptamine Receptor 1A), PCDH8(Protocadherin 8), PENK(Proenkephalin), SLC12A5(Solute Carrier Family 12 Member 5) 및 SLC32A1(Solute Carrier Family 32 Member 1)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자의 CpG 영역이 정상 대조군에 비해 과메틸화된 상태,
    (ii) CAPS2(Calcyphosine 2) 및 DAB1(DAB Adaptor Protein 1)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자의 CpG 영역이 정상 대조군에 비해 저메틸화된 상태, 또는
    (iii) 상기 (i)에 따른 과메틸화 상태 및 (ii)에 따른 저메틸화 상태
    를 검출하여 상기 개체가 대장암이 있는 것으로 진단하는 단계; 및
    (b) 상기 개체에서 대장암에 대한 치료요법을 시행하는 단계를 포함하는
    방법.
  31. NXPH1(Neurexophilin 1), ZNF559-ZNF177(Zinc Finger Protein 559-Zinc Finger Protein 177), ANKMY1(Ankyrin Repeat And MYND Domain Containing 1), AVPR1A(Arginine Vasopressin Receptor 1A), CAPS2(Calcyphosine 2), DAB1(DAB Adaptor Protein 1), HTR1A(5-Hydroxytryptamine Receptor 1A), PCDH8(Protocadherin 8), PENK(Proenkephalin), SLC12A5(Solute Carrier Family 12 Member 5) 및 SLC32A1(Solute Carrier Family 32 Member 1)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 메틸화 마커 유전자, 이의 CpG 영역, 또는 제16항 내지 제27항 중 어느 한 항에 따른 조성물의 대장암 진단 용도.
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