CN110168106A

CN110168106A - 预测进展期胃癌患者的术后预后或抗癌药物适合性的系统

Info

Publication number: CN110168106A
Application number: CN201780069923.4A
Authority: CN
Inventors: 郑载镐; 卢圣勳; 许镛敏; 金铉起
Original assignee: Lobo Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Lobo Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2017-03-14
Filing date: 2017-08-11
Publication date: 2019-08-23
Anticipated expiration: 2037-08-11
Also published as: NZ756580A; CL2019002633A1; KR101966642B1; AU2017403899B2; UA125590C2; KR20190024923A; BR112019019022A2; JP2019537436A; EP3517624A1; US20190284637A1; CA3055735A1; JP6864089B2; KR102069043B1; AU2017403899A1; CO2019011359A2; MX2019011017A; KR20180105036A; EP3517624A4; WO2018169145A1; CA3055735C

Abstract

本发明涉及预测进展期胃癌患者的术后预后和抗癌药物适合性的系统。开发了一种算法，该算法能够通过使用预后或抗癌药物适合性标志物基因群和参照基因群的mRNA表达水平的定量测试结果来预测进展期胃癌的预后和抗癌药物适合性，从而可用作确定胃癌患者的治疗方法的补充信息。

Description

预测进展期胃癌患者的术后预后或抗癌药物适合性的系统

技术领域

本发明涉及使用对进展期胃癌患者的预后或抗癌药物适合性相关标志物基因群和参照基因群的mRNA表达的定量分析值来预测进展期胃癌患者的预后或抗癌药物适合性的系统。

背景技术

在全球范围内，胃癌是所有类型的癌症中致死率第三高的癌症，尤其在韩国，胃癌是除甲状腺癌外最常见的癌症，而众所周知甲状腺癌预后相对较好。在韩国，由于通过国家体检早期发现、手术标准化和抗癌药物的开发，胃癌患者的生存率得到了显著提高，然而，尽管目前已经有标准化治疗，但至少有一半的II期和III期进展期胃癌患者仍然会复发。

癌症已被认为是一种基因疾病，并且根据基因测试技术例如新一代测序(NGS)的发展，已经尝试根据其分子生物学特征而不是根据现有的解剖学和病理学表型对癌症进行分类。最近报道，根据癌症基因组图谱(TCGA)项目中的各种分子特征，胃癌大致分为四种类型。这意味着，尽管癌症在解剖学上处于同一阶段，但预后和抗癌药物反应的程度可能根据其分子生物学特征而不同。

根据最近报告的TCGA项目中295名胃癌患者的结果，胃癌被划分成四个类型，包括①爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)阳性胃癌、②微卫星高不稳定性(MSI-H)胃癌、③染色体不稳定性(CIN)胃癌，和④基因组稳定性(GS)胃癌。根据这种大规模癌症基因组测序，可以知道胃癌被分类为分子遗传学上不同的异质性亚组，而不是单一类型的癌症。因此，表明，对于胃癌的个性化治疗，有必要基于分子遗传学和病理学特征识别亚类，开发和应用靶基因。另外，在胃癌的研究中，已经报道了可以根据胃癌的亚型对预后进行分类的结果。

如果在胃癌术后进行抗癌药物治疗后可以预测患者的预后，则这将成为根据每种预后确定适当的治疗策略的证据数据。在目前的标准化治疗实践中，已对所有II期和III期进展期胃癌患者进行术后辅助抗癌疗法治疗。该疗法对于预后不良的群体可能是治疗不足的。也就是说，如果能够展开除当前标准治疗之外的其他治疗方法的策略，那么可能针对预后不良的患者具有临床意义。

此外，由于患者被分为抗癌药物反应组(预测群S)和抗癌药物无反应组(预测群R)，可以通过结合预后信息提供现有治疗方法的信息来提供用于确定患者治疗策略的详细证据数据。也就是说，对于既属于抗癌药物无反应组(预测群R)又属于预后良好组(预后群I)的情况，可以预防继续使用常规抗癌药物的过度治疗，对于抗癌药物反应组(预测群S)可以劝告使用常规治疗方法，而对于既属于抗癌药物无反应组(预测群R)又属于预后不良组(预后群III)的情况，可实现细分化，以诱导新疗法的积极开发。。

自2010年以来，发现在II期和III期进展期胃癌的情况下，标准化D2胃切除术后的辅助抗癌疗法提高了胃癌患者的存活率，并且目前这相当于标准疗法。传统上，根据解剖学和病理学表型对胃癌进行分类，并且当根据TNM分类将胃癌确定为II期或更高时，使用抗癌疗法治疗，但目前除TNM分期外，没有预测抗癌治疗的预后的方法。

发明内容

技术问题

本发明的目的是提供一种使用标志物基因群和参照基因群的分析值来预测进展期胃癌的预后或抗癌药物适合性的组合物，该标志物基因群能预测进展期胃癌(II期至III期：基于AJCC第6版)患者的术后预后或抗癌药物适合性。

本发明的另一个目的是提供一种使用标志物基因群和参照基因群的分析值来就患者的存活率方面提供预测预后或抗癌药物适合性的信息的方法，该标志物基因群能预测进展期胃癌患者的术后预后或抗癌药物适合性。

技术方案

为实现该目的，本发明提供了一种预测II期和III期胃癌的预后或抗癌药物适合性的组合物，所述组合物包括：

用于测量预后或抗癌药物适合性相关标志物基因群中mRNA表达水平的试剂，所述标志物基因群包括WARS、GZMB、CDX1和SFRP4；和

用于测量参照基因群中mRNA表达水平的试剂，所述参照基因群包括ACTB、ATP5E、GPX1、UBB和HPRT1。

本发明还提供了用于预测II期和III期胃癌的预后或抗癌药物适合性的试剂盒，该试剂盒包括所述用于预测II期和III期胃癌的预后或抗癌药物适合性的组合物。

本发明还提供了一种提供预测II期和III期胃癌预后的信息的方法，该方法包括：

测量自II期和III期胃癌的肿瘤获得的生物样品中的预后或抗癌药物适合性相关标志物基因群以及参照基因群的mRNA表达水平，并根据以下等式1计算预后或抗癌药物适合性相关标志物基因的ΔCq值，所述标志物基因群包括WARS、GZMB、CDX1和SFRP4，所述参照基因群包括ACTB、ATP5E、GPX1、UBB和HPRT1；以及

与预先确定的预后或抗癌药物适合性相关参考标志物基因的最终阈值相比较，

当生物样品中GZMB和WARS的ΔCq值高于预先确定的参考GZMB和WARS的最终阈值时，将组分类为预后良好组(预后群I)，以及

倘若生物样品中GZMB和WARS的至少一个ΔCq值低于预先确定的参考GZMB或WARS的最终阈值，当生物样品中SFRP4的ΔCq值低于预先确定的参考SFRP4的最终阈值时，将组分类为预后中等组(预后群II)，当生物样品中SFRP4的ΔCq值高于预先确定的参考SFRP4的最终阈值时，将组分类为预后不良组(预后群III)，

其中，对于WARS、GZMB、CDX1和SFRP4，预先确定的预后或抗癌药物适合性相关参考标志物基因的最终阈值分别为-2.14、-5.18、-2.69和-3.63，以及

通过获得来自II期和III期胃癌的肿瘤组织样品的包括WARS、GZMB、CDX1和SFRP4的预后或抗癌药物适合性相关标志物基因的ΔCq值、使用该ΔCq值计算每种基因的自适应回归值、以及将每种基因的校正值与自适应回归值相加，来计算最终阈值，WARS、GZMB、CDX1和SFRP4的自适应回归值分别为-2.54、-5.58、-3.59和-4.53，并且其校正值分别为+0.4、+0.4、+0.9和+0.9。

[等式1]

ΔCq＝(参照基因群的Cq值)-(预后或抗癌药物适合性相关标志物基因的Cq值)

在此，参照基因群的Cq值是指包括ACTB、ATP5E、GPX1、UBB和HPRT1的参照基因的平均Cq值。

本发明还提供了一种提供预测II期和III期胃癌的抗癌药物适合性的信息的方法，该方法包括：

测量自II期和II期胃癌的肿瘤获得的生物样品中的预后或抗癌药物适合性相关标志物基因群以及参照基因群的mRNA表达水平，并根据以下等式1计算预后或抗癌药物适合性相关标志物基因的ΔCq值，所述标志物基因群包括WARS、GZMB、CDX1和SFRP4，所述参照基因群包括ACTB、ATP5E、GPX1、UBB和HPRT1；以及

当生物样品中GZMB和WARS的ΔCq值高于预先确定的参考GZMB和WARS的最终阈值时，将组分类为抗癌药物无反应组(预测群R)，以及

倘若生物样品中的GZMB和WARS的至少一个ΔCq值低于预先确定的参考GZMB或WARS的最终阈值，当生物样品中的CDX1的ΔCq值低于预先确定的参考CDX1的最终阈值时，将组分类为抗癌药物无反应组(预测群R)，当生物样品中的CDX1的ΔCq值高于预先确定的参考CDX1的最终阈值时，将组分类为抗癌药物反应组(预测群S)，

[等式1]

有益效果

在本发明中，开发了一种算法，该算法可以使用预后或抗癌药物适合性相关标志物基因群和参照基因群的mRNA表达水平的定量分析结果来就存活率(如总生存率和无病存活率)方面预测进展期胃癌的预后和抗癌药物适合性，并且可以用作确定治疗胃癌患者的方法的补充信息。

附图说明

图1示出了为选择参照基因而确认在石蜡包埋样品中的靶基因表达水平的结果。

图2示出了表示预后和抗癌药物预测相关标志物基因的自适应回归值的ΔCq值，将它们分别加上WARS、GZMB、CDX1和SFRP4的校正值+0.4、+0.4、+0.9和+0.9以确定最终阈值。

图3示出了展示出从本发明的基于二元信号的二层系统中的第一层的免疫轴中分类的预后良好组(预后群I)的结果。

图4示出了展示出从本发明的基于二元信号的二层系统中的第一层的免疫轴中分类的抗癌药物无反应组(预测群R)的结果。

图5示出了展示出从本发明的基于二元信号的二层系统中的第二层的类癌症干细胞轴中分类的预后中等组和预后不良组(预后群II和III)的结果。

图6示出了展示出从本发明的基于二元信号的二层系统中的第二层的上皮轴中分类的抗癌药物反应组和抗癌药物无反应组(预测群S和R)的结果。

图7是基于二元信号的二层系统的示意图，该系统是本发明的预后组(预后群I、II、III)和抗癌药物适合性相关组(预测群R和S)的分类方法。

图8示出了根据本发明的可以预测进展期胃癌的预后和抗癌药物适合性的算法在预后组中5年总体存活率的(a)Kaplan-Meir曲线和(b)对数秩检验结果。

图9示出了根据本发明的可以预测进展期胃癌的预后和抗癌药物适合性的算法在预后组中5年无病存活率的(a)Kaplan-Meir曲线和(b)对数秩检验结果。

图10示出了经受胃切除术后接受抗癌化疗(CTX)和未接受抗癌化疗(仅手术)的胃癌患者(a)5年总体存活率的Kaplan-Meir曲线和对数秩检验中获得的p值，以及(b)5年无病存活率的Kaplan-Meir曲线和对数秩检验中获得的p值。

图11示出了根据本发明的可以预测进展期胃癌的抗癌药物反应的概率的算法，从经受胃切除术后接受抗癌化疗(CTX)和未接受抗癌化疗(仅手术)的抗癌药物反应组(预测群S)胃癌患者的5年总体存活率的Kaplan-Meir曲线和对数秩检验中获得的p值。

图12示出了根据本发明的可以预测进展期胃癌的抗癌药物反应的概率的算法，从经受胃切除术后接受抗癌化疗(CTX)和未接受抗癌化疗(仅手术)的抗癌药物反应组(预测群S)胃癌患者的5年无病存活率的Kaplan-Meir曲线和对数秩检验中获得的p值。

图13示出了根据本发明的可以预测进展期胃癌的抗癌药物反应的概率的算法，从经受胃切除术后接受抗癌化疗(CTX)和未接受抗癌化疗(仅手术)的抗癌药物无反应组(预测群R)胃癌患者的5年总体存活率的Kaplan-Meir曲线和对数秩检验中获得的p值。

图14示出了根据本发明的可以预测进展期胃癌的抗癌药物反应的概率的算法，从经受胃切除术后接受抗癌化疗(CTX)和未接受抗癌化疗(仅手术)的抗癌药物无反应组(预测群S)胃癌患者的5年无病存活率的Kaplan-Meir曲线和对数秩检验中获得的p值。

图15示出了从CLASSIC临床试验样品中接受希罗达+奥沙利铂(XELOX)抗癌化疗治疗(CTX)的患者组和仅观察组(仅手术)的5年总体存活率的Kaplan-Meir曲线和对数秩检验中获得的p值。

图16示出了根据本发明的可以预测进展期胃癌的预后和抗癌药物适合性的算法，针对于CLASSIC临床试验样品，预后分类组的5年总体存活率的(a)Kaplan-Meir曲线和(b)对数秩检验结果。

图17示出了从CLASSIC临床试验样品中接受XELOX(希罗达+奥沙利铂)抗癌化疗治疗(CTX)的患者组和仅观察组(仅手术)的5年无病存活率的Kaplan-Meir曲线和对数秩检验中获得的p值。

图18示出了根据本发明的可以预测进展期胃癌的预后和抗癌药物适合性的算法，针对于CLASSIC临床试验样品，预后分类组的5年无病存活率的(a)Kaplan-Meir曲线和(b)对数秩检验结果。

图19示出了根据本发明的可以预测进展期胃癌的抗癌药物反应的概率的算法，针对于CLASSIC临床试验样品，在XELOX抗癌药物反应组(预测群S)中，接受XELOX(希罗达+奥沙利铂)抗癌化疗治疗的患者组(CTX)和仅观察组(仅手术)的5年总体存活率的Kaplan-Meir曲线和对数秩检验中获得的p值。

图20示出了根据本发明的可以预测进展期胃癌的抗癌药物反应的概率的算法，针对于CLASSIC临床试验样品，在XELOX抗癌药物反应组(预测群S)中，接受XELOX(希罗达+奥沙利铂)抗癌化疗治疗的患者组(CTX)和仅观察组(仅手术)的5年无病存活率的Kaplan-Meir曲线和对数秩检验中获得的p值。

图21示出了根据本发明的可以预测进展期胃癌的抗癌药物反应的概率的算法，从CLASSIC临床试验样品的XELOX抗癌药物无反应组(预测群R)中接受XELOX(希罗达+奥沙利铂)抗癌化疗治疗的患者组(CTX)和仅观察组(仅手术)的5年总体存活率的Kaplan-Meir曲线和对数秩检验中获得的p值。

图22示出了根据本发明的可以预测进展期胃癌的抗癌药物反应的概率的算法，从CLASSIC临床试验样品的XELOX抗癌药物无反应组(预测群R)中接受XELOX(希罗达+奥沙利铂)抗癌化疗治疗的患者组(CTX)和仅观察组(仅手术)的5年无病存活率的Kaplan-Meir曲线和对数秩检验中获得的p值。

图23示出了在本发明的预测进展期胃癌的预后的算法的临床表现评估中预后组中5年总体存活率的Kaplan-Meier曲线。

具体实施方式

在下文中，将详细描述本发明的配置。

本发明涉及一种预测II期和III期胃癌预后或抗癌药物适合性的组合物，该组合物包括：

本发明的预测II期和III期胃癌的预后或抗癌药物适合性的组合物可用于就存活率方面预测进展期胃癌患者的预后和抗癌药物适合性。

本文使用的术语“进展期胃癌”是指基于AJCC第6版的II期或III期胃癌。

本文使用的术语“预后或抗癌药物适合性相关标志物基因”是指能够区分正常和病理状况、预测治疗后5年存活率或客观测量治疗反应预测的标志物。在本发明中，标志物基因可用于预测进展期胃癌的预后和抗癌药物适合性，是根据预后或抗癌药物反应而具有增加或减少的差异mRNA表达水平的基因。根据本发明的示例性实施方式，选择总共四种具有异质性的胃癌标志物基因，其中标志物基因是，例如，可以代表免疫模块的标志物基因(WARS和GZMB)和可以代表类癌症干细胞模块和上皮模块的标志物基因(SFRP4和CDX1)，它们通过确保新鲜冷冻组织的微阵列数据和RT-qPCR数据以及石蜡包埋的样品样本的RT-qPCR数据中的统计学显著性来稳定地测量。

本文使用的术语“参照基因”是指总是稳定表达的基因。也就是说，作为在任何组织中有规律表达的基因，参照基因用于与标志物基因表达水平进行比较来检查标志物基因的表达水平。也就是说，由于存在样品间的质量差异和取决于储存设施的变化，因此即使测量基因表达水平，也难以确定测量值是生物学变异。因此，通过标准化确定样品之间的基因表达量(ΔCq)。作为常规标准化方法，可以使用利用分位数的方法、全局标准化方法和利用参照基因的方法，但是在本发明中，使用利用参照基因的标准化方法。另外，使用单个基因作为参照基因的方法可能降低精确度，因此可以选择多种基因并且可以研究变异程度以选择适合于组织特征的参照基因。在本发明中，选择在与胃癌相关文献中公开或常规商业化产品中使用的基因，并且证明所选基因是否适合作为目标，然后用作参照基因。根据本发明的示例性实施方式，针对于文献中公开的21种参照基因，将食道癌、胰腺癌、胃癌、结肠癌等癌组织与正常组织进行比较，在其中通过qPCR选择变异最小的基因作为参照基因。随后，选择ACTB、ATP5E、HPRT1、PGK1、GPX1、RPL29、UBB和VDAC2作为商业化产品中使用的参照基因并进行qPCR，最后，使用ACTB、ATP5E、GPX1、UBB和HPRT1形成的基因群作为用于预测本发明的进展期胃癌的复发或抗癌药物反应的概率的参照基因。

本文使用的术语“mRNA表达水平的测量”是指通过确认生物样品中预后或抗癌药物适合性相关标志物基因或参照基因的mRNA表达的过程来测量mRNA的量以预测进展期胃癌的复发或抗癌药物反应的概率。分析mRNA表达的方法包括逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、竞争性RT-PCR、实时RT-PCR、核糖核酸酶保护试验(RPA)、Northern印迹和DNA芯片，但本发明不限于此。

在根据本发明的组合物中，用于测量预后或抗癌药物适合性相关标志物基因和参照基因的mRNA表达水平的试剂包括与预后或抗癌药物适合性相关标志物基因和参照基因的mRNA特异性结合的引物、探针或反义核苷酸。由于有关预后或抗癌药物适合性相关标志物基因和参照基因的信息在GenBank、UniProt等中是已知的，基于该信息，本领域普通技术人员可以容易地设计与基因的mRNA特异性结合的引物、探针或反义核苷酸。

本文使用的术语“引物”是识别靶基因序列的片段，并且包含一对正向和反向引物的引物对，但优选是提供具有特异性和灵敏度的分析结果的引物对。由于引物的核酸序列是与样品中存在的非靶序列不一致的序列，因此当该引物是仅扩增含有互补引物结合位点的靶基因序列并且不引起非特异性扩增的引物时，可以赋予高特异性。根据本发明的示例性实施方式，可以使用SEQ ID NO:1至18中列出的引物组。更具体地，可以参考NM_003014.21298-1361，使用SEQ ID NO:1和2中列出的引物组来检测SFRP4；可以参考NM_004131.3213-277，使用SEQ ID NO:3和4中列出的引物组来检测GZMB；可以参考NM_173701.1 408-480，使用SEQ ID NO:5和6中列出的引物组来检测WARS；可以参考NM_001804.2 1319-1385，使用SEQ ID NO:7和8中列出的引物组来检测CDX1；可以参考NM_001101 278-349，使用SEQID NO:9和10中列出的引物组来检测ACTB；可以参考NM_006886 117-189，使用SEQ ID NO:11和12中列出的引物组来检测ATP5E；可以参考NM_000194.1 531-597，使用SEQ ID NO:13和14中列出的引物组来检测HPRT1；可以参考NM_000581.2 308-378，使用SEQ ID NO:15和16中列出的引物组来检测GPX1；并且可以参考NM_018955.2 61-138，使用SEQ ID NO:17和18中列出的引物组来检测UBB。

本文使用的术语“探针”是指可以特异性结合样品中待检测的靶材料以通过结合来特异性鉴定样品中靶材料的存在的材料。探针的类型没有限制，是本领域常规使用的探针类型，优选可以是肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)、肽、多肽、蛋白质、RNA或DNA。更具体地，探针是可以来源于生物体、与生物体类似的或体外制造的生物材料，例如酶、蛋白质、抗体、微生物、动物或植物细胞或器官(细胞器)、神经元、DNA和RNA，DNA可以包括cDNA、基因组DNA、寡核苷酸，RNA包括基因组RNA、mRNA和寡核苷酸，并且蛋白质可以包括抗体、抗原、酶和肽。根据本发明的示例性实施方式，可以使用用于qPCR测量的SEQ ID NO:19至27探针。优选地，探针可以是荧光标记的。

本文使用的术语“反义”是指具有核苷酸碱基序列和亚基之间的骨架的寡聚体，该寡聚体通过形成Watson-Crick碱基对与RNA中的靶序列杂交，通常使得与靶序列中的mRNA形成RNA:寡聚体二聚体。寡聚体可以与靶序列具有精确的序列互补性或近似互补性。

本文使用的术语“预后或抗癌药物适合性的预测”包括确定对象对特定疾病或病症的易感性、具有特定疾病或病症的对象的预后(例如，鉴定转移前或转移性癌症的状况，确定癌症的阶段或癌症对治疗的反应性)、或治疗计量学(therametrics，例如，监测对象的状况以提供关于治疗功效的信息)。本发明的目的是在存活率(例如总体存活率和无病存活率)方面预测手术后胃癌患者的预后和抗癌药物适合性。

根据本发明的预测II期和III期胃癌的预后或抗癌药物适合性的组合物可以进一步包括药学上可接受的载体。

药学上可接受的载体包括通常用于制药领域的载体和溶媒，具体包括离子交换树脂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白(例如人血清白蛋白)、缓冲物质(例如所有类型的磷酸盐、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾和饱和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物)、水、盐或电解质(例如鱼精蛋白硫酸盐、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠和锌盐)、硅溶胶、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、基于纤维素的基质、聚乙二醇、羧甲基纤维素钠、聚芳酯、蜡、聚乙二醇或羊毛脂，但本发明不限于此。

此外，本发明的组合物还可包含润滑剂、润湿剂、乳化剂、悬浮剂或防腐剂以及上述组分。

本发明还涉及预测II期和III期胃癌的预后或抗癌药物适合性的试剂盒，该试剂盒包括用于预测II期和III期胃癌的预后或抗癌药物适合性的组合物。

优选地，试剂盒可以是RT-PCR试剂盒或DNA芯片试剂盒。

预测II期和III期胃癌的预后或抗癌药物适合性的试剂盒可以进一步包括适合于分析方法的包含一种或多种类型组分的组合物、溶液或装置。优选地，诊断试剂盒可以进一步包括进行RT-PCR的必需元件。RT-PCR试剂盒包括对编码标志物蛋白的基因具有特异性的引物对。引物是序列对基因的核酸序列具有特异性的核苷酸，并且长度可以为约7至50bp，更优选为约10至30bp。另外，RT-PCR试剂盒还可以包括对对照基因的核酸序列具有特异性的引物。除此之外，RT-PCR试剂盒可包括试管或其他合适的容器、反应缓冲液(各种pH和镁浓度)、脱氧核苷酸(dNTP)、酶如Taq聚合酶和逆转录酶、DNA酶和核糖核酸酶抑制剂、DEPC水和灭菌水等。

另外，本发明的预测II期和III期胃癌的预后或抗癌药物适合性的试剂盒可包括进行DNA芯片方法的必要元件。DNA芯片试剂盒可以包括附着有与基因或其片段对应的cDNA或寡核苷酸的基板，以及用于制备荧光标记探针的反应物、试剂和酶等。另外，基板可包含与对照基因或其片段对应的cDNA或寡核苷酸。

本发明还提供了一种提供信息以预测II期和III期胃癌预后的方法，该方法包括：

[等式1]

将通过步骤详细描述本发明的提供预测II期和III期胃癌预后或抗癌药物适合性的信息的方法。

第一步包括测量从自II期和III期胃癌的肿瘤获得的生物样品中的预后或抗癌药物适合性相关标志物基因群以及参照基因群的mRNA表达水平，并计算每种预后或抗癌药物适合性相关标志物基因的ΔCq值

预后或抗癌药物适合性相关标志物基因群和参照基因群的mRNA表达水平可通过RT-PCR、竞争性RT-PCR、实时RT-PCR、核糖核酸酶保护试验、Northern印迹或DNA芯片来测量。更优选地，mRNA表达水平通过实时RT-PCR测量，或者可以作为循环定量(Cq)值获得。

使用上述获得的预后或抗癌药物适合性相关标志物基因群和参照基因群的Cq值，根据下等式1计算ΔCq值。

[等式1]

ΔCq值是指通过将标志物基因的表达水平标准化而获得的值，并且随着ΔCq值越高，表达水平越高。

第二步是与预先确定的预后或抗癌药物适合性相关参考标志物基因的最终阈值相比较对生物样品的预后组进行分类的步骤。

为了对预后组进行分类，预先确定成为预后或抗癌药物适合性相关标志物基因的标准的最终阈值。

为此，从II期和III期胃癌的肿瘤组织样品和正常组织样品中，获得根据预后或抗癌药物适合性相关标志物基因的mRNA表达水平的Cq值，根据等式1计算ΔCq值，并且通过将ΔCq值应用于自适应回归技术来计算自适应回归值(A.R.V.)，所述标志物基因包括WARS、GZMB、CDX1和SFRP4。虽然通常基于由阵列选择的值的中值或平均值来处理数据，但是在总数据的任意点被确定为参考点时所获得的分离区间的平均值的方差最大的点被确定为自适应回归值(或阈值)。也就是说，阈值是区分正常组织和癌组织中具有生物学显著性的相应基因的高表达和低表达的参考点。自适应回归值计算如下。

采用自适应回归方法拟合

MSR＝SSR/(m-1)

MSB＝SSB/(n-m)

其中，SSR：回归平方和；SSTOT：总平方和；SSE：平方和误差；MSR：回归均方；MSB：误差均方；和F：F分布。

在此，与F分布的尾概率对应的p值如下。

其中，是F分布的随机变量。

在上述过程中，当p值较小时，可以认为拟合更好。

②阶跃函数的确定

在此，F₁₂表示一阶和两阶之间的相对更好的拟合函数。

③在本发明的方法中，当使用上述一阶法通过基因确定任意点作为总数据中的参考点时，将统计值最高的点确定为A.R.V.，并且将校正值与A.R.V.相加以确定最终阈值。

可以基于临床有用性和安全性获得标志物基因的校正值。也就是说，通过获得针对ΔCq值的作为分析性性质的A.R.V.值，并且通过针对构成预后轴的WARS、GZMB和SFRP4以及构成预测轴的WARS、GZMB和CDX1，基于ΔCq筛选出WARS和GZMB为0.4至0.5、SFRP4为0.8至0.9并且CDX1为0.8至0.9的组合，就预后方面选择构成最佳风险比的组合并且就抗癌药物适合性方面选择是否进行抗癌药物治疗与预测群之间构成关联的组合。

优选地，WARS、GZMB、CDX1和SFRP4的自适应回归值分别为-2.54、-5.58、-3.59和-4.53，并且其校正值可分别为+0.4、+0.4、+0.9和+0.9。

标志物基因即WARS、GZMB、CDX1和SFRP4的最终阈值通过将校正值与自适应回归值相加而获得，分别为-2.14、-5.18、-2.69和-3.63。

当确定参考标志物基因的最终阈值时，通过基于二元信号的二层系统进行对预后群和抗癌药物反应组(预测群)的分类。换句话说，根据本发明的用于预测进展期胃癌的预后或抗癌药物适合性的概率的算法进行的分组在图7中具体示出，并且参考该图，当生物样品中GZMB和WARS的ΔCq值高于预先确定的参考GZMB和WARS的最终阈值时，将该组分类为预后良好组(预后群I)，以及倘若生物样品中GZMB和WARS的至少一个ΔCq值低于预先确定的参考GZMB或WARS的最终阈值，当生物样品中SFRP4的ΔCq值低于预先确定的参考SFRP4的最终阈值时，将组分类为预后中等组(预后群II)，当生物样品中SFRP4的ΔCq值高于预先确定的参考SFRP4的最终阈值时，将组分类为预后不良组(预后群III)。

另外，当生物样品中GZMB和WARS的ΔCq值高于预先确定的参考GZMB和WARS的最终阈值时，将组分类为抗癌药物无反应组(预测群R)，并且倘若生物样品中GZMB和WARS的至少一个ΔCq值低于预定确定的参考GZMB或WARS的最终阈值，当生物样品中CDX1的ΔCq值低于预定确定的参考CDX1的最终阈值时，将组分类为抗癌药物无反应组(预测群R)，当生物样品中CDX1的ΔCq值高于预先确定的参考SFRP4的最终阈值时，将组分类为抗癌药物反应组(预测群S)。

生物样品可以是新鲜肿瘤组织、新鲜冷冻肿瘤组织、石蜡包埋的肿瘤组织、细针抽吸液、腹水、管清洗液或胸膜液，并且优选是石蜡包埋的肿瘤组织。

此外，预后或抗癌药物适合性相关标志物基因群和参照基因群的mRNA表达水平可通过RT-PCR、竞争性RT-PCR、实时RT-PCR、核糖核酸酶保护分析、Northern印迹或DNA芯片进行。优选地，通过实时RT-PCR进行测量。

在下文中，通过参考示例性实施方式的详细描述和附图，可以清楚地理解本发明的优点和特征以及实现它们的方法。然而，本发明不限于下文公开的示例性实施方式，并且可以以许多不同的形式实施。提供这些示例性实施方式是为了使本发明的公开内容完整并将本发明的范围完全传达给本领域普通技术人员，并且本发明应仅由所附权利要求限定。

[实施例]

<实施例1>预测进展期胃癌的预后或抗癌药物适合性概率的算法的开发

在进展期胃癌的石蜡包埋组织上制造包含50％以上肿瘤的3mm孔，并根据方案从穿孔组织中提取RNA。获得至少400ng的总RNA。所需的Q.C元素是A260/A280大于或等于1.8。

对于RT-qPCR实验，使用nProfiler I试剂盒，使用患者的总RNA(400ng/18μl)，并将基因特异性引物(GSP)混合物(3μl)分散在样品中。将2720热循环仪(AppliedBiosystems)的温度升至50℃，然后将样品放入循环仪中。RNA样品在65℃下变性5分钟，然后停止热循环仪。对于RT，加入6μl RT缓冲液和2μl RT混合物，在37℃下进行DNA合成60分钟，并将DNA在70℃下保持15分钟。为了进行qPCR，将cDNA混合物(3μl)和9种引物-探针混合物(2μl，试剂盒中的Gene-1至Gene-9)中的每一种混合。将样品在95℃下进行酶活化120秒，1个循环，在95℃下变性10秒和在60℃下检测30秒，40个循环。使用nDxI程序(NovomicsCo.,Ltd.)分析提取的数据。

RT和qPCR过程由nProfiler I制备，nProfiler I是由9种胃癌基因组成的基于mRNA的qPCR试剂盒。本文使用的试剂如表1所示。

[表1]

上述9种基因是在新鲜冷冻组织的微阵列数据和RT-qPCR数据以及石蜡包埋的样品样本的RT-qPCR数据中具有统计学显著性的四种标志物基因，以及五种参照基因。开发了nProfiler I胃癌测定，该测定是可以根据最终选择的基因的表达水平对预后进行分类的诊断试剂盒。

选择参照基因的过程如下。

通过以下论文对特异地应用于胃癌的参照基因进行文献调查：

通过RT-qPCR鉴定适用于胃癌中基因表达研究的参照基因(Identification ofvalid reference genes for gene expression studies of human stomach cancer byreverse transcription-qPCR.Rho et al.BMC Cancer 2010,10:240)；结直肠癌、食道癌和胃癌组织中参照基因的变化(Housekeeping gene variability in normal andcancerous colorectal,pancreatic,esophageal,gastric and hepatictissues.Claudia Rubie et al.Mol Cell Probes.2005)；使用qPCR的美国类似产品参照基因的案例研究：乳腺癌参照基因(A Multigene Assay to Predict Recurrence ofTamoxifen-Treated,Node-Negative Breast Cancer.Paik S et al.N Engl JMed.2004Dec)；结肠直肠癌参照基因(Interaction Between Tumor Gene Expression andRecurrence in Four Independent Studies of Patients With Stage II/III ColonCancer Treated With Surgery Alone or Surgery Plus Adjuvant Fluorouracil PlusLeucovorin.O'Connell et al.J Clin Oncol.2010)。

此外，检测了用于目前商业化的实体癌症相关产品的参照基因。基于这些基因，利用对基因是否适合作为临床样品的参照基因的先前研究来验证所选择的基因，并最终选择该基因。

基于上述，主要选择总共8个参照基因作为候选基因。

最后，选择组合在30个石蜡包埋样品中时变异程度最小的5个基因(使用geNorm)作为参照基因(参见图1)：ACTB/ATP5E/GPX1/UBB/HPRT1

随后，为了开发算法，对从2006年到2010年在延世大学Severance医院接受手术的II期或III期胃癌患者获得的310个剩余的石蜡包埋样品样本(3-mm核心)进行实时RT PCR。

标志物基因是可以区分胃癌异质性并且可以在癌组织中稳定检测的基因，并且有四种标志物基因，例如可以代表免疫轴的标志物基因(WARS、GZMB)、可以代表类癌症干细胞轴的标志物基因(SFRP4)以及可以代表上皮轴的标志物基因(CDX1)。

上文开发的标志物基因和上述参照基因显示在下表2中。

[表2]

然后，确定预后或抗癌药物适合性相关标志物基因群和参照基因群中每个基因的阈值，以建立预后相关组的分类标准(预后群I：预后良好组，预后群II：预后中等组，和预后群III：预后不良组)和抗癌药物适合性相关组(预测群S：抗癌药物反应组，和预测群R：抗癌药物无反应组)。

为了确定这样的分类标准，使用基于二元信号的二层系统将基因组分类为预后组(预后群)和抗癌药物反应组(预测群)。

使用通过实时RT-PCR获得的预后或抗癌药物适合性相关标志物基因群和参照基因群的Cq值，根据下面的等式1计算每个标志物基因的ΔCq值，从而使mRNA表达水平标准化：

[等式1]

ΔCq＝参照基因群的Cq值-标志物基因的Cq值

这里，参照基因群的Cq值是指包括ACTB、ATP5E、GPX1、UBB和HPRT1的参照基因的平均Cq值。

ΔCq值越高，则基因表达越高。

通过将ΔCq值应用于自适应回归技术来计算自适应回归值(A.R.V.)。虽然通常基于由阵列选择的值的中值或平均值来处理数据，但是在总数据的任意点被确定为参考点时所获得的分离区间的平均值的方差最大的点被确定为自适应回归值(或阈值)。也就是说，阈值是区分正常组织和癌组织中具有生物学显著性的相应基因的高表达和低表达的参考点。自适应回归值计算如下。

采用自适应回归方法拟合

MSR＝SSR/(m-1)

MSB＝SSB/(n-m)

这里，与F分布的尾概率对应的p值如下。

其中，是F分布的随机变量。

在上述过程中，当p值较小时，可以认为拟合更好。

②阶跃函数的确定

在此，F₁₂表示一阶和两阶之间的相对更好的拟合函数。

③在本发明的方法中，当使用上述一阶法通过基因确定任意点作为总数据中的参考点时，将统计最高的点确定为A.R.V.，并且将校正值与A.R.V.相加以确定最终阈值。获得310个肿瘤组织石蜡包埋样品和108个正常组织石蜡包埋样品的A.R.V.，并对正常组织样品和胃癌组织样品进行定量和标准化。获得使用自适应回归技术针对正常和胃癌组织样品的每种基因计算的值，通过将上述校正值应用于先前获得的值来确定与以下标准对应的最终阈值。另外，当基因的Cq值确定为N/A或未确定时，从自适应回归值中消除该样品的相应基因。根据上述方法计算的标志物基因的最终阈值在下表3中示出(参见图2)。

[表3]

标志物基因	自适应回归值	校正值	最终阈值
				WARS	-2.54	+0.4	-2.14
GZMB	-5.58	+0.4	-5.18
				CDX1	-3.59	+0.9	-2.69
SFRP4	-4.53	+0.9	-3.63

如下使用四种标志物基因对基于二元信号的二层系统进行分类。

首先，在第一层步骤中，使用布尔逻辑门通过两种标志物基因(WARS、GZMB)分类为预后良好组(预后群I，图3中用粗线包围的区域)和抗癌药物无反应组(预测群R，图4中用粗线包围的区域)。在此，标志物基因WARS和GZMB被命名为免疫轴。

接下来，在第二层步骤中，未在第一层步骤中分类的其他胃癌患者组在第二层步骤中分类，并且在此，使用其他两种标志物基因CDX1和SFRP4来分类。

在此，在预后差异方面，通过代表类癌症干细胞轴的标志物基因(SFRP4)，将低表达组分类为预后中等组(预后群II，图5中由粗线包围的左侧区域)，高表达组被命名为预后不良组(预后群III，图5中由粗线包围的右侧区域)。

然后，在抗癌药物适合性方面，通过代表上皮轴的标志物基因(CDX1)，将高表达组分类为抗癌药物反应组(预测群S，图6中用粗线包围的上部区域)，低表达组以及在第一层步骤中分类的组(图4中以粗线包围的区域)分类为抗癌药物无反应组(预测群R，图6中用粗线包围的下部区域)。

这种分类算法在图7中示出。

<实施例2>用于预测进展期胃癌的预后和抗癌药物适合性的概率的算法的验证

根据实施例1中获得的预测算法使用Kaplan-Meir曲线和COX单变量/多变量分析(n＝307，三个样品QC失败)验证预后和抗癌药物适合性的显著性。

如图8的Kaplan-Meir曲线所示，可以看出三个预后组(预后群I、II和III)之间存在预后差异。三组的5年总体存活率分别为83.3％、71.8％和58.2％，表明预后群I在三组中预后最好，预后群III在其中的预后最差。

[表4]

如表4所示，在对本发明的预后组进行的COX单变量/多变量分析中，揭示了预后组(预后群)分类不仅可以用于对预后进行分类，而且充当独立的预后预测因子。特别地，预后群I和预后群III之间存在预后差异，并且预后群II被确定为缓冲区。

在无病存活率方面验证预后结果。如图9的Kaplan-Meir曲线所示，可以看出三组(预后群I、预后群II、预后群III)之间的无病存活率存在差异，类似于总体存活率的结果。三组的5年无病存活率分别为75.8％、66.9％和48.2％，表明在三组中预后群I预后最好，预后群III预后最差。

此外，如表5所示，可以看出，预后组(预后群)的分类不仅在无病存活率方面在对本发明的预后组进行的COX单变量/多变量分析的预后分类中是有效地的，而且每个预后组充当独立的预后预测因子。

[表5]

然后，在接受胃切除术后未接受抗癌化疗的患者(仅手术)和接受辅助化疗(CTX)的患者的总体存活率方面，比较所有样本(n＝307)的预后，如图10的Kaplan-Meir曲线所示，各组之间没有显著差异。获得这样的结果似乎是因为将该样本作为作为回顾性样品而收集，并且对于患者是否进行抗癌化疗的确定是有BIAS的。因此，通过使用实施例2中的参数，比如性别、年龄、TNM分期和抗癌治疗与否，进行COX多变量分析来分析数据。

根据本发明的抗癌药物反应组(预测群S；n＝145)中接受或未接受抗癌疗法的患者的预后的比较结果如图11所示。在COX单变量分析中，接受抗癌疗法的组与未接受抗癌疗法的组之间没有显著差异，这被认为是由样品组的BIAS引起的。然而，根据使用性别、年龄和TNM分期参数的COX多变量分析，显示接受抗癌疗法的组比未接受抗癌疗法的组的抗癌效果更高的统计学显著结果(参见表6和图11)。

[表6]

在无病存活率方面所验证的预后显示与在总体生存率方面相同的结果。在根据本发明的预测群S(n＝145)中，在无病存活率方面比较接受或未接受抗癌疗法的患者的预后，如图12所示，根据COX单变量分析，接受或未接受抗癌疗法的组之间没有显著差异，而根据使用参数，比如性别、年龄和TNM分期的COX多变量分析，接受抗癌疗法的组比未接受抗癌疗法的组的抗癌效果更高，但这种情况很少。在实施例4中另外验证了无病存活率(参见表7和图12)。

[表7]

然后，在预测群R(n＝162)中，对接受和未接受抗癌化疗的患者在总体存活率方面的预后的比较结果如图13所示，根据COX单变量/多变量分析，接受和未接受抗癌疗法的组在存活率上显示出不显著的差异(参见表8和图13)。

最后，在预测群R(n＝162)中，对接受和未接受抗癌化疗的患者在无病存活率方面的预后的比较结果如图14所示，根据COX单变量/多变量分析，接受和未接受抗癌疗法的组在存活率上显示出不显著的差异(参见表9和图14)。

[表8]

[表9]

<实施例3>抗癌药物反应组(预测群S和R)分类与是否进行抗癌疗法的关联的验证

当比较抗癌药物适合性(预测群)和是否给药抗癌药物之间的关联时，看出从抗癌化疗中获得有益效果的组之间没有直接的关联，但是当在回顾性样品偏差方面进行COX多变量分析时，看出抗癌药物适合性(预测群)和抗癌化疗之间的关联。该结果表明，从用年龄、性别和TNM分期参数分析的COX多变量中看出，在抗癌药物反应组(Predictive ClusterS)中预期有抗癌化疗益处，但在抗癌药物无反应组中(预测群R)预期没有抗癌化疗益处(参见表10，预测群多COX的p值＝0.039)。

[表10]

同样在无病存活率方面验证到的结果与在总体生存率方面相同。这表明在抗癌药物反应组(预测群S)中预期有抗癌化疗益处，但在抗癌药物无反应组(预测群R)中预期没有抗癌化疗益处(参见表11，预测群多COX的p值＝0.048)。

[表11]

由上述结果，预测根据本发明的算法分类的预后良好组(预后群I)和预后不良组(预后群III)的预后，可以看出在5年存活率和无病存活率的差异。作为5年总体存活率的比较结果，在抗癌药物反应组(预测群S)中手术和抗癌药物治疗的益处具有统计学显著性，但在抗癌药物无反应组(预测群R)中则无统计学显著性。此外，该结果在统计学上表明抗癌药物反应组的分类与抗癌药物治疗之间存在关联。

<实施例4>对于使用CLASSIC临床试验样品的预后组(预后群I、II、III)和标准疗法希罗达+奥沙利铂(XELOX)反应组(预测群R和S)之间的XELOX辅助抗癌治疗益处的关联的验证

CLASSIC(胃癌中卡培他滨和奥沙利铂的辅助研究)临床试验是韩国、日本和中国的37家医院中的每一家进行，以验证针对基于AJCC第6版的II期和III期患者的手术(D2切开术)后的希罗达+奥沙利铂(XELOX)抗癌疗法的随机3期国际临床试验。共有1037名患者参与了该试验，其中手术后仅观察515名患者，对520名患者进行希罗达和奥沙利铂(以下简称XELOX)给药，由此，最后报道，与观察组相比，XELOX给药组显示出15％的预后增强效果。因此，CLASSIC临床试验被用作II期和III期患者的标准抗癌治疗方案。

在示例性实施方式中，使用表1中所示的nProfiler I试剂盒，对参与CLASSIC临床试验的629个患者样品验证了预后和抗癌药物适合性的效果。

如实施例1中所示，从629个样品中提取RNA，并使用nProfiler I胃癌测定试剂盒进行qPCR。按照nProfiler I试剂盒中的规定进行质量控制，因此淘汰了4个样品。

通过nProfiler I试剂盒测量总共9个基因的Cq值，并且根据等式1计算ΔCq值。根据如实施例1的表3中所示的预先确定的值通过应用分类的参考点，将计算出的ΔCq值分类为如实施例1的图7中所示的组。

在组分类之前，手术后给药XELOX(XELOX)的组和仅手术组的预后如图15所示。

比较在在手术后仅观察(仅手术)的患者组和接受胃切除术后给药XELOX的患者组之间的预后时，可以看出所有样本组之间存在显著差异(n＝625)，如图15的Kaplan-Meir曲线所示。与实施例1、2和3不同，在<实施例4>中，由于样本从随机3期临床试验的患者样品中收集，因此确定在选择XELOX治疗时没有BIAS，因此，在<实施例4>中，进行单变量/多变量分析。作为分析的结果，在COX单变量分析和Kaplan Meir图中，XELOX给药组(CTX)和仅观察(仅手术)组之间的预后存在显著差异，这与先前公开的文献的结果相同(参见图15)。在无病存活率方面，该结果是相同的(参见图17)。

根据实施例1中所示的预测算法，使用Kaplan-Meir曲线和COX单变量/多变量分析验证预后和抗癌药物适合性的显著性。

如图16的Kaplan-Meir曲线所示，可以看出三组(预后群I、预后群II和预后群III)之间的预后存在差异。三组的5年总体存活率分别为83.2％、74.8％和66.0％，表明三组中预后群I预后最好，预后群III预后最差。

另外，如表12所示，在COX单变量/多变量分析中，每个子类被鉴定为独立的预后预测因子。特别地，预后群I和预后群III之间存在预后差异，并且预后群II被确定为缓冲区。

[表12]

在无病存活率方面验证该结果如下。与总体存活率方面的结果一样，可以看出，就无病存活率而言，如图18的Kaplan-Meir曲线所示，三组(预后群I、预后群II和预后群III)之间存在预后差异。三组的5年无病存活率分别为76.9、65.0和55.3％，表明预后群I的预后最好，预后群III的预后最差。

另外，如表13所示，作为无病存活率的验证结果，在COX单变量/多变量分析中，每种子类被鉴定为独立的预后预测因子。特别地，预后群I和预后群III之间存在预后差异，并且预后群II被确定为缓冲区。

[表13]

在预测群S(n＝281)中，在总体存活率方面对接受希罗达+奥沙利铂(XELOX)抗癌疗法(CTX)和仅观察的患者组(仅手术)的预后进行比较，如图19所示，在COX单变量分析中，接受XELOX抗癌疗法的组与未接受抗癌疗法的组之间存在显著差异。在针对性别、年龄和TNM分期调整的COX多变量分析中，与仅手术组相比，接受XELOX治疗的组显示出统计学上显著的结果，即预后良好，这与在单变量分析的情况相同(参见表14和图19)。

[表14]

此外，在无病存活率方面验证上述结果中，在预测群S(n＝281)中，在接受XELOX抗癌疗法的患者组和仅观察患者组之间比较预后。如图20所示，在COX单变量分析中，接受XELOX抗癌疗法的组与仅手术组之间存在显著差异。在针对性别，年龄和TNM分期调整的COX多变量分析中，与仅手术组相比，接受XELOX治疗的组显示出统计学上显著的结果，即预后良好，这与在单变量分析的情况相同(参见表15和图20)。

随后，在预测群R(n＝344)中，当在接受XELOX抗癌疗法的患者组和仅观察患者组之间比较预后时，如图21所示，两组之间的存活率没有显著差异。该结果与在COX单变量/多变量分析中的结果是一致的(参见表16和图21)。

[表15]

[表16]

随后，当在无病存活率方面验证预后时，观察到与总体存活率相同的结果。在预测群R(n＝344)中，当在接受XELOX抗癌疗法的患者组和仅观察患者组之间比较预后时，如图22所示，两组的存活率无显著差异。该结果与在COX单变量/多变量分析的结果是一致的(参见表17和图22)。

[表17]

之后，当在总体存活率方面验证预后时，观察到抗癌药物适合性(预测群)和XELOX抗癌疗法治疗之间存在直接关联(表18)。

[表18]

当在无病存活率方面验证预后时，如在总体生存率方面所验证，观察到抗癌药物适合性(预测群)和XELOX抗癌疗法之间存在直接关联(表19)。

该结果通过验证实施例3的结果获得，并且表明，XELOX抗癌化疗的益处在抗癌药物反应组(预测群S)中出现，但是在抗癌药物无反应组(预测群R)中没有出现。

根据来自上述结果的本发明的算法而分类的预后良好组(预后群I)和预后不良组(预后群III)的预后预测结果，可以看出在5年存活率上存在显著差异。此外，抗癌药物反应组(预测群S)中显示手术后XELOX抗癌疗法的效果，但抗癌药物无反应组(预测群R)中没有治疗效果，表明抗癌药物适合性和XELOX治疗存在显著关联。

[表19]

<实施例5>使用II期和III期进展期胃癌患者手术后剩余的FFPE样本评估预后组(预后群I，II和III)的临床表现

为了验证在实施例1中获得的胃癌患者的预后预测算法(用于nProfiler I胃癌测定的医疗装置)的临床性能评价，通过对II期和III期(基于AJCC第6版)胃癌患者手术后剩余的FFPE样本进行实时PCR，测量基因的ΔCq值，并用新的对象组测试预测患者预后的算法的临床表现。具体地，1)通过鉴定从Kaplan-Meier曲线的验证集推导出的两个预后组(预后群I、预后群III)的5年存活率来评估算法的预测表现；2)通过使用对数秩检验对具有统计显著性的预后组之间的预后差异进行比较测试，评估组间预后差异的稳定性，从而确定三组中预后群I是最佳预后组，预后群III是最差预后组；3)使用多变量Cox比例风险模型分析预后组中的风险比，从而鉴定出预后组是独立的预后因子。

对于临床试验，使用总共684个样本，并且在样本筛选步骤中，由于RNA的数量和质量不足而淘汰了18个样本。除筛选淘汰的18个样本外，接受666个样本作为临床试验的样本。在首次测试和分析步骤中，666个样本中有126个样本符合QC淘汰标准，因此进行了一次重新测试，导致总共126个样本中有12个样本由于QC淘汰标准而被进行“中途淘汰”处理。结果，除了从筛选淘汰的18个样本和由重新测试标准而淘汰的12个样本这总共30个样本之外，选择684个目标样本中的654个样本作为有效性评估分析组。

在此临床试验中，没有评估抗癌药物适合性(预测群S和R)，这是因为，由于在654例患者样品中，有97.7％的患者接受了抗癌药物治疗，对于比较被分在抗癌药物反应组(预测群R或S)子组的接受抗癌治疗的患者与未接受抗癌治疗的患者之间的预后差异而言，缺少未接受抗癌治疗的患者。

首先，为了测量预后组中5年存活率的预测表现，通过将每个样本的ΔCq值应用于算法来对预后组进行分类，然后使用Kaplan-Meier曲线计算每个预后组的存活率(参考图23和表20)。

[表20]

预后群的五年存活率

另外，如下表21中所示，两个预后组(例如预后组I和预后组III)的95％置信区间之间的重叠检验结果证实没有重叠。

[表21]

为了确认预后组之间差异的稳定性，对预后组I、II和III进行对数秩检验以鉴定统计学上的显著差异，并且对于统计学计算，通过计算自由度为2的卡方来计算p值。如果比较预后组的效果没有差异，则所有部分中的事件(死亡)的发生必须以与每个部分中在三个预后组中被观察的对象数量(O)成比例的频率发生。在对数秩检验中，对合并三个预后组的整个群以观察时间的顺序来排列，去掉已审查的条目，并且仅留下了发生事件(死亡)的部分。此外，计算每个预后组的预期死亡频率(E)。由于每个预后组关于死亡的总体观察频率(O)和预期频率(E)的关联显示自由度为2的卡方分布，如果值(X²)大于5.99(p值<0.05)，则认为三个预后组显示出显著差异。对数秩检验中的零假设如下：

H₀：预后群I、II和III之间没有差异

计算预期频率(预期死亡数)的方法

(E_1j：组1中第j个变量的预期死亡数；O_j：观察到的所有组中第j个变量的死亡数；N_1j：组1中第j个变量的观察对象的数量；N j：所有组中第j个变量的观察对象的数量)

两组或更多组之间的对数秩检验的统计：卡方X²＝Z(Σ^-1)Z^t(Σ：方差-协方差矩阵，Z：k-1统计向量)

当关于对数秩检验统计值的p值小于0.05时，解释为预后组之间存在预后差异，相反，当关于统计量的p值大于0.05，解释为预后组之间无预后差异。

结果，当计算出自由度为2的卡方(X²)为24.7(p值＝4.39e-06)时，指示了统计学上的显著差异(参见表22)。因此，可以看出三组之间存在预后差异(预后群I、II和III)。

[表22]

为了研究三个预后组之间的差异，使用对数秩检验进行具有自由度为2的卡方分布的事后检验，通过计算所有显著的p值可以看出有预后差异。也就是说，由于三个预后组之间的差异是明显的，因此判断该结果满足[预后组之间差异的稳定性]。

[表23]

用于分析的预后群	要观察的样品数量	卡方(X<sup>2</sup>)	P值
				预测群I对比预后群II	337	11.5	0.000691
预后群I对比预后群III	401	22.6	1.96e-06
				预后群II对比预后群III	570	5.8	0.016

为了确定预后组的风险度和独立性，校正胃癌的其他风险因子(年龄、性别、TNM分期和抗癌治疗与否)的影响，以根据风险因子即预后组本身通过风险比分析来评估存活率是否存在差异。使用Cox比例风险模型分析方法，使用预先存在的预后因子作为协变量进行多变量分析，以研究根据该算法的预后组是否是影响胃癌预后的独立预后因子。

Cox比例风险模型中的零分析如下：

H₀：β_j＝0意味着无论时间(t)如何，具有不同风险因子的两个人成比例地相关。

h(t)＝h₀(t)exp(β₁χ₁+...+β_kχ_k)

[χ₁,…,χ_k：自变量(风险因子)，h₀(t)：在时间t时的基线风险，即表示对所有自变量，值为“0”的人是有风险的]

风险比

统计学和P值计算

当Z<Z_α/2或Z<Z_1-α/2时，H₀被拒绝，并且当Z_α/2≤Z≤Z_1-α/2时，H₀被采纳。

如果Z≥0，p值＝2×[1-Φ(Z)]

如果Z<0，p值＝2×Φ(Z)

然后，被选择为有效性评估分析组的654个样品中，从分析中淘汰了不确定是否接受抗癌药物的22个样品，并且使用多变量Cox比例风险模型分析剩余的632个样品以计算风险比、95％置信区间和p值。

根据多变量Cox比例风险模型的分析结果，当两个预后群(预后群I对比预后群III)之间的风险比具有统计学显著性(p值<0.05)时，这解释为根据算法的预后组是独立的预后因子。

[表24]

多变量Cox比例风险回归模型分析的结果

	风险比率以及95％CI	p值
			年龄	1.0200(1.0098-1.0300)	0.000112
性别
			男	1
女	1.1223(0.8893-1.4160)	0.331330
			化疗
否	1
			是	0.7531(0.3715-1.5260)	0.431482
TNM分期
			II期	1
III期	2.0315(1.5882-2.5990)	1.67e-08
			预后群
预后群I.	1
			预后群II	2.0439(1.3155-3.1760)	0.001475
预后群III	2.5765(1.6810-3.9490)	1.40E-05

根据使用Cox比例风险模型进行分析的结果，作为影响预后胃癌的风险因子(自变量)，年龄(p值＝0.000112)、TNM分期(p值＝1.67e-08)以及预后组具有统计学显著性。

在预后组(预后群)作为临床试验的评估变量的情况下，使用预后群I作为相应的自变量的参考来计算预后群II和III的风险比。因此，在诊断中，预后群II(p值＝0.001475)的风险性是预后群I的2.04倍，而预后群III(p值＝1.40e-05)的风险性是预后群I的2.58倍，这在统计学上是显著的。

因此，即使用风险因子(年龄、性别、TNM分期和抗癌治疗与否)调整Cox比例风险模型，也可以看出根据该算法的预后群的分类是胃癌中的独立预后因子。

根据评估临床试验安全性的结果，在相应的时期内，测试者根据实验室生物安全指南保存和处理样本。根据临床试验期间的观察，没有与副作用有关的安全问题，例如异常病例和处理样本的测试者被样本感染。

应用通过临床试验从实施例1中获得的预测算法和算法的阈值，验证预后的临床有效性评价结果。作为有效性评估变量的预后群I和预后群III的5年存活率分别被确认为81.98％(95％CI，74.12至90.67％)以及55.74(95％CI，50.52至61.49％)，符合临床试验计划中定的评估标准设，并且确认了，预后组I和预后组III中5年存活率的95％CI彼此不重叠。

此外，根据为评价分类的三个预后组之间是否存在预后差异而进行的对数秩检验，确认了三个组之间存在显著差异。此外，根据事后分析，计算出所有三个组的显著的p值，表明各组之间存在预后差异。也就是说，在三个预后组之间，由于预后组之间的差异是明确的，因此结果满足[预后组之间差异的稳定性]。

最后，通过使用年龄、性别、抗癌治疗与否、分期等作为协变量进行多变量Cox比例风险模型分析来估计风险比，预后群II(p值＝0.001475)的风险性是预后群I的2.04倍，并且预后群III(p值＝1.40e-05)的风险性是预后群I的2.58倍，这是统计学显著性的。也就是说，已确认预后群I具有最佳预后，并且预后群III具有最差的预后。也就是说，即使Cox比例风险模型根据风险因子(例如，年龄、性别、TNM分期和抗癌治疗与否)进行调整，仍可以看出根据该算法的预后群的分类是胃癌中的独立预后因子。

因此，如临床试验的评价结果所示，认为成功地评价了从实施例1获得的胃癌患者的预后预测算法和nProfiler I胃癌测定医疗装置的临床性能。

工业适用性

本发明可用作用于确定治疗胃癌患者的方法的补充信息。

序列表

<110> 洛博生物科技有限公司

<120> 预测进展期胃癌患者的术后预后或抗癌药物适合性的系统

<130> G18C30C0226P/CN

<150> KR 10-2017-0032027

<151> 2017-03-14

<160> 27

<170> PatentIn version 3.2

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> SFRP4 forward primer

<400> 1

ggagacttcc gacttcctta ca 22

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> SFRP4 reverse primer

<400> 2

tggccttaca taggctgtcc 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> GZMB forward primer

<400> 3

cggtggcttc ctgatacaag 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> GZMB reverse primer

<400> 4

ttatggagct tccccaacag 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> WARS forward primer

<400> 5

ttgtggaccc atggacagta 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> WARS reverse primer

<400> 6

ccaaaccgaa caatgagctt 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CDX1 forward primer

<400> 7

agggaggaac gtggtcaact 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CDX1 reverse primer

<400> 8

tatgatgggg gcaggtagaa 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ACTB forward primer

<400> 9

tcaccctgaa gtaccccatc 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ACTB reverse primer

<400> 10

tgtggtgcca gattttctcc 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ATP5E forward primer

<400> 11

atggtggcct actggagaca 20

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ATP5E reverse primer

<400> 12

ctctcactgc ttttgcacag a 21

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> HPRT1 forward primer

<400> 13

tggtcaggca gtataatcca a 21

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> HPRT1 reverse primer

<400> 14

cttcgtgggg tccttttcac 20

<210> 15

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> GPX1 forward primer

<400> 15

cccgtgcaac cagtttgg 18

<210> 16

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> GPX1 reverse primer

<400> 16

ggacgtactt gagggaattc aga 23

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> UBB forward primer

<400> 17

tgggtgagct tgtttgtgtc 20

<210> 18

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> UBB reverse primer

<400> 18

tttgacctgt tagcggatac c 21

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> SFRP4 probe

<400> 19

aggcaatgcc cagcctcatc 20

<210> 20

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> GZMB probe

<400> 20

cgacttcgtg ctgacagctg c 21

<210> 21

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> WARS probe

<400> 21

tgccttttgc actgcttgtc tg 22

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CDX1 probe

<400> 22

tgcctcttcc tgcagcctca 20

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ACTB probe

<400> 23

cggcatcgtc accaactggg 20

<210> 24

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ATP5E probe

<400> 24

tggactcagc tacatccgat actccca 27

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<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> HPRT1 probe

<400> 25

tgcaagcttg cgaccttgac c 21

<210> 26

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> GPX1 probe

<400> 26

ctcttcgttc ttggcgttct cctgatg 27

<210> 27

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> UBB probe

<400> 27

caccaaccac gtccacccac 20

Claims

1.一种预测II期和III期胃癌的预后或抗癌药物适合性的组合物，所述组合物包含：

用于测量预后或抗癌药物适合性相关标志物基因群的mRNA表达水平的试剂，所述标志物基因群包括WARS、GZMB、CDX1和SFRP4；和

用于测量参照基因群的mRNA表达水平的试剂，所述参照基因群包括ACTB、ATP5E、GPX1、UBB和HPRT1。

2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，用于测量预后或抗癌药物适合性相关标志物基因群或参照基因群的mRNA表达水平的试剂包括序列与所述mRNA互补的寡核苷酸。

3.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，用于测量预后或抗癌药物适合性相关标志物基因组或参照基因群的mRNA表达水平的试剂包括SEQ ID NO:1至18中所示的引物组；或SEQ ID NO:19至27中所示的探针。

4.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物用于在总体存活率或无病存活率方面预测II期和III期胃癌患者的预后或抗癌药物适合性的概率。

5.一种预测II期和III期胃癌的预后或抗癌药物适合性的试剂盒，所述试剂盒包括：

权利要求1所述的组合物。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒是逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)试剂盒或DNA芯片试剂盒。

7.一种提供预测II期和III期胃癌预后的信息的方法，所述方法包括：

倘若在生物样品中GZMB和WARS的至少一个ΔCq值低于预先确定的参考GZMB或WARS的最终阈值时，当生物样品中SFRP4的ΔCq值低于预先确定的参考SFRP4的最终阈值时，将组分类为预后中等组(预后群II)，当SFRP4的ΔCq值高于预先确定的参考SFRP4的最终阈值时，将组分类为预后不良组(预后群III)，

通过获得来自II期和III期胃癌的肿瘤组织样品的包括WARS、GZMB、CDX1和SFRP4的预后或抗癌药物适合性相关标志物基因的ΔCq值、使用该ΔCq值计算每种基因的自适应回归值、以及将每种基因的校正值与自适应回归值相加，来计算最终阈值，WARS、GZMB、CDX1和SFRP4的自适应回归值分别为-2.54、-5.58、-3.59和-4.53，并且其校正值分别为+0.4、+0.4、+0.9和+0.9，

[等式1]

其中，参照基因群的Cq值是指包括ACTB、ATP5E、GPX1、UBB和HPRT1的参照基因的平均Cq值。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述生物样品选自新鲜肿瘤组织、新鲜冷冻肿瘤组织、石蜡包埋的肿瘤组织、细针抽吸液、腹水、管清洗液或胸膜液。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，通过RT-PCR、竞争性RT-PCR、实时RT-PCR、核糖核酸酶保护分析、Northern印迹或DNA芯片进行预后或抗癌药物适合性相关标志物基因群和参照基因群的mRNA表达水平的测量。

10.一种提供预测II期和III期胃癌的抗癌药物适合性的信息的方法，该方法包括：

[等式1]

11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述生物样品选自新鲜肿瘤组织、新鲜冷冻肿瘤组织、石蜡包埋的肿瘤组织、细针抽吸液、腹水、管清洗液或胸膜液。

12.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，通过RT-PCR、竞争性RT-PCR、实时RT-PCR、核糖核酸酶保护分析、Northern印迹或DNA芯片进行预后或抗癌药物适合性相关标志物基因群和参照基因群的mRNA表达水平的测量。