BR112019019022A2 - sistema para a previsão de prognósticos e benefícios da quimioterapia adjuvante para pacientes com câncer gástrico em estágios ii e iii - Google Patents
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Abstract
a presente invenção se refere a um sistema para a previsão de prognósticos e benefícios a partir da quimioterapia adjuvante para pacientes com câncer gástrico em estágios ii e iii, e um algoritmo que pode prever prognósticos e a capacidade de resposta à quimioterapia usando resultados da análise quantitativa dos níveis de expressão do mrna de um prognóstico ou um grupo do gene marcador relacionado à capacidade de resposta à quimioterapia e um grupo do gene de referência no câncer gástrico avançado é desenvolvido e pode ser usado como informações suplementar para determinar um método para o tratamento de um paciente com câncer gástrico.
Description
SISTEMA PARA A PREVISÃO DE PROGNÓSTICOS E BENEFÍCIOS DA QUIMIOTERAPIA ADJUVANTE PARA PACIENTES COM CÂNCER GÁSTRICO EM ESTÁGIOS II E III
Campo técnico [1] A presente invenção se refere a um sistema para a previsão de prognósticos e benefícios a partir da quimioterapia adjuvante para pacientes com câncer gástrico avançado usando valores da análise quantitativa da expressão do mRNA de prognósticos ou o grupo do gene marcador relacionado à capacidade de resposta à quimioterapia e um grupo do gene de referência em pacientes com câncer gástrico avançado.
Estado da técnica [2] Globalmente, o câncer gástrico é o terceiro maior câncer fatal dentre todos os tipos de câncer, e particularmente, o câncer mais comum exceto o câncer da tireoide, o qual apresenta prognósticos relativamente bons da Coréia. Na Coréia, a taxa de sobrevivência dos pacientes com câncer gástrico tem sido significativamente melhorada devido a detecção precoce pelos exames médicos nacionais, padronização cirúrgica e desenvolvimento da quimioterapia, porém, apesar do tratamento atualmente padronizado, pelo menos uma metade dos pacientes com câncer gástrico avançado de estágio II e III ainda experimentam recorrência.
[3] 0 câncer tem sido reconhecido como uma doença genética e tem havido um esforço para classificar o câncer de acordo com as suas características moleculares e biológicas, e não de acordo com os fenótipos anatômicos e patológicos existentes, de acordo com o desenvolvimento de técnicas de testes genéticos, tal como o Sequenciamento de
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Nova Geração (do inglês Next Generation Sequencing - NGS). Foi recentemente reportado que o câncer gástrico é amplamente classificado em quatro tipos de acordo com diversas características moleculares no projeto Atlas do genoma do câncer (TCGA). Isto significa que, embora o câncer esteja anatomicamente no mesmo estágio, prognósticos e um grau de resposta à quimioterapia podem variar dependendo das suas características moleculares e biológicas.
[4] De acordo com o resultado recentemente reportado do projeto TCGA para 295 pacientes com câncer gástrico, o câncer gástrico é dividido em quatro tipos incluindo (Ϊ) câncer gástrico positivo para o vírus EpsteinBarr (EBV), @ câncer gástrico com alta instabilidade de microssatélite (MSI-H), @ câncer gástrico com instabilidade cromossômica (CIN) e (Ϊ) câncer gástrico genomicamente estável (GS). De acordo com tais sequenciamentos massivos de genoma de câncer, pode ser conhecido que o câncer gástrico é classificado em subgrupos moleculares geneticamente diferentes, e não um único tipo de câncer. Sendo assim, isso mostra que, para o tratamento personalizado do câncer gástrico, genes alvo precisam ser desenvolvidos e aplicados de acordo com os subgrupos com base nas características genéticas moleculares e patológicas. Em adição, no estudo do câncer gástrico, o resultado no qual os prognósticos podem ser classificados de acordo com os subtipos de câncer gástrico foram reportados.
[5] Se os prognósticos do paciente podem ser previstos após a quimioterapia seguida de uma cirurgia de
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3/76 câncer gástrico, serão os materiais probatórios para o estabelecimento de uma estratégia terapêutica adequada de acordo com cada prognóstico. Nas atuais práticas de tratamento padronizado, o tratamento com quimioterapia adjuvante após a cirurgia tem sido usado para todos os pacientes com câncer gástrico avançado em estágio II e III. Esta terapia pode ser sub-tratada em grupos apresentando um prognóstico ruim. Isto é, isso pode apresentar um significado clinico que pode desenvolver uma estratégia
| para métodos | terapêuticos | adicionais, | além | do tratamento |
| padrão atual, | em relação | a pacientes | com | um prognóstico |
| ruim. | ||||
| [6] Em | adição, uma vez que | os | pacientes são |
divididos em um grupo responsivo à quimioterapia (Conjunto preditivo S) e um grupo não responsivo à quimioterapia (Conjunto preditivo R), dados probatórios detalhados para o estabelecimento de uma estratégia terapêutica do paciente podem ser fornecidos fornecendo informações dos métodos terapêuticos existentes em conexão com as informações prognosticas. Isto é, o tratamento exagerado, usando continuamente uma quimioterapia convencional, pode ser evitado para um grupo não responsivo à quimioterapia (Conjunto preditivo R) e um grupo de bom prognóstico (Conjunto de Prognóstico I), o uso de um método terapêutico convencional pode ser estimulado para um grupo responsivo à quimioterapia (Conjunto preditivo S), e a classificação que pode induzir o desenvolvimento ativo de um novo método terapêutico é possível para um grupo não responsivo à quimioterapia (Conjunto preditivo R) e um grupo de prognóstico ruim (Conjunto de Prognóstico III).
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4/76 [7] Desde 2010, foi descoberto que, nos casos de câncer gástrico avançado em estágio II e III, quimioterapia adjuvante seguida de gastrectomia D2 padronizada aumenta a taxa de sobrevivência de um paciente com câncer gástrico e é, atualmente, uma terapia padrão. Tradicionalmente, o câncer gástrico é classificado de acordo com fenótipos anatômicos e patológicos e, quando o câncer gástrico é determinado como de estágio 2 ou maior de acordo com a classificação TNM, o tratamento quimioterápico é usado, porém, além do estágio TNM, não há um método para a previsão de prognósticos de acordo com o tratamento quimioterápico.
Descrição
Problema técnico [8] Um objeto da presente invenção fornece uma composição para a previsão de prognósticos de câncer gástrico avançado ou da capacidade de resposta à quimioterapia usando valores de análise para um grupo de gene marcador a qual é capaz de prever prognósticos pós operatórios ou da capacidade de resposta à quimioterapia em pacientes com câncer gástrico avançado (estágio II estágio III: com base em AJCC, 6a edição) e um grupo do gene de referência.
[9] Outro objeto da presente invenção fornece um método para fornecer informações para a previsão de prognósticos ou da capacidade de resposta à quimioterapia em termos de taxa de sobrevivência de um paciente usando valores de análise para um grupo de gene marcador o qual é capaz de prever prognósticos pós operatórios ou da capacidade de resposta à quimioterapia em pacientes com
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5/76 câncer gástrico avançado e um grupo do gene de referência.
Solução técnica [10] Para alcançar os objetivos, a presente invenção fornece uma composição para a previsão de prognósticos ou da capacidade de resposta à quimioterapia de câncer gástrico em estágios II e III, a qual inclui:
[11] um agente para a medição do nível de expressão
| do mRNA | em um prognóstico | ou | o grupo | do | gene marcador | |
| relacionado à capacidade | de | resposta | à | quimioterapia | ||
| incluindo | WARS, GZMB, CDX1 e | SFRP4; e | ||||
| [12] | um agente para | a | medição | de | um | nível de |
| expressão | de mRNA em um | grupo do gene | de | referência | ||
| incluindo | ACTB, ATP5E, GPX1, | UBB | e HPRT1. |
[13] A presente invenção também fornece um kit para a previsão de prognósticos ou da capacidade de resposta à quimioterapia de câncer gástrico em estágios II e III, o kit incluindo a composição para a previsão de prognósticos ou da capacidade de resposta à quimioterapia de câncer gástrico em estágios II e III.
[14] A presente invenção ainda fornece um método para fornecer informações para a previsão de prognósticos de câncer gástrico em estágios II e III, o método incluindo:
[15] medição dos níveis de expressão do mRNA de um prognóstico ou o grupo do gene marcador relacionado à capacidade de resposta à quimioterapia, incluindo WARS, GZMB, CDX1 e SFRP4, e um grupo do gene de referência incluindo ACTB, ATP5E, GPX1, UBB e HPRT1 a partir de uma amostra biológica obtida a partir de um tumor de câncer gástrico em estágios II e III, e o cálculo dos valores ACq
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6/76 de prognósticos ou genes marcadores relacionados à capacidade de resposta à quimioterapia de acordo com a Equação 1 abaixo; e [16] em comparação com os valores limites finais de prognósticos de referência pré-determinados ou genes marcadores relacionados à capacidade de resposta à quimioterapia, [17] classificação de um grupo como um grupo de bom prognóstico (Conjunto de Prognóstico I) quando os valores ACq de GZMB e WARS na amostra biológica são superiores aos valores limites finais pré determinados de GZMB e WARS de referência, e [18] desde que pelo menos um valor ACq de GZMB e WARS na amostra biológica seja inferior ao valor limite final pré determinado de GZMB ou WARS de referência, a classificação de um grupo como um grupo de prognóstico intermediário (Conjunto de Prognóstico II) quando o valor ACq de SFRP4 na amostra biológica é inferior ao valor limite final pré determinado do SFRP4 de referência, e um grupo como um grupo de prognóstico ruim (Conjunto de Prognóstico III) quando o valor ACq de SFRP4 na amostra biológica é superior ao valor limite final pré determinado do SFRP4 de referência, [19] em que os valores limites finais dos prognósticos de referência pré-determinados ou genes marcadores relacionados à capacidade de resposta à quimioterapia são -2.14, -5.18, -2.69 e -3.63 em relação a WARS, GZMB, CDX1 e SFRP4, respectivamente, e [20] o valor limite final é calculado pela obtenção de valores ACq de prognósticos ou genes marcadores
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Ί/Ί6 relacionados à capacidade de resposta à quimioterapia incluindo WARS, GZMB, CDX1 e SFRP4 a partir de amostras de tecido tumoral de câncer gástrico em estágios II e III, calculando um valor de regressão adaptativo por gene usando o valor ACq e adicionando um valor de correção por gene para o valor de regressão adaptativo, os valores de regressão adaptativo de WARS, GZMB, CDX1 e SFRP4 are -2.54, -5.58, -3.59 e -4.53, respectivamente, e os valores de correção dos mesmos são +0.4, +0.4, +0.9 e +0.9, respectivamente.
[Equação 1]
ACq = (valor Cq de grupo do gene de referência) - (valor Cq de prognósticos ou gene marcador relacionado à capacidade de resposta à quimioterapia) [21] Aqui, o valor Cq do grupo do gene de referência se refere a um valor Cq médio dos genes de referência incluindo ACTB, ATP5E, GPX1, UBB e HPRT1.
[22] A presente invenção também fornece um método para fornecer informações para prever a capacidade de resposta à quimioterapia em câncer gástrico em estágios II e III, o método incluindo:
[23] Medição de níveis de expressão do mRNA de um prognóstico ou gene marcador relacionado à capacidade de resposta à quimioterapia incluindo WARS, GZMB, CDX1 e SFRP4 e um grupo do gene de referência incluindo ACTB, ATP5E, GPX1, UBB e HPRT1 em uma amostra biológica obtida a partir de um tumor de câncer gástrico em estágios II e III, e calculando os valores ACq de prognósticos ou genes marcadores relacionados à capacidade de resposta à quimioterapia de acordo com a Equação 1 abaixo; e
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8/76 [24] em comparação com os valores limites finais de prognósticos de referência pré-determinados ou genes marcadores relacionados à capacidade de resposta à quimioterapia, [25] classificação de um grupo como um grupo não responsivo à quimioterapia (Conjunto preditivo R) quando os valores ACq de GZMB e WARS na amostra biológica são superiores aos valores limites finais pré determinados de GZMB e WARS de referência, e [26] desde que pelo menos um valor ACq de GZMB e WARS na amostra biológica é inferior ao valor limite final pré determinado de GZMB ou WARS de referência, a classificação de um grupo como um grupo não responsivo à quimioterapia (Conjunto preditivo R) quando o valor ACq de CDX1 na amostra biológica é inferior ao valor limite final pré determinado de WARS de referência, e um grupo como um grupo responsivo à quimioterapia (Conjunto preditivo S) quando o valor ACq de CDX1 na amostra biológica é superior ao valor limite final pré determinado de WARS de referência [27] em que os valores limites finais de prognósticos de referência pré-determinados ou genes marcadores relacionados à capacidade de resposta à quimioterapia, são -2.14, -5.18, -2.69 e -3.63 em relação a WARS, GZMB, CDX1 e SFRP4, respectivamente, e [28] o valor limite final é calculado pela obtenção de valores ACq de prognósticos ou genes marcadores relacionados à capacidade de resposta à quimioterapia incluindo WARS, GZMB, CDX1 e SFRP4 a partir de amostras de tecido tumoral de câncer gástrico em estágios II e III, calculando um valor de regressão adaptativo por gene usando
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9/76 o valor ACq e adicionando de um valor de correção por gene para o valor de regressão adaptativo, os valores de regressão adaptativo de WARS, GZMB, CDX1 e SFRP4 são -2.54, -5.58, -3.59 e -4.53, respectivamente, e os valores de correção dos mesmos são +0.4, +0.4, +0.9 e +0.9, respectivamente .
[Equação 1 ]
ACq = (valor Cq do grupo do gene de referência) - (valor Cq dos prognósticos ou gene marcador relacionado à capacidade de resposta à quimioterapia) [29] Aqui, o valor Cq do grupo do gene de referência se refere a um valor Cq médio dos genes de referência incluindo ACTB, ATP5E, GPX1, UBB e HPRT1.
Efeitos vantajosos [30] Na presente invenção, um algoritmo que pode prever prognósticos e a capacidade de resposta à quimioterapia usando resultados da análise quantitativa dos níveis de expressão do mRNA de um prognóstico ou gene marcador relacionado à capacidade de resposta à quimioterapia e um grupo do gene de referência no câncer gástrico avançado em termos de taxa de sobrevivências tal como uma taxa de sobrevivência total e uma taxa de sobrevivência livre de doença é desenvolvido e pode ser usado como informações suplementar para determinar um método para o tratamento de um paciente com câncer gástrico.
Descrição das Figuras [31] A FIG. 1 mostra o resultado da confirmação de um nível de expressão de um gene alvo em uma amostra embebida em parafina para selecionar um gene de referência.
[32] A FIG. 2 mostra os valores ACq que representam
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10/76 o valor de regressão adaptativo de prognósticos e genes marcadores relacionados a previsão da quimioterapia, para os quais os valores de correção +0.4, +0.4, +0.9 e +0.9 de WARS, GZMB, CDX1 e SFRP4 são adicionados, respectivamente, para determinar os valores limites finais.
| [33] | A FIG. 3 mostra | um resultado | que ilustra | um | ||
| grupo de | bom | prognóstico | (Conjunto | de | Prognóstico | I) |
| classificado a | partir de um | eixo imune | no primeiro grupo | de | ||
| um sistema | de | dois grupos com base em | um | sinal binário | da |
presente invenção.
[34] A FIG. 4 mostra um resultado que ilustra um grupo não responsivo à quimioterapia (Conjunto preditivo R) classificado a partir de um eixo imune no primeiro grupo de um sistema de dois grupos com base em um sinal binário da presente invenção.
[35] A FIG. 5 mostra um resultado que ilustra os grupos de prognóstico intermediário e ruim (Conjunto de Prognóstico II & III) classificados a partir de um eixo tipo tronco no segundo grupo de um sistema de dois grupos com base em um sinal binário da presente invenção.
[36] A FIG. 6 mostra um resultado que ilustra um grupo responsivo a quimioterapia e um grupo não responsivo à quimioterapia (Conjunto preditivo S & R), os quais são classificados a partir de um eixo epitelial no segundo grupo de um sistema de dois grupos com base em um sinal binário da presente invenção.
[37] A FIG. 7 é um diagrama esquemático de um sistema de dois grupos com base em um sinal binário, o qual é um método de classificação para os grupos prognósticos (Conjunto de Prognóstico I, II, III) e os grupos
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11/76 relacionados a capacidade de resposta à quimioterapia (Conjunto preditivo R & S) da presente invenção.
[38] A FIG. 8 mostra (a) curvas Kaplan-Meir e (b) os resultados do teste logaritmico de classificação para as taxas de sobrevivência total em 5 anos nos grupos prognósticos de acordo com um algoritmo que pode prever prognósticos e a capacidade de resposta à quimioterapia de câncer gástrico avançado da presente invenção.
[39] A FIG. 9 mostra (a) curvas Kaplan-Meir e (b) resultados do teste logaritmico de classificação para as taxas de sobrevivência total livre de doenças em 5 anos nos grupos prognósticos de acordo com o algoritmo que pode prever prognósticos e a capacidade de resposta à quimioterapia de câncer gástrico avançado da presente invenção.
[40] A FIG. 10 mostra (a) p valores obtidos a partir das curvas Kaplan-Meier e teste logaritmico de classificação para taxas de sobrevivência total em 5 anos e (b) p valores obtidos a partir das curvas Kaplan-Meier e teste logaritmico de classificação para taxas de sobrevivência total livre de doenças em 5 anos, em pacientes com câncer gástrico, os quais receberam quimioterapia (CTX), não receberam quimioterapia (somente cirurgia), após serem submetidos a uma gastrectomia.
[41] A FIG. 11 mostra os p valores obtidos a partir de curvas Kaplan-Meier e teste logaritmico de classificação para taxas de sobrevivência total em 5 anos em pacientes com câncer gástrico, os quais receberam quimioterapia (CTX) não receberam quimioterapia (somente cirurgia), após serem submetidos a uma gastrectomia de um grupo responsivo à
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12/76 quimioterapia (Conjunto preditivo S), de acordo com o algoritmo que pode prever a probabilidade de resposta à quimioterapia do câncer gástrico avançado da presente invenção.
[42] A FIG. 12 mostra p valores obtidos a partir de curvas Kaplan-Meier e teste logaritmico de classificação para taxas de sobrevivência total livre de doenças em 5 anos em pacientes com câncer gástrico, os quais receberam quimioterapia (CTX), não receberam quimioterapia (somente cirurgia), após serem submetidos a uma gastrectomia de um grupo responsivo à quimioterapia (Conjunto preditivo S) de acordo com o algoritmo que pode prever a probabilidade de resposta à quimioterapia de câncer gástrico avançado da presente invenção.
[43] A FIG. 13 mostra p valores obtidos a partir de curvas Kaplan-Meier e teste logaritmico de classificação para taxas de sobrevivência total em 5 anos em pacientes com câncer gástrico, os quais receberam quimioterapia (CTX) não receberam quimioterapia (somente cirurgia), após serem submetidos a uma gastrectomia de um grupo não responsivo à quimioterapia (Conjunto preditivo R) de acordo com o algoritmo que pode prever a probabilidade de resposta à quimioterapia de câncer gástrico avançado da presente invenção.
[44] A FIG. 14 mostra p valores obtidos a partir de curvas Kaplan-Meier e teste logaritmico de classificação para taxas de sobrevivência total livre de doenças em 5 anos em pacientes com câncer gástrico, os quais receberam quimioterapia (CTX), não receberam quimioterapia (somente cirurgia), após serem submetidos a uma gastrectomia de um
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13/76 grupo não responsivo à quimioterapia (Conjunto preditivo R) de acordo com o algoritmo que pode prever a probabilidade de resposta à quimioterapia de câncer gástrico avançado da presente invenção.
[45] A FIG. 15 mostra p valores obtidos a partir de curvas Kaplan-Meier e teste logaritmico de classificação para taxas de sobrevivência total em 5 anos em um grupo de pacientes que receberam tratamento quimioterápico (CTX) com Xeloda + oxaliplatins (XELOX) e um grupo somente para observação (somente cirurgia) em uma amostra de ensaio clínico CLASSIC.
[46] A FIG. 16 mostra (a) curvas Kaplan-Meir e (b) resultados do teste logaritmico de classificação para taxas de sobrevivência total em 5 anos em um grupo de classificação de prognósticos em à amostra de ensaio clínico CLASSIC de acordo com o algoritmo que pode prever prognósticos e a capacidade de resposta à quimioterapia de câncer gástrico avançado da presente invenção.
[47] A FIG. 17 mostra p valores obtidos a partir de curvas Kaplan-Meier e teste logaritmico de classificação para taxas de sobrevivência total livre de doenças em 5 anos em um grupo de pacientes que receberam tratamento quimioterápico (CTX) com Xeloda + oxaliplatins (XELOX) e um grupo somente para observação (somente cirurgia) em uma amostra de ensaio clínico CLASSIC.
[48] A FIG. 18 mostra (a) curvas Kaplan-Meir e (b) resultados do teste logaritmico de classificação para taxas de sobrevivência total livre de doenças em 5 anos nos grupos de classificação de prognósticos em relação à amostra de ensaio clínico CLASSIC de acordo com o algoritmo
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14/76 que pode prever prognósticos e a capacidade de resposta à quimioterapia de câncer gástrico avançado da presente invenção.
[49] A FIG. 19 mostra (a) curvas Kaplan-Meir e (b) resultados do teste logaritmico de classificação para taxas de sobrevivência total em 5 anos em um grupo de pacientes que receberam tratamento quimioterápico (CTX) com Xeloda + oxaliplatina (XELOX) e um grupo somente para observação (somente cirurgia) em uma amostra de ensaio clínico CLASSIC de acordo com o algoritmo que pode prever a probabilidade de resposta à quimioterapia de câncer gástrico avançado da presente invenção.
[50] A FIG. 20 shows p valores obtidos a partir de curvas Kaplan-Meier e teste logaritmico de classificação para taxas de sobrevivência total livre de doenças em 5 anos em um grupo de pacientes que receberam tratamento quimioterápico (CTX) com Xeloda + oxaliplatina (XELOX) e um grupo somente para observação (somente cirurgia) em relação à amostra de ensaio clínico CLASSIC de acordo com o algoritmo que pode prever a probabilidade de resposta à quimioterapia de câncer gástrico avançado da presente invenção.
[51] A FIG. 21 mostra p valores obtidos a partir de curvas Kaplan-Meier e teste logaritmico de classificação para taxas de sobrevivência total em 5 anos em um grupo de pacientes que receberam tratamento quimioterápico (CTX) com Xeloda + oxaliplatina (XELOX) e um grupo somente para observação (somente cirurgia) em um grupo não responsivo à quimioterapia XELOX (Conjunto preditivo R) de uma amostra de ensaio clínico CLASSIC de acordo com o algoritmo que
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15/76 pode prever a probabilidade de resposta à quimioterapia de câncer gástrico avançado da presente invenção.
[52] A FIG. 22 mostra p valores obtidos a partir de curvas Kaplan-Meier e teste logaritmico de classificação para taxas de sobrevivência total livre de doenças em 5 anos em um grupo de pacientes que receberam tratamento quimioterápico (CTX) com Xeloda + oxaliplatina (XELOX) e um grupo somente para observação (somente cirurgia) em um grupo não responsivo à quimioterapia XELOX (Conjunto preditivo R) de uma amostra de ensaio clínico CLASSIC de acordo com o algoritmo que pode prever a probabilidade de resposta à quimioterapia de câncer gástrico avançado da presente invenção.
[53] A FIG. 23 mostra curvas Kaplan-Meier para uma taxa de sobrevivência total em 5 anos em um grupo prognóstico na avaliação do desempenho clínico de um algoritmo que prevê os prognósticos de câncer gástrico avançado da presente invenção.
Modalidades da invenção [54] Aqui em seguida, a configuração da presente invenção será descrita em detalhes.
[55] A presente invenção se refere a uma composição para a previsão de prognósticos ou da capacidade de resposta à quimioterapia de câncer gástrico em estágios II e III, a composição incluindo:
| [56] | um | agente para | a medição | de | um | nível | de |
| expressão | de | mRNA em um | prognóstico | ou | gene | marcador | |
| relacionado à | capacidade | de resposta | à | quimioterapia | |||
| incluindo | WARS, | , GZMB, CDX1 e | SFRP4; e | ||||
| [57] | um | agente para | a medição | de | um | nível | de |
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16/76 expressão de mRNA em um grupo do gene de referência incluindo ACTB, ATP5E, GPX1, UBB e HPRT1.
[58] A composição para a previsão de prognósticos ou da capacidade de resposta à quimioterapia de câncer gástrico em estágios II e III da presente invenção pode ser usada para prever prognósticos e a capacidade de resposta à quimioterapia em pacientes com câncer gástrico avançado em termos da taxa de sobrevivência.
[59] 0 termo câncer gástrico avançado aqui utilizado se refere a câncer gástrico em estágio II ou III com base em AJCC, 6a edição.
[60] O termo prognósticos ou gene marcador relacionado à capacidade de resposta à quimioterapia aqui utilizado se refere a um marcador que pode distinguir entre condições normais e patológicas, prever uma taxa de sobrevivência em 5 anos após o tratamento, ou objetivamente medir a previsão da resposta ao tratamento. Na presente invenção, o gene marcador é um gene que pode ser usado para prever prognósticos e a capacidade de resposta à quimioterapia de câncer gástrico avançado, e um gene que apresenta um nível de expressão de mRNA diferencial o qual é aumentado ou diminuído de acordo com prognósticos ou da capacidade de resposta à quimioterapia. De acordo com um exemplo de modalidade da presente invenção, um total de quatro genes marcadores para o câncer gástrico apresentando heterogeneidade são selecionados, em que os genes marcadores são, por exemplo, genes marcadores (WARS e GZMB) que podem representar um módulo imune e genes marcadores (SFRP4 e CDX1) que podem representar um módulo tipo tronco & um módulo tipo epitelial, os quais são estavelmente
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17/76 medidos garantindo significância estatística em dados de micro ensaios e dados de RT-qPCR de tecido fresco congelado e dados de RT-qPCR de um amostra de amostra embebida em parafina.
[61] 0 termo gene de referência aqui utilizado se refere a um gene o qual está sempre estavelmente expresso. Isto é, tal como um gene regularmente expresso em qualquer tecido, o gene de referência é usado para examinar um nível de expressão de um gene marcador em comparação com seu nível de expressão. Isto é, uma vez que existe uma diferença qualitativa entre amostras e uma variação dependendo de uma organização no armazenamento, mesmo se o nível de expressão de gene é medido, é difícil determinar que o valor medido é uma variação biológica. Sendo assim, um nível de expressão (ACq) de gene entre amostras é determinado por normalização. Como métodos de normalização convencionais, um método usando um quantil, um método de normalização global e um método usando um gene de referência podem ser usados, porém, na presente invenção, a normalização usando um gene de referência é usada. Em adição, o método utilizando um único gene como um gene de referência pode ter sua precisão diminuída e, logo, diversos genes podem ser selecionados e um grau de variação pode ser investigado de modo a selecionar um gene de referência adequado para as características do tecido. Na presente invenção, um gene que é descrito na literatura associado ao câncer gástrico ou utilizado em um produto comercializado convencional é selecionado e o gene selecionado é testado se é adequado ou não como um objeto, e, então, é usado como um gene de referência. De acordo com
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18/76 um exemplo de modalidade da presente invenção, 21 genes de referência descritos na literatura são comparados ao tecido do câncer de esôfago, pancreático, gástrico ou de cólon e ao tecido normal, e dentre eles, um gene com a menor variação é selecionado como um gene de referência por qPCR. Subsequentemente, os genes de referências usados em produtos comercializados, ACTB, ATP5E, HPRT1, PGK1, GPX1, RPL29, UBB e VDAC2 são selecionados e submetidos ao qPCR, e por fim, os genes de referências usados para prever a probabilidade de prognósticos ou resposta à quimioterapia do câncer gástrico avançado da presente invenção, um grupo de genes ACTB, ATP5E, GPX1, UBB e HPRT1 é usado.
[62] 0 termo medida de um nível de expressão de mRNA aqui utilizado se refere a medida de um nível de mRNA por um processo de confirmação da expressão do mRNA de prognósticos ou genes marcadores relacionados à capacidade de resposta à quimioterapia ou genes de referência em uma amostra biológica para prever a probabilidade de prognósticos ou resposta à quimioterapia de câncer gástrico avançado. Métodos para a análise da expressão do mRNA incluem transcrição reversa seguida da reação em cadeia de polimerase (RT-PCR), RT-PCR competitiva, RT-PCR em tempo real, ensaio de proteção da RNase (RPA), Northern blotting, e um chip de DNA, porém a presente invenção não está limitada a estes.
[63] Na composição de acordo com a presente invenção o agente para a medição dos níveis de expressão do mRNA dos prognósticos ou dos genes marcadores relacionados a capacidade de resposta à quimioterapia e os genes de referência incluem um iniciador, sonda ou nucleotídeo
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19/76 antisense que se liga especificamente ao mRNA dos prognósticos ou genes marcadores relacionados à capacidade de resposta à quimioterapia e os genes de referência. Uma vez que a informações acerca dos prognósticos ou genes marcadores relacionados à capacidade de resposta à quimioterapia e os genes de referência é conhecida para o GenBank, UniProt, etc., com base nesta informações, um iniciador, sonda ou nucleotideo antisense que se liga especificamente ao mRNA de um gene pode ser facilmente projetado por um técnico no assunto.
[64] 0 termo iniciador aqui utilizado é um fragmento que reconhece uma sequência de gene alvo, e um par de iniciadores que inclui um par de iniciadores forward e reverse, porém, preferencialmente, é um par de iniciadores que fornece um resultado da análise apresentando especificidade e sensibilidade. Uma vez que a sequência de ácido nucleico de um iniciador é uma sequência que é inconsistente com uma sequência não alvo presente em uma amostra, quando o iniciador é um que apenas amplifica uma sequência de gene alvo contendo um sítio de ligação do iniciador complementar e não causa amplificação não específica, a alta especificidade pode ser transmitida. De acordo com um exemplo de modalidade da presente invenção, um conjunto de iniciadores tal como definido nas SEQ ID NOs: 1 a 18 pode ser usado. Mais especificamente, o SFRP4 pode ser detectado usando um conjunto de iniciadores tal como definido nas SEQ ID NOs: 1 e 2 com referência a NM_003014.2 1298-1361, o GZMB pode ser detectado usando conjunto de iniciadores tal como definido nas SEQ ID NOs: 3 e 4 com referência a NM_004131.3 213-277, o WARS pode ser
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20/76 detectado usando um conjunto de iniciadores tal como definido nas SEQ ID NOs: 5 e 6 com referência a NM_173701.1 408-480, o CDX1 pode ser detectado usando um conjunto de iniciadores tal como definido nas SEQ ID NOs: 7 e 8 com referência a NM_001804.2 1319-1385, o ACTB pode ser detectado usando um conjunto de iniciadores tal como definido nas SEQ ID NOs: 9 e 10 com referência a NM_001101 278-349, ο ATP5E pode ser detectado usando um conjunto de iniciadores tal como definido nas SEQ ID NOs: 11 e 12 com referência a NM_006886 117-189, o HPRT1 pode ser detectado usando um conjunto de iniciadores tal como definido nas SEQ ID NOs: 13 e 14 com referência a NM_000194.1 531-597, o GPX1 pode ser detectado usando um conjunto de iniciadores tal como definido nas SEQ ID NOs: 15 e 16 com referência a NM_000581.2 308-378 e o UBB pode ser detectado usando um conjunto de iniciadores tal como definido nas SEQ ID NOs: 17 e 18 com referência a NM_018955.2 61-138.
[65] O termo sonda aqui utilizado se refere a um material que pode especificamente ligar-se a um material alvo para ser detectado em uma amostra para especificamente identificar a presença de um material alvo em uma amostra pela ligação. O tipo de sonda é um que é convencionalmente usado na técnica sem limitação e pode ser um ácido nucleico peptidico (PNA), a ácido nucleico bloqueado (LNA), um peptídeo, um polipeptídeo, uma proteína, RNA ou DNA. Mais especificamente, a sonda é um biomaterial, o qual pode ser derivado de um organismo, similar àquele ou produzido in vitro, por exemplo, uma enzima, uma proteína, um anticorpo, uma célula ou órgãos (organelas) de microrganismo, animal ou planta, neurônios, DNA, e RNA, DNA pode incluir cDNA,
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DNA genômico, um oligonucleotídeo , RNA inclui RNA genômico mRNA e um oligonucleotídeo, e uma proteína pode incluir um anticorpo, um antígeno, uma enzima e um peptídeo. De acordo com um exemplo de modalidade da presente invenção, sondas das SEQ ID NOs: 19 - 27 para a medida do qPCR podem ser usadas. Preferencialmente, as sondas podem ser marcadas com fluorescência.
[66] 0 termo antisense aqui utilizado se refere a um oligômero apresentando uma sequência de base de nucleotídeo e uma estrutura entre as subunidades, o oligômero hibridizado com uma sequência alvo no RNA pela formação de pares de base de Watson-Crick para tipicamente permitir a formação de um heterodímero RNA:oligômero com o mRNA na sequência alvo. 0 oligômero pode apresentar a complementaridade de sequência exata ou complementaridade aproximada de uma sequência alvo.
[67] 0 termo previsão de prognósticos ou da capacidade de resposta à quimioterapia aqui utilizado inclui a determinação de susceptibilidade de um indivíduo a uma doença ou distúrbio específico, prognósticos de um indivíduo com uma doença ou distúrbio específico (por exemplo, identificação da condição de câncer prémetastático ou metastático, determinação do estágio de câncer ou capacidade de resposta do câncer ao tratamento), ou therametrics (por exemplo, monitoramento da condição de um indivíduo para transmitir informações sobre a eficácia terapêutica). 0 objeto da presente invenção é para prever prognósticos e a capacidade de resposta à quimioterapia em pacientes com câncer gástrico após a cirurgia em termos de taxas de sobrevivência, tal como uma taxa de sobrevivência
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22/76 total e uma taxa de sobrevivência livre de doença.
[68] A composição para a previsão de prognósticos ou da capacidade de resposta à quimioterapia de câncer gástrico em estágios II e III de acordo com a presente invenção pode ainda incluir um carreador farmaceuticamente aceitável.
[69] 0 carreador farmaceuticamente aceitável inclui carreadores e veículos usados geralmente no campo farmacêutico e especificamente inclui resina de troca iônica, alumina, estearato de alumínio, lecitina, proteínas séricas (por exemplo, albumina sérica humana), materiais de tampão (por exemplo, todos os tipos de fosfatos, glicina, ácido sórbico, sorbato de potássio e uma mistura parcial de glicerídeos de ácidos graxos vegetais saturados), água, sais ou eletrólitos (por exemplo, sulfato de protamina, fosfato de hidrogênio dissódico, fosfato de hidrogênio de cálcio, cloreto de sódio e sal de zinco), silica coloidal, trissilicato de magnésio, polivinil pirrolidona, um substrato a base de celulose, polietileno glicol, carboximetil celulose de sódio, poliarilato, cera, polietileno glicol ou lanolina, porém a presente invenção não está limitada a estes.
[70] Em adição, a composição da presente invenção pode ainda incluir um lubrificante, um agente molhante, uma emulsão, um agente de suspensão ou preservante, bem como os componentes acima mencionados.
[71] A presente invenção também se refere a um kit para a previsão de prognósticos ou da capacidade de resposta à quimioterapia de câncer gástrico em estágios II e III, o kit incluindo a composição para a previsão de
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23/76 prognósticos ou da capacidade de resposta à quimioterapia de câncer gástrico em estágios II e III.
[72] Preferencialmente, o kit pode ser um kit de RTPCR ou um kit de chip de DNA.
[73] 0 kit para a previsão de prognósticos ou da capacidade de resposta à quimioterapia de câncer gástrico em estágios II e III pode ainda incluir uma composição, solução ou dispositivo incluindo um ou mais tipos de componentes, os quais são adequados para um método de análise. Preferencialmente, o kit de diagnóstico pode ainda incluir elementos essenciais para realizar RT-PCR. Um kit de RT-PCR inclui um par de iniciadores específico para genes que codificam proteínas marcadoras. Um iniciador é um nucleotídeo que apresenta uma sequência específica para a sequência de ácido nucleico de um gene e pode apresentar um comprimento de aproximadamente 7 a 50 bp e, mais preferencialmente, um comprimento de aproximadamente 10 a 30 bp. Em adição, o kit de RT-PCR pode ainda incluir um iniciador específico para a sequência de ácido nucleico de um gene controle. Além destes, o kit de RT-PCR pode incluir um tubo de teste ou recipiente adequado, soluções de tampão de reação (diversos pHs e concentrações de magnésio), desoxinucleotídeos (dNTPs) , enzimas tais como uma Taqpolimerase e uma transcriptase reversa, inibidores da DNase e RNase, água DEPC e água esterilizada.
[74] Em adição, o kit para a previsão de prognósticos ou da capacidade de resposta à quimioterapia de câncer gástrico em estágios II e III da presente invenção podem incluir elementos essenciais para realizar um método de chip de DNA. Um kit de chip de DNA pode
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24/76 incluir um substrato ao qual o cDNA ou oligonucleotideo, o qual corresponde a um gene ou fragmentos do mesmo, está ligado, e reagentes, agentes e enzimas para o preparo de sondas marcadas com fluorescência. Em adição, o substrato pode incluir cDNA ou um oligonucleotideo, o qual corresponde a um gene controle ou fragmentos do mesmo.
[75] A presente invenção também fornece um método para fornecer informações para prever prognósticos de câncer gástrico em estágios II e III, o método incluindo:
[76] a medição dos níveis de expressão do mRNA de um prognóstico ou gene marcador relacionado à capacidade de resposta à quimioterapia incluindo WARS, GZMB, CDX1 e SFRP4 e um grupo do gene de referência incluindo ACTB, ATP5E, GPX1, UBB e HPRT1 a partir de uma amostra biológica obtida a partir de um tumor de câncer gástrico em estágios II e III, e o cálculo dos valores ACq de prognósticos ou genes marcadores relacionados à capacidade de resposta à quimioterapia de acordo com a Equação 1 abaixo; e [77] em comparação com os valores limites finais da referência pré determinada, prognósticos ou genes marcadores relacionados à capacidade de resposta à quimioterapia, [78] a classificação de um grupo como um grupo de bom prognóstico (Conjunto de Prognóstico I) quando os valores ACq de GZMB e WARS na amostra biológica são superiores aos valores limites finais pré determinados de GZMB e WARS de referência, e [7 9] desde que pelo menos um valor ACq de GZMB e WARS na amostra biológica seja inferior ao valor limite final pré determinado de GZMB ou WARS de referência, a
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25/76 classificação de um grupo como um grupo de prognóstico intermediário (Conjunto de Prognóstico II) quando o valor ACq de SFRP4 na amostra biológica é inferior ao valor limite final pré determinado do SFRP4 de referência, e um grupo como um grupo de prognóstico ruim (Conjunto de Prognóstico III) quando o valor ACq de SFRP4 na amostra biológica é superior ao valor limite final pré determinado do SFRP4 de referência, [80] em que os valores limites finais dos prognósticos de referência pré-determinados ou genes marcadores relacionados à capacidade de resposta à quimioterapia, são -2.14, -5.18, -2.69 e -3.63 em relação a WARS, GZMB, CDX1 e SFRP4, respectivamente, e [81] o valor limite final é calculado pela obtenção de valores ACq de prognósticos ou genes marcadores relacionados à capacidade de resposta à quimioterapia incluindo WARS, GZMB, CDX1 e SFRP4 a partir de amostras de tecido tumoral de câncer gástrico em estágios II e III, calculando um valor de regressão adaptativo por gene usando os valores ACq e adicionando de um valor de correção por gene para o valor de regressão adaptativo, os valores de regressão adaptativo de WARS, GZMB, CDX1 e SFRP4 são -2.54, -5.58, -3.59 e -4.53, respectivamente, e os valores de correção dos mesmos são +0.4, +0.4, +0.9 e +0.9, respectivamente:
[Equação 1 ]
ACq = (valor Cq do grupo do gene de referência) - (valor Cq dos prognósticos ou gene marcador relacionado à capacidade de resposta à quimioterapia) [82] Aqui, o valor Cq do grupo do gene de referência
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26/76 se refere a um valor Cq médio dos genes de referência incluindo ACTB, ATP5E, GPX1, UBB e HPRT1.
[83] A presente invenção também fornece um método para fornecer informações para prever a capacidade de resposta à quimioterapia em câncer gástrico em estágios II e III, o método incluindo:
[84] a medição dos níveis de expressão do mRNA de um prognóstico ou gene marcador relacionado à capacidade de resposta à quimioterapia incluindo WARS, GZMB, CDX1 e SFRP4 e um grupo do gene de referência incluindo ACTB, ATP5E, GPX1, UBB e HPRT1 em uma amostra biológica obtida a partir de um tumor de câncer gástrico em estágios II e III, e o cálculo dos valores ACq de prognósticos ou genes marcadores relacionados à capacidade de resposta à quimioterapia de acordo com a Equação 1 abaixo; e [85] em comparação com os valores limites finais dos prognósticos de referência pré-determinados ou genes marcadores relacionados à capacidade de resposta à quimioterapia, [86] a classificação de um grupo como um grupo não responsivo à quimioterapia (Conjunto preditivo R) quando os valores ACq de GZMB e WARS na amostra biológica são superiores aos valores limites finais pré determinados de GZMB e WARS de referência, e [87] desde que pelo menos um valor ACq de GZMB e WARS na amostra biológica é inferior ao valor limite final pré determinado de GZMB ou WARS de referência, a classificação de um grupo como um grupo não responsivo à quimioterapia (Conjunto preditivo R) quando o valor ACq de CDX1 na amostra biológica é inferior ao valor limite final
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27/76 pré determinado de WARS de referência, e um grupo como um grupo responsivo à quimioterapia (Conjunto preditivo S) quando o valor ACq de CDX1 na amostra biológica é superior ao valor limite final pré determinado de WARS de referência [88] em que os valores limites finais dos prognósticos de referência pré-determinados ou genes marcadores relacionados à capacidade de resposta à quimioterapia, são -2.14, -5.18, -2.69 e -3.63 em relação a WARS, GZMB, CDX1 e SFRP4, respectivamente, e [89] o valor limite final é calculado pela obtenção de valores ACq de prognósticos ou genes marcadores relacionados à capacidade de resposta à quimioterapia incluindo WARS, GZMB, CDX1 e SFRP4 a partir de amostras de tecido tumoral de câncer gástrico em estágios II e III, calculando um valor de regressão adaptativo por gene usando os valores ACq e adicionando um valor de correção por gene para o valor de regressão adaptativo, os valores de regressão adaptativo de WARS, GZMB, CDX1 e SFRP4 são -2.54, -5.58, -3.59 e -4.53, respectivamente, e os valores de correção dos mesmos são +0.4, +0.4, +0.9 e +0.9, respectivamente:
[Equação 1]
ACq = (valor Cq do grupo do gene de referência) - (valor Cq dos prognósticos ou gene marcador relacionado à capacidade de resposta à quimioterapia) [90] Aqui, o valor Cq do grupo do gene de referência se refere a um valor Cq médio dos genes de referência incluindo ACTB, ATP5E, GPX1, UBB e HPRT1.
[91] O método para fornecer informações para prever prognósticos de câncer gástrico em estágios II e III ou da
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28/76 capacidade de resposta à quimioterapia da presente invenção será descrito por etapas em detalhes.
[92] A primeira etapa inclui uma etapa de medição dos níveis de expressão do mRNA de um prognóstico ou gene marcador relacionado à capacidade de resposta à quimioterapia e um grupo do gene de referência em uma amostra biológica obtida a partir de um tumor de câncer gástrico em estágios II e III e o cálculo do valor ACq de cada prognósticos ou gene marcador relacionado à capacidade de resposta à quimioterapia.
[93] Os níveis de expressão do mRNA dos prognósticos ou gene marcador relacionado à capacidade de resposta à quimioterapia e o grupo do gene de referência pode ser medido por RT-PCR, RT-PCR competitivo, RT-PCR em tempo real análise de proteção da RNase, Northern blotting ou um chip de DNA. Mais preferencialmente, o nível de expressão de
| mRNA é medido por RT-PCR em | tempo real, | ou pode ser obtido | ||||
| como | um valor | de quantificação do ciclo | (Cq) | • | ||
| [94] Um | valor ACq é | calculado | de | acordo com | a | |
| seguinte Equação 1 usando os | valores Cq | dos | prognósticos | ou | ||
| gene | marcador | relacionado | à capacidade | de resposta | à |
quimioterapia obtido acima e o grupo do gene de referência. [Equação 1]
ACq = (valor Cq do grupo do gene de referência) - (valor Cq dos prognósticos ou gene marcador relacionado à capacidade de resposta à quimioterapia) [95] Aqui, o valor Cq do grupo do gene de referência se refere a um valor Cq médio dos genes de referência incluindo ACTB, ATP5E, GPX1, UBB e HPRT1.
[96] 0 valor ACq se refere a um valor obtido pela
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29/76 normalização de um nível de expressão de um gene marcador, e quanto maior for o valor ACq, maior é o nível de expressão.
[97] A segunda etapa é uma etapa de classificação do grupo prognóstico de uma amostra biológica em comparação com os valores limites finais de prognósticos de referência pré-determinados ou genes marcadores relacionados à capacidade de resposta à quimioterapia.
[98] Para classificar os grupos prognósticos, um valor limite final o qual se torna o padrão dos prognósticos ou genes marcadores relacionados à capacidade de resposta à quimioterapia é pré determinado.
[99] Para esta finalidade, a partir de uma amostra de tecido tumoral de câncer gástrico em estágios II e III e uma amostra de tecido normal, os valores Cq de acordo com níveis de expressão do mRNA dos prognósticos ou genes marcadores relacionados à capacidade de resposta à quimioterapia incluindo WARS, GZMB, CDX1 e SFRP4 são obtidos, um valor ACq é calculado de acordo com Equação 1, e um valor de regressão adaptativo (A.R.V.) é calculado pela aplicação do valor ACq a uma técnica de regressão adaptativa. Em geral, enquanto os dados são processados com base em uma mediana ou média de valores selecionados por um ensaio, em um algoritmo de acordo com a técnica de regressão adaptativa, um ponto apresentando a maior variância dos valores de intervalo médio separados obtidos quando um ponto arbitrário dos dados totais é determinado como um ponto de referência é determinado como um valor de regressão adaptativo (ou um valor limite). Isto é, o valor limite é um ponto de referência que distingue alta
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30/76 expressão e baixa expressão de um gene correspondente, os quais são biologicamente significativos, no tecido normal e no tecido com câncer. O valor de regressão adaptativo é calculado da seguinte forma.
(Ϊ) Ajuste pelo método de regressão adaptativa +~ i .
em que, SSR: soma dos quadrados da regressão; SSTOT: soma total dos quadrados; SSE: erro da soma dos quadrados; MSR: quadrado médio da regressão; MSB: erro do quadrado médio; e F: distribuição F.
[100] Aqui, um p valor correspondendo a cauda da probabilidade da distribuição F é a seguinte.
em que, e uma vanavel aleatória da distribuição
F.
[101] No processo acima descrito, como o p valor é menor, pode ser considerado que o ajuste é melhor.
@ Etapa de determinação da função
[102] Aqui, F12 representa uma função de ajuste relativamente melhor entre a etapa um e a etapa dois.
@ No método da presente invenção, quando um ponto
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31/76 arbitrário é determinado como um ponto de referência nos dados totais pelo gene usando o método da etapa um acima descrito, um ponto no qual as estatísticas são as maiores foi determinado como um A.R.V., e um valor de correção é adicionado ao A.R.V. para determinar um valor limite final.
[103] Valores de correção dos genes marcadores podem ser obtidos com base na utilidade clínica e segurança. Isto é, os valores de correção são determinados pela obtenção de um valor A.R.V., o qual é o desempenho analítico, para um valor ACq, e seleção de uma combinação que constitui a Proporção de Risco ótima em termos de prognósticos e uma combinação que constitui interações entre quimioterapia e conjunto preditivos em termos da capacidade de resposta à quimioterapia pela avaliação de uma combinação de 0.4 a 0.5 para WARS e GZMB, 0.8 a 0.9 para SFRP4 e 0.8 a 0.9 para CDX1 com base no ACq para WARS, GZMB e SFRP4 que constituem um eixo prognóstico e WARS, GZMB e CDX1 que constituem um eixo preditivo.
[104] Preferencialmente, os valores de regressão adaptativo de WARS, GZMB, CDX1 e SFRP4 são -2.54, -5.58, 3.59 e -4.53, respectivamente, e os valores de correção destes podem ser +0.4, +0.4, +0.9 e +0.9, respectivamente.
[105] Os genes marcadores, isto é, os valores limites finais de WARS, GZMB, CDX1 e SFRP4, os quais são obtidos pela adição de valores de correção aos valores de regressão adaptativos, são -2.14, -5.18, -2.69 e -3.63, respectivamente.
[106] Quando os valores limites finais dos genes marcadores de referência são determinados, a classificação em grupos prognósticos e grupo responsivo à quimioterapia
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32/76 (Conjunto preditivo) é realizada por um sistema de dois grupos com base em um sinal binário. Em outras palavras, a classificação do grupo de acordo com um algoritmo para a previsão da probabilidade de prognósticos ou resposta à quimioterapia do câncer gástrico avançado da presente invenção é especificamente ilustrado na FIG. 7 e se refere a esta, quando os valores ACq de GZMB e WARS em uma amostra biológica são superiores aos valores limites finais pré determinados de GZMB e WARS de referência, o grupo é classificado como um grupo de bom prognóstico (Conjunto de Prognóstico I), e desde que pelo menos um valor ACq de GZMB e WARS na amostra biológica seja inferior ao valor limite final pré determinado de GZMB ou WARS de referência, quando o valor ACq de SFRP4 na amostra biológica é inferior ao valor limite final pré determinado do SFRP4 de referência, um grupo pode ser classificado como um grupo de prognóstico intermediário (Conjunto de Prognóstico II) , e quando o valor ACq de SFRP4 na amostra biológica é superior ao valor limite final pré determinado do SFRP4 de referência, um grupo pode ser classificado como um grupo de prognóstico ruim (Conjunto de Prognóstico III).
[107] Em adição, quando os valores ACq de GZMB e WARS em uma amostra biológica são superiores aos valores limites finais pré determinados de GZMB e WARS de referência, um grupo é classificado como um grupo não responsivo à quimioterapia (Conjunto preditivo R) , e desde que pelo menos um valor ACq de GZMB e WARS na amostra biológica seja inferior ao valor limite final pré determinado de GZMB ou WARS de referência, quando o valor ACq de CDX1 na amostra biológica é inferior ao valor limite final pré determinado
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33/76 de WARS de referência, um grupo é classificado como um grupo não responsive à quimioterapia (Conjunto preditivo R) e quando o valor ACq de CDX1 na amostra biológica é superior ao valor limite final pré determinado de WARS de referência, um grupo pode ser classificado como um grupo responsivo à quimioterapia (Conjunto preditivo S).
[108] A amostra biológica pode ser tecido tumoral fresco, tecido tumoral fresco congelado, tecido tumoral embebido em parafina, um fluido de aspiração com agulha fina, ascites, uma solução de lavagem de tubos, ou um fluido pleural, e preferencialmente, é tecido tumoral embebido em parafina.
[109] Em adição, a medida dos níveis de expressão do mRNA dos prognósticos ou gene marcador relacionado à capacidade de resposta à quimioterapia e o grupo do gene de referência pode ser realizada por RT-PCR, RT-PCR competitiva, RT-PCR em tempo real, análise de proteção da RNase, Northern blotting ou um chip de DNA. Preferencialmente, a medida é realizada por RT-PCR em tempo real.
[110] Aqui em seguida, as vantagens e características da presente invenção e os métodos para alcançar os mesmos podem ser claramente entendidos por referência a descrição detalhada dos exemplos de modalidades e figuras anexas. No entanto, a presente invenção não está limitada aos exemplos de modalidades descritos abaixo, e pode ser incorporada de muitas formas diferentes. Estes exemplos de modalidades são meramente fornecidos para concluir a divulgação da presente invenção e transmitir completamente o escopo da presente invenção para um técnico no assunto, e a presente invenção
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34/76 deve ser definida apenas pelas reivindicações anexas.
[Exemplos] <Exemplo 1> Desenvolvimento do algoritmo que prevê os prognósticos ou a probabilidade da capacidade de resposta à quimioterapia de câncer gástrico avançado [111] Um poro de 3 mm incluindo 50 % ou mais de um tumor foi feito em um tecido com câncer gástrico avançado embebido em parafina, e o RNA foi extraído a partir do tecido perfurado de acordo com um protocolo. Pelo menos 400 ng do RNA total foi obtido. Um elemento Q.C requerido foi A260 / A280 = > 1.8.
[112] Para um experimento RT-qPCR, um kit nProfiler I foi usado, o RNA total (400 ng / 18 μΐ) de um paciente foi usado, e uma mistura de iniciadores específicos para o gene (GSP) (3 μΐ) foi dispersada na amostra. Uma temperatura de um termociclador 2720 (Applied Biosystems) foi aumentada para 50 °C e, então, uma amostra foi colocada no ciclador. A amostra de RNA foi desnaturada a 65 °C por 5 minutos, e o termociclador foi parado. Para RT, 6 μΐ de tampão RT e 2 μΐ de uma mistura de RT foram adicionados, a síntese de DNA foi realizada a 37 °C por 60 minutos e o DNA foi mantido a 70 °C por 15 minutos. Para realizar o qPCR, uma mistura de cDNA (3 μΐ) e cada uma de nove misturas iniciador - sonda (2 μΐ, Gene-1 a Gene-9 do kit) foram misturadas. A amostra foi submetida a um ciclo de ativação enzimática a 95 °C por 120 segundos, 40 ciclos de desnaturação a 95 °C por 10 segundos e detecção a 60 °C por 30 segundos. Os dados extraídos foram analisados usando um programa nDx! (Novomics Co., Ltd.).
[113] Os processos RT e qPCR foram preparados por
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35/76 nProfiler I e o nProfiler I é um kit de qPCR a base de mRNA consistindo em 9 genes para câncer gástrico. Os reagentes aqui utilizados são mostrados na Tabela 1.
[Tabela 1]
| Composição qPCR do kit nProfiler I | ||
| KIT | Marcação | Finalidade |
| KIT A | MIX GSP | RT-PCR |
| Tampão RT | RT-PCR | |
| MIX RT | RT-PCR | |
| MIC de qPCR | qPCR | |
| Controle negativo I | qPCR | |
| MIX de iniciador - sonda GENE-1 (SFRP4) | qPCR | |
| MIX de iniciador - sonda GENE-2 (GZMB) | qPCR | |
| MIX de iniciador - sonda GENE-3 (WARS) | qPCR | |
| MIX de iniciador - sonda GENE-4 (CDX1) | qPCR | |
| MIX de iniciador - sonda GENE-5 (ACTB) | qPCR | |
| MIX de iniciador - sonda GENE-6 (ATP5E) | qPCR | |
| MIX de iniciador - sonda GENE-7 (HPRT1) | qPCR | |
| MIX de iniciador - sonda GENE-8 (GPX1) | qPCR | |
| MIX de iniciador - sonda GENE-9 (UBB) | qPCR | |
| KIT B | Controle positivo I | RT-PCR |
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| Tipo de Gene | Sequência iniciador / sonda (5'-3') | SEQ ID NO. | |
| SFRP4 (NM_003014.2) | Forward | ggagacttccgacttccttaca | 1 |
| Reverse | tggccttacataggctgtcc | 2 | |
| Sonda | aggcaatgcccagcctcatc | 19 | |
| GZMB (NM_004131.3) | Forward | cggtggcttcctgatacaag | 3 |
| Reverse | ttatggagcttccccaacag | 4 | |
| Sonda | cgacttcgtgctgacagctgc | 20 | |
| WARS (NM_173701.1) | Forward | ttgtggacccatggacagta | 5 |
| Reverse | ccaaaccgaacaatgagctt | 6 | |
| Sonda | tgccttttgcactgcttgtctg | 21 | |
| CDX1 (NM_001804.2) | Forward | agggaggaacgtggtcaact | 7 |
| Reverse | tatgatgggggcaggtagaa | 8 | |
| Sonda | tgcctcttcctgcagcctca | 22 | |
| ACTB (NM_001101) | Forward | tcaccctgaagtaccccatc | 9 |
| Reverse | tgtggtgccagattttctcc | 10 | |
| Sonda | cggcatcgtcaccaactggg | 23 | |
| ATP5E (NM_006886) | Forward | atggtggcctactggagaca | 11 |
| Reverse | ctctcactgcttttgcacaga | 12 | |
| Sonda | tggactcagctacatccgatactccca | 24 | |
| HPRT1 (NM_000194.1) | Forward | tggtcaggcagtataatccaa | 13 |
| Reverse | cttcgtggggtccttttcac | 14 | |
| Sonda | tgcaagcttgcgaccttgacc | 25 | |
| GPX1 (NM_000581.2) | Forward | cccgtgcaaccagtttgg | 15 |
| Reverse | ggacgtacttgagggaattcaga | 16 | |
| Sonda | ctcttcgttcttggcgttctcctgatg | 26 | |
| UBB (NM_018955.2) | Forward | tgggtgagcttgtttgtgtc | 17 |
| Reverse | tttgacctgttagcggatacc | 18 | |
| Sonda | caccaaccacgtccacccac | 27 |
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37/76 [114] Os 9 genes acima mencionados são quatro genes marcadores apresentando significância estatística em dados de micro ensaios e dados de RT-qPCR de tecido fresco congelado e dados RT-qPCR de uma amostra de amostra embebida em parafina e cinco genes de referência. Um ensaio de câncer de estômago nProfiler I, o qual é um kit de diagnóstico o qual pode classificar prognósticos de acordo com os níveis de expressão dos genes finalmente selecionados, foi desenvolvido.
[115] Um processo de seleção dos genes de referência é o seguinte.
[116] Os genes de referência especificamente aplicados ao câncer gástrico foram submetidos a uma investigação de literatura pelos seguintes artigos:
[117] Identificação de genes de referência adequados para a pesquisa de expressão gênica em câncer gástrico por RT-qPCR (Identification of valid reference genes for gene expression studies of human stomach cancer by reverse transcription-qPCR. Rho et al. BMC Cancer 2010, 10: 240); mudança do gene de referência em tecidos de câncer colorretal, esofágico e gástrico (Housekeeping gene variability in normal and cancerous colorectal, pancreatic, esophageal, gastric and hepatic tissues. Claudia Rubie et al. Mol Cell Probes. 2005); estudo de caso para genes de referência como produtos americanos similares usando qPCR: genes de referência do câncer de mama (A Multigene Assay to Predict Recurrence of Tamoxifen-Treated, Node-Negative Breast Cancer. Paik S et al. N Engl J Med. 2004 Dec); genes de referência do câncer colorretal (Interaction Between Tumor Gene Expression and Recurrence in Four Independent
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Studies of Patients With Stage II/III Colon Cancer Treated With Surgery Alone or Surgery Plus Adjuvant Fluorouracil Plus Leucovorin. O’Connell et al. J Clin Oncol. 2010) .
[118] Em adição, os genes de referência, os quais são usados em produtos atualmente comercializados relacionados ao câncer, foram examinados. Um gene selecionado com base nesses genes foi verificado usando pesquisas anteriores se o gene é adequado como gene de referência de uma amostra clinica e, por fim, selecionado.
[119] Com base no descrito acima, em primeiro lugar, um total de 8 genes de referência foram selecionados como candidatos.
[120] Por fim, 5 genes os quais apresentaram o menor grau de variação quando combinado em 30 amostras embebidas em parafina foram selecionados (usando geNorm) como genes de referência (referência à FIG. 1): ACTB / ATP5E / GPX1 / UBB / HPRT1.
[121] Subsequentemente, para desenvolver um algoritmo o RT-PCR em tempo real foi realizado em 310 amostras de amostra embebida em parafina remanescentes (núcleo de 3 mm) obtidas a partir de pacientes com câncer gástrico em estágio II ou III, os quais se submeteram a cirurgia no Hospital Severance, da Universidade de Yonsei de 2006 a 2010.
[122] Os genes marcadores são genes os quais podem distinguir a heterogeneidade de câncer gástrico e podem ser estavelmente detectados em tecido com câncer e existem quatro genes marcadores, tais como genes marcadores (WARS, GZMB) os quais podem representar um eixo imune, um gene marcador (SFRP4) o qual pode representar um eixo tipo
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39/76 tronco e um gene marcador (CDX1) o qual pode representar um eixo epitelial.
[123] Os genes marcadores desenvolvidos acima e os genes de referência descritos acima são mostrados na Tabela 2 abaixo.
[Tabela 2]
| Tipo | Eixo | Tipo | Uso |
| WARS | Eixo imune | AC TB | Gene de referência |
| GZMB | ATP5E | ||
| CDX1 | Eixo epitelial | HPRT1 | |
| SFRP4 | Eixo tipo tronco | GPX1 | |
| UBB |
[124] Em seguida, os valores limites por gene nos prognósticos ou gene marcador relacionado à capacidade de resposta à quimioterapia e grupo do genes de referência foram determinados de modo a estabelecer um padrão para a classificação de grupos associados a prognósticos (Conjunto de Prognóstico I: grupo de bom prognóstico, Conjunto de Prognóstico II: grupo de prognóstico intermediário e Conjunto de Prognóstico III: grupo de prognóstico ruim) e os grupos associados à capacidade de resposta à quimioterapia (Conjunto preditivo S: grupo responsivo à quimioterapia e Conjunto preditivo R: grupo não responsivo à quimioterapia).
[125] Para estabelecer tal padrão de classificação, os grupos de gene foram classificados em grupo prognósticos (Conjunto de Prognósticos) e grupo responsivo a quimioterapias (Conjunto preditivos) usando um sistema de dois grupos com base em um sinal binário.
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40/76 [126] 0 valor ACq de cada gene marcador foi calculado de acordo com a Equação 1 abaixo usando os valores Cq dos prognósticos ou gene marcador relacionado à capacidade de resposta à quimioterapia e o grupo do gene de referência, os quais foram obtidos por RT-PCR em tempo real, assim normalizando um nível de expressão de mRNA:
[Equação 1]
ACq = valor Cq do grupo do gene de referência - valor Cq do gene marcador [127] Aqui, o valor Cq do grupo do gene de referência se refere a um valor Cq médio dos genes de referência incluindo ACTB, ATP5E, GPX1, UBB e HPRT1.
[128] Quanto maior é o valor ACq, maior é a expressão do gene.
[129] um valor de regressão adaptativo (A.R.V.) foi calculado pela aplicação do valor ACq a uma técnica de regressão adaptativa. Em geral, enquanto os dados foram processados com base em uma mediana ou média de valores selecionados por um ensaio, em um algoritmo de acordo com a técnica de regressão adaptativa, um ponto apresentando a maior variância dos valores de intervalo médio separados obtidos quando um ponto arbitrário dos dados totais foi determinado como um ponto de referência foi determinado como um valor de regressão adaptativo (ou um valor limite). Isto é, o valor limite era um ponto de referência que distingue alta expressão e baixa expressão de um gene correspondente, os quais são biologicamente significativos, no tecido normal e no tecido com câncer. O valor de regressão adaptativo é calculado da seguinte forma
O Ajuste pelo método de regressão adaptativa
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41/76
SSR= Sfe-*)7 =SSTOT- SSÍ *
MSR — SSi?/ (τη ~ 1)
W = M(n-?n) em que, SSR: soma dos quadrados da regressão; SSTOT:
soma total dos quadrados; SSE: erro da soma dos quadrados;
MSR: quadrado médio da regressão; MSB: erro do quadrado médio; e F: distribuição F.
[130] Aqui, urn p valor correspondendo a cauda da probabilidade da distribuição F é o seguinte.
em que, $
K é uma variável aleatória da distribuição
F.
[131] No processo acima descrito, como o p valor é menor, pode ser considerado que o ajuste é melhor.
@ Etapa de determinação da função
[132] Aqui, F12 representa uma função de ajuste relativamente melhor entre a etapa um e a etapa dois.
@ No método da presente invenção, quando um ponto arbitrário é determinado como um ponto de referência nos dados totais pelo gene usando o método da etapa um acima descrita, um ponto no qual as estatísticas são as maiores foi determinado como um A.R.V., e um valor de correção é
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42/76 adicionado ao A.R.V. para determinar um valor limite final. 0 A.R.V. foi obtido para 310 amostras de tecidos tumorais embebidos em parafinas e 108 amostras de tecido normal embebidos em parafinas, e as amostras de tecido normal e as amostras de tecido com câncer gástrico foram quantificadas e normalizadas. Valores calculados para as amostras de tecido normal e câncer gástrico por gene usando uma técnica de regressão adaptativa foram obtidos, os valores limites finais correspondentes aos padrões abaixo foram determinados pela aplicação dos valores de correção acima mencionados para os valores previamente obtidos. Em adição, quando o valor Cq de um gene foi determinado como N/A ou indeterminado, o gene correspondente desta amostra foi eliminado a partir dos valores de regressão adaptativos. Os valores limites finais dos genes marcadores calculados de acordo com o método acima descrito são mostrados na Tabela 3 abaixo (referência à FIG. 2).
[Tabela 3]
| Gene marcador | Valor de regressão adaptativo | Valor de correção | Valor limite final |
| WARS | -2.54 | + 0.4 | -2.14 |
| GZMB | -5.58 | + 0.4 | -5.18 |
| CDX1 | -3.59 | + 0.9 | -2.69 |
| SFRP4 | -4.53 | + 0.9 | -3.63 |
[133] O sistema de dois grupos com base em um sinal binário foi classificado usando quatro genes marcadores como segue.
[134] Em primeiro lugar, na primeira etapa do grupo, um grupo de bom prognóstico (Conjunto de Prognóstico I, a região abrangida por uma linha em negrito na FIG. 3) e um
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43/76 grupo não responsivo à quimioterapias (Conjunto preditivo R a região abrangida por uma linha em negrito na FIG. 4) foram classificados por dois genes marcadores (WARS, GZMB) usando um porta lógica booleana. Aqui, os genes marcadores WARS e GZMB foram nomeados eixo imune.
[135] Em seguida, na segunda etapa do grupo, os outros grupos de pacientes com câncer gástrico os quais não foram classificados na primeira etapa do grupo foram classificados na segunda etapa do grupo, e aqui, os outros dois genes marcadores CDX1 e SFRP4 foram usados para a classificação.
[136] Aqui, em termos de diferença de prognóstico, por um gene marcador (SFRP4) que representa um eixo tipo tronco, um grupo de baixa expressão foi classificado como um grupo de prognóstico intermediário (Conjunto de Prognóstico II, a região esquerda abrangida por uma linha em negrito na FIG. 5) , e um grupo de alta expressão foi nomeado um grupo de prognóstico ruim (Conjunto de Prognóstico III, a região direita abrangida por uma linha em negrito na FIG. 5) .
[137] E então, em termos da capacidade de resposta à quimioterapia, por um gene marcador (CDX1) que representa um eixo epitelial, um grupo de alta expressão foi classificado como um grupo responsivo à quimioterapia (Conjunto preditivo S, a região superior abrangida por uma linha em negrito na FIG. 6), e um grupo de baixa expressão bem como os grupos classificados na primeira etapa do grupo (a região abrangida por uma linha em negrito na FIG. 4) foram classificadas como um grupo não responsivo à quimioterapia (Conjunto preditivo R, a região inferior
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44/76 abrangida por uma linha em negrito na FIG. 6).
[138] Tal algoritmo de classificação é ilustrado na FIG. 7.
<Exemplo 2> Verificação do algoritmo para a previsão de prognósticos e probabilidade da capacidade de resposta à quimioterapia de câncer gástrico avançado [139] A significância dos prognósticos e a capacidade de resposta à quimioterapia de acordo com o algoritmo de previsão obtido no Exemplo 1 foi verificada usando uma curva Kaplan-Meir e análise COX univariada / multivariada (n = 307, três amostras foram falhadas QC).
[14 0] Tal como revelado na curva Kaplan-Meir da FIG.
8, pode ser observado que houve uma diferença no prognóstico entre os três grupos prognósticos (Conjunto de Prognóstico I, II & III) . As taxas de sobrevivência total em 5 anos dos três grupos foram 83.3, 71.8, e 58.2 %, respectivamente, indicando que o Conjunto de Prognóstico I apresentou o melhor prognóstico dentre os três grupos, e o Conjunto de Prognóstico III apresentou o pior prognóstico dentre esses.
[Tabela 4]
| Variável | COX único | COX múltiplo | ||
| HR (95% de IC) | p valor | HR (95% de IC) | p valor | |
| Idade | ||||
| < 65 vs. 65 | 1.53 (1.05 - 2.22) | 0.03 | 1.41 (0.95 - 2.09) | 0.09 |
| Sexo | ||||
| Fêmea vs. Macho | 0.91 (0.60 - 1.38) | 0.66 | 0.81 (0.53 - 1.24) | 0.33 |
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| Status T | ||||
| T3T4 vs. T1T2 | 1.96 (1.31 - 2.93) | 0.001 | 2.50 (1.63 - 3.85) | 3.02 e-05 |
| Status N | ||||
| N1N2 vs. N0 | 2.08 (1.01 - 4.27) | 0.05 | 3.27 (1.54 - 6.96) | 0.002 |
| Conjunto de Prognóstico | ||||
| II vs. I | 1.79 (0.63 - 5.06) | 0.27 | 2.46 (0.86 - 7.02) | 0.09 |
| III vs. I | 2.93 (1.07 - 8.02) | 0.04 | 3.32 (1.21 - 9.11) | 0.02 |
| Quimioterapia | ||||
| Sim vs. Não | 0.90 (0.61 - 1.32) | 0.58 | 0.79 (0.52 - 1.19) | 0.26 |
[141] Tal como mostrado na Tabela 4, foi identificado que a classificação dos grupos prognósticos (Conjuntos de Prognósticos) não foi apenas eficaz na classificação dos prognósticos da análise COX univariada / multivariada realizada nos grupos prognósticos da presente invenção, porém também cada grupo prognóstico serviu como um fator preditivo de prognóstico independente. Particularmente, houve uma diferença no prognóstico entre o Conjunto de Prognóstico I e o Conjunto de Prognóstico III e o Conjunto de Prognóstico II foi determinado como uma zona de tampão.
[142] Os resultados do prognóstico foram verificados em termos de uma taxa de sobrevivência livre de doença. Tal como mostrado na curva Kaplan-Meir da FIG. 9, pode ser observado que havia uma diferença na taxa de sobrevivência livre de doença entre os três grupos (Conjunto de
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Prognóstico I, Conjunto de Prognóstico II, Conjunto de Prognóstico III), similar ao resultado da taxa de sobrevivência total. As taxas de sobrevivência total livre de doenças em 5 anos dos três grupos foram 75.8 %, 66.9 % e 48.2 %, respectivamente, indicando que o Conjunto de Prognóstico I apresentou o melhor prognóstico dentre os três grupos e o Conjunto de Prognóstico III apresentou o pior prognóstico.
[143] Em adição, tal como mostrado na Tabela 5, pode ser observado que a classificação dos grupos prognósticos (Conjuntos de Prognóstico) não foi apenas eficaz na classificação de prognósticos em termos da taxa de sobrevivência livre de doença na análise COX univariada / multivariada realizada nos grupos prognósticos da presente invenção, porém também cada grupo prognóstico serviu como um fator preditivo de prognóstico independente.
[Tabela 5]
| Variável | COX único | COX múltiplo | ||
| HR (95 % de IC) | P valor | HR (95 % de IC) | P valor | |
| Idade | ||||
| < 65 vs. 65 | 1.42 (1.003 - 2.02) | 0.05 | 1.40 (0.97 - 2.02) | 0.07 |
| Sexo | ||||
| Fêmea vs. Macho | 0.86 (0.58 - 1.27) | 0.44 | 0.78 (0.52 - 1.15) | 0.21 |
| Status T | ||||
| T3T4 vs. T1T2 | 1.96 (1.34 - 2.85) | 0.0005 | 2.44 (1.62 - 3.68) | 1.18 e-05 |
| Status N |
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4Ί/Ίζ>
| N1N2 vs. N0 | 1.76 (0.95 - 3.27) | 0.073 | 2.67 (1.39 - 5.15) | 0.003 |
| Conjunto de Prognóstico | ||||
| II vs. I | 1.73 (0.68 - 4.40) | 0.25 | 2.35 (0.92 - 6.04) | 0.08 |
| III vs. I | 2.74 (1.11- 6.76) | 0.03 | 3.12 (1.26 - 7.71) | 0.01 |
| Quimioterapia | ||||
| Sim vs. Não | 1.09 (0.76 - 1.56) | 0.65 | 0.93 (0.63 - 1.38) | 0.72 |
[144] Em seguida, quando os prognósticos foram comparados para todos os amostras (n = 307) em termos da taxa de sobrevivência total dos pacientes os quais não receberam quimioterapia (somente cirurgia) e pacientes os quais receberam quimioterapia adjuvante (CTX), após terem recebido uma gastrectomia, não houve diferença significativa entre os grupos tal como mostrado na curva Kaplan-Meir da FIG. 10. Parece que tal resultado aparece porque as amostras foram coletadas como amostras retrospectivas e a determinação de se a quimioterapia adjuvante foi aplicada ou não aplicada a um paciente foi tendenciosa. Sendo assim, os dados foram analisados pela realização de um Análise COX multivariada usando parâmetros tais como sexo, idade, estágio TNM e tratamento quimioterápico no Exemplo 2.
[145] Como um resultado de comparação dos prognósticos dos pacientes os quais receberam ou não receberam quimioterapia no um grupo responsivo à quimioterapia (Conjunto preditivo S; n = 145) de acordo com
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48/76 a presente invenção, tal como mostrado na FIG. 11, não houve diferença significativa entre o grupo que recebeu quimioterapia e o grupo que não recebeu quimioterapia na análise COX univariada, considerado causado pelo BIAS nos grupos de amostra. No entanto, de acordo com a análise COX multivariada usando parâmetros de sexo, idade e estágio TNM, um resultado estatisticamente significativo no qual o grupo que recebeu quimioterapia mostrou um maior benefício da quimioterapia do que o grupo que não recebeu quimioterapia é mostrado (referência a Tabela 6 e FIG. 11).
[Tabela 6]
| Variável | COX único | COX múltiplo | ||
| HR (95 % de IC) | p valor | HR (95 % de IC) | p valor | |
| Idade | ||||
| < 65 vs. à 65 | 1.56 (0.90 - 2.71) | 0.11 | 1.40 (0.79 - 2.50) | 0.25 |
| Sexo | ||||
| Fêmea vs. Macho | 0.92 (0.52 - 1.63) | 0.77 | 0.81 (0.46 - 1.44) | 0.48 |
| Status T | ||||
| T3T4 vs. T1T2 | 2.13 (1.15- 3.93) | 0.02 | 4.01 (2.06 - 7.81) | 4.53e- 05 |
| Status N | ||||
| N1N2 vs. N0 | 2.35 (0.85 - 6.52) | 0.10 | 5.24 (1.78 - 15.47) | 0.003 |
| Quimioterapia | ||||
| Sim vs. Não | 0.70 (0.41 - 1.22) | 0.21 | 0.43 (0.23 - 0.79) | 0.007 |
[146] Tal como verificado em termos de taxa de
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49/76 sobrevivência livre de doença, os prognósticos mostraram o mesmo resultado daquele em termos de taxa de sobrevivência total. No Conjunto preditivo S (n = 145) de acordo com a presente invenção, como o prognóstico dos pacientes os quais receberam ou não receberam quimioterapia foi comparado em termos da taxa de sobrevivência livre de doença, tal como mostrado na FIG. 12, NÃO HOUVE diferença significativa entre os grupos que receberam ou não receberam quimioterapia de acordo com a análise COX univariada, uma vez que, de acordo com a análise COX multivariada usando parâmetros tais como sexo, idade e estágio TNM, o grupo que recebeu quimioterapia apresentou maiores benefícios da quimioterapia do que o grupo que não recebeu quimioterapia, o qual foi, no entanto, marginal. A taxa de sobrevivência livre de doença foi adicionalmente verificada no Exemplo 4 (referência a Tabela 7 e FIG. 12).
[Tabela 7]
| Variável | COX único | COX múltiplo | ||
| HR (95 % de IC) | p valor | HR (95 % de IC) | P valor | |
| Idade | ||||
| < 65 vs. 65 | 1.82 (1.09 - 3.04) | 0.02 | 1.77 (1.04 - 3.02) | 0.03 |
| Sexo | ||||
| Fêmea vs. Macho | 0.78 (0.45 - 1.34) | 0.36 | 0.68 (0.39 - 1.18) | 0.17 |
| Status T | ||||
| T3T4 vs. T1T2 | 1.80 (1.03 - 3.14) | 0.04 | 3.16 (1.69 - 5.89) | 0.0003 |
| Status N |
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| N1N2 vs. N0 | 1.81 (0.78 - 4.22) | 0.17 | 3.30 (1.31 - 8.30) | 0.01 |
| Quimioterapia | ||||
| Sim vs. Não | 0.85 (0.50 - 1.42) | 0.53 | 0.58 (0.32 - 1.05) | 0.07 |
[147] Em seguida, no Conjunto preditivo R (η = 162), como um resultado dos prognósticos comparados de pacientes os quais receberam e não receberam quimioterapia em termos de taxa de sobrevivência total, tal como mostrado na FIG. 13, os grupos que receberam e não receberam quimioterapia mostraram um diferença insignificativa na sobrevivência de acordo com a análise COX univariada / multivariada (referência a Tabela 8 e FIG. 13).
[148] Por fim, como um resultado dos prognósticos comparados de pacientes os quais receberam e não receberam quimioterapia no Conjunto preditivo R (n = 162) em termos da taxa de sobrevivência livre de doença, tal como mostrado na FIG. 14, os grupos que receberam e não receberam quimioterapia mostraram uma indiferença significativa na sobrevivência de acordo com a análise COX univariada / multivariada (referência a Tabela 9 e FIG. 14).
[Tabela 8]
| Variável | COX único | COX múltiplo | ||
| HR (95 % de IC) | P valor | HR (95 % de IC) | p valor | |
| Idade | ||||
| < 65 vs. 4 65 | 1.47 (0.89 - 2.45) | 0.13 | 1.48 (0.85 - 2.57) | 0.17 |
| Sexo | ||||
| Fêmea vs. | 0.94 (0.51 - | 0.85 | 0.89 (0.47 - | 0.73 |
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| Macho | 1.74) | 1.69) | ||
| Status T | ||||
| T3T4 vs. T1T2 | 1.83 (1.07 - 3.14) | 0.03 | 2.09 (1.20 - 3.62) | 0.0089 |
| Status N | ||||
| N1N2 vs. NO | 1.80 (0.65 - 4.95) | 0.26 | 2.25 (0.78 - 6.45) | 0.13 |
| Quimioterapia | ||||
| Sim vs. Não | 1.09 (0.64 - 1.87) | 0.75 | 1.20 (0.66 - 2.19) | 0.55 |
| [Tabela 9] | ||||
| Variável | COX único | COX múltiplo | ||
| HR (95 % de IC) | p valor | HR (95 % de IC) | p valor | |
| Age | ||||
| < 65 vs. 65 | 1.16 (0.72 - 1.87) | 0.54 | 1.18 (0.71 - 1.97) | 0.52 |
| Sex | ||||
| Fêmea vs . Macho | 1.02 (0.58 - 1.79) | 0.94 | 0.97 (0.54 - 1.74) | 0.93 |
| Status T | ||||
| T3T4 vs. T1T2 | 2.06 (1.23 - 3.45) | 0.006 | 2.36 (1.40 - 4.00) | 0.001 |
| Status N | ||||
| N1N2 vs. NO | 1.77 (0.71 - 4.40) | 0.22 | 2.36 (0.92 - 6.10) | 0.08 |
| Quimioterapia | ||||
| Sim vs. Não | 1.31 (0.79 - 2.18) | 0.30 | 1.28 (0.73 - 2.26) | 0.38 |
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52/76 <Exemplo 3> Verificação da interação entre a classificação dos grupos responsivos à quimioterapia (Conjunto preditivo S & R) e a quimioterapia [149] Ao comparar a interação entre a capacidade de resposta à quimioterapia (Conjuntos preditivos) e a quimioterapia, foi observado que não houve interação direta entre grupos obtendo efeitos vantajosos a partir da quimioterapia, mas foi observado que havia uma interação entre a capacidade de resposta à quimioterapia (Conjuntos preditivos) e a quimioterapia quando a análise COX multivariada foi realizada em termos de tendências da amostra retrospectiva. Este resultado indica que, como observado a partir das análises COX multivariadas com parâmetros de idade, sexo e estágio TNM, o benefício da quimioterapia foi esperado em um grupo responsivo à quimioterapia (Conjunto preditivo S), porém não em um grupo não responsivo à quimioterapia (Conjunto preditivo R) (referência a Tabela 10, p-valor dos conjuntos preditivos COX múltiplo = 0.039).
| [Tabela 10[ | |||
| Variável | COX único | COX múltiplo | |
| p valor da interação quimioterápica | |||
| Idade | < 65 vs. ^65 | 0.94 | 0.97 |
| Sexo | Fêmea vs. Macho | 0.34 | 0.42 |
| Status T | T3T4 vs. T1T2 | 0.99 | 0.63 |
| Status N | N1N2 vs. N0 | 0.89 | 0.95 |
| Conjuntos preditivos | R vs. S | 0.27 | 0.039 |
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53/76 [150] Como também verificado em termos da taxa de sobrevivência livre de doença, o resultado foi o mesmo para a taxa de sobrevivência total. Isto indica que o beneficio da quimioterapia foi esperado em um grupo responsivo à quimioterapia (Conjunto preditivo S) , porém não em grupo não responsivo à quimioterapia (Conjunto preditivo R) (se refere à Tabela 11, p-valor dos conjuntos preditivos COX múltiplo = 0.048).
| [Tabela 11[ | |||
| Variável | COX único | COX múltiplo | |
| p valor da interação quimioterápica | |||
| Idade | < 65 vs. ^65 | 1.00 | 0.99 |
| Sexo | Fêmea vs. Macho | 0.29 | 0.28 |
| Status T | T3T4 vs. T1T2 | 0.64 | 0.30 |
| Status N | N1N2 vs. N0 | 0.79 | 0.59 |
| Conjuntos preditivos | R vs. S | 0.27 | 0.048 |
[151] Como o prognóstico de um grupo de bom prognóstico (Conjunto de Prognóstico I) e um grupo de prognóstico ruim (Conjunto de Prognóstico III), os quais foram classificados de acordo com o algoritmo da presente invenção, foram previstos a partir do resultado acima, foi observado que houve diferenças significativas taxa de sobrevivência total em 5 anos e taxa de sobrevivência livre de doença. Como um resultado da comparação da taxa de sobrevivência total em 5 anos, os benefícios da cirurgia e quimioterapia são estatisticamente significativos em um grupo responsivo à quimioterapia (Conjunto preditivo S) ,
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54/76 porém não em um grupo não responsivo à quimioterapia (Conjunto preditivo R) . Em adição, este resultado mostra, estatisticamente, que houve uma interação entre a classificação dos grupos responsivos à quimioterapia e a quimioterapia.
<Exemplo 4> Verificação das interações nos benefícios da quimioterapia adjuvante XELOX entre os grupos prognósticos (Conjunto de Prognóstico I, II, III) usando amostra de ensaio clínico CLASSIC e grupos responsivos à terapia padrão Xeloda + oxaliplatina (XELOX) (Conjunto preditivo R & S) [152] Um ensaio clínico CLASSIC (estudo adjuvante de capecitabina e oxaliplatina em câncer de estômago) é um ensaio clínico internacional aleatório de Fase 3 realizado em cada um dos 37 hospitais na Coréia, Japão e China para verificar a quimioterapia Xeloda + oxaliplatina (XELOX) após a cirurgia (dissecação D2) para pacientes em estágio II e III com base em AJCC, 6a edição. Um total de 1037 pacientes estavam envolvidos neste ensaio e, dentre eles, 515 pacientes foram somente observados após a cirurgia e 520 pacientes foram administrados Xeloda e oxaliplatina (a seguir, XELOX) e, então, por fim, foi reportado que o grupo administrado com XELOX mostra um melhora de 15 % do efeito prognóstico, comparado ao grupo observado. Sendo assim, o ensaio clínico CLASSIC foi usado como um regime quimioterápico padrão para pacientes em estágio II e III.
[153] No exemplo de modalidade, efeitos nos prognósticos e na capacidade de resposta à quimioterapia foram verificados para 629 amostras dos pacientes que participam do ensaio clínico CLASSIC usando o kit nProfiler
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I mostrado na Tabela 1.
[154] 0 RNA foi extraído a parir de 629 amostras tal como mostrado no Exemplo 1 e submetidos a 1PCR usando um kit de ensaio de câncer de estômago nProfiler I. 0 controle de qualidade foi realizado tal como especificado no kit nProfiler I e, então, quatro amostras foram eliminadas.
[155] Valores Cq de um total de 9 genes foram medidos por um kit nProfiler I, e valores ACq foram calculados de acordo com a Equação 1. Os valores ACq calculados foram classificados como grupos tal como mostrado na FIG. 7 do Exemplo 1 pela aplicação de um ponto de referência para a classificação de acordo com os valores pré determinados tal como mostrado na Tabela 3 do Exemplo 1.
[156] Antes da classificação do grupo, os prognósticos do grupo administrado com XELOX (XELOX) após a cirurgia e o grupo somente de cirurgia são mostrados na FIG.
15.
[157] Quando os prognósticos foram comparados entre o grupo de pacientes observado somente após a cirurgia (somente cirurgia) e o grupo de pacientes em que o XELOX foi administrado, após receber uma gastrectomia, pode ser observado que houve uma diferença significativa entre os grupos em todas as amostras (n = 625) tal como mostrado na curva Kaplan-Meir da FIG. 15. Diferente dos Exemplos 1, 2 e 3, no <Exemplo 4>, uma vez que os amostras foram coletados a partir de amostras de pacientes do ensaio clínico aleatório da Fase 3, foi determinado que não havia BIAS na seleção do tratamento XELOX e, dessa forma, no <Exemplo 4>, a análise univariada / multivariada foi realizada. Como um resultado da análise, na análise COX univariada e curva
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Kaplan-Meir, houve diferença significativa nos prognósticos entre o grupo que foi administrado XELOX (CTX) e o grupo somente para observação (somente cirurgia), o qual é o mesmo do resultado da literatura previamente publicada (referência a FIG. 15) . Este resultado foi o mesmo em termos da taxa de sobrevivência livre de doença (referência a FIG. 17).
[158] A significância dos prognósticos e a capacidade de resposta à quimioterapia foi verificada de acordo com o algoritmo de previsão mostrado no Exemplo 1 usando as curvas Kaplan-Meir e as análises COX univariada / multivariada.
[15 9] Tal como revelado na curva Kaplan-Meir da FIG.
16, pode ser observado que houve uma diferença nos prognósticos entre os três grupos (Conjunto de Prognóstico I, Conjunto de Prognóstico II e Conjunto de Prognóstico III) . As taxas de sobrevivência total em 5 anos nos três grupos foram 83.2, 74.8 e 66.0 %, respectivamente, indicando que, dentre os três grupos, o Conjunto de Prognóstico I apresentou o melhor prognóstico e o Conjunto de Prognóstico III apresentou o pior prognóstico.
[160] Em adição, tal como mostrado na Tabela 12, na análise COX univariada / multivariada, cada subtipo foi identificado como um fator preditivo de prognóstico independente. Particularmente, houve uma diferença no prognóstico entre o Conjunto de Prognóstico I e o Conjunto de Prognóstico III e o Conjunto de Prognóstico II foi determinado como uma zona de tampão.
[Tabela 12]
| Variável | COX único | COX múltiplo |
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| HR (95 % de IC) | P valor | HR (95 % de IC) | P valor | |
| Idade | ||||
| < 65 vs. 4 65 | 1.32 (0.96 - 1.81) | 0.09 | 1.40 (1.01 - 1.92) | 0.04 |
| Sexo | ||||
| Fêmea vs. Macho | 0.75 (0.53 - 1.05) | 0.09 | 0.72 (0.51 - 1.02) | 0.06 |
| Status T | ||||
| T3T4 vs. T1T2 | 1.78 (1.32 - 2.40) | 0.0001 | 2.01 (1.47 - 2.74) | 1.25 e-05 |
| Status N | ||||
| N1N2 vs. NO | 1.16 (0.66 - 2.05) | 0.60 | 1.75 (0.97 - 3.15) | 0.06 |
| Conjunto de Prognóstico | ||||
| II vs. I | 1.60 (0.91 - 2.83) | 0.105 | 1.92 (1.08 - 3.41) | 0.03 |
| III vs. I | 2.16 (1.22 - 3.80) | 0.0078 | 2.36 (1.33 - 4.18) | 0.003 |
| Quimioterapia | ||||
| Sim vs. Não | 0.69 (0.51 - 0.93) | 0.014 | 0.66 (0.49 - 0.89) | 0.0067 |
[161] Tal resultado foi verificado em termos de uma taxa de sobrevivência livre de doença como segue. Como o resultado em termos da taxa de sobrevivência total, pode ser observado que, em termos da taxa de sobrevivência livre de doença, houve uma diferença no prognóstico entre os três grupos (Conjunto de Prognóstico I, Conjunto de Prognóstico II e Conjunto de Prognóstico III) tal como mostrado na
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58/76 curva Kaplan-Meir da FIG. 18. As taxas de sobrevivência total livre de doenças em 5 anos nos três grupos são 76.9, 65.0 e 55.3 %, respectivamente, indicando que o Conjunto de Prognóstico I apresentou o melhor prognóstico e o Conjunto de Prognóstico III apresentou o pior prognóstico dentre os três grupos.
[162] Em adição, tal como mostrado na Tabela 13, como um resultado de verificação em termos da taxa de sobrevivência livre de doença, na análise COX univariada / multivariada, cada subtipo foi identificado como um fator preditivo de prognóstico independente. Particularmente, houve uma diferença no prognóstico entre o Conjunto de Prognóstico I e o Conjunto de Prognóstico III e o Conjunto de Prognóstico II foi determinado como uma zona de tampão.
[Tabela 13]
| Variável | COX único | COX múltiplo | ||
| HR (95 % de IC) | P valor | HR (95 % de IC) | p valor | |
| Idade | ||||
| < 65 vs. á 65 | 1.24 (0.94 - 1.64) | 0.12 | 1.34 (1.02 - 1.77) | 0.04 |
| Sexo | ||||
| Fêmea vs. Macho | 0.88 (0.66 - 1.16) | 0.36 | 0.82 (0.62 - 1.09) | 0.18 |
| Status T | ||||
| T3T4 vs. T1T2 | 2.01 (1.55 - 2.60) | 1.19 e-07 | 2.16 (1.65 - 2.84) | 3.02 e- 08 |
| Status N | ||||
| N1N2 vs. N0 | 0.81 (0.53 - 1.26) | 0.35 | 1.36 (0.86 - 2.15) | 0.19 |
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59/76
| Conjunto de Prognóstico | ||||
| II vs. I | 1.70 (1.03 - 2.80) | 0.038 | 2.00 (1.21 - 3.32) | 0.007 |
| III vs. I | 2.36 (1.44 - 3.89) | 0.0007 | 2.53 (1.53 - 4.17) | 0.00028 |
| Quimioterapia | ||||
| Sim vs. Não | 0.65 (0.51 - 0.85) | 0.0012 | 0.63 (0.49 - 0.82) | 0.00047 |
[163] No Conjunto preditivo S (η = 281), como os prognósticos do grupo de pacientes que receberam tratamento quimioterápico (CTX) com Xeloda + oxaliplatina (XELOX) e o grupo somente para observação (somente cirurgia) são comparados em termos da taxa de sobrevivência total, tal como mostrado na FIG. 19, na análise COX univariada, houve uma diferença significativa entre o grupo que recebeu tratamento quimioterápico XELOX e o grupo que não recebeu quimioterapia. Na análise COX multivariada ajustada para sexo, idade e estágio TNM, o grupo que recebeu o tratamento quimioterápico XELOX mostrou um resultado estatisticamente significativo, isto é, um bom prognósticos, o qual foi o mesmo da análise univariada, tal como comparado ao grupo somente de cirurgia (referência a Tabela 14 e FIG. 19).
| [Tabela 14] | ||||
| Variável | COX único | COX múltiplo | ||
| HR (95 % de IC) | P valor | HR (95 % de IC) | P valor | |
| Idade | ||||
| < 65 vs. ú 65 | 1.03 (0.60 - 1.76) | 0.92 | 1.02 (0.60 - 1.75) | 0.94 |
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60/76
| Sexo | ||||
| Fêmea vs. Macho | 0.76 (0.46 - 1.24) | 0.27 | 0.66 (0.40 - 1.09) | 0.10 |
| Status T | ||||
| T3T4 vs. T1T2 | 1.96 (1.25 - 3.05) | 0.003 | 2.27 (1.44 - 3.60) | 0.0005 |
| Status N | ||||
| N1N2 vs. N0 | 1.46 (0.59 - 3.62) | 0.41 | 2.43 (0.96 - 6.18) | 0.061 |
| Quimioterapia | ||||
| Sim vs. Não | 0.47 (0.30 - 0.75) | 0.002 | 0.46 (0.29 - 0.74) | 0.0012 |
[164] Ainda, na verificação do resultado acima em termos da taxa de sobrevivência livre de doença, quando, no Conjunto preditivo S (n = 281), os prognósticos foram comparados entre o grupo de paciente que recebeu o tratamento quimioterápico XELOX e o grupo de pacientes somente para observação, tal como mostrado na FIG. 20, houve uma diferença significativa entre o grupo que recebeu tratamento quimioterápico XELOX e o grupo somente de cirurgia na análise COX univariada. Na análise COX multivariada ajustada para sexo, idade e estágio TNM, o grupo que recebeu o tratamento quimioterápico XELOX mostrou um resultado estatisticamente significativo, isto é, um bom prognóstico, o qual foi o mesmo daquele em análise univariada, tal como comparado ao grupo somente de cirurgia (referência a Tabela 15 e FIG. 20).
[165] Subsequentemente, no Conjunto preditivo R (n = 344), quando os prognósticos foram comparados entre o grupo de pacientes que recebeu tratamento quimioterápico XELOX e
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61/76 o grupo de pacientes somente para observação, tal como mostrado na FIG. 21, não houve diferença significativa na sobrevivência entre dois grupos. Este resultado foi o mesmo daquele na análise COX univariada / multivariada (referência a Tabela 16 e FIG. 21).
| [Tabela 15] | ||||
| Variável | COX único | COX múltiplo | ||
| HR (95 % de IC) | P valor | HR (95 % de IC) | P valor | |
| Idade | ||||
| < 65 vs. 65 | 1.21 (0.77 - 1.90) | 0.41 | 1.18 (0.75 - 1.85) | 0.48 |
| Sexo | ||||
| Fêmea vs. Macho | 0.69 (0.44 - 1.07) | 0.097 | 0.60 (0.38 - 0.95) | 0.03 |
| Status T | ||||
| T3T4 vs. T1T2 | 2.18 (1.47 - 3.24) | 0.0001 | 2.59 (1.72 - 3.88) | 4.66 e-06 |
| Status N | ||||
| N1N2 vs. NO | 1.50 (0.66 - 3.42) | 0.34 | 2.56 (1.10 - 5.96) | 0.03 |
| Quimioterapia | ||||
| Sim vs. Não | 0.47 (0.31 - 0.70) | 0.0002 | 0.45 (0.30 - 0.68) | 0.0001 |
[Tabela 16]
| Variável | COX único | COX múltiplo | ||
| HR (95 % de IC) | P valor | HR (95 % de IC) | P valor | |
| Idade | ||||
| < 65 vs. 65 | 1.57 (1.04 - | 0.03 | 1.57 (1.04 - | 0.03 |
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| 2.36) | 2.37) | |||
| Sexo | ||||
| Fêmea vs. Macho | 0.73 (0.46 - 1.18) | 0.20 | 0.75 (0.47 - 1.20) | 0.23 |
| Status T | ||||
| T3T4 vs. T1T2 | 1.64 (1.10 - 2.64) | 0.02 | 1.79 (1.18 - 2.74) | 0.007 |
| Status N | ||||
| N1N2 vs. N0 | 0.99 (0.48 - 2.04) | 0.98 | 1.24 (0.58 - 2.66) | 0.58 |
| Quimioterapia | ||||
| Sim vs. Não | 0.93 (0.62 - 1.38) | 0.71 | 0.90 (0.60 - 1.36) | 0.63 |
[166] Subsequentemente, quando os prognósticos foram verificados em termos da taxa de sobrevivência livre de doença, o mesmo resultado daquele da taxa de sobrevivência total foi observado. No Conjunto preditivo R (n = 344), quando os prognósticos foram comparados entre o grupo de pacientes que receberam tratamento quimioterápico XELOX e o grupo de pacientes somente de observação, tal como mostrado na FIG. 22, não houve diferença significativa na sobrevivência entre dois grupos. Este resultado foi o mesmo daquele da análise COX univariada / multivariada (referência a Tabela 17 e FIG. 22).
[Tabela 17]
| Variável | COX único | COX múltiplo | ||
| HR (95 % de IC) | P valor | HR (95 % de IC) | P valor | |
| Idade | ||||
| < 65 vs. h 65 | 1.24 (0.87 - | 0.23 | 1.31 (0.92 - | 0.13 |
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| 1.77) | 1.87) | |||
| Sexo | ||||
| Fêmea vs. Macho | 1.04 (0.72 - 1.50) | 0.84 | 0.99 (0.68 - 1.44) | 0.97 |
| Status T | ||||
| T3T4 vs. T1T2 | 1.92 (1.36 - 2.71) | 0.0002 | 1.89 (1.31 - 2.73) | 0.0006 |
| Status N | ||||
| N1N2 vs. N0 | 0.55 (0.33 - 0.91) | 0.02 | 0.80 (0.46 - 1.38) | 0.42 |
| Quimioterapia | ||||
| Sim vs. Não | 0.81 (0.58 - 1.14) | 0.23 | 0.81 (0.58 - 1.15) | 0.24 |
[167] Em seguida, quando os prognósticos foram verificados em termos da taxa de sobrevivência total, foi observado que houve uma interação direta entre a capacidade de resposta à quimioterapia (Conjunto preditivo) e o tratamento quimioterápico XELOX (Tabela 18).
| [Tabela 18) | |||
| Variável | COX único | COX múltiplo | |
| p valor da interação quimioterápica | |||
| Idade | < 65 vs. h 65 | 0.32 | 0.33 |
| Sexo | Fêmea vs. Macho | 0.87 | 0.88 |
| Status T | T3T4 vs. T1T2 | 0.01 | 0.02 |
| Status N | N1N2 vs. N0 | 0.82 | 0.97 |
| Conjuntos | R vs. S | 0.036 | 0.048 |
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| preditivos |
[168] Quando os prognósticos foram verificados em termos da taxa de sobrevivência livre de doença, foi observado que existia uma interação direta entre a capacidade de resposta à quimioterapia (Conjunto preditivo) tal como taxas de sobrevivência totais e tratamento quimioterápico XELOX, tal como verificado em termos da taxa de sobrevivência total (Tabela 19).
[169] Este resultado é obtido pela verificação do resultado do Exemplo 3, e mostra que, a vantagem da quimioterapia XELOX ocorre no grupo responsivo à quimioterapia (Conjunto preditivo S) , porém não ocorre no grupo não responsivo à quimioterapia (Conjunto preditivo R).
[170] Como um resultado da previsão de prognósticos no grupo de bom prognóstico (Conjunto de Prognóstico I) e no grupo de prognóstico ruim (Conjunto de Prognóstico III), os quais são classificados pelo algoritmo da presente invenção a partir do resultado acima descrito, pode ser observado que existe uma diferença significativa na taxa de sobrevivência em 5 anos. Em adição, o efeito da quimioterapia XELOX após a cirurgia é exibido de forma significativa no grupo responsivo à quimioterapia (Conjunto preditivo S), porém não há efeito terapêutico no grupo não responsivo à quimioterapia (Conjunto preditivo R) , indicando uma interação significativa com a capacidade de resposta à quimioterapia e o tratamento XELOX.
| [Tabela 19 | ||
| Variável | COX único COX múltiplo | |
| p valor da interação quimioterápica |
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| Idade | < 65 vs. 65 | 0.76 | 0.80 |
| Sexo | Fêmea vs. Macho | 0.38 | 0.29 |
| Status T | T3T4 vs. T1T2 | 0.008 | 0.02 |
| Status N | N1N2 vs. NO | 0.15 | 0.21 |
| Conjuntos preditivos | R vs. S | 0.043 | 0.066 |
<Exemplo 5> Avaliação de desempenho clínico nos grupos prognósticos (Conjunto de Prognóstico I, II e III) usando amostras FFPE em descanso após a cirurgia para pacientes com câncer gástrico avançado de estágio II e III [171] Para verificar a avaliação do desempenho clínico no algoritmo de previsão de prognósticos de pacientes com câncer gástrico obtido no Exemplo 1 (ensaio de dispositivo médico para câncer de estômago nProfiler I), um valor ACq de um gene foi medido através de PCR em tempo real realizado em amostras FFPE em descanso após a cirurgia para os pacientes com câncer gástrico em estágio II e III (com base em AJCC, 6a edição) e desempenho clínico do algoritmo que prevê prognósticos de pacientes foi testado com um novo grupo de indivíduo. Especificamente, 1) o desempenho da previsão do algoritmo foi avaliado pela identificação de taxas de sobrevivência em 5 anos de dois grupos prognósticos (Conjunto de Prognóstico I, Conjunto de Prognóstico III) deduzido a partir da verificação definida a partir de curvas Kaplan-Meier; 2) a estabilidade da diferença no prognóstico entre os grupos foi avaliada através de um teste comparativo para uma diferença no prognóstico entre os grupos prognósticos com significância estatística usando um teste logarítmico de classificação de
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66/76 modo a identificar que, dentre os três grupos, o Conjunto de Prognóstico I é o melhor grupo prognóstico e o Conjunto de Prognóstico III é o pior grupo prognóstico; e 3) uma Proporção de Risco em um grupo prognóstico foi analisada usando um modelo de risco proporcional de Cox multivariado de modo a identificar que o grupo prognóstico é um fator de prognóstico independente.
[172] Para o ensaio clinico, um total de 684 amostras foram usados e, em uma etapa de avaliação da amostra, 18 amostras foram rejeitadas devido a uma quantidade e qualidade insuficiente de RNA. Exceto as 18 amostras rejeitados na classificação, 666 amostras foram aceitas como amostras para o ensaio clinico. Em uma primeira etapa de teste e análise, 126 amostras de um total de 666 amostras corresponderam ao critério de falha QC de modo que um único tempo de re-teste foi realizado, resultando na eliminação de 12 amostras entre o total de 126 amostras devido aos critérios de falha CQ. Como um resultado, exceto um total de 30 amostras tal como as 18 amostras rejeitadas na classificação e as 12 amostras eliminadas devido aos critérios de re-teste, 654 amostras dentre as 684 amostras alvo foram selecionadas como um grupo de análise da avaliação da eficácia.
[173] Neste ensaio clinico, não houve avaliação da capacidade de resposta à quimioterapia (Conjunto preditivo R, S) , a qual foi porque, uma vez que 97.7 % dos pacientes dentre os 654 amostras de paciente receberam quimioterapia, houve uma falta de pacientes os quais não receberam quimioterapia para comparação de uma diferença no prognóstico entre os pacientes os quais receberam
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67/76 quimioterapia e os pacientes os quais não receberam quimioterapia, os quais foram classificados como subgrupos por um grupo responsive à quimioterapia (Conjunto preditivo R ou S).
[174] Em primeiro lugar, para medir o desempenho da previsão de uma taxa de sobrevivência de 5 anos em um grupo prognóstico, o grupo prognóstico foi classificado pela aplicação de um valor ACq por amostra ao algoritmo, e então uma taxa de sobrevivência por grupo prognóstico foi calculada com curvas Kaplan-Meier (referência a FIG. 23 e Tabela 20).
[Tabela 20] [175] Sobrevivência de cinco anos dos Conjuntos de
Prognóstico
| Conjunto de Prognóstico | Sobrevivência total |
| Taxa de sobrevivência (95 % de IC) | |
| Conjunto de Prognóstico I | 0.8198 (0.7412 - 0.9067) |
| Conjunto de Prognóstico II | 0.6618 (0.6058 - 0.7230) |
| Conjunto de Prognóstico III | 0.5574 (0.5052 - 0.6149) |
[17 6] Em adição, como um resultado da checagem da sobreposição entre os intervalos de confiança de 95 % dos dois grupos prognósticos tais como o grupo prognóstico I e o grupo prognóstico III, foi confirmado que não houve sobreposição, tal como mostrado na Tabela 21 abaixo.
[Tabela 21]
| Classificação | Intervalo de confiança de 95 % de 654 amostras | Teste de sobreposição do intervalo de confiança de 95 % |
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| entre os Conjuntos de Prognóstico I e III | |||
| Intervalo de | Os intervalos de | ||
| confiança de 95 % | 74.12 % - | - 90.67 % | confiança do |
| no Conjunto de | Conjunto de | ||
| Prognóstico I | Prognóstico I e | ||
| Intervalo de | do Conjunto de | ||
| confiança de 95 % | 50.52 % - | - 61/49 % | Prognóstico III |
| no Conjunto de | não são | ||
| Prognóstico III | sobrepostos |
[177] Para confirmar a estabilidade na diferença entre os grupos prognósticos, os grupos prognósticos I, II e III foram submetidos a um teste logarítmico de classificação para identificar uma diferença estatisticamente significativa e para o cálculo estatístico um p valor foi calculado pelo cálculo de um qui-quadrado com 2 graus de liberdade. Se não houve diferença no efeito da comparação dos grupos prognósticos, a ocorrência de um evento (morte) em todas as seções deve ocorrer em uma frequência proporcional ao número de indivíduos a serem observados (0) nos três grupos prognósticos de cada seção. No teste logarítmico de classificação, todo o grupo que resume os três grupos prognósticos foi organizado em ordem de tempo de observação e, a partir disso, a entrada censurada foi eliminada para deixar apenas uma seção na qual o evento (morte) ocorreu. Em adição, foi calculada a frequência esperada (E) de morte para cada grupo prognóstico. Como a interação entre a frequência total de
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69/76 observação (0) e a frequência esperada (E) em relação à morte para cada grupo prognóstico mostrou uma distribuição qui-quadrado com dois graus de liberdade, se o valor (X2) fosse maior que 5,99 (p valor < 0,05), considerou-se que os três grupos prognósticos apresentam uma diferença significativa. A hipótese nula no teste logarítmico de classificação foi a seguinte:
Ho: nenhuma diferença entre o Conjunto de Prognóstico I, II e III [178] Método para o cálculo da frequência esperada (taxa de morte esperada)
Biji mortalidade esperada da Ia variável no Grupo 1; Oj: mortalidade observada da variável j em todos os grupos; Nij: número de indivíduos observados na variável j no Grupo 1; Nj: número de indivíduos observados na variável j em todos os grupos) [179] Estatísticas do teste log-rank entre dois ou mais grupos: qui-quadrado: X (Σ: matriz de variância - covariância, Z: k-1: vetor estatístico) [180] Quando os p valores em relação às estatísticas do teste logarítmico de classificação são menores do que 0.05, foi interpretado que existe uma diferença no prognóstico entre os grupos prognósticos, e caso contrário, quando o p valor em relação a estatística fosse maior do que 0.05, foi interpretado que não há diferença nos prognósticos entre os grupos prognósticos.
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Ίΰ/Ίξ>
[181] Como um resultado, quando o qui-quadrado (X2) com 2 graus de liberdade foi calculado como 24.7 (p valor = 4.39 e-06), uma diferença estatisticamente significativa foi indicada (referência a Tabela 22) . Sendo assim, pode ser observado que havia uma diferença no prognóstico entre os três grupos (Conjunto de Prognóstico I, II e III).
[Tabela 22]
| N | Observado | Esperado | (0- E) λ2/Ε | (0- E) A2/V | |
| Todos os conjuntos = 1 | 84 | 24 | 52.3 | 15.312 | 18.41 |
| Todos os conjuntos = 2 | 253 | 122 | 129.6 | 0.446 | 0.74 |
| Todos os conjuntos = 3 | 317 | 185 | 149.1 | 8.645 | 15.87 |
| Qui-quadrado = 24.7 | em 2 graus de liberdade, p = | 4.39 e-06 |
[182] Para investigar onde se origina a diferença entre os três grupos prognósticos, como um resultado da realização de um teste post-hoc apresentando uma distribuição de qui-quadrado com dois graus de liberdade usando um teste logaritmico de classificação, pode ser observado que houve uma diferença nos prognósticos pelo cálculo de todos os p valores significativos. Isto é, uma vez que a diferença entre os três grupos prognósticos era evidente, foi julgado que este resultado satisfaz a estabilidade na diferença entre os grupos prognósticos.
[Tabela 23]
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| Conjunto de Prognóstico para análise | Número de amostras a serem observadas | Quiquadrado (X2) | P valor |
| Conjunto de Prognóstico I vs. Conjunto de Prognóstico II | 337 | 11.5 | 0.000691 |
| Conjunto de Prognóstico vs. Conjunto de Prognóstico III | 401 | 22.6 | 1.96e-06 |
| Conjunto de Prognóstico II vs. Conjunto de Prognóstico III | 570 | 5.8 | 0.016 |
[183] Para confirmar o grau de perigo e independência do grupo prognóstico, a influência de outros fatores de risco (idade, sexo, estágio TNM e quimioterapia) do câncer gástrico foi corrigida para avaliar se havia uma diferença na taxa de sobrevivência de acordo com um fator de risco, isto é, um grupo prognóstico por si só, através da análise da Proporção de Risco. Usando um método de análise do modelo de risco proporcional de Cox, uma análise multivariada usando um fator prognóstico pré existente como uma covariável foi realizado para investigar se o grupo prognóstico de acordo com o algoritmo era um fator de prognóstico independente o qual afetou os prognósticos do câncer gástrico.
[184] A análise nula no modelo de risco proporcional
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72/76 de Cox foi é a seguinte:
Ho = Bj = 0 significa que duas pessoas com fatores de risco diferentes estão relacionadas proporcionalmente, independentemente do tempo (t).
h(t) = h0 (t) exp (βιχι + ...
[χι, · · · ,Xk] : variáveis risco), ho(t): perigo basal no perigo para uma pessoa com + fòkXk) independentes (fatores de time t, isto é, indicando um valor 0 para todas as variáveis independentes.
Proporção de Risco — UA
Estatísticas e Cálculo do p valor . ...
r* 5 , Λ ώ = J. í S€< Ο. !
Quando Z < Ζα/2 ou Z < Zi-a/2, Ho é rejeitada e quando
Ζα/2 Z < Zi-a/2, Ho é adotada.
[185] Então, dentre 654 amostras selecionadas como um grupo de análise de avaliação de eficácia, 22 amostras as quais foram incertas quanto como a quimioterapia foi recebida foram eliminadas da análise e as 632 amostras remanescentes foram analisadas usando um modelo de risco proporcional de Cox multivariado para calcular uma Proporção de Risco e um intervalo de confiança de 95 % e um p valor do mesmo.
[186] Como um resultado da análise de um modelo de risco proporcional de Cox multivariado, quando a Proporção de Risco entre dois conjuntos de prognósticos (Conjunto de Prognóstico I vs. Conjunto de Prognóstico III) foi estatisticamente significativa (p valor < 0.05), foi interpretado que o grupo prognóstico de acordo com o
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73/76 algoritmo foi um fator de prognóstico independente.
[Tabela 24] [187] Resultado da análise multivariada do modelo de regressão de risco proporcional de Cox
| Proporção de Risco com 95 % de IC | p valor | |
| Idade | 1.0200 (1.0098 - 1.0300) | 0.000112 |
| Sexo | ||
| Macho | 1 | |
| Fêmea | 1.1223 (0.8893 - 1.4160) | 0.331330 |
| Quimioterapia | ||
| Não | 1 | |
| Sim | 0.7531 (0.3715 - 1.5260) | 0.431482 |
| Estágio TNM | ||
| Estágio II | 1 | |
| Estágio III | 2.0315 (1.5882 - 2.5990) | 1.67e-08 |
| Conjunto de Prognóstico | ||
| Conjunto de Prognóstico I | 1 | |
| Conjunto de Prognóstico II | 2.0439 (1.3155 - 3.1760) | 0.001475 |
| Conjunto de Prognóstico III | 2.5765 (1.6810 - 3.9490) | 1.40e-05 |
[188] Como um resultado da análise usando o modelo de risco proporcional de Cox, foi mostrado que, como fatores de risco (variáveis independentes) que afetam os prognósticos de câncer gástrico, a idade (p valor =
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Ί4/Ίξ>
0.000112), ο estágio ΤΝΜ (ρ valor = 1.67 e-08) e ο grupo prognóstico foram estatisticamente significativos.
[189] No caso do grupo prognóstico (Conjunto de Prognóstico) o qual é uma variável de avaliação para o ensaio clínico, uma Proporção de Risco do Conjunto de Prognósticos II e III foi calculada usando o Conjunto de Prognóstico I como a referência de uma variável independente correspondente. Sendo assim, no diagnóstico, comparado ao Conjunto de Prognóstico I, o Conjunto de Prognóstico II (p valor = 0.001475) foi 2.04 vezes mais perigoso e o Conjunto de Prognóstico III (p valor = 1.40 e05) foi 2.58 vezes mais perigoso, o que foi estatisticamente significativo.
[190] Sendo assim, muito embora o modelo de risco proporcional de Cox tenha sido ajustado com os fatores de risco (idade, sexo, estágio TNM e quimioterapia), foi observado que a classificação dos Conjuntos de Prognósticos de acordo com o algoritmo é um fator de prognóstico independente em câncer gástrico.
[191] Como um resultado da avaliação da segurança do ensaio clínico, durante o período correspondente, um avaliador armazenou e manipulou uma amostra de acordo com as diretrizes de segurança biológica em laboratórios. De acordo com a observação durante um período do ensaio clínico, não houve problemas de segurança relacionados aos efeitos colaterais tais como casos anormais e infecções a partir de amostras para um avaliador que manuseia a amostra.
[192] Um resultado da avaliação para eficácia clínica dos prognósticos foi verificado usando a aplicação do algoritmo de previsão obtido no Exemplo 1 através do ensaio
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75/76 clínico e um valor limite do algoritmo. As taxas de sobrevivência em 5 anos no Conjunto de Prognóstico I e no Conjunto de Prognóstico III como variáveis de avaliação de eficácia foram confirmadas como 81.98 % (95 % de IC, 74.12 a 90.67 %) e 55.74 (95 % de IC, 50.52 a 61.49 %), respectivamente, atendeu aos critérios de avaliação definidos no plano do ensaio clínico, e foi confirmado que 95 % de IC das taxas de sobrevivência em 5 anos no grupo prognóstico I e no grupo prognóstico III não se sobrepuseram uma com a outra.
[193] Em adição, de acordo com um teste logarítmico de classificação realizado para avaliar se existia uma diferença prognostica entre os três grupos prognósticos classificados, foi confirmado que existia uma diferença significativa entre os três grupos. Em adição, de acordo com a análise post-hoc, p valores significativos foram calculados a partir de todos os três grupos, indicando que existia uma diferença prognostica entre os grupos. Isto é, uma vez que, entre os três grupos prognósticos, a diferença entre os grupos prognósticos era evidente, o resultado satisfaz a [estabilidade na diferença entre os grupos prognósticos].
[194] Por fim, como uma Proporção de Risco foi estimada pela execução de uma análise do modelo de risco proporcional de Cox multivariado usando idade, sexo, quimioterapia, estágio, etc. como covariáveis, comparado ao Conjunto de Prognóstico I, o Conjunto de Prognóstico II (p valor = 0.001475) foi 2.04 vezes mais perigoso, e comparado ao Conjunto de Prognóstico I, o Conjunto de Prognóstico III (p valor = 1.40 e-05) foi 2.58 vezes mais perigoso, o qual
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Ί6/Ί6 foi estatisticamente significativo. Isto é, foi confirmado que o Conjunto de Prognóstico I apresentou os melhores prognósticos, e Conjunto de Prognóstico III apresentou os piores prognósticos. Isto é, muito embora o modelo de risco proporcional de Cox tenha sido ajustado com os fatores de risco(por exemplo, idade, sexo, estágio TNM e quimioterapia), pode ser observado que a classificação de um Conjunto de Prognóstico de acordo com o algoritmo foi um fator de prognóstico independente do câncer gástrico.
[195] Consequentemente, tal como mostrado no resultado da avaliação para o ensaio clinico, o algoritmo de previsão de prognósticos para um paciente com câncer gástrico, o qual foi obtido a partir do Exemplo 1, e o desempenho clinico de um dispositivo médico para um ensaio de câncer de estômago nProfiler I foram considerados como sendo avaliados de forma bem sucedida.
Aplicação industrial [196] A presente invenção pode ser usada como informações suplementar para determinar um método para o tratamento de um paciente com câncer gástrico.
Claims (12)
- REIVINDICAÇÕES1. Composição para a previsão de prognósticos ou da capacidade de resposta à quimioterapia de câncer gástrico em estágios II e III, a composição CARACTERIΖΑΡΑ pelo fato de compreender:um agente para a medição de um nível de expressão de mRNA em um prognóstico ou gene marcador relacionado à capacidade de resposta à quimioterapia incluindo WARS, GZMB CDX1 e SFRP4; e um agente para a medição de um nível de expressão de mRNA em um grupo do gene de referência incluindo ACTB, ATP5E, GPX1, UBB e HPRT1.
- 2. Composição, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIΖΑΡΑ pelo fato de o agente para a medição de um nível de expressão de mRNA dos prognósticos ou gene marcador relacionado à capacidade de resposta à quimioterapia ou o grupo do gene de referência incluir um oligonucleotídeo apresentando uma sequência complementar a do mRNA.
- 3. Composição, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIΖΑΡΑ pelo fato de o agente para a medição de um nível de expressão de mRNA dos prognósticos ou gene marcador relacionado à capacidade de resposta à quimioterapia ou o grupo do gene de referência incluir um conjunto de iniciadores tal como definido nas SEQ ID NOs: 1 a 18; ou sondas tal como definidas nas SEQ ID NOs: 19 a 27.
- 4. Composição, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIΖΑΡΑ pelo fato de ser usada para a previsão da probabilidade de prognósticos ou resposta à quimioterapia em pacientes com câncer gástrico em estágios II e III emPetição 870190091133, de 13/09/2019, pág. 83/1102/6 termos de uma taxa de sobrevivência total ou taxa de sobrevivência livre de doença.
- 5. Kit para a previsão de prognósticos ou da capacidade de resposta à quimioterapia de câncer gástrico em estágios II e III, o kit CARACTERI ΖΑΡΑ pelo fato de compreender:a composição conforme definida na reivindicação 1.
- 6. Kit, de acordo com a reivindicação 5, CARACTERIΖΑΡΑ pelo fato de o kit ser um kit de transcrição reversa seguida da reação em cadeia de polimerase (RT-PCR) ou kit de chip de DNA.
- 7. Método para fornecer informações para a previsão de prognósticos de câncer gástrico em estágios II e III, o método CARACTERIΖΑΡΑ pelo fato de compreender:a medição dos níveis de expressão do mRNA de um prognóstico ou gene marcador relacionado à capacidade de resposta à quimioterapia incluindo WARS, GZMB, CDX1 e SFRP4 e um grupo do gene de referência incluindo ACTB, ATP5E, GPX1, UBB e HPRT1 a partir de uma amostra biológica obtida a partir de um tumor de câncer gástrico em estágios II e III, e o cálculo dos valores ACq de prognósticos ou genes marcadores relacionados à capacidade de resposta à quimioterapia de acordo com a Equação 1 abaixo; e em comparação com os valores limites finais dos prognósticos de referência pré-determinados ou genes marcadores relacionados à capacidade de resposta à quimioterapia, classificação de um grupo como um grupo de bom prognóstico (Conjunto de Prognóstico I) quando os valores ACq de GZMB e WARS na amostra biológica são maiores do quePetição 870190091133, de 13/09/2019, pág. 84/1103/6 os valores limites finais pré determinados de GZMB e WARS de referência, e desde que, quando pelo menos um valor ACq de GZMB e WARS na amostra biológica é inferior ao valor limite final pré determinado de GZMB ou WARS de referência, a classificação de um grupo como um grupo de prognóstico intermediário (Conjunto de Prognóstico II) quando o valor ACq de SFRP4 na amostra biológica é inferior ao valor limite final pré determinado do SFRP4 de referência, e um grupo como grupo de prognóstico ruim (Conjunto de Prognóstico III) quando o valor ACq de SFRP4 é superior ao valor limite final pré determinado do SFRP4 de referência, em que os valores limites finais dos prognósticos de referência pré-determinados ou genes marcadores relacionados à capacidade de resposta à quimioterapia são 2.14, -5.18, -2.69 e -3.63 em relação a WARS, GZMB, CDX1 e SFRP4, respectivamente, e o valor limite final é calculado pela obtenção de valores ACq de prognósticos ou genes marcadores relacionados à capacidade de resposta à quimioterapia incluindo WARS, GZMB, CDX1 e SFRP4 a partir de amostras de tecido tumoral de câncer gástrico em estágios II e III, calculando um valor de regressão adaptativo por gene usando os valores ACq e adicionando um valor de correção por gene para o valor de regressão adaptativo, os valores de regressão adaptativo de WARS, GZMB, CDX1 e SFRP4 are -2.54, -5.58, -3.59 e -4.53, respectivamente, e os valores de correção dos mesmos são +0.4, +0.4, +0.9 e +0.9, respectivamente.[Equação 1]Petição 870190091133, de 13/09/2019, pág. 85/1104/6ACq = (valor Cq do grupo do gene de referência) - (valor Cq dos prognósticos ou gene marcador relacionado à capacidade de resposta à quimioterapia) em que o valor Cq do grupo do gene de referência se refere a um valor Cq médio dos genes de referência incluindo ACTB, ATP5E, GPX1, UBB e HPRT1.
- 8. Método, de acordo com a reivindicação 7, CARACTERI ΖΑΡΑ pelo fato de a amostra biológica ser selecionada do grupo que consiste em tecido tumoral fresco, tecido tumoral fresco congelado, tecido tumoral embebido em parafina, um fluido de aspiração com agulha fina, ascites, uma solução de lavagem de tubos, ou um fluido pleural.
- 9. Método, de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIΖΑΡΑ pelo fato de a medida dos níveis de expressão do mRNA dos prognósticos ou gene marcador relacionado à capacidade de resposta à quimioterapia e o grupo do gene de referência ser realizado por RT-PCR, RT-PCR competitivo, RT-PCR em tempo real, análise de proteção de RNase, Northern blotting ou chip de DNA.
- 10. Método para fornecer informações para a previsão da capacidade de resposta à quimioterapia de câncer gástrico em estágios II e III, o método CARACTERIΖΑΡΑ pelo fato de compreender:medição dos níveis de expressão do mRNA de um prognóstico ou gene marcador relacionado à capacidade de resposta à quimioterapia incluindo WARS, GZMB, CDX1 e SFRP4 e um grupo do gene de referência incluindo ACTB, ATP5E, GPX1, UBB e HPRT1 em uma amostra biológica obtida a partir de um tumor de câncer gástrico em estágios II e III, e o cálculo de valores ACq de prognósticos ou genes marcadoresPetição 870190091133, de 13/09/2019, pág. 86/1105/6 relacionados à capacidade de resposta à quimioterapia de acordo com a Equação 1 abaixo; e em comparação com os valores limites finais de prognósticos de referência pré-determinados ou genes marcadores relacionados à capacidade de resposta à quimioterapia, classificação de um grupo como um grupo não responsivo à quimioterapia (Conjunto preditivo R) quando os valores ACq de GZMB e WARS na amostra biológica forem superiores aos valores limites finais pré determinados de GZMB e WARS de referências, e desde que, pelo menos um valor ACq de GZMB e WARS na amostra biológica é inferior ao valor limite final pré determinado de GZMB ou WARS de referência, a classificação de um grupo como um grupo não responsivo à quimioterapia (Conjunto preditivo R) quando o valor ACq de CDX1 na amostra biológica é inferior ao valor limite final pré determinado de WARS de referência, e um grupo como um grupo responsivo à quimioterapia (Conjunto preditivo S) quando o valor ACq de CDX1 na amostra biológica é superior ao valor limite final pré determinado de WARS de referência, em que os valores limites finais de prognósticos de referência pré-determinados ou genes marcadores relacionados à capacidade de resposta à quimioterapia são 2.14, -5.18, -2.69 e -3.63 em relação a WARS, GZMB, CDX1 e SFRP4, respectivamente, e o valor limite final é calculado pela obtenção de valores ACq de prognósticos ou genes marcadores relacionados à capacidade de resposta à quimioterapia incluindo WARS, GZMB, CDX1 e SFRP4 a partir de amostras dePetição 870190091133, de 13/09/2019, pág. 87/1106/6 tecido tumoral de câncer gástrico em estágios II e III, calculando um valor de regressão adaptativo por gene usando os valores ACq e adicionando um valor de correção por gene para o valor de regressão adaptativo, os valores de regressão adaptativo de WARS, GZMB, CDX1 e SFRP4 são -2.54, -5.58, -3.59 e -4.53, respectivamente, e os valores de correção dos mesmos são +0.4, +0.4, +0.9 e +0.9, respectivamente.[Equação 1]ACq = (valor Cq do grupo do gene de referência) - (valor Cq dos prognósticos ou gene marcador relacionado à capacidade de resposta à quimioterapia) em que o valor Cq do grupo do gene de referência se refere a um valor Cq médio dos genes de referência incluindo ACTB, ATP5E, GPX1, UBB e HPRT1.
- 11. Método, de acordo com a reivindicação 10, CARACTERI ΖΑΡΑ pelo fato de a amostra biológica ser selecionada do grupo que consiste em tecido tumoral fresco, tecido tumoral fresco congelado, tecido tumoral embebido em parafina, um fluido de aspiração com agulha fina, ascites, uma solução de lavagem de tubos, ou um fluido pleural.
- 12. Método, de acordo com a reivindicação 10, CARACTERIΖΑΡΑ pelo fato de a medida dos níveis de expressão do mRNA dos prognósticos ou gene marcador relacionado à capacidade de resposta à quimioterapia e do grupo do gene de referência ser realizada por RT-PCR, RT-PCR competitivo, RT-PCR em tempo real, análise de proteção de RNase, Northern blotting ou um chip de DNA.
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