WO2017164568A1 - V-ATPase subunit V1E1의 단백질 발현 수준을 측정하여 식도암 환자의 생존율과 예후를 예측하는 방법 - Google Patents

V-ATPase subunit V1E1의 단백질 발현 수준을 측정하여 식도암 환자의 생존율과 예후를 예측하는 방법 Download PDF

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esophageal cancer
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atp6v1e1
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엄성희
손성욱
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성균관대학교산학협력단
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    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer

Definitions

  • the present invention relates to a marker for diagnosing or predicting esophageal cancer and its use, and more particularly, to a marker composition for diagnosing or prognostic esophageal cancer comprising mRNA or protein of the ATP6V1E1 gene (V-ATPase subunit V1E1), the mRNA or
  • the present invention relates to a composition for diagnosing or predicting esophageal cancer, including an agent for measuring protein levels, a method for providing information for predicting diagnosis or prognosis, a pharmaceutical composition for preventing or treating esophageal cancer, and a method for screening a substance for treating esophageal cancer.
  • Esophageal cancer is a malignant tumor of the esophagus, the eighth most prevalent and the sixth most common cancer in the world. Esophageal cancers are largely classified into Esophageal squamous cell carcinoma (ESCC) and Esophageal adenocarcinoma (EAC). Squamous cell carcinoma is reported to occur at a high rate of 60-70% of esophageal cancers worldwide, and esophageal adenocarcinoma accounts for 20-30%. Globally, esophageal cancer occurs in 2.5 to 5.0 males and 1.5 to 2.5 females per 100,000 population, and the prevalence varies regionally. 100 per 100,000 population in the region between South Africa and the Caspian Sea and northern China It is reported that the prevalence is over.
  • ESCC Esophageal squamous cell carcinoma
  • EAC Esophageal adenocarcinoma
  • Esophageal cancer is caused by Barrett's esophagus, which is caused by dietary factors, chronic esophageal irritation, smoking, drinking, radiation, and persistent reflux of stomach acid. Esophageal cancer is asymptomatic until significant progress, and it has been reported that many cases have already spread to other tissues when symptoms occur. A typical symptom is dysphagia, which is difficult to swallow, and occurs in more than 90% of esophageal cancers, which continue to progress and do not improve. In addition, weight loss, vomiting, bleeding, hoarseness, and chronic cough may occur, and digestive fluids or foreign objects may be aspirated into the airways, causing aspiration pneumonia.
  • Diagnosis is made by biopsy through an endoscope, which may be done by endoscopy, barium esophography, computed tomography (CT), or endoscopy ultrasound.
  • endoscope computed tomography
  • CT computed tomography
  • esophageal cancer When esophageal cancer is first diagnosed, it has already metastasized to surrounding tissues or distant metastasis.
  • the 5-year survival rate of esophageal cancer is 5-20%, which is a very poor prognosis, so early diagnosis is very important. Therefore, understanding the onset and progression of esophageal cancer is very important, but the research on the molecular mechanisms that induce the onset is insufficient.
  • Vacuolar H + ATPase is composed of a complex consisting of a plurality of subunits.
  • V1 A, B, C, D, E, F, G, and H subunit
  • V0 a, c, c ', c ”, and e subunit domains are electrons Is involved in the movement.
  • V-ATPase is present in the membranes of various organs in cells, such as endosomes, lysosomes, and secretory vesicles, and has an important effect on the function of these organs. In particular, it is known to play an important role in protein isolation and transport, and to perform a variety of functions including acidification of organs within the cell, bone resorption.
  • the pH of the tumor microenvironment is more acidic than normal tissue due to the active glycolysis in the tumor and the increased amount of lactic acid.
  • the acidic environment of these tumors is very important for maintaining tumorigenesis, and this regulatory process is known to be mediated by V-ATPase.
  • V1E1 a subunit of V-ATPase, affects the diagnosis and progression of esophageal cancer cells.
  • the present inventors have conducted extensive studies to discover genetic markers for the diagnosis and prognosis of esophageal cancer, and as a result, the expression level of ATP6V1E1 (V-ATPase subunit V1E1) gene in patients with esophageal cancer and the survival rate and histological grade of tumor It was confirmed that the gene was involved in the growth, metastasis, induction of apoptosis, and the regulation of glucose metabolism in the esophageal cancer cells, and confirmed that the gene is an important factor in the diagnosis, prognosis, and treatment of esophageal cancer. Based on this, the present invention has been completed.
  • V-ATPase subunit V1E1 V-ATPase subunit V1E1
  • an object of the present invention is to provide a marker composition for esophageal cancer diagnosis or prognosis prediction comprising the ATP6V1E1 gene or a protein encoded by the gene.
  • Another object of the present invention is to provide a composition for diagnosing esophageal cancer or prognosis, and a kit for diagnosing or prognostic esophageal cancer comprising an agent for measuring mRNA or protein levels of ATP6V1E1 gene.
  • another object of the present invention is to provide a method for providing information for diagnosing esophageal cancer or predicting prognosis comprising measuring the expression level of mRNA or protein of ATP6V1E1 gene in a biological sample derived from a subject.
  • Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating esophageal cancer, comprising an inhibitor of expression or activity of ATP6V1E1 as an active ingredient.
  • Another object of the present invention is to provide a method for screening a substance for treating esophageal cancer.
  • the present invention provides a marker composition for esophageal cancer diagnosis or prognosis comprising the ATP6V1E1 gene or a protein encoded by the gene.
  • the present invention also provides a composition for diagnosing or predicting esophageal cancer, comprising an agent for measuring the mRNA of the ATP6V1E1 gene or the protein level encoded by the gene.
  • the present invention also provides a kit for esophageal cancer diagnosis or prognosis, comprising the composition.
  • the ATP6V1E1 gene may be composed of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the protein encoded by the ATP6V1E1 gene may be composed of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • the agent for measuring mRNA level may be a sense and antisense primer, or probe that complementarily binds to the mRNA of the gene.
  • the agent for measuring the protein level may be an antibody that specifically binds to the protein encoded by the gene.
  • the present invention also provides a method for providing information for diagnosing or predicting esophageal cancer, comprising measuring the expression level of the mRNA of the ATP6V1E1 gene or the protein encoded by the gene in a biological sample derived from the subject.
  • the expression level of the mRNA is polymerase chain reaction (PCR), reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR), real-time polymerase chain reaction (Real-time PCR), RNase protection assay (RNase) protection assay (RPA), microarray, and northern blotting.
  • the protein expression level is Western blotting, radioimmunoassay (RIA), radioimmunodiffusion, enzyme immunoassay (ELISA), immunoprecipitation (immunoprecipitation) At least one method selected from the group consisting of flow cytometry, immunofluorescence, ouchterlony, complement fixation assay, and protein chip. Can be measured.
  • the prognosis may be relapse, survival, or disease free survival.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of esophageal cancer, comprising an inhibitor of the expression or activity of ATP6V1E1 as an active ingredient.
  • the inhibitor is siRNA (small interfering RNA), shRNA (short hairpin RNA), miRNA (micro RNA), ribozyme (ribozyme), DNAzyme, peptide nucleic acids (PNA), antisense nucleotides, peptides , Antibodies, and aptamers may be one or more selected from the group consisting of.
  • the composition may inhibit the migration and invasion ability of esophageal cancer cells.
  • the composition may inhibit the glucose metabolism of esophageal cancer cells.
  • the present invention also provides a method for screening a therapeutic agent for esophageal cancer, comprising the following steps.
  • the cells may be cells derived from esophageal tissue.
  • the candidate material may be selected from the group consisting of compounds, microbial cultures or extracts, natural product extracts, nucleic acids, and peptides.
  • the step (b) is a polymerase chain reaction (PCR), microarray (microarray), northern blotting (western blotting), Western blotting, enzyme immunoassay (ELISA) ), Immunoprecipitation, immunochemical staining, and immunofluorescence, using at least one method selected from the group consisting of.
  • the present invention also provides a method for preventing or treating esophageal cancer, comprising administering to a subject a composition comprising an inhibitor of the expression or activity of ATP6V1E1 as an active ingredient.
  • the present invention provides a use for the prevention or treatment of esophageal cancer of an expression or activity inhibitor of ATP6V1E1.
  • the present invention also provides a diagnostic or prognostic predictive use of the mRNA of the ATP6V1E1 gene or the protein encoded by the gene.
  • the present inventors have identified a relationship between the expression level of ATP6V1E1 (V-ATPase subunit V1E1) protein, histological grade of esophageal cancer and the survival rate of patients in esophageal tissues derived from esophageal cancer patients. Inhibition of motility, metastasis, apoptosis, and glucose metabolism confirmed that the gene is an important factor for tumorigenesis and development of esophageal cancer.
  • the ATP6V1E1 gene is useful as a genetic marker for the diagnosis and prognosis of esophageal cancer.
  • the present invention may be variously used for screening and developing medicines for treating esophageal cancer therapeutic substances that inhibit the expression or activity of the gene.
  • FIG. 1a and 1b are for evaluating the specificity of the antibody to the V-ATPase subunit V1E1 protein, ATP6V1E1 siRNA (si-V1E1) or non-silencing siRNA (si-NS) in TE8 embedded in esophageal cancer cell line TE8 or paraffin After transfection, the expression level of ATP6V1E1 was confirmed by Western blotting (FIG. 1A) and immunohistochemical staining method (FIG. 1B), and FIG. 1C shows the higher histologic grade of esophageal cancer in esophageal cancer-derived patients. These results show that the V-ATPase subunit V1E1 is highly expressed.
  • Figure 2a analyzes the disease-free survival of esophageal cancer patients according to the evaluation grade (0, 1, 2, 3) for the expression level of the V-ATPase subunit V1E1 in the esophageal tissue derived from esophageal cancer patients 2b and 2c classify tumor grades into stage I + II (FIG. 2B) and stage III + IV (FIG. 2C), respectively, and show disease-free survival rates of esophageal cancer patients according to expression levels of V-ATPase subunit V1E1. (disease-free survival) is shown, Figure 2d shows the disease-free survival (disease-free survival) according to the expression level of the V-ATPase subunit V1E1.
  • Figure 3a is a result showing that the proliferation of esophageal cancer cells (si-V1E1) inhibited the expression of V-ATPase subunit V1E1 is inhibited
  • Figure 3b is a cell cycle related protein (e) Cyclin D, cdk2, p27) and apoptosis-related proteins (bcl-2, cleave-caspase3, cleave-PARP) were confirmed.
  • Figure 4a is a result showing that when the expression of V-ATPase subunit V1E1 inhibited (si-V1E1) reduced the migration and invasion of esophageal cancer cells
  • Figure 4b is the epithelial mesenchyme when the expression of V-ATPase subunit V1E1 is inhibited
  • EMT transition
  • Figure 4c shows the inhibition of cell focal adhesion formation when the expression of V-ATPase subunit V1E1 is inhibited
  • Figure 4d is p- Decreased expression of JNK and p-ERK proteins confirmed cell invasion and focal adhesion mechanisms of V-ATPase subunit V1E1.
  • FIG. 5A and 5B show the results of decreasing lactic acid concentration (FIG. 5A) and decreasing ATP level (FIG. 5B) in esophageal cancer cells (si-V1E1) that inhibited the expression of V-ATPase subunit V1E1.
  • Figure 6a is a result showing the decrease in glucose uptake of esophageal cancer cells (si-V1E1) inhibited the expression of V-ATPase subunit V1E1
  • Figure 6b is glucose uptake and glycolysis in esophageal cancer cells inhibited the expression of V-ATPase subunit V1E1 Results indicate decreased expression of genes involved.
  • FIG. 7A and 7B show oligomycin, FCCP, and rotenone and glucose treatment in esophageal cancer cells (si-V1E1) that inhibited the expression of control (si-NS) or V-ATPase subunit V1E1.
  • Oxygen consumption rate (OCR) (FIG. 7A) and extracellular acidification rate (ECAR) (FIG. 7B) according to the material treatment were measured.
  • the present inventors have made extensive studies to discover genetic markers for the diagnosis and prognosis of esophageal cancer.
  • the present inventors have discovered A-V6A1 (V-ATPase subunit V1E1) gene markers that can be used for diagnosis, prognosis, or treatment of esophageal cancer.
  • A-V6A1 V-ATPase subunit V1E1 gene markers that can be used for diagnosis, prognosis, or treatment of esophageal cancer. was completed.
  • the present invention provides a marker composition for esophageal cancer diagnosis or prognosis prediction comprising the ATP6V1E1 gene or a protein encoded by the gene.
  • the present invention also provides a composition for diagnosing esophageal cancer or prognosis, comprising a preparation for measuring the mRNA level of the ATP6V1E1 gene or a protein encoded by the gene, and a kit for esophageal cancer diagnosis or prognostic prediction comprising the composition.
  • the ATP6V1E1 gene of the present invention may be composed of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, the protein encoded by the ATP6V1E1 gene may be composed of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • Esophageal cancer refers to a malignant tumor occurring in the esophagus.
  • Esophageal squamous cell carcinoma is the most common malignant tumor of the esophagus, and adenocarcinoma, lymphoma and sarcoma are relatively rare.
  • Esophageal cancer is diagnosed by endoscopy, and can be diagnosed by endoscopy, barium esophography, computed tomography (CT), or endoscopy ultrasound. When esophageal cancer is first diagnosed, it is often already metastasized to surrounding tissues or distant metastasis has occurred. Early diagnosis is very important.
  • Diagnosis in the broad sense means to determine the actual condition of the patient in all aspects. The contents of the judgment include the name of the disease, the etiology, the type of disease, the severity, the detailed mode of the condition, and the presence or absence of complications. Diagnosis in the present invention is to determine whether the esophageal cancer and the progression level.
  • prognosis used in the present invention means a prediction about the progression and recovery of a condition, and refers to a prospective or preliminary evaluation. Prognosis in the present invention means, but is not limited to, recurrence, overall survival, or disease-free survival of esophageal cancer.
  • the agent for measuring mRNA level of the ATP6V1E1 gene may be, but is not limited to, a sense and antisense primer or probe that binds to mRNA complementarily.
  • primer refers to an oligonucleotide synthesized for use in diagnosis, DNA sequencing, and the like, as a short gene sequence that is a starting point for DNA synthesis.
  • the primers can be synthesized in a conventional length of 15 to 30 base pairs, but may vary depending on the purpose of use, and may be modified by methylation, capping, or the like by a known method.
  • probe refers to a nucleic acid capable of specifically binding to mRNA of several bases to several hundred bases in length, which has been produced through enzymatic chemical separation or purification. The presence of mRNA can be confirmed by labeling radioisotopes or enzymes, and can be designed and modified by known methods.
  • the agent for measuring the protein level may be an antibody that specifically binds to a protein encoded by a gene, but is not limited thereto.
  • antibody includes immunoglobulin molecules that are immunologically reactive with specific antigens, and include both monoclonal and polyclonal antibodies.
  • antibodies include forms produced by genetic engineering such as chimeric antibodies (eg, humanized murine antibodies) and heterologous antibodies (eg, bispecific antibodies).
  • the kit for predictive diagnosis or prognosis of the present invention consists of one or more different component compositions, solutions or devices suitable for analytical methods.
  • the kit of the present invention may be used to perform genomic DNA derived from a sample to be analyzed, a primer set specific for the marker gene of the present invention, an appropriate amount of DNA polymerase, a dNTP mixture, a PCR buffer, and water to perform PCR. It may be a kit comprising.
  • the PCR buffer may contain KCl, Tris-HCl and MgCl 2 .
  • the components necessary for performing electrophoresis to confirm amplification of PCR products may be further included in the kit of the present invention.
  • kit of the present invention may be a kit including essential elements necessary for performing RT-PCR.
  • RT-PCR kits include test tubes or other appropriate containers, reaction buffers, deoxynucleotides (dNTPs), enzymes such as Taq-polymerase and reverse transcriptase, DNase, RNase inhibitors, DEPC, as well as individual primer pairs specific for the marker gene.
  • dNTPs deoxynucleotides
  • enzymes such as Taq-polymerase and reverse transcriptase
  • DNase DNase
  • RNase inhibitors DEPC
  • individual primer pairs specific for the marker gene include DEPC-water, sterile water, and the like. It may also include primer pairs specific for the genes used as quantitative controls.
  • the kit of the present invention may be a kit containing essential elements necessary for carrying out the DNA chip.
  • the DNA chip kit may include a substrate to which a cDNA corresponding to a gene or a fragment thereof is attached with a probe, and the substrate may include a cDNA corresponding to a quantitative gene or a fragment thereof.
  • the kit of the present invention may be in the form of a microarray having a substrate on which the marker gene of the present invention is immobilized.
  • the kit of the present invention may be a kit comprising the necessary elements necessary to perform an ELISA.
  • ELISA kits include antibodies specific for the marker protein and include agents that measure the protein level.
  • the ELISA kit may comprise reagents capable of detecting an antibody that has formed an “antigen-antibody complex”, such as labeled secondary antibodies, chromopores, enzymes, and substrates thereof. It may also include antibodies specific for quantitative control proteins.
  • antigen-antibody complex means a combination of a protein encoded by a gene and an antibody specific to it.
  • the amount of antigen-antibody complex formed can be measured quantitatively through the magnitude of the signal of the detection label.
  • detection labels may be selected from the group consisting of enzymes, fluorescent materials, ligands, luminescent materials, microparticles, redox molecules and radioisotopes, but are not limited thereto.
  • the present invention also provides a method for providing information for diagnosing or predicting esophageal cancer, comprising measuring the expression level of the mRNA of the ATP6V1E1 gene or the protein encoded by the gene in a biological sample derived from the subject.
  • Biological samples derived from the subject may include, but are not limited to, tissue, cells, whole blood, blood, saliva, sputum, cerebrospinal fluid and urine.
  • the expression level of the mRNA is polymerase chain reaction (PCR), reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR), real-time polymerase chain reaction (Real-time PCR), RNase protection assay (RNase) by conventional methods known in the art protection assay (RPA), microarray, or northern blotting, or one or more methods selected from the group consisting of, but is not limited thereto.
  • PCR polymerase chain reaction
  • RT-PCR reverse transcription polymerase chain reaction
  • Real-time PCR real-time polymerase chain reaction
  • RNase RNase protection assay
  • microarray microarray
  • northern blotting or one or more methods selected from the group consisting of, but is not limited thereto.
  • the protein expression level is Western blotting, radioimmunoassay (RIA), radioimmunodiffusion, enzyme immunoassay (ELISA), immunoprecipitation (immunoprecipitation) by conventional methods known in the art
  • RIA radioimmunoassay
  • ELISA enzyme immunoassay
  • immunoprecipitation immunoprecipitation
  • the term "information providing method for diagnosis or prognosis of esophageal cancer" used in the present invention is a preliminary step for diagnosis or prediction of prognosis and provides objective basic information necessary for the diagnosis or prognosis of esophageal cancer and the clinical Judgment or opinion is excluded.
  • the present inventors Using pathological data on the survival of esophageal tissues and patients from esophageal cancer patients, the present inventors have found that the expression level of the ATP6V1E1 gene is closely related to the pathological grade of esophageal cancer tumors and the survival rate of patients.
  • ATP6V1E1 protein is not expressed in normal individuals, but according to the histological grade of esophageal cancer tumors. It was confirmed that the expression of the gene is increased (see Example 3).
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of esophageal cancer comprising an inhibitor of the expression or activity of ATP6V1E1 as an active ingredient.
  • prevention means any action that inhibits or delays the development of esophageal cancer by administration of a pharmaceutical composition according to the present invention.
  • treatment means any action that improves or advantageously changes the symptoms of esophageal cancer by administration of the pharmaceutical composition according to the present invention.
  • the expression or activity inhibitors include small interfering RNA (siRNA), short hairpin RNA (shRNA), microRNA (miRNA), ribozyme, DNAzyme, peptide nucleic acids (PNA), antisense nucleotides, peptides, antibodies, and apta. It may be one or more selected from the group consisting of mer, preferably siRNA that inhibits the expression of the ATP6V1E1 gene, but is not limited thereto.
  • ATP6V1E1 siRNA was transfected into the esophageal cancer cell line to inhibit the expression of the gene, analyzes changes in the proliferation, survival, death and metastatic ability of the esophageal cancer cell line, and the function of the gene in esophageal cancer cells was identified.
  • esophageal cancer cells that inhibited the expression of ATP6V1E1 inhibited proliferation compared to control cells, G1 cell cycle arrest occurs through decreased expression of proteins involved in cell cycle progression, and apoptosis (apoptosis). ) It was confirmed that apoptosis was induced through increased expression of induction-related proteins (see Example 6).
  • the migration and invasive ability is suppressed in esophageal cancer cells that inhibited the expression of ATP6V1E1, the expression of EMT-related genes that occur first during the metastasis of cancer cells is reduced, and FAK (Focal) Adhesion kinase) It was confirmed that the focal adhesion of esophageal cancer cells is inhibited by reducing phosphorylation of ERK and JNK sub signaling proteins (see Example 7).
  • ATP6V1E1 is closely involved in the proliferation and survival, death, metastasis, and glucose metabolism of esophageal cancer cells, and therefore, expression or activity inhibition of ATP6V1E1 may be usefully used for the prevention or treatment of esophageal cancer.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention includes an inhibitor of the expression or activity of ATP6V1E1 as an active ingredient, and may further include a pharmaceutically acceptable carrier.
  • pharmaceutically acceptable carriers are conventionally used in the preparation, and include, but are not limited to, saline solution, sterile water, Ringer's solution, buffered saline, cyclodextrin, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, ethanol, liposomes, and the like. If necessary, other conventional additives such as antioxidants and buffers may be further included.
  • diluents, dispersants, surfactants, binders, lubricants and the like may be additionally added to formulate injectable formulations, pills, capsules, granules or tablets such as aqueous solutions, suspensions, emulsions and the like.
  • Suitable pharmaceutically acceptable carriers and formulations can be preferably formulated according to the individual components using methods disclosed in Remington's literature.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited in formulation, but may be formulated as an injection, inhalant, or external skin preparation.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered orally or parenterally (for example, intravenously, subcutaneously, intraperitoneally or topically) according to the desired method, but preferably orally, Depends on the condition and weight of the patient, the extent of the disease, the form of the drug, the route of administration and the time of day, and may be appropriately selected by those skilled in the art.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is administered in a pharmaceutically effective amount.
  • pharmaceutically effective amount means an amount sufficient to treat or diagnose a disease at a reasonable benefit / risk ratio applicable to medical treatment or diagnosis, and an effective dose level refers to a patient's disease type, severity, or drug. Can be determined according to the activity of the drug, the sensitivity to the drug, the time of administration, the route of administration and the rate of release, the duration of treatment, factors including the drug used concurrently and other factors well known in the medical field.
  • the pharmaceutical compositions according to the present invention may be administered as individual therapeutic agents or in combination with other therapeutic agents, may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents, and may be single or multiple administrations. Taking all of the above factors into consideration, it is important to administer an amount that can obtain the maximum effect in a minimum amount without side effects, which can be easily determined by those skilled in the art.
  • the effective amount of the pharmaceutical composition of the present invention may vary depending on the age, sex, condition, weight of the patient, the absorption of the active ingredient in the body, the inactivation rate and excretion rate, the type of disease, the drug used in general 0.001 to 150 mg, preferably 0.01 to 100 mg per kg of body weight may be administered daily or every other day, or divided into 1 to 3 times a day.
  • the dosage may be increased or decreased depending on the route of administration, the severity of obesity, sex, weight, age, etc., and the above dosage does not limit the scope of the present invention in any way.
  • the present invention comprises the steps of treating a candidate with a cell in vitro; Measuring the expression or activity of the ATP6V1E1 gene of the cells; And selecting a substance that reduces expression or activity of ATP6V1E1 as a therapeutic agent for esophageal cancer as compared to a candidate non-treatment group.
  • the cell may be a cell derived from esophageal tissue, but is not limited thereto.
  • the candidate may be selected from the group consisting of compounds, microbial cultures or extracts, natural product extracts, nucleic acids, and peptides, but is not limited thereto.
  • the expression or activity of the ATP6V1E1 gene may be measured by polymerase chain reaction (PCR), microarray, northern blotting, western blotting, enzyme immunoassay (ELISA), immunoprecipitation method ( It may be carried out using one or more methods selected from the group consisting of immunoprecipitation, immunochemical staining (immunohistochemistry), and immunofluorescence (immunofluorescence).
  • PCR polymerase chain reaction
  • ELISA enzyme immunoassay
  • immunoprecipitation method It may be carried out using one or more methods selected from the group consisting of immunoprecipitation, immunochemical staining (immunohistochemistry), and immunofluorescence (immunofluorescence).
  • esophageal tissues were obtained from surgical procedures from 160 esophageal cancer patients and 31 normal subjects, and received pathological data about the esophageal cancer patients stored from 1996 to 2007 from the pathology department of Samsung Seoul Hospital. Esophageal tissue was classified pathological features based on tumor node metastasis (TNM) classification. All esophageal tissues were fixed in 10% formalin and then embedded in paraffin.
  • TPM tumor node metastasis
  • xylene was treated with esophageal cancer patients or normal human-derived esophageal tissue embedded in paraffin to deparaffinize and rehydrate.
  • the tissues are then microwaved in the presence of TrisEDTA buffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 9.5) at 98 ° C. for 20 minutes to expose antigens in tissues and peroxidase on slides to inhibit nonspecific binding of antibodies.
  • Blocking solution (Dako REAL TM Peroxidase Blocking Solution; Dako, CA, USA) was treated for 8 minutes.
  • the tissues were treated with ATP6V1E1-specific primary antibody (Sigma, USA) diluted 1: 100 and incubated with washing buffer (0.1% Tween 20 in distilled water), DAKO REAL EnVision / HRP, Rabbit / Mouse (Envision) detection solution was treated and reacted. After the reaction, the tissues were rinsed once again, and the chromogen was sensitized. The slides were then counterstained with Meyers hematoxylin, dehydrated, mounted with Canada balsam and observed under a microscope.
  • Immunohistochemical staining was performed on the esophageal cancer patients or normal human-derived esophageal tissues according to the method described above with a primary antibody against ATP6V1E1 and observed under a microscope, and then staining intensity and V-ATPase subunit V1E1 were examined. The percentage of cells stained with antibodies was evaluated and scored. Staining intensity was evaluated as 1 (weak), 2 (medium), or 3 (strong), and the percentage of stained cells was 1 ( ⁇ 5%), 2 (5% -25%), 3 (26% -50) %), 4 (51% -75%), or 5 (> 75%). Then, the score for immunohistochemical staining was calculated by multiplying the scores of the staining intensity and the percentage of stained cells.
  • Human esophageal cancer cell line TE8 was supplied from RIKEN (Saitama, Japan) and cultured in RPMI1640 medium to which 10% FBS (Invitrogen, CA, USA) was added.
  • SiRNA siATP6V1E1, 5'-CAGATGTCCAATTTGATGAAT-3 '
  • ATP6V1E1 5'-CAGATGTCCAATTTGATGAAT-3 '
  • Gfectin GP2000
  • a nonsilencing control siRNA Qiagen, Germany
  • Radio-ImmunoPrecipitation Assay (RIPA) buffer (150 mM NaCl, 50 mM Tris-Cl, pH 7.4, 1 mM ethylenediaminetetraacetic acid), 1% Nonidet P-40 (NP-40), 0.25% Na in human esophageal cancer cell TE8 -deoxycholate, and protease inhibitors) were lysed and placed on ice for 10 minutes, and then the whole cell lysates were centrifuged to obtain protein extracts. Subsequently, SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) is performed using a protein of a suitable concentration so that the protein is separated in acrylamide gel according to its size, and then transferred to an electrical flow.
  • RIPA Radio-ImmunoPrecipitation Assay
  • the proteins in the gel were then transferred to the PVDF membrane. Then, the primary antibody specific for each protein to be observed was incubated by treating the membrane.
  • the primary antibodies used in this example are as listed below. ATP6V1E1 from Sigma, USA; p-JNK (Thr183 / Tyr185), extracellular signal-regulated kinase (ERK), p-ERK, p-paxillin (Tyr 118), cleave-caspase3, cleave-PARP, AKT, p-AKT, PKM2, p-PKM2, AMPK, p-AMPK, mTOR, and p-mTOR (Cell Signaling Technology); Cjun Nterminal kinase (JNK), cyclin D, cdk2, p27, p-FAK (Tyr 397), focal adhesion kinase (FAK), Bcl-2, and ⁇ -actin (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA); paxillin (BD Bio
  • TE8 cells which are human esophageal cancer cells
  • trypan blue solution was suspended and aliquoted and left at room temperature for 5 minutes after treatment with trypan blue solution. Then, using a hemocytometer (hemocytometer) to measure the number of live cells that are not stained trypan blue.
  • transwell chambers (Costar Inc., CA, USA) were used to perform in vitro Matrigel invasion assays.
  • Transwell filters were coated with Matrigel, seeded with cells on Matrigel and then incubated. The filter was then removed from the chamber, the cells penetrated into the Matrigel were fixed and stained with hematoxylin & eosin. The cells attached to the filter were counted under an optical microscope.
  • Migration assay was performed in a similar manner to the invasion assay without the filter coated with Matrigel. The experiments were repeated three times independently.
  • TE8 a human esophageal cancer cell
  • PBS paraformaldehyde
  • NP-40 paraformaldehyde
  • BSA bovine serum albumin
  • a primary antibody specific for p-paxillin is treated and reacted, followed by treatment with a rhodamine-bound anti-mouse secondary antibody (Santa Cruz Biotechnology), or 1 mg / ml Hoechst (Invitrogen).
  • Alexa 488 phalloidin Alexa 488 phalloidin (Invitrogen) was treated and incubated. After mounting using an antifading mounting medium (Dako North America), the cells were observed under a fluorescence microscope (Axiovert, Zeiss, Germany).
  • Intracellular lactate concentration and ATP production were measured using a colorimetric L-Lactate assay kit (abcam) and an EnzyLightTM ADP / ATP Ratio Assay kit (bioassay system), respectively, and the total cell number was measured for calibration.
  • TE8 a human esophageal cancer cell, was seeded 2 ⁇ 10 5 / well in 6-well plates and incubated for 24 hours, followed by transfection of ATP6V1E1 siRNA or nonsilencing siRNA according to the method described in Example 1-4. After 72 hours, all culture medium was removed and fluorinated 2-NBDG (2-deoxy-2 [(7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-yl) amino] -D-glucose with 10 uM concentration was removed. Fresh culture medium with or without) was added 2 ml of each well. Thereafter, the cells were further incubated for 1 hour at 37 ° C. and 5% CO 2 , followed by flow cytometry analysis.
  • Oxidative phosphorylation was analyzed by measuring extracellular acidification rate (ECAR) and oxygen consumption rate (OCR) using Seahorse XF24 extracellular flux analyzers, respectively. It was.
  • the clinical and pathologic characteristics of 160 esophageal cancer patients described in Example 1-1 may include age, sex, tumor size, differentiation, tumor nodule metastasis (TNM) stage, tumor invasion, and lymph node metastasis (LN metastasis). , And classified as distant metastasis is shown in Table 2 below.
  • V-ATPase subunit V1E1 in esophageal tissues of normal and esophageal cancer patients, we first examined the specificity of antibodies against V1A1 subunit of V-ATPase. To this end, the expression levels of V-ATPase subunit V1E1 were measured using TE8 cell blocks embedded in human esophageal cancer cell line TE8 and paraffin. As a result, as shown in FIGS. 1A and 1B, when the cells were transfected with ATP6V1E1 siRNA to inhibit expression (si V1E1), the intracellular V- compared to the control group (si NS) transfected with nonsilencing siRNA. It was confirmed that the expression of the ATPase subunit V1E1 was significantly reduced. The results indicate that the specificity of the antibody detecting the V-ATPase subunit V1E1 is high.
  • V1E1 after immunohistochemical staining was performed on the esophageal tissue isolated from 31 normal persons and 160 esophageal cancer patients using Example 1-1 according to the method of Example 1-2 using the antibody confirmed in the above specificity.
  • the expression level of the subunit was observed.
  • FIG. 1C expression of V1E1 protein was not observed in non-tumor-derived esophageal tissues, whereas in tissues derived from esophageal cancer patients in proportion to histological grades (Weak, Moderate, Strong). It was confirmed that the expression of the V1E1 protein is increased.
  • V-ATPase subunit V1E1 To analyze the relationship between the expression level of V-ATPase subunit V1E1 and the survival rate of patients in esophageal cancer, histologic immunohistostaining was performed on esophageal tissues derived from normal and esophageal cancer patients. After calculating and dividing into 1 (low), 2 (medium), and 3 (high) groups according to the score, the survival rate was analyzed for each group including the normal 0 (none) and represented as a Kaplan-Meier survival curve. As a result, as shown in FIG. 2A, in a patient group in which V1E1 is expressed at a high score of two or more immunohistochemistry scores, the disease-free survival time is less than two points in V1E1. It was confirmed that the expression level is shorter than the low patient group.
  • the disease free survival rate of the esophageal cancer patients according to the expression level of V1E1 revealed that the high expression level of V1E1 was significantly associated with the decrease in the survival rate of the esophageal cancer patients.
  • V-ATPase subunit V1E1 is available as a marker for prognosis and prediction of esophageal cancer.
  • V-ATPase subunit V1E1 As an independent diagnostic marker in esophageal cancer, multivariate analysis of V-ATPase subunit V1E1 for disease free survival in patients with esophageal cancer using Cox proportional hazard regression. analyses). To this end, the analysis was performed by substituting Cox proportional risk regression models with the patient's age, tumor nodule metastasis grade (TNM stage), chemotherapy and radiotherapy treatment scores as well as scores for the expression level of V-ATPase subunit V1E1. .
  • V-ATP6V1E1 As a result, as shown in Table 3, the expression of the V-ATP6V1E1 protein was confirmed to be independent of the disease-free survival rate diagnostic factors. Tumor nodule metastasis grades III and IV were also confirmed to be independent of disease-free survival and overall survival diagnostic factors. In addition, disease-free survival and overall survival of patients with relapse of esophageal cancer who had undergone radiotherapy were found to be rare in the group of patients expressing high levels of V-ATP6V1E1.
  • V-ATPase subunit V1E1 overexpression is associated with tumor nodule metastasis grade and esophageal cancer relapse patients who received radiation therapy.
  • V-ATPase is associated with cell growth, including cell size and survival
  • V-ATPase subunit V1E1 affects the survival of esophageal cancer cells.
  • V-ATPase subunit V1E1 affects apoptosis in TE8 esophageal cancer cells.
  • the expression changes of proteins involved in apoptosis were observed through Western blot.
  • the expression of bcl-2 protein involved in apoptosis inhibition was reduced compared to the control (si NS), cleaved caspase3 and cleaved PARP ( Poly [ADPribose] polymerase 1) was found to significantly increase the expression of the protein.
  • V-ATPase subunit V1E1 affects the survival and proliferation of esophageal cancer cells and apoptosis through apoptosis.
  • V-ATP6V1E1 siRNA si-V1E1
  • si-NS non-silencing siRNA
  • V-ATPase subunit V1E1 when the expression of the V-ATPase subunit V1E1 was inhibited, it was confirmed that migration and invasion of TE8 esophageal cancer cells were inhibited. This means that the V-ATPase subunit V1E1 affects the metastatic properties of esophageal cancer cells.
  • V- to epithelial-mesenchymal transition EMT
  • MMP2 matrix metalloproteinases 2
  • MMP7 matrix metalloproteinases 7
  • V1E1 expression affects focal adhesion of esophageal cancer cells.
  • V-ATPase subunit V1E1-mediated esophageal cancer cells Furthermore, in order to investigate the molecular mechanism of focal adhesion and invasion of V-ATPase subunit V1E1-mediated esophageal cancer cells, the expression changes of signaling pathway-related proteins that mediate cell movement were observed through Western blot. As a result, as shown in FIG. 4D, when the expression of the V-ATPase subunit V1E1 is inhibited, extracellular signal regulated kinase (ERK) and JNK (C-Jun N-terminal kinase), which are sub-regulators of FAK, are involved in cell movement mediated signaling pathways. ) Phosphorylation (p-ERK and p-JNK) of the protein was confirmed to decrease.
  • ERK extracellular signal regulated kinase
  • JNK C-Jun N-terminal kinase
  • V-ATPase subunit V1E1 positively regulates cell motility and focal adhesion formation through FAK and its sub-regulators, ERK and JNK.
  • V-ATPase subunit V1E1 affect aerobic glycolysis in esophageal cancer cells? To find out.
  • V-ATP6V1E1 siRNA si-V1E1
  • si-NS non-silencing siRNA
  • TE8 cells which are esophageal cancer cell lines
  • the concentrations of lactic acid and ATP which are the main energy sources produced by glycolysis, were measured.
  • Figures 5a and 5b when the expression of V-ATPase subunit V1E1 was inhibited, both lactic acid and ATP concentration in esophageal cancer cells significantly decreased compared to the control (si-NS).
  • the results show that V-ATPase subunit V1E1 is involved in regulating metabolic flow for aerobic glycolysis in mitochondrial respiration.
  • the change in glucose uptake was measured according to the method of Example 1-11 to determine whether inhibition of expression of V-ATPase subunit V1E1 affects glucose uptake of cells.
  • FIG. 6A when the expression of the V-ATPase subunit V1E1 was inhibited, it was confirmed that the glucose uptake was significantly reduced compared to the control group (si-NS). This was thought to be related to the reduction of lactate concentration in cells where the expression of the V-ATPase subunit V1E1 was inhibited.
  • V-ATPase subunit V1E1 When the expression of V-ATPase subunit V1E1 was inhibited through Examples 8-1 and 8-2, it was confirmed that the concentration of lactic acid and ATP in esophageal cancer cells was decreased, and the glucose uptake rate of cells was decreased. Thus, V-ATPase subunit V1E1 was decreased.
  • OCR oxygen consumption rate
  • ECAR extracellular acidification rate
  • FCCP plays a role in facilitating respiration in mitochondria
  • rotenone is a substance that inhibits the electron transport system in mitochondria.
  • OXPHOS mitochondrial oxidative phosphorylation
  • glycolysis is known to be mediated by the PI3K (phosphoinositide 3 kinase) / AKT signaling pathway.
  • PI3K phosphoinositide 3 kinase
  • AKT phosphoinositide 3 kinase
  • PKM2 pyruvate kinase M2
  • V-ATPase subunit V1E1 when the expression of V-ATPase subunit V1E1 was inhibited, the total AKT and PKM2 protein expression in esophageal cancer cells did not differ, whereas p-AKT (ser473) and p-PKM2 (Tyr105). Expression decreased compared to the control (si-NS). The results indicate that the V-ATPase subunit V1E1 promotes glycolysis via AKT and PKM2.
  • V-ATPase subunit V1E1 (ATP6V1E1)
  • PKM2 PKM2 gene
  • RNA sequence analysis was performed on Cancer Genome Atlas (TCGA) for 1170 tumors isolated from esophageal cancer patients.
  • TCGA Cancer Genome Atlas
  • V-ATPase subunit V1E1 plays a very important role in aerobic glycolysis by regulating ATP concentration, lactic acid synthesis, expression of glycolytic enzymes, and glucose metabolism in esophageal cancer cells.
  • the present invention has elucidated the relationship between the expression level of ATP6V1E1 (V-ATPase subunit V1E1) protein, the histological grade of esophageal cancer and the survival rate of patients in esophageal tissues derived from esophageal cancer patients. Inhibition of motility, metastasis, apoptosis, and glucose metabolism has shown that the ATP6V1E1 gene is an important factor for tumorigenesis and development of esophageal cancer.ATP6V1E1 gene can be usefully used as a gene marker for the diagnosis and prognosis of esophageal cancer. In addition, it is expected to be useful for screening and treating drugs for esophageal cancer therapeutic substances that inhibit the expression or activity of the ATP6V1E1 gene.
  • V-ATPase subunit V1E1 V-ATPase subunit V1E1

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Abstract

본 발명은 식도암 진단 또는 예후 예측용 마커 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명자들은 식도암 환자 유래 식도 조직에서 ATP6V1E1(V-ATPase subunit V1E1) 단백질의 발현수준과 식도암의 조직학적 등급 및 환자의 생존율간의 관련성이 있음을 규명하였고, ATP6V1E1 유전자의 발현 저해 시 식도암 세포의 증식, 운동성, 전이, 세포사멸, 및 당 대사능이 억제되는 것을 통해 상기 유전자가 식도암의 종양형성 및 발달에 중요한 인자임을 확인하였는바, 상기 ATP6V1E1 유전자는 식도암의 진단 및 예후 예측을 위한 유전자 마커로써 유용하게 이용될 수 있으며, 상기 유전자의 발현 또는 활성을 억제하는 식도암 치료물질의 스크리닝 및 의약품 개발 용도로도 다양하게 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

V-ATPase subunit V1E1의 단백질 발현 수준을 측정하여 식도암 환자의 생존율과 예후를 예측하는 방법
본 발명은 식도암 진단 또는 예후 예측용 마커 및 이의 용도에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 ATP6V1E1(V-ATPase subunit V1E1) 유전자의 mRNA 또는 단백질을 포함하는 식도암의 진단 또는 예후 예측용 마커 조성물, 상기 mRNA 또는 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는 식도암 진단 또는 예후 예측용 조성물, 진단 또는 예후 예측을 위한 정보제공방법, 식도암 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 및 식도암 치료물질의 스크리닝 방법 등에 관한 것이다.
식도암(Esophageal cancer)은 식도에 발생하는 악성 종양으로, 세계에서 8번째로 유병률이 높으며, 사망률은 6번째로 높은 암으로 알려져 있다. 식도암은 크게 식도 편평상피세포암(Esophageal squamous cell carcinoma; ESCC) 및 식도 선암(Esophageal adenocarcinoma; EAC)으로 분류된다. 편평상피세포암은 전 세계 식도암 중 60~70%의 높은 비율로 발병하며, 식도 선암은 20~30%를 차지한다고 보고되어 있다. 전 세계적으로 식도암은 인구 100,000명당 남자는 2.5~5.0명, 여자는 1.5~2.5명 꼴로 발생하고 있으며, 지역적으로 유병률에 차이가 있는데 남아프리카-카스피해 근방 및 중국 북부지역을 잇는 지역에서는 인구 100,000명당 100명이 넘은 유병률을 보인다고 보고되어 있다.
식도암은 식이요소, 만성적인 식도 자극, 흡연, 음주, 방사선, 및 지속적인 위산의 역류에 의해 유발되는 바레트 식도(Barrett’s esophagus) 등이 원인으로 작용하여 유발된다. 식도암은 상당히 진행될 때까지 증상이 없으며, 증상이 나타났을 때는 이미 다른 조직으로 전이된 경우가 많다고 보고되어 있다. 대표적인 증상으로는 음식물을 삼키기 힘든 연하곤란이며, 90% 이상의 식도암에서 나타나고, 이는 만성적으로 계속 진행되며 호전되지 않는다. 또한, 체중 감소, 구토, 출혈, 쉰 목소리, 만성 기침이 나타날 수 있고, 소화액이나 이물질 등이 기도로 잘못 흡인되어 흡인성 폐렴이 유발되기도 한다.
진단은 내시경을 통한 조직검사를 통해 이루어지며, 내시경, 바륨 식도조영술, 컴퓨터단층촬영(CT), 또는 내시경 초음파를 통해 검사가 이루어진다. 식도암은 처음 진단되었을 때 이미 주변 조직으로 전이된 상태이거나 원격 전이가 발생한 경우가 많으며, 식도암의 5년 생존율은 5~20%로 예후가 매우 좋지 않은 암에 속하므로, 조기 진단이 매우 중요하다. 따라서 식도암의 발병 및 진행에 대한 이해가 매우 중요하나, 발병을 유도하는 분자적 기작에 대한 연구가 미흡한 실정이다.
한편, Vacuolar H+ATPase(V-ATPase)는 다수의 서브유닛으로 구성된 복합체로 구성되어 있다. V1(A,B,C,D,E,F,G, 및 H 서브유닛) 도메인은 ATP 가수분해에 관여하고, V0(a, c, c’, c”, 및 e 서브유닛) 도메인은 전자의 이동에 관여한다.
V-ATPase은 엔도좀(endosome), 리소좀(lysosome), 및 분비소포(secretory vesicle)와 같은 세포 내 다양한 기관의 막에 존재하여 상기 기관들의 기능에 중요한 영향을 미친다. 특히, 단백질 분리 및 수송에 중요한 역할을 하고, 세포 내 기관의 산성화, 골흡수(bone resorption)를 포함한 다양한 기능을 수행한다고 알려져 있다.
종양 미세 환경(tumor microenvironment)의 pH는 종양에서 해당과정이 활발히 일어나고 젖산의 양이 증가하기 때문에 정상 조직보다 더 산성을 나타낸다. 이러한 종양의 산성환경은 종양형성(tumorigenesis)을 유지하는데 매우 중요하며, 이러한 조절 과정은 V-ATPase에 의해 매개된다고 알려져 있다.
그러나 아직까지 V-ATPase의 서브유닛인 V1E1이 식도암의 진단 및 식도암세포의 발병 및 진행에 어떠한 영향을 미치는지 그 연관성에 대해서는 알려진 바가 없다.
본 발명자들은 식도암의 진단 및 예후 예측을 위한 유전자 마커를 발굴하기 위해 예의 연구한 결과, 식도암 환자 유래 식도 조직에서 ATP6V1E1(V-ATPase subunit V1E1) 유전자의 발현 수준과 환자의 생존율 및 종양의 조직학적 등급 간의 상관관계가 있음을 확인하였고, 상기 유전자가 식도암 세포의 성장, 전이, 세포사멸 유도, 및 당 대사 조절에 관여함을 실험적으로 규명함으로써 식도암의 진단 및 예후 예측, 치료에 중요한 인자임을 확인하였는바, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명은 ATP6V1E1 유전자 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질을 포함하는, 식도암 진단 또는 예후 예측용 마커 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 ATP6V1E1 유전자의 mRNA 또는 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 식도암 진단 또는 예후 예측용 조성물 및 이를 포함하는 진단 또는 예후 예측용 키트를 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 피검체 유래의 생물학적 시료에서 ATP6V1E1 유전자의 mRNA 또는 단백질의 발현수준을 측정하는 단계를 포함하는, 식도암 진단 또는 예후 예측을 위한 정보제공방법을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 ATP6V1E1의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는, 식도암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 식도암 치료물질의 스크리닝 방법을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 ATP6V1E1 유전자 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질을 포함하는, 식도암 진단 또는 예후 예측용 마커 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 ATP6V1E1 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 식도암 진단 또는 예후 예측용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는, 식도암 진단 또는 예후 예측용 키트를 제공한다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 ATP6V1E1 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 ATP6V1E1 유전자가 코딩하는 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 mRNA 수준을 측정하는 제제는 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 센스 및 안티센스 프라이머, 또는 프로브일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 단백질 수준을 측정하는 제제는 유전자가 코딩하는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체일 수 있다.
또한, 본 발명은 피검체 유래의 생물학적 시료에서 ATP6V1E1 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 발현수준을 측정하는 단계를 포함하는, 식도암 진단 또는 예후 예측을 위한 정보제공방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 mRNA의 발현수준은 중합효소연쇄반응(PCR), 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR), 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection assay; RPA), 마이크로어레이(microarray), 및 노던 블롯팅(northern blotting)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방법을 통해 측정될 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 단백질 발현수준은 웨스턴 블롯팅(western blotting), 방사선면역분석법(radioimmunoassay; RIA), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 효소면역분석법(ELISA), 면역침강법(immunoprecipitation), 유세포분석법(flow cytometry), 면역형광염색법(immunofluorescence), 오우크테로니(ouchterlony), 보체 고정 분석법(complement fixation assay), 및 단백질 칩(protein chip)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방법을 통해 측정될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 예후는 재발, 생존, 또는 무병생존인 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 ATP6V1E1의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는, 식도암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 억제제는 siRNA(small interfering RNA), shRNA(short hairpin RNA), miRNA(micro RNA), 리보자임(ribozyme), DNAzyme, PNA(peptide nucleic acids), 안티센스 뉴클레오티드, 펩타이드, 항체, 및 압타머로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 조성물은 식도암 세포의 이동(migration) 및 침습(invasion)능을 억제할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 조성물은 식도암 세포의 포도당 대사과정을 억제할 수 있다.
또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 식도암 치료물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
(a) In vitro 상에서 세포에 후보물질을 처리하는 단계;
(b) 상기 세포의 ATP6V1E1 유전자의 발현 또는 활성을 측정하는 단계; 및
(c) 후보물질 비처리군에 비해 ATP6V1E1의 발현 또는 활성을 감소시키는 물질을 식도암의 치료물질로 선정하는 단계.
본 발명의 일 구현예로, 상기 세포는 식도조직 유래 세포일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 후보물질은 화합물, 미생물 배양액 또는 추출물, 천연물 추출물, 핵산, 및 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 (b) 단계는 중합효소연쇄반응(PCR), 마이크로어레이(microarray), 노던 블롯팅(northern blotting), 웨스턴 블롯팅(western blotting), 효소면역분석법(ELISA), 면역침강법(immunoprecipitation), 면역화학염색법(immunohistochemistry), 및 면역형광염색법(immunofluorescence)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방법을 이용하여 측정될 수 있다.
또한, 본 발명은 ATP6V1E1의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 식도암의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 ATP6V1E1의 발현 또는 활성 억제제의 식도암의 예방 또는 치료 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 ATP6V1E1 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 식도암 진단 또는 예후 예측 용도를 제공한다.
본 발명자들은 식도암 환자 유래 식도 조직에서 ATP6V1E1(V-ATPase subunit V1E1) 단백질의 발현수준과 식도암의 조직학적 등급 및 환자의 생존율간의 관련성이 있음을 규명하였고, ATP6V1E1 유전자의 발현 저해 시 식도암 세포의 증식, 운동성, 전이, 세포사멸, 및 당 대사능이 억제되는 것을 통해 상기 유전자가 식도암의 종양형성 및 발달에 중요한 인자임을 확인하였는바, 상기 ATP6V1E1 유전자는 식도암의 진단 및 예후 예측을 위한 유전자 마커로써 유용하게 이용될 수 있으며, 상기 유전자의 발현 또는 활성을 억제하는 식도암 치료물질의 스크리닝 및 의약품 개발 용도로도 다양하게 활용될 수 있을 것으로 기대된다.
도 1a 및 도 1b는 V-ATPase subunit V1E1 단백질에 대한 항체의 특이성을 평가하기 위한 것으로, 식도암 세포주 TE8 또는 파라핀에 포매시킨 TE8에 ATP6V1E1 siRNA(si-V1E1) 또는 non-silencing siRNA(si-NS)를 트랜스펙션한 후 웨스턴 블롯팅(도 1a) 및 면역조직화학염색법(도 1b)을 통해 ATP6V1E1의 발현수준을 확인한 결과이고, 도 1c는 식도암 환자 유래 식도 조직에서 식도암의 조직학적 등급이 높을수록 V-ATPase subunit V1E1이 높게 발현되는 것을 보여주는 결과이다.
도 2a는 식도암 환자 유래 식도 조직에서 면역조직화학염색결과 V-ATPase subunit V1E1의 발현 수준에 대한 평가 등급(0, 1, 2, 3)에 따른 식도암 환자의 무병생존율(disease-free survival)을 분석하여 나타낸 것이고, 도 2b 및 도 2c는 종양등급을 각각 stage Ⅰ+Ⅱ(도 2b) 및 stage Ⅲ+Ⅳ(도 2c)로 분류하고, V-ATPase subunit V1E1의 발현 수준에 따른 식도암 환자의 무병생존율(disease-free survival)을 나타낸 것이며, 도 2d는 V-ATPase subunit V1E1의 발현 수준에 따른 무병생존율(disease-free survival)을 나타낸 것이다.
도 3a는 V-ATPase subunit V1E1의 발현을 저해시킨 식도암 세포(si-V1E1)의 증식이 저해됨을 나타내는 결과이고, 도 3b는 V-ATPase subunit V1E1의 발현을 저해시킨 식도암 세포에서 세포 주기 관련 단백질(cyclin D, cdk2, p27)과 세포자멸사(apoptosis) 관련 단백질(bcl-2, cleave-caspase3, cleave-PARP)의 발현변화를 확인한 결과이다.
도 4a는 V-ATPase subunit V1E1의 발현을 저해시킨 경우(si-V1E1) 식도암 세포의 이동 및 침습이 감소하는 것을 나타내는 결과이고, 도 4b는 V-ATPase subunit V1E1의 발현을 저해시킨 경우 상피중간엽이행(EMT) 관련 유전자(vimentin, MMP2, MMP7)의 발현 감소를 나타내는 결과이며, 도 4c는 V-ATPase subunit V1E1의 발현을 저해시킨 경우 세포 초점접착 형성 억제를 보여주는 결과이고, 도 4d는 p-JNK 및 p-ERK 단백질의 발현 감소를 통해 V-ATPase subunit V1E1의 세포 침습 및 초점접착 기전을 확인한 결과이다.
도 5a 및 5b는 V-ATPase subunit V1E1의 발현을 저해시킨 식도암 세포(si-V1E1) 내의 젖산 농도 감소(도 5a) 및 ATP 수준 감소(도 5b)를 나타내는 결과이다.
도 6a는 V-ATPase subunit V1E1의 발현을 저해시킨 식도암 세포(si-V1E1)의 포도당 흡수율 감소를 보여주는 결과이고, 도 6b는 V-ATPase subunit V1E1의 발현을 저해시킨 식도암 세포에서 포도당 흡수 및 당 분해에 관여하는 유전자들의 발현 감소를 나타내는 결과이다.
도 7a 및 7b는 대조군(si-NS) 또는 V-ATPase subunit V1E1의 발현을 저해시킨 식도암 세포(si-V1E1)에 올리고마이신(oligomycin), FCCP, 및 로테논(rotenone)을 처리하고 포도당을 처리한 후 상기 물질 처리에 따른 산소 소비율(oxygen consumption rate; OCR)(도 7a) 및 세포 외 산성화율(extracellular acidification rate; ECAR)(도 7b)을 측정한 결과이다.
도 8은 V-ATPase subunit V1E1의 발현을 저해시킨 식도암 세포(si-V1E1)에서 p-PKM2와 p-AKT의 발현 감소를 통해 V-ATPase subunit V1E1의 해당과정 촉진 기전을 확인한 결과이다.
도 9는 식도암 환자로부터 분리된 1170개의 종양에 대한 RNA 서열분석 결과를 통해 ATP6V1E1(V-ATPase subunit V1E1) 및 PKM2 유전자 발현 간의 관련성을 나타내는 결과이다.
본 발명자들은 식도암의 진단 및 예후 예측을 위한 유전자 마커를 발굴하기 위해 예의 연구한 결과, 식도암의 진단, 예후 예측, 또는 치료에 이용할 수 있는 ATP6V1E1(V-ATPase subunit V1E1) 유전자 마커를 발견함으로써 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명은 ATP6V1E1 유전자 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질을 포함하는 식도암 진단 또는 예후 예측용 마커 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 ATP6V1E1 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는 식도암 진단 또는 예후 예측용 조성물, 및 상기 조성물을 포함하는 식도암 진단 또는 예후 예측용 키트를 제공한다.
본 발명의 상기 ATP6V1E1 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것일 수 있고, 상기 ATP6V1E1 유전자가 코딩하는 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명에서 대상으로 하는 질병인 "식도암"은 식도에 발생하는 악성종양을 의미한다. 식도에 발생하는 악성종양은 편평상피세포암(Esophageal squamous cell carcinoma)이 가장 흔하며, 선암이나 림프종, 육종 등은 비교적 드물게 나타난다. 식도암의 진단은 내시경을 통한 조직검사를 통해 이루어지며, 내시경, 바륨 식도조영술, 컴퓨터단층촬영(CT), 또는 내시경 초음파를 통해 검사가 이루어진다. 식도암은 처음 진단되었을 때 이미 주변 조직으로 전이된 상태이거나 원격 전이가 발생한 경우가 많으므로 초기 진단이 매우 중요하다.
본 발명에서 사용되는 용어, "진단(diagnosis)"이란 넓은 의미로는 환자의 병의 실태를 모든 면에 걸쳐서 판단하는 것을 의미한다. 판단의 내용은 병명, 병인, 병형, 경중, 병상의 상세한 양태, 및 합병증의 유무 등이다. 본 발명에서 진단은 식도암의 발병 여부 및 진행단계 수준 등을 판단하는 것이다.
본 발명에서 사용되는 용어, "예후(prognosis)"란, 병세의 진행, 회복에 관한 예측을 의미하는 것으로, 전망 내지는 예비적 평가를 말한다. 본 발명에서 예후는 식도암의 재발, 생존(overall survival), 또는 무병생존(disease-free survival)을 의미하는 것이나, 이것으로 한정되는 것은 아니다.
상기 ATP6V1E1 유전자의 mRNA 수준을 측정하는 제제는 mRNA에 상보적으로 결합하는 센스 및 안티센스 프라이머, 또는 프로브일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용되는 용어, "프라이머"란 DNA 합성의 기시점이 되는 짧은 유전자 서열로써, 진단, DNA 시퀀싱 등에 이용할 목적으로 합성된 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 상기 프라이머들은 통상적으로 15 내지 30 염기쌍의 길이로 합성하여 사용할 수 있으나, 사용 목적에 따라 달라질 수 있으며, 공지된 방법으로 메틸화, 캡화 등으로 변형시킬 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "프로브"란 효소 화학적인 분리정제 또는 합성과정을 거쳐 제작된 수 염기 내지 수백 염기 길이의 mRNA와 특이적으로 결합할 수 있는 핵산을 의미한다. 방사성 동위원소나 효소 등을 표지하여 mRNA의 존재 유무를 확인할 수 있으며, 공지된 방법으로 디자인하고 변형시켜 사용할 수 있다.
상기 단백질 수준을 측정하는 제제는 유전자가 코딩하는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용되는 용어, "항체"는 면역학적으로 특정 항원과 반응성을 갖는 면역글로불린 분자를 포함하며, 단클론(monoclonal) 항체 및 다클론(polyclonal) 항체를 모두 포함한다. 또한, 상기 항체는 키메라성 항체(예를 들면, 인간화 뮤린 항체) 및 이종결합항체(예를 들면, 양특이성 항체)와 같은 유전공학에 의해 생산된 형태를 포함한다.
본 발명의 진단 또는 예후 예측용 키트는 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치로 구성된다.
예컨대, 본 발명의 키트는 PCR을 수행하기 위해, 분석하고자 하는 시료로부터 유래된 게놈 DNA, 본 발명의 마커 유전자에 대해 특이적인 프라이머 세트, 적당량의 DNA 중합 효소, dNTP 혼합물, PCR 완충용액 및 물을 포함하는 키트일 수 있다. 상기 PCR 완충용액은 KCl, Tris-HCl 및 MgCl2를 함유할 수 있다. 이외에 PCR 산물의 증폭 여부를 확인할 수 있는 전기영동 수행에 필요한 구성 성분들이 본 발명의 키트에 추가로 포함될 수 있다.
또한, 본 발명의 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. RT-PCR 키트는 마커 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 데옥시뉴클레오티드(dNTPs), Taq-폴리머레이즈 및 역전사 효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한, 정량 대조군으로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 키트는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. DNA 칩 키트는, 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA가 프로브로 부착되어 있는 기판을 포함하고, 기판은 정량구조 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 본 발명의 마커 유전자가 고정화되어 있는 기판을 갖는 마이크로어레이 형태일 수 있다.
또한, 본 발명의 키트는 ELISA를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트일 수 있다. ELISA 키트는 마커 단백질에 대한 특이적인 항체를 포함하며, 상기 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함한다. 상기 ELISA 키트는 "항원-항체 복합체"를 형성한 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면 표지된 2차 항체, 발색단(chromopores), 효소, 및 그의 기질을 포함할 수 있다. 또한, 정량 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "항원-항체 복합체"란 유전자가 코딩하는 단백질과 이에 특이적인 항체의 결합물을 의미한다. 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨(detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 측정할 수 있다. 이러한 검출 라벨은 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미세입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 피검체 유래의 생물학적 시료에서 ATP6V1E1 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 발현수준을 측정하는 단계를 포함하는, 식도암 진단 또는 예후 예측을 위한 정보제공방법을 제공한다.
상기 피검체 유래의 생물학적 시료는 조직, 세포, 전혈, 혈액, 타액, 객담, 뇌척수액 및 뇨 등을 포함할 수 있으나, 이것으로 제한되는 것은 아니다.
상기 mRNA의 발현수준은 당업계에 알려진 통상적인 방법으로 중합효소연쇄반응(PCR), 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR), 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection assay; RPA), 마이크로어레이(microarray), 또는 노던 블롯팅(northern blotting)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방법을 통해 측정될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 단백질 발현수준은 당업계에 알려진 통상적인 방법으로 웨스턴 블롯팅(western blotting), 방사선면역분석법(radioimmunoassay; RIA), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 효소면역분석법(ELISA), 면역침강법(immunoprecipitation), 유세포분석법(flow cytometry), 면역형광염색법(immunofluorescence), 오우크테로니(ouchterlony), 보체 고정 분석법(complement fixation assay), 또는 단백질 칩(protein chip)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방법을 통해 측정될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 사용되는 용어 "식도암의 진단 또는 예후 예측을 위한 정보제공방법"은 진단 또는 예후 예측을 위한 예비적 단계로써 식도암의 진단 또는 예후 예측을 위하여 필요한 객관적인 기초정보를 제공하는 것이며 의사의 임상학적 판단 또는 소견은 제외된다.
본 발명자들은 식도암 환자 유래 식도 조직 및 환자들의 생존에 대한 병리학적 자료를 이용하여 ATP6V1E1 유전자의 발현수준이 식도암 종양의 병리학적 등급 및 환자의 생존율과 밀접한 연관성이 있음을 규명하였다.
본 발명의 일실시예에서는, 정상인 및 식도암 환자로부터 얻은 식도 조직을 ATP6V1E1 항체를 이용하여 면역조직화학염색을 수행한 결과, 정상인에서는 ATP6V1E1 단백질이 발현되지 않는 반면, 식도암 종양의 조직학적 등급에 따라 상기 유전자의 발현이 증가하는 것을 확인하였다(실시예 3 참조).
본 발명의 다른 실시예에서는, 실시예 2에서 면역화학조직염색 수행 후 산출한 평가점수에 따라 그룹을 나눈 후, 식도암 환자들의 생존율을 분석한 결과 상기 평가점수가 높은 경우 즉, ATP6V1E1의 발현 수준이 높은 경우 무병생존 기간이 평가점수가 낮은 그룹에 비해 짧은 것을 확인하였으며, 식도암 종양 등급에 따른 생존율 분석 결과 초기 단계의 stage Ⅰ+Ⅱ의 경우 무병생존율과 ATP6V1E1 발현수준의 상관관계가 높은 것을 확인하였다. 나아가 ATP6V1E1 발현수준에 따른 식도암 환자들의 무병생존율 분석을 통해 상기 유전자의 높은 발현수준이 환자들의 생존율 감소와 상당한 연관성이 있음을 알 수 있었다(실시예 4 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, 다변량분석(multivariate analyses)을 실시하여 식도암에서 ATP6V1E1이 독립적인 진단 마커로 이용 가능함을 확인하였다(실시예 5 참고).
상기 결과를 통해 V-ATPase subunit V1E1인 ATP6V1E1 유전자 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질이 식도암의 진단 및 예후 예측을 위한 분자 마커로써 이용될 수 있음을 알 수 있다.
본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 ATP6V1E1의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 식도암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "예방"이란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 식도암을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "치료"란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 식도암에 대한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
상기 발현 또는 활성 억제제는 siRNA(small interfering RNA), shRNA(short hairpin RNA), miRNA(micro RNA), 리보자임(ribozyme), DNAzyme, PNA(peptide nucleic acids), 안티센스 뉴클레오티드, 펩타이드, 항체, 및 압타머로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 것일 수 있으며, 바람직하게는 ATP6V1E1 유전자의 발현을 저해하는 siRNA일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서는 식도암 세포주에 ATP6V1E1 siRNA를 트랜스펙션하여 상기 유전자의 발현을 저해시키고, 식도암 세포주의 증식, 생존, 사멸, 전이능의 변화를 분석하고, 식도암 세포에서 상기 유전자의 기능을 규명하였다.
본 발명의 일실시예에서는, ATP6V1E1의 발현을 저해시킨 식도암 세포의 경우 대조군 세포에 비하여 증식이 억제되고, 세포주기 진행에 관련된 단백질들의 발현 감소를 통해 G1 cell cycle arrest가 일어나며, 세포자멸자(apoptosis) 유도 관련 단백질들의 발현 증가를 통해 세포사멸이 유도됨을 확인하였다(실시예 6 참조).
본 발명의 다른 실시예에서는, ATP6V1E1의 발현을 저해시킨 식도암 세포에서 이동 및 침습능이 억제되고, 암세포의 전이 과정에서 첫 번째로 일어나는 상피간엽이행(EMT) 관련 유전자들의 발현이 감소하며, FAK(Focal Adhesion kinase) 하위 신호전달 단백질인 ERK와 JNK의 인산화 감소를 통해 식도암 세포의 초점접착능이 억제됨을 확인하였다(실시예 7 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, ATP6V1E1의 발현을 저해시킨 식도암 세포에서 젖산 및 ATP 농도 감소, 포도당 흡수율 감소, 세포 외 산성화율 감소를 확인함으로써 식도암 세포의 포도당 분해 대사과정인 해당과정이 억제됨을 확인하였고, 세포의 산소 소비율 증가를 통해 포도당의 산화가 증가함을 알 수 있었으며, AKT 및 PKM2의 활성 감소를 통해 상기 해당과정 억제 기전은 PI3K(phosphoinositide 3 kinase)/AKT 신호전달 억제에 의한 것임을 확인하였다(실시예 8 참조).
상기 결과를 통해 ATP6V1E1이 식도암 세포의 증식 및 생존, 사멸, 전이, 및 당 대사에 밀접히 관여함을 알 수 있으며, 따라서 ATP6V1E1의 발현 또는 활성 억제는 식도암의 예방 또는 치료에 유용하게 이용될 수 있다.
본 발명에 따른 상기 약학적 조성물은 ATP6V1E1의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하며, 약학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용 가능한 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 사이클로덱스트린, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 등을 포함하지만 이에 한정되지 않으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액 등 다른 통상의 첨가제를 더 포함할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제, 윤활제 등을 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제화에 관해서는 레밍턴의 문헌에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 제형에 특별한 제한은 없으나 주사제, 흡입제, 피부 외용제 등으로 제제화할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으나, 바람직하게는 경구투여할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료 또는 진단에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료 또는 진단하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에 다른 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
구체적으로 본 발명의 약학적 조성물의 유효량은 환자의 연령, 성별, 상태, 체중, 체내에 활성 성분의 흡수도, 불활성율 및 배설속도, 질병종류, 병용되는 약물에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 1 ㎏ 당 0.001 내지 150 ㎎, 바람직하게는 0.01 내지 100 ㎎을 매일 또는 격일 투여하거나, 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 In vitro 상에서 세포에 후보물질을 처리하는 단계; 상기 세포의 ATP6V1E1 유전자의 발현 또는 활성을 측정하는 단계; 및 후보물질 비처리군에 비해 ATP6V1E1의 발현 또는 활성을 감소시키는 물질을 식도암의 치료물질로 선정하는 단계를 포함하는 식도암 치료물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
상기 세포는 식도 조직 유래 세포일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 후보물질은 화합물, 미생물 배양액 또는 추출물, 천연물 추출물, 핵산, 및 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 ATP6V1E1 유전자의 발현 또는 활성 측정은 중합효소연쇄반응(PCR), 마이크로어레이(microarray), 노던 블롯팅(northern blotting), 웨스턴 블롯팅(western blotting), 효소면역분석법(ELISA), 면역침강법(immunoprecipitation), 면역화학염색법(immunohistochemistry), 및 면역형광염색법(immunofluorescence)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방법을 이용하여 수행될 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[ 실시예 ]
실시예 1. 실험준비 및 실험방법
1-1. 환자 유래 조직샘플 준비
160명의 식도암 환자 및 31명의 정상인으로부터 외과적 수술을 통해 분리된 식도 조직을 얻었으며, 삼성 서울병원의 병리학과로부터 1996년부터 2007년까지 저장된 상기 식도암 환자에 대한 병리학적 데이터를 공급받았다. 식도 조직은 종양 결절 전이(tumor nodes metastasis; TNM) 분류법에 기반하여 병리학적 특징을 분류하였다. 상기 모든 식도 조직은 10% 포르말린(formalin)으로 고정한 후 파라핀(paraffin)에 포매시켰다.
1-2. 면역조직화학염색법( Immunohistochemical staining)
상기 실시예 1-1의 방법에 따라 파라핀에 포매시킨 식도암 환자 또는 정상인 유래 식도 조직에 자일렌(xylene)을 처리하여 탈파라핀화시키고, 다시 수화시키는 과정(rehydration)을 진행하였다. 이후 상기 조직을 TrisEDTA buffer(10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 9.5) 존재하에 98℃에서 20분 동안 microwave 처리하여 조직 내 항원이 노출되도록 하고, 항체의 비특이적인 결합을 저해하기 위해 슬라이드에 퍼옥시다아제 블로킹 용액(Dako REAL™ Peroxidase Blocking Solution; Dako, CA, USA)을 8분 동안 처리하였다. 다음으로, 조직에 1:100으로 희석한 ATP6V1E1 특이적 1차 항체(Sigma, USA)를 처리하고 배양한 후 washing buffer(0.1% Tween 20 in distilled water)로 헹구고, DAKO REAL EnVision/HRP, Rabbit/Mouse(Envision) 검출 용액을 처리하여 반응시켰다. 반응 후 다시 한 번 조직을 헹구고 색소원(chromogen)을 감광하였다. 이후 슬라이드를 Meyers hematoxylin으로 대조염색하고, 탈수과정을 거친 후 Canada balsam으로 마운팅한 후 현미경으로 관찰하였다.
1-3. 면역조직화학염색법 결과 분석방법
상기 1-2의 방법에 따라 식도암 환자 또는 정상인 유래 식도조직을 ATP6V1E1에 대한 1차 항체로 면역조직화학염색을 수행하고 현미경으로 관찰한 후, 염색 강도(staining intensity)와 V-ATPase subunit V1E1에 대한 항체로 염색된 세포 비율을 평가하여 점수화하였다. 염색 강도는 1(약함), 2(보통), 또는 3(강함)으로 평가하였고, 염색된 세포의 비율은 1(<5%), 2(5%-25%), 3(26%-50%), 4(51%-75%), 또는 5(>75%)으로 나누어 평가하였다. 이후 상기 염색 강도 및 염색된 세포의 비율에 대한 점수를 곱하여 면역조직화학염색법 평가 점수를 산출하였다. 예컨대, 조직 관찰 결과 염색 강도가 3(강함)이고, 염색된 세포의 비율이 3(26%-50%)으로 평가된 경우, 최종 평가 점수는 상기 두 점수를 곱하여 9점으로 하였다. 각 병변부위는 두 명의 병리학자에게 의뢰하여 관찰 및 점수화하였으며, 소견에 차이가 있을 경우 의논하여 최종 평가 결과를 도출하였다.
1-4. 세포 배양 및 트랜스펙션(Transfection)
사람 식도암 세포주 TE8은 RIKEN(Saitama, Japan)으로부터 공급받았으며, 10% FBS(Invitrogen, CA, USA)가 첨가된 RPMI1640 배지에서 배양하였다.
상기 TE8 세포 내 ATP6V1E1의 발현을 억제하기 위해. ATP6V1E1에 특이적인 siRNA(siATP6V1E1, 5'-CAGATGTCCAATTTGATGAAT-3')를 Gfectin(GP2000)을 이용해 세포에 트랜스펙션하고 72시간 동안 배양하였다. 대조군으로는 어느 유전자도 타겟하지 않는 nonsilencing control siRNA(Qiagen, Germany)를 동일한 조건으로 트랜스펙션 하여 준비하였다.
1-5. RNA 추출 및 Quantitative RT-PCR
사람 식도암 세포 TE8에 TriRNA 시약(Favorgen, Taiwan)을 처리하여 total RNA를 추출하고, random hexamers를 이용하여 RNA로부터 cDNA를 합성하였다. 실시간 중합효소연쇄반응(real-time PCR)은 qPCR preMix for SYBR Green(Enzynomics, korea)을 이용하여 수행하였으며, 상기 PCR 과정에서 사용한 프라이머 서열은 하기 표 1에 나타내었다.
유전자 방향 서열 서열번호
hV-ATP6V1E1 Forward 5'-GCA CAA GCC GAC CTT TCT-3' 3
hV-ATP6V1E1 Reverse 5'-TTC ACC GGC CTA GCA TTG -3' 4
hHIF-1a Forward 5'-CGT TCC TTC GAT CAG TTG TC-3' 5
hHIF-1a Reverse 5'-TCA GTG GTG GCA GTG GTA GT-3' 6
hGlut1 Forward 5'-CGG GCC AAG AGT GTG CTA AA-3' 7
hGlut1 Reverse 5'-TGA CGA TAC CGG AGC CAA TG-3' 8
hHK1 Forward 5'-TGG AGT CCG AGG TTT ATG-3' 9
hHK1 Reverse 5'-TTT GGA TTG TTG GCA AGG-3' 10
hPFK Forward 5'-CAT GAC CCA TGA AGA GCA CC-3' 11
hPFK Reverse 5'-CCA ACT CGA ACC ACA GCC CTG-3' 12
hENO1 Forward 5'-CGT ACC GCT TCC TTA GAA C-3' 13
hENO1 Reverse 5'-CAA TGA CTT GGG CCA ATT AC-3' 14
hPKM2 Forward 5'-GCC TGC TGT GTC GGA GAA G-3' 15
hPKM2 Reverse 5'-CTC TCC CAG GAC CTT CCT AA-3' 16
hLDHA Forward 5'-ATC TTG ACC TAC GTG GCT TGG A-3' 17
hLDHA Reverse 5'-CCA TAC AGG CAC ACT GGA ATC TC-3' 18
hVimentin Forward 5'-GGG ACC TCT ACG AGG AGG AG-3' 19
hVimentin Reverse 5'-CGC ATT GTC AAC ATC CTG TC-3' 20
hMMP2 Forward 5'-CCA CTG CCT TCG ATA CAC-3' 21
hMMP2 Reverse 5'-GAG CCA CTC TCT GGA ATC TTA AA-3' 22
hMMP7 Forward 5'-GAG TGA GCT ACA GTG GGA ACA-3' 23
hMMP7 Reverse 5'-CTA TGA CGC GGG AGT TTA ACA T-3' 24
h18s rRNA Forward 5'-CGG CGA CGA CCC ATT CGA AC-3' 25
h18s rRNA Reverse 5'-GAA TCG AAC CCT GAT TCC CCG TC-3' 26
1-6. 웨스턴 블롯 (Western Blot)
사람 식도암 세포 TE8에 Radio-ImmunoPrecipitation Assay(RIPA) 버퍼(150 mM NaCl, 50 mM Tris-Cl, pH 7.4, 1 mM EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid), 1% Nonidet P-40(NP-40), 0.25% Na-deoxycholate, 및 protease inhibitors)를 처리하여 세포를 용해시키고 10분 동안 얼음 위에 놓아둔 후 전체 세포 용해물을 원심분리를 수행하여 단백질 추출물을 얻었다. 이후 적정 농도의 단백질을 이용하여 SDS-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동(SDS-PAGE)을 수행하여 단백질이 크기에 따라 아크릴아마이드 겔 내에서 분리되도록 한 후 트랜스퍼(transfer) 과정을 실시하여 전기적인 흐름에 따라 겔 내의 단백질들이 PVDF 멤브레인으로 옮겨지도록 하였다. 이후 관찰하고자 하는 각각의 단백질에 특이적인 1차 항체를 멤브레인에 처리하여 배양하였다. 본 실시예에서 사용한 1차 항체는 하기에 나열한 바와 같다. ATP6V1E1(Sigma, USA); p-JNK(Thr183/Tyr185), ERK(extracellular signal-regulated kinase), p-ERK, p-paxillin(Tyr 118), cleave-caspase3, cleave-PARP, AKT, p-AKT, PKM2, p-PKM2, AMPK, p-AMPK, mTOR, 및 p-mTOR(Cell Signaling Technology); JNK(cjun Nterminal kinase), cyclin D, cdk2, p27, p-FAK(Tyr 397), FAK(focal adhesion kinase), Bcl-2, 및 β-actin(Santa Cruz Biotechnology, CA, USA); paxillin(BD Biosciences, NJ, USA). 1차 항체와 반응시킨 멤브레인을 버퍼로 헹구고 2차 항체와 반응시킨 후, chemiluminescence 시약을 이용해 감광하여 관찰하고자 하는 단백질의 발현량을 확인하였다. 또한, 상기 β-actin에 대한 1차 항체를 이용해 동일한 조건으로 웨스턴 블롯팅을 수행하여 β-actin 단백질 양으로 각 샘플의 단백질 양을 보정하였다.
1-7. 세포 생존능 분석(Cell Viability Assay)
생존 세포의 수를 측정하기 위하여, 사람 식도암 세포인 TE8 세포를 현탁하여 일정량으로 분주하고, 트리판 블루(trypan blue) 용액을 처리한 후 5분 동안 상온에 두었다. 이후 혈구계산기(hemocytometer)를 이용해 트리판 블루에 염색되지 않은 살아있는 세포의 수를 측정하였다.
1-8. 세포 이동 및 침습 분석(Migration and Invasion Assay)
In vitro 마트리겔(Matrigel) invasion assays를 수행하기 위해 6.5mm 트랜스웰 챔버(Costar Inc., CA, USA)를 이용하였다. 트랜스웰 필터를 마트리겔로 코팅하고, 마트리겔 위에 세포를 씨딩한 후 배양하였다. 이후 챔버에서 필터를 제거하고, 마트리겔 내로 침투한 세포들을 고정한 후 헤마톡실린 & 에오신(hematoxylin & eosin)으로 염색하였다. 필터에 부착된 세포들은 광학현미경 하에서 수를 측정하였다.
Migration assay는 필터를 마트리겔로 코팅하지 않은 상태에서 상기 invasion assay와 유사한 방법으로 수행하였다. 상기 실험들은 독립적으로 3회 반복수행 하였다.
1-9. 면역세포화학염색(Immunocytochemistry)
사람 식도암 세포인 TE8을 PBS로 헹군 후 4% 파라포름알데히드(formaldehyde)를 처리하여 세포를 고정하였다. 상기 용액을 제거하고, 0.2% NP-40을 고정된 세포에 처리하여 세포투과성을 증가시킨 후, BSA(bovine serum albumin)를 1시간 동안 처리하여 블로킹 과정을 수행하였다. 이어서 p-paxillin에 특이적인 1차 항체를 처리하여 반응시키고, 로다민(rhodamine)이 결합된 항마우스 2차 항체(Santa Cruz Biotechnology)를 처리하거나, 또는 1 ㎎/㎖ Hoechst(Invitrogen)가 포함된 Alexa 488 phalloidin(Invitrogen)을 처리하고 배양하였다. 이후 antifading mounting medium(Dako North America)를 이용하여 마운팅하고, 형광 현미경(Axiovert, Zeiss, Germany) 하에서 세포를 관찰하였다.
1-10. 세포 내 젖산 및 ATP 농도 측정(Lactate and ATP assay)
세포 내 젖산(Lactate) 농도 및 ATP 생성량은 각각 colorimetric L-Lactate assay kit(abcam) 및 EnzyLightTM ADP/ATP Ratio Assay kit(bioassay system)를 이용하여 측정하였으며, 보정을 위해 총 세포 수를 측정하였다.
1-11. 포도당 흡수율 분석(Glucose uptake assay) 및 flow cytometry
사람 식도암 세포인 TE8을 6웰 플레이트에 2×105/well 개씩 씨딩하고 24시간 동안 배양한 후 상기 실시예 1-4에 기재된 방법에 따라 ATP6V1E1 siRNA 또는 nonsilencing siRNA를 트랜스펙션하였다. 72시간 후 모든 배양 배지를 제거하고, 10 uM 농도의 형광을 띄는 2-NBDG(2-deoxy-2[(7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-yl)amino]-D-glucose)가 첨가되거나 첨가되지 않은 새로운 배양배지를 각 웰 당 2 ㎖씩 넣어주었다. 이후 세포를 37℃, 5% CO2 조건하에서 1시간 동안 추가로 배양한 후 flow cytometry 분석을 실시하였다. Flow cytometry 분석을 위해, 배양한 세포에서 배지를 제거하고 차가운 PBS(phosphate buffered saline)로 2회 헹구어 2-NBDG 흡수 반응을 정지시키고, 각 웰에 차가운 성장배지 500 ㎕를 넣고 세포를 현탁시킨 후 최종농도가 1 ㎍/㎖이 되도록 PI(Propidium Iodide) 용액을 넣어 주고 4℃에서 보관하면서 30분 이내로 BD FACS Canto II(San Jose, CA, USA)를 이용해 flow cytometry 분석을 실시하였다.
1-12. 해당과정 및 산화적 인산화 측정
해당과정(glycolysis) 및 산화적인산화(Oxidative phosphorylation; OXPHOS)는 Seahorse XF24 extracellular flux analyzers를 이용하여 각각 세포외 산성화율(extracellular acidification rate; ECAR) 및 산소 소비율(oxygen consumption rate; OCR)을 측정함으로써 분석하였다.
실시예 2. 식도암 환자의 특성 분석
상기 실시예 1-1에 기재한 160명의 식도암 환자들의 임상병리학적 특성을 연령, 성별, 종양크기, 분화, 종양 결절 전이(TNM) 단계, 종양침습(tumor invasion), 림프절 전이(LN metastasis) 여부, 및 원격전이(distant metastasis) 여부로 분류하여 하기 표 2에 나타내었다.
보다 구체적으로, 65세 이상 및 65세 미만의 환자들은 각각 123명(77%), 37명(23%)으로 65세 이상의 환자들이 많음을 확인하였고, 성별은 남성 및 여성이 각각 97%, 3%로 남성이 대부분인 것으로 나타났다. 종양 결절 전이 분류법에 근거하여 악성 종양 단계별로 분류한 결과는 1단계 27명(17%), 2단계 53명(34%), 3단계 60명(37%), 및 4단계 20명(12%)으로, 2단계와 3단계에 해당하는 환자들이 70% 이상을 차지하였다. 또한, 종양 침습(tumor invasion)을 일차 종양 크기(tumor size)와 종양 신장(tumor extension)을 바탕으로 T1, T2, T3, 및 T4로 구분하여 분류한 결과 T3 그룹에 속하는 환자들이 55%로 절반 이상을 차지하였다. 전이 측면에서는 식도암 환자의 61%가 림프절에 전이된 것으로 나타났으나, 전체의 87%에서 원격전이는 일어나지 않은 것으로 확인되었다.
Characteristics Case No.(n=160) %
Age ≥65 years 123 77
＜65 years 37 23
Sex Male 155 97
Female 5 3
Tumor size ≥4.0 ㎝ 90 56
＜4.0 ㎝ 70 44
Differentiation W/D 25 16
M/D 106 66
P/D 29 18
TMN stage Ⅰ 27 17
Ⅱ 53 34
Ⅲ 60 37
Ⅳ 20 12
Tumor invasion T1 34 20
T2 28 18
T3 90 55
T4 8 5
LN metastasis Negative 62 39
Positive 98 61
Distant metastasis Absent 138 87
Positive 22 13
실시예 3. 정상인 및 식도암 환자의 식도 조직에서 V-ATPase subunit V1E1의 발현량 비교분석
정상인과 식도암 환자의 식도 조직에서 V-ATPase subunit V1E1의 발현수준을 평가하기 위해, 먼저 V-ATPase의 V1E1 subunit에 대한 항체의 특이성을 검증하고자 하였다. 이를 위해, 사람 식도암 세포주인 TE8와 파라핀에 포매시킨 TE8 세포 블록을 이용하여 V-ATPase subunit V1E1의 발현수준을 측정하였다. 그 결과, 도 1a 및 도 1b에 나타낸 바와 같이, 세포에 ATP6V1E1 siRNA를 트랜스펙션하여 발현을 저해시킨 경우(si V1E1), nonsilencing siRNA를 트랜스펙션한 대조군(si NS)에 비하여 세포 내 V-ATPase subunit V1E1의 발현이 현저히 감소되어 있는 것을 확인하였다. 상기 결과는 V-ATPase subunit V1E1를 검출하는 항체의 특이성이 높다는 것을 의미한다.
상기에서 특이성을 확인한 항체를 이용하여, 실시예 1-1을 통해 31명의 정상인 및 160명의 식도암 환자로부터 분리한 식도 조직에 대하여 실시예 1-2의 방법에 따라 면역조직화학염색법을 수행한 후 V1E1 subunit의 발현수준을 관찰하였다. 그 결과, 도 1c에 나타낸 바와 같이, 정상인(Non-Tumor) 유래 식도 조직에서는 V1E1 단백질의 발현이 관찰되지 않은 반면, 식도암 환자 유래 조직에서는 식도암의 조직학적 등급(Weak, Moderate, Strong)에 비례하여 V1E1 단백질의 발현이 증가하는 것을 확인하였다.
실시예 4. 식도암 환자에서 V-ATPase subunit V1E1의 발현수준과 생존율 간의 관련성 분석
식도암 환자에서 V-ATPase subunit V1E1의 발현량과 환자의 생존율 간에 관련성이 있는지 분석하기 위하여, 정상인 및 식도암 환자 유래 식도 조직을 조직화학면역염색을 실시하고, 실시예 1-3에 기재된 방법으로 평가 점수를 산출하여 점수에 따라 1(low), 2(medium), 3(high) 그룹으로 나눈 후, 정상인 0(none)을 포함한 각 그룹에 대하여 생존율을 분석하여 Kaplan-Meier 생존 곡선으로 나타내었다. 그 결과, 도 2a에 나타낸 바와 같이, 평가점수(immunohistochemistry score)가 2점 이상으로 V1E1이 높은 수준으로 발현되는 환자 그룹의 경우 무병생존기간(disease-free survival time)이 평가점수가 2점 미만인 V1E1 발현수준이 낮은 환자 그룹보다 더 짧은 것을 확인하였다.
다음으로, 종양등급에 따른 생존율과 V1E1 발현수준 간의 관계를 분석하였다. 이를 위해, 종양등급을 stage Ⅰ+Ⅱ 및 stage Ⅲ+Ⅳ의 두 그룹으로 분류하고 각 그룹에서 V1E1 발현수준에 따른 무병생존율을 분석하였다. 그 결과, 도 2b 및 2c에 나타낸 바와 같이 무병생존율 분석 결과, V1E1의 발현 수준이 stage III+IV의 환자들에서 보다 초기 단계의 stage I+II 환자들의 무병생존율과 연관성이 높은 것을 확인하였다.
나아가 도 2d에 나타낸 바와 같이, V1E1의 발현수준에 따른 식도암 환자들의 무병생존율 분석 결과를 통해 V1E1의 높은 발현수준이 식도암 환자들의 생존율 감소와 상당한 연관성이 있는 것을 알 수 있었다.
상기 결과들은 V-ATPase subunit V1E1이 식도암의 예후, 예측을 위한 표지자로써 이용 가능함을 의미한다.
실시예 5. 식도암 환자에서 진단 변수의 다변량분석
식도암에서 V-ATPase subunit V1E1이 독립적인 진단 표지자로 이용 가능한지 평가하기 위하여, 콕스 비례 위험 회귀(Cox proportional hazard regression)법을 이용하여 식도암 환자의 무병생존율에 대한 V-ATPase subunit V1E1의 다변량 분석(multivariate analyses)을 실시하였다. 이를 위해, V-ATPase subunit V1E1의 발현수준에 대한 평가점수뿐만 아니라 환자의 연령, 종양 결절 전이 등급(TNM stage), 화학요법 및 방사선요법 치료 경험을 콕스 비례 위험 회귀 모델에 대입하여 분석을 수행하였다.
그 결과, 하기 표 3에 나타낸 바와 같이, V-ATP6V1E1 단백질의 발현은 무병생존율 진단 인자와 독립적인 것을 확인하였다. 종양 결절 전이 등급 Ⅲ 및 Ⅳ 또한 무병생존율 및 전체생존율 진단 인자와 독립적임을 확인하였다. 또한, 방사선 치료를 받은 경험이 있는 식도암 재발 환자의 무병생존율 및 전체생존율은 V-ATP6V1E1을 높은 수준으로 발현하는 환자 군에서 거의 없는 것으로 나타났다.
상기 결과를 통해 V-ATPase subunit V1E1 과발현은 종양 결절 전이 등급 및 방사선 치료를 받은 식도암 재발 환자에서 연관성이 있음을 알 수 있다.
Predictors Disease-free survival Overall survival
HR (95% CI) P-value HR (95% CI) P-value
Age 0-65 1.00 1.00
65+ 1.103(0.6-1.9) 0.720 1.025(0.6-1.9) 0.935
TMN Stage Ⅰ 1.00 1.00
Ⅱ 2.320(0.9-6.1) 0.093 3.222(0.9-11.0) 0.062
Ⅲ 4.325(1.7-11.1) ＜0.003* 6.732(2.0-22.0) 0.002*
Ⅳ 7.498(2.7-20.7) ＜0.001* 9.556(2.7-34.0) 0.001*
Chemotherapy Absent 1.00 1.00
Positive 1.062(0.8-1.4) 0.632 1.116(0.6-1.5) 0.410
Radiation therapy Absent 1.00 1.00
Positive 0.722(0.6-0.9) 0.004* 0.732(0.6-0.9) 0.010*
V- ATP6V1E1 Negative 1.00 1.00
Positive 1.748(1.1-2.8) 0.018* 1.394(0.9-2.3) 0.188
실시예 6. V-ATPase subunit V1E1의 발현 저해에 의한 식도암세포 증식 억제 확인
V-ATPase의 발현이 세포 크기 및 생존을 포함하는 세포 성장과 연관이 있다는 사실에 근거하여, V-ATPase subunit V1E1의 발현 저해가 식도암 세포의 생존에 영향을 미치는지 알아보고자 하였다. 이를 위해, 상기 실시예 1-4의 방법에 따라 식도암 세포주인 TE8 세포에 V-ATP6V1E1 siRNA(si-V1E1) 또는 non-silencing siRNA(si-NS)를 트랜스펙션하고, 실시예 1-7의 방법에 따라 세포 수를 측정하여 세포 생존율을 분석하였다. 그 결과, 도 3a에 나타낸 바와 같이, V-ATPase subunit V1E1의 발현을 저해시킨 경우 대조군(si-NS)에 비하여 TE8 식도암 세포의 증식이 억제되는 것을 확인하였다.
또한, 실시예 1-6의 방법에 따라 웨스턴 블롯을 통해 세포주기(cell cycle)에 관련된 단백질들의 발현변화를 관찰한 결과, 도 3b에 나타낸 바와 같이, 세포주기 진행에 관련된 cyclin D와 cdk2 단백질의 발현이 현저히 감소한 것을 통하여 V-ATPase subunit V1E1의 발현 저해에 의해 G1 cell cycle arrest가 유도되었음을 알 수 있었다.
나아가, V-ATPase subunit V1E1의 발현이 TE8 식도암 세포에서 세포자멸사(apoptosis)에 영향을 미치는지 알아보기 위해, 웨스턴 블롯을 통해 apoptosis에 관여하는 단백질들의 발현변화를 관찰하였다. 그 결과, 도 3b에 나타낸 바와 같이, V-ATPase subunit V1E1의 발현을 저해시킨 경우, 대조군(si NS)에 비하여 apoptosis 억제에 관여하는 bcl-2 단백질의 발현이 감소하였으며, cleaved caspase3와 cleaved PARP(Poly [ADPribose] polymerase 1) 단백질의 발현이 현저히 증가하는 것을 확인하였다. 상기 결과를 통해 V-ATPase subunit V1E1의 발현을 저해시키는 경우 apoptosis가 유발되는 것을 확인하였다.
상기 결과들은 V-ATPase subunit V1E1의 발현이 식도암 세포의 생존율 및 증식, apoptosis를 통한 세포사멸에 영향을 미친다는 것을 의미한다.
실시예 7. V- ATPase subunit V1E1의 발현 저해에 의한 식도암 세포의 운동성 및 초점접착 형성 억제 확인
종양 침습 및 림프절 전이는 식도암에서 관찰되는 식도암 세포의 중요한 특성이다. 따라서 V-ATPase subunit V1E1의 발현 저해가 식도암 세포의 이동 및 침습에 어떠한 영향을 미치는지 알아보고자 하였다. 이를 위해, 상기 실시예 1-4의 방법에 따라 식도암 세포주인 TE8 세포에 V-ATP6V1E1 siRNA(si-V1E1) 또는 non-silencing siRNA(si-NS)를 트랜스펙션하고, 실시예 1-8의 방법에 따라 세포 이동 및 세포 침습능을 측정하였다. 그 결과, 도 4a에 나타낸 바와 같이, V-ATPase subunit V1E1의 발현을 저해시킨 경우, TE8 식도암 세포의 이동 및 침습이 억제되는 것을 확인하였다. 이는 V-ATPase subunit V1E1이 식도암 세포의 전이적 특성에 영향을 미친다는 것을 의미한다.
상기 결과를 바탕으로, 상피암세포(epithelial cancer cell)에서 이동과 침습이 가능한 간엽세포로 표현형이 변화하는 현상으로 암 전이 과정에서 첫 단계로 이루어지는 상피간엽이행(epithelial-mesenchymal transition; EMT)에 V-ATPase subunit V1E1이 영향을 미치는지 확인하고자 하였다. 이를 위해, 상기 현상에 관여하는 Vimentin, MMP2(matrix metalloproteinases 2), 및 MMP7(matrix metalloproteinases 7)의 발현을 관찰하였다. 그 결과, 도 4b에 나타낸 바와 같이, 상기 3가지 유전자의 발현이 모두 유의하게 감소하는 것을 확인하였다. 이를 통해, V-ATPase subunit V1E1의 발현이 식도암 세포의 이동 및 침습과 관련이 있음을 알 수 있었다.
다음으로, 전이성 식도암은 FAK(Focal Adhesion kinase) 과발현과 연관이 있다는 연구결과들에 근거하여, V1E1의 발현 저해가 식도암 세포의 초점접착(focal adhesion)에 영향을 미치는지 알아보고자 하였다. 이를 위해, 상기 실시예 1-4의 방법에 따라 식도암세포주인 TE8 식도암 세포에 V-ATP6V1E1 siRNA(si-V1E1) 또는 non-silencing siRNA(si-NS)를 트랜스펙션하고, 실시예 1-9의 방법에 따라 면역세포화학염색을 실시하였다. 그 결과, 도 4c에 나타낸 바와 같이, V-ATPase subunit V1E1의 발현을 저해시킨 경우 액틴 세포골격(actin cytoskeleton)과 인테그린(integrin) 사이의 상호작용을 매개하는 p-paxillin 단백질이 거의 염색되지 않은 것을 통해 초점접착 형성이 현저히 억제되는 것을 알 수 있었다.
나아가 상기 결과를 바탕으로 V-ATPase subunit V1E1 매개 식도암 세포의 초점접착 및 침습의 분자적 기전을 알아보기 위하여, 세포운동을 매개하는 신호전달경로 관련 단백질들의 발현변화를 웨스턴 블롯을 통해 관찰하였다. 그 결과, 도 4d에 나타낸 바와 같이, V-ATPase subunit V1E1의 발현을 저해시킨 경우 세포 운동 매개 신호전달 경로에서 FAK의 하위 조절자인 ERK(extracellular signal regulated kinase) 및 JNK(C-Jun N-terminal kinase) 단백질의 인산화(p-ERK 및 p-JNK)가 감소한 것을 확인하였다.
상기 결과들은 V-ATPase subunit V1E1이 FAK 및 이의 하위 조절자인 ERK 및 JNK를 통해 세포 운동 및 초점접착 형성을 양성적으로 조절함을 의미한다.
실시예 8. V- ATPase subunit V1E1의 발현 저해에 의한 식도암 세포의 해당과정 억제 확인
8-1. 세포 내 젖산 및 ATP 농도 측정
최근, 식도암의 종양형성(tumorigenesis)은 세포 내 젖산(lactate) 농도 및 해당과정(glycolysis)에 의존적이라는 연구결과들이 보고되었는바, V-ATPase subunit V1E1이 식도암 세포에서 호기성 해당과정에 어떠한 영향을 미치는지 알아보고자 하였다.
이를 위해, 상기 실시예 1-4의 방법에 따라 식도암 세포주인 TE8 세포에 V-ATP6V1E1 siRNA(si-V1E1) 또는 non-silencing siRNA(si-NS)를 트랜스펙션하고, 실시예 1-10의 방법에 따라 해당과정 결과 생성되는 주요 에너지원인 젖산과 ATP의 농도를 측정하였다. 그 결과, 도 5a 및 도 5b에 나타낸 바와 같이, V-ATPase subunit V1E1의 발현을 저해시킨 경우 식도암 세포 내 젖산과 ATP 농도 모두 대조군(si-NS)에 비하여 유의하게 감소하였다. 상기 결과를 통해 V-ATPase subunit V1E1이 미토콘드리아 호흡과정에서 호기성 해당과정을 위한 대사적 흐름을 조절하는데 관여한다는 것을 알 수 있었다.
8-2. 포도당 흡수율 변화 분석
상기 결과를 바탕으로, V-ATPase subunit V1E1의 발현 저해가 세포의 포도당 흡수율에 영향을 미치는지 알아보기 위하여 실시예 1-11의 방법에 따라 포도당 흡수율 변화를 측정하였다. 그 결과, 도 6a에 나타낸 바와 같이 V-ATPase subunit V1E1의 발현이 저해된 경우 대조군(si-NS)에 비해 포도당 흡수율이 유의하게 감소하는 것을 확인하였다. 이는 V-ATPase subunit V1E1의 발현이 저해된 세포에서 젖산 농도의 감소와 관련이 있는 것으로 판단되었다.
상기 결과를 통해 V-ATPase subunit V1E1의 발현이 저해된 식도암 세포에서 포도당 흡수율이 감소하는 것을 확인하였으므로, 암세포에서 포도당 흡수를 주로 매개한다고 알려진 Glut1(glucose transporter 1), Glut1 발현과 연관이 있다고 알려진 HIF1(hypoxia inducible factor 1), 및 이들의 표적 유전자들의 발현 변화를 확인하고자 하였다. 이를 위해, 상기 실시예 1-5의 방법에 따라 real-time PCR을 수행한 결과, 도 6b에 나타낸 바와 같이, 식도암 세포에서 V-ATPase subunit V1E1의 발현을 저해시킨 경우, Glut1, HIF1-α를 비롯하여, LDHA(Lactate dehydrogenase A)와 같은 당 분해 관련 효소들의 발현이 유의하게 감소하는 것을 확인하였다.
8-3. V-ATPase subunit V1E1 발현 저해에 의한 포도당 산화 증가 확인
상기 실시예 8-1 및 8-2를 통해 V-ATPase subunit V1E1의 발현이 저해된 경우 식도암 세포 내 젖산 및 ATP 농도가 감소하고, 세포의 포도당 흡수율이 감소한다는 것을 확인하였으므로, V-ATPase subunit V1E1이 산소 소비율(oxygen consumption rate; OCR)과 세포 외 산성화율(extracellular acidification rate; ECAR) 조절을 통해 식도암 세포의 대사 이동(metabolic shift) 조절에 영향을 미치는지 알아보고자 하였다. 이를 위해, V-ATPase subunit V1E1의 발현을 저해시킨 세포(si-V1E1) 또는 대조군 세포(si-NS)에 올리고마이신(Oligomycin), FCCP, 및 로테논(Rotenone)을 처리하거나 처리하지 않은 상태에서 25 mM 농도의 포도당을 처리하였다. FCCP는 미토콘드리아에서 호흡을 촉진시키는 역할을 하고, 로테논은 미토콘드리아에서 전자전달계를 저해하는 물질이다. 이후 실시예 1-12의 방법에 따라 미토콘드리아의 산화적 인산화(mitochondrial oxidative phosphorylation; OXPHOS) 수준을 측정하기 위해 산소 소비율을 측정한 결과, 도 7a에 나타낸 바와 같이, V1E1의 발현이 저해된 세포에 FCCP를 처리한 경우에는 포도당 처리에 의해 산화적 인산화 수준이 증가하였다. 또한, 동일한 조건에서 로테논을 처리한 경우에는 산소 소비율이 증가하는 것을 확인하였다. 상기 결과는 V1E1의 발현 저해가 포도당 산화를 통한 미토콘드리아 호흡률을 증가시킴을 의미한다.
또한, 상기와 동일한 처리 조건에서 세포 외 산성화율를 측정한 결과, 도 7b에 나타낸 바와 같이, V-ATPase subunit V1E1의 발현을 저해시킨 경우 대조군(si-NS)에 비하여 세포 외 산성화율이 전반적으로 감소한 것을 통해 포도당에서 젖산으로의 전환이 감소된 것을 확인하였다.
다음으로, V-ATPase subunit V1E1 발현 저해가 미토콘드리아 호흡 및 당분해능의 변화를 유도하는지 알아보기 위해, 대조군(si-NS) 및 V1E1의 발현을 저해시킨 세포에 미토콘드리아 호흡을 억제하는 올리고마이신 또는 로테논을 처리하고 웨스턴 블롯을 수행하였다. 그 결과 V1E1의 발현이 저해된 세포의 경우 올리고마이신 또는 로테논을 처리하였음에도 불구하고 미토콘드리아 산화가 증가하는 것을 확인하였다. 더욱이, V-ATPase subunit V1E1의 발현 저해는 세포 외 산성화율를 감소시키고, 이는 해당과정의 감소를 의미한다. 따라서 상기 결과를 통해 ATPase subunit V1E1의 발현 저해는 해당과정을 억제함으로써 포도당의 산화를 증가시킨다는 것을 알 수 있었다.
8-4. ATPase subunit V1E1에 의한 해당과정 촉진 기전 확인
암세포에서 해당과정은 PI3K(phosphoinositide 3kinase)/AKT 신호전달 경로에 의해 매개된다고 알려져 있다. 활성화된 AKT는 포도당 흡수 및 PKM2(pyruvate kinase M2)의 인산화를 유도하여 당 분해 효소의 발현을 증가시킨다. 따라서 V-ATPase subunit V1E1이 AKT 및 PKM2 활성에 영향을 미쳐 해당과정의 활성화를 유도하는지 알아보기 위해 V1E1의 발현이 저해된 세포에서 AKT 및 PKM2 단백질의 인산화(pAKT 및 pPKM2) 수준을 관찰하였다. 그 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이, V-ATPase subunit V1E1의 발현을 저해시킨 경우 식도암 세포 내 total AKT 및 PKM2 단백질 발현량은 차이가 없는 반면, p-AKT(ser473) 및 p-PKM2(Tyr105)의 발현이 대조군(si-NS)에 비하여 감소하였다. 상기 결과는 V-ATPase subunit V1E1이 AKT 및 PKM2를 통해 해당과정을 촉진함을 의미한다.
나아가 식도암에서 V-ATPase subunit V1E1(ATP6V1E1) 및 PKM2 유전자 발현간의 관련성을 확인하기 위해, 식도암 환자로부터 분리된 1170개의 종양에 대하여 Cancer Genome Atlas(TCGA)에서 분석된 RNA 서열 분석 결과를 확인하였다. 상기 서열분석 결과 내에 ATP6V1E1 mRNA 발현 수준을 비교한 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이, ATP6V1E1 mRNA 발현과 PKM2 발현 간에 상당한 연관성(P<0.001, R2=0.173)이 있는 것을 알 수 있었다. 상기 결과는 ATP6V1E1 단백질이 식도암에서 해당과정을 위한 PKM2의 발현을 조절함을 의미한다.
상기 결과들을 통해, V-ATPase subunit V1E1이 식도암 세포에서 ATP 농도, 젖산 합성, 당 분해 효소의 발현, 및 당대사 관련 신호전달을 조절함으로써 호기성의 해당과정에서 매우 중요한 역할을 하는 것을 알 수 있었다.
상기 진술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
본 발명은 식도암 환자 유래 식도 조직에서 ATP6V1E1(V-ATPase subunit V1E1) 단백질의 발현수준과 식도암의 조직학적 등급 및 환자의 생존율간의 관련성이 있음을 규명하였고, ATP6V1E1 유전자의 발현 저해 시 식도암 세포의 증식, 운동성, 전이, 세포사멸, 및 당 대사능이 억제되는 것을 통해 ATP6V1E1 유전자가 식도암의 종양형성 및 발달에 중요한 인자임을 확인하였는바, ATP6V1E1 유전자는 식도암의 진단 및 예후 예측을 위한 유전자 마커로써 유용하게 이용될 수 있으며, ATP6V1E1 유전자의 발현 또는 활성을 억제하는 식도암 치료물질의 스크리닝 및 의약품 개발용도 등으로 유용하게 이용할 수 있을 것으로 기대된다.

Claims (26)

  1. ATP6V1E1 유전자 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질을 포함하는, 식도암 진단 또는 예후 예측용 마커 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 ATP6V1E1 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 식도암 진단 또는 예후 예측용 마커 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 ATP6V1E1 유전자가 코딩하는 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 식도암 진단 또는 예후 예측용 마커 조성물.
  4. ATP6V1E1 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 식도암 진단 또는 예후 예측용 조성물.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 ATP6V1E1 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 식도암 진단 또는 예후 예측용 조성물.
  6. 제4항에 있어서,
    상기 ATP6V1E1 유전자가 코딩하는 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 식도암 진단 또는 예후 예측용 조성물.
  7. 제4항에 있어서,
    상기 mRNA 수준을 측정하는 제제는 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 센스 및 안티센스 프라이머, 또는 프로브인 것을 특징으로 하는, 식도암 진단 또는 예후 예측용 조성물.
  8. 제4항에 있어서,
    상기 단백질 수준을 측정하는 제제는 유전자가 코딩하는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체인 것을 특징으로 하는, 식도암 진단 또는 예후 예측용 조성물.
  9. 제4항의 조성물을 포함하는, 식도암 진단 또는 예후 예측용 키트.
  10. 피검체 유래의 생물학적 시료에서 ATP6V1E1 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 발현수준을 측정하는 단계를 포함하는, 식도암 진단 또는 예후 예측을 위한 정보제공방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 ATP6V1E1 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 식도암 진단 또는 예후 예측을 위한 정보제공방법.
  12. 제10항에 있어서,
    상기 ATP6V1E1 유전자가 코딩하는 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 식도암 진단 또는 예후 예측을 위한 정보제공방법.
  13. 제10항에 있어서,
    상기 mRNA의 발현수준은 중합효소연쇄반응(PCR), 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR), 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection assay; RPA), 마이크로어레이(microarray), 및 노던 블롯팅(northern blotting)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방법을 통해 측정되는 것을 특징으로 하는, 식도암 진단 또는 예후 예측을 위한 정보제공방법.
  14. 제10항에 있어서,
    상기 단백질 발현수준은 웨스턴 블롯팅(western blotting), 방사선면역분석법(radioimmunoassay; RIA), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 효소면역분석법(ELISA), 면역침강법(immunoprecipitation), 유세포분석법(flow cytometry), 면역형광염색법(immunofluorescence), 오우크테로니(ouchterlony), 보체 고정 분석법(complement fixation assay), 및 단백질 칩(protein chip)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방법을 통해 측정되는 것을 특징으로 하는, 식도암 진단 또는 예후 예측을 위한 정보제공방법.
  15. 제10항에 있어서,
    상기 예후는 재발, 생존, 또는 무병생존인 것을 특징으로 하는, 식도암 진단 또는 예후 예측을 위한 정보제공방법.
  16. ATP6V1E1의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는, 식도암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 억제제는 siRNA(small interfering RNA), shRNA(short hairpin RNA), miRNA(micro RNA), 리보자임(ribozyme), DNAzyme, PNA(peptide nucleic acids), 안티센스 뉴클레오티드, 펩타이드, 항체, 및 압타머로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 식도암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  18. 제16항에 있어서,
    상기 조성물은 식도암 세포의 이동(migration) 및 침습(invasion)능을 억제하는 것을 특징으로 하는, 식도암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  19. 제16항에 있어서,
    상기 조성물은 식도암 세포의 포도당 대사과정을 억제하는 것을 특징으로 하는, 식도암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  20. 하기의 단계를 포함하는, 식도암 치료물질의 스크리닝 방법:
    (a) In vitro 상에서 세포에 후보물질을 처리하는 단계;
    (b) 상기 세포의 ATP6V1E1 유전자의 발현 또는 활성을 측정하는 단계; 및
    (c) 후보물질 비처리군에 비해 상기 ATP6V1E1 유전자의 발현 또는 활성을 감소시키는 물질을 식도암의 치료물질로 선정하는 단계.
  21. 제20항에 있어서,
    상기 세포는 식도조직 유래 세포인 것을 특징으로 하는, 식도암 치료물질의 스크리닝 방법.
  22. 제20항에 있어서,
    상기 후보물질은 화합물, 미생물 배양액 또는 추출물, 천연물 추출물, 핵산, 및 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 식도암 치료물질의 스크리닝 방법.
  23. 제20항에 있어서,
    상기 (b) 단계는 중합효소연쇄반응(PCR), 마이크로어레이(microarray), 노던 블롯팅(northern blotting), 웨스턴 블롯팅(western blotting), 효소면역분석법(ELISA), 면역침강법(immunoprecipitation), 면역화학염색법(immunohistochemistry), 및 면역형광염색법(immunofluorescence)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방법을 이용하여 측정하는 것을 특징으로 하는, 식도암 치료물질의 스크리닝 방법.
  24. ATP6V1E1의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 식도암의 예방 또는 치료 방법.
  25. ATP6V1E1의 발현 또는 활성 억제제의 식도암의 예방 또는 치료 용도.
  26. ATP6V1E1 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 식도암 진단 또는 예후 예측 용도.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023237431A1 (en) * 2022-06-07 2023-12-14 Esocap Ag Drug delivery system comprising an agent effective in the treatment or prevention of an esophageal disease for the application to esophageal mucous membranes

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101657033B1 (ko) * 2016-03-25 2016-09-13 성균관대학교산학협력단 V-ATPase subunit V1E1의 단백질 발현 수준을 측정하여 식도암 환자의 생존율과 예후를 예측하는 방법
KR101973906B1 (ko) * 2018-08-22 2019-04-29 성균관대학교산학협력단 V-atp6voc의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는, 식도암 예방 또는 치료용 약학적 조성물

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2009039052A (ja) * 2007-08-09 2009-02-26 Hiroshima Univ 食道癌の予後診断マーカー遺伝子およびその利用
WO2015098112A1 (ja) * 2013-12-27 2015-07-02 独立行政法人医薬基盤研究所 食道がんのマーカーおよびその利用
KR101657033B1 (ko) * 2016-03-25 2016-09-13 성균관대학교산학협력단 V-ATPase subunit V1E1의 단백질 발현 수준을 측정하여 식도암 환자의 생존율과 예후를 예측하는 방법

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2008310704B2 (en) * 2007-10-11 2014-03-20 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Methods and compositions for the diagnosis and treatment of esphageal adenocarcinomas
CA2827894A1 (en) * 2011-02-22 2012-08-30 Caris Life Sciences Luxembourg Holdings, S.A.R.L. Circulating biomarkers

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2009039052A (ja) * 2007-08-09 2009-02-26 Hiroshima Univ 食道癌の予後診断マーカー遺伝子およびその利用
WO2015098112A1 (ja) * 2013-12-27 2015-07-02 独立行政法人医薬基盤研究所 食道がんのマーカーおよびその利用
KR101657033B1 (ko) * 2016-03-25 2016-09-13 성균관대학교산학협력단 V-ATPase subunit V1E1의 단백질 발현 수준을 측정하여 식도암 환자의 생존율과 예후를 예측하는 방법

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DATABASE Nucleotide 7 October 2008 (2008-10-07), XP055601267, retrieved from NCBI Database accession no. CU 013231.1 *
DATABASE Protein 13 February 2016 (2016-02-13), XP055601302, retrieved from NCBI Database accession no. NP_001687.1 *
ZHAO: "Comparative proteomics analysis of barrett metaplasia and esophageal adenocarcinoma using two-dimensional liquid mass mapping", MOLECULAR & CELLULAR PROTEOMICS, vol. 6, no. 6, 8 July 2006 (2006-07-08), pages 987 - 999, XP055041702, DOI: doi:10.1074/mcp.M600175-MCP200 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023237431A1 (en) * 2022-06-07 2023-12-14 Esocap Ag Drug delivery system comprising an agent effective in the treatment or prevention of an esophageal disease for the application to esophageal mucous membranes

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