KR20090029338A - 간암 마커로서의 ｌｃｎ2 유전자, 단백질 및 간암 진단키트 - Google Patents

Abstract

본 발명은 간암 환자의 조직, 세포 또는 체액에서 LCN2의 과발현 현상을 이용하여 간단한 분석을 통해 간암 진단의 정확성을 높인 간암 마커 및 이를 이용한 간암 진단 키트에 관한 발명이다.

간암, LCN 2, 리포칼린, 체액, 진단 키트

Description

간암 마커로서의 ＬＣＮ2 유전자, 단백질 및 간암 진단 키트{Lipocalin 2 as a tumor associated marker of hepatocellular carcinoma and a hepatocellular carcinoma diagnostic kit using thereof}

본 발명은 간암 환자의 혈청에서 LCN(Lipocalin) 2(이하 발명의 상세한 설명, 도면 및 청구범위에서 "리포칼린 2"와 혼용함)의 과발현 현상을 이용하여 정량 분석을 통해 간암 진단의 정확성을 높인 간암 마커 및 간암 진단 키트에 관한 발명이다.

간염, 간경변, 간암 등을 포함한 간질환은 한국, 일본, 대만, 중국 및 대부분의 동남아 국가에서 단일 질병으로는 가장 많은 환자가 발생하고 있으며 간암으로 인한 사망률은 장기별 기준으로 보면 세계적으로 네 번째(50만5천명)이며(세계보건기구 1997년도), 국내에 있어서는 세 번째(11.5%)를 차지하고 있다(한국 암발생 통계 2002). 간암진단의 경우 조직검사를 실시하거나 혈중 알파 태아 단백질(alpha-fetoprotein, 이하 "AFP")과 같은 간암표지 단백질검사를 실시하여 간암 여부를 진단하여 왔다.

현재 간암관련 진단, 예후판정, 치료평가 바이오마커로 가장 잘 알려진 마커 는 AFP, PIVKA(Protein Induced by Vitamin K Absence)-II등이 있으나 특이도, 민감도에서 만족스럽지 못하다. 간세포암 진단에 있어서 혈중 알파 태아 단백질(alpha-fetoprotein, AFP)의 유용성은 잘 알려져 있다. 진행된 간세포암의 진단뿐만 아니라 간경변증 환자에서 자연경과 중 매년 3-10%에서 간세포암이 발병하기 때문에 조기발견을 위한 정기적인 AFP 측정이 필요하다. 그러나 AFP는 간세포암뿐만 아니라 알콜성 간염, 만성 간염이나 간경변증과 같은 양성질환에서도 고농도로 상승하기 때문에 위양성이 많고 실제 양성율이 50-60%에 지나지 않는다(민감도는 20ng/㎖ 및 400ng/㎖에서 각각 29.9% 및 65.8%). PIVKA-II는 DCP(des-r-carboxyprothrombin) 즉 응고작용이 없는 비정상 프로트롬빈으로 혈청 AFP와는 독립적으로 간세포암의 진단에서 각각 48.2% 및 95.9%의 민감도와 특이도가 보고되고 있다. 이러한 생물학적 지표들은 현재 임상적으로 이용되고 있으나 모든 간암의 생물학적 특성을 반영하지 못하고 제한적 유용성이 높다. 그러므로 현재의 간암 마커인 AFP나 PIVKAII보다 간암을 특이적이고 효과적으로 진단할 수 있는 마커를 발굴하고 이를 이용하여 간암을 조기 진단할 수 있는 검사 시약의 개발이 필요하다.

현재 혈액, 조직, 배설물로부터 종양을 진단할 수 있는 마커가 일부 개발되어 있으나 많은 종류의 종양 마커는 암이 없어도 증가하거나 검출되는 경우가 있다. 종양 마커 발굴은 암을 사전에 예방하거나 혹은 조기발견, 치료중인 경우는 그 예후를 관찰하기 위한 목적으로 활용되고 있다. 최근에 제노믹스(Genomics), 프로테오믹스(Proteomics) 연구에 의해 몇 가지 종류의 간암 마커 후보 단백질과 유전 자가 보고되고 있다. 김남순 등에 의해 간암조직에서 정상조직과 비교하여 발현율 차이를 보이는 14종의 유전자를 발굴, 이들 유전자 발현 차이를 이용, 간암 진단으로 활용에 대한 논문과 특허가 발표된바 있다(대한민국 공개번호 10-2005-0076876, 2005: International J. of oncology, 29 :315-327, 2006). 이 특허와 논문에서는 14종 유전자에 대한 경쟁적 RT-PCR을 실시하며 간암 진단의 유용성을 밝혔으며 항체를 이용한다면 단백질 측정도 가능할 것이라는 가능성을 제시하였다. 현재 대부분의 종양 마커 발굴은 조직의 유전자 발현 차를 중심으로 탐색하고 있으나 바이오 마커의 성질상 조직에서 유전자 발현이 높다고 해서 조직, 뇨, 또는 혈청으로 단백질이 분비되는 것은 아니다. 따라서 진단의 편의성을 위하여 혈액이나 뇨에서 분비되는 종양 마커 발굴이 중요하며 그에 대한 분석법 및 진단법이 중요하다.

리포칼린 2(LCN2)는 호중구 젤라티나제-결합 리포칼린(Neutrophil gelatinase-associated lipocalin; "NGAL")으로도 불리며 24-kDa 단백질로서 인간 호중구(human neutrophils)의 특정 그래뉼에 저장되어 있다. 그 기능으로는 지방산이나 철을 수송하고 사이토카인-의존성 호중구(cytokine-dependent neutrophils) 및 다른 류코사이트(leukocytes)에서 세포사멸(apoptosis)을 유도하고 bacterial catecholate-type ferric siderophores에 결합함으로서 세균 성장을 억제하고 inflammatory responses의 조절기능을 지니고 있다. 최근 암과 관련된 보고가 발표되고 있으며(Bratt T. Biochim Biophys Acta 2000). 특히 유방암, 폐암, 대장암, 췌장암에서 발견한 보고가 있다(Nielsen BS et al. Gut 1996, Furutani M et al, Cancer Lett 1998). 정상 난소에서는 발현되지 않으나(Cowland JB eta al. Genomics 1997), 난소암에서는 과량 발현한다는 보고가 있다(Bartsch S, EBS Lett 1995). 이들은 주로 암세포주를 이용하여 실험하였으며 RNA 수준에서 발현차를 보고 면역조직화학 등에 의해 단백질 발현을 조사하였다. 간암과 관련되어 보고되어 있는 논문은 없다.

기존 연구에 의하면 조직에서의 LCN2에 대한 mRNA 발현은 cDNA microarray, RT-PCR, Northern Blot, dot-blot hybridization같은 방법에 의해 측정하였고 단백질은 항체를 이용한 면역조직화학 방법에 의해 측정되어 왔다.

측정테스트 킷에 관련된 연구로는 “치근막 질환의 진단과 이의 진행위험을 예견하는 방법과 이에 사용되는 테스트 킷트”(KR 1998-7003659, 1998,12,05), 췌장암 진단용 킷트(KR 2006-0096833, 2006.9.30)가 보고된 바 있으나 본 발명자의 특허가 LCN2를 이용한 간암진단 과 치료에 관한 특허인 반면 이들 특허는 LCN2를 측정하여 치근막 질환, 췌장암을 진단하는 킷트이다.

LCN2가 치료와 진단에 사용된 용도로 제시된 특허는 “인간 리포칼린 2를 유효성분으로 포함하는 암 전이 억제용 약학적 조성물, 이를 이용한 암 전이 억제 방법”(KR2006-0095114, 2006,08,31)이 있으며 이 특허에는 리포칼린 2 단백질을 이용하여 대장암전이 억제 방법, 대장암 전이 가능성 예측키트 및 대장암 전이 위험군의 선별 방법이 개시되어 있다.

진단방법에 사용된 특허로 “Assay for carcinoma proliferative status by measuring NGAL expression level”(US 5627034(1997,5,6)), “Methods and compositions for diagnosing and treating rheumatoid arthritis, US2001-023451(2001,12,17)” 등이 있으며 이들은 LCN2 유전자 발현을 정량 분석함으로써 암세포 증식분석 - 조직과 혈청을 이용한 유방암 진단하거나 마이크로어레이를 이용한 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis) 마커에 관한 것이다.

이와 같이 대부분의 특허와 논문이 유방암, 폐암, 대장암, 췌장암에 관련된 내용이며 간암에 관련되어 특성을 규명하고 이를 이용하여 간암 진단과 치료에 이용하는 선행연구는 없다. 그러므로 본 발명에서 밝힌 LCN2의 생물학적 의의와 간암과의 연관성은 LCN2를 이용하여 간암을 진단, 예후에 중요하게 이용할 수 있으며 LCN2가 관여된 암화의 기작을 밝히고 이를 이용하여 암을 치료하는데 중요한 역할을 하게 될 것으로 사료된다.

따라서, 본 발명의 목적은 간암 유전자 LCN2 또는 그의 단편 및 항체를 포함하는 간암 진단용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 유전자 LCN2 또는 그의 단편으로부터 유래되는 mRNA에 상보적인 염기서열을 지닌 siRNA를 제공하고, 이를 사용하여 간암의 발병 또는 전이를 치료 또는 예방하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 작용을 촉진 또는 억제하는지를 확인하는 것을 특징으로 하는 간암 억제제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.

본 발명에서는 LCN2의 생물학적 기능을 밝히고 임상적 의의를 알아보기 위하여 간암(hepatocellular carcinoma, HCC) 조직과 혈액에서 RNA, 단백질 발현정도를 밝혀 간암의 진단, 예후마커로서의 가능성을 평가해 보았다. 이를 위하여 간암조직, 정상인의 간 조직, 간암환자의 정상 간조직을 대상으로 cDNA 마이크로어레이, RT-PCR, 조직면역화학염색을 실시하였으며 실험결과 LCN2는 간암조직에서 비암(non-tumor) 조직 또는 정상 간조직과 비교했을 때 보다 높은 RNA, 단백질 발현을 보였다. 특히 에드먼슨의 암 단계(Edmondson's tumor grade) III, 임파선으로부터 전이한 간암세포조직에서 높은 단백질 발현증가를 보였다. 또한 간암 세포주를 대상으로 웨스턴 블랏을 실시한 HLK2, HKK2, HLK6에서 LCN2 발현을 보였으며, 특히 HLK2는 전이성을 보이는 간암 세포주이다.

임상혈청시료를 이용하여 LCN2의 분포도를 조사해 본 결과 간암에서 높은 농도의 LCN2이 분비됨을 볼 수 있었다.

이와 같은 실험결과들로 미루어 보아 LCN2는 간암 진행, 특히 전이성 간암에 있어 중요한 마커이며 간암 진단과 예후에 좋은 마커로서 사용 가능성이 높다. 본 발명은 간암조직과 혈청에서의 LCN2의 발현 및 특성을 연구하여 LCN2를 간암의 조기 진단, 예후, 치료의 모니터링에 사용함을 목적으로 한다. ELISA(Enzyme linked immunosorbent assay) 법을 비롯한 정량분석법을 이용한다면 간암의 조기진단, 예후, 치료 모니터링에 효과적으로 사용될 수 있을 것으로 사료된다. 또한, 본 발명은 간암 치료 연구 및 암화 특성을 연구하는데도 사용될 수 있다.

본 발명은 기존의 간암의 진단 및 치료의 마커에 관한 것으로서 형질 전환 세포주와 동물의 제조, siRNA(small interfering RNA)를 이용한 유전자 치료, 간암 특이적 항암제의 개발 등에 효과적으로 이용될 수 있다.

본 발명은 인간 LCN2의 간암에서의 생물학적 특징과 임상의학적 의의를 제공한다. 또한 이를 이용하여 간암세포와 조직, 혈청에서 LCN2의 RNA, 단백질의 발현을 비교하는 것을 그 특징으로 한다. LCN2의 발현은 간암 발병 원인 규명, 진단 및 치료에 이용할 수 있을 것으로 기대한다.

이와 같은 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명에서는 LCN2의 생물학적 기능을 밝히고 임상적 의의를 알아보기 위하여 간암조직에서 RNA, 단백질 발현정도를 밝혀 간암의 진단, 예후 마커로서의 가능성을 평가해 보았다. 이를 위하여 전북대학교, 강남성모병원으로부터 간암환자로부터 원발성 간암 조직(primary HCC tissues)을 얻어 양성시료로 사용하였으며 정상 간 조직은 강남성모병원으로부터 간암환자가 아닌 환자로부터 얻었다. 조직시료로부터 RNA을 분리 cDNA 마이크로어레이, RT-PCR을 실시하여 RNA 발현분포를 보았다. 단백질 발현을 보기 위하여 웨스턴 블랏, 조직면역화학염색을 실시하였으며 혈청에서의 분포를 알아보기 위하여 단국대학교와 전북대학교에서 간암을 비롯한 간질환관련환자로부터 혈액을 채취, ELISA법을 이용하여 혈청 중 LCN2의 양을 분석하였다. ELISA법 확립을 위해 LCN2에 대한 재조합 단백질과 항체를 생산하였다. 통계 분석은 SPSS statistical software V13.0을 하였으며 p값이 0.05 이하이면 유의성이 있는 것으로 간주하였다. cDNA 마이크로어레이, RT-PCR, 웨스턴 블랏, 면역화학 염색 실험결과 LCN2는 간암조직에서 비암 조직 또는 정상 간과 비교했을 때 좀더 높은 RNA 및 단백질 발현을 보였다. 특히 에드먼슨의 암 단계9Edmondson's tumor grade) III, IV 전이성 간암에서 높은 단백질 발현증가를 보였다. 혈청검사 결과 간암환자의 혈청에서 LCN2가 높은 발현을 보였으며, 간암 세포주에서도 높은 발현을 보였다.

본 발명은 LCN2 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 간암 마커 진단 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 정상 대조군과 비교하여 LCN2 단백질 양의 증가로 간암을 진단하는 것을 특징으로 하는 간암 마커 진단 키트를 제공한다. 상기 키트에는 ELISA(Enzyme linked immunosorbent assay)용 키트가 포함된다.

또한, 본 발명은 LCN2 mRNA를 정량적으로 검출하는 간암 마커 진단 키트를 제공한다. 상기 mRNA 정량 검출 방법은 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR, 실시간 RT-PCR, RNase 보호 분석법(RNase protection assay), 노던블랏팅(Nothern blotting), DNA 칩 등을 선택할 수 있다. 상기 mRNA 정량 검출 간암 마커 진단 키트는 LCN2 mRNA에 특이적으로 결합하는 뉴클레오타이드를 포함하는 것을 특징으로 한다. 또한, 상기 mRNA 정량 검출 간암 마커 진단 키트는 LCN2 mRNA에 대응하는 cDNA 제조용 프라이머, 역전사 효소, Taq 폴리머레이즈, PCR용 프라이머, dNTP를 포함하는 것을 특징으로 하는 간암 마커 진단 키트인 것을 특징으로 한다.

본 발명은 LCN2 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 조직, 세포, 뇨, 혈액, 혈청 및 혈장 중에서 선택되는 생물학적 시료와 접촉시키는 단계를 포함하는 간암 마커 검출 방법을 제공한다.

또한, 본 발명의 간암 마커 검출 방법은

a) 분석할 생물학적 시료를 제공하는 단계;

b) 상기 시료와 LCN2 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 접촉시키는 단계;

c) 항원-항체 복합체를 정량 검출하는 단계; 및

d) 상기 c) 단계 검출 결과를 정상 대조군과 비교하는 단계;를 포함하는 것 을 특징으로 한다.

본 발명은 서열번호 1의 LCN2 발암 유전자 또는 그의 단편을 포함하는 형질전환용 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 벡터에 의해 형질전환된 HLK2-LCN2, HKK2-LCN2, HLK6-LCN2 등의 동물 세포주를 제공한다.

본 발명은 서열번호 1의 LCN2 간암 유전자 또는 그의 단편으로부터 전사되는 mRNA의 서열의 전부 또는 일부와 상보적인 서열을 지니고, 상기 mRNA에 결합하여 상기 발암 유전자 또는 단편의 발현을 억제하는 안티-센스 유전자를 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 1의 LCN2 간암 유전자 또는 그의 단편으로부터 전사되는 mRNA의 서열의 전부 또는 일부와 상보적인 서열을 지니고, 다이써(Dicer) 단백질에 의해 인지되어 상기 LCN2 간암 발암 유전자의 발현을 저해하는 siRNA 서열을 제공한다.

또한, 본 발명은 LCN2 단백질에 시험 화합물을 결합시키고, 시험 화합물이 상기 LCN2 단백질의 작용을 촉진 또는 억제하는지를 확인하는 것을 특징으로 하는 간암 억제제의 스크리닝 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 1의 염기 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 간암 치료용 또는 전이 억제용 타겟 유전자 LCN2를 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 간암 치료용 또는 전이 억제용 타겟 LCN2 단백질을 제공한다.

본 발명은 LCN2 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는 암 진단 키트에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 LCN2 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 제제를 생물학적 시료와 접촉시키는 단계를 포함하는 암 마커 검출 방법에 관한 것이다.

본 발명에서 "마커"는 간암 등의 암 세포를 정상 세포와 구분하여 진단할 수 있는 물질로, LCN2 유전자에 대한 핵산 마커 및 LCN2 단백질에 대한 폴리펩타이드 마커일 수 있으며, 이들 마커들은 정상 세포에 비해 간암 세포에서 발현이 증가하는 특징을 나타낸다.

본 발명에서 "진단"은 간암 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다.

본 발명의 인간 간암 유전자인 LCN2은 서열번호 1로 나타낸 바와 같이 597bp 길이의 전체 염기서열을 가지며, 서열번호 1의 염기서열에서 뉴클레오티드 번호 1-594 부위에 해당하는 전사 해독 프레임(open reading frame)을 가지며 여기서 코딩되는 전체 단백질은 198개의 아미노산으로 이루어져 있으며 아미노산 서열은 서열번호 2에 나타낸 바와 같다. 그러나 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인해서 또는 상기 발암 유전자를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여 본 발명의 유전자는 코딩 영역으로부터 발현되는 발암 단백질의 아미노산을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩영역의 다양한 변형이 이루어질 수 있고 코딩영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 다양한 변형 또는 수 식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 서열번호 1의 발암 유전자와 실질적으로 동일한 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 포함한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.

본 발명의 간암 유전자로부터 발현되는 단백질은 198개의 아미노산으로 이루어져 있고 서열번호 2와 같은 서열을 가진다.

본 발명의 간암 유전자 및 단백질은 사람의 간암을 비롯한 각종 조직으로부터 분리되거나, 공지의 DNA 또는 펩타이드 합성 방법에 따라 합성할 수도 있다. 또한 이렇게 제조된 유전자를 당 분야에 공지된 동물 발현용 벡터에 삽입할 수 있으며, 이를 적절한 동물 세포주에 도입시킬 수 있다.

본 발명의 유전자는 실시간 PCR의 분석 방법에서 간암조직에서 비교적 발현이 높기 때문에 간암을 유발하는 발암/전이 유전자로 판단된다.

따라서, 본 발명의 간암 유전자는 간암의 발생에 관여하는 것으로 판단되며, 간암의 진단, 형질전환 동물의 제조, 간암 특이적 항암제 탐색, siRNA 유전자 치료 등에 효과적으로 이용될 수 있으며, 인간의 수명을 조절하는 유전자로 이용될 수 있다.

상기 발암/전이 유전자를 이용한 암의 진단방법은, 예를 들어, 상기 원암 유전자가 코드한 단백질의 항체를 이용한 방법과 상기 발암/전이 유전자의 전부 또는 일부를 프로브로서 사용하여 대상자의 조직으로부터 분리한 핵산과 하이브리드화한 후 당 분야에 공지된 다양한 방법, 예를 들어, 역전사 중합효소연쇄반응(reverse transcription polymerase chain reaction), 노던 블롯팅(Northern blotting)등으로 이를 검출함으로써 대상자가 본 발명의 발암/전이 유전자를 발현하는지를 판단하는 과정을 포함한다. 상기 프로브를 방사선 동위원소 또는 효소 등으로 표지하거나 항체를 이용한 면역학적 분석법은 용이하게 유전자의 발현을 확인할 수 있다. 따라서 본 발명에서는 상기 발암/전이 유전자의 전부 또는 일부를 포함하는 간암 진단용 키트를 제공한다.

형질전환 동물은 본 발명의 발암/전이 유전자를 포유동물, 예를 들어, 마우스 등의 설치류 동물에 도입함으로써 제조할 수 있으며, 이 유전자를 적어도 8세포기 이전의 수정란 단계에서 도입하는 것이 바람직하다. 이렇게 제조된 형질전환 동물은 발암/전이성 물질 또는 상기 유전자 저해물질 및 항암물질의 탐색 등에 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 발암/전이 유전자로부터 유도되는 단백질을 진단 도구로서 항체를 생산하는데 유용하게 사용될 수 있다. 본 발명의 항체는, 본 발명의 발암/전이 유전자로부터 발현된 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 그의 단편을 이용하여 당 분야에 공지된 통상의 방법에 따라 단일 모노클론항체(Monoclonal antibody) 또는 폴리클론항체(polyclonal antibody)로서 제조할 수 있으며, 이러한 항체들을 이용하여 당 분야에 공지된 효소 면역측정법(Enzyme Linked Immunosorbent assay; ELISA), 방사선 면역측정법(Radioimmunoassay; RIA), 샌드위 치 측정법(sandwich assay), 폴리아크릴 겔상의 웨스턴 블롯 또는 면역 블롯 등의 방법에 의해 대상자의 체액 시료 중에 상기 단백질이 발현되었는지를 확인함으로써 간암을 진단할 수 있다.

또한, 본 발명의 발암/전이 유전자의 프로모터를 이용한 리포터 시스템을 가진 지속적으로 증식 가능한 세포주를 확립할 수 있으며, 이러한 세포주는 저분자 물질의 탐색을 통한 항암제 탐색에 유용하게 이용될 수 있다.

생물학적 시료 중의 LCN2 마커 유전자의 발현 수준은 mRNA 또는 이의 단백질 양을 확인함으로써 알 수 있으며, 생물학적 시료에서 mRNA와 단백질을 분리하는 과정은 공지의 공정을 이용하여 수행할 수 있으며, mRNA와 단백질의 양은 다양한 방법으로 측정할 수 있다.

본 발명에서 "생물학적 시료"란 LCN2 마커 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준의 차이를 검출할 수 있는 조직, 세포 등으로 바람직하게는 뇨, 혈액, 혈장, 혈청 등을 포함하며 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 "mRNA 수준 측정"이란 LCN2 마커 유전자를 검출하기 위하여 생물학적 시료에서 LCN2 마커 유전자들의 mRNA 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로 mRNA의 양을 측정한다. 이를 위한 분석 방법으로는 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR, 실시간 RT-PCR, RNase 보호 분석법(RNase protection assay), 노던블랏팅(Nothern blotting), DNA 칩 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.

상기 검출 방법들을 통하여 정상 대조군에서의 mRNA 발현량과 간암 의심환자에서의 mRNA 발현량을 비교할 수 있고, LCN2 마커 유전자에서 mRNA로의 유의한 발 현량의 증가 여부를 판단하여 간암 의심 환자의 실제 암 환자 여부를 진단할 수 있다.

mRNA 수준을 RT-PCR로 측정하기 위한 키트는 LCN2 마커 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍을 포함한다. 프라이머는 각 마커 유전자의 핵산서열에 특이적인 서열을 가지는 뉴클레오타이드로서, 약 7 내지 50bp의 길이, 좀더 바람직하게는 약 10 내지 30bp의 길이이다. 또한, 대조군 유전자의 핵산서열에 특이적인 프라이머를 포함할 수 있다. 그 외 RT-PCR 키트는 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머레이저 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제 DEPC수(DEPC water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. "프라이머"는 짧은 자유 3' 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트와 염기쌍을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약 및 상이한 네 가지 뉴클레오사이드 3인산의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 프라이머는 DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다. 프라이머는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다.

본 발명에서 "단백질 수준 측정"이란 생물학적 시료에서 LCN2 마커 유전자에서 발현된 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로서 바람직하게는 상기 유전자의 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 단백질의 양을 확인한다.

"항체"란 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상 항체는 LCN2 마커 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 폴리클론 항체, 모노클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다.

항체를 이용하여 단백질 수준을 측정하는 분석방법으로는 웨스턴 블랏, ELISA(Enzyme linked immunosorbent assay), RIA(Radioimmunoassay), 방사면역 확산법(Radioimmunodiffusion), 오크털로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로켓 면역전기영동, 조직면역염색, 면역침전분석(Immunoprecipitation), 보체고정분석(Complement fixation assay), FACS, 단백질 칩 등이 있으며, 기재된 방법으로 제한되는 것은 아니다.

위와 같은 분석방법을 통하여 정상 대조군의 항원-항체 복합체의 형성량과 간암 의심환자의 항원-항체 복합체의 형성량을 비교할 수 있고, LCN2 단백질의 유의한 발현량 증가 여부를 판단하여 간암 의심환자의 실제 간암 여부를 진단할 수 있다.

"항원-항체 복합체"란 LCN2 단백질과 이에 특이적인 항체의 결합물을 의미하고, 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨(detection label)의 신호 크기를 통하여 정량적으로 측정할 수 있다. 검출 라벨은 효소, 형광물질, 리간드, 발광물질, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택할 수 있으며, 상기 기재된 물질로 제한되는 것은 아니다. 검출 라벨로 효 소를 사용하는 경우 이용할 수 있는 효소로는 β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, β-D-갈락토시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제 또는 알칼라인 포스파타아제, 아세틸콜린에스터라아제, 글루코스 옥시다아제, 헥소키나아제 등이 있으며, 상기 기재된 범위로 제한되지 않는다. 형광물질로는 플루오레신, 피코시아닌, 플루오레스카민 등이 있고, 상기 기재된 물질로 제한되는 것은 아니다. 리간드로는 바이오틴 유도체 등이 있고, 이에 제한되지는 않는다. 발광물질로는 루시페린 등이 있고, 이에 제한되지는 않는다. 미소입자로는 콜로이드 금 등이 있고, 이에 제한되는 것은 아니다. 레독스 분자로는 퀴논, 1,4-벤조퀴논, 하이드로퀴논 등이 있고, 이에 제한되는 것은 아니다. 방사선 동위원소에는 ³H,¹⁴C 등이 포함되며, 이에 제한되는 것은 아니다.

단백질 발현수준 측정은 바람직하게는 ELISA를 이용한다. ELISA로는 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 표지된 또다른 항체를 이용하는 직접적 샌드위치 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 또다른 항체와 반응시킨 후 이 항체를 인지하는 표지된 2차 항체를 이용하는 간접적 샌드위치 ELISA 등 다양한 ELISA 방법을 포함한다. 좀더 바람직하게는 고체 지지체에 항체를 부착시키고 시료를 반응시킨 후 항원-항체 복합체의 항원을 인지하는 표지된 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키거나, 항원-항체 복합체의 항원을 인지하는 항체에 대해 표지된 2차 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키는 샌드위치 ELISA 방법에 의해서 검출한다. LCN2 마커 단백질과 항체의 복 합체 형성 정도를 확인하여 암 발병 여부를 확인할 수 있는 것이다.

또 다른 방법으로 LCN2 마커에 대한 하나 이상의 항체가 기판 위 정해진 위치에 배열되어 고밀도로 고정화되어 있는 단백질 칩을 이용할 수 있다. 단백질 칩을 이용하여 시료를 분석하는 방법은 시료에서 단백질을 분리하고, 분리한 단백질을 단백질 칩과 혼성화시켜 항원-항체 복합체를 형성시키고 이를 판독하여 단백질의 존재 또는 발현 정도를 확인하여 암 발병 여부를 확인할 수 있다.

또 다른 방법으로 LCN2에 대한 항체를 이용하여 웨스턴 블랏팅을 하는 것이다. 시료에서 전체 단백질을 분리하고, 이것을 전기영동하여 단백질을 크기에 따라 분리한 다음 나이트로셀룰로스 막으로 이동시켜 항체와 반응시킨다. 생성된 항원-항체 복합체의 양을 표지된 항체를 이용하여 확인함으로써 암 발병 여부를 확인할 수 있다.

위와 같은 검출방법들은 정상 대조군의 마커 유전자 발현량과 간암 발병 세포에서의 마커 유전자의 발현량을 비교하는 단계를 포함한다. mRNA 또는 단백질의 수준은 LCN2 마커 단백질의 절대적 또는 상대적 차이로 나타낼 수 있다.

본 발명은 LCN2 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 암 진단 키트에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 LCN2 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 생물학적 시료와 접촉시키는 단계를 포함하는 간암 마커 검출 방법에 관한 것이다.

본 발명에서 LCN2 단백질이 간암 마커로 규명되었으므로, 이를 이용하여 항체를 생성하는 것은 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있 다. 본 발명이 속하는 기술분야에 널리 알려진 바에 따라, 폴리클론 항체는 LCN2 단백질 항원을 동물에 주사하여 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 얻는다. 동물로는 염소, 토끼, 돼지 등 임의의 동물 숙주를 이용하여 제조할 수 있다. 모노클론 항체는 본 발명이 속하는 기술분야에 널리 알려진 대로 하이브리도마 방법(hybridoma method)(Kohler & Milstein(1976) European J. Immunology 6:511-519 참조) 또는 파지 항체 라이브러리(Clackson et al., Nature, 352:624-628, 1991; Marks et al, J. Mol . Biol ., 222:58, 1-597, 1991) 기술을 이용하여 제조할 수 있다.

하이브리도마 방법은 LCN2 단백질 항원을 주사한 마우스와 같은 면역학적으로 적합한 숙주동물의 세포를 이용하고, 다른 하나는 암 또는 골수종 세포주를 이용한다. 이러한 두 종류의 세포들을 폴리에틸렌글라이콜과 같은 본 발명이 속하는 기술분야에 널리 공지된 방법으로 융합시킨 후 항체생산 세포를 표준적인 조직 배양방법으로 증식시킨다. 한계 희석법(limited dilution technique)에 의한 서브클로닝에 의해 균일한 세포 집단을 얻은 후 LCN2 단백질에 대해 특이적인 항체를 생산할 수 있는 하이브리도마를 표준 기술에 따라 시험관 내 또는 생체 내에서 대량 배양한다.

파지 항체 라이브러리 방법은 LCN2 단백질에 대한 항체 유전자를 획득하여 이를 파지(phage)의 표면에 융합 단백질 형태로 발현하여 항체 라이브러리를 시험관 내에서 제작하고, 이 라이브러리로부터 LCN2 단백질과 결합하는 모노클론 항체를 분리, 제작하는 방법이다.

상기 방법에 의하여 제조된 항체는 전기영동, 투석, 이온교환 크로마토그래피, 친화 크로마토그래피 등의 방법으로 분리할 수 있다.

본 발명의 키트에 포함되는 항체는 2개의 전체 길이 경쇄(light chain) 및 2개의 전체 길이 중쇄(heavy chain)를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적 단편이란 적어도 항원 결합기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab')₂, F(ab)₂ 및 Fv 등이 있다.

LCN2 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 본 발명의 진단 키트는 바람직하게는 ELISA용 진단키트로서, 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있으며, 그 밖에도 항원-항체 복합체를 검출할 수 있는 시약, 예컨대 표지된 2차 항체, 발색단, 항체와 컨쥬게이트된 효소 및 그 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다.

본 발명의 LCN2 발암/전이 유전자 및 단백질은 사람의 간암을 비롯한 각종 조직으로부터 분리되거나, 공지의 DNA 또는 펩타이드 합성 방법에 따라 합성할 수 있다. 또한 이렇게 제조된 유전자를 본 발명이 속하는 기술 분야에 공지된 동물 발현용 벡터에 삽입할 수 있으며, LCN2 유전자가 삽입된 동물 발현용 벡터를 적절한 동물 세포주에 도입시킬 수 있다.

본 발명은 또한 유전자 치료에 효과적인 LCN2 유전자에 대한 안티-센스 유전 자와 siRNA(small interfering RNA)를 제공한다. 본 발명에서, "안티센스 유전자(anti-sense gene)"는 서열번호 1의 발암 유전자 또는 그의 일부로부터 전사되는 mRNA의 일부 또는 전부와 상보적인 서열을 가지는 폴리뉴클레오티드로서, 상기 mRNA와 결합하여 리보솜에 의한 해독과정을 저해할 수 있는 서열을 갖는 DNA 서열을 환자의 체내로 도입함으로써 상기 발암 유전자의 발현으로 인한 암을 치료할 수 있다. 또한 상기 LCN2 유전자의 siRNA는 21~30 뉴클레오티드의 RNA 조각으로 세포 내에 도입되면 다이써(Dicer)에 의해 인지되고 이는 세포 내에 존재하는 상기 유전자의 mRNA를 분해하게 되어 유전자의 발현을 저해하게 된다. 본 발명의 조성물을 이용한 siRNA 유전자 치료에서 통상적인 방법으로 환자에게 투여되어 발암/전이 유전자의 발현을 저해한다. 예를 들어 문헌 (Filleur 등, Cancer Res ., 63(14): 3919-22, 2003)에 따라 특별한 생체 내 도입 방법 없이 적은 양의 정맥 주사 방법(low-volume intravenous injection)에 의해 siRNA로 유전자 발현이 조절 가능하다는 것을 보여주고 있다. 또한 siRNA 생체 내 흡수량과 안정성을 증가시키기 위한 시도로써, 문헌 (Chien 등, Cancer Gene Ther., 12(3): 321-8, 2005)의 방법에 따라 siRNA의 정맥을 통한 주입에서 복합체를 만들어 사용하는 방법도 제시되고 있다. 이 방법은 정맥 주사의 효율이 기존의 다른 리포솜 복합체보다 약 7배 정도 높게 나타났으며, 부작용도 적은 것이 확인되었다(Chien 등, Cancer Gene Ther., 12(3): 321-8, 2005).

따라서, 본 발명은 LCN2 유전자의 안티센스 유전자 및 siRNA 중 1종 이상과 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 간암의 예방, 치료용, 전이억제용 약제학 적 조성물을 제공한다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 LCN2 유전자의 안티센스 유전자 및 siRNA 중 1종 이상의 유효성분 이외에 약제학적으로 허용 가능한 담체 즉 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 및 이들 성분 중 1종 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액 등 다른 통상의 첨가제를 가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있으며, 표적 기관에 특이적으로 작용할 수 있도록 표적 기관 특이적 항체 또는 기타 리간드를 상기 담체와 결합시켜 사용할 수 있다. 더 나아가 당해 기술분야의 적정한 방법으로 또는 레밍턴의 문헌(Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 투여방법은 특별히 제한되는 것은 아니나, 목적하는 방법에 따라 정맥내, 피하, 복강 내 또는 국소적용과 같이 비경구 투여하거나 경구 투여할 수 있다. 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 일일 투여량은 화합물의 경우 약 0.1 내지 100㎎/㎏이고 바람직하게는 0.5 내지 10㎎/㎏이며, 하루에 1회 내지 수회 나누어 투여하는 것이 바람직하다.

본 발명의 조성물을 이용한 siRNA와 안티센스 유전자 치료에서, 본 발명의 안티센스 유전자를 포함하는 통상적인 방법으로 환자에게 투여되어 발암 유전자의 발현을 저해한다. 예를 들면, 문헌(J.S. Kim et al., J. Controlled Release, 53, 175-182(1998))의 방법에 따라 안티센스 올리고데옥시뉴클레오타이드(ODN)를 폴리-L-라이신 유도체와 정전기적 인력에 의하여 혼합시키고, 이 혼합체를 환자에게 정맥 투여한다.

본 발명의 항암 조성물은 활성성분으로서 본 발명의 안티센스 유전자를 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 경우에 따라 다른 첨가제와 함께 포함한다. 본 발명의 약학 조성물은 제형에 특별한 제한은 없으나 주사제로 제제화하는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명의 LCN2 발암 유전자의 프로모터를 이용한 리포터 시스템을 가진 지속적으로 증식 가능한 세포주를 확립할 수 있으며, 이러한 세포주는 저분자 물질의 탐색을 통한 항암제 탐색에 유용하게 이용될 수 있다.

이하, 다음 실시예에 의거하여 본 발명의 구성을 더욱 상세히 설명하겠는바, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 조직 시료 처리

cDNA 마이크로어레이 실험을 위하여, 강남성모병원과 전북대학교 병원으로부터 40명의 간암환자로부터 원발성 간암 조직(primary HCC tissues)을 얻었다. 정상 간 조직은 강남 성모병원으로부터 간암환자가 아닌 환자로부터 얻었다. 조직시료는 액체질소에서 동결시켰다. RNeasy midi kit(Qiagen, Hilden, Germany)을 이용하여 총 RNA를 분리하였다. 또한 조직은 10% 포르말린으로 고정, 파라핀 블록을 만들었다.

< 실시예 2> 간암조직에서의 LCN2 의 mRNA 발현 조사

LCN2과 간암의 발전(progression)과의 연관성을 밝히기 위해 cDNA microarrayer를 이용하여 간암환자의 암조직과 인접 조직을 대상으로 LCN2의 유전자 발현을 조사, 비교하였다. LCN2가 간암조직에서 중요한 발현 차이를 보였다(도 1). 특별히 LCN2는 간암환자의 80%이상(35/40)이 정상 간 조직에 비해 RNA 발현 증가를 나타내었다(q-value = 0.0002846).

40쌍의 암(tumor)-비암(nontumor) HCC 시료 쌍을 선택하여 RT-PCR를 실시하여 RNA 수준을 조사하였다. RT-PCR은 다음과 같이 실시하였다.

즉, Primer3 소프트웨어(http://frodo.wi.mit.edu/)를 이용하여 LCN2에 상응하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 디자인하였다. 정방향 프라이머는 5'-CCG GAA TTC CAT GCC CCT AGG TCT CCT G-3', 역방향 프라이머는 5'-CGG GGT ACC TCA GCC GTC GAT ACA CTG G-3'와 같다. RT-PCR 분석에 대한 주형(template)으로써 total RNA 5㎍에 상응하는 1차쇄(first strand) cDNA 혼합물을 사용하였다. 유전자의 발현수준은 β-액틴 발현에 대해 표준화(normalization)하였다. DNA 칩 분석결과와 마찬가지로 간암조직에서의 LCN2 발현은 정상조직과 비교하여 발현이 크게 증가함을 볼 수 있었다(도 2). 위의 실험으로부터 대부분의 간암에서(28/40, 70%) LCN2의 mRNA 발현이 상향 조절됨을 확인할 수 있었다.

< 실시예 3> LCN2 재조합 단백질 및 항체 생산

1. LCN2 재조합 단백질

NdeI/BamHI으로 이중 절단(double digestion)하여 pET11a에 LCN2 유전자를 서브클로닝하였다. 발현세포로는 BL21(DE3)를 사용하였다. LB 배지(Luria-Bertani medium)(앰피실린 100㎍/㎖ 포함)에 BL21-pET-11a(+)LCN2의 싱글 콜로니를 시딩한 다음, 37℃ 쉐이킹 배양기(shaking incubator)에서 하룻밤 동안 배양하였다. IPTG를 처리하여 LCN2 단백질이 잘 발현되는 것을 확인한 후, 단백질의 용해도를 확인하였다. IPTG(isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside)에 의해 발현된 LCN2 단백질이 불용성 형태(insoluble form)을 형성하는 것을 확인하였다. LCN2 단백질을 대량생산한 후 Ni-NTA(nitrilotriacetic acid) 수지 컬럼을 이용하여 LCN2 단백질을 분리하였다.

2. 항체생산

2-1. 토끼 폴리클론 항체

정제된 항원과 CFA(Colonization Factor Antigen)를 섞어 토끼에 피하 면역주사하였다. 면역형광항체(Immunofluorescent antibody)와 항원을 사용하여 혈액을 검사하고 ELISA로 역가를 측정하였다. 이후 전채혈하여 혈청을 분리하고 Protein A column(upstate)을 이용하여 정제하였다.

2-2. 마우스 모노클론 항체

정제된 항원과 CFA를 섞어 Balb/c 마우스에 혈관주사 및 피하주사로 면역하였다. 이후 면역형광항체와 항원으로 부스팅(boosting)하고, ELISA로 역가를 측정하였다. 이후 마우스 비장을 분리하여 SP2/0-Ag14 세포와 기존에 알려진 방법(Somat Cell Mol Genet,1979, Schneiderman S. et al.)대로 폴리에틸렌글리콜을 이용하여 융합하였다. 이후, HAT(hypoxanthine-aminopterin-thymidine) 선택을 이용하여 스크리닝하고, LCN2를 항원으로 사용하는 ELISA를 통하여 하이브리도마(hybridoma)를 선별하였다. 선별된 하이브리도마는 Balb/c 마우스의 복강에 주사하여 복수를 얻고, 모노클론 항체를 정제하였다. 항체의 정제는 Protein A column(upstate)을 이용하였다.

3. 특이성 검증

293T 세포주에서 녹색형광단백질(Green fluorescence protein; "GFP"와 혼용함) 표지 또는 myc 표지발현벡터를 이용하여 융합 단백질 재조합 유전자를 일시적으로 발현시켜 웨스턴 블랏으로 그 특이성을 관찰하였다(도 3). LCN2는 녹색형광단백질이나 myc 융합 단백질에 일치하는 밴드를 보여 주었다. 면역형광염색에 의해서도 핵과 세포질에 위치하는 녹색형광단백질의 형광에 일치하게 LCN2 면역염색성을 관찰할 수 있었다(도 4).

< 실시예 4 > 간암 세포주에서의 LCN2 발현

간암 세포주에서 단백질 발현을 비교하기 위하여 폴리클론 항체를 이용하여 웨스턴 블랏 분석을 실시하였다(도 5). 이를 위하여 간암 세포주를 배양한 후 세포를 용출용액(1% Triton X-100, 150mM NaCl, 100mM KCl, 20mM HEPES(pH 7.9), 10mM EDTA, 1mM sodium orthovanadate, 10㎍/㎖ aprotinin, 10㎍/㎖ leupeptin, 1M PMSF)에 용출시킨 후 세포 용균액을 전기영동하고 나이트로셀룰로스 막(Bio-Rad, CA, USA)에 블랏팅하였다. 면역블랏팅 멤브레인을 5% non fat dry milk, 0.1% Tween 20이 포함된 PBS(Phosphate buffered saline)용액에 넣고 실온에서 2시간 동안 블로킹한 후 LCN2에 대한 항체 (1:5,000)로 2시간 동안 반응시킨 후, 5,000배 희석된 서양고추냉이 퍼옥시다아제(Horseradish Peroxidase; "HRP"과 혼용함)가 접합된 2차 항체로 1시간 동안 반응시켰다. 마지막으로 enhanced chemiluminescence assay kit (Pierce, IL, USA)으로 전개하여 분석하였다. 웨스턴 블랏을 실시한 HLK2, HKK2, HLK6에서 LCN2 발현을 보였으며, 특히 HLK2는 전이성을 보이는 간암 세포주이다.

< 실시예 5> 면역조직화학 시험에 의한 간조직에서의 LCN2 발현 시험

정상조직, 간암조직, 전이성 간암조직을 대상으로 면역조직화학 연구를 실시하여 LCN2 단백질 발현을 조사하였다(도 6). 파라핀을 제거하고 항원 복구(antigenic retrieval processes)를 거쳐, 슬라이드는 LCN2에 대한 항체 (1:200)로 표지(labeling)하였으며 표지된 LCN2는 아비딘-바이오틴 복합체(avidin-biotin complex; ABC)법에 의해 분석하였다. 이때 발색시약으로 DAB(3, 3'- Diaminobenzidine)을 사용하였다. 항체에 대한 음성 대조군으로 식염수를 사용하였으며 조직영역에서 세포의 10% 이상이 균일하게 염색되면 양성으로 간주하였다.

분석을 실시한 결과 LCN2는 간암조직의 변연부에서 발현이 증가되었으며, 간실질과 임파구 침윤 변역부에서 발현이 증가하였다. 또한 전이성 간암조직에서 그 발현량이 현저하게 증가하였다. 또한 에드먼슨의 단계 II, III에서 그 발현량이 증가하였다.

< 실시예 6> ELISA 에 의한 환자 혈청 중 LCN2 단백질 농도 측정

모노클론 항체와 폴리클론 항체를 이용하여 ELISA 방법을 확립하였다. 토끼에서 얻은 폴리클론 항체를 1㎍/㎖로 코팅한 후 1% BSAT(1% bovine serum albumin and 0.1% Triton-X)로 블로킹하였다. LCN2 표준액 및 희석된 환자혈청을 가한 후 LCN2에 대한 단일클론 항체를 가하여 2시간 동안 반응시킨 후 세척하였다. 적당한 농도로 희석된 2차 항체 접합 서양고추냉이를 가하고 1시간 후 세척하고 TMB(tetramethylbenzidine)로 현상하였다. 표준액의 검정곡선에 따라 ELISA 방법에 의하여 환자 혈청 중 LCN2 단백질 농도를 측정하였다. 정상인(16), 간경변 환자(16), 간암 환자(16)의 혈청을 100배씩 희석한 후 LCN2의 농도를 측정한 결과 간암의 경우 정상치보다 통계적으로 상승된 LCN2 농도를 보였다(도 7, 표 4). 이 결과는 혈청 내 LCN2 농도의 상승이 간암 발생과 연관이 있음을 뜻한다.

질환명	개체수	평균 (ng/㎖)	표준편차 (ng/㎖)
정상(Normal)	16	59.6	43.6
간경변(LC)	16	19.3	41.1
간암(HCC)	16	130.8	226.2

결론적으로 간암에서 LCN2 발현이 증가하며 간암에서 LCN2 수준은 진단, 예후 인자로서 가능성과 효용성이 크다.

< 실시예 7> 샌드위치형 ELISA 키트

다음의 구성요소들을 사용하여 LCN2 농도 측정용 키트를 제조하였다:

A. 고상형 항체: 항체가 흡착된 마이크로타이터 플레이트로서, LCN2에 대한 폴리클론 항체 100㎕를 마이크로타이터 플레이트에 가하고 4℃에서 하룻밤 동안 방치한 후 고상체 표면의 공간에 알부민을 흡착시켜 제조하였다.

B. 탐지용 항체: LCN2에 대한 모노클론 항체

C. 효소결합 항체: 서양고추냉이 퍼옥시다아제가 결합된 2차 항체 용액(anti-mouse-IgG-퍼옥시다제)

D. 혈청 희석용액

E. 기질액

F. 세척액: 0.05% 트윈이 포함된 인산염 완충액

G. 표준용액: LCN2 표준액

상기 키트를 이용하여 간암 환자 중 LCN2의 혈청희석 반응을 다음과 같이 검사하였다. A의 고상형 항체, 즉 마이크로타이터 플레이트에 각 혈청 시료를 혈청 희석용액(D)을 사용, 적절히 희석하여 웰당 100㎕씩 가한 후 B, C, E의 구성요소들을 사용하여 실시예 6과 같은 샌드위치형 측정방법으로 LCN2 농도를 검사하였다.

도 1은 cDNA 마이크로어레이에 의한 간암조직(T)과 비간암 조직(NT)에서 LCN2 mRNA 발현 프로파일을 나타낸 것이다.

도 2는 RT-PCR에 의한 간암조직(T)과 비간암 조직(NT)에서 LCN2 mRNA 발현을 비교분석한 것이다.

도 3은 웨스턴 블랏 분석에 의한 LCN2 항체 특이성 검증: Myc 또는 녹색형광단백질(GFP) 표지 LCN2 발현 벡터의 도입에 의한 발현 293T 세포의 단백발현 분석 결과이다.

도 4는 면역형광염색에 의한 LCN2 항체 특이성 검증: 녹색형광단백질 표지 LCN2 발현 벡터의 도입에 의한 Hep 3B 및 Chang 간세포에서 단백질 발현 분석결과이다.

도 5는 웨스턴 블랏 분석에 의한 간암 세포주에서 LCN2 발현 분석결과이다. HLK2는 전이성을 보이는 간암 세포주이다.

도 6은 조직면역화학염색에 의한 간암조직에서의 LCN2 발현 분석 결과이다.

A: 간암조직의 변연부의 LCN2 발현 증가

B: 간암조직의 내부 간실질 및 임파구 침윤 변연부에서의 LCN2 발현 증가

C: 전이성 간암조직 내의 간암세포의 LCN2 발현 증가

D: 정상 간 조직에서의 LCN2 발현

E: 에드먼슨(Edmondson) 2등급 간세포암에서 LCN2 발현 증가

F: 에드먼슨(Edmondson) 3등급 간세포암에서 LCN2발현 증가

G: 임파선에서 전이성 간세포암조직의 LCN2 발현 증가

도 7은 ELISA 방법에 의한 임상시료 결과

<110> Korea Reasearch Institute of Bioscience and Biotechnology Industrial coorporation foundation chonbuk national university <120> Lipocalin 2 as a tumor associated marker of hepatocellular carcinoma and a hepatocellular carcinoma diagnostic kit using thereof <130> KRIBB-EYSONG-LCN2 <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 597 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(594) <400> 1 atg ccc cta ggt ctc ctg tgg ctg ggc cta gcc ctg ttg ggg gct ctg 48 Met Pro Leu Gly Leu Leu Trp Leu Gly Leu Ala Leu Leu Gly Ala Leu 1 5 10 15 cat gcc cag gcc cag gac tcc acc tca gac ctg atc cca gcc cca cct 96 His Ala Gln Ala Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro 20 25 30 ctg agc aag gtc cct ctg cag cag aac ttc cag gac aac caa ttc cag 144 Leu Ser Lys Val Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe Gln 35 40 45 ggg aag tgg tat gtg gta ggc ctg gca ggg aat gca att ctc aga gaa 192 Gly Lys Trp Tyr Val Val Gly Leu Ala Gly Asn Ala Ile Leu Arg Glu 50 55 60 gac aaa gac ccg caa aag atg tat gcc acc atc tat gag ctg aaa gaa 240 Asp Lys Asp Pro Gln Lys Met Tyr Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu 65 70 75 80 gac aag agc tac aat gtc acc tcc gtc ctg ttt agg aaa aag aag tgt 288 Asp Lys Ser Tyr Asn Val Thr Ser Val Leu Phe Arg Lys Lys Lys Cys 85 90 95 gac tac tgg atc agg act ttt gtt cca ggt tgc cag ccc ggc gag ttc 336 Asp Tyr Trp Ile Arg Thr Phe Val Pro Gly Cys Gln Pro Gly Glu Phe 100 105 110 acg ctg ggc aac att aag agt tac cct gga tta acg agt tac ctc gtc 384 Thr Leu Gly Asn Ile Lys Ser Tyr Pro Gly Leu Thr Ser Tyr Leu Val 115 120 125 cga gtg gtg agc acc aac tac aac cag cat gct atg gtg ttc ttc aag 432 Arg Val Val Ser Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys 130 135 140 aaa gtt tct caa aac agg gag tac ttc aag atc acc ctc tac ggg aga 480 Lys Val Ser Gln Asn Arg Glu Tyr Phe Lys Ile Thr Leu Tyr Gly Arg 145 150 155 160 acc aag gag ctg act tcg gaa cta aag gag aac ttc atc cgc ttc tcc 528 Thr Lys Glu Leu Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser 165 170 175 aaa tct ctg ggc ctc cct gaa aac cac atc gtc ttc cct gtc cca atc 576 Lys Ser Leu Gly Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile 180 185 190 gac cag tgt atc gac ggc tga 597 Asp Gln Cys Ile Asp Gly 195 <210> 2 <211> 198 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Pro Leu Gly Leu Leu Trp Leu Gly Leu Ala Leu Leu Gly Ala Leu 1 5 10 15 His Ala Gln Ala Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro 20 25 30 Leu Ser Lys Val Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe Gln 35 40 45 Gly Lys Trp Tyr Val Val Gly Leu Ala Gly Asn Ala Ile Leu Arg Glu 50 55 60 Asp Lys Asp Pro Gln Lys Met Tyr Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu 65 70 75 80 Asp Lys Ser Tyr Asn Val Thr Ser Val Leu Phe Arg Lys Lys Lys Cys 85 90 95 Asp Tyr Trp Ile Arg Thr Phe Val Pro Gly Cys Gln Pro Gly Glu Phe 100 105 110 Thr Leu Gly Asn Ile Lys Ser Tyr Pro Gly Leu Thr Ser Tyr Leu Val 115 120 125 Arg Val Val Ser Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys 130 135 140 Lys Val Ser Gln Asn Arg Glu Tyr Phe Lys Ile Thr Leu Tyr Gly Arg 145 150 155 160 Thr Lys Glu Leu Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser 165 170 175 Lys Ser Leu Gly Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile 180 185 190 Asp Gln Cys Ile Asp Gly 195 <210> 3 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 ccggaattcc atgcccctag gtctcctg 28 <210> 4 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 cggggtacct cagccgtcga tacactgg 28

Claims (18)

1. LCN2 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 간암 진단 키트.
2. 제1항에 있어서,

   정상 대조군과 비교하여 LCN2 단백질 양의 증가로 간암을 진단하는 것을 특징으로 하는 간암 진단 키트.
3. 제1항에 있어서,

   상기 키트는 ELISA(Enzyme linked immunosorbent assay)용 키트인 것을 특징으로 하는 간암 진단 키트.
4. LCN2 mRNA를 정량적으로 검출하는 간암 진단 키트.
5. 제1항 또는 제4항에 있어서,

   상기 간암은 에드먼슨의 암 등급(Edmondson's tumor grade) Ⅲ 또는 Ⅳ인 것을 특징으로 하는 간암 진단 키트.
6. 제4항에 있어서,

   mRNA 정량 검출 방법은 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR, 실시간 RT-PCR, RNase 보호 분석법(RNase protection assay), 노던블랏팅(Nothern blotting) 및 DNA 칩 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 간암 진단 키트.
7. 제4항에 있어서,

   LCN2 mRNA에 특이적으로 결합하는 서열번호 제3번 또는 서열번호 제4번의 뉴클레오타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 간암 진단 키트.
8. 제4항에 있어서,

   LCN2 mRNA에 대응하는 cDNA 제조용 프라이머, 역전사 효소, Taq 폴리머레이즈, PCR용 프라이머, dNTP를 포함하는 것을 특징으로 하는 간암 진단 키트.
9. LCN2 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 간 조직, 간 세포, 뇨, 혈액, 혈청 및 혈장 중에서 선택되는 생물학적 시료와 접촉시키는 단계를 포함하는 간암 마커 검출 방법.
10. 제9항에 있어서,

    a) 분석할 생물학적 시료를 제공하는 단계;

    b) 상기 시료와 LCN2 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 접촉시키는 단계;

    c) 항원-항체 복합체를 정량 검출하는 단계; 및

    d) 상기 c) 단계 검출 결과를 정상 대조군과 비교하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 간암 마커 검출 방법.
11. 서열번호 1의 LCN2 발암 유전자 또는 그의 단편을 포함하는 형질전환용 벡터.
12. 제11항의 벡터에 의해 형질전환된 동물 세포주.
13. 제12항에 있어서, 상기 형질전환된 동물 세포주는 HLK2-LCN2, HKK2-LCN2 또는 HLK6-L인 것을 특징으로 하는 동물 세포주.
14. 서열번호 1의 LCN2 발암 유전자 또는 그의 단편으로부터 전사되는 mRNA의 서열의 전부 또는 일부와 상보적인 서열을 지니고, 상기 mRNA에 결합하여 상기 발암 유전자 또는 단편의 발현을 억제하는 안티-센스 유전자.
15. 서열번호 1의 LCN2 발암 유전자 또는 그의 단편으로부터 전사되는 mRNA의 서열의 전부 또는 일부와 상보적인 서열을 지니고, 다이써(Dicer) 단백질에 의해 인지되어 상기 LCN2 발암 유전자의 발현을 저해하는 siRNA 서열.
16. LCN2 단백질에 시험 화합물을 결합시키고, 시험 화합물이 상기 LCN2 단백질 의 작용을 촉진 또는 억제하는지를 확인하는 것을 특징으로 하는 간암 억제제의 스크리닝 방법.
17. 서열번호 1의 염기 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 간암 치료 또는 전이 억제용 타겟 유전자 LCN2.
18. 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 간암 치료 또는 전이 억제용 타겟 LCN2 단백질.

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