JP2010523107A - 胃癌遺伝子ZNF312b、該遺伝子から翻訳されるタンパク質、ならびに診断キット及び該タンパク質を使用する抗癌剤スクリーニング方法 - Google Patents
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Abstract
Description
1)個体の試料から前記マーカー遺伝子の発現レベルを測定する工程;及び
2)工程1)のマーカー遺伝子の発現レベルが正常対照群より高い個体を選別する工程を含む胃癌診断方法を提供する。
1)実験群として胃由来細胞を被検組成物または被検化合物で処理する工程;
2)工程1)の実験群細胞と処理しない対照群細胞の前記マーカー遺伝子の発現レベルを測定して比較する工程;及び
3)前記実験群の発現レベルを対照群と比較して有意に増加または減少させる被検組成物または被検化合物を選別する工程とを含む、胃癌誘発物質または抑制物質をスクリーニングする方法を提供する。
1)配列番号9で表わされる塩基配列で構成されるZNF312bプロモーター及びその断片に作動可能に連結されたレポーター遺伝子を含む遺伝子コンストラクトを製造する工程;
2)前記工程1)の遺伝子コンストラクトを発現ベクターに導入した後、動物細胞に形質転換して形質転換体を製造する工程;
3)前記工程2)の形質転換体を被検組成物または被検化合物で処理した実験群と処理しない対照群を製造する工程;
4)前記工程3)の実験群及び対照群のレポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程;及び
5)前記工程4)の実験群の発現レベルを対照群と比較して有意に増加または減少する被検組成物または被検化合物を選別する工程とを含む、胃癌誘発物質または抑制物質をスクリーニングする方法を提供する。
1)配列番号15で表わされる塩基配列で構成されるK−rasプロモーター及びその断片に作動可能に連結されたレポーター遺伝子を含む遺伝子コンストラクトを製造する工程;
2)前記工程1)の遺伝子コンストラクトを発現ベクターに導入し、配列番号2で表わされるアミノ酸配列で構成されるZNF312bタンパク質またはその断片を発現する動物細胞に形質転換することにより形質転換体を製造する工程;
3)前記工程2)の形質転換体を被検組成物または被検化合物で処理した実験群と処理しない対照群を製造する工程;
4)前記工程3)の実験群及び対照群のレポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程;及び
5)前記工程4)の実験群の発現レベルを対照群と比較して有意に増加または減少する被検組成物または被検化合物を選別する工程を含む、胃癌誘発物質または抑制物質をスクリーニングする方法を提供する。
1)実験群として配列番号15で表わされる塩基配列で構成されるK−rasプロモーターまたはその断片を含むオリゴヌクレオチドと配列番号2で表わされるアミノ酸配列を含むZNF312bタンパク質またはその断片とを、被検組成物または被検化合物と一緒に処理する工程;
2)工程1)の実験群と処理しない対照群で、K−rasプロモーターまたはその断片に対するZNF312bタンパク質またはその断片の結合レベルを測定して比較する工程;及び
3)前記実験群の結合レベルを対照群と比較して有意に増加または減少する被検組成物または被検化合物を選別する工程とを含む、胃癌誘発物質または抑制物質をスクリーニングする方法を提供する。
1)分析する生物学的試料とZNF312bタンパク質、またはその断片に特異的に結合する抗体を接触させる工程;
2)前記工程1)の接触で形成された抗原抗体複合体を定量検出する工程;及び
3)前記工程2)の検出レベルを対照群と比較して選別する工程を含む。
1)個体の試料からZNF312bマーカー遺伝子及びその断片の発現レベルを測定する工程;及び
2)工程1)のマーカー遺伝子の発現レベルが正常対照群より高い個体を選別する工程を含む胃癌診断方法を提供する。
1)実験群として胃由来細胞に被検組成物または被検化合物を処理する工程;
2)工程1)の実験群細胞と処理しない対照群細胞の配列番号1で表わされる塩基配列またはその断片を含む胃癌診断用ZNF312bマーカー遺伝子の発現レベルを測定して比較する工程;及び
3)前記実験群の発現レベルを対照群と比較して、有意に増加する被検組成物または被検化合物を選別する工程を含む、胃癌誘発物質スクリーニング方法を提供する。
1)実験群として胃由来細胞に被検組成物または被検化合物を処理する工程;
2)工程1)の実験群細胞と処理しない対照群細胞の配列番号1で表わされる塩基配列またはその断片を含む胃癌診断用ZNF312bマーカー遺伝子の発現レベルを測定して比較する工程;及び
3)前記実験群の発現レベルを対照群と比較して、有意に減少させる被検組成物または被検化合物を選別する工程を含む、胃癌抑制物質スクリーニング方法を提供する。
1)配列番号9で表わされる塩基配列で構成されるZNF312bプロモーター又はその断片に作動可能に連結されたレポーター遺伝子を含む遺伝子コンストラクトを製造する工程;
2)前記工程1)の遺伝子コンストラクトを発現ベクターに導入した後、動物細胞に形質転換して形質転換体を製造する工程;
3)前記工程2)の形質転換体に被検組成物または被検化合物を処理した実験群と処理しない対照群を製造する工程;
4)前記工程3)の実験群及び対照群のレポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程;及び
5)前記工程4)の実験群の発現レベルを対照群と比較して有意に増加する被検組成物または被検化合物を選別する工程を含む、胃癌誘発物質スクリーニング方法を提供する。
1)配列番号9で表わされる塩基配列で構成されるZNF312bプロモーター及びその断片に作動可能に連結されたレポーター遺伝子を含む遺伝子コンストラクトを製造する工程;
2)前記工程1)の遺伝子コンストラクトを発現ベクターに導入した後、動物細胞に形質転換して形質転換体を製造する工程;
3)前記工程2)の形質転換体に被検組成物または被検化合物を処理した実験群と処理しない対照群を製造する工程;
4)前記工程3)の実験群及び対照群のレポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程;及び
5)前記工程4)の実験群の発現レベルを対照群と比較して有意に減少させる被検組成物または被検化合物を選別する工程とを含む、胃癌抑制物質スクリーニング方法を提供する。
1)配列番号15で表わされる塩基配列で構成されるK−rasプロモーター及びその断片に作動可能に連結されたレポーター遺伝子を含む遺伝子コンストラクトを製造する工程;
2)前記工程1)の遺伝子コンストラクトを発現ベクターに導入し、配列番号2で表わされるアミノ酸配列で構成されるZNF312bタンパク質またはその断片を発現する動物細胞に形質転換することにより形質転換体を製造する工程;
3)前記工程2)の形質転換体に被検組成物または被検化合物を処理した実験群と処理しない対照群を製造する工程;
4)前記工程3)の実験群及び対照群のレポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程;及び
5)前記工程4)の実験群の発現レベルを対照群と比較して有意に増加させる被検組成物または被検化合物を選別する工程とを含む、胃癌誘発物質スクリーニング方法を提供する。
前記方法において、工程2)のZNF312bの断片は、配列番号2で表わされるアミノ酸配列の中で配列番号19で表わされるアミノ酸配列であるカルボキシ末端部位を含むことが好ましいが、これに限定されない。
1)配列番号15で表わされる塩基配列で構成されるK−rasプロモーター及びその断片に作動可能に連結されたレポーター遺伝子を含む遺伝子コンストラクトを製造する工程;
2)前記工程1)の遺伝子コンストラクトを発現ベクターに導入し、配列番号2で表わされるアミノ酸配列で構成されるZNF312bタンパク質またはその断片を発現する動物細胞に形質転換することにより形質転換体を製造する工程;
3)前記工程2)の形質転換体に被検組成物または被検化合物を処理した実験群と処理しない対照群を製造する工程;
4)前記工程3)の実験群及び対照群のレポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程;及び
5)前記工程4)の実験群の発現レベルを対照群と比較して有意に減少させる被検組成物または被検化合物を選別する工程とを含む、胃癌抑制物質スクリーニング方法を提供する。
1)配列番号15で表わされる塩基配列で構成されるK−rasプロモーターまたはその断片を含むオリゴヌクレオチドと配列番号2で表わされるアミノ酸配列を含むZNF312bタンパク質またはその断片とを、被検組成物または被検化合物と一緒に処理する工程;
2)工程1)の実験群と処理しない対照群で、K−rasプロモーターまたはその断片に対するZNF312bタンパク質またはその断片の結合レベルを測定して比較する工程;及び
3)前記実験群の結合レベルを対照群と比較して有意に増加させる被検組成物または被検化合物を選別する工程とを含む、胃癌誘発物質スクリーニング方法を提供する。
1)配列番号15で表わされる塩基配列で構成されるK−rasプロモーターまたはその断片を含むオリゴヌクレオチドと配列番号2で表わされるアミノ酸配列を含むZNF312bタンパク質またはその断片とを、被検組成物または被検化合物と一緒に処理する工程;
2)工程1)の実験群と処理しない対照群で、K−rasプロモーターまたはその断片に対するZNF312bタンパク質またはその断片の結合レベルを測定して比較する工程;及び
3)前記実験群の結合レベルを対照群と比較して有意に減少させる被検組成物または被検化合物を選別する工程とを含む、胃癌抑制物質スクリーニング方法を提供する。
但し、下記の実施例及び実験例は、本発明を例示するだけのものであって、本発明の内容が、下記の実施例及び実験例に限定されるものではない。
<1−1>腫瘍細胞培養
本発明者らは、1982年韓国胃癌患者から樹立されたもので、韓国細胞株銀行から分譲受けたSNU−638及びSNU−668細胞株を培養した。前記細胞株は、10%牛胎児血清、100mg/mlストレプトマイシン、そして100IU/mlアンピシリンが含まれたRPMI−1640(Hyclone,米国)培地で培養した。
本発明者らは、商業的に販売されているシステムであるRNeasy Total RNAキット(Qiagen Inc.,ドイツ)を使用して胃癌患者から得た組織から総RNAを抽出した。DNA汚染源を除去するためにDNase(Promega,米国)を使用し、フェノールクロロホルム法によって総RNAのみを精製した。
本発明者らは、前記実施例<1−2>で得た総RNA 1mgにオリゴdTをプライマーとして逆転写反応を行なった。続いて、生成されたcDNAを1/20に希釈した後、希釈されたcDNA 2μlを鋳型にして、ZNF312bのプライマー[正方向:5’−CGAAGTGTGTGGAAAGGT−3’(配列番号3)、逆方向:5’−AATACACGCGGGCTACAAAC−3’(配列番号4)]でPCRを行なった。前記PCR反応の条件は、94℃で45秒、58℃で45秒、及び72℃で45秒反応させながら、それを35回繰り返した後、最終伸長時間として7分反応させた。増幅された産物は、1.2%アガロースゲルに電気泳動した後、EtBrで染色して紫外線を照射してイメージ分析装置で確認した。その結果を映像分析装置で分析して定量化した。対照群にB2Mを使用して試料間の差異を補正した。図2は、胃癌患者等の組織からZNF312bの発現レベルを確認した結果を示したものであり、それを図1に定量化して示した。図1から分かるように、ZNF312bは胃癌組織で過量に過剰発現されることが確認された(図1及び図2)。
<3−1>ZNF312b発現ベクターの製造
本発明者らは、ZNF312b遺伝子をpcDNAベクターにクローニングした。まず、総cDNAを鋳型にして、KpnIとBamHI制限酵素認識部位を含有したZNF312bプライマーを使用してPCRを行なった。生成されたPCR産物を精製した後、KpnIとBamHI制限酵素で切断後、pcDNAベクターに挿入してpcDNA−ZNF312b発現ベクターを製造した。
本発明者らは、ZNF312b shRNAを発現するベクターを製造するために、pSilencer4.1−CMVneo(Ambion,米国)ベクターにZNF312b shRNA配列を含有したsi−ZNF312b−1オリゴマー[5’−GCA CTC TCT GCA TCT CAA C−3’(配列番号5)]を挿入して、pSilent−ZNF312bベクターを製造した。
<4−1>ZNF312b過剰発現胃癌細胞株の樹立
本発明者らは、前記実施例<3−1>で製造したpcDNA−ZNF312bベクターを胃癌細胞株であるSNU−638及びSNU−668に形質導入し、ZNF312b過剰発現細胞株であるSNU638−ZNF312bとSNU668−ZNF312bをそれぞれ樹立した。
本発明者らは、前記実施例<3−2>で製造されたベクターpSilent−ZNF312bを、SNU−668に形質導入させてZNF312b抑制細胞株であるSNU668−shZNF312bを樹立した。
本発明者らは、前記<実施例4>で製造されたベクターのタンパク質の発現レベルを評価するために、ウエスタンブロット実験を行なった。
<6−1>ZNF312b遺伝子の発現抑制による細胞増殖
本発明者らは、ZNF312b遺伝子の発現抑制による胃癌細胞株の細胞増殖能を調査するために、ZNF312bの塩基配列(配列番号1)中で19個のヌクレオチドからなる三つの種類のsiRNA[si−ZNF312b−1:5’−GCA CTC TCT GCA TCT CAA C−3’(配列番号6)、si−ZNF312b−2:5’−GTG TGT GGA AAG GTC TTT A−3’(配列番号7)、及びsi−ZNF312b−3’:5’−GCA GTT CAA GTG CAA TAT C−3’(配列番号8)]を作製し、それによって、ZNF312b遺伝子の発現阻害能を測定した。その結果、図3のように、si−ZNF312b−1の阻害能が最も高いことが調査され、それをZNF312b遺伝子の一時的な発現阻害実験に使用した(図3)。
本発明者らは、前記<実施例4>で樹立された細胞株であるSNU638−ZNF312b及びSNU668−ZNF312bを使用して、前記遺伝子の過剰発現を通じた胃癌細胞株の細胞増殖能を調査した。細胞増殖実験は、CCK−8試薬を使用して行ない、細胞(5×103個)を96ウェルプレートに入れて、24時間培養した後、24時間間隔で細胞増殖実験を行なった。図7はSNU638−ZNF312bを、図8はSNU668−ZNF312bを使用して細胞増殖実験を行なった結果を示したものであり、グラフ中の図は、HA−ZNF312bの過剰発現レベルをウエスタンブロットで示したもので、前記遺伝子の過剰発現が細胞増殖を増加させたことが分かった(図7及び図8)。
本発明者らは、細胞周期を測定してZNF312b遺伝子の細胞増殖関連性を調査した。細胞周期実験は、PI染色法を使用して行なった。PIは、核を染色する方法で、各細胞を24時間培養した後、70%エチルアルコールで4℃、12時間以上固定させた後、PIで染色してFACS分析機を使用して測定した。その結果、図9〜図11に見られるように、対照群と比較して前記ZNF312b遺伝子の発現が阻害された時、G1期が増加されて、G2+M時期が減少して細胞増殖が減少したが、前記ZNF312b遺伝子を過剰発現した場合は、G1期が減少して、G2+M時期が増加することによって細胞増殖率が増加することが分かった。細胞周期を使用した細胞増殖実験も、ZNF312b遺伝子の抑制または過剰発現によって細胞増殖の抑制または活性が確認され、本遺伝子が細胞増殖と関連があることが分かった(図9、図10及び図11)。
本発明者らは、ZNF312b遺伝子が発癌遺伝子として機能をするかどうかを確認するために、コロニー形成実験を行なった。まず、45℃の2倍濃度のRPMI1640培地と1.2%アガロース溶液を同量ずつ混ぜて0.6%の1×培地を作って、6ウェルプレートに入れて1時間固めた後、5000個の細胞を0.5ml培地に希釈して同量の0.6%アガロースと混ぜて0.6%のアガロース平板上に入れた。常温で1時間固めた後、1×培地を入れて、37℃の培養器で培養しながらコロニーの形成を観察した。形成されたコロニーは、100倍率の顕微鏡で観察して計数して図式化した。図12及び図13は、ZNF312b胃癌抑制細胞株であるSNU668−shZNF312bを使用して前記遺伝子を阻害した後、コロニー形成を観察したものであり、図14及び図15は、前記遺伝子を過剰発現胃癌細胞株であるSNU638−ZNF312bとSNU668−ZNF312bを使用してコロニー形成実験を行なったものである。その結果、図12〜図15に見られるように、ZNF312b遺伝子発現を阻害する胃癌抑制細胞株であるSNU668−shZNF312bを使用した場合、対照群と比較してコロニー形成が阻害され、ZNF312b遺伝子を過剰発現する胃癌細胞株であるSNU638−ZNF312b及びSNU668−ZNF312bを使用した場合、対照群と比較してコロニー形成が増加したことが分かった(図12、図13、図14及び図15)。
本発明者らは、ZNF312b遺伝子が発癌遺伝子として機能するかどうかを確認するために、ヌードマウスを使用した腫瘍形成実験を行なった。前記実施例<4−1>で樹立されたSNU668−ZNF312b細胞株、及び対照群であるSNU668−Neo細胞株をヌードマウスにそれぞれ移植して腫瘍形成を観察した。実験群は、各3匹のヌードマウスに各細胞株5×105の細胞を接種した。接種4週後、それぞれの腫瘍の大きさを測定して数値化して比較した。腫瘍の大きさ(mm3)は、広さ×高さ/2の公式を使用して数値化した。その結果、図16〜図17にみられるように、ZNF312b遺伝子の過剰発現細胞株であるSNU668−ZNF312bを移植したヌードマウスの腫瘍大きさが顕著に大きくなっていることを確認することができた(図16及び図17)。
<10−1>ZNF312b断片過剰発現ベクターの製造
本発明者らは、pcDNA−ZNF312bベクターを鋳型にして、図7aのような断片をPCR方法で増幅した後、pcDNAベクターにクローニングした。まず、pcDNA−ZNF312bを鋳型にして、KpnIとBamHI制限酵素認識部位を含有したZNF312bプライマーを使用してPCRを行なった。生成された各PCR産物を精製した後、KpnIとBamHI制限酵素で切断後、pcDNAベクターに挿入してpcDNA−ZNF312bN1(N1で表記)、pcDNA−ZNF312bN2(N2)、pcDNA−ZNF312bC1(C1)及びpcDNA−ZNF312bC2(C2)発現ベクターを製造した(図18)。
本発明者らは、前記実施例<10−1>で製造したベクターpcDNA−ZNF312b−N1と−C1を胃癌細胞株であるSNU−638に形質導入し、全長ZNF312b及び断片ZNF312b過剰発現細胞株であるSNU638−ZNF312b(SNU638−FL)、SNU638−ZNF312bN1(SNU638−N1)及びSNU638−ZNF312bC1(SNU638−C1)をそれぞれ樹立した。
<11−1>核分画実験
本発明者らは、ZNF312bの細胞内位置と核に移動するのに必要なタンパク質部分を同定するために、核分画法を使用して細胞質と核を分離した。分離した試料を使用してウエスタンブロット法を行い、ZNF312bが核内に存在し、カルボキシ末端(配列番号20)を通じて核に移動するということを確認した。
本発明者らは、ZNF312b及びその断片を発現させた細胞をカバースリップガラス上において、24時間後に前記細胞を4%パラホルムアルデヒドで20分間処理して固定させた。前記固定された細胞等は、PBSを使用して3回洗浄した後、1%TritonX−100で10分間処理した後、1時間1%BSAで常温でブロッキングし、4℃でモノクローナル抗−HAで12時間反応させた。PBSで3回洗浄した後、Alexa−568が付いている抗マウス2次抗体を1時間処理して、PBSで3回洗浄した。その後、30分間DPAIで反応させて、PBSで3回洗浄した。前記過程を経た細胞は、スライドの上に蓄積して、蛍光顕微鏡(olympus,日本)を使用して分析した。その結果、図20に見られるように、核分画実験と同様にカルボキシ末端を含有したZNF312bだけが、核に存在し、アミノ末端のみを含有した断片ZNF312bタンパク質は、細胞質に存在することが分かった(図20)。
<12−1>ZNF312b断片過剰発現胃癌細胞株の細胞増殖
本発明者らは、前記実施例<10−2>で樹立された細胞株であるSNU638−FL及びその断片ZNF312bを発現する細胞株SNU638−N1及びSNU638−C1を使用して、胃癌細胞株の細胞増殖能を調査した。細胞増殖実験は、前記実施例<6−1>のようなCCK−8試薬を使用して行ない、全長ZNF312b及びカルボキシ末端(配列番号20)含有ZNF312b断片を一時的に形質導入させて短期間発現させた後、細胞増殖実験を行なった。その結果、図21にみられるように、一過性の過剰発現は、胃癌細胞株の細胞増殖を増加させることが分かり、図22にみられるように前記遺伝子を恒常的に発現する細胞株を使用して細胞増殖実験を行なった結果、恒常的過剰発現も胃癌細胞株の細胞増殖を増加させることが分かった(図21及び図22)。
本発明者らは、全長ZNF312b及びカルボキシ末端含有ZNF312b断片を恒常的に過剰発現する胃癌細胞株SNU638−FL、SNU638−N1及びSNU638−C1を使用して、前記<実施例8>と同じ方法でコロニー形成実験を行なった。その結果、図8cにみられるように全長ZNF312b及びカルボキシ末端含有ZNF312断片を過剰発現させた時、コロニー形成が増加した。したがって、ZNF312bの胃癌腫瘍形成能は、ZNF312bタンパク質のカルボキシ末端部分に存在することが分かった(図23)。
<13−1>ZNF312b抑制による細胞増殖シグナル伝達
本発明者らは、ZNF312b遺伝子の発現抑制による胃癌細胞株の細胞増殖と係わるシグナル伝達系を調査するために、si−ZNF312b−1を胃癌細胞株に形質導入させてZNF312bの発現を減少させた後、前記<実施例5>の方法でウエスタンブロットを実施した。ここで、使用された抗体は、phospho−MEK1/2、MEK1/2、phospho−ERK1/2、ERK1/2、K−ras、及びチューブリンで、これらを通じてZNF312bのタンパク質がK−rasの発現を調節し、調節されたK−rasが細胞増殖シグナル伝達であるERK経路に作用するかどうかを確認した。その結果、図24に見られるように、ZNF312bの抑制は、K−rasの発現減少を誘導した。これは、ERKシグナル伝達であるMEK1/2及びERK1/2のリン酸化減少、すなわちERKシグナル伝達の不活性化につながることを観察することができた(図24)。
本発明者らは、ZNF312b遺伝子及びその断片の過剰発現による胃癌細胞株の細胞増殖と係わるシグナル伝達を調査するために、SNU−638細胞に各断片を形質導入させた後、それら細胞を溶解させて、前記実施例<13−1>と同じ方法でシグナル伝達系を確認した。その結果、図25にみられるように、図24の結果とは反対に、全長ZNF312b及びカルボキシ末端を含有した断片ZNF312bの過剰発現は、K−rasの発現活性を誘導してそれを通じてERK経路が活性化することを確認した。したがって、ZNF312bは、細胞増殖シグナル伝達を調節し、前記調節は、ZNF312bのカルボキシ末端が核心的役割を果たして、それを通じて胃癌発生に関与していることが分かった(図25)。
<14−1>ZNF312bプロモーター部位を含むpGL3b−ZNF312bベクターの製造
本発明者らは、ZNF312b遺伝子のプロモーター部位をルシフェラーゼレポーター遺伝子をコードすることができるベクターに導入するため、ZNF312bのプロモーター(配列番号9)及びその断片(配列番号10〜配列番号14)をNheIとBglII制限酵素認識部位を含有したプライマーを使用してPCRで増幅させた後、pGL3 basicベクター(Promega,米国)に挿入した。まず、SNU638 cDNAを鋳型にして増幅させたPCR産物を精製した後、NheIとBglII制限酵素で切断し、pGL3 basicベクターに挿入して、ZNF312bのプロモーター部位を有する6種類のpGL3b−ZNF312bベクターを製造した(図26)。
本発明者らは、ZNF312bのプロモーター(配列番号9)及びその断片(配列番号10〜配列番号14)中、活性を有する部位を解明するために、前記実施例<14−1>で製造されたpGL3−ZNF312bベクターを胃癌細胞株であるSNU−638に形質導入させて、ZNF312bプロモーター活性を一時的に有する細胞株を樹立した。まず、胃癌細胞株SNU−638の細胞(2×105個)にリポフェクタミン2000(Invitrogen,米国)6μlを使用して、それぞれのpGL3−ZNF312bベクター2μgを形質導入した後、48時間培養した。
本発明者らは、前記実施例<14−2>で樹立した細胞株でのZNF312bのプロモーターの転写活性能を測定した。前記転写活性能の測定は、ルシフェラーゼレポーターの活性を評価した。測定には、ルシフェラーゼ分析システムキット(Promega,米国)を使用した。
<16−1>ZNF312bプロモーター断片を含有したpGL4−ZNF312bベクターの製造
本発明者らは、プロモーター断片の転写活性能を恒常的に有する細胞株を樹立するため、ZNF312bのプロモーター中の+1bp〜−850bp部位(配列番号12)をNheIとHindIII制限酵素認識部位を含有したプライマーを使用して、pGL4.14ベクター(Promega,米国)に挿入して、pGL4.14−ZNF312b−0.85ベクターを製造した(図28)。
本発明者らは、ZNF312bプロモーター中の+1bp〜−850bp部位(配列番号12)の転写活性能を恒常的に有する細胞株を樹立するために、前記実施例<16−1>で作製したpGL4.14−ZNF312b−0.85をSNU−638細胞株にリポフェクタミン2000(Invitrogen,米国)を使用して形質導入した。48時間培養後、前記遺伝子が発現される細胞株のみを選択するために、選別マーカーであるハイグロマイシンを100μg/mlになるように培養液に入れた。また、単一クローンを有した細胞株を得るために、ハイグロマイシン培地を3日間隔で交換しながらコロニーを選別した。前記樹立された細胞株は、薬効がある化合物を選別するのに使用した。
本発明者らは、前記実施例<16−2>で樹立した細胞株でのZNF312bプロモーター中の+1bp〜−850bp部位(配列番号12)の転写活性能を、前記<実施例10>と同一な方法で測定した。ZNF312bプロモーター転写活性能を恒常的に有するpGL4.14−ZNF312b−0.85含有細胞株を使用して実験した結果、図29に見られるように、対照群と比較してルシフェラーゼ活性が約15倍増加することが確認された(図29)。
本発明者らは、前記実施例<16−2>で樹立したpGL4.14−ZNF312b−0.85細胞株を96ウェルプレートに密度が1×104個になるようにして24時間培養し、細胞が単層に均一に分布するようにした。100μl培地に化合物の最終濃度が10μMになるように処理した。ここで、化合物が溶解しているDMSOは、最終濃度0.3%になるようにした。24時間をさらに培養した後、25μlの細胞溶解液で細胞を溶解させた。細胞抽出物25μlとルシフェラーゼレポーター基質20μlを混ぜた後、前記<実施例10>と同一な方法でルシフェラーゼレポーター活性を測定して、薬効がある化合物を選別した。化合物を処理しないでDMSOだけ処理した細胞株を対照群にして、それぞれの化合物を処理した時、レポーター活性の阻害程度を示した。ルシフェラーゼレポーターの阻害活性は、下記の方法で計算した:
本発明者らは、ZNF312bの転写活性能を阻害するものとして選別された化合物の細胞毒性を測定するために、CCK−8(Dojindo,日本)試薬で処理した。これは、テトラゾリウム塩を使用する方法で、細胞内に存在する脱水素酵素によって親水性のホルマザンに転換されることを測定して細胞毒性を確認した。まず、96ウェルプレートに前記実施例<16−2>で樹立した細胞株の密度が1.5×104個になるようにして24時間培養し、細胞が単層に均一に分布するようにした。100μl培地に化合物の最終濃度が10μMになるように処理した。ここで、化合物が溶解しているDMSOは、最終濃度0.3%になるようにした。24時間さらに培養した後、CCK−8試薬10μlを処理して細胞毒性を測定した。
<20−1>K−rasプロモーター部位を含有したpGL3b−K−rasベクターの製造
本発明者らは、ZNF312bによるK−ras発現量増加と調節機序を解明するために、K−rasプロモーターレポーターを製造した。図30に見られるように、K−rasのプロモーター部位の断片として、Ras2.0(−2000〜+1bp;配列番号15)、Ras1.0(−1000〜+1bp;配列番号16)、Ras0.65(−650〜+1bp;配列番号17)、及びRas0.5(−500〜+1bp;配列番号18)を作製した(図30)。プロモーターの作動有無を確認するためのレポーターシステムには、ルシフェラーゼ遺伝子を使用した。
本発明者らは、前記実施例<20−1>のK−rasレポーター(Ras2.0)を前記実施例<10−1>のZNF312b(FL)及びその断片(N1、N2、C1及びC2)と共にSNU−638細胞株に形質導入させた後、48時間培養した。
<21−1>ZNF312b及びその断片によるK−rasプロモーター活性測定
本発明者らは、前記実施例<20−2>で樹立した細胞株でのK−rasプロモーターの転写活性能を測定するため、ルシフェラーゼレポーターの活性を分析した。前記ルシフェラーゼ分析は、ルシフェラーゼ分析キット(Promega,米国)を使用して、キットのプロトコルにしたがって行なった。すなわち、前記実施例<20−2>の培養された細胞を溶解(lysis)させて、4℃、15000rpmで10分間遠心分離してタンパク質を分離した後、タンパク質定量で試料間の総タンパク質を補正して、ルミノメーター(Victor 3 microplate)を使用してルシフェラーゼ活性を測定した。ここで、使用された溶解物(lysate)は10μlで、前記溶解物内ルシフェラーゼの基質は、50μlを使用した。
本発明者らは、SNU−638細胞にそれぞれのK−rasレポーター(Ras2.0,Ras1.0,Ras0.65,及びRas0.5)とZNF312b−C1を一緒に形質導入した。48時間経過後、細胞を溶解してルシフェラーゼ分析及びZNF312b−C1の発現量を調査するために、ウエスタンブロットを実施した。それを3回反覆して有意性のある結果を得た。
本発明者らは、ZNF312bによるK−ras活性の作用部位が−650〜−500bp部位であることをより正確に調べるため、TransAM flexi DNA binding assay kit(Active motif,米国)を使用して確認した。
Claims (35)
- 配列番号1で表わされるZNF312b遺伝子またはその断片の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、または前記オリゴヌクレオチドを増幅することができるプライマー対を含む胃癌診断用キット。
- 前記断片が、配列番号1で表わされる塩基配列中にカルボキシ末端部位(配列番号20)を含むことを特徴とする、請求項1に記載の胃癌診断用キット。
- 配列番号2で表わされるZNF312bタンパク質またはその断片に特異的に結合する抗体を含む胃癌診断用キット。
- 正常対照群と比較して、ZNF312bタンパク質またはその断片の量の増加で胃癌を診断することを特徴とする、請求項3に記載の胃癌診断用キット。
- 配列番号1で表わされるZNF312b遺伝子またはその断片の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、またはそれに相補的なオリゴヌクレオチドが組み込まれた胃癌診断用DNAマイクロアレイ。
- 配列番号2で表わされるZNF312bタンパク質またはその断片に特異的に結合する抗体を、胃組織、胃細胞、尿、血液、血清及び血漿からなる群から選択される生物学的試料と接触させる工程を含む胃癌マーカー検出方法。
- 1)個体の試料から配列番号1で表わされるZNF312b遺伝子またはその断片の発現レベルを測定する工程;及び
2)工程1)のマーカー遺伝子の発現レベルが正常対照群より有意に高い個体を選別する工程、を含む胃癌診断方法。 - 工程1)の試料が、胃組織、胃細胞、尿、血液、血清及び血漿からなる群から選択されることを特徴とする、請求項7に記載の胃癌診断方法。
- 1)実験群として胃由来細胞に被検組成物または被検化合物を処理する工程;
2)工程1)の実験群細胞と処理しない対照群細胞の配列番号1で表わされるZNF312b遺伝子またはその断片の発現レベルを測定して比較する工程;及び
3)前記実験群の発現レベルを対照群と比較して有意に増加させる被検組成物または被検化合物を選別する工程、とを含む胃癌誘発物質スクリーニング方法。 - 工程2)の断片が、配列番号1で表わされる塩基配列中にカルボキシ末端部位(配列番号20)を含むことを特徴とする、請求項9に記載の胃癌誘発物質スクリーニング方法。
- 1)実験群として胃由来細胞に被検組成物または被検化合物を処理する工程;
2)工程1)の実験群細胞と処理しない対照群細胞の配列番号1で表わされるZNF312b遺伝子またはその断片の発現レベルを測定して比較する工程;及び
3)前記実験群の発現レベルを対照群と比較して有意に減少させる被検組成物または被検化合物を選別する工程、とを含む胃癌抑制物質スクリーニング方法。 - 工程2)の断片は配列番号1で表わされる塩基配列の中でカルボキシ末端部位(配列番号20)を含むことを特徴とする、請求項9に記載の胃癌抑制物質スクリーニング方法。
- 1)配列番号9で表わされる塩基配列で構成されるZNF312bプロモーター及びその断片に作動可能に連結されたレポーター遺伝子を含む遺伝子コンストラクトを製造する工程;
2)前記工程1)の遺伝子コンストラクトを発現ベクターに導入し、動物細胞に形質転換して形質転換体を製造する工程;
3)前記工程2)の形質転換体を被検組成物または被検化合物で処理した実験群と処理しない対照群を製造する工程;
4)前記工程3)の実験群及び対照群のレポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程;及び
5)前記工程4)の実験群の発現レベルを対照群と比較して有意に増加させる被検組成物または被検化合物を選別する工程、とを含む胃癌誘発物質スクリーニング方法。 - 工程1)の断片が、配列番号9で表わされる塩基配列中において、転写開始点を基準に−850bp〜+1bp部位(配列番号12)を含むことを特徴とする、請求項13に記載の胃癌誘発物質スクリーニング方法。
- 工程1)のレポーター遺伝子が、ルシフェラーゼ遺伝子であることを特徴とする、請求項13に記載の胃癌誘発物質スクリーニング方法。
- 1)配列番号9で表わされる塩基配列で構成されるZNF312bプロモーター及びその断片に作動可能に連結されたレポーター遺伝子を含む遺伝子コンストラクトを製造する工程;
2)前記工程1)の遺伝子コンストラクトを発現ベクターに導入し、動物細胞に形質転換して形質転換体を製造する工程;
3)前記工程2)の形質転換体を被検組成物または被検化合物で処理した実験群と処理しない対照群を製造する工程;
4)前記工程3)の実験群及び対照群のレポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程;及び
5)前記工程4)の実験群の発現レベルを対照群と比較して有意に減少させる被検組成物または被検化合物を選別する工程、とを含む胃癌抑制物質スクリーニング方法。 - 工程1)の断片が、配列番号9で表わされる塩基配列の中で転写開始点を基準に−850bp〜+1bp部位(配列番号12)を含むことを特徴とする、請求項16に記載の胃癌抑制物質スクリーニング方法。
- 工程1)のレポーター遺伝子が、ルシフェラーゼ遺伝子であることを特徴とする、請求項13に記載の胃癌抑制物質スクリーニング方法。
- 1)配列番号15で表わされる塩基配列で構成されるK−rasプロモーター及びその断片に作動可能に連結されたレポーター遺伝子を含む遺伝子コンストラクトを製造する工程;
2)前記工程1)の遺伝子コンストラクトを発現ベクターに導入し、配列番号2で表わされるアミノ酸配列で構成されるZNF312bタンパク質またはその断片を発現する動物細胞に形質転換することにより形質転換体を製造する工程;
3)前記工程2)の形質転換体を被検組成物または被検化合物で処理した実験群と処理しない対照群を製造する工程;
4)前記工程3)の実験群及び対照群のレポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程;及び
5)前記工程4)の実験群の発現レベルを対照群と比較して有意に増加させる被検組成物または被検化合物を選別する工程、とを含む胃癌誘発物質スクリーニング方法。 - 工程1)の断片が、配列番号19で表わされる塩基配列を含むことを特徴とする、請求項19に記載の胃癌誘発物質スクリーニング方法。
- 1)配列番号15で表わされる塩基配列で構成されるK−rasプロモーター及びその断片に作動可能に連結されたレポーター遺伝子を含む遺伝子コンストラクトを製造する工程;
2)前記工程1)の遺伝子コンストラクトを発現ベクターに導入し、配列番号2で表わされるアミノ酸配列で構成されるZNF312bタンパク質またはその断片を発現する動物細胞を形質転換することにより形質転換体を製造する工程;
3)前記工程2)の形質転換体を被検組成物または被検化合物で処理した実験群と処理しない対照群を製造する工程;
4)前記工程3)の実験群及び対照群のレポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程;及び
5)前記工程4)の実験群の発現レベルを対照群と比較して有意に減少させる被検組成物または被検化合物を選別する工程、とを含む胃癌抑制物質スクリーニング方法。 - 工程1)の断片が、配列番号19で表わされる塩基配列を含むことを特徴とする、請求項19に記載の胃癌抑制物質スクリーニング方法。
- 1)配列番号15で表わされる塩基配列で構成されるK−rasプロモーターまたはその断片を含むオリゴヌクレオチドと配列番号2で表わされるアミノ酸配列を含むZNF312bタンパク質またはその断片とを、被検組成物または被検化合物と一緒に処理する工程;
2)工程1)の実験群と処理しない対照群でK−rasプロモーターまたはその断片に対するZNF312bタンパク質またはその断片の結合レベルを測定して比較する工程;及び
3)前記実験群の結合レベルを対照群と比較して有意に増加させる被検組成物または被検化合物を選別する工程、とを含む胃癌誘発物質スクリーニング方法。 - 工程1)のK−rasプロモーターの断片が、配列番号19で表わされる塩基配列を含むことを特徴とする、請求項23に記載の胃癌誘発物質スクリーニング方法。
- 工程1)のZNF312bタンパク質の断片が、配列番号2で表わされるアミノ酸配列の中でカルボキシ末端部分(配列番号20)を含むことを特徴とする、請求項23に記載の胃癌誘発物質スクリーニング方法。
- 1)配列番号15で表わされる塩基配列で構成されるK−rasプロモーターまたはその断片を含むオリゴヌクレオチドと配列番号2で表わされるアミノ酸配列を含むZNF312bタンパク質またはその断片とを、被検組成物または被検化合物と一緒に処理する工程;
2)工程1)の実験群と処理しない対照群で、K−rasプロモーターまたはその断片に対するZNF312bタンパク質またはその断片の結合レベルを測定して比較する工程;及び
3)前記実験群の結合レベルを対照群と比較して有意に減少させる被検組成物または被検化合物を選別する工程、とを含む胃癌抑制物質スクリーニング方法。 - 工程1)のK−rasプロモーターの断片が、配列番号19で表わされる塩基配列を含むことを特徴とする、請求項26に記載の胃癌抑制物質スクリーニング方法。
- 工程1)のZNF312bタンパク質の断片が、配列番号2で表わされるアミノ酸配列の中でカルボキシ末端部分(配列番号20)を含むことを特徴とする、請求項26に記載の胃癌抑制物質スクリーニング方法。
- 配列番号1で表わされるZNF312b遺伝子またはその断片を含むベクターを、ヒトを除いた動物に形質転換することによって胃癌が誘発される胃癌診断及びスクリーニング用動物。
- 配列番号1で表わされるZNF312b遺伝子またはその断片から転写されるmRNAの配列の全部または一部と相補的な配列を有し、前記mRNAに結合して前記ZNF312b遺伝子またはその断片の発現を抑制するアンチセンス遺伝子。
- 配列番号1で表わされるZNF312b遺伝子またはその断片から転写されるmRNAの配列の全部または一部と相補的な配列を有し、ダイサータンパク質によって認識されて前記ZNF312b遺伝子またはその断片の発現を阻害するsiRNA配列。
- 請求項11、請求項16、請求項21または請求項26に記載のいずれか一項の方法でスクリーニングされた胃癌抑制物質を有効成分として含む、胃癌予防及び治療用組成物。
- 請求項32に記載の薬学的に有効な量の組成物を、胃癌にかかった個体に投与する工程を含む胃癌の治療方法。
- 請求項32に記載の薬学的に有効な量の組成物を、個体に投与する工程を含む胃癌の予防方法。
- 胃癌予防及び治療用組成物の製造のための請求項32に記載の胃癌抑制物質の使用。
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