KR20050053530A - 사람 결장암에 관계하는 유전자 및 폴리펩티드 - Google Patents

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Abstract

본 출원은, 대응하는 비암조직과 비교하여, 결장직장암에 있어서 그 발현이 현저히 상승되어 있는 신규 사람 유전자 RNF43, 나아가 위암에 있어서 그 발현이 현저히 상승되어 있는 CXADRL1 및 GCUD1을 제공한다. 이들 유전자 및 이들의 유전자에 의하여 코드되는 폴리펩티드는, 예를 들어, 세포증식성 질환의 진단에 이용할 수 있고, 또 질환에 대한 약제를 개발하기 위한 표적 분자로서 이용할 수 있다.

Description

사람 결장암에 관계하는 유전자 및 폴리펩티드{Genes and polypeptides relating to human colon cancers}
본발명은 생물학의 분야에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 암연구의 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 세포의 증식기구에 관여하는 신규유전자 RNF43, CXADRL1, CUD1 및 이들의 유전자에 의해 코드되는 폴리펩티드에 관한 것이다. 본발명의 유전자 및 폴리펩티드는 예를 들어 세포증식성 질환의 진단과 질환에 대한 약제를 개발하기 위한 표적 분자로서 이용할 수 있다.
위암 및 결장직장암(colorectal cancer)은 세계적으로 암에 의한 사망의 주된 원인이다. 진단 및 치료의 전략에 있어서 최근의 진보에도 불구하고, 진행 암 환자의 예후는 여전히 매우 나쁘다. 종양 억제유전자 및/또는 암 유전자의 변화가 발암에 관여하는 것이 분자적 연구에 의하여 명확하게 되었지만 그 엄밀한 기작은 여전히 불명하다.
cDNA 마이크로어레이 기술에 의하여 정상세포 및 악성세포에서 유전자 발현의 포괄적 프로파일을 얻고, 악성세포와 이에 대응하는 정상세포에서 유전자 발현을 비교하는 것이 가능하게 되었다(Okabe 등, Cancer Res 61: 2129-37 (2001), Kitahara 등, Cancer Res 61: 3544-9 (2001), Lin 등, Oncogene 21: 4120-8 (2002), Hasegawa 등, Cancer Res 62: 7012-7 (2002)). 이 접근은 암세포의 복잡한 성질을 명확하게 하는 것을 가능하게 하여 발암의 기작을 해명하는데 기여하였다. 종양에서 탈조절된(deregulated) 유전자의 동정은 개개의 암에 따라 정확하고 틀림이 없는 진단 및 신규한 치료 표적의 개발로 이어질 가능성이 있다(Bienz 및 CleversCell, 103: 311-20 (2000)). 종양의 기초를 이루는 기작을 전게놈적인 관점에서부터 해명하기 위하여 또한, 진단 및 신규 치료약의 개발을 위한 표적분자를 탐색하기 위하여 본 발명자 등은 23040종의 유전자를 포함하는 cDNA 마이크로 어레이를 이용하여 종양세포의 발현 프로파일을 분석하여 왔다（Okabe 등, Cancer Res 61: 2129-37 (2001)；Kitahara 등, Cancer Res 61: 3544-9 (2001)；Lin 등, Oncogene 21: 4120-8 (2002)；Hasegawa 등, Cancer Res 62: 7012-7 (2002)）.
발암의 기작을 해명하기 위하여 설계된 연구에 의하여 항종양 약의 분자표적의 동정이 촉진되고 있다. 예를 들어, Ras（그 활성화는 posttranslational farnesylation에 의존한다）가 관계하는 증식 시그널 전달 경로를 저해하기 위하여 당초 개발된 farnexyltransferase 저해제（FTI）는 동물 모델에 있어 Ras 의존성 종양의 치료에 유효하다（He 등, Cell 99: 335-45 (1999)). 항암약과 항HER2 모노클로날항체 trastuzumab을 병용한 사람에 대한 임상시험이 전암 유전자(proto-oncogene) 수용체 HER2/neu의 길항을 목적으로 하여 수행되고, 유방암 환자의 임상반응 및 전반적인 생존율의 개선이 달성되고 있다.（Lin 등, Cancer Res 61: 6345-9 (2001). bcr-abl 융합단백질을 선택적으로 불활성화하는 티로신키나제 저해제 STI-571는 bcr-abl 티로신키나제의 구성적 활성화(constitutive activation )가 백혈구의 트랜스포메이션에 결정적인 역할을 하는 만성골수성 백혈병의 치료를 목적으로 하여 개발되었다. 이들 종류의 약제는 특정 유전자 산물의 발암 활성을 억제하는 목적으로 설계되고 있다（Fujita 등, Cancer Res 61: 7722-6 (2001). 이를 위하여 암세포에서 고빈도로 상향조절되는 유전자 산물은 신규 항암약을 개발하기 위한 표적후보로서 역할할 가능성이 있다.
CD8+ 세포 상해성 T 림프구（CTL）는 MHC 클래스 I 분자 상에 제시된 종양관련 항원（tumor-associated antigens , TAA）에서 유래하는 에피토프 펩티드를 인식하고 종양세포를 용해하는 것이 개시되어 있다. TAA의 최초 예로서 MAGE 패밀리가 발견된 이래 다른 많은 TAA가 면역학적 접근을 이용하여 발견되고 있다（Boon, Int J Cancer 54: 177-80 (1993)；Boon 및 van der Bruggen, J Exp Med 183: 725-9 (1996)；van der Bruggen 등, Science 254: 1643-7(1991)；Brichard 등, J Exp Med 178: 489-95 (1993)；Kawakami등, J Exp Med 180: 347-52 (1994). 발견된 TAA의 어떤 것은 현재 면역요법의 표적으로서 임상개발의 단계에 있다. 현재까지 발견된 TAA에는 MAGE（van der Bruggen등, Science 254: 1643-7 (1991)）, gp100（Kawakami 등, J Exp Med 180: 347-52 (1994)）, SART（Shichijo 등, J Exp Med 187: 277-88 (1998)）및 NY-ESO-1（Chen 등, Proc Natl Acad Sci USA 94: 1914-8 (1997)）가 포함된다. 한편, 종양세포에서 특이적으로 과잉발현되는 것이 나타난 유전자 산물은 세포성 면역반응을 유도하는 표적으로서 인식되는 것으로 나타나고 있다. 이러한 유전자 산물에는 p53（Umano 등, Brit J Cancer 84: 1052-7 (2001)）, HER2/neu（Tanaka 등, Brit J Cancer 84: 94-9(2001), CEA（Nukaya 등, Int J Cancer 80: 92-7 (1999)）등이 포함된다.
TAA에 관여하는 기초연구 및 임상연구의 현저한 진보에도 불구하고 (Rosenbeg 등, Nature Med 4: 321-7 (1998)；Mukherji 등, Proc Natl Acad Sci USA 92: 8078-82 (1995)；Hu 등, Cancer Res 56: 2479-83 (1996)), 결장직장암을 포함하는 선암의 치료를 위한 후보가 되는 TAA의 수는 상당히 한정되어 있다. 암세포에서 대량으로 발현되면서 동시에 그 발현이 암세포에 한정되는 TAA는 면역치료의 표적으로서 유망한 후보가 된다고 생각된다. 추가적으로, 강력하면서도 특이적인 항종양 면역반응을 유발하는 새로운 TAA의 동정은 다양한 종류의 암에서 펩티드 백신 접종의 임상사용을 촉진한다고 생각된다（Boon 및 can der Bruggen, J Exp Med 183: 725-9 (1996)；van der Bruggen 등, Science 254: 1643-7 (1991)；Brichard 등, J Exp Med 178: 489-95 (1993)；Kawakami 등, J Exp Med 180: 347-52 (1994)；Shichijo 등, J Exp Med 187: 277-88 (1998)；Chen 등, Proc Natl Acad Sci USA 94: 1914-8 (1997)；Harris, J Natl Cancer Inst 88: 1442-5 (1996)；Butterfield등, Cancer Res 59: 3134-42 (1999)；Vissers 등, Cancer Res 59: 5554-9 (1999)；van der Burg 등, J Immunol 156: 3308-14 (1996)；Tanaka 등, Cancer Res 57: 4465-8 (1997)；Fujie 등, Int J Cancer 80: 169-72 (1999)；Kikuchi 등, Int J Cancer 81: 459-66 (1999)；Oiso 등, Int J Cancer 81: 387-94 (1999)).　
어떤 건강한 도너 유래의 말초혈 단핵세포（PBMC）가 펩티드 자극을 받으면펩티드에 반응하여 현저한 레벨의 IFN-γ를 생산하지만 51Cr 방출 에세이에서 HLA-A24 또는 HLA-A0201 제한적인 양상으로 종양세포에 대하여 세포상해성 (세포독성, cytotoxicity)을 미치는 일은 거의 없다고 반복 보고되고 있다（Kawano 등, Cance Res 60: 3550-8 (2000)；Nishizaka 등, Cancer Res 60: 4830-7 (2000)；Tamura 등, Jpn J Cancer Res 92: 762-7 (2001).
그러나 HLA-A24 및 HLA-A0201는 어느 쪽도 일본인에서 많은 HLA 대립유전자이고 백인에서도 마찬가지이다（Date 등, Tissue Antigens 47: 93-101 (1996)；Kondo 등, J Immunol 155: 4307-12 (1995)；Kubo 등, J Immunol 152: 3913-24 (1994)；Imanishi 등, Proceeding of the eleventh International Hictocompatibility Workshop and Conference Oxford University Press, Oxford, 1065 (1992)；Williams 등, Tissue Antigens 49: 129 (1997). 이 때문에 이들의 HLA에 따라 제시되는 암 항원 펩티드는 일본인 및 백인의 암 치료에 특히 유용할 가능성이 있다. 나아가, 인비트로에서의 저친화성 CTL의 유도는 통상 펩티드를 고농도에서 사용하여 항원 제시 세포（APC）의 표면에 이들의 CTL을 효과적으로 활성화한다고 생각되는 특이적인 펩티드/MHC복합체를 높은 레벨로 발생시키는 것에 의하여 일어난다고 알려져 있다(Alexander-Miller 등, Proc Natl Acad Sci USA 93: 4102-7 (1996)).
발명의 요약
본 발명의 목적은 위암세포 또는 결장직장암세포의 증식기구에 관여하는 신규한 단백질, 이들 단백질을 코드하는 유전자, 나아가 이들을 생산하여 위암 또는 결장직장암의 진단 및 치료에 이용하기 위한 방법을 제공하는 것이다.
위암 및 결장직장암의 발증기작을 해명하기 위하여 또한,이들 종양의 치료를 위한 신규 진단 마커 및/또는 약제표적을 동정하기 위하여 본 발명자 등은 23040종의 유전자를 포함하는 게놈 전체의 cDNA 마이크로어레이를 이용하여 위암 및 결장직장암의 발증에서 유전자의 발현 프로파일을 분석하였다. 약리학적 관점에서 발암 시그널을 억제하는 편이 종양억제 효과의 활성화를 행하는 것보다도 현실적으로 용이하다. 이 때문에 본 발명자 등은 위암 및 결장직장암의 발증시에 상향조절(up-regulated)되는 유전자를 탐색하였다.
그 결과, 위암에서 고빈도로 상향조절되는 전사물 중에서 신규 사람 유전자 CXADRL1（coxsackie and adenovirus receptor like 1）및 GCUD1（up-regulated in gastric cancer）가 각각 염색체 밴드 3q13 및 7p14 상에 동정되었다. CXADRL1 또는 GCUD1의 유전자 도입은 세포의 증식을 촉진하였다. 나아가 특이적인 안티센스 S-올리고뉴클레오티드 또는 저분자 간섭 RNA(small interfering RNA)의 트랜스펙션에 의한CXADRL1 또는 GCUD1의 발현 저하는 위암세포의 증식을 저해하였다. DNA 및/또는 RNA 합성 저해제, 대사억제물질 및 DNA 인터칼레이터라고 하는 많은 항암약은 암세포 만이 아니라 정상으로 증식하는 세포에 대해서도 유해하다. 그러나 CXADRL1의 발현을 억제하는 약제는 이 유전자의 통상의 발현이 정소 및 난소에 국한되기 때문에 다른 장기에는 유해한 영향을 미치지 않는다고 생각되며 이 때문에 암 치료에 대단히 중요한 가능성이 있다.
나아가 결장직장암에서 고빈도로 상향조절되는 전사물 중에서 염색체 밴드17pter-p13.1로 지정된 유전자 RNF43（Ring finger protein 43）가 동정되었다. 효모2-하이브리드 스크리닝 에세이에 의하여 RNF43 단백질이 NOTCH2 또는 STRIN와 회합(associate)하는 것이 나타났다.
NOTCH2는 진화상 보존된 세포간 시그널 전달 기구의 구성 요소인 대형 막관통 수용체 단백질이다. NOTCH2는 Notch 시그널 전달 경로의 단백질 인자로서, 신장에서 사구체 형성 및 심장과 눈의 혈관구조의 발달에 관여하는 것으로 보고되고 있다(McCright 등, Development 128: 491-502 (2001)). 3 종류의 Delta/Serrate/ Lag-2(DSL) 단백질, Delta1, Jaggaed1 및 Jaggaed2은 NOTCH2에 대한 기능성 리간드인 것이 보고되고 있다（Shimizu 등, Mol Cell Biol 20: 6913-22 (2000)).
Notch 시그널 전달 경로에 있어서 리간드 결합에 의해 유도된 시그널은 이 수용체의 단백질 분해 및 NOTCH 단백질의 세포내 도메인의 핵내 이행을 수반하는 과정에 의하여 세포내로 전달된다（Artavanis-Tsakonas 등, Annu Rev Cell Biol 7: 427-52 (1999)；Weinmaster, Curr Opin Genet Dev 10: 363-9 (2000)의 총설을 참조할 것).
나아가, RNF43에 대응하는 특이적 안티센스 S-올리고뉴클레오티드 또는 저분자 간섭 RNA의 트랜스펙션에 의한 RNF43의 발현저하는 결장직장암세포의 증식을 저해하였다. 기술한 대로, 많은 항암약은 암세포만이 아니라 정상적으로 증식하고 있는 세포에 대해서도 유해하다. 그러나 RNF43의 발현을 억제하는 약제도 이 유전자의 통상의 발현이 태아, 보다 구체적으로는 태아 간 및 태아 신장에 국한되기 때문에 다른 장기에는 유해한 영향을 미치지 않는다고 생각되며 이 때문에 암 치료에 대단히 중요한 가능성이 있다.
따라서, 본 발명은 암 진단 마커의 후보임과 동시에 진단을 위한 새로운 전략 및 유효한 항암약을 개발하기 위한 유망한 표적 후보이기도 한 단리된 신규 유전자 CXADRL1, GCUD1, 및 RNF43를 제공한다. 나아가 본 발명은 이들의 유전자에 의해 코드되는 폴리펩티드 외에 그 생산 및 용도도 제공한다. 보다 구체적으로 기술하면 본 발명은 이하를 제공한다.
본 출원은 신규 사람 폴리펩티드 CXADRL1, GCUD1 및 RNF43 또는 세포증식을 촉진하고 위암 및 직장결장암 등의 세포 증식성 질환에서 상향조절된 이들의 기능적 동등물을 제공한다.
　하나의 바람직한 태양에서 CXADRL1 폴리펩티드는 CXADR（coxsackie and adenovirus receptor）와의 동일성이 약 37％인 추정 431 아미노산의 단백질을 포함한다. CXADRL1는 서열번호：1의 ORF(open reading frame)에 의하여 코드되고 코돈 29~124 및 158~232에 2개의 면역 글로불린 도메인을 포함하고, 코돈 246~268에 막관통 도메인을 포함한다. CXADRL1 폴리펩티드는 바람직하게는 서열번호：2에 나타낸 아미노산 서열을 포함한다. 본 출원은 또한, CXADRL1 폴리뉴클레오티드 서열의 적어도 일부에 의하여 또는 서열번호：1에 나타낸 서열에 대하여 적어도 30％,보다 바람직하게는 적어도 40％ 상보적인 폴리뉴클레오티드 서열에 의하여 코드되는 단리된 단백질도 제공한다.
한편 하나의 바람직한 태양에서 GCUD1 폴리펩티드는 서열번호：3의 ORF(open reading frame)에 의하여 코드되는 추정 414 아미노산의 단백질을 포함한다. GCUD1 폴리펩티드는 바람직하게는 서열번호：4에 나타낸 아미노산 서열을 포함한다. 본 출원은 또한, GCUD1 폴리뉴클레오티드 서열의 적어도 일부에 의하여 또는 서열번호：3에 나타낸 서열에 대하여 적어도 15％, 보다 바람직하게는 적어도 25％ 상보적인 폴리뉴클레오티드 서열에 의하여 코드되는 단리된 단백질도 제공한다。
나아가 하나의 바람직한 태양에서 RNF43 폴리펩티드는 서열번호：5의 ORF에 의하여 코드되는 추정 783 아미노산의 단백질을 포함한다. RNF43 폴리펩티드는 바람직하게는 서열번호：6에 나타낸 아미노산 서열을 포함하고 코돈 272 ~312에 링 핑거(ring finger)모티프를 포함한다. RNF43 폴리펩티드는 링핑거 단백질 상동체인 DKFZp566H073.1（GenBank accession number：T08729）에 대하여 38％의 상동성을 나타내었다. 본 출원은 또한, RNF43 폴리뉴클레오티드 서열의 적어도 일부에 의하여 또는 서열번호：5에 나타낸 서열에 대하여 적어도 30％, 보다 바람직하게는 적어도 40％ 상보적인 폴리뉴클레오티드 서열에 의하여 코드되는 단리된 단백질도 제공한다.　
본발명은 또한, 대응하는 비암점막(非癌粘膜, non-cancerous mucosae)과 비교하여 대부분의 위암에서 그 발현이 현저하게 상승하고 있는 신규 사람 유전자 CXADRL1 및 GCUD1을 제공한다. 위암 이외에 CXADRL1 및 GCUD1는 결장직장암 및 간암에서도 고발현 하였다. 단리된 CXADRL1 유전자는 서열번호：1에 기재된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 구체적으로는 CXADRL1 cDNA는 1296 뉴클레오티드의 ORF을 포함하는 3423 뉴클레오티드를 포함한다（서열번호：1). 본 발명은 추가로 서열번호：1에 나타낸 폴리뉴클레오티드 서열과 혼성화하고 CXADRL1 단백질 또는 그 기능적 동등물을 코드하는 범위에서 그것에 대하여 적어도 30％, 보다 바람직하게는 적어도 40％ 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 이러한 폴리뉴클레오티드의 예는 서열번호：1의 축퇴물(degenerates) 및 대립유전자 변이체이다. 한편 단리된 GCUD1 유전자는 서열번호：3에 기재된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 구체적으로는 GCUD1 cDNA는 1245 뉴클레오티드의 ORF를 포함하는 4987 뉴클레오티드를 포함한다（서열번호：3).
본 발명은 또한, 서열번호：3에 나타낸 폴리뉴클레오티드 서열과 혼성화하고 GCUD1 단백질 또는 그 기능적 동등물을 코드하는 범위에서 그에 대하여 적어도15％ 보다 바람직하게는 적어도 25％ 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 이러한 폴리뉴클레오티드의 예는 서열번호：3의 축퇴물(degenerates) 및 대립유전자 변이체이다.
추가적으로 본 발명은 대응하는 비암점막과 비교하여 대부분의 결장직장암에서 그 발현이 현저하게 상승하고 있는 신규 사람 유전자 RNF43을 제공한다 . 결장직장암 이외에 RNF43는 폐암, 위암 및 간암에서도 고발현 하였다. 단리된 RNF43 유전자는 서열번호:5에 기재된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 구체적으로는RNF43 cDNA는 2352 뉴클레오티드의 ORF를 포함하는 5345 뉴클레오티드를 포함한다(서열번호:5). 본 발명은 또한, 서열번호：5에 나타낸 폴리뉴클레오티드 서열과 혼성화하고 RNF3 단백질 또는 그 기능적 동등물을 코드하는 범위에서 그에 대하여 적어도 30％, 보다 바람직하게는 적어도 40％ 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함한다 . 이러한 폴리뉴클레오티드의 예는 서열번호：5의 축퇴물(degenerates) 및 대립유전자 변이체이다.
본 명세서에서 사용되는 단리된 유전자(isolated gene)라 함은, 그 구조가 어떤 천연의 폴리뉴클레오티드의 구조와 동일하지 않고 별개의 유전자 3개를 상회하는 범위의 천연의 게놈 폴리뉴클레오티드의 어떠한 단편의 구조와도 동일하지 않은 폴리뉴클레오티드이다. 그 때문에 이 용어에는 예를 들어（a）자연에서 생물의 게놈 중에 존재하고 천연의 게놈 DNA 분자의 부분 서열을 가지는 DNA（b）결과로서 생기는 분자가 어느 천연의 벡터 또는 게놈 DNA와도 동일하지 않은 양상으로 벡터 중 또는 원핵생물 또는 진핵생물의 게놈 DNA중에 삽입된 폴리뉴클레오티드（c）cDNA, 게놈 단편, PCR에 의해 생성된 단편 또는 제한단편 등의 독립된 분자 및（d）하이브리드 유전자의 부분인 재조합 뉴클레오티드 서열 즉, 융합 폴리펩티드를 코드하는 유전자가 포함된다.
따라서, 1개의 국면에서 본 발명은 본 명세서에 기재된 폴리펩티드 또는 그 단편을 코드하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 단리된 폴리뉴클레오티드는 서열번호:1, 3 또는 5에 기재된 뉴클레오티드 서열과 적어도 60% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것이 바람직하다. 단리된 핵산분자는 서열번호：1, 3 또는 5에 나타낸 뉴클레오티드 서열과 적어도 65％, 70％, 75％, 80％, 85％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％ 또는 그 이상 동일한 것이 보다 바람직하다. 참조서열, 예를 들어 서열번호：1, 3 또는 5보다도 길이가 길거나 동등한 단리된 폴리뉴클레오티드의 경우에는 참조서열의 전체 길이와 비교하였다. 단리된 폴리뉴클레오티드가 참조서열보다도 짧은, 예를 들어 서열번호：1, 3또는 5 보다도 짧은 경우에는 같은 길이（상동성의 산출에 필요한 루프는 제외하고）의 참조서열의 세그멘트와 비교하였다.
본 발명은 또한, CXADRL1, GCUD1 또는 RNF43 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드 서열을 이용하여 숙주세포의 트랜스펙션 또는 형질전환을 행하는 것 및 그 폴리뉴클레오티드 서열을 발현시킴으로써 단백질을 생산하는 방법도 제공한다. 더불어 본 발명은 CXADRL1, GCUD1 또는 RNF43 단백질을 코드하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터 및 CXADRL1, GCUD1 또는 RNF43 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드를 보유하는 숙주세포도 제공한다. 이러한 벡터 및 숙주세포는 CXADRL1, GCUD1 또는 RNF43 단백질의 생산을 위하여 이용할 수 있다.
CXADRL1, GCUD1 또는 RNF43 단백질을 인식하는 항체도 본 출원에 의하여 제공된다. 일부에는 CXADRL1, GCUD1 또는 RNF43 유전자의 안티센스 폴리뉴클레오티드(예를 들어 안티센스 DNA), 리보자임 및 siRNA 저분자 간섭 RNA도 제공한다.
본 발명은 나아가 표적 생물시료에서 유전자의 발현 레벨을 결정하는 단계, CXADRL1, GCUD1 또는 RNF43 유전자의 발현 레벨을 정상 시료와 비교하는 단계 및 시료의 CXADRL1, GCUD1 또는 RNF43 유전자의 높은 발현 레벨을 암 등의 세포증식성 질환을 가지는 것으로 정의하는 단계를 포함하는 세포증식성 질환의 진단을 위한 방법을 제공한다. CXADRL1 또는 GCUD1의 발현 레벨에 의하여 진단되는 질환은 바람직하게는 위암, 결장직장암 및 간암이며, RNF43의 발현 레벨에 의하여 검출되는 질환에는 결장직장암, 폐암, 위암 및 간암이 있다.
나아가 세포증식성 질환을 치료하기 위한 화합물의 스크리닝 방법도 제공한다. 본 방법은 CXADRL1, GCUD1 또는 RNF43 폴리펩티드를 피험화합물로 접촉시키는 단계 및 CXADRL1, GCUD1 또는 RNF43 폴리펩티드와 결합하는 피험화합물을 선별하는 단계를 포함한다.
본 발명은 또한, 세포증식성 질환을 치료하기 위한 화합물의 스크리닝 방법으로서 CXADRL1, GCUD1 또는 RNF43 폴리펩티드를 피험화합물과 접촉시키는 단계, 및 CXADRL1, GCUD1 또는 RNF43 폴리펩티드의 발현 레벨 또는 생물학적 활성을 억제하는 피험화합물을 선별하는 단계를 포함하는 방법도 제공한다.
또한, 본 발명은 세포증식성 질환을 치료하기 위한 화합물의 스크리닝 방법으로서 CXADRL1와 AIP1를 피험화합물의 존재하에서 접촉시키는 단계 및 CXADRL1와 AIP1와의 결합을 저해하는 피험화합물을 선별하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 세포증식성 질환을 치료하기 위한 화합물의 스크리닝 방법으로서 RNF43와 NOTCH2 또는 STRIN을 피험화합물의 존재하에서 접촉시키는 단계 및 RNF43와 NOTCH2 또는 STRIN과의 결합을 저해하는 피험화합물을 선별하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 암 등의 세포증식성 질환을 치료하기 위한 약학적 조성물을 제공한다. 약학적 조성물은 예를 들어 항암약일 수 있다. 약학적 조성물은 각각 서열번호; 1, 3 또는 5에 제시 및 기재된 CXADRL1, GCUD1 또는 RNF43 폴리뉴클레오티드 서열의 안티센스 S-올리고뉴클레오티드 또는 siRNA의 적어도 일부로서 기재할 수 있다. 적절한 안티센스 S-올리고뉴클레오티드는 서열번호: 23, 25, 27, 29 또는 31의 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 가진다. 서열번호：23 또는 25의 뉴클레오티드 서열을 가지는 것을 포함하는 CXADRL1의 안티센스 S-올리고뉴클레오티드는 위암, 결장직장암, 또는 간암의 치료에 바람직하게 사용될 수 있다. 서열번호：27 또는 29의 뉴클레오티드 서열을 가지는 것을 포함하는 GCUD1의 안티센스 S-올리고뉴클레오티드는 위암, 결장직장암 또는 간암의 치료에 바람직하게 사용할 수 있다. 또한, 서열번호：31의 뉴클레오티드 서열을 가지는 것을 포함하는RNF43의 안티센스 S-올리고뉴클레오티드는 결장직장암, 폐암, 위암 또는 간암의 치료에 바람직하게 사용할 수 있다. 적합한 siRNA는 서열번호：40 및 41 또는 42 및43 또는 62 및 63의 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 가지는 뉴클레오티드의 세트로 구성된다. 서열번호：40 및 41 또는 42 및 43의 뉴클레오티드 서열을 가지는 뉴클레오티드의 세트로 구성되는 CXADRL1의 siRNA는 위암, 결장직장암, 또는 간암의 치료에 바람직하게 이용될 수 있다. 또한, 서열번호：62 및 63의 뉴클레오티드 서열을 가지는 뉴클레오티드의 세트로 구성되는 RNF43의 siRNA는 결장직장암, 폐암, 위암 또는 간암에 대하여 바람직하다. 상기 약학적 조성물은 세포증식성 질환의 치료를 위한 화합물에 관한 본 스크리닝 방법에 의하여 선별된 화합물을 포함하는 것이어도 좋다.
약학적 조성물의 작용 경로는 암세포의 증식을 저해하는 것인 것이 바람직하다. 약학적 조성물은 사람 및 가축을 포함하는 포유동물에 대하여 적용할 수 있다.
본 발명은 나아가 본 발명에 의하여 제공되는 약학적 조성물을 이용하여 세포증식성 질환을 치료하기 위한 방법을 제공한다.
나아가 본 발명은 CXADRL1, GCUD1 또는 RNF43 폴리펩티드를 투여하는 단계를 포함하는 암 치료 또는 예방을 위한 방법을 제공한다. CXADRL1, GCUD1 또는 RNF43폴리펩티드의 투여에 의하여 항 종양면역이 유도된다고 생각된다. 따라서, 본 발명은 CXADRL1, GCUD1 또는 RNF43 폴리펩티드를 투여하는 단계를 포함하는 항종양면역을 유도하기 위한 방법 및 CXADRL1, GCUD1 또는 RNF43 폴리펩티드를 포함하는 암 치료 또는 예방을 위한 약학적 조성물도 제공한다.
본 발명의 상기 개요 및 이하의 상세한 설명은 어느 것도 바람직한 태양으로서 본 발명 또는 본 발명의 기타 대체적인 태양을 제한하지 않는 것으로 이해된다.
도 1은 위암에 있어서 A5928(CXADRL1) 및 C8121(GCUD1)의 발현을 표시한다. 도 1a는, cDNA 마이크로 어레이에 의하여 조사된 14 건의 원발성(primary) 위암에 있어서 A5928의 상대적인 발현비(암/비암)를 나타낸다. 그 발현은, 컷오프(cutoff) 필터(Cy3 시그널 및 Cy5 시그널 모두가 25,000을 상회함)를 통과한 14건의 위암 중에서 14건 전부에 있어서 상방 제어되어 있다(Cy3:Cy5 강도비가 >2.0). 도 1b는, cDNA 마이크로 어레이에 의하여 조사된 12건의 원발성 위암에 있어서 C8121의 상대적인 발현비(암/비암)를 나타낸다. 그 발현은, 컷오프(cutoff) 필터를 통과한 12건의 위암 중에서 10건에 있어서 상방 제어되어 있다(Cy3:Cy5 강도비가 >2.0). 도 1c는, 10건의 위암증례를 이용하여 반정량적 RT-PCR에 의하여 분석한 CXADRL1의 발현을 나타낸다. 도 1d는, 9건의 위암증례를 이용하여 반정량적 RT-PCT에 의하여 분석한 GCUD1의 발현을 나타낸다. CXADRL1 및 GCUD1 모두의 발현분석에 관해서 GAPDH의 발현을 내부대조(internal control)로 이용하였다.
도 2는 다양한 사람 조직에 있어서 CXADRL1의 발현, 및 CXADRL1의 예상되는 단백질 구조 및 단백질 모티프를 표시한다. 도 2a는, 다조직 노던블롯 분석에 의하여 분석한, 다양한 사람 조직에 있어서 CXADRL1의 발현을 나타낸 사진이다. 도 2b는, CXADRL1의 예상되는 단백질 구조를 나타낸다. CXADRL1 cDNA는 1,296 뉴클레오타이드의 ORF를 포함하는 3,423 뉴클레오타이드로 이루어져, 7개의 엑손으로 구성된다.
도 3은 CXADRL1의 증식촉진 작용을 표시한다. 도 3a는, CXADRL1을 트랜스펙트한 NIH3T3 세포의 콜로니 형성 에세이의 결과를 나타낸 사진이다. 도 3b는, 반정량적 RT-PCR에 의하여 분석한, NIH3T3-CXADRL1 세포에 있어서 외인성 CXADRL1의 발현을 나타낸다. GAPDH의 발현을 내부대조로 이용하였다. #2, #5, #6 및 #7은 모두 CXADRL1을 트랜스펙트한 NIH3T3 세포를 나타낸다. 도 3c는, NIH3T3 세포의 수를 나타낸다. 10% FBS를 포함하는 배지내에서의 NIH3T3-CXADRL1 세포의 증식은 유사(NIH3T3-LacZ) 세포의 증식 보다도 통계학적으로 높은 정도 이었다(p<0.05).
도 4는 MKN-1 세포에 있어서, CXADRL1을 억제하기 위하여 지정된 안티센스 S-올리고 뉴클레오타이드의 증식 저해작용을 표시한다. CXADRL1-AS4 및 CXADRL1-AS5는 MKN-1 세포의 증식을 억제하는 것으로 나타났다.
도 5는 St-4 세포에 있어서 CXADRL1-siRNA의 증식 억제작용을 표시한다. 도 5A는, 유사 siRNA 또는 CXADRL1-siRNA#7을 트랜스펙트한 St-4 세포에 있어서 CXADRL1 및 GAPDH(대조)의 발현을 나타낸 사진을 제시한다. 도 5B는, 대조-siRNA 또는 CXADRL1-siRNA#7로 처리한 생세포의 김사(Giemsa) 염색의 결과를 표시한 사진을 나타낸다. 도 5C는, 대조 플라스미드 또는 CXADRL1-siRNA7을 발현하는 플라스미드를 트랜스펙트한 세포에 대하여 MTT 에세이를 한 결과를 나타낸다.
도 6은 항 CXADRL1 항혈청 또는 항 Flag 항체를 이용한, 외인성 Flag 표지 CXADRL1 단백질을 발현하는 세포의 면역블롯 분석의 결과를 나타낸 사진을 표시한다.
도 7은 효모 2-하이브리드 시스템에 의하여 검색한 CXADRL1과 AIP1과의 상호작용을 표시한다. 도 7은, 효모 2-하이브리드 시스템에 의하여 검색한 CXADRL1과 AIP1과의 상호작용을 표시한 사진이다.
도 8은 CXADRL1-207의 자극에 의하여 생긴 CTL 계열의 펩타이드 특이적 세포독성을 표시한다. 이 CTL 계열은, CXADRL1-207로 표지한 표적세포(T2)에 대하여 높은 세포독성 활성을 보이지만, 펩타이드로 표지하지 않은 동일 표적세포(T2)에 대해서는 명백한 세포독성 활성이 검출되지 않았다.
도 9는 SNU475, MKN74, 및 SNU-C4에 대한 CXADRL1-207 CTL클론의 세포독성 활성을 표시한다. CXADRL1-207 CTL 클론은, CXADRL1 및 HLA-A*0201 모두를 발현하는 SNU475에 대하여 높은 세포독성 활성을 나타내었다. 이것에 반하여, CXADRL1-207 CTL클론은, CXADRL1을 발현하지만 HLA-A*0201을 발현하지 않는 MKN74에 대해서는 명백한 세포독성 활성을 나타내지 않았다. 더욱, 이 CTL 클론은, HLA-A*0201을 발현하지만 CXADRL1을 발현하지 않는 SNU-C4에 대해서도 명백한 세포독성 활성을 나타내지 않았다.
도 10은 비방사성 표적 저해 에세이의 결과를 표시한다. CXADRL1-207 CTL클론은 CXADRL1-207을 HLA-A*0201 제한적인 방식으로 특이적으로 인식한다. Na2 51CrO 4로 표지한 SNU475를 방사성 표적으로 제조하고, CXADRL1-207 펩타이드로 표지한 T2(펩타이드+)를 비방사성 표적(저해물질)으로 이용하였다. E/T비는 20으로 고정하였다. SNU475의 세포독성 활성은 동일 펩타이드로 표지한 T2를 첨가함으로써 저해되었지만, 펩타이드로 표지하지 않은 T2를 첨가하더라도 거의 저해되지 않았다.
도 11은 CXADRL1-207 CTL클론의 세포독성 활성에 있어서, HLA 클래스 I, HLA 클래스 II, CD4 및 CD8에 대하여 생산된 항체의 작용을 나타낸 저지 에세이 결과를 표시한다. CXADRL1-207 CTL 클론은 HLA 클래스 I 및 CD8 제한적인 방식으로 세포 독성 활성을 보였다. CXADRL1 펩타이드에 의하여 생긴 CTL 클론의 특징을 조사하기 위하여, HLA 클래스 I, HLA 클래스 II, CD4 및 CD8에 대한 항체를 세포독성 활성의 저해 능력에 관하여 검토하였다. 수평축은 세포독성 활성의 저해율(%)을 나타낸다. SNU475 표적에 대한 CTL클론의 세포독성은, 항 클래스 I 항체 및 항 CD8 항체를 이용한 경우에 유의적으로 저하되었다. 이 결과는, CTL클론이 CXADRL1 유래의 펩타이드를 HLA 클래스 I 및 CD8 의존적인 방식으로 인식하는 것을 나타내고 있다.
도 12는 다양한 사람 조직에 있어서 GCUD1의 노던블롯 분석의 결과를 표시하고 있는 사진이다. GCUD1의 전사물의 사이즈는 약 3.5kb 이다.
도 13은 pcDNA3.1myc/His-GCUD1을 트랜스펙트한 세포의 면역세포화학에 의하여 관찰된 GCUD1의 세포내 위치를 나타낸 사진을 표시한다. 플라스미드로부터 발현한 cMyc 표지 GCUD1 단백질은 세포질에 위치한다.
도 14는 콜로니 형성 에세이에 의하여 검토한 NIH3T3 세포에 대한 GCUD1의 증식촉진 작용을 나타낸 사진이다.
도 15는 MKN-28 세포에 대한, GCUD1을 억제하도록 지정된 안티센스 S-올리고 뉴클레오타이드의 증식 저해 작용을 나타낸다. GCUD1-AS5 및 GCUD1-AS8은 MKN-28 세포의 증식을 억제하는 것이 판명되었다.
도 16은 재조합 GCUD1 단백질의 정제를 나타낸 사진을 표시한다.
도 17은 외인성 Flag 표지 GCUD1 단백질을 발현하는 세포에 있어서, 항 GCUD1 항혈청 또는 항 Flag 항체를 이용하여 면역블롯 분석을 행한 결과를 나타낸 사진을 표시한다.
도 18은 GCUD1-196(도 18A) 또는 GCUD1-272(도 18B)의 자극에 의하여 생긴 CTL계열의 펩타이드 특이적 세포독성을 표시한다. 이 CTL계열은, GCUD1-196 또는 GCUD1-272로 표지한 표적 세포(T2)에 대하여 높은 세포독성 활성을 보였지만, 펩타이드로 표지하지 않은 동일 표적 세포(T2)에 대해서는 명백한 세포독성 활성이 검출되지 않았다.
도 19는 SNU475 및 MKN45에 대한 GCUD1-196 CTL클론의 세포독성 활성을 표시한다. GCUD1-196 CTL클론은, GCUD1 및 HLA-A*0201 모두를 발현하는 SNU475에 대하여 높은 세포독성 활성을 보였다. 이것에 대하여, GCUD1-196 CTL클론은, GCUD1을 발현하지만 HLA-A*0201을 발현하지 않은 MKN45에 대하여는 명백한 세포독성 활성을 보이지 않았다.
도 20은 비방사성 표적 저해 에세이의 결과를 표시한다. GCUD1-196 CTL클론은, GCUD1-196을 HLA-A*0201 제한적인 방식으로 특이적으로 인식한다. Na2 51CrO4 로 표지한 SNU475를 방사성 표적으로 제조하고, GCUD1-196 펩타이드로 표지한 T2(펩타이드+)를 비상사성 표적(저해물질)으로 이용하였다. E/T비는 20으로 고정하였다. SNU475에 대한 세포독성 활성은, 동일 펩타이드로 표지한 T2를 첨가함으로써 저해되었지만, 펩타이드로 표지하지 않은 T2를 첨가하더라도 거의 저해되지 않았다.
도 21은 GCUD1-196 CTL클론의 세포독성 활성에 있어서, HLA 클래스 I, HLA 클래스 II, CD4 및 CD8에 대하여 생산된 항체의 작용을 나타낸 저해 에세이의 결과를 표시한다. GCUD1-196 CTL클론은 HLA 클래스 I 및 CD8에 제한적인 방식으로 세포독성 활성을 나타내었다. GCUD1 펩타이드에 의하여 생긴 CTL 클론의 특징을 조사하기 위하여, HLA 클래스 I, HLA 클래스 II, CD4 및 CD8에 대한 항체를 세포독성 활성의 저해능력에 관하여 검토하였다. 수평축은 세포독성 활성의 저해율(%)을 나타낸다. SNU475 표적에 대한 CTL클론의 세포독성은, 항 클래스 I 항체 및 항 CD8 항체를 이용한 경우에 유의적으로 저하되었다. 이 결과는, CTL클론이 GCUD1 유래의 펩타이드를 HLA 클래스 I 및 CD8 의존적인 방식으로 인식하는 것을 표시하고 있다.
도 22는 결장암에 있어서 FLJ20315의 발현을 표시한다. 도22a는, cDNA 마이크로 어레이에 의하여 조사한 11건의 원발생 결장암 케이스에 있어서 FLJ20315의 상대적인 발현비(암/비암)를 표시한다. 그 발현은, 컷오프 필터(Cy3 시그널 및 Cy5 시그널 모두가 25,000을 상회함)를 통과한 11건의 결장암 케이스 중에서 10건에서 상방 제어되었다(Cy3:Cy5 강도비>2.0). 또 22b는, 더욱 18건의 결장암 케이스를 이용하여 반정량적(semi-quantitative) RT-PCR에 의하여 분석한 FLJ20315의 발현을 표시하고 있다(T, 종양조직; N, 정상조직). GAPDH의 발현을 내부대조로 이용하였다.
도 23a는, 다양한 사람 태아 조직에 있어서 RNF43의 태아 조직 노던블롯 분석 결과를 나타낸 사진을 표시한다. 도 23b는, RNF43의 예상되는 단백질 구조를 표시한다.
도 24는 myc 표지 RNF43 단백질의 세포내 위치를 나타낸 사진을 표시한다. 도 24a는, pcDNA3.1-myc/His-RNF43 또는 대조 플라스미드(유사)의 어느 하나를 트랜스펙트한 COS7 세포의 추출물을 이용하여 myc 표지 RNF43 단백질의 웨스턴블롯 분석을 한 결과를 나타낸 사진이다. 도 24b는, 마우스 항 myc 항체로 염색하여 FITC 결합 2차항체로 가시화한 트랜스펙트 세포의 사진을 표시한다. 핵은 DAPI로 대비염색 하였다.
도 25는 세포증식에 대한 RNF43의 작용을 표시한다. 도 25a는, NIH3T3 세포에 있어서 RNF43의 콜로니 형성 에세이의 결과를 나타낸 사진이다. 도 25b는, 유사(COS7-pcDNA) 세포, 및 pcDNA-RNF43을 COS7 세포에 트랜스펙트하여 수립한 COS7-RNF43 세포에 있어서 RNF43의 발현을 나타낸 사진을 표시한다. 도 25c는, 세포증식에 관하여, 외인성 RNF43을 안정적으로 발현하는 COS7-RNF43 세포와 유사 세포를 비교한 결과를 표시한다.
도 26은 RNF43을 억제하도록 설계된 안티센스 S-올리고 뉴클레오타이드의 증식저해 작용을 표시한다. 도 26a에서는, 대조 S-올리고 뉴클레오타이드(RNF43-S1) 또는 안티센스 S-올리고 뉴클레오타이드(RNF43-AS1)의 어느 하나에 의하여 12시간 처리한 LoVo 세포에 있어서 RNF43의 발현을, 반정량적 RT-PCR에 의하여 분석하여 나타낸 사진을 표시한다. 도 26b는, MTT 에세이에 의하여 측정한, 대조 S-올리고 뉴클레오타이드 또는 안티센스 S-올리고 뉴클레오타이드에 의한 처리후의 LoVo 세포의 세포생존도를 표시한다. MTT 에세이는 3회씩 행하였다.
도 27은 RNF43-siRNA의 증식억제 작용을 표시한다. 도 27A는, RNF43의 발현에 대한 RNF43-siRNA의 작용을 나타낸 사진을 표시한다. 도 27B는, 대조-siRNA 또는 RNF43-siRNA에 의한 처리후의 생세포의 김사(Giemsa) 염색 결과를 나타낸 사진을 표시한다. 도 27C는, 대조 플라스미드 또는 RNF43-siRNA를 발현하는 플라스미드를 트랜스펙트한 세포에 대한 MTT 에세이의 결과를 표시한다. *, Fisher의 제약부 최소 유의차 검정(Fisher's protected least significant difference test)에 의해 평가된 유의차(p<0.05).
도 28은 표지한 RNF43 단백질의 발현을 표시한다. 도 28A는, pFLAG-5CMV-RNF43(레인 2) 또는 유사 벡터(레인 1)을 트랜스펙트한 COS7 세포의 배양액 내에서 분비되는 Flag 표지 RNF43 단백질의 웨스턴블롯 분석 결과를 표시한 사진이다. 도 28B는, pcDNA3.1-Myc/His-RNF43(레인 2) 또는 유사 벡터(레인 1)를 트랜스펙트한 COS7 세포의 배양액 내에서 분비되는 Myc 표지 RNF43 단백질의 웨스턴블롯 분석 결과를 표시한 사진이다.
도 29는 Myc 표지 또는 Flag 표지한 RNF43 단백질을 포함하는 순화배지의 배양촉진 작용을 표시한다. 도 29A는, 대조배지 내(1), 또는 유사벡터(2), pcDNA3.1-Myc/His-RNF43 (3), 또는 pFLAG-5CMV-RNF43 (4)를 트랜스펙트한 COS7 세포의 순화배지내에서 배양한 NIH3T3세포의 형태를 나타낸 사진을 표시한다. 도 29B는, 도 29A에 기재된 지정 배지내에서 배양한 NIH3T3세포의 수를 표시한다. 데이터는 각군에 대한 3회씩의 실험의 평균으로 표시되어 있다. bar,±SE. *, 대조·유사물과 비교한 경우의 유의차(p<0.05).
도 30은 RNF43의 N말단 재조합 단백질(N1) 및 C말단 재조합 단백질(C1)의 제조를 표시한다. 도 30A는, 재조합 단백질 RNF43-N1 및 RNF43-C1의 구조도를 표시한다. 도 30B는, 0.2mM IPTG의 존재하(레인 2) 또는 비존재하(레인 1)에서의 대장균에 있어서 Nus(상표) 표지 RNF43-N1 단백질의 발현을 표시한 사진이다. 도 30C는, 1mM IPTG의 존재하(레인 2) 또는 비존재하(레인 1)에서의 대장균에 있어서 Nus(상표) 표지 RNF43-C1 단백질의 발현을 표시한 사진이다.
도 31은 효모 2-하이브리드 시스템에 의하여 검토한 RNF43과 NOTCH2의 상호작용을 표시한다. 도 31a는, NOTCH2의 예상되는 구조 및 상호작용 영역을 표시한다. (a-1)는 NOTCH2 단백질의 예상되는 전장 구조를 나타내고, (a-2)는 예상되는 상호작용 관여 영역(responsible region)을 나타낸다(ECD, 세포외 도메인; TM, 막관통 도메인; ICD, 세포내 도메인). 도 31b는, 2-하이브리드 시스템에 의하여 검토된 RNF43과 NOTCH2의 상호작용을 나타낸 사진이다.
도 32는 효모 2-하이브리드 시스템에 의하여 검토한 RNF43과 STRIN의 상호작용을 표시한다. 도 32a는, STRIN의 예상되는 구조 및 상호작용 영역을 표시한다. (a-1)는 STRIN 단백질의 예상되는 전장 구조를 나타내고, (a-2)는 예상되는 상호작용 관여 영역을 나타낸다(RING, RING 도메인). 도 32b는, 2-하이브리드 시스템에 의하여 검토된 RNF43과 STRIN의 상호작용을 나타낸 사진이다.
도 33은 RNF43-721의 자극에 의하여 생긴 CTL 계열의 펩타이드 특이적 세포독성을 표시한다. 이 CTL계열은, RNF43-721로 표지한 표적세포(TISI)에 대하여는 높은 세포독성 활성을 보이지만(■선), 펩타이드로 표지하지 않은 동일 표적세포(TISI)에 대해서는 명백한 세포독성 활성이 검출되지 않았다(▲선). 이 CTL 계열은 펩타이드 특이적 세포독성을 가지는 것이 입증되었다.
도 34는 RNF43-721의 자극에 의하여 생긴 CTL클론의 펩타이드 특이적 세포독성을 표시한다. 재료 및 방법의 페이지에 기재한 바와 같이, 펩타이드로 표지한 표적(TISI)에 대하여, 13종의 RNF43-721 CTL클론의 세포독성 활성을 검토하였다. 수립된 RNF43-721 CTL클론은, 펩타이드로 표지한 표적세포(TISI)에 대해서 극히 강력한 세포독성 활성을 미쳤지만, 펩타이드로 표지하지 않은 동일 표적세포(TISI)에 대해서는 명백한 세포독성 활성을 보이지 않았다.
도 35는 HT29, WiDR, 및 HCT1161에 대한 RNF43-721 CTL 클론 45의 세포독성 활성을 표시한다. RNF43-721 CTL클론은, RNF43을 내인성으로 발현하는 종양세포를 HLA 제한적인 방식으로 인식하여 용해한다. HT29, WiDR, 및 HCT1161은 어느것도 RNF43을 내인성으로 발현하고, RNF43-721 CTL 클론 45는 이펙터 세포로서 역할을 하였다. TISI를, RNF43을 발현하지 않는 표적으로서 이용하였다. RNF43-721 CTL클론 45는, RNF43 및 HLA-A24 모두를 발현하는 HT29(▲선) 및 WiDR(◆선)에 대하여 높은 세포독성 활성을 보였다. 일방, RNF43-721 CTL클론 45는, RNF43을 발현하지만 HLA-A24를 발현하지 않는 HCT116(△선), 및 HLA-A24를 발현하지만 RNF43을 발현하지 않는 TISI(□선)에 대하여는 명백한 세포독성 활성을 보이지 않았다. 더욱, RNF43-721 CTL클론 45는, 관계없는 펩타이드로 표지한 TISI(■의 점선), 및 RNF43을 발현하지만 HLA-A24를 거의 발현하지 않은 SNU-C4(●선)에 대해서도 세포독성 활성을 보이지 않았다.
도 36은 비방사성 표적 저해 에세이의 결과를 표시한다. RNF43-721 CTL 클론은, RNF43-721을 HLA-A24 제한적인 방식으로 특이적으로 인식한다. Na2 51CrO4 로 표지한 HT29를 방사성 표적으로 제조하여, RNF43-721 펩타이드로 표지한 TISI(펩타이드+)를 비방사성 표적(저해물질)으로 이용하였다. E/T비는 20으로 고정하였다. HT29에 대한 세포독성 활성은 동일 펩타이드로 표지한 TISI를 첨가함으로써 저해되었지만(■선), 펩타이드로 표지하지 않은 TISI를 첨가하더라도 거의 저해되지 않았다(□선).
도 37은 RNF43-721 CTL 클론의 세포독성 활성에 있어서, HLA 클래스 I, HLA 클래스 II, CD3, CD4, 및 CD8에 대하여 생산된 항체의 작용을 나타낸, 저지 에세이의 결과를 표시한다. RNF43-721 CTL 클론은, HLA 클래스 I, CD3, 및 CD8 제한적인 방식으로 세포독성 활성을 보였다. RNF43 펩타이드에 의하여 생긴 CTL 클론의 특징을 조사하기 위하여, HLA 클래스 I, HLA 클래스 II, CD3, CD4, 및 CD8에 대한 항체를 세포독성 활성의 저해능력에 관하여 검토하였다. 수평축은 세포독성의 저해율(%)을 나타낸다. WiDR 표적에 대한 CTL 클론의 세포독성은, 항 클래스 I 항체, 항 CD3 항체, 및 항 CD8 항체를 이용한 경우에 유의적으로 저하되었다. 이 결과는, CTL 클론이 RNF43 유래의 펩타이드를 HLA 클래스 I, CD3, 및 CD8 의존적인 방식으로 인식하는 것을 나타내고 있다.
도 38은 RNF43-11-9(도 38A) 또는 RNF43-11-10(도 38B)에 의하여 생긴 CTL계열의 펩타이드 특이적 세포독성을 표시한다. 이들 CTL 계열은, RNF43-11-9 또는 RNF43-11-10으로 표지한 표적세포(T2)에 대하여 높은 세포독성 활성을 보였지만, 펩타이드로 표지하지 않은 동일한 표적세포(T2)에 대해서는 명백한 세포독성 활성이 관찰되지 않았다.
도 39는 RNF43-11-9(도 39A) 또는 RNF43-11-10(도 39B)의 자극에 의하여 생긴 CTL클론의 펩타이드 특이적 세포독성을 표시한다. 재료 및 방법의 페이지에서 기재한 바와 같이, 펩타이드로 표지한 표적(T2)에 대한 4종의 RNF43-11-9 CTL클론 또는 7종의 RNF43-11-10 클론의 세포독성 활성을 검토하였다. 수립된 RNF43-11-9 및 RNF43-11-10 CTL 클론은, 펩타이드로 표지한 표적세포(T2)에 대하여 극히 강력한 세포독성 활성을 보였지만, 펩타이드로 표지하지 않은 동일 표적세포(T2)에 대해서는 명백한 세포독성 활성을 보이지 않았다.
도 40은 HT29 및 DLD-1에 대한 RNF43-5 CTL클론 90 및 RNF43-17 CTL클론 25의 세포독성 활성을 표시한다. RNF43-5 CTL클론 90 및 RNF43-17 CTL클론 25는, RNF43을 내인성으로 발현하는 종양세포를 HLA 제한적인 방식으로 인식하여 용해한다. HT29 및 DLD-1은 어느것도 RNF43을 내인성으로 발현하고, RNF43-5 CTL클론 90 및 RNF43-17 CTL클론 25는 이펙터 세포로서의 역할을 하였다. T2를, RNF43을 발현하지 않는 표적으로 이용하였다. RNF43-5 CTL클론 90 및 RNF43-17 CTL클론 25는, RNF43 및 HLA-A*0201 모두를 발현하는 DLD-1에 대하여 높은 세포독성 활성을 보였다. 일방, RNF43-5 CTL클론 90 및 RNF43-17 CTL클론 25는, RNF43을 발현하지만 HLA-A*0201을 발현하지 않는 HT29에 대해서는 명백한 세포독성 활성을 보이지 않았다.
도 41은 비방사성 표적 저해 에세이의 결과를 표시한다. RNF43-11-9 CTL클론은, RNF43-11-9를 HLA-A2 제한적인 방식으로 특이적으로 인식한다. Na2 51CrO4 로 표지한 HCT116을 방사성 표적으로 제조하고, RNF43-11-9 펩타이드로 표지한 T2(펩타이드+)를 비방사성 표적(저해물질)으로 이용하였다. E/T비는 20으로 고정하였다. HCT116에 대한 세포독성 활성은, 동일 펩타이드로 표지한 T2를 첨가함으로써 저해되었지만, 펩타이드로 표지하지 않은 TISI를 첨가하더라도 거의 저해되지 않았다.
본 명세서에서 사용하는 「1개의 」 및「그것의」라는 용어는 별도로 기재하는 경우를 제외하고 「적어도 1개의」를 의미한다.
본 출원은 대응하는 비암조직과 비교하여 위암에서 그 발현이 현저하게 상승하고 있는 신규한 사람 유전자 CXADRL1 및 GCUD1을 동정한다. CXADRL1 cDNA는 서열번호：1에 나타난 바와 같이 1296 뉴클레오티드의 ORF를 포함하는 3423 뉴클레오티드로 구성된다. 이 ORF는 추정 431 아미노산의 단백질을 코드한다. CXADRL1는AIP1와 회합(associate)한다. AIP1（atrophin interacting protein 1）은 유전병의 하나인 dentatorubral-pallidoluysian atrophy 의 원인이 되는 유전자 atrophin-1과 회합하는 단백질이다. AIP1은 구아닐산 키나제 같은 도메인(guanylate kinase-like domain), 2개의 WW 도메인 및 5개의 PDZ 도메인을 포함하는 추정 1455 아미노산의 단백질을 코드한다. AIP1의 마우스 상동체는 activin type IIA 와 상호작용하는 것으로 나타났다. 그러나 AIP1의 기능은 아직 해명되어 있지 않다. 예상되는 아미노산 서열은 CXADR（coxsackie and adenovirus receptor）에 대하여 약 37％의 상동성을 나타내었다. 이 때문에 이 단백질은 CXADRL1（coxsackie and adenovirus receptor like 1）로 명명되었다. 한편, GCUD1 cDNA는 서열번호：3에 나타난 바와 같이 1245 뉴클레오티드의 ORF를 포함하는 4987 뉴클레오티드로 구성된다. 이 ORF는 추정 414 아미노산의 단백질을 코드한다. 이 단백질의 발현은 위암에서 상향조절되기 때문에 이 단백질은 GCUD1（up-regulated in gastric cancer）로 명명되었다.
나아가 본 발명은 대응하는 비암조직과 비교하여 결장직장암에서 그 발현이 현저하게 상승되는 신규 사람 유전자 RNF43를 포함한다. RNF43 cDNA는 서열번호：5 에 나타난 바와 같이 2352 뉴클레오티드의 ORF를 포함하는 5345 뉴클레오티드로 구성된다. 이 ORF는 추정 783 아미노산의 단백질을 코드한다. RNF43는 NOTCH2 및STRIN과 회합한다. NOTCH2는 진화적으로 보존된 세포간 시그널 전달 기구의 구성요소인 대형 막관통 수용체 단백질로 보고되어 있다. NOTCH2은 Notch 시그널 전달 경로의 단백질 인자로서, 신장에서 사구체 형성 및 심장 및 눈의 혈관 구조의 발달에 관여하는 것이 보고되어 있다. 나아가 3종류의 Delta/Serrate/Lag-2（DSL）단백질, Delta1, Jaggaed1 및 Jaggaed2는 NOTCH2에 대한 기능성 리간드인 것이 보고되고 있다. STRIN은 마우스 Trif과의 동일성이 79％인 단백질을 코드하는 것으로 추정된다. STRIN 또는 Trif의 기능은 아직 해명되지 않았다.
세포에서 CXADRL1, GCUD1, 또는 RNF43의 외인성 발현은 항상 세포증식의 항진을 가져오고 한편, 안티센스 S-올리고뉴클레오티드 또는 저분자 간섭 RNA（siRNA）에 의한 그 발현 억제는 암세포의 현저한 증식저해를 가져왔다. 이들 소견은 CXADRL1, GCUD1 및 RNF43가 암세포에 발암활성을 부여하는 것 및 이들의 단백질 활성의 저해가 암 치료를 위한 유망한 전략이 될 수 있음을 시사한다.
본 발명은 서열번호：1에 기재된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 신규한 사람 유전자 CXADRL1 외에 그 축퇴물 및 변이체도 그들이 서열번호：2에 나타낸 아미노산 서열예를 포함하는 CXADRL1 단백질 또는 그 기능적 동등물을 코드하는 범위에서 포함한다. CXADRL1와 기능적으로 동등한 폴리펩티드의 예에는, 예를 들어 사람 CXADRL1 단백질에 대응하는 다른 생물의 상동 단백질 외에 사람 CXADRL1 단백질의 변이체가 포함된다.
본 발명은 또한, 서열번호：3에 기재된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 신규한 사람 유전자 GCUD1 외에 그 축퇴물 및 변이체도 그들이 서열번호：4에 나타낸 아미노산 서열예를 포함하는 GCUD1 단백질 또는 그 기능적 동등물을 코드하는 범위에서 포함한다. GCUD1와 기능적으로 동등한 폴리펩티드의 예에는 예를 들어 사람 GCUD1 단백질에 대응하는 다른 생물의 상동 단백질 외에 사람 GCUD1 단백질의 변이체가 포함된다.
추가적으로, 본 발명은 서열번호：5에 기재된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 신규한 사람 유전자 RNF43 외에 그 축퇴물 및 변이체도 그들이 서열번호：6에 나타낸 아미노산 서열예를 포함하는 RNF43 단백질 또는 그 기능적 동등물을 코드하는 범위에서 포함한다. RNF43과 기능적으로 동등한 폴리펩티드의 예에는 예를 들어 사람 RNF43 단백질에 대응하는 다른 생물의 상동 단백질 외에 사람 RNF43 단백질의 변이체가 포함된다.
본 발명에 있어서「기능적으로 동등한」이라는 용어는 대상 폴리펩티드가CXADRL1, GCUD1 또는 RNF43 단백질과 같이 세포증식을 촉진함과 함께 암세포에서 발암활성을 부여하는 활성을 가지는 것을 의미한다. 대상 폴리펩티드가 세포증식 활성을 가질지 여부는 대상 폴리펩티드를 코드하는 DNA를 각각의 폴리펩티드를 발현하는 세포에 도입하고 세포의 증식 촉진 또는 콜로니 형성 활성의 상승을 검출하는 것에 의하여 판정된다. 이러한 세포에는 예를 들어 CXADRL1 및 GCUD1에 대하여는 NIH3T3세포；및 RNF43에 대해서는 NIH3T3 세포, SW480세포 및 COS7세포가 포함된다. 또는 대상 폴리펩티드가 CXADRL1와 기능적으로 동등한지 여부를 그 AIP1와의 결합능을 검출하는 것에 의하여 판정하는 것도 가능하다. 추가적으로 대상 폴리펩티드가 RNF43와 기능적으로 동등한지 여부를 그 NOTCH2 또는 STRIN과의 결합능을 검출하는 것에 의하여 판정할 수 있다.
소정의 단백질과 기능적으로 동등한 폴리펩티드를 제작하기 위한 방법은 당업자에 주지하며 이에는 단백질 변이체를 도입하는 기지의 방법이 포함된다. 예를 들어 당업자는 사람 CXADRL1, GCUD1 또는 RNF43 단백질과 기능적으로 동등한 폴리펩티드를 이들의 단백질의 어떠한 아미노산 서열에 부위 특이적 돌연변이 유도법에 의하여 적절한 변이를 도입함으로써 제작할 수 있다（Hashimoto-Gotoh 등, Gene 152: 271-5 (1995)；Zoller 및 Smith, Methods Enzymol 100: 468-500 (1983)；Kramer 등, Nucleic Acids Res. 12: 9441-9456 (1984)；Kramer 및 Fritz, Methods Enzymol 154: 350-67 (1987)；Kunkel, Proc Natl Acad Sci USA 82: 488-92 (1985)；Kunkel, Methods Enzymol 85: 2763-6 (1988)). 아미노산 변이는 자연적으로도 일어날 수 있다. 그 결과 생기는 변이 폴리펩티드가 사람 CXADRL1, GCUD1 또는 RNF43 단백질과 기능적으로 동등하다면, 1개 또는 복수의 아미노산이 변이된 사람 CXADRL1, GCUD1 또는 RNF43 단백질의 아미노산 서열을 가지는 단백질도 본 발명의 폴리펩티드에 포함된다. 이러한 변이체에서 변이시킨 아미노산의 수는 일반적으로 10 아미노산 또는 그 이하, 바람직하게는 6 아미노산 또는 그 이하, 보다 바람직하게는 3 아미노산 또는 그 이하이다.
변이단백질 또는 어느 특정의 아미노산 서열의 1개 혹은 복수의 아미노산 잔기의 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가에 의하여 변형된 아미노산 서열을 가지는 단백질인 변형단백질은 원래의 생물학적 활성을 가지는 것이 알려져 있다(Mark 등, Proc Natl Acad Sci USA 81: 5662-6 (1984)；Zoller 및 Smith, Nucleic Acids Res 10: 6487-500 (1982)；Dalbadie-McFarland 등, Proc Natl Acad Sci USA 79: 6409-13 (1982)).
변이시키는 아미노산 잔기는 아미노산 측쇄의 특성이 보존되는 다른 아미노산으로 변이시키는 것이 바람직하다（보존적 아미노산 치환으로서 알려진 방법). 아미노산 측쇄의 특성의 예에는 소수성 아미노산（A, I, L, M, F, P, W, Y, V), 친수성 아미노산（R, D, N, C, E, Q, G, H, K, S, T）및 이하의 관능기 또는 특징을 공통으로 가지는 측쇄가 있다：지방족 측쇄（G, A, V, L, I, P）；수산기 함유측쇄（S, T, Y）；유황원자 함유측쇄（C, M）; 카르복실산 및 아미드 함유측쇄（D, N, E, Q）；염기함유측쇄（R, K, H）；및 방향족 함유측쇄（H, F, Y, W). 괄호안의 문자는 아미노산 의 1문자 약호를나타내는 것에 주의.
사람 CXADRL1, GCUD1, 또는 RNF43 단백질의 아미노산 서열에 1개 또는 복수의 아미노산 잔기가 부가된 폴리펩티드의 일예는 사람 CXADRL1, GCUD1 또는 RNF43 단백질을 포함하는 융합단백질이다. 융합단백질로는 사람 CXADRL1, GCUD1 또는RNF43 단백질과 다른 펩티드 또는 단백질과의 융합물인 것으로서 이들은 본 발명에 포함된다. 융합단백질은 본 발명의 사람 CXADRL1, GCUD1 또는 RNF43 단백질을 코드하는 DNA를 다른 펩티드 또는 단백질을 코드하는 DNA와 프레임이 합치하도록 연결하고 이 융합 DNA를 발현벡터에 삽입하여 이것을 숙주에서 발현시킨다고 하는 당업자에게 주지한 기법에 의하여 제작할 수 있다. 본 발명의 단백질과 융합시키는 펩티드 또는 단백질에는 제한이 없다.
본 발명의 단백질과 융합시키는 펩티드로서 이용할 수 있는 기지의 펩티드에는 예를 들어 FLAG（Hopp 등, Biotechnology 6: 1204-10 (1988)), 6개의 His（히스티딘）잔기를 포함하는 6xHis, 10xHis, 인플루엔자 응집소（HA), 사람 c-myc 단편, VSP-GP 단편, p18HIV 단편, T7 태그, HSV 태그, E 태그, SV40 T항원 단편, lck 태그, α-튜블린 단편, B 태그, 프로테인 C단편 등이 포함된다. 본 발명의 단백질과 융합시킬 수 있는 단백질의 예에는, GST（글루타치온-S-트랜스퍼라제）, 인플루엔자 응집소（HA）, 면역글로불린 정상영역, β-갈락토시다제, MBP（말토스 결합단백질）등이 포함된다.
융합단백질은 위에서 고찰된 바와 같이 융합펩티드 또는 단백질을 코드하는 시판하는 DNA와 본 발명의 폴리펩티드를 코드하는 DNA를 융합시켜 제작된 융합 DNA를 발현시킴으로써 제작할 수 있다.
기능적으로 동등한 폴리펩티드를 단리하기 위한 당해 기술분야에서 알려진 대체적인 방법에는 예를 들어 혼성화법을 이용하는 방법이 있다（Sambrook 등, 「Molecular Cloning」제2판, 9.47-9.58, Cold Spring Harbor Lab. Press (1989)). 당업자는 사람 CXADRL1, GCUD1 또는 RNF43 단백질을 코드하는 DNA서열（즉, 서열번호：1, 3 또는 5）의 전체 또는 부분에 대하여 높은 상동성을 가지는 DNA를 용이하게 단리하여 단리된 DNA로부터 사람 CXADRL1, GCUD1 또는 RNF43 단백질과 기능적으로 동등한 폴리펩티드를 단리할 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드에는 사람 CXADRL1, GCUD1 또는 RNF43 단백질을 코드하는 DNA 서열의 전체 또는 부분과 혼성화하는 DNA에 의하여 코드되고 사람 CXADRL1, GCUD1 또는 RNF43 단백질과 기능적으로 동등한 폴리펩티드가 포함된다. 이들 폴리펩티드에는 사람유래의 단백질에 대응하는 포유동물 상동체（예를 들어 원숭이, 래트, 토끼 및 소 유전자에 의하여 코드되는 폴리펩티드）가 포함된다. 사람 CXADRL1 단백질을 코드하는 DNA에 대하여 상동성이 높은 cDNA를 동물로부터 단리하는 경우에는 정소 또는 난소로부터의 조직을 이용하는 것이 특히 바람직하다. 또한, 사람 GCUD1을 코드하는 DNA에 대하여 상동성이 높은 cDNA를 동물로부터 단리하는 경우에는 정소, 난소 또는 뇌로부터의 조직을 이용하는 것이 특히 바람직하다. 나아가 사람 RNF43 단백질을 코드하는 DNA에 대해서 상동성이 높은cDNA를 동물로부터 단리하는 경우에는 태아 간 또는 태아 신장의 조직을 이용하는 것이 특히 바람직하다.
사람 CXADRL1, GCUD1 또는 RNF43 단백질과 기능적으로 상동인 폴리펩티드를 코드하는 DNA를 단리하기 위한 혼성화 조건은 당업자에 의하여 관행적으로 선택될 수 있다. 예를 들어 30분간 또는 그 이상에 걸친 68℃에서의 전(pre) 혼성화를 「Rapid-hyb완충액」（Amersham LIFE SCIENCE）을 이용하여 행하고, 표지한 프로브를 첨가한 후 1시간 또는 그 이상 68℃에서 가온함으로써 혼성화를 행하여도 좋다. 이에 이은 세정단계는 예를 들어 낮은 엄격한 조건하에서 행할 수 있다. 낮은 엄격한 조건이라 함은 예를 들어 42℃, 2X SSC, 0.1％ SDS 또는 바람직하게는 50℃, 2X SSC, 0.1％ SDS이다. 보다 바람직하게는, 높은 엄격한 조건을 이용한다. 높은 엄격한 조건이라 함은, 예를 들어 실온의 2X SSC, 0.01％ SDS 중에서 20분간의 세정을 3회 행한 후 37℃의 1x SSC, 0.1％ SDS에서 20분간의 세정을 3회 행하고 50℃의 1x SSC, 0.1％ SDS중에서 20분간의 세정을 2회 행하는 것이다. 그러나 온도 및 염농도 등의 어떤 요인은 혼성화의 엄격성에 영향을 미친다고 생각되며 당업자는 필요한 엄격성을 얻기 위하여 이들의 요인을 적절하게 선택할 수 있다.
혼성화 대신에 유전자 증폭법 예를 들어, PCR을, 단백질을 코드하는 DNA의 염기정보（서열번호：1, 3 또는 5)에 근거하여 합성한 프라이머를 이용하여 사람 CXADRL1, GCUD1 또는 RNF43 단백질과 기능적으로 동등한 폴리펩티드를 코드하는 DNA를 단리하기 위하여 이용할 수도 있다.
이상의 혼성화법 또는 유전자 증폭법에 의하여 단리된 DNA에 의하여 코드되는 사람 CXADRL1, GCUD1 또는 RNF43 단백질과 기능적으로 동등한 폴리펩티드는 통상 사람 CXADRL1, GCUD1 또는 RNF43 단백질의 아미노산 서열에 대하여 높은 상동성을 갖는다. 「높은 상동성」이라 함은 일반적으로 40％ 또는 그 이상, 바람직하게는 60％ 또는 그 이상, 보다 바람직하게는 80％ 또는 그 이상, 나아가 보다 더욱 바람직하게는 95％ 또는 그 이상의 상동성을 가리킨다. 폴리펩티드의 상동성은「Wilbur 및 Lipman, Proc Natl Acad Sci USA 80: 726-30 (1983)」중의 알고리즘에 따라 결정할 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드는 그 생산을 위해 사용하는 세포 혹은 숙주 또는 이용하는 정제방법에 따라서 아미노산 서열, 분자량, 등전점, 당쇄의 유무 또는 형태에 관하여 차이가 있어도 좋다. 그러나 이들이 본 발명의 사람 CXADRL1, GCUD1 또 는 RNF43 단백질의 폴리펩티드와 동등한 기능을 가지는 한, 본 발명의 범위에 포함된다.
본 발명의 폴리펩티드는 당업자에 주지된 방법에 의하여 재조합 단백질로서 제조하는 것도 가능하고 또는 천연 단백질로서 제조할 수도 있다. 재조합 단백질은 본 발명의 폴리펩티드를 코드하는 DNA(예를 들어 서열번호：1, 3 또는 5의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA)를 적절한 발현 벡터에 삽입하고 그 벡터를 적절한 숙주세포에 도입하여 추출물을 얻고 이를 크로마토그래피, 예를 들어 이온 교환 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, 젤 여과 크로마토그래피 혹은 본 발명의 단백질에 대한 항체를 고정한 컬럼을 이용하는 친화성 크로마토그래피를 수행하는 것에 의하여 또는 상기 컬럼의 복수를 조합시켜 폴리펩티드를 정제하는 것에 의하여 제조하는 것이 가능하다.
마찬가지로, 본 발명의 폴리펩티드를 숙주세포（예를 들어 동물세포 및 대장균)의 내부에서 글루타치온-S-트랜스퍼라제 단백질과의 융합 단백질로서 혹은 다수의 히스티딘을 추가한 재조합 단백질로서 발현시키는 경우에는, 발현한 재조합 단백질을 글루타치온 컬럼 또는 니켈 컬럼을 이용하여 정제할 수 있다. 또한, 본 발명의 폴리펩티드를 c-myc, 다수의 히스티딘 또는 FLAG으로 표지한 단백질로서 발현시키는 경우에는 각각c-myc, His 또는 FLAG에 대한 항체를 이용하여 검출함으로써 정제할 수 있다.
융합단백질을 정제한 후에 필요에 따라서 트롬빈 또는 Xa 인자로 절단하는 것에 의하여 목적 폴리펩티드 이외의 영역을 제외하는 것도 가능하다.
천연의 단백질은 당업자에 알려진 방법에 의하여, 예를 들어 하기의 CXADRL1, GCUD1 또는 RNF43 단백질과 결합하는 항체를 결합시킨 친화성 컬럼을, 본 발명의 폴리펩티드를 발현하는 조직 또는 세포의 추출물과 접촉시키는 것에 의하여 단리할 수 있다. 항체는 폴리클로날 항체여도 모노클로날 항체여도 좋다.
본 발명은 또한 본 발명의 폴리펩티드의 부분（partial）펩티드도 포함한다. 부분펩티드는 본 발명의 폴리펩티드에 대하여 특이적인 아미노산 서열을 가지고 적어도 7 아미노산, 바람직하게는 8 아미노산 또는 그 이상, 보다 바람직하게는 9 아미노산 또는 그 이상으로 구성된다. 부분펩티드는 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드에 대한 항체를 제작하기 위하여, 본 발명의 폴리펩티드와 결합하는 화합물을 스크리닝 하기 위하여, 그리고 본 발명의 폴리펩티드의 저해물질을 스크리닝 하기 위하여 이용할 수 있다.
본 발명의 부분펩티드는 유전자 조작에 의하여 기지의 펩티드 합성방법에 의하여 또는 본 발명의 폴리펩티드를 적절한 펩티다아제로 소화하는 것에 의하여 제작가능하다. 펩티드 합성을 위해서는 예를 들어, 고상합성(solid phase synthesis) 또는 액상합성(liquid phase synthesis)을 이용할 수 있다.
나아가 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드도 제공한다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 상기한 대로 본 발명의 폴리펩티드의 인비보 혹은 인비트로에서의 생산을 위하여 사용할 수 있고 또는 본 발명의 단백질을 코드하는 유전자의 유전적 이상에 기인하는 질환에 대한 유전자 치료를 위하여 사용하는 것도 가능하다. mRNA, RNA, cDNA, 게놈 DNA, 화학합성된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 어떠한 형태의 폴리뉴클레오티드도 그것이 본 발명의 폴리펩티드를 코드하는 한 사용할 수 있다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드에는 소정의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 외에 그 축퇴서열(degenerate sequence)도 그 결과로서 생기는 DNA가 본 발명의 폴리펩티드를 코드하는 한 포함된다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 당업자에 알려진 방법에 의하여 제작할 수 있다. 예를 들어 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 폴리펩티드를 발현하는 세포로부터 cDNA 라이브러리를 제작하고 본 발명의 DNA（예를 들어 서열번호：1, 3 또는 5）의 부분서열을 프로브로 하여 이용하여 혼성화를 행함으로써 제작할 수 있다. cDNA 라이브러리는 예를 들어 Sambrook 등, 「Molecular Cloning」, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)」에 기재된 방법에 의하여 제작할 수 있다； 또는 시판되는 cDNA 라이브러리를 이용하여도 좋다. cDNA 라이브러리는 본 발명의 폴리펩티드를 발현하는 세포로부터 RNA를 추출하고 본 발명의 DNA（예를 들어 서열번호：1, 3 또는 5）의 서열에 기초하여 올리고 DNA를 합성하고 올리고 DNA를 프라이머로서 이용하여 PCR을 행하고, 본 발명의 단백질을 코드하는 cDNA를 증폭함으로써 제작할 수 있다.
나아가 얻어진 cDNA의 뉴클레오티드의 시퀀싱을 행하여 cDNA에 의해 코드되는 번역영역을 관행적으로 결정하여 본 발명의 폴리펩티드의 아미노산 서열을 용이하게 얻을 수 있다. 그 후, 얻어진 cDNA 또는 그 부분을 이용하여 게놈 DNA 라이브러리를 스크리닝함으로써 게놈 DNA를 단리할 수 있다.
보다 구체적으로 기술하면, mRNA를 우선 본 발명의 대상 폴리펩티드가 발현되는 세포, 조직 또는 장기（예를 들어 CXADRL1의 경우는 정소 또는 난소；GCUD1의 경우는 정소, 난소 또는 뇌；RNF43의 경우는 태아간 또는 태아신장）로부터 준비한다. mRNA의 단리에는 기지의 방법을 이용할 수 있다；예를 들면, 총RNA는 구아니딘 초원심분리（Chirgwin 등, Biochemistry 18: 5294-9 (1979)）또는 AGPC법（Chomczynski 및 Sacchi, Anal Biochem 162: 156-9 (1987)）에 의하여 제조할 수 있다. 또한, mRNA를 mRNA정제키트（Pharmacia）등을 이용하여 총 RNA로부터 정제해도 되고 또는 mRNA를 QuickPrep mRNA정제키트（ Pharmacia ）에 의하여 직접 정제하여도 된다.
얻어진 mRNA는 역전사효소를 이용하여 cDNA를 합성하기 위하여 이용된다. cDNA는 AMV역전사효소 제1사슬 cDNA합성키트（Seikagaku Kogyo）등의 시판되는 키트를 이용하여 정제할 수 있다. 또는, 본 명세서에 기재된 프라이머 등 5'-Ampli FINDER RACE 키트（Clontech）및 PCR을 이용하는 5'-RACE법（Frohman 등, Proc Natl Acad Sci USA 85: 8998-9002 (1988)；Belyavsky 등, Nucleic Acids Res 17: 2919-32 (1989)）에 따라 cDNA의 합성 및 증폭을 행할 수도 있다.
소망하는 DNA 단편을 PCR 산물로 제조하고 벡터 DNA와 연결한다. 이 재조합 벡터를 대장균 등의 형질전환에 이용하고 선택한 콜로니로부터 희망하는 재조합벡터를 얻는다. 소망하는 DNA의 뉴클레오티드 서열을 디옥시뉴클레오티드 사슬종결법（dideoxynucleotide chain termination）등의 종래 방법에 의하여 검증한다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열을 발현을 위하여 이용하는 숙주에서 코돈 사용 빈도를 고려하여 넣음으로써 보다 효율적으로 발현되도록 설계할 수도 있다（Grantham 등, Nucleic Acids Res 9: 43-74 (1981). 본 발명의 폴리뉴클레오티드 서열을, 시판하는 키트 또는 종래의 방법에 의하여 수정할 수 있다. 예를 들어, 제한효소에 의한 소화, 합성 올리코뉴클레오티드 혹은 적절한 폴리뉴클레오티드 단편의 삽입, 링커의 부가 또는 개시코돈（ATG）및/또는 종결 코돈（TAA, TGA 혹은 TAG）의 삽입으로 서열을 수정할 수 있다.
구체적으로는, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 서열번호：1, 3 또는 5의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA를 포함한다.
나아가, 본 발명은 서열번호：1, 3 또는 5의 뉴클레오티드 서열을 가지는 폴리뉴클레오티드와 엄격한 조건 하에서 혼성화하고 상기 본 발명의 CXADRL1, GCUD1 또는 RNF43 단백질과 기능적으로 동등한 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 당업자는 엄격한 조건을 적절하게 선택하여도 좋다. 예를 들어 낮은 엄격한 조건을 이용할 수 있다. 보다 바람직하게는, 높은 엄격한 조건을 이용한다. 이들 조건은 상기한 것과 같다. 상기 혼성화시키는 DNA는 cDNA 또는 염색체 DNA인 것이 바람직하다.
본 발명은 또한, 본 발명의 폴리뉴클레오티드가 내부에 삽입된 벡터도 제공한다. 본 발명의 벡터는 본 발명의 폴리펩티드를 발현시키기 위하여 또는 유전자 치료를 위해 본 발명의 폴리펩티드를 투여하기 위하여 숙주세포에서 폴리뉴클레오티드 특히, DNA를 유지시키는데 유용하다.
대장균이 숙주세포로서 벡터를 대장균（예를 들어 JM109, DH5α, HB101 또는XL1Blue）의 내부에서 대량으로 증폭 및 생산하는 경우에, 벡터는 대장균에서 증폭시키기 위한「ori」 및 형질전환된 대장균을 선택하기 위한 마커 유전자（예를 들어 암피실린, 테드라사이클린, 카나마이신, 클로람페니콜 등의 약제에 의하여 선택되는 약제저항성 유전자）를 가질 필요가 있다. 예를 들어, M13 시리즈의 벡터, pUC 시리즈의 벡터, pBR322, pBluescript, pCR-Script 등을 이용할 수 있다. 나아가 상기 벡터와 마찬가지로 pGEM-T, pDIRECT 및 pT7도 cDNA 서브클로닝 및 추출을 위하여 이용할 수 있다. 본 발명의 단백질의 생산을 위하여 벡터를 이용하는 경우에는 발현벡터가 특히 유용하다. 예를 들어, 대장균에서 발현하도록 하는 발현 벡터는 대장균에서 증폭시키기 위한 상기의 특징을 가질 필요가 있다. JM109, DH5αHB101, 또는 XL1Blue 등의 대장균을 숙주세포로서 이용하는 경우에는 벡터는 대장균에서 희망하는 유전자를 효율적으로 발현할 수 있는 프로모터, 예를 들어 lacZ 프로모터（Ward 등, Nature 341: 544-6 (1989)；FASEB J 6: 2422-7 (1992)）, araB 프로모터（Better 등, Science 240: 1041-3 (1988)）, 또는 T7 프로모터 등을 가질 필요가 있다. 그 점에 관해서는, 예를 들어 pGEX-5X-1（Amersham）, 「QIAexpress시스템」（Qiagen）, pEGFP 및 pET（이 경우 숙주는 T7 RNA 폴리머라제를 발현하는 BL21인 것이 바람직하다）을 상기 벡터 대신에 이용하여도 좋다. 나아가 벡터는 폴리펩티드 분비를 위한 시그널 서열을 포함할 수 있다. 대장균의 주변질（periplasm）로의 폴리펩티드 분비를 지시하는 시그널 서열의 일예는 pelB 시그널 서열（Lei 등, J Bacteriol 169: 4379 (1987)）이 있다. 벡터를 표적 숙주세포에 도입하기 위한 수단에는 예를 들어, 염화칼슘법 및 전기천공법(electroporation method)이 포함된다.
대장균 이외에 예를 들어, 포유동물 유래의 발현 벡터（예를 들어 pcDNA3（Invitrogen） 및 pEGF-BOS（Nucleic Acids Res 18(17): 5322 (1990)）, pEF, pCDM8), 곤충세포 유래의 발현 벡터（예를 들어 「Bac-to-BAC 배큘로바이러스 발현계」（GIBCO BRL）, pBacPAK8）, 식물세포 유래의 발현벡터（예를 들어 pMH1, pMH2）, 동물바이러스 유래의 발현벡터（예를 들어 pHSV, pMV, pAdexLcw）, 레트로바이러스 유래의 발현벡터（예를 들어 pZIpneo）, 효모 유래의 발현벡터（예를 들어 「Pichia Expression Kit」（Invitrogen）, pNV11, SP-Q01） 및 고초균（Bacillus subtilis）유래의 발현 벡터（예를 들어 pPL608, pKTH50）를 본 발명의 폴리펩티드의 생산을 위하여 이용할 수 있다.
벡터를 CHO 세포, COS 세포 또는 NIH3T3 세포 등의 동물세포 내에서 발현시키기 위해서는, 벡터는 이 종류의 세포에서 발현을 위해 필요한 프로모터, 예를 들어 SV40 프로모터（Mulligan 등, Nature 277: 108 (1979)）, MMLV-LTR 프로모터, EF1α프로모터 ,（Mizushima 등, Nucleic Acids Res 18: 5322 (1990)）, CMV 프로모터 등을 가질 필요 외에 형질전환체를 선별하기 위한 마커유전자（예를 들어 약제(예를 들어, 네오마이신, G418)에 의하여 선별되는 약제저항성 유전자）를 가지는 것이 바람직하다. 이들의 특징을 구비한 기지의 벡터의 일예에는 예를 들어, pMAM, pDR2, pBK-RSV, pBK-CMV, pOPRSV 및 pOP13이 포함된다.
나아가 본 방법을, 유전자를 안정적으로 발현시키기 위하여 그리고 이와 동시에 세포내의 유전자의 카피수를 증폭하기 위하여 이용할 수도 있다. 예를 들어 상보적 DHFR 유전자를 포함하는 벡터(예를 들어, pCHO I)를 핵산합성경로가 결실된 CHO 세포에 도입한 후에 methotrexate (MTX)에 의하여 증폭할 수 있다. 나아가 유전자의 한시적 발현(trasient expression)의 경우에는 SV40의 복제기점을 포함하는 벡터（pcD 등)를, SV40 T항원을 발현하는 유전자를 염색체상에 포함하는 COS세포에 형질전환 도입하는 방법을 이용할 수 있다.
이상과 같이 얻어진 본 발명의 폴리펩티드는 숙주세포의 내부 또는 외부（배지 등）로부터 단리하여 실질적으로 순수한 균일한 폴리펩티드로서 정제할 수 있다. 소정의 폴리펩티드에 언급하여 본 명세서에서 사용하고 있는 「실질적으로 순수한(substantially pure)」이라 함은 그 폴리펩티드가 다른 생체고분자로부터 실질적으로 유리(substantially free)하고 있는 것을 의미한다. 실질적으로 순수한 폴리펩티드는 건조중량으로 순도가 적어도 75％（예를 들어 적어도 80, 85, 95 또는 99％）이다. 순도는 임의의 적절한 표준적 방법에 의하여 예를 들어, 컬럼 크로마토그래피, 폴리아크릴아미드젤 전기영동 또는 HPLC 분석에 의하여 측정할 수 있다. 폴리펩티드의 단리 및 정제를 위한 방법은 어떤 특정한 방법에 한정되지 않는다；실제로는 임의의 표준적 방법을 이용할 수 있다.
예를 들어, 컬럼 크로마토그래피, 필터, 한외여과, 염석, 용매침전, 용매추출, 증류, 면역침강, SDS-폴리아크릴아미드젤 전기영동, 등전점 전기영동, 투석 및 재결정화를 적절하게 선택, 조합시켜 폴리펩티드의 단리 및 정제를 행할 수 있다.
크로마토그래피의 예로는, 예를 들어 친화성 크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 젤여과 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, 흡착 크로마토그래피 등이 포함된다（「Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual」, Daniel R. Marshak 등 엮음, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996). 이들 크로마토그래피를 HPLC 및 FPLC 등의 액체 크로마토그래피에 의하여 행하여도 좋다. 따라서 본 발명은 이상의 방법에 의하여 제조된 고순도의 폴리펩티드를 제공한다.
본 발명의 폴리펩티드를 정제 전 또는 후에 적절한 단백질 수식(modification) 효소로 처리하여 임으로 변형하는 것, 또는 부분적으로 결실시키는 것도 가능하다. 유용한 단백질 수식효소에는 트립신, 키모트립신, 라이신엔도펩티다아제(lysylendopeptidase), 단백질키나제, 글루코시다제 등이 비제한적으로 포함된다.
본 발명은 본 발명의 폴리펩티드와 결합하는 항체를 제공한다. 본 발명의 항체는 모노클로날 항체 또는 폴리클로날 항체 등의 임의의 형태로 사용할 수 있으며 이들에는 토끼 등의 동물을 본 발명의 폴리펩티드로 면역시킴으로써 얻어지는 항혈청, 모든 클래스의 폴리클로날 항체 및 모노클로날 항체, 사람 항체 및 유전자 조합에 의해 제작된 인간화항체(humanized antibody)가 포함된다.
항체를 얻기 위한 항원으로서 사용되는 본 발명의 폴리펩티드는 임의의 동물종에서 유래할 수 있지만 바람직하게는 사람, 마우스 또는 래트 등의 포유동물, 보다 바람직하게는 사람에서 유래한다. 사람 유래의 폴리펩티드는 본 명세서에 개시하는 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열로부터 입수할 수 있다.
본 발명에 의하면 면역화 항원으로서 이용되는 폴리펩티드는 전체 단백질이어도 좋고, 또는 단백질의 부분 펩티드여도 좋다. 부분펩티드는 예를 들어 본 발명의 폴리펩티드의 아미노（N）말단 또는 카복시（C）말단 단편을 포함할 수 있다. 보다 구체적으로는, CXADRL1의 코돈 235 위치에서 276 위치까지, 493 위치에서 537 위치까지, 또는 70 위치에서 111 위치까지 포함하는 폴리펩티드를 본 발명의 CXADRL1에 대한 항체를 제작하기 위한 부분 펩티드로서 이용할 수 있다.
또는, 본 발명의 폴리펩티드에 대한 항체의 제작을 위하여 이하의 아미노산 서열의 어느 하나를 포함하는 펩티드를 이용하여도 좋다.
　-RNF43；서열번호：80, 97 또는 108
　-CXADRL1；서열번호：124
　-GCUD1；서열번호：164
본 발명에 있어서 항체는 본 발명의 폴리펩티드의 전장 또는 단편의 어느 것과 반응하는 단백질로서 정의된다.
본 발명의 폴리펩티드 또는 그 단편을 코드하는 유전자를 기지의 발현벡터에 삽입하고 그 후 본 명세서에 기재한 것과 같은 숙주세포의 형질전환에 이용하여도 좋다. 소망하는 폴리펩티드 또는 그 단편을 임의의 표준적인 방법에 의하여 숙주세포의 내부 또는 외부에서 회수하고 그 후 항원으로서 이용할 수 있다. 또는 폴리펩티드를 발현하는 세포전체 혹은 그 용해물(lysates) 또는 화학합성한 폴리펩티드를 항원으로서 이용하여도 좋다.
어떠한 포유동물도 항원으로 면역시킬 수 있지만 세포융합에 이용하는 모세포(parents cells)와의 적합성을 고려하여 도입하는 것이 바람직하다. 일반적으로 설치류(Rodentia), 토끼목（Lagomorpha） 또는 영장류（Primate）의 동물이 이용된다. 설치류의 동물에는 예를 들어 마우스, 래트 및 햄스터가 포함된다. 토끼 목에는 예를 들어, 토끼가 포함된다. 영장류 동물에는 Macaca fascicularis와 같은 협비원류（Catarrhini）（구세계 원숭이）원숭이, 빨간털 원숭이 (rhesus monkey), 망토비비（sacred baboon）및 침팬치가 포함된다.
동물을 항원으로 면역시키기 위한 방법은 당해 기술분야에서 널리 알려져 있다. 항원의 복강내 주사 또는 피하주사는 포유동물의 면역화를 위한 표준적인 방법이다. 보다 구체적으로 기술하면, 항원을 희석하여 적절한 양의 인산 완충식염수（PBS）, 생리식염수 등에 현탁시킨다. 필요에 따라서 항원현탁액을 프로이트 완전 어쥬번트(Fruend's complete adjuvant) 등의 적절한 양의 표준적인 어쥬번트와 혼합하여 에멀젼으로 만든 후 포유동물에 대하여 투여할 수 있다. 그 후 적절한 양의 프로이트 완전 어쥬번트와 혼합한 항원의 투여를 4~21 일마다 수회 행하는 것이 바람직하다. 적절한 담체(carrier)를 면역화를 위해 사용하여도 좋다. 상기와 같은 면역화 이후에 혈청을 소망하는 항체의 양의 증가에 관하여 표준적인 방법에 따라 검토한다.
본 발명의 폴리펩티드에 대한 폴리클로날 항체를 혈청 중의 소망하는 항체 의 증가에 관하여 검토한 면역 후의 포유동물로부터 혈액을 채취하고 종래 임의의 방법에 따라 혈액으로부터 혈청을 분리함으로써 제조할 수도 있다. 폴리클로날 항체에는 폴리클로날 항체를 포함하는 혈청이 포함되고 폴리클로날 항체를 포함하는 분획을 혈청으로부터 분리할 수도 있다. 면역 글로불린 G 또는 M은 본 발명의 폴리펩티드만을 인식하는 분획으로부터 예를 들어 본 발명의 폴리펩티드를 결합시킨 친화성 컬럼을 사용한 후 이 분획을 프로테인 A 컬럼 또는 프로테인 G 컬럼을 이용하여 추가로 정제하여 제조할 수 있다.
모노클로날 항체를 제조하기 위해서는 항원으로 면역시킨 포유동물로부터 면역세포를 수집하고 상기한 대로 혈청 중의 소망하는 항체의 레벨 상승에 대한 확인 후 세포융합에 제공한다. 세포융합에 이용하는 면역세포는 비장으로부터 입수하는 것이 바람직하다. 상기 면역세포와 융합시키기 위한 기타 바람직한 세포에는 포유동물의 골수종세포, 보다 바람직하게는 약제에 의한 융합세포의 선별을 위한 획득성질을 가지는 골수종세포가 포함된다.
상기 면역세포 및 골수종세포는 기지의 방법, 예를 들어 Milstein 등（Galfre 및 Milstein, Methods Enzymol 73: 3-46 (1981)）의 방법에 따라 융합시킬 수 있다.
세포융합에 의하여 결과적으로 얻어진 하이브리도마는 HAT 배지（히포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘을 포함하는 배지）등의 표준적인 선택배지에서 배양함으로써 선택할 수 있다. 세포배양은 통상 HAT 배지 중에서 바라는 하이브리도마를 제외한 다른 모든 세포(비융합세포)가 사멸하는데 충분한 시간인 수일에서 수주간에 걸쳐 계속된다. 그 후 소망하는 항체를 생산하는 하이브리도마 세포의 스크리닝 및 클로닝을 위한 표준적인 한계희석을 행한다.
하이브리도마 제조용으로 비사람동물을 항원으로 면역하는 상기의 방법에 추가하여 EB 바이러스에 감염한 림프구 등의 사람 림프구를 폴리펩티드, 폴리펩티드 발현세포 또는 이들의 용해물에 의하여 인비트로에서 면역할 수도 있다. 이어 면역 후의 림프구를 무한하게 분열할 수 있는 U266 등의 사람 유래 골수종세포와 융합시켜 폴리펩티드와 결합할 수 있는, 바라는 바의 사람 항체를 생산하는 하이브리도마를 얻을 수 있다（특허공개 소화63-17688호).
얻어진 하이브리도마를 이어 마우스의 복강(abdominal cavity)내에 이식하고 복수(ascites)를 추출한다. 얻어진 모노클로날 항체는 예를 들어, 황산 암모늄 침전, 프로테인 A 또는 프로테인 G 컬럼, DEAE 이온 교환 크로마토그래피 또는 본 발명의 폴리펩티드를 결합시킨 친화성 컬럼에 의하여 정제할 수 있다. 본 발명의 항체는 본 발명의 폴리펩티드의 정제 및 검출을 위한 것만이 아니라, 본 발명의 폴리펩티드의 안타고니스트의 후보로서도 이용할 수 있다. 나아가 이 항체를 본 발명의 폴리펩티드와 관련한 질환에 대한 항체요법에 적용할 수도 있다. 얻어진 항체를 인체에 대하여 투여할 경우에는(항체요법), 면역원성을 억제하기 위해서 사람항체 또는 인간화 항체가 바람직하다.
예를 들어, 사람 항체 유전자의 레퍼토리를 가지는 트랜스펙션 동물은 폴리펩티드, 폴리펩티드 발현세포, 또는 이들의 용해물로부터 선택되는 항원으로 면역할 수 있다. 이어, 항체생산 세포를 동물로부터 채취하고 골수종세포와 융합시켜 하이브리도마를 얻고 그 하이브리도마로부터 폴리펩티드에 대한 사람 항체를 제조할 수 있다(국제공개공보제92-03918호, 국제공개공보제 93-2227호, 국제공개공보제 94-02602호, 국제공개공보제 94-25585호, 국제공개공보제 96-33735호 및 국제공개공보제 96-34096호를 참조）.
또는 면역한 림프구(immunized lymphocyte)와 같은 항체 생산 면역세포를 암유전자에 의하여 불사화(immortalized)시켜 모노클로날 항체의 제조에 이용할 수도 있다 .
이렇게 얻어진 모노클로날 항체는 유전자 조작기술을 이용한 재조합에 의해 제조할 수 있다（예를 들어, Borrebaeck 및 Larrick, 「Therapeutic Monoclonal Antibodies）, MacMillan Publishers LTD（영국）에서 간행(1990), 을 참조). 예를 들어 항체를 코드하는 DNA를 항체 생산 하이브리도마 또는 면역림프구 등의 면역세포로부터 클로닝하여 적절한 벡터에 삽입한 후 숙주세포에 도입하여 재조합 항체를 제조할 수 있다. 본 발명은 또한, 상기한 바와 같이 제조한 재조합 항체를 제공한다.
또한, 본 발명의 항체는 본 발명의 폴리펩티드의 1개 또는 복수와 결합하는 한, 항체의 단편 또는 수식 항체여도 좋다. 예를 들어 항체 단편은 Fab, F(ab')2, Fv 또는 H 사슬 및 L 사슬 유래의 Fv 단편을 적절한 링커에 의하여 연결한 단일사슬 Fv（scFv）여도 좋다（Huston 등, Proc Natl Acad Sci USA 85: 5879-83 (1988)）. 보다 구체적으로 기술하면, 파파인 또는 펩신 등의 효소로 항체를 처리하여 항체 단편을 제작할 수도 있다. 또는 항체 단편을 코드하는 유전자를 구축하여 본 발현벡터에 삽입한 후 적절한 숙주세포에서 발현시켜도 좋다(예를 들어 Co 등, J Immunol 152: 2968-76 (1994)；Better 및 Horwitz Methods Enzymol 178: 476-96 (1989)；Pluckthun 및 Skerra, Methods Enzymol 178: 497-515 (1989)；Lamoyi, Methods Enzymol 121: 652-63 (1986)；Rousseaux 등, Methods Enzymol 121: 663-9 (1986)；Bird 및 Walker, Trends Biotechnol 9: 132-7 (1991)를 참조).
항체를 폴리에틸렌글리콜（PEG）등의 각종 분자와 결합시켜 수식(modification)할 수도 있다. 본 발명은 이러한 수식 항체를 제공한다. 수식 항체는 항체를 화학적으로 수식하여 얻어질 수 있다. 이들 수식 방법은 당해 기술분야에서 관례적이다.
또는, 본 발명의 항체를 비사람항체 유래의 가변영역과 사람 항체의 정상 영역과의 키메라 항체로서 또는 비사람항체 유래의 상보성 결정영역（CDR), 사람 항체 유래의 프레임 워크 영역（FR）및 정상영역을 포함하는 인간화 항체로서 얻어질 수도 있다. 이러한 항체는 기지의 기술을 이용하여 제조 가능하다.
이렇게 얻어진 항체를 균일하게 될 때까지 정제하여도 좋다. 예를 들어 항체를 일반적인 단백질에 대하여 이용하는 분리법 및 정제법에 따라 분리 및 정제할 수 있다. 예를 들어, 친화성 크로마토그래피 등의 컬럼 크로마토그래피, 필터, 한외여과, 염석, 투석, SDS폴리아크릴아미드젤 전기영동, 등전점 전기영동 등(그러나 이들에 한정되지 않는다)을 적절하게 선택, 조합하여 항체를 분리 및 단리할 수 있다（「A Laboratory Manual」, Harlow 및 David Lane 역, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)). 프로테인 A 컬럼 및 프로테인 G 컬럼은 친화성 컬럼으로서 이용할 수 있다. 이용되는 프로테인 A 컬럼의 예에는, 예를 들어 HyperD, POROS 및 세파로스F.F.（Pharmacia）가 포함된다.
크로마토그래피의 예에는 친화성 크로마토그래피를 제외하고 예를 들어, 이온교환 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 젤여과, 역상크로마토그래피, 흡착 크로마토그래피 등이 포함된다（「Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual）, Daniel R. Marshak 등 엮음, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996)). 크로마토그래피 과정은 HPLC 및 FPLC 등의 액상 크로마토그래피에 의하여 행할 수도 있다.
본 발명의 항체의 항원결합성을 측정하기 위해서는, 예를 들어, 흡광도, 효소결합면역흡착 에세이법（ELISA）, 효소면역에세이법（EIA）, 방사면역에세이법（RIA）및 /또는 면역형광검사법을 이용할 수 있다. ELISA의 경우에는 본 발명의 항체를 플레이트 상에 고정화하고 본발명의 폴리펩티드를 플레이트에 첨가한 후에 항체 생산세포의 배양상청 또는 정제 항체 같은 소망하는 항체를 포함하는 시료를 첨가한다. 이어, 1차 항체를 인식하고 알칼라인 포스파타아제 등의 효소로 표지된 2차 항체를 첨가하고 플레이트를 배양한다. 그 후 세정하고 p-니트로페닐인산 등의 효소 기질을 플레이트에 첨가하고 시료의 항원결합 활성을 평가하기 위한 흡광도를 측정한다. C 말단 단편 또는 N 말단 단편 같은 폴리펩티드의 단편을 항체 결합활성을 평가하기 위한 항원으로서 이용하여도 좋다. BIAcore(Pharmacia)를 본 발명에 의한 항체의 활성의 평가에 이용하여도 좋다.
이상의 방법은 본 발명의 항체를, 본 발명의 폴리펩티드를 포함한다고 예상되는 시료에 대하여 노출시켜 항체 및 폴리펩티드에 의하여 형성된 면역복합체를 검출 또는 측정하여 본 발명의 폴리펩티드의 검출 또는 측정을 가능하게 한다.
본 발명에 의한 폴리펩티드의 검출 또는 측정 방법은 폴리펩티드를 특이적으로 검출 또는 측정하는 것이 가능하기 때문에 본 방법은 폴리펩티드가 이용되는 각종 실험에 유용하다고 생각된다.
본 발명은 또한, 사람 CXADRL1, GCUD1 또는 RNF43 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드（서열번호：1, 3 또는 5）또는 그 상보 사슬과 혼성화하고 적어도 15 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티도 제공한다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 폴리펩티드를 코드하는 DNA와 특이적으로 혼성화하는 폴리뉴클레오티드인 것이 바람직하다. 본 명세서에서 사용하는 「특이적으로 혼성화한다」라는 용어는 다른 단백질을 코드하는 DNA와의 크로스 혼성화가 통상의 혼성화 조건하에서, 바람직하게는 엄격한 혼성화 조건하에서 현저하게 일어나지 않는 것을 의미한다. 이러한 폴리뉴클레오티드에는 본 발명의 폴리펩티드를 코드하는 DNA 또는 그 상보 사슬과 특이적으로 혼성화하는 프로브, 프라이머, 뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유도체(예, 안티센스 올리고 뉴클레오티드 및 리보자임)가 포함된다. 나아가 이러한 폴리뉴클레오티를 DNA 칩의 제조를 위하여 이용할 수 있다.
본 발명은 서열번호：1, 3 또는 5의 뉴클레오티드 서열 내부의 어느 부위와 혼성화하는 안티센스 올리고 뉴클레오티드를 포함한다. 이 안티센스 올리고 뉴클레오티드는 서열번호：1, 3 또는 5의 뉴클레오티드 서열 중 15 개의 연속한 뉴클레오티드에 대한 것이 바람직하다. 상기의 적어도 15 개의 연속한 뉴클레오티드 중에 1개의 개시 코돈을 포함하는 상기 안티센스 올리고 뉴클레오티드는 더욱 바람직하다. 보다 구체적으로 기술하면, 이러한 안티센스 올리고 뉴클레오티드에는 CXADRL1의 발현을 억제하는 목적으로 서열번호：23 또는 25의 뉴클레오티드 서열을； GCUD1의 경우에는 서열번호：27 또는 29 의 뉴클레오티드 서열을； RNF43 의 경우에는 서열번호：31 의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것이 포함된다.
안티센스 올리고 뉴클레오티드의 유도체 또는 수식 산물을 안티센스 올리고 뉴클레오티드로서 이용할 수도 있다. 이러한 수식 산물(modification product)의 예로는 메틸포스포네이트 형 또는 에틸포스포네이트 형 등의 저급 알킬포스포네이트 수식물, phosphorothioate 수식물 및 phosphoroamidate 수식물이 포함된다.
본 명세서에서 이용되는 「안티센스 올리고 뉴클레오티드」라는 용어는 DNA또는 mRNA의 특정 영역을 구성하는 것에 대응하는 뉴클레오티드가 완전하게 상보적인 것만이 아니라, 1개 또는 복수의 뉴클레오티드에 미스매치가 있는 것도 그 DNA또는 mRNA 및 안티센스 올리고 뉴클레오티드가 서열번호：1, 3 또는 5의 뉴클레오티드 서열과 특이적으로 혼성화 할 수 있는 한 포함된다.
이러한 폴리뉴클레오티드에는 「적어도 15 개의 연속한 뉴클레오티드 서열의 영역」내에 적어도 70％ 또는 그 이상, 바람직하게는 80％ 또는 그 이상, 보다 바람직하게는 90％ 또는 그 이상, 더욱 바람직하게는 95％ 또는 그 이상의 상동성을 가지는 것이 포함된다. 상동성의 결정에는 본 명세서에 기술하는 알고리즘을 이용할 수 있다. 이러한 폴리뉴클레오티는 이하의 실시예의 항목에서 기술하는 바와 같이 본 발명의 폴리펩티드를 코드하는 DNA의 단리 혹은 검출을 위한 프로브로서, 또는 증폭용의 프라이머로서 유용하다.
본 발명의 안티센스 올리고 뉴클레오티드 유도체는 폴리펩티드를 코드하는 DNA 또는 mRNA와 결합하여 그 전사 또는 번역을 저해하고 mRNA의 분해를 촉진하여 본발명의 폴리펩티드의 발현을 억제하고 이에 의하여 폴리펩티드의 기능을 저해함으로써 본 발명의 폴리펩티드를 생산하는 세포에 대하여 작용한다.
본 발명의 안티센스 올리고 뉴클레오티드 유도체는 유도체에 대한 활성이 없는 적절한 기재(基材)와 혼합하여 바르는 제제 또는 습포제 등의 외용제의 형태로 할 수 있다.
마찬가지로 필요에 따라서, 유도체를, 부형제, 등장제, 용해 보조제, 안정제, 보존제, 진통제 등을 첨가하는 것으로써, 정제, 분제, 과립제, 캅셀제, 리포좀캅셀제, 주사제, 물약, 점비약 및 동결건조 제재로서 제재화할 수도 있다. 이것들은 통상의 방법에 따라 조제 가능하다.
안티센스 올리고 뉴클레오티드 유도체는 이환 부위(ailing site)에 대해서 직접 외용하거나 또는 그것이 이환 부위에 도달하도록 혈관내에 주입하여 환자에 투여된다. 지속성 및 막투과성을 높이기 위해서 안티센스용 마운트 배지를 이용할 수도 있다. 그 예에는, 리포좀, 폴리-L-리신, 지방질, 콜레스테롤, 리포펙틴 또는 이들 유도체가 있다.
본 발명의 안티센스 올리고 뉴클레오티드 유도체의 투여량은, 환자 상태에 따라 적절히 조정한 다음, 바람직한 양을 이용할 수 있다. 예를 들면, 0.1~100 mg/kg, 바람직하게는 0.1~50 mg/kg의 범위의 용량을 투여할 수 있다.
본 발명은 또, 서열번호：1, 3, 또는 5의 뉴클레오티드 서열의 센스 사슬 핵산 및 안티센스 사슬 핵산의 편성을 포함한, 저분자 간섭 RNA(siRNA)도 포함한다. 보다 구체적으로 기술하면, RNF43의 발현을 억제하기 위한 이런 종류의 siRNA에는, 센스 사슬에 서열번호：40, 41, 42, 또는 43의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것이 포함된다. 또, CXADRL1의 발현을 억제하기 위한 siRNA에는, 센스 사슬에 서열번호：62 또는 63의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것이 포함된다.
「siRNA」라고 하는 용어는, 표적 mRNA의 번역을 방해하는 이중 사슬 RNA 분자를 가리킨다. siRNA를 세포에 도입하기 위해서는, RNA를 전사하기 위한 주형으로서 DNA를 이용하는 것을 포함한, 표준적인 기법이 이용된다. siRNA는, 사람 CXADRL1, GCUD1 또는 RNF43 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드(서열번호：1, 3 또는 5)의 센스 핵산 서열 및 안티센스 핵산 서열을 포함한다. siRNA는 예를 들면, 머리핀과 같이 단일의 전사물(이중 사슬 RNA)이 표적 유전자 유래의 센스 서열 및 상보적 안티센스 서열의 양쪽 모두를 가지도록 구축된다.
본 방법은, 세포의 유전자 발현, 즉, 예를 들면 세포의 악성 변환의 결과로서, 상향 조절되고 있는 CXADRL1, GCUD1 또는 RNF43의 발현을 변화시키기 위해서 이용된다. 표적 세포에 있어서의 siRNA와 CXADRL1, GCUD1 또는 RNF43 전사물과의 결합은 세포에 의한 단백질 생합성의 감소를 유발한다. 올리고 뉴클레오티드의 길이는 적어도 10 뉴클레오티드이며, 천연의 전사물 정도의 길이일 수 있다. 올리고 뉴클레오티드가 19~25 뉴클레오티드 길이인 것이 바람직하고 가장 바람직하게는, 75, 50, 25 뉴클레오티드 이하의 길이이다. 포유동물 세포에 있어서의 발현을 저해하는 CXADRL1, GCUD1 또는 RNF43 siRNA 올리고 뉴클레오티드의 예에는, 서열번호：112~114의 어떤 것을 포함한 올리고 뉴클레오티드가 포함된다. 이러한 서열은 각각 이하 siRNA 서열의 표적서열이다：
　 서열번호：112, 서열번호：40, 41(RNF43)；
　 서열번호：113, 서열번호：42, 43(RNF43)；및
서열번호：114, 서열번호：62, 63(CXADRL1).
siRNA의 뉴클레오티드 서열은, Ambion사의 웹 사이트(http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html)로부터 입수할 수 있는 siRNA 설계용의 컴퓨터 프로그램을 이용해 설계할 수 있다. siRNA에 대한 뉴클레오티드 서열은, 컴퓨터 프로그램에 의하여 이하의 프로토콜에 근거하여 선택된다.
siRNA 표적 부위의 선택：
1. 목적 전사물의 AUG 개시 코돈으로부터 시작하여 AA 디뉴클레오티드 서열에 관해서 하류로 스캔한다. 각 AA 및 3'측에 인접한 19 뉴클레오티드의 출현율을 siRNA 표적의 가능성이 있는 부위로서 기록한다. Tuschl 등은, siRNA를 5' 및 3' 비번역 영역(UTR) 및 개시 코돈 부근(75 염기내)의 영역에 대해서는 설계하지 않도록 추천하고 있으며 이것은, 이러한 영역에는 조절 단백질의 결합 부위가 많이 포함될 가능성이 있기 때문에 있다. UTR 결합 단백질 및/또는 번역 개시 복합체는, siRNA 엔도뉴클레아제 복합체의 결합을 방해할 가능성이 있다.
2. 잠재적 표적 부위를 인간 게놈 데이타베이스와 비교하여 다른 코드 서열과 분명한 상동성을 가지는 어느 표적 영역도 검토로부터 제외한다. 상동성 검색은 BLAST를 이용해 실시할 수 있으며 이것은 NCBI의 서버：www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/에 있다.
3. 합성용으로 적격인 표적 서열을 선택한다. Ambion사에서는, 유전자의 전체 길이에 따라 몇개의 표적 서열을 평가용으로 선택할 수 있다.
본 발명의 안티센스 올리고 뉴클레오티드 또는 siRNA는 본 발명의 폴리펩티드의 발현을 저해하고 그 때문에, 본 발명의 폴리펩티드의 생물학적 활성을 억제하는데 유용하다. 마찬가지로 본 발명의 안티센스 올리고 뉴클레오티드 또는 siRNA를 포함한 발현 저해 물질도, 그들이 본 발명의 폴리펩티드의 생물학적 활성을 저해할 수 있다고 하는 점에서 유용하다. 이 때문에, 본 발명의 안티센스 올리고 뉴클레오티드 또는 siRNA를 포함한 조성물은 암 등의 세포 증식성 질환의 치료에 유용하다.
또한, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드의 발현 레벨을 진단 마커로서 이용하여 세포 증식성 질환을 진단하기 위한 방법도 제공한다.
이 진단 방법은, (a) 본 발명의 CXADRL1, GCUD1 또는 RNF43 유전자의 발현 레벨을 검출하는 단계 및 (b) 발현 레벨의 상승을 암 등의 세포 증식성 질환과 관련 짓는 단계를 포함한다.
개개의 표본에 있어서의 CXADRL1, GCUD1 또는 RNF43 유전자의 발현 레벨은, CXADRL1, GCUD1 혹은 RNF43 유전자에 대응하는 mRNA, 또는 CXADRL1, GCUD1 혹은 RNF43 유전자에 의해 코드되는 단백질을 정량하는 것에 의해 평가할 수 있다. mRNA의 정량법은 당업자에게 주지하다. 예를 들면, CXADRL1, GCUD1 또는 RNF43 유전자에 대응하는 mRNA의 레벨은 노던블롯 분석 또는 RT-PCR에 의해 평가할 수 있다. CXADRL1, GCUD1 또는 RNF43 유전자의 전체 뉴클레오티드 서열은 서열번호：1, 3 또는 5에 나타나고 있기 때문에, 당업자는 모두 CXADRL1, GCUD1 또는 RNF43 유전자를 정량하기 위한 프로브 또는 프라이머의 뉴클레오티드 서열을 설계할 수 있다.
CXADRL1, GCUD1, 또는 RNF43 유전자의 발현 레벨도 유전자에 의해 코드되는 단백질의 활성 또는 양에 근거해 분석할 수 있다. CXADRL1, GCUD1 또는 RNF43 단백질의 정량방법은 이하에 나타나고 있다. 예를 들면, 면역에세이법(immunoassay)은 생물 재료에 있어서의 단백질의 결정에 유용하다. 어떠한 생물학적 재료도, 단백질 또는 그 활성의 결정에 유용할 수 있다. 예를 들면, 혈액 시료는 혈청 마커에 의해 코드되는 단백질의 평가를 목적으로 분석된다. 한편, CXADRL1, GCUD1, 또는 RNF43 유전자에 의해 코드되는 단백질의 활성을 결정하기 위해서는, 분석하려고 하는 각 단백질의 활성에 상응하여 적합한 방법이 선택될 수 있다.
표본(피험시료)에 있어서의 CXADRL1, GCUD1 또는 RNF43 유전자의 발현 레벨을 평가하여 정상 시료에 있어서의 발현 레벨과 비교한다. 이러한 비교에 의해 표적 유전자의 발현 레벨이 정상 시료에 있어서의 발현 레벨보다 높게 나타났을 경우에는, 그 대상은 세포 증식성 질환으로 이환(affected)하고 있다고 판단한다. 정상 시료 유래 및 대상 유래의 표본에 있어서의 CXADRL1, GCUD1 또는 RNF43 유전자의 발현 레벨을 동시에 결정해도 된다. 또는, 미리 대조군으로부터 채취해 둔 표본의 유전자 발현 레벨을 분석하는 것으로 얻은 결과에 근거하는 통계학적 방법에 따라, 발현 레벨의 정상 범위를 결정할 수도 있다. 대상의 시료를 비교하여 얻은 결과를 그 정상 범위와 비교하여 그 결과가 정상 범위내에 들어가지 않는 경우에는, 대상은 세포 증식성 질환에 이환하고 있다고 판단한다. 본 발명에 있어서 진단하려고 하는 세포 증식성 질환은, 바람직하게는 암이다. 보다 바람직하게는, CXADRL1 또는 GCUD1 유전자의 발현 레벨을 평가하여 정상 시료에 있어서의 것과 비교하는 경우, 진단 대상 세포 증식성 질환은 위암, 결장 직장암 또는 간암이고 RNF43 유전자를 그 발현 레벨에 관해서 평가하는 경우에는, 진단 대상 질환은 결장직장암, 폐암, 위암, 또는 간암이다.
본 발명에 있어서는, 위암, 결장 직장암, 폐암 및 간암을 포함하는 암 등의 세포 증식성 질환을 진단하기 위한 진단약도 제공한다. 본 발명의 진단약은, 본 발명의 폴리 뉴클레오티드 또는 폴리펩티드와 결합하는 화합물을 포함한다. 본 발명의 폴리 뉴클레오티드와 하이브리다이즈 하는 올리고 뉴클레오티드, 또는 본 발명의 폴리펩티드와 결합하는 항체를 이러한 화합물로서 이용하는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드를 이용하는, 세포 증식성 질환을 치료하기 위한 화합물의 스크리닝 방법을 제공한다. 이 스크리닝 방법의 하나의 태양에는 (a) 피험화합물을 본 발명의 폴리펩티드와 접촉시키는 단계, (b) 본 발명의 폴리펩티드와 피험화합물과의 결합활성을 검출하는 단계, 및 (c) 본 발명의 폴리펩티드와 결합하는 화합물을 선택하는 단계가 포함된다.
스크리닝에 이용하는 본 발명의 폴리펩티드는 재조합 폴리펩티드여도, 천연의 단백질이어도 되고 또는 이들의 부분 펩티드이어도 좋다. 임의의 피험화합물, 예를 들면, 세포 추출물, 세포 배양상청, 발효성 미생물의 산물, 해양생물로부터의 추출물, 식물 추출물, 정제 단백질 또는 정제하지 않은 단백질, 펩티드, 비펩티드 화합물, 합성 마이크로 분자 화합물(synthetic micromolecular compound) 및 천연화합물을 이용할 수 있다. 피험화합물과 접촉시키는 본 발명의 폴리펩티드는 예를 들면, 정제 폴리펩티드, 가용성 단백질, 담체와 결합한 형태 또는 다른 폴리펩티드와 융합한 융합단백질일 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드를 이용하여 단백질, 예를 들면 본 발명의 폴리펩티드와 결합하는 단백질을 스크리닝 하는 방법으로서는, 당업자에게 주지한 방법을 이용할 수 있다. 이러한 스크리닝은 예를 들면, 면역침강법에 의해 구체적으로는 이하의 양상으로 실시할 수 있다. pSV2neo, pcDNAI 및 pCD8 라고 하는 외래 유전자용 발현 벡터에 대해서 유전자를 삽입하여 본 발명의 폴리펩티드를 코드하는 유전자를 동물세포 등에서 발현시킨다. 발현을 위해서 이용하는 프로모터는 일반적으로 이용할 수 있는 임의의 프로모터로서 이에는 예를 들면, SV40 초기 프로모터(Rigby, Williamson(편), 「Genetic Engineering) 제3권, Academic Press, London, 83-141 (1982)), EF-1α프로모터 (Kim 등, Gene 91: 217-23 (1990)), CAG 프로모터(Niwa 등, Gene 108: 193-200 (1991)), RSV LTR 프로모터(Cullen, Methods in Enzymology 152: 684-704 (1987)), SRα프로모터 (Takebe 등, Mol Cell Biol 8: 466 (1988)), CMV 최초기 프로모터(immediately early promoter) (Seed 및 Aruffo, Proc Natl Acad Sci USA 84: 3365-9 (1987)), SV40 후기 프로모터(Gheysen 및 Fiers, J Mol Appl Genet 1: 385-94 (1982)), 아데노바이러스 후기 프로모터(Kaufman 등, Mol Cell Biol 9: 946 (1989)), HSV TK 프로모터 등이 포함된다. 외래 유전자를 발현시키기 위한 동물세포로의 유전자의 도입은 임의의 방법에 따라 실시할 수가 있으며 이에는 예를 들면, 전기천공법(Chu 등, Nucleic Acids Res 15: 1311-26 (1987)), 인산 칼슘법(Chen 및 Okayama, Mol Cell Biol 7: 2745-52 (1987)), DEAE 덱스트란 방법(Lopata 등, Nucleic Acids Res 12: 5707-17 (1984)；Sussman 및 Milman, Mol Cell Biol 4: 1642-3 (1985)), 리포법펙틴법(Derijard, B Cell 7: 1025-37 (1994)；Lamb 등, Nature Genetics 5: 22-30 (1993)：Rabindran등, Science 259: 230-4 (1993))등이 있다. 본 발명의 폴리펩티드는, 본 발명의 폴리펩티드의 N 말단 또는 C 말단에, 특이성이 판명된 단일 클론 항체의 에피토프를 도입하는 것으로써, 단일 클론 항체의 인식 부위(에피토프)를 포함한 융합 단백질로서 발현시킬 수 있다. 시판되고 있는 에피토프 항체 시스템을 이용할 수도 있다(Experimental Medicine 13: 85-90 (1995)). 예를 들면 β갈락토시다아제, 말토스 결합 단백질, 글루타치온 S-트랜스퍼라제, 녹색 형광 단백질(GFP)등과의 융합 단백질을, 멀티클로닝 사이트를 이용하는 것에 의해 발현시킬 수 있는 벡터가 시판되고 있다.
융합에 의해 본 발명의 폴리펩티드의 성질을 바꾸지 않도록 몇 개~수십 개의 아미노산으로 구성되는 작은 에피토프만을 도입하는 것에 의해 제작된 융합 단백질도 보고되고 있다. 폴리 히스티딘(His 태그), 인플루엔자 응집소 HA, 사람 c-myc, FLAG, 수포성 구내염 바이러스 당단백질(VSV-GP), T7 유전자 10 단백질(T7 태그), 사람 단순 포진 바이러스 당단백질(HSV 태그), E 태그(모노클로날 파지(phage) 상의 에피토프)등의 에피토프, 및 그것들을 인식하는 단일 클론 항체를, 본 발명의 폴리펩티드와 결합하는 단백질의 스크리닝을 위한 에피토프 항체 시스템으로서 이용할 수 있다(Experimental Medicine 13: 85-90 (1995)).
면역침강의 경우에는, 적절한 계면활성제를 이용하여 조제한 세포 lysate에 이러한 항체를 첨가하여 면역 복합체를 형성시킨다. 면역 복합체는, 본 발명의 폴리펩티드, 그 폴리펩티드와의 결합능이 있는 폴리펩티드 및 항체로 구성된다. 상기 에피토프에 대한 항체를 이용하는 것에 가세하여 면역침강을 본 발명의 폴리펩티드에 대한 항체를 이용해 실시할 수도 있으며 이러한 항체는 상기한 대로 제조할 수 있다.
면역복합체는, 항체가 마우스 IgG 항체이면, 예를 들면 프로테인 A 세파로스 또는 프로테인 G 세파로스에 의해 침강시킬 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드를 GST등의 에피토프와의 융합 단백질로서 제작하는 경우에는, 이러한 에피토프와 특이적으로 결합하는 기질, 예를 들면 글루타치온-세파로스 4 B를 이용하여 본 발명의 폴리펩티드에 대한 항체를 이용할 때와 같은 양상으로 면역 복합체를 형성시킬 수 있다.
면역침강은, 예를 들면, 문헌 중에 기재된 방법에 의하거나 모방하여 실시할 수 있다(Harlow 및 Lane, 「Antibodies), 511-52, Cold Spring Harbor Laboratory publications, New York (1988)).
SDS-PAGE는 면역침강한 단백질의 분석에 일반적으로 이용되고 있으며 결합한 단백질은 젤을 적절한 농도로 이용해 단백질의 분자량에 의해 분석할 수가 있다. 본 발명의 폴리펩티드와 결합한 단백질을 쿠마시 염색 또는 은 염색등의 일반적인 염색법에 따라 검출하는 것은 곤란하기 때문에, 단백질에 대한 검출 감도는, 방사성 동위체인 35 S-메티오닌 또는 35 S-시스테인을 포함한 배양액 중에서 세포를 배양하여 세포내의 단백질을 표지한 다음 단백질을 검출하는 것에 의해 개선할 수가 있다. 단백질의 분자량을 알 수 있고 있는 경우에는, 표적 단백질을 SDS-폴리아크릴 아미드젤로부터 직접 정제하여 그 서열을 결정할 수 있다.
폴리펩티드를 이용하는, 본 발명의 폴리펩티드와 결합하는 단백질의 스크리닝을 위한 방법으로서 예를 들면, 웨스트-웨스턴 블롯 분석(Skolnik 등, Cell 65: 83-90 (1991))를 이용할 수 있다. 구체적으로는, 본 발명의 폴리펩티드와 결합하는 단백질은, 세포, 조직, 장기(예를 들면, CXADRL1에 결합하는 단백질의 스크리닝을 위해서는 정소 및 난소；GCUD1와 결합하는 단백질의 스크리닝을 위해서는 정소, 난소 및 뇌；및, RNF43와 결합하는 단백질의 스크리닝을 위해서는 태아 폐 및 태아 신장 등의 조직) 또는 본 발명의 폴리펩티드와 결합하는 단백질을 발현한다고 예상되는 배양 세포로부터, 파지 벡터(예를 들면, ZAP)를 이용하여 cDNA 라이브러리를 제작하고 단백질을 LB-아가로스 상에서 발현시킨 후 발현한 단백질을 필터상에 고정하고 정제 및 표지가 된 본 발명의 폴리펩티드를 상기의 필터와 반응시킴으로써, 또한 본 발명의 폴리펩티드와 결합한 단백질을 발현하는 플라크(plaque)를 표지에 의해 검출함으로써 얻을 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드는, 비오틴과 아비딘과의 결합을 이용하거나 또는 본 발명의 폴리펩티드와 특이적으로 결합하는 항체, 혹은 본 발명의 폴리펩티드와 융합한 펩티드 혹은 폴리펩티드(예를 들면, GST)를 이용하여 표지할 수 있다. 방사성 동위체 또는 형광 등을 이용하는 방법을 이용해도 좋다.
또는, 본 발명의 스크리닝 방법의 또다른 하나의 실시태양은 세포를 이용하는 2-하이브리드 (hybrid) 시스템이다(「MATCHMAKER 2-하이브리드(hybrid)계(MATCHMAKER Two-Hybrid system)), 「포유동물 MATCHMAKER 2-하이브리드 에세이 키트(Mammalian MATCHMAKER Two-Hybrid Assay Kit)), 「MATCHMAKER 1-하이브리드(hybrid)계(MATCHMAKER one-Hybrid system))(Clonetech)；「HybriZAP 2-하이브리드(hybrid) 벡터계(HybriZAP Two-Hybrid Vector System))(Stratagene)；참고문헌 「Dalton 및 Treisman, Cell 68: 597-612 (1992)), 「Fields 및 Sternglanz, Trends Genet 10: 286-92 (1994)).
2-하이브리드(hybrid) 시스템에서는, 본 발명의 폴리펩티드를 SRF 결합 영역 또는 GAL4 결합 영역과 융합시켜 효모 세포에서 발현시킨다. 본 발명의 폴리펩티드와 결합하는 단백질을 발현한다고 예상되는 세포로부터, 라이브러리가 발현했을 경우에 VP16 또는 GAL4 전사 활성화 영역과 융합되도록 cDNA 라이브러리를 작성한다. 그리고나서 cDNA 라이브러리를 상기의 효모 세포에 도입하여 검출된 양성 클론으로부터 라이브러리에서 유래하는 cDNA를 단리한다(본 발명의 폴리펩티드와 결합하는 단백질을 효모 세포에서 발현시키는 경우에는, 이 둘의 결합에 의해 리포터 유전자가 활성화 되어 양성 클론이 검출되게 된다). cDNA에 의해 코드되는 단백질은, 이상과 같이 단리한 cDNA를 대장균에 도입하여 단백질을 발현시킴으로써 제조할 수 있다.
리포터 유전자로서는 HIS3 유전자 외에 예를 들면, Ade2 유전자, lacZ 유전자, CAT 유전자, 루시페라제 유전자 등을 이용할 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드와 결합하는 화합물을, 친화성 크로마토그래피를 이용하여 스크리닝할 수도 있다. 예를 들면, 본 발명의 폴리펩티드를 친화성 컬럼의 담체상에 고정화하고 본 발명의 폴리펩티드와 결합할 수 있는 단백질을 포함한 피험화합물을 컬럼에 적용할 수 있다. 본 명세서에 있어서의 피험화합물은, 예를 들면, 세포추출물, 세포 lysate 등이어도 좋다. 피험화합물의 로딩 후에 컬럼을 세정하고 본 발명의 폴리펩티드와 결합한 화합물을 얻을 수 있다.
피험화합물이 단백질인 경우에는, 얻어진 단백질의 아미노산 서열을 분석하고 그 서열에 근거하여 올리고 DNA를 합성하고 그 올리고 DNA를, 단백질을 코드하는 DNA를 얻기 위한 프로브로서 이용하여 cDNA 라이브러리를 스크리닝 한다.
표면 플라즈몬 공명 현상(surface plasmon resonance phenomenon) 을 이용하는 바이오센서를, 결합한 화합물의 검출 또는 정량을 위한 수단으로서 본 발명에 이용할 수도 있다. 이러한 바이오센서를 이용하면, 표지하지 않은 매우 미량의 폴리펩티드 만을 이용하여 본 발명의 폴리펩티드와 피험화합물과의 상호작용을 표면 플라즈몬 공명 시그널로서 실시간으로 관찰할 수 있다(예를 들면, BIAcore, Pharmacia). 이 때문에, BIAcore 등의 바이오센서를 이용하여 본 발명의 폴리펩티드와 피험화합물과의 결합을 평가하는 것이 가능하다.
본 발명의 고정화된 폴리펩티드를 합성 화합물, 또는 천연물 뱅크, 또는 랜덤 파지 펩티드 디스플레이 라이브러리에 대해서 노출시켰을 경우에 결합하는 분자를 스크리닝 하는 방법 및 본 발명의 단백질과 결합하는 단백질 뿐만이 아니라 화합물(안타고니스트를 포함한다)도 단리하기 위한 combinatorial 화학에 근거하는 high throughput 기법을 이용한 스크리닝 방법(Wrighton 등, Science 273: 458-64 (1996)；Verdine, Nature 384: 11-13 (1996)；Hogan, Nature 384: 17-9 (1996))은 당업자에게 주지하다.
또는, 본 발명의 스크리닝 방법은,
a) 후보 화합물을, 1개 또는 복수의 마커 유전자의 전사 조절 영역 및 전사 조절 영역의 제어하에서 발현되는 리포터 유전자를 포함한 벡터가 도입된 세포와 접촉시키는 단계(이때, 1개 또는 복수의 마커 유전자는 CXADRL1, GCUD1 및 RNF43로 구성되는 군으로부터 선택된다)；
b) 상기 리포터 유전자의 활성을 측정하는 단계；및
c) 상기 리포터 유전자의 발현 레벨을 대조구와 비교하여 저하시키는 화합물을 선택하는 단계를 포함할 수 있다.
적합한 리포터 유전자 및 숙주세포는 당해 기술 분야에서 주지하다. 스크리닝을 위해서 필요한 리포터 구축물은, 마커 유전자의 전사 조절 영역을 이용하는 것에 의해 제작할 수 있다. 마커 유전자의 전사 조절 영역이 당업자에게 알려져 있는 경우에는, 사전 서열정보를 이용하여 리포터 구축물을 제작할 수 있다. 마커 유전자의 전사 조절 영역이 아직 확인되어 있지 않은 경우에는, 전사 조절 영역을 포함한 뉴클레오티드 세그먼트(segment)를 마커 유전자의 뉴클레오티드 서열정보에 근거하여 게놈 라이브러리로부터 단리할 수 있다.
이 스크리닝에 의해 단리되는 화합물은, 예를 들면, 암 등의 세포증식성 질환에 기인하는 질환의 치료 또는 예방을 목적으로 하는 본 발명의 폴리펩티드의 활성을 저해하는 약제의 후보이다. 본 발명의 폴리펩티드에 대한 결합 활성을 가지는, 본 스크리닝 방법에 따라 얻어진 화합물의 구조의 일부가 부가, 결실 및/또는 치환에 의해 변형된 화합물은, 본 발명의 스크리닝 방법에 따라 얻어진 화합물에 포함된다.
또다른 하나의 태양에 있어서 본 발명은, 세포 증식성 질환의 치료에 대해 표적이 될 가능성이 있는 후보 물질을 스크리닝하기 위한 방법을 제공한다. 상기에서 상세하게 고찰한 것처럼, CXADRL1, GCUD1, 또는 RNF43의 발현 레벨을 제어하여 위암, 또는 결장 직장암, 폐암, 위암, 혹은 간암의 발증 또는 진행을 제어하는 것이 가능하다. 이 때문에, 세포 증식성 질환의 치료에 있어서의 표적의 가능성이 있는 후보 물질을, CXADRL1, GCUD1, 또는 RNF43의 발현 레벨 및 활성을 지표로서 이용하는 스크리닝에 의해 확인할 수 있다. 본 발명에 있어 이러한 스크리닝에는, 예를 들면,
a) 후보 화합물을, CXADRL1, GCUD1, 또는 RNF43를 발현하는 세포와 접촉시키는 단계；및
b) CXADRL1, GCUD1, 또는 RNF43의 발현 레벨을, 피험화합물의 비존재하에서 검출되는 발현 레벨과 비교하여 저하시키는 화합물을 선택하는 단계가 포함될 수 있다.
CXADRL1, GCUD1 또는 RNF43의 적어도 하나를 발현하는 세포에는, 예를 들면, 위암, 결장 직장암, 폐암, 또는 간암으로 수립된 세포주가 포함되는데 이러한 세포는 본 발명의 상기의 스크리닝을 위해서 이용할 수 있다. 발현 레벨은 당업자에게 주지한 방법에 따라 평가할 수 있다. 이 스크리닝 방법에서는, CXADRL1, GCUD1, 또는 RNF43의 적어도 하나의 발현 레벨을 저하시키는 화합물을 후보 약제로서 선택할 수 있다.
본 발명의 세포 증식성 질환을 치료하기 위한 화합물의 스크리닝 방법의 또다른 하나의 태양에 있어, 본 방법은 본 발명의 폴리펩티드의 생물학적 활성을 지표로서 이용한다. 본 발명의 CXADRL1, GCUD1 및 RNF43 단백질은 세포 증식을 촉진하는 활성을 가지기 때문에, 본 발명의 이들 단백질의 활성을 저해하는 화합물을, 이 활성을 지표로서 이용하여 스크리닝 할 수 있다. 이 스크리닝 방법은, (a) 피험화합물을 본 발명의 폴리펩티드와 접촉시키는 단계, (b) 단계 (a)의 폴리펩티드의 생물학적 활성을 검출하는 단계, 및 (c) 피험화합물의 비존재하에서 검출되는 생물학적 활성과 비교하여 폴리펩티드의 생물학적 활성을 억제하는 화합물을 선택하는 단계를 포함한다.
어떠한 폴리펩티드도, 그것이 CXADRL1, GCUD1 또는 RNF43 단백질의 생물학적 활성을 가지는 한, 스크리닝에 이용할 수 있다. 이러한 생물학적 활성에는, 사람 CXADRL1, GCUD1 또는 RNF43 단백질의 세포 증식 활성, RNF43의 NOTCH2 또는 STRIN와 결합하는 활성이 포함된다. 예를 들면, 사람 CXADRL1, GCUD1 또는 RNF43 단백질 또는 이러한 단백질과 기능적으로 동등한 폴리펩티드를 이용할 수도 있다. 이러한 폴리펩티드는 세포에서 내인성으로 발현시켜도, 외인성으로 발현시켜도 좋다.
임의의 피험화합물, 예를 들면, 세포 추출물, 세포 배양상청, 발효성 미생물의 산물, 해양생물의 추출물, 식물 추출물, 정제 단백질 또는 정제되지 않은 단백질, 펩티드, 비펩티드 화합물, 합성 마이크로 분자 화합물, 천연 화합물을 이용할 수 있다.
이 스크리닝에 의해 단리되는 화합물은, 본 발명의 폴리펩티드의 안타고니스트의 후보이다. 「안타고니스트」라고 하는 용어는, 본 발명의 폴리펩티드와의 결합에 의해 그 폴리펩티드의 기능을 저해하는 분자를 가리킨다. 또한, 이 스크리닝에 의해 단리되는 화합물은, 본 발명의 폴리펩티드와 분자(DNA 및 단백질을 포함한다)와의 인비보 상호작용을 저해하는 화합물의 후보이기도 하다.
본방법에 있어서 검출하려고 하는 생물학적 활성이 세포 증식인 경우에는, 실시예의 항목에 기재한 것처럼, 예를 들면, 본 발명의 폴리펩티드를 발현하는 세포를 제작하고 세포를 피험화합물의 존재하에서 배양하여 세포 증식의 속도를 평가하며 세포 주기 등을 측정하는 것으로써, 또한 콜로니 형성 활성을 측정하는 것으로써, 생물학적 활성을 검출할 수가 있다.
상기의 스크리닝에 의해 단리되는 화합물은, 본 발명의 폴리펩티드의 활성을 저해하는 약제의 후보이며, 본 발명의 폴리펩티드와 관련이 있는 질환, 예를 들면, 암을 포함한 세포 증식성 질환의 치료에 응용할 수 있다. 보다 구체적으로 기술하면, CXADRL1 또는 GCUD1 단백질의 생물학적 활성을 지표로서 이용하는 경우에는, 본방법에 따라 스크리닝된 화합물은 위암, 결장 직장암 또는 간암의 치료를 위한 약제의 후보가 되며 한편, RNF43 단백질의 생물학적 활성을 지표로서 이용하는 경우에는, 본방법에 따라 스크리닝된 화합물은 결장 직장암, 폐암, 위암, 또는 간암의 치료를 위한 약제의 후보가 된다.
게다가 CXADRL1, GCUD1, 또는 RNF43 단백질의 활성을 저해하는 화합물의 구조의 일부가 부가, 결실 및/또는 치환에 의해 변형된 화합물도, 본 발명의 스크리닝 방법에 따라 얻을 수 있는 화합물에 포함된다.
본 발명의 세포 증식성 질환을 치료하기 위한 화합물의 스크리닝 방법의 또다른 하나의 태양에 있어서 본 방법은, RNF43의 NOTCH2 또는 STRIN와의 결합능을 이용한다. 본 발명의 RNF43 단백질은 NOTCH2 및 STRIN와 회합(associate)하는 것이 판명되었다. 이러한 소견은, 본 발명의 RNF43 단백질이 NOTCH2 및 STRIN 등의 분자와의 결합을 개입시켜 세포 증식의 기능을 발휘하는 것을 시사한다. 이 때문에, RNF43 단백질과 NOTCH2 또는 STRIN와의 결합을 저해하는 것에 의해 세포 증식의 저해가 초래되어 이 결합을 저해하는 화합물은 암 등의 세포 증식성 질환을 치료하기 위한 조제약으로서 기여할 수 있을 것으로 예상된다. 본방법에 따라 스크리닝된 화합물에 의해 치료되는 세포 증식성 질환은, 바람직하게는 결장 직장암, 폐암, 위암, 또는 간암이다.
이 스크리닝 방법은, (a) 피험화합물의 존재하에서 본 발명의 폴리펩티드를 NOTCH2 또는 STRIN와 접촉시키는 단계, (b) 폴리펩티드와 NOTCH2 또는 STRIN와의 결합을 검출하는 단계, 및 (c) 폴리펩티드와 NOTCH2 또는 STRIN와의 결합을 저해하는 화합물을 선택하는 단계를 포함한다.
이 스크리닝에 이용되는 본 발명의 RNF43 폴리펩티드 및 NOTCH2 또는 STRIN는, 재조합 폴리펩티드, 천연의 단백질 또는, 이들의 부분 펩티드여도 상호의 결합능을 유지하고 있는 한 상관없다. 스크리닝에 이용되는 RNF43 폴리펩티드, NOTCH2 또는 STRIN는, 예를 들면, 정제 폴리펩티드, 가용성 단백질, 담체와 결합한 형태, 또는 다른 폴리펩티드와 융합한 융합 단백질일 수 있다.
임의의 피험화합물, 예를 들면, 세포 추출물, 세포 배양상청, 발효성 미생물의 산물, 해양생물로부터의 추출물, 식물 추출물, 정제 단백질 또는 정제하지 않은 단백질, 펩티드, 비펩티드 화합물, 합성 마이크로 분자 화합물 및 천연 화합물을 이용할 수 있다.
RNF43 단백질과 NOTCH2 또는 STRIN와의 결합을 저해하는 화합물의 스크리닝 방법으로서는, 당업자에게 주지한 여러 방법을 이용할 수 있다. 이러한 스크리닝은, 인비트로에세이계, 예를 들면 세포계에 대해 실시할 수 있다. 보다 구체적으로 말하면 우선, RNF43 폴리펩티드 또는 NOTCH2 혹은 STRIN의 어느 한쪽을 지지체에 결합시키고 그에 대해 다른 단백질을 피험시료와 함께 첨가한다. 다음에, 혼합물을 인큐베이트 하고 세정한 다음, 지지체와 결합한 다른 한쪽의 단백질을 검출 및/또는 측정한다.
마찬가지로 CXADRL1와 AIP1와의 회합을 방해하는 화합물을 본 발명에 의해 단리할 수 있다. CXADRL1와 AIP1와의 결합을 저해하면 세포 증식의 억제가 일어남이 예상되어 이 결합을 저해하는 화합물은, 암 등의 세포 증식성 질환을 치료하기 위한 조제약으로 기능할 수 있다.
단백질을 결합시키기 위해서 이용할 수 있는 지지체의 예에는, 아가로스, 셀룰로오스, 및 덱스트란 등의 불용성 다당류, 및 폴리아크릴 아미드, 폴리스티렌, 및 실리콘 등의 합성 수지가 포함되며 이상의 재료로부터 제작된 시판되는 비즈(beads) 및 플레이트(예를 들면, 멀티 웰 플레이트, 바이오센서 칩 등)를 이용하는 것이 바람직하다. 비즈를 이용하는 경우에는, 그것들을 컬럼에 충전할 수 있다.
단백질은, 화학적 결합 및 물리적 흡착 등의 관행의 방법에 따라 지지체에 결합시킬 수 있다. 또는, 단백질을 특이적으로 인식하는 항체를 개입시켜 지지체에 결합시켜도 좋다. 또한, 아비딘과 비오틴의 결합을 이용하여 단백질을 지지체에 결합시킬 수도 있다.
단백질 간의 결합은, 완충액이 단백질 간의 결합을 저해하지 않는 한, 인산 완충액 및 Tris 완충액 중에서 행해진다(이들로 한정되지 않는다).
본 발명에 있어서 표면 플라즈몬 공명 현상을 이용하는 바이오센서를, 결합한 단백질의 검출 또는 정량을 위한 수단으로서 이용할 수도 있다. 이러한 바이오센서를 이용하면, 표지하지 않은 매우 미량의 폴리펩티드 만을 이용하여 단백질끼리의 상호작용을 표면 플라즈몬 공명 시그널로서 실시간으로 관찰할 수 있다(예를 들면, BIAcore,Pharmacia). 이 때문에, BIAcore등의 바이오센서를 이용하여 RNF43 폴리펩티드와 NOTCH2 또는 STRIN와의 결합을 평가하는 것이 가능하다.
또는, RNF43 폴리펩티드 또는 NOTCH2 혹은 STRIN의 어느쪽을 표지하고 결합한 단백질의 표지를, 결합한 단백질의 검출 또는 측정에 이용할 수도 있다. 구체적으로는, 단백질의 한편을 미리 표지한 후에, 표지한 단백질을 피험화합물의 존재하에서 다른 한편의 단백질과 접촉시켜, 세정하고 결합한 단백질을 표지에 의해 검출 또는 측정한다.
본 방법에 있어서의 단백질의 표지를 위해서는, 방사성 동위체(예를 들면, 3 H, 14 C, 32 P, 33 P, 35 S, 125 I, 131 I), 효소(예를 들면, 알카라인 포스파타아제, horseradish peroxidase, β갈락토시다아제, β글루코시다아제), 형광 물질(예를 들면, fluorescein isothiosyanete (FITC), 로다민) 및 비오틴/아비딘 등의 표지 물질을 이용할 수 있다. 단백질을 방사성 동위체로 표지하는 경우에는, 검출 또는 측정을 리퀴드 신틸레이션에 의해 실시할 수 있다. 또는, 효소로 표지한 단백질은, 발색 등의 기질의 효소적 변화를 검출하기 위해서, 효소 기질을 첨가해 흡광 광도계로 검출 또는 측정할 수도 있다. 게다가 형광 물질을 표지로서 이용하는 경우에는, 결합한 단백질을 형광 광도계를 이용해 검출 또는 측정할 수 있다.
또한, RNF43 폴리펩티드와 NOTCH2 또는 STRIN와의 결합을, RNF43 폴리펩티드 및 NOTCH2 또는 STRIN에 대한 항체를 이용하여 검출 또는 측정할 수도 있다. 예를 들면, 지지체상에 고정시킨 RNF43 폴리펩티드를 피험화합물 및 NOTCH2 또는 STRIN와 접촉시킨 후에, 혼합물을 인큐베이트 하고 세정한 다음, NOTCH2 또는 STRIN에 대한 항체를 이용하여 검출 또는 측정을 실시할 수 있다. 또는, NOTCH2 또는 STRIN를 지지체상에 고정화하고 RNF43에 대한 항체를 항체로서 이용해도 좋다.
항체를 본 스크리닝에 이용하는 경우에는, 항체를 상기의 표지 물질의 어느것으로 표지하고 표지 물질에 근거하여 검출 또는 측정을 실시하는 것이 바람직하다. 또는, 표지 물질로 표지한 2차 항체에 의해 검출되도록 RNF43 폴리펩티드, NOTCH2 또는 STRIN에 대한 항체를 일차 항체로서 이용할 수도 있다. 게다가 본 발명의 스크리닝에 대해 단백질과 결합한 항체는, 프로테인 G 또는 프로테인 A 컬럼을 이용해 검출 또는 측정할 수 있다.
또는, 본 발명의 스크리닝 방법의 또다른 태양에 있어서, 세포를 이용하는 2-하이브리드(hybrid) 시스템을 이용할 수도 있다(「MATCHMAKER 2-하이브리드(hybrid)계) 「포유동물 MATCHMAKER 2-하이브리드 에세이 키트) 「MATCHMAKER 1-하이브리드(hybrid)계)(클론텍)；「HybriZAP 2-하이브리드(hybrid) 벡터계)(스트라타진)；참고 문헌 「Dalton 및 Treisman, Cell 68: 597-612 (1992)) 「Fields 및 Sternglanz, Trends Genet 10: 286-92 (1994))).
2-하이브리드(hybrid)계에서는, 본 발명의 RNF43 폴리펩티드를 SRF 결합 영역 또는 GAL4 결합 영역과 융합시켜, 효모 세포에서 발현시킨다. 본 발명의 RNF43 폴리펩티드와 결합하는 NOTCH2 또는 STRIN를 VP16 또는 GAL4 전사 활성화 영역과 융합시켜, 피험화합물의 존재하에서 효모 세포에서 발현시킨다. 피험화합물이 RNF43 폴리펩티드와 NOTCH2 또는 STRIN와의 결합을 저해하지 않으면, 이 둘의 결합에 의해 리포터 유전자가 활성화 되어 양성 클론이 검출되게 된다.
리포터 유전자로서는, HIS3 유전자 외에, 예를 들면, Ade2 유전자, lacZ 유전자, CAT 유전자, 루시페라제 유전자 등을 이용할 수 있다.
본 스크리닝에 의해 단리되는 화합물은, 본 발명의 RNF43 단백질의 활성을 저해하는 약제의 후보이며, RNF43 단백질과 관련이 있는 질환, 예를 들면, 암 등의 세포 증식성 질환, 보다 구체적으로는 결장 직장암, 폐암, 위암, 또는 간암의 치료에 응용할 수 있다. 게다가 RNF43 단백질과 NOTCH2 또는 STRIN와의 결합을 저해하는 화합물의 구조의 일부가, 부가, 결실 및/또는 치환에 의해 변형된 화합물도, 본 발명의 스크리닝 방법에 따라 얻을 수 있는 화합물에 포함된다.
본 발명의 방법에 따라 단리된 화합물을, 세포 증식성 질환(예를 들면, 암)을 치료하기 위해서, 사람 및 다른 포유동물, 예를 들면 마우스, 래트, 몰모트, 토끼, 고양이, 개, 양, 돼지, 소, 원숭이, 비비, 침팬지에 대해서 조제약으로서 투여하는 경우에는, 단리된 화합물을 직접 투여하거나 또는 기존의 약제 조제법을 이용하여 제형으로 제재화해도 좋다. 예를 들면, 필요에 따라서, 약제를 당의정제(sugarcoated tablet), 캅셀제, elixirs 제, 및 마이크로 캅셀제로서 경구투여할 수도 있으며 또는 물 혹은 다른 임의의 약학적으로 허용되는 액체와의 멸균 용액 혹은 현탁액인 주사제의 형태로서 비경구적으로 투여할 수도 있다. 예를 들면, 화합물을, 일반적으로 인정되는 약제의 실현을 위해서 필요한 단위 용량의 형태로, 약리학적으로 허용 되는 담체 또는 매체, 구체적으로는 멸균수, 생리 식염수, 식물유, 유화제, 현탁제, 계면활성제, 안정제, 향미제, 부형제, 매체(vehicle), 보존제, 결합제 등과 혼합할 수 있다. 이러한 제재에 있어서의 유효 성분의 양에 의해 지정된 범위 내에 있는 적절한 투여량을 얻을 수 있다.
정제 및 캅셀별로 혼합할 수 있는 첨가제의 예에는, 젤라틴, 옥수수 전분, tragacanth gum 및 arabic gum 등의 결합제； 결정 셀룰로오스 등의 매질(excipient)； 옥수수 전분, 젤라틴 및 알긴산 등의 팽윤제；스테아린산마그네슘 등의 윤활제； 스크로스, 락토스 또는 사카린 등의 감미료； 페퍼민트, 동록유 및 체리 등의 향미제가 있다. 단위 투여제형이 캅셀제인 경우에는, 기름 등의 액체 담체도 상기의 성분에 더 포함될 수 있다. 주사용의 멸균 혼합물은, 통상의 약제의 실현에 따라 주사용 증류수 등의 매체(vehicle)를 이용해 제재화할 수 있다.
생리 식염수, 글루코오스, 및 D-소르비톨, D-만노스, D-만니톨 및 염화 나트륨 등의 어쥬번트를 포함한 그 외의 등장용액을, 주사용의 수용액으로서 이용할 수 있다. 이것들은 적합한 가용화제, 예를 들면 알코올, 구체적으로는 에탄올, 프로필렌 글리콜 및 폴리에틸렌 글리콜등의 다가 알코올, Polysorbate 80(상표) 및 HCO-50 등의 비이온성 계면활성제 등과 조합하여 이용할 수 있다.
참기름 또는 대두유는 유지성 액체로서 이용할 수 있으며 이들을 가용화제로서의 안식향산벤질 또는 벤질 알코올과 조합해 이용할 수도 있고 추가로 이들을 인산 완충액 및 초산나트륨 완충액 등의 완충액；염산 프로 카인 등의 진통약；벤질 알코올, 페놀 등의 안정제；및 항산화제와 함께 제재화할 수도 있다. 조제된 주사제는 적합한 앰플에 충전할 수 있다.
본 발명의 의약 화합물을, 예를 들면 동맥내 주사, 정맥내 주사, 피하 주사로서 또는 비강내(intranasal )투여, 불경 기관지( intramuscular )투여, 근육내 (transbronchial )투여 또는 경구 투여로 환자에게 투여하기 위해서는, 당업자에게 잘 알려진 방법을 이용할 수 있다. 투여량 및 투여 방법은 환자의 체중, 연령 및 투여 방법에 따라 다르며, 당업자는 관행적으로 선택할 수 있다. 상기 화합물이 DNA에 의해 코드될 수 있는 경우에는, DNA를 유전자 치료용의 벡터에 삽입하여 치료하기 위해서 그 벡터를 투여할 수 있다. 투여량 및 투여 방법은 환자의 체중, 연령 및 증상에 따라 다르지만, 당업자는 그것들을 적절히 선택할 수 있다.
예를 들면, 증상에 따라 약간의 차이는 있지만, 본 발명의 폴리펩티드와 결합하여 그 활성을 조절하는 화합물의 투여량은, 표준적인 성인(체중 60 kg)에 대해서 경구투여하는 경우, 약 0.1 mg~ 약 100 mg/일, 바람직하게는 약 1.0 mg~ 약 50 mg/일, 보다 바람직하게는 약 1.0 mg~ 약 20 mg/일이다.
표준적인 성인(체중 60 kg)에 대해서 주사제의 형태로서 비경구적으로 투여하는 경우에는, 환자, 표적 장기, 증상 및 투여 방법에 따라 약간의 차이는 있지만, 약 0.01 mg~ 약 30 mg/일, 바람직하게는 약 0.1~ 약 20 mg/일, 보다 바람직하게는 약 0.1~ 약 10 mg/일의 용량을 정맥주사 하는 것이 좋다. 또한, 다른 동물의 경우에도, 체중 60 kg로 환산한 양을 투여하는 것이 가능하다.
또한, 본 발명은, 본 발명의 폴리펩티드에 대한 항체를 이용하는, 암 등의 세포 증식성 질환의 치료 또는 예방을 위한 방법을 제공한다. 본방법에 의하면, 본 발명의 폴리펩티드에 대한 항체의 약학적 유효량을 투여한다. CXADRL1, GCUD1, 및 RNF43 단백질의 발현은 암 세포에서 상향 조절되고 있을 뿐만 아니라, 이러한 단백질의 발현 억제는 세포 증식 활성의 저하를 가져오기 때문에, 항체와 이러한 단백질과의 결합에 의해, 세포 증식성 질환의 치료 또는 예방이 가능하다고 생각된다. 이 때문에, 본 발명의 폴리펩티드에 대한 항체는, 본 발명의 단백질의 활성을 저하시키는데 충분한 투여량(이것은 0.1~ 약 250 mg/kg/일의 범위에 있다)으로 투여된다. 성인에 대한 용량의 범위는 일반적으로 약 5 mg ~ 약 17.5 g/일이며, 바람직하게는 약 5mg ~ 약 10 g/일, 가장 바람직하게는 약 100 mg ~ 약 3 g/일이다.
또는, 종양 세포에 특이적인 세포 표면 마커와 결합하는 항체를 약물 전달을 위한 툴로서 이용할 수도 있다. 예를 들면, 세포 상해물질과 결합시킨 항체를, 종양 세포를 손상시키는데 충분한 용량으로서 투여한다.
본 발명은 또, 항종양 면역을 유도하는 방법이며, CXADRL1, GCUD1 혹은 RNF43 단백질 혹은 그 면역 활성 단편, 또는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드 혹은 그 단편을 투여하는 단계를 포함하는 방법에도 관한 것이다. CXADRL1, GCUD1, 또는 RNF43 단백질 또는 그 면역 활성 단편은, 세포 증식성 질환에 대한 백신으로서 유용하다. 경우에 따라서는, 단백질 또는 그 단편을, T세포 수용체(TCR)와 결합한 형태, 또는 매크로파지, 수지상 세포(dendritic cell, DC) 혹은 B세포 등의 항원 제시 세포(APC)에 의해 제시된 형태로서 투여할 수도 있다. DC의 항원 제시 능력이 높기 때문에 APC 중에서 DC를 이용하는 것이 가장 바람직하다.
본 발명에 있어서, 세포 증식성 질환에 대한 백신이란, 동물에 접종 했을 때 항종양 면역을 유도하는 기능을 가지는 물질을 가리킨다. 본 발명에 의하면, 서열번호：80, 97 또는 108의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드는, RNF43를 발현하는 결장 직장암 세포, 폐암 세포, 위암 세포, 또는 간암 세포에 대해서 강력하고 특이적인 면역 반응을 유도할 수 있는 HLA-A24 또는 HLA-A*0201 제한적인 에피토프펩티드인 것이 시사되었다. 본 발명에 의하면, 서열번호：124의 아미노산 서열을 포함한 폴리펩티드는, CXADRL1를 발현하는 결장 직장암 세포, 위암 세포, 또는 간암 세포에 대해서 강력하고 특이적인 면역 반응을 유도할 수 있는 HLA-A*0201 제한적인 에피토프 펩티드인 것이 시사되었다. 본 발명에 의하면, 서열번호：164의 아미노산 서열을 포함한 폴리펩티드는, GCUD1를 발현하는 결장 직장암 세포, 위암 세포, 또는 간암 세포에 대해서 강력하고 특이적인 면역 반응을 유도할 수 있는 HLA-A*0201 제한적인 에피토프 펩티드인 것이 시사되었다. 따라서, 본 발명은, 서열번호：80, 97, 108, 124 또는 164의 아미노산 서열을 포함한 폴리펩티드를 이용하여 항종양 면역을 유도하는 방법도 포함한다. 일반적으로, 항종양 면역에는 이하와 같은 면역 반응이 포함된다：
- 종양에 대한 세포 상해성 림프구의 유도
- 종양을 인식하는 항체의 유도, 및
- 항 종양 사이토카인 생산의 유도.
그러므로, 어느 특정 단백질을 동물에 접종했을 때에 이러한 면역 반응을 유도하는 경우에는, 그 단백질은 항종양 면역 유도 작용을 가진다고 판정된다. 단백질에 의한 항종양 면역의 유도는, 숙주에 있어서의 단백질에 대한 면역계의 반응을 인비보 또는 인비트로로 관찰하는 것에 의해 검출할 수 있다.
예를 들면, 세포 상해성 T 림프구의 유도를 검출하기 위한 방법은 잘 알려져 있다. 생체의 내부에 진입하는 외래 물질은, 항원 제시 세포(APC)의 작용에 의해 T 세포 및 B 세포에 제시된다. APC에 의해 제시된 항원에 대해서 항원 특이적인 양상으로 응답한 T 세포는, 항원에 의한 자극 때문에 세포 상해성 T세포(cytotoxic T cell；CTL)로 분화한 후에 증식한다(이것은 T세포의 활성화로 불린다). 따라서, 특정 펩티드에 의한 CTL 유도는, 그 펩티드를 APC에 의해 T 세포에 대해서 제시시켜 CTL의 유도를 검출하는 것에 의해 평가할 수 있다. 게다가 APC에는 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 매크로파지, 호산구 및 NK 세포를 활성화하는 작용도 있다. CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포도 항종양 면역에 대해 중요하기 때문에, 이러한 세포의 활성화 작용을 지표로서 이용하여 펩티드의 항종양 면역 유도 작용을 평가할 수 있다.
수지상 세포(DC)를 APC로서 이용해 CTL의 유도 작용을 평가하기 위한 방법은 당기술 분야에서 주지하다. DC는 APC 중에서도 가장 강한 CTL 유도 작용을 가지는 대표적인 APC이다. 이 방법에서는, 우선 피험 폴리펩티드를 DC와 접촉시키고 이 DC를 T 세포와 접촉시킨다. DC와의 접촉 후에 목적 세포에 대한 세포 상해 작용을 가지는 T 세포가 검출되면, 피험 폴리펩티드가 세포 상해성 T 세포를 유도하는 활성을 가지는 것으로 나타난다. 종양에 대한 CTL의 활성은, 예를 들면, 51 Cr 표지한 종양 세포의 용해를 지표로 하여 검출할 수 있다. 또는, 3 H-티미딘 혼입 활성 (3H-thymidine uptake activity) 또는 LDH(lactose dehydrogenase ) 방출을 지표로하여 종양 세포의 손상의 정도를 평가하는 방법도 잘 알려져 있다.
DC 이외에, 말초혈단핵세포(PBMC)를 APC로서 이용할 수 있다. CTL의 유도는, PBMC를 GM-CSF 및 IL-4의 존재하에서 배양하여 촉진될 수 있음이 보고되고 있다. 마찬가지로 CTL는, PBMC를 keyhole limpet hemocyanin (KLH) 및 IL-7의 존재하에서 배양하는 것에 의해서도 유도되는 것이 나타나고 있다.
이러한 방법에 따라 CTL 유도 활성을 가지는 것이 확인된 피험 폴리펩티드는, DC 활성화 작용과 후속하는 CTL 유도 활성을 가지는 폴리펩티드이다. 이 때문에, 종양 세포에 대한 CTL를 유도하는 폴리펩티드는 종양에 대한 백신으로서 유용하다. 또한, 폴리펩티드와의 접촉에 의해 종양에 대한 CTL를 유도하는 능력을 획득한 APC도 종양에 대한 백신으로서 유용하다. 또한, APC에 의한 폴리펩티드 항원의 제시에 의해 세포 상해성을 획득한 CTL를 종양에 대한 백신으로서 이용할 수도 있다. APC 및 CTL에 기인하는 항종양 면역을 이용한, 종양에 대한 이러한 치료 방법은 세포 면역 요법(cellular immunotherapy)으로 불린다.
일반적으로, 세포 면역 요법을 위해서 폴리펩티드를 이용하는 경우에는, 구조가 다른 복수의 폴리펩티드를 병용하여 그것들을 DC와 접촉시킴으로써 CTL 유도 효율이 높아지는 것으로 알려져 있다. 따라서, DC를 단백질 단편으로 자극하는 경우에는 많은 종류의 단편 혼합물을 이용하는 것이 유리하다.
또는, 폴리펩티드에 의한 항종양 면역의 유도를, 종양에 대한 항체 생산의 유도를 관찰함으로써 확인할 수도 있다. 예를 들면, 폴리펩티드에 대한 항체가, 그 폴리펩티드로 면역한 실험동물에서 유도되었을 경우, 및 종양 세포의 증식이 이러한 항체에 의해 억제되었을 경우에는, 그 폴리펩티드는 항종양 면역을 유도하는 능력이 있다고 판정할 수 있다.
항종양 면역은 본 발명의 백신을 투여함으로써 유도되며 항종양 면역의 유도에 의해, 위암, 결장 직장암, 폐암, 및 간암 등의 세포 증식성 질환의 치료 및 예방이 가능하게 된다. 암에 대한 치료법 또는 암 발증의 예방은 암 세포의 증식 저해, 암의 퇴축(involution) 및 암 발증의 억제라고 하는 단계의 어느쪽도 포함한다. 암을 가지는 개체의 사망률의 저하, 혈액 중 종양 마커의 감소, 암에 부수하는 검출 가능한 증상의 완화 등도 암의 치료 또는 예방에 포함된다. 이러한 치료 효과 및 예방 효과는 통계학적으로 의미가 있는 것이 바람직하다. 예를 들면, 관측치로서 세포 증식성 질환에 대한 백신의 치료 효과 또는 예방 효과를 백신 투여를 실시하지 않는 대조구와 비교하여 5% 또는 그 미만은 유의 수준이다. 통계 분석에는, 예를 들면, 스튜던트의 t검정, 맨-휘트니의 U검정 또는 ANOVA를 이용할 수 있다.
면역학적 활성을 가지는 상기의 단백질, 또는 단백질을 코드하는 벡터를 어쥬번트와 병용할 수도 있다. 어쥬번트란, 면역학적 활성을 가지는 단백질과 동시에(또는 연속해) 투여했을 경우에, 그 단백질에 대한 면역 반응을 증강시키는 화합물을 가리킨다. 어쥬번트의 예에는, 콜레라 독소, 살모네라균 독소, 명반(alum) 등이 포함되지만, 이들에 한정되지 않는다. 게다가 본 발명의 백신을 약학적으로 허용되는 담체와 적절히 배합해도 좋다. 이러한 담체의 예에는, 멸균수, 생리 식염수, 인산 완충액, 배양액 등이 포함된다. 또한, 필요에 따라서, 백신이 안정제, 현탁제, 보존제, 계면활성제 등을 포함할 수도 있다. 백신은 전신적 또는 국소적으로 투여된다. 백신 투여는 단회 투여에 의할 수도 있고 다회 투여에 의한 추가 자극을 실시할 수도 있다.
APC 또는 CTL를 본 발명의 백신으로서 이용하는 경우에, 종양을, 예를 들면 생체외(ex vivo) 방법에 의하여 치료 또는 예방할 수 있다. 보다 구체적으로 기술하면, 치료 또는 예방을 받는 대상의 PBMC를 채취하고 이를 생체외에서 폴리펩티드와 접촉시켜 APC 또는 CTL의 유도 후에, 세포를 대상에 투여할 수 있다. 폴리펩티드를 코드하는 벡터를 PBMC에 생체외로 도입하는 것에 의해 APC를 유도할 수도 있다. 인비트로에서 유도된 APC 또는 CTL는 투여 전에 클로닝 할 수 있다. 표적 세포를 손상시키는 활성이 높은 세포를 클로닝 및 증식시키는 것으로써, 세포 면역 요법을 한층 더 효율적으로 실시할 수 있다. 또한, 이와 같이 단리한 APC 및 CTL는 세포가 유래된 개체에의 세포 면역 요법 뿐만 아니라, 다른 개체의 같은 종류의 종양에도 이용할 수 있다.
또한 본 발명의 폴리펩티드의 약학적 유효량을 포함하는 암 등의 세포 증식성 질환의 치료 또는 예방을 위한 약학적 조성물도 제공한다. 본 약학적 조성물은 항종양 면역을 일으키게 하기 위하여 이용할 수 있다. CXADRL1의 통상의 발현은 정소 및 난소에 국한되고 있고 GCUD1의 통상의 발현은 정소, 난소, 및 뇌에 국한 되고 있으며 RNF43의 통상의 발현은 태아, 보다 구체적으로는 태아의 폐 및 신장에 국한되고 있다. 이 때문에, 이러한 유전자의 억제는 다른 장기에는 유해한 영향을 미치지 않는다고 생각된다. 따라서, CXADRL1 및 GCUD1 폴리펩티드는 세포 증식성 질환, 특히 위암, 결장 직장암, 또는 간암을 치료하는데 바람직하며 RNF43 폴리펩티드는 세포 증식성 질환, 특히 결장 직장암, 폐암, 위암, 및 간암을 치료하는데 바람직하다. 게다가 서열번호：80, 97 및 108의 아미노산 서열을 포함하는 RNF43의 펩티드 단편은 각각, RNF43에 대한 면역 반응을 유도하는 것으로 판명되고 있기 때문에, 서열번호：80, 97 또는 108의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드는 세포 증식성 질환, 특히 결장 직장암, 폐암, 위암, 및 간암의 치료 또는 예방을 목적으로 하는 약학적 조성물에 이용할 수 있는 폴리펩티드의 바람직한 예이다. 또한 서열번호：124의 아미노산 서열을 포함한 CXADRL1의 펩티드 단편은 각각, CXADRL1에 대한 면역 반응을 유도하는 것으로 판명되고 있기 때문에, 서열번호：124의 아미노산 서열을 포함한 폴리펩티드는, 세포 증식성 질환, 특히 결장 직장암, 폐암, 위암, 및 간암의 치료 또는 예방을 목적으로 하는 약학적 조성물에 이용할 수 있는 폴리펩티드의 바람직한 예이다. 게다가 서열번호：164의 아미노산 서열을 포함한 GCUD1의 펩티드 단편은 각각, GCUD1에 대한 면역 반응을 유도하는 것으로 판명되고 있기 때문에, 서열번호：164의 아미노산 서열을 포함한 폴리펩티드는, 세포 증식성 질환, 특히 결장 직장암, 폐암, 위암, 및 간암의 치료 또는 예방을 목적으로 하는 약학적 조성물에 이용할 수 있는 폴리펩티드의 바람직한 예이다. 본 발명에 있어 폴리펩티드 또는 그 단편은 항종양 면역을 유도하는데 충분한 투여량으로 투여되는데, 이는 0.1 mg~10 mg, 바람직하게는 0.3 mg~5 mg, 보다 바람직하게는 0.8 mg~1.5 mg의 범위이다. 투여는 반복된다. 항종양 면역을 유도하려면, 예를 들면, 1 mg의 펩티드 또는 그 단편을 2주간 마다 4회 투여하면 좋다.
이하의 실시예는, 본 발명을 예시함과 함께 당업자에 의한 그 작성 및 사용을 보조하는 목적으로 제시된다. 실시예는 어떠한 형태에서도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 의도하고 있지 않다.
따로 정의하는 경우를 제외하고 본 명세서에서 이용하는 모든 기술 용어 및 과학 용어는, 본 발명이 속하는 당업자가 일반적으로 이해하고 있는 것과 같은 의미를 가진다. 본 발명의 실시 또는 검토에 있어 본 명세서에 기재한 것과 유사한 또는 동등한 방법 및 재료를 이용할 수 있지만, 바람직한 방법 및 재료는 이하에 설명한다. 본 명세서 중에 인용하는 어떠한 특허, 특허 출원 및 간행물도 참조로서 본 명세서에 삽입될 수 있다.
발명을 실시하기 위한 최선의 태양
본 발명은 이하의 실시예에 의해 상세하게 예시되지만, 이러한 실시예에 한정되지 않는다.
1. 재료 및 방법
(1) 환자 및 조직 표본
모든 위암 및 결장 직장암 조직, 또 이에 대응하는 비암조직은, 외과 수술을 받은 환자의 수술 표본으로부터 설명과 동의를 얻은 다음 입수하였다.
(2) 게놈 전역에 걸치는 cDNA 마이크로 어레이
연구에는 23040종의 유전자를 포함한, 게놈 전역에 걸치는 cDNA 마이크로 어레이(시설내에서 제작했다)를 이용하였다. 현미해부한 조직으로부터 추출한, DNase I 처리한 총 RNA를 Ampliscribe T7 전사 키트(Epicentre Technologies)를 이용하여 증폭하고 역전사 동안에 Cy-dye (Amersham)로 (비암조직 유래의 RNA는 Cy5에 의해, 종양 유래의 RNA는 Cy3에 의해) 표지했다. 하이브리다이제이션, 세정 및 검출을 이전의 기재대로 수행하여(Ono 등, Cancer Res. 60: 5007-11 (2000)), 각 표적에 관한 Cy5 및 Cy3의 형광 강도를 Array Vision 소프트웨어(Amersham Pharmacia)를 이용하여 측정했다. 백그라운드 시그널을 제외한 후에 각 스팟에 대해 2회씩의 값을 평균했다. 이어, 각 슬라이드에 대하여 52종의 하우스키핑 유전자의 평균 Cy5 강도 및 평균 Cy3 강도가 조정되도록 슬라이드상의 모든 형광 강도를 표준화 했다. Cy3 및 Cy5의 양쪽 모두에 대해서 강도가 25,000 형광 단위 미만인 유전자는 이후의 검토로부터 제외하고, Cy3/Cy5 시그널비가＞2.0인 것을 새로운 평가를 위해서 선택했다.
(3) 세포주
사람배신장(embryonic kidney) 293(HEK293)은 다카라(TaKaRa)로부터 입수하였다. COS7 세포, NIH3T3 세포, 사람 자궁경암 세포주 HeLa, 사람 위암 세포주 MKN-1 및 MKN-28, 사람 간암 세포주 Alexander, 및 사람 결장암(colon cancer) 세포주 LoVo, HCT116, DLD-1 및 SW480는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(ATCC, Rockville, MD)으로부터 입수했다. 사람 간암 세포주 SNU475 및 사람 결장 암 세포주 SNUC4 및 SNUC5는 한국 세포주 은행(Korean Cell Line Bank)으로부터 입수했다. 세포는 모두 적절한 배지에서 단층으로 증식시킨다：COS7, NIH3T3, HEK293, 및 Alexander는 Dulbecco's modified Eagle's medium ；MKN-1, MKN-28, SNU475, SNUC4, DLD-1, 및 SNUC5는 RPMI1640 ；HCT116는 McCoy's 5A medium ；SW480는 Leibovitz's L-15；LoVo는 HAM's F-12 ；및 HeLa는 Eagle's minimum essential medium (Life Technologies, Grand Island, NY). 모든 배지에는 10% 소태아혈청 및 1% 항생물질/항진균용액(Sigma)를 첨가했다. 사람 위암 세포주 St-4는 암연구소(일본)의 Dr.Tsuruo가 기증해 주셨다. St-4 세포는, 10% 소태아혈청 및 1% 항생 물질/항진균 용액(Sigma)을 첨가한 RPMI1640에서 단층으로 증식시켰다.
사람 B 림프액아구세포주(human B-lymphoblastoid cell lines)인 T2 세포(HLA-A*0201) 및 EHM(HLA-A3/3)는 슈쿠 교수(Prof. Shiku)( Univ. Mie )가 기증해 주셨다. HT29(결장 암 세포주；HLA-A24/01), WiDR(결장 암 세포주；HLA-A24/01), 및 HCT116(결장 암 세포주；HLA-A02/01), DLD-1(결장 암 세포주；HLA-A24/01), SNU475(간세포 암 세포주；HLA-A*0201), MKN45(위암 세포주；HLA-A2음성), MKN74(위암 세포주；HLA-A2음성)는 ATCC로부터 구입하였다. TISI 세포(HLA-A24/24)는 타카라주조(Takara Shuzo Co, Ltd.)(오츠, 일본)에서 기증해 주셨다. RT-PCR 검사에 의해 SNU475 및 MKN74에 있어서의 강한 CXADRL1 발현이 밝혀졌다. RT-PCR 검사에 의해 SNU475 및 MKN45에 있어서의 강한 GCUD1 발현이 밝혀졌다.
(4) RNA 조제 및 RT-PCR
총 RNA는 키아겐 RNeasy 키트(Qiagen) 또는 Trizol 시약(Life Technologies )을 제조자의 프로토콜에 따라 이용하여 추출했다. 폴리 dT12-18 프라이머(Amersham Pharmacia Biotech)와 함께 Superscript II 역전사 효소(Life Technologies )를 이용하여 총 RNA의 10㎍ 앨리코트를 역전사하여 단일 사슬 cDNA로 만들었다. 각각의 단일 사슬 cDNA 조제물을, 부피 20㎕의 PCR 완충액(TaKaRa) 중에서 실시하는 표준적인 RT-PCR에 의한 다음 PCR 증폭을 위해서 희석했다. 증폭은 이하의 조건하에서 실시한다：GeneAmp PCR 시스템 9700(Perkin-Elmer, Foster City, CA)에서 94℃ 4분간의 변성 뒤에, 94℃ 30초간, 56℃ 30초간 및 72℃ 45초간을 20 사이클(GAPDH의 경우), 35 사이클(CXADRL1의 경우), 30 사이클(GCUD1의 경우), 30 사이클(RNF43의 경우) 수행한다. 프라이머 서열은 이하와 같다：GAPDH의 경우, 포워드：5'-ACAACAGCCTCAAGATCATCAG(서열번호：7) 및 리버스：5'-GGTCCACCACTGACACGTTG(서열번호：8)；CXADRL1의 경우, 포워드：5'-AGCTGAGACATTTGTTCTCTTG(서열번호：9) 및 리버스：5'-TATAAACCAGCTGAGTCCAGAG(서열번호：10)；GCUD1의 경우, 포워드：5'-TTCCCGATATCAACATCTACCAG(서열번호：11), 리버스：5'-AGTGTGTGACCTCAATAAGGCAT(서열번호：12), RNF43의 경우, 포워드：5'-CAGGCTTTGGACGCACAGGACTGGTAC-3'(서열번호：13) 및 리버스：5'-CTTTGTGATCATCCTGGCTTCGGTGCT-3'(서열번호：14).
(5) 노던블롯 분석
사람다조직 블롯(Human multiple-tissue blots) (클론텍, Palo Alto, CA)을, CXADRL1, GCUD1 또는 RNF43의 32 P 표지 PCR 산물과 하이브리다이즈 시켰다. 프리하이브리다이제이션, 하이브리다이제이션 및 세정은 공급원의 지침에 따라 행하였다. 블롯의 오토래디오 그래피는 강화 스크린을 이용하여 -80℃에서 24~72 시간 수행하였다.
(6) cDNA 말단의 5' 신속 증폭(5'RACE)
5'RACE 실험은 Marathon cDNA 증폭 키트(Clontech)를 제조자의 지시에 따라 행하였다. 5'부분의 증폭을 위해서 유전자 특이적 리버스 프라이머(5'-GGTTGAGATTTAAGTTCTCAAA-3'(서열번호：15)) 및 키트와 함께 공급되고 있는 AP-1 프라이머를 이용했다. cDNA 주형은 사람 정소 mRNA(Clontech)로부터 합성하였다. PCR 산물을 TA 클로닝 키트(Invitrogen)를 이용하여 클로닝하고 그 서열을 ABI PRISM 3700 DNA 시퀀서(Applied Biosystems))를 이용하여 결정하였다.
(7) CXADRL1, GCUD1 및 FLJ20315를 발현하는 플라스미드의 구축
CXADRL1, GCUD1 및 RNF43의 전코드 영역을, 유전자 특이적 프라이머 세트를 이용하여 RT-PCR에 의해 증폭하였다. CXADRL1에 관해서는, 5'-AGTTAAGCTTGCCGGGATGACTTCTCAGCGTTCCCCTCTGG-3'(서열번호：16) 및 5'-ATCTCGAGTACCAAGGACCCGGCCCGACTCTG-3'(서열번호：17), GCUD1에 관해서는, 5'-GCGGATCCAGGATGGCTGCTGCAGCTCCTCCAAG-3'(서열번호：18) 및 5'-TAGAATTCTTAAAGAACTTAATCTCCGTGTCAACAC-3'(서열번호：19), RNF43에 관해서는 5'-TGCAGATCTGCAGCTGGTAGCATGAGTGGTG-3'(서열번호：20) 및 5'-GAGGAGCTGTGTGAACAGGCTGTGTGAGATGT-3'(서열번호：21). PCR 산물은 pcDNA3. 1(Invitrogen) 또는 pcDNA3.1 myc/His(Invitrogen) 벡터의 적절한 클로닝 사이트에 클로닝 하였다.
(8) 면역블롯팅
pcDNA3.1 myc/His-CXADRL1, pcDNA3.1 myc/His-GCUD1, pcDNA3.1 myc/His-RNF43, 또는 pcDNA3.1 myc/His-LacZ를 트랜스펙트한 세포를 PBS로 2회 세정하고 용해 완충액(150mM NaCl, 1%Triton X-100, 50mM Tris-HCl pH 7.4, 1mM DTT, 및 1X complete Protease Inhibitor Cocktail(Boehringer)으로 회수했다. 호모지나이제이션 후에 세포를 10,000xg로 30분간 원심분리하고, Bradford 에세이(Bio-Rad)에 의해 상청을 단백질 농도에 대하여 표준화 하였다. 단백질을 10% SDS-PAGE에 의해 분리하고 마우스 항 myc(SANTA CRUZ) 항체를 이용하여 면역블롯팅을 실시했다. HRP를 결합시킨 염소 항마우스 IgG(Amersham)를 ECL 검출 시스템(Amersham) 용의 2차 항체로서 이용했다.
(9) 면역 조직화학 염색(immunohistochemical staining)
pcDNA3.1 myc/His-CXADRL1, pcDNA3.1 myc/His-GCUD1, pcDNA3.1 myc/His-RNF43, 또는 pcDNA3.1 myc/His-LacZ를 트랜스펙트한 세포를, 4% 파라포름알데히드를 포함한 PBS로 15 분간 고정한 후에, 0.1% Triton X-100을 포함한 PBS에 의해 실온에서 2.5분간 투과화 처리를 실시하였다. 그 후, 비특이적인 하이브리다이제이션을 방지하기 위해서 세포를 4℃에서 2% BSA(PBS내)로 24시간 커버하였다. 마우스 항myc 단일 클론 항체(Sigma)를 1：1000 희석으로 일차 항체로서 이용하고 로다민 결합 항마우스 2차 항체(Leinco 및 ICN)와의 인큐베이션 후에 반응을 가시화했다. 핵은 4',6'-diamidine-2'-phenylindole dihydrochloride (DAPI)로 대비 염색하였다. 형광 이미지는 ECLIPSE E800 현미경에 의해 얻었다.
(10) 콜로니 형성 에세이
각 유전자를 발현하는 플라스미드 또는 대조구 플라스미드를 트랜스펙트 한 세포를, 적절한 농도의 제네티신과 함께 10~21일 인큐베이트 하였다. 세포를 100% 메탄올로 고정하고 김사 용액(Giemsa solution)에 의해 염색하였다. 실험은 모두 2회씩 수행하였다.
(11) CXADRL1 또는 RNF43를 과잉 발현하는 세포의 수립
pcDNA3.1 myc/His-CXADRL1, pcDNA3.1 myc/His-RNF43, pcDNA3.1 myc/His-LacZ, 또는 대조구 플라스미드를 각각 트랜스펙트 한 NIH3T3 세포, COS7 세포 및 LoVo 세포를 적절한 농도의 제네티신을 포함한 배지에서 유지했다. 트란스펙션으로부터 2주 후 생존하고 있는 단일 콜로니를 선택하여 각 유전자의 발현을 세미정량적 (semi-quantitative) RT-PCR에 의해 조사하였다.
(12) 세포 증식에 대한 안티센스 올리고 뉴클레오티드의 영향의 검토
10 cm 배양접시(2x105개/접시)에 플레이팅한 세포에 대해서, LIPOFECTIN 시약(GIBCO BRL)을 이용하여 CXADRL1, GCUD1 혹은 RNF43의 합성 S-올리고 뉴클레오티드를 트랜스펙트 했다. 그 후 적절한 농도의 제네티신을 첨가한 다음, 세포를 6~12일 배양했다. 세포를 100% 메탄올로 고정하고 김사 용액에 의해 염색하였다. S-올리고 뉴클레오티드의 서열은 이하와 같다：
CXADRL1-S4, 5'-TCTGCACGGTGAGTAG-3'(서열번호：22)；
CXADRL1-AS4, 5'-CTACTCACCGTGCAGA-3'(서열번호：23)；
CXADRL1-S5, 5'-TTCTGTAGGTGTTGCA-3'(서열번호：24)；
CXADRL1-AS5, 5'-TGCAACACCTACAGAA-3'(서열번호：25)；
GCUD1-S5, 5'-CTTTTCAGGATGGCTG-3'(서열번호：26)；
GCUD1-AS5, 5'-CAGCCATCCTGAAAAG-3'(서열번호：27)；
GCUD1-S8, 5'-AGGTTGAGGTAAGCCG-3'(서열번호：28)；
GCUD1-AS8, 5'-CGGCTTACCTCAACCT-3'(서열번호：29)；
RNF43-S1, 5'-TGGTAGCATGAGTGGT-3'(서열번호：30)；및
RNF43-AS1, 5'-ACCACTCATGCTACCA-3'(서열번호：31).
(13) 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) 분석
5x105개/100 mm 배양 접시의 밀도로 플레이팅한 세포에 대해서, CXADRL1, GCUD1, 또는 RNF43의 발현을 억제하도록 지정된 센스 또는 안티센스 S-올리고 뉴클레오티드에 의한 트란스펙션을 3련씩 수행하였다. 트란스펙션 72 시간 후에, 배지를 500 ㎍/ml의 MTT(Sigma)를 포함하는 새로운 배지와 교환하고 플레이트를 37℃에서 4시간 인큐베이트 했다. 그 후, 1 ml의 0.01N HCl/10% SDS의 첨가에 의해 세포를 용해하고 ELISA 플레이트 리더를 검사 파장 570 nm(기준 630 nm)에서 용해물(lysates)의 흡광도를 측정했다. 세포 생존도는 흡광도를 대조 세포와 비교해 나타냈다.
(14) psiH1BX3.0의 구축
H1RNA 유전자는 RNA 중합효소 III에 의해 전사되어 3' 말단에 우리딘이 있는 짧은 전사물을 생산하는 것이 보고되고 있기 때문에, 그 프로모터 영역을 포함한 H1RNA 유전자의 게놈 단편을, 프라이머 세트［5'-TGGTAGCCAAGTGCAGGTTATA-3'(서열번호：32), 5'-CCAAAGGGTTTCTGCAGTTTCA-3'(서열번호：33)］및 주형으로서 사람 태반 DNA를 이용하여 PCR에 의해 증폭했다. 그 산물을 정제하고 TA 클로닝 키트(Invitrogen)를 공급원의 프로토콜에 따라 pCR2.0 플라스미드 벡터에 클로닝 했다. pcDNA3. 1(+) 플라스미드를 프라이머세트, 5'-TGCGGATCCAGAGCAGATTGTACTGAGAGT-3'(서열번호：34), 및 5'-CTCTATCTCGAGTGAGGCGGAAAGAACCA-3'(서열번호：35)를 이용해 PCR로 증폭한 후, BamHI 및 XhoI로 소화 처리를 하고 이 증폭·소화 처리를 실시한 단편 pcDNA3. 1(+) 플라스미드의 뉴클레오티드 위치 1257~56에 H1RNA 유전자를 포함한 BamHI 및 XhoI 단편을 정제하여 클로닝 하였다. 연결된 DNA는, 프라이머 5'-TTTAAGCTTGAAGACCATTTTTGGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAC-3'(서열번호：36) 및 5'-TTTAAGCTTGAAGACATGGGAAAGAGTGGTCTCA-3'(서열번호：37)를 이용한 PCR에서 주형으로서 이용했다. 그 산물을 HindIII로 소화한 후에 자기 연결시켜 psiH1BX3.0 벡터 플라스미드를 얻었다. 대조구로서 5'-CACCGAAGCAGCACGACTTCTTCTTCAAGAGAGAAGAAGTCGTGCTGCTTC-3'(서열번호：38) 및 5'-AAAAGAAGCAGCACGACTTCTTCTCTCTTGAAGAAGAAGTCGTGCTGCTTC-3'(서열번호：39)의 이중 사슬 올리고 뉴클레오티드를 psiH1BX 벡터의 BbsI 부위에 클로닝 하여 psiH1BX-EGFP를 조제했다.
(15) RNF43-siRNA 또는 CXADRL1-siRNA의 유전자 사이렌싱 작용의 검토
RNF43-siRNA 또는 CXADRL1-siRNA의 어느쪽을 발현하는 플라스미드는, 이중 사슬 올리고 뉴클레오티드를 psiH1BX3.0 벡터에 클로닝 하는 것에 의해 제조하였다. RNF43 siRNA로서 이용한 올리고 뉴클레오티드는 이하와 같다：
siRNA16-4로서 5'-TCCCGTCACCGGATCCAACTCAGTTCAAGAGACTGAGTTGGATCCGGTGAC-3'(서열번호：40) 및
5'-AAAAGTCACCGGATCCAACTCAGTCTCTTGAACTGAGTTGGATCCGGTGAC-3'(서열번호：41)；
siRNA1834로서 5'-TCCCGCTATTGCACAGAACGCAGTTCAAGAGACTGCGTTCTGTGCAATAGC-3'(서열번호：42) 및
5'-AAAAGCTATTGCACAGAACGCAGTCTCTTGAACTGCGTTCTGTGCAATAGC-3'(서열번호：43)；
siRNA1로서 5'-TCCCCAGAAAGCTGTTATCAGAGTTCAAGAGACTCTGATAACAGCTTTCTG-3'(서열번호：44) 및
5'-AAAACAGAAAGCTGTTATCAGAGTCTCTTGAACTCTGATAACAGCTTTCTG-3'(서열번호：45)；
siRNA14로서 5'-TCCCTGAGCCACCTCCAATCCACTTCAAGAGAGTGGATTGGAGGTGGCTCA-3'(서열번호：46) 및
5'-AAAATGAGCCACCTCCAATCCACTCTCTTGAAGTGGATTGGAGGTGGCTCA-3'(서열번호：47)；
siRNA15로서 5'-TCCCCTGCACGGACATCAGCCTATTCAAGAGATAGGCTGATGTCCGTGCAG-3'(서열번호：48) 및
5'-AAAACTGCACGGACATCAGCCTATCTCTTGAATAGGCTGATGTCCGTGCAG-3'(서열번호：49).
CXADRL1-siRNA로서 이용한 올리고 뉴클레오티드는 이하와 같다：
siRNA#1으로서 5'-TCCCGTGTCAGAGAGCCCTGGGATTCAAGAGATCCCAGGGCTCTCTGACAC-3'(서열번호：50) 및
5'-AAAAGTGTCAGAGAGCCCTGGGATCTCTTGAATCCCAGGGCTCTCTGACAC-3'(서열번호：51)；
siRNA#2로서 5'-TCCCCCTCAATGTCATTTGGATGTTCAAGAGACATCCAAATGCAATTGAGG-3'(서열번호：52) 및
5'-AAAACCTCAATGTCATTTGGATGTCTCTTGAACATCCAAATGCAATTGAGG-3'(서열번호：53)；
siRNA#3으로서 5'-TCCCTGTCATTTGGATGGTCACTTTCAAGAGAAGTGACCATCCAAATGACA-3'(서열번호：54) 및
5'-AAAATGTCATTTGGATGGTCACTTCTCTTGAAAGTGACCATCCAAATGACA-3'(서열번호：55)；
siRNA#4로서 5'-TCCCTGCCAACCAACCTGAACAGTTCAAGAGACTGTTCAGGTTGGTTGGCA-3'(서열번호：56) 및
5'-AAAATGCCAACCAACCTGAACAGTCTCTTGAACTGTTCAGGTTGGTTGGCA-3'(서열번호：57)；
siRNA#5로서 5'-TCCCCCAACCTGAACAGGTCATCTTCAAGAGAGATGACCTGTTCAGGTTGG-3'(서열번호：58) 및
5'-AAAACCAACCTGAACAGGTCATCTCTCTTGAAGATGACCTGTTCAGGTTGG-3'(서열번호：59)；
siRNA#6으로서 5'-TCCCCCTGAACAGGTCATCCTGTTTCAAGAGAACAGGATGACCTGTTCAGG-3'(서열번호：60) 및
5'-AAAACCTGAACAGGTCATCCTGTTCTCTTGAAACAGGATGACCTGTTCAGG-3'(서열번호：61)；및
CXADRL-siRNA#7으로서 5'-TCCCCAGGTCATCCTGTATCAGGTTCAAGAGACCTGATACAGGATGACCTG-3'(서열번호：62) 및 5'-AAAACAGGTCATCCTGTATCAGGTCTCTTGAACCTGATACAGGATGACCTG-3'(서열번호：63).
FuGENE6 시약(Roche)을 이용하여 공급원의 지침에 따라 psiH1BX-RNF43, psiH1BX-CXADRL1, 또는 psiH1BX-mock 플라스미드를 SNUC4 세포 또는 St-4 세포에 트랜스펙트 했다. 트란스펙션으로부터 48시간 후에 총 RNA를 세포로부터 추출하였다.
(16) RNF43 단백질의 재조합 아미노 말단 영역 및 카르복실 말단 영역의 구축
RNF43의 아미노 말단 영역 및 카르복실 말단 영역을, 이하의 프라이머 세트를 이용하여 RT-PCR에 의해 증폭한다：아미노 말단 영역에 관해서는, 5'-GAAGATCTGCAGCGGTGGAGTCTGAAAG-3'(서열번호：64) 및 5'-GGAATTCGGACTGGGAAAATGAATCTCCCTC-3'(서열번호：65)；및 카르복실 말단 영역에 관해서는, 5'-GGAGATCTCCTGATCAGCAAGTCACC-3'(서열번호：66) 및 5'-GGAATTCCACAGCCTGTTCACACAGCTCCTC-3'(서열번호：67). 그 산물을 BamHI-EcoRI로 소화하고 pET-43.1a(+) 벡터(Novagen)의 BamHI-EcoRI 부위에 클로닝 했다. 이 플라스미드를 대장균 BL21trxB(DE3) pLysS 세포(스트라타진)에 트랜스펙트 했다. 재조합 RNF43 단백질을, 0.2mM IPTG를 첨가하여 25℃에서 배양한 세포로부터 16시간 후에 추출했다.
(17) 효모2-하이브리드(hybrid) 실험
효모2-하이브리드 에세이는, MATCHMAKER GAL4 2-하이브리드(hybrid)시스템 3(MATCHMAKER GAL4 Two-Hybrid System 3)(Clontech)를 제조자의 프로토콜에 따라 수행하였다. RNF43의 전코드 서열을 사람 정소 cDNA 라이브러리(Clontech )의 스크리닝을 위한 베이트(bait)로서 pAS2-1 벡터의 EcoR I-BamH I부위에 클로닝 했다. 효모에 있어서의 상호작용을 확인하기 위해서, pAS2-RNF43를 베이트벡터로서 이용하고 pACT2-NOTCH2 및 pACT2-STRIN를 prey 벡터로서 이용했다.
본 발명자 등은, CXADRL1의 세포질 영역을, 사람 정소 cDNA 라이브러리((Clontech)의 스크리닝을 위한 베이트로서 pAS2-1 벡터의 EcoRI 부위에 클로닝 했다. 효모에 있어서의 상호작용을 확인하기 위해서, 본 발명자등은 베이트벡터로 pAS2-CXADRL1를 이용하고 플레이 벡터로 pACT2-AIP1를 이용했다.
(18) CXADRL 특이적 항체의 조제
항 CXADRL 항혈청은, Ab-1에 관해서는 코돈 235~276, Ab-2에 관해서는 코돈 493~537, 또는 Ab-3에 관해서는 코돈 70~111을 포함하는 CXADRL1의 합성 폴리펩티드로 면역시킴으로써 제조하였다. pET-CXADRL 플라스미드를 트랜스펙트한 대장균에서 재조합 His 표지 CXADRL1 단백질을 제조하고 그것을 이용하여 혈청을 정제하였다. Flag 표지 CXADRL1를 발현하는 세포로부터 추출한 단백질을, 10% SDS-PAGE에 의해 분리하고 항 CXADRL1 혈청 또는 항 Flag 항체의 어느쪽을 이용하여 면역블로팅을 실시했다. HRP 결합 염소(goat) 항토끼 IgG 항체 또는 HRP 결합 양(sheep) 항마우스 IgG 항체를 각각, ECL 검출 시스템(Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) 용의 2차 항체로서 이용했다. 항 CXADRL 항혈청을 이용한 면역 블롯팅은 FLAG 표지된 CXADRL1의 50 kD 밴드를 나타냈으며 이 패턴은 항 FLAG 항체를 이용하여 검출된 것과 동일했다.
(19) 재조합 GCUD1 단백질의 조제
GCUD1에 대해서 특이적인 항체를 제작하기 위해서, 재조합 GCUD1 단백질을 조제했다. GCUD1의 전코드 영역을, 프라이머세트 5'-GCGGATCCAGGATGGCTGCAGCTCCTCCAAG-3'(서열번호：68) 및 5'-CTGAATTCACTTAAAGAACTTAATCTCCGTGTCAACAC-3'(서열번호：69)를 이용하여 RT-PCR에 의해 증폭하였다. 그 산물을 정제하고 BamH1 및 EcoR1로 소화한 다음, pGEX6P-2의 적절한 클로닝 사이트에 클로닝 했다. 그 결과 생긴 플라스미드를 pGEX-GCUD1라고 명명했다. 상기 pGEX-GCUD1 플라스미드를 대장균 DH10B에 도입하여 형질전환 하였다. 재조합 단백질의 생산을 IPTG의 첨가에 의해 유도하고 글루타치온 SepharoseTM4 B(Amersham Pharmacia)를 제조자의 프로토콜에 따라 이용하여 단백질을 정제하였다.
(20) GCUD1 특이적 항체의 조제
GCUD1에 대한 폴리클로날 항체를 혈청으로부터 정제하였다. Flag 표지 GCUD1를 발현하는 플라스미드를 세포에 트랜스펙트 하여 얻은 단백질을 10% SDS-PAGE에 의해 분리하여 항 GCUD1 또는 항 Flag 항체에 의해 면역블롯을 실시하였다. HRP 결합 염소 항토끼 IgG(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) 또는 HRP 결합 항Flag 항체를 각각, ECL 검출 시스템(Amersham Pharmacia 바이오텍, Piscataway, NJ) 용 2차 항체로서 이용했다. FLAG 표지 GCUD1의 47 kD 밴드가, 항GCUD1 항체를 이용한 면역블롯팅에 나타났으며, 이 패턴은 항FLAG 항체를 이용하여 검출된 것과 동일했다.
(21) 통계분석
데이터에 대하여는 분산분석(ANOVA) 및 쉐페(Scheffe) F 검정을 하였다.
(22) 펩티드의 제조
HLA-A24 분자 또는 HLA-A*0201 분자와 결합하는, RNF43, CXADRL1 또는 GCUD1의 9mer 아미노산 펩티드 및 10mer 아미노산 펩티드를, 결합예측 소프트(http://bimas.dcrt.nih.gov/cgi-bin/molbio/ken_parker_comboform)를 이용하여 예상하였다.
미모토프(Mimotopes, San Diego, LA)가 표준적 고상합성법(standard solid phase synthesis method)에 따라서 합성한 이들의 펩티드를, 역상 HPLC에 의하여 정제하였다. 펩티드의 순도(>90%) 및 동정은, 각각 분석용 HPLC 및 매스 스펙트로메트리 분석에 의하여 결정하였다. 펩티드는 디메틸설폭사이드(DMSO) 내에서 20 mg/ml이 되도록 용해하여, -80℃에서 보존하였다.
(23) In vitro CTL 유도
단구유래의 수지상세포(DC)를, HLA상에서 제시된 펩티드에 대한 CTL반응을 유도하기 위한 항원제시세포(APC)로서 이용하였다. DC는 별도 문헌에 기재된 바와 같이 인비트로로 제작하였다(Nukaya 등, Int J Cancer 80: 92-7 (1999); Tsai 등, J Immunol 158: 1796-802 (1997)). 구체적으로는, 말초혈 단핵세포(PBMC)를 HLA-A*0201 또는 HLA-A24의 건강 지원자로부터 Ficoll-Plaque(파마시아) 용액을 이용하여 단리하고, PBMC의 단구 분획을 플라스틱제 조직배양 플라스크(Beckton Dickinson)에 대한 부착성에 의하여 분리하였다. 이 단구 분획을, 2% 열 불활성 자기혈청(AS), 1000 U/ml의 GM-CSF (Kirin Brewery Company에 의해 제공) 및 1000 U/ml의 IL-4(Genzyme)를 포함하는 AIM-V 배지(인비트로젠) 내에서 7일간 배양하여, DC 분획을 얻었다. DC를 많이 포함하는 이 세포집단에 대하여, 20℃의 AIM-V 내에서 4시간에 걸쳐, 3㎍/ml의 β2-마이크로글로블린의 존재하에서, 20㎍/ml의 후보 펩티드로 표지하였다. 펩티드로 표지된 이들 항원제시세포에 방사선을 조사하여(5500 rads), 이것을 Dynabeads M-450CD8(Dynal) 및 Detachabead(Dynal)에 의한 양성선택에 의하여 입수한 자기 CD8+ T세포와 1:20의 비율로 혼합하였다. 이들 배양물을 48웰 플레이트(Corning)에 넣고, 각 웰은, 1.5x104 개의 펩티드로 표지한 항원제시세포, 3x105 개의 CD8+ T세포, 및 10ng/ml의 IL-7(Genzyme)을, 2% AS를 가한 0.5ml의 AIM-V 내에 포함시킨다. 3일후에, 이들의 배양물에 대하여 IL-2(CHIRON)를 최종농도 20 IU/ml 이 되도록 첨가하였다. 더욱 7일 및 14일째에 각시점에 있어서 그 때마다, 상기와 동일한 양식으로 자기 펩티드로 표지하여 항원제시세포를 제조하고, 그 항원제시세포로 T세포를 다시 자극하였다. 배양하에 있는 림프계 세포를 21일째의 시점에서 회수하고, 펩티드로 표지한 TISI 또는 T2 세포에 대한 세포독성에 관한 시험을 하였다.
(24) CTL의 증식
펩티드로 표지한 TISI 또는 T2에 대하여 명백한 세포독성을 가지는 것이 실증된 배양림프계 세포를, Riddell 등에 의하여 기재된 것과 유사한 방법을 이용하여 배양하에서 더욱 증식시켰다(Walter 등, N Engl J Med 333: 1038-1044, 1995; Riddel 등, Nature Med. 2: 216-223, 1996). 5x104 개의 림프계 세포는, 25x106 개의 방사선 조사(3300 rads) PBMC, 5x106 개의 방사선 조사(8000 rads) EHM 세포, 및 40ng/ml의 항 CD3 모노클로날 항체(Pharmingen)를 포함하는, 5% AS를 가한 25ml의 AIM-V 내에서 재현탁 하였다. 배양을 개시하여 1일 후에 120 IU/ml의 IL-2를 배양물에 첨가하였다. 이 배양물에, 5% AS 및 30 IU/ml의 IL-2를 가한 새로운 AIM-V를 5일 째, 8일 째, 및 11일 째에 가하였다.
(25) CTL 클론의 수립
CTL 클론을 얻기 위하여, 강력한 세포독성을 가지는 림프계 세포를 이용하였다. 세포 부유액을, 96웰 라운드-바텀(round bottom) 마이크로타이터 플레이트(Nalge Nunc International) 내의 각웰 당 0.3, 1 , 및 3 CTL/림프계세포의 밀도가 되도록 희석하였다. 이들 세포를, 7x104 개/웰 의 동종 PBMC, 1x104 개/웰 의 EHM, 30ng/ml의 항 CD3 항체, 및 125 U/ml의 IL-2를 포함하는, 5% AS를 가한 150 ㎕/웰 의 AIM-V 내에서 배양하였다. 10일 후에, 50㎕/웰의 IL-2를 최종농도 125 U/ml이 되도록 배지에 첨가하였다. 배양 CTL의 세포독성 활성을 14일째에 조사하여, CTL 클론을 상기와 동일한 방법을 이용하여 증식시켰다.
(26) 세포독성 에세이(cytotoxicity assay)
표적 세포를, CO2 인큐베이터 내에서 100μCi의 Na2 51CrO4 (Perkin Elmer Life Sciences)에 의하여 37℃에서 1시간에 걸쳐 표지시켰다. 펩티드로 표지한 표적을 이용하는 경우에는, Na2 51CrO4에 의한 표지의 전에, 표적 세포를 20㎍/ml의 펩티드를 첨가한 다음에 37℃에서 16시간 인큐베이트 하였다. 표적세포를 헹구고, 최종용적 0.2ml이 되도록 라운드-바텀 마이크로타이더 플레이트 내에서 이펙터(effector) 세포와 혼합하였다. 세포간 접촉을 증가시키기 위하여 플레이트를 원심시키고(4분간, 800xg), 37℃의 CO2 인큐베이터에 넣었다. 4시간의 인큐베이션 후에, 0.1ml의 상청을 각 웰로부터 회수하고, 방사선을 감마 카운터를 이용하여 측정하였다. RNF43 또는 CXADRL1 또는 GCUD1를 내인성으로 발현하는 표적세포에 대한 세포독성을 평가하는 경우에는, NK-유사 이펙터 세포에 의한 비특이적 용해를 줄이기 위하여, 30배 초과량(30-fold excess)의 비표지 K562 세포의 존재하에서 세포용해 활성을 조사하였다. 51Cr표지한 HT29 세포 또는 SNU475 세포의 인식에 관하여 경합시키기 위하여, 펩티드에 의한 표지(20㎍/ml, 37℃에서 16시간)를 한 비표지 TISI 세포 또는 T2세포를 이용하여 비방사성 표적 저해 에세이를 하여, 항원특이성을 확인하였다. MHC 구속(restriction)에 관하여는, 저지 에세이(blocking assay)에 있어서, 항 HLA 클래스 I(W6/32) 항체 및 항 HLA 클래스 II 항체, 항 CD4 항체 및 항 CD8 항체(DAKO)에 의한 세포독성의 저해를 측정하여 검토하였다.
특이적 세포독성(specific cytotoxicity)의 비율은, 특이적 51Cr 방출의 비율을 이하의 방식으로 산출하는 것에 의해 구하였다:(피험시료 방출 cpm - 자연방출 cpm)/(최대방출 cpm - 자연방출 cpm) x 100. 자연방출은 표적세포만을 이펙터 세포의 비존재하에서 인큐베이트 하는 것에 의하여 측정하고, 최대방출은 표적을 1N HCl과 함께 인큐베이트 하는 것에 의하여 측정하였다. 모든 측정은 2회씩 하였지만, 평균의 표준오차는 항상 평균치의 10% 미만이었다.
2. 결과
(1) 위암에 있어서 고빈도로 상방 제어되는(up-regulated) 2종류의 신규 사람 유전자, CXADRL1 및 GCUD1의 동정
23040 종의 유전자를 포함하는 게놈 전역에 걸쳐 cDNA 마이크로 어레이를 이용하여, 위암의 발현 프로파일 20례(例)를, 대응하는 비암(non-cancerous) 점막과 비교하였다. 마이크로 어레이 해석으로 검출된 고빈도로 상방제어되는 유전자 중에서, UniGene 클러스터(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene/)의 EST, Hs.6658에 대응하는 시설내(in-house) 접근 번호 A5928의 유전자가, 4.09-48.60의 범위에서 과발현하는 것이 판명되었다(도 1a). 이 유전자의 개방형 판독틀(open reading frame)은, CXADR(coxsackie and adenovirus receptor)의 그것과 약 37% 동일한 단백질을 코드하기 때문에, 이 유전자는 CXADRL1(coxsackie and adenovirus receptor like 1)으로 명명되었다. CXADRL1은 6 건(case)의 결장직장암증 케이스 중에서 6 건, 20 건의 HCC증 케이스 중에서 12건으로 상방제어 되어 있었다. 더욱, UniGene 클러스터의 KIAA0913 유전자 산물(Hs. 75137)에 대응하는 시설내 접근 번호 C8121의 유전자도, 마이크로 어레이에 의한 대응하는 비암 위점막과의 비교에서, 12건의 위암조직 중에서 9건으로 발현이 유의적으로 증강되어 있었기 때문에 주목되었다(도 1b). 시설내 접근 번호가 C8121인 이 유전자는 GCUD1(up-regulated in gastric cancer)로 명명되었다. GCUD1은, 6건의 결장직장암증 케이스 중에서 5건, 6건의 HCC증 케이스 중에서 1건, 14건의 폐암(squeamous cell carcinoma) 케이스 중에서 1건, 13건의 정소 종양 케이스 중에서 1건으로 상방제어 되고 있었다. cDNA 마이크로 어레이의 결과를 명확하게 하기 위하여, 위암에 있어서 이들 전사물의 발현을 반정량적(semi-quantitative) RT-PCR에 의하여 조사한 바, 10 건의 종양의 모두에서 CXADRL1의 발현이 상승되어 있고(도 1c) 9건의 암 중에서 7건으로 GCUD1의 발현이 상승되어 있는 것이 확인되었다(도 1d).
(2) 신규 유전자 CXADRL1의 단리 및 구조
CXADRL1의 PCR 산물을 프로브로서 이용하는 다조직(multiple-tissue) 노던블롯 분석에 의하여, 정소 및 난소에 있어서 3.5kb 전사물의 발현이 판명되었다(도 2a). A5928은 노던블롯으로 검출된 유전자 보다도 작았기 때문에, CXADRL1 유전자의 전 코드 서열을 결정하기 위하여 5'ACE 실험을 하였다. 추정된 완전장 cDNA는 3423 뉴클레오티드로 이루어져, 오픈 리딩 프레임은 431 아미노산의 단백질(서열번호: 2)을 코드하는 1296 뉴클레오티드(서열번호: 1)이다(GenBank 접근 번호: AB071618). 최초의 ATG는, 진핵생물에 있어서 번역개시를 위한 컨센서스 서열과 일치하는 서열(CCCGGGATGA)(서열번호: 70)에 인접하고 있고, 인플레임(in-flame) 종결코돈이 상류에 있다. NCBI(the National Center for Biotechnology Information) 데이터베이스에 있어서 상동성의 검색을 위하여 BLAST 프로그램을 이용한 바, 염색체 밴드 3q13에 지정되어 있는 서열인 GenBank 접근 번호 AC068984의 게놈 서열이 동정되었다. cDNA와 게놈 서열과 비교하는 것에 의하여, CXADRL1이 7개의 엑손으로 이루어진 것이 판명되었다(도 2b).
SMART(Simple Modular Architecture Research Tool, http://smart.embl-heidelberg.de)를 이용한 단백질 모티프에 관한 검색에 의하여, 예상되는 단백질이 2개의 면역 글로블린 도메인(코돈 29-124 및 158-232) 및 1개의 막관통 도메인(코돈 246-268)을 포함하는 것이 판명되고, 이것으로부터, CXADRL1이 면역 글로블린 슈퍼 패밀리에 속할 가능성이 시사되었다.
(3) 세포증식에 대한 CXADRL1의 효과
CXADRL1을 발현하는 플라스미드(pcDNA3.1 myc/His-CXADRL1)를 NIH3T3 세포에 트랜스펙트하는 것에 의하여, 콜로니 형성 에세이를 하였다. pcDNA3.1 myc/His-CXADRL1을 트랜스펙트한 세포는, 유사(mock)-트랜스펙트 세포보다도 현저하게 많은 콜로니를 형성하였다(도 3a). 더욱, CXADRL1의 이러한 증식 촉진작용을 더 검토하기 위하여, 외인성 CXADRL1를 안정적으로 발현하는 NIH3T3 세포를 수립하였다(도 3b). 10% FBS를 포함하는 배지액 내에서의 NIH3T3-CXADRL1 세포의 증식속도는 원래의 NIH3T3 세포의 그것 보다도 유의적으로 높았다(도 3c).
(4) 안티센스 S-올리고 뉴클레오티드에 의한, 사람 위암 세포에 있어서 CXADRL1 발현의 억제
6쌍의 대조 S-올리고 뉴클레오티드 및 CXADRL1에 대응하는 안트센스 S-올리고 뉴클레오티드를, 검토한 6종의 위암세포주 내에서 CXADRL1의 발현 수준이 가장 높았던 MKN-1 위암세포에 트랜스펙트 하였다. 트랜스펙션으로부터 6일 후에, 형질전환 세포의 생존도를 MTT 에세이에 의하여 계측하였다. 안티센스 S-올리고 뉴클레오티드(CXADRL1-AS4 또는 CXADRL1-AS5)를 트랜스펙트한 세포주는, 대조 S-올리고 뉴클레오티드(CXADRL1-S4 또는 CXADRL1-S5)를 트랜스펙트한 세포주 보다도 현저히 적었다(도 4). 3회의 독립된 실험으로 일치하는 결과가 얻어졌다.
(5) CXADRL1 siRNA를 발현하는 플라스미드의 구축, 및 위암세포의 증식에 대한 그 결과
다양한 CXADRL1-siRNA를 발현하는 플라스미드를 구축하여, CXADRL1의 발현에 대한 효과에 관하여 검토하였다. 구축한 siRNA 중에서, psiH1BX-CXADRL7은 St-4 세포에 있어서 CXADRL1의 발현을 유의적으로 억제하였다(도 5A). CXADRL1의 억제가 결장암세포의 증식억제를 초래하는지 여부를 검증하기 위하여, St-4 세포에 psiH1BX-CXADRL7 또는 유사(mock) 벡터를 트랜스펙트하였다. psiH1BX-CXADRL7을 트랜스펙트한 생세포의 수는 대조 생세포의 수보다도 적었다(도 5B 및 5C).
(6) 항 CXADRL1 항체의 제조
CXADRL1의 발현에 관하여 검토하여 그 기능을 해명하기 위하여, CXADRL1에 대한 항혈청을 제조하였다. 항 CXADRL1를 이용한 면역블롯에 의하여, FLAG 표지 CXADRL1의 50kD 밴드가 검출되고, 이것은 항 FLAG 항체를 이용하여 검출된 것과 사이즈의 면에서 거의 동일하였다(도 6).
(7) 효모 2-하이브리드 스크리닝 시스템에 의한 CXADRL1 상호작용성 단백질의 동정
CXADRL1의 기능을 명확히 하기 위하여, 본 발명자들은 효모 2-하이브리드 스크리닝 시스템을 이용하여 CXADRL1 상호작용성 단백질을 검출하였다. 동정된 양성 클론 중에서, 핵내 AIP1(atrophin interacting protein 1)의 C 말단 영역은, 효모세포에서 pAS2.1-CXADRL1 및 pACT2-AIP1(도 7)을 이용한 동시 형질전환에 의하여, CXADRL1과 상호작용 하였다. 양성 클론은 코돈 808∼1008을 포함하고 있고, 이것은 AIP1의 상호작용에 관여하는 영역이 이 영역내에 있다는 것을 보이고 있다.
(8) CXADRL1 유래의 후보 펩티드의 예측
표1은, 후보 펩티드(서열번호: 115∼154)를 결합친화성이 높은 순으로 표시하고 있다. 합계 40종의 펩티드를 하기와 같이 선택하여 검토하였다.　
(9) 후보 펩티드를 이용한 T세포의 자극 및 CTL클론의 수립
「재료 및 방법」의 페이지에 기재한 방식으로, CXADRL1 유래의 이들 후보 펩티드를 이용하여 림프계 세포를 배양하였다. 그 결과 얻어진, 검출가능한 세포독성 활성을 보이는 림프계 세포를 증폭하여 CTL 클론을 수립하였다. CTL 클론을 상기의 CTL계열로부터 한계희석법을 이용하여 증식시켰다. CXADRL1-207(ALSSGLYQC)(서열번호: 124)에 의하여 유도시킨 CTL클론은, 펩티드로 표지하지 않은 표적에 대한 세포독성 활성과 비교하여, 펩티드로 표지한 표적에 대한 세포독성 활성을 보다 높은 정도로 보였다. 이 CTL클론의 세포독성 활성을 도 8에 표시하였다. 이 CTL 클론은, 펩티드로 표지한 표적에 대하여 극히 강력한 세포독성 활성을 보였지만, 펩티드로 표지하지 않았던 표적에 대해서는 여하한 세포독성 활성도 보이지 않았다.
(10) CXADRL1를 표적으로 하여 내인성으로 발현하는 종양세포주에 대한 세포독성 활성
예측된 펩티드에 대하여 생성시킨 CTL클론에 대하여, CXADRL1를 내인성으로 발현하는 종양세포를 인식하여 사멸시키는 능력을 검토하였다. 도 9는 CXADRL1-207(ALSSGLYQC)(서열번호: 124)에 대하여 생성시킨 CTL 클론 75의 결과를 표시하고 있다. CTL 클론 75는 CXADRL1 및 HLA-A*0201을 발현하는 SNU475에 대하여는 강력한 세포독성 활성을 보이지만, CXADRL1을 발현하지만 HLA-A*0201은 발현하지 않는 MKN74에 대해서는 보이지 않고, HLA-A*0201을 발현하지만 CXADRL1은 발현하지 않는 SNU-C4에 대해서도 보이지 않았다.
(11) 수립된 CTL의 특이성
CXADRL1-207 CTL 클론의 특이성을 확인하기 위하여, 비표지 표적 저해 에세이를 하였다. 51Cr에 의하여 표지한 SNU475 세포를 방사성 표적으로 이용하여, 51Cr 표지를 하지 않고서 CXADRL1-207(서열번호: 124)로 표지한 T2 세포를 비방사성 표적으로 이용하였다. CXADRL1-207(서열번호: 124)로 표지한 T2를 에세이에 다양한 비율로 첨가하면, SNU475 세포에 대한 특이적 세포 용해는 유의적으로 저해되었다(도 10). 이들 결과는, E/T비를 20으로 한 경우의 특이적 용해의 비율로 표시되어 있다.
CXADRL1-207 CTL 클론에 관하여, 이들의 CTL클론의 특징을 검토하기 위하여, HLA 클래스I, HLA 클래스II, CD4 및 CD8에 대한 항체에 대하여, 세포독성 활성을 저해하는 능력을 조사하였다. SNU475 세포에 대한 CTL 클론의 세포독성은, 항 HLA 클래스 I 항체 및 항 CD8 항체를 이용한 경우에 유의적으로 저하되고(도 11), 이것으로부터 이 CTL클론이 CXADRL1 유래의 펩티드를 HLA 클래스I 및 CD8 방식으로 인식하는 것이 밝혀졌다.
(12) 신규 사람 유전자 GCUD1의 발현 및 특징 분석
GCUD1 cDNA를 프로브로서 이용하는 다조직(multi-tissue) 노던블롯 분석에 의하여, 5.0kb 전사물이 정소, 난소 및 뇌에서 특이적으로 발현되는 것이 밝혀졌다(도 12). GCUD1에 대응하는 KIAA0913(GenBank 접근 번호: XM-014766)의 뉴클레오티드 서열은 4987 뉴클레오티드로 이루어져 있지만, 정소, 난소, 및 암조직을 이용한 RT-PCR 실험으로부터 1245 뉴클레오티드의 오픈 리딩 프레임을 포함하는 4987 뉴클레오티드(서열번호: 3)(GenBank 접근 번호: AB071705)의 전사물이 밝혀지게 되었다. 더욱, GCUCD1에 대응하는 게놈 서열에 관하여 게놈 데이터베이스를 검색하여, 염색체 밴드 7p14에 지정된 드래프트(draft) 서열을 찾아내었다(GenBank 접근 번호: NT-007819). cDNA서열과 게놈 서열의 비교에 의하여, GCUD1 유전자가 8개의 엑손으로 이루어진 것이 판명되었다.
(13) GCUD1의 세포내 위치(localization)
GCUD1에 대응하는 전 코드 영역을 pCDNA3.1myc/His 벡터 내로 클로닝하여, 이 구축물을 COS7 세포에 일과성으로(transiently) 트랜스펙트 하였다. COS7 세포를 면역세포 화학염색(immunocytochemical staining)하여, 표지 GCUD1 단백질이 세포질 내에서 존재하는 것을 명백히 하였다(도 13).
(14) 세포증식에 대한 GCUD1의 효과
세포증식에 대한 GCUD1의 효과를 분석하기 위하여, GCUD1을 발현하는 플라스미드(pcDNA3.1myc/His-GCUD1)를 NIH3T3세포에 트랜스펙트 하는 것에 의하여, 콜로니 형성 에세이를 하였다. NIH3T3 세포에 있어서, pcDNA3.1myc/His-GCUD1은 대조 플라스미드(pcDNA3.1myc/His-LacZ)와 비교하여 현저히 많은 콜로니를 유도하였다(도 14). 이 결과는 3회의 독립된 실험에 의하여 뒷받침 되었다.
(15) GCUD1의 발현을 저하시키도록 지정된 안티센스 S-올리고 뉴클레오타이드에 의한 위암세포의 증식 억제
GCUD1의 억제가 위암세포의 세포사를 초래하는지 여부를 검증하기 위하여, GCUD1의 발현을 억제하기 위하여 설계된 다양한 안티센스 S-올리고 뉴클레오타이드를 합성하였다. 각 안티센스 S-올리고 뉴클레오타이드의 트랜스펙션으로부터 6일 후에, 트랜스펙트 세포의 생존도를 MTT 에세이에 의하여 계측하였다. MKN-28 세포에 있어서, 안티센스 S-올리고 뉴클레오타이드(GCUD1-S5 또는 GCUD1-S8)를 트랜스펙트한 생세포는, 대조 S-올리고 뉴클레오타이드(GCUD1-S5 또는 GCUD1-S8)를 트랜스펙트한 생세포의 수보다도 현저히 적어졌다(도 15). 이 결과는 3회의 독립한 실험에 의하여 뒷받침되었다. 동일한 결과는 MKN-1 세포에서도 관찰되었다.
(16) 항 GCUD1 항체의 제조
GCUD1의 발현에 대하여 검색하여, 그 기능을 해명하기 위하여, GCUD1에 대한 항혈청을 제조하였다. GST-GCUD1 융합단백질을 발현하는 세균세포로부터 GCUD1의 재조합 단백질을 추출하여 정제하였다(도 16). 이 재조합 단백질을 토끼 3마리의 면역처치에 이용하였다. 항 GCUD1 혈청을 이용한 면역블롯에서는 FLAG 표지 GCUD1의 47kD 밴드가 표시되어(면역전 혈청에서는 표시되지 않았다), 이것은 항 FLAG 항체를 이용하여 검출된 밴드와 사이즈의 면에서 거의 동일하였다(도 17).
(17) GCUD1 유래의 후보 펩티드의 예측
표2(GCUD1)는, 후보 펩티드(서열번호: 155∼194)를 결합 친화성이 높은 순으로 표시하고 있다. 합계 40종의 펩티드를 하기와 같이 선택하여 검토하였다.
(18) 후보 펩티드를 이용한 T세포의 자극 및 CTL 클론의 수립
「재료 및 방법」의 페이지에서 기재한 방식으로, GCUD1 유래의 이들 후보 펩티드를 이용하여 림프계 세포를 배양하였다. 그 결과 얻어진, 검출가능한 세포독성 활성을 보이는 림프계 세포를 증폭하여 CTL 클론을 수립하였다. CTL 클론을 상기의 CTL계열로부터 한계희석법을 이용하여 증식시켰다. GCUD1-196(KMDAEHPEL)(서열번호: 164) 및 GCUD1-272(FLTTASGVSV)(서열번호: 177)에 의하여 유도시킨 CTL클론은, 펩티드로 표지하지 않은 표적에 대한 세포독성 활성과 비교하여, 펩티드로 표지한 표적에 대한 세포독성 활성을 보다 높은 정도로 보였다. 이 CTL클론의 세포독성 활성을 도 18에 표시하였다. 각각의 CTL 클론은, 펩티드로 표지한 표적에 대하여 극히 강력한 세포독성 활성을 보였지만, 펩티드로 표지하지 않았던 표적에 대해서는 세포독성 활성도 보이지 않았다.
(19) GCUD1을 표적으로 하여 내인성으로 발현하는 종양세포주에 대한 세포독성 활성
예측된 펩티드에 대하여 생성시킨 CTL클론에 대하여, GCUD1을 내인성으로 발현하는 종양세포를 인식하여 사멸시키는 능력을 검토하였다. 도 19는 GCUD1-196(서열번호: 164)에 대하여 생성시킨 CTL 클론 23의 결과를 표시하고 있다. CTL 클론 23은 GCUD1 및 HLA-A*0201을 발현하는 SNU475에 대하여는 강력한 세포독성 활성을 보이지만, GCUD1을 발현하지만 HLA-A*0201은 발현하지 않는 MKN45에 대해서는 보이지 않았다.
(20) 수립된 CTL의 특이성
GCUD1-196 CTL 클론의 특이성을 확인하기 위하여, 비표지 표적 저해 에세이도 하였다. 51Cr에 의하여 표지한 SNU475 세포를 방사성 표적으로 이용하여, 51Cr 표지를 하지 않고서 GCUD1-196으로 표지한 T2 세포를 비방사성 표적으로 이용하였다. GCUD1-196(서열번호: 164)으로 표지한 T2를 에세이에 다양한 비율로 첨가하면, SNU475 세포에 대한 특이적 세포 용해는 유의적으로 저해되었다(도 20). 이들 결과는, E/T비를 20으로 한 경우의 특이적 용해의 비율로 표시되어 있다.
GCUD1-196(서열번호: 164) CTL 클론에 관하여, 이들의 CTL클론의 특징을 검토하기 위하여, HLA 클래스I, HLA 클래스II, CD4 및 CD8에 대한 항체에 대하여, 세포독성 활성을 저해하는 능력을 조사하였다. SNU475 세포에 대한 CTL 클론의 세포독성은, 항 HLA 클래스 I 항체 및 항 CD8 항체를 이용한 경우에 유의적으로 저하되고(도 21), 이것으로부터 CTL클론이 GCUD1 유래의 펩티드를 HLA 클래스I 및 CD8 방식으로 인식하는 것이 밝혀졌다.
(21) 사람 직장암(colon cancer)에 있어서 고빈도로 상방제어되는 유전자 FLJ20315의 동정
23040종의 유전자를 포함하는 cDNA 마이크로 어레이를 이용하여, 11 케이스의 결장암 조직의 발현 프로파일을 대응하는 결장 비암 점막 조직과 비교하였다. 이 분석에 의하면, 다수의 유전자의 발현 레벨이, 대응하는 비암 조직과 비교하여 암조직에서 고빈도로 상승되어 있었다. 그 중에서, UniGene 클러스터(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene/)의 EST(FLJ20315), Hs.18475에 대응하는 시설내 접근 번호 B4469의 유전자가, 대응하는 비암 점막과 비교하여 암조직에 있어서 1.44∼11.22배의 범위에서 상방 제어되어 있었다(도 22a). FLJ20315는 18 건의 위암증 케이스 중에서 6건, 20 건의 HCC증 케이스 중에서 12건, 22건의 폐암(adenocarcinoma)증 케이스 중에서 11건, 2건의 정소 종양증 케이스 중에서 2건, 및 9건의 전립선암증 케이스 중에서 3건으로 상방 제어되고 있었다. 이 마이크로 어레이 결과를 명확히 하기 위하여, 그 외의 결장암 시료에 있어서 이들의 전사물의 발현을 반정량적 RT-PCR에 의하여 검토한 바, 18건의 종양 중에서 15건으로 FLJ20315 발현의 상승이 확인되었다(도 22b).
(22) RNF43의 발현 및 구조
BLAST 프로그램을 이용하여, 미국 국립 바이오테크놀로지 정보센터(National Center for Biotechnology Information)의 공개 데이터 베이스에 있어서 FLJ20315 서열의 추가적인 상동성 검색을 행한 바, XM_097063, BF817142를 포함하는 EST, 및 염색체 밴드 17pter-p13.1에 지정되어 있는 GenBank 접근 번호 NT-010651의 게놈 서열이 동정되었다. 그 결과, 783 아미노산의 단백질(서열번호: 6)을 코드하는 2352 뉴클레오타이드의 오픈 리딩 프레임을 포함하는 5345 뉴클레오타이드의 어셈블된(assembled) 서열(서열번호: 5)(GenBank 접근 번호:081837)이 얻어졌다. 이 유전자는 RNF43(Ring finger protein 43)으로 명명되었다. 최초의 ATG는, 진핵생물에 있어서 번역개시를 위한 컨센서스 서열과 일치하는 서열(AGCATGC), 및 상류에 있는 인프레임(in-frame) 종결코돈에 인접하여 있었다. cDNA와 게놈 서열과의 비교에 의하여, 이 유전자가 11개의 엑손으로 이루어진 것이 판명되었다. RNF43의 PCR 산물을 프로브로 하여 성인 다조직(multiple-tissue) 노던블롯을 이용한 노던블롯 분석에서는 밴드가 검출되지 않았다(데이터는 표시하지 않음). 그러나, 5.2kb의 전사물이 태아 폐 및 태아 신장에서 발현되는 것이, 동일 PCR 산물을 프로브로 이용한 인간 태아 조직 노던블롯을 이용하여 명백하게 되었다(도 23a). SMART(Simple Modular Architecture Research Tool, http://smart.embl-heidelberg.de)를 이용한 단백질 모티프에 관한 검색에 의하여, 예상되는 단백질이 링 핑거(Ring finger) 모티프를 1개 포함하는 것이 판명되었다(코돈 272∼312)(도 23b).
(23) myc 표지 RNF43 단백질의 세포내 위치(localization)
RNF43 단백질의 세포내 위치를 조사하기 위하여, myc 표지 RNF43 단백질을 발현하는 플라스미드(pDNAmyc/His-RNF43)를 COS7 세포에 일과성으로 트랜스펙트하였다. 이 세포로부터 추출물 및 항 myc 항체를 이용한 웨스턴블롯 분석에 의하여, 표지된 단백질에 대응하는 85.5KDa의 밴드가 표시되었다(도 24a). 계속하여, 동일 항체를 이용하여 세포의 면역조직화학 염색을 하였는 바, 이 단백질이 주로 핵내에 존재하는 것이 밝혀졌다(도 24b). SW480 사람 직장암 세포에서도 RNF43 단백질의 동일한 세포내 위치가 관찰되었다.
(24) 세포증식에 대한 RNF43의 효과
RNF43을 발현하는 플라스미드(pcDNA-RNF43)를 NIH3T3 세포에 트랜스펙트하는 것에 의하여, 콜로니 형성 에세이를 하였다. pcDNA-RNF43을 트랜스펙트한 세포는, 대조 세포보다도 유의적으로 다수의 콜로니를 형성하였다(도 25a). RNF43에 의한 콜로니 형성 활성의 상승은, RNF43의 내인성 발현이 극히 적은 SW480 세포에서도 나타났다(데이터는 표시하지 않음). 이 증식촉진 작용을 더욱 검토하기 위하여, 외인성 RNF43을 안정적으로 발현하는 COS7 세포(COS7-RNF43)를 수립(establish)하였다(도 25b). 10% FBS를 포함하는 배양액 중에서의 COS7-RNF43 세포의 증식속도는 COS7-유사(mock) 세포의 증식속도 보다도 유의적으로 높았다(도 25c).
(25) RNF43의 발현을 저하시키도록 지정된 안티센스 S-올리고 뉴클레오타이드에 의한, 결장암 세포의 증식억제
RNF43의 발현억제가 결장암 세포의 증식 지연 및/또는 세포사를 초래하는지 여부를 검증하기 위하여, 대조 S-올리고뉴클레오타이드 및 RNF43에 대응하는 안티센스 S-올리고뉴클레오타이드를 5쌍 합성하여, 검토한 11종의 결장암 세포주 중에서 RNF43의 발현레벨이 가장 높았던 LoVo 결장암 세포에 트랜스펙트 하였다. 5종류의 안티센스 S-올리고뉴클레오타이드 중에서, RNF43-AS1은, 트랜스펙션으로부터 12시간 후의 시점에서, 대조 S-뉴클레오타이드(RNF43-S1)와 비교하여 RNF43의 발현을 유의적으로 억제하였다(도 26a). 트랜스펙션으로부터 6일후의 시점에서, RNF43-AS1을 트랜스펙트한 생세포의 수는 RNF43-S1을 트랜스펙트한 생세포의 수보다도 유의적으로 적었고, 이것으로부터 RNF43의 발현억제가 트랜스펙트 세포의 증식 및/또는 생존성을 저하시키는 것이 시사되었다(도 26b). 3회의 독립된 실험으로 일치하는 결과가 얻어졌다.
(26) RNF43 siRNA를 발현하는 플라스미드의 구축 및 결장암 세포의 증식에 대한 그 효과
포유동물 세포에 있어서, 19개의 상보적 뉴클레오타이드 및 3' 말단의 티미딘(thymidine) 또는 우리딘(uridine)의 상보적 이중체(dimer)를 가지는 20mer 또는 21mer의 이중사슬 RNA(ds RNA)로 구성되는 저분자 간섭 RNA(siRNA)는, 유전자 발현의 전체적인 변화를 동반하지 않고, 유전자-특이적인 유전자 사일런싱(silencing) 작용을 가지는 것이 최근 밝혀져 있다. 이 때문에, RNF43 발현에 대한 효과에 관하여 검토하기 위하여, 다양한 RNF43-siRNA를 발현하는 플라스미드를 구축하였다. 각종 RNF43-siRNA 중에서, psiH1BX-RNF16-4 및 psiH1BX-RNF1834는, SNUC4세포에 있어서 RNF43의 발현을 유의적으로 억제하였다(도 27A). RNF43의 억제가 결장암 세포의 증식억제를 초래하는지 여부를 검증하기 위하여, SNUC4세포에 psiH1BX-RNF16-4, psiH1BX-RNF1834, 또는 유사 벡터를 트랜스펙트 하였다. 안티센스 S-올리고뉴클레오타이드의 데이터와 일치하게, psiH1BX-RNF16-4 또는 psiH1BX-RNF1834를 트랜스펙트한 생세포의 수는 대조 생세포의 수보다도 적었다(도 27B, 27C).
(27) 외인성 Flag 표지 RNF43 단백질에 의한, COS7 세포의 배양액 중에의 Flag 표지 RNF43 단백질의 분비
RNF43의 아미노산 서열을 가지는 단백질 모티프에 관한, SMART(Simple Modular Architecture Research Tool, http://smart.embl-heidelberg.de)를 이용한 검색에 의하여, 1개의 시그널 펩티드 및 1개의 링 핑커(ring finger) 도메인이 예측되었기 때문에, RNF43 단백질의 분비에 관하여 검토하였다. Flag 표지 RNF43을 발현하는 플라스미드(pFLAG-RNF43) 또는 Myc 표지 RNF43을 발현하는 플라스미드(pcDNA3.1-Myc/His-RNF43) 또는 유사 벡터를 COS7 세포에 트랜스펙트하고, 0.5% 소 송아지 혈청(bovine calf serum)을 첨가하여 배지내에서 세포를 48시간 배양하였다. 항Flag 항체 또는 항Myc 항체를 이용한 웨스턴 블롯 분석에 의하여, 분비된 Flag 표지 RNF43 또는 Myc 표지 단백질이, 각각 pFLAG-RNF43 또는 pcDNA3.1-Myc/His-RNF43을 트랜스펙트한 세포를 포함하는 배지내에서는 검출되었지만, 유사 벡터를 가지는 세포를 포함하는 배지내에서는 검출되지 않았다(도 28A 및 28B).
(28) NIH3T3 세포에 대한, pFLAG-RNF43을 트랜스펙트한 세포의 배양액의 효과
RNF43의 외인성 발현은 NIH3T3 세포에 대한 증식촉진 작용을 초래하기 때문에, 분비된 Flag 표지 RNF43에도 NIH3T3 세포에 대한 증식작용이 있는가 여부를 검토하였다. NIH3T3 세포를 배지를 변경하지 않고 배양하던가, 유사 트랜스펙트 세포 또는 pFlag-RNF43을 트랜스펙트한 세포의 순화배지(conditioned media)를 이용하여 배양하였다. 예상된 바와 같이, pFlag-RNF43 또는 pcDNA3.1-Myc/His-RNF43로 트랜스펙트된 세포의 순화배지 중에서 배양된 세포는, 비처리세포 또는 유사 벡터로 트랜스펙트된 세포의 순화배지 중에서 배양한 세포와 비교하여 유의적으로 높은 증식속도를 보였다(도 29A 및 29B). 이들 데이터는, RNF43이 그 증식촉진 작용을 자기분비적인(autocrining) 방식으로 발휘하는 것을 시사한다.
(29)재조합 아미노산 말단 및 카르복실 말단 RNF43 단백질의 제조
RNF43에 대한 특이적 항체를 제작하기 위하여, Nus 표지 RNF43 단백질을 발현하는 플라스미드를 구축하였다(도 30A). 이 플라스미드를 대장균 BL21trxB(DE3)pLysS 세포에 형질전환도입(transformation) 하였을 때, 세균 추출물에 있어서 예상된 사이즈의 재조합 단백질 생산이 SDS-PAGE에 의해 관찰되었다(도 30B 및 30C).
(30)효모 2-하이브리드 스크리닝 시스템에 의한 RNF43 상호작용성 단백질의 동정
RNF43의 발암 기구(oncogenic mechanism)를 명백히 하기 위하여, 효모 2-하이브리드 스크리닝 시스템을 이용하여 RNF43 상호작용성 단백질을 검색하였다. 동정된 양성 클론 중에서, NOTCH2 또는 STRIN은, 효모세포에서 pAS2.1-RNF43 및 pACT2-NOTCH2(도 31B), 또는 pAS2.1-RNF43 및 pACT2-STRIN(도 32B)를 이용한 동시 형질전환에 의하여, RNF43과 상호작용 하였다. NOTCH2 및 STRIN에 있어서 상호작용의 원인으로 되는 영역은 각각 도 31A 및 도 32A에 표시되어 있다.
(31) RNF43 유래의 HLA-A24 결합 펩티드의 예측
RNF43의 아미노산 서열을, HLA-A24와 결합하는 펩티드인 9 아미노산 길이 또는 10 아미노산 길이의 펩티드에 관하여, 결합예측 소프트(http://bimas.dcrt.nih.gov/cgi-bin/molbio/ken_parker_comboform)를 이용하여 스캔하였다. 표3은, 예측된 펩티드(서열번호: 71∼90)를 결합 친화성이 높은 순으로 표시하고 있다. 합계 20종의 펩티드를 하기와 같이 선택하여 검토하였다.
이 표에 있어서, 개시위치는 RNF43의 N 말단으로부터의 아미노산의 위치를 나타낸다.
(32) 예측된 펩티드를 이용한 T세포의 자극
RNF43 유래의 이들 펩티드에 대한 CTL을, 「재료 및 방법」의 페이지에 기재한 방법에 따라서 제작하였다. 그 결과 얻어진, 검출가능한 세포독성을 보이는 림프계 세포를 증폭하여 CTL 계열(CTL lines)을 수립하였다.
9mer 펩티드(서열번호: 71∼80) 자극에 의하여 유도된 CTL 계열의 세포독성 활성을 표4에 표시하였다.
NE: CTL클론이 수립되지 않음
RNF43-350(HYHLPAAYL)(서열번호: 72), RNF43-639(LFNLQKSSL)(서열번호: 73), 및 RNF43-721(NSQPVWLCL)(서열번호: 80)에 의하여 자극된 CTL 계열은, 펩티드로 표지하지 않은 표적에 대한 세포독성 활성과 비교하여, 펩티드로 표지한 표적에 대한 세포독성 활성을, 보다 높은 정도로 나타났다. 이들 CTL클론으로부터 출발하여, RNF43-639에 관하여 1개의 CTL클론이 수립되고, RNF43-721에 관하여 13종의 CTL 클론이 수립되었다.
RNF43-721에 의하여 자극된 CTL계열은, 펩티드로 표지한 표적에 대하여 강력한 세포독성 활성을 보였지만, 펩티드로 표지하지 않은 표적에 대해서는 어떠한 세포독성 활성도 보이지 않았다(도 33).
10mer 펩티드(서열번호: 81∼90)로 자극한 CTL계열의 세포독성 활성을 검토하는 것에 의하여 얻어진 결과를 표5에 표시하였다.
NE: CTL클론이 수립되지 않음
RNF43-81(KLMQSHPLYL)(서열번호: 87) 또는 RNF43-54(KMDPTGKLNL)(서열번호: 88)에 의하여 자극된 CTL계열은, 펩티드로 표지하지 않았던 표적에 대한 세포독성 활성과 비교하여, 펩티드로 표지한 표적에 대하여 약간의(modest) 세포독성 활성을 보였다.
(33) CTL클론의 수립
상기와 같이, 한계분석법을 이용하여 CTL 클론을 CTL 계열로부터 증식시켰다. RNF43-721에 대한 13종의 CTL 클론, 및 RNF43-639에 대한 1개의 CTL 클론이 수립되었다(표4, 상기 참조). RNF43-721 CTL 클론의 세포독성 활성은 도 34에 표시되어 있다. 각각의 CTL 클론은, 펩티드로 표지한 표적에 대하여 강력한 세포독성 활성을 보였지만, 펩티드로 표지하지 않았던 표적에 대해서는 어떠한 세포독성 활성도 보이지 않았다.
(34) RNF43을 표적으로 하여 내인성으로 발현하는 결장직장암(colorectal cancer) 세포주에 대한 세포독성 활성
예측된 펩티드에 대하여 생성시킨 CTL클론에 관하여, RNF43을 내인성으로 발현하는 종양세포를 인식하여 사멸시키는 능력을 검토하였다. 도 35는, RNF43-721에 대하여 생성시킨 CTL클론 45의 결과를 표시하고 있다. CTL클론 45는, RNF43 및 HLA-A24를 모두 발현하는 HT29 및 WiDR에 대하여 강력한 세포독성 활성을 보였다. 일방, CTL 클론 45는, HCT116(RNF43을 발현하지만 HLA-A24는 발현하지 않음) 또는 TISI(HLA-A24를 발현하지만 RNF43은 발현하지 않음)에 대해서는 세포독성 활성을 보이지 않았다. 더욱 CTL클론 45는, 관계없는(irrelevant) 펩티드로 표지한 TISI, 및 RNF43을 발현하지만 HLA-A24는 거의 발현하지 않은 SNU-C4에 대해서는 세포독성 활성을 보이지 않았다(데이터는 표시하지 않음).
(35) 수립된 CTL의 특징 분석
RNF43-721 CTL 클론의 특이성을 확실히 하기 위하여, 비방사성 표적 저해 에세이(cold target inhibition assay)를 하였다. 51Cr에 의하여 표지한 HT29 세포를 방사성 표적으로 이용하고, 51Cr 표지를 하지 않고 RNF43-721로 표지한 TISI 세포를 비방사성 표적으로서 이용하였다. RNF43-721로 표지한 TISI를 에세이에서 다양한 비율로 첨가했을 때, HT29세포에 대한 특이적 세포용해는 유의적으로 저해되었다(도 36). 이 결과는, E/T비를 20으로 한 경우의 특이적 용해 비율(percentage)로 표시되어 있다. RNF43 펩티드에 대하여 생성시킨 CTL 클론의 특징을 검토하기 위하여, HLA 클래스 I, HLA 클래스 II, CD3, CD4 및 CD8에 대한 항체에 관하여, CTL 클론 세포독성을 저해하는 능력을 조사하였다. WiDR 세포 표적에 대한 CTL클론의 세포독성은, 항 HLA 클래스 I 항체, 항 CD3 항체 및 항 CD8 항체를 이용한 경우에 유의적으로 저하하였다(도 37). 이 결과는, CTL클론이 RNF43 유래의 펩티드를 HLA 클래스 I, CD3 및 CD8을 매개로 인식하는 것을 나타내고 있다.
(36) RNF43-721 펩티드의 상동성 분석
RNF43-721에 대하여 수립된 CTL 클론은 극히 강력한 세포독성 활성을 보였다. 이 결과는, RNF43-721의 서열이, 인간 면역계를 감작시키는(sensitize) 것이 알려진 다른 분자에서 유래하는 펩티드와 상동성(homologous) 있는 것을 나타낼 가능성이 있다. 이 가능성을 부정하기 위하여, BLAST(http://www.ncbi. nlm.nih.gov/blast/blast.cgi)를 이용하여 RNF43-721의 상동성 분석을 하였다. BLAST에서 얻어진 분자 중에는, RNF43-721과 완전히 일치하는 서열도 상동성이 높은 서열도 인지되지 않았다(표 6).
이들 결과는, RNF43-721의 서열이 특유하고, RNF43-721을 이용하여 수립된 CTL클론이 다른 분자에 대한 면역반응을 유발할 가능성이 낮음을 나타내고 있다.
(37) 에피토프 제시 효율을 향상시키기 위한 RNF43-721의 변형(modification)
펩티드 제시의 효율을 향상시키기 위하여, RNF43-721 펩티드를 앵커(anchor) 부위에서의 아미노산 변경에 의하여 변형시켰다. 이 변경에 의하여, 펩티드의 HLA 클래스 I 분자에 대한 결합 친화성이 향상될 것으로 생각되었다. 표 7은, 아미노산의 2번 위치가 변경된 RNF43-721에 있어서 HLA-A24 분자에 대한 결합 친화성이 향상된 것을 보이고 있다(서열번호: 91 및 92).
RNF43-721의 원래 펩타이드로부터 변경된 펩타이드의 예상되는 결합 능력
서 열 스코어 순위*
NSQPVWLCL 10.08 10
NFQPVWLCL 50.40 3
NYQPVWLCL 504.00 1
*HLA-A24 제한적인(restricted) 9mer 펩티드
38) RNF43 유래의 후보 펩티드의 예측
표 8은, 후보 펩티드(서열번호: 87 및 93∼111)를 결합친화성이 높은 순서로 표시하고 있다.
합계 20종의 펩티드를 하기와 같이 선택하여 검토하였다.
(39) 후보 펩티드를 이용한 T세포의 자극
「재료 및 방법」의 페이지에 기재한 방법에 따라서, RNF43 유래의 후보 펩티드를 이용하여 림프계 세포를 배양하였다. 그 결과 얻어진, 검출가능한 세포독성 활성을 나타내는 림프계 세포를 증폭하여 CTL클론을 수립하였다. 9mer 펩티드(서열번호: 93∼102)를 이용하여 자극함으로써 유도된 CTL 계열의 세포독성 활성을 표 9에 표시하였다.
NE: CTL클론이 수립되지 않음
RNF43-11-9(ALWPWLLMA)(서열번호: 97)에 의하여 유도된 CTL 계열은, 펩티드로 표지하지 않은 표적에 대한 세포독성 활성과 비교하여, 펩티드로 표지한 표적에 대한 세포독성 활성을, 보다 높은 정도로 보였다. 이들 CTL 클론으로부터 출발하여, 4종의 CTL클론이 RNF43-11-9를 이용하여 수립되었다. RNF43-11-9에 의하여 자극된 CTL계열은, 펩티드로 표지한 표적에 대하여 강력한 세포독성 활성을 보였지만, 펩티드로 표지하지 않은 표적에 대하여는 어떠한 명백한 세포독성 활성도 보이지 않았다.(도 38A).
10mer 펩티드(서열번호: 87 및 103∼111)에 의하여 자극된 CTL 계열의 세포독성 활성의 검토 결과를 표 10에 표시하였다.
NE: CTL클론이 수립되지 않음
RNF43-11-10(ALWPWLLMAT)(서열번호: 108)에 의하여 유도된 CTL계열은, 펩티드로 표지하지 않은 표적에 대한 세포독성 활성과 비교하여, 펩티드로 표지한 표적에 대한 세포독성 활성을, 보다 높은 정도로 보였다(도 38B).
(40) CTL 클론의 수립
CTL 클론을 상기의 CTL 계열로부터 한계희석법을 이용하여 증식시켰다. RNF43-11-9에 대한 4종의 CTL 클론이 수립되었다(표 9, 상기 참조). RNF43 펩티드 유래의 CTL클론의 세포독성 활성은 도 39A 및 39B에 표시되어 있다. 각각의 CTL클론은, 펩티드로 표지하지 않은 표적에 대해서는 어떠한 세포독성 활성도 보이지 않았지만, 펩티드로 표지한 표적에 대해서는 극히 강력한 세포독성 활성을 보였다.
(41) RNF43을 표적으로 하여 내인성으로 발현하는 결장직장암 세포주에 대한 세포독성 활성
예측된 펩티드에 대하여 생성시킨 CTL 클론에 관하여, RNF43을 내인성으로 발현하는 종양세포를 인식하여 사멸시키는 능력을 검토하였다. 도 40A 및 40B는, RNF43 유래의 펩티드에 대하여 생성시킨 CTL 클론에 관하여 얻어진 결과를 표시하고 있다. 이들 CTL 클론은, RNF43 및 HLA-A*0201 모두를 발현하는 DLD-1에 대하여는 강력한 세포독성 활성을 보였지만, RNF43을 발현하지만 HLA-A*0201을 발현하지 않는 HT29에 대해서는 세포독성 활성을 보이지 않았다.
(42) CTL 클론의 특이성
RNF43-11(9mer) CTL 클론의 특이성을 확실히 하기 위하여, 비방사성 표적 저해 에세이를 하였다. 51Cr으로 표지된 HCT116 세포를 방사성 표적으로서 이용하고, 51Cr 표지를 하지 않고서 RNF43-11로 표지한 T2 세포를 비방사성 표적으로서 이용하였다. HCT-116 세포 표적의 특이적 세포용해는, RNF43-11로 표지한 T2를 에세이에서 다양한 비율로 첨가할 때 유의적으로 저해되었다(도 41).
신규한 사람 유전자 CXADRL1 및 GCUD1의 발현은, 비암 위조직과 비교하여 위암에 있어서 현저히 상승되어 있다. 일방, 신규한 사람 유전자 RNF43의 발현은 비암 점막조직과 비교하여 결장직장암에 있어서 현저히 상승되어 있다. 따라서, 이들 유전자는 암의 진단 마커로서 유용할 가능성이 있고, 이들 유전자에 의하여 코드된 단백질은 암의 진단 에세이에 이용될 가능성이 있다.
본 발명자들은, 신규한 단백질 CXADRL1, GCUD1 또는 RNF43의 발현이 세포 증식을 촉진하여, 일방, CXADRL1, GCUD1 또는 RNF43 유전자에 대응하는 안티센스 올리고 뉴클레오타이드 또는 저분자 간섭 RNA에 의하여 세포증식이 억제되는 것도 보였다. 이러한 결과는, CXADRL1, GCUD1 및 RNF43 단백질 각각이 발암 활성(oncogenic activity)을 유발하는 것을 시사한다. 이 때문에, 이들 신규한 종양성 단백질은 항암 약제의 개발에 있어서 유용한 표적이 된다. 예를 들어, CXADRL1, GCUD1 또는 RNF43의 발현을 저지하는 작용물질, 또는 그 활성을 방해하는 작용물질에는, 항암제, 특히 위암 및 결장직장암의 치료용 항암제로서 치료상의 유용성이 있다고 사료된다. 이와 같은 작용물질의 예로는, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 저분자 간섭(small interfering) RNA, 및 CXADRL1, GCUD1 또는 RNF43을 인식하는 항체가 포함된다.
더욱, 본 발명자들은, CXADRL1이 AIP1과 상호작용하는 것을 보였다. CXADRL1의 세포증식 활성은 CXADRL1과 AIP1의 결합에 의하여 조절될 것으로 생각된다. 이 때문에, CXADRL1과 AIP1로 구성되는 복합체의 형성 활성을 저해하는 작용물질도, 암, 특히 결장직장암, 폐암, 위암, 및 간암의 치료 및 예방에 유용할 가능성이 있다. 또, 본 발명자들은 RNF43이 NOTCH2 또는 STRIN과 상호작용하는 것도 보였다. RNF43의 세포증식 활성은 RNF43과 NOTCH2 또는 STRIN과의 결합에 의하여 조절되다고 생각된다. 이 때문에, RNF43과 NOTCH2 또는 STRIN으로 구성되는 복합체의 형성 활성을 저해하는 작용물질도, 암, 특히 결장직장암, 폐암, 위암 및 간암의 치료 및 예방에 유용할 가능성이 있다.
본 발명을, 그 특정의 태양으로 언급하면서 상세히 설명하고 있지만, 발명의 취지 및 범위로부터 벗어나지 않고서, 다양한 변경 및 수정을 할 수 있음은 당업자에게 명백하다고 생각된다.
<110> ONCOTHERAPY SCIENCE, INC. JAPAN AS REPRESENTED BY THE PRESIDENT OF THE UNIVERSITY OF TOKYO <120> GENES AND POLYPEPTIDES RELATING TO HUMAN COLON CANCERS <130> 4fpi-11-11 <150> US 60/386,985 <151> 2002-06-06 <150> US 60/415,209 <151> 2002-09-30 <150> US 60/451,013 <151> 2003-02-28 <160> 194 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 3423 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (238)..(1530) <400> 1 gctggcgagc ccggaacgcc tctggtcaca gctcagcgtc cgcggagccg ggcggcgctg 60 gagctgcact tggctcgtct gtgggtctga cagtcccagc tctgcgcggg gaacagcggc 120 ccggagctgg gtgtgggagg accaggctgc cccaagagcg cggagactca cgcccgctcc 180 tctcctgttg cgaccgggag ccgggtagga ggcaggcgcg ctccctgcgg ccccggg 237 atg act tct cag cgt tcc cct ctg gcg cct ttg ctg ctc ctc tct ctg 285 Met Thr Ser Gln Arg Ser Pro Leu Ala Pro Leu Leu Leu Leu Ser Leu 1 5 10 15 cac ggt gtt gca gca tcc ctg gaa gtg tca gag agc cct ggg agt atc 333 His Gly Val Ala Ala Ser Leu Glu Val Ser Glu Ser Pro Gly Ser Ile 20 25 30 cag gtg gcc cgg ggt cag cca gca gtc ctg ccc tgc act ttc 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cagtgttgcc cagatgcatt ttacatcact gtaaagagat tacttttgtg 2790 gttactacct ggcttggctg gccttgcggt tcaccagatt aatttacaaa ctcccccact 2850 ttattttgtg ctatgtagat ctggccatac ttgcattagt gactgtcttg ccttaaccac 2910 acttaagcaa cccacaaatt tcttctcaga tttgtttcct agattactta tgatactcat 2970 cccatgtctc aataagagtg tcttttcttt ctggatgtgt tctcttactc cctcttacca 3030 ccatactttt tgctctcttc tcctgcaagc gtagtcttca cagggagtgg cttcctgaca 3090 tttttttcag ttatgtgaat gaatggaaac caacagctgc tgcaaacact gtttttccaa 3150 gaaggctaca ctcagaacct aaccattgcc aaccatttca gtattgataa aaagctgaat 3210 ttactttagc attacttatt tttttttcca tttgatggtt cttactttgt aaaaatttaa 3270 ataaatgaat gtctatactt tttataaaga aaagtgaaaa taccatgaca ctgaaaagat 3330 gatgctatca gatgctgttt agaaagcatt tatcttgcat ttctttattc tttctaatta 3390 tctaaaattc aataaaattt tattcatata aaa 3423 <210> 2 <211> 431 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Thr Ser Gln Arg Ser Pro Leu Ala Pro Leu Leu Leu Leu Ser Leu 1 5 10 15 His Gly Val Ala Ala Ser Leu Glu Val Ser Glu Ser Pro Gly Ser Ile 20 25 30 Gln Val Ala Arg Gly Gln Pro Ala Val Leu Pro Cys Thr Phe Thr Thr 35 40 45 Ser Ala Ala Leu Ile Asn Leu Asn Val Ile Trp Met Val Thr Pro Leu 50 55 60 Ser Asn Ala Asn Gln Pro Glu Gln Val Ile Leu Tyr Gln Gly Gly Gln 65 70 75 80 Met Phe Asp Gly Ala Pro Arg Phe His Gly Arg Val Gly Phe Thr Gly 85 90 95 Thr Met Pro Ala Thr Asn Val Ser Ile Phe Ile Asn Asn Thr Gln Leu 100 105 110 Ser Asp Thr Gly Thr Tyr Gln Cys Leu Val Asn Asn Leu Pro Asp Ile 115 120 125 Gly Gly Arg Asn Ile Gly Val Thr Gly Leu Thr Val Leu Val Pro Pro 130 135 140 Ser Ala Pro His Cys Gln Ile Gln Gly Ser Gln Asp Ile Gly Ser Asp 145 150 155 160 Val Ile Leu Leu Cys Ser Ser Glu Glu Gly Ile Pro Arg Pro Thr Tyr 165 170 175 Leu Trp Glu Lys Leu Asp Asn Thr Leu Lys Leu Pro Pro Thr Ala Thr 180 185 190 Gln Asp Gln Val Gln Gly Thr Val Thr Ile Arg Asn Ile Ser Ala Leu 195 200 205 Ser Ser Gly Leu Tyr Gln Cys Val Ala Ser Asn Ala Ile Gly Thr Ser 210 215 220 Thr Cys Leu Leu Asp Leu Gln Val Ile Ser Pro Gln Pro Arg Asn Ile 225 230 235 240 Gly Leu Ile Ala Gly Ala Ile Gly Thr Gly Ala Val Ile Ile Ile Phe 245 250 255 Cys Ile Ala Leu Ile Leu Gly Ala Phe Phe Tyr Trp Arg Ser Lys Asn 260 265 270 Lys Glu Glu Glu Glu Glu Glu Ile Pro Asn Glu Ile Arg Glu Asp Asp 275 280 285 Leu Pro Pro Lys Cys Ser Ser Ala Lys Ala Phe His Thr Glu Ile Ser 290 295 300 Ser Ser Asp Asn Asn Thr Leu Thr Ser Ser Asn Ala Tyr Asn Ser Arg 305 310 315 320 Tyr Trp Ser Asn Asn Pro Lys Val His Arg Asn Thr Asp Ser Val Ser 325 330 335 His Phe Ser Asp Leu Gly Gln Ser Phe Ser Phe His Ser Gly Asn Ala 340 345 350 Asn Ile Pro Ser Ile Tyr Ala Asn Gly Thr His Leu Val Pro Gly Gln 355 360 365 His Lys Thr Leu Val Val Thr Ala Asn Arg Gly Ser Ser Pro Gln Val 370 375 380 Met Ser Arg Ser Asn Gly Ser Val Ser Arg Glu Pro Arg Pro Pro His 385 390 395 400 Thr His Ser Tyr Thr Ile Ser His Ala Thr Leu Glu Arg Ile Gly Ala 405 410 415 Val Pro Val Met Val Pro Ala Gln Ser Arg Ala Gly Ser Leu Val 420 425 430 <210> 3 <211> 4987 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (60)..(1301) <223> cDNA <400> 3 gcggccgcag cctcagcacc gcagagcgga gagcggagcc cggagcccgc cgccccagg 59 atg gct gca gct cct cca agt tac tgt ttt gtt gcc ttc cct cca cgt 107 Met Ala Ala Ala Pro Pro Ser Tyr Cys Phe Val Ala Phe Pro Pro Arg 1 5 10 15 gct aag gat ggt ctg gtg gta ttt ggg aaa aat tca gcc cgg ccc aga 155 Ala Lys Asp Gly Leu Val Val Phe Gly Lys Asn Ser Ala Arg Pro Arg 20 25 30 gat gaa gtg caa gag gtt gtg tat ttc tcg gct gct gat cac gaa ccg 203 Asp Glu Val Gln Glu Val Val Tyr Phe Ser Ala Ala Asp His Glu Pro 35 40 45 gag agc aag gtt gag tgc act tac att tca atc gac caa gtt cca agg 251 Glu Ser Lys Val Glu Cys Thr Tyr Ile Ser Ile Asp Gln Val Pro Arg 50 55 60 acc tat gcc ata atg ata agc aga ccc gcc tgg ctc tgg gga gca gaa 299 Thr Tyr Ala Ile Met Ile Ser Arg Pro Ala Trp Leu Trp Gly Ala Glu 65 70 75 80 atg gga gcc aat gaa cat gga gtg tgc ata gcc aat gaa gcc atc aac 347 Met Gly Ala Asn Glu His Gly Val Cys Ile Ala Asn Glu Ala Ile Asn 85 90 95 acc aga gag cca gct gcc gag ata gaa gcc ttg ctg ggg atg gat ctg 395 Thr Arg Glu Pro Ala Ala Glu Ile Glu Ala Leu Leu Gly Met Asp Leu 100 105 110 gtc agg ctt ggt tta gaa aga ggg gaa aca gct aaa gaa gcc tta gat 443 Val Arg Leu Gly Leu Glu Arg Gly Glu Thr Ala Lys Glu Ala Leu Asp 115 120 125 gtc att gtc tcc ttg ttg gaa gaa cat gga caa ggt ggg aat tac ttt 491 Val Ile Val Ser Leu Leu Glu Glu His Gly Gln Gly Gly Asn Tyr Phe 130 135 140 gaa gat gca aac tcc tgc cac agc ttc caa agt gca tat ctg att gtg 539 Glu Asp Ala Asn Ser Cys His Ser Phe Gln Ser Ala Tyr Leu Ile Val 145 150 155 160 gat cgt gat gaa gcc tgg gtg ctc gag acc ata ggg aag tac tgg gct 587 Asp Arg Asp Glu Ala Trp Val Leu Glu Thr Ile Gly Lys Tyr Trp Ala 165 170 175 gcc gag aaa gtc aca gag gga gtg agg tgc att tgc agt cag ctt tcg 635 Ala Glu Lys Val Thr Glu Gly Val Arg Cys Ile Cys Ser Gln Leu Ser 180 185 190 ctc acc act aag atg gat gca gag cat ccg gaa ctc agg agt tac gct 683 Leu Thr Thr Lys Met Asp Ala Glu His Pro Glu Leu Arg Ser Tyr Ala 195 200 205 cag agc caa ggt tgg tgg acg gga gag ggc gag ttc aat 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cct gcc aaa aag gag cct cgg 1067 Gln Ser Pro Cys Phe Gly Asp Asp Asp Pro Ala Lys Lys Glu Pro Arg 325 330 335 ttc cag gag aaa cca gac cgc cgg cat gag ctg tac aaa gcc cac gag 1115 Phe Gln Glu Lys Pro Asp Arg Arg His Glu Leu Tyr Lys Ala His Glu 340 345 350 tgg gca cgt gcc atc atc gaa agt gac cag gag caa ggt cgc aag ctg 1163 Trp Ala Arg Ala Ile Ile Glu Ser Asp Gln Glu Gln Gly Arg Lys Leu 355 360 365 agg agc acc atg ctg gag ctg gag aag caa ggc ctg gaa gcc atg gaa 1211 Arg Ser Thr Met Leu Glu Leu Glu Lys Gln Gly Leu Glu Ala Met Glu 370 375 380 gaa atc ctg acc agc tcc gag cca ctg gac cct gcg gaa gtg ggg gac 1259 Glu Ile Leu Thr Ser Ser Glu Pro Leu Asp Pro Ala Glu Val Gly Asp 385 390 395 400 ctt ttc tat gac tgt gtt gac acg gag att aag ttc ttt aag tgaagtaag 1310 Leu Phe Tyr Asp Cys Val Asp Thr Glu Ile Lys Phe Phe Lys 405 410 cgttcccttt ccccttctta tttaagactt cccaccttac taaattacca gcaaaacaaa 1370 ccactctcct gtttgagtaa aatgagaaag ttaatatgtg gcctcctttt ctgaagccag 1430 atcaaactgt taccttgtgt tccaccttga atctcacagc gtccccttct gcaatgtagg 1490 tctccttcct gtgcagtgta acatgtatcc cgttgcctgt tgttcggttg tgtgactaat 1550 tgtggatttt aagctgctat tattgtattt cagtggcaat ggacacatta gccttttaca 1610 agaggactag agttcatcaa gccttgaaag gcaggcttca cagtgccgag ttggcgggaa 1670 aagcaaattc ttttgaagtc ttagtctttc cctcagtagc ggtttctttc aggttaacaa 1730 gaggcatttg tgcacacaca cagggctctt gtgtgtgttg tcaaggggac cctccgtggc 1790 ctcccgtgag tgcatgcctg tagtgcacag tgtctctaca ggtgtcttct ggggggcaga 1850 accaattgga aggaagaaag ggacccctct ccagtcctgg ctccttccta catcctgggc 1910 tcctgaagaa gctgtcttcc cattttccat gcgctgtgct tatgtgtggt ggactgcaga 1970 gctgcttcca cttacaggag agctgataat ttgttagctg gaacctattc acttccgaga 2030 ttcagacata gccatgctgg tggccttctg aatcactgca tggatgtccc aggaggcagc 2090 tctccccaca cagcagcaca gccatcacag gattccttgt gtagaaatga ttcccagtct 2150 agttaccaac agctagtcta ggagtaattg aatggcccta tggcacagtt ccacccacag 2210 agtagtgaat ctctcagcca aggagggaaa gaaaaggaag aactcttgac tatttagatt 2270 ctagttaaat atctggaatc ctagcagtca ctacattatc tcagcagaga gactttaatt 2330 aaactgattt gtttccaatg tcgggttcac ttaaaggatt tgacttacca ccagagcata 2390 gaaaagcatg caaggaagac cagatgggct tagcattggg aagacagagg gcaaggaggt 2450 gatagatgga tatagaagca tttctctgca ggataccagt tcaggcccca ccattcctgc 2510 caaggccatt acatcccaca aacccaaata caaagcagct gacttccctg gatcttcccc 2570 ccactcctca cacctcacat gtcccaggag ctgccttcat tcaggcgggt agctgcactg 2630 ggcatggggt ggtggtggga gcttaccgcc acctattcaa gctctcagct actcctgaaa 2690 cgggcagaga tgatgaacag aagtgtatgt aaatacagca gctagtggga gagcaccagt 2750 tgggcctaat cctgcctcat cattcttggc aggaatctgc aaatggaaac attgtgagta 2810 tcagcaatct gggaagtgac agggttaata actccttccc agaagctgta tcatgagatt 2870 ttgaggggac cgagccctgt tacatggatg tgaacagtga ggatcagagg ttttatcaga 2930 acacattctt tttttctacc aactctccag agcgtgagta taggagtgcc atgagctttt 2990 tagtcagcag ttttgtaaac tctgtatata aaatcattaa ccacacattg tgggtgatgg 3050 gaagacgatt tcagctgaca gagttaatgg caaccaataa tggtggcctg tagctgctaa 3110 gagcttcacg caggtttggc 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Leu Ala Ala Leu Trp Pro 1 5 10 tgg ctg ctg atg gct acc ctg cag gca ggc ttt gga cgc aca gga ctg 578 Trp Leu Leu Met Ala Thr Leu Gln Ala Gly Phe Gly Arg Thr Gly Leu 15 20 25 30 gta ctg gca gca gcg gtg gag tct gaa aga tca gca gaa cag aaa gct 626 Val Leu Ala Ala Ala Val Glu Ser Glu Arg Ser Ala Glu Gln Lys Ala 35 40 45 att atc aga gtg atc ccc ttg aaa atg gac ccc aca gga aaa ctg aat 674 Ile Ile Arg Val Ile Pro Leu Lys Met Asp Pro Thr Gly Lys Leu Asn 50 55 60 ctc act ttg gaa ggt gtg ttt gct ggt gtt gct gaa ata act cca gca 722 Leu Thr Leu Glu Gly Val Phe Ala Gly Val Ala Glu Ile Thr Pro Ala 65 70 75 gaa gga aaa tta atg cag tcc cac ccg ctg tac ctg tgc aat gcc agt 770 Glu Gly Lys Leu Met Gln Ser His Pro Leu Tyr Leu Cys Asn Ala Ser 80 85 90 gat gac gac aat ctg gag cct gga ttc atc agc atc gtc aag ctg gag 818 Asp Asp Asp Asn Leu Glu Pro Gly Phe Ile Ser Ile Val Lys Leu Glu 95 100 105 110 agt cct cga cgg gcc ccc cgc ccc tgc ctg tca ctg gct agc aag gct 866 Ser Pro Arg Arg Ala Pro Arg Pro Cys Leu Ser Leu Ala Ser Lys Ala 115 120 125 cgg atg gcg ggt gag cga gga gcc agt gct gtc ctc ttt gac atc act 914 Arg Met Ala Gly Glu Arg Gly Ala Ser Ala Val Leu Phe Asp Ile Thr 130 135 140 gag gat cga gct gct gct gag cag ctg cag cag ccg ctg ggg ctg acc 962 Glu Asp Arg Ala Ala Ala Glu Gln Leu Gln Gln Pro Leu Gly Leu Thr 145 150 155 tgg cca gtg gtg ttg atc tgg ggt aat gac gct gag aag ctg atg gag 1010 Trp Pro Val Val Leu Ile Trp Gly Asn Asp Ala Glu Lys Leu Met Glu 160 165 170 ttt gtg tac aag aac caa aag gcc cat gtg agg att gag ctg aag gag 1058 Phe Val Tyr Lys Asn Gln Lys Ala His Val Arg Ile Glu Leu Lys Glu 175 180 185 190 ccc ccg gcc tgg cca gat tat gat gtg tgg atc cta atg aca gtg gtg 1106 Pro Pro Ala Trp Pro Asp Tyr Asp Val Trp Ile Leu Met Thr Val Val 195 200 205 ggc acc atc ttt gtg atc atc ctg gct tcg gtg ctg cgc atc cgg tgc 1154 Gly Thr Ile Phe Val Ile Ile Leu Ala Ser Val Leu Arg Ile Arg Cys 210 215 220 cgc ccc cgc cac agc agg ccg gat ccg ctt cag cag aga aca gcc tgg 1202 Arg Pro Arg His Ser Arg Pro Asp Pro Leu Gln Gln Arg Thr Ala Trp 225 230 235 gcc atc agc cag ctg gcc acc agg agg tac cag gcc agc tgc agg cag 1250 Ala Ile Ser Gln Leu Ala Thr Arg Arg Tyr Gln Ala Ser Cys Arg Gln 240 245 250 gcc cgg ggt gag tgg cca gac tca ggg agc agc tgc agc tca gcc cct 1298 Ala Arg Gly Glu Trp Pro Asp Ser Gly Ser Ser Cys Ser Ser Ala Pro 255 260 265 270 gtg tgt gcc atc tgt ctg gag gag ttc tct gag ggg cag gag cta cgg 1346 Val Cys Ala Ile Cys Leu Glu Glu Phe Ser Glu Gly Gln Glu Leu Arg 275 280 285 gtc att tcc tgc ctc cat gag ttc cat cgt aac tgt gtg gac ccc tgg 1394 Val Ile Ser Cys Leu His Glu Phe His Arg Asn Cys Val Asp Pro Trp 290 295 300 tta cat cag cat cgg act tgc ccc ctc tgc gtg ttc aac atc aca gag 1442 Leu His Gln His Arg Thr Cys Pro Leu Cys Val Phe Asn Ile Thr Glu 305 310 315 gga gat tca ttt tcc cag tcc ctg gga ccc tct cga tct tac caa gaa 1490 Gly Asp Ser Phe Ser Gln Ser Leu Gly Pro Ser Arg Ser Tyr Gln Glu 320 325 330 cca ggt cga aga ctc cac ctc att cgc cag cat ccc ggc cat gcc cac 1538 Pro Gly Arg Arg Leu His Leu Ile Arg Gln His Pro Gly His Ala His 335 340 345 350 tac cac ctc cct gct gcc tac ctg ttg ggc cct tcc cgg agt gca gtg 1586 Tyr His Leu Pro Ala Ala Tyr Leu Leu Gly Pro Ser Arg Ser Ala Val 355 360 365 gct cgg ccc cca cgg cct ggt ccc ttc ctg cca tcc cag gag cca ggc 1634 Ala Arg Pro Pro Arg Pro Gly Pro Phe Leu Pro Ser Gln Glu Pro Gly 370 375 380 atg ggc cct cgg cat cac cgc ttc ccc aga gct gca cat ccc cgg gct 1682 Met Gly Pro Arg His His Arg Phe Pro Arg Ala Ala His Pro Arg Ala 385 390 395 cca gga gag cag cag cgc ctg gca gga gcc cag cac ccc tat gca caa 1730 Pro Gly Glu Gln Gln Arg Leu Ala Gly Ala Gln His Pro Tyr Ala Gln 400 405 410 ggc tgg gga atg agc cac ctc caa tcc acc tca cag cac cct gct gct 1778 Gly Trp Gly Met Ser His Leu Gln Ser Thr Ser Gln His Pro Ala Ala 415 420 425 430 tgc cca gtg ccc cta cgc cgg gcc agg ccc cct gac agc agt gga tct 1826 Cys Pro Val Pro Leu Arg Arg Ala Arg Pro Pro Asp Ser Ser Gly Ser 435 440 445 gga gaa agc tat tgc aca gaa cgc agt ggg tac ctg gca gat ggg cca 1874 Gly Glu Ser Tyr Cys Thr Glu Arg Ser Gly Tyr Leu Ala Asp Gly Pro 450 455 460 gcc agt gac tcc agc tca ggg ccc tgt cat ggc tct tcc agt gac tct 1922 Ala Ser Asp Ser Ser Ser Gly Pro Cys His Gly Ser Ser Ser Asp Ser 465 470 475 gtg gtc aac tgc acg gac atc agc cta cag ggg gtc cat ggc agc agt 1970 Val Val Asn Cys Thr Asp Ile Ser Leu Gln Gly Val His Gly Ser Ser 480 485 490 tct act ttc tgc agc tcc cta agc agt gac ttt gac ccc cta gtg tac 2018 Ser Thr Phe Cys Ser Ser Leu Ser Ser Asp Phe Asp Pro Leu Val Tyr 495 500 505 510 tgc agc cct aaa ggg gat ccc cag cga gtg gac atg cag cct agt gtg 2066 Cys Ser Pro Lys Gly Asp Pro Gln Arg Val Asp Met Gln Pro Ser Val 515 520 525 acc tct cgg cct cgt tcc ttg gac tcg gtg gtg ccc aca ggg gaa acc 2114 Thr Ser Arg Pro Arg Ser Leu Asp Ser Val Val Pro Thr Gly Glu Thr 530 535 540 cag gtt tcc agc cat gtc cac tac cac cgc cac cgg cac cac cac tac 2162 Gln Val Ser Ser His Val His Tyr His Arg His Arg His His His Tyr 545 550 555 aaa aag cgg ttc cag tgg cat ggc agg aag cct ggc cca gaa acc gga 2210 Lys Lys Arg Phe Gln Trp His Gly Arg Lys Pro Gly Pro Glu Thr Gly 560 565 570 gtc ccc cag tcc agg cct cct att cct cgg aca cag ccc cag cca gag 2258 Val Pro Gln Ser Arg Pro Pro Ile Pro Arg Thr Gln Pro Gln Pro Glu 575 580 585 590 cca cct tct cct gat cag caa gtc acc gga tcc aac tca gca gcc cct 2306 Pro Pro Ser Pro Asp Gln Gln Val Thr Gly Ser Asn Ser Ala Ala Pro 595 600 605 tcg ggg cgg ctc tct aac cca cag tgc ccc agg gcc ctc cct gag cca 2354 Ser Gly Arg Leu Ser Asn Pro Gln Cys Pro Arg Ala Leu Pro Glu Pro 610 615 620 gcc cct ggc cca gtt gac gcc tcc agc atc tgc ccc agt acc agc agt 2402 Ala Pro Gly Pro Val Asp Ala Ser Ser Ile Cys Pro Ser Thr Ser Ser 625 630 635 ctg ttc aac ttg caa aaa tcc agc ctc tct gcc cga cac cca cag agg 2450 Leu Phe Asn Leu Gln Lys Ser Ser Leu Ser Ala Arg His Pro Gln Arg 640 645 650 aaa agg cgg ggg ggt ccc tcc gag ccc acc cct ggc tct cgg ccc cag 2498 Lys Arg Arg Gly Gly Pro Ser Glu Pro Thr Pro Gly Ser Arg Pro Gln 655 660 665 670 gat gca act gtg cac cca gct tgc cag att ttt ccc cat tac acc ccc 2546 Asp Ala Thr Val His Pro Ala Cys Gln Ile Phe Pro His Tyr Thr Pro 675 680 685 agt gtg gca tat cct tgg tcc cca gag gca cac ccc ttg atc tgt gga 2594 Ser Val Ala Tyr Pro Trp Ser Pro Glu Ala His Pro Leu Ile Cys Gly 690 695 700 cct cca ggc ctg gac aag agg ctg cta cca gaa acc cca ggc ccc tgt 2642 Pro Pro Gly Leu Asp Lys Arg Leu Leu Pro Glu Thr Pro Gly Pro Cys 705 710 715 tac tca aat tca cag cca gtg tgg ttg tgc ctg act cct cgc cag ccc 2690 Tyr Ser Asn Ser Gln Pro Val Trp Leu Cys Leu Thr Pro Arg Gln Pro 720 725 730 ctg gaa cca cat cca cct ggg gag ggg cct tct gaa tgg agt tct gac 2738 Leu Glu Pro His Pro Pro Gly Glu Gly Pro Ser Glu Trp Ser Ser Asp 735 740 745 750 acc gca gag ggc agg cca tgc cct tat ccg cac tgc cag gtg ctg tcg 2786 Thr Ala Glu Gly Arg Pro Cys Pro Tyr Pro His Cys Gln Val Leu Ser 755 760 765 gcc cag cct ggc tca gag gag gaa ctc gag gag ctg tgt gaa cag gct 2834 Ala Gln Pro Gly Ser Glu Glu Glu Leu Glu Glu Leu Cys Glu Gln Ala 770 775 780 gtg tga gatgttcagg cctagctcca accaagagtg tgctccagat gtgtttgggc 2890 Val cctacctggc acagagtcct gctcctggga aaggaaagga ccacagcaaa caccattctt 2950 tttgccgtac ttcctagaag cactggaaga ggactggtga tggtggaggg tgagagggtg 3010 ccgtttcctg ctccagctcc agaccttgtc tgcagaaaac atctgcagtg cagcaaatcc 3070 atgtccagcc aggcaaccag ctgctgcctg tggcgtgtgt gggctggatc ccttgaaggc 3130 tgagtttttg agggcagaaa gctagctatg ggtagccagg tgttacaaag gtgctgctcc 3190 ttctccaacc cctacttggt ttccctcacc ccaagcctca tgttcatacc agccagtggg 3250 ttcagcagaa cgcatgacac cttatcacct ccctccttgg gtgagctctg aacaccagct 3310 ttggcccctc cacagtaagg ctgctacatc aggggcaacc ctggctctat cattttcctt 3370 ttttgccaaa aggaccagta gcataggtga gccctgagca ctaaaaggag gggtccctga 3430 agctttccca ctatagtgtg gagttctgtc cctgaggtgg gtacagcagc cttggttcct 3490 ctgggggttg agaataagaa tagtggggag ggaaaaactc ctccttgaag atttcctgtc 3550 tcagagtccc agagaggtag aaaggaggaa tttctgctgg actttatctg ggcagaggaa 3610 ggatggaatg aaggtagaaa aggcagaatt acagctgagc ggggacaaca aagagttctt 3670 ctctgggaaa agttttgtct tagagcaagg atggaaaatg gggacaacaa aggaaaagca 3730 aagtgtgacc cttgggtttg gacagcccag aggcccagct ccccagtata agccatacag 3790 gccagggacc cacaggagag tggattagag cacaagtctg gcctcactga gtggacaaga 3850 gctgatgggc ctcatcaggg tgacattcac cccagggcag cctgaccact cttggcccct 3910 caggcattat cccatttgga atgtgaatgt ggtggcaaag tgggcagagg accccacctg 3970 ggaacctttt tccctcagtt agtggggaga ctagcaccta ggtacccaca tgggtattta 4030 tatctgaacc agacagacgc ttgaatcagg cactatgtta agaaatatat ttatttgcta 4090 atatatttat ccacaaacag gcactatgtt aagaaatata tttatttgct aatatattta 4150 tccacaaatg tggtctggtc ttgtggtttt gttctgtcgt gactgtcact cagggtaaca 4210 acgtcatctc tttctacatc aagagaagta aattatttat gttatcagag gctaggctcc 4270 gattcatgaa aggatagggt agagtagagg gcttggcaat aagaactggt ttgtaagccc 4330 ctaaaagtgt ggcttagtga gatcagggaa ggagaaagca tgactggatt cttactgtgc 4390 ttcagtcatt attattatac tgttcacttc acacattatc atacttcagt gactcagacc 4450 ttgggcaaat actctgtgcc tcgctttttc agtccataaa atgggcctac ttaatagttg 4510 ttgcaggact tacatgagat aatagagtgt agaaaatatg ttccaaagtg gaaagtttta 4570 ttcatgtgat agaaaacatc caaacctgtc acagagccca tctgaacaca gcatgggacc 4630 gccaacaaga agaaagcccg cccggaagca gctcaatcag gaggctgggc tggaatgaca 4690 gcgcagcggg gcctgaaact atttatatcc caaagctcct ctcagataaa cacaaatgac 4750 tgcgttctgc ctgcactcgg gctattgcga ggacagagag ctggtgctcc attggcgtga 4810 agtctccagg gccagaaggg gcctttgtcg cttcctcaca aggcacaagt tccccttctg 4870 cttccccgag aaaggtttgg taggggtggt ggtttagtgc ctatagaaca aggcatttcg 4930 cttcctagac ggtgaaatga aagggaaaaa aaggacacct aatctcctac aaatggtctt 4990 tagtaaagga accgtgtcta agcgctaaga actgcgcaaa gtataaatta tcagccggaa 5050 cgagcaaaca gacggagttt taaaagataa atacgcattt ttttccgccg tagctcccag 5110 gccagcattc ctgtgggaag caagtggaaa ccctatagcg ctctcgcagt taggaaggag 5170 gggtggggct gtcgctggat ttcttctcgg tctctgcaga gacaatccag agggagacag 5230 tggattcact gcccccaatg cttctaaaac ggggagacaa aacaaaaaaa aacaaacttc 5290 cgggttacca tcggggaaca ggaccgacgc ccagggccac cagccccctc gtgcc 5345 <210> 6 <211> 783 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Met Ser Gly Gly His Gln Leu Gln Leu Ala Ala Leu Trp Pro Trp Leu 1 5 10 15 Leu Met Ala Thr Leu Gln Ala Gly Phe Gly Arg Thr Gly Leu Val Leu 20 25 30 Ala Ala Ala Val Glu Ser Glu Arg Ser Ala Glu Gln Lys Ala Ile Ile 35 40 45 Arg Val Ile Pro Leu Lys Met Asp Pro Thr Gly Lys Leu Asn Leu Thr 50 55 60 Leu Glu Gly Val Phe Ala Gly Val Ala Glu Ile Thr Pro Ala Glu Gly 65 70 75 80 Lys Leu Met Gln Ser His Pro Leu Tyr Leu Cys Asn Ala Ser Asp Asp 85 90 95 Asp Asn Leu Glu Pro Gly Phe Ile Ser Ile Val Lys Leu Glu Ser Pro 100 105 110 Arg Arg Ala Pro Arg Pro Cys Leu Ser Leu Ala Ser Lys Ala Arg Met 115 120 125 Ala Gly Glu Arg Gly Ala Ser Ala Val Leu Phe Asp Ile Thr Glu Asp 130 135 140 Arg Ala Ala Ala Glu Gln Leu Gln Gln Pro Leu Gly Leu Thr Trp Pro 145 150 155 160 Val Val Leu Ile Trp Gly Asn Asp Ala Glu Lys Leu Met Glu Phe Val 165 170 175 Tyr Lys Asn Gln Lys Ala His Val Arg Ile Glu Leu Lys Glu Pro Pro 180 185 190 Ala Trp Pro Asp Tyr Asp Val Trp Ile Leu Met Thr Val Val Gly Thr 195 200 205 Ile Phe Val Ile Ile Leu Ala Ser Val Leu Arg Ile Arg Cys Arg Pro 210 215 220 Arg His Ser Arg Pro Asp Pro Leu Gln Gln Arg Thr Ala Trp Ala Ile 225 230 235 240 Ser Gln Leu Ala Thr Arg Arg Tyr Gln Ala Ser Cys Arg Gln Ala Arg 245 250 255 Gly Glu Trp Pro Asp Ser Gly Ser Ser Cys Ser Ser Ala Pro Val Cys 260 265 270 Ala Ile Cys Leu Glu Glu Phe Ser Glu Gly Gln Glu Leu Arg Val Ile 275 280 285 Ser Cys Leu His Glu Phe His Arg Asn Cys Val Asp Pro Trp Leu His 290 295 300 Gln His Arg Thr Cys Pro Leu Cys Val Phe Asn Ile Thr Glu Gly Asp 305 310 315 320 Ser Phe Ser Gln Ser Leu Gly Pro Ser Arg Ser Tyr Gln Glu Pro Gly 325 330 335 Arg Arg Leu His Leu Ile Arg Gln His Pro Gly His Ala His Tyr His 340 345 350 Leu Pro Ala Ala Tyr Leu Leu Gly Pro Ser Arg Ser Ala Val Ala Arg 355 360 365 Pro Pro Arg Pro Gly Pro Phe Leu Pro Ser Gln Glu Pro Gly Met Gly 370 375 380 Pro Arg His His Arg Phe Pro Arg Ala Ala His Pro Arg Ala Pro Gly 385 390 395 400 Glu Gln Gln Arg Leu Ala Gly Ala Gln His Pro Tyr Ala Gln Gly Trp 405 410 415 Gly Met Ser His Leu Gln Ser Thr Ser Gln His Pro Ala Ala Cys Pro 420 425 430 Val Pro Leu Arg Arg Ala Arg Pro Pro Asp Ser Ser Gly Ser Gly Glu 435 440 445 Ser Tyr Cys Thr Glu Arg Ser Gly Tyr Leu Ala Asp Gly Pro Ala Ser 450 455 460 Asp Ser Ser Ser Gly Pro Cys His Gly Ser Ser Ser Asp Ser Val Val 465 470 475 480 Asn Cys Thr Asp Ile Ser Leu Gln Gly Val His Gly Ser Ser Ser Thr 485 490 495 Phe Cys Ser Ser Leu Ser Ser Asp Phe Asp Pro Leu Val Tyr Cys Ser 500 505 510 Pro Lys Gly Asp Pro Gln Arg Val Asp Met Gln Pro Ser Val Thr Ser 515 520 525 Arg Pro Arg Ser Leu Asp Ser Val Val Pro Thr Gly Glu Thr Gln Val 530 535 540 Ser Ser His Val His Tyr His Arg His Arg His His His Tyr Lys Lys 545 550 555 560 Arg Phe Gln Trp His Gly Arg Lys Pro Gly Pro Glu Thr Gly Val Pro 565 570 575 Gln Ser Arg Pro Pro Ile Pro Arg Thr Gln Pro Gln Pro Glu Pro Pro 580 585 590 Ser Pro Asp Gln Gln Val Thr Gly Ser Asn Ser Ala Ala Pro Ser Gly 595 600 605 Arg Leu Ser Asn Pro Gln Cys Pro Arg Ala Leu Pro Glu Pro Ala Pro 610 615 620 Gly Pro Val Asp Ala Ser Ser Ile Cys Pro Ser Thr Ser Ser Leu Phe 625 630 635 640 Asn Leu Gln Lys Ser Ser Leu Ser Ala Arg His Pro Gln Arg Lys Arg 645 650 655 Arg Gly Gly Pro Ser Glu Pro Thr Pro Gly Ser Arg Pro Gln Asp Ala 660 665 670 Thr Val His Pro Ala Cys Gln Ile Phe Pro His Tyr Thr Pro Ser Val 675 680 685 Ala Tyr Pro Trp Ser Pro Glu Ala His Pro Leu Ile Cys Gly Pro Pro 690 695 700 Gly Leu Asp Lys Arg Leu Leu Pro Glu Thr Pro Gly Pro Cys Tyr Ser 705 710 715 720 Asn Ser Gln Pro Val Trp Leu Cys Leu Thr Pro Arg Gln Pro Leu Glu 725 730 735 Pro His Pro Pro Gly Glu Gly Pro Ser Glu Trp Ser Ser Asp Thr Ala 740 745 750 Glu Gly Arg Pro Cys Pro Tyr Pro His Cys Gln Val Leu Ser Ala Gln 755 760 765 Pro Gly Ser Glu Glu Glu Leu Glu Glu Leu Cys Glu Gln Ala Val 770 775 780 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer sequence <400> 7 acaacagcct caagatcatc ag 22 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence 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Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer sequence <400> 35 ctctatctcg agtgaggcgg aaagaacca 29 <210> 36 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer sequence <400> 36 tttaagcttg aagaccattt ttggaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaac 47 <210> 37 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer sequence <400> 37 tttaagcttg aagacatggg aaagagtggt ctca 34 <210> 38 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized oligonucleotide sequence <400> 38 caccgaagca gcacgacttc ttcttcaaga gagaagaagt cgtgctgctt c 51 <210> 39 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized oligonucleotide sequence <400> 39 aaaagaagca gcacgacttc ttctctcttg aagaagaagt cgtgctgctt c 51 <210> 40 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized oligonucleotide for siRNA <400> 40 tcccgtcacc ggatccaact cagttcaaga gactgagttg gatccggtga c 51 <210> 41 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized oligonucleotide for siRNA <400> 41 aaaagtcacc ggatccaact cagtctcttg aactgagttg gatccggtga c 51 <210> 42 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized oligonucleotide for siRNA <400> 42 tcccgctatt gcacagaacg cagttcaaga gactgcgttc tgtgcaatag c 51 <210> 43 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized oligonucleotide for siRNA <400> 43 aaaagctatt gcacagaacg cagtctcttg aactgcgttc tgtgcaatag c 51 <210> 44 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized oligonucleotide for siRNA <400> 44 tccccagaaa gctgttatca gagttcaaga gactctgata acagctttct g 51 <210> 45 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized oligonucleotide for siRNA <400> 45 aaaacagaaa gctgttatca gagtctcttg aactctgata acagctttct g 51 <210> 46 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized oligonucleotide for siRNA <400> 46 tccctgagcc acctccaatc cacttcaaga gagtggattg gaggtggctc a 51 <210> 47 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized oligonucleotide for siRNA <400> 47 aaaatgagcc acctccaatc cactctcttg aagtggattg gaggtggctc a 51 <210> 48 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized oligonucleotide for siRNA <400> 48 tcccctgcac ggacatcagc ctattcaaga gataggctga tgtccgtgca g 51 <210> 49 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized oligonucleotide for siRNA <400> 49 aaaactgcac ggacatcagc ctatctcttg aataggctga tgtccgtgca g 51 <210> 50 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized oligonucleotide for siRNA <400> 50 tcccgtgtca gagagccctg ggattcaaga gatcccaggg ctctctgaca c 51 <210> 51 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized oligonucleotide for siRNA <400> 51 aaaagtgtca gagagccctg ggatctcttg aatcccaggg ctctctgaca c 51 <210> 52 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized oligonucleotide for siRNA <400> 52 tccccctcaa tgtcatttgg atgttcaaga gacatccaaa tgcaattgag g 51 <210> 53 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized oligonucleotide for siRNA <400> 53 aaaacctcaa tgtcatttgg atgtctcttg aacatccaaa tgcaattgag g 51 <210> 54 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized oligonucleotide for siRNA <400> 54 tccctgtcat ttggatggtc actttcaaga gaagtgacca tccaaatgac a 51 <210> 55 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized oligonucleotide for siRNA <400> 55 aaaatgtcat ttggatggtc acttctcttg aaagtgacca tccaaatgac a 51 <210> 56 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized oligonucleotide for siRNA <400> 56 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Sequence <220> <223> an artificially synthesized peptide sequence <400> 166 Tyr Ala Gln Ser Gln Gly Trp Trp Thr 1 5 <210> 167 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized peptide sequence <400> 167 Lys Leu Arg Ser Thr Met Leu Glu Leu 1 5 <210> 168 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized peptide sequence <400> 168 Tyr Leu Ile Val Asp Arg Asp Glu Ala 1 5 <210> 169 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized peptide sequence <400> 169 Ala Ala Pro Pro Ser Tyr Cys Phe Val 1 5 <210> 170 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized peptide sequence <400> 170 Gly Met Asp Leu Val Arg Leu Gly Leu 1 5 <210> 171 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized peptide sequence <400> 171 Lys Val Thr Glu Gly Val Arg Cys Ile 1 5 <210> 172 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> an 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Claims (36)

  1. 이하로 구성되는 군으로부터 선택되는 실질적으로 순수한 폴리펩티드.
    （a）서열번호：2, 4 또는 6의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드；
    （b）서열번호：2, 4 또는 6의 아미노산 서열로 구성되는 단백질과 동등한 생물학적 활성을 가지는, 1개 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가된 서열번호：2, 4 또는 6의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드; 및
    （c）서열번호：2, 4 또는 6 중 어느 하나의 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드와 동등한 생물학적 활성을 가지는, 서열번호：1, 3 또는 5의 뉴클레오티드 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드와 엄격한 조건 하에서 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의하여 코드되는 폴리펩티드.
  2. 청구항 1 기재의 폴리펩티드를 코드하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
  3. 청구항 2 기재의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  4. 청구항 2 기재의 폴리뉴클레오티드 또는 청구항 3 기재의 벡터를 보유하는 숙주세포.
  5. 이하의 단계를 포함하는, 청구항 1 기재의 폴리펩티드를 생산하기 위한 방법.
    （a）청구항 4 기재의 숙주세포를 배양하는 단계；
    （b）숙주세포에 폴리펩티드를 발현시키는 단계; 및,
    （c）발현한 폴리펩티드를 수집하는 단계.
  6. 청구항 1 기재의 폴리펩티드와 결합하는 항체.
  7. 청구항 2 기재의 폴리뉴클레오티드 또는 그 상보사슬에 대하여 상보적인, 적어도 15 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드.
  8. 청구항 2 기재의 폴리뉴클레오티드에 대한 안티센스 폴리뉴클레오티드 또는 저분자 간섭 RNA(small interfering RNA).
  9. 제8항에 있어서, 서열번호：23, 25, 27, 29 또는 31의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 안티센스 폴리뉴클레오티드.
  10. 제8항에 있어서, 그 센스 사슬이 서열번호：112, 113 및 114의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 저분자 간섭 RNA.
  11. 이하의 단계를 포함하는 세포증식성 질환의 진단을 위한 방법.
    （a）표본 생물시료에서 서열번호：2, 4 또는 6의 아미노산 서열을 코드하는 유전자의 발현 레벨을 검출하는 단계；및,
    （b）그 발현 레벨의 상승을 질환과 관련 짓는 단계
  12. 제 11항에 있어서, 발현 레벨이 이하로 구성되는 군으로부터 선택되는 방법 중 어느 하나에 의하여 검출되는 방법.
    （a）서열번호：2, 4 또는 6의 아미노산 서열을 코드하는 mRNA를 검출하는 방법；
    （b）서열번호：2, 4 또는 6의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 검출하는 방법; 및,
    (c)서열번호：2, 4 또는 6의 아미노산 서열을 포함하는 단백질의 생물학적 활성을 검출하는 방법.
  13. 이하의 단계를 포함하는 세포증식성 질환을 치료하기 위한 화합물의 스크리닝 방법.
    （a）피험화합물을,
    　　（1）서열번호：2, 4 또는 6의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드,
    　　（2）서열번호：2, 4 또는 6의 아미노산 서열로 구성되는 단백질과 동등한 생물학적 활성을 가지는, 1개 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가된 서열번호：2, 4 또는 6의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 및
    　　（3）서열번호：2, 4 또는 6의 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드와 동등한 생물학적 활성을 가지는, 서열번호：1, 3 또는 5의 뉴클레오티드 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드와 엄격한 조건하에서 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의하여 코드되는 폴리펩티드,
    로 구성되는 군으로부터 선택되는 폴리펩티드와 접촉시키는 단계；
    　（b）폴리펩티드와 피험화합물과의 결합활성을 검출하는 단계; 및,
    　（c）폴리펩티드와 결합하는 화합물을 선택하는 단계
  14. 이하의 단계를 포함하는 세포증식성 질환을 치료하기 위한 화합물의 스크리닝 방법.
    （a）후보화합물을 서열번호：1, 3 또는 5의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 1개 또는 복수의 폴리뉴클레오티드를 발현하는 세포와 접촉시키는 단계; 및,
    （b）서열번호：1, 3 또는 5의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 1개 또는 복수의 폴리뉴클레오티드의 발현 레벨을, 피험화합물의 비존재하에서 검출되는 발현레벨과 비교하여 저하시키는 화합물을 선택하는 단계
  15. 이하의 단계를 포함하는 세포증식성 질환을 치료하기 위한 화합물의 스크리닝 방법.
    　（a）피험화합물을
    　　（1）서열번호：2, 4 또는 6의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드,
    　　（2）서열번호：2, 4 또는 6의 아미노산 서열로 구성되는 단백질과 동등한 생물학적 활성을 가지는, 1개 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가된 서열번호：2, 4 또는 6의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드; 및
    (3) 서열번호 2, 4 또는 6의 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드와 동등한 생물학적 활성을 가지는, 서열번호 1, 3 또는 5의 뉴클레오티드 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드와 엄격한 조건 하에서 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의하여 코드되는 폴리펩티드,
    로 구성되는 군으로부터 선택되는 폴리펩티드와 접촉시키는 단계；
    (b) 단계 (a)의 폴리펩티드의 생물학적 활성을 검출하는 단계 및,
    （c）피험화합물의 비존재하에서 검출되는 생물학적 활성과 비교하여 폴리펩티드의 생물학적 활성을 억제하는 화합물을 선별하는 단계.
  16. 제15항에 있어서, 생물학적 활성이 세포증식성인 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 이하의 단계를 포함하는 세포증식성 질환을 치료하기 위한 화합물의 스크리닝 방법.
    　（a）피험화합물의 존재하에서
    　　（1）서열번호：2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드,
    　　（2）서열번호：2의 아미노산 서열로 구성되는 단백질과 동등한 생물학적 활성을 가지는, 1개 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가된 서열번호：2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드,
    　　（3）서열번호：2의 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드와 동등한 생물학적 활성을 가지는, 서열번호：1 의 뉴클레오티드 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드와 엄격한 조건 하에서 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의하여 코드되는 폴리펩티드,
    로 구성되는 군으로부터 선택되는 폴리펩티드를 AIP1 과 접촉시키는 단계；
    　（b）폴리펩티드와 AIP1 과의 결합을 검출하는 단계；및,
    　（c）폴리펩티드와 AIP1 과의 결합을 저해하는 피험화합물을 선택하는 단계.
  18. 이하의 단계를 포함하는 세포증식성 질환을 치료하기 위한 화합물의 스크리닝 방법.
    　（a） 피험화합물의 존재 하에서
    　 （1）서열번호：6 의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드,
    　　（2）서열번호：6 의 아미노산 서열로 구성되는 단백질과 동등한 생물학적 활성을 가지는, 1개 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가된 서열번호：6의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드
    　　（3）서열번호：6 의 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드와 동등한 생물학적 활성을 가지는, 서열번호：5 의 뉴클레오티드 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드와 엄격한 조건 하에서 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의하여 코드되는 폴리펩티드,
    로 구성되는 군으로부터 선택되는 폴리펩티드를 NOTCH2 또는 STRIN과 접촉시키는 단계；
    （b）폴리펩티드와 NOTCH2 또는 STRIN과의 결합을 검출하는 단계；및,
    （c）폴리펩티드와 NOTCH2 또는 STRIN과의 결합을 저해하는 피험화합물을 선별하는 단계.
  19. 이하의 단계를 포함하는 세포증식성 질환을 치료하기 위한 화합물의 스크리닝 방법.
    (a) 후보화합물을 1개 또는 복수의 마커 유전자의 전사 조절 영역 및 전사 조절 영역의 제어하에서 발현되는 리포터 유전자를 포함하는 벡터가 도입된 세포와 접촉시키는 단계, 이 경우 1개 또는 복수의 마커 유전자는 서열번호: 1, 3, 및 5 로 구성되는 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열 중 어느 하나를 포함한다;
    (b) 당해 리포터 유전자의 활성을 측정하는 단계; 및
    (c) 당해 리포터 유전자의 발현 레벨을 대조구와 비교하여 저하시키는 화합물을 선택하는 단계
  20. 제11항 내지 제19항 중 어느 하나에 있어서, 세포증식성 질환이 암인 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 이하로 구성되는 군으로부터 선택되는 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드에 대한 안티센스 폴리뉴클레오티드 또는 저분자 간섭 RNA의 약학적 유효량을 유효성분으로 하여 포함하고, 한편 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 세포증식성 질환을 치료하기 위한 조성물：
    　（a）서열번호 ：2, 4 또는 6의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 ；
    　（b）서열번호 ：2, 4 또는 6의 아미노산 서열로 구성되는 단백질과 동등한 생물학적 활성을 가지는, 1개 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가된 서열번호：2, 4 또는 6의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 ; 및
    　（c）서열번호 ：2, 4 또는 6의 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드와 동등한 생물학적 활성을 가지는, 서열번호 ：1, 3 또는 5 의 뉴클레오티드 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드와 엄격한 조건 하에서 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의하여 코드되는 폴리펩티드.
  22. 이하로 구성되는 군으로부터 선택되는 폴리펩티드에 대한 항체의 약학적 유효량을 유효성분으로 하여 포함하고 한편, 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 세포증식성 질환을 치료하기 위한 조성물.
    (a) 서열번호 2, 4 또는 6의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
    (b) 서열번호 2, 4 또는 6의 아미노산 서열로 구성되는 단백질과 동등한 생물학적 활성을 가지는, 1개 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가된 서열번호 2, 4 또는 6의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 ; 및
    (c) 서열번호 2, 4 또는 6의 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드와 동등한 생물학적 활성을 가지는, 서열번호 1, 3 또는 5 의 뉴클레오티드 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드와 엄격한 조건하에서 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의하여 코드되는 폴리펩티드.
  23. 청구항 제13항 내지 제19항의 어느 하나에 기재된 방법에 의하여 선택되는 화합물의 약학적 유효량을 유효성분으로 하여 포함하고 한편, 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 세포증식성 질환을 치료하기 위한 조성물.
  24. 제21항 내지 제23항에 있어서, 세포증식성 질환이 암인 것을 특징으로 하는 조성물.
  25. 이하로 구성되는 군으로부터 선택되는 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드에 대한 안티센스 폴리뉴클레오티드 또는 저분자 간섭 RNA의 약학적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 세포증식성 질환을 치료하기 위한 방법.
    (1) 서열번호 2, 4 또는 6의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드.
    (2) 서열번호 2, 4 또는 6의 아미노산 서열로 구성되는 단백질과 동등한 생물학적 활성을 가지는, 1개 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가된 서열번호 2, 4 또는 6의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 ; 및
    (3) 서열번호 2, 4 또는 6의 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드와 동등한 생물학적 활성을 가지는, 서열번호 1, 3 또는 5 의 뉴클레오티드 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드와 엄격한 조건 하에서 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의하여 코드되는 폴리펩티드.
  26. 이하로 구성되는 군으로부터 선택되는 폴리펩티드에 대한 항체의 약학적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 세포증식성 질환을 치료하기 위한 방법.
    (a) 서열번호 2, 4 또는 6의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드.
    (b) 서열번호 2, 4 또는 6의 아미노산 서열로 구성되는 단백질과 동등한 생물학적 활성을 가지는, 1개 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가된 서열번호 2, 4 또는 6의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 ; 및
    (c) 서열번호 2, 4 또는 6의 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드와 동등한 생물학적 활성을 가지는 서열번호 1, 3 또는 5 의 뉴클레오티드 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드와 엄격한 조건 하에서 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의하여 코드되는 폴리펩티드.
  27. 제13항 내지 제19항 중 어느 하나에 기재된 방법에 의하여 선택되는 화합물의 약학적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 세포증식성 질환을 치료하기 위한 방법.
  28. 제25항 내지 제27항 중 어느 하나에 있어서, 세포증식성 질환이 암인 것을 특징으로 하는 방법.
  29. (a) 내지 (c)로 구성되는 군으로부터 선택되는 폴리펩티드 또는 그 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드의 약학적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 암 치료 또는 예방을 위한 방법.
    (a) 서열번호: 2, 4 또는 6의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 그 단편.
    (b) 서열번호: 2, 4 또는 6의 아미노산 서열로 구성되는 단백질과 동등한 생물학적 활성을 가지는, 1개 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가된 서열번호: 2, 4 또는 6의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 그 단편; 및
    (c) 서열번호: 2, 4 또는 6의 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드와 동등한 생물학적 활성을 가지는, 서열번호: 1, 3 또는 5의 뉴클레오티드 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드와 엄격한 조건하에서 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의하여 코드되는 폴리펩티드 또는 그 단편.
  30. 제29항에 있어서, 폴리펩티드가 서열번호: 80, 97, 108, 124 및 164의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드의 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 암 치료 또는 예방을 위한 방법.
  31. (a) 내지 (c)로 구성되는 군으로부터 선택되는 폴리펩티드를 항원 제시 세포와 접촉시키는 단계; 또는 그 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드 또는 그 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 항원 제시 세포에 도입하는 단계를 포함하는 항종양 면역을 유도하기 위한 방법.
    (a) 서열번호: 2, 4 또는 6의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 그 단편.
    (b) 서열번호: 2, 4 또는 6의 아미노산 서열로 구성되는 단백질과 동등한 생물학적 활성을 가지는, 1개 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가된 서열번호: 2, 4 또는 6의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 그 단편; 및
    (c) 서열번호: 2, 4 또는 6의 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드와 동등한 생물학적 활성을 가지는, 서열번호: 1, 3 또는 5의 뉴클레오티드 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드와 엄격한 조건하에서 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의하여 코드되는 폴리펩티드 또는 그 단편.
  32. 제31항에 있어서, 폴리펩티드가 서열번호: 80, 97, 108, 124 및 164 의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드의 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 항종양 면역을 유도하기 위한 방법.
  33. 제31항에 있어서, 대상에 대하여 항원 제시 세포를 투여하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 항종양 면역을 유도하기 위한 방법.
  34. (a) 내지 (c)로 구성되는 군으로부터 선택되는 폴리펩티드 또는 그 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드의 약학적 유효량을 유효성분으로 하여 포함하고, 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 암 치료 또는 예방을 위한 약학적 조성물.
    (a) 서열번호: 2, 4 또는 6의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 그 단편.
    (b) 서열번호: 2, 4 또는 6의 아미노산 서열로 구성되는 단백질과 동등한 생물학적 활성을 가지는, 1개 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가된 서열번호: 2, 4 또는 6의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 그 단편; 및
    (c) 서열번호: 2, 4 또는 6의 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드와 동등한 생물학적 활성을 가지는, 서열번호: 1, 3 또는 5 의 뉴클레오티드 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드와 엄격한 조건 하에서 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의하여 코드되는 폴리펩티드 또는 그 단편.
  35. 제33항에 있어서, 서열번호: 80, 97, 108, 124 및 164의 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드의 약학적 유효량을 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  36. 제34항에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 발현벡터 중에 삽입되어 있는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
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