BRPI0311822B1

BRPI0311822B1 - composição farmacêutica para o tratamento de câncer

Info

Publication number: BRPI0311822B1
Application number: BRPI0311822-3A
Authority: BR
Inventors: Tahara Hideaki; Tsunoda Takuya; Furukawa Yoichi; Nakamura Yusuke
Original assignee: Oncotherapy Science Inc; Univ Tokyo
Priority date: 2002-06-06
Filing date: 2003-06-03
Publication date: 2019-10-29
Also published as: AU2009243506A1; EP2275544A3; EP2233572A2; SG145559A1; WO2003104275A3; JP2006507802A; CY1112052T1; US20090012032A1; JP2012019791A; AU2003241179A1; CN100532549C; BRPI0311822B8; US7425612B2; KR20050053530A; DE60336227D1; PT1513934E; US7847065B2; HK1083521A1; CA2488404A1; BR0311822A

Abstract

"genes e polipeptídeos que se relacionam aos cânceres de cólon humanos". a presente invenção proporciona novos genes humanos rnf43, cuja expressão é marcadamente elevada em cânceres colorretais, bem como cxadrl1 e gcud1, cuja expressão é marcadamente elevada em cânceres gástricos comparados aos tecidos não-cancerosos correspondentes. os genes e os polipeptídeos codificados pelos genes podem ser usados, por exemplo, na diagnose de uma doença proliferativa de células, e como moléculas alvo para o desenvolvimento de drogas contra a doença.

Description

Campo Técnico

A presente invenção relaciona-se ao campo de ciência biológica, mais especificamente ao campo de pesquisa sobre o câncer. Em particular, a presente invenção relaciona-se aos novos genes, RNF43, CXADRL1, e GCUD1, envolvidos no mecanismo de proliferação de células, bem como aos polipeptídeos codificados pelos genes. Os genes e os polipeptídeos da presente invenção podem ser usados, por exemplo, na diagnose de doença de proliferação de células, e como moléculas-alvo para o desenvolvimento de drogas contra a doença.

Antecedentes da Técnica

Os cânceres gástricos e os cânceres colorretais são as causas principais de morte por câncer mundial. Apesar do progresso recente em estratégias diagnósticas e terapêuticas, o prognóstico dos pacientes com cânceres avançados permanece muito insatisfatório. Embora os estudos moleculares tenham revelado o envolvimento de alterações nos genes supressores de tumor e/ou oncogenes na carcinogênese, os mecanismos exatos ainda permanecem para serem elucidados.

As tecnologias de microarranjos de cDNA têm capacitado obter perfis compreensivos da expressão do gene em células normais e malignas, e comparar a expressão do gene nas células malignas e normais correspondentes (Okabe e outros, Cancer Res 61:2129-37 (2001); Kitahara e outros, Cancer Res 61: 3544-9 (2001); Lin e outros, Oncogene 21:4120-8 (2002); Hasegawa e outros, Cancer Res 62:7012-7 (2002)). Esta abordagem capacita divulgar a natureza complexa das células de câncer, e auxilia a entender o mecanismo da carcinogênese. A identificação dos genes que estão desre

Petição 870190009732, de 30/01/2019, pág. 8/14 guiados nos tumores pode resultar na diagnose mais precisa e acurada dos cânceres individuais, e desenvolver novos alvos terapêuticos (Bienz e Clevers, Cell 103:311-20 (2000)). Para descrever os mecanismos que fundamentam os tumores a partir de um ponto de vista da extensão do genoma, e descobrir moléculas-alvo para a diagnose e o desenvolvimento de novas drogas terapêuticas, os presentes inventores têm estado analisando os perfis de expressão das células de tumor usando um microarranjo de cDNA de 23040 genes (Okabe e outros, Câncer Res 61:2129-37 (2001); Kitahara e outros, Câncer Res 61:3544-9 (2001); Lin e outros, Oncogene 21:4120-8 (2002); Hasegawa e outros, Câncer Res 62:7012-7 (2002)).

Os estudos projetados para revelar os mecanismos da carcinogênese já facilitaram a identificação dos alvos moleculares para os agentes antitumor. Por exemplo, os inibidores da farnesil transferase (FTIs), que foram originalmente desenvolvidos para inibir a via de sinalização do crescimento relacionada ao Ras, cuja ativação depende da farnesilação póstraducional, têm sido efetivos no tratamento de tumores dependentes de Ras em modelos de animais (He e outros, Cell 99:335-45 (1999)). Os ensaios clínicos em ser humano usando uma combinação de drogas anticâncer e anticorpo monoclonal anti-HER2, trastuzumab, têm sido conduzidos para antagonizar o receptor de proto-oncogene HER2/neu; e vêm atingindo resposta clínica aperfeiçoada e sobrevivência global de pacientes com cânceres de mama (Lin e outros, Câncer Res 61:6345-9 (2001)). Um inibidor de tirosina cinase, STI-571, que seletivamente inativa as proteínas de fusão bcr-abl, foi desenvolvido para tratar as leucemias mielógenas crônicas em que a ativação constitutiva da tirosina cinase bcr-abl desempenha uma função crucial na transformação de leucócitos. Os agentes destes tipos são projetados para suprimir a atividade oncogênica dos produtos de genes específicos (Fujita e outros, Câncer Res 61:7722-6 (2001)). Portanto, os produtos de genes comumente supra-regulados nas células cancerosas podem servir como alvos potenciais para o desenvolvimento de novos agentes anticâncer.

Foi demonstrado que os linfócitos T citotóxicos (CTLs) CD8+ reconhecem os peptídeos de epítopos derivados de antígenos associados aos tumores (TAAs) apresentados sobre a molécula de Classe I do MHC, e lisam as células de tumor. Desde a descoberta da família de MAGE como o primeiro exemplo de TAAs, muitos outros TAAs têm sido descobertos usando abordagens imunológicas (Boon, Int J Câncer 54: 177-80 (1993); Boon e van der Bruggen, J Exp Med 183: 725-9 (1996); van der Bruggen e outros, Science 254: 1643-7 (1991); Brichard e outros, J Exp Med 178: 489-95 (1993); Kawakami e outros, J Exp Med 180: 347-52 (1994)). Alguns dos TAAs descobertos estão agora no estágio de desenvolvimento clínico como alvos de imunoterapia. Os TAAs descobertos até o momento incluem o MAGE (van der Bruggen e outros, Science 254: 1643-7 (1991)), o gp100 (Kawakami e outros, J Exp Med 180: 347-52 (1994)), o SART (Shichijo e outros, J Exp Med 187: 277-88 (1998)), e o NY-ESO-1 (Chen e outros, Proc Natl Acad Sei USA 94: 1914-8 (1997)). Por outro lado, os produtos de genes que tinham sido demonstrados serem especificamente superexpressos em células de tumor, têm sido mostrados serem reconhecidos como alvos que induzem as respostas imunes celulares. Tais produtos de genes incluem o p53 (Umano e outros, Brit J Câncer 84: 1052-7 (2001)), o HER2/neu (Tanaka e outros, Brit J Câncer 84: 94-9 (2001)), o CEA (Nukaya e outros, Int J Câncer 80: 92-7 (1999)), e assim por diante.

Apesar do progresso significativo na pesquisa básica e clínica com relação aos TAAs (Rosenbeg e outros, Nature Med 4: 321-7 (1998); Mukherji e outros, Proc Natl Acad Sei USA 92: 8078-82 (1995); Hu e outros, Câncer Res 56: 2479-83 (1996)), somente está disponível um número limitado de TAAs candidatos para o tratamento de adenocarcinomas, incluindo o câncer colorretal. TAAs abundantemente expressos nas células de câncer, e ao mesmo tempo cuja expressão estivesse restrita às células de câncer, seriam candidatos promissores como alvos imunoterapêuticos. Além disso, a identificação de novos TAAs que induzam respostas imunes antitumor potentes e específicas é esperada encorajar o uso clínico da estratégia de vacinação de peptídeo em diversos tipos de câncer (Boon e can der Bruggen, J Exp Med 183: 725-9 (1996); van der Bruggen e outros, Science 254: 1643-7 (1991); Brichard e outros, J Exp Med 178: 489-95 (1993); Kawakami e ou4 tros.J Exp Med 180: 347-52 (1994); Shichijo e outros, J Exp Med 187: 27788 (1998); Chen e outros, Proc Natl Acad Sei USA 94: 1914-8 (1997); Harris, J Natl Câncer Inst 88: 1442-5 (1996); Butterfield e outros, Câncer Res 59: 3134-42 (1999); Vissers e outros, Câncer Res 59: 5554-9 (1999); van der Burg e outros, J Immunol 156: 3308-14 (1996); Tanaka e outros, Câncer Res 57: 4465-8 (1997); Fujie e outros, Int J Câncer 80: 169-72 (1999); Kikuchi e outros, Int J Câncer 81: 459-66 (1999); Oiso e outros, Int J Câncer 81: 38794(1999)).

Tem sido repetidamente relatado que as células mononucleares sanguíneas periféricas (PBMCs) estimuladas por peptideos, a partir de certos doadores saudáveis, produzem níveis significativos de IFN-γ em resposta ao peptideo, porém raramente exercem citotoxicidade contra as células de tumor em uma maneira restrita ao HLA-A24 ou -A0201 em ensaios de liberação de ⁵¹Cr (Kawano e outros, Câncer Res 60: 3550-8 (2000); Nishizaka e outros, Câncer Res 60: 4830-7 (2000); Tamura e outros, Jpn J Câncer Res 92: 762-7 (2001)). Entretanto, tanto o HLA-A24 quanto o HLA-A0201 são um dos alelos de HLA populares no japonês, bem como no caucasiano (Date e outros, Tissue Antigens 47: 93-101 (1996); Kondo e outros, J Immunol 155: 4307-12 (1995); Kubo e outros, J Immunol 152: 3913-24 (1994); Imanishi e outros, Proceeding of the eleventh International Hictocompatibility Workshop and Conference Oxford University Press, Oxford, 1065 (1992); Williams e outros, Tissue Antigen 49: 129 (1997)). Assim, os peptideos antigênicos de cânceres apresentados por estes HLAs podem ser especialmente úteis para o tratamento de cânceres entre o japonês e o caucasiano. Além disso, é sabido que a indução de CTLs de baixa afinidade in vitro normalmente resulta do uso de peptideo em uma alta concentração, gerando um alto nível de complexos de peptídeo/MHC específicos sobre as células apresentadoras de antígenos (APCs), que efetivamente ativarão estes CTLs (AlexanderMiller e outros, Proc Natl Acad Sei USA 93: 4102-7 (1996)).

Sumário da Invenção

Um objetivo da presente invenção é proporcionar novas proteínas envolvidas no mecanismo de proliferação de células de câncer gástrico ou colorretal e os genes codificando as proteínas, bem como os métodos para a produção e o uso dos mesmos na diagnose e no tratamento de câncer gástrico ou câncer colorretal.

Para discrever o mecanismo da carcinogênese gástrica e colorretal e identificar novos marcadores diagnósticos e/ou alvos de drogas para o tratamento destes tumores, os presentes inventores analisaram os perfis de expressão de genes na carcinogênese gástrica e colorretal usando um microarranjo de cDNA na extensão do genoma contendo 23040 genes. A partir do ponto de vista farmacológico, a supressão dos sinais oncogênicos é mais fácil na prática do que a ativação dos efeitos supressivos do tumor. Assim, os presentes inventores pesquisaram genes que sejam supra-regulados durante a carcinogênese gástrica e colorretal.

Entre os transcritos que foram comumente supra-regulados em cânceres gástricos, foram identificados os novos genes humanos CXADRL1 (receptor de coxsackie e adenovírus tipo 1) e GCt/D7(supra-regulado em câncer gástrico) na banda de cromossomo 3q13 e 7p14, respectivamente. A transferência de gene de CXADRL1 ou GCUD1 promoveu a proliferação das células. Além disso, a redução da expressão de CXADRL1 ou GCLID1, por transfecção de seus S-oligonucleotídeos, anti-sentido, específicos ou RNAs de pequena interferência, inibiu o crescimento das células de câncer gástrico. Muitas drogas anticâncer, tais como os inibidores da síntese de DNA e/ou RNA, os supressores metabólicos, e os intercaladores de DNA, não são somente tóxicos para as células de câncer, como também para as células que crescem normalmente. Entretanto, os agentes que suprimem a expressão do CXADRL1 podem não afetar adversamente os outros órgãos devido ao fato que a expressão normal do gene está restrita ao testículo e ao ovário, e assim pode ser de grande importância para o tratamento do câncer.

Além disso, entre os transcritos que foram comumente supraregulados nos cânceres colorretais, foi identificado o gene RNF43 (proteína Ring finger 43) designado na banda cromossômica 17pter-p13.1. Ademais, o ensaio para exame de dois híbridos em levedura revelou que a proteína RNF43 associou-se com a NOTCH2 ou a STRIN.

A NOTCH2 é uma grande proteína receptora de transmembrana que é um componente de um mecanismo de sinalização intercelular conservado de modo evolucionário. A NOTCH2 é um membro de proteína da via de sinalização de Notch e é descrita estar envolvida na glomerulogênese no rim e no desenvolvimento da vasculatura do coração e do olho (McCright e outros, Development 128: 491-502 (2001)). Três proteínas de Delta/Serrate/Lag-2 (DSL), Deitai, Jaggaedl, e Jaggaed2, são descritas como ligandos funcionais para a NOTCH2 (Shimizu e outros, Mol Cell Biol 20: 6913-22 (2000)). O sinal induzido por ligação do ligando na via de sinalização de Notch é transmitido intracelularmente por um processo envolvendo a proteólise do receptor e a translocação nuclear do domínio intracelular da proteína NOTCH (ver as revisões Artavanis-Tsakonas e outros, Annu Rev Cell Biol 7: 427-52 (1999); Weinmaster, Curr Opin Genet Dev 10: 363-9 (2000)). Além disso, a redução da expressão de RNF43, por transfecção de S-oligonucleotídeos anti-sentido,, específicos, ou RNAs de pequena interferência correspondendo à RNF43, inibiu o crescimento de células de câncer colorretal. Conforme já descrito acima, muitas drogas anticâncer não são somente tóxicas para as células de câncer, porém também para as células de crescimento normal. Entretanto, os agentes que suprimem a expressão de RNF43 podem também não afetar adversamente os outros órgãos, devido ao fato que a expressão normal do gene está restrita ao feto, mais especificamente ao pulmão fetal e ao rim fetal, e assim pode ser de grande importância para o tratamento de câncer.

Assim, a presente invenção proporciona novos genes isolados, CXADRL1, GCUD1, e RNF43, os quais são candidatos como marcadores diagnósticos para câncer, assim como alvos potenciais promissores para o desenvolvimento de novas estratégias para a diagnose e agentes anticâncer efetivos. Além disso, a presente invenção proporciona polipeptídeos codificados por estes genes, bem como a produção e o uso dos mesmos. Mais especificamente, a presente invenção proporciona o que segue:

O presente pedido proporciona novos polipeptídeos humanos, CXADRL1, GCUD1, e RNF43, ou um equivalente funcional destes, que pro move a proliferação das células e é supra-regulado em doenças proliferativas de células, tais como os cânceres gástricos e colorretais.

Em uma modalidade preferida, o polipeptídeo CXADRL1 inclui uma proteína de 431 aminoácidos putativa, com aproximadamente 37% de identidade com o CXADR (receptor de coxsackie e adenovírus). O CXADRL1 é codificado pelo quadro de leitura aberto de SEQ ID NO: 1 e contém dois domínios de imunogloblina nos códons 29-124 e 158-232, bem como um domínio de transmembrana nos códons 246-268. O polipeptídeo CXADRL1 preferivelmente inclui a seqüência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 2. O presente pedido também proporciona uma proteína isolada codificada a partir de pelo menos uma porção da seqüência de polinucleotídeo de CXADRL1, ou as seqüências de polinucleotídeo pelo menos 30%, e mais preferivelmente pelo menos 40% complementares à seqüência apresentada na SEQ ID NO: 1.

Por outro lado, em uma modalidade preferida, o polipeptídeo GCUD1 inclui uma proteína de 414 aminoácidos putativa, codificada pelo quadro de leitura aberto de SEQ ID NO: 3. O polipeptídeo GCUD1 preferivelmente inclui a seqüência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 4. O presente pedido também proporciona uma proteína isolada codificada a partir de pelo menos uma porção da seqüência de polinucleotídeo de GCUD1, ou as seqüências de polinucleotídeo pelo menos 15%, e mais preferivelmente pelo menos 25% complementares à seqüência apresentada na SEQ ID NO: 3.

Além disso, em uma modalidade preferida, o polipeptídeo RNF43 inclui uma proteína de 783 aminoácidos putativa, codificada pelo quadro de leitura aberto de SEQ ID NO: 5. O polipeptídeo RNF43 preferivelmente inclui a seqüência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 6 e contém um motivo de Ring finger nos códons 272-312. O polipeptídeo RNF43 mostrou 38% de homologia com o homólogo da proteína RING finger DKFZp566H073.1 (Número de Acesso ao GenBank: T08729). O presente pedido também proporciona uma proteína isolada codificada a partir de pelo menos uma porção da seqüência de polinucleotídeo de RNF43, ou as se qüências de polinucleotídeo pelo menos 30%, e mais preferivelmente pelo menos 40% complementares à seqüência apresentada em SEQ ID NO: 5.

A presente invenção adicionalmente proporciona os novos genes humanos, CXADRL1 e GCUD1, cujas expressões são marcadamente elevadas em uma grande maioria de cânceres gástricos em comparação com as mucosas não-cancerosas correspondentes. Além dos cânceres gástricos, o CXADRL1 e o GCUD1 também foram altamente expressos no câncer colorretal e no câncer do fígado. O gene CXADRL1 isolado inclui uma seqüência de polinucleotídeo como descrita em SEQ ID NO: 1. Em particular, o cDNA do CXADRL1 inclui 3423 nucleotídeos que contêm um quadro de leitura aberto de 1296 nucleotídeos (SEQ ID NO: 1). A presente invenção adicionalmente inclui os polinucleotídeos que hibridizam com a, e que são pelo menos 30%, e mais preferivelmente pelo menos 40% complementares à, seqüência de polinucleotídeo apresentada em SEQ ID NO: 1, na medida em que eles codificam uma proteína CXADRL1 ou um seu equivalente funcional. Os exemplos de tais polinucleotídeos são os degenerados e os mutantes alélicos de SEQ ID NO: 1. Por outro lado, o gene GCUD1 isolado inclui uma seqüência de polinucleotídeo como descrita em SEQ ID NO: 3. Em particular, o cDNA do GCUD1 inclui 4987 nucleotídeos que contêm um quadro de leitura aberto de 1245 nucleotídeos (SEQ ID NO: 3). A presente invenção adicionalmente inclui os polinucleotídeos que hibridizam com a, e que são pelo menos 15%, e mais preferivelmente pelo menos 25% complementares à, seqüência de polinucleotídeo apresentada em SEQ ID NO: 3, na medida em que eles codificam uma proteína GCUD1 ou um seu equivalente funcional. Os exemplos de tais polinucleotídeos são os degenerados e os mutantes alélicos de SEQ ID NO: 3.

Ademais, a presente invenção proporciona um novo gene humano RNF43, cuja expressão é marcadamente elevada em uma grande maioria de cânceres colorretais em comparação com as mucosas nãocancerosas correspondentes. Além dos cânceres colorretais, o RNF43 também foi altamente expresso no câncer do pulmão, no câncer gástrico, e no câncer do fígado. O gene RNF43 isolado inclui uma seqüência de polinucle otídeo como descrita em SEQ ID NO: 5. Em particular, o cDNA do RNF43 inclui 5345 nucleotídeos que contêm um quadro de leitura aberto de 2352 nucleotídeos (SEQ ID NO: 5). A presente invenção adicionalmente inclui os polinucleotídeos que hibridizam com a, e que são pelo menos 30%, e mais preferivelmente pelo menos 40% complementares à, seqüência de polinucleotídeo apresentada em SEQ ID NO: 5, na medida em que eles codificam uma proteína RNF43 ou um seu equivalente funcional. Os exemplos de tais polinucleotídeos são os degenerados e os mutantes alélicos de SEQ ID NO: 5.

Conforme usado aqui, um gene isolado é um polinucleotídeo cuja estrutura não é idêntica àquela de qualquer polinucleotídeo de ocorrência natural ou àquela de qualquer fragmento de um polinucleotídeo genômico de ocorrência natural alcançando mais do que três genes separados. O termo, portanto, inclui, por exemplo, (a) um DNA que tem a seqüência de parte de uma molécula de DNA genômico de ocorrência natural no genoma do organismo no qual ela ocorre naturalmente; (b) um polinucleotídeo incorporado em um vetor ou no DNA genômico de um procarioto ou eucarioto em uma maneira tal que a molécula resultante não seja idêntica a qualquer vetor ou DNA genômico de ocorrência natural; (c) uma molécula separada, tal como um cDNA, um fragmento genômico, um fragmento produzido por reação em cadeia por polimerase (PCR), ou um fragmento de restrição; e (d) uma seqüência de nucleotídeos recombinantes que é parte de um gene híbrido, isto é, um gene codificando um polipeptídeo de fusão.

Desse modo, em um aspecto, a invenção proporciona um polinucleotídeo isolado que codifica um polipeptídeo descrito aqui ou um fragmento deste. De preferência, o polipeptídeo isolado inclui uma seqüência de nucleotídeos que é pelo menos 60% idêntica à seqüência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO: 1, 3, ou 5. Mais preferivelmente, a molécula de ácido nucléico isolada é pelo menos 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou mais, idêntica à seqüência de nucleotídeos mostrada na SEQ ID NO: 1, 3, ou 5. No caso de um polinucleotídeo isolado que seja maior do que a, ou equivalente no comprimento à, seqüência de referência, por exemplo, a SEQ ID NO: 1, 3, ou 5, a comparação é feita com o tamanho natural da seqüência de referência. Onde o polinucleotídeo isolado for mais curto do que a seqüência de referência, por exemplo, mais curto do que a SEQ ID NO: 1, 3, ou 5, a comparação é feita com o segmento da seqüência de referência do mesmo comprimento (excluindo qualquer laço requerido pelo cálculo da homologia).

A presente invenção também proporciona um método de produzir uma proteína por transfecção ou transformação de uma célula hospedeira com uma seqüência de polinucleotídeo codificando a proteína CXADRL1, GCUD1, ou RNF43, e expressando a seqüência de polinucleotídeo. Além disso, a presente invenção proporciona vetores compreendendo uma seqüência de nucleotídeos codificando a proteína CXADRL1, GCUD1, ou RNF43, e células hospedeiras abrigando um polinucleotídeo codificando a proteína CXADRL1, GCUD1, ou RNF43. Tais vetores e células hospedeiras podem ser usados para a produção da proteína CXADRL1, GCUD1, ou RNF43.

Um anticorpo que reconhece a proteína CXADRL1, GCUD1, ou RNF43 também é proporcionado pelo presente pedido. Em parte, um polinucleotídeo anti-sentido (por exemplo, o DNA anti-sentido), a ribozima, e o siRNA (RNA de pequena interferência) do gene CXADRL1, GCUD1, ou RNF43 são também proporcionados.

A presente invenção adicionalmente proporciona um método para a diagnose de doenças proliferativas de células, que inclui determinar um nível de expressão do gene na amostra biológica do espécime, comparar o nível de expressão do gene CXADRL1, GCUD1, ou RNF43 com aquele em amostra normal, e definir um nível de expressão alto do gene CXADRL1, GCUD1, ou RNF43 na amostra como tendo uma doença proliferativa de células, tal como o câncer. A doença diagnosticada pelo nível de expressão de CXADRL1 ou GCUD1 é adequadamente um câncer gástrico, colorretal, e do fígado; e aquela detectada pelo nível de expressão do RNF43 é o câncer colorretal, do pulmão, gástrico, e do fígado.

Além disso, é proporcionado um método de examinar quanto a um composto para o tratamento de uma doença proliferativa de células. O método inclui contatar o polipeptídeo CXADRL1, GCUD1, ou RNF43 com os compostos de teste, e selecionar os compostos de teste que se ligam ao polipeptídeo CXADRL1, GCUD1, ou RNF43.

A presente invenção adicionalmente proporciona um método de examinar quanto a um composto para o tratamento uma doença proliferativa de células, em que o método inclui contatar o polipeptídeo CXADRL1, GCUD1, ou RNF43 com um composto de teste, e selecionar o composto de teste que suprime o nível de expressão ou a atividade biológica do polipeptídeo CXADRL1, GCUD1, ou RNF43.

Alternativamente, a presente invenção proporciona um método de examinar quanto a um composto para o tratamento de uma doença proliferativa de células, em que o método inclui contatar CXADRL1 e AIP1 na presença de um composto de teste, e selecionar o composto de teste que inibe a ligação de CXADRL1 e AIP1.

Além disso, a presente invenção proporciona um método de examinar quanto a um composto para o tratamento de uma doença proliferativa de células, em que o método incluir contatar RNF43 e NOTCH2 ou STRIN na presença de um composto de teste, e selecionar o composto de teste que inibe a ligação de RNF43 e NOTCH2 ou STRIN.

O presente pedido também proporciona uma composição farmacêutica para o tratamento de doença proliferativa de células, tal como o câncer. A composição farmacêutica pode ser, por exemplo, um agente anticâncer. A composição farmacêutica pode ser descrita como pelo menos uma porção do S-oligonucleotídeo anti-sentido ou siRNA da seqüência de polinucleotídeo de CXADRL1, GCUD1, ou RNF43 mostrada e descrita na SEQ ID NO: 1, 3, ou 5, respectivamente. Um S-oligonucleotídeo anti-sentido adequado tem a seqüência de nucleotídeos selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO: 23, 25, 27, 29, ou 31. O S-oligonucleotídeo anti-sentido de CXADRL1, incluindo aqueles tendo a seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 23 ou 25, pode ser adequadamente usado para tratar o câncer gástrico; o S-oligonucleotídeo anti-sentido de GCUD1, incluindo aqueles tendo a se qüência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 27 ou 29, adequadamente para tratar o câncer gástrico, colorretal, ou do fígado; e o S-oligonucleotídeo antisentido de RNF43, incluindo aqueles tendo a seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 31, adequadamente para o câncer colorretal, do pulmão, gástrico, ou do fígado. Um siRNA adequado consiste em um grupo de nucleotídeos com as seqüências de nucleotídeos selecionadas a partir do grupo de SEQ ID NOs: 40 e 41, 42 e 43, ou 62 e 63. O siRNA de CXADRL1, consistindo em um grupo de nucleotídeos com a seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NOs: 40 e 41, ou 42 e 43, pode ser adequadamente usado para tratar o câncer gástrico, colorretal, ou do pulmão; e o siRNA de RNF43, consistindo em um grupo de nucleotídeos com a seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NOs: 62 e 63, adequadamente para o câncer colorretal, do pulmão, gástrico, ou do fígado. As composições farmacêuticas também podem ser aquelas compreendendo os compostos selecionados pelos presentes métodos de examinar quanto aos compostos para o tratamento de doenças proliferativas de células.

O curso de ação da composição farmacêutica é desejavelmente inibir o crescimento das células cancerosas. A composição farmacêutica pode ser aplicada aos mamíferos, incluindo os seres humanos e os mamíferos domesticados.

A presente invenção adicionalmente proporciona métodos para tratar uma doença proliferativa de células usando a composição farmacêutica proporcionada pela presente invenção.

Além disso, a presente invenção proporciona um método para o tratamento ou a prevenção de câncer, método este que compreende a etapa de administrar o polipeptídeo CXADRL1, GCUD1, ou RNF43. É esperado que a imunidade antitumor seja induzida pela administração do polipeptídeo CXADRL1, GCUD1, ou RNF43. Assim, a presente invenção também proporciona um método para induzir a imunidade antitumor, método este que compreende a etapa de administrar o polipeptídeo CXADRL1, GCUD1, ou RNF43, bem como a composição farmacêutica para tratar ou prevenir o câncer, compreendendo o polipeptídeo CXADRL1, GCUD1, ou RNF43.

É para ser entendido que tanto o sumário precedente da invenção quanto a descrição detalhada que se segue são de uma modalidade preferida, e não-restritivos da invenção ou outras modalidades alternativas da invenção.

Breve Descrição dos Desenhos

As Figuras 1a a 1d representam a expressão de A5928 (CXADRL1) e C8121(GCUD1) em cânceres gástricos. A Figura 1a representa as razões relativas de expressão (câncer/não-câncer) de A5928 em 14 cânceres gástricos primários examinados por microarranjo de cDNA. A sua expressão foi supra-regulada (razão de intensidade de Cy3:Cy5, >2,0) em 14 dos 14 cânceres gástricos que passaram através do filtro de corte (ambos os sinais de Cy3 e Cy5 maiores do que 25.000). A Figura 1b representa as razões relativas de expressão (câncer/não-câncer) de C8121 em 12 cânceres gástricos primários examinados por microarranjo de cDNA. A sua expressão foi supra-regulada (razão de intensidade de Cy3:Cy5, >2,0) em 10 dos 12 cânceres gástricos que passaram através do filtro de corte. A Figura 1c representa a expressão de CXADRL1 analisada por RT-PCR semiquantitativa usando 10 casos de cânceres gástricos. A Figura 1d representa a expressão de GCUD1 analisada por RT-PCR semiquantitativa usando 9 casos de cânceres gástricos. A expressão de GAPDH serviu como um controle interno para ambas as análises de expressão de CXADRL1 e GCUD1.

As Figuras 2a e 2b representam a expressão de CXADRL1 em diversos tecidos humanos e a estrutura protéica predita e os motivos de proteína de CXADRL1. A Figura 2a é uma fotografia representando a expressão de CXADRL1 em diversos tecidos humanos, analisada por análise de northern blot de múltiplos tecidos. A Figura 2b representa a estrutura protéica predita de CXADRL1. O cDNA de CXADRL1 consiste em 3.423 nucleotídeos com um ORF de 1.296 nucleotídeos e é composto de 7 exons.

As Figuras 3a a 3c representam o efeito promotor do crescimento de CXADRL1. A Figura 3a é uma fotografia representando o resultado dos ensaios de formação de colônias de células NIH3T3 transfectadas com CXADRL1. A Figura 3b representa a expressão de CXADRL1 exógeno nas células NIH3T3-CXADRL1 analisada por RT-PCR semiquantitativa. A expressão de GAPDH serviu como um controle interno. n°2, n°5, n°6, e n°7 todos indicam as células NIH3T3 transfectadas com CXADRL1. A Figura 3c representa o número de células NIH3T3. O crescimento das células NIH3T3CXADRL1 foi estatisticamente maior do que das células falsas (NIH3T3LacZ) nos meios de cultura contendo 10% de FBS (P<0,05).

A Figura 4 representa o efeito inibitório do crescimento dos Soligonucleotídeos anti-sentido projetados para suprimir o CXADRL1 nas células MKN-1. O CXADRL1-AS4 e o CXADRL1-AS5 foram demonstrados suprimir o crescimento das células MKN-1.

As Figuras 5A a 5C representam o efeito supressivo do crescimento de CXADRL1-siRNA sobre as células St-4. A Figura 5A apresenta fotografias representando a expressão de CXADRL1 e GAPDH (controle) em células St-4 transfectadas com falso ou CXADRL1-siRNAn°7. A Figura 5B representa fotografias representando o resultado da coloração por Giemsa de células viáveis tratadas com controle-siRNA ou CXADRL1-siRNAn°7. A Figura 5C representa o resultado do ensaio de MTT sobre células transfectadas com o plasmídio de controle ou os plasmídeos expressando CXADRL1-SÍRNA7.

A Figura 6 representa uma fotografia demonstrando o resultado da análise por imunoblot de células expressando a proteína exógena CXADRL1 marcada com Flag com anti-soros anti-CXADRL1 ou anticorpo anti-Flag.

A Figura 7 representa a interação entre CXADRL1 e AIP1 examinada pelo sistema de dois híbridos em levedura. A Figura 7 é uma fotografia representando a interação de CXADRL1 com AIP1 examinada pelo sistema de dois híbridos.

A Figura 8 representa a citotoxicidade específica para peptídeo da linhagem de CTL produzida através de estimulação por CXADRL1-207. A linhagem de CTL mostrou alta atividade citotóxica sobre as células-alvo (T2) pulsadas com CXADRL1-207, enquanto que nenhuma atividade citotóxica significativa foi detectada sobre as mesmas células-alvo (T2) pulsadas sem peptídeos.

A Figura 9 representa a atividade citotóxica do Clone de CLT CXADRL1-207 sobre SNU475, MKN74, e SNU-C4. O Clone de CTL de CXADRL1-207 mostrou alta atividade citotóxica sobre SNU475, que expressa tanto CXADRL1 quanto HLA-A*0201. Por outro lado, o Clone de CTL de CXADRL1-207 não mostrou nenhuma atividade citotóxica significativa sobre MKN74, que expressa CXADRL1, porém não HLA-A*0201. Além disso, este Clone de CTL não mostrou atividade citotóxica significativa sobre SNU-C4, que expressa HLA-A*0201, porém não CXADRL1.

A Figura 10 representa o resultado do ensaio de inibição de alvo frio. O Clone de CTL de CXADRL1-207 especificamente reconhece CXADRL1-207 em uma maneira restrita ao HLA-A*0201. O SNU475 marcado com Na₂ ⁵¹Cr O₄foi preparado como um alvo quente, enquanto que a T2 pulsada com o peptídeo CXADRL1-207 (Peptídeo +) foi usada como um alvo frio (Inibidores). A razão de E/T foi fixada em 20. A atividade citotóxica sobre o SNU475 foi inibida pela adição de T2 pulsada com o peptídeo idêntico, enquanto quase nenhuma inibição pela adição de T2 sem o pulso de peptídeo.

A Figura 11 representa o resultado do ensaio de bloqueio mostrando o efeito dos anticorpos produzidos contra HLA-Classe I, HLA-Classe II, CD4, e CD8 sobre a atividade citotóxica do Clone de CTL de CXADRL1207. O Clone de CTL de CXADRL1-207 mostrou atividade citotóxica em uma maneira restrita ao HLA-Classe I e CD8. Para examinar as características do clone de CTL produzido com o peptídeo CXADRL1, os anticorpos contra HLA-Classe I, HLA-Classe II, CD4, e CD8 foram testados quanto à sua capacidade de inibir a atividade citotóxica. O eixo horizontal revela a % de inibição da citotoxicidade. A citotoxicidade do clone de CTL sobre os alvos de SNU475 foi significativamente reduzida quando os anticorpos contra classe I e CD8 foram usados. Este resultado indica que o clone de CTL reconhece o peptídeo derivado de CXADRL1 em uma maneira dependente de HLAClasse I e CD8.

A Figura 12 é uma fotografia representando o resultado da análi se por Northern blot de GCUD1 em diversos tecidos humanos. O transcrito de GCUD1 é aproximadamente 3,5 kb por tamanho.

A Figura 13 mostra uma fotografia representando a localização subcelular de GCLID1 observada por imunocitoquímica de células transfectadas com pcDNA3.1myc/His-GCUD1. A proteína GCUD1 marcada com cMyc expressou-se a partir do plasmídio localizado no citoplasma.

A Figura 14 é uma fotografia mostrando o efeito promotor do crescimento de GCUD1 sobre as células NIH3T3 examinadas por ensaios de formação de colônias.

A Figura 15 representa o efeito inibitório do crescimento de Soligonucleotídeos anti-sentido projetados para suprimir o GCUD1 sobre as células MKN-28. O GCUD1-AS5 e o GCUD1-AS8 foram revelados suprimir o crescimento das células MKN-28.

A Figura 16 representa uma fotografia mostrando a purificação da proteína recombinante de GCUD1.

A Figura 17 representa uma fotografia demonstrando o resultado da análise por imunoblot de células expressando a proteína exógena GCUD1 marcada com Flag com os anti-soros anti-GCUD1ou anticorpo antiFlag.

As Figuras 18A e 18B representam a citotoxicidade específica para peptideo da linhagem de CTL produzida através de estimulação por GCUD1-196 (A) ou GCUD1-272 (Β). A linhagem de CTL mostrou alta atividade citotóxica sobre as células-alvo (T2) pulsadas com GCUD1-196 ou GCUD1-272, enquanto que nenhuma atividade citotóxica significativa foi detectada sobre as mesmas células-alvo (T2) pulsadas sem peptideos.

A Figura 19 representa a atividade citotóxica do Clone de CLT GCUD1-196 sobre SNU475 e MKN45. O Clone de CTL de GCUD1-196 mostrou alta atividade citotóxica sobre SNU475, que expressa tanto GCUD1 quanto HLA-A*0201. Por outro lado, o Clone de CTL de GCUD1-196 não mostrou nenhuma atividade citotóxica significativa sobre MKN45, que expressa GCUD1, porém não HLA-A*0201.

A Figura 20 representa o resultado do ensaio de inibição de alvo frio. O Clone de CTL de GCUD1-196 especificamente reconhece GCUD1196 em uma maneira restrita ao HLA-A*0201. O SNU475 marcado com Na₂ ⁵¹Cr O4 foi preparado como um alvo quente, enquanto que a T2 pulsada com o peptídeo GCUD1-196 (Peptídeo +) foi usada como um alvo frio (Inibidores). A razão de E/T foi fixada em 20. A atividade citotóxica sobre o SNU475 foi inibida pela adição de T2 pulsada com o peptídeo idêntico, enquanto quase nenhuma inibição pela adição de T2 sem 0 pulso de peptídeo.

A Figura 21 representa o resultado do ensaio de bloqueio mostrando o efeito dos anticorpos produzidos contra HLA-Classe I, HLA-Classe II, CD4, e CD8 sobre a atividade citotóxica do Clone de CTL de GCUD1-196. O Clone de CTL de GCUD1-196 mostrou atividade citotóxica em uma maneira restrita ao HLA-Classe I e CD8. Para examinar as características do clone de CTL produzido com o peptídeo GCUD1, os anticorpos contra HLA-Classe I, HLA-Classe II, CD4, e CD8 foram testados quanto à sua capacidade de inibir a atividade citotóxica. O eixo horizontal revela a % de inibição da citotoxicidade. A citotoxicidade do clone de CTL sobre os alvos de SNU475 foi significativamente reduzida quando os anticorpos contra classe I e CD8 foram usados. Este resultado indica que o clone de CTL reconhece o peptídeo derivado de GCUD1 em uma maneira dependente de HLA Classe I e CD8.

As Figuras 22a e 22b representam a expressão de FLJ20315 em câncer de cólon. A Figura 22a representa as razões relativas de expressão (câncer/não-câncer) de FLJ20315 em 11 casos de cânceres do cólon primários examinados por microarranjo de cDNA. A sua expressão foi supraregulada (razão de intensidade de Cy3:Cy5, >2,0) em 10 dos 11 casos de cânceres do cólon que passaram através do filtro de corte (ambos os sinais de Cy3 e Cy5 maiores do que 25.000). A Figura 22b representa a expressão de FLJ20315 analisada por RT-PCR semiquantitativa usando 18 casos de cânceres do cólon adicionais (T, tecido com tumor; N, tecido normal). A expressão de GAPDH serviu como um controle interno.

A Figura 23a representa uma fotografia mostrando o resultado da análise por northern blot do tecido fetal de RNF43 em diversos tecidos fetais humanos. A Figura 23b representa a estrutura protéica predita de

RNF43.

As Figuras 24a e 24b mostram fotografias representando a localização subcelular da proteína RNF43 marcada com myc. A Figura 24a é uma fotografia representando o resultado da análise por Western blot da proteína RNF43 marcada com myc usando extratos de células COS7 transfectadas com pcDNA3.1-myc/His-RNF43 ou plasmídeos de controle (falso). A Figura 24b apresenta fotografias das células transfectadas que foram tingidas com o anticorpo anti-myc de camundongo e visualizadas por anticorpo secundário conjugado ao FITC. Os núcleos foram contra-tingidos com DAPI.

As Figuras 25a a 25c representam o efeito do RNF43 sobre o crescimento da célula. A Figura 25a é uma fotografia representando o resultado do ensaio de formação de colônias de RNF43 em células NIH3T3. A Figura 25b apresenta fotografias representando a expressão de RNF43 em células falsas (COS7-pcDNA) e COS7-RNF43 que foi estabelecida pela transfecção das células COS7 com pcDNA-RNF43. As Figura 25c representa o resultado da comparação sobre o crescimento da célula entre as células COS7-RNF43 estavelmente expressando o RNF43 exógeno e as células falsas.

As Figuras 26a e 26b representam o efeito inibitório do crescimento de S-oligonucleotídeos anti-sentido projetados para suprimir o RNF43. A Figura 26a apresenta fotografias representando a expressão de RNF43 em células LoVo tratadas por 12 h com o controle (RNF43-S1) ou os S-oligonucleotídeos anti-sentido (RNF43-AS1), analisada por RT-PCR semiquantitativa. A Figura 26b representa a viabilidade celular das células LoVo após o tratamento com o controle ou os S-oligonucleotídeos anti-sentido, medida por ensaio de MTT. O ensaio de MTT foi realizado em triplicata.

As Figuras 27A a 27C representam o efeito supressivo do crescimento de RNF43-siRNAs. A Figura 27A apresenta fotografias representando o efeito de RNF43-siRNAs sobre a expressão de RNF43. A Figura 27B apresenta fotografias representando o resultado da coloração por Giemsa de células viáveis após o tratamento com controle- siRNA ou RNF43-siRNAs. A Figura 27C representa o resultado do ensaio de MTT sobre as células transfectadas com o plasmídio de controle ou os plasmídeos expressando RNF43-siRNAs. *, uma diferença significativa (p <0,05), como determinada por um teste da diferença significativa mínima protegida de Fisher.

As Figuras 28A e 28B representam a expressão da proteína RNF43 marcada. A Figura 28A é uma fotografia representando o resultado da análise por Western-blot da proteína RNF43 marcada com Flag, secretada no meio de cultura de células COS7 transfectadas com pFLAG-5CMVRNF43 (raia 2) ou vetor falso (raia 1). A Figura 28B é uma fotografia representando o resultado da análise por Western-blot da proteína RNF43 marcada com Myc, secretada no meio de cultura de células COS7 transfectadas com pcDNA3.1-Myc/His-RNF43 (raia 2) ou vetor falso (raia 1).

As Figuras 29A e 29B representam o efeito promotor do crescimento de meio condicionado contendo a proteína RNF43 marcada com Myc ou marcada com Flag. A Figura 29A apresenta fotografias representando a morfologia das células NIH3T3 cultivadas em meio de controle (1) ou em meio condicionado de células COS7 transfectadas com vetor falso (2), pcDNA3.1-Myc/His-RNF43 (3), ou pFLAG-5CMV-RNF43 (4). A Figura 29B representa o número de células NIH3T3 cultivadas no meio indicado descrito na Figura 29A. Os dados são mostrados como a média de experiências em triplicata para cada grupo; barras, ±SE. *, diferença significativa quando comparado com o controle, falso (p<0,05).

As Figuras 30A a 30C representam a preparação da proteína recombinante N-terminal (N1) e C-terminal (C1) de RNF43. A Figura 30A representa a estrutura esquemática da proteína recombinante RNF43-N1 e C1. A Figura 30B é uma fotografia representando a expressão da proteína RNF43-N1 marcada com Nus® em E. coli com (raia 2) ou sem (raia 1) 0,2 mM de IPTG. A Figura 30C é uma fotografia representando a expressão da proteína RNF43-C1 marcada com Nus® em E. coli com (raia 2) ou sem (raia 1)1 mM de IPTG.

As Figuras 31A e 31B representam a interação entre RNF43 e NOTCH2 examinada pelo sistema de dois híbridos em levedura. A Figura 31A representa a estrutura predita e a região de interação de NOTCH2. (a) mostra a estrutura de tamanho natural predita da proteína NOTCH2, e (b) mostra a região responsável predita para a interação (ECD, Domínio extracelular; TM, domínio de transmembrana; ICD, Domínio intracelular). A Figura 31B é uma fotografia representando a interação de RNF43 com NOTCH2 examinada pelo sistema de dois híbridos.

As Figuras 32A e 32B representam a interação entre RNF43 e STRIN examinada pelo sistema de dois híbridos em levedura. A Figura 32A representa a estrutura predita e a região de interação de STRIN. (a) mostra a estrutura de tamanho natural predita da proteína STRIN, e (b) mostra a região responsável predita para a interação (RING, domínio de RING). A Figura 32B é uma fotografia representando a interação de RNF43 com STRIN examinada pelo sistema de dois híbridos.

A Figura 33 representa a citotoxicidade específica para peptídeo da linhagem de CTL produzida através de estimulação por RNF43-721. A linhagem de CTL mostrou alta atividade citotóxica sobre as células-alvo (TlSl) pulsadas com RNF43-721 (linha quadrilateral), enquanto que nenhuma atividade citotóxica significativa foi detectada sobre as mesmas células-alvo (TISI) pulsadas sem os peptídeos (linha triangular). A linhagem de CTL foi demonstrada ter uma citotoxicidade específica para peptídeo.

A Figura 34 representa a citotoxicidade específica para peptídeo dos clones de CTL produzidos através de estimulação por RNF43-721. A atividade citotóxica dos 13 clones de CTL de RNF43-721 sobre os alvos pulsados com o peptídeo (TISI) foi testada como descrito nos Materiais e Métodos. Os clones de CTL de RNF43-721 tinham uma atividade citotóxica muito potente sobre as células-alvo (TISI) pulsadas com os peptídeos, sem mostrar qualquer atividade citotóxica significativa sobre as mesmas células-alvo (TISI) que não foram pulsadas com quaisquer peptídeos.

A Figura 35 representa a atividade citotóxica do Clone 45 de CTL de RNF43-721 sobre HT29, WiDR, e HCT116. O Clone de CTL de RNF43-721 reconhece e lisa as células de tumor que expressam de forma endógena o RNF43 em um modo restrito ao HLA. A HT29, a WiDR, e a HCT116 todas expressam de modo endógeno o RNF43, e o Clone 45 de

CTL de RNF43-721 serviu como uma célula efetora. A TISI foi usada como o alvo que não expressa RNF43. O Clone 45 de CTL de RNF43-721 mostrou alta atividade citotóxica sobre HT29 (linha triangular cheia) e WiDR (linha com losango) que expressam tanto RNF43 quanto HLA-A24. Por outro lado, o Clone 45 de CTL de RNF43-721 não mostrou nenhuma atividade citotóxica significativa sobre HCT116 (linha triangular vazia), que expressa RNF43, porém não HLA-A24, e TISI (linha quadrilateral vazia), que expressa HLAA24, porém não RNF43. Além disso, o Clone 45 de CTL de RNF43-721 não mostrou nenhuma atividade citotóxica sobre TISI pulsada com peptídeo irrelevante (linha pontilhada quadrilateral cheia) e SNU-C4 (linha com círculo cheia), que expressa RNF43, porém pouco HLA-A24.

A Figura 36 representa o resultado do ensaio de inibição de alvo frio. O Clone de CTL de RNF43-721 especificamente reconhece RNF43-721 em uma maneira restrita ao HLA-A24. Ο HT29 marcado com Na₂ ⁵¹Cr O₄foi preparado como um alvo quente, enquanto que a TISI pulsada com o peptídeo RNF43-721 (Peptídeo +) foi usada como um alvo frio (Inibidores). A razão de E/T foi fixada em 20. A atividade citotóxica sobre ο HT29 foi inibida pela adição de TISI pulsada com o peptídeo idêntico (linha quadrilateral cheia), enquanto quase nenhuma inibição ocorreu pela adição de TISI sem o pulso de peptídeo (linha quadrilateral vazia).

A Figura 37 representa o resultado do ensaio de bloqueio mostrando o efeito dos anticorpos produzidos contra HLA-Classe I, HLA-Classe ll,CD3, CD4, e CD8 sobre a atividade citotóxica do Clone de CTL de RNF43721. O Clone de CTL de RNF43-721 mostrou atividade citotóxica em uma maneira restrita ao HLA-Classe I, CD3 e CD8. Para examinar as características do clone de CTL produzido com o peptídeo RNF43, os anticorpos contra HLA-Classe I, HLA-Classe II, CD3, CD4, e CD8 foram testados quanto à sua capacidade de inibir a atividade citotóxica. O eixo horizontal revela a % de inibição da citotoxicidade. A citotoxicidade do clone de CTL sobre os alvos de WiDR foi significativamente reduzida quando os anticorpos anti classe I, CD3 e CD8 foram usados. Este resultado indica que o clone de CTL reconhece o peptídeo derivado de RNF43 em uma maneira dependente de HLA

Classe I, CD3 e CD8.

As Figuras 38A e 38B representam a citotoxicidade específica para peptídeo das linhagens de CTL produzidas com RNF43-11-9 (A) ou RNF43-11-10 (B). Estas linhagens de CTL mostraram alta atividade citotóxica sobre células-alvo (T2) pulsadas com RNF43-11-9 ou RNF43-11-10, enquanto que nenhuma atividade citotóxica significativa foi observada sobre as mesmas células-alvo (T2) pulsadas sem os peptídeos.

As Figuras 39A e 39B representam a citotoxicidade específica para peptídeo de clones de CTL produzidos através de estímulo por RNF4311-9 (A) ou RNF43-11-10 (B). A atividade citotóxica de 4 clones de CTL de RNF43-11-9 ou 7 clones de RNF43-11-10 sobre os alvos pulsados com peptídeos (T2) foi testada como descrito nos Materiais e Métodos. Os clones de CTL de RNF43-11-9 e RNF43-11-10 estabelecidos tiveram atividades citotóxicas muito potentes sobre as células-alvo (T2) pulsadas com os peptídeos, sem mostrar qualquer atividade citotóxica significativa sobre as mesmas células-alvo (T2) que não foram pulsadas com quaisquer peptídeos.

As Figuras 40A e 40B representam a atividade citotóxica do Clone 90 de CTL de RNF43-5 e do Clone 25 de CTL de RNF43-17 sobre HT29 e DLD-1. O Clone 90 de CTL de RNF43-5 e o Clone 25 de CTL de RNF4317 reconhecem e lisam as células de tumor que expressam de modo endógeno o RNF43 em um modo restrito ao HLA. A HT29 e a DLD-1 todas expressam de forma endógena o RNF43, e o Clone 90 de CTL de RNF43-5 e o Clone 25 de CTL de RNF43-17 serviram como uma célula efetora. A T2 foi usada como o alvo que não expressa o RNF43. O Clone 90 de CTL de RNF43-5 e o Clone 25 de CTL de RNF43-17 mostraram alta atividade citotóxica sobre DLD-1, que expressa tanto RNF43 quanto HLA-A*0201. Por outro lado, o Clone 90 de CTL de RNF43-5 e o Clone 25 de CTL de RNF43-17 não mostraram nenhuma atividade citotóxica significativa sobre HT29, que expressa RNF43, porém não HLA-A*0201.

A Figura 41 representa o resultado do ensaio de inibição de alvo frio. O Clone de CTL de RNF43-11-9 especificamente reconhece RNF43-119 em uma maneira restrita ao HLA-A2. O HCT116 marcado com Na₂ ⁵¹Cr O₄ foi preparado como um alvo quente, enquanto que a T2 pulsada com o peptídeo RNF43-11-9 (Peptídeo +) foi usada como um alvo frio (Inibidores). A razão de E/T foi fixada em 20. A atividade citotóxica sobre o HCT116 foi inibida pela adição de T2 pulsada com o peptídeo idêntico enquanto quase nenhuma inibição foi observada pela adição de TISI sem o pulso de peptídeo.

Descrição Detalhada da Invenção

As palavras um, uma, o(s) e a(s), como usadas aqui, significam pelo menos um(a), a não ser que de outro modo especificamente indicado.

O presente pedido identifica os novos genes humanos CXADRL1 e GCUD1, cuja expressão é marcadamente elevada no câncer gástrico, em comparação com os tecidos não-cancerosos correspondentes. O cDNA de CXADRL1 consiste em 3423 nucleotídeos que contêm um quadro de leitura aberto de 1296 nucleotídeos, como apresentado em SEQ ID NO: 1. O quadro de leitura aberto codifica uma proteína de 431 aminoácidos putativa. O CXADRL1 associa-se com a AIP1. A AIP1 (proteína 1 de interação com a atripina-1) é uma proteína que se associa com a atropina-1, um gene responsável por uma doença de hereditariedade, a atrofia dentatorubro-palidoluysiana. A AIP1 codifica uma proteína de 1455 aminoácidos deduzida, contendo o domínio semelhante à guanilato cinase, dois domínios de WW e cinco domínios de PDZ. O homólogo de AIP1 de camundongo foi mostrado interagir com a activina tipo IIA. Entretanto, a função da AIP1 permanece a ser resolvida. A seqüência de aminoácidos predita mostrou uma identidade de aproximadamente 37% com o CXADR (receptor de coxsackie e adenovírus). Portanto, esta proteína foi nomeada CXADRL1 (receptor de coxsackie e adenovírus tipo 1). Por outro lado, o cDNA de GCUD1 consiste em 4987 nucleotídeos que contêm um quadro de leitura aberto de 1245 nucleotídeos, como apresentado em SEQ ID NO: 3. O quadro de leitura aberto codifica uma proteína de 414 aminoácidos putativa. Visto que a expressão da proteína foi supra-regulada no câncer gástrico, a proteína foi nomeada GCUD1 (supra-regulada no câncer gástrico).

Além disso, a presente invenção inclui o novo gene humano RNF43, cuja expressão é marcadamente elevada no câncer colorretal, em comparação com o tecido não-canceroso correspondente. O cDNA de RNF43 consiste em 5345 nucleotídeos que contêm um quadro de leitura aberto de 2352 nucleotídeos, como apresentado em SEQ ID NO: 5. O quadro de leitura aberto codifica uma proteína de 783 aminoácidos putativa. O RNF43 associa-se com a NOTCH2 e a STRIN. A NOTCH2 é descrita como uma grande proteína receptora de transmembrana que é um componente de um mecanismo de sinalização intercelular conservado de modo evolucionário. A NOTCH2 é um membro de proteína da via de sinalização de Notch e é descrita estar envolvida na glomerulogênese no rim e no desenvolvimento da vasculatura do coração e do olho. Além disso, três proteínas de Delta/Serrate/Lag-2 (DSL), Deitai, Jaggaedl, e Jaggaed2, são descritas como ligando funcionais para a NOTCH2. A STRIN codifica uma proteína putativa que compartilha 79% de identidade com a Trif de camundongo. A função da STRIN ou da Trif permanece para ser clarificada.

Consistentemente, a expressão exógena de CXADRL1, GCUD1, ou RNF43 nas células conferiu um crescimento celular aumentado, enquanto que a supressão de sua expressão com os S-oligonucleotídeos anti-sentido ou o RNA de pequena interferência (siRNA) resultou na inibição significativa do crescimento das células cancerosas. Estas verificações sugerem que o CXADRL1, o GCUD1, e o RNF43 proporcionam atividade oncogênica às células de câncer, e que a inibição da atividade destas proteínas poderia ser uma estratégia promissora para o tratamento de câncer.

A presente invenção inclui o novo gene humano CXADRL1, incluindo uma seqüência de polinucleotídeo como descrita na SEQ ID NO: 1, bem como os degenerados e os mutantes desta, na medida em que eles codificam uma proteína CXADRL1, incluindo a seqüência de aminoácidos descrita na SEQ ID NO: 2 ou o seu equivalente funcional. Os exemplos de polipeptídeos funcionalmente equivalentes ao CXADRL1 incluem, por exemplo, as proteínas homólogas de outros organismos correspondendo à proteína CXADRL1 humana, bem como os mutantes das proteínas CXADRL1 humanas.

A presente invenção também inclui o novo gene humano GCUD1, incluindo uma seqüência de polinucleotídeo como descrita na SEQ ID NO: 3, bem como os degenerados e os mutantes desta, na medida em que eles codificam uma proteína GCUD1, incluindo a seqüência de aminoácidos descrita na SEQ ID NO: 4 ou o seu equivalente funcional. Os exemplos de polipeptídeos funcionalmente equivalentes ao GCUD1 incluem, por exemplo, as proteínas homólogas de outros organismos correspondendo à proteína GCUD1 humana, bem como os mutantes das proteínas GCUD1 humanas.

Além disso, a presente invenção inclui o novo gene humano RNF43, incluindo uma seqüência de polinucleotídeo como descrita na SEQ ID NO: 5, bem como os degenerados e os mutantes desta, na medida em que eles codificam uma proteína RNF43, incluindo a seqüência de aminoácidos descrita na SEQ ID NO: 6 ou o seu equivalente funcional. Os exemplos de polipeptídeos funcionalmente equivalentes ao RNF43 incluem, por exemplo, as proteínas homólogas de outros organismos correspondendo à proteína RNF43 humana, bem como os mutantes das proteínas RNF43 humanas.

Na presente invenção, o termo funcionalmente equivalente(s) significa que o polipeptídeo exposto tem a atividade de promover a proliferação das células, como a proteína CXADRL1, GCUD1, ou RNF43, e conferir atividade oncogênica às células de câncer. Quer o polipeptídeo exposto tenha uma atividade de proliferação das células, quer não tenha, pode ser julgado introduzindo o DNA codificando o polipeptídeo exposto em uma célula expressando o respectivo polipeptídeo, e detectando a promoção da proliferação das células ou o aumento na atividade de formação de colônias. Tais células incluem, por exemplo, as células NIH363 para CXADRL1 e GCLID1; e as células NIH3T3, as células SW480, e as células COS7 para RNF43. Alternativamente, se o polipeptídeo exposto é funcionalmente equivalente ao CXADRL1 pode ser julgado detectando a sua capacidade de ligação à AIP1. Além disso, se o polipeptídeo exposto é funcionalmente equivalente ao RNF43 pode ser julgado detectando a sua capacidade de ligação à NOTCH2 ou à STRIN.

Os métodos para preparar polipeptídeos funcionalmente equivalentes a uma dada proteína são bastante conhecidos por uma pessoa versada na técnica e incluem os métodos conhecidos de introduzir mutações na proteína. Por exemplo, alguém versado na técnica pode preparar polipeptídeos funcionalmente equivalentes à proteína CXADRL1, GCUD1, ou RNF43 humana por introdução de uma mutação apropriada na seqüência de aminoácidos de quaisquer destas proteínas, por mutagênese orientada para o sítio (Hashimoto-Gotoh e outros, Gene 152:271-5 (1995); Zollere Smith, Methods Enzymol 100: 468-500 (1983); Kramere outros, Nucleic Acids Res. 12:94419456 (1984); Kramer e Fritz, Methods Enzymol 154: 350-67 (1987); Kunkel, Proc Natl Acad Sei USA 82: 488-92 (1985); Kunkel, Methods Enzymol 85: 2763-6 (1988)). As mutações nos aminoácidos podem ocorrer na natureza, também. O polipeptídeo da presente invenção inclui aquelas proteínas tendo as seqüências de aminoácidos da proteína CXADRL1, GCUD1, ou RNF43 humana, na qual um ou mais aminoácidos são mutados, desde que os polipeptídeos mutados resultantes sejam funcionalmente equivalentes à proteína CXADRL1, GCUD1, ou RNF43 humana. O número de aminoácidos a serem mutados em um tal mutante é geralmente 10 aminoácidos ou menos, preferivelmente 6 aminoácidos ou menos, e mais preferivelmente 3 aminoácidos ou menos.

As proteínas mutadas ou modificadas, as proteínas tendo seqüências de aminoácidos modificadas substituindo, removendo, inserindo, e/ou adicionando um ou mais resíduos de aminoácidos de uma certa seqüência de aminoácidos, são sabidas conservarem a atividade biológica original (Mark e outros, Proc Natl Acad Sei USA 81: 5662-6 (1984); Zoller e Smith, Nucleic Acids Res 10:6487-500 (1982); Dalbadie-McFarland e outros, Proc Natl Acad Sei USA 79: 6409-13 (1982)).

O resíduo de aminoácido a ser mutado é preferivelmente mutado para um aminoácido diferente no qual são conservadas as propriedades da cadeia lateral do aminoácido (um processo conhecido como substituição conservativa do aminoácido). Os exemplos das propriedades das cadeias laterais dos aminoácidos são os aminoácidos hidrofóbicos (A, I, L, M, F, P, W, Y, V), os aminoácidos hidrofílicos (R, D, N, C, E, Q, G, Η, K, S, T), e as cadeias laterais tendo os seguintes grupos funcionais ou características em comum: uma cadeia lateral alifática (G, A, V, L, I, P); uma cadeia lateral contendo grupo hidroxila (S, T, Y); uma cadeia lateral contendo átomo de enxofre (C, M); uma cadeia lateral contendo ácido carboxílico e amida (D, N, E, Q); uma cadeia lateral contendo base (R, K, H); e uma cadeia lateral contendo aromático (H, F, Y, W). Observação, as letras entre parênteses indicam os códigos de aminoácidos de uma letra.

Um exemplo de um polipeptídeo ao qual um ou mais resíduos de aminoácidos são adicionados à seqüência de aminoácidos da proteína CXADRL1, GCUD1, ou RNF43 humana é uma proteína de fusão contendo a proteína CXADRL1, GCUD1, ou RNF43 humana. As proteínas de fusão são fusões da proteína CXADRL1, GCUD1, ou RNF43 humana e outros peptídeos ou proteínas, e estão incluídas na presente invenção. As proteínas de fusão podem ser preparadas por técnicas bastante conhecidas para uma pessoa versada na técnica, tais como por ligação do DNA codificando a proteína CXADRL1, GCUD1, ou RNF43 humana da invenção com o DNA codificando outros peptideos ou proteínas, de modo que os quadros igualem-se, inserção do DNA de fusão em um vetor de expressão e a sua expressão em um hospedeiro. Não há nenhuma restrição em relação aos peptideos ou às proteínas fundidos à proteína da presente invenção.

Os peptideos conhecidos que podem ser usados como peptídeos que são fundidos à proteína da presente invenção incluem, por exemplo, o FLAG (Hopp e outros, Biotechnology 6: 1204-10 (1988)), o 6xHis contendo seis resíduos de His (histidina), o 10xHis, a aglutinina de Influenza (HA), o fragmento de c-myc humano, o fragmento de VSP-GP, o fragmento de p18HIV, a marca de T7, a marca de HSV, a marca E, o fragmento de antígeno de SV40T, a marca de Ick, o fragmento de α-tubulina, a marca de Β, o fragmento de Proteína C, e similares. Os exemplos de proteínas que podem ser fundidas a uma proteína da invenção incluem a GST (glutationa-Stransferase), a aglutinina de Influenza (HA), a região constante da imunoglo bulina, a β-galactosidase, a MBP (proteína de ligação à maltose), e semelhante.

As proteínas de fusão podem ser preparadas por fusão do DNA comercialmente disponível, codificando os peptídeos ou as proteínas de fusão discutidos acima, com o DNA codificando o polipeptídeo da presente invenção e expressão do DNA fundido preparado.

Um método alternativo conhecido na técnica para isolar os polipeptídeos funcionalmente equivalentes é, por exemplo, o método usando uma técnica de hibridização (Sambrook e outros, Molecular Cloning 2- ed. 9.47-9.58, Cold Spring Harbor Lab. Press (1989)). Alguém versado na técnica pode prontamente isolar um DNA tendo alta homologia com um todo ou parte da seqüência de DNA codificando a proteína CXADRL1, GCUD1, ou RNF43 humana (isto é, a SEQ ID NO: 1, 3, ou 5), e isolar os polipeptídeos funcionalmente equivalentes à proteína CXADRL1, GCUD1, ou RNF43 humana do DNA isolado. Os polipeptídeos da presente invenção incluem aqueles que são codificados pelo DNA que hibridiza com um todo ou parte da seqüência de DNA codificando a proteína CXADRL1, GCUD1, ou RNF43 humana e são funcionalmente equivalentes à proteína CXADRL1, GCUD1, ou RNF43 humana. Estes polipeptídeos incluem os homólogos mamíferos correspondendo à proteína derivada de ser humano (por exemplo, um polipeptídeo codificado por um gene de macaco, rato, coelho e bovino). No isolamento de um cDNA altamente homólogo ao DNA codificando a proteína CXADRL1 humana de animais, é particularmente preferível usar os tecidos do testículo ou do ovário. Alternativamente, no isolamento de um cDNA altamente homólogo ao DNA codificando o GCUD1 humano de animais, é particularmente preferível usar os tecidos do testículo, do ovário, ou do cérebro. Além disso, no isolamento de um cDNA altamente homólogo ao DNA codificando a proteína RNF43 humana de animais, é particularmente preferível usar o tecido do pulmão fetal ou do rim fetal.

A condição de hibridização para isolar um DNA codificando um polipeptídeo funcionalmente equivalente à proteína CXADRL1, GCUD1, ou RNF43 humana pode ser rotineiramente selecionada por uma pessoa versa da na técnica. Por exemplo, a hibridização pode ser efetuada conduzindo a pré-hibridização a 68°C por 30 min ou mais tempo usando o tampão Rapidhyb (Amersham LIFE SCIENCE), adicionando uma sonda marcada, e aquecendo a 68°C por 1 hora ou mais tempo. A seguinte etapa de lavagem pode ser conduzida, por exemplo, em uma baixa condição rigorosa. Uma baixa condição rigorosa é, por exemplo, 42°C, 2X SSC, 0,1% de SDS, ou preferivelmente 50°C, 2X SSC, 0,1% de SDS. Mais preferivelmente, são usadas altas condições rigorosas. Uma alta condição rigorosa é, por exemplo, a lavagem 3 vezes em 2X SSC, 0,01% de SDS na temperatura ambiente por 20 min, então a lavagem 3 vezes em 1x SSC, 0,1% de SDS a 37°C por 20 min, e a lavagem duas vezes em 1x SSC, 0,1% de SDS a 50°C por 20 min. Entretanto, diversos fatores, tais como a temperatura e a concentração do sal, podem influenciar o rigor da hibridização e alguém versado na técnica pode adequadamente selecionar os fatores para obter o rigor requerido.

No lugar da hibridização, pode ser utilizado um método de amplificação de gene, por exemplo, o método de reação em cadeia por polimerase (PCR), para isolar um DNA codificando um polipeptídeo funcionalmente equivalente à proteína CXADRL1, GCUD1, ou RNF43 humana, usando um primer sintetizado com base na informação de seqüência do DNA codificando a proteína (SEQ ID NO: 1,3, ou 5).

Os polipeptídeos que são funcionalmente equivalentes à proteína CXADRL1, GCUD1, ou RNF43 humana, codificada pelo DNA isolado através das técnicas de hibridização ou das técnicas de amplificação do gene acima descritas, normalmente têm uma alta homologia com a seqüência de aminoácidos da proteína CXADRL1, GCUD1, ou RNF43 humana. A alta homologia tipicamente refere-se a uma homologia de 40% ou mais, preferivelmente 60% ou mais, mais preferivelmente 80% ou mais, ainda mais preferivelmente 95% ou mais. A homologia de um polipeptídeo pode ser determinada seguindo o algoritmo em “Wilbur e Lipman, Proc Natl Acad Sei USA 80: 726-30(1983)”.

Um polipeptídeo da presente invenção pode ter variações na seqüência de aminoácidos, no peso molecular, no ponto isoelétrico, na presença ou ausência de cadeias de açúcares, ou na forma, dependendo da célula ou do hospedeiro usado para produzi-lo ou do método de purificação utilizado. Todavia, desde que ele tenha uma função equivalente àquela da proteína CXADRL1, GCUD1, ou RNF43 humana da presente invenção, ele está dentro do escopo da presente invenção.

Os polipeptídeos da presente invenção podem ser preparados como proteínas recombinantes ou proteínas naturais, por métodos bastante conhecidos para aqueles versados na técnica. Uma proteína recombinante pode ser preparada inserindo um DNA, o qual codifica o polipeptídeo da presente invenção (por exemplo, o DNA compreendendo a seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1, 3, ou 5), em um vetor de expressão apropriado, introduzindo o vetor em uma célula hospedeira apropriada, obtendo o extrato, e purificando o polipeptídeo por sujeição do extrato à cromatografia, por exemplo, a cromatografia de troca iônica, a cromatografia de fase reversa, a filtração em gel, ou a cromatografia por afinidade, utilizando uma coluna à qual são fixados os anticorpos contra a proteína da presente invenção, ou por combinação de mais do que uma das colunas antes mencionadas.

Também quando o polipeptídeo da presente invenção for expresso dentro de células hospedeiras (por exemplo, as células animais e a E. coli) como uma proteína de fusão com a proteína de glutationa-Stransferase ou como uma proteína recombinante suplementada com múltiplas histidinas, a proteína recombinante expressa pode ser purificada usando uma coluna de glutationa ou uma coluna de níquel. Alternativamente, quando o polipeptídeo da presente invenção for expresso como uma proteína marcada com c-myc, histidinas múltiplas, ou FLAG, ele pode ser detectado e purificado usando anticorpos para c-myc, His, ou FLAG, respectivamente.

Após a purificação da proteína de fusão, é também possível excluir as regiões diferentes do polipeptídeo visado cortando com trombina ou fator-Xa, conforme requerido.

Uma proteína natural pode ser isolada por métodos conhecidos para uma pessoa versada na técnica, por exemplo, através do contato da coluna de afinidade, na qual os anticorpos que se ligam à proteína CXADRL1, GCUD1, ou RNF43 descrita abaixo estão ligados, com o extrato de tecidos ou células expressando o polipeptídeo da presente invenção. Os anticorpos podem ser anticorpos policlonais ou anticorpos monoclonais.

A presente invenção também inclui os peptídeos parciais do polipeptídeo da presente invenção. O peptídeo parcial tem uma seqüência de aminoácidos específica para o polipeptídeo da presente invenção e consiste em pelo menos 7 aminoácidos, preferivelmente 8 aminoácidos ou mais, e mais preferivelmente 9 aminoácidos ou mais. O peptídeo parcial pode ser usado, por exemplo, para a preparação de anticorpos contra o polipeptídeo da presente invenção, o exame quanto a um composto que se liga ao polipeptídeo da presente invenção, e o exame quanto aos aceleradores ou inibidores do polipeptídeo da presente invenção.

Um peptídeo parcial da invenção pode ser produzido por engenharia genética, por métodos conhecidos de síntese de peptídeos, ou por digestão do polipeptídeo da invenção com uma peptidase apropriada. Para a síntese de peptídeos, por exemplo, pode ser usada a síntese em fase sólida ou a síntese em fase líquida.

Além disso, a presente invenção proporciona polinucleotídeos codificando o polipeptídeo da presente invenção. Os polinucleotídeos da presente invenção podem ser usados para a produção in vivo ou in vitro do polipeptídeo da presente invenção, como descrito acima, ou podem ser aplicados à terapia do gene para doenças atribuídas à anormalidade genética no gene codificando a proteína da presente invenção. Qualquer forma do polinucleotídeo da presente invenção pode ser usada, desde que ele codifique o polipeptídeo da presente invenção, incluindo o mRNA, o RNA, o cDNA, o DNA genômico, os polinucleotídeos quimicamente sintetizados. O polinucleotídeo da presente invenção inclui um DNA compreendendo uma dada seqüência de nucleotídeos, assim como as suas seqüências degeneradas, desde que o DNA resultante codifique um polipeptídeo da presente invenção.

O polinucleotídeo da presente invenção pode ser preparado por métodos conhecidos para uma pessoa versada na técnica. Por exemplo, o polinucleotídeo da presente invenção pode ser preparado por: preparação de uma biblioteca de cDNA a partir de células que expressam o polipeptídeo da presente invenção, e condução da hibridização usando uma seqüência parcial do DNA da presente invenção (por exemplo, SEQ ID NO: 1, 3, ou 5) como uma sonda. Uma biblioteca de cDNA pode ser preparada, por exemplo, através do método descrito em Sambrook e outros, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); alternativamente, podem ser usadas bibliotecas de cDNA comercialmente disponíveis. Uma biblioteca de cDNA pode ser também preparada por: extração dos RNAs de células expressando o polipeptídeo da presente invenção, síntese de oligo DNAs com base na seqüência do DNA da presente invenção (por exemplo, SEQ ID NO: 1, 3, ou 5), condução da PCR usando os oligo DNAs como iniciadores, e amplificação dos cDNAs codificando a proteína da presente invenção.

Além disso, por seqüenciamento dos nucleotídeos do cDNA obtido, a região de tradução codificada pelo cDNA pode ser rotineiramente determinada, e a seqüência de aminoácidos do polipeptídeo da presente invenção pode ser facilmente obtida. Ademais, por exame da biblioteca de DNA genômico usando o cDNA obtido ou partes do mesmo como uma sonda, o DNA genômico pode ser isolado.

Mais especificamente, os mRNAs podem ser preparados primeiramente a partir de uma célula, tecido, ou órgão (por exemplo, o testículo ou o ovário para o CXADRL1; o testículo, o ovário, ou o cérebro para o GCUD1; e o pulmão fetal, ou o rim fetal para o RNF43), no qual o polipeptídeo visado da invenção é expresso. Podem ser usados métodos conhecidos para isolar os mRNAs; por exemplo, o RNA total pode ser preparado por ultracentrifugação de guanidina (Chirgwin e outros, Biochemistry 18:5294-9 (1979)) ou pelo método de AGPC (Chomczynski e Sacchi, Anal Biochem 162:156-9 (1987)). Além disso, o mRNA pode ser purificado a partir do RNA total usando o Kit de Purificação de mRNA (Pharmacia) e similar ou, alternativamente, o mRNA pode ser diretamente purificado pelo Kit de Purificação de mRNA

QuickPrep (Pharmacia).

O mRNA obtido é usado para sintetizar o cDNA usando a transcritase reversa. O cDNA pode ser sintetizado usando um kit comercialmente disponível, tal como o Kit de Síntese de cDNA de Primeira Fita com Transcritase Reversa de AMV (Seikagaku Kogyo). Alternativamente, o cDNA pode ser sintetizado e amplificado seguido o método de 5-RACE (Frohman e outros, Proc Natl Acad Sei USA 85: 8998-9002 (1988); Belyavsky e outros, Nucleic Acids Res 17: 2919-32 (1989)), que utiliza um primer e similar, descrito aqui, o Kit 5-Ampli FINDER RACE (Clontech), e a reação em cadeia por polimerase (PCR).

Um fragmento de DNA desejado é preparado a partir dos produtos da PCR e ligado com um DNA do vetor. Os vetores recombinantes são usados para transformar a E. coli e similar, e um vetor recombinante desejado é preparado a partir de uma colônia selecionada. A seqüência de nucleotídeos do DNA desejado pode ser verificada por métodos convencionais, tais como a terminação de cadeia de didesoxinucleotídeo.

A seqüência de nucleotídeos de um polinucleotídeo da invenção pode ser projetada para ser expressa mais eficientemente levando-se em conta a freqüência de uso de códon no hospedeiro a ser usado para a expressão (Grantham e outros, Nucleic Acids Res 9: 43-74 (1981)). A seqüência do polinucleotídeo da presente invenção pode ser alterada por um kit comercialmente disponível ou um método convencional. Por exemplo, a seqüência pode ser alterada por digestão com enzimas de restrição, inserção de um oligonucleotídeo sintético ou um fragmento de polinucleotídeo apropriado, adição de um ligador, ou inserção do códon de iniciação (ATG) e/ou do códon de interrupção (TAA, TGA, ou TAG).

Especificamente, o polinucleotídeo da presente invenção inclui o DNA compreendendo a seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1, 3, ou 5.

Além disso, a presente invenção proporciona um polinucleotídeo que hibridiza, sob condições rigorosas, com um polinucleotídeo tendo uma seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1, 3, ou 5, e codifica um poli peptídeo funcionalmente equivalente à proteína CXADRL1, GCUD1, ou RNF43 da invenção descrita acima. Alguém versado na técnica pode apropriadamente escolher as condições rigorosas. Por exemplo, pode ser usada a baixa condição rigorosa. Mais preferivelmente, pode ser usada a alta condição rigorosa. Estas condições são as mesmas que as descritas acima. O DNA de hibridização acima mencionado é preferivelmente um cDNA ou um DNA cromossômico.

A presente invenção também proporciona um vetor no qual um polinucleotídeo da presente invenção é inserido. Um vetor da presente invenção é útil para manter um polinucleotídeo, especialmente um DNA, da presente invenção na célula hospedeira, para expressar o polipeptídeo da presente invenção, ou para administrar o polinucleotídeo da presente invenção para a terapia de gene.

Quando a E. coli for uma célula hospedeira e o vetor for amplificado e produzido em uma grande quantidade na E. coli (por exemplo, JM109, DH5a, HB101, ou XL1 Blue), o vetor deve ter um ori para ser amplificado na E. coli e um gene marcador para selecionar a E. coli transformada (por exemplo, um gene de resistência a drogas selecionado por uma droga, tal como a ampicilina, a tetraciclina, a canamicina, o cloranfenicol ou similares). Por exemplo, os vetores da série M13, os vetores da série pUC, o pBR322, o pBluescript, o pCR-Script, etc. podem ser usados. Além disso, o pGEM-T, o p-DIRECT, e o pT7 podem também ser usados para subclonar e extrair o cDNA bem como os vetores descritos acima. Quando um vetor for usado para produzir a proteína da presente invenção, um vetor de expressão é especialmente útil. Por exemplo, um vetor de expressão a ser expresso na E. coli deve ter as características acima mencionadas para ser amplificado na E. coli. Quando a E. coli, tal como JM109, DH5a, HB101, ou XL1 Blue, for usada como uma célula hospedeira, o vetor deve ter um promotor, por exemplo, o promotor de lacZ (Ward e outros, Nature 341: 544-6 (1989); FASEB J 6: 2422-7 (1992)), o promotor de araB (Better e outros, Science 240: 1041-3 (1988)), ou o promotor de T7 ou similar, que pode eficientemente expressar o gene desejado na E. coli. Neste aspecto, o pGEX-5X-1 (Phar macia), o “sistema QIAexpress” (Qiagen), o pEGFP e o pET (neste caso, o hospedeiro é preferivelmente o BL21, o qual expressa a T7 RNA polimerase), por exemplo, podem ser usados em vez dos vetores acima mencionados. Adicionalmente, o vetor pode também conter uma seqüência de sinais para a secreção do polipeptídeo. Uma seqüência de sinais ilustrativa que orienta o polipeptídeo a ser secretado para o periplasma da E. coli é a seqüência de sinais de pelB (Lei e outros, J Bacteriol 169: 4379 (1987)). Os meios para a introdução dos vetores nas células hospedeiras alvo incluem, por exemplo, o método do cloreto de cálcio, e o método de eletroporação.

Além da E. coli, por exemplo, os vetores de expressão derivados de mamíferos (por exemplo, o pcDNA3 (Invitrogen) e o pEGF-BOS (Nucleic Acids Res 18(17): 5322 (1990)), o pEF, o pCDM8), os vetores de expressão derivados de células de insetos (por exemplo, “o sistema de expressão de baculovírus Bac a BAC” (GIBCO BRL), o pBacPAK8), os vetores de expressão derivados de plantas (por exemplo, o pMH1, o pMH2), os vetores de expressão derivados de vírus de animais (por exemplo, o pHSV, o pMV, o pAdexLcw), os vetores de expressão derivados de retrovírus (por exemplo, o pZIpneo), o vetor de expressão derivado de levedura (por exemplo, o “Kit de Expressão de Pichia” (Invitrogen), o pNV11, o SP-Q01), e os vetores de expressão derivados de Bacillus subtilis (por exemplo, o pPL608, o pKTH50), podem ser usados para produzir o polipeptídeo da presente invenção.

A fim de expressar o vetor em células animais, tais como as células CHO, COS, ou NIH3T3, o vetor deve ter um promotor necessário para a expressão em tais células, por exemplo, o promotor de SV40 (Mulligan e outros, Nature 277: 108 (1979)), o promotor de MMLV-LTR, o promotor de EF1a (Mizushima e outros, Nucleic Acids Res 18: 5322 (1990)), o promotor de CMV, e similares, e preferivelmente um gene marcador para selecionar os transformantes (por exemplo, um gene de resistência a drogas selecionado por uma droga (por exemplo, neomicina, G418)). Os exemplos de vetores conhecidos com estas características incluem, por exemplo, o pMAM, o pDR2, o pBK-RSV, o pBK-CMV, o pOPRSV, e o pOP13.

Além disso, podem ser usados métodos para expressar um gene estavelmente e, ao mesmo tempo, amplificar o número de cópias do gene nas células. Por exemplo, um vetor compreendendo o gene de DHFR complementar (por exemplo, o pCHO I) pode ser introduzido nas células CHO nas quais a via de sintetizar o ácido nucléico é removida, e então amplificado pelo metotrexato (MTX). Ademais, no caso da expressão transiente de um gene, pode ser usado o método em que um vetor compreendendo uma origem de replicação de SV40 (pcD, etc.) é transformado nas células COS compreendendo o antígeno de SV40 T expressando o gene sobre o cromossomo.

Um polipeptídeo da presente invenção, obtido como acima descrito, pode ser isolado de dentro ou de fora (tal como o meio) das células hospedeiras, e purificado como um polipeptídeo homogêneo substancialmente puro. O termo substancialmente puro, como usado aqui em referência a um dado polipeptídeo, significa que o polipeptídeo está substancialmente isento de outras macromoléculas biológicas. O polipeptídeo substancialmente puro é pelo menos 75% (por exemplo, pelo menos, 80, 85, 95, ou 99%) puro por peso seco. A pureza pode ser medida por qualquer métodopadrão apropriado, por exemplo através de cromatografia em coluna, eletroforese em gel de poliacrilamida, ou análise por HPLC. O método para o isolamento e a purificação do polipeptídeo não está limitado a qualquer método específico; na realidade, qualquer método-padrão pode ser usado.

Por exemplo, a cromatografia em coluna, o filtro, a ultrafiltração, a precipitação com sal, a precipitação com solvente, a extração com solvente, a destilação, a imunoprecipitação, a eletroforese em gel de poliacrilamida-SDS, a eletroforese de ponto isoelétrico, a diálise, e a recristalização podem ser apropriadamente selecionadas e combinadas para isolar e purificar o polipeptídeo.

Os exemplos de cromatografia incluem, por exemplo, a cromatografia por afinidade, a cromatografia de troca iônica, a cromatografia hidrofóbica, a filtração em gel, a cromatografia de fase reversa, a cromatografia de adsorção, e similares (Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed. Daniel R. Marshak e outros, Cold

Spring Harbor Laboratory Press (1996)). Estas cromatografias podem ser efetuadas por cromatografia líquida, tal como HPLC e FPLC. Assim, a presente invenção proporciona polipeptídeos altamente purificados, preparados pelos métodos acima descritos.

Um polipeptídeo da presente invenção pode ser opcionalmente modificado ou parcialmente removido tratando-o com uma enzima de modificação de proteína apropriada, antes ou após a purificação. As enzimas de modificação de proteína úteis incluem, porém não estão limitadas à, tripsina, quimotripsina, lisilendopeptidase, cinase protéica, glicosidase, e assim por diante.

A presente invenção proporciona um anticorpo que se liga ao polipeptídeo da invenção. O anticorpo da invenção pode ser usado em qualquer forma, tal como os anticorpos monoclonais ou policlonais, e inclui o anti-soro obtido por imunização de um animal, tal como um coelho, com o polipeptídeo da invenção, todas as classes de anticorpos policlonais e monoclonais, os anticorpos humanos, e os anticorpos humanizados produzidos por recombinação genética.

Um polipeptídeo da invenção, usado como um antígeno para obter um anticorpo, pode ser derivado de qualquer espécie animal, porém preferivelmente é derivado de um mamífero, tal como um ser humano, camundongo, ou rato, mais preferivelmente de um ser humano. Um polipeptídeo derivado de ser humano pode ser obtido a partir das seqüências de nucleotídeos ou de aminoácidos divulgadas aqui. De acordo com a presente invenção, o polipeptídeo a ser usado como um antígeno de imunização pode ser uma proteína completa ou um peptídeo parcial da proteína. Um peptídeo parcial pode compreender, por exemplo, o fragmento amino (N)-terminal ou carbóxi (C)-terminal de um polipeptídeo da presente invenção. Mais especificamente, um polipeptídeo de CXADRL1 incluindo os códons de 235 a 276, de 493 a 537, ou de 70 a 111 pode ser usado como peptideos parciais para a produção de anticorpos contra o CXADRL1 da presente invenção.

Alternativamente, para a produção de anticorpos contra o polipeptídeo da presente invenção, podem ser usados os peptideos compreen38 dendo qualquer uma das seguintes seqüências de aminoácidos.

RNF43 ; SEQ ID No: 80, 97, ou 108

CXADRL1 ; SEQ ID No: 124

GCUD1 ; SEQ ID No: 164

Aqui, um anticorpo é definido como uma proteína que reage com o tamanho natural ou um fragmento de um polipeptídeo da presente invenção.

Um gene codificando um polipeptídeo da invenção ou o seu fragmento pode ser inserido em um vetor de expressão conhecido, o qual é então usado para transformar uma célula hospedeira, como descrito aqui. O polipeptídeo desejado, ou o seu fragmento, pode ser recuperado do lado de dentro ou do lado de fora das células hospedeiras por qualquer métodopadrão, e pode subseqüentemente ser usado como um antígeno. Alternativamente, as células inteiras expressando o polipeptídeo ou os seus lisados, ou um polipeptídeo quimicamente sintetizado pode ser usado como o antígeno.

Qualquer animal mamífero pode ser imunizado com o antígeno, porém preferivelmente é levada em conta a compatibilidade com as células parentais usadas para a fusão da célula. Em geral, são usados os animais dos Roedores, da Lagomorpha, ou dos Primatas. Os animais dos Roedores incluem, por exemplo, o camundongo, o rato, e o hamster. Os animais da Lagomorpha incluem, por exemplo, o coelho. Os animais dos Primatas incluem, por exemplo, um macaco catarrino (macaco do velho mundo), tal como Macaca fascicularis, o macaco reso, o babuíno sagrado, e os chimpanzés.

Os métodos para imunizar os animais com os antígenos são conhecidos na técnica. A injeção intraperitoneal ou a injeção subcutânea de antígenos é um método-padrão para a imunização dos mamíferos. Mais especificamente, os antígenos podem ser diluídos e suspensos em uma quantidade apropriada de solução salina tamponada com fosfato (PBS), solução salina fisiológica, etc.. Se desejado, a suspensão de antígenos pode ser misturada com uma quantidade apropriada de um adjuvante-padrão, tal como o adjuvante completo de Freund, transformada em emulsão, e então administrada aos animais mamíferos. De preferência, ela é seguida por diversas administrações de antígeno misturado com uma quantidade apropriada de adjuvante incompleto de Freund a cada 4 a 21 dias. Um veículo apropriado pode também ser usado para a imunização. Após a imunização como acima descrito, o soro é examinado por um método-padrão quanto a um aumento na quantidade de anticorpos desejados.

Os anticorpos policlonais contra os polipeptídeos da presente invenção podem ser preparados coletando o sangue do mamífero imunizado, examinado quanto ao aumento de anticorpos desejados no soro, e separando o soro do sangue por qualquer método convencional. Os anticorpos policlonais incluem o soro contendo os anticorpos policlonais, assim como a fração contendo os anticorpos policlonais pode ser isolada do soro. A imunoglobulina G ou M pode ser preparada a partir de uma fração que reconhece somente o polipeptídeo da presente invenção usando, por exemplo, uma coluna de afinidade acoplada com o polipeptídeo da presente invenção, e adicionalmente purificando esta fração usando coluna de proteína A ou de proteína G.

Para preparar os anticorpos monoclonais, as células imunes são coletadas do mamífero imunizado com o antígeno e checadas quanto ao nível aumentado de anticorpos desejados no soro, como descrito acima, e são submetidas à fusão de células. As células imunes usadas para a fusão de células são preferivelmente obtidas do baço. As outras células parentais preferidas a serem fundidas com o imunócito acima incluem, por exemplo, as células de mieloma de mamíferos, e mais preferivelmente as células de mieloma tendo uma propriedade adquirida para a seleção de células fundidas por drogas.

O imunócito e as células de mieloma acima mencionados podem ser fundidos de acordo com métodos conhecidos, por exemplo, o método de Milstein e outros (Galfre e Milstein, Methods Enzymol 73: 3-46 (1981)).

Os hibridomas resultantes obtidos pela fusão das células podem ser selecionados por seu cultivo em um meio de seleção padrão, tal como o meio de HAT (meio contendo hipoxantina, aminopterina, e timidina). A cultu ra de células é tipicamente continuada no meio de HAT por diversos dias até diversas semanas, o tempo sendo suficiente para permitir que todas as outras células, com a exceção do hibridoma desejado (células não-fundidas), morram. Então, a diluição limitativa padrão é efetuada para examinar e clonar uma célula de hibridoma produzindo o anticorpo desejado.

Além do método acima descrito, no qual um animal não-humano é imunizado com um antígeno para a preparação de hibridoma, os linfócitos humanos, tais como aqueles infectados pelo vírus de EB, podem ser imunizados com um polipeptídeo, células que expressam o polipeptídeo, ou seus lisados in vitro. Então, os linfócitos imunizados são fundidos com as células de mieloma derivadas de seres humanos que são capazes de dividirem-se indefinidamente, tais como a U266, para produzir um hibridoma produzindo um anticorpo humano desejado que é capaz de se ligar ao polipeptídeo, pode ser obtido (Pedido de Patente Japonesa Publicado Não-Examinado N^Q(JP-A)Sho 63-17688).

Os hibridomas obtidos são subseqüentemente transplantados na cavidade abdominal de um camundongo e as ascites são extraídas. Os anticorpos monoclonais obtidos podem ser purificados através de, por exemplo, precipitação com sulfato de amônio, uma coluna de proteína A ou proteína G, cromatografia de troca iônica de DEAE, ou uma coluna de afinidade à qual está acoplado o polipeptídeo da presente invenção. O anticorpo da presente invenção pode ser usado não somente para a purificação e a detecção do polipeptídeo da presente invenção, mas também como um candidato para agonistas e antagonistas do polipeptídeo da presente invenção. Além disso, este anticorpo pode ser aplicado ao tratamento com anticorpos para doenças relacionadas ao polipeptídeo da presente invenção. Quando o anticorpo obtido for para ser administrado ao corpo humano (tratamento com anticorpo), um anticorpo humano ou um anticorpo humanizado é preferível para reduzir a imunogenicidade.

Por exemplo, os animais transgênicos tendo um repertório de genes de anticorpos humanos podem ser imunizados com um antígeno selecionado a partir de um polipeptídeo, células que expressam o polipeptídeo, ou os seus lisados. As células produtoras de anticorpos são então coletadas dos animais e fundidas com as células de mieloma para obter o hibridoma, a partir do qual podem ser preparados os anticorpos humanos contra o polipeptídeo (ver WO92-03918, WO93-2227, W094-02602, WO94-25585, WO96-33735, e WO96-34096).

Alternativamente, uma célula imune, tal como um linfócito imunizado, produzindo anticorpos pode ser imortalizada por um oncogene e usada para preparar anticorpos monoclonais.

Os anticorpos monoclonais assim obtidos podem ser também preparados de modo recombinante usando técnicas de engenharia genética (ver, por exemplo, Borrebaeck e Larrick, Therapeutic Monoclonal Antibodies, publicado no Reino-Unido por MacMillan Publishers LTD (1990)). Por exemplo, um DNA codificando um anticorpo pode ser clonado a partir de uma célula imune, tal como um hibridoma ou um linfócito imunizado produzindo o anticorpo, inserido em um vetor apropriado, e introduzido nas células hospedeiras para preparar um anticorpo recombinante. A presente invenção também proporciona anticorpos recombinantes preparados como descrito acima.

Além disso, um anticorpo da presente invenção pode ser um fragmento de um anticorpo ou anticorpo modificado, desde que ele se ligue a um ou mais dos polipeptídeos da invenção. Por exemplo, o fragmento do anticorpo pode ser Fab, F(ab’)2, Fv, ou Fv de cadeia individual (scFv), em que os fragmentos Fv de cadeias H e L são ligados por um ligador apropriado (Huston e outros, Proc. Natl Acad Sei USA 85: 5879-83 (1988)). Mais especificamente, um fragmento do anticorpo pode ser gerado por tratamento de um anticorpo com uma enzima, tal como a papaína ou a pepsina. Alternativamente, um gene codificando o fragmento do anticorpo pode ser construído, inserido em um vetor de expressão, e expresso em uma célula hospedeira apropriada (ver, por exemplo, Co e outros, J Immunol 152: 2968-76 (1994); Better e Horwitz, Methods Enzymol 178: 476-96 (1989); Pluckthun e Skerra, Methods Enzymol 178: 497-515 (1989); Lamoyi, Methods Enzymol 121: 652-63 (1986); Rousseaux e outros, Methods Enzymol 121: 663-9

(1986); Bird e Walker, Trends Biotechnol 9: 132-7 (1991)).

Um anticorpo pode ser modificado por conjugação com uma variedade de moléculas, tais como o polietileno glicol (PEG). A presente invenção proporciona tais anticorpos modificados. O anticorpo modificado pode ser obtido modificando quimicamente um anticorpo. Estes métodos de modificação são convencionais no campo.

Altemativamente, um anticorpo da presente invenção pode ser obtido como um anticorpo quimérico, entre uma região variável derivada de anticorpo não-humano e a região constante derivada de anticorpo humano, ou como um anticorpo humanizado, compreendendo a região determinante de complementaridade (CDR) derivada de anticorpo não-humano, a região de estrutura (FR) derivada do anticorpo humano, e a região constante. Tais anticorpos podem ser preparados usando tecnologia conhecida.

Os anticorpos obtidos como acima descrito podem ser purificados até a homogeneidade. Por exemplo, a separação e a purificação do anticorpo podem ser efetuadas de acordo com os métodos de separação e purificação usados para as proteínas gerais. Por exemplo, o anticorpo pode ser separado e isolado pelo uso apropriadamente selecionado e combinado de cromatografias em colunas, tais como a cromatografia por afinidade, o filtro, a ultrafiltração, a saturação com sal, a diálise, a eletroforese em gel de poliacrilamida SDS, o foco isoelétrico, e outros (Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow e David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)), porém não estão limitados a estes. Uma coluna de proteína A e uma coluna de proteína G podem ser usadas como a coluna de afinidade. As colunas de proteína A ilustrativas a serem usadas incluem, por exemplo, Hyper D, POROS, e Safarose F.F. (Pharmacia).

A cromatografia ilustrativa, com a exceção da afinidade, inclui, por exemplo, a cromatografia de troca iônica, a cromatografia hidrofóbica, a filtração em gel, a cromatografia de fase reversa, a cromatografia de adsorção, e similares (Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak e outros, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996)). Os procedimentos cromatográficos podem ser realizados por cromatografia de fase líquida, tal como HPLC, e FPLC.

Por exemplo, a medição da absorbância, o ensaio imunológico por ligação com enzima (ELISA), o imunoensaio com enzima (EIA), o radioimunoensaio (RIA), e/ou a imunofluorescência podem ser usados para medir a atividade de ligação do anticorpo da invenção ao antígeno. No ELISA, o anticorpo da presente invenção é imobilizado sobre uma placa, um polipeptídeo da invenção é aplicado à placa, e então é aplicada uma amostra contendo um anticorpo desejado, tal como o sobrenadante da cultura de células produtoras de anticorpos ou os anticorpos purificados. Então, um anticorpo secundário que reconhece o anticorpo primário e está marcado com uma enzima, tal como a fosfatase alcalina, é aplicado, e a placa é incubada. A seguir, após a lavagem, o substrato de enzima, tal como o fosfato de pnitrofenila, é adicionado à placa, e a absorbância é medida para avaliar a atividade de ligação ao antígeno da amostra. Um fragmento do polipeptídeo, tal como um fragmento C-terminal ou N-terminal, pode ser usado como o antígeno para avaliar a atividade de ligação do anticorpo. O BIAcore (Pharmacia) pode ser usado para avaliar a atividade do anticorpo de acordo com a presente invenção.

Os métodos acima mencionados permitem a detecção ou a medição do polipeptídeo da invenção, por exposição do anticorpo da invenção a uma amostra assumida conter o polipeptídeo da invenção, e detecção ou medição do complexo imune formado pelo anticorpo e o polipeptídeo.

Porque o método de detecção ou medição do polipeptídeo de acordo com a invenção pode especificamente detectar ou medir um polipeptídeo, o método pode ser útil em uma variedade de experiências nas quais é usado o polipeptídeo.

A presente invenção também proporciona um polinucleotídeo que hibridiza com o polinucleotídeo codificando a proteína CXADRL1, GCUD1, ou RNF43 humana (SEQ ID NO: 1, 3, ou 5) ou a sua fita complementar, e que compreende pelo menos 15 nucleotídeos. O polinucleotídeo da presente invenção é preferivelmente um polinucleotídeo que especificamente hibridiza com o DNA codificando o polipeptídeo da presente invenção.

O termo especificamente hibridiza, como usado aqui, significa que a hibridização cruzada não ocorre significativamente com o DNA codificando outras proteínas, sob as condições usuais de hibridização, preferivelmente sob as condições rigorosas de hibridização. Tais polinucleotídeos incluem as sondas, os iniciadores, os nucleotídeos e os derivados de nucleotídeos (por exemplo, os oligonucleotídeos anti-sentido e as ribozimas), que especificamente hibridizam com o DNA codificando o polipeptídeo da invenção ou a sua fita complementar. Além disso, tal polinucleotídeo pode ser utilizado para a preparação de fragmento de DNA.

A presente invenção inclui um oligonucleotídeo anti-sentido que hibridiza com qualquer sítio dentro da seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1, 3, ou 5. Este oligonucleotídeo anti-sentido é preferivelmente contra pelo menos 15 nucleotídeos contínuos da seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1,3, ou 5. O oligonucleotídeo anti-sentido acima mencionado, o qual contém um códon de iniciação no pelo menos 15 nucleotídeos contínuos mencionado acima, é ainda mais preferido. Mais especificamente, tais oligonucleotídeos anti-sentido incluem aqueles compreendendo a seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 23 ou 25 para a supressão da expressão de CXADRL1; SEQ ID NO: 27, ou 29 para GCUD1; e SEQ ID NO: 31 para RNF43.

Os derivados ou os produtos modificados de oligonucleotídeos anti-sentido podem ser usados como oligonucleotídeos anti-sentido. Os exemplos de tais produtos modificados incluem as modificações de fosfonato de alquila inferior, tais como o tipo fosfonato de metila ou o tipo fosfonato de etila, as modificações de fosforotioato e as modificações de fosforoamidato.

O termo oligonucleotídeos anti-sentido, como usado aqui, significa não somente aqueles nos quais os nucleotídeos correspondendo àqueles que constituem uma região especificada de um DNA ou mRNA são inteiramente complementares, como também aqueles tendo uma combinação inadequada de um ou mais nucleotídeos, desde que o DNA ou o mRNA e o oligonucleotídeo anti-sentido possam especificamente hibridizar com a seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1, 3, ou 5.

Tais polinucleotídeos estão contidos como aqueles tendo, na região da seqüência de pelo menos 15 nucleotídeos contínuos, uma homologia de pelo menos 70% ou maior, preferivelmente a 80% ou maior, mais preferivelmente 90% ou maior, ainda mais preferivelmente 95% ou maior. O algoritmo estabelecido aqui pode ser usado para determinar a homologia. Tais polinucleotídeos são úteis como sondas para o isolamento ou a detecção de DNA codificando o polipeptídeo da invenção, conforme estabelecido em um exemplo posterior, ou como um primer usado para amplificações.

Os derivados de oligonucleotídeos anti-sentido da presente invenção atuam sobre as células que produzem o polipeptídeo da invenção por ligação ao DNA ou mRNA codificando o polipeptídeo, inibindo a sua transcrição ou tradução, promovendo a degradação do mRNA, e inibindo a expressão do polipeptídeo da invenção, desse modo resultando na inibição da função do polipeptídeo.

Um derivado de oligonucleotídeo anti-sentido da presente invenção pode ser feito em uma preparação externa, tal como um ungüento ou uma cataplasma, misturando com um material de base adequado que seja inativo contra os derivados.

Também, conforme necessitado, os derivados podem ser formulados em comprimidos, pós, grânulos, cápsulas, cápsulas de lipossomos, injeções, soluções, gotas nasais e agentes de liofilização por adição de excipientes, agentes isotônicos, solubilizadores, estabilizadores, conservantes, supressores da dor, e similares. Estes podem ser preparados seguindo os métodos usuais.

O derivado de oligonucleotídeo anti-sentido é dado ao paciente aplicando diretamente sobre o local doente ou injetando em um vaso sanguíneo de modo que ele atingirá o local da doença. Um meio de fixação do anti-sentido pode também ser usado para aumentar a durabilidade e a permeabilidade da membrana. Os exemplos são o lipossomo, a poli-L-lisina, o lipídio, o colesterol, a lipofectina ou os derivados destes.

A dosagem do derivado de oligonucleotídeo anti-sentido da presente invenção pode ser ajustada adequadamente de acordo com a condi ção do paciente e usada nas quantidades desejadas. Por exemplo, uma faixa de doses de 0,1 a 100 mg/kg, preferivelmente 0,1 a 50 mg/kg, pode ser administrada.

A presente invenção também inclui os RNAs de pequena interferência (siRNA) compreendendo uma combinação de um ácido nucléico de fita com sentido e um ácido nucléico de fita anti-sentido da seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1, 3, ou 5. Mais especificamente, tal siRNA para a supressão da expressão do RNF43 inclui aqueles cuja fita com sentido compreende a seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 40, 41, 42, ou 43. Alternativamente, o siRNA para a supressão da expressão do CXADRL1 inclui aqueles cuja fita com sentido compreende a seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 62, ou 63.

O termo siRNA refere-se à molécula de RNA de fita dupla que impede a tradução de um mRNA-alvo. As técnicas padrão são usadas para introduzir o siRNA nas células, incluindo aquelas em que o DNA é usado como o molde para transcrever o RNA. O siRNA compreende uma seqüência de ácidos nucléicos com sentido e uma seqüência de ácidos nucléicos anti-sentido do polinucleotídeo codificando a proteína CXADRL1, GCUD1, ou RNF43 humana (SEQ ID NO: 1, 3, ou 5). O siRNA é construído de modo tal que um único transcrito (RNA de fita dupla) tenha ambas as seqüências com sentido e anti-sentido complementares a partir do gene-alvo, por exemplo, um hairpin.

O método é usado para alterar a expressão do gene de uma célula, isto é, supra-regular a expressão de CXADRL1, GCUD1, ou RNF43, por exemplo, como um resultado da transformação maligna das células. A ligação do siRNA ao transcrito de CXADRL1, GCUD1, ou RNF43 na célulaalvo resulta em uma redução da produção de proteína pela célula. O comprimento do oligonucleotídeo é pelo menos 10 nucleotídeos e pode ser tão longo quanto o transcrito de ocorrência natural. De preferência, o oligonucleotídeo é 19-25 nucleotídeos de comprimento. Mais preferivelmente, o oligonucleotídeo é menos do que 75, 50, 25 nucleotídeos de comprimento. Os exemplos de oligonucleotídeos de siRNA oligonucleotídeos de CXADRL1,

GCUD1, ou RNF43, que inibem a expressão em células mamíferas, incluem os oligonucleotídeos contendo quaisquer de SEQ ID NO; 112-114. Estas seqüências são seqüência-alvo das seguintes seqüências de siRNA, respectivamente.

SEQ ID NO: 112, SEQ ID NOs: 40, 41 (RNF43);

SEQ ID NO: 113, SEQ ID NOs: 42, 43 (RNF43); e

SEQ ID NO: 114, SEQ ID NOs: 62, 63 (CXADRL1).

A seqüência de nucleotídeos de siRNAs pode ser projetada usando um programa de computador para projeto de siRNA, disponível a partir do local de rede da Ambion (http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html). As seqüências de nucleotídeos para o siRNA são selecionadas pelo programa de computador com base no seguinte protocolo:

Seleção dos Locais-Alvos de siRNA:

1. Começando com o códon de iniciação de AUG do transcrito visado, escanear a jusante para as seqüências de dinucleotídeo AA. Registrar a ocorrência de cada AA e dos 19 nucleotídeos adjacentes em 3' como locais-alvos potenciais de siRNA. Tuschl, e outros recomendaram contra projetar o siRNA para as regiões não traduzidas (UTRs) em 5' e 3' e as regiões próximas do códon de iniciação (dentro de 75 bases), visto que estas podem ser mais ricas em locais de ligação da proteína reguladora. As proteínas de ligação às UTRs e/ou os complexos de iniciação da tradução podem interferir com a ligação do complexo de siRNA endonuclease.

2. Comparar os locais-alvos potenciais com o banco de dados de genoma humano e eliminar de consideração quaisquer seqüências-alvo com homologia significativa com outras seqüências de codificação. A busca da homologia pode ser efetuada usando BLAST, que pode ser encontrado no servidor de NCBI em: www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/.

3. Selecionar as seqüências-alvo de qualificação para a síntese. No Ambion, preferivelmente diversas seqüências-alvo podem ser selecionadas ao longo do comprimento do gene para avaliação.

O oligonucleotídeo anti-sentido ou o siRNA da invenção inibe a expressão do polipeptídeo da invenção e é, portanto, útil para a supressão da atividade biológica do polipeptídeo da invenção. Também, os inibidores da expressão, compreendendo o oligonucleotídeo anti-sentido ou o siRNA da invenção, são úteis no ponto que eles podem inibir a atividade biológica do polipeptídeo da invenção. Portanto, uma composição compreendendo o oligonucleotídeo anti-sentido ou o siRNA da presente invenção é útil no tratamento de uma doença proliferativa de células, tal como o câncer.

Além disso, a presente invenção proporciona um método para diagnosticar uma doença proliferativa de células usando o nível de expressão dos polipeptídeos da presente invenção como um marcador diagnóstico.

Este método de diagnosticar compreende as etapas de: (a) detectar o nível de expressão do gene CXADRL1, GCUD1, ou RNF43 da presente invenção; e (b) relacionar uma elevação do nível de expressão com a doença proliferativa de células, tal como o câncer.

Os níveis de expressão do gene CXADRL1, GCUD1, ou RNF43 em um espécime particular podem ser estimados quantificando o mRNA correspondendo ao, ou a proteína codificada pelo, gene CXADRL1, GCUD1, ou RNF43. Os métodos de quantificação para o mRNA são conhecidos para aqueles versados na técnica. Por exemplo, os níveis de mRNAs correspondendo ao gene CXADRL1, GCUD1, ou RNF43 podem ser estimados por Northern blotting ou RT-PCR. Visto que as seqüências de nucleotídeos de tamanho natural dos genes CXADRL1, GCUD1, ou RNF43 são mostradas na SEQ ID NO: 1, 3, ou 5, qualquer um versado na técnica pode projetar as seqüências de nucleotídeos para sondas ou iniciadores para quantificar o gene CXADRL1, GCUD1, ou RNF43.

Também o nível de expressão do gene CXADRL1, GCUD1, ou RNF43 pode ser analisado com base na atividade ou na quantidade de proteína codificada pelo gene. Um método para determinar a quantidade da proteína CXADRL1, GCUD1, ou RNF43 é mostrado abaixo. Por exemplo, o método de imunoensaio é útil para a determinação das proteínas em materiais biológicos. Quaisquer materiais biológicos podem ser usados para a determinação da proteína ou de sua atividade. Por exemplo, a amostra de san gue é analisada para a estimativa da proteína codificada por um marcador de soro. Por outro lado, um método adequado pode ser selecionado para a determinação da atividade de uma proteína codificada pelo gene CXADRL1, GCUD1, ou RNF43 de acordo com a atividade de cada proteína a ser analisada.

Os níveis de expressão do gene CXADRL1, GCUD1, ou RNF43 em um espécime (amostra de teste) são estimados e comparados com aqueles em uma amostra normal. Quando uma tal comparação mostra que o nível de expressão do gene-alvo é maior do que aqueles na amostra normal, o paciente é considerado estar afetado com uma doença proliferativa de células. O nível de expressão do gene CXADRL1, GCUD1, ou RNF43 nos especimens da amostra normal e do paciente pode ser determinado ao mesmo tempo. Alternativamente, as faixas normais dos níveis de expressão podem ser determinadas por um método estatístico baseado nos resultados obtidos por análise do nível de expressão do gene nos espécimes anteriormente coletados de um grupo de controle. Um resultado obtido comparando a amostra de um paciente é comparado com a faixa normal; quando o resultado não incide na faixa normal, o paciente é considerado estar afetado com a doença proliferativa de células. Na presente invenção, a doença proliferativa de células a ser diagnosticada é preferivelmente o câncer. Mais preferivelmente, quando o nível de expressão do gene CXADRL1, ou GCUD1 for estimado e comparado com aqueles em uma amostra normal, a doença proliferativa de células a ser diagnosticada é o câncer gástrico, colorretal, ou do fígado; e quando o gene RNF43 for estimado por seu nível de expressão, então a doença a ser diagnosticada é o câncer colorretal, do pulmão, gástrico, ou do fígado.

Na presente invenção, um agente diagnóstico para diagnosticar a doença proliferativa de células, tal como o câncer, incluindo os cânceres gástricos, colorretais, do pulmão, e do fígado, é também proporcionado. O agente diagnóstico da presente invenção compreende um composto que se liga a um polinucleotídeo ou um polipeptídeo da presente invenção. De preferência, um oligonucleotídeo que hibridiza com o polinucleotídeo da pre sente invenção, ou um anticorpo que se liga ao polipeptídeo da presente invenção pode ser usado como um tal composto.

Além disso, a presente invenção proporciona um método de examinar quanto a um composto para o tratamento de uma doença proliferativa de células usando o polipeptídeo da presente invenção. Uma modalidade deste método de exame compreende as etapas de: (a) contatar um composto de teste com um polipeptídeo da presente invenção, (b) detectar a atividade de ligação entre o polipeptídeo da presente invenção e o composto de teste, e (c) selecionar um composto que se liga ao polipeptídeo da presente invenção.

O polipeptídeo da presente invenção a ser usado para o exame pode ser um polipeptídeo recombinante ou uma proteína derivada da natureza, ou um seu peptídeo parcial. Pode ser usado qualquer composto de teste, por exemplo, os extratos de células, o sobrenadante da cultura de células, os produtos da fermentação de microorganismo, os extratos de organismo marinho, os extratos de plantas, as proteínas purificadas ou brutas, os peptídeos, os compostos não-peptídicos, os compostos micromoleculares sintéticos e os compostos naturais. O polipeptídeo da presente invenção a ser contatado com um composto de teste pode ser, por exemplo, um polipeptídeo purificado, uma proteína solúvel, uma forma ligada a um veículo, ou uma proteína de fusão fundida com outros polipeptídeos.

Como um método de examinar quanto às proteínas, por exemplo, que se ligam ao polipeptídeo da presente invenção usando o polipeptídeo da presente invenção, podem ser usados muito métodos bastante conhecidos por uma pessoa versada na técnica. Um tal exame pode ser conduzido, por exemplo, pelo método de imunoprecipitação, especificamente, na seguinte maneira. O gene codificando o polipeptídeo da presente invenção é expresso em células de animais e assim por diante, inserindo o gene em um vetor de expressão para genes exógenos, tais como o pSV2neo, o pcDNA I, e o pCD8. O promotor a ser usado para a expressão pode ser qualquer promotor que possa ser usado comumente e inclui, por exemplo, o promotor inicial de SV40 (Rigby em Williamson (ed.), Genetic Engineering, vol. 3. Academic Press, London, 83-141 (1982)), o promotor de EF-1a (Kim e outros, Gene 91: 217-23 (1990)), o promotor de CAG (Niwa e outros, Gene 108: 193-200 (1991)), o promotor de LTR de RSV (Cullen, Methods in Enzymology 152: 684-704 (1987)), o promotor de SRa (Takebe e outros, Mol Cell Biol 8: 466 (1988)), o promotor inicial imediato de CMV (Seed e Aruffo, Proc Natl Acad Sei USA 84: 3365-9 (1987)), o promotor tardio de SV40 (Gheysen e Fiers, J Mol Appl Genet 1: 385-94 (1982)), o promotor tardio de Adenovírus (Kaufman e outros, Mol Cell Biol 9: 946 (1989)), o promotor de TK de HSV, e assim por diante. A introdução do gene nas células animais para expressar um gene exógeno pode ser efetuada de acordo com quaisquer métodos, por exemplo, o método de eletroporação (Chu e outros, Nucleic Acids Res 15: 1311-26 (1987)), o método com fosfato de cálcio (Chen e Okayama, Mol Cell Biol 7: 2745-52 (1987)), o método com DEAE dextrana (Lopata e outros, Nucleic Acids Res 12: 5707-17 (1984); Sussman e Milman, Mol Cell Biol 4: 1642-3 (1985)), o método com Lipofectina (Derijard, B Cell 7: 1025-37 (1994); Lamb e outros, Nature Genetics 5: 22-30 (1993): Rabindran e outros, Science 259: 230-4 (1993)), e assim por diante. O polipeptídeo da presente invenção pode ser expresso como uma proteína de fusão compreendendo um sítio de reconhecimento (epítopo) de um anticorpo monoclonal por introdução do epítopo do anticorpo monoclonal, cuja especificidade tenha sido revelada, na extremidade de N ou de C do polipeptídeo da presente invenção. Um sistema de epítopo-anticorpo comercialmente disponível pode ser usado (Experimental Medicine 13: 85-90 (1995)). Os vetores que podem expressar uma proteína de fusão com, por exemplo, a β-galactosidase, a proteína de ligação à maltose, a glutationa S-transferase, a proteína de fluorescência verde (GFP) e assim por diante, pelo uso de seus múltiplos sítios de clonagem, estão comercialmente disponíveis.

É também descrita uma proteína de fusão preparada por introdução de somente pequenos epítopos consistindo em diversos até uma dúzia de aminoácidos, de modo a não alterar a propriedade do polipeptídeo da presente invenção pela fusão. Os epítopos, tais como a poliistidina (marca de His), o agregado de influenza HA, o c-myc humano, o FLAG, a glicopro teína do vírus da estomatite vesicular (VSV-GP), a proteína do gene de T7 10 (marca de T7), a glicoproteína do vírus do herpes simples humano (marca de HSV), a marca E (um epítopo sobre o fago monoclonal), e similares, e os anticorpos monoclonais que os reconhecem podem ser usados como o sistema de epítopo-anticorpo para o exame de proteínas que se ligam ao polipeptídeo da presente invenção (Experimental Medicine 13: 85-90 (1995)).

Na imunoprecipitação, é formado um complexo imune por adição destes anticorpos ao lisado de células preparado usando um detergente apropriado. O complexo imune consiste no polipeptídeo da presente invenção, um polipeptídeo compreendendo a capacidade de ligação com o polipeptídeo, e um anticorpo. A imunoprecipitação também pode ser conduzida usando anticorpos contra o polipeptídeo da presente invenção, além de usar anticorpos contra os epítopos acima descritos, anticorpos estes que podem ser preparados como descrito acima.

Um complexo imune pode ser precipitado, por exemplo, pela Proteína A safarose ou Proteína G safarose quando o anticorpo for um anticorpo de IgG de camundongo. Se o polipeptídeo da presente invenção for preparado como uma proteína de fusão com um epítopo, tal como a GST, pode ser formado um complexo imune no mesmo modo que no uso do anticorpo contra o polipeptídeo da presente invenção, usando uma substância que especificamente se liga a estes epítopos, tal como a glutationa-Safarose 4B.

A imunoprecipitação pode ser efetuada seguindo ou de acordo com, por exemplo, os métodos na literatura (Harlow e Lane, Antibodies, 51152, Cold Spring Harbor Laboratory publications, Nova York (1988)).

O SDS-PAGE é comumente usado para a análise das proteínas imunoprecipitadas e a proteína ligada pode ser analisada pelo peso molecular da proteína usando géis com uma concentração apropriada. Visto que a proteína ligada ao polipeptídeo da presente invenção é difícil de detectar por um método de coloração comum, tal como a coloração de Coomassie ou a coloração de prata, a sensibilidade da detecção para a proteína pode ser aperfeiçoada cultivando as células em meio de cultura contendo isótopo radioativo, ³⁵S-metionina ou ³⁵S-cisteína, marcando as proteínas nas células, e detectando as proteínas. A proteína-alvo pode ser purificada diretamente do gel de SDS-poliacrilamida e a sua seqüência pode ser determinada, quando o peso molecular de uma proteína tiver sido revelado.

Como um método para examinar as proteínas que se ligam ao polipeptídeo da presente invenção usando o polipeptídeo, por exemplo, pode ser usada a análise por West-Western blotting (Skolnik e outros, Cell 65: 8390 (1991)). Especificamente, uma proteína que se liga ao polipeptídeo da presente invenção pode ser obtida preparando uma biblioteca de cDNA a partir de células, tecidos, órgãos (por exemplo, os tecidos tais como o testículo e o ovário para examinar as proteínas que se ligam ao CXADRL1; o testículo, o ovário, e o cérebro para examinar as proteínas que se ligam ao GCUD1; e o pulmão fetal e o rim fetal para aquelas que se ligam ao RNF43), ou células cultivadas, esperadas expressar uma proteína que se liga ao polipeptídeo da presente invenção usando um vetor de fago (por exemplo, ZAP), expressando a proteína sobre LB-agarose, fixando a proteína expressa sobre um filtro, reagindo o polipeptídeo purificado e marcado da presente invenção com o filtro acima mencionado, e detectando as placas que expressam as proteínas ligadas ao polipeptídeo da presente invenção de acordo com a marca. O polipeptídeo da invenção pode ser marcado utilizando a ligação entre a biotina e a avidina, ou utilizando um anticorpo que especificamente se liga ao polipeptídeo da presente invenção, ou um peptídeo ou polipeptídeo (por exemplo, a GST) que está fundido ao polipeptídeo da presente invenção. Os métodos usando radioisótopo ou fluorescência e similares podem ser também usados.

Alternativamente, em uma modalidade do método de exame da presente invenção, pode ser usado um sistema de dois híbridos utilizando células (“Sistema de Dois Híbridos MATCHMAKER”, “Kit de Ensaio de Dois Híbridos MATCHMAKER de Mamífero”, “Sistema de um Híbrido MATCHMAKER” (Clontech); “Sistema de Vetor de Dois Híbridos HybriZAP” (Stratagene); as referências “Dalton e Treisman, Cell 68: 597-612 (1992)”, “Fields and Sternglanz, Trends Genet 10: 286-92 (1994)”).

No sistema de dois híbridos, o polipeptídeo da invenção é fundido à região de ligação de SRF ou à região de ligação de GAL4 e expresso em células de levedura. Uma biblioteca de cDNA é preparada a partir das células esperadas expressarem uma proteína que se liga ao polipeptídeo da invenção, de modo tal que a biblioteca, quando expressa, seja fundida à região de ativação transcricional de VP16 ou GAL4. A biblioteca de cDNA é então introduzida nas células de levedura acima descritas e o cDNA derivado da biblioteca é isolado dos clones positivos detectados (quando uma proteína que se liga ao polipeptídeo da invenção for expressa em células de levedura, a ligação dos dois ativa um gene repórter, tornando detectáveis os clones positivos). Uma proteína codificada pelo cDNA pode ser preparada introduzindo o cDNA isolado acima na E. coli e expressando a proteína.

Como um gene repórter, por exemplo, o gene de Ade2, o gene de lacZ, o gene de CAT, o gene de luciferase e similares podem ser usados além do gene de HIS3.

Um composto que se liga ao polipeptídeo da presente invenção pode também ser examinado usando a cromatografia por afinidade. Por exemplo, o polipeptídeo da invenção pode ser imobilizado sobre um veículo de uma coluna de afinidade, e um composto de teste, contendo uma proteína capaz de ligar-se ao polipeptídeo da invenção, é aplicado à coluna. Um composto de teste aqui contido pode ser, por exemplo, os extratos de células, os Usados de células, etc.. Após a carga do composto de teste, a coluna é lavada, e os compostos ligados ao polipeptídeo da invenção podem ser preparados.

Quando o composto de teste for uma proteína, a seqüência de aminoácidos da proteína obtida é analisada, um oligo DNA é sintetizado com base na seqüência, e as bibliotecas de cDNA são examinadas usando o oligo DNA como uma sonda para obter um DNA codificando a proteína.

Um biossensor usando o fenômeno de ressonância de plasmônio de superfície pode ser usado como um meio para detectar ou quantificar o composto ligado na presente invenção. Quando um tal biossensor for usa do, a interação entre o polipeptídeo da invenção e um composto de teste pode ser observada em tempo real como um sinal de ressonância de plasmônio de superfície, usando somente uma quantidade mínima de polipeptídeo e sem marcação (por exemplo, BIAcore, Pharmacia). Portanto, é possível avaliar a ligação entre o polipeptídeo da invenção e um composto de teste usando um biossensor, tal como o BIAcore.

Os métodos de examinar as moléculas que se ligam quando o polipeptídeo imobilizado da presente invenção for exposto aos compostos químicos sintéticos, ou aos bancos de substâncias naturais, ou a uma biblioteca de exposição aleatória de peptídeos de fagos, e os métodos de examinar usando alta produção com base em técnicas químicas combinatórias (Wrighton e outros, Science 273: 458-64 (1996); Verdine, Nature 384: 11-13 (1996); Hogan, Nature 384: 17-9 (1996)) para isolar não somente as proteínas, como também os compostos químicos que se ligam à proteína da presente invenção (incluindo o agonista e o antagonista), são bastante conhecidos para alguém versado na técnica.

Altemativamente, o método de exame da presente invenção pode compreender as seguintes etapas:

a) contatar um composto candidato com uma célula na qual tenha sido introduzido um vetor compreendendo a região reguladora transcricional de um ou mais genes marcadores e um gene repórter que é expresso sob o controle da região reguladora transcricional, em que o um ou mais genes marcadores são selecionados a partir do grupo consistindo em CXADRL1, GCUD1, e RNF43,

b) medir a atividade do dito gene repórter; e

c) selecionar um composto que reduz o nível de expressão do dito gene repórter em comparação com um controle.

Os genes relatores e as células hospedeiras adequados são bastante conhecidos na técnica. O constructo relator requerido para o exame pode ser preparado utilizando a região reguladora transcricional de um gene marcador. Quando a região reguladora transcricional de um gene marcador tiver sido conhecida para aqueles versados na técnica, um constructo relator pode ser preparado usando a informação de seqüência prévia. Quando a região reguladora transcricional de um gene marcador permanecer nãoidentificada, um segmento de nucleotídeo contendo a região reguladora transcricional pode ser isolado de uma biblioteca de genoma com base na informação da seqüência de nucleotídeos do gene marcador.

Um composto isolado pelo exame é um candidato para drogas que promovem ou inibem a atividade do polipeptídeo da presente invenção, para o tratamento ou a prevenção de doenças atribuídas às, por exemplo, doenças proliferativas de células, tais como o câncer. Um composto, no qual uma parte da estrutura do composto obtido pelo presente método de examinar tendo a atividade de ligação ao polipeptídeo da presente invenção é convertida por adição, remoção e/ou substituição, está incluído nos compostos obtidos pelo método de exame da presente invenção.

Em uma modalidade adicional, a presente invenção proporciona métodos para examinar agentes candidatos que sejam alvos potenciais no tratamento de doença proliferativa de células. Conforme discutido em detalhe acima, pelo controle dos níveis de expressão do CXADRL1, do GCUDI, ou do RNF43, pode-se controlar o início e o progresso do câncer gástrico, ou do câncer colorretal, do pulmão, gástrico, ou do fígado. Assim, os agentes candidatos, os quais são alvos potenciais no tratamento de doença proliferativa de células, podem ser identificados através de exames que utilizam os níveis de expressão e as atividades de CXADRL1, GCUDI, ou RNF43 como índices. No contexto da presente invenção, tal exame pode compreender, por exemplo, as seguintes etapas:

a) contatar um composto candidato com uma célula expressando o CXADRL1, o GCUDI, ou o RNF43; e

b) selecionar um composto que reduz o nível de expressão de CXADRL1, GCUDI, ou RNF43 em comparação com o nível de expressão detectado na ausência do composto de teste.

As células que expressam pelo menos um de CXADRL1, GCUDl, ou RNF43 incluem, por exemplo, as linhagens de células de cânceres gástricos, colorretais, do pulmão, ou do fígado; tais células podem ser usa57

das para o exame acima descrito da presente invenção. O nível de expressão pode ser estimado por métodos bastante conhecidos para alguém versado na técnica. No método de examinar, um composto que reduz o nível de expressão de pelo menos um de CXADRL1, GCIIDI, ou RNF43 pode ser selecionado como agentes candidatos.

Em uma outra modalidade do método para examinar um composto para o tratamento de uma doença proliferativa de células da presente invenção, o método utiliza a atividade biológica do polipeptídeo da presente invenção como um índice. Visto que as proteínas CXADRL1, GCIIDI, e RNF43 da presente invenção têm a atividade de promover a proliferação das células, um composto que promove ou inibe esta atividade de uma destas proteínas da presente invenção pode ser examinado usando esta atividade como um índice. Este método de exame inclui as etapas de: (a) contatar um composto de teste com o polipeptídeo da presente invenção; (b) detectar a atividade biológica do polipeptídeo da etapa (a); e (c) selecionar um composto que suprime a atividade biológica do polipeptídeo em comparação com a atividade biológica detectada na ausência do composto de teste.

Quaisquer polipeptídeos podem ser usados para o exame, desde que eles compreendam a atividade biológica da proteína CXADRL1, GCUDI, ou RNF43. Tal atividade biológica inclui a atividade de proliferação das células da proteína CXADRL1, GCIIDI, ou RNF43 humana, a atividade do RNF43 de ligar-se à NOTCH2 ou à STRIN. Por exemplo, uma proteína CXADRL1, GCUDI, ou RNF43 humana pode ser usada e os polipeptídeos funcionalmente equivalentes a estas proteínas podem também ser usados. Tais polipeptídeos podem ser expressos de forma endógena ou exógena pelas células.

Quaisquer compostos de teste, por exemplo, os extratos de células, o sobrenadante da cultura de células, os produtos da fermentação de microorganismo, os extratos de organismo marinho, os extratos de plantas, as proteínas purificadas ou brutas, os peptideos, os compostos nãopeptídicos, os compostos micromoleculares sintéticos, os compostos naturais, podem ser usados.

O composto isolado por este exame é um candidato para agonistas ou antagonistas do polipeptídeo da presente invenção. O termo agonista refere-se às moléculas que ativam a função do polipeptídeo da presente invenção por ligação ao mesmo. Igualmente, o termo antagonista refere-se às moléculas que inibem a função do polipeptídeo da presente invenção por ligação ao mesmo. Além disso, um composto isolado por este exame é um candidato para compostos que inibem a interação in vivo do polipeptídeo da presente invenção com as moléculas (incluindo os DNAs e as proteínas).

Quando a atividade biológica a ser detectada no presente método for a proliferação das células, ela pode ser detectada, por exemplo, preparando as células que expressam o polipeptídeo da presente invenção, cultivando as células na presença de um composto de teste, e determinando a velocidade da proliferação das células, medindo o ciclo da célula e similar, bem como medindo a atividade de formação de colônia, como descrito nos Exemplos.

O composto isolado pelos exames acima mencionados é um candidato para as drogas que inibem a atividade do polipeptídeo da presente invenção e pode ser aplicado ao tratamento de doenças associadas com o polipeptídeo da presente invenção, por exemplo, as doenças proliferativas de células, incluindo o câncer. Mais particularmente, quando a atividade biológica da proteína CXADRL1 ou GCUD1 for usada como o índice, os compostos examinados pelo presente método servem como um candidato para drogas para o tratamento de câncer gástrico, colorretal, ou do fígado. Por outro lado, quando a atividade biológica da proteína RNF43 for usada como o índice, os compostos examinados pelo presente método servem como um candidato para drogas para o tratamento de câncer colorretal, do pulmão, gástrico, ou do fígado.

Além disso, o composto no qual uma parte da estrutura do composto que inibe a atividade da proteína CXADRL1, GCUDI, ou RNF43 é convertida por adição, remoção e/ou substituição, está também incluído nos compostos obteníveis pelo método de exame da presente invenção.

Em uma modalidade adicional do método para examinar um composto para o tratamento de uma doença proliferativa de células da presente invenção, o método utiliza a capacidade de ligação do RNF43 à NOTCH2 ou à STRIN. A proteína RNF43 da presente invenção foi revelada associar-se com a NOTCH2 ou a STRIN. Estas verificações sugerem que a proteína RNF43 da presente invenção exerce a função de proliferação das células através sua ligação às moléculas, tais como a NOTCH2 e a STRIN. Assim, é esperado que a inibição da ligação entre a proteína RNF43 e a NOTCH2 ou a STRIN resulte na supressão da proliferação das células, e os compostos que inibem a ligação servem como substâncias farmacêuticas para o tratamento de doença proliferativa de células, tal como o câncer. De preferência, a doença proliferativa da célula tratada pelo composto examinado pelo presente método é o câncer colorretal, do pulmão, gástrico, ou do fígado.

Este método de exame inclui as etapas de: (a) contatar um polipeptídeo da presente invenção com a NOTCH2 ou a STRIN na presença de um composto de teste; (b) detectar a ligação entre o polipeptídeo e a NOTCH2 ou a STRIN; e (c) selecionar o composto que inibe a ligação entre o polipeptídeo e a NOTCH2 ou a STRIN.

O polipeptídeo RNF43 da presente invenção, e a NOTCH2 ou a STRIN a serem usados para o exame podem ser um polipeptídeo recombinante ou uma proteína derivada da natureza, ou podem também ser um seu peptídeo parcial, desde que ele conserve a capacidade de ligação um ao outro. O polipeptídeo RNF43, a NOTCH2 ou a STRIN a serem usados no exame podem ser, por exemplo, um polipeptídeo purificado, uma proteína solúvel, uma forma ligada a um veículo, ou uma proteína de fusão fundida com outros polipeptídeos.

Pode ser usado qualquer composto de teste, por exemplo, os extratos de células, o sobrenadante da cultura de células, os produtos da fermentação de microorganismo, os extratos de organismo marinho, os extratos de plantas, as proteínas purificadas ou brutas, os peptideos, os compostos não-peptídicos, os compostos micromoleculares sintéticos e os com60 postos naturais.

Como um método de examinar quanto a compostos que inibem a ligação entre a proteína RNF43 e a NOTCH2 ou a STRIN, podem ser usados muitos métodos bastante conhecidos por alguém versado na técnica. Um tal exame pode ser realizado como um sistema de ensaio in vitro, por exemplo, em um sistema celular. Mais especificamente, primeiro, o polipeptídeo RNF43 ou a NOTCH2 ou a STRIN é ligada a um suporte, e a outra proteína é adicionada conjuntamente com uma amostra de teste para a mesma. A seguir, a mistura é incubada, lavada, e a outra proteína ligada ao suporte é detectada e/ou medida.

No mesmo modo, um composto que interfere com a associação de CXADRL1 e AIP1 pode ser isolado pela presente invenção. É esperado que a inibição da ligação entre CXADRL1 e AIP1 resulte na supressão da proliferação das células, e os compostos que inibem a ligação servem como substâncias farmacêuticas para o tratamento de doença proliferativa de células, tal como o câncer.

Os exemplos de suportes que podem ser usados para a ligação das proteínas incluem os polissacarídeos insolúveis, tais como a agarose, a celulose, e o dextrano; e as resinas sintéticas, tais como a poliacrilamida, o poliestireno, e o silício; preferivelmente os glóbulos e as placas comerciais disponíveis (por exemplo, as placas com múltiplas cavidades, o chip de biossensor, etc.) preparados a partir dos materiais acima descritos podem ser usados. Quando usando os glóbulos, eles podem ser cheios em uma coluna.

A ligação de uma proteína a um suporte pode ser conduzida de acordo com métodos de rotina, tais como a ligação química, e a adsorção física. Alternativamente, uma proteína pode ser ligada a um suporte através de anticorpos que especificamente reconhecem a proteína. Além disso, a ligação de uma proteína a um suporte pode ser também conduzida por meio da ligação da avidina e a biotina.

A ligação entre as proteínas é efetuada em tampão, por exemplo, porém não estão limitados ao, tampão de fosfato e tampão de Tris, desde que o tamanho não iniba a ligação entre as proteínas.

Na presente invenção, um biossensor usando o fenômeno da ressonância de plasmônio de superfície pode ser usado para detectar ou quantificar a proteína ligada. Quando um tal biossensor for usado, a interação entre a proteína pode ser observada em tempo real como um sinal de ressonância de plasmônio de superfície, usando somente uma quantidade mínima de polipeptídeo e sem marcação (por exemplo, BIAcore, Pharmacia). Portanto, é possível avaliar a ligação entre o polipeptídeo RNF43 e a NOTCH2 ou a STRIN usando um biossensor, tal como o BIAcore.

Alternativamente, o polipeptídeo RNF43, ou a NOTCH2 ou a STRIN, pode ser marcado, e a marca da proteína ligada pode ser usada para detectar ou medir a proteína ligada. Especificamente, após pré-marcar uma das proteínas, a proteína marcada é contatada com a outra proteína na presença de um composto de teste, e então, as proteínas ligadas são detectadas ou medidas de acordo com a marca, após a lavagem.

As substâncias marcadoras , tais como o radioisótopo (por exemplo, ³H, ¹⁴C, ³²P, ³³P, ³⁵S, ¹²⁵l, ¹³¹l), as enzimas (por exemplo, a fosfatase alcalina, a peroxidase de rábano silvestre, a β-galactosidase, a βglicosidase), as substâncias fluorescentes (por exemplo, o isotiocianato de fluoresceína (FITC), a rodamina), e biotina/avidina, podem ser usadas para a marcação de uma proteína no presente método. Quando a proteína for marcada com radioisótopo, a detecção ou a medição pode ser realizada por cintilação líquida. Altemativamente, as proteínas marcadas com enzimas podem ser detectadas ou medidas por adição de um substrato da enzima para detectar a mudança enzimática do substrato, tal como a geração de cor, com o medidor de absorção. Além disso, no caso onde uma substância fluorescente for usada como a marca, a proteína ligada pode ser detectada ou medida usando fluorofotômetro.

Além disso, a ligação do polipeptídeo RNF43 e a NOTCH2 ou a STRIN pode ser também detectada ou medida usando anticorpos para o polipeptídeo RNF43 e a NOTCH2 ou a STRIN. Por exemplo, após contatar o polipeptídeo RNF43 imobilizado sobre um suporte com um composto de teste e a NOTCH2 ou a STRIN, a mistura é incubada e lavada, e a detecção ou a medição pode ser conduzida usando um anticorpo contra a NOTCH2 ou a STRIN. Alternativamente, a NOTCH2 ou a STRIN pode ser imobilizada sobre um suporte, e um anticorpo contra RNF43 pode ser usado como o anticorpo.

No caso de utilizar um anticorpo no presente exame, o anticorpo é preferivelmente marcado com uma das substâncias de marcação mencionadas acima, e detectado ou medido com base na substância de marcação. Alternativamente, o anticorpo contra o polipeptídeo RNF43, a NOTCH2, ou a STRIN pode ser usado como um anticorpo primário a ser detectado com um anticorpo secundário que é marcado com uma substância de marcação. Além disso, o anticorpo ligado à proteína no exame da presente invenção pode ser detectado ou medido usando a coluna de proteína G ou proteína A.

Alternativamente, em uma outra modalidade do método de exame da presente invenção, pode ser usado um sistema de dois híbridos utilizando células (“Sistema de Dois Híbridos MATCHMAKER”, “Kit de Ensaio de Dois Híbridos MATCHMAKER de Mamífero”, “Sistema de um Híbrido MATCHMAKER” (Clontech); “Sistema de Vetor de Dois Híbridos HybriZAP” (Stratagene); as referências “Dalton e Treisman, Cell 68: 597-612 (1992)”, “Fields and Sternglanz, Trends Genet 10: 286-92 (1994)”).

No sistema de dois híbridos, o polipeptídeo RNF43 da invenção é fundido à região de ligação de SRF ou à região de ligação de GAL4 e expresso em células de levedura. A NOTCH2 ou a STRIN que se liga ao polipeptídeo RNF43 da invenção é fundida à região de ativação transcricional de VP16 ou GAL4 e também expressa nas células de levedura na existência de um composto de teste. Quando o composto de teste não inibir a ligação entre o polipeptídeo RNF43 e a NOTCH2 ou a STRIN, a ligação dos dois ativa um gene repórter, tornado detectáveis os clones positivos.

O composto isolado pelo exame é um candidato para drogas que inibem a atividade da proteína RNF43 da presente invenção e podem ser aplicadas ao tratamento de doenças associadas com a proteína RNF43, por exemplo, as doenças proliferativas de células, tais como o câncer, mais particularmente o câncer colorretal, do pulmão, gástrico, ou do fígado. Além disso, os compostos, nos quais uma parte da estrutura do composto que inibe a ligação entre a proteína RNF43 e a NOTCH2 ou a STRIN é convertida por adição, remoção, substituição e/ou inserção, estão também incluídos nos compostos obteníveis pelo método de exame da presente invenção.

Quando administrando o composto isolado pelos métodos da invenção como uma substância farmacêutica para seres humanos e outros mamíferos, tais como os camundongos, os ratos, os porquinhos-da-índia, os coelhos, as galinhas, os gatos, os cães, as ovelhas, os porcos, o gado, os macacos, os babuínos, os chimpanzés, para o tratamento de uma doença proliferativa de células (por exemplo, o câncer), o composto isolado pode ser diretamente administrado ou pode ser formulado em uma forma de dosagem usando métodos de preparação farmacêutica conhecidos. Por exemplo, de acordo com a necessidade, as drogas podem ser tomadas oralmente, como comprimidos revestidos com açúcares, cápsulas, elixires e microcápsulas, ou não-oralmente, na forma de injeções de soluções ou suspensões estéreis com a água ou qualquer outro líquido farmaceuticamente aceitável. Por exemplo, os compostos podem ser misturados com veículos ou meios farmacologicamente aceitáveis, especificamente, a água esterilizada, a solução salina fisiológica, o óleo de planta, os emulsificantes, os agentes de suspensão, os tensoativos, os estabilizadores, os agentes aromatizantes, os excipientes, os veículos, os conservantes, os ligantes e similares, em uma forma de dose de unidade requerida para a implementação geralmente aceita de droga. A quantidade de ingredientes ativos nestas preparações torna obtenível uma dosagem adequada dentro da faixa indicada.

Os exemplos de aditivos que podem ser misturados aos comprimidos e às cápsulas são os ligantes, tais como a gelatina, o amido de milho, a goma tragacanto e a goma-arábica; os excipientes, tais como a celulose cristalina; os agentes de intumescimento, tais como o amido de milho, a gelatina e o ácido algínico; os lubrificantes, tais como o estearato de magné sio; os adoçantes, tais como a sacarose, a lactose ou a sacarina; os agentes aromatizantes, tais como a hortelã-pimenta, o óleo de adenotrix de gaultéria e a cereja. Quando a forma de dosagem de unidade for uma cápsula, um veículo líquido, tal como o óleo, pode também ser adicionalmente incluído nos ingredientes acima descritos. Os compósitos estéreis para injeções podem ser formulados seguindo as implementações normais de drogas usando veículos, tais como a água destilada usada para injeções.

A solução salina fisiológica, a glicose, e outros líquidos isotônicos incluindo os adjuvantes, tais como o D-sorbitol, a D-manose, o Dmanitol, e o cloreto de sódio, podem ser usados como soluções aquosas para injeções. Estes podem ser usados em conjunção com solubilizantes adequados, tais como o álcool, especificamente o etanol, os poliálcoois, tais como o propileno glicol e o polietileno glicol, os tensoativos não-iônicos, tais como o Polissorbato 80 (R) e o HCQ-50.

O óleo de gergelim ou o óleo de soja pode ser usado como um líquido oleaginoso e pode ser usado em conjunção com o benzoato de benzila ou o álcool benzílico como um solubilizante e pode ser formulado com um tampão, tal como o tampão de fosfato e o tampão de acetato de sódio; um supressor da dor, tal como o cloridrato de procaína; um estabilizador, tal como o álcool benzílico, o fenol; e um antioxidante. A injeção preparada pode ser enchida para uma ampola adequada.

Podem ser usados métodos bastante conhecidos para alguém versado na técnica para administrar o composto farmacêutico inventivo aos pacientes, por exemplo como injeções intra-arteriais, intravenosas, percutâneas e também como administrações intranasais, trans-bronquiais, intramusculares ou orais. A dosagem e o método de administração variam de acordo com o peso do corpo e a idade de um paciente e o método de administração; entretanto, alguém versado na técnica pode rotineiramente selecioná-los. Se o dito composto for codificável por um DNA, o DNA pode ser inserido em um vetor para a terapia do gene e o vetor administrado efetuar a terapia. A dosagem e o método de administração variam de acordo com o peso do corpo, a idade, e os sintomas de um paciente, porém alguém versa65 do na técnica pode selecioná-los adequadamente.

Por exemplo, embora existam algumas diferenças de acordo com os sintomas, a dose de um composto que se liga com o polipeptídeo da presente invenção e regula a sua atividade é aproximadamente 0,1 mg a cerca de 100 mg por dia, preferivelmente cerca de 1,0 mg a cerca de 50 mg por dia e mais preferivelmente cerca de 1,0 mg a cerca de 20 mg por dia, quando administrada oralmente a um adulto normal (peso de 60 kg).

Quando administrando parenteralmente, na forma de uma injeção a um adulto normal (peso de 60 kg), embora existam algumas diferenças de acordo com o paciente, o órgão-alvo, os sintomas e o método de administração, é conveniente injetar de modo intravenoso uma dose de aproximadamente 0,01 mg a cerca de 30 mg por dia, preferivelmente cerca de 0,1 a cerca de 20 mg por dia e mais preferivelmente cerca de 0,1 a cerca de 10 mg por dia. Também, no caso de outros animais, é possível administrar uma quantidade convertida para 60 kg de peso do corpo.

Além disso, a presente invenção proporciona um método para tratar ou prevenir uma doença proliferativa de células, tal como o câncer, usando um anticorpo contra o polipeptídeo da presente invenção. De acordo com o método, é administrada uma quantidade farmaceuticamente eficaz de um anticorpo contra o polipeptídeo da presente invenção. Visto que a expressão das proteínas CXADRL1, GCUD1, e RNF43 é supra-regulada nas células de câncer, e a supressão da expressão destas proteínas resulta na diminuição na atividade de proliferação das células, é esperado que as doenças proliferativas de células possam ser tratadas ou prevenidas por ligação do anticorpo e estas proteínas. Assim, um anticorpo contra o polipeptídeo da presente invenção é administrado em uma dosagem suficiente para reduzir a atividade da proteína da presente invenção, que está na faixa de 0,1 a cerca de 250 mg/kg por dia. A faixa de doses para os seres humanos adultos é geralmente de cerca de 5 mg a cerca de 17,5 g/dia, preferivelmente cerca de 5 mg a cerca de 10 g/dia, e mais preferivelmente cerca de 100 mg a cerca de 3 g/dia.

Altemativamente, um anticorpo que se liga a um marcador da superfície da célula, específico para as células de tumor, pode ser usado como uma ferramenta para a distribuição da droga. Por exemplo, o anticorpo conjugado com um agente citotóxico é administrado em uma dosagem suficiente para ferir as células de tumor.

A presente invenção também se relaciona a um método de induzir a imunidade antitumor, compreendendo a etapa de administrar a proteína CXADRL1, GCUD1, ou RNF43 ou um fragmento imunologicamente ativo da mesma, ou um polinucleotídeo codificando a proteína ou os seus fragmentos. A proteína CXADRL1, GCUD1, ou RNF43 ou os fragmentos imunologicamente ativos da mesma são úteis como vacinas contra as doenças proliferativas de células. Em alguns casos, as proteínas ou os fragmentos destas podem ser administrados em uma forma ligada ao receptor de células T (TCR) ou apresentados por uma célula apresentadora de antígenos (APC), tal como o macrófago, a célula dendrítica (DC), ou as células B. Devido à forte capacidade da DC de apresentar antígenos, o uso da DC é mais preferível entre as APCs.

Na presente invenção, a vacina contra a doença proliferativa de células refere-se a uma substância que tem a função de induzir a imunidade antitumor com a inoculação nos animais. De acordo com a presente invenção, os polipeptídeos compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 80, 97, ou 108 foram sugeridos serem peptídeos de epítopos restritos ao HLA-A24 ou ao HLA-A*0201 que podem induzir uma resposta imune potente e específica contra as células de câncer colorretal, do pulmão, gástrico, ou do fígado que expressam o RNF43. De acordo com a presente invenção, os polipeptídeos compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 124 foram sugeridos serem peptídeos de epítopos restritos ao HLAA*0201 que podem induzir uma resposta imune potente e específica contra as células de câncer colorretal, gástrica, ou do fígado que expressam o CXADRL1. De acordo com a presente invenção, os polipeptídeos compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 164 foram sugeridos serem peptídeos de epítopos restritos ao HLA-A*0201 que podem induzir uma resposta imune potente e específica contra as células de câncer color retal, gástrica, ou do fígado que expressam o GCUD1. Assim, a presente invenção também inclui o método de induzir a imunidade antitumor usando polipeptídeos compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 80, 97, 108, 124 ou 164. Em geral, a imunidade antitumor inclui as respostas imunes, tal como se segue:

- indução de linfócitos citotóxicos contra os tumores,

- indução de anticorpos que reconhecem os tumores, e

- indução da produção de citocina antitumor.

Portanto, quando uma certa proteína induz qualquer uma destas respostas imunes com a inoculação em um animal, a proteína é decidida ter efeito indutor da imunidade antitumor. A indução da imunidade antitumor por uma proteína pode ser detectada observando in vivo ou in vitro a resposta do sistema imune no hospedeiro contra a proteína.

Por exemplo, um método para detectar a indução de linfócitos T citotóxicos é bastante conhecido. Uma substância estranha que entra no corpo vivo é apresentada às células T e às células B pela ação das células apresentadoras de antígenos (APCs). As células T que respondem ao antígeno apresentado pela APC em um modo específico para o antígeno diferenciam-se em células T citotóxicas (ou linfócitos T citotóxicos; CTLs) devido ao estímulo pelo antígeno, e então se proliferam (isto é referido como ativação das células T). Portanto, a indução dos CTLs por um certo peptídeo pode ser avaliada apresentando o peptídeo à célula T pela APC, e detectando a indução do CTL. Além disso, a APC tem o efeito de ativar as células T CD4+, as células T CD8+, os macrófagos, os eosinófilos, e as células NK. Visto que as células T CD4+ e as células T CD8+ são também importantes na imunidade antitumor, a ação indutora da imunidade antitumor do peptídeo pode ser avaliada usando o efeito de ativação destas células como indicadores.

Um método para avaliar a ação indutora do CTL usando as células dendrítica (DCs) como APC é bastante conhecido na técnica. A DC é uma APC representativa tendo a ação indutora de CTL mais forte entre as APCs. Neste método, o polipeptídeo de teste é inicialmente contatado com a

DC, e então esta DC é contatada com as células T. A detecção das células T tendo efeitos citotóxicos contra as células de interesse, após o contato com a DC, mostra que o polipeptídeo de teste tem uma atividade de induzir as células T citotóxicas. A atividade do CTL contra os tumores pode ser detectada, por exemplo, usando a lise de células de tumor marcadas com ⁵¹Cr como o indicador. Alternativamente, o método de avaliar o grau de dano à célula de tumor usando a atividade de captação da ³H-timidina ou a liberação de LDH (lactose desidrogenase) como o indicador é também bastante conhecido.

Separadamente da DC, as células mononucleares sanguíneas periféricas (PBMCs) também podem ser usadas como a APC. A indução do CTL é descrita que ela pode ser aumentada cultivando a PBMC na presença de GM-CSF e IL-4. Similarmente, o CTL tem sido mostrado ser induzido por cultivo da PBMC na presença de hemocianina de lapa de buraco da fechadura (KLH) e IL-7.

Os polipeptídeos de teste que confirmaram possuir atividade indutora do CTL por estes métodos são polipeptídeos que têm efeito de ativação da DC e atividade indutora do CTL subseqüente. Portanto, os polipeptídeos que induzem o CTL contra as células de tumor são úteis como vacinas contra tumores. Além disso, as APCs que adquiriram a capacidade de induzir o CTL contra os tumores por contato com os polipeptídeos são úteis como vacinas contra os tumores. Ademais, os CTLs que adquiriram citotoxicidade devido à apresentação dos antígenos do polipeptídeo pela APC podem ser também usados como vacinas contra os tumores. Tais métodos terapêuticos para tumores usando a imunidade antitumor devido à APC e ao CTL são referidos como imunoterapia celular.

Geralmente, quando usando um polipeptídeo para a imunoterapia celular, a eficiência da indução do CTL é sabida aumentar combinandose uma pluralidade de polipeptídeos tendo diferentes estruturas e contatando-os com a DC. Portanto, quando estimulando a DC com os fragmentos de proteínas, é vantajoso usar uma mistura de múltiplos tipos de fragmentos.

Alternativamente, a indução da imunidade antitumor por um poli peptídeo pode ser confirmada observando a indução da produção de anticorpo contra os tumores. Por exemplo, quando os anticorpos contra um polipeptídeo forem induzidos em um animal de laboratório imunizado com o polipeptídeo, e quando o crescimento das células de tumor for suprimido por estes anticorpos, o polipeptídeo pode ser determinado ter uma capacidade de induzir a imunidade antitumor.

A imunidade antitumor é induzida por administração da vacina desta invenção, e a indução da imunidade antitumor capacita o tratamento e a prevenção de doenças proliferativas de células, tais como os cânceres gástricos, colorretais, do pulmão, e do fígado. A terapia contra o câncer ou a prevenção do início do câncer inclui quaisquer das etapas, tais como a inibição do crescimento das células cancerosas, a involução do câncer, e a supressão da ocorrência de câncer. A diminuição na mortalidade dos indivíduos tendo câncer, a diminuição dos marcadores de tumor no sangue, o alívio dos sintomas detectáveis que acompanham o câncer, e similares, estão também incluídos na terapia ou na prevenção do câncer. Tais efeitos terapêuticos e preventivos são, de preferência, estatisticamente significativos. Por exemplo, na observação, em um nível de significado de 5% ou menos, em que o efeito terapêutico ou preventivo de uma vacina contra as doenças proliferativas de células é comparado a um controle sem a administração da vacina. Por exemplo, o teste t de Student, o teste U de Mann-Whitney, ou o ANOVA podem ser usados para as análises estatísticas.

A proteína acima mencionada tendo atividade imunológica ou um vetor codificando a proteína pode ser combinado com um adjuvante. Um adjuvante refere-se a um composto que aumenta a resposta imune contra a proteína quando administrado junto (ou sucessivamente) com a proteína tendo atividade imunológica. Os exemplos de adjuvantes incluem a toxina da cólera, a toxina de salmonela, o alume, e similares, porém não estão limitados a estes. Além disso, a vacina desta invenção pode ser combinada apropriadamente com um veículo farmaceuticamente aceitável. Os exemplos de tais veículos são a água esterilizada, a solução salina fisiológica, o tampão de fosfato, o fluido de cultura, e similares. Ademais, a vacina pode conter, conforme necessário, estabilizadores, suspensões, conservantes, tensoativos, e similares. A vacina é administrada de modo sistêmico ou local. A administração da vacina pode ser efetuada por uma única administração, ou reforçada por múltiplas administrações.

Quando usando a APC ou o CTL como a vacina desta invenção, os tumores podem ser tratados ou prevenidos, por exemplo, pelo método ex vivo. Mais especificamente, as PBMCs do paciente que recebe o tratamento ou a prevenção são coletadas, as células são contatadas com o polipeptídeo ex vivo, e seguindo a indução da APC ou do CTL, as células podem ser administradas ao paciente. A APC pode ser também induzida introduzindo um vetor que codifica o polipeptídeo nas PBMCs ex vivo. A APC ou o CTL induzido in vitro pode ser clonado antes da administração. Pela clonagem e crescimento das células tendo alta atividade de danificar as células-alvo, a imunoterapia celular pode ser efetuada mais efetivamente. Além disso, a APC e o CTL isolados nesta maneira podem ser usados para a imunoterapia celular não somente contra indivíduos a partir dos quais as células são derivadas, como também contra tipos similares de tumores de outros indivíduos.

Adicionalmente, é proporcionada uma composição farmacêutica para o tratamento ou a prevenção de uma doença proliferativa de células, tal como o câncer, compreendendo uma quantidade farmaceuticamente eficaz do polipeptídeo da presente invenção. A composição farmacêutica pode ser usada para produzir a imunidade antitumor. A expressão normal de CXADRL1 está restrita ao testículo e ao ovário; a expressão normal de GCUD1 está restrita ao testículo, ao ovário, e ao cérebro; e a expressão normal de RNF43 está restrita ao feto, mais especificamente ao pulmão e ao rim fetais. Portanto, a supressão destes genes pode não afetar adversamente os outros órgãos. Assim, os polipeptídeos CXADRL1 e GCUD1 são preferíveis para tratar a doença proliferativa de células, especialmente o câncer gástrico, colorretal, ou do fígado; e o polipeptídeo RNF43 é também preferível para tratar a doença proliferativa de células, especialmente os cânceres colorretais, do pulmão, gástricos, e do fígado. Além disso, visto que os fragmentos peptídicos de RNF43 compreendendo as seqüências de aminoácidos de SEQ ID NO: 80, 97, e 108, respectivamente, foram revelados induzirem a resposta imune contra o RNF43, os polipeptídeos compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 80, 97, ou 108 são exemplos preferíveis de polipeptídeos que podem ser usados em uma composição farmacêutica para o tratamento ou a prevenção de doença proliferativa de células, especialmente os cânceres colorretais, do pulmão, gástricos, e do fígado. Além disso, visto que os fragmentos peptídicos de CXADRL1 compreendendo as seqüências de aminoácidos de SEQ ID NO: 124, respectivamente, foram revelados induzirem a resposta imune contra o CXADRL1, o polipeptídeo compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 124 é exemplo preferível de polipeptídeo que pode ser usado em uma composição farmacêutica para o tratamento ou a prevenção de doença proliferativa de células, especialmente os cânceres colorretais, do pulmão, gástricos, e do fígado. Ademais, visto que os fragmentos peptídicos de GCUD1 compreendendo as seqüências de aminoácidos de SEQ ID NO: 164, respectivamente, foram revelados induzirem a resposta imune contra o GCUD1, o polipeptídeo compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 164 é exemplo preferível de polipeptídeo que pode ser usado em uma composição farmacêutica para o tratamento ou a prevenção de doença proliferativa de células, especialmente os cânceres colorretais, do pulmão, gástricos, e do fígado. Na presente invenção, o polipeptídeo ou o fragmento do mesmo é administrado em uma dosagem suficiente para induzir a imunidade antitumor, que está na faixa de 0,1 mg a 10 mg, preferivelmente 0,3 mg a 5 mg, mais preferivelmente 0,8 mg a 1,5 mg. As administrações são repetidas. Por exemplo, 1 mg do peptideo ou do seu fragmento pode ser administrado 4 vezes em cada duas semanas, para induzir a imunidade antitumor.

Os seguintes exemplos são apresentados para ilustrar a presente invenção e para auxiliar alguém versado comum na preparação e no uso da mesma. Os exemplos não são pretendidos de modo algum limitar de outra forma o escopo da invenção.

A não ser que de outro modo definido, todos os termos técnicos e científicos usados aqui têm o mesmo significado como comumente entendido por alguém versado na técnica a qual esta invenção pertence. Embora métodos e materiais similares ou equivalentes a estes descritos aqui possam ser usados na prática ou no teste da presente invenção, os métodos e os materiais adequados são descritos abaixo. Quaisquer patentes, pedidos de patentes, e publicações citados aqui são incorporados por referência.

Melhor Modo para Realizar a Invenção

A presente invenção é ilustrada em detalhes pelos seguintes Exemplos, porém não está restrita a estes Exemplos.

1. Materiais e Métodos (1) Pacientes e espécimess de tecidos

Todos os tecidos com cânceres gástricos e colorretais, bem como os tecidos não-cancerosos correspondentes foram obtidos com consentimento informado de espécimes cirúrgicos de pacientes que sofreram cirurgia.

(2) Microarranio de cDNA na extensão do qenoma

Os microarranjos de cDNA na extensão do genoma internos compreendendo 23040 genes foram usados neste estudo. O RNA total tratado com DNase I extraído do tecido microdissecado foi amplificado com o Kit de Transcrição de T7 Ampliscribe (Epicentre Technologies) e marcado durante a transcrição reversa com o corante Cy (Amersham) (o RNA do tecido não-canceroso com Cy5 e o RNA do tumor com Cy3). A hibridização, a lavagem, e a detecção foram realizadas como anteriormente descrito (Ono e outros, Câncer Res. 60: 5007-11 (2000)), e a intensidade da fluorescência de Cy5 e Cy3 para cada ponto-alvo foi medida usando o software Array Vision (Amersham Pharmacia). Após subtração do sinal de fundo, foi tirada a média dos valores em duplicata para cada ponto. Então, todas as intensidades da fluorescência sobre a lâmina foram normalizadas para ajustar a intensidade média de Cy5 e Cy3 de 52 genes constitutivos para cada lâmina. Os genes com intensidades abaixo de 25.000 unidades de fluorescência tanto para Cy3 quanto para Cy5 foram excluídos de investigação adicional, e aqueles com razões de sinais de Cy3/Cy5 > 2,0 foram selecionados para mais avaliação.

(3) Linhagens de células

O rim embriônico humano 293 (HEK293) foi obtido de TaKaRa. A célula COS, a célula NIH3T3, a linhagem de células de câncer cervical humano HeLa, as linhagens de células de câncer gástrico humano MKN-1 e MKN-28, a linhagem de células de hepatoma humano Alexander, e as linhagens de células de câncer do cólon humano, LoVo, HCT116, DLD-1 e SW480, foram obtidas da Coleta de Cultura do Tipo Americano (ATCC, Rockville, MD). A linhagem de células de hepatoma humano SNU475 e as linhagens de células de câncer do cólon humano, SNUC4 e SNUC5, foram obtidas do banco de linhagens de células da Coréia. Todas as células foram desenvolvidas em monocamadas em meios apropriados: meio de Eagle modificado da Dulbecco para COS7, NIH3T3, HEK293, e Alexander; RPMI1640 para MKN-1, MKN-28, SNU475, SNUC4, DLD-1 e SNUC5; meio 5A de McCoy para HCT116; L-15 de Leibovitz para SW480; F-12 de HAM para LoVo; e meio essencial mínimo de Eagle para HeLa (Life Technologies, Grand Island, NY). Todos os meios foram suplementados com 10% de soro bovino fetal e 1 % de solução antibiótica/antimicótica (Sigma). As linhagens de células de câncer gástrico humano St-4 foram gentilmente fornecidas pelo Dr. Tsuruo no Instituto do Câncer, no Japão. As células St-4 foram desenvolvidas em monocamadas em RPMI1640 suplementado com 10% de soro bovino fetal e 1% de solução antibiótica/antimicótica (Sigma).

As células T2 (HLA-A*0201) e EHM (HLA-A3/3), as linhagens de células de linfoblastóide B humano foram doações generosas do Professor Shiku (Univ. Mie). A HT29 (linhagem de células de carcinoma do cólon; HLAA24/01), a WiDR (linhagem de células de carcinoma do cólon; HLA-A24/01), e a HCT116 (linhagem de células do carcinoma do cólon; HLA-A02/01), a DLD-1 (linhagem de células do carcinoma do cólon; HLA-A24/01), a SNU475 (linhagem de células do carcinoma hepatocelular; HLA-A*0201), a MKN45 (linhagem de células de câncer gástrico; HLA-A2 negativa), a MKN74 (linhagem de células de câncer gástrico; HLA-A2 negativa) foram também adquiridas da ATCC. As células TISI (HLA-A24/24) foram doações generosas da

Takara Shuzo Co, Ltd. (Otsu, Japão). Os exames por RT-PCR revelaram uma forte expressão de CXADRL1 em SNU475 e MKN74. Os exames por RT-PCR revelaram uma forte expressão de GCUD1 em SNU475 e MKN45.

(4) Preparação do RNA e RT-PCR

O RNA total foi extraído com o kit RNeasy Qiagen (Qiagen) ou o reagente Trizol (Life Technologies) de acordo com os protocolos dos fabricantes. As alíquotas de dez microgramas do RNA total foram transcritas de modo reverso para os cDNAs de fitas simples usando o primer poli dTi₂-is (Amersham Pharmacia Biotech) com a transcriptase reversa Superscript II (Life Technologies). Cada preparação de cDNA de fita simples foi diluída para a amplificação por PCR subseqüente por experiências de RT-PCR padrões, realizadas em volumes de 20 μΙ de tampão de PCR (TaKaRa). A amplificação foi conduzida sob as seguintes condições: desnaturação por 4 minutos a 94°C, seguida por 20 (para GAPDH), 35 (para CXADRL1), 30 (para GCUD1), 30 (para RNF43) ciclos de 94 °C por 30 s, 56 °C por 30 s, e 72 °C por 45 s, no sistema de PCR GeneAmp 9700 (Perkin-Elmer, Foster City, CA). As seqüências de iniciadores eram; para GAPDH: avançado, 5’ACAACAGCCTCAAGATCATCAG (SEQ ID NO: 7) e reverso, 5’GGTCCACCACTGACACGTTG (SEQ ID NO: 8); para CXADRL1: avançado, 5-AGCTGAGACATTTGTTCTCTTG (SEQ ID NO: 9) e reversa: 5’TATAAACCAGCTGAGTCCAGAG (SEQ ID NO: 10); para GCUD1 avançado: 5’-TTCCCGATATCAACATCTACCAG (SEQ ID NO: 11) reverso: 5’AGTGTGTGACCTCAATAAGGCAT (SEQ ID NO: 12), para RNF43 avançado; 5’-CAGGCTTTGGACGCACAGGACTGGTAC-3’ (SEQ ID NO: 13) e reverso; 5-CTTTGTGATCATCCTGGCTTCGGTGCT-3’ (SEQ ID NO: 14).

(5) Análise de Northern-blot

As manchas de múltiplos tecidos humanos (Clontech, Paio Alto, CA) foram hibridizadas com os produtos da PCR marcados com ³²P de CXADRL1, GCUD1, ou RNF43. A pré-hibridização, a hibridização e a lavagem foram efetuadas de acordo com as recomendações do fornecedor. As manchas foram auto-radiografadas com filtros de intensificação a -80°C por 24 a 72 h.

(6) Amplificação rápida em 5' das extremidades do cDNA (5' RACE)

Os experimentos de 5' RACE foram realizados usando o kit de amplificação de cDNA Marathon (Clontech) de acordo com as instruções do fabricante. Para a amplificação da parte 5' de CXADRL1, foram usados os iniciadores reversos específicos para o gene (5’GGTTGAGATTTAAGTTCTCAAA-3’ (SEQ ID NO: 15)) e o iniciador AP-1 fornecido com o kit. O molde de cDNA foi sintetizado a partir do mRNA do testículo humano (Clontech). Os produtos da PCR foram clonados usando o kit de clonagem TA (Invitrogen) e as suas seqüências foram determinadas com o seqüenciador de DNA ABI PRISM 3700 (Applied Biosystems).

(7) Construção de plasmídeos expressando CXADRL1, GCUD1, e FLJ20315

As regiões inteiras de codificação de CXADRL1, GCUD1, e RNF43 foram amplificadas por RT-PCR usando os conjuntos de iniciadores específicos para genes; para CXADRL1, 5’AGTTAAGCTTGCCGGGATGACTTCTCAGCGTTCCCCTCTGG-3’ (SEQ ID NO: 16) e 5’-ATCTCGAGTACCAAGGACCCGGCCCGACTCTG-3’ (SEQ ID NO: 17), para GCUD1 5’GCGGATCCAGGATGGCTGCTGCAGCTCCTCCAAG-3’ (SEQ ID NO: 18) e 5’-TAGAATTCTTAAAGAACTTAATCTCCGTGTCAACAC-3’ (SEQ ID NO: 19), para RNF43, 5’-TGCAGATCTGCAGCTGGTAGCATGAGTGGTG-3’ (SEQ ID NO: 20) e 5’-GAGGAGCTGTGTGAACAGGCTGTGTGAGATGT-3’ (SEQ ID NO: 21). Os produtos da PCR foram clonados no sítio de clonagem apropriado do vetor pcDNA3.1 (Invitrogen), ou pcDNA3.1myc/His (Invitrogen).

(8) Imunoblottinq

As células transfectadas com pcDNA3.1myc/His-CXADRL1, pcDNA3.1myc/His-GCUD1, pcDNA3.1myc/His-RNF43 ou pcDNA3.1myc/HisLacZ foram lavadas duas vezes com PBS e coletadas em tampão de lise (NaCI a 150 mM, 1% de Triton X-100, Tris-HCI a 50 mM pH 7,4, DTT a 1 mM, e 1X Coquetel de Inibidor de Protease completo (Boehringer)). Seguindo a homogeneização, as células foram centrifugadas a 10.000xg por 30 minutos, os sobrenadantes foram padronizados para a concentração de proteína pelo ensaio de Bradford (Bio-Rad). As proteínas foram separadas por 10% de SDS-PAGE e sofreram imunoblotting com o anticorpo anti-myc de camundongo (SANTA CRUZ). A IgG anticamundongo em cabra conjugada à HRP (Amersham) serviu como o anticorpo secundário para o Sistema de Detecção ECL (Amersham).

(9) Coloração imuno-histoquímica

As células transfectadas com pcDNA3.1myc/His-CXADRL1, pcDNA3.1myc/His-GCUD1, pcDNA3.1myc/His-RNF43 ou pcDNA3.1myc/HisLacZ foram fixadas com PBS contendo 4% de paraformaldeído por 15 minutos, então tornadas permeáveis com PBS contendo 0,1% de Triton X-100 por 2,5 minutos, na TA. Subseqüentemente, as células foram cobertas com 2% de BSA em PBS por 24 h, a 4°C, para bloquear a hibridização nãoespecífica. O anticorpo monoclonal anti-myc de camundongo (Sigma) em diluição a 1:1000 foi usado como o anticorpo primário, e a reação foi visualizada após incubação com o anticorpo secundário anticamundongo conjugado à Rodamina (Leinco e ICN). Os núcleos foram contratingidos com o dicloridrato de 4^,,6'-diamidina-2'-fenilindol (DAPI). As imagens fluorescentes foram obtidas sob um microscópio ECLIPSE E800.

(10) Ensaio de Formação de Colônia

As células transfectadas com os plasmídeos expressando cada gene ou os plasmídeos de controle foram incubadas com uma concentração apropriada de geneticina por 10 a 21 dias. As células foram fixadas com 100% de metanol e tingidas por solução de Giemsa. Todas as experiências foram realizadas em duplicata.

(11) Estabelecimento das células superexpressando CXADRL1, ou RNF43

As células NIH3T3, COS7, e LoVo transfectadas com pcDNA3.1 myc/His-CXADRL1, pcDNA3.1 myc/His-RNF43, pcDNA3.1 myc/HisLacZ ou os plasmídeos de controle, respectivamente, foram mantidos em meios contendo concentração apropriada de geneticina. Duas semanas após a transfecção, as colônias individuais sobreviventes foram selecionadas, e a expressão de cada gene foi examinada por RT-PCR semiquantitativa.

(12) Exame do efeito dos oliqonucleotídeos anti-sentido sobre o crescimento das células

As células preparadas sobre placas de 10 cm (2X10⁵ células/placa) foram transfectadas com o plasmídio, ou os S-oligonucleotídeos sintéticos de CXADRL1, GCUD1, ou RNF43 usando o Reagente LIPOFECTIN (GIBCO BRL). Então as células foram cultivadas com a adição de uma concentração apropriada de geneticina por seis a doze dias. As células foram então fixadas com 100% de metanol e tingidas por solução de Giemsa. As seqüências dos S-oligonucleotídeos foram como se segue: CXADRL1-S4, 5-TCTGCACGGTGAGTAG-3’ (SEQ ID NO: 22); CXADRL1-AS4, 5’-CTACTCACCGTGCAGA-3’ (SEQ ID NO: 23); CXADRL1-S5, 5-TTCTGTAGGTGTTGCA-3’ SEQ ID NO: 24); CXADRL1-AS5, 5’-TGCAACACCTACAGAA-3’ (SEQ ID NO: 25); GCUD1-S5, 5’-CTTTTCAGGATGGCTG-3’ (SEQ ID NO: 26);

GCUD1-AS5, 5’-CAGCCATCCTGAAAAG-3’ (SEQ ID NO: 27); GCUD1-S8, 5’-AGGTTGAGGTAAGCCG-3’ (SEQ ID NO: 28);

GCUD1-AS8, 5’-CGGCTTACCTCAACCT-3’ (SEQ ID NO: 29); RNF43-S1, 5’-TGGTAGCATGAGTGGT-3’ (SEQ ID NO; 30); and RNF43-AS1,5’-ACCACTCATGCTACCA-3’ (SEQ ID NO: 31).

(13) Ensaio de brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio (MTT)

As células preparadas em uma densidade de 5X10⁵ células/placa de 100 mm foram transfectadas em triplicata com os Soligonucleotídeos com sentido ou anti-sentido, projetados para suprimir a expressão de CXADRL1, GCLID1 ou RNF43. Setenta e duas horas após a transfecção, o meio foi substituído por meio novo contendo 500 gg/ml de MTT (brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazólio) (Sigma) e as placas foram incubadas por quatro horas a 37°C. Subseqüentemente, as células foram lisadas pela adição de 1 ml de HCI a 0,01 N/10% de SDS e a absorbância dos lisados foi medida com a leitora de placas de ELISA em um comprimento de ondas de teste de 570 nm (referência, 630 nm). A viabilidade da célula foi representada pela absorbância comparada àquela das células de controle.

(14) Construção de psiH1BX3.0

Visto que o gene H1RNA foi descrito ser transcrito pela RNA polimerase III, que produz transcritos curtos com as uridinas na extremidade de 3', um fragmento genômico do gene H1RNA contendo a sua região promotora foi amplificado por PCR usando um conjunto de iniciadores [5TGGTAGCCAAGTGCAGGTTATA-3’ (SEQ ID NO: 32), e 5’CCAAAGGGTTTCTGCAGTTTCA-3’ (SEQ ID NO: 33)] e o DNA placentário humano como um molde. Os produtos foram purificados e clonados no vetor de plasmídio pCR2.0 usando o kit de clonagem de TA (Invitrogen) de acordo com o protocolo do fornecedor. O fragmento de BamHI e Xho\ contendo o gene H1RNA foi purificado e clonado no plasmídio pcDNA3.1(+) na posição do nucleotídeo a partir de 1257 até 56, plasmídio este que foi amplificado por PCR com um conjunto de iniciadores, 5’TGCGGATCCAGAGCAGATTGTACTGAGAGT-3’ (SEQ ID NO: 34) e 5’CTCTATCTCGAGTGAGGCGGAAAGAACCA-3’ (SEQ ID NO: 35), e então digerido com BamHI e Xho\. O DNA ligado foi usado como um molde para a PCR com os iniciadores, 5’- TTTAAGCTTGAAGACCATTTTTGGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAC-3’ (SEQ ID NO: 36) e 5’TTTAAGCTTGAAGACATGGGAAAGAGTGGTCTCA-3’ (SEQ ID NO: 37). O produto foi digerido com HindWl, e subseqüentemente autoligado para produzir o plasmídio de vetor psiH1BX3.0. Como o controle, o psiH1BX-EGFP foi preparado por clonagem de oligonucleotídeos de fitas duplas de 5’CACCGAAGCAGCACGACTTCTTCTTCAAGAGAGAAGAAGTCGTGCTGCTTC-3’ (SEQ ID NO: 38) e 5’- AAAAGAAGCAGCACGACTTCTTCTCTCTTGAAGAAGAAGTCGTGCTGCTTC-3’ (SEQ ID NO: 39) no sítio de Bbs\ do vetor psiHIBX.

(15) Exame do efeito de silenciamento do gene dos RNF43-, ou CXADRL1siRNAs

Um plasmídio expressando RNF43-siRNA ou CXADRL1-siRNA foi preparado por clonagem dos oligonucleotídeos de fitas duplas no vetor psiH1BX3.0.

Os oligonucleotídeos usados como RNF43 siRNAs foram:

5’- TCCCGTCACCGGATCCAACTCAGTTCAAGAGACTGAGTTGGATCCGGTGAC-3’ (SEQ ID NO: 40) e 5’-AAAAGTCACCGGATCCAACTCAGTCTCTTGAACTGAGTTGGATCCGGTGAC-3’ (SEQ ID NO: 41) como siRNAI 6-4; 5- TCCCGCTATTGCACAGAACGCAGTTCAAGAGACTGCGTTCTGTGCAATAGC-3’ (SEQ ID NO: 42) e

5’-AAAAGCTATTGCACAGAACGCAGTCTCTTGAACTGCGTTCTGTGCAATAGC-3’ (SEQ ID NO: 43) como siRNAI 834; 5’- TCCCCAGAAAGCTGTTATCAGAGTTCAAGAGACTCTGATAACAGCTTTCTG-3’ (SEQ ID NO: 44) e õ-AAAACAGAAAGCTGTTATCAGAGTCTCTTGAACTCTGATAACAGCTTTCTG-3’ (SEQ ID NO: 45) como siRNAI;

5’- TCCCTGAGCCACCTCCAATCCACTTCAAGAGAGTGGATTGGAGGTGGCTCA-3’ (SEQ ID NO: 46) e

5’-AAAATGAGCCACCTCCAATCCACTCTCTTGAAGTGGATTGGAGGTGGCTCA-3’ (SEQ ID NO: 47) como siRNAI4; 5- TCCCCTGCACGGACATCAGCCTATTCAAGAGATAGGCTGATGTCCGTGCAG-3’ (SEQ ID NO: 48) e 5’-AAAACTGCACGGACATCAGCCTATCTCTTGAATAGGCTGATGTCCGTGCAG-3’ (SEQ ID NO: 49) como siRNAI 5. Os oligonucleotídeos usados como CXADRL1- siRNAs foram:

5’-TCCCGTGTCAGAGAGCCCTGGGATTCAAGAGATCCCAGGGCTCTCTGACAC-3’ (SEQ ID NO: 50) e

5’-AAAAGTGTCAGAGAGCCCTGGGATCTCTTGAATCCCAGGGCTCTCTGACAC3’ (SEQ ID NO: 51) como siRNAn°1;

5’-TCCCCCTCAATGTCATTTGGATGTTCAAGAGACATCCAAATGCAATTGAGG-3’ (SEQ ID NO: 52) e

Õ-AAAACCTCAATGTCATTTGGATGTCTCTTGAACATCCAAATGCAATTGAGG-3’ (SEQ ID NO: 53) como siRNAn°2;

5’-TCCCTGTCATTTGGATGGTCACTTTCAAGAGAAGTGACCATCCAAATGACA-3’ (SEQ ID NO: 54) e

5’-AAAATGTCATTTGGATGGTCACTTCTCTTGAAAGTGACCATCCAAATGACA-3’ (SEQ ID NO: 55) como siRNAn°3;

5’-TCCCTGCCAACCAACCTGAACAGTTCAAGAGACTGTTCAGGTTGGTTGGCA-3’ (SEQ ID NO: 56) e

5’-AAAATGCCAACCAACCTGAACAGTCTCTTGAACTGTTCAGGTTGGTTGGCA-3’ (SEQ ID NO: 57) como siRNAn°4;

5’-TCCCCCAACCTGAACAGGTCATCTTCAAGAGAGATGACCTGTTCAGGTTGG-3’ (SEQ ID NO: 58) e

5’-AAAACCAACCTGAACAGGTCATCTCTCTTGAAGATGACCTGTTCAGGTTGG-3’ (SEQ ID NO: 59) como siRNAn°5;

5’-TCCCCCTGAACAGGTCATCCTGTTTCAAGAGAACAGGATGACCTGTTCAGG-3’ (SEQ ID NO: 60) e

5’-AAAACCTGAACAGGTCATCCTGTTCTCTTGAAACAGGATGACCTGTTCAGG-3’ (SEQ ID NO: 61) como siRNAn°6; e

5’-TCCCCAGGTCATCCTGTATCAGGTTCAAGAGACCTGATACAGGATGACCTG-3’ (SEQ ID NO: 62) e

5’-AAAACAGGTCATCCTGTATCAGGTCTCTTGAACCTGATACAGGATGAC

CTG-3’ (SEQ ID NO: 63) como CXADRL-siRNAn°7. Os plasmídeos psiH1BX-RNF43, psiH1BX-CXADRL1, ou psiH1BX-falso foram transfectados nas células SNUC4 ou St-4 usando o reagente FuGENE6 (Roche) de acordo com as recomendações do fornecedor. O RNA total foi extraído das células 48 horas após a transfecção.

(16) Construção das regiões amino- e carboxil-terminais recombinantes da proteína RNF43

As regiões amino- e carboxil-terminais de RNF43 foram amplificadas por RT-PCR usando os seguintes conjuntos de iniciadores: 5’GAAGATCTGCAGCGGTGGAGTCTGAAAG-3’ (SEQ ID NO: 64) e 5’GGAATTCGGACTGGGAAAATGAATCTCCCTC-3’ (SEQ ID NO: 65) para a região amino-terminal; e 5’-GGAGATCTCCTGATCAGCAAGTCACC-3’ (SEQ ID NO: 66) e 5’-GGAATTCCACAGCCTGTTCACACAGCTCCTC-3’ (SEQ ID NO: 67) para a região carboxil-terminal. Os produtos foram digeridos com EamHI-EcoRl e clonados no sítio de BamHI-EcoRI do vetor pET-43.1a(+) (Novagen). Os plasmídeos foram transfectados nas células de E. coli BL21trxB(DE3)pLysS (Stratagene). A proteína RNF43 recombinante foi extraída das células cultivadas a 25 °C por 16 h após a adição de IPTG a 0,2 mM.

(17) Experimento de dois híbridos em levedura

O ensaio de dois híbridos em levedura foi efetuado usando o sistema de Dois Híbridos MATCHMAKER GAL4 3 (Clontech) de acordo com os protocolos do fabricante. A seqüência inteira de codificação do RNF43 foi clonada no sítio de EcoR \-BamH I do vetor pAS2-1 como uma isca para o exame da biblioteca de cDNA de testículo humano (Clontech). Para confirmar a interação na levedura, o pAS2-RNF43 foi usado como um vetor isca, o pACT2-NOTCH2 e o pACT2-STRIN como vetor vítima.

Foi clonada a região citoplásmica de CXADRL1 no sítio de EcoRl do vetor pAS2-1 como uma isca para o exame de uma biblioteca de cDNA de testículo humano (Clontech). Para confirmar a interação na levedura, foi usado o pAS2-CXADRL1 para o vetor isca, e o pACT2-AIP1 para o vetor vítima.

(18) Preparação do anticorpo específico para CXADRL

Os anti-soros anti-CXADRL foram preparados por imunização com polipeptídeos sintéticos de CXADRL1 incluindo os códons a partir de 235 até 276 para Ab-1, a partir de 493 até 537 para Ab-2, ou a partir de 70 até 111 para Ab-3. Os soros foram purificados usando a proteína CXADRL1 marcada com His recombinante, preparada em E. coli transfectada com o plasmídio pET-CXADRL. A proteína extraída das células expressando a CXADRL1 marcada com Flag foi adicionalmente separada por 10% de SDSPAGE e sofreu immunoblotting com os soros anti-CXADRL1 ou o anticorpo anti-FLAG. O anticorpo de IgG anticoelho em cabra conjugada à HRP ou de IgG anticamundongo em ovelha conjugada à HRP serviu como o anticorpo secundário, respectivamente, para o Sistema de Detecção ECL (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). O immunoblotting com os anti-soros anti-CXADRL mostraram uma banda de 50 kD de CXADRL1 marcada com FLAG, padrão este que era idêntico àquele detectado com o anticorpo antiFLAG.

(19) Preparação da proteína GCUD1 recombinante

Para gerar um anticorpo específico contra GCUD1, a proteína recombinante GCUD1 foi preparada. A região inteira de codificação de GCUD1 foi amplificada por RT-PCR com um conjunto de iniciadores, 5’GCGGATCCAGGATGGCTGCAGCTCCTCCAAG-3’ (SEQ ID NO: 68) e 5’CTGAATTCACTTAAAGAACTTAATCTCCGTGTCAACAC-3’ (SEQ ID NO: 69). O produto foi purificado, digerido com Ban?H1 e EcoR1, e clonado em um sítio de clonagem apropriado de pGEX6P-2. O plasmídio resultante foi nomeado pGEX-GCUD1. O plasmídio pGEX-GCUD1 foi transformado em E. coli DH10B. A produção da proteína recombinante foi induzida pela adição de IPTG, e a proteína foi purificada com Glutationa Safarose® 4B (Amersham Pharmacia) de acordo com os protocolos dos fabricantes.

(20) Preparação do anticorpo específico para GCUD1

O anticorpo policlonal contra GCUD1 foi purificado dos soros. As proteínas das células transfectadas com os plasmídeos expressando a GCUD1 marcada com Flag foram separadas por 10% de SDS-PAGE e so freram immunoblotting com anticorpo anti-GCUD1 ou anti-Flag. A IgG anticoelho em cabra conjugada à HRP (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) ou o anticorpo anti-Flag conjugado à HRP serviu como o anticorpo secundário, respectivamente, para o Sistema de Detecção ECL (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). O immunoblotting com o anticorpo antiGCUD1 mostrou uma banda de 47 kD de GCUD1 marcada com FLAG, padrão este que era idêntico àquele detectado com o anticorpo anti-FLAG.

(21) Análise estatística

Os dados foram submetidos à análise da variância (ANOVA) e ao teste F de Scheffé.

(22) Preparação dos peptídeos

Os peptídeos de 9 meros e 10 meros de RNF43, CXADRL1 ou GCUD1 que se ligam à molécula de HLA-A24 ou HLA-A*0201 foram preditos com o auxílio do soft de predição da ligação (http://bimas.dcrt.nih.gov/cgibin/molbio/ken_parker_comboform). Estes peptídeos foram sintetizados por Mimotopes, San Diego, LA, de acordo com o método de síntese de fase sólida padrão e purificados por HPLC de fase reversa. A pureza (>90%) e a identidade dos peptídeos foram determinadas por HPLC analítica e análise por espectrometria de massa, respectivamente. Os peptídeos foram dissolvidos em sulfóxido de dimetila (DMSO) a 20 mg/ml e armazenados a -80 °C.

(23) Indução do CTL in vitro

As células dendríticas derivadas de monócitos (DCs) foram usadas como células apresentadoras de antígenos (APCs) para induzir as respostas dos CTLs contra os peptídeos apresentados sobre HLA. As DCs foram geradas in vitro como descrito alhures (Nukaya e outros, Int J Câncer 80: 92-7 (1999); Tsai e outros, J Immunol 158: 1796-802 (1997)). Especificamente, as células mononucleares sanguíneas periféricas (PBMCs) foram isoladas de um voluntário saudável com HLA-A*0201 ou HLA-A24 usando solução de Ficoll-Plaque (Pharmacia), e a fração de monócitos das PBMCs foi separada por aderência a um frasco plástico de cultura de tecido (Becton Dickinson). Esta fração de monócitos foi cultivada por sete dias em meio AIM-V (Invitrogen) contendo 2% de soro autólogo (AS) desativado por calor,

1000 U/ml de GM-CSF (fornecido pela Kirin Brewery Company), e 1000 U/ml de IL-4 (Genzyme) para obter a fração de DCs. Os 20 gg/ml de peptídeos candidatos foram pulsados sobre esta população de células enriquecidas com DC na presença de 3 gg/ml de p2-microglobulina por 4 h a 20°C em AIM-V. Estas células apresentadoras de antígenos pulsadas com peptídeos foram então irradiadas (5500 rads) e misturadas em uma razão de 1:20 com as células T CD8+ autólogas, obtidas por seleção positiva com Dynabeads M-450 CD8 (Dynal) e Detachabead (Dynal). Estas culturas foram estabelecidas em placas com 48 cavidades (Corning); cada cavidade continha 1,5 x 10⁴ células apresentadoras de antígenos pulsadas com peptídeos, 3x10⁵células T CD8+ e 10 ng/ml de IL-7 (Genzyme) em 0,5 ml de AIM-V com 2% de AS. Três dias depois, estas culturas foram suplementadas com IL-2 (CHIRON) até uma concentração final de 20 lU/ml. Nos dias 7 e 14, as células T foram adicionalmente estimuladas novamente com as células apresentadoras de antígenos pulsadas com peptídeos autólogas, que foram preparadas cada vez no mesmo modo como descrito acima. As células linfóides na cultura no dia 21 foram coletadas e testadas quanto à citotoxicidade contra as células TISI ou T2 pulsadas com peptídeos.

(24) Expansão dos CTLs

As células linfóides cultivadas, com citotoxicidade significativa provada contra TISI ou T2 pulsada com peptídeo, foram adicionalmente expandidas em cultura usando um método similar àquele descrito por Riddell, e outros (Walter e outros, N Engl J Med 333:1038-1044, 1995; Riddel e outros, Nature Med. 2:216-223, 1996). 5 x 10⁴ de células linfóides foram suspensas novamente em 25 ml de AIM-V suplementado com 5% de AS contendo 25 x 10⁶ PBMCs irradiadas (3300 rads), 5 x 10⁶ células EHM irradiadas (8000 rads), e 40 ng/ml de anticorpo monoclonal anti-CD3 (Pharmingen). Um dia após iniciar as culturas, 120 lU/ml de IL-2 foram adicionados às culturas. As culturas compreendiam AIM-V novo suplementado com 5% de AS e 30 lU/ml de IL-2 nos dias 5, 8 e 11.

(25) Estabelecimento de clones de CTL

Algumas das células linfóides com citotoxicidade potente foram usadas para obter clones de CTL. As suspensões de células foram diluídas até uma densidade de 0,3, 1, e 3 CTLs/células linfóides por poço em placa de microtítulo com fundo redondo, de 96 poços (Nalge Nunc International). Estas células foram cultivadas em 150 μΙ/poço de AIM-V suplementado com 5% de AS contendo 7 x 10⁴ células/poço de PBMCs alogênicas, 1 x 10⁴ células/poço de EHM, 30 ng/ml de anticorpo anti-CD3, e 125 U/ml de IL-2. 10 dias depois, 50 μΙ /poço de IL-2 foram adicionados ao meio até uma concentração final de 125 U/ml. A atividade citotóxica dos CTLs cultivados foi testada no dia 14, e os clones de CTL foram expandidos usando o mesmo método conforme descrito acima.

(26) Ensaio de Citotoxicidade

As células-alvo foram marcadas com 100 pCi de Na₂ ⁵¹CrO4 (Perkin Elmer Life Sciences) por 1 h, a 37 °C, em uma incubadora de CO2. Quando os alvos pulsados com peptídeos foram usados, as células-alvo foram incubadas com a adição de 20 pg/ml do peptídeo por 16 h a 37 °C, antes da marcação com Na2⁵¹CrO4. As células-alvo foram enxaguadas e misturadas com efetores em um volume final de 0,2 ml em placas de microtítulo de fundo redondo. As placas foram centrifugadas (4 minutos a 800 x g) para aumentar o contato de célula com célula e colocadas em uma incubadora de CO₂ a 37°C. Após 4 h de incubação, 0,1 ml do sobrenadante foi coletado de cada poço e a radioatividade foi determinada com um contador gama. No caso de avaliar a citotoxicidade contra as células-alvo que expressam de modo endógeno RNF43 ou CXADRL1 ou GCUD1, a atividade citolítica foi testada na presença de um excesso de 30 vezes de células K562 nãomarcadas para reduzir qualquer lise não específica devido aos efetores semelhantes à NK. A especificidade de antígeno foi confirmada pelo ensaio de inibição de alvo frio, que utilizou as células TISI ou T2 não marcadas que foram pulsadas com o peptídeo (20 μ g/ml por 16 h a 37 °C) para competir quanto ao reconhecimento de células HT29 ou SNU475 marcadas com 51 Cr. A restrição do MHC foi examinada por ensaio de bloqueio, medindo a inibição da citotoxicidade pelo anticorpo anti-HLA-classe I (W6/32) e anticorpo anti HLA-classe II, anticorpo anti-CD4 e anticorpo anti-CD8 (DAKO).

A percentagem de citotoxicidade específica foi determinada calculando a percentagem de liberação de ⁵¹Cr específica pela seguinte fórmula: {(cpm da liberação da amostra de teste - cpm da liberação espontânea)/(cpm da liberação máxima - cpm da liberação espontânea)} X 100. A liberação espontânea foi determinada incubando as células-alvo sozinhas, na ausência de efetores, e a liberação máxima foi obtida por incubação dos alvos com HCl a 1N. Todos os determinantes foram feitos em duplicata, e os erros padrão das médias estavam consistentemente abaixo de 10% do valor da média.

2. Resultados (1) Identificação de dois novos genes humanos, CXADRL1 e GCUD1, comumente supra-requlados em cânceres gástricos

Por meio de um microarranjo de cDNA na extensão do genoma contendo 23040 genes, os perfis de expressão de 20 cânceres gástricos foram comparados com as mucosas não-cancerosas correspondentes. Entre os genes comumente supra-regulados, detectados na análise de microarranjo, um gene com um número de acesso interno de A5928 correspondendo a um EST, Hs.6658 do grupo UniGene (http://www.ncbi. nlm.nih.gov/UniGene/), foi verificado ser super-expressado em uma faixa entre 4,09 e 48,60 (Figura 1a). Visto que um quadro de leitura aberto deste gene codificou uma proteína aproximadamente 37% idêntica àquela de CXADR (receptor de coxsackie e adenovírus), este gene foi nomeado CXADRL1 (receptor de coxsackie e adenovírus tipo 1). O CXADRL1 foi também supra-regulado em 6 de 6 casos de câncer colorretal e 12 dos 20 casos de HCC. Além disso, um gene com um número de acesso interno de C8121, correspondendo ao produto de gene de KIAA0913 (Hs.75137) do grupo UniGene, foi também focado devido à sua expressão significativamente aumentada em nove de doze tecidos com cânceres gástricos em comparação com as mucosas gástricas não-cancerosas correspondentes por microarranjo (Figura 1b). Este gene, com o número de acesso interno C8121, foi nomeado GCUD1 (supra-regulado em câncer gástrico). O GCUD1 foi também supra-regulado em 5 de 6 casos de cânceres colorretais, 1 de 6 casos de HCC, 1 de 14 casos de câncer do pulmão (carcinoma de células escamosas), 1 de 13 casos de seminomas testiculares. Para clarificar os resultados do microarranjo de cDNA, a expressão destes transcritos em cânceres gástricos foi examinada por RT-PCR semiquantitativa para confirmar uma expressão aumentada de CXADRL1 em todos os 10 tumores (Figura 1c) e a expressão elevada de GCUD1 em sete de nove cânceres (Figura 1d).

(2) Isolamento e estrutura de um novo gene CXADRL1

A análise de northern-blot de múltiplos tecidos, usando um produto de PCR de CXADRL1 como uma sonda, revelou a expressão de um transcrito de 3,5 kb no testículo e no ovário (Figura 2a). Visto que ο A5928 era menor do que o gene detectado no Northern blot, as experiências de 5' RACE foram realizadas para determinar a seqüência de codificação inteira do gene CXADRL1. O cDNA de tamanho natural putativo consistia em 3423 nucleotídeos, com um quadro de leitura aberto de 1296 nucleotídeos (SEQ ID NO: 1) codificando uma proteína de 431 aminoácidos (SEQ ID NO: 2) (número de Acesso do GenBank: AB071618). O primeiro ATG era flanqueado por uma seqüência (CCCGGGATGA) (SEQ ID NO: 70) que estava consistente com a seqüência de consenso para a iniciação da tradução em eucariotos, com um códon de interrupção dentro do quadro a montante. Usando o programa BLAST para buscar homologias nos bancos de dados do NCBI (o Centro Nacional para Informação de Biotecnologia), foi identificada uma seqüência genômica com o número de acesso do GenBank AC068984, seqüência esta que tinha sido atribuída à banda cromossômica 3q13. Uma comparação do cDNA e a seqüência genômica revelou que o CXADRL1 consistia em 7 exons (Figura 2b).

Uma busca por motivos de proteínas usando a Simple Modular Architecture Research Tool (Ferramenta de Pesquisa de Arquitetura Modular Simples) (SMART, http://smart.embl-heidelberg.de) revelou que a proteína predita continha dois domínios de imunogloblina (códons 29-124 e 158232) e um domínio de transmembrana (códons 246-268), sugerindo que o CXADRL1 podería pertencer à superfamília de imunogloblina.

(3) Efeito do CXADRL1 sobre o crescimento da célula

Um ensaio de formação de colônia foi efetuado transfectando as células NIH3T3 com um plasmídio expressando CXADRL1 (pcDNA3.1myc/His-CXADRL1). As células transfectadas com pcDNA3.1myc/His-CXADRL1 produziram marcadamente mais colônias do que as células transfectadas com falso (Figura 3a). Para investigar adicionalmente este efeito promotor do crescimento do CXADRL1, as células NIH3T3 que expressaram estavelmente o CXADRL1 exógeno foram estabelecidas (Figura 3b). A taxa de crescimento das células NIH3T3-CXADRL1 era significativamente maior do que aquela das células NIH3T3 parentais em meios de cultura contendo 10% de FBS (Figura 3c).

(4) Supressão da expressão de CXADRL1 em células de câncer gástrico humano por S-oliqonucleotídeos anti-sentido

Seis pares de S-oligonucleotídeos de controle e anti-sentido correspondendo ao CXADRL1 foram transfectados nas células de câncer gástrico MKN-1, que tinham mostrado o mais alto nível de expressão de CXADRL1 entre as seis linhagens de células de câncer gástrico examinadas. Seis dias após a transfecção, a viabilidade das células transfectadas foi medida por ensaio de MTT. As células viáveis transfectadas com os Soligonucleotídeos anti-sentido (CXADRL1-AS4 ou -AS5) eram marcadamente menos do que aquelas transfectadas com os S-oligonucleotídeos de controle (CXADRL1-S4 ou -S5) (Figura 4). Foram obtidos resultados consistentes em três experiências independentes.

(5) Construção dos plasmídeos expressando os CXADRL1 siRNAs e seu efeito sobre o crescimento de células de câncer gástrico

Os plasmídeos expressando diversos CXADRL1-siRNAs foram construídos e examinados quanto ao seu efeito sobre a expressão do CXADRL1. Entre os siRNAs construídos, o psiH1BX-CXADRL7 significativamente suprimiu a expressão do CXADRL1 nas células St-4 (Figura 5A). Para testar se a supressão do CXADRL1 pode resultar na supressão do crescimento das células de câncer do cólon, as células St-4 foram transfectadas com psiH1BX-CXADRL7 ou vetor falso. O número de células viáveis transfectadas com psiH1BX-CXADRL7 era menor do que o número de célu89

Ias de controle viáveis (Figuras 5B e 5C).

(6) Preparação do anticorpo anti-CXADRL1

Para examinar a expressão e explorar a função do CXADRL1, foi preparado o anti-soro contra CXADRL1. O immunoblotting com antiCXADRL1 detectou uma banda de 50 kD de CXADRL1 marcada com FLAG, que era quase idêntica no tamanho àquela detectada com o anticorpo antiFLAG (Figura 6).

(7) Identificação de uma proteína de interação com CXADRL1 pelo sistema de exame de dois híbridos em levedura

Para clarificar a função do CXADRL1, foram pesquisadas proteínas de interação com o CXADRL1 usando o sistema de exame de dois híbridos em levedura. Entre os clones positivos identificados, a região Cterminal da AIP1 nuclear (proteína 1 de interação com a atrofina) interagiu com o CXADRL1 por transformação simultânea usando pAS2.1-CXADRL1 e pACT2-AIP1 (Figura 7) nas células de levedura. Os clones positivos continham códons entre 808 e 1008, indicando que a região responsável pela interação na AIP1 está dentro desta região.

(8) Predição dos peptideos candidatos derivados de CXADRL1

A Tabela 1 mostra os peptideos candidatos (SEQ ID NOs: 115154) em ordem de alta afinidade de ligação. Quarenta peptideos no total foram selecionados e examinados conforme descrito abaixo.

Tabela 1 Predição dos peptideos candidatos derivados de CXADRL1

HLA-A*0201 9 meros

HLA-A*0201 10 meros

Orderr	Seqüência	Escore	Posição	Order	π Seqüência	Escore	Posição
1	YLVEKLDNT	1314,7	176	1	YLWEkLDNTL	3344	176
2	LLLLSLHGV	1006,2	11	2	LINLnVIWMV	280,45	52
3	1 NLNVI W	49,262	53	3	ALSSgLYQCV	104,33	207
4	VWTPLSNA	37,961	59	4	ALIN1NV1WM	62,845	51
5	CLVNNLPD)	23,995	120	5	ILLCsSEEGI	32,155	162
6	SLHGVAASL	21,362	15	6	VLPCtFTTSA	32,093	41
7	VI 1 1 FCI AL	18,975	252	7	LLLSIHGVAA	31,249	12
8	LI NLNVI MM	14,69	52	8	SIYAnGTHLV	30,603	356
9	AVLPCIPIΓ	13,993	40	9	QLSDtGTYQC	20,369	111
10	ALSSGLYQC	11,426	207	10	GLYQcVASNA	15,898	211
11	VMSRSNGSV	11,101	384	11	PLLUSLHGV	13,022	10
12	SI FJ NNTCL	10,868	104	12	IQVArGQPAV	11,988	32
13	KVHRNTDSV	10,437	327	13	FINNtQLSDT	10,841	106
14	RJ GWPVMZ	9,563	413	14	LVPGqHKTLV	10,346	364
15	NI GVTGLTV	9,563	132	15	NLPDiGGRNI	8,555	124
16	SI YANGTHL	9,399	356	16	VLVPpSAPHC	8,446	140
17	LLCSSEEG	8,691	163	17	AVIliFCIAL	7,103	251
18	LLSLHa/AA	8,446	13	18	VHIfCIALI	5,609	252
19	1 1 FCI ALI L	7,575	254	19	ILGAfFYWRS	5,416	261
20	TIVPATNVSI	7,535	97	20	GLTVIVPPSA	4,968	137

(9) Estimulação das células T e estabelecimento de clones de CTL usando os peptideos candidatos

As células linfóides foram cultivadas usando estes peptideos candidatos derivados de CXADRL1 na maneira descrita em Materiais e Métodos. As células linfóides resultantes mostrando atividade citotóxica detectável foram expandidas, e o clone de CTL foi estabelecido. O clone de CTL foi propagado a partir das linhagens de CTL descritas acima, usando os métodos de diluição limitativa. O clone de CTL induzido com CXADRL1-207 (ALSSGLYQC) (SEQ ID NO: 124) mostrou as maiores atividades citotóxicas contra o alvo pulsado com peptideos, quando comparado com aquelas contra alvos não pulsados com quaisquer peptideos. A atividade citotóxica deste clone de CTL foi mostrada na Figura 8. Este clone de CTL tinha uma atividade citotóxica muito potente contra o alvo pulsado com peptídeo, sem mostrar qualquer atividade citotóxica contra o alvo não pulsado com quaisquer peptídeos.

(10) Atividade citotóxica contra as linhagens de células de tumor expressando de modo endóqeno o CXADRL1 como um alvo

Os clones de CTL produzidos contra os peptídeos preditos foram examinados quanto à sua capacidade de reconhecer e matar as células de tumor que expressam de modo endógeno o CXADRL1. A Figura 9 mostra os resultados do Clone de CTL 75 produzido contra o CXADRL1-207 (ALSSGLYQC) (SEQ ID NO: 124). O Clone de CTL 75 mostrou atividade citotóxica potente contra SNU475, que expressa CXADRL1 e HLA-A*0201, entretanto ele não mostrou contra MKN74, que expressou CXADRL1, porém não HLA-A*0201, e não mostrou contra SNU-C4, que expressou HLAA*0201 porém não CXADRL1.

(11) Especificidade dos CTLs estabelecidos

O ensaio de inibição de alvo frio foi também efetuado para confirmar a especificidade do Clone de CTL de CXADRL1-207. As células SNU475 marcadas por ⁵¹Cr foram usadas como um alvo quente, enquanto as células T2 pulsadas com CXADRL1-207 (SEQ ID NO: 124) foram usadas sem a marcação por⁵¹ Cr como um alvo frio. A lise de célula específica contra as células SNU475 foi significativamente inibida, quando a T2 pulsada com CXADRL1-207 (SEQ ID NO: 124) foi adicionada no ensaio em diversas razões (Figura 10). Estes resultados foram indicados como uma percentagem de lise específica na razão de E/T de 20.

Com relação ao clone de CTL de CXADRL1-207, para examinar as características destes clones de CTL, os anticorpos contra HLA-Classe I, HLA-Classe II, CD4 e CD8 foram testados quanto à sua capacidade de inibir a atividade citotóxica. A citotoxicidade do clone de CTL contra as células SNU475 foi significativamente inibida quando o anticorpo anti-HLA-Classe I e o anticorpo anti-CD8 foram usados (Figura 11), indicando que o clone de CTL reconhece o peptídeo derivado de CXADRL1 em um modo dependente de HLA-Classe I e CD8.

(12) Expressão e caracterização do novo gene humano GCUD1

A análise de northern blot de múltiplos tecidos usando o cDNA de GUCD1 como uma sonda mostrou um transcrito de 5,0 kb expresso especificamente no testículo, no ovário, e no cérebro (Figura 12). Embora a seqüência de nucleotídeos de KIAA0913 (Número de Acesso do GenBank:

XM-014766), correspondendo ao GCUD1, consistisse em 4987 nucleotídeos, as experiências de RT-PCR usando tecidos do testículo, do ovário e com câncer revelaram um transcrito que consistia em 4987 nucleotídeos contendo um quadro de leitura aberto de 1245 nucleotídeos (SEQ ID NO: 3) (Número de Acesso do GenBank: AB071705). Além disso, a seqüência genômica correspondendo ao GUCD1 foi pesquisada em bancos de dados genômicos para encontrar uma seqüência de projeto atribuída à banda cromossômica 7p14 (Número de Acesso do GenBank: NT-007819). Uma comparação entre a seqüência de cDNA e a seqüência genômica revelou que o gene GUCD1 consistia em 8 exons.

(13) Localização subcelularde GCUD1

A região de codificação inteira correspondendo ao GCUD1 foi clonada no vetor pCDNA3.1myc/His e o constructo foi transfectada de modo transiente para a célula COS7. A coloração imunocitoquímica da célula COS7 revelou que a proteína GCUD1 marcada estava presente no citoplasma (Figura 13).

(14) Efeito de GCUD1 sobre o crescimento da célula

Para analisar o efeito de GCUD1 sobre o crescimento da célula, um ensaio de formação de colônia foi conduzido, transfectando as células NIH3T3 com um plasmídio expressando GCUD1 (pcDNA3.1myc/HisGCUD1). Comparado com o plasmídio de controle (pcDNA3.1myc/HisLacZ), o pcDNA3.1myc/His-GCUD1 induziu marcadamente mais colônias nas células NIH3T3 (Figura 14). Este resultado foi confirmado por três experiências independentes.

(15) Supressão do crescimento das células de câncer gástrico por Soliqonucleotídeos anti-sentido designados para reduzirem a expressão de GCUD1

Para testar se a supressão de GCUD1 pode resultar na morte celular de células de câncer gástrico, foram sintetizados diversos Soligonucleotídeos anti-sentido projetados para suprimir a expressão de GCUD1. Seis dias após a transfecção dos S-oligonucleotídeos anti-sentido respectivos, a viabilidade das células transfectadas foi medida pelo ensaio de MTT. As células viáveis transfectadas com os S-oligonucleotídeos antisentido (GCUD1-AS5 ou -AS8) eram marcadamente menos do que aquelas transfectadas com os S-oligonucleotídeos de controle (GCUD1-S5 ou -S8) nas células MKN-28 (Figura 15). Este resultado foi confirmado por três experiências independentes. Foi observado um resultado similar com as células MKN-1.

(16) Preparação do anticorpo anti-GCUD1

Para examinar a expressão e explorar a função de GCUD1, foi preparado o anti-soro contra GCUD1. A proteína recombinante de GCUD1 foi extraída e purificada das células bacterianas expressando a proteína de fusão GST-GCUD1 (Figura 16). A proteína recombinante foi usada para a imunização de três coelhos. O immunoblotting com os soros anti-GCDU1, porém não os soros pré-imunes, mostrou uma banda de 47 kD de GCUD1 marcada com FLAG, que era quase idêntica no tamanho àquela detectada com o anticorpo anti-FLAG (Figura 17).

(17) Predição dos peptídeos candidatos derivados de GCUD1

A Tabela 2 (GCUD1) mostra os peptídeos candidatos (SEQ ID NOs: 155-194) em ordem de alta afinidade de ligação. Quarenta peptídeos no total foram selecionados e examinados conforme descrito abaixo. Tabela 2 Predição dos peptídeos candidatos derivados de GCUD1

Orden	Seqüência	Escore	Posição
1	SIFKPFIFV	369,77	303
2	WLWGAEMGA	189,68	75
3	IIVHSRPAWL	144,26	68
4	LLGMDLVRL	83,527	107
5	FIFVDDVKL	49,993	308
6	VCIDSEFFL	31,006	265
7	KPFIFVDDV	25,18	306
8	1VDRDEAWV	22,761	159
9	TLRDKASGV	21,672	257
10	KMDAEHPEL	21,6	196
11	ALDVIVSLL	19,653	126
12	YAQSQGWWT	19,639	207
13	KLRSTMLEL	13,07	367
14	YLIVDRDEA	11,198	157
15	AAPPSYCFV	7,97	3
16	GMDLVRLGL	6,171	109
17	KVTEGVRCI	6,026	179
18	CJDSEFFLT	4,517	266
19	TVQTMMNTL	4,299	250
20	EMGANEHGV	3,767	80

Orden	Seqüência	Escore	Posição
1	FIFVdDVKLV	374,37	308
2	LIVDrDEAWV	366,61	158
3	FLTTaSGVSV	319,94	272
4	TMLEIEKQGL	234,05	371
5	ALLGmDLVRL	181,79	106
6	AIMIsRPAWL	59,775	67
7	GVCIdSEFFL	59,628	264
8	KLVPkTQSPC	17,388	315
9	FNFSeVFSPV	14,682	220
I 1°	YISIdQVPRT	10,841	56
11	GEGEfNFSEV	10,535	216
12	WAAEkVTEGV	8,927	175
13	VLPQnRSSPC	8,446	281
14	AAAPpSYCFV	7,97	2
15	TMMNtLRDKA	6,505	253
16	EVGDIFYDCV	5,227	397
17	AEMGaNEHGV	5,004	79
18	GLWfGKNSA	4,968	20
19	QLSLtTKMDA	4,968	190
20	RSIFkPFIFV	4,745	302

(18) Estimulação das células T e estabelecimento de clones de CTL usando os peptideos candidatos

As células linfóides foram cultivadas usando estes peptideos candidatos derivados de GCUD1 na maneira descrita em Materiais e Métodos. As células linfóides resultantes mostrando atividade citotóxica detectável foram expandidas, e os clones de CTL foram estabelecidos. Os clones de CTL foram propagados a partir das linhagens de CTL descritas acima, usando os métodos de diluição limitativa. Os clones de CTL induzidos com GCUD1-196 (KMDAEHPEL) (SEQ ID NO: 164) e GCUD1-272 (FLTTASGVSV) (SEQ ID NO: 177) mostraram as maiores atividades citotóxicas contra o alvo pulsado com peptideos, quando comparados com aquelas contra alvos não pulsados com quaisquer peptideos. A atividade citotóxica destes clones de CTL foi mostrada na Figura 18. Cada clone de CTL tinha uma atividade citotóxica muito potente contra o alvo pulsado com peptídeo, sem mostrar qualquer atividade citotóxica contra o alvo não pulsado com quaisquer peptideos.

(19) Atividade citotóxica contra as linhagens de células de tumor expressando de modo endógeno o GCUD1 como um alvo

Os clones de CTL produzidos contra os peptideos preditos foram examinados quanto à sua capacidade de reconhecer e matar as células de tumor que expressam de modo endógeno o GCUD1. A Figura 19 mostra os resultados do Clone de CTL 23 produzido contra o GCUD1-196 (SEQ ID NO: 164). O Clone de CTL 23 mostrou atividade citotóxica potente contra SNU475, que expressa GCUD1 e HLA-A*0201, entretanto ele não mostrou contra MKN45, que expressou GCUD1, porém não HLA-A*0201.

(20) Especificidade dos CTLs estabelecidos

O ensaio de inibição de alvo frio foi também efetuado para confirmar a especificidade do Clone de CTL de GCUD1-196. As células SNU475 marcadas por ⁵¹Cr foram usadas como um alvo quente, enquanto as células T2 pulsadas com GCUD1-196 foram usadas sem a marcação por ⁵¹Cr como um alvo frio. A lise de célula específica contra as células SNU475 foi significativamente inibida, quando a T2 pulsada com GCUD1-196 (SEQ ID NO:

164) foi adicionada no ensaio em diversas razões (Figura 20). Estes resultados foram indicados como uma percentagem de lise específica na razão de E/T de 20.

Com relação ao clone de CTL de GCUD1-196 (SEQ ID NO: 164), para examinar as características destes clones de CTL, os anticorpos contra HLA-Classe I, HLA-Classe II, CD4 e CD8 foram testados quanto à sua capacidade de inibir a atividade citotóxica. A citotoxicidade do clone de CTL contra as células SNU475 foi significativamente inibida quando o anticorpo anti-HLA-Classe I e o anticorpo anti-CD8 foram usados (Figura 21), indicando que o clone de CTL reconhece o peptídeo derivado de GCUD1 em um modo dependente de HLA-Classe I e CD8.

(21) Identificação do gene FLJ20315 comumente supra-regulado em câncer de cólon humano

Os perfis de expressão de 11 tecidos com câncer de cólon foram comparados com os tecidos não-cancerosos da mucosa do cólon correspondendo aos mesmos usando o microarranjo de cDNA contendo 23040 genes. De acordo com esta análise, os níveis de expressão de diversos genes, que eram freqüentemente elevados nos tecidos com câncer, compararam-se aos tecidos não-cancerosos correspondentes. Entre eles, um gene com um número de acesso interno de B4469 correspondendo a um EST (FLJ20315), Hs.18457 no grupo UniGene (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene/), foi supra-regulado nos tecidos com câncer comparados às mucosas não-cancerosas correspondentes em uma faixa de aumento entre 1,44 e 11,22 (Figura 22a). O FLJ20315 foi também supra-regulado em 6 dos 18 casos de câncer gástrico, 12 de 20 casos de HCC, 11 de 22 casos de câncer do pulmão (adenocarcinoma), 2 de 2 casos de seminomas testiculares e 3 de 9 casos de câncer da próstata. Para clarificar os resultados do microarranjo, a expressão destes transcritos em amostras adicionais de câncer do cólon foi examinada por RT-PCR semiguantitativa, para confirmar o aumento da expressão de FLJ20315 em 15 dos 18 tumores (Figura 22b).

(22) Expressão e Estrutura do RNF43

As buscas adicionais por homologia da seqüência de FLJ20315 em bancos de dados públicos, usando o programa BLAST no Centro Nacional para Informação de Biotecnologia (http://www.ncbi.nlm.nih.qov/BLAST/), identificaram ESTs incluindo XM_097063, BF817142 e uma seqüência genômica com um Número de Acesso do GenBank NT-010651 atribuída à banda cromossômica 17pter-p13.1. Como um resultado, foi obtida uma seqüência agrupada de 5345 nucleotídeos contendo um quadro de leitura aberto de 2352 nucleotídeos (SEQ ID NO: 5) codificando uma proteína de 783 aminoácidos (SEQ ID NO: 6) (Número de Acesso do GenBank: AB081837). O gene foi nomeado RNF43 (proteína Ring finger 43). O primeiro ATG era flanqueado por uma seqüência (AGCATGC) que se harmonizava com a seqüência de consenso para a iniciação da tradução em eucariotos, e por um códon de interrupção no quadro a montante. Uma comparação do cDNA e a seqüência genômica revelou que este gene consistia em 11 exons. A análise por northern-blot usando os northern-blots de múltiplos tecidos, com um produto da PCR de RNF43 como uma sonda, não conseguiu detectar nenhuma banda (dados não mostrados). Entretanto, um transcrito de 5,2 kb foi detectado ser expresso no pulmão fetal e no rim fetal usando um northern-blot de tecido fetal humano com o mesmo produto da PCR como uma sonda (Figura 23a). Uma busca por motivos de proteínas com a Simple Modular Architecture Research Tool (Ferramenta de Pesquisa de Arquitetura Modular Simples) (SMART, http://smart.emblheidelberq.de) revelou que a proteína predita continha um motivo de Ring finger (códons 272-312) (Figura 23b).

(23) Localização subcelularda proteína RNF43 marcada com myc

Para investigar a localização subcelular da proteína RNF43, um plasmídio expressando a proteína RNF43 marcada com myc (pDNAmyc/HisRNF43) foi transfectado de modo transiente nas células COS7. A análise por western blot usando os extratos das células e o anticorpo anti-myc revelou uma banda de 85,5 KDa correspondendo à proteína marcada (Figura 24a). A coloração imuno-histoquímica subseqüente das células com o mesmo anti corpo indicou que a proteína estava principalmente presente no núcleo (Figura 24b). Uma localização subcelular similar da proteína RNF43 foi observada nas células de câncer do cólon humano SW480.

(24) Efeito de RNF43 sobre o crescimento da célula

Um ensaio de formação de colônias foi conduzido transfectando as células NIH3T3 com um plasmídio expressando o RNF43 (pcDNARNF43). As células transfectadas com pcDNA-RNF43 produziram significativamente mais número de colônias do que as células de controle (Figura 25a). A atividade aumentada da formação de colônias pelo RNF43 foi também mostrada nas células SW480, em que a expressão endógena de RNF43 era muito baixa (dados não mostrados). Para investigar adicionalmente este efeito promotor do crescimento, foram estabelecidas as células COS7 que expressam estavelmente o RNF43 exógeno (COS7-RNF43) (Figura 25b). A taxa de crescimento das células COS7-RNF43 era significativamente maior do que aquela das células COS7-falso nos meios de cultura contendo 10% de FBS (Figura 25c).

(25) Supressão do crescimento de células de câncer do cólon por Soliqonucleotídeos anti-sentido designados para reduzirem a expressão de RNF43

Para testar se a supressão da expressão do RNF43 pode resultar no retardo do crescimento e/ou na morte celular das células de câncer do cólon, cinco pares de S-oligonucleotídeos de controle e anti-sentido correspondendo ao RNF43 foram sintetizados e transfectados nas células de câncer do cólon LoVo, que mostraram um maior nível de expressão do RNF43 entre as 11 linhagens de células de câncer do cólon examinadas. Entre os cinco S-oligonucleotídeos anti-sentido, o RNF43-AS1 significativamente suprimiu a expressão do RNF43 comparado aos S-oligonucleotídeos de controle (RNF43-S1) 12 horas após a transfecção (Figura 26a). Seis dias após a transfecção, o número de células sobreviventes transfectadas com RNF43AS1 era significativamente menor do que aquelas transfectadas com RNF43-S1, sugerindo que a supressão da expressão do RNF43 reduziu o crescimento e/ou a sobrevivência das células transfectadas (Figura 26b).

Foram obtidos resultados consistentes em três experiências independentes.

(26) Construção de plasmídeos expressando RNF43 siRNAs e o seu efeito sobre o crescimento de células de câncer do cólon

Nas células mamíferas, o RNA de pequena interferência (siRNA), composto de RNA de fita dupla (dsRNA) de 20 ou 21 meros com 19 nucleotídeos complementares e dimeros complementares 3' terminais de timidina ou uridina, foi recentemente mostrado ter um efeito silenciador de gene específico para gene sem induzir mudanças globais na expressão do gene. Portanto, os plasmídeos expressando diversos RNF43-siRNAs foram construídos para examinar o seu efeito sobre a expressão do RNF43. Entre os diversos RNF43-siRNAs, o psiH1BX-RNF16-4 e o psiH1BX-RNF1834 significativamente suprimiram a expressão do RNF43 em células SNUC4 (Figura 27A). Para testar se a supressão do RNF43 resulta na supressão do crescimento das células de câncer do cólon, as células SNUC4 foram transfectadas com psiH1BX-RNF16-4, psiH1BX-RNF1834 ou vetor falso. Em concordância com os dados dos S-oligonucleotídeos anti-sentido, o número de células viáveis transfectadas com psiH1BX-RNF16-4 ou psiHIBXRNF1834 era menor do que o número de células viáveis de controle (Figuras 27B, 27C).

(27) Secreção da proteína RNF43 marcada com Flaq em meios de culturas de células COS7 com proteína RNF43 marcada com Flaq exóqena

Visto que uma busca por motivos de proteínas com seqüência de aminoácidos de RNF43 usando a Simple Modular Architecture Research Tool (Ferramenta de Pesquisa de Arquitetura Modular Simples) (SMART, http://smart.embl-heidelberq.de) predisse um peptídeo de sinal e um domínio de ring finger, a secreção da proteína RNF43 foi examinada. O plasmídio expressando a RNF43 marcada com Flag (pFLAG-RNF43) ou a RNF43 marcada com Myc (pcDNA3.1-Myc/His-RNF43), ou o vetor falso foi transfectado nas células COS7, e as células foram cultivadas em meios suplementados com 0,5 % de soro de bezerro bovino por 48 horas. A análise por western blot com anticorpo anti-Flag ou anticorpo anti-Myc detectou RNF43 marcada com Flag ou proteína marcada com Myc secretada nos meios contendo células transfectadas com pFLAG-RNF43 ou pcDNA3.1-Myc/HisRNF43, respectivamente, porém não nos meios contendo células com o vetor falso (Figuras 28A e 28B).

(28) Efeitos dos meios de cultura de células transfectadas com pFLAGRNF43 sobre as células NIH3T3

Uma vez que a expressão exógena do RNF43 conferiu um efeito promotor do crescimento sobre as células NIH3T3, a RNF43 marcada com Flag secretada foi examinada se ela também tem um efeito proliferativo sobre as células NIH3T3. As células NIH3T3 foram cultivadas sem a alteração dos meios, ou com meios condicionados de células transfectadas com células transfectadas com falso, ou aquelas com pFlag-RNF43. Conforme esperado, as células transfectadas com pFlag-RNF43 ou pcDNA3.1-Myc/HisRNF43, cultivadas em meios condicionados, mostraram uma taxa de crescimento significativamente maior comparadas às células não tratadas ou às células transfectadas com vetor falso cultivadas nos meios condicionados (Figuras 29A e 29B). Estes dados sugerem que o RNF43 pode exercer o seu efeito promotor do crescimento em uma forma autócrina.

(29) Preparação de proteína RNF43 recombinante amino- e carboxil-terminal

Para gerar um anticorpo específico contra a RNF43, um plasmídio expressando a proteína RNF43 marcada com Nus foi construído (Figura 30A). Com a transformação do plasmídio na célula de E. coli BL21trxB(DE3)pl_ysS, foi observada a produção de uma proteína recombinante no extrato bacteriano com o tamanho esperado por SDS-PAGE (Figuras 30B e 30C).

(30) Identificação das proteínas que interagem com a RNF43 pelo sistema de exame de dois híbridos em levedura

Para clarificar o mecanismo oncogênico da RNF43, as proteínas que interagem com a RNF43 foram pesquisadas usando o sistema de exame de dois híbridos em levedura. Entre os clones positivos identificados, a NOTCH2 ou a STRIN interagiu com a RNF43 por transformação simultânea de uma célula de levedura com pAS2.1-RNF43 e pACT2-NOTCH2 (Figura 31B), ou pAS2.1-RNF43 e pACT2-STRIN (Figura 32B). As regiões respon100 sáveis pela interação em NOTCH2 e STRIN estão indicadas na Figura 31A e na Figura 32B, respectivamente.

(31) Predição dos peptídeos de ligação ao HLA-A24 derivados de RNF43

A següência de aminoácidos de RNF43 foi varrida quanto a peptídeos com um comprimento de 9 ou 10 aminoácidos, peptídeos estes que se ligam ao HLA-A24 usando o soft de predição de ligação (http://bimas.dcrt.nih.gov/cgi-bin/molbio/ken parker comboform). A Tabela 3 mostra os peptídeos preditos (SEQ ID NOs: 71-90) em ordem de alta afinidade de ligação. Vinte peptídeos no total foram selecionados e examinados conforme descrito abaixo.

Tabela 3

Peptídeos preditos de RNF43 que se ligam ao HLA-A24 (ΗΚ^7/Βίιη33.άαί.ιιίΒ.§ον/ο§ί·όίη/Σηο1ΒίοΛεη_ρατΕβιι_οοιχι1»ίοιιη)

Posição de início	Seqüência de AA (9 meros)	Afinidade de ligação	Posição de início	Seqüência de AA (10 meros)	Afinidade de ligação
RNF43-331	SYQEPGRRL	360	RNF43-449	SYCTERSGYL	200
RNF43-350	HYHLPAAYL	200	RNF43-350 HYHLPAAYLL	200
RNF43-639	LENLQKSSL	30	RNF43-718	CYSNSQPVWL	200
RNF43-24	GFGRTGLVL	20	RNF43-209	IFVULÀSVL	36
RNF43-247	RYQASCRQA	15	RNF43-313	VWTEGDSF	15
ENF43-397	RAPGEQQRL	14	RNF43-496	TFCSSLSSDF	12
RNF43-114	RAFRPCLSL	12	RNF43-81	ETMQSHELYL	12
RNF43-368	RPPRPGPFL	12	RNF43-54	KMDPTGKLNL	9
RNF43-45	EAVIRVIPL	12	RNF43-683	HyTPSVAYPW	8
BNF43-721	NSQPVWLCL	10	RNF43-282	GQELKVISCL	4

Na tabela, a posição de início indica a localização dos aminoácidos a partir da extremidade de N de RNF43.

(32) Estimulação das células T usando os peptídeos preditos

Os CTLs contra estes peptídeos derivados de RNF43 foram gerados de acordo com o método descrito no Materiais e Métodos. Os CTLs resultantes mostrando atividade citotóxica detectável foram expandidos, e as linhagens de CTL foram estabelecidas.

As atividades citotóxicas das linhagens de CTL induzidas por estimulação com peptídeos de 9 meros (SEQ ID NOs: 71-80) são mostradas na Tabela 4.

101

Tabela 4 Citotoxicidade das linhagens de CTL (9 meros)

Posição Seqüência de início de AA		Citotoxicidade		Clones de CTL estabelecidos
X20		X2
Pep(+) Pep(-)	Pep(+)	Pep(-)
RNF43-331 SYQEPGRRL	360,0	2%	1%	. 0%	0%
RNF43-350 HYHLPAAYL	200,0	26%	17%	5%	4%
RNF43-639 LFNLQKSSL	30,0	42%	33%	7%	5%	1
RNF43-24 GFGRTGLVL	20,0	8%	9%	1%	2%
RNF43-247 RYQASCRQA	15,0	71%	82%	28%	16%
BNF43-397 RAPGEQQRL	14,4	41%	32%	15%	15%
RNF43-114 RAPRPCLSL	12,0	23%	26%	6%	9%
RNF43-368 RPPRPGPFL	12,0	1%	0%	.0%	0%
RNF43-45 KAVERVIPL	12,0			NE
RNF43-721 NSQPVWLCL	10,0	68%	0%	26%	0%	13

NE = Sem estabelecimento de linhagens de CTL )

As linhagens de CTL estimuladas com RNF43-350 (HYHLPAAYL) (SEQ ID NO: 72), RNF43-639 (LFNLQKSSL) (SEQ ID NO: 73), e 5 RNF43-721 (NSQPVWLCL) (SEQ ID NO: 80) mostraram atividades citotóxicas maiores sobre o alvo que foi pulsado com os peptideos em comparação com aquelas sobre o alvo que não foi pulsado com quaisquer dos peptideos. Começando a partir destes CTLs, um clone de CTL foi estabelecido com o RNF43-639 e 13 clones de CTL foram estabelecidos com o RNF43-721.

As linhagens de CTL estimuladas com RNF43-721 mostraram uma atividade citotóxica potente sobre o alvo pulsado com os peptideos, sem mostrar qualquer atividade citotóxica significativa sobre o alvo que não foi pulsado com quaisquer dos peptideos (Figura 33).

Os resultados obtidos por exame da atividade citotóxica das li15 nhagens de CTL estimuladas com os peptideos de 10 meros (SEQ ID NOs: 81-90) são mostrados na Tabela 5.

102

Tabela 5 Citotoxicidade das linhagens de CTL (10 meros)

Posição Seqüência de início de AA	Citotoxicidade χ2ο x2 Clones de CTL Pep(+) Pep(·) Pep(+) Pep(·) estabelecidos
RNF43-449 SYCTERSGYL 200,0 RNF43-350 HYHLPAAYLL 200,0 RNF43-718 CYSNSQPVWL 200,0 RNF43-209 IFVLELASVL 36,0 RNF43-313 VFNLTEGDSF 15,0 RNF43-496 TFCSSLSSDF 12,0	1% 1% 0% 0% NE NE sem síntese sem síntese 8% 9% 0% 0%

RNF43-81 KLMQSHPLYL 12,0 10% 5% 2% -3%

RNF43-54 KMDPTGKLNL 9,6 BNF43-683 HYTPSVAYPW 8,4 RNF43-282 GQELRVISCL 8,4

5% 2% 0% -1% 0% 0% 0% -1% NE

NE = Sem estabelecimento de linhagens de CTL )

As linhagens de CTL estimuladas com RNF43-81 (KLMQSHPLYL) (SEQ ID NO: 87) ou RNF43-54 (KMDPTGKLNL) (SEQ ID NO: 88) mostraram uma atividade citotóxica modesta sobre o alvo pulsado com peptídeo, comparada com aquela sobre o alvo que não foi pulsado com quaisquer dos peptídeos.

(33) Estabelecimento dos clones de CTL

Os clones de CTL foram propagados a partir das linhagens de CTL descritas acima, usando o método de diluição limitativa. 13 clones de CTL contra RNF43-721 e 1 clone de CTL contra RNF43-639 foram estabelecidos (ver a Tabela 4 supra). A atividade citotóxica dos clones de CTL de RNF43-721 é mostrada na Figura 34. Cada clone de CTL tinha uma atividade citotóxica muito potente sobre o alvo pulsado com peptídeo, sem mostrar qualquer atividade citotóxica sobre o alvo que não foi pulsado com quaisquer dos peptídeos.

(34) Atividade citotóxica contra as linhagens de células de câncer colorretal expressando de modo endógeno o RNF43 como alvo

Os clones de CTL produzidos contra os peptídeos preditos foram examinados guanto à sua capacidade de reconhecer e matar as células de tumor gue expressam de modo endógeno o RNF43. A Figura 35 mostra os

103 resultados do Clone de CTL 45 produzido contra o RNF43-721. O Clone de CTL 45 mostrou uma atividade citotóxica potente sobre HT29 e WiDR, ambas expressando RNF43 e HLA-A24. Por outro lado, o Clone de CTL 45 não mostrou nenhuma atividade citotóxica sobre HCT116 (expressando RNF43, porém não HLA-A24) ou TISI (expressando HLA-A24, porém não RNF43). Além disso, o Clone de CTL 45 não mostrou qualquer atividade citotóxica sobre TISI e SNU-C4 pulsadas com peptídeos irrelevantes, que expressam o RNF43, porém pouco HLA-A24 (dados não mostrados).

(35) Caracterização dos CTLs estabelecidos

Um ensaio de inibição de alvo frio foi efetuado para confirmar a especificidade do Clone de CTL de RNF43-721. As células HT29 marcadas por ⁵¹Cr foram usadas como um alvo quente, enquanto as células TISI pulsadas com RNF43-721 sem a marcação por ⁵¹Cr foram usadas como um alvo frio. Quando a TISI pulsada com RNF43-721 foi adicionada no ensaio em diversas razões, a lise específica de célula contra o alvo de células HT29 foi significativamente inibida (Figura 36). Este resultado é indicado como uma percentagem de lise específica na razão de E/T de 20. Para examinar as características do clone de CTL produzido contra o peptídeo RNF43, os anticorpos contra HLA-Classe I, HLA-Classe II, CD3, CD4 e CD8 foram testados quanto à sua capacidade de inibir a atividade citotóxica do clone de CTL. A citotoxicidade do clone de CTL sobre o alvo de células WiDR foi significativamente inibida quando os anticorpos anti-HLA-Classe I, CD3 e CD8 foram usados (Figura 37). O resultado indica que o clone de CTL reconhece o peptídeo derivado de RNF43 via HLA-Classe I, CD3 e CD8.

(36) Análise da homoloqia do peptídeo RNF43-721

Os clones de CTL estabelecidos contra RNF43-721 mostraram uma atividade citotóxica muito potente. Este resultado pode indicar que a seqüência de RNF43-721 é homóloga aos peptídeos derivados de outras moléculas que são sabidas sensibilizar o sistema imunológico. Para excluir esta possibilidade, a análise da homologia do RNF43-721 foi efetuada usando BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast.cgi). Não foi encontrada nenhuma seqüência completamente igualando-se ou altamente homóloga ao

104

RNF43-721 entre as moléculas listadas na BLAST (Tabela 6).

Tabela 6

Análise da homoloqia do RNF43-721 (BLAST http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast.cgi)

Identificação (9/9)0

Identificação (8/9)0

Identificação (7/9)0

Identificação (6/9)2

Estes resultados indicam que a seqüência de RNF43-721 é única e há pouca possibilidade para os clones de CTL estabelecidos com RNF43-721 produzirem resposta imunológica a outras moléculas.

(37) Modificação do RNF43-721 para aperfeiçoar a eficácia da apresentação do epítopo

Para aperfeiçoar a eficácia da apresentação do epítopo, o peptídeo RNF43-721 foi modificado em alternações dos aminoácidos sobre o lado de apoio. A modificação foi esperada aperfeiçoar a afinidade de ligação do peptídeo à molécula de HLA Classe I. A Tabela 7 demonstra uma melhor afinidade de ligação do RNF43-721 à molécula de HLA-A24 com alternações dos aminoácidos na posição 2 (SEQ ID NOs: 91 e 92)

Tabela 7

Capacidades de ligação preditas dos peptídeos modificados a partir do

peptídeo nativo RNF43-721
Seqüência	Escore	Ordem
NSQPVWLCL	10,08	10
NFQPVWLCL	50,40	3
NYQPVWLCL	504,00	1

* = Nos peptídeos de 9 meros restritos à HLA-A24) (38) Predição dos peptídeos candidatos derivados de RNF43

A Tabela 8 mostra os peptídeos candidatos (SEQ ID NOs: 87, e

93-111) em ordem de alta afinidade de ligação.

105

Tabela 8

RNF43: Predição dos peptídeos de epítopos (HLA-A*0201)

9 meros	10 meros
5	N⁹ 1	Posição de Seqüências	Escore 274,3	N⁹ 11	Posição de Seqüência iniciação	Escore 1521,5
iniciação 60	KLNLTLEGV
81	KLMQSHPLYL
	2	8	QLAALWPWL 199,7	12	357	YLLGPSRSAV	1183,7
	3	82	LMQSHPLYL	144,2	13	202	LMTVVGTIFV	469_r6
	4	358	LLGPSRSAV	118,2	14	290	CLHEFIERNCV	285,1
	5	11	ALWPWLLMA	94,8	15	500	SLSSDFDPLV	264,2
	6	15	WLLMATLQA	84,5	16	8	QLAAIWPWLL	160,2
					17	11	ALWPWLLMAT	142,2
	7	200	WILMTVVGT	40,1
					18	7	LQLAALWPWL	127,3
	8	171	KLMEFVYKN	34,5
					19	726	WLCLTPRQPL	98,2
	9	62	NLTLEGVFA	27.3
					20	302	WLHQHRTÇPL	98,2
	10	156	GLTWPWLI	23,9

Vinte peptídeos no total foram selecionados e examinados conforme descrito abaixo.

(39) Estimulação das células T usando os peptídeos candidatos

As células linfóides foram cultivadas usando os peptídeos candi10 datos derivados de RNF43 de acordo com o método descrito nos Materiais e Métodos. As células linfóides resultantes mostrando atividade citotóxica detectável foram expandidas, e as linhagens de CTL foram estabelecidas. As atividades citotóxicas das linhagens de CTL induzidas pela estimulação usando peptídeos de 9 meros (SEQ ID NOs: 93-102) são mostradas na Ta15 bela 9.

106

Tabela 9

Citotoxicidade das linhagens de CTL (HLA-A*0201 9 meros)

Posição de Seqüência Afinidade de Citotoxicidade (%)
início	de AA ligação	X20	X2
Pep(+) Pep(-)	Pep(+) Pep(-)
RNF43-60	KLNLTLEGV	274,3	2,1	0,2	-1,6	0,0
RNF43-8	QLAALWPWL 199,7	3,5	0,0	0,0	1,0
RNF43-82	LMQSHPLYL	144,2	1,7	1,2	0,0	-0,4
RNF43-358	LLGPSRSAV	118,2	-0,4	-0,7	0,0	-0,8
RNF43-11	ALWPWLLMA	94.8	90,2	¥	45.4	-14
RNF43-15	WLLMATLQA	84,5	-0,2	o_to	-0,4	v
RNF43-200	WILMTVVGT	40,1		Sem síntese
RNF43-171	KLMEFVYKN	34,5	2,6	0,0	1,1	-0,5
RNF43-62	NLTLEGVFA	27,3		Sem síntese
RNF43-156	GLTWPVVLI	23,9	-0_t4	0,7	-0,5	-0,3

NE = Sem estabelecimento de linhagens de CTL)

As linhagens de células induzidas com RNF43-11-9 (ALWPWLLMA) (SEQ ID NO: 97) mostraram maiores atividades citotóxicas sobre o alvo pulsado com peptideos, comparadas com aquelas sobre o alvo que não foi pulsado com quaisquer dos peptideos. Começando a partir destes CTLs, quatro clones de CTL foram estabelecidos com o RNF43-11-9. A 10 linhagem de CTL estimulada com o RNF43-11-9 mostrou uma atividade citotóxica potente sobre o alvo pulsado com peptídeo, sem mostrar qualquer atividade citotóxica significativa sobre o alvo que não foi pulsado com quaisquer dos peptideos (Figura 38A).

Os resultados do exame sobre a atividade citotóxica das linha15 gens de CTL induzidas com os peptideos de 10 meros (SEQ ID NOs: 87, e 103-111) são mostrados na Tabela 10.

107

Tabela 10

Citotoxicidade das linhagens de CTL (HLA-A*0201 10 meros) o ·- · citotoxicidade (%)

Posição de Sequencia Afinidade ....................^v.---início de AA de ligação X2O__X2

Pep(+) Pep(-) Pep(+) Pep(-)

RNF43-81	KLMQSHPLYL	1521,5	18,0	27,6	6,3	8/3
RNF43-357	YLLGPSRSAV	1183,7	18,2	15,4	3,7	3,0
RNF43-202	LMTVVGTIFV	469,6		Sem síntese
RNF43-290	CLHEFHRNCV	285,1	9,6	9,7	2,7	3,7
RNF43-500	SLSSDFDPLV	264,2		NE
RNF43-8	QLAAIWPWLL	160,2	6_r7	9,0	1.1	1,3
RNF43-11	ALWPWLLMAT	142.2	91.5	27.1	40,5	4^
RNF43-7	LQLAALWPWL	127,3		NE
RNF43-726	WLCLTPRQPL	98/2		NE
RNF43-302	WLHQHRTCPL	98^	7,4	6,1	1,5	2,2

NE = Sem estabelecimento de linhagens de CTL )

As linhagens de CTL induzidas com RNF43-11-10 (ALWPWLLMAT) (SEQ ID NO: 108) mostraram uma atividade citotóxica maior sobre o alvo pulsado com peptídeos, comparadas com aquela sobre o alvo que não foi pulsado com quaisquer dos peptídeos (Figura 38B).

(40) Estabelecimento dos clones de CTL

Os clones de CTL foram propagados a partir das linhagens de CTL descritas acima, usando o método de diluição limitativa. Quatro clones de CTL contra RNF43-11-9 foram estabelecidos (ver a Tabela 9 supra). A atividade citotóxica dos clones de CTL derivados dos peptídeos RNF43 é mostrada nas Figuras 39A e 39B. Cada clone de CTL tinha uma atividade citotóxica muito potente sobre o alvo pulsado com peptídeos, sem mostrar qualquer atividade citotóxica sobre o alvo que não foi pulsado com quaisquer dos peptídeos.

(41) Atividade citotóxica contra as linhagens de células de câncer colorretal expressando de modo endóqeno o RNF43 como alvo

Os clones de CTL produzidos contra os peptídeos preditos foram examinados quanto à sua capacidade de reconhecer e matar as células de tumor que expressam de modo endógeno o RNF43. A Figuras 40A e 40B

108 mostram os resultados obtidos para os clones de CTL produzidos contra os peptídeos derivados de RNF43. Os Clones de CTL mostraram uma atividade citotóxica potente sobre DLD-1, que expressa RNF43 e HLA-A*0201, porém nada sobre HT29, que expressa RNF43, porém não HLA-A*0201.

(42) Especificidade dos clones de CTL

Um ensaio de inibição de alvo frio foi efetuado para confirmar a especificidade do Clone de CTL de RNF43-5-11(9 meros). As células HCT116 marcadas com ⁵¹Cr foram usadas como um alvo quente, enquanto as células TISI pulsadas com RNF43-5 sem a marcação com ⁵¹Cr foram usadas como um alvo frio. A lise específica de célula do alvo de células HCT-116 foi significativamente inibida, quando a T2 pulsada com RNF43-5 foi adicionada no ensaio em diversas razões (Figura 41).

Aplicabilidade Industrial

A expressão dos novos genes humanos CXADRL1 e GCUD1 é marcadamente elevada no câncer gástrico em comparação com os tecidos do estômago não-cancerosos. Por outro lado, a expressão do novo gene humano RNF43 é marcadamente elevada nos cânceres colorretais em comparação com os tecidos não-cancerosos da mucosa. Desse modo, estes genes podem servir como um marcador diagnóstico de câncer e as proteínas codificadas desse modo podem ser usadas em ensaios diagnósticos de câncer.

Os presentes inventores também mostraram que a expressão da nova proteína CXADRL1, GCUD1, ou RNF43 promove o crescimento da célula, enquanto que o crescimento da célula é suprimido por oligonucleotídeos anti-sentido ou RNAs de pequena interferência correspondendo ao gene CXADRL1, GCUD1, ou RNF43. Estas verificações sugerem que cada uma das proteínas CXADRL1, GCUD1, e RNF43 estimula a atividade oncogênica. Assim, cada uma destas novas oncoproteínas é alvos úteis para o desenvolvimento de substâncias farmacêuticas anticâncer. Por exemplo, os agentes que bloqueiam a expressão de CXADRL1, GCUD1, ou RNF43, ou impedem a sua atividade podem encontrar utilidade terapêutica como agentes anticâncer, particularmente agentes anticâncer para o tratamento de

109 cânceres gástricos e colorretais. Os exemplos de tais agentes incluem os oligonucleotídeos anti-sentido, os RNAs de pequena interferência, e os anticorpos que reconhecem CXADRL1, GCUD1, ou RNF43.

Além disso, os presentes inventores mostraram que o CXADRL1 interage com a AIP1. É esperado que a atividade de proliferação de células do CXADRL1 seja regulada por sua ligação à AIP1. Assim, agentes que inibem a atividade da formação de um complexo composto de CXADRL1 e AIP1 podem também encontrar utilidade no tratamento e na prevenção de câncer, especialmente os cânceres colorretais, do pulmão, gástricos, e do fígado. Alternativamente, os presentes inventores mostraram que o RNF43 interage com NOTCH2 e STRIN. É esperado que a atividade de proliferação de células do RNF43 seja regulada por sua ligação à NOTCH2 ou à STRIN. Assim, agentes que inibem a atividade da formação de um complexo composto de RNF43 e NOTCH2 ou STRIN podem também encontrar utilidade no tratamento e na prevenção de câncer, especificamente os cânceres colorretais, do pulmão, gástricos, e do fígado.

Embora a invenção tenha sido descrita em detalhe e com referência a modalidades específicas da mesma, será aparente para alguém versado na técnica que diversas alterações e modificações podem ser feitas nesta, sem sair do espírito e do escopo da invenção.

Claims

REIVINDICAÇÃO

1. Composição farmacêutica para o tratamento de câncer, caracterizada pelo fato de que compreende um polipeptídeo consistindo na sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO:

5 80, 97 e 108, em combinação com o adjuvante incompleto de Freund.