WO2022216113A1 - 면역관문억제제를 이용한 암 치료방법 - Google Patents

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Definitions

  • the present invention relates to a cancer treatment method using an immune checkpoint inhibitor, and more specifically, by confirming the expression of an immune checkpoint protein and a lymphoid or myeloid cell-specific protein in circulating tumor cells isolated from blood, the immune checkpoint protein expression is positive. And it relates to a method of treating cancer by selecting a patient whose lymphatic or myeloid cell-specific protein expression is positive as a patient to which an immunotherapy is applicable, and administering an immune checkpoint inhibitor to the patient.
  • Cancer is one of the most deadly threats to human health. In the United States, cancer affects nearly 1.3 million new patients each year and is the second leading cause of death after heart disease, with 1 in 4 deaths. In addition, cancer is expected to surpass cardiovascular disease as the number one cause of death within 5 years. Solid tumors account for the majority of these deaths.
  • companion diagnostics which means an approved diagnosis that can select an appropriate target anticancer drug and treatment method, based on the systematic analysis result of the patient's individual factors.
  • Companion diagnosis can present a clear clinical rationale for prescription according to the doctor's diagnosis, and can provide appropriate treatment to the patient, thereby increasing cancer treatment efficiency and reducing the misuse of targeted anticancer drugs, thereby improving the financial soundness of the national health insurance. can also contribute.
  • the companion diagnosis market is growing in the treatment fields of breast cancer, lung cancer, colorectal cancer, stomach cancer, and melanoma, and in particular, the breast cancer and lung cancer fields are expected to lead the market growth.
  • the global market for companion diagnostics is growing at a high growth rate every year as pharmaceutical companies reduce the cost of developing new drugs and increase the demand for targeted therapies.
  • immunotherapy uses the patient's own immune system to attack the cancer regardless of its origin.
  • the immune system is regulated by a network of checks and balances that have evolved to attack foreign invaders such as bacteria and viruses.
  • cancer can evade the immune system by expressing proteins that inhibit it from attacking cancer cells, such as PD-L1 and PD-L2.
  • the interaction between tumor cells and T cells involves contact between the major histocompatibility complex (MHC) on the tumor cell and the T cell receptor (TCR) on the T cell.
  • MHC major histocompatibility complex
  • TCR T cell receptor
  • tumor cells express the immune checkpoint protein PD-L1 on their surface, it can evade T cell immunosurveillance.
  • PD-L1 binds to PD-1 expressed by T cells and inhibits T cell immunosurveillance by blocking T cell activation.
  • Immune checkpoint inhibitors that can block the PD-L1/PD-1 interaction have been developed.
  • the drug allows the T cell immunosurveillance mechanism to function normally again, so that the tumor cells can be destroyed through a normal immune response in the subject.
  • Blockade of CTLA-4 on T cells may have a similar effect (Hodi et al., N. Engl. J. Med. Vol. 363, pp. 711-23, 2010).
  • checkpoint inhibitors The secret to the effective use of checkpoint inhibitors is to determine whether a particular subject with cancer responds to the drug. If PD-L1 or an antibody that binds to PD-1 and acts as an immune checkpoint inhibitor is administered to a patient whose tumor cells do not express PD-L1, the treatment will be ineffective. To date, the reactivity of these checkpoint inhibitors is only 20-30% so far (Herbst RS, et al. The New England journal of medicine. Vol. 383(14), pp. 1328-39, 2020).
  • TPS tumor proportion score
  • a liquid biopsy comprising circulating tumor cells (CTC), circulating cell free DNA (cfDNA) and exosomes has recently attracted attention as a new solution (Rijavec E, et al. al., Cancers. Vol. 12(1):17, 2020).
  • Blood-based biopsy is an improvement over tissue biopsy in that cells dissociated or otherwise separated by a tumor can be followed sequentially in real time.
  • Circulating tumor cells are one of the cancer-associated cell types that can be readily isolated from peripheral blood and can be used as a replacement for tumor cells obtained from tissue biopsies.
  • CTCs are tumor cells that have isolated into the bloodstream from a solid tumor.
  • CTCs can be found in the blood of patients with carcinoma, sarcoma, neuroblastoma, and melanoma. Identification of additional cell types that can be obtained from blood-based biopsies will be important in further developing the use of this technology to identify cancer patients for whom treatment with checkpoint inhibitors would be beneficial.
  • the present inventors made diligent efforts to develop a CTC-based cancer treatment method.
  • the expression of the immune checkpoint protein and the lymphatic system or immune system cell-specific protein was simultaneously confirmed, and the expression of the immune checkpoint protein was positive, and the lymphatic system
  • the immune checkpoint inhibitor is administered to a patient with positive immune system cell-specific protein expression, it was confirmed that the same level of cancer treatment effect as that of the biopsy was obtained without performing the biopsy, and the present invention was completed.
  • Another object of the present invention is to provide a method for treating cancer.
  • Another object of the present invention is to provide a method for determining sensitivity to immune checkpoint inhibitors.
  • Another object of the present invention is to provide a method for selecting immunotherapy for cancer patients.
  • the present invention comprises the steps of (a) confirming the expression of an immune checkpoint protein and a lymphatic or myeloid-specific protein in the isolated circulating cancer cells; and (b) classifying a patient whose immune checkpoint protein expression is positive and the lymphatic system or myeloid system-specific protein expression is confirmed as positive to a patient to which the immunotherapy can be applied.
  • the present invention also relates to the present invention.
  • the present invention also relates to the present invention.
  • the sensitivity to the immune checkpoint inhibitor comprising the step of determining that there is a sensitivity to the immune checkpoint inhibitor ( susceptibility) decision method is provided.
  • the present invention also relates to the present invention.
  • the present invention also relates to the present invention.
  • compositions for the treatment of cancer comprising an immune checkpoint inhibitor for treating an individual having positive immune checkpoint protein expression and positive lymphatic or myeloid-specific protein expression.
  • the present invention also provides the use of an immune checkpoint inhibitor for the manufacture of a therapeutic agent for treating a subject having positive immune checkpoint protein expression and positive lymphatic or myeloid-specific protein expression.
  • 1 is a fluorescence image of circulating tumor cells expressing EpCAM/Vimentin, PD-L1 and CD18 proteins confirmed according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 is an image of measuring fluorescence intensities of EpCAM/Vimentin, PD-L1 and CD18 proteins in circulating tumor cells identified according to an embodiment of the present invention.
  • FIG 3 is a fluorescence image (A) confirming the expression of CD16 and CD18 in a patient's blood sample according to an embodiment of the present invention (A) and a graph (B) quantifying the same.
  • first, second, A, and B may be used to describe various components, but the components are not limited by the above terms, and only for the purpose of distinguishing one component from other components.
  • a first component may be named as a second component, and similarly, the second component may also be referred to as a first component without departing from the scope of the technology to be described below. and/or includes a combination of a plurality of related listed items or any of a plurality of related listed items.
  • each process constituting the method may occur differently from the specified order unless a specific order is clearly described in context. That is, each process may occur in the same order as specified, may be performed substantially simultaneously, or may be performed in the reverse order.
  • antibody is used in the broadest sense, and monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, multispecific antibodies (eg, bispecific antibodies) and antibody fragments as long as they exhibit the desired antigen-binding activity. includes, but is not limited to, various antibody structures.
  • Biomarker refers to an indicator that can be detected in a sample. Biomarkers can serve as predictive, diagnostic and/or prognostic indicators of a disease or disorder (eg, cancer), characterized by specific molecular, pathological, histological and/or clinical features.
  • a disease or disorder eg, cancer
  • cancer and “cancerous” refer to or describe the physiological condition of mammals that is typically characterized by uncontrolled cell growth. Examples of cancer include carcinoma, lymphoma, blastoma, sarcoma and leukemia or lymphoma.
  • lung cancer including small cell lung cancer, non-small cell lung cancer, lung adenocarcinoma and squamous cell carcinoma of lung; bladder cancer (such as urinary bladder cancer (UBC), muscle invasive bladder cancer (MIBC) and BCG-refractory non-muscle invasive bladder cancer (NMIBC); kidney or kidney cancer (e.g., renal cell carcinoma (RCC)); urinary tract cancer; breast cancer (e.g., estrogen receptor ( HER2+ breast cancer and triple-negative breast cancer (TNBC)) negative for ER-), progesterone receptor (PR-) and HER2 (HER2-); prostate cancers such as castration-resistant prostate cancer (CRPC); peritoneal cancer; hepatocellular carcinoma; gastrointestinal cancer gastric or gastric cancer, including cancer and gastrointestinal stromal cancer; Thyroid cancer; liver carcinoma; anal carcinoma; penile carcinoma; superficial dilated melanoma, lentigo malignant melanoma
  • UBC urinary bladder cancer
  • MIBC muscle invasive bladder cancer
  • the terms "treat,” “treating” and “treatment” have their general and conventional meaning, which refers to the complete or partial removal of a tumor or cancer from a subject, the size of the tumor in the subject. shrinking the tumor, killing the tumor or cancer cells in the subject, and ameliorating the symptoms of the cancer or tumor in the subject.
  • treatment means to eliminate, reduce, kill, or ameliorate by about 1% to about 100% compared to a subject not receiving the checkpoint inhibitor.
  • removing, reducing, killing or ameliorating is about 100%, about 99%, about 98%, about 97%, about 96%, about 95%, about 90%, about 80%, about 70%, about 60%.
  • Treatment results can be permanent, or can be several days (eg 1, 2, 3, 4, 5, 6 or 7 days) weeks (eg 1, 2, 3 or 4 weeks), months (eg 1, 2, 3, 4, 5, 6 months or longer) or several years (eg 1, 2, 3, 4, 5, 6 years or longer).
  • days eg 1, 2, 3, 4, 5, 6 or 7 days
  • weeks eg 1, 2, 3 or 4 weeks
  • months eg 1, 2, 3, 4, 5, 6 months or longer
  • years eg 1, 2, 3, 4, 5, 6 years or longer.
  • the terms "inhibit,” “inhibiting” and “inhibition” have their general, conventional meanings, which include the establishment of cancer or tumors, the development of cancer or tumors, the growth and metastasis of cancer or tumors. inhibiting, delaying, blocking, impeding, or restraining the progression thereof.
  • inhibition is meant interfering by about 1% to about 100% compared to a subject not receiving the checkpoint inhibitor.
  • the interference is about 100%, about 99%, about 98%, about 97%, about 96%, about 95%, about 90%, about 80%, about 70%, about 60%, about 50%, about 40%, about 30%, about 20%, about 10%, about 5% or about 1%.
  • the method of suppression may be performed in the subject before, concurrently with, or after the onset of clinical symptoms of the cancer or tumor.
  • a subject may be a subject suffering from cancer or a tumor, or may merely be a subject prone to developing cancer or a tumor.
  • the results of inhibition can be permanent, or several days (eg 1, 2, 3, 4, 5, 6 or 7 days) weeks (eg 1, 2, 3 or 4 weeks), months (eg 1, 2, 3, 4, 5, 6 months or more) or several years (eg 1, 2, 3, 4, 5, 6 years or more).
  • the term “administration” refers to a method of providing a dose of a compound or composition.
  • the compounds and/or compositions used in the methods described herein can be administered intravenously (eg, intravenously). by injection), subcutaneously, intramuscularly, intradermally, transdermally, intraarterially, intraperitoneally, intralesional , rectal, topically, intratumorally, intraperitoneally, subconjunctivally, intravesically, mucosally, intrapericardially, intraumbilical cord, intraocularly, orally, topically, topically, by inhalation, by injection , by infusion, by continuous infusion, by localized perfusion that directly bathes the target cells, by catheter, by lavage, in a cream, or in a lipid composition. (eg, the compound or composition being administered and the severity of the condition, disease or disorder being treated).
  • Immune checkpoint inhibitors, and pharmaceutical formulations comprising immune checkpoint inhibitors may depend upon the particular goal or purpose of the method; the age and size of the subject; and different schedules depending on the subject's general health status.
  • checkpoint inhibitors and pharmaceutical agents may be administered once, or 2, 3, 4, 5, 6 or more times over the course of treatment or inhibition.
  • the timing between each dosing in the dosing schedule can range from days, weeks, months or years, and can range from every 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, once every 30 weeks or longer.
  • the same amount of the immune checkpoint inhibitor may be administered at each dose of the dosing schedule, or the amount at each dose may vary.
  • the identity of the immune checkpoint inhibitor at each dosing in the dosing schedule may also vary, or may remain the same.
  • an immune checkpoint inhibitor or a pharmaceutical formulation comprising an immune checkpoint inhibitor, is administered to the subject in a “therapeutically effective amount”.
  • a therapeutically effective amount will vary from subject to subject. However, a therapeutically effective amount is an amount sufficient to achieve the goal or purpose of the method, regardless of whether it is intended to inhibit or treat.
  • a therapeutically effective amount of the checkpoint inhibitor used in the methods of the present invention is typically from about 0.1 ⁇ g to about 10,000 ⁇ g of the checkpoint inhibitor per kg body weight of a subject receiving the peptide.
  • a therapeutically effective amount also includes about 0.5 ⁇ g to about 5,000 ⁇ g, about 1 ⁇ g to about 500 ⁇ g, about 10 ⁇ g to about 200 ⁇ g, about 1 ⁇ g to about 800 ⁇ g, about 10 ⁇ g to about 5,000 ⁇ g of the checkpoint inhibitor per kg body weight of the subject.
  • targeted anticancer drugs can be treated according to specific genetic tests such as EGFR, ALK, and ROS1.
  • specific genetic tests such as EGFR, ALK, and ROS1.
  • cancer cells cannot be collected even if a biopsy is performed because fibrosis occurs in the surrounding area.
  • a biomarker that can exhibit the same diagnostic effect as a biopsy only with a blood test was developed in a patient who is difficult to perform such a biopsy. When confirmed, it was confirmed that immunotherapy can be selected with high accuracy.
  • the expression of the protein "positive” means that the presence of the protein in the circulating cancer cells in the blood is confirmed by various methods known to those skilled in the art, preferably by fluorescence intensity, but is not limited thereto. it is not
  • the determination of the protein expression as positive is based on a specific cut-off value in consideration of the number of cells in which each or both of the proteins are expressed, and the intensity (intensity of fluorescence) of expression for each protein. Or it can be determined through the expression level is high or low compared to the reference population, but is not limited thereto.
  • the expression "negative" of the protein means that the presence of the protein in the blood circulating cancer cells is not confirmed by various methods known to those skilled in the art, and preferably can be confirmed by fluorescence intensity, It is not limited.
  • the determination of the protein expression as negative is based on a specific cut-off value in consideration of the number of cells in which each or all of the protein is not expressed, and the intensity (intensity of fluorescence) of expression for each protein. It can be judged as, or can be judged by the expression level is high or low compared to the reference population, but is not limited thereto.
  • the immune checkpoint protein can be used without limitation as long as it is a protein involved in the immune checkpoint-related signaling pathway, preferably, CD27, CD28, CD40, CD122, CD137, OX40, GITR, ICOS, A2AR, B7. It may be selected from the group consisting of -H3, BY-H4, CTLA-4, IDO, KIR, LAG3, NOX2, PD-1, PD-L1, TIM-3, VISTA and SIGLEC7, more preferably PD-1 , PD-L1 and CTLA-4 may be selected from the group consisting of, and most preferably, PD-L1, but is not limited thereto.
  • the lymphatic or myeloid-specific protein can be used without limitation as long as it is a protein expressed in lymphoid or myeloid cells, preferably, CD18, CD29, CD61, CD104, ITGB5, ITGB6, ITGB7, ITGB8, CD49a, CD49b, CD49c, CD49d, CD49e, CD49f, ITGA7, ITGA8, ITGA9, ITGA10, ITGA11, CD11D, CD103, CD11a, CD11b, CD51, CD41, CD11c, CD64, CD32, CD16a, CD16b, CD23, CD89, FcRn, It may be selected from the group consisting of Fc ⁇ RI and Fc ⁇ / ⁇ R, more preferably CD18, CD16, CD29, CD61, CD104, CD32, CD11b and CD64, and most preferably CD18. , but is not limited thereto.
  • the separated blood circulating cancer cells may be isolated by performing the following steps:
  • the circulating tumor cells refers to tumor cells found in the peripheral blood of a malignant tumor patient. Circulating cancer cells in the blood are very rare and the number of samples available is very limited. Techniques in the detection and characterization of circulating cancer cells in the blood include, but are not limited to, multiple reverse transcription quantitative polymerase chain reaction methods, imaging-based approaches, and microfiltration and microchip devices. Circulating cancer cells in the blood can serve as tumor biological markers that inevitably provide individualized treatment and follow-up after treatment as a liquid biopsy specimen. In addition, circulating cancer cells in the blood can be used as targets to understand the biological properties of tumors and the dissemination of tumor cells, but are not limited thereto.
  • the biochip is a conventional semiconductor chip form by integrating and combining materials such as DNA, proteins, enzymes, antibodies, microorganisms, animal and plant cells and organs, and nerve cells derived from living organisms on a solid substrate made of an inorganic material such as a semiconductor at a high density. It refers to a tool or device that uses the unique functions of biomolecules and obtains biological information such as gene expression pattern, gene binding, protein distribution, or increases the speed of biochemical processes and reaction or information processing.
  • the high-density microchip refers to a biochip capable of separating materials of a specific size based on the working principle of the biochip.
  • the high-density microchip is based on the difference in the size of blood cells and can capture circulating cancer cells in the blood with a recovery rate of about 90% within 10 minutes.
  • the pore size of the high-density microchip may be preferably 5.5 to 8.5 ⁇ m, more preferably 6.5 to 7.5 ⁇ m. If the pore size is smaller than 5.5 ⁇ m, red blood cells and white blood cells do not pass through the chip and get stuck on the chip and cannot be removed. Cancer cells pass through the chip, making it impossible to selectively recover circulating cancer cells in the blood.
  • the shape of the pores of the high-density microchip may be a circular shape, a rectangular shape, or an elliptical shape, and preferably a rectangular shape.
  • the pores of the high-density microchip may be arranged in a regular pattern.
  • the high-density microchip may be specifically made of stainless steel, nickel, aluminum, or copper.
  • the pores may be formed by etching using MEMS (Micro-electro Mechanical Systems) technology.
  • the gap between two adjacent pores among the pores is narrower than the diameter of the cancer cells circulating in the blood.
  • the gap between the two pores may be formed to be 45 to 65% of the diameter of the circulating cancer cells in the blood.
  • the high-density microchip is not deformed by the pressure of blood or solution flowing through the passage. After passing through the pores, the blood is discharged to the outside, and the cancer cells circulating in the blood do not pass through the pores and remain on the surface.
  • Non-target cells i.e., red blood cells with a higher strain rate than circulating cancer cells in the blood, easily pass through the pores.
  • the blood circulating cancer cells can be discharged outside by supplying the solution in a reverse or forward direction.
  • the solution may be supplied in the reverse direction to minimize damage to the circulating cancer cells in the blood.
  • the solution may be supplied by a syringe, a syringe pump, a plunger pump, or the like.
  • the solution may be composed of a diluent for diluting blood, water, and an acid for dilution.
  • the blood circulating cancer cells discharged to the outside by the supply of the solution can be collected in a container, for example, a test tube, a culture dish, and the like, and can be easily collected.
  • circulating cancer cells in the blood with a diameter of 7.5-15 ⁇ m pass through a tube with a diameter of 8 ⁇ m when a pressure of about 100 mmHg is applied.
  • Circulating cancer cells in the blood with a diameter of 15 ⁇ m that pass through a tube with a diameter of 8 ⁇ m have a strain rate of about 53%.
  • the distance between the two pores should be less than 4 ⁇ m, considering the strain rate of the circulating cancer cells in the blood. desirable.
  • the diameter of the cancer cells reaches about 40 ⁇ m.
  • the strain rate of circulating cancer cells in the blood with a diameter of 40 ⁇ m during backwashing it is preferable to set the distance between the two pores to be 21 ⁇ m or less.
  • the cancer cells circulating in the blood may not fall off the surface while being deformed by the flow of the solution.
  • cancer cells with a diameter of 40 ⁇ m may not fall off from the surface between the two pores with an interval of more than 21 ⁇ m.
  • the interval between the two pores is 45 to 65% of the diameter of the circulating cancer cells in the blood. Circulating cancer cells in the blood with a diameter of 7.5 ⁇ m may not be removed from the surface between the two pores by backwashing when the spacing exceeds 65%, that is, about 4.9 ⁇ m. Circulating cancer cells in the blood with a diameter of 40 ⁇ m may not be removed from the surface between the two pores by backwashing when the spacing exceeds 65%, that is, exceeds 26 ⁇ m.
  • the pressure of the solution is increased to forcibly remove the circulating cancer cells in the blood adhering to the surface between the two pores, damage to the circulating cancer cells in the blood occurs and the collection rate of the living circulating cancer cells in the blood is lowered. If the distance between 7.5 ⁇ m in diameter and circulating cancer cells in the blood is less than 45%, that is, less than about 3.375 ⁇ m, there is a high possibility that the high-density microchip will be damaged by the flow of blood and solution.
  • the sample may be repeatedly passed through the high-density microchip. Specifically, after the blood circulating cancer cells are separated from the high-density microchip once, the separated blood-circulating cancer cells may be loaded into the high-density microchip once again to be separated, and the separation process may be repeated.
  • separation of circulating cancer cells through the high-density microchip is not performed by applying a specific artificial pressure after loading a solution containing circulating cancer cells into the high-density microchip, but by using gravity. Isolation of circulating cancer cells can be achieved. Separation of circulating cancer cells through the high-density microchip according to the present invention minimizes damage caused by artificial pressure to circulating cancer cells in the blood, thereby maintaining the state in the patient's body.
  • the high-density microchip is used to minimize damage to circulating cancer cells in the blood by the high-density microchip when the circulating cancer cells in the blood are separated or to make the high-density microchip more efficient for repeated use.
  • it may be coated with a specific material to make the recovery rate of circulating cancer cells in the blood more efficient.
  • the specific substance may be an antibody capable of specifically binding to cancer cells circulating in the blood, and may be a biomaterial that does not physically or chemically damage cells.
  • the specific substance may be BSA (Bovine Serum Albumin) or an antibody.
  • the antibody may be composed of, for example, an anti-Epithelial Cell Adhesion Molecule antibody (Anti-EpCAM antibody), an anti-Cytokeratin antibody (Anti-Cytokeratin antibody, Anti-CK antibody), and the like.
  • the specific substance may be BSA (Bovine Serum Albumin).
  • the BSA (Bovine Serum Albumin) solution refers to bovine serum albumin. It is a protein with a molecular weight of about 66.4 kDa and is abundantly present in most animals. BSA can be added as a nutrient for cells during cell culture in biochemistry/biology, and is often used as a standard for obtaining a calibration curve in protein quantification. It may be added to supplement the protein concentration in the solution. And before attaching a protein to detect a specific antibody in various biochemical experiments (Western blot, Immunocytochemistry, ELISA, etc.) It can also be used to block.
  • the separation using the high-density microchip may be performed by gravity, specifically, at an atmospheric pressure of 1000 to 1020 hPa. Preferably, it may be made at an atmospheric pressure of 1000 to 1015 hPa. More preferably, it may be made at an atmospheric pressure of 1000 to 1013 hPa.
  • the BSA solution may be coated on the upper surface, the lower surface, or the inner surface of the pores of the high-density microchip. Preferably, it may be coated on both the upper and lower surfaces of the high-density microchip and the inner surface of the pores.
  • the BSA solution coating may be made at a concentration of 0.05 to 0.15%. According to a preferred embodiment of the present invention, the BSA solution coating may be made at a concentration of 0.08 to 0.012%.
  • the BSA solution coating may be treated for 5 to 15 minutes. According to a preferred embodiment of the present invention, the BSA solution coating may be treated for 8 to 12 minutes.
  • the expression of the immune checkpoint protein and the lymphatic or myeloid-specific protein may be characterized by performing the following steps:
  • a fluorescent marker that specifically binds to circulating cancer cells in the blood a fluorescent marker that specifically binds to an immune checkpoint protein; and reacting with a fluorescent label that specifically binds to lymphoid or myeloid-specific proteins;
  • the fluorescent marker that specifically binds to the circulating cancer cells in the blood refers to a fluorescent material that can specifically bind to the circulating cancer cells themselves or to substances present inside or outside the blood circulating cancer cells.
  • a fluorescent marker capable of identifying circulating cancer cells in the blood may specifically bind to a cell nucleus or specifically bind to proteins, DNA, RNA, etc. existing inside and outside the cell.
  • DAPI can be used as a fluorescent marker in the cell nucleus
  • a fluorescent marker that specifically binds to vimentin, an intermediate filament protein can be used
  • epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) and A fluorescent marker that specifically binds to CK (cytokeratin) may be used, and a fluorescent marker that specifically binds to CD45 used as a means of removing non-target cells may be used.
  • the fluorescent marker that specifically binds to circulating cancer cells in the blood may be composed of nucleotides, oligonucleotides, peptides, polypeptides, nucleic acids or proteins, and may be proteins composed of antibodies.
  • the fluorescent marker that specifically binds to the circulating cancer cells in the blood can be any substance that specifically binds to the circulating cancer cells in the blood and makes it identifiable.
  • the optical image may be generated by an imaging system.
  • the imaging system may be a cell imaging system, and the cell imaging system is, for example, a system for placing stained cells on a platform such as a slide glass and observing and photographing the cells at various wavelengths.
  • the cell imaging system may include an automatic cell counting module, a fluorescence intensity analysis module, and a cytology-based cell classification/cognition module.
  • a measurement function, a report automatic generation function, and a DB management function may be included as a user interface.
  • Such a cell imaging system includes a digital image analysis equipment for distinguishing cells, culture medium, debris, etc., and for determining and counting cells desired by a user.
  • the cell imaging system according to an embodiment of the present invention can accurately identify and count fluorescently-labeled or marker-bound target cells from an optical image.
  • the optical image may be an optical image captured by reflected light reflected from an object.
  • the cytooptic image may be output by a cell imaging device and images of cells and debris on the background.
  • the optical image may be provided as one image file formed by stitching a plurality of divided images for each specific wavelength range.
  • the optical image of the plurality of wavelength ranges may include a blue wavelength range image, a green wavelength range image, and a red wavelength range image.
  • the optical image for the blue wavelength range is particularly useful for the discrimination of cell nuclei of circulating cancer cells in the blood
  • the optical images for the green wavelength range and the red wavelength range are particularly useful for the discrimination of the cell membrane of the circulating cancer cells in the blood.
  • the optical image data is subjected to data filtering and first It is also possible to perform filtering or secondary filtering, and it is also possible to perform data filtering a plurality of times. Also, after primary filtering or secondary filtering is performed, image data may be stored and outputted.
  • performing the primary filtering step and the secondary filtering step on the optical image for the first wavelength range, and then performing the primary filtering step and the secondary filtering step on the optical image for a second wavelength range different from the first wavelength range may be further performed.
  • the first wavelength range may be a blue wavelength range
  • the second wavelength range may be a green or red wavelength range.
  • the cell nucleus of the cancer cells circulating in the blood may be determined by performing the first filtering process and the second filtering process on the blue wavelength range image.
  • the cell membrane of the circulating cancer cells in the blood may be determined by performing the first filtering process on at least one image of the green wavelength range image and the red wavelength range image. This primary and secondary filtering makes it possible to accurately identify cells from optical images. For example, the identification of target cells such as white blood cells and cancer cells is increased through the green and red wavelength range images.
  • the morphology of the circulating cancer cells in the blood is measured, where the morphology of the circulating cancer cells in the blood may include one or more of a cell area, a cell size, and a circularity. have.
  • the measurement of fluorescence intensity for the immune checkpoint protein and the lymphatic or myeloid cell-specific protein is measured at multiple wavelengths emitted from the immune checkpoint protein and the fluorescent marker that specifically binds to the lymphatic or myeloid cell-specific protein. It is achieved by measuring the fluorescence intensity in the optical image of all or part of the range, and primary filtering can be performed on it.
  • the size of cells is measured in optical images of all or part of multiple wavelength ranges. Then, a region made of polygons or circles larger than the measured cell size by a predetermined ratio or amount is set, and the fluorescence intensity of the cells is measured within this region to perform primary filtering.
  • tertiary filtering is performed by measuring the morphology of the circulating cancer cells in the blood in the integrated image obtained by merging all or part of the optical images for each of the plurality of wavelength ranges.
  • the morphology for the circulating cancer cells in the blood may include one or more of a cell area, a cell size, and a roundness.
  • the tertiary filtering may be performed on the entire circulating cancer cells in the blood, and it is also possible to supplementally perform the identification of the circulating cancer cells in the blood during the primary and secondary filtering process. If additional identification is required, it is possible to go through a separate data filtering process or go through a tertiary filtering process multiple times.
  • the image analysis may be performed by a computer program.
  • Such computer programs may include processors, controllers, arithmetic logic units (ALUs), digital signal processors, microcomputers, field programmable gate arrays (FPGAs), programmable logic units (PLUs), microprocessors, or instructions. It may be implemented using one or more general purpose computers or special purpose computers, such as any other device capable of executing and responsive to .
  • the fluorescent marker that specifically binds to the immune checkpoint protein is selected from the group consisting of an antibody specific to PD-1, an antibody specific to PD-L1, and an antibody specific to CTLA-4. can, but is not limited thereto.
  • the fluorescent marker that specifically binds to the lymphoid or myeloid protein is an antibody specific for CD18, an antibody specific for CD16, an antibody specific for CD29, an antibody specific for CD61, an antibody specific for CD104, It may be characterized in that it is selected from the group consisting of an antibody specific for CD32, an antibody specific for CD11b, and an antibody specific for CD64, but is not limited thereto.
  • the immune checkpoint inhibitor may be used without limitation as long as it is a substance capable of inhibiting the function of the immune checkpoint protein, and may be a protein, a compound, a natural product, DNA, RNA, a peptide, etc., preferably an antibody, , more preferably a monoclonal antibody, and more preferably a human antibody, a humanized antibody, or a chimeric antibody.
  • the immune checkpoint inhibitor may be any one or more selected from the group consisting of a PD-L1 antagonist, a PD-1 antagonist, and a CTLA-4 antagonist, but is not limited thereto.
  • PD-1 antagonist refers to reducing, blocking, inhibiting, abrogating or reducing signal transduction resulting from the interaction of PD-1 with one or more of its binding partners, such as PD-L1 and/or PD-L2.
  • the PD-1 antagonist is a molecule that inhibits the binding of PD-1 to its binding partner.
  • the PD-1 antagonist is PD-1 and/or PD-L1 Inhibits binding to PD-L2.
  • PD-1 antagonists include anti-PD-1 antibodies and antigen-binding fragments thereof, immunoadhesins, fusion proteins, oligopeptides, small molecule antagonists, polynucleotide antagonists and PD- 1 and other molecules that reduce, block, inhibit, abrogate or interfere with signal transduction resulting from the interaction of PD-L1 and/or PD-L2
  • the PD-1 antagonist is a dysfunctional T -reduce negative signals mediated by cell surface proteins or by cell surface proteins expressed on T lymphocytes and other cells that mediate signaling through PD-1 or PD-L1, so that the cell is less dysfunctional.
  • the PD-1 antagonist is an anti-PD-1 antibodies and antigen-binding fragments thereof, immunoadhesins, fusion proteins
  • the term "PD-L1 antagonist” refers to reducing, blocking, inhibiting, abrogating or interfering with signal transduction due to the interaction of PD-L1 with one or more of its binding partners, such as PD-1 or B7-1. refers to molecules.
  • a PD-L1 antagonist is a molecule that inhibits binding of PD-L1 to its binding partner.
  • the PD-L1 antagonist inhibits the binding of PD-L1 to PD-1 and/or B7-1.
  • the PD-L1 antagonist is an anti-PD-L1 antibody, antigen-binding fragment thereof, immunoadhesin, fusion protein, oligopeptide, and PD-L1 and its binding partner, such as PD-1 or B7-1 other molecules that reduce, block, inhibit, abrogate or interfere with signal transduction due to their interaction with
  • the PD-L1 antagonist is expressed on T lymphocytes that mediate signaling through PD-L1, such that dysfunctional T-cells are less dysfunctional (eg, enhance effector response to antigen recognition). Reduces negative costimulatory signals mediated by or through cell surface proteins.
  • the PD-L1 antagonist is an anti-PD-L1 antibody.
  • CTLA4 antagonist refers to a molecule that reduces, blocks, inhibits, abrogates or interferes with signal transduction due to the interaction of CTLA4 with one or more of its binding partners, such as B7-1.
  • a CTLA4 antagonist is a molecule that inhibits binding of CTLA4 to its binding partner.
  • the CTLA4 antagonist inhibits the binding of CTLA4 to B7-1.
  • the CTLA4 antagonist reduces signal transduction due to the interaction of anti-CTLA4 antibodies, antigen-binding fragments thereof, immunoadhesins, fusion proteins, oligopeptides, and CTLA4 with its binding partners, such as B7-1.
  • the CTLA4 antagonist is a cell surface protein expressed on T lymphocytes that mediates signaling through CTLA4, such that dysfunctional T-cells are less dysfunctional (eg, enhance effector response to antigen recognition). Reduces negative costimulatory signals mediated by or through cell surface proteins.
  • the CTLA4 antagonist is an anti-CTLA4 antibody.
  • the immune checkpoint inhibitor is Pembrolizumab, (Keytruda), Nivolumab, (Opdivo), Semiplimab, (Lybtayo) , Atezolizumab, (Tecentriq), Avelumab, (Bacencio), Durvalumab, (Imfinzi), Ipilimumab, Yervoy ( Yervoy)) and trimelimumab may be characterized in that at least one selected from the group consisting of, but is not limited thereto.
  • the cancer is lung cancer, kidney cancer, bladder cancer, breast cancer, colorectal cancer, ovarian cancer, pancreatic cancer, gastric carcinoma, esophageal cancer, mesothelioma, melanoma, head and neck cancer, thyroid cancer, sarcoma, prostate cancer, glioma It may be characterized by being selected from the group consisting of blastoma, cervical cancer, thymic carcinoma, leukemia, lymphoma, myeloma, mycosis fungoides, Merkel cell cancer, or hematologic malignancy, preferably lung cancer, most preferably arsenic It may be cell lung cancer, but is not limited thereto.
  • the present invention from another point of view,
  • compositions for the treatment of cancer comprising an immune checkpoint inhibitor for treating an individual having positive immune checkpoint protein expression and positive lymphatic or myeloid-specific protein expression.
  • an immune checkpoint inhibitor for the manufacture of a therapeutic agent for treating a subject having positive immune checkpoint protein expression and positive lymphatic or myeloid-specific protein expression.
  • CTCs were isolated from the patient's blood using SmartBiopsy TM cell Isolation kit (Cytogen) and SmartBiopsy TM cell Isolator (Cytogen) according to the manufacturer's instructions.
  • the high-density microchip applied to the SmartBiopsy TM cell isolator uses a chip with a pore size of 5 ⁇ m, so that target cells larger than 5 ⁇ m are collected on the chip. Since the pore size of the microchip is adjustable, it is a microchip designed to selectively recover cells of a specific size (US10,502,668, KR10-1254675).
  • Smart BiopsyTM Cell Isolator recognizes the height of the target (peripheral blood mononuclear cell, PBMC) from the solution and automatically performs mixing, transport and filtering with ADP (Air Displacement Pipette).
  • the system of this equipment consists of X-Y Main Axis, ADP, Chip Handler, and Consumable Table. Basically, Smart BiopsyTM Cell Isolator is operated according to the manual using the software.
  • the system of this equipment consists of X-Y Main axis module, 1ml pipette (ADP) module, covering module, consumable parts module, vision parts module, and a consumable table is included.
  • ADP pipette
  • Smart BiopsyTM Cell Isolator is operated according to the manual using in-house software.
  • washing, blocking, primary antibody / secondary antibody staining, and mounting are performed automatically and takes a total of 6 hours (based on 12 slides).
  • the sample (slide) was treated with 50 ⁇ l of 0.2% Triton X-100 for 10 minutes and then washed 3 times for 5 minutes with PBS.
  • the mounting process is carried out using a cover glass.
  • Cells separated by an isolator (about 500 to 10000 or more) were fixed on a slide for staining by performing a cytospin process, a cell centrifugation method.
  • EpCAM/Vimentin, PD-L1 and CD18 markers for positive selection of CD45 and CTC were used to confirm the characteristics of isolated CTCs.
  • EpCAM/Vimentin, PD-L1, CD18 antibody and CD45 antibody were used, and antibody information is shown in Table 4 below.
  • DAPI 4,6-diamidino-2-phenylindole
  • CST030, Cytogen SmartBiopsy TM IF Stainer
  • CTC cells expressing PD-L1 and CD18 were identified using blood samples from inflammatory patients and lung cancer patients (FIG. 1).
  • a CD18 marker was additionally introduced in order to increase the accuracy of determining immunotherapy through PD-L1 expression analysis.
  • EpCAM&Vim(+)/PD-L1(+) and EpCAM&Vim(+)/PD-L1(+)/CD18(+) cells was compared with respect to total CTCs, i.e., EpCAM&Vim(+) expressing cells.
  • EpCAM&Vim(+) expressing cells i.e., EpCAM&Vim(+) expressing cells.
  • CTC-based PD-L1 expression was analyzed in the lung cancer patient group, and the tissue and the results were compared.
  • PD-L1 expression analysis in the tissues of 20 lung cancer patients was performed with DAKO pharmdx clone 22c3 and VENTANA SP263, and in CTC of the same patient, PD-L1(+) and PD-L1(+)/CD18(+ ) expression was compared (Table 5).
  • Table 5 By counting the number of PD-L1-positive cells in liquid biopsy-based circulating tumor cells from lung cancer patients, calculating the target antibody-specific antibody sensitivity and specificity, and finally comparing and analyzing it with the TPS in the clinical field, we compare the potential of the relevant effective indicator. , the performance was verified.
  • the cell ratio of PD-L1(+) is EpCAM&Vim(+)/PD-L1(+) and EpCAM&Vim(+)/PD-L1(+) based on total CTC, that is, EpCAM&Vim(+) expressing cells.
  • the cell ratio of /CD18(+) was determined.
  • the number of most cells was 1 and the average fluorescence intensity was 11.2.
  • the cancer treatment method using circulating tumor cells selects patients by simultaneously confirming the expression of the immune checkpoint protein and the lymphoid or myeloid cell-specific protein in the liquid biopsy, the agreement with the biopsy is excellent, and commercial use is excellent. Therefore, the method of the present invention is useful for cancer diagnosis and treatment.

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Abstract

본 발명은 면역관문억제제를 이용한 암 치료방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 혈액에서 분리된 순환종양세포에서 면역관문 단백질 및 림프계 또는 골수계 세포 특이적 단백질의 발현을 확인하여 면역관문 단백질 발현이 양성이고, 림프계 또는 골수계 세포 특이적 단백질의 발현이 양성으로 확인되는 환자를 면역항암제가 적용가능한 환자로 선별하고, 상기 환자에게 면역관문억제제를 투여하여 암을 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 순환종양세포를 이용한 암 치료방법은 액체생검에서 면역관문 단백질과 림프계 또는 골수계 세포 특이적 단백질의 발현을 동시에 확인하여 환자를 선별하기 때문에 조직검사와의 일치도가 월등히 뛰어나 상업적 활용도가 높으므로, 본 발명의 방법은 암 진단 및 치료에 유용하다.

Description

면역관문억제제를 이용한 암 치료방법
본 발명은 면역관문억제제를 이용한 암 치료방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 혈액에서 분리된 순환종양세포에서 면역관문 단백질 및 림프계 또는 골수계 세포 특이적 단백질의 발현을 확인하여 면역관문 단백질 발현이 양성이고, 림프계 또는 골수계 세포 특이적 단백질의 발현이 양성으로 확인되는 환자를 면역항암제가 적용가능한 환자로 선별하고, 상기 환자에게 면역관문억제제를 투여하여 암을 치료하는 방법에 관한 것이다.
암은 인간 건강에 가장 치명적인 위협 중 하나이다. 미국에서 암은 매년 거의 130만명의 신규한 환자에게 영향을 미치며, 심장병 이후 사망의 두번째 주요 원인으로, 4명 중 1명이 사망한다. 또한 암은 5년 이내 사망 원인 중 1위로 심혈관 질환을 능가할 것으로 예상된다. 고형 종양은 이러한 사망의 대부분을 담당한다.
암을 치료하기 위한 다양한 방법들이 시도되고 있으나, 환자 각각에서 임상적 결과 및 예후가 보고된 데이터들과 항상 일치하지 않아 모든 암의 전체 5년 생존율은 지난 20년동안 약 10%만 개선되었을 뿐이다. 따라서 암 환자의 항암 치료에서 치료약물에 대한 반응성 및 예후를 미리 예측함으로써 이질적인 특성을 갖는 암환자에 대하여 가장 적절한 치료법을 제공해주어 불필요한 치료와 관련된 독성을 피하고 궁극적으로 치료효과를 높일 수 있을 것이다.
이러한 필요성에 따라, 최근 환자 개인적 요인에 대한 체계화된 분석결과를 바탕으로 적절한 표적항암제 및 치료방법을 선별할 수 있는 승인된 진단을 의미하는 동반진단(Companion diagnostics)에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 동반진단은 의사의 진단에 따른 처방의 명확한 임상적 근거를 제시할 수 있으며, 환자에게는 적절한 치료법을 제시할 수 있어 암 치료 효율을 높일 수 있을 뿐만 아니라 표적항암제의 오남용을 줄여 국가의 건강보험 재정 건전성에도 기여할 수 있다. 현재 동반진단 시장은 유방암, 폐암, 대장암, 위암, 흑색종 등의 치료분야에서 성장하고 있으며 특히 유방암 및 폐암 분야가 시장 성장을 견인할 것으로 기대되고 있다. 제약사의 신약개발 비용 절감, 표적치료제에 대한 수요가 높아짐에 따라 동반진단 세계시장은 매년 높은 성장률로 성장하고 있다.
한편, 면역요법은 암을 그의 기원과는 상관없이 공격하는 환자 자신의 면역계를 이용한다. 면역계는 박테리아 및 바이러스와 같은 외부 침입자를 공격하도록 진화된 견제 및 균형 네트워크에 의해 조절된다. 그러나, 암은 면역계가 암 세포를 공격하지 못하게 억제시키는 단백질, 예컨대, PD-L1 및 PD-L2를 발현함으로써 면역계를 회피할 수 있다.
특히, 종양 세포와 T 세포 사이의 상호작용은 종양 세포 상의 주조직적합성 복합체 (MHC)와 T 세포 상의 T 세포 수용체 (TCR) 사이의 접촉을 포함한다. MHC와 T 세포 수용체 사이의 접촉시, T 세포는 활성화되고, 종양세포는 파괴된다.
종양 세포가 그의 표면 상에 면역관문 단백질 PD-L1을 발현한다면, 이는 T 세포 면역감시를 회피할 수 있다. PD-L1은 존재시 T 세포에 의해 발현되는 PD-1에 결합하고, T 세포 활성화를 차단함으로써 T 세포 면역감시를 억제시킨다.
PD-L1/PD-1 상호작용을 차단시킬 수 있는 면역관문억제제가 개발되어 왔다. 상기 약물은 T 세포 면역감시 기전이 다시 정상적으로 작용할 수 있도록 허용하고, 이로써, 종양 세포는 대상체에서 정상적인 면역 반응을 통해 파괴될 수 있다. T 세포 상의 CTLA-4의 차단도 유사한 효과를 가질 수 있다(Hodi et al., N. Engl. J. Med. Vol. 363, pp. 711-23, 2010).
면역관문억제제의 효과적인 사용에 대한 비결은 암을 앓는 특정 대상체가 상기 약물에 반응하는지 여부를 측정하는 것이다. PD-L1 또는 PD-1에 결합하고, 면역관문억제제로서 작용하는 항체를, 환자의 종양 세포가 PD-L1을 발현하지 않는 환자에게 투여하였다면, 치료는 효과가 없을 것이다. 현재까지 이러한 면역관문억제제의 반응성은 현재까지 20-30%에 불과한 실정이다(Herbst RS, et al. The New England journal of medicine.Vol. 383(14), pp. 1328-39, 2020).
PD-L1의 발현율을 측정하는 방법은 환자의 조직 세포에서 PD-L1의 종양비율 점수(tumor proportion score, TPS)를 계산하는 것이 현재까지 권장되는 방법이다. 예를 들어, PD-1에 특이적으로 작용하는 항체인 펨브로리주맙(Pembrolizumab, 키트루다), 니볼루맙(Nivolumab, 옵디보)가 효과적으로 작동하기 위해서는 환자의 조직검사에서 PD-L1의 발현율이 일정 % 이상이 검출되어야 하며, 건강보험 급여적용이 되기 위해서는 옵디보는 PD-L1 10% 이상, 키트루다는 50%이상이 검출되어야 하고, 아테졸리주맙(Atezolizumab, 티센트릭)은 종양세포와 종양침윤면역세포 모두에서 PD-L1 5% 이상의 발현이 검출되어야 한다.
하지만, PD-L1 발현 조사를 위해 종양 생검을 통해 암 세포를 수득하는 것은 환자에게 통증 및 불쾌감을 준다는 점, 단리된 종양 부위 이상은 조사하지 못한다는 점, 및 단백질 발현 프로파일이 종양 미세환경에서 시간이 경과함에 따라 변할 수 있는 잠재성을 가지고 있다는 점을 비롯한, 심각한 단점을 가지고 있다. 아울러 재생검(re-biopsy) 역시 침습성 및 다른 복잡한 문제를 야기한다. 또한, 각각의 면역관문 억제제의 환자 판별 기준이 서로 상이하여 환자에게 가장 효과적인 치료법을 선택하는데 큰 어려움이 따르는 실정이다.
이러한 단점을 극복하기 위해 순환 종양 세포(circulating tumor cell, CTC), 순환 무세포 핵산(circulating cell free DNA, cfDNA) 및 엑소솜을 포함하는 액체 생검이 최근 새로운 해결책을 주목받고 있다(Rijavec E, et al., Cancers. Vol. 12(1):17, 2020). 혈액 기반 생검은 종양에 의해 박리되거나, 또는 다르게는 분리된 세포를 실시간으로 순차적으로 추적할 수 있다는 점에서 조직 생검보다 개선된 것이다.
혈액 샘플은 더욱 쉽게 수득할 수 있고, 환자로부터 더 자주 수득될 수 있다. 추가로, 단백질 발현 프로파일 변화를 시간 경과에 따라 모니터링할 수 있다. 순환 종양 세포(CTC)는 말초 혈액으로부터 쉽게 단리될 수 있고, 조직 생검으로부터 수득된 종양 세포에 대한 대체물로서 사용될 수 있는 암 연관 세포 유형 중 하나이다. CTC는 고형 종양으로부터 혈류 내로 분리된 종양 세포이다. CTC는 암종, 육종, 신경아세포종 및 흑색종 환자의 혈액에서 발견될 수 있다. 혈액 기반 생검으로부터 수득될 수 있는 추가의 세포 유형을 확인하는 것이, 면역관문억제제를 이용하는 치료가 도움이 되는 암 환자를 확인하는 상기 기술의 용도를 추가로 개발하는 데 중요할 것이다.
이러한 기술배경하에, 본 발명자들은 CTC 기반의 암 치료방법을 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, 면역관문 단백질과 림프계 또는 면역계 세포 특이적 단백질의 발현을 동시에 확인하고, 면역관문 단백질의 발현이 양성이고, 림프계 또는 면역계 세포 특이적 단백질의 발현이 양성인 환자에게 면역관문 억제제를 투여할 경우, 조직 검사를 수행하지 않아도 조직 검사와 동일한 수준의 암 치료효과가 나타나는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
발명의 요약
본 발명의 목적은 면역관문 억제제 적용을 위한 환자 선별방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 암 치료방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 면역관문 억제제에 대한 감수성 결정방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 암 환자의 면역항암요법 선택 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 분리된 혈중 순환 암세포에서 면역관문 단백질 및 림프계 또는 골수계 특이적 단백질의 발현을 확인하는 단계; 및 (b) 면역관문 단백질 발현이 양성이고, 림프계 또는 골수계 특이적 단백질의 발현이 양성으로 확인되는 환자를 면역항암제를 적용할 수 있는 환자로 분류하는 단계를 포함하는 면역항암제 적용을 위한 환자 선별방법을 제공한다.
본 발명은 또한,
(a) 분리된 혈중 순환 암세포에서 면역관문 단백질 및 림프계 또는 골수계 특이적 단백질의 발현을 확인하는 단계; 및 (b) 면역관문 단백질 발현이 양성이고, 림프계 또는 골수계 특이적 단백질의 발현이 양성으로 확인되는 환자에게 면역관문 억제제를 투여하는 단계를 포함하는 암 치료방법을 제공한다.
본 발명은 또한,
(a) 분리된 혈중 순환 암세포에서 면역관문 단백질 및 림프계 또는 골수계 특이적 단백질의 발현을 확인하는 단계; 및 (b) 면역관문 단백질 발현이 양성이고, 림프계 또는 골수계 특이적 단백질의 발현이 양성으로 확인되는 경우, 면역관문 억제제에 대한 감수성이 있는 것으로 결정하는 단계를 포함하는 면역관문 억제제에 대한 감수성(susceptibility) 결정방법을 제공한다.
본 발명은 또한,
(a) 분리된 혈중 순환 암세포에서 면역관문 단백질 및 림프계 또는 골수계 특이적 단백질의 발현을 확인하는 단계; 및 (b) 면역관문 단백질 발현이 양성이고, 림프계 또는 골수계 특이적 단백질의 발현이 양성으로 확인되는 경우, 면역관문 억제제를 치료요법으로 선택하는 단계를 포함하는 암 환자의 면역항암요법 선택 방법을 제공한다.
본 발명은 또한,
면역관문 단백질 발현이 양성이고, 림프계 또는 골수계 특이적 단백질 발현이 양성인 개체를 치료하기 위한 면역관문억제제를 포함하는 암 치료용 약학조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 면역관문 단백질 발현이 양성이고, 림프계 또는 골수계 특이적 단백질 발현이 양성인 개체를 치료하기 위한 치료용 약제의 제조를 위한 면역관문억제제의 용도를 제공한다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라 확인한 EpCAM/Vimentin, PD-L1 및 CD18 단백질 발현 순환 종양 세포의 형광이미지이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 확인한 순환 종양 세포에서 EpCAM/Vimentin, PD-L1 및 CD18 단백질의 형광 강도를 측정한 이미지이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 환자의 혈액샘플에서 CD16과 CD18의 발현을 확인한 형광 이미지(A)와 이를 정량화한 그래프(B)이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 확인한 EpCAM/Vimentin, PD-L1 및 CD18의 세포수 및 형광강도에 대한 Heatmap이다.
발명의 상세한 설명 및 바람직한 구현예
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법 및 이하에 기술하는 실험 방법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
제1, 제2, A, B 등의 용어는 다양한 구성요소들을 설명하는데 사용될 수 있지만, 해당 구성요소들은 상기 용어들에 의해 한정되지는 않으며, 단지 하나의 구성요소를 다른 구성요소로부터 구별하는 목적으로만 사용된다. 예를 들어, 이하 설명하는 기술의 권리 범위를 벗어나지 않으면서 제1 구성요소는 제2 구성요소로 명명될 수 있고, 유사하게 제2 구성요소도 제1 구성요소로 명명될 수 있다. 및/또는 이라는 용어는 복수의 관련된 기재된 항목들의 조합 또는 복수의 관련된 기재된 항목들 중의 어느 항목을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어에서 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 해석되지 않는 한 복수의 표현을 포함하는 것으로 이해되어야 하고, "포함한다" 등의 용어는 설시된 특징, 개수, 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 의미하는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 개수, 단계 동작 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
또, 방법 또는 동작 방법을 수행함에 있어서, 상기 방법을 이루는 각 과정들은 문맥상 명백하게 특정 순서를 기재하지 않은 이상 명기된 순서와 다르게 일어날 수 있다. 즉, 각 과정들은 명기된 순서와 동일하게 일어날 수도 있고 실질적으로 동시에 수행될 수도 있으며 반대의 순서대로 수행될 수도 있다.
본 발명에서 용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되며, 원하는 항원-결합 활성을 나타내는한, 단클론성 항체, 다클론성 항체, 다중특이적 항체(예를 들어, 이중특이적 항체) 및 항체 단편을 비제한적으로 포함하며, 다양한 항체 구조를 포함한다.
본 발명에 용어 "바이오마커"는 샘플에서 검출될 수 있는 지표를 지칭한다. 바이오마커는 특정분자, 병리적, 조직학적 및/또는 임상적 특징을 특징으로 하는, 질환 또는 장애(예를 들어, 암)의 예측, 진단 및/또는 예후의 지표로서 작용할 수 있다.
본 발명에서 용어 "암” 및 "암성"은 전형적으로 조절되지 않은 세포 성장을 특징으로 하는 포유동물의 생리적 병태를 지칭하거나 설명한다. 암의 예는 암종, 림프종, 모세포종, 육종 및 백혈병 또는 림프양 악성종양을 비제한적으로 포함한다. 이러한 암의 보다 구체적인 예는 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 폐 선암종 및 폐의 편평상피 암종을 포함하는 폐암; 방광암(예를 들어, 요로성 방광암(UBC), 근육 침습성 방광암(MIBC) 및 BCG-불응성 비-근육 침습성 방광암(NMIBC)); 신장 또는 신장암(예를 들어, 신장 세포 암종(RCC)); 요로 암; 유방암(예를 들어, 에스트로겐 수용체(ER-), 프로게스테론 수용체(PR-) 및 HER2(HER2-) 음성인 HER2+ 유방암 및 삼중-음성 유방암(TNBC)); 거세-저항성 전립선암(CRPC)과 같은 전립선 암; 복막 암; 간세포 암; 위장 암 및 위장 기질 암을 포함한 위 또는 위암; 췌장암; 교모세포종; 자궁경부암; 난소암; 간암; 간종양; 결장암; 직장암; 결장직장암; 자궁내막 또는 자궁 암종; 타액샘 암종; 전립선암; 외음부 암; 갑상선암; 간 암종; 항문 암종; 음경 암종; 표재 확장성 흑색종, 악성 흑자 흑색종, 선단 흑자성 흑색종, 및 결절성 흑색종을 포함하는 흑색종; 다발성 골수종 및 B-세포 림프종(저급/여포성 비-호지킨 림프종(NHL) 포함; 소림프구성(SL) NHL; 중급/여포성 NHL; 중간급 확산성 NHL; 고급 면역모세포성 NHL; 고급 림프아구성 NHL; 고등급의 작은 비-절단 세포 NHL; 거대 질환 NHL; 외투 세포 림프종; AIDS-관련된 림프종; 및 발덴스트롬 거대글로불린혈증 포함); 만성 림프구성 백혈병(CLL); 급성 림프아구성 백혈병(ALL); 급성 골수성 백혈병(AML); 모발 세포 백혈병; 만성 골수모세포 백혈병(CML); 이식후 림프증식성 장애(PTLD); 및 골수이형성 증후군(MDS), 뿐만 아니라 모반증, 부종(예컨대, 뇌종양 관련), 메이그스 증후군, 뇌암, 두경부암 및 관련 전이와 관련된 비정상 혈관 증식을 비제한적으로 포함한다.
본 발명에서 용어 "치료하다," "치료하는" 및 "치료"라는 용어는 그의 일반적이고, 통상적인 의미를 가지며, 이는 대상체로부터 종양 또는 암을 완전히 또는 부분적으로 제거하는 것, 대상체에서 종양의 크기를 축소시키는 것, 대상체에서 종양 또는 암 세포를 사멸시키는 것, 및 대상체에서 암 또는 종양의 증상을 호전시키는 것 중 하나 이상의 것을 포함한다. 치료는 면역관문 억제제를 투여 받지 않은 대상체 대비 약 1% 내지 약 100%만큼 제거, 축소, 사멸 또는 호전시키는 것을 의미한다. 바람직하게, 제거, 축소, 사멸 또는 호전시키는 것은 약 100%, 약 99%, 약 98%, 약 97%, 약 96%, 약 95%, 약 90%, 약 80%, 약 70%, 약 60%, 약 50%, 약 40%, 약 30%, 약 20%, 약 10%, 약 5% 또는 약 1%인 것이다. 치료 결과는 영구적일 수 있거나, 또는 수일 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7일) 수주 (예컨대, 1, 2, 3 또는 4주), 수개월 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6개월 이상) 또는 수년(예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6년 이상)의 기간 동안 계속 진행될 수 있다.
본 발명에서 용어 "억제시키다," "억제하는" 및 "억제"라는 용어는 그의 일반적이고, 통상적인 의미를 가지며, 이는 암 또는 종양의 확립, 암 또는 종양의 발생, 암 또는 종양의 성장 및 전이를 방해하거나, 그의 진행을 지연시키거나, 차단하거나, 저지하거나, 또는 제지시키는 것 중 하나 이상의 것을 포함한다. 억제란, 면역관문 억제제를 투여 받지 않은 대상체 대비 약 1% 내지 약 100%만큼 방해하는 것을 의미한다. 바람직하게, 방해는 약 100%, 약 99%, 약 98%, 약 97%, 약 96%, 약 95%, 약 90%, 약 80%, 약 70%, 약 60%, 약 50%, 약 40%, 약 30%, 약 20%, 약 10%, 약 5% 또는 약 1%인 것이다. 억제 방법은 암 또는 종양의 임상적 증상이 발병되기 이전에, 그와 동시에, 또는 그 이후에 대상체에서 수행될 수 있다. 따라서, 대상체는 암 또는 종양을 앓는 대상체일 수 있거나, 또는 단지 암 또는 종양이 발생하기 쉬운 대상체일 수 있다. 억제 결과는 영구적일 수 있거나, 또는 수일 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7일) 수주 (예컨대, 1, 2, 3 또는 4주), 수개월 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6개월 이상) 또는 수년 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6년 이상)의 기간 동안 계속 진행될 수 있다.
본 발명에서 용어 “투여"는 투여량의 화합물 또는 조성물을 제공하는 방법을 의미한다. 본 명세서에 기재된 방법에 사용된 화합물 및/또는 조성물은, 예를 들어, 정맥내로(예를 들어, 정맥내 주입에 의해), 피하로, 근육내로, 진피내로, 경피로, 동맥내로, 복강내로, 병소내로, 두개내로, 관절내로, 전립선내로, 늑막내로, 기관내로, 비강내로, 유리체내로, 질내로, 직장내로, 국소적으로, 종양내로, 복막내로, 결막하로, 방광내로, 점막으로, 심막내로, 탯줄내로, 안구내로, 경구로, 국소적으로, 국소적으로, 흡입에 의해, 주사로, 주입에 의해, 연속적 주입에 의해, 표적 세포를 직접 세척(bath)하는 국소화된 관류에 의해, 카테터에 의해, 세척에 의해, 크림으로, 또는 지질 조성물로 투여될 수 있다. 투여 방법은 다양한 인자(예를 들어, 투여되는 화합물 또는 조성물 및 치료되는 병태, 질환 또는 장애의 중증도)에 따라 달라질 수 있다.
면역관문 억제제, 및 면역 관문억제제를 포함하는 제약 제제는, 고려하여야 하는 몇 가지 인자만을 예를 들자면, 방법의 특정 목표 또는 목적; 대상체의 연령 및 크기; 및 대상체의 일반적인 건강 상태에 의존하여 대상체에게 상이한 스케줄로 투여될 수 있다. 일반적으로, 면역관문 억제제 및 제약 제제는 치료 또는 억제 과정 동안에 걸쳐 1회, 또는 2, 3회, 4회, 5회, 6회 이상 투여될 수 있다. 투약 스케줄에서 각 투약 사이의 타이밍은 수일, 수주, 수개월 또는 수년 범위일 수 있고, 매 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30주 이상의 기간 마다 1회 투여하는 것을 포함한다. 투약 스케줄의 매회 투약시에 동일한 정량을 면역관문 억제제를 투여할 수 있거나, 매회 투약시의 양은 달라질 수 있다. 투약 스케줄에서 각 투약시 면역 관문억제제의 아이덴티티 또한 달라질 수 있거나, 동일한 상태로 유지될 수 있다.
본 발명의 각각의 방법들에서, 면역관문억제제, 또는 면역관문억제제를 포함하는 제약 제제는 "치료학상 유효량"으로 대상체에게 투여된다. 치료학상 유효량은 대상체마다 달라질 것이다. 그러나, 치료학상 유효량은 본 방법의 목표 또는 목적이 억제시키고자 하는 것이든, 또는 치료하고자 하는 것이든 그와 상관 없이, 그를 달성하는 데 충분한 양이다. 예로서, 본 발명의 방법에서 사용되는 면역관문억제제의 치료학상 유효량은 전형적으로 펩티드를 투여받는 대상체의 체중 1 kg당 면역관문억제제 약 0.1 ㎍ 내지 약 10,000 ㎍이다. 치료학상 유효량은 또한 대상체의 체중 1 kg당 면역관문억제제 약 0.5 ㎍ 내지 약 5,000 ㎍, 약 1 ㎍ 내지 약 500㎍, 약 10 ㎍ 내지 약 200 ㎍, 약 1 ㎍ 내지 약 800 ㎍, 약 10 ㎍ 내지 약 1,000 ㎍, 약 50 ㎍ 내지 약 5,000㎍, 약 50 ㎍ 내지 약 500 ㎍, 약 100 ㎍ 내지 약 1,000 ㎍, 약 250 ㎍ 내지 약 2,500 ㎍, 약 500 ㎍ 내지 약2,000 ㎍, 약 10 ㎍ 내지 약 800 ㎍, 약 10 ㎍ 내지 약 1,000 ㎍, 약 1 ㎍ 내지 약 300 ㎍, 및 약 10 ㎍ 내지 약 300 ㎍을 포함한다.
말기암 환자와 같이 상태가 위중한 환자는 EGFR, ALK, ROS1 등 특정 유전자 검사에 따라 표적항암제 치료가 가능하지만 1년 정도 표적항암제를 복용하게 되면 약제 내성이 발생할 가능성도 있으며, 또한 종양도 작아지고 암 주변에 섬유화가 발생해 조직검사를 시행해도 암세포를 채취하지 못하는 경우가 많이 발생한다. 뿐만 아니라, 말기암 환자는 수술이 불가하고, 반복적인 조직 검사도 어려운 경우가 많아서, 면역항암제를 처방하기 위한 조직검사 또는 처방 후 치료 반응성을 모니터링 하기도 어려운 실정이다.
본 발명에서는, 이러한 조직 검사를 수행하기 어려운 환자에서, 혈액 검사만으로 조직 검사와 동일한 진단 효과를 나타낼 수 있는 바이오 마커를 개발하였으며 그 결과, 면역관문 단백질 및 림프계 또는 골수계 특이적 단백질의 발현을 동시에 확인할 경우, 면역항암요법을 높은 정확도로 선택할 수 있다는 것을 확인하였다.
즉, 본 발명의 일 실시예에서는, 분리된 혈액에서 분리한 CTC를 PD-L1 및CD18 항체로 염색하고 이들의 발현양을 확인할 경우, PD-L1의 발현 만을 확인하는 방법에 비해 조직 검사 결과와 동일한 결과가 나타나는 비율이 획기적으로 증가하는 것을 확인하였다(도 1, 도 2).
따라서, 본 발명은 일 관점에서,
다음의 단계를 포함하는 면역항암제 적용을 위한 환자 선별방법에 관한 것이다:
(a) 분리된 혈중 순환 암세포에서 면역관문 단백질 및 림프계 또는 골수계 특이적 단백질의 발현을 확인하는 단계; 및
(b) 면역관문 단백질 발현이 양성이고, 림프계 또는 골수계 특이적 단백질의 발현이 양성으로 확인되는 환자를 면역항암제를 적용할 수 있는 환자로 분류하는 단계.
본 발명에서, 상기 단백질 발현이 “양성”이라는 의미는 혈중 순환 암세포에서 해당 단백질의 존재가 통상의 기술자에게 알려진 다양한 방법으로 확인된다는 것을 의미하며, 바람직하게는 형광강도로 확인될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서, 상기 단백질 발현을 양성으로 판단하는 것은 상기 단백질이 각각 또는 모두 발현되는 세포의 수, 각 단백질 별 발현의 강도(형광의 세기)를 고려하여 특정 기준값(cut-off value)을 기준으로 판단하거나, 기준 모집단과 비교하여 발현양이 높거나 낮음을 통해 판단할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서, 상기 단백질 발현이 “음성”이라는 의미는 혈중 순환 암세포에서 해당 단백질의 존재가 통상의 기술자에게 알려진 다양한 방법으로 확인되지 않는다는 것을 의미하며, 바람직하게는 형광강도로 확인될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서, 상기 단백질 발현을 음성으로 판단하는 것은 상기 단백질이 각각 또는 모두 발현되지 않는 세포의 수, 각 단백질 별 발현의 강도(형광의 세기)를 고려하여 특정 기준값(cut-off value)을 기준으로 판단하거나, 기준 모집단과 비교하여 발현양이 높거나 낮음을 통해 판단할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 면역관문 단백질은 면역관문 관련 신호전달 경로에 관여하는 단백질이면 제한없이 사용할 수 있고, 바람직하게는, CD27, CD28, CD40, CD122, CD137, OX40, GITR, ICOS, A2AR, B7-H3, BY-H4, CTLA-4, IDO, KIR, LAG3, NOX2, PD-1, PD-L1, TIM-3, VISTA 및 SIGLEC7으로 구성된 군에서 선택될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 PD-1, PD-L1 및 CTLA-4로 구성된 군에서 선택될 수 있고, 가장 바람직하게는 PD-L1일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 림프계 또는 골수계 특이적 단백질은 림프계 또는 골수계 세포에서 발현되는 단백질이면 제한없이 사용할 수 있고, 바람직하게는, CD18, CD29, CD61, CD104, ITGB5, ITGB6, ITGB7, ITGB8, CD49a, CD49b, CD49c, CD49d, CD49e, CD49f, ITGA7, ITGA8, ITGA9, ITGA10, ITGA11, CD11D, CD103, CD11a, CD11b, CD51, CD41, CD11c, CD64, CD32, CD16a, CD16b, CD23, CD89, FcRn, FcεRI 및 Fcα/μR로 구성된 군에서 선택될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 CD18, CD16, CD29, CD61, CD104, CD32, CD11b 및 CD64로 구성된 군에서 선택될 수 있고, 가장 바람직하게는 CD18일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 분리된 혈중 순환 암세포는 다음의 단계를 수행하여 분리되는 것을 특징으로 할 수 있다:
(i) 암 환자로부터 혈액을 획득하는 단계; 및
(ii) 상기 혈액으로부터 바이오칩을 이용하여 암 세포를 분리하는 단계.
본 발명에서, 상기 혈중 순환 암세포(Circulating Tumor Cells, CTC)란, 악성 종양 환자의 말초혈액에서 발견되는 종양세포를 의미한다. 혈중 순환 암세포들은 매우 드물고 구할 수 있는 표본의 양이 매우 제한된다. 혈중 순환 암세포의 검출 및 특성 해석에서의 기술은 다중역전사정량중합효소연쇄반응 방법들, 영상화 기반 접근법들, 그리고 미세여과법 및 마이크로칩 장치들을 포함하며 이에 국한되지 않는다. 혈중 순환 암세포는 액상생검 검체로 개별화된 치료와 치료 후 경과관찰을 필연적으로 제공할 수 있는 종양생물학적 표지자로 작용할 수 있다. 또한, 혈중 순환 암세포는 종양의 생물학적 특성 및 종양세포의 파종을 이해하기 위한 표적으로 사용될 수 있지만 이에 국한되지 않는다.
상기 바이오 칩이란, 반도체와 같은 무기물로 된 고체 기질에 생물에서 유래된 DNA, 단백질, 효소, 항체, 미생물, 동식물 세포 및 기관, 신경세포 등의 물질을 고밀도로 집적화하고 조합하여 기존의 반도체칩 형태로 만든 혼성 소자로서 생체분자의 고유한 기능을 이용하며 유전자 발현 양상, 유전자 결합, 단백질 분포 등의 생물학적 정보를 얻거나 생화학적 공정 및 반응 속도 또는 정보 처리 속도를 높이는 도구나 장치를 말한다.
상기 고밀도 마이크로칩이란, 바이오칩의 작용 원리를 기반으로 특정 사이즈의 물질을 분리해낼 수 있는 바이오 칩을 말한다.
상기 고밀도 마이크로칩은 혈액 세포의 크기 차이를 기반으로 하며 10분 이내에 약 90%의 회수율로 혈중 순환 암세포를 포착할 수 있다.
본 발명의 실시예에서 상기 고밀도 마이크로칩의 기공 크기(pore size)는 5.5 내지 8.5μm이 바람직할 수 있으며, 더 바람직하게는 6.5 내지 7.5 μm일 수 있다. 기공의 크기가 5.5μm보다 작을 경우 적혈구 및 백혈구가 칩을 통과하지 못해 칩 상에 걸리게 되어 제거되지 못하고, 기공의 크기가 8.5 μm보다 클 경우에는 기공의 크기가 혈중 순환 암세포의 크기보다 커서 혈중 순환 암세포가 칩을 통과하여 혈중 순환 암세포를 선택적으로 회수할 수 없게 된다. 본 발명의 일실시예에서 상기 고밀도 마이크로칩의 기공 모양은 원형, 사각형 또는 타원 모양일 수 있으며, 바람직하게는 사각형일 수 있다.
본 발명의 일실시예에서, 상기 고밀도 마이크로칩의 기공은 규칙적인 패턴으로 배열될 수 있다. 본 발명의 다른 일실시예에서 상기 고밀도 마이크로칩은 구체적으로 스테인리스스틸, 니켈, 알루미늄 또는 구리를 소재로 제작될 수 있다. 상기 기공들은 멤스(MEMS, Micro-electro Mechanical Systems)기술을 이용한 에칭(etching)에 의해 형성될 수 있다.
기공들 중 인접하는 두 기공들 사이의 간격은 혈중 순환 암세포의 직경보다 좁게 형성되어 있다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 두 기공들 사이의 간격은 혈중 순환 암세포의 직경에 대하여 45~65%로 형성될 수 있다. 상기 고밀도 마이크로칩은 통로를 흐르는 혈액 또는 솔루션의 압력에 의하여 변형되지 않는다. 혈액은 기공들을 통과한 후, 밖으로 배출되며 혈액 속의 혈중 순환 암세포 들은 기공들을 통과하지 못하고 표면에 잔류된다.
비표적세포들, 즉 혈중 순환 암세포보다 변형률이 높은 적혈구는 기공들을 쉽게 통과한다.
혈중 순환 암세포들의 여과 후, 혈중 순환 암세포들은 솔루션을 역방향 또는 정방향으로 공급하여 밖으로 배출시킬 수 있다. 본 발명의 일실시예에 따르면, 솔루션은 혈중 순환 암세포의 손상을 최소화할 수 있도록 역방향으로 공급할 수 있다. 상기 솔루션은 주사기, 시린지펌프, 플런저펌프 등에 의하여 공급될 수 있다. 본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 솔루션은 혈액을 희석하는 희석제, 물(Water) 및 희석용 산으로 구성될 수 있다. 상기 솔루션의 공급에 의하여 밖으로 배출되는 혈중 순환 암세포를 컨테이너(Container), 예를 들어 시험관, 배양접시 등에 수거하여 간편하게 채집할 수 있다.
한편, 직경 7.5~15μm의 혈중 순환 암세포는 약 100mmHg의 압력이 가해질 때 직경 8μm의 관을 통과한다. 직경 8μm의 관을 통과하는 직경 15μm의 혈중 순환 암세포는 약 53%의 변형률을 갖는다. 역세척(Back washing), 즉 혈액의 흐름과 반대방향으로 솔루션을 흐르게 하여 직경 7.5μm의 혈중 순환 암세포를 밖으로 배출시킬 때, 혈중 순환 암세포의 변형률을 고려하면 두 기공들 사이의 간격은 4μm 이하가 바람직하다. 예를 들어, 비소세포폐암과 유방암은 그 암세포의 직경이 40μm 정도에 이르는 것으로 알려져 있다. 역세척 시 직경 40μm의 혈중 순환 암세포의 변형률을 고려하면, 두 기공들 사이의 간격은 21μm 이하로 설정하는 것이 바람직하다. 직경 7.5μm의 혈중 순환 암세포가 간격 4μm를 초과하는 두 기공들 사이에 존재할 때, 혈중 순환 암세포가 솔루션의 흐름에 의하여 변형되면서 표면으로부터 탈락되지 않을 수 있다. 또한, 직경 40μm의 암세포도 간격 21μm를 초과하는 두 기공들 사이의 표면으로부터 탈락되지 않을 수 있다. 본 발명에 따른 고밀도 마이크로칩에 있어서 솔루션의 압력을 고려하여 두 기공들 사이의 간격은 혈중 순환 암세포의 직경에 대하여 45~65%로 이루어진다. 직경 7.5μm의 혈중 순환 암세포는 간격이 65%를 초과, 즉 약 4.9μm를 초과하는 경우, 역세척에 의하여 두 기공들사이의 표면으로부터 탈락되지 않을 수 있다. 직경 40μm의 혈중 순환 암세포는 간격이 65%를 초과, 즉 26μm를 초과하는 경우, 역세척에 의하여 두 기공들 사이의 표면으로부터 탈락되지 않을 수 있다. 두 기공들 사이의 표면에 달라붙은 혈중 순환 암세포를 강제로 탈락시키고자 솔루션의 압력을 높이는 경우, 혈중 순환 암세포의 손상이 발생되어 살아 있는 혈중 순환 암세포의 채집율이 저하된다. 직경 7.5μm의 혈중 순환 암세포에 대한 간격이 45% 미만, 즉 약 3.375μm 미만인 경우, 혈액과 솔루션의 흐름에 의하여 상기 고밀도 마이크로칩이 파손될우려가 높다.
본 발명의 일실시예에서, 상기 고밀도 마이크로칩에서 상기 시료가 반복적으로 통과하게 할 수 있다. 구체적으로, 혈중 순환 암세포가 상기 고밀도 마이크로칩에서 한번 분리되고 난 후 상기 분리된 혈중 순환 암세포를 다시 한번 상기 고밀도 마이크로칩으로 로딩하여 분리할 수 있고, 상기 분리 과정을 반복할 수 있다.
본 발명의 일실시예에서, 상기 고밀도 마이크로칩을 통한 혈중 순환 암세포 분리는 혈중 순환 암세포가 포함된 용액을 고밀도 마이크로칩에 로딩한 후에 특정적인 인위적 압력을 가함으로써 이루어지는 것이 아니라, 중력을 이용하여 혈중 순환 암세포 분리가 이루어 질 수 있다. 본 발명에 따른 고밀도 마이크로칩을 통한 혈중 순환 암 세포 분리는 혈중 순환 암세포에 인위적인 압력에 의한 데미지를 최소화함으로써 환자 체내에 존재하던 상태 그대로를 유지하게 해줄 수 있다.
본 발명의 일실시예에서, 상기 고밀도 마이크로칩은, 혈중 순환 암세포가 분리될 때 상기 고밀도 마이크로칩에 의한 혈중 순환 암세포 데미지를 최소화시키거나 상기 고밀도 마이크로칩이 반복사용이 더 효율적으로 되도록 하기 위해, 또는 혈중 순환 암세포 회수율을 보다 더 효율적으로 하기 위해 특정 물질로 코팅될 수 있다. 상기 특정 물질은, 구체적으로 혈중 순환 암세포에 특이적으로 결합할 수 있는 항체가 될 수 있으며, 세포에 물리적 또는 화학적으로 데미지를 주지 않는 생체재료이면 가능하다. 본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 특정 물질은 BSA(Bovine Serum Albumin) 또는 항체일 수 있다. 상기 항체는 예를 들어 항상피세포접합분자 항체(Anti-Epithelial Cell Adhesion Molecule antibody, Anti-EpCAM antibody), 항시토케라틴 항체(Anti-Cytokeratin antibody, Anti-CK antibody) 등으로 구성될 수 있다. 본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 특정 물질은 BSA(Bovine Serum Albumin)일 수 있다.
상기 BSA(Bovine Serum Albumin)용액이란, 소혈청 알부민을 말한다. 분자량은 약 66.4 kDa 정도 되는 단백질로써 대부분의 동물에 많이 존재하는 단백질이다. BSA는 생화학/생물학에서 세포 배양시에 세포의 영양분으로써 첨가해줄 수 있고, 또한 단백질의 정량에서 검정곡선을 얻기 위한 표준물로도 많이 쓰이며 제한효소를 사용할때 적은양의 효소(단백질)를 사용해야 하므로 용액내의 단백질 농도를 보완해주기 위하여 첨가해줄 수도 있다. 그리고 여러 생화학적 실험(Western blot, Immunocytochemistry, ELISA 등) 에서 특정 항체를 검출하고자 하는 단백질을 붙여주기 전에, 비특이적 결합(nonspecific binding), 즉 원하지 않는 단백질 혹은 원치않는 위치에 항체가 달라붙는 비특이적 결합을 막아 주기 위해 사용될 수도 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 원심분리법을 이용하여 말초 혈액을 상기 BSA용액으로 코팅된 고밀도 마이크로칩에 반응시켜서 혈중 순환 암세포를 제외한 기타 생체고분자를 제거할 수 있다. 본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 고밀도 마이크로칩을 이용한 분리는 중력으로 이루어질 수 있고, 구체적으로는 대기압 1000 내지 1020hPa에서 이루어질 수 있다. 바람직하게는 대기압1000 내지 1015hPa에서 이루어질 수 있다. 더 바람직하게는 대기압 1000 내지 1013hPa에서 이루어질 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 BSA용액은 상기 고밀도 마이크로칩의 상면, 하면 또는 상기 기공의 내측면에 코팅될 수 있다. 바람직하게는 상기 고밀도 마이크로칩의 상면, 하면 및 상기 기공의 내측면 모두에 코팅될 수 있다
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 BSA용액코팅은 0.05 내지 0.15% 농도로 이루어 질 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 상기 BSA용액코팅은 0.08 내지 0.012% 농도로 이루어질 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 BSA 용액 코팅은 5 내지 15분동안 처리될 수 있다. 볼 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 BSA 용액 코팅은 8내지 12분동안 처리될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 면역관문 단백질 및 림프계 또는 골수계 특이적 단백질의 발현은 다음의 단계를 수행하여 확인하는 것을 특징으로 할 수 있다:
(1) 혈중 순환 암세포에 특이적으로 결합하는 형광표지자; 면역관문 단백질에 특이적으로 결합하는 형광표지자; 및 림프계 또는 골수계 특이적 단백질에 특이적으로 결합하는 형광표지지와 반응시키는 단계;
(2) 상기 형광표지자와 반응시킨 혈중 순환 암세포; 면역관문 단백질; 및 림프계 또는 골수계 특이적 단백질을 대상으로 복수 파장범위 각각에 대한 광학 이미지를 수신하는 단계;
(3) 상기 복수 파장범위 전체 또는 일부의 광학 이미지에서 상기 혈중 순환 암세포; 면역관문 단백질; 및 림프계 또는 골수계 특이적 단백질에 대한 형광강도를 측정하여 1차 필터링을 수행하는 단계;
(4) 상기 복수 파장범위 전체 또는 일부의 광학 이미지에서 상기 혈중 순환 암세포에 대한 모폴로지(morphology)를 측정하여 2차 필터링을 수행하는 단계; 및
(5) 상기 복수 파장범위 각각에 대한 광학 이미지 중 전체 또는 일부를 병합한 통합 이미지에서 상기 혈중 순환 암세포에 대한 모폴로지를 측정하여 3차 필터링을 수행하는 단계.
본 발명에서, 상기 혈중 순환 암세포에 특이적으로 결합하는 형광표지자는 혈중 순환 암세포 자체 또는 내외부에 존재하는 물질에 특이적으로 결합할 수 있는 형광물질을 의미한다. 본 발명의 일실시예에 따르면, 혈중 순환 암세포를 식별할 수 있는 형광표지자는 세포핵에 특이적으로 결합할 수 있거나 세포내외부에 존재하는 단백질이나 DNA, RNA등에 특이적으로 결합할 수 있다. 구체적으로, 세포핵에는 DAPI가 형광표지자로 쓰일 수 있고, 중간경 필라멘트단백질인 비멘틴(vimentin)에 특이적으로 결합하는 형광표지자가 쓰일 수 있으며, 상피 세포 부착 분자(EpCAM, epithelial cell adhesion molecule)과 CK(cytokeratin)에 특이적으로 결합하는 형광표지자가 사용될 수 있으며, 비표적세포 제거수단으로 쓰이는 CD45에 특이적으로 결합하는 형광표지자가 사용될 수 있다. 상기 혈중 순환 암세포에 특이적으로 결합하는 형광표지자는 뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오타이드, 펩타이드, 폴리펩타이드, 핵산 또는 단백질로 이루어질 수 있으며, 단백질로 된 항체일 수 있다. 상기 혈중 순환 암세포에 특이적으로 결합하는 형광표지자는 혈중 순환 암세포에 특이적으로 결합하여 식별가능하게 하는 물질이면 가능하다.
상기 광학적 이미지는 이미징 시스템에 의해 생성될 수 있다. 본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 이미징 시스템은 세포 이미징 시스템일 수 있으며, 상기 세포 이미징 시스템은 예컨대 슬라이드 글라스와 같은 플랫폼 상에 염색된 세포를 놓고 여러 파장별로 세포를 관찰하고 촬영하는 시스템이다. 세포 이미징 시스템은 자동 셀 카운팅(cell counting) 모듈, 형광 강도(intensity) 분석 모듈, 세포학(cytology) 기반 셀 분류/인식(cell classification/cognition) 모듈을 포함할 수 있다. 또한, 사용자 편의 기능으로서, 측정(Measurement) 기능, 리포트(Report) 자동 생성 기능, DB 관리 기능을 유저 인터페이스로 포함할 수 있다. 이러한 세포 이미징 시스템은 세포, 배양액, 데브리스(debris) 등을 구별하고, 사용자가 원하는 세포를 판별하고 계수하기 위한 디지털 영상분석 장비가 포함된다. 본 발명의 일실시예에 따른 세포 이미징 시스템은, 광학적 이미지로부터 형광표지된 또는 마커가 결합된 표적세포를 정확히 식별하고 계수할 수 있다.
상기 광학적 이미지는 물체로부터 반사된 반사광에 의해 촬상된 광학 이미지일 수 있다. 세포 광학 이미지는 세포 이미징 장치에 의해 출력되어 배경 상에 세포와 데브리스 등이 촬상된 것일 수 있다. 이 광학 이미지는 특정 파장범위 각각에 대하여 복수개의 분할 이미지를 스티칭(stitching)하여 이루어진 하나의 이미지 파일로 제공되는 것일 수 있다. 여기서, 복수 파장범위의 광학 이미지는 청색 파장범위 이미지, 녹색 파장범위 이미지, 및 적색 파장범위 이미지를 포함할 수 있다. 청색 파장범위에 대한 광학 이미지는 혈중 순환 암세포의 세포핵 판별에 특히 유용하며, 녹색 파장범위 및 적색 파장범위에 대한 광학 이미지는 혈중 순환 암세포의 세포막의 판별에 특히 유용하다. 그 외에도 다양한 색상(컬러)의 파장범위를 이용하여 특정 형광표지자 또는 마커를 식별하는 것이 가능하다.
상기 1차 필터링 또는 2차 필터링에 있어서, 혈중 순환 암세포, 면역관문 단백질, 림프계 또는 골수계 세포 특이적 단백질의 식별이 원하는 수준으로 이루어지지 않으면, 광학 이미지 데이터에 대한 데이터 필터링을 거치고 다시 한번 1차 필터링 또는 2차 필터링을 수행하는 것도 가능하며, 데이터 필터링을 복수회 거치는 것도 가능하다. 또한, 1차 필터링 또는 2차 필터링이 수행된 이후에는 이미지 데이터를 저장하고 이를 출력할 수 있다.
또한, 제1 파장범위에 대한 광학 이미지에서 1차 필터링 단계 및 2차 필터링 단계를 수행하고, 이어서 제1 파장범위와 상이한 제2 파장범위에 대한 광학 이미지에서 1차 필터링 단계 및 2차 필터링 단계 중 하나 이상의 단계를 더 수행할 수 있다.
예컨대, 제1 파장범위는 청색 파장범위, 제2 파장범위는 녹색 또는 적색 파장범위일 수 있다. 이 경우, 청색 파장범위 이미지에서 제1 필터링 과정 및 제2 필터링 과정을 수행하여 혈중 순환 암세포의 세포핵을 판별할 수 있다. 또한, 녹색 파장범위 이미지와 적색 파장범위 이미지 중 하나 이상의 이미지에서 제1 필터링 과정을 수행하여 혈중 순환 암세포의 세포막을 판별할 수 있다. 이러한 1차 및 2차 필터링을 통해 광학 이미지로부터 세포를 정확히 식별하는 것이 가능하게 된다. 예컨대, 녹색 및 적색 파장범위 이미지를 통해서 예컨대 백혈구와 암세포 등의 표적세포에 대한 식별성이 높아지게 된다.
한편, 2차 필터링 과정에서는 혈중 순환 암세포에 대한 모폴로지를 측정하게 되는데, 여기서 혈중 순환 암세포에 대한 모폴로지는 세포 면적(area), 세포 크기(diameter), 및 진원도(circularity) 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
본 발명의 일실시예에서, 면역관문 단백질 및 림프계 또는 골수계 세포 특이적 단백질에 대한 형광강도 측정은 면역관문 단백질 및 림프계 또는 골수계 세포 특이적 단백질에 특이적으로 결합하는 형광표지자에서 나오는 복수 파장범위 전체 또는 일부의 광학 이미지에서 형광강도를 측정함으로써 이루어지며 이에 대해 1차 필터링을 수행할 수 있다.
면역관문 단백질 및 림프계 또는 골수계 세포 특이적 단백질 이외에 혈중 순환 암세포에 대한 형광강도를 측정하여 1차 필터링을 수행하는 과정을 더 구체적으로 살펴보면 복수 파장범위 전체 또는 일부의 광학 이미지에서 세포의 크기를 측정하고, 이후 측정된 세포의 크기보다 미리 정해진 비율 또는 양만큼 큰 다각형 또는 원으로 이루어진 영역을 설정하고, 이 영역 내에서 세포에 대한 형광강도를 측정하여 1차 필터링을 수행할 수 있다.
상기 3차 필터링 단계에서, 복수 파장범위 각각에 대한 광학 이미지 중 전체 또는 일부를 병합한 통합 이미지에서 혈중 순환 암세포에 대한 모폴로지를 측정하여 3차 필터링을 수행한다. 여기서 혈중 순환 암세포에 대한 모폴로지는 세포 면적, 세포 크기, 및 진원도 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
상기 3차 필터링은 혈중 순환 암세포 전체에 대해 수행하는 것도 가능하고, 1차 및 2차 필터링 과정에서 혈중 순환 암세포의 식별이 어려웠던 것에 대해 보충적으로 수행하는 것도 가능하다. 추가 식별이 필요한 경우에는 별도의 데이터 필터링을 거치거나, 3차 필터링 과정을 다수회 거치는 것도 가능하다.
상기 이미지 분석은 컴퓨터 프로그램에 의해 실행될 수 있다. 이러한 컴퓨터 프로그램은 프로세서, 콘트롤러, ALU(arithmetic logic unit), 디지털 신호 프로세서(digital signal processor), 마이크로컴퓨터, FPGA(field programmable gate array), PLU(programmable logic unit), 마이크로프로세서, 또는 명령(instruction)을 실행하고 응답할 수 있는 다른 어떠한 장치와 같이, 하나 이상의 범용 컴퓨터 또는 특수 목적 컴퓨터를 이용하여 구현될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 면역관문 단백질에 특이적으로 결합하는 형광표지자는 PD-1에 특이적인 항체, PD-L1에 특이적인 항체 및 CTLA-4에 특이적인 항체로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 림프계 또는 골수계 단백질에 특이적으로 결합하는 형광표지자는 CD18에 특이적인 항체, CD16에 특이적인 항체, CD29에 특이적인 항체, CD61에 특이적인 항체, CD104에 특이적인 항체, CD32에 특이적인 항체, CD11b에 특이적인 항체 및 CD64에 특이적인 항체로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 면역관문 억제제는 면역관문 단백질의 기능을 억제할 수 있는 물질이면 제한없이 사용할 수 있고, 단백질, 화합물, 천연물, DNA, RNA, 펩타이드 등일 수 있으며, 바람직하게는 항체일 수 있고, 보다 바람직하게는 단일클론 항체일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 인간 항체, 인간화 항체, 또는 키메라 항체인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 면역관문 억제제는 PD-L1 길항제, PD-1 길항제, 및 CTLA-4 길항제로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서, 용어 “PD-1 길항제"는 PD-1과 하나 이상의 그의 결합 파트너, 예컨대 PD-L1 및/또는 PD-L2와의 상호작용으로부터 유래된 신호 형질도입을 감소, 차단, 억제, 폐지 또는 방해하는 분자이다. 일부 구현예에서, PD-1 길항제는 PD-1의 그의 결합 파트너에 대한 결합을 억제하는 분자이다. 구체적인 양태에서, PD-1 길항제는 PD-1의 PD-L1 및/또는 PD-L2에 대한 결합을 억제한다. 예를 들어, PD-1 길항제는 항 PD-1 항체 및 이의 항원-결합 단편, 면역부착소, 융합 단백질, 올리고펩타이드, 소분자 길항제, 폴리뉴클레오타이드 길항제 및 PD-1과 PD-L1 및/또는 PD-L2의 상호작용으로부터 유래된 신호 형질도입을 감소, 차단, 억제, 폐지 또는 방해하는 다른 분자를 포함한다. 일 구현예에서, PD-1 길항제는 기능이상 T-세포가 기능이상을 덜하도록, PD-1 또는 PD-L1을 통한 신호전달을 매개한 T 림프구 및 다른 세포 상에서 발현된 세포 표면 단백질에 의해 또는 세포 표면 단백질을 통해 매개되는 음성 신호를 감소시킨다. 일부 구현예에서, PD-1 길항제는 항-PD-1 항체이다.
본 발명에서, 용어 "PD-L1 길항제"는 PD-L1과 하나 이상의 그의 결합 파트너, 예컨대 PD-1 또는 B7-1과의 상호작용으로 인한 신호 형질도입을 감소, 차단, 억제, 폐지 또는 방해하는 분자를 지칭한다. 일부 구현예에서, PD-L1 길항제는 PD-L1의 그의 결합 파트너에 대한 결합을 억제하는 분자이다. 구체적인 양태에서, PD-L1 길항제는 PD-L1과 PD-1 및/또는 B7-1의 결합을 억제한다. 일부 구현예에서, PD-L1 길항제는 항-PD-L1 항체, 이의 항원-결합 단편, 면역부착소, 융합 단백질, 올리고펩타이드, 및 PD-L1과 그의 결합 파트너, 예컨대 PD-1 또는 B7-1와의 상호작용으로 인한 신호 형질도입을 감소, 차단, 억제, 폐지 또는 방해하는 다른 분자를 포함한다. 일 구현예에서, PD-L1 길항제는 기능이상 T-세포가 기능이상을 덜하도록(예를 들어, 항원 인식에 대한 효과기 반응을 증진), PD-L1을 통한 신호전달을 매개한 T 림프구 상에서 발현된 세포 표면 단백질에 의해 또는 세포 표면 단백질을 통해 매개되는 음성 공통자극 신호를 감소시킨다. 일부 구현예에서, PD-L1 길항제는 항-PD-L1 항체이다.
본 발명에서, 용어 "CTLA4 길항제"는 CTLA4와 하나 이상의 그의 결합 파트너, 예컨대 B7-1과의 상호작용으로 인한 신호 형질도입을 감소, 차단, 억제, 폐지 또는 방해하는 분자를 지칭한다. 일부 구현예에서, CTLA4 길항제는 CTLA4의 그의 결합 파트너에 대한 결합을 억제하는 분자이다. 구체적인 양태에서, CTLA4 길항제는 CTLA4과 B7-1의 결합을 억제한다. 일부 구현예에서, CTLA4 길항제는 항- CTLA4 항체, 이의 항원-결합 단편, 면역부착소, 융합 단백질, 올리고펩타이드, 및 CTLA4과 그의 결합 파트너, 예컨대 B7-1와의 상호작용으로 인한 신호 형질도입을 감소, 차단, 억제, 폐지 또는 방해하는 다른 분자를 포함한다. 일 구현예에서, CTLA4 길항제는 기능이상 T-세포가 기능이상을 덜하도록(예를 들어, 항원 인식에 대한 효과기 반응을 증진), CTLA4를 통한 신호전달을 매개한 T 림프구 상에서 발현된 세포 표면 단백질에 의해 또는 세포 표면 단백질을 통해 매개되는 음성 공통자극 신호를 감소시킨다. 일부 구현예에서, CTLA4 길항제는 항- CTLA4 항체이다.
본 발명에 있어서, 상기 면역관문 억제제는 펨브로리주맙(Pembrolizumab, (키트루다(Keytruda)), 니볼루맙(Nivolumab, (옵디보(Opdivo)), 세미플리맙(Cemiplimab, (립타요(Lybtayo)), 아테졸리주맙(Atezolizumab, (티센트릭(Tecentriq)), 아벨루맙(Avelumab, (바벤시오(Bacencio)), 더발루맙(Durvalumab, (임핀지(Imfinzi)), 이필리무맙(Ipilimumab, 여보이(Yervoy)) 및 트리멜리무맙(Tremelimumab)으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 암은 상기 암은 폐암, 신장암, 방광암, 유방암, 결장직장암, 난소암, 췌장 암, 위 암종, 식도암, 중피종, 흑색종, 두경부 암, 갑상선암, 육종, 전립선암, 교모세포종, 자궁경부암, 흉선 암종, 백혈병, 림프종, 골수종, 균상식육종, 머켈 세포 암, 또는 혈액성 악성종양으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 폐암, 가장 바람직하게는 비소세포폐암 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 다른 관점에서,
다음의 단계를 포함하는 암 치료방법에 관한 것이다:
(a) 분리된 혈중 순환 암세포에서 면역관문 단백질 및 림프계 또는 골수계 특이적 단백질의 발현을 확인하는 단계; 및
(b) 면역관문 단백질 발현이 양성이고, 림프계 또는 골수계 특이적 단백질의 발현이 양성일 때, 면역관문 억제제를 투여하는 단계.
본 발명은 또 다른 관점에서,
다음의 단계를 포함하는 면역관문 억제제에 대한 감수성(susceptibility) 결정방법에 관한 것이다:
(a) 분리된 혈중 순환 암세포에서 면역관문 단백질 및 림프계 또는 골수계 특이적 단백질의 발현을 확인하는 단계; 및
(b) 면역관문 단백질 발현이 양성이고, 림프계 또는 골수계 특이적 단백질의 발현이 양성일 때, 면역관문 억제제에 대한 감수성이 있는 것으로 결정하는 단계.
본 발명은 또 다른 관점에서,
다음의 단계를 포함하는 암 환자의 면역항암요법 선택 방법에 관한 것이다:
(a) 분리된 혈중 순환 암세포에서 면역관문 단백질 및 림프계 또는 골수계 특이적 단백질의 발현을 확인하는 단계; 및
(b) 면역관문 단백질 발현이 양성이고, 림프계 또는 골수계 특이적 단백질의 발현이 양성일 때, 면역관문 억제제를 치료요법으로 선택하는 단계.
본 발명은 또 다른 관점에서,
면역관문 단백질 발현이 양성이고, 림프계 또는 골수계 특이적 단백질 발현이 양성인 개체를 치료하기 위한 면역관문억제제를 포함하는 암 치료용 약학조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서,
면역관문 단백질 발현이 양성이고, 림프계 또는 골수계 특이적 단백질 발현이 양성인 개체를 치료하기 위한 치료용 약제의 제조를 위한 면역관문억제제의 용도에 관한 것이다.
실시예
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 혈중 CTC 분리
본 연구는 연구윤리위원회 (IRB) 승인을 받았으며, 폐암환자 20명 (표 1) 및 염증환자 20명 (표 2)의 조직 및 혈액 샘플은 사전 동의를 받아 사용하였다.
Figure PCTKR2022005130-appb-img-000001
Figure PCTKR2022005130-appb-img-000002
상기 환자의 혈액에서 SmartBiopsyTM cell Isolation kit (싸이토젠) 및 SmartBiopsyTM cell Isolator (싸이토젠)을 이용하여 제조사의 지시에 따라 CTC를 분리하였다. SmartBiopsyTM cell Isolator에 적용되는 고밀도 마이크로칩은 5μm 기공 사이즈 (pore size)의 칩을 사용함으로써 5μm보다 큰 사이즈의 표적 세포는 칩 위에 채집되도록 하였다. 마이크로칩의 기공 사이즈는 조절이 가능하므로 특정 사이즈 세포를 선택적으로 회수할 수 있도록 고안된 마이크로칩이다 (US10,502,668, KR10-1254675).
Smart Biopsy™ Cell Isolator (CIS030)
- Smart Biopsy™ Cell Isolator는 용액으로부터 표적하는 대상(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)의 높이를 인식하여 ADP(Air Displacement Pipette)로 혼합, 운반 및 Filtering을 자동으로 진행하는 장비임. 본 장비의 시스템은 X-Y Main Axis, ADP, Chip Handler, Consumable Table로 구성되어 있음. 기본적으로Smart Biopsy™ Cell Isolator의 구동은 소프트웨어를 사용하여 매뉴얼에 순서에 따라 작동됨.
실시예 2. 분리된 CTC의 선별을 위한 마커 스크리닝
2-1. CTC 염색 방법
Smart Biopsy™ IF Stainer (CST030)
- 자동 면역 염색 장비로써 총 12개의 슬라이드의 동시 염색 수행이 가능함. 해당 장비의 시스템은 X-Y Main axis module, 1ml pipette(ADP) module, covering module, consumable parts module, vision parts module로 구성되어 있으며 소모품 테이블(Consumable table)이 포함되어 있음. Smart Biopsy™ Cell Isolator는 자체 제작 소프트웨어를 사용하여 매뉴얼에 따라 작동시킴.
혈중 순환 종양세포 염색 방법
[Smart Biopsy™ IF Stainer 방식]
1. Smart Biopsy™ IF Stainer장비에 세포를 고정시킨 슬라이드와 필요한 항체 (ex: EpCAM, Vimentin, PD-L1, CD18, CD45항체)를 장비 내Buffer tube)에 각각 넣어준 후 장비 메뉴얼에 따라 작동함
2. Washing, blocking, 1차 항체 / 2차 항체 염색, Mounting 과정이 자동적으로 이루어지며 총 6시간 (12개 슬라이드 기준)이 소요됨.
3. Smart Biopsy™ IF Stainer을 통한 모든 염색 프로세스는 하기 [메뉴얼 방식]에 따라 작동함.
[Manual 방식]
1. 시료(슬라이드)에 0.2% Triton X-100 50㎕를 10분간 처리 후 PBS를 사용하여 5분간 3회 수세과정(washing)을 거침.
2. Non-specific binding을 줄이기 위하여 1% BSA를 사용하여 1시간 동안 Blocking 진행
3. 필요한 항체(ex: 면역세포의 negative selection을 위한 Anti-CD45, 림프계 세포의 negative selection를 위한 Anti-CD18 및 positive selection을 위한 PD-L1 항체)들을 각각 1% BSA에 희석하여 1시간 동안 처리함. (1차 항체 처리)
4. 두 개의 다른 파장을 가진 2차항체 (('goat Anti-mouse Alexa Fluor 647‘, 'goat Anti-rabbit Alexa Fluor 546')를 1% BSA에 희석한 후 1시간 동안 상온 보관함. (2차 항체 처리)
5. 폐암 순환종양세포 특이적 항체(PD-L1)과의 교차반응 억제를 위하여 blocking 과정을 1시간 처리함.
6. 순환종양세포 표지자인 ‘Anti-EpCAM Alexa Fluor 488 conjugated 항체를 1시간 동안 상온 보관함.
7. PBS를 사용하여 5분간 3회 수세과정(washing)을 거침.
8. DAPI 염색 과정을 거친 후 cover glass를 사용하여 Mounting 과정을 진행함.
2-2. CTC 선별을 위한 마커 선별
혈액 내 CTC를 좀 더 명확히 확인하기 위해 환자 혈액내 PBMC에서 하기 표 3의 항체와 2차 항체로 Thermo Fisher의 anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 546 (A-11010/ 2 mg/mL)과 anti-mouse IgG, Alexa Fluor 546 (A-11003/ 2 mg/mL)를 사용하여 마커의 발현 레벨을 확인한 결과, 도 3에 기재된 바와 같이 여러 마커 중, CD18의 발현량이 가장 높은 것을 확인하였다.
Figure PCTKR2022005130-appb-img-000003
실시예 3. 선별한 마커 기반 CTC 염색
Isolator에 의해 분리된 세포(대략 500~10000개 이상)를 세포 원심분리법인 싸이토스핀(cytospin) 과정을 수행하여 염색용 슬라이드에 고정시켰다.
면역세포의 negative selection을 위해 CD45 및 CTC의 positive selection을 위해 EpCAM/Vimentin, PD-L1 및 CD18 마커를 사용하여 분리된 CTC의 특성을 확인하였다.
항체로는 EpCAM/Vimentin, PD-L1, CD18 항체 및 CD45 항체를 사용하였으며, 항체 정보는 하기 표 4와 같다. 마지막으로 세포 핵을 염색할 수 있는 DAPI(4′,6-diamidino-2-phenylindole)를 추가하여 SmartBiopsyTM IF Stainer (CST030, 싸이토젠)를 사용하여 제조사의 지시에 따라 세포 염색을 진행하였다.
Figure PCTKR2022005130-appb-img-000004
실시예 4. CTC 형광 이미지 분석
SmartBiopsyTM Cell Image Analyzer (싸이토젠)를 이용하여 형광 표지 CTC가 로딩된 슬라이드의 이미지를 촬영하고, EpCAM/Vimentin, PD-L1, CD18 발현 세포의 수와 형광 강도를 측정하였다(도 1, 도 2 및 도 4).
염증 환자와 폐암 환자의 혈액 샘플을 이용하여 PD-L1 및 CD18을 발현하는 CTC 세포를 확인하였다(도 1). 본 발명에서는 PD-L1 발현 분석을 통한 면역항암요법 결정시 그 정확도를 높이고자 CD18 마커를 추가로 도입하였다.
따라서, 전체 CTC, 즉 EpCAM&Vim(+) 발현 세포를 기준으로 EpCAM&Vim(+)/PD-L1(+) 및 EpCAM&Vim(+)/PD-L1(+)/CD18(+) 세포의 비를 비교하였다. 아울러, 추가로 PD-L1 형광 강도 및 pure PD-L1(+) 세포수를 함께 분석하여 정확도를 높일 수 있었다.
실시예 5. CTC 기반 PD-L1 발현 분석
5-1. 폐암 환자군 분석
먼저 폐암 환자군에서 CTC 기반 PD-L1 발현을 분석하고, 조직과 그 결과를 비교하였다.
즉, EpCAM&Vim(+)을 발현하는 CTC 중 EpCAM&Vim(+)/PD-L1(+) 및 EpCAM&Vim(+)/PD-L1(+)/CD18(+) 세포의 비율을 확인하고, 조직의 TPS 값과 비교하였다.
폐암 환자 20명의 조직에서 PD-L1 발현 분석은 다코 팜dx(DAKO pharmdx) 클론 22c3 및 VENTANA SP263으로 수행하였고, 동일 환자의 CTC에서도 PD-L1(+) 및 PD-L1(+)/CD18(+) 발현을 비교하였다(표 5). 폐암 환자의 액체생검 기반 순환종양세포의 PD-L1 양성 세포수를 계수하고 표적 항체 특이적 항체 민감도 및 특이도 산출하여, 최종적으로 임상현장의 TPS와 비교 분석함으로써 해당 유효지표의 대변 가능성을 비교하고, 성능을 검증하였다.
Figure PCTKR2022005130-appb-img-000005
그 결과, PD-L1 마커만을 사용한 경우보다 CD18을 추가로 사용한 경우 조직과의 일치도가 획기적으로 증가한 것을 확인하였다. 즉, 22C3의 TPS (%) 기준으로 PD-L1(+) 세포(%)를 비교할 경우, 대략적인 일치도가 65%에서 80% 정도로 증가한 것을 알 수 있다. 따라서, CTC 기반 면역항암요법 결정을 위한 PD-L1 발현 분석은 CD18 마커를 추가로 도입하는 것이 정확도 및 조직과의 일치도를 높일 수 있다.
다만, 조직과 일치하지 않는 경우에는 PD-L1(+) CTC의 개수 및 형광강도를 추가로 분석하여 비교 검증하였다(표 7).
5-2. 염증 환자군 분석
다음으로 염증 환자군에서 폐암 환자군과 동일한 방법으로 PD-L1 발현을 검증하였다.
Figure PCTKR2022005130-appb-img-000006
그 결과, PD-L1 마커만을 사용했을 경우 염증 환자의 염증세포에서도 높은 비율로 PD-L1이 발현하고 있음을 알 수 있었다. 그러나, CD18(+)을 추가 마커로 사용한 경우에는 염증세포 내 PD-L1을 발현하는 세포의 비율이 감소한 것을 확인하였다(표 6). PD-L1(+) 발현 세포비가 50% 이상인 경우를 양성으로 볼 때, PD-L1(+) 발현 세포가 30% 정도에서 20% 정도로 감소한 것을 확인할 수 있었다.
상기 표 6에서 PD-L1(+)의 세포 비율은 전체 CTC, 즉 EpCAM&Vim(+) 발현 세포를 기준으로 EpCAM&Vim(+)/PD-L1(+) 및 EpCAM&Vim(+)/PD-L1(+)/CD18(+)의 세포 비율을 구하였다.
실시예 6. PD-L1(+) 세포의 개수 및 형광 강도 분석
표 5에서 조직과 일치하지 않은 경우 및 표 6의 염증환자에서 PD-L1(+) 발현 세포가 검출된 경우, PD-L1(+) CTC의 개수 및 형광강도를 추가로 분석하여 CTC 기반 면역항암요법 결정 방법을 구축하고 검증하였다.
염증 환자의 경우, PD-L1(+) 세포 발현이 검출된 8명에서 PD-L1(+)/CD18(+) 세포수 및 형광강도를 확인하였다(표 7).
Figure PCTKR2022005130-appb-img-000007
그 결과, 대부분 세포수는 1개, 형광강도는 평균 11.2로 나타났다.
그 다음으로 폐암 환자군의 경우, 조직 TPS와 CTC 결과가 일치한 환자와 불일치한 환자에서 PD-L1(+)/CD18(+) 세포수 및 형광강도를 확인하였다(표 8).
Figure PCTKR2022005130-appb-img-000008
그 결과, CGL08 및 CGL19와 같이 조직과 CTC 모두 양성으로 일치한 경우에는 세포수 3~10개, 형광강도 19.41~24.88로 확인되었다. 또한, CGL21과 같이 조직과 CTC 모두 음성으로 일치한 경우에 세포수 3개, 형광강도는 14.8이였다. CGL27, CGL29 및 CGL30은 세포수가 모두 1개, 형광강도는 8.9~10.3이나, 조직 TPS와 일치하거나 불일치 하였다.
상기 결과에 따르면, PD-L1(+)/CD18(+) 세포수가 3개 이상 및 형광 강도가 약 19 이상일 경우, CTC 기반 면역항암요법 결정시 양성으로 판단이 가능하다. 또한, PD-L1(+)/CD18(+) 세포수가 3개 이상 및 형광 강도가 약 15 이하일 경우, CTC 기반 면역항암요법 결정시 음성으로 판단이 가능하다.
상기 결과들을 종합해보면, 세포수 1개 이하일 경우에는 조직과의 일치도 또는 CTC 기반의 면역항암요법 결정 방법이 유효하지 않은 것으로 볼 수 있다. 염증 환자에서 위양성으로 볼 수 있는 CTC 세포의 수도 모두 1개 이하이므로, 폐암 환자에서도 1개 이하의 CTC 세포로는 면역항암요법 결정이 불가능하다고 볼 수 있다.
또한 형광강도를 살펴보면, 염증 환자에서 위양성으로 볼 수 있는 CTC 세포의 형광강도 평균이 11.2였으므로, 11.2 이하의 형광 강도를 나타낼 경우 이를 기준으로 면역항암요법 결정시 음성으로 판단이 가능할 것이다. 폐암 환자군에서 조직 TPS와 음성으로 일치하는 CGL21의 경우에는 세포수 3개, 평균 형광강도 14.8로 나타났기 때문에, 폐암 환자에서 14.8 이하의 형광 강도를 나타낼 경우에는 면역항암요법 결정시 음성으로 판단이 가능할 것으로 보인다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
본 발명에 따른 순환종양세포를 이용한 암 치료방법은 액체생검에서 면역관문 단백질과 림프계 또는 골수계 세포 특이적 단백질의 발현을 동시에 확인하여 환자를 선별하기 때문에 조직검사와의 일치도가 월등히 뛰어나 상업적 활용도가 높으므로, 본 발명의 방법은 암 진단 및 치료에 유용하다.

Claims (19)

  1. 다음의 단계를 포함하는 면역항암제 적용을 위한 환자 선별방법:
    (a) 혈중 순환 암세포에서 면역관문 단백질 및 림프계 또는 골수계 특이적 단백질의 발현을 확인하는 단계; 및
    (b) 면역관문 단백질 발현이 양성이고, 림프계 또는 골수계 특이적 단백질의 발현이 양성으로 확인되는 환자를 면역항암제가 적용가능한 환자로 분류하는 단계.
  2. 제1항에 있어서, 상기 면역관문 단백질은 PD-1, PD-L1 및 CTLA-4로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 림프계 또는 골수계 특이적 단백질은 CD18, CD16, CD29, CD61, CD104, CD32, CD11b 및 CD64로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 분리된 혈중 순환 암세포는 다음의 단계를 수행하여 분리되는 것을 특징으로 하는 방법:
    (i) 암 환자로부터 혈액을 획득하는 단계; 및
    (ii) 상기 혈액으로부터 바이오칩을 이용하여 혈중 순환 암세포를 분리하는 단계.
  5. 제1항에 있어서, 상기 면역관문 단백질 및 림프계 또는 골수계 특이적 단백질의 발현은 다음의 단계를 수행하여 확인하는 것을 특징으로 하는 방법:
    (1) 혈중 순환 암세포에 특이적으로 결합하는 형광표지자; 면역관문 단백질에 특이적으로 결합하는 형광표지자; 및 림프계 또는 골수계 특이적 단백질에 특이적으로 결합하는 형광표지지와 반응시키는 단계;
    (2) 상기 형광표지자와 반응시킨 혈중 순환 암세포; 면역관문 단백질; 및 림프계 또는 골수계 특이적 단백질을 대상으로 복수 파장범위 각각에 대한 광학 이미지를 수신하는 단계;
    (3) 상기 복수 파장범위 전체 또는 일부의 광학 이미지에서 상기 암 세포; 면역관문 단백질; 및 림프계 또는 골수계 특이적 단백질에 대한 형광강도를 측정하여 1차 필터링을 수행하는 단계;
    (4) 상기 복수 파장범위 전체 또는 일부의 광학 이미지에서 상기 암 세포에 대한 모폴로지(morphology)를 측정하여 2차 필터링을 수행하는 단계; 및
    (5) 상기 복수 파장범위 각각에 대한 광학 이미지 중 전체 또는 일부를 병합한 통합 이미지에서 상기 혈중 순환 암세포에 대한 모폴로지를 측정하여 3차 필터링을 수행하는 단계.
  6. 제5항에 있어서, 상기 혈중 순환 암세포에 특이적으로 결합하는 형광표지자는 비멘틴(vimentin)에 특이적인 항체, EpCAM에 특이적인 항체 및 CK에 특이적인 항체로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제5항에 있어서, 상기 면역관문 단백질에 특이적으로 결합하는 형광표지자는 PD-1에 특이적인 항체, PD-L1에 특이적인 항체 및 CTLA-4에 특이적인 항체로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제5항에 있어서, 상기 림프계 또는 골수계 단백질에 특이적으로 결합하는 형광표지자는 CD18에 특이적인 항체, CD16에 특이적인 항체, CD29에 특이적인 항체, CD61에 특이적인 항체, CD104에 특이적인 항체, CD32에 특이적인 항체, CD11b에 특이적인 항체 및 CD64에 특이적인 항체로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 면역관문 억제제는 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 면역관문 억제제는 단일클론 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 면역관문 억제제는 인간 항체, 인간화 항체, 또는 키메라 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제1항에 있어서, 상기 면역관문 억제제는 PD-L1 길항제, PD-1 길항제, 및 CTLA-4 길항제로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제1항에 있어서, 상기 면역관문 억제제는 펨브로리주맙(Pembrolizumab, (키트루다(Keytruda)), 니볼루맙(Nivolumab, (옵디보(Opdivo)), 세미플리맙(Cemiplimab, (립타요(Lybtayo)), 아테졸리주맙(Atezolizumab, (티센트릭(Tecentriq)), 아벨루맙(Avelumab, (바벤시오(Bacencio)), 더발루맙(Durvalumab, (임핀지(Imfinzi)), 이필리무맙(Ipilimumab, 여보이(Yervoy)) 및 트리멜리무맙(Tremelimumab)으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제1항에 있어서, 상기 암은 상기 암은 폐암, 신장암, 방광암, 유방암, 결장직장암, 난소암, 췌장 암, 위 암종, 식도암, 중피종, 흑색종, 두경부 암, 갑상선암, 육종, 전립선암, 교모세포종, 자궁경부암, 흉선 암종, 백혈병, 림프종, 골수종, 균상식육종, 머켈 세포 암, 또는 혈액성 악성종양으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 암은 폐암인 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제14항에 있어서, 상기 암은 비소세포페암인 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 다음의 단계를 포함하는 암 환자의 면역항암요법 선택 방법:
    (a) 분리된 혈중 순환 암세포(circulating tumor cell, CTC)에서 면역관문 단백질 및 림프계 또는 골수계 특이적 단백질의 발현을 확인하는 단계; 및
    (b) 면역관문 단백질 발현이 양성이고, 림프계 또는 골수계 특이적 단백질의 발현이 양성일 때, 면역관문 억제제를 치료요법으로 선택하는 단계.
  18. 다음의 단계를 포함하는 암 치료방법:
    (a) 혈중 순환 암세포에서 면역관문 단백질 및 림프계 또는 골수계 특이적 단백질의 발현을 확인하는 단계; 및
    (b) 면역관문 단백질 발현이 양성이고, 림프계 또는 골수계 특이적 단백질의 발현이 양성일 때, 면역관문 억제제를 투여하는 단계.
  19. 다음의 단계를 포함하는 면역관문 억제제에 대한 감수성(susceptibility) 결정방법:
    (a) 혈중 순환 암세포에서 면역관문 단백질 및 림프계 또는 골수계 특이적 단백질의 발현을 확인하는 단계; 및
    (b) 면역관문 단백질 발현이 양성이고, 림프계 또는 골수계 특이적 단백질의 발현이 양성일 때, 면역관문 억제제에 대한 감수성이 있는 것으로 결정하는 단계.
PCT/KR2022/005130 2021-04-09 2022-04-08 면역관문억제제를 이용한 암 치료방법 WO2022216113A1 (ko)

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