CN117157525A

CN117157525A - 使用免疫检查点抑制剂治疗癌症的方法

Info

Publication number: CN117157525A
Application number: CN202280025528.7A
Authority: CN
Inventors: 全炳熙
Original assignee: Cytogen Inc
Current assignee: Cytogen Inc
Priority date: 2021-04-09
Filing date: 2022-04-08
Publication date: 2023-12-01
Also published as: CN117222894A

Abstract

本发明涉及一种使用免疫检查点抑制剂治疗癌症的方法，更具体地说，涉及一种通过在从血液中分离的循环肿瘤细胞中确认免疫检查点蛋白以及淋巴细胞特异性蛋白或骨髓细胞特异性蛋白的表达，选择免疫检查点蛋白的表达为阳性而淋巴细胞特异性蛋白或骨髓细胞特异性蛋白的表达为阴性的患者作为癌症免疫疗法适用的患者，并对该患者给药免疫检查点抑制剂来治疗癌症的方法。根据本发明的使用循环肿瘤细胞治疗癌症的方法同时确认液体活检中免疫检查点蛋白以及淋巴细胞特异性蛋白或骨髓细胞特异性蛋白的表达，然后通过去除假阳性循环肿瘤细胞来选择患者，从而具有高准确性和高商业实用性，因此，本发明的方法可用于诊断和治疗癌症。

Description

使用免疫检查点抑制剂治疗癌症的方法

技术领域

本发明涉及一种使用免疫检查点抑制剂治疗癌症的方法，更具体地，涉及一种通过在从血液中分离的循环肿瘤细胞中检查免疫检查点蛋白以及淋巴细胞特异性蛋白或骨髓细胞特异性蛋白的表达，选择发现免疫检查点蛋白的表达为阳性而淋巴细胞特异性蛋白或骨髓细胞特异性蛋白的表达为阴性的患者作为癌症免疫治疗药物适用的患者，并对该患者给药免疫检查点抑制剂来治疗癌症的方法。

背景技术

癌症是对人类健康最致命的威胁之一。在美国，癌症每年影响近130万新患者，是仅次于心脏病的第二大死因，并且四分之一的人死于癌症。此外，癌症有望在5年内超过心血管疾病成为头号死因。实体瘤是这些死亡的主要原因。

虽然已经尝试了各种治疗癌症的方法，但是每个患者的临床结果和预后并不总是与报道的数据相匹配，并且因此在过去20年里，所有癌症患者的总体五年存活率仅提高了约10％。因此，当通过预测癌症患者对治疗药物的反应性和癌症患者的预后来为具有异质性特征的癌症患者提供最合适的治疗时，可以避免与不必要的治疗相关的毒性并最终增强治疗效果。

根据这种需要，近年来，已经积极进行了关于伴随诊断(companion diagnostic)的研究，伴随诊断是指能够基于患者个体因素的系统分析结果为选择合适的靶向抗癌药物和治疗方法提供信息的认证的诊断。伴随诊断可以根据医生的诊断为处方提供明确的临床依据，并且可以为患者提供合适的治疗，从而提高癌症治疗效率以及减少靶向抗癌药物的误用，以有助于国民健康保险的财务稳健性。目前，在乳腺癌、肺癌、结直肠癌、胃癌、黑素瘤等的治疗领域中，伴随诊断市场正在增长，并且特别是，乳腺癌和肺癌治疗领域有望引领市场增长。随着制药公司降低开发新药的成本，以及对靶向治疗的需求增加，伴随诊断的全球市场每年都在高速增长。

同时，免疫疗法使用患者自身的免疫系统来攻击癌症，而不管其来源。免疫系统受制衡网络的调节，该网络进化为攻击外来入侵者诸如细菌和病毒。然而，癌症可以通过表达抑制免疫系统攻击癌细胞的蛋白质(例如，PD-L1和PD-L2)来逃避免疫系统。

特别地，肿瘤细胞和T细胞之间的相互作用涉及肿瘤细胞上的主要组织相容性复合体(MHC)和T细胞上的T细胞受体(TCR)之间的接触。当MHC和T细胞受体接触时，T细胞被激活，从而肿瘤细胞被破坏。

如果肿瘤细胞在其表面表达免疫检查点蛋白PD-L1，那么它们可以逃脱T细胞免疫监测。当PD-L1存在时，其与T细胞表达的PD-1结合，并通过阻断T细胞激活来抑制T细胞免疫监视。

已经开发了可以阻断PD-L1/PD-1相互作用的免疫检查点抑制剂。这类药物使得T细胞免疫监视机制再次正常发挥作用，因此肿瘤细胞可以通过受试者的正常免疫应答而被破坏。对T细胞上的CTLA-4的阻断也有类似的效果(Hodi et al.,N.Engl.J.Med.Vol.363,pp.711-23,2010)。

有效使用免疫检查点抑制剂的关键是确定患有癌症的特定受试者是否会对药物产生反应。如果向其肿瘤细胞不表达PD-L1的患者给药结合PD-L1或PD-1并充当免疫检查点抑制剂的抗体，那么治疗将无效。迄今为止，这些免疫检查点抑制剂的反应性仅为20％至30％(Herbst RS,et al.The New England Journal of Medicine.Vol.383(14),pp.1328-39,2020)。

作为测量PD-L1表达率的方法，计算患者组织细胞中PD-L1的肿瘤细胞阳性比例分数(TPS)是目前所推荐的方法。例如，为了使帕博利珠单抗(pembrolizumab)(可瑞达(Keytruda))和纳武利尤单抗(nivolumab)(欧狄沃(Opdivo))(特异性地针对PD-1的抗体)有效地发挥作用，在患者活检中检测到的PD-L1的表达率应该为一定百分比(％)或更高，并且为了有资格获得健康保险福利，欧狄沃的PD-L1的表达率应该为10％或更高，可瑞达的应该为50％或更高。对于阿替利珠单抗(Tecentriq)，PD-L1在肿瘤细胞和肿瘤浸润性免疫细胞中的表达率应为5％或更高。

然而，通过肿瘤活检获得癌细胞用于PD-L1表达测量具有严重的缺点，包括给患者带来疼痛和不适，不能测量超过肿瘤的隔离区域，以及蛋白质表达谱在肿瘤微环境中随时间改变的可能性。此外，再次活检还会导致侵入性和其他复杂的问题。此外，免疫检查点抑制剂之间的患者识别标准不同，因此很难为患者选择最有效的治疗方法。

为了克服这些缺点，含有循环肿瘤细胞(CTC)、循环细胞游离DNA(cfDNA)以及外泌体的液体活检最近作为一种新的解决方案引起了关注(Rijavec E,et al.,Cancers.Vol.12(1):17,2020)。基于血液的活检相对于组织活检的改进之处在于它们可以提供对由肿瘤脱落或以其他方式脱离的细胞的实时顺序追踪。

血液样品可以更容易地获得，并且可以更经常地从患者身上获得。此外，可以随着时间的推移监测蛋白质表达谱的变化。循环肿瘤细胞(CTC)是一种癌症相关的细胞类型，可以容易地从外周血中分离，并且可以用作从组织活检中获得的肿瘤细胞的替代物。CTC是从实体瘤脱离进入血流的肿瘤细胞。CTC可以在癌、肉瘤、成神经细胞瘤和黑色素瘤患者的血液中发现。从基于血液的活检中获得的其他细胞类型的识别对于进一步开发使用该技术来识别将受益于免疫检查点抑制剂治疗的癌症患者将是至关重要的。

在这种技术背景下，本发明人进行了大量的努力来开发基于CTC的癌症治疗方法，并且结果发现，当同时检查免疫检查点蛋白的表达以及淋巴细胞特异性蛋白或免疫细胞特异性蛋白的表达，并向免疫检查点蛋白的表达为阳性而淋巴细胞特异性蛋白或免疫细胞特异性蛋白的表达为阴性的患者给药免疫检查点抑制剂时，免疫检查点抑制剂的癌症治疗效果得到增强，因为免疫检查点抑制剂可以在排除假阳性患者同时仅给药于对免疫检查点抑制剂有反应的患者，从而完成了本发明。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种选择适用于免疫检查点抑制剂的患者的方法。

本发明的另一个目的是提供一种治疗癌症的方法。

本发明的又一个目的是提供一种确定对免疫检查点抑制剂的易感性的方法。

本发明的再一个目的是提供一种为癌症患者选择癌症免疫疗法的方法。

为了实现上述目的，本发明提供了一种选择适用于癌症免疫治疗药物的患者的方法，该方法包括以下步骤：(a)在分离的循环肿瘤细胞中检查免疫检查点蛋白以及淋巴特异性蛋白或骨髓特异性蛋白的表达；以及(b)将发现免疫检查点蛋白的表达为阳性而淋巴特异性蛋白或骨髓特异性蛋白的表达为阴性的患者分类为可适用于癌症免疫疗法药物的患者。

本发明还提供了一种治疗癌症的方法，包括以下步骤：(a)在分离的循环肿瘤细胞中检查免疫检查点蛋白以及淋巴特异性蛋白或骨髓特异性蛋白的表达；以及(b)向免疫检查点蛋白的表达为阳性而淋巴特异性蛋白或骨髓特异性蛋白的表达为阴性的患者给药免疫检查点抑制剂。

本发明还提供了一种用于确定对免疫检查点抑制剂的易感性的方法，该方法包括以下步骤：(a)在分离的循环肿瘤细胞中检查免疫检查点蛋白以及淋巴特异性蛋白或骨髓特异性蛋白的表达；以及(b)当识别出免疫检查点蛋白的表达为阳性而淋巴特异性蛋白或骨髓特异性蛋白的表达为阴性时，确定分离的循环肿瘤细胞对免疫检查点抑制剂是敏感的。

本发明还提供了一种为癌症患者选择癌症免疫疗法的方法，该方法包括以下步骤：(a)在分离的循环肿瘤细胞中检查免疫检查点蛋白以及淋巴特异性蛋白或骨髓特异性蛋白的表达；以及(b)当识别出免疫检查点蛋白的表达为阳性而淋巴特异性蛋白或骨髓特异性蛋白的表达为阴性时，选择免疫检查点抑制剂作为治疗药物。

本发明还提供了用于治疗癌症的药物组合物，其包含用于治疗免疫检查点蛋白的表达为阳性而淋巴特异性蛋白或骨髓特异性蛋白的表达为阴性的受试者的免疫检查点抑制剂。

本发明还提供了免疫检查点抑制剂在制备用于治疗免疫检查点蛋白的表达为阳性而淋巴特异性蛋白或骨髓特异性蛋白的表达为阴性的受试者的药物中的用途。

附图说明

图1示出了根据本发明的实施例获得的循环肿瘤细胞和免疫细胞的荧光图像。

图2示出了根据本发明的实施例获得的表达循环肿瘤细胞标志物和PD-L1的循环肿瘤细胞(A)，以及表达标志物和CD18的假阳性细胞(骨髓细胞，(B))的荧光图像。

图3描述了根据本发明的实施例，显示骨髓细胞系中CD16和CD18的表达的荧光图像(A)，以及显示定量表达的结果的图(B)。

图4描述了根据本发明的实施例，显示骨髓细胞系中CD11b和CD18的表达的荧光图像(A)，以及显示定量表达的结果的图(B)。

图5描述了根据本发明的实施例，显示患者血液样品中CD16和CD18的表达的荧光图像(A)，以及显示定量表达的结果的图(B)。

图6示出了根据本发明的实施方式的比较组织样品和CD18-/CD45-CTC之间的PD-L1肿瘤细胞阳性比例分数的结果。(A)：Bland-Altman图；以及(B)：散点图。

图7示出了根据本发明的实施例的分析CTC数量和癌组织大小之间的相关性的结果。

具体实施方式

除非另有定义，否则本说明书中使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的技术人员通常理解的相同的含义。通常，本说明书中使用的术语和下述实验方法是本领域公知且常用的。

术语，诸如“第一”、“第二”、“A”、“B”等可以用来描述各种成分，但是这些成分不受这些术语的限制。这些术语仅用于区分一种成分和另一种成分。例如，在不脱离本发明的范围的情况下，第一成分可以被指定为第二成分，并且类似地，第二成分也可以被指定为第一成分。术语“和/或”包括多个相关列出项的组合或多个相关列出项中的任何一个。

如本文所用，单数表达应理解为包括复数表达，除非在其上下文中另有说明。应当了解，术语“包括”等意在表示所陈述的特征、数字、步骤、操作、成分、部件或其组合的存在，但是不排除一个或多个其他特征、数字、步骤、操作、成分、部件或其组合的存在或添加。

此外，在执行方法或操作方法时，构成该方法的步骤可以以与上下文中描述的顺序不同的顺序来进行，除非上下文中清楚地描述了特定顺序。也就是说，这些步骤可以根据所描述的顺序进行，或者可以基本上同时进行，或者可以以相反的顺序进行。

如本文所用，术语“抗体”以最广泛的意义使用，并且涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出所需的抗原结合活性。

如本文所用，术语“生物标志物”是指能够在样品中检测到的指示物。该生物标志物可以充当以某些分子、病理学、组织学和/或临床特征为特征的特定疾病或疾患(例如，癌症)的指示物。

如本文所用，术语“癌症”和“癌性的”是指或描述典型特征在于不受调节的细胞生长/增殖的哺乳动物的生理状况。癌症的实例包括但不限于癌、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤和白血病。这些癌症的更具体的实例包括但不限于，肺癌，包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺的鳞状细胞癌；膀胱癌(例如，尿膀胱癌(UBC)、肌层浸润性膀胱癌(MIBC)和BCG难治性非肌层浸润性膀胱癌(NMIBC))；肾脏或肾癌(例如，肾细胞癌(RCC))；泌尿道癌症；乳腺癌(例如，HER2+乳腺癌和三阴性乳腺癌(TNBC)，它们是雌激素受体(ER-)、孕酮受体(PR-)以及HER2(HER2-)阴性的)；前列腺癌，诸如去势抵抗性前列腺癌(CRPC)；腹膜癌；肝细胞癌；胃或胃癌，包括胃肠癌和胃肠间质癌；胰腺癌；胶质母细胞瘤；宫颈癌；卵巢癌；肝癌；肝细胞瘤；结肠癌；直肠癌；大肠癌；子宫内膜癌或子宫癌；唾液腺癌；前列腺癌；外阴癌；甲状腺癌；肝癌；肛门癌；阴茎癌；黑色素瘤，包括浅表播散性黑色素瘤、恶性雀斑样痣黑色素瘤、肢端雀斑样痣黑色素瘤和结节性黑色素瘤；多发性骨髓瘤和B细胞淋巴瘤(包括低度/滤泡性非霍奇金淋巴瘤(NHL))；小淋巴细胞性(SL)NHL；中级/滤泡性NHL；中级弥漫性NHL；高级免疫母细胞性NHL；高级淋巴母细胞性NHL；高级小无裂细胞淋巴瘤；巨块疾病NHL；套细胞淋巴瘤；AIDS相关淋巴瘤；和瓦尔登斯特罗巨球蛋白血症)；慢性淋巴细胞白血病(CLL)；急性淋巴细胞白血病(ALL)；急性髓系白血病(AML)；毛细胞白血病；慢性成髓细胞白血病(CML)；移植后淋巴组织增生性疾病(PTLD)；和骨髓增生异常综合征(MDS)，以及与昏迷症、水肿(诸如与脑肿瘤相关的水肿)、梅格斯综合征、脑癌、头颈癌和相关转移瘤相关的异常血管增生。

如本文所用，术语“治疗(“treat”、“treating”和“treatment”)”具有其普通和习惯的含义，并且包括从受试者中完全或部分清除肿瘤或癌症、减小受试者中肿瘤的大小、杀死受试者中肿瘤或癌症的细胞、以及改善受试者中癌症或肿瘤的症状中的一种或多种。治疗是指相对于未给药免疫检查点抑制剂的受试者，清除、减少、杀死或改善约1％至约100％。优选地，清除、减少、杀死或改善约100％、约99％、约98％、约97％、约96％、约95％、约90％、约80％、约70％、约60％、约50％、约40％、约30％、约20％、约10％、约5％或约1％。治疗的结果可以是永久性的，或者可以持续若干天(诸如1、2、3、4、5、6或7天)、若干周(诸如1、2、3或4周)、若干个月(诸如1、2、3、4、5、6或更多个月)或若干年(诸如1、2、3、4、5、6或更多年)的时段。

如本文所用，术语“抑制("inhibit"、"inhibiting"和"inhibition")”具有其普通和惯用的含义，并包括一种或多种，阻碍、阻止、阻断、妨碍或抑制癌症或肿瘤的形成、癌症或肿瘤的发展、癌症或肿瘤的生长和转移。抑制是指相对于未给药免疫检查点抑制剂的受试者，阻碍约1％至约100％。优选地，阻碍约100％、约99％、约98％、约97％、约96％、约95％、约90％、约80％、约70％、约60％、约50％、约40％、约30％、约20％、约10％、约5％或约1％。抑制的方法可以在癌症或肿瘤的临床症状发作之前、同时或之后在受试者中实践。因此，受试者可能患有癌症或肿瘤，或者仅仅是易于发展成癌症或肿瘤。抑制剂的结果可以是永久性的，或者可以持续若干天(诸如1、2、3、4、5、6或7天)、若干周(诸如1、2、3或4周)、若干个月(诸如1、2、3、4、5、6或更多个月)或若干年(诸如1、2、3、4、5、6或更多年)的时段。

如本文所用，术语“给药”是指给予受试者一定剂量的化合物或组合物的方法。本文所述方法中使用的化合物和/或组合物可以通过以下方式给药：例如，静脉内(例如，通过静脉输注)、皮下、肌内、真皮内、经皮、动脉内、腹腔内、病灶内、颅内、关节内、前列腺内、胸膜内、气管内、鼻内、玻璃体内、阴道内、直肠内、局部、肿瘤内、腹膜内、结膜下、膀胱内、黏膜内、心包内、脐内、眼内、口服、外用、局部、通过吸入、通过注射、通过输注、通过连续输注、通过局部灌注直接浸泡靶细胞、通过导管、通过灌洗、在乳膏中或在脂质组合物中。给药方法可以根据各种因素(例如，被给药的化合物或组合物以及被治疗的病症、疾病或疾患的严重程度)而变化。

免疫检查点抑制剂和包含免疫检查点抑制剂的药物制剂可以使用不同的方案给药于受试者，这取决于该方法的特定目的或目标；受试者的年龄和大小；和受试者的总体健康状况，仅列举了几个要考虑的因素。通常，在治疗或抑制过程中，免疫检查点抑制剂和药物制剂可以给药一次、两次、三次、四次、五次、六次或更多次。给药方案中每次给药之间的时间可以在若干天、若干周、若干个月或若干年之间的范围内，并且包括每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30周或更多周给药一次。可以在给药方案的每个剂量中给药相同量的免疫检查点抑制剂，或者每个剂量中的量可以不同。在给药方案的每一剂量中，免疫检查点抑制剂的特性也可以变化或保持不变。

在本发明的每种方法中，向受试者给药“治疗有效量”的免疫检查点抑制剂或包含免疫检查点抑制剂的药物制剂。治疗有效量因受试者而异。然而，治疗有效量是足以实现该方法的目的或目标的量，无论是抑制还是治疗。例如，本发明方法中使用的免疫检查点抑制剂的治疗有效量通常为给药肽的受试者的每kg的体重约0.1μg至约10，000μg的免疫检查点抑制剂。治疗有效量还包括每kg的受试者体重约0.5μg至约5000μg、约1μg至约500μg、约10μg至约200μg、约1μg至约800μg、约10μg至约1000μg、约50μg至约5000μg、约50μg至约500μg、约100μg至约1000μg、约250μg至约2500μg、约500μg至约2000μg、约10μg至约800μg、约10μg至约1000μg、约1μg至约300μg以及约10μg至约300μg的免疫检查点抑制剂。

在可瑞达(用于现有免疫疗法的治疗药物)的情况下，据报道，作为在用可瑞达治疗的表达1％或更多PD-L1的患者中进行2/3期“KEYNOTE-010”试验的结果，随着PD-L1表达率更高，可瑞达的治疗效果更好，并且治疗反应根据PD-L1表达率而相对明显地有所区别，这表明PD-L1是癌症免疫疗法中的良好标志物。然而，在欧狄沃的情况下，据报道，作为在用欧狄沃治疗的晚期非鳞状非小细胞肺癌患者中的3期“Checkmate-057”试验数据的回顾性分析结果，PD-L1表达率为1％、5％和10％或更高的欧狄沃治疗组的客观缓解率(objectiveresponse rates，ORR)分别为31％、36％和37％，这是相似的。

此外，据报道，泰圣奇(Tecentriq)在对于现有铂类化疗无效的局部晚期或转移性非小细胞肺癌患者中进行的“OAK”试验中，与现有的多西他赛化疗相比，无论PD-L1是否表达，总生存期(OS)延长了约4个月，这表明泰圣奇不仅对PD-L1表达为阳性的患者有效，而且对PD-L1表达为阴性的患者也有效。

据报道，英飞凡(Imfinzi)在同时进行了铂类化疗和放疗后没有进展的3期非小细胞肺癌患者中进行的3期“PACIFIC”试验中，与安慰剂组相比，无进展生存期(PFS)大约增加了一倍，并且亚组分析的结果是，英飞凡表现出一致的效果，与PD-L1表达率无关。

毕竟，在目前的状态下，即使给药PD-1/PD-L1免疫检查点抑制剂，也不会在所有癌症患者中出现显著的治疗效果，并且用于测量这些治疗药物的PD-L1表达率的免疫组织化学(IHC)诊断装置的临床实用性存在问题。

例如，约28％的对治疗有反应的患者被诊断为假阴性PD-L1表达，并且错过了接受治疗的机会，约42％的对治疗无反应的患者被错误地诊断为假阳性PD-L1表达，并且因此存在给药的适宜性和经济可行性降低的风险。

本发明人进行了大量的努力以开发能够高效消除假阳性细胞的生物标志物，并开发了有效选择适用于癌症免疫疗法的患者的方法，结果发现，当同时检查免疫检查点蛋白的表达以及淋巴特异性蛋白或骨髓特异性蛋白的表达时，可以以高准确度选择癌症免疫疗法。

也就是说，在本发明的一种实施例中，证实了当用PD-L1和CD18抗体染色从血液中分离的CTC并检查这些蛋白质的表达水平时，与仅检测PD-L1的表达的方法相比，可以有效地消除假阳性细胞(图1和2)。

因此，在一个方面，本发明涉及一种选择适用于癌症免疫治疗药物的患者的方法，该方法包括以下步骤：(a)在分离的循环肿瘤细胞中检查免疫检查点蛋白以及淋巴特异性蛋白或骨髓特异性蛋白的表达；以及(b)将发现免疫检查点蛋白的表达为阳性而淋巴特异性蛋白或骨髓特异性蛋白的表达为阴性的患者分类为可适用于癌症免疫疗法药物的患者。

在本发明中，“蛋白表达为阳性”的表述是指通过本领域技术人员已知的各种方法，优选通过荧光强度识别出了分离的循环肿瘤细胞中的蛋白质的存在，但不限于此。

在本发明中，确定感兴趣的蛋白质的表达为阳性可以基于考虑到其中每种或所有蛋白质都有表达的细胞数量的特定截断值，以及基于每种蛋白质的表达强度(荧光强度)，或者可以通过确定表达水平是高于还是低于参考群体中的表达水平来进行，但不限于此。

在本发明中，“蛋白表达为阴性”的表述是指通过本领域技术人员已知的各种方法，优选通过荧光强度来未识别出分离的循环肿瘤细胞中蛋白质的存在，但不限于此。

在本发明中，确定感兴趣的蛋白质的表达为阴性可以基于考虑到其中每种或所有蛋白质都未表达的细胞数量的特定截断值，以及基于每种蛋白质的表达强度(荧光强度)，或者可以通过确定表达水平是高于还是低于参考群体中的表达水平来进行，但不限于此。

在本发明中，免疫检查点蛋白可以是，但不限于，任何参与免疫检查点相关信号转导通路的蛋白。优选地，免疫检查点蛋白可以选自由以下组成的组：CD27、CD28、CD40、CD122、CD137、OX40、GITR、ICOS、A2AR、B7-H3、BY-H4、CTLA-4、IDO、KIR、LAG3、NOX2、PD-1、PD-L1、TIM-3、VISTA和SIGLEC7，以及更优选地，选自由：PD-1、PD-L1和CTLA-4组成的组，最优选PD-L1，但不限于此。

在本发明中，淋巴特异性蛋白或骨髓特异性蛋白可以是，但不限于，在淋巴或骨髓细胞中表达的任何蛋白质。优选地，淋巴特异性蛋白或骨髓特异性蛋白可以选自由以下组成的组：CD18、CD29、CD61、CD104、ITGB5、ITGB6、ITGB7、ITGB8、CD49a、CD49b、CD49c、CD49d、CD49e、CD49f、ITGA7、ITGA8、ITGA9、ITGA10、ITGA11、CD11D、CD103、CD11a、CD11b、CD51、CD41、CD11c、CD64、CD32、CD16a、CD16b、CD23、CD89、FcRn、FcεRI和Fcα/μR，以及更优选地，可以选自由：CD18、CD16、CD29、CD61、CD104、CD32、CD11b和CD64组成的组，最优选CD18，但不限于此。

在本发明中，分离的循环肿瘤细胞可以通过以下步骤获得：

(i)从癌症患者获得血液；以及

(ii)使用生物芯片从血液中分离出循环肿瘤细胞。

如本文所用，术语“循环肿瘤细胞(CTC)”指在恶性肿瘤患者外周血中发现的肿瘤细胞。循环肿瘤细胞非常罕见，并且可用的样品量也非常有限。用于检测和表征血液中循环癌细胞的技术包括但不限于多重逆转录酶-定量聚合酶链式反应方法、基于成像的方法、微滤技术和微孔芯片装置。循环肿瘤细胞是能够作为肿瘤生物标志物液体活检样品，所述肿瘤生物标志物不可避免地提供个体化的治疗和治疗后随访。此外，循环肿瘤细胞可以用作用于理解肿瘤生物学特征和肿瘤细胞接种的靶标，但不限于此。

生物芯片是以现有的半导体芯片形式通过在由无机材料诸如半导体制成的固体基底上高度集成和组合物质诸如生物体衍生的DNA、蛋白质、酶、抗体、微生物、动物和植物细胞和器官以及神经元而制造的混合型装置。生物芯片是指一种工具或器件，其利用生物分子的固有功能来获取生物信息，诸如基因表达模式、基因结合或蛋白质分布，或加速生物化学过程和反应或信息处理。

高密度微孔芯片是指基于生物芯片的工作原理能够分离具有特定大小的物质的生物芯片。

高密度微孔芯片基于血细胞的大小差异，并且可以在10分钟内以约90％的回收率捕获循环肿瘤细胞。

在本发明的一种实施方式中，高密度微孔芯片的孔径可以优选为5.5至8.5μm，更优选为6.5至7.5μm。如果孔径小于5.5μm，则不能除去红细胞和白细胞，因为这些细胞会保留在芯片上而不能穿过芯片，如果孔径大于8.5μm，则不能选择性地回收循环肿瘤细胞，因为孔径大于循环肿瘤细胞的大小，因此循环肿瘤细胞能够穿过芯片。在本发明的一种实施方式中，高密度微孔芯片的孔形状可以是圆形、矩形或椭圆形，优选矩形。

在本发明的一种实施方式中，高密度微孔芯片的孔可以以规则的图案排列。在本发明的另一实施方式中，高密度微孔芯片可以具体地由不锈钢、镍、铝或铜制成。可以使用MEMS(微机电系统)技术通过蚀刻来形成孔。

孔的相邻两个孔之间的间距小于循环肿瘤细胞的直径。根据本发明的一种实施方式，两个孔之间的间距可以是对于循环肿瘤细胞的直径的45％至65％。高密度微孔芯片不会由于流过通道的血液或溶液的压力而变形。血液通过孔后排出到外部，以及血液中的循环肿瘤细胞不能通过孔而停留在芯片表面。

非靶细胞，即比循环肿瘤细胞具有更高变形率的红细胞，容易通过孔。

过滤循环肿瘤细胞后，循环肿瘤细胞可以以反向或正向供应溶液而被排出到外部。根据本发明的一种实施方式，溶液可以以反向供应，以便最小化对循环肿瘤细胞的损伤。溶液可以由注射器、注射泵、柱塞泵等提供。根据本发明的一种实施方式，溶液可以由稀释血液的稀释剂、水和稀释酸组成。通过供应溶液排出到外部的循环肿瘤细胞可以容易地收集在容器中，例如试管或培养皿中。

同时，当对其施加约100mmHg的压力时，直径为7.5至15μm的循环肿瘤细胞通过直径为8μm的管。通过8-μm直径管的直径为15μm的循环肿瘤细胞具有约53％的变形率。当直径为7.5μm的循环肿瘤细胞通过反冲洗排出到外部时(即，允许溶液以与血流相反的方向流动时)，考虑到循环肿瘤细胞的变形率，两个孔之间的间距优选为4μm或更小。例如，已知非小细胞肺癌和乳腺癌细胞的直径达到约40μm。在反冲洗期间考虑到直径为40μm的循环癌细胞的变形率，两个孔之间的间距优选地设定为21μm或更小。当直径为7.5μm的循环癌细胞存在于间距大于4μm的两个孔之间时，循环肿瘤细胞可能不会从表面脱离，因为它们会由于溶液的流动而变形。此外，直径为40μm的肿瘤细胞也不能从间距大于21μm的两个孔之间的表面脱离。在根据本发明的高密度微孔芯片中，考虑到溶液的压力，两个孔之间的间距是循环肿瘤细胞直径的45至65％。如果间距大于65％，即大于约4.9μm，则直径为7.5μm的循环肿瘤癌细胞可能不会通过反冲洗从两个孔之间的表面脱离。如果间距大于65％，即大于26μm，则直径为40μm的循环肿瘤细胞可能不会通过反冲洗从两个孔之间的表面脱离。如果增加溶液的压力来强制将附着在两个孔之间的表面上的循环肿瘤细胞脱离，则可能发生循环肿瘤细胞的损伤，这降低了活的循环肿瘤细胞的收集率。如果直径为7.5μm的循环癌细胞的间距小于45％，即小于约3.375μm，则高密度微孔芯片很可能被血液和溶液的流动损坏。

在本发明的一种实施方式中，样品可以反复通过高密度微孔芯片。具体地，在从高密度微孔芯片中分离一次循环肿瘤细胞后，可以将所分离的循环肿瘤细胞再次装载到高密度微孔芯片上并进行分离，并且可以重复分离过程。

在本发明的一种实施方式中，通过高密度微孔芯片对循环肿瘤细胞的分离不是通过在将含有循环肿瘤细胞的溶液加载到高密度微孔芯片上后施加特定的人工压力来进行的，而是可以利用重力来进行。通过根据本发明的高密度微孔芯片对循环肿瘤细胞的分离可以最小化人工压力对循环肿瘤细胞造成的损伤，从而将循环肿瘤细胞维持在与这些细胞存在于患者体内时相同的状态。

在本发明的一种实施方式中，高密度微孔芯片可以涂有特定的材料，以使高密度微孔芯片在分离循环肿瘤癌细胞期间对循环肿瘤细胞造成的损伤最小化，或者使高密度微孔芯片的重复使用更有效，或者使循环肿瘤细胞的回收更有效。具体地，特定材料可以是能够与循环肿瘤细胞特异性结合的抗体，并且也可以是不会物理性或化学性损伤细胞的任何生物材料。根据本发明的一种实施方式，特定材料可以是BSA(牛血清白蛋白)或抗体。抗体可以由例如抗上皮细胞粘附分子抗体(抗EpCAM抗体)、抗细胞角蛋白抗体(抗CK抗体)等组成。根据本发明的优选实施方式，特定材料可以是BSA(牛血清白蛋白)。

BSA(牛血清白蛋白)溶液是指牛血清白蛋白。它是一种分子量约为66.4kDa的蛋白质，其在大多数动物中大量存在。在生物化学/生物学的细胞培养期间，BSA可以作为营养物添加到细胞中，并且也经常用作在蛋白质定量中获得校准曲线的标准。此外，由于当使用限制酶时需要使用少量的酶(蛋白质)，所以也可以加入BSA以补充溶液中蛋白质的浓度。此外，在各种生化实验中(蛋白质印迹、免疫细胞化学、ELISA等)，BSA也可以用于防止非特异性结合，即在特异性抗体与待检测的蛋白质结合之前，防止特异性抗体与不需要的蛋白质或不需要的位置结合。

根据本发明的一种实施方式，离心可以用于使外周血与涂覆有BSA溶液的高密度微孔芯片反应，从而除去除循环肿瘤细胞以外的生物聚合物。根据本发明的一种实施方式，使用高密度微孔芯片对循环肿瘤细胞的分离可以利用重力进行。具体地，分离可以在大气压(1000hPa)至1020hPa的压力下进行。优选地，其可以在大气压(1000hPa)至1015hPa的压力下进行。更优选地，其可以在大气压(1000hPa)至1013hPa的压力下进行。

根据本发明的一种实施方式，高密度微孔芯片的上表面或下表面或孔的内表面可以涂覆有BSA溶液。优选地，不但高密度微孔芯片的上表面或下表面，而且孔的内表面也可以涂覆有BSA溶液。

根据本发明的一种实施方式，涂覆BSA溶液可以以0.05至0.15％的BSA浓度进行。根据本发明的优选实施方式，涂覆BSA溶液可以以0.08至0.012％的BSA浓度进行。

根据本发明的一种实施方式，涂覆BSA溶液可以进行5至15分钟。根据本发明的优选实施方式，涂覆BSA溶液可以进行8至12分钟。

在本发明中，免疫检查点蛋白以及淋巴特异性蛋白或骨髓特异性蛋白的表达可以通过进行以下步骤来检查：

(1)使循环肿瘤细胞与以下反应：与循环肿瘤细胞特异性结合的荧光标志物、与免疫检查点蛋白特异性结合的荧光标志物，以及与淋巴特异性蛋白或骨髓特异性蛋白特异性结合的荧光标志物；

(2)在多个波长范围内分别接收与荧光标志物反应的循环肿瘤细胞、免疫检查点蛋白以及淋巴特异性蛋白或骨髓特异性蛋白的光学图像；

(3)通过在多个波长范围的全部或部分中测量光学图像中的循环肿瘤细胞、免疫检查点蛋白以及淋巴特异性蛋白或骨髓特异性蛋白的荧光强度来进行第一过滤；

(4)通过在多个波长范围的全部或部分中测量光学图像中的循环肿瘤细胞的形态来进行第二过滤；以及

(5)通过测量组合的图像中的循环肿瘤细胞的形态来进行第三次过滤，所述组合的图像通过叠加所述多个相应波长范围中的所有或部分光学图像而获得。

在本发明中，与循环肿瘤细胞特异性结合的荧光标志物是指可以与循环肿瘤细胞本身或存在于循环肿瘤细胞内部或外部的物质特异性结合的荧光物质。根据本发明的一种实施方式，能够识别循环肿瘤细胞的荧光标志物可以与细胞核特异性结合，或者与存在于细胞内或细胞外的蛋白质、DNA、RNA等特异性结合。具体地，为了与细胞核结合，DAPI可以用作荧光标志物。此外，可以使用与波形蛋白(一种中间丝蛋白)特异性结合的荧光标志物。此外，可以使用与上皮细胞粘附分子(EpCAM)和细胞角蛋白(CK)特异性结合的荧光标志物，并且也可以使用与用作去除非靶细胞的手段的CD45特异性结合的荧光标志物。与循环肿瘤细胞特异性结合的荧光标志物可以由核苷酸、寡核苷酸、肽、多肽、核酸或蛋白质组成，并且可以优选是由蛋白质组成的抗体。与循环肿瘤细胞特异性结合的荧光标志物可以是任何能够通过特异性结合细胞来识别循环肿瘤细胞的物质。

光学图像可以由成像系统产生。根据本发明的一种实施方式，成像系统可以是细胞成像系统。细胞成像系统是配置为将染色的细胞放置在平台诸如载玻片上并在各种波长下观察和成像细胞的系统。细胞成像系统可以包括自动细胞计数模块、荧光强度分析模块和基于细胞学的细胞分类/认知模块。此外，作为用户便利功能，可以包括测量功能、报告自动生成功能和DB管理功能作为用户界面。这种细胞成像系统包括数字图像分析设备，其用于区分细胞、培养基、碎片等，以及用于识别和计数用户所需的细胞。根据本发明的一种实施方式的细胞成像系统可以从光学图像中准确地识别和计数经荧光标记或标志物结合的靶细胞。

光学图像可以是通过从物体反射的光获得的光学图像。细胞的光学图像可以由细胞成像系统输出，并且可以包括背景上的细胞、碎片等的图像。这种光学图像可以作为单个图像文件来提供，该单个图像文件是通过将相应特定波长范围的多个分割图像拼接在一起而构建的。这里，多个波长范围中的光学图像可以包括蓝色波长范围图像、绿色波长范围图像和红色波长范围图像。蓝色波长范围的光学图像特别用于识别循环肿瘤细胞核，而绿色和红色波长范围的光学图像特别用于识别循环肿瘤细胞的膜。此外，可以通过使用各种颜色的波长范围来识别特定的荧光探针或标志物。

在第一过滤或第二过滤中，如果循环肿瘤细胞、免疫检查点蛋白或淋巴细胞特异性蛋白或骨髓细胞特异性蛋白的识别没有达到期望的水平，则可以进行光学图像数据的过滤，并再次进行第一过滤或第二过滤，并且还可以进行多次数据过滤。此外，在进行第一过滤或第二过滤之后，可以将图像数据进行存储和输出。

此外，在对第一波长范围的光学图像进行第一过滤步骤和第二过滤步骤之后，还可以对不同于第一波长范围的第二波长范围的光学图像进行第一过滤步骤和第二过滤步骤中的一个或多个。

例如，第一波长范围可以是蓝色波长范围，第二波长范围可以是绿色或红色波长范围。在这种情况下，可以通过对蓝色波长范围图像进行第一过滤过程和第二过滤过程来识别循环肿瘤细胞的细胞核。此外，可以通过对绿色波长范围图像和红色波长范围图像中的一个或多个进行第一过滤过程来识别循环肿瘤细胞的细胞膜。这些第一和第二过滤过程能够从光学图像中准确地识别细胞。例如，绿色和红色波长范围图像增强了靶细胞(例如，白细胞和肿瘤细胞)的识别。

同时，在第二过滤过程中，测量循环肿瘤细胞的形态。这里，循环肿瘤细胞的形态学可以包括细胞面积、细胞大小(直径)和细胞圆形度中的一个或多个。

在本发明的一种实施方式中，免疫检查点蛋白以及淋巴细胞特异性蛋白或骨髓细胞特异性蛋白的荧光强度的测量通过测量多个波长范围的全部或部分的光学图像上的荧光强度来进行，所述多个波长范围由与淋巴细胞特异性蛋白或骨髓细胞特异性蛋白特异性结合的荧光标志物产生，并且可以对其进行第一过滤。

现在将更详细地描述通过测量除免疫检查点蛋白以及淋巴细胞特异性蛋白或骨髓细胞特异性蛋白之外的循环肿瘤细胞的荧光强度来进行第一过滤的过程。第一过滤可以通过以下来进行：测量多个波长范围的全部或部分的光学图像中的细胞大小，并且然后按预定比率或量设置比所测量的细胞大小大的多边形或圆形区域，并测量该区域内细胞的荧光强度。

在第三过滤步骤中，第三过滤通过测量组合的图像中的循环肿瘤细胞的形态来进行，所述组合的图像通过叠加所述多个波长范围中的所有或部分光学图像而获得。这里，循环肿瘤细胞的形态学可以包括细胞面积、细胞大小和细胞圆形度中的一个或多个。

第三过滤可以在整个循环肿瘤癌细胞上进行，并且也可以另外在第一和第二过滤过程中的难以识别的细胞上进行。如果需要额外的识别，可以进行单独的数据过滤，或者也可以多次进行第三过滤。

图像分析可以由计算机程序执行。计算机程序可以使用一个或多个通用或专用计算机来实现，诸如处理器、控制器、算术逻辑单元(ALU)、数字信号处理器、微型计算机、现场可编程门阵列(FPGA)、可编程逻辑单元(PLU)、微处理器或能够执行和响应指令的任何其他装置。

在本发明中，与免疫检查点蛋白特异性结合的荧光标志物可以选自由以下组成的组：PD-1特异性抗体、PD-L1特异性抗体和CTLA-4特异性抗体，但不限于此。

在本发明中，与淋巴特异性蛋白或骨髓特异性蛋白特异性结合的荧光标志物可以选自由以下组成的组：CD18特异性抗体、CD16特异性抗体、CD29特异性抗体、CD61特异性抗体、CD104特异性抗体、CD32特异性抗体、CD11b特异性抗体和CD64特异性抗体，但不限于此。

在本发明中，免疫检查点抑制剂可以是但不限于任何能够抑制免疫检查点蛋白的功能的物质。具体地，它可以是蛋白质、化合物、天然产物、DNA、RNA、肽等，优选抗体，更优选单克隆抗体，甚至更优选人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。

在本发明中，免疫检查点抑制剂可以是选自由以下组成的组的任何一种或多种：PD-L1拮抗剂、PD-1拮抗剂和CTLA-4拮抗剂，但不限于此。

如本文所用，术语“PD-1拮抗剂”是指减少、阻断、抑制、消除或干扰由PD-1与其结合配偶体(binding partner)诸如PD-L1和/或PD-L2的一种或多种相互作用而产生的信号转导的分子。在一些实施方式中，PD-1拮抗剂是抑制PD-1与其结合配偶体结合的分子。在具体方面，PD-1拮抗剂抑制PD-1与PD-L1和/或PD-L2的结合。例如，PD-1拮抗剂包括抗PD-1抗体、其抗原结合片段、免疫粘附素、融合蛋白、寡肽以及减少、阻断、抑制、消除或干扰由PD-1与其结合配偶体诸如PD-L1或PD-L2的相互作用产生的信号转导的其它分子。在一种实施方式中，PD-1拮抗剂减少了由或通过细胞表面蛋白介导的阴性共刺激信号，所述细胞表面蛋白在通过PD-1介导的信号转导的T淋巴细胞上表达，从而使功能障碍性T细胞的功能障碍减轻。在一些实施方式中，PD-1拮抗剂是抗PD-1抗体。

如本文所用，术语“PD-L1拮抗剂”是指减少、阻断、抑制、消除或干扰由PD-L1与其结合配偶体(诸如PD-1和/或B7-1)的一种或多种相互作用而产生的信号转导的分子。在一些实施方式中，PD-L1拮抗剂是抑制PD-L1与其结合配偶体结合的分子。在具体方面，PD-L1拮抗剂抑制PD-L1与PD-1和/或B7-1的结合。在一些实施方式中，PD-L1拮抗剂包括抗PD-L1抗体、其抗原结合片段、免疫粘附素、融合蛋白、寡肽以及减少、阻断、抑制、消除或干扰由PD-L1与其结合配偶体(诸如PD-1或B7-1)的相互作用产生的信号转导的其它分子。在一种实施方式中，PD-L1拮抗剂减少了由或通过细胞表面蛋白介导的阴性共刺激信号，所述细胞表面蛋白在通过PD-L1介导的信号转导的T淋巴细胞上表达，从而使功能障碍性T细胞的功能障碍减轻(例如，增强对抗原识别的效应子应答)。在一些实施方式中，PD-L1拮抗剂是抗PD-L1抗体。

如本文所用，术语“CTLA4拮抗剂”是指减少、阻断、抑制、消除或干扰由CTLA4与其结合配偶体(诸如B7-1)的一种或多种相互作用而产生的信号转导的分子。在一些实施方式中，CTLA4拮抗剂是抑制CTLA4与其结合配偶体结合的分子。在具体方面，CTLA4拮抗剂抑制CTLA4与B7-1的结合。在一些实施方式中，CTLA4拮抗剂包括抗CTLA4抗体、其抗原结合片段、免疫粘附素、融合蛋白、寡肽以及减少、阻断、抑制、消除或干扰由CTLA4与其结合配偶体(诸如B7-1)的相互作用产生的信号转导的其它分子。在一种实施方式中，CTLA4拮抗剂减少了由或通过细胞表面蛋白介导的阴性共刺激信号，所述细胞表面蛋白在通过CTLA4介导的信号转导的T淋巴细胞上表达，从而使功能障碍性T细胞的功能障碍减轻(例如，增强对抗原识别的效应子应答)。在一些实施方式中，CTLA4拮抗剂是抗CTLA4抗体。

在本发明中，免疫检查点抑制剂可以是选自由以下组成的组的至少一种：帕博利珠单抗(可瑞达)、纳武利尤单抗(欧狄沃)、西米普利单抗(cemiplimab)(Lybtayo)、阿替利珠单抗(泰圣奇)、阿维单抗(avelumab)(Bacencio)、度伐利尤单抗(durvalumab)(英飞凡)、伊匹木单抗(ipilimumab)(Yervoy)和曲美木单抗(tremelimumab)，但不限于此。

在本发明中，癌症可以选自由以下组成的组：肺癌、肾癌、膀胱癌、乳腺癌、结直肠癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、食道癌、间皮瘤、黑色素瘤、头颈癌、甲状腺癌、肉瘤、前列腺癌、胶质母细胞瘤、宫颈癌、胸腺癌、白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、蕈样肉芽肿、梅克尔细胞癌(Merkelcell carcinoma)以及血液恶性肿瘤，并且可以优选地为肺癌，最优选地为非小细胞肺癌，但不限于此。

另一方面，本发明涉及一种治疗癌症的方法，包括以下步骤：(a)在分离的循环肿瘤细胞中检查免疫检查点蛋白以及淋巴特异性蛋白或骨髓特异性蛋白的表达；以及(b)当免疫检查点蛋白的表达为阳性而淋巴特异性蛋白或骨髓特异性蛋白的表达为阴性时，给药免疫检查点抑制剂。

另一方面，本发明涉及一种用于确定对免疫检查点抑制剂的易感性的方法，该方法包括以下步骤：(a)在分离的循环肿瘤细胞中检查免疫检查点蛋白以及淋巴特异性蛋白或骨髓特异性蛋白的表达；以及(b)当免疫检查点蛋白的表达为阳性而淋巴特异性蛋白或骨髓特异性蛋白的表达为阴性时，确定循环肿瘤细胞对免疫检查点抑制剂是敏感的。

另一方面，本发明涉及一种为癌症患者选择癌症免疫疗法的方法，该方法包括以下步骤：(a)在分离的循环肿瘤细胞中检查免疫检查点蛋白以及淋巴特异性蛋白或骨髓特异性蛋白的表达；以及(b)当识别出免疫检查点蛋白的表达为阳性而淋巴特异性蛋白或骨髓特异性蛋白的表达为阴性时，选择免疫检查点抑制剂作为治疗药物。

另一方面，本发明涉及用于治疗癌症的药物组合物，其包含用于治疗免疫检查点蛋白的表达为阳性而淋巴特异性蛋白或骨髓特异性蛋白的表达为阴性的受试者的免疫检查点抑制剂。

另一方面，本发明涉及免疫检查点抑制剂在制备用于治疗免疫检查点蛋白的表达为阳性而淋巴特异性蛋白或骨髓特异性蛋白的表达为阴性的受试者的药物中的用途。

实施例

在下文中，将参考实施例更详细地描述本发明。这些实施例仅用于说明本发明，对于本领域技术人员来说，显然本发明的范围不应被解释为受这些实施例的限制。

统计学分析

来自患者的数据用于比较基线和人口统计学特征。所有值都表示为平均数±标准差或表示为数字(百分比)。T检查用于比较连续变量，卡方检查(Chi-square)用于比较分类变量。准确性和加权κ用于比较组织样品和血液样品的PD-L1阳性率。使用Bland-Altman图分析了作为CTC和组织样品之间连续变量的PD-L1表达的一致性。使用皮尔逊(Pearson)相关系数分析肿瘤负荷和CTC数量之间的关系。根据1.1版的CT实体瘤缓解评估标准，使用靶病变的最长直径总和(每个器官最多2个，以及总共5个)确定基线临床肿瘤负荷。p值小于0.05被认为具有统计学意义。统计分析在IBM SPSS 25.0版(IBM公司，阿尔蒙克，NY，USA)中进行。

实施例1.从血液中分离CTC

这项研究得到了研究伦理委员会(Research Ethics Committee，IRB)的批准，在书面同意后使用了29名肺癌患者(表1)和30名受感染患者(表2)的组织和血液样品。

[表1]每名肺癌患者的信息

/>

(EGFR，表皮生长因子受体；ALK，间变性淋巴瘤激酶；PD-L1，程序性细胞死亡配体1；NSCLC，非小细胞肺癌；NOS，未另行指明)

[表2]每名受感染患者的信息

/>

(NTM：非结核分枝杆菌)

下表3总结了患者的基本信息。

[表3]肺癌患者和受感染患者的信息汇总

值是平均数±标准差(SD)或数字(％)

(NSCLC，非小细胞肺癌；NOS，未另行指明；SCLC，小细胞肺癌；NTM，非结核分枝杆菌)

此外，下表4总结了在招募肺癌患者组期间获得的与PD-L1表达相关的分子诊断信息。

[表4]

来自肺癌组的组织样品的分析结果

(EGFR，表皮生长因子受体；ALK，间变性淋巴瘤激酶；PD-L1，程序性细胞死亡配体1)

根据制造商的说明，使用SmartBiopsy^TM细胞分离试剂盒(CytoGen)和SmartBiopsy^TM细胞隔离器(CytoGen)从患者血液中分离出CTC。作为应用于SmartBiopsy^TM细胞隔离器的高密度微孔芯片，使用孔径为5μm的芯片，以便在芯片上收集大于5μm的靶细胞。由于微孔芯片的孔径是可调节的，所以微孔芯片是设计用于选择性回收具有特定大小的细胞的微孔芯片(US10,502,668和KR10-1254675)。

Smart Biopsy^TM细胞隔离器(CIS030)

-Smart Biopsy^TM细胞隔离器是从溶液中识别靶细胞(外周血单核细胞，PBMC)的高度，并使用空气置换移液器(ADP)自动进行混合、运输和过滤的系统。该系统由主X-Y轴、ADP、芯片处理器和耗材台组成。基本上，Smart Biopsy^TM细胞隔离器是根据用户手册使用软件进行操作的。

实施例2.用于分离的CTC的假阳性过滤的标志物的选择

2-1.CTC染色法

Smart Biopsy^TM IF染色器(CST030)

-Smart Biopsy^TM IF染色器是一种自动免疫染色系统，可同时对总共12张载玻片进行染色。该系统由主X-Y轴模块、1-ml移液器(ADP)模块、覆盖模块、耗材部件模块、视觉部件模块和耗材台组成。Smart Biopsy^TM细胞隔离器是根据手册使用内部软件进行操作的。

对循环肿瘤细胞进行染色的方法

[Smart Biopsy^TM IF染色器方法]

1.将细胞固定载玻片和所需抗体(例如，EpCAM、波形蛋白、PD-L1、CD18和CD45抗体)放入Smart Biopsy^TM IF染色器系统内的缓冲管中，并且然后根据手册操作系统。

2.洗涤、封闭、第一抗体/第二抗体染色、和安装过程总共自动进行6小时(基于12张载玻片)。

3.Smart Biopsy^TM IF染色器的所有染色过程均按照以下手动方法进行。

[手动方法]

1.样品(载玻片)用50μl的0.2％ Triton X-100处理10分钟，然后用PBS洗涤三次5分钟。

2.使用1％ BSA封闭1小时以减少非特异性结合。

3.将所需抗体(例如，用于免疫细胞的阴性选择的抗CD45、用于淋巴细胞的阴性选择的抗CD18和用于阳性选择的PD-L1抗体)各自稀释于1％BSA中，并用每种抗体稀释液处理样品1小时(一抗处理)。

4.将具有两种不同波长的两种二抗(“山羊抗小鼠Alexa Fluor 647”和“山羊抗兔Alexa Fluor 546”)稀释在于1％ BSA中，然后将样品与第二抗体稀释液在室温下温孵1小时(二抗处理)。

5.封闭过程进行1小时，以抑制与对肺癌循环肿瘤细胞具有特异性的抗体(PD-L1)的交叉反应。

6.将样品与抗-EpCAM Alexa Fluor 488缀合的抗体在室温下温孵1小时，所述抗体是循环肿瘤细胞的标志物。

7.使用PBS进行3次5分钟的洗涤过程。

8.进行DAPI染色过程，然后使用盖玻片进行安装过程。

2-2.用于CTC过滤的标志物的选择

为了更清楚地识别血液中的CTC，使用已知作为淋巴细胞标志物的CD45去除淋巴细胞，并且为了将除CD45阳性细胞之外的假阳性细胞(骨髓细胞)去除，通过免疫荧光染色(IF)分析炎症细胞系中已知为特异性标志物的CD18和CD16的表达水平以及CD18和CD11b的表达水平。

所用的细胞系是作为人T淋巴细胞的Jurkat(KCLB 40152)，作为人单核细胞的THP-1(KCLB 40202)，作为人成髓细胞的KG-1(KCLB 10246)。对于每种抗原的抗体上的信息如下表5所示。用CD18/CD16组合的样品和CD18/CD11b组合的样品中的每一种对10张载玻片进行染色，然后进行分析。

[表5]

/>

在这种情况下，使用Thermo Fisher的抗兔IgG，Alexa Fluor546(A-11010/2mg/mL)和抗小鼠IgG，Alexa Fluor 546(A-11003/2mg/mL)作为第二抗体。

结果，如图3和4中所示，证实了CD18不仅在表达上高于CD16和CD11b，而且作为特异性标志物也很重要。

此外，如图5中所示，作为在患者血液中的PBMC中重复相同实验的结果，证实了CD18的表达水平更高。

因此，CD18和CD45一起被选作CTC过滤的标志物，并用于消除假阳性细胞。

实施例3.基于所选择的标志物的CTC染色

将通过隔离器分离的细胞(约500至10000或更多细胞)通过进行cytospin过程(细胞离心过程)固定在载玻片上用于染色。

使用CTC的用于阴性选择的CD45和CD18标志物以及用于阳性选择的EpCAM/波形蛋白和PD-L1标志物分析分离的CTC的特征。

作为抗体，使用了EpCAM/波形蛋白、PD-L1、CD18和CD45抗体，并且关于抗体的信息显示在下表6中。最后，加入能够对细胞核染色的DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚)，并根据制造商的说明使用SmartBiopsy^TM IF染色器(CST030，CytoGen)进行细胞染色。

[表6]关于抗体的信息

实施例4.CTC的荧光图像的分析及CTC分离的准确性的确认

使用SmartBiopsy^TM细胞图像分析仪(Cytogen)，拍摄加载有荧光标记的CTC的载玻片的图像，并测量表达EpCAM/波形蛋白、PD-L1和CD18的细胞的数量和荧光强度(图1和2)。

作为检查来自受感染患者和肺癌患者的血液样品中的CTC标志物和PD-L1的表达的结果，证实了存在表达CTC标志物和PD-L1的假阳性细胞(图1和2)。

这些假阳性细胞可以被认为是表达CD16/18的骨髓细胞。因此，在本发明中，通过使用CD16/18标志物作为单一阴性标志物或白细胞特异性选择性标志物来排除假阳性细胞。

因此，CD18(-)和PD-L1(+)细胞被定义为消除了假阳性的纯表达PD-L1细胞。

此外，证实了CD18/CD45阴性CTC被从29名肺癌患者中的21名和30名感染患者中的4名中分离出。如下表7所示，证实了用于肺癌诊断的CTC分离的灵敏度为72.4％，特异性为86.7％。

[表7]CTC分离的准确性

灵敏度，72.4％；特异性，86.7％

实施例5.CTC与组织样品之间的PD-L1表达水平的相关性分析

组织样品中PD-L1表达的分析结果显示在上面的表4中，并且根据实施例4的标准从29名肺癌患者的PBMC中选择的具有PD-L1阳性CTC的患者进行识别。

结果，如在以下表8中所示，证实了29名患者中的14名在组织样品和血液样品中均为PD-L1表达阳性，7名患者在组织样品和血液样品中均为PD-L1表达阴性。

[表8]在CTC和组织样品之间的PD-L1表达的相关性

准确度＝72.4％；灵敏度＝82.4％；特异性＝58.3％；加权κ＝0.417

因此，证实了可以通过血液中PD-L1阳性CTC的数量来预测肿瘤组织中PD-L1的表达，准确度为72.4％，灵敏度为82.4％。

此外，对于血液中具有CTC的21名患者，PD-L1的循环肿瘤细胞阳性比例分数(CTPS)通过下面的等式1计算，PD-L1的肿瘤细胞阳性比例分数(TPS)通过下面的等式2计算。

[等式1]

[等式2]

结果，如图6中所示，证实了随着TPS增加，CTPS增加，并且当TPS为负时，CTPS相对较低。

实施例6.使用CTPS预测肿瘤负荷

如图7中所示，作为比较肺癌患者组织样品中的肿瘤大小和CTPS值的结果，获得了皮尔逊相关系数值为0.445，并且证实了两组之间存在正相关。

尽管已经参照具体特征详细描述了本发明，但是对于本领域技术人员来说，显然该描述仅仅是其优选实施方式，并不限制本发明的范围。因此，本发明的实质范围由所附权利要求及其等同物来限定。

工业实用性

在根据本发明的使用循环肿瘤细胞治疗癌症的方法中，同时在液体活检中检查免疫检查点蛋白的表达以及淋巴细胞特异性蛋白或骨髓细胞特异性蛋白的表达，然后通过消除假阳性循环肿瘤细胞来选择患者。因此，本发明的方法具有高准确度和高商业实用性，因此可以用于癌症诊断和治疗。

Claims

1.一种选择适用于癌症免疫治疗药物的患者的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)在循环肿瘤细胞中检查免疫检查点蛋白以及淋巴特异性蛋白或骨髓特异性蛋白的表达；以及

(b)将发现所述免疫检查点蛋白的表达为阳性而所述淋巴特异性蛋白或骨髓特异性蛋白的表达为阴性的患者分类为可适用于所述癌症免疫疗法药物的患者。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述免疫检查点蛋白选自由PD-1、PD-L1和CTLA-4组成的组。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述淋巴特异性蛋白或骨髓特异性蛋白选自由以下组成的组：CD18、CD16、CD29、CD61、CD104、CD32、CD11b和CD64。

4.根据权利要求1所述的方法，其中，通过进行以下步骤来分离所述循环肿瘤细胞：

(i)从癌症患者获得血液；以及

(ii)使用生物芯片从血液中分离循环肿瘤细胞。

5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述免疫检查点蛋白以及所述淋巴特异性蛋白或骨髓特异性蛋白的表达可以通过进行以下步骤来检查：

(2)在多个波长范围内分别接收与所述荧光标志物反应的所述循环肿瘤细胞、所述免疫检查点蛋白以及所述淋巴特异性蛋白或骨髓特异性蛋白的光学图像；

(3)通过在多个波长范围的全部或部分中测量光学图像中的循环肿瘤细胞、免疫检查点蛋白以及淋巴特异性蛋白或骨髓特异性蛋白的荧光强度进行第一过滤；

(4)通过在多个波长范围的全部或部分中测量光学图像中的循环肿瘤细胞的形态进行第二过滤；以及

(5)通过测量组合的图像中的循环肿瘤细胞的形态来进行第三过滤，所述组合的图像通过叠加所述多个相应波长范围中的所有或部分光学图像而获得。

6.根据权利要求5所述的方法，其中，与所述循环癌细胞特异性结合的所述荧光标志物选自由波形蛋白特异性抗体、EpCAM特异性抗体和CK抗体组成的组。

7.根据权利要求5所述的方法，其中，与所述免疫检查点蛋白特异性结合的所述荧光标志物选自由PD-1特异性抗体、PD-L1特异性抗体和CTLA-4特异性抗体组成的组。

8.根据权利要求5所述的方法，其中，与所述淋巴特异性蛋白或骨髓特异性蛋白特异性结合的所述荧光标志物选自由以下组成的组：CD18特异性抗体、CD16特异性抗体、CD29特异性抗体、CD61特异性抗体、CD104特异性抗体、CD32特异性抗体、CD11b特异性抗体和CD64特异性抗体。

9.根据权利要求1所述的方法，其中，所述免疫检查点抑制剂是抗体。

10.根据权利要求1所述的方法，其中，所述免疫检查点抑制剂是单克隆抗体。

11.根据权利要求1所述的方法，其中，所述免疫检查点抑制剂是人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。

12.根据权利要求1所述的方法，其中，所述免疫检查点抑制剂是选自由以下组成的组的任何一种或多种：PD-L1拮抗剂、PD-1拮抗剂和CTLA-4拮抗剂。

13.根据权利要求1所述的方法，其中，所述免疫检查点抑制剂是选自由以下组成的组的任何一种或多种：帕博利珠单抗(可瑞达)、纳武利尤单抗(欧狄沃)、西米普利单抗(Lybtayo)、阿替利珠单抗(泰圣奇)、阿维单抗(Bacencio)、度伐利尤单抗(英飞帆)、伊匹木单抗(Yervoy)和曲美木单抗。

14.根据权利要求1所述的方法，其中，所述癌症选自由以下组成的组：肺癌、肾癌、膀胱癌、乳腺癌、结直肠癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、食道癌、间皮瘤、黑色素瘤、头颈癌、甲状腺癌、肉瘤、前列腺癌、胶质母细胞瘤、宫颈癌、胸腺癌、白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、蕈样肉芽肿病、梅克尔细胞癌以及血液恶性肿瘤。

15.根据权利要求14所述的方法，其中，所述癌症是肺癌。

16.根据权利要求14所述的方法，其中，所述癌症是非小细胞肺癌。

17.一种为癌症患者选择癌症免疫疗法的方法，所述方法包括以下步骤：

(b)当所述免疫检查点蛋白的表达为阳性而所述淋巴特异性蛋白或骨髓特异性蛋白的表达为阴性时，选择所述免疫检查点抑制剂作为治疗药物。

18.一种治疗癌症的方法，包括以下步骤：

(b)当所述免疫检查点蛋白的表达为阳性而所述淋巴特异性蛋白或骨髓特异性蛋白的表达为阴性时，给药所述免疫检查点抑制剂。

19.一种用于确定对免疫检查点抑制剂的易感性的方法，所述方法包括以下步骤：

(b)当所述免疫检查点蛋白的表达为阳性而所述淋巴特异性蛋白或骨髓特异性蛋白的表达为阴性时，确定所述循环肿瘤细胞对所述免疫检查点抑制剂是敏感的。