JP2023526044A - 免疫療法のための腫瘍バイオマーカー - Google Patents

免疫療法のための腫瘍バイオマーカー Download PDF

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Abstract

肝細胞癌および他のがんにおける、腫瘍の予後診断のためのバイオマーカー。ＩＣＯＳ＋制御性Ｔ細胞（ＴＲｅｇ）に対して標的化された抗がん免疫療法の処方のため、例えば、抗ＩＣＯＳ抗体での処置のために患者を選択するためのバイオマーカーの測定。（ｉ）ＩＣＯＳ単一陽性細胞の総数に対するＩＣＯＳ単一陽性細胞の周囲の定義された影響半径内のＩＣＯＳ ＦＯＸＰ３二重陽性細胞の数の比、（ｉｉ）各々のＩＣＯＳ陽性ＦＯＸＰ３陰性細胞とその最も近いＩＣＯＳ ＦＯＸＰ３二重陽性細胞との間の平均距離、（ｉｉｉ）ＩＣＯＳ陽性であるＦＯＸＰ３陽性細胞の割合、および（ｉｖ）ＩＣＯＳ陽性細胞の密度を含むバイオマーカー。【選択図】図１

Description

本発明は、抗ＩＣＯＳ抗体およびＩＣＯＳ＋制御性Ｔ細胞（ＴＲｅｇ）を阻害または殺傷する他の治療剤を包含する、Ｔ細胞表面受容体ＩＣＯＳ（Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ｔ ｃｅｌｌ Ｃｏ－Ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ；誘導性Ｔ細胞共刺激因子）を発現する制御性Ｔ細胞に対して標的化された抗がん免疫療法に関する。本発明は、そのような免疫療法に対する腫瘍の感受性を指し示し、および免疫療法に対する患者の応答の早期指標を提供するバイオマーカーに関する。
患者自身の免疫系が疾患と戦うようにモジュレートされる免疫療法は、多くのタイプのがんに対するフロントライン処置となるまでになった。Ｔ細胞活性化を阻害するシグナルは、標的化された薬物を使用して下方モジュレーションされて（「免疫チェックポイント遮断」）、Ｔ細胞が有効な抗腫瘍応答を開始することを可能にする［非特許文献１］。免疫療法に応答する患者において、抗腫瘍の結果は劇的および救命的であり得、この分野における関心を高めている。免疫チェックポイント阻害剤、例えばプログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１）、プログラム細胞死リガンド－１（ＰＤ－Ｌ１）、および細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ－４）を標的化するモノクローナル抗体での免疫療法は、複数のがんに対する重要な処置となっている。新たな薬物および新たな組合せ薬物を試験するための免疫チェックポイント阻害剤を用いる何百もの臨床試験が現行で進行中である。
免疫チェックポイント共阻害受容体、例えばＰＤ－１およびＣＴＬＡ－４に加えて、共刺激受容体はＴ細胞の機能的な状態に影響を及ぼし、がん免疫サーベイランスのために不可欠である。共刺激受容体へのリガンドの結合で、下流のシグナルが活性化されて、Ｔ細胞機能、生存および／または増殖が駆動される。ＩＣＯＳは、Ｔ細胞上に排他的に見出される共刺激受容体であり、患者の抗腫瘍Ｔ細胞応答を活性化させるための免疫療法のための標的として同定されている。例えば、特許文献１およびそれにおける参考文献を参照。
腫瘍の他に、免疫成分を伴う他の疾患および状態において、均衡が、抗原特異的Ｔ細胞免疫応答を発揮するエフェクターＴ細胞（ＴＥｆｆ、例えばＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球、ＣＴＬ）と、ＴＥｆｆを下方調節することによりその免疫応答を抑制する制御性Ｔ細胞（ＴＲｅｇ）との間に存在する。腫瘍におけるＴＲｅｇのレベルの上昇は、肝細胞癌（ＨＣＣ）を包含する、少なくとも一部のタイプのがんについての予後不良に関連している［非特許文献２、非特許文献３］。Ｔｕら（２０１６）は、ＴＲｅｇ、特にＩＣＯＳ＋ＦＯＸＰ３＋ ＴＲｅｇはＨＣＣ腫瘍における免疫抑制に寄与し、患者生存の低減に関連していることを報告した［非特許文献３］。ＩＣＯＳは、ＴＥｆｆ上の重要な共刺激受容体であるが、ＴＲｅｇ上のその高い発現に起因して腫瘍成長も促進する。ｉｎ ｖｉｔｒｏ研究は、ＩＣＯＳ発現（ＩＣＯＳ＋）ＴＲｅｇはＩＣＯＳ陰性ＴＲｅｇよりも免疫抑制性であることを示した［非特許文献４、非特許文献５］。抗ＩＣＯＳ抗体免疫療法は、ＴＥｆｆの数および活性に有利となるようにＴＥｆｆ／ＴＲｅｇ均衡をモジュレートすることを目的とする。ＩＣＯＳ陽性ＴＲｅｇの枯渇（例えば、Ｆｃ媒介性エフェクター機能、例えば抗体依存性細胞傷害性、ＡＤＣＣを介する）のトリガーとなる抗体は、ＴＥｆｆの抑制を緩和し、ＴＥｆｆ／ＴＲｅｇ比を向上させるため、ＴＥｆｆ抗腫瘍応答を促進する正味効果を有する。抗ＩＣＯＳ抗体はまた、ＩＣＯＳ受容体レベルでアゴニスト活性を発揮してＴＥｆｆによるサイトカイン産生を直接的に刺激し得る。これらの２つのＴＥｆｆブースト効果の組合せは、ＩＣＯＳがＴＥｆｆ上よりもＴＲｅｇ上で有意により高いレベルで提示されることに起因して、抗ＩＣＯＳ抗体を用いて可能であり、例えば、ヒトＩｇＧ１抗ＩＣＯＳ抗体は、ＩＣＯＳＬｏｗ Ｔｅｆｆを刺激し、およびＩＣＯＳＨｉｇｈ ＴＲｅｇを枯渇させることにより抗腫瘍免疫をブーストすることができる［非特許文献６；非特許文献７］。抗ＩＣＯＳ抗体はそのため、ＴＥｆｆ免疫応答が動員される腫瘍免疫療法のための治療剤の潜在的に価値のあるクラスとなる。多数の抗ＩＣＯＳ抗体が記載され、Ｔ細胞集団／活性に影響を及ぼすことが示されている［非特許文献８；特許文献２；特許文献３；特許文献４；特許文献５；特許文献１］。いくつかの抗ＩＣＯＳ抗体ががん患者における臨床試験を受けている：ＪＴＸ－２０１１［非特許文献２５］、ＧＳＫ－３３５９６０９［非特許文献９］、ＭＥＤＩ－５７０、ＢＭＳ－９８６２２６［特許文献５；ＮＣＴ０３２５１９２４］およびＫＹ１０４４［非特許文献７］。
現在までの免疫腫瘍学の進歩は印象的なものであったが、免疫療法処置は依然として、救うよりも多くの患者において失敗している。３０％またはより低い奏効率が、広範囲の腫瘍タイプにわたり免疫療法について標準である。黒色腫における抗ＰＤ－１抗体ニボルマブの奏効率は約３０％である。進行性ＨＣＣにおけるフェーズＩ／ＩＩ研究において、その奏効率は１５～２０％であった［非特許文献１０］。別の抗ＰＤ－１抗体であるペムブロリズマブは、ソラフェニブで以前に処置されたＨＣＣを有する患者におけるフェーズＩＩ研究においてニボルマブと類似した奏効率を達成した［非特許文献１１］。ニボルマブおよびペムブロリズマブは、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によりそれぞれ２０１７年および２０１８年にＨＣＣの処置のために迅速承認を承諾された。しかしながら、それぞれファーストラインおよびセカンドラインの状況においてニボルマブおよびペムブロリズマブを試験した進行性ＨＣＣにおけるその後のフェーズＩＩＩ試験は肯定的な結果を達成しなかった［非特許文献１２、非特許文献１３］。尿路上皮癌における抗ＰＤ－Ｌ１抗体アテゾリズマブのフェーズＩＩ臨床試験において、奏効率は、ＰＤ－Ｌ１＋腫瘍を有する患者において約２６％、全体で（腫瘍におけるＰＤ－Ｌ１発現にかかわらずに患者において）１５％、ＰＤ－Ｌ１陰性腫瘍を有する患者において１０％であった。後者の例は、免疫療法から利益を受けるより良好な可能性（依然として２６％に過ぎないが）を有するがん患者の群に免疫療法をマッチさせるためのバイオマーカーの価値を示す。Ｃａｌｄｅｒａｒｏらもまた、ＨＣＣにおけるＰＤ－Ｌ１発現と臨床的および病的特色との間の関係性を報告した［非特許文献１４］。
併用療法は、ＨＣＣおよび他のがんにおいて免疫チェックポイント阻害剤の有効性を向上させるための方法として研究されている。ニボルマブを抗ＣＴＬＡ－４抗体イピリムマブと組み合わせた試験コホートで約３０％の客観的奏効率が最近報告され［非特許文献１５］、それにしたがって米国ＦＤＡは、ソラフェニブで以前に処置されたＨＣＣ患者のためのニボルマブ／イピリムマブの組合せに対して迅速承認を承諾した。別の最近の試験では、進行性ＨＣＣを有する患者のためのファーストライン療法としてのソラフェニブと比べた抗ＰＤ－Ｌ１抗体アテゾリズマブと抗ＶＥＧＦ抗体ベバシズマブとの組合せが試験され、該試験では肯定的な結果が報告され、アテゾリズマブ＋ベバシズマブの組合せはＯＲＲを約３０％まで増加させた［非特許文献１６］。
一般に、ある患者が免疫療法に応答して他の患者が応答しない理由は不明確である。応答における劇的な差異が表面上は類似した患者において見られ、１人の患者は完全に応答するが、他の患者は同じ処置からほとんどまたは全く臨床的利益を経験しない。これは、ベースライン腫瘍微環境（ＴＭＥ）における差異に帰せられる可能性があるが、詳細は未だ理解されていない。一部の予測バイオマーカーが同定されているが（例えば、上記されるアテゾリズマブ研究における腫瘍および免疫細胞上のＰＤ－Ｌ１発現）、免疫療法で処置された患者の高い割合は処置から利益を受けないことが依然として実情である。機能する可能性が最も高い療法に患者をマッチさせることにおけるどんな進歩も、臨床的有効性における歓迎される改善をもたらし、実りのない医学的介入を耐え忍ぶ患者の数を制限する。
がんタイプおよびサブタイプの伝統的な診断は、解剖学的および組織ベースの分類、例えば、肺がん、膵臓がんなどに基づく。しかしながら、そのような腫瘍カテゴリー内のおよびそれにわたる免疫療法に対する低い奏効率を考慮すると、これらの定義は、特定の処置から利益を受けるであろう患者の群の同定において部分的な助けにしかならない。臨床医および規制当局者はしたがって、「組織不可知論的」アプローチの価値を今や認識しており、該アプローチでは、処置は、腫瘍の起源となる組織または細胞タイプとは別々の（但しそれと相関し得る）腫瘍および／または患者のバイオマーカーに基づく。例えば、米国ＦＤＡは、切除不能性または転移性の、マイクロサテライト高度不安定性またはミスマッチ修復欠損性固形腫瘍を有する患者の処置のために抗ＰＤ－１抗体ペムブロリズマブを承認した。組織タイプと組織不可知論的腫瘍分類との組合せもまた可能である。
腫瘍の突然変異状態はそれらの微環境に影響を及ぼす。腫瘍細胞の集団は、免疫検出からそれらを遮蔽し、腫瘍の成長をサポートするように局所的な組織に影響を及ぼして腫瘍促進性環境を確立する表現型を生成するように進化し得る。そのような腫瘍は、免疫細胞による浸潤が乏しいことがあり、免疫学的に「コールド」であるとして参照される。他の状況において、腫瘍細胞における高い突然変異率（例えば、ＤＮＡミスマッチ修復における欠陥の結果としてもたらされる）は豊富なネオエピトープを生成して、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の高い浸潤および免疫学的に「ホット」な腫瘍に繋がる。腫瘍遺伝子型および表現型と、経時的なそれらの共同的進行との間の繋がりの性質および程度は、大規模なおよび迅速な発見の対象である。応答性腫瘍と非応答性腫瘍との間の差異の解明は、免疫療法の特定の過程が信頼性を以って治癒的である多くの患者サブクラスの同定に最終的に繋がることが望まれる。転移性腫瘍を有する患者の大部分は多数の異なるゲノム変更を有することが報告されているので、成功裏の処置は、処置とがんプロファイルとの間の緊密なマッチを達成するために複数の治療剤のカスタマイズされた組合せを要求し得る［非特許文献１７］。
様々な診断システムが、免疫浸潤物および局所炎症応答を包含するＴＭＥの特徴付けに基づいて開発されている［非特許文献１８；非特許文献１９；非特許文献２０；非特許文献２１］。免疫チェックポイント遮断剤、例えば抗ＣＴＬＡ－４および抗ＰＤ－１で処置された患者集団のレトロスペクティブ分析は、処置に応答する能力と関連した腫瘍の免疫状況における差異を指し示した［非特許文献２１］。「腫瘍突然変異負担」および「Ｔ細胞惹起性遺伝子発現プロファイル」は、抗ＰＤ－１抗体ペムブロリズマブでの肯定的な処置アウトカムに関連することが報告された［非特許文献２２］。ＣＴＬ浸潤および患者生存と相関する遺伝子シグネチャー（処置前ＲＮＡ－ＳｅｑまたはＮａｎｏＳｔｒｉｎｇプロファイルから）に基づいて腫瘍によるＣＴＬ逃避をモデル化するコンピュータモデル「ＴＩＤＥ」（Ｔｕｍｏｕｒ Ｉｍｍｕｎｅ Ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ；腫瘍免疫機能障害および除外）は、他のバイオマーカー、例えばＰＤ－Ｌ１発現および突然変異負荷よりも正確にファーストライン抗ＰＤ－１または抗ＣＴＬＡ－４で処置された黒色腫患者のアウトカムを予測することが報告された［非特許文献２３］。抗ＣＴＬＡ－４抗体イピリムマブの作用のモードは、非応答性患者と比較して応答性患者においてより高いベースライン末梢頻度で見出されるＦｃγＲＩＩＩＡ発現性非古典的単球を伴うことが報告された［非特許文献２４］。
研究は、抗ＩＣＯＳ抗体は、ＩＣＯＳおよび／またはＦＯＸＰ３（ＴＲｅｇのマーカー）の発現について陽性の腫瘍について特定の治療的価値を与え得ることを指し示している［非特許文献６；特許文献４；特許文献１］。抗ＩＣＯＳ抗体ＪＴＸ２０１１でのＩＣＯＮＩＣ試験ＮＣＴ０２９０４２２６からのデータに基づいて、疾患制御および腫瘍低減の率は、腫瘍において高いＩＣＯＳ発現を有する患者においてより高いことが報告された［非特許文献２５］。それにもかかわらず、ＩＣＯＳおよび／またはＦＯＸＰ３発現は、抗ＩＣＯＳ抗体療法が所与の患者のために機能するかどうかの「大まかな」指標しか提供しない。
特許文献６は、固形がんを患う患者が処置（化学療法、放射線療法または免疫療法）に応答するかどうかを決定する方法であって、患者からの腫瘍サンプルを、ＣＣＲ２、ＣＤ３Ｄ、ＣＤ３Ｅ、ＣＤ３Ｇ、ＣＤ８Ａ、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＧＺＭＡ、ＧＺＭＢ、ＧＺＭＫ、ＧＺＭＭ、ＩＬ１５、ＩＲＦ１、ＰＲＦ１、ＳＴＡＴ１、ＣＤ６９、ＩＣＯＳ、ＣＸＣＲ３、ＳＴＡＴ４、ＣＣＬ２、およびＴＢＸ２１から選択される遺伝子のセットの発現レベルをアッセイすることを伴う、前記方法を記載した。このセット中の遺伝子の発現レベルはまた、がん予後と関連していることが報告された。
特許文献７は、がん患者が良好なまたは不良な適応免疫応答および良好なまたは不良な免疫抑制応答を有するかどうかを決定する方法であって、定義された遺伝子セットの発現レベルについて患者からの腫瘍サンプルをアッセイすることを伴う、前記方法を記載した。
特許文献８は、体細胞突然変異についてがんサンプルをアッセイして、免疫チェックポイントモジュレーターでの処置のための候補である患者を同定する方法を記載した。
特許文献９は、患者から得られた生物学的サンプルにおける「免疫細胞遺伝子シグネチャー」に基づく免疫療法での処置のための患者の選択であって、免疫細胞シグネチャーが、定義された遺伝子セットからの遺伝子の１つまたはそれ以上の発現レベルを含む、前記選択を記載した。
特許文献１０は、定義された遺伝子セットからのｍＲＮＡのレベルについて患者サンプルをアッセイして抗ＩＣＯＳ抗体での処置のための患者を同定する方法を記載した。
特許文献１１および特許文献１２は、少なくとも免疫チェックポイント阻害剤での処置に対するがん患者の応答を予測する方法であって、「宿主駆動性」バイオマーカー、例えばサイトカイン、ケモカイン、増殖因子、酵素または可溶性受容体をアッセイすることを含む、前記方法を記載した。
特許文献１３は、がんに罹患した患者における化学療法剤での処置レジメンを決定する方法であって、患者からの腫瘍サンプルにおいてＣＤ８およびＣＤ３を定量化することを含む、前記方法を記載した。腫瘍および腫瘍の浸潤性周縁部におけるＣＤ８＋およびＣＤ３＋細胞の密度を定量化する方法が記載された。
個々の患者のための適切な処置および組合せ処置の処方を可能にする好適なバイオマーカーを同定することと共に、それは処置の早期ステージにある患者のための予後バイオマーカーを同定するために有用である。免疫療法処置レジメンは長い持続期間を有し、少なくとも何か月間、多くの場合に何年間も続く。これは、細胞殺傷／腫瘍収縮がほぼ即時的である化学療法処置とは異なる。免疫療法に対する応答は、３工程プロセスとして考えることができる：薬物が免疫系の細胞を活性化させる細胞応答；免疫細胞が腫瘍を攻撃する抗腫瘍応答；および抗腫瘍効果が腫瘍負担を低減させ、患者のアウトカムを改善する治療奏功。最終的な治療奏功と相関する早期マーカー、例えば処置の最初の数週以内に患者において検出可能であり、より長期の予後を指し示すバイオマーカーを同定することができれば、これは、バイオマーカー陽性を呈する患者のための処置の継続において信頼性を提供する一方、バイオマーカーを欠いた患者は、代替的な療法に切り替えることができる。
Ｆｅｎｇら［非特許文献２６］は、口腔扁平上皮細胞がんを有する患者の予後情報が腫瘍組織切片中のＴ細胞の頻度から導出可能であることを報告した。浸潤性周縁部におけるＣＤ８＋ Ｔ細胞の多くの数は全生存期間と正に相関し、ＣＤ８＋ Ｔ細胞の３０ｕｍ以内のＦＯＸＰ３＋細胞の数は全生存期間と負に相関した。著者らは、これらおよび他の測定を、全生存期間と相関する「累積抑制指数」に統合した。
特許文献１４は、抗ＩＣＯＳ抗体に対する患者応答と関連しているとしてＩＣＯＳおよびＴ－ｂｅｔのレベルの上昇を同定した。
最近、Ｋａｇａｍｕら［非特許文献２７］は、患者の末梢血中のＣＤ４＋ Ｔ細胞の状態を使用して、ニボルマブ（抗ＰＤ－１）での処置後に早期疾患進行を示す非小細胞肺がんを有する患者を同定することが可能であり、ノンレスポンダーまたはレスポンダーとしての患者の分類が可能になることを報告した。レスポンダーは、有意（ｐ＜０．０００１）により高いパーセンテージのエフェクター、ＣＤ６２Ｌｌｏｗ ＣＤ４＋ Ｔ細胞をＰＤ－１遮断の前に有することが見出された。反対に、ＣＤ２５＋ ＦＯＸＰ３＋ ＣＤ４＋ Ｔ細胞のパーセンテージはノンレスポンダーにおいて有意（ｐ＝０．０３４）により高かった。遺伝子発現分析は、ＣＣＬ１９、ＣＬＥＣ－２Ａ、ＩＦＮＡ、ＩＬ７、ＴＧＦＢＲ３、ＣＸＣＲ３、およびＨＤＡＣ９は、レスポンダーに由来するＣＤ６２Ｌｌｏｗ ＣＤ４＋ Ｔ細胞において優先的に発現されることを明らかにした。顕著なことに、５００日を超える無進行生存期間を有する長期レスポンダーは、ＰＤ－１遮断療法の前に有意により多くの数のＣＤ６２Ｌｌｏｗ ＣＤ４＋ Ｔ細胞を示した。療法後のＣＤ６２Ｌｌｏｗ ＣＤ４＋ Ｔ細胞パーセンテージの減少は、抵抗性の獲得を結果としてもたらし、長期生存者は高いＣＤ６２Ｌｌｏｗ ＣＤ４＋ Ｔ細胞パーセンテージを維持した。
国際公開第２０１９／１２２８８４号 国際公開第２０１６／１２０７８９号 国際公開第２０１６／１５４１７７号 国際公開第２０１８／０２９４７４号 国際公開第２０１８／１８７６１３号 国際公開第２０１４／００９５３５号 国際公開第２０１４／０２３７０６号 国際公開第１５／１０３０３７号 国際公開第１６／１０９５４６号 国際公開第２０１７／０７０４２３号 国際公開第２０１８／２２５０６２号 国際公開第２０１８／２２５０６３号 国際公開第２０２０／２４５１５５号 国際公開第２０１９／２２２１８８号
Ｗｅｉ、Ｄｕｆｆｙ ＆ Ａｌｌｉｓｏｎ、Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖ．２０１８ Ｇａｏ Ｑら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２５：２５８６～９３頁 ２００７ Ｔｕ ＪＦら、Ｓｃｉ Ｒｅｐ ６：３５０５６ ２０１６ Ｓｔｒａｕｓｓ Ｌら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １８０：２９６７～２９８０頁 ２００８ Ｋｏｒｎｅｔｅ Ｍ、Ｓｇｏｕｒｏｕｄｉｓ Ｅ、Ｐｉｃｃｉｒｉｌｌｏ ＣＡ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １８８：１０６４～１０７４頁 ２０１２ ３２ｎｄ Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ ａｎｄ Ｐｒｅ－Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ Ｐｒｏｇｒａｍｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ （ＳＩＴＣ ２０１７）： Ｐａｒｔ Ｔｗｏ．Ｐｏｓｔｅｒ Ｐ２８８ Ｊｏｕｒｎａｌ ｆｏｒ ＩｍｍｕｎｏＴｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ ５：８７ ２０１７ Ｓａｉｎｓｏｎら、ＢｉｏＲｘｉｖ Ｓｅｐ ２０１９ ｄｏｉ：１０．１１０１／７７１４９３ Ｍｏら、Ｖａｃｃｉｎｅ ３５：５９３２～５９３８頁 ２０１７ Ｙａｐ ＴＡら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ３６：３０００ ２０１８ Ｈａｎｓｅｎ Ａら、Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ２９ ２０１８ Ｅｌ－Ｋｈｏｕｅｉｒｙ ＡＢら、Ｌａｎｃｅｔ ３８９：２４９２～２５０２頁 ２０１７ Ｚｈｕ ＡＸら、Ｌａｎｃｅｔ Ｏｎｃｏｌ １９：９４０～９５２頁 ２０１８ Ｙａｕ Ｔら、Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ３０ ２０１９ Ｆｉｎｎ ＲＳら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ １９０１３０７ ２０１９ Ｃａｌｄｅｒａｒｏ，Ｊ．ら、「Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｄｅａｔｈ ｌｉｇａｎｄ １ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ： Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ Ｗｉｔｈ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｆｅａｔｕｒｅｓ．」、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ６４、２０３８～２０４６頁 ２０１６ Ｙａｕ Ｔら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ３７：４０１２～４０１２頁 ２０１９ Ｃｈｅｎｇ Ａ－Ｌら、Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ３０ ２０１９ Ｓｉｃｋｌｉｃｋら、Ｎａｔ Ｍｅｄ、２０１９年４月 ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１５９１－０１９－０４０７－５ Ａｌｉら、ＰＬｏＳ Ｍｅｄ．１３：ｅ１００２１９４ ２０１６ Ｎｅｗｍａｎら、Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ １２：４５３～４５７頁 ２０１５ Ａｒａｎ、Ｈｕ ＆ Ｂｕｔｔｅ、Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ １８：２２０ ２０１７ Ｂｉｎｎｅｗｅｉｓら、Ｎａｔ Ｍｅｄ ２４：５４１～５５０頁 ２０１８ Ｃｒｉｓｔｅｓｃｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３６２ ２０１８ Ｊｉａｎｇら、Ｎａｔ Ｍｅｄ．２０１８ Ｒｏｍａｎｏら、ＰＮＡＳ １１２（１９）：６１４０～６１４５頁 ２０１５ Ｆｅｎｇら、ＪＣＩ Ｉｎｓｉｇｈｔ ２（１４）：ｅ９３６５２ ２０１７ Ｋａｇａｍｕら、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ８：３３４～３４４頁 ２０２０ ＤＯＩ： １０．１１５８／２３２６－６０６６．ＣＩＲ－１９－０５７４
本発明者らは、腫瘍微環境（ＴＭＥ）内の細胞組成、免疫的構成および細胞の特有の空間的構成の特色は、患者の臨床的進行の可能性および患者が免疫療法での処置から利益を受ける可能性があるかどうかの情報を与えることができることを発見した。本発明者らは、患者生存の持続期間ならびに、抗ＩＣＯＳおよび／または抗ＴＲｅｇ免疫療法剤での処置を包含する、免疫療法に対する応答の可能性と相関するＴＭＥのバイオマーカーを同定した。これらのバイオマーカーは、がん患者における疾患予後診断を補助し、患者をプロファイリングして患者が免疫療法から利益を受ける可能性を同定することを可能とし、処置の前および後の両方にモニターされた場合に、患者が療法に応答しているかどうかの価値のある早期指標を提供する。
これらのバイオマーカーは、ＴＭＥの以下の特色を含み、これは、例えば、切除された腫瘍または生検サンプルの分析を介して、患者の腫瘍から同定することができる：
（ｉ）ＩＣＯＳ＋密度：ＩＣＯＳタンパク質を発現する細胞、すなわち、ＩＣＯＳ陽性（ＩＣＯＳ＋）細胞の密度または濃度、
（ｉｉ）ＩＣＯＳ＋ ＴＲｅｇの割合：ＩＣＯＳ陽性のＴＲｅｇの割合を表す、ＩＣＯＳ＋であるＦＯＸＰ３＋細胞の割合、
（ｉｉｉ）細胞間近接性：ＩＣＯＳ＋ ＦＯＸＰ３＋：ＩＣＯＳ＋ ＦＯＸＰ３－細胞間近接性、すなわち、ＩＣＯＳ陽性ＴＲｅｇと他のＩＣＯＳ陽性細胞（ＩＣＯＳ＋ ＴＥｆｆを包含する）との間の近接性を表す、各々のＩＣＯＳ単一陽性（すなわち、ＩＣＯＳ陽性ＦＯＸＰ３陰性）細胞とその最も近いＩＣＯＳ ＦＯＸＰ３二重陽性細胞との間の平均距離、ならびに
（ｉｖ）区域的影響比：ＩＣＯＳ単一陽性細胞の総数に対する任意のＩＣＯＳ単一陽性細胞の定義された領域（「影響半径」）内のＩＣＯＳ ＦＯＸＰ３二重陽性細胞の数の比であって、影響半径が、細胞－細胞および／またはサイトカイン依存性コミュニケーションがＩＣＯＳ ＦＯＸＰ３二重陽性細胞とＩＣＯＳ単一陽性細胞との間で起こり得る距離（例えば、３０μｍ）を表すもの。
これらのバイオマーカーの各々は、患者が抗ＩＣＯＳおよび／または抗ＴＲｅｇ免疫療法から利益を受ける期待度と正に相関する。一般に、バイオマーカーがより高くなればなるほど（密度、割合、近接性または区域的影響がより大きくなればなるほど）、処置の非存在下での患者の予後はより不良となるが、患者が抗ＩＣＯＳおよび／または抗ＴＲｅｇ介入に応答する可能性はより高くなる。そのため、本明細書に記載されているバイオマーカーの測定は、処置のための患者の適切な選択を促し、免疫療法が、有益な抗腫瘍応答を生成する可能性が最も高い患者に選択的に投与されることを可能にする。
これらのバイオマーカーの詳細は、付属の表Ｂにおいて要約されており、以下に記載される。バイオマーカー（ｉｉ）、（ｉｉｉ）および（ｉｖ）は免疫抑制性ＴＭＥの指標である。
ＦＯＸＰ３はＴＲｅｇの既知のマーカーであり、ＩＣＯＳおよびＦＯＸＰ３の両方を発現する細胞は、ＴＲｅｇの高度免疫抑制性サブグループとして同定可能である。本発明者らはＴＲｅｇの同定マーカーとしてＦＯＸＰ３の使用を本明細書において記載するが、代替的なマーカーがＴＲｅｇを選択的に同定するために容易に使用可能であることが認められる。本発明者らが本明細書において開示するように、ＩＣＯＳ＋細胞のより高い密度、ＩＣＯＳ＋であるＴＲｅｇのより高い割合、およびＩＣＯＳ＋ ＴＲｅｇと他のＩＣＯＳ＋ Ｔ細胞（ＦＯＸＰ３－）との間のより近い近接性はすべて、患者のより不良な予後に関連し、患者は、同じ腫瘍タイプを有する他の患者と比べて、例えば、生存の持続期間の低減または無再発生存期間（ＲＦＳ）、無進行生存期間（ＰＦＳ）もしくは無増悪期間（ＴＴＰ）の持続期間の低減を示す。反対に、しかしながら、そのような患者は、抗ＩＣＯＳおよび／または抗ＴＲｅｇ免疫療法に応答する可能性が特に高い亜群を表す。
本明細書に記載される抗ＴＲｅｇ治療剤、例えばＫＹ１０４４抗体のようなＦｃエフェクター陽性抗ＩＣＯＳ抗体での処置は、ＴＲｅｇの数を低減させ、ＴＭＥにおけるＴＥｆｆ／ＴＲｅｇの比を向上させ、それにより腫瘍に対する患者の免疫応答をブーストして、患者における腫瘍成長の低減ならびに好ましくは１つまたはそれ以上の腫瘍のサイズにおける低減および最終的な根絶に繋がり得る。他の非ＴＲｅｇ枯渇性抗ＩＣＯＳ抗体は、ＴＥｆｆによるサイトカイン産生を増強し、それによりＴＥｆｆ活性をブーストすることにより抗腫瘍免疫応答を同様に向上させる。
本発明者らは本明細書において、定義されたバイオマーカーをどのように個々の腫瘍サンプルおよび患者群において測定および定量化して、患者をレスポンダー群とノンレスポンダー群とに有用に分類するカットオフ値を提供できるのかを記載する。腫瘍生物学の複雑な性質および患者の多様性を考慮すれば、これらのバイオマーカーを使用して為される予測は１００％正確であることはできないが、確率に基づく有用なガイドを依然として提供する。そのため、本発明は、患者を、その患者が利益を導出する療法に好適にマッチさせる確率を増加させる。がん患者は、そのため、療法に対する応答の相対的な可能性の指標を提供するために本発明によるバイオマーカーを使用してスクリーニングすることができ、この情報は、本発明による免疫療法の過程に取り組むべきかどうかの決定においておよび／または免疫療法のいずれの過程（例えば、いずれの単剤療法もしくはいずれの剤の組合せ）を採用するべきかの決定において臨床医および患者の両方にとって価値のあるものである。
本発明の実施形態は、肝細胞がん（ＨＣＣ）を参照して開示され、研究された患者コホートでのＴＭＥベースにおける以下の定量的な度合により例示される：
－ １２０細胞／ｍｍ２より多くとして測定される、高密度のＩＣＯＳ＋細胞；
－ １００細胞／ｍｍ２より多くの高密度のＩＣＯＳ＋細胞であって、ＨＣＣが、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染症に関連することが既知であるか、または米国がん合同委員会（ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｉｎｔ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ｃａｎｃｅｒ；ＡＪＣＣ）の基準にしたがってステージ２もしくはその後のステージのＨＣＣであるもの［２８］；
－ ＦＯＸＰ３＋細胞の半数より多くがＩＣＯＳ＋であるとして測定される、ＩＣＯＳ＋であるＦＯＸＰ３＋細胞の高い割合；
－ １０５μｍ未満の平均細胞間距離として測定される、ＩＣＯＳ＋ ＦＯＸＰ３－陰性（ＩＣＯＳ単一陽性）細胞とそれらの最近接ＩＣＯＳ＋ ＦＯＸＰ３＋二重陽性細胞との間の近い近接性；
－ すべてのＩＣＯＳ単一陽性細胞に対するＩＣＯＳ単一陽性細胞の３０μｍの影響半径内のＩＣＯＳ ＦＯＸＰ３二重陽性細胞の数の高い比。
これらの基準のうちの１つまたはそれ以上（好ましくはすべて）を満たすＨＣＣ患者は、本明細書に記載されている抗ＩＣＯＳおよび／または抗ＴＲｅｇ免疫療法での処置のために選択可能である。
参照値は、通常、特定の臨床的特徴（例えばがんサブタイプ）を有する患者に関して決定され、同等の患者における予後診断のために最良に使用される。上記は、本明細書において例示されるＨＣＣ患者群のための実例的な実施形態であり、他の好適なカットオフ値が、他の腫瘍タイプおよび／または患者の集団に関して決定可能である。そのため、本明細書において例示される参照値は、ＨＣＣ以外の他のがんを有する患者における予後診断のために場合により応用可能であるが、そのようなより広い文脈におけるそれらの使用は、可能な場合、標的がんタイプまたは分子サブタイプを有する患者からのデータの評価により最初に確認されるべきである（組織学不可知）。本発明者らは、予測されるがん予後ならびに抗ＩＣＯＳおよび／または抗ＴＲｅｇ免疫療法からの利益の可能性にしたがって患者を区別するための好適な参照値および式を決定する方法を記載する。ＨＣＣのための参照値の決定および使用は実施例において示されており、同等の方法を使用して他のがんに関する参照値を決定および採用することができる。
本発明は、以下の態様におけるものを包含する、医学的状況におけるバイオマーカーの応用に関する：
患者におけるがんの予後診断におけるもの、例えば、生存、無再発生存期間（ＲＦＳ）、無進行生存期間（ＰＦＳ）および／または無増悪期間（ＴＴＰ）の長さであり得る、生存を予測するためのもの；
適切な処置への患者のマッチングにおけるもの、例えば、抗ＩＣＯＳおよび／または抗ＴＲｅｇ免疫療法での処置のための患者の選択ならびに利益を受ける可能性がより高いとして同定される患者のための抗ＩＣＯＳおよび／または抗ＴＲｅｇ免疫療法の処方；
患者が処置に応答しているかどうかの早期指標としての抗ＩＣＯＳおよび／または抗ＴＲｅｇ免疫療法に対する細胞応答のモニタリングにおけるもの；
患者からのバイオマーカーデータが病歴および／または療法に対する応答に対してマッピングされて、臨床的な評価および将来の患者のための処置を向上させることができるモデルが提供または精密化される、医学的研究におけるもの。
１つまたはそれ以上のバイオマーカーは、患者におけるがん性固形腫瘍の予後診断のために使用することができ、これは、患者からの腫瘍コア組織において決定される以下のバイオマーカーの１つまたはそれ以上を包含する：
（ｉ）ＩＣＯＳ単一陽性細胞の総数に対するＩＣＯＳ単一陽性細胞の周囲の定義された影響半径内のＩＣＯＳ ＦＯＸＰ３二重陽性細胞の数の比、
（ｉｉ）各々のＩＣＯＳ陽性ＦＯＸＰ３陰性細胞とその最も近いＩＣＯＳ＋ ＦＯＸＰ３＋二重陽性細胞との間の平均距離、
（ｉｉｉ）ＩＣＯＳ陽性であるＦＯＸＰ３陽性細胞の割合、および
（ｉｖ）ＩＣＯＳ陽性細胞の密度。
よって、第１の態様において、本発明は、患者におけるがん性固形腫瘍の予後診断方法であって、
患者から得られた腫瘍コア組織のサンプルを提供すること、
前記サンプルにおいて以下のバイオマーカー：
（ｉ）ＩＣＯＳ単一陽性細胞の総数に対するＩＣＯＳ単一陽性細胞の周囲の定義された影響半径内のＩＣＯＳ ＦＯＸＰ３二重陽性細胞の数の比、
（ｉｉ）各々のＩＣＯＳ陽性ＦＯＸＰ３陰性細胞とその最も近いＩＣＯＳ＋ ＦＯＸＰ３＋二重陽性細胞との間の平均距離、
（ｉｉｉ）ＩＣＯＳ陽性であるＦＯＸＰ３陽性細胞の割合、および
（ｉｖ）ＩＣＯＳ陽性細胞の密度
のうちの１つまたはそれ以上を決定すること、ならびに
前記１つまたはそれ以上のバイオマーカーに基づいて患者のための予後診断を提供すること
を含み、
より短い生存は、
ＩＣＯＳ単一陽性細胞の総数に対するＩＣＯＳ単一陽性細胞の周囲の定義された影響半径内のＩＣＯＳ ＦＯＸＰ３二重陽性細胞の数のより高い比、
各々のＩＣＯＳ陽性ＦＯＸＰ３陰性細胞とその最も近いＩＣＯＳ＋ ＦＯＸＰ３＋二重陽性細胞との間のより短い平均距離、
ＩＣＯＳ陽性であるＦＯＸＰ３陽性細胞のより高い割合、および／または
ＩＣＯＳ陽性細胞のより高い密度
により指し示される、前記方法を提供する。
ＩＣＯＳ単一陽性細胞の総数に対するＩＣＯＳ単一陽性細胞の周囲の定義された影響半径内のＩＣＯＳ ＦＯＸＰ３二重陽性細胞の数の比は、参照値に対して決定および比較することができる。参照値より高い数はより短い生存の予後を指し示し、参照値より低い数はより長い生存の予後を指し示す。ＨＣＣにおいて、例えば、本発明者らは、３０μｍ（３０マイクロメートル）の影響半径について０．１である患者分類のための参照値を決定した。そのため、ＩＣＯＳ単一陽性細胞の総数に対するＩＣＯＳ単一陽性細胞の周囲の定義された影響半径内のＩＣＯＳ ＦＯＸＰ３二重陽性細胞の０．１より高い比であると決定される場合、これはより短い生存の指標となる。
同様に、各々のＩＣＯＳ＋ ＦＯＸＰ３－（ＩＣＯＳ単一陽性）細胞とその最も近いＩＣＯＳ＋ ＦＯＸＰ３＋（ＩＣＯＳ ＦＯＸＰ３二重陽性）細胞との間の平均距離は、参照値に対して決定および比較することができる。参照値より短い距離は生存のより短い持続期間の予後を指し示す一方、参照値より長い距離はより長い生存の予後を指し示す。例えば、腫瘍がＨＣＣである場合、１０５μｍの参照値が使用可能である。そのため、各々のＩＣＯＳ単一陽性細胞とその最も近いＩＣＯＳ＋ ＦＯＸＰ３＋二重陽性細胞との間の１０５μｍより短い平均距離はＨＣＣにおけるより短い生存の指標となる一方、各々のＩＣＯＳ単一陽性細胞とその最も近いＩＣＯＳ＋ ＦＯＸＰ３＋二重陽性細胞との間の１０５μｍより長い平均はＨＣＣにおけるより長い生存の指標となる。
ＩＣＯＳ陽性であるＦＯＸＰ３陽性細胞の割合は、参照値に対して決定および比較することができる。参照値より高い割合はより短い生存の予後を指し示す一方、参照値より低い割合はより長い生存の予後を指し示す。例えば、腫瘍がＨＣＣである場合、０．５の参照値が使用可能である。そのため、ＦＯＸＰ３陽性細胞の半数より多くがＩＣＯＳ陽性である場合にこれはより短い生存の指標となる一方、ＦＯＸＰ３陽性細胞の半数未満がＩＣＯＳ陽性である場合にこれはより長い生存の指標となる。
ＩＣＯＳ陽性細胞の密度は、参照値に対して決定および比較することができる。参照値より高い密度はより短い生存の予後を指し示す一方、参照値より低い密度はより長い生存の予後を指し示す。例えば、腫瘍がＨＣＣである場合、１２０ ＩＣＯＳ陽性細胞／ｍｍ２の参照値が使用可能である。そのため、１２０／ｍｍ２より高いＩＣＯＳ＋細胞の密度はより短い生存の指標となる一方、１２０／ｍｍ２より低い密度はより長い生存の指標となる。腫瘍が、Ｂ型肝炎ウイルス感染症に関連するＨＣＣであるか、またはステージ２もしくはその後のステージのＨＣＣである場合、１００ ＩＣＯＳ陽性細胞／ｍｍ２の参照値が使用可能である。ＨＣＣのこれらのサブタイプを示す患者のための予後診断ではしたがってこのより低い参照値を使用することができる一方、ＨＣＣの別のタイプまたはＨＢＶに関連するか、もしくはステージ２もしくはその後のステージのＨＣＣとして同定されていないＨＣＣを示す患者のための予後診断では１２０細胞／ｍｍ２のより高い参照値を使用することができる。後者は、ステージ１ ＨＣＣを有すると診断された患者を包含する。
付随する実施例により示されるように、参照値は統計的モデリングから導出され、参照値は、その由来となったモデルにおけるデータに対する「最良フィット」を示し得るが、患者分類および予後診断のおおよそのガイドとしてのみ役立つことができ、そのため絶対的に決定的なものとみなされるべきではない。本明細書において提供される正確な値、例えば「３０μｍの半径内の０．１ ＩＣＯＳ ＦＯＸＰ３二重陽性細胞」、「各々のＩＣＯＳ＋ ＦＯＸＰ３－細胞とその最も近いＩＣＯＳ＋ ＦＯＸＰ３＋細胞との間の１０５μｍの平均距離」、「ＩＣＯＳ陽性である５０％のＦＯＸＰ３陽性細胞」、「１２０ ＩＣＯＳ＋細胞／ｍｍ２」または「１００ ＩＣＯＳ＋細胞／ｍｍ２」は、実例的な実施形態を表すに過ぎず、本発明は、予測的価値を依然として保持しながらこれらの精密な値のバリアントを使用して行うことができることが理解されるであろう。例えば、影響半径を２５μｍおよびＩＣＯＳ ＦＯＸＰ３二重陽性細胞の閾値数を０．２として定義した場合、患者は相対的に長い生存を予想できる者であるかどうかならびにそのような患者は抗ＩＣＯＳおよび／または抗ＴＲｅｇ治療剤での処置から利益を受ける可能性がより高いまたはより低いかどうかを有用に見積もることができることが依然として予想される。
生存は、異なる方法で定義および測定することができる。最も単純には、生存は、全生存期間（ＯＳ）の持続期間、すなわち、患者が死亡するまでの時間の長さとして定義することができる。他の生存関連の臨床的なエンドポイントは、測定される生存時間にかけての患者の疾患の状態の度合を組み込んでおり、これは例えば無再発生存期間（ＲＦＳ）、無進行生存期間（ＰＦＳ）および無増悪期間（ＴＴＰ）を包含する。簡潔に述べれば、ＲＦＳは、処置されたがんの再発または復帰までの時間の長さであり、ＰＦＳは、がんが悪化（進行）するまでの時間の長さであり、ＴＴＰはＰＦＳに類似しているが、がんに関係しない原因から死亡した患者をカウントしない。本発明のバイオマーカーは、疾患を生き延びる患者の能力を予測し、そのためＯＳ、ＲＦＳ、ＰＦＳおよびＴＴＰの各々の持続期間と相関することが予想される。この文脈において、生存の予測される持続期間は、抗ＩＣＯＳおよび／または抗ＴＲｅｇ免疫療法剤での処置の非存在下での生存であり、すなわち、予後診断は、患者が本明細書の他の箇所において記載されている抗ＩＣＯＳおよび／または抗ＴＲｅｇ免疫療法をどのように受けるのかまたはそれを受けるかどうかに関係なく為される。
予後診断を提供することは、そのため、患者が他の同等の患者と比べてより長い生存を享受するかどうかを予測することを含んでもよい。予後診断を提供することは、例えば月または年の概算される数として、生存時間を予測すること、例えばＯＳ、ＲＦＳ、ＰＦＳおよびＴＴＰの持続期間を予測することを含んでもよい。患者の予測される生存の持続期間（例えば、ＯＳ）は、場合により、組織サンプルが採取された日からの月数として概算される。生存の持続期間は、バイオマーカーがそれらの対応する参照値より上または下にあるかどうかにしたがって、範囲、例えばｘか月未満またはｘか月より長いとして概算することができる。例えば、本明細書に記載されるＨＣＣ患者集団において、ＯＳ中央値は１００．３か月であった。ＨＣＣを示すさらなる患者のために、区域的影響、細胞間近接性、ＩＣＯＳ＋ ＴＲｅｇの割合および／またはＩＣＯＳ＋細胞密度のためのバイオマーカーリーディングが決定され、１００．３か月より長いまたは短い生存の予後診断を提供するためにこの集団のために定義された参照値に対して比較される。
１つまたはそれ以上のそのようなバイオマーカーにより予測される相対的に不良な予後を有するとしてそのように同定された患者は、予後診断がより楽観的である患者よりも本発明による免疫療法に応答するより高い確率を有し得る。換言すれば、患者は、相対的に短い生存の持続期間を有することが予測されるが、患者の生存は抗ＩＣＯＳおよび／または抗ＴＲｅｇ免疫療法剤での処置により延長可能である可能性がより高い。
そのため、本発明の第２の態様は、他の患者よりも抗ＩＣＯＳおよび／または抗ＴＲｅｇ免疫療法剤での処置に応答する可能性が高い患者を同定することに関する。本発明のこの態様は、患者亜群（例えば、ＨＣＣ患者の亜群）の同定を提供し、亜群は、バイオマーカーまたはバイオマーカーの組合せの存在または値により定義され、前記亜群内の患者は、亜群の外側の患者よりも（すなわち、定義されたバイオマーカーを呈しない患者と比較して）抗ＩＣＯＳおよび／または抗ＴＲｅｇ免疫療法に対して応答性であることが予測される。
この第２の態様において、本発明は、患者におけるがん性固形腫瘍の、抗ＩＣＯＳおよび／または抗ＴＲｅｇ免疫療法剤に応答する可能性を決定する方法であって、
患者から得られた腫瘍コア組織のサンプルを提供すること、ならびに
前記サンプルにおいて以下のバイオマーカー：
（ｉ）ＩＣＯＳ単一陽性細胞の総数に対するＩＣＯＳ単一陽性細胞の周囲の定義された影響半径内のＩＣＯＳ ＦＯＸＰ３二重陽性細胞の数の比、
（ｉｉ）各々のＩＣＯＳ＋ ＦＯＸＰ３－細胞とその最も近いＩＣＯＳ＋ ＦＯＸＰ３＋細胞との間の平均距離、
（ｉｉｉ）ＩＣＯＳ陽性であるＦＯＸＰ３陽性細胞の割合、および
（ｉｖ）ＩＣＯＳ陽性細胞の密度
のうちの１つまたはそれ以上を決定すること
を含み、
患者の、抗ＩＣＯＳおよび／または抗ＴＲｅｇ免疫療法剤に応答するより高い可能性は、
ＩＣＯＳ単一陽性細胞の総数に対するＩＣＯＳ単一陽性細胞の周囲の定義された影響半径内のＩＣＯＳ ＦＯＸＰ３二重陽性細胞の数のより高い比、
各々のＩＣＯＳ陽性ＦＯＸＰ３陰性細胞とその最も近いＩＣＯＳ＋ ＦＯＸＰ３＋陽性細胞との間のより短い平均距離、
ＩＣＯＳ陽性であるＦＯＸＰ３陽性細胞のより高い割合、および／または
ＩＣＯＳ陽性細胞のより高い密度
により指し示される、前記方法を提供する。
上記のバイオマーカーのうちの１つまたはそれ以上は、そのため、患者におけるがん性腫瘍の、抗ＩＣＯＳおよび／または抗ＴＲｅｇ免疫療法剤に応答する可能性を決定するために使用される。患者が、他の患者と比べて処置に応答する増加もしくは低減された可能性を有するかどうかを決定することができ、および／または応答の可能性が数値的に概算可能である。
場合により、方法は、本発明の第１の態様について記載されるのと同じ方法で、および本明細書の他の箇所に例示されるように、１つまたはそれ以上のバイオマーカーを、対応する参照値と比較することを含む。参照値は患者の参照集団のために算出され、例えば、ＨＣＣ患者のために決定されたバイオマーカーは、ＨＣＣ患者の集団からの参照値と比較することができる。処置に応答する増加または低減された可能性は、そのため、参照集団における処置に対する応答の期待度に関して決定される。
方法は、免疫療法に応答する増加した可能性を有するとして患者を同定することならびにそれにより前記患者の処置のために抗ＩＣＯＳおよび／または抗ＴＲｅｇ免疫療法剤を選択することをさらに含んでもよい。上記のバイオマーカーのうちの１つまたはそれ以上は、そのため、抗ＩＣＯＳおよび／または抗ＴＲｅｇ免疫療法から利益を受ける可能性がより高いとして患者を同定するため、ならびに場合によりこれに伴って抗ＩＣＯＳおよび／または抗ＴＲｅｇ免疫療法剤での処置のために患者を選択するために使用することができる。例えば、定義された参照値を上回る、ＴＭＥにおけるＩＣＯＳ＋細胞の増加した数を示すＨＣＣを有する患者は、抗ＩＣＯＳおよび／または抗ＴＲｅｇ免疫療法剤での処置のために好適であるとして同定することができる。場合により、抗ＩＣＯＳおよび／または抗ＴＲｅｇ免疫療法剤は次に、患者のために処方されおよび／または患者に投与される。
バイオマーカーリーディングが、患者は免疫療法に応答する可能性がより低い（ノンレスポンダー）ことを指し示す場合、この患者には異なる処置を推奨することができる。代替的に、そのようなバイオマーカーリーディングは、患者は、１つまたはそれ以上の他の処置と組み合わせて抗ＩＣＯＳおよび／または抗ＴＲｅｇ免疫療法剤で処置されるべきことを指し示すことができ、該組合せにおいて応答が達成される可能性がより高い。例えば、一部の処置は、本明細書に記載されるバイオマーカーに影響を及ぼすことがあり、バイオマーカーが、免疫療法のための役割の増加を指し示す方向に変化することを結果としてもたらし得る。免疫療法は、このさらなる処置と組み合わせて投与することができ、複数の処置が一緒に（同時に）または任意の順序で逐次的に投与される。図１。
第３の態様において、本発明は、抗ＩＣＯＳおよび／または抗ＴＲｅｇ免疫療法でのがん患者の処置に関し、患者は、本明細書に記載されるバイオマーカーにより同定され、ならびに本明細書に記載されるバイオマーカーにより同定される患者の処置における使用のための抗ＩＣＯＳおよび／または抗ＴＲｅｇ免疫療法剤に関する。抗ＩＣＯＳおよび／または抗ＴＲｅｇ免疫療法剤を含む医薬組成物は、そのような患者における使用のために提供することができる。さらに、抗ＩＣＯＳおよび／または抗ＴＲｅｇ免疫療法剤は、そのような患者におけるがん性固形腫瘍の処置のための医薬の生産のために使用することができる。処置は、患者の生存を延長することを含んでもよい。
本発明のこの第３の態様による方法は、患者においてがん性固形腫瘍を処置することを含み、方法は、
抗ＩＣＯＳおよび／または抗ＴＲｅｇ免疫療法剤に応答する増加した可能性を有するとして患者を同定することを含み、前記患者は、本発明の第２の態様に記載されるように同定されるか、または同定されている。そのため、例えば、患者は、腫瘍からの以下のバイオマーカーリーディング：
参照値より高い、ＩＣＯＳ単一陽性細胞の総数に対するＩＣＯＳ単一陽性細胞の周囲の定義された影響半径内のＩＣＯＳ ＦＯＸＰ３二重陽性細胞の数の比、
参照値より短い、各々のＩＣＯＳ陽性ＦＯＸＰ３陰性細胞とその最も近いＩＣＯＳ陽性ＦＯＸＰ３陽性細胞との間の平均距離、
参照値より高い、ＩＣＯＳ陽性であるＦＯＸＰ３陽性細胞の割合、および
参照値より高い、ＩＣＯＳ陽性細胞の密度
のうちの１つまたはそれ以上により同定可能である。ならびに前記方法は、
抗ＩＣＯＳおよび／または抗ＴＲｅｇ免疫療法剤を患者に投与すること
を含む。
抗ＩＣＯＳおよび／または抗ＴＲｅｇ免疫療法剤は、そのため、患者においてがん性固形腫瘍を処置するために使用され、腫瘍は、定義されたバイオマーカーのうちの１つまたはそれ以上を含むことが決定されている。よって、抗ＩＣＯＳおよび／または抗ＴＲｅｇ免疫療法剤での処置の前に、患者から以前に得られた腫瘍コア組織のサンプル中のバイオマーカーのうちの１つまたはそれ以上は、本明細書に記載されているバイオマーカーのための参照値との比較により療法の好適性を指し示すために決定されたものであってもよい。例としてＨＣＣについて、腫瘍は、以下のバイオマーカー：
０．１より高い、ＩＣＯＳ単一陽性細胞の総数に対するＩＣＯＳ単一陽性細胞の周囲の定義された影響半径内のＩＣＯＳ ＦＯＸＰ３二重陽性細胞の数の比、
１０５μｍ未満の、各々のＩＣＯＳ陽性ＦＯＸＰ３陰性細胞とその最も近いＩＣＯＳ陽性ＦＯＸＰ３陽性細胞との間の平均距離、
半数より高い、ＩＣＯＳ陽性であるＦＯＸＰ３陽性細胞の割合、および
１２０細胞／ｍｍ２より高い、ＩＣＯＳ陽性細胞の密度
のうちの１つまたはそれ以上を含むことが決定されていてもよい。
ＨＢＶに関連するＨＣＣ、またはステージ２もしくはその後のステージのＨＣＣについて、腫瘍は、以下のバイオマーカー：
０．１より高い、ＩＣＯＳ単一陽性細胞の総数に対するＩＣＯＳ単一陽性細胞の周囲の定義された影響半径内のＩＣＯＳ ＦＯＸＰ３二重陽性細胞の数の比、
１０５μｍ未満の、各々のＩＣＯＳ陽性ＦＯＸＰ３陰性細胞とその最も近いＩＣＯＳ陽性ＦＯＸＰ３陰性細胞との間の平均距離、
半数より高い、ＩＣＯＳ陽性であるＦＯＸＰ３陽性細胞の割合、および
１００細胞／ｍｍ２より高い、ＩＣＯＳ陽性細胞の密度
のうちの１つまたはそれ以上を含むことが決定されていてもよい。
本発明の第４の態様は、１つまたはそれ以上の本明細書に記載されるバイオマーカーにおける変化を検出することにより抗ＩＣＯＳおよび／または抗ＴＲｅｇ免疫療法に対するがん患者の応答を測定することに関する。そのような変化は、応答のシグネチャーを表すことができ、外的に可視的な臨床徴候よりも有意に前に検出可能となって、処置が疾患の進行を阻害する生物学的効果を達成しているかどうかの有用な指標を提供し得る。
がん性固形腫瘍を処置するために投与された抗ＩＣＯＳおよび／または抗ＴＲｅｇ免疫療法剤に対する患者の応答をモニターする方法は、
抗ＩＣＯＳおよび／または抗ＴＲｅｇ免疫療法剤の投与後に患者から得られた腫瘍コア組織の試験サンプルを提供すること、
前記サンプルにおいて以下のバイオマーカー：
（ｉ）ＩＣＯＳ単一陽性細胞の総数に対するＩＣＯＳ単一陽性細胞の周囲の定義された影響半径内のＩＣＯＳ ＦＯＸＰ３二重陽性細胞の数の比、
（ｉｉ）各々のＩＣＯＳ＋ ＦＯＸＰ３－細胞とその最も近いＩＣＯＳ＋ ＦＯＸＰ３＋細胞との間の平均距離、
（ｉｉｉ）ＩＣＯＳ陽性であるＦＯＸＰ３陽性細胞の割合、および
（ｉｖ）ＩＣＯＳ陽性細胞の密度
のうちの１つまたはそれ以上を決定すること、
前記試験サンプルにおける前記１つまたはそれ以上のバイオマーカーを、患者から得られた腫瘍コア組織のより早期のサンプルにおける同じ１つまたはそれ以上のバイオマーカーと比較すること、ならびに
変化が前記１つまたはそれ以上のバイオマーカーにおいて起こったかどうかを決定すること
を含んでもよい。
試験サンプルは、免疫療法剤を投与した後に、免疫療法剤が効果を起こすための時間的期間を許容した後に、得られる。例えば、試験サンプルは、免疫療法剤の前記投与の少なくとも３日後に採取することができる。試験サンプルは、好ましくは、前記投与の２、４、６または８週以内に採取される。
より早期のサンプルは、患者の処置におけるより早期の時点において、試験サンプルを得る時点の前に、好ましくは免疫療法剤の前記投与の前に、患者から得られる。より早期のサンプルは、免疫療法剤の前記投与の前（場合により少し前、例えば最大１４日前）、その時点（例えば、同じ日）、またはその直後（例えば、翌日）に得ることができる。より早期のサンプルは、免疫療法剤での処置の過程の開始前もしくは開始時点、（例えば、最大１４日前）、免疫療法剤の初期投与の時点（例えば、同じ日）、またはその直後（例えば、翌日）に得られた初期サンプルであってもよい。
試験サンプルは、典型的には、それが比較されるより早期のサンプルの少なくとも２週後に得られる。
それにより、患者が免疫療法剤に応答しているかどうかを評価することができ、応答は、より早期のサンプルからの以下の変化：
ＩＣＯＳ単一陽性細胞の総数に対するＩＣＯＳ単一陽性細胞の周囲の定義された影響半径内のＩＣＯＳ ＦＯＸＰ３二重陽性細胞の数の比における低減、
各々のＩＣＯＳ＋ ＦＯＸＰ３－細胞とその最も近いＩＣＯＳ＋ ＦＯＸＰ３＋細胞との間の平均距離における増加、
ＩＣＯＳ陽性であるＦＯＸＰ３陽性細胞の割合における低減、および
ＩＣＯＳ陽性細胞の密度における低減
のうちの１つまたはそれ以上により指し示される。
実際上、より早期のサンプルは、１つまたはそれ以上のバイオマーカーのための参照値を提供するために使用され、該参照値に対して試験サンプルからの１つまたはそれ以上のバイオマーカーが次に比較される。
方法は、より早期のサンプルと比較される試験サンプルにおける前記バイオマーカーのうちの１つまたはそれ以上における変化を観察することを含んでもよく、前記変化は、患者が免疫療法に応答していることの指標となる。
本発明のこの第４の態様の方法は、抗ＩＣＯＳおよび／または抗ＴＲｅｇ免疫療法を受けている患者の連続的な評価またはモニタリングにおいて使用することができ、そのため場合により、療法の過程の間に定期的に繰り返され、１つまたはそれ以上のバイオマーカーについてのリーディングは先行するリーディングと比較され、それにより経時的な１つまたはそれ以上のバイオマーカーにおける変化が記録される。好ましくは患者への抗ＩＣＯＳおよび／または抗ＴＲｅｇ免疫療法剤の第１の投与の前に得られる初期サンプルに加えて、サンプルは、場合により、抗ＩＣＯＳおよび／もしくは抗ＴＲｅｇ免疫療法剤のあらゆる投与の後に、またはある特定の投与の後にのみ（例えば、第１の投与の後および約１か月毎、２か月毎または３か月毎の間隔で再び；組織サンプル採取は、場合により、処置のための診療所への患者の来診と合致するように時期決定される）、バイオマーカーの測定のために採取することができる。試験サンプルからのリーディングは、そのため、長期的な時間的期間にかけてのバイオマーカーにおける変化をモニターするために、複数のより早期のサンプルからのものと比較することができる。方法は、したがって、より早期のサンプルと比較された試験サンプルにおけるバイオマーカーのうちの１つまたはそれ以上における変化を検出することであって、前記変化が、場合により、一連の複数のサンプルにおいて検出されること（試験サンプルを複数のより早期のサンプル、例えば、週または月の長期的な期間にかけてのサンプルと比較すること）、および応答シグネチャー（好ましくは、複数のより早期のサンプルと比較された試験サンプルにおいて観察された持続的な応答シグネチャー）を検出することであって、応答シグネチャーが、患者が処置に応答していることを指し示すことを含んでもよい。
バイオマーカーリーディングを使用して、患者のさらなる処置に関する臨床的な決定の情報を与えることができる。陽性シグナルが検出される場合（患者が処置に応答していることを指し示す１つまたはそれ以上のバイオマーカー）、抗ＩＣＯＳおよび／または抗ＴＲｅｇ免疫療法を継続することができる。これが該当しない場合、または長期化された処置の間に該当しなくなった場合、免疫療法を終了することができ、患者を場合により代替的な処置に切り替えることができる。代替的に、１つまたはそれ以上の追加の処置での免疫療法の補充が指し示されることがある。場合により、そのような代替的な処置の選択は、サンプルにおいて決定されたバイオマーカーによりガイドされる。当然、任意のそのような処置の決定はまた、患者における疾患の任意の他の症状もしくは徴候または臨床応答を考慮するが、バイオマーカーリーディングは処置の薬力学への価値のあるおよび早い洞察を提示するため、患者の予後を検討および更新するためならびに医師による意思決定をガイドするための重要なシグナルを提供する。
一般に、複数のバイオマーカーにおける変化は、互いに同じ方向の傾向を示すことが予想され、例えば、１つのバイオマーカーが変化への応答を強く指し示し、別のバイオマーカーが反対を指し示すのではなく、すべての変化は処置に対する応答を指し示す。より高い正確性およびより大きい予測的価値が、式にしたがって複数のバイオマーカーリーディングの出力を統合することにより得ることができ、本明細書の他の箇所において記載されるように、式の出力は、サンプルの間でおよび／または参照値に対して比較される。
１つもしくはそれ以上のバイオマーカーリーディングまたはそれらから算出される式が処置に対する応答を指し示す応答シグネチャーを観察することができ、応答シグネチャーは、
ＩＣＯＳ単一陽性細胞の総数に対するＩＣＯＳ単一陽性細胞の周囲の定義された影響半径内のＩＣＯＳ ＦＯＸＰ３二重陽性細胞の数の比における低減を測定すること、
各々のＩＣＯＳ単一陽性細胞とその最も近いＩＣＯＳ ＦＯＸＰ３二重陽性細胞との間の平均距離における増加を測定すること、
ＩＣＯＳ陽性であるＦＯＸＰ３陽性細胞の割合における低減を測定すること、および／または
ＩＣＯＳ陽性細胞の密度における低減を測定すること
により同定される。
変化は、療法の前および後のバイオマーカーリーディングを比較することにより同定することができる。
試験サンプルにおいて応答シグネチャーの存在が観察されたら、抗ＩＣＯＳおよび／または抗ＴＲｅｇ免疫療法剤での処置の継続を患者のために処方することができる。
バイオマーカーにおける変化の程度を使用して、投薬および／または療法のスケジュール決定の情報を与えることができる。処置を繰り返し調整して、バイオマーカーにおける陽性の変化、すなわち、処置に対する応答の指標となる変化を最大化することができ、投与される治療剤の量および／またはタイミングは、最も最近のバイオマーカーデータに基づいて調整される。
バイオマーカーにおける陽性の変化がない場合、すなわち、バイオマーカーが、患者が処置に応答していることを指し示さない場合、特に陽性の変化が、繰返しのサンプル採取を伴う長期化されたモニタリングにかけて観察されない場合、抗ＩＣＯＳおよび／または抗ＴＲｅｇがん免疫療法処置を前記患者のために中止することができるか、または処置レジメンを、例えば、単剤療法処置から組合せ処置へと、変化させることができる。
応答のシグネチャーは、抗ＩＣＯＳおよび／または抗ＴＲｅｇ免疫療法剤が、患者を他の処置、例えば免疫チェックポイント遮断剤に応答しやすくしたことを指し示し得る。これは併用療法に対する適合されたアプローチを可能とし、それにより、さらなる治療剤が、応答シグネチャーが検出された患者の処置のために選択的に処方される。バイオマーカーのうちの１つまたはそれ以上における変化は、例えば、腫瘍が、（既存の抗ＩＣＯＳおよび／または抗ＴＲｅｇ免疫療法の他に）他の処置、例えばさらなる治療剤の投与に対する増加した感受性を有することを指し示してもよく、バイオマーカーをモニターして、そのような他の処置のための投与の適切なタイミングを決定することができる。そのような他の処置の例は、異なる抗ＩＣＯＳおよび／もしくは抗ＴＲｅｇ免疫療法剤、免疫チェックポイント遮断剤、化学療法剤、標的化療法（例えば抗血管新生およびチロシンキナーゼ阻害剤）、もしくは放射線療法（または複数のそのような他の処置の組合せ）の投与を包含する。免疫学的細胞死を誘導する剤が使用可能である。任意のそのような他の処置は、先行する抗ＩＣＯＳおよび／もしくは抗ＴＲｅｇ免疫療法剤と組み合わせて（すなわち、先行する処置は中止されない）患者に投与することができるか、またはそれを置換することができる（すなわち、先行する処置は中止され、患者は他の処置に切り替えられる）。
第５の態様において、本発明は、新たな患者亜群においてバイオマーカーを使用するためのパラメーターを決定することに関し、これは、１つまたはそれ以上のバイオマーカーを、患者予後または処置に対する応答と相関させること、および腫瘍予後または処置に対する応答に関して患者が区別されることを可能とするバイオマーカーの定量的値を同定することを含む。そのように決定された参照値は、本発明の他の態様、例えば疾患予後診断および処置のための患者の選択において用いることができる。
本発明のこの第５の態様は、がん性固形腫瘍を有する患者を、患者の予測される予後または抗ＩＣＯＳおよび／もしくは抗ＴＲｅｇ免疫療法剤に対する予測される応答にしたがって分類するための参照値を同定する方法であって、
疾患アウトカムが既知であるか、または抗ＩＣＯＳおよび／もしくは抗ＴＲｅｇ免疫療法剤に対する応答が既知である単一の腫瘍タイプ（同じ組織学的および／または分子タイプのがん性固形腫瘍）（場合により組織学不可知）を有する患者の集団（統計的に意味のある数、例えば、少なくとも２０人、少なくとも１００人）の各々から得られた腫瘍コア組織のサンプルを提供すること、
前記サンプルの各々における以下のバイオマーカー：
（ｉ）ＩＣＯＳ単一陽性細胞の総数に対するＩＣＯＳ単一陽性細胞の周囲の定義された影響半径内のＩＣＯＳ ＦＯＸＰ３二重陽性細胞の数の比、
（ｉｉ）各々のＩＣＯＳ単一陽性細胞とその最も近いＩＣＯＳ ＦＯＸＰ３二重陽性細胞との間の平均距離、
（ｉｉｉ）ＩＣＯＳ陽性であるＦＯＸＰ３陽性細胞の割合、および
（ｉｖ）ＩＣＯＳ陽性細胞の密度
のうちの１つまたはそれ以上を決定すること、
前記１つまたはそれ以上のバイオマーカーの各々についてのデータを、各々の患者における疾患アウトカムまたは抗ＩＣＯＳおよび／もしくは抗ＴＲｅｇ免疫療法剤に対する応答についてのデータとペア化すること、ならびに
前記１つまたはそれ以上のバイオマーカーの各々についてのデータをグループ分けして、疾患アウトカムまたは抗ＩＣＯＳおよび／もしくは抗ＴＲｅｇ免疫療法剤に対する応答についての統計的に有意なデータの２つの群を定義する数値的カットオフを同定することであって、
前記カットオフは、同じタイプのがん性固形腫瘍を有する患者を、患者の予測される予後または抗ＩＣＯＳおよび／もしくは抗ＴＲｅｇ免疫療法剤に対する予測される応答にしたがって分類するための参照値を表すこと
を含む、前記方法を提供する。
本明細書に記載されるバイオマーカーの各々は、個々にまたは１つもしくはそれ以上の他のバイオマーカーと組み合わせて使用することができる。がんの病因および進行は多要因的であり、より大きな予測的価値が、バイオマーカーの組合せを使用して得ることができる。統計的モデリング方法、例えばロジスティック回帰を使用して、いずれのバイオマーカーおよびバイオマーカーの組合せが最良の予測的価値を提供するのかを決定することができる。複数のバイオマーカーのための参照値を組み合わせて、患者を、患者の予後および／または処置に対する応答の可能性にしたがって分類することができる式を提供することができる。そのような式は、患者が抗ＩＣＯＳおよび／または抗ＴＲｅｇ療法から利益を受ける可能性があるのかどうかの決定において、ならびにそのため抗ＩＣＯＳおよび／または抗ＴＲｅｇ治療剤での処置のための患者を同定するために応用することができ、式にしたがって算出される参照値を満たすか、またはそれを上回る患者は、抗ＩＣＯＳおよび／または抗ＴＲｅｇ治療剤での処置を与えられる。
本発明の実施形態がこれより、添付の図面を参照して、より詳細に記載される。当業者は、本明細書に記載される発明の特有の実施形態に対する多くの均等物を認識するか、またはルーチン以下の実験を使用して確認することができる。そのような均等物は、添付の請求項の保護の範囲内にあることが意図される。
図１は、バイオマーカーが本発明にしたがって抗ＩＣＯＳがん免疫療法での処置のための患者の選択において使用される方法のフローダイアグラムであり、がんの免疫的構成を評価するためならびにＨＣＣの確認された診断を伴う患者における抗ＩＣＯＳ処置の適格性および必要性を予測するためのデータ収集の処理の実施形態を示す。バイオマーカーリーディングが陽性である患者（「イエス」（ｙｅｓ）アーム）に、場合により他の処置と組み合わせて、抗ＩＣＯＳ抗体ＫＹ１０４４が投与される。バイオマーカーリーディングが陰性である患者（「ノー」（ｎｏ）アーム）は、抗ＩＣＯＳ療法を処方されないか、または１つもしくはそれ以上の他の処置（例えば、バイオマーカーに影響を及ぼし、「イエス／ノー」閾値を越える」効果を有する他の剤の投与）と組み合わせて抗ＩＣＯＳ療法を与えられる。 図２は、正常隣接組織（腫瘍周囲）と比べたＴＭＥにおけるＩＣＯＳ ＦＯＸＰ３二重陽性ＴＲｅｇの密度における有意な増加を示す棒グラフである。 図３は、正常隣接組織（腫瘍周囲）と比べたＴＭＥにおけるＩＣＯＳ ＦＯＸＰ３二重陽性ＴＲｅｇ対全ＴＲｅｇ（すべてのＦＯＸＰ３＋）細胞の比の有意な増加を示す棒グラフである。 図４は、ＨＣＣ腫瘍生検のＴＭＥにおけるＩＣＯＳ陽性細胞の密度にしたがって分離された、経時的な全生存期間のカプラン－マイヤー曲線を示す（ｎ＝１４２人の患者）。Ｔａｉｗａｎ ＮＴＵコホートからの１４２個のＨＣＣサンプルを、ＩＣＯＳ細胞密度／ｍｍ２の最高四分位数（点線）と下位３つの四分位数（実線）（１２０細胞／ｍｍ２のカットオフ密度を表す）とにしたがって層化した。ログランク（マンテル－コックス）検定 ｐ＜０．０５。 図５は、ＨＣＣ腫瘍生検のＴＭＥにおけるＩＣＯＳ＋ＦＯＸＰ３＋対全ＦＯＸＰ３＋細胞比にしたがって分離された、経時的な全生存期間のカプラン－マイヤー曲線を示す（ｎ＝１４２人の患者）。０．５のカットオフ比を使用して高比集団（点線）と低比集団（実線）とを分離した。ログランク（マンテル－コックス）検定 ｐ＝０．０４５１。 図６は、ＨＢＶ感染ＨＣＣ腫瘍生検のＴＭＥ におけるＩＣＯＳ陽性細胞の密度にしたがって分離された、経時的な全生存期間のカプラン－マイヤー曲線を示す（ｎ＝８７人の患者）。Ｔａｉｗａｎ ＮＴＵコホートからの８７個のＨＣＣサンプルを、ＩＣＯＳ細胞密度／ｍｍ２の最高四分位数（点線）と下位３つの四分位数（実線）（１００細胞／ｍｍ２のカットオフを表す）にしたがって層化した。ログランク（マンテル－コックス）検定 ｐ＜０．０５。 図７は、ＡＪＣＣステージ２ ＨＣＣ腫瘍サンプルのＴＭＥにおけるＩＣＯＳ陽性細胞の密度にしたがって分離された、経時的な全生存期間のカプラン－マイヤー曲線を示す（ｎ＝４１人の患者）。Ｔａｉｗａｎ ＮＴＵコホートからの４１個のＡＪＣＣステージ２ ＨＣＣサンプルを、ＩＣＯＳ細胞密度／ｍｍ２の最高四分位数（点線）と下位３つの四分位数（実線）（１００細胞／ｍｍ２のカットオフを表す）にしたがって層化した。ログランク（マンテル－コックス）検定 ｐ＜０．０１。 図８は、ＡＪＣＣステージ２ ＨＣＣ腫瘍生検のＴＭＥにおけるＩＣＯＳ陽性細胞の全密度にしたがって分離された、無再発生存率（ＲＦＳ％）のカプラン－マイヤー曲線を示す（ｎ＝４１人の患者）。Ｔａｉｗａｎ ＮＴＵコホートからの４１個のＡＪＣＣステージ２ ＨＣＣサンプルを、ＩＣＯＳ細胞密度／ｍｍ２の最高四分位数（点線）と下位３つの四分位数（実線）（１００細胞／ｍｍ２のカットオフを表す）にしたがって層化した。ログランク（マンテル－コックス）検定 ｐ＜０．０５。 図９は、ＴＭＥにおけるＩＣＯＳ単一陽性細胞のそれらの最も近いＩＣＯＳ ＦＯＸＰ３二重陽性細胞までの平均距離にしたがって分離された、経時的な全生存期間のカプラン－マイヤー曲線を示す。Ｔａｉｗａｎ ＮＴＵコホートからの１４２個のＨＣＣサンプルを、平均距離中央値：短い距離（＜１０５μｍ、実線）と長い距離（≧１０５μｍ、点線）にしたがって層化した。ログランク（マンテル－コックス）検定 ｐ＜０．０５。 図１０は、ＨＣＣのＴＭＥにおけるＩＣＯＳ単一陽性細胞の総数に対するＩＣＯＳ単一陽性細胞の周囲の定義された影響半径内のＩＣＯＳ ＦＯＸＰ３二重陽性細胞の数の比にしたがって分離された、経時的な全生存期間のカプラン－マイヤー曲線を示す。Ｔａｉｗａｎ ＮＴＵコホートからの１４２個のＨＣＣサンプルを、ＩＣＯＳ単一陽性細胞の３０μｍ以内の二重陽性細胞の０．１より大きいまたは小さい平均の値にしたがって層化した。低い発生率（＜０．１、実線）対高い発生率（≧０．１、点線）。ｐ＜０．０５ ログランク（マンテル－コックス）。 図１１は、抗ＩＣＯＳモノクローナル抗体ＫＹ１０４４の投与の前および後のヒト患者におけるＩＣＯＳ ＦＯＸＰ３二重陽性細胞対全ＦＯＸＰ３陽性細胞の比（すべてのＴＲｅｇ内のＩＣＯＳ＋ ＴＲｅｇの割合を表す）における低減を示す。Ａ）コホート１（０．８ｍｇのフラット用量、Ｑ３Ｗ） 平滑筋肉腫を有する患者；Ｂ）コホート２（２．４ｍｇのフラット用量、Ｑ３Ｗ） 原発不明の癌腫（丸）、腎細胞癌（三角）および膵臓がん（四角）を有する患者；Ｃ）コホート３（８ｍｇのフラット用量、Ｑ３Ｗ） 転移性前立腺がんを有する患者；Ｄ）コホート４（２４ｍｇのフラット用量、Ｑ３Ｗ） 膵臓（丸）および食道（三角）がんを有する患者ならびにＥ）コホート５（８０ｍｇのフラット用量、Ｑ３Ｗ） 結腸腺癌（丸）、膵臓（三角）および中皮腫（四角）を有する患者。 図１２（Ａ）は、組織切片の半分より多くを含む約２ｃｍ×１ｃｍの区画を定義する、腫瘍コアを定義する境界が描かれた組織切片画像である。非腫瘍の特色を腫瘍コア区画からの除外のためにマークしている。マークされた境界内の腫瘍組織のみが評価のためにＴＭＥとして含まれる。 （Ｂ）は（Ａ）の区画の拡大である。ＩＨＣ染色が見られ、これは、すべての細胞核を染色するヘマトキシリン色素、ならびにそれぞれＩＣＯＳおよびＦＯＸＰ３のための２つの別個の色素原のより暗い染色剤を含む。 （Ｃ）は（Ｂ）と同一の視野であり、ＩＣＯＳ ＦＯＸＰ３二重陽性細胞（二重染色により同定される）を表す四角ボックスおよびＩＣＯＳ単一陽性細胞（ＩＣＯＳ特異的染色のみ、ＦＯＸＰ３陰性により同定される）を表す丸を追加的に示す。「最近接」線は、各々のＩＣＯＳ単一陽性細胞をその最も近いＩＣＯＳ ＦＯＸＰ３二重陽性細胞に接続する。すべてのＩＣＯＳ ＦＯＸＰ３二重陽性細胞が接続されているわけではなく、その理由は、組織中の一部のＩＣＯＳ ＦＯＸＰ３二重陽性細胞は、任意のＩＣＯＳ単一陽性細胞に対する最も近いＩＣＯＳ ＦＯＸＰ３二重陽性細胞ではないからである。 （Ｄ）は（Ｃ）の区画の拡大である。距離は、ＴＭＥにおけるあらゆるＩＣＯＳ単一陽性細胞とＩＣＯＳ ＦＯＸＰ３二重陽性細胞との間で測定される。各々のＩＣＯＳ単一陽性細胞からＩＣＯＳ ＦＯＸＰ３二重陽性細胞までの最短の距離（すなわち、最も近いＩＣＯＳ ＦＯＸＰ３二重陽性細胞までの距離）は接続線により指し示される。ＩＣＯＳ単一陽性細胞のサブセットからそれらの最も近いＩＣＯＳ ＦＯＸＰ３二重陽性細胞までの個々の距離測定値が示され、これらはそれぞれ５０．７、３６．６、４５．４および３９．５μｍであり、そのような測定値はあらゆるＩＣＯＳ単一陽性細胞のために記録される。これらの距離は、Ｈａｌｏ（登録商標）ソフトウェアパッケージを使用して測定される。 図１３（Ａ）は、図１２（Ａ）における境界により定義される腫瘍コアの区画のＨａｌｏ（登録商標）プロットであり、ＩＣＯＳ単一陽性（黒）およびＩＣＯＳ ＦＯＸＰ３二重陽性（灰色）細胞にマークしており、基礎となる組織画像は伴わない。 （Ｂ）は（Ａ）の区画の拡大である。 （Ｃ）は（Ｂ）の区画の拡大であり、図１２（Ｃ）に示される区画のＨａｌｏ（登録商標）プロットである。各々のＩＣＯＳ単一陽性細胞（丸）からその最も近いＩＣＯＳ ＦＯＸＰ３二重陽性細胞（四角）までの最近接線が示される。 図１４（Ａ）は、図１２（Ａ）において描写される組織切片の区画の拡大であり、該区画は、図１２（Ｂ）に示される区画とオーバーラップしている。 （Ｂ）は（Ａ）と同一の視野であり、ＩＣＯＳ単一陽性細胞（ＩＣＯＳ特異的染色のみ、ＦＯＸＰ３陰性により同定される）を表す丸および任意のＩＣＯＳ単一陽性細胞の３０μｍ以内にあるＩＣＯＳ ＦＯＸＰ３二重陽性細胞（二重染色により同定される）を表す四角ボックスを追加的に示す。線は、各々のＩＣＯＳ単一陽性細胞を３０μｍ以内のＩＣＯＳ ＦＯＸＰ３二重陽性細胞に接続する。任意のＩＣＯＳ単一陽性細胞の３０μｍ以内にないＩＣＯＳ ＦＯＸＰ３二重陽性細胞はマークされていない。任意のＩＣＯＳ ＦＯＸＰ３二重陽性細胞の３０μｍ以内にないＩＣＯＳ単一陽性細胞はマークされていない。 （Ｃ）は（Ｂ）の区画の拡大である。例示的な距離測定値がＩＣＯＳ単一陽性細胞と３０μｍ以内のＩＣＯＳ ＦＯＸＰ３二重陽性細胞との間で示される。これらの距離はそれぞれ７．４μｍ、７．６μｍおよび１５．６μｍである。これらの距離は、ＴＭＥ全体にわたり、あらゆるＩＣＯＳ単一陽性細胞からその３０μｍ以内のあらゆるＩＣＯＳ ＦＯＸＰ３二重陽性細胞までで測定される。これらの距離は、Ｈａｌｏ（登録商標）ソフトウェアパッケージを使用して測定される。 （Ｄ）は、（Ｂ）に対応するわずかに拡大された区画のＨａｌｏ（登録商標）プロットであり、基礎となる組織画像は伴わず、すべての検出されたＩＣＯＳ単一陽性細胞（丸）およびＩＣＯＳ ＦＯＸＰ３二重陽性細胞（四角）がマークされている。線は各々のＩＣＯＳ単一陽性細胞を３０μｍ以内のＩＣＯＳ ＦＯＸＰ３二重陽性細胞に接続する。 図１５（Ａ）は、組織切片のほとんどを含む約２ｃｍ×２ｃｍの区画を定義する、腫瘍コアを定義する境界が描かれた組織切片画像である。非腫瘍の特色を腫瘍コア区画からの除外のためにマークしている。マークされた境界内の腫瘍組織のみが評価のためにＴＭＥとして含まれる。 （Ｂ）は、（Ａ）における境界により定義される腫瘍コアの区画のＨａｌｏ（登録商標）プロットであり、ＩＣＯＳ ＦＯＸＰ３二重陽性細胞（灰色の丸）およびＦＯＸＰ３単一陽性細胞（黒の三角）がマークされており、基礎となる組織画像は伴わない。 （Ｃ）は（Ｂ）の区画の拡大である。 （Ｄ）および（Ｅ）は、（Ｃ）内の区画のそれぞれスキャンされた画像およびＨａｌｏ（登録商標）プロットである。ＴＭＥ区画から除外された組織の特色を丸で囲んでいる。ＩＨＣ染色が（Ｄ）において見られ、これは、すべての細胞核を染色するヘマトキシリン色素、ならびにそれぞれＩＣＯＳおよびＦＯＸＰ３のための２つの別個の色素原のより暗い染色剤を含む。（Ｅ）は、ＩＣＯＳ ＦＯＸＰ３二重陽性細胞を灰色の丸として、およびＦＯＸＰ３単一陽性細胞を黒の三角としてマークし、基礎となる組織画像は示されていない。
腫瘍サンプルの提供
ＴＭＥ内の細胞組成、免疫的構成および特有の空間的構成を評価するために、腫瘍組織のサンプルがｉｎ ｖｉｔｒｏで提供される。サンプルは、治癒的手術（腫瘍を切除するための手術）後の切除された腫瘍からまたはｉｎ ｖｉｖｏで残存する腫瘍から得られた生検サンプルから得ることができる。切除された組織は、一般に利用可能な組織のより大きい体積を考慮して分析の容易さのために好ましいが、生検材料（例えば、コア針生検から）を等しく使用することができる。細針生検は代替的であるが、サンプルは、分析が代表的なものとなるために十分な腫瘍コア組織を含むべきであるため、より大きいサンプル採取（例えば、開放生検）方法が好ましい。代替的に、ｉｎ ｖｉｖｏイメージングシステムが直接的にｉｎ ｓｉｔｕでＴＭＥ内のバイオマーカーの評価を可能とする場合、外科的サンプル採取工程は省略することができる。一般に、しかしながら、本発明の方法は一般にｉｎ ｖｉｔｒｏのサンプルに対して行われる。
腫瘍コアのバルクを構成するがん性細胞に加えて、ＴＭＥは、様々な免疫細胞、例えば様々なサブタイプのＴリンパ球、単球、好中球、樹状細胞およびマクロファージを含む。
臨床生検でのタンパク質発現の評価は、腫瘍特徴および指標的予後マーカーの発現を評価するためにホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）スライドにおいて頻繁に実行される。これらは、所与の患者のために正確な処置を適合させるのを助けるためまたは新たなバイオマーカーの同定を通じて所与の療法のためのレスポンダー患者とノンレスポンダー患者とを遡及的に区別するために使用することができる。
組織サンプルが（例えば、切除された組織または生検検体から）得られたら、それは通常、その完全性を保存し、およびそれを試験のために調製するように処理される。組織は、１０％のホルマリン中に固定され、続いてパラフィン中に包埋され、標準的なブロック形状は０．５×１×１ｃｍであることができる。この処理の代替は新鮮凍結手順であり、該手順において、組織を最適切断温度（ＯＣＴ）化合物中に包埋し、ドライアイス中でフラッシュ凍結させた後に、長期間の貯蔵のために液体窒素に移すことができる。ＦＦＰＥ処理は室温で長期間の貯蔵の利益を与える一方、新鮮凍結は組織を貯蔵するためのより迅速な処理であり、抗原をネイティブなフォーマットに保つが、調製および輸送のためのドライアイスならびに長期間の貯蔵のための液体窒素へのアクセスを要求する。
組織サンプルの２次元切片を試験のために提供することができる。患者当たりまたは腫瘍当たり最小１つの切片が調製される。場合により、複数の切片を同じ組織サンプルからまたは複数のサンプルから、例えば、１つの腫瘍の異なる領域からまたは複数の腫瘍から調製することができる。ＦＦＰＥサンプルのために、ブロックがミクロトームにロードされて４～５ミクロンの直径の切片に切断され、通常２５ｍｍ×７５ｍｍの標準的なサイズの、染色のために好適なガラススライドにマウントされる。新鮮凍結されたブロックは、クライオスタットを介して類似した方法で切断およびマウントされ、クライオスタットは本質的に冷凍器中のミクロトームであり、切片が処理の間に凍結されたままであることを可能とする。組織切片は次に、例えば、免疫組織化学（ＩＨＣ）およびデジタル画像分析により、バイオマーカーリーディングを決定するための試験のために提示される。
組織切片中の腫瘍コアの区画を評価のために定義することができる。切除された組織は多くの場合に、腫瘍組織に加えて非腫瘍組織を含む。これは、生検された組織についても該当し得るが、生検サンプルは単純に腫瘍コア組織からなり得る。腫瘍の程度は典型的には病理医により決定され、病理医は、組織のサンプル中の腫瘍の周縁部を定義することができる。腫瘍内の領域（周縁部の内側に＞５００μｍ）は腫瘍コアとして参照され、腫瘍微環境はこの区画を指す。ＴＭＥは腫瘍周囲間質と対比することができ、腫瘍周囲間質は、腫瘍周縁部から外側に＞５００μｍの組織として定義され、腫瘍の由来になる同じ組織タイプまたは臓器のものであってもよいし、そうでなくてもよい、正常な、非がん性組織を一般に含む。腫瘍周縁部を表す境界は、物理的ＩＨＣスライド上に直接的に（例えば、ガラス上に手動で）または好ましくは組織切片のデジタル画像上の視覚的オーバーレイとして電子的に描くことができる。腫瘍周縁部は典型的には自由形状であり、２次元において組織切片上にそれは単一のループとして表すことができ、または、例えば、腫瘍／非腫瘍組織の複数のパッチが切片中に現れる場合、複数のループを含んでもよい。組織切片のアノテーションはまた、ＴＭＥから除外されるべき１つまたはそれ以上の区画、例えばアーチファクトまたは組織ひだの周りの境界を定義してもよい。図１２。
ＩＣＯＳの検出
ヒト、マウスおよびカニクイザルＩＣＯＳの配列は、ヒトＮＣＢＩ ＩＤ：ＮＰ＿０３６２２４．１、マウスＮＣＢＩ ＩＤ：ＮＰ＿０５９５０８．２およびカニクイザルＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ：ＥＨＨ５５０９８．１としてＮＣＢＩから入手可能である。本発明における患者は好ましくはヒト患者であるので、本明細書におけるＩＣＯＳへの参照は、文脈が他に規定しなければ、ヒトＩＣＯＳを指すまたは含む。
ＩＣＯＳは、活性化されたＴ細胞のマーカーである。ＩＣＯＳ陽性細胞は、細胞表面上のＩＣＯＳ受容体を検出することにより同定することができる。ＩＣＯＳ結合剤、例えば抗体、例えば、抗ＩＣＯＳクローンＤ１Ｋ２Ｔは、剤と、存在する場合にＩＣＯＳとの結合を可能とする条件下で組織切片と接触させられる。剤はそれ自体が検出可能（例えば、検出可能な標識を有する）であるか、または特異的に抗ＩＣＯＳ剤に対する標識された二次的な剤（例えば、検出可能な標識を有する二次抗体）に結合することにより間接的に検出可能である。ＩＨＣを使用して、例えば、抗ＩＣＯＳ抗体（例えば、ウサギＩｇＧであるＤ１Ｋ２Ｔ）はＩＣＯＳ陽性細胞に結合し、検出可能な標識を有する二次抗体（例えば、ウサギＩｇＧ Ｆｃに対する抗体）により検出される。過剰な未結合の剤は洗浄により除去され、検出可能な標識が次に検出されて組織中のＩＣＯＳの位置を突き止め、それによりＩＣＯＳ陽性細胞の存在および位置が同定される。
ＩＣＯＳ陽性（ＩＣＯＳ＋）細胞は、本明細書において概説されているような方法を使用して検出可能なＩＣＯＳを発現する細胞である。ＩＣＯＳ陽性細胞は、ＩＣＯＳに加えて他のマーカー、例えばＦＯＸＰ３を発現してもよい。ＩＣＯＳ陽性細胞はＦＯＸＰ３について陰性であってもよく、その場合、それはまた、ＩＣＯＳ単一陽性細胞（特にはＩＣＯＳが染色された複数の抗原の中で検出される唯一の抗原である場合）またはＩＣＯＳ＋ ＦＯＸＰ３－（ＩＣＯＳ陽性ＦＯＸＰ３陰性）細胞として参照されることがある。ＩＣＯＳ陽性細胞はＦＯＸＰ３について陽性であってもよく、その場合、それはまた、ＩＣＯＳ ＦＯＸＰ３二重陽性細胞、またはＩＣＯＳ＋ ＦＯＸＰ３＋細胞として参照されることがある。反対に、ＩＣＯＳ陰性（ＩＣＯＳ－）細胞は、ＩＣＯＳが本明細書において概説されているような方法を使用して検出可能でない細胞（例えば、細胞は、ＩＨＣにおいてバックグラウンドより有意に高いＩＣＯＳ標識を呈しない）である。
ＦＯＸＰ３の検出
ＦＯＸＰ３はＴＲｅｇのマーカーである。ＦＯＸＰ３陽性細胞は、細胞内のＦＯＸＰ３を検出することにより同定することができる。ＦＯＸＰ３は細胞内分子であるため、組織サンプルは、例えば、界面活性剤とインキュベートすることにより、抗原を露出するように処理されるべきである。ＦＯＸＰ３結合剤、例えば抗体、例えば、抗ＦＯＸＰ３クローン２３６Ａ／Ｅ７は、剤と、存在する場合にＦＯＸＰ３との結合を可能とする条件下で組織切片と接触させられる。剤はそれ自体が検出可能（例えば、検出可能な標識を有する）であるか、または特異的に抗ＦＯＸＰ３剤に対する標識された二次的な剤（例えば、検出可能な標識を有する二次抗体）に結合することにより間接的に検出可能である。ＩＨＣを使用して、例えば、抗ＦＯＸＰ３抗体（例えば、クローン２３６Ａ／Ｅ７）はＦＯＸＰ３陽性細胞に結合し、検出可能な標識を有する二次抗体により検出される。過剰な未結合の剤は洗浄により除去され、検出可能な標識が次に検出されて組織中のＦＯＸＰ３の位置を突き止め、それによりＦＯＸＰ３陽性細胞の存在および位置が同定される。
ＦＯＸＰ３陽性（ＦＯＸＰ３＋）細胞は、本明細書において概説されているような方法を使用して検出可能なＦＯＸＰ３を発現する細胞である。ＦＯＸＰ３陽性細胞は、ＦＯＸＰ３に加えて他のマーカー、例えばＩＣＯＳを発現してもよい。ＦＯＸＰ３陽性細胞はＩＣＯＳについて陰性であってもよく、その場合、それはまた、ＦＯＸＰ３単一陽性細胞（特にはＦＯＸＰ３が染色された複数の抗原の中で検出される唯一の抗原である場合）、またはＩＣＯＳ－ＦＯＸＰ３＋（ＩＣＯＳ陰性ＦＯＸＰ３陽性）細胞として参照されることがある。ＦＯＸＰ３陽性細胞はＩＣＯＳについて陽性であってもよく、その場合、それはまた、ＩＣＯＳ ＦＯＸＰ３二重陽性細胞、またはＩＣＯＳ＋ ＦＯＸＰ３＋細胞として参照されることがある。反対に、ＦＯＸＰ３陰性（ＦＯＸＰ３－）細胞は、ＦＯＸＰ３が本明細書において概説されているような方法を使用して検出可能でない細胞（例えば、細胞は、ＩＨＣにおいてバックグラウンドより有意に高いＦＯＸＰ３標識を呈しない）である。
免疫組織化学
組織切片は、ＩＨＣを使用して抗原を可視化するために染色することができる。簡潔に述べれば、ＩＨＣは、組織切片を抗原特異的な剤（例えば、抗体）とインキュベートして剤のそのコグネイト抗原への結合を可能とすること、過剰な未結合の剤を洗浄すること、ならびに結合した剤の存在を検出し、それにより組織中の抗原の存在および位置を可視化することを伴う。ＩＨＣは、直接的に連結されたレポーター抗体を使用して直接的にまたは一次抗体、続いて連結もしくはコンジュゲートされた二次抗体の抗原結合を通じて間接的に行うことができる。前者は時間的により効率的であり得るが、後者は、シグナル増幅の利益と共により柔軟なアプローチを提供することができる。ＩＨＣは、異なる抗原のための異なるシグナル／レポーター／標識、例えば、蛍光または酵素マルチプレックスＩＨＣを使用して、複数の異なる抗原を検出し、位置を突き止めるために、複数の異なる抗原特異的な剤を用いて同じ組織切片に対してマルチプレックスで行うことができる［２９；３０；３１；３２；３３］。
ＩＨＣは、ＦＦＰＥおよび新鮮凍結組織の切片に対して一般的に使用される。ＦＦＰＥスライド上でＩＨＣ処理を開始するために、組織上のパラフィンは最初に、キシレン、エタノールおよび水中での一連のインキュベーションを通じて除去される。固定剤による抗原エピトープの被覆に起因して、ＦＦＰＥスライドは、通常、抗原賦活化と呼ばれる処理を受けることを要求され、これは、固定剤メチレン架橋を破壊して関心対象の抗原の「被覆を外し」て、抗体が結合できるようにする処理である。これは２つの主な方法：熱誘導エピトープ賦活化（ＨＩＥＲ）およびプロテアーゼ誘導エピトープ賦活化（ＰＩＥＲ）により達成することができる［３４；３５］。ＨＩＥＲにおいて、組織をマウントしたスライドは数分間煮沸された後に洗浄され、通常、圧力鍋、マイクロ波、または蒸し器の使用と共に実行され、ＰＩＥＲは、特有の酵素、例えばトリプシンまたはプロテイナーゼＫと数分間３７℃でインキュベートした後に洗浄する処理である。なお、各々の処理の正確な時間は、使用される技術ならびに最適な賦活化および損傷した組織の回避のために賦活化されている抗原に依存して最適化される必要がある。対照的に、新鮮凍結スライドは抗原賦活化工程を要求しないが、細胞内標的、例えばＦＯＸＰ３の染色の場合に短い固定工程を要求する。これは通常アルコールを用いて実行され、アルコールは、パラホルムアルデヒドとは異なり、抗原エピトープをマスクしない。
細胞内標的、例えばＦＯＸＰ３の染色のために、ＦＦＰＥおよび固定された新鮮凍結スライドは、界面活性剤、例えばＰＢＳ中の０．２５％のＴｒｉｔｏｎ－Ｘ １００中で１５～３０分、室温でインキュベートされた後に洗浄される。組織は次に、ブロッキング緩衝液と１時間室温でインキュベートすることにより一次抗体の非特異的結合を予防するためにブロッキングされる。組織中の内因性アルカリホスファターゼ（ＡＰ）もまた、凍結組織から調製されたスライドにおいて多く残存することがあり、このステージにおいてレバミソールでのブロッキングを要求する。組織サンプルがブロッキングされたら、関心対象の抗原を次に一次抗原特異的抗体（抗ＩＣＯＳおよび抗ＦＯＸＰ３）で染色することができる。なお、抗原特異的抗体は、上記に概説される処理にしたがって標的に結合する必要があるので、ＩＨＣ染色における使用のために確認される必要がある。一次抗体は、関心対象の標的上の所与のエピトープに特異的でなければならず、バックグラウンド染色または偽陽性染色を回避するために他の無関連の標的に結合してはならない。抗体特異性の最も確かな証拠は、問題とする抗原についてのノックアウト組織または細胞における結合の欠如である。過剰な未結合の抗体は洗浄により除去される。発色性ＩＨＣのために、スライドは次に、メタノール中の過酸化水素中でインキュベートすることによりペルオキシダーゼ活性についてブロッキングされるべきである。一次抗体が直接的に標識されない場合、レポーターをコンジュゲートされた二次抗体は次にインキュベートされ、最終の洗浄工程後にレポーターは検出される。
異なるレポーターの使用は異なる利点および欠点を提供し得る。発色性ＩＨＣは、所与の抗原の視覚化を可能とする、不溶性の、有色の沈殿物への基質の変換を触媒する酵素連結部分を使用する［２９；３０］。染色は永久的であり、経時的に分解する可能性は低く、組織学的色素、例えばヘマトキシリンおよびエオシンと並列で使用することができる。しかしながら、市販の酵素および酵素基質が少数であることに起因して、少数の抗原のみが評価可能である。免疫蛍光（ＩＦ）ＩＨＣは、蛍光部分に連結された抗原特異的抗体を使用し、並列で使用される染色マーカーの数の増加を可能とする。この方法の欠点は、経時的なシグナル劣化および複数の抗原が評価される場合のフルオロフォア間のスペクトルオーバーラップを含む［３１；３３］。本発明の目的のために、ＩＨＣの両方の形態は、ＩＣＯＳおよびＦＯＸＰ３の染色のために十分すぎるものである。発色性ＩＨＣを使用する染色処理の例として、組織は、異なる種の２つの一次抗体、例えばマウスおよびヒツジＩｇＧ、続いてホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）またはアルカリホスファターゼ（ＡＰ）にコンジュゲートされた２つの別個の種の一次抗体、抗マウスおよび抗ヒツジを標的化する２つの二次抗体を使用してＩＣＯＳおよびＦＯＸＰ３の両方について染色されるべきである。ＩＣＯＳおよびＦＯＸＰ３の発現は次に、ＨＲＰまたはＡＰと反応する２つの異なる色素、例えば、組織をそれぞれ褐色および青色／黒に染色するＤＡＢおよびＢＣＩＰ／ＮＢＴを応用することにより明らかにすることができる。
連続染色免疫蛍光、例えばチップサイトメトリーは、ＦＦＰＥまたは新鮮凍結組織上の蛍光部分に連結された抗原特異的抗体での染色を介して複数の抗原を定量的に分析することができる処理である。蛍光は、切片中の細胞タイプの分析を生成するための人工知能ソフトウェアと組み合わせた高ダイナミックレンジイメージングを用いて評価することができる［３６］。以前に説明したように、新鮮凍結切片は抗原賦活化を要求せず、したがってこの方法を使用してＦＦＰＥ組織よりも良好な質の結果が生成される。しかしながら、チップサイトメトリー技術は、この分析のために要求される抗原の被覆を外すための類似した抗原賦活化工程の追加と共にＦＦＰＥスライドで依然として可能である。この後に、ＦＦＰＥの組織および新鮮な誘導された組織の両方は次に、標準的な処理によりサイトメトリーチップに再固定することができる。組織は次に、５つの直接的に標識された一次抗体を使用して標準的なＩＨＣについて上記されたものと類似した処理で最大５つの別々の抗原について染色することができる。例えば、２つの別個のフルオロフォア、例えばＡＰＣおよびＧＦＰに直接的にコンジュゲートされたＩＣＯＳおよびＦＯＸＰ３を標的化する２つの一次抗体は、分析での組織中のＩＣＯＳおよびＦＯＸＰ３抗原発現の区別を可能とする。組織中の空間的構成は次に、好ましくはソフトウェアにより補助されて、評価することができる。この技術と標準的なＩＨＣとの１つの主な区別は、固定処理が組織を安定化させて、最大２年の室温での貯蔵を可能とすることである。追加的に、これは、蛍光抗体をクエンチするために損傷を被ることなく組織を漂白することを可能として、組織が追加の５つの抗原について再染色されることを可能にする。反復の染色および漂白の処理を通じて、高解像度および低いバックグラウンド蛍光と共に同じスライド上でほぼ無制限のタンパク質バイオマーカーを染色することができる。
マスサイトメトリーイメージング（ＭＣＩ）は、上記される標準的な酵素または蛍光ＩＨＣ方法の代替である。イメージングマスサイトメトリー（ＩＭＣ）およびマルチプレックスイオンビームイメージング（ＭＩＢＩ）は、ＦＦＰＥサンプルおよび新鮮凍結サンプルの両方からの複数の抗原の極めて詳細な発現を所与の区画において提供することができる新規のマスサイトメトリーイメージングの２つの形態である［３７；３８］。ＩＭＣにおいて、組織は、金属タグを付加された抗原特異的一次抗体で染色され、各々の抗原の発現は次に、組織の非常に小さい区画（例えば、１μＭ２）を高密度レーザービームで連続的にアブレーションすることおよび特有の金属イオンの割合を、それらの特有の質量をサイトメトリー飛行時間（ＣｙＴＯＦ）を使用して検出することを介して分析することにより評価することができる。代替的に、ＭＩＢＩを使用する場合、処理は非常に類似しているが、酸素デュオプラズマトロン一次イオンビームを使用して組織をラスター化し、薄層を連続的にアブレートし、金属同位体をイオンとして放出させるという例外を伴う［３９；４０；４１；４２；４３］。両方の方法において、各々の切片中の抗原特異的抗体の量は、１Ｄａの分解能まで金属タグの特有の質量の定量化を介して評価することができ、組織全体の高度に詳細なデジタル画像が次に、獲得された情報を使用して再構築される。例として、標準的なＩＨＣについて概説されたものと類似した染色処理にしたがって、および要求される場合には抗原賦活化を使用して、組織は、希土類重金属アイソタイプ、例えば１０２Ｐｄおよび２０９Ｂｉ（多くの他の重金属アイソタイプが可能である）に連結された抗ＩＣＯＳおよび抗ＦＯＸＰ３一次抗体を用いて染色される［４４］。組織中のＩＣＯＳおよびＦＯＸＰ３の発現は次に、上記に概説される処理を使用して漸次に分析される。この技術の分解能に起因して、それを使用して、本明細書に記載される組織パラメーターおよびバイオマーカーのいずれも評価することができる。１Ｄａまでアイソタイプを区別する能力により、ＭＣＩは、スペクトルオーバーラップの問題を回避しながら最大４０個のマーカーを並列で分析することが可能となる。したがって、複数の細胞タイプを同時に同じスライド上で評価することができる。追加的に、該技術は、シグナル分解またはバックグラウンド蛍光により制限されない。
デジタル画像分析
切片として提供される組織サンプルは、顕微鏡法により観察することができる。明視野照明は、ＩＨＣからの対比色素の視覚化のために好適である。組織サンプルをスキャンして組織のデジタル画像（例えば、拡大された明視野画像）を提供することができる。画像倍率、例えば、２０倍または４０倍は、分析を促す。画像は、記載されるように、腫瘍コアの区画を定義するためにアノテーションすることができる。本明細書に記載される研究において、本発明者らは、５μｍのＩＨＣ染色組織スライドを２０倍の倍率でＨａｍａｍａｔｓｕ Ｎａｎｏｚｏｏｍｅｒデジタルスキャナーを使用して明視野モードにおいてスキャンした。
細胞をカウントし、細胞間距離を測定して、腫瘍コアの定義された区画からバイオマーカーリーディングを得ることができる。好ましくは、細胞カウントおよび距離測定は、デジタル画像のソフトウェア分析を使用して自動化される。本発明者らは、ＨＡＬＯ（登録商標）プラットフォーム（Ｉｎｄｉｃａ Ｌａｂｓ）を使用してデジタル画像分析を行った。簡潔に述べれば、処理は、それぞれＩＣＯＳおよびＦＯＸＰ３のＩＨＣ色素原ならびに核の対比染色を分離するための３色素原デコンボリューションを伴った。細胞物体は、個々の色素原に重み付けされた光学密度値を適用することにより形成させた。各々の陽性細胞タイプを次に、定義されたサイズ、形状および細胞内区画染色パラメーターを使用して同定した。細胞標識に対応しないバックグラウンド染色を同定して減算し、その結果、ＩＣＯＳまたはＦＯＸＰ３の存在は、バックグラウンドより高いレベルの染色により指し示された。分類指標を開発し、アルゴリズムに統合して、分析のための関心対象の組織領域を自動的にセグメント化した。完成したアルゴリズムを研究におけるすべての組織切片画像に自動化された客観的な方式で応用して、詳細な細胞毎のデータを生成した。
細胞密度
ＴＭＥ中の細胞のタイプの密度は、それらの細胞の総数をＴＭＥの面積で除算したものであり、典型的には細胞数／ｍｍ２として表される。関心対象の細胞タイプは、本明細書の他の箇所において詳述されるようにマーカー、例えばＩＣＯＳおよびＦＯＸＰ３の検出を通じて組織切片（またはその画像）上で同定することができ、細胞をカウントすることが可能となる。記載したように、カウントは、定義される基準を満たす指定される視野中のすべての物体をカウントするためにソフトウェアを使用して自動化することができるため、ソフトウェアに腫瘍コア中のすべてのＩＣＯＳ陽性細胞をカウントするように指示することができる。ＩＣＯＳ以外の他の細胞マーカーが検出される場合、この細胞カウントは、複数の別個の集団、例えば、ＩＣＯＳ単一陽性細胞およびＩＣＯＳ ＦＯＸＰ３二重陽性細胞を含んでもよい。ＩＣＯＳ陽性細胞の総数は、バックグラウンドより高いレベルでＩＣＯＳが検出されるすべての細胞であり、そのためＩＣＯＳ単一陽性細胞の他に、ＩＣＯＳ ＦＯＸＰ３二重陽性細胞を包含する、他の検出されるマーカーに加えてＩＣＯＳが存在する細胞を包含する。腫瘍コア（ＴＭＥ）の面積はまた、自動化されたソフトウェアを使用して、本明細書に記載されている腫瘍コアの周りの境界を描くことによりソフトウェアをガイドして、決定することができる。ＴＭＥ中のＩＣＯＳ陽性細胞の数を前記ＴＭＥの面積で除算して密度が得られる。
ＴＭＥ中のＩＣＯＳ陽性細胞の密度の増加は、ＴＲｅｇも枯渇または阻害し得る抗ＩＣＯＳ免疫療法剤、例えば抗ＩＣＯＳ抗体ＫＹ１０４４に対する応答についてのバイオマーカーである。実施例２、３、４および８は、このバイオマーカーの決定および使用の実例を示す。
（ＩＣＯＳ＋ＦＯＸＰ３＋）／全ＦＯＸＰ３＋の割合
この割合または比は、ＴＭＥ中のＩＣＯＳ ＦＯＸＰ３二重陽性細胞の数を決定すること、ＴＭＥ中のＦＯＸＰ３陽性細胞の数を決定すること、および前者を後者で除算することにより算出される。関心対象の細胞タイプは、本明細書の他の箇所において詳述されるようにマーカー（ＩＣＯＳ、ＦＯＸＰ３）の検出を通じて組織切片（またはその画像）において同定することができ、細胞をカウントすることが可能となる。記載したように、カウントは、定義される基準を満たす指定される視野中のすべての物体をカウントするためにソフトウェアを使用して自動化することができるため、ソフトウェアに腫瘍コア中のすべてのＦＯＸＰ３陽性細胞をカウントするように指示することができる。ＦＯＸＰ３以外の他の細胞マーカーが検出される場合、この細胞カウントは、複数の別個の集団、例えば、ＦＯＸＰ３単一陽性細胞およびＩＣＯＳ ＦＯＸＰ３二重陽性細胞を含んでもよい。ＦＯＸＰ３陽性細胞の総数は、バックグラウンドより高いレベルでＦＯＸＰ３が検出されるすべての細胞であり、そのためＦＯＸＰ３単一陽性細胞の他に、ＩＣＯＳ ＦＯＸＰ３二重陽性細胞を包含する、他の検出されるマーカーに加えてＦＯＸＰ３が存在する細胞を包含する。腫瘍コア（ＴＭＥ）の面積はまた、自動化されたソフトウェアを使用して、本明細書に記載されている腫瘍コアの周りの境界を描くことによりソフトウェアをガイドして、決定することができる。ＴＭＥ中のＩＣＯＳ ＦＯＸＰ３二重陽性細胞の数をＴＭＥ中のＦＯＸＰ３陽性細胞の数で除算して比が得られる。
ＦＯＸＰ３はＴＲｅｇのマーカーであるので、この比はＩＣＯＳ＋ ＴＲｅｇの割合として参照することができる。ＩＣＯＳ＋であるＴＲｅｇの高い割合は、免疫抑制されたＴＭＥの指標となるバイオマーカーである。このバイオマーカーの存在は、免疫療法剤が患者に利益を与え得ることを指し示す。１つの実施形態において、５０％（比０．５）のカットオフが、患者をカテゴライズするために使用される。そのため、例えば、患者からの腫瘍サンプルの試験が、ＴＭＥ中のＦＯＸＰ３＋（ＴＲｅｇ）細胞の５０％より多くがＩＣＯＳ＋であることを指し示す場合に、ＨＣＣ患者は抗ＩＣＯＳおよび／または抗ＴＲｅｇ処置のために選択される。実施例１、２、８および９は、このバイオマーカーの決定および使用の実例を示す。
細胞間近接性
記載されているマーカーの検出により細胞タイプの位置を同定したら、それらの細胞の間の距離を測定することができる。測定は、核の中心から核の中心までで行うべきであり、核の中心は、ＴＭＥにおいて小型の円形形状を有するＴ細胞における細胞の中央を一般に表す。
各々のＩＣＯＳ単一陽性細胞とその最も近いＩＣＯＳ ＦＯＸＰ３二重陽性細胞との間の平均距離は、ＩＣＯＳ単一陽性細胞からＩＣＯＳ ＦＯＸＰ３二重陽性細胞までの最短距離を測定すること、これをあらゆるＩＣＯＳ単一陽性細胞について繰り返すこと、およびこれらの最短距離の和をＩＣＯＳ単一陽性細胞の数で除算することにより決定される。本明細書に記載される他のバイオマーカーと同様に、測定は、（例えば、組織切片のデジタル画像上の）組織サンプルの腫瘍コア（ＴＭＥ）区画において行われる。
ＩＣＯＳ ＦＯＸＰ３二重陽性細胞とＩＣＯＳ単一陽性細胞との間の近接性は、ＴＥｆｆに対する強く免疫抑制性の細胞の近接性を表す。近い近接性（短い距離）は、免疫抑制されたＴＭＥの指標となるバイオマーカーである。このバイオマーカーの存在は、免疫療法剤が患者に利益を与え得ることを指し示す。実施例５および８は、このバイオマーカーの決定および使用の実例を示す。
区域的影響
本発明者らは、ＩＣＯＳ単一陽性細胞の総数に対するＩＣＯＳ単一陽性細胞の周囲の定義された影響半径内のＩＣＯＳ ＦＯＸＰ３二重陽性細胞の数の比であるとして区域的影響比を定義する。
比は、ＴＭＥ中のすべてのＩＣＯＳ ＦＯＸＰ３二重陽性細胞を同定すること、ＴＭＥ中のすべてのＩＣＯＳ単一陽性（すなわち、ＩＣＯＳ＋ ＦＯＸＰ３－）細胞を同定すること、次にＴＭＥ中の任意の（１つまたはそれ以上の）ＩＣＯＳ単一陽性細胞の定義された半径内にあるＩＣＯＳ ＦＯＸＰ３二重陽性細胞のサブセットを選択すること、およびこのサブセット中の数をＩＣＯＳ単一陽性細胞の数で除算することにより見出すことができる。
ＩＣＯＳ ＦＯＸＰ３二重陽性細胞は、任意のＩＣＯＳ単一陽性細胞の定義された半径内にある場合にカウントされる。それは、任意のＩＣＯＳ単一陽性細胞の定義された半径内にない場合にはカウントされない。複数のＩＣＯＳ単一陽性細胞の定義された半径内にあるＩＣＯＳ ＦＯＸＰ３二重陽性細胞は１回のみカウントされる。カウントされた細胞のこのサブセットはそのため、ＴＭＥ中の任意のＩＣＯＳ単一陽性細胞の定義された影響半径内にあるすべてのＩＣＯＳ ＦＯＸＰ３二重陽性細胞を含む。
ＩＣＯＳ ＦＯＸＰ３二重陽性細胞のカウントされた数は次に、ＴＭＥ中のＩＣＯＳ単一陽性細胞の数で除算される。ＩＣＯＳ単一陽性細胞のカウントは、ＴＭＥ中のすべてのＩＣＯＳ単一陽性細胞を含む総数であり、これは、これらの細胞がそれらの定義された半径内にＩＣＯＳ ＦＯＸＰ３二重陽性細胞を有するか否かにかかわらない。
この算出は区域的影響比を提供する。３０μｍの半径が好ましい。リンパ球細胞サイズは７～１５μｍの直径の間で変動する。直ちの細胞外環境は細胞に影響を及ぼし、２つの細胞が約３０μｍ以内にある場合、可溶性細胞間メディエーターを介するおよび直接的な細胞：細胞接触を潜在的に介するコミュニケーションを予想することができる。免疫抑制性ＴＲｅｇ、例えばＩＣＯＳ ＦＯＸＰ３二重陽性細胞は、直接的な相互作用を通じてまたは免疫抑制性サイトカイン、例えばＩＬ１０およびＴＧＦβの放出を通じてＦＯＸＰ３陰性リンパ球を抑制することができる。そのため、互いの影響区域内にある細胞を同定するために、本発明者らは、関心対象の細胞、この場合にはＩＣＯＳ＋ ＦＯＸＰ３－細胞の周囲の３０μｍの半径を定義する。本発明は、この半径の精密な距離により限定されず、より広い（例えば、５０μｍ）またはより狭い（例えば、２０μｍ）区域を描くことができ、例えば示唆される３０μｍの値の約５０％（１５～４５μｍ）または２０％（２４～３０μｍ）以内である。実施例６および８は、区域的影響バイオマーカーの決定および使用の実例を示す。
がん性固形腫瘍
がんは、がんの起源となる組織のタイプ（組織学的タイプ）により、またはがんが最初に発生した身体中の位置である原発部位により典型的には分類される。がん分類は、世界保健機関により生成された国際標準、ＩＣＤ－Ｏ－３［４５］（参照によって本明細書に組み入れる）の主題である。形態アクシスは、Ｍ－８０００／０～Ｍ－９９８９／３の範囲に及ぶ５桁コードを提供する。最初の４桁は特有の組織学的な項を指し示す。スラッシュ（／）の後の第５桁は挙動コードであり、腫瘍が悪性、良性、ｉｎ ｓｉｔｕ、または（良性もしくは悪性のいずれであれ）不確定であるかどうかを指し示す。別々の１桁コードもまた組織学的グレード付け（差別化）のために提供される。
患者のコホートおよびそれから算出されるバイオマーカーの参照値を考慮する場合、参照値は、同じタイプの腫瘍を有する患者から算出されることが好ましい。腫瘍は、同じ生理学的カテゴリー（例えば、すべての癌腫、すべての肉腫またはすべての骨髄腫、これは場合により、１つより多くのカテゴリーにわたる混合型腫瘍を含む）、および好ましくは同じ組織種、場合によりＩＣＤ－Ｏ－３により分類される形態学的タイプ（例えば、ＨＣＣ Ｍ－８１７０／３）のものであってもよい。腫瘍タイプは、例えば肝臓がん、例えば、ＨＣＣ（例えば、ＩＣＤ－Ｏ－３ Ｍ－８１７０／３、Ｍ－８１７１／３、Ｍ－８１７２／３、Ｍ－８１７３／３、Ｍ－８１７４／３もしくはＭ－８１７５／３）、腎臓細胞がん（場合により腎細胞癌、例えば、明細胞腎細胞癌）、頭頸部がん、黒色腫（場合により悪性黒色腫）、非小細胞肺がん（例えば、腺癌）、膀胱がん、卵巣がん、子宮頸がん、胃がん、膵臓がん、乳がんまたは精巣生殖細胞癌であってもよく、これには、列記されるものなどの任意の固形腫瘍の転移が包含される。
患者は、患者の腫瘍が肝臓に転移している場合に、全身性抗ＰＤ－１免疫療法に応答する可能性がより低いことが見出された。肝臓転移を有する患者は多くの場合に臨床試験から除外される。Ｌｅｅら［４６］は、抗原特異的ＴＲｅｇは肝臓において活性化されることおよびこれらの「肝臓訓練済み」ＴＲｅｇは次に患者においてより広い抗腫瘍免疫応答を抑制することを示唆した。前臨床研究は、肝臓転移を有する患者について、抗ＰＤ－１のような免疫チェックポイント阻害剤に対する腫瘍の感受性は、ＴＲｅｇを枯渇させることにより改善される可能性があることを指し示した。
この原理は、他の身体組織、例えば骨および肺に転移するＨＣＣに拡張される可能性がある。ここで原発性腫瘍は肝臓にあり、転移は遠隔性であるが、Ｌｅｅらにより記載された効果が起こる可能性があり、すなわち、腫瘍抗原特異的ＴＲｅｇが肝臓において活性化され、免疫チェックポイント阻害剤での処置に対する他の組織中の腫瘍の感受性を低減させる免疫抑制効果を広める。
本発明の実施形態において、腫瘍はそのため：
－ 肝臓の原発性腫瘍（例えば、ＨＣＣ）；
－ 肝臓転移、すなわち、身体中の他の箇所を起源とし、肝臓に転移した非肝臓起源の腫瘍；または
－ 患者が肝臓における腫瘍転移も有する、肝臓以外の部位における腫瘍
であってもよい。
本発明の実施形態において、患者は、肝臓において腫瘍を有する患者であり、腫瘍は、場合により、肝臓の原発性腫瘍（例えば、ＨＣＣ）または肝臓転移のいずれかである。
本発明は、そのような腫瘍を有する患者を、抗ＴＲｅｇ免疫療法での処置のために好適であるとして同定することを伴ってもよく、そのような処置はまた、免疫チェックポイント阻害剤（例えば、抗ＰＤ－１または抗ＰＤ－Ｌ１）の投与を含む。
肝細胞がん（ＨＣＣ）
原発性肝臓がんは現在、世界中のがんでの死亡の４番目に多い原因であり、ほとんどの肝臓がん症例はＨＣＣである。ＨＣＣの発がんは、主にＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）もしくはＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）による感染症からのまたは肝硬変からの、肝臓の慢性炎症に帰せられる。
血液中のアルファ－フェトプロテイン（ＡＦＰ）のレベルの上昇は、原発性肝臓がんまたは生殖細胞腫瘍のいずれかの存在の公知の指標である。このタンパク質は通常、胎児により産生され、健康な成人男性および妊娠していない健康な女性の血液中では検出不可能である。ＡＦＰレベルは、ＨＣＣ患者における生存と負に相関することが見出されている。
ＨＣＣのために選択される現行の処置は一般的に疾患ステージにより影響される。ＡＪＣＣ病期分類システムは、がん患者における疾患進行の程度を記載するために米国がん合同委員会により開発された分類システムである［２８］。早期ステージの現局化したＨＣＣを有する患者について、治癒目的処置モダリティーは、切除、アブレーション、および肝臓移植を包含する一方、中間ステージの現局化したＨＣＣを有する患者について、画像ガイド経カテーテル腫瘍療法、例えば経動脈的化学塞栓術は生存利益を得ている。しかしながら、ＨＣＣを有する患者の大部分は、局所進行性もしくは転移性疾患に進行するか、またはそれをｄｅ ｎｏｖｏで発症し、全身療法が必要とされる［４７］。
マルチキナーゼ阻害剤であるソラフェニブは、ＨＣＣのために承認された最初の全身療法であった［４８、４９］。２０１６年以来、３つのマルチキナーゼ阻害剤および１つの抗血管内皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）モノクローナル抗体を含む、４つの他の標的化された剤が、フェーズＩＩＩ臨床試験において、進行性ＨＣＣを有する患者に対して生存利益を提供することが実証されている［５０、５１、５２、５３］。結果的に、複数の国の規制機関は、レンバチニブをＨＣＣに対するファーストライン全身療法として承認しており、レゴラフェニブ、カボザンチニブ、およびラムシルマブ（α－フェトプロテイン＞４００ｎｇ／ｍＬの患者に限定される）を、ソラフェニブで以前に処置されたＨＣＣを有する者の処置のために承認している。抗ＰＤ－１抗体もまた、進行性ＨＣＣにおけるセカンドライン処置として使用されている。
本発明による患者は、ＨＢＶおよび／もしくはＨＣＶ感染症に関連するか、またはＨＢＶおよび／もしくはＨＣＶ感染症に関連しないＨＣＣを有してもよい。ＨＣＣは、任意のステージ（ＡＪＣＣ ｓｔａｇｉｎｇ ｍａｎｕａｌ、第８版にしたがって決定される）、例えば、ステージ１、ステージ２またはステージ３であってもよい。患者は、男性または女性、成人または小児（１８歳未満）であってもよい。患者は、腫瘍に対する肝切除術を受けていてもよく、または受けることを意図していてもよい。患者は、ＨＣＣに対する以前の処置、例えば、ソラフェニブおよび／または上記される任意の他の剤での処置を受けていてもよい。患者は、免疫療法によるがんに対する以前の処置を受けていてもよく、または受けていなくてもよい。
予後
全生存期間（ＯＳ）は、疾患、例えばがんの診断または処置の開始の日のいずれかから死までの時間の長さとして定義される。（個々の患者ではなく）疾患を有すると診断された患者の集団を記載するために使用される場合、ＯＳは典型的には中央値として表され、これは、群中の患者の半数が依然として生存している、診断または処置の開始の日のいずれかからの時間の長さを表す。本明細書に記載されるＨＣＣ患者コホートにおいて、ＯＳは、肝切除術の日から患者の死亡日または患者の最終フォローアップ日までで算出された。
がんにおける無再発生存期間（ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ ｆｒｅｅ ｓｕｒｖｉｖａｌ；ＲＦＳ）は、患者ががんのいかなる徴候も症状もなしに生存する、一次処置後のがん終了の時間の長さを指す。無病生存期間（ＤＦＳ）、無再発生存期間（ｒｅｌａｐｓｅ ｆｒｅｅ ｓｕｒｖｉｖａｌ）とも呼ばれる。
無進行生存期間（ＰＦＳ）は、患者が疾患と共に生きるがそれが悪化しない、処置の間および後の時間の長さを指す。
無増悪期間（ＴＴＰ）は、診断または処置の開始の日から、疾患が悪化または身体の他の部分に拡大し始めるまでの時間の長さを指す。
一般に、生存の同じ１つまたはそれ以上の度合についてのデータは、同じ１つまたはそれ以上の度合による生存の予後についてのデータを提供するために、（例えば、参照値が生成される患者の集団において）コホート内のすべての患者について得られる。
免疫療法剤
本発明による免疫療法剤（免疫療法のために使用される剤）は、抗ＩＣＯＳ剤であってもよく、および／または抗ＴＲｅｇ免疫療法剤であってもよい。抗ＩＣＯＳ剤は、ＩＣＯＳ、好ましくはＩＣＯＳ細胞外ドメインに結合する剤である。抗ＴＲｅｇ免疫療法剤は、好ましくは選択的に、すなわち、他のＴ細胞、例えばＴＥｆｆを枯渇させることも阻害することもないか、またはそのような他のＴ細胞に対する効果がＴＲｅｇに対する効果よりも小さい、ＴＲｅｇを枯渇させるかまたは阻害する剤である。ＩＣＯＳに結合し、そしてまたＴＲｅｇを枯渇させるかまたは阻害する剤は、抗ＩＣＯＳおよび抗ＴＲｅｇ免疫療法剤である。例は、抗ＩＣＯＳ抗体ＫＹ１０４４およびＦｃエフェクター機能を有する他の抗ＩＣＯＳ抗体（例えば、抗ＩＣＯＳヒトＩｇＧ１を包含する。
抗ＴＲｅｇ免疫療法は、抗体、他の生物学的剤、小分子および細胞療法を包含する。抗ＴＲｅｇ免疫療法剤は、ＴＲｅｇに結合し、（例えば、エフェクター陽性Ｆｃ領域を介して）細胞エフェクター機能を媒介してＴＲｅｇを枯渇させるかまたは阻害する抗体であってもよい。抗ＴＲｅｇ免疫療法剤は、ＴＲｅｇ上に、例えば、ＴＲｅｇ細胞表面上に選択的にまたは差次的に発現されるＴＲｅｇのマーカーに結合してもよい。そのような表面マーカーの例は、ＩＣＯＳ、ＣＤ２５、ＣＣＲ８、ＣＴＬＡ－４およびグルココルチコイド誘導性ＴＮＦ関連タンパク質（ＧＩＴＲ）を包含する。ＭＨＣ提示エピトープもまた、そのようなマーカーを示して、細胞外部分を含まない細胞内タンパク質、例えばＦＯＸＰ３を介してＴＲｅｇを標的化する機会を与え得る。ＦＯＸＰ３および他の細胞内マーカーの消化されたペプチドはＭＨＣクラスＩでＴＲｅｇ表面上に提示され、それらは、ＭＨＣ溝中に提示されるエピトープに特異的に結合する剤により認識可能である。Ｄａｏらは、細胞内ＦＯＸＰ３のエピトープに結合するＴＣＲ模倣抗体を記載した［５４］。Ｄａｏらにより要約されるように、記載されている他のＴＲｅｇ免疫療法剤は、ＣＤ２５に対する標的化剤（例えば、抗ＣＤ２５抗体ダクリズマブ）、ＩＬ－２受容体に対する剤（例えば、ＩＬ－２毒素融合物、例えばＩＬ－２とジフテリア毒素との融合タンパク質であるデニロイキンジフチトクス）、ＴＲｅｇを枯渇させる抗ＧＩＴＲ抗体、ＴＲｅｇ機能を抑制する抗ＣＴＬＡ－４抗体、ならびにＴＲｅｇによる腫瘍ホーミングを妨害し、および／またはＴ細胞可塑性をモジュレートする剤を包含する。ケモカイン受容体－４（ＣＣＲ４）に対する抗体は、より高いレベルのＦＯＸＰ３を発現するＴＲｅｇを選択的に枯渇させ、ＮＹ－ＥＳＯ－１ペプチドに特異的なＣＤ８＋ Ｔ細胞応答の増大を結果としてもたらすことが示された。ＣＣＲ４は、活性化されたＴ細胞、Ｔヘルパー２、ＮＫ細胞、マクロファージ、および樹状細胞上に発現され、したがって選択的な効果を混同させる。脱フコシル化されたヒト化抗ＣＣＲ４ ｍＡｂ、モガムリズマブは、様々ながんにおける臨床試験をされている。ケモカイン受容体－８（ＣＣＲ８）は、乳がん患者においてＴＲｅｇ上に優先的に発現され、予後不良に関連する。ＣＣＲ８はまた、組織内在性メモリーＣＤ８＋ Ｔ細胞およびＮＫ－Ｔ細胞上に発現され、したがって、この分子を標的化する治療的な可能性は調査が残されている。追加的に、ＴＲｅｇ機能のための決定的なサイトカインであるトランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）－ベータのモジュレートもまた試みられている。シクロホスファミドは、ＴＲｅｇを抑制することが示されている。
最近、抗ＣＤ３６および／またはＰＰＡＲベータ阻害剤を含む抗ＴＲｅｇ療法が国際公開第２０２００５３８３３号において記載された。それは、例えばＣＤ３６阻害剤を投与することを含む、対象において腫瘍内ＴＲｅｇ（例えば、ＣＤ４＋細胞）の数を低減させる方法を開示した。一部の実施形態において、方法は、ＰＰＡＲベータ阻害剤を投与することを含んだ。
抗体
好ましい免疫療法剤は抗体であり、抗体は、全体免疫グロブリンまたは免疫グロブリンドメインを含むその抗原結合断片であってもよく、天然のものであるのか、それとも部分的にまたは全体的に合成により製造されたものであるのかによらない。抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤもしくはＩｇＥ分子またはその抗原特異的抗体断片（Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ジスルフィド連結Ｆｖ、ｓｃＦｖ、単一ドメイン抗体、閉鎖立体配座多特異性抗体、ジスルフィド連結ｓｃｆｖ、ダイアボディを包含するがこれらに限定されない）であってもよく、抗体を天然に産生する任意の種に由来するものであるのか、それとも組換えＤＮＡ技術により作出されたものであるのかによらず；血清、Ｂ細胞、ハイブリドーマ、トランスフェクトーマ、酵母または細菌から単離されたものであるのかによらない。抗体は、ルーチンの技術を使用してヒト化することができる。
抗体は、その標的抗原のエピトープに結合するおよびそれに相補的な抗体抗原結合部位（パラトープ）を含む。「エピトープ」という用語は、抗体により結合される抗原の領域を指す。エピトープは、構造的または機能的なものとして定義することができる。機能的エピトープは、一般に、構造的エピトープのサブセットであり、相互作用の親和性に直接的に寄与する残基を有する。エピトープはまた、コンホメーショナル（立体配座的）、すなわち、非直鎖状アミノ酸から構成されるものであってもよい。ある特定の実施形態において、エピトープは、分子の化学的活性表面基、例えばアミノ酸、糖側鎖、ホスホリル基、またはスルホニル基である決定因子を含んでもよく、ある特定の実施形態において、特有の３次元構造的特徴、および／または特有の電荷的特徴を有してもよい。
抗体断片の例は：
（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価断片である、Ｆａｂ断片；
（ｉｉ）ヒンジ領域におけるジスルフィド架橋により連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片である、Ｆ（ａｂ’）２断片；
（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；
（ｉｖ）抗体の単一のアームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片、
（ｖ）ＶＨまたはＶＬドメインからなる、ｄＡｂ断片（Ｗａｒｄら、（１９８９） Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４～５４６頁；参照によって全体を本明細書に組み入れる）；ならびに
（ｖｉ）特異的な抗原結合機能性を保持する単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）
を包含する。
抗体のさらなる例は、重鎖（５’－ＶＨ－（場合によるヒンジ）－ＣＨ２－ＣＨ３－３’）の二量体を含み、軽鎖を欠いている、Ｈ２抗体である。
単鎖抗体（例えば、ｓｃＦｖ）は、一般的に使用される断片である。多特異性抗体は、抗体断片から形成されたものであってもよい。本発明の抗体は、適宜、任意のそのようなフォーマットを用いることができる。
酵素パパインでの全体免疫グロブリンの消化は、「Ｆａｂ」断片としても公知の２つの同一の抗原結合断片、および抗原結合活性を有しないが結晶化する能力を有する「Ｆｃ」断片を結果としてもたらす。「Ｆａｂ」は、本明細書において使用される場合、重鎖および軽鎖の各々の１つの定常ドメインおよび１つの可変ドメインを含む抗体の断片を指す。本明細書における「Ｆｃ領域」という用語は、ネイティブ配列Ｆｃ領域およびバリアントＦｃ領域を包含する、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。「Ｆｃ断片」は、ジスルフィドにより一緒に保持された両方のＨ鎖のカルボキシ末端部分を指す。抗体のエフェクター機能はＦｃ領域中の配列により決定され、該領域はまた、ある特定のタイプの細胞上に見出されるＦｃ受容体（ＦｃＲ）により認識される。酵素ペプシンでの抗体の消化は、抗体分子の２つのアームが連結されたままであり、２つの抗原結合部位を含むＦ（ａｂ’）２断片を結果としてもたらす。Ｆ（ａｂ’）２断片は、抗原を架橋する能力を有する。
ｍＡｂ２は、「Ｆｃａｂ」として公知の抗原結合部位を形成するように操作された、改変された定常領域に融合した、インタクトな抗体からのＶＨおよびＶＬドメインを含む。Ｆｃａｂ／ｍＡｂ２フォーマットの背景にある技術は、国際公開第２００８／００３１０３号においてより詳細に記載されており、ｍＡｂ２フォーマットの記載を参照によって本明細書に組み入れる。このフォーマットのさらなる記載は、国際公開第２００６／０７２６２０号、国際公開第２００８／００３１１６号、国際公開第２００９／０００００６号および国際公開第２００９／０１３２８７６号において見出すことができる。
「Ｆｖ」は、本明細書において使用される場合、抗原認識および抗原結合部位の両方を保持する抗体の最小断片を指す。この領域は、緊密な非共有結合性または共有結合性の会合状態にある１つの重鎖可変ドメインおよび１つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。各々の可変ドメインの３つのＣＤＲが相互作用してＶＨ－ＶＬ二量体の表面上に抗原結合部位を定義するのはこの構成においてである。合わさって、６つのＣＤＲは抗原結合特異性を抗体に付与する。しかしながら、単一の可変ドメイン（または抗原に特異的な３つのＣＤＲのみを含むＦｖの半分）であっても、結合部位全体よりも低い親和性ではあるが、抗原を認識して結合する能力を有する。
Ｆａｂにおいて、抗体抗原結合部位は、１つまたはそれ以上の抗体可変ドメインにより提供されることがある。例において、抗体結合部位は、単一の可変ドメイン、例えば、重鎖可変ドメイン（ＶＨドメイン）または軽鎖可変ドメイン（ＶＬドメイン）により提供される。別の例において、結合部位は、ＶＨ／ＶＬペアまたはそのようなペアの２つもしくはより多くを含む。そのため、抗体抗原結合部位はＶＨおよびＶＬを含んでもよい。
場合により、抗体免疫グロブリンドメインは、追加のポリペプチド配列におよび／または標識、タグ、毒素もしくは他の分子に融合またはコンジュゲートさせることができる。抗体免疫グロブリンドメインは、１つまたはそれ以上の異なる抗原結合領域に融合またはコンジュゲートさせて、第２の抗原に結合することができる分子を提供することができる。本発明の抗体は、（ｉ）ＩＣＯＳのための抗体抗原結合部位および（ｉｉ）別の抗原を認識するさらなる抗原結合部位（場合により、本明細書に記載されている抗体抗原結合部位）を含む、多特異性抗体、例えば、二特異性抗体であってもよい。
抗体可変ドメインは、相補性決定領域（ＣＤＲ；すなわち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）、ならびにフレームワーク領域（ＦＲ）のアミノ酸配列を含む。そのため、ＶＨおよびＶＬドメインの各々の中にＣＤＲおよびＦＲがある。「超可変領域」、「ＣＤＲ領域」または「ＣＤＲ」という用語は、配列が超可変的であり、および／または構造的に定義されたループを形成する抗体可変ドメインの領域を指す。一般に、抗体の抗原結合部位は、６つの超可変領域：ＶＨにおいて３つ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）、およびＶＬにおいて３つ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）を含む。抗体の重鎖および軽鎖のこれらの領域は抗原結合特異性を抗体に付与する。ＶＨドメインはＨＣＤＲのセットを含み、ＶＬドメインはＬＣＤＲのセットを含む。ＶＨは重鎖の可変ドメインを指す。ＶＬは軽鎖の可変ドメインを指す。各々のＶＨおよびＶＬは、典型的には、アミノ末端からカルボキシ末端へと以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で並べられた、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成される。抗体は、ＶＨ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ならびにフレームワークを含む抗体ＶＨドメインを含んでもよい。それは、代替的にまたは追加的に、ＶＬ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ならびにフレームワークを含む抗体ＶＬドメインを含んでもよい。本発明による抗体ＶＨおよびＶＬドメインならびにＣＤＲの例は、添付の配列表および本開示の部分を形成する表において列記されている。本明細書に記載されるように、「ＣＤＲのセット」は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。そのため、ＨＣＤＲのセットは、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を指し、ＬＣＤＲのセットは、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を指す。他に記載されなければ、「ＣＤＲのセット」はＨＣＤＲおよびＬＣＤＲを含む。
ＣＤＲは、Ｋａｂａｔシステム［５５］、Ｃｈｏｔｈｉａシステム［５６］またはＩＭＧＴシステム［５７、５８］にしたがって定義することができる。ＩＭＧＴがデフォルトで使用されるため、本明細書におけるＣＤＲおよび可変ドメインのナンバリングは、そうでないことが記載されなければ、ＩＭＧＴによるものである。
本発明による抗体および他の生物学的剤は、単離または精製された形態で提供することができる。単離された抗体またはタンパク質は、その製造環境（例えば、天然または組換え）の成分から同定、分離および／または回収されたものである。例えば、抗体またはタンパク質は、抗体の由来となる細胞もしくは組織供給源からの細胞材料もしくは他の夾雑タンパク質を実質的に含まないか、または化学的に合成される場合に化学的前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まない。「細胞材料を実質的に含まない」という表現は、単離または組換えによる製造の元となる細胞の細胞成分から抗体が分離されている抗体の調製物を含む。そのため、細胞材料を実質的に含まない抗体は、約３０％、２０％、１０％、または５％（乾燥重量による）未満の異種タンパク質（本明細書において「夾雑タンパク質」とも称される）を有する抗体の調製物を包含する。抗体が組換えにより製造される場合、それはまた、好ましくは培養培地を実質的に含まず、すなわち、培養培地は、タンパク質調製物の体積の約２０％、１０％、または５％未満である。抗体が化学合成により製造される場合、それは好ましくは化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まず、すなわち、タンパク質の合成に関与する化学的前駆体または他の化学物質から分離されている。よって、抗体のそのような調製物は、約３０％、２０％、１０％、５％（乾燥重量による）未満の、関心対象の抗体以外の化学的前駆体または化合物を有する。好ましい実施形態において、本発明の抗体は単離または精製されている。
抗体は、本明細書に記載されるおよび／もしくは添付の配列表に示される抗体のいずれかのＶＨドメインと少なくとも６０、７０、８０、８５、９０、９５、９８もしくは９９％のアミノ酸配列同一性を有するＶＨドメインを含んでもよく、ならびに／またはそれらの抗体のいずれかのＶＬドメインと少なくとも６０、７０、８０、８５、９０、９５、９８もしくは９９％のアミノ酸配列同一性を有するＶＬドメインを含んでもよい。２つのアミノ酸配列の同一性％を算出するために使用することができるアルゴリズムは、例えばＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、またはＳｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを含み、これらは例えばデフォルトのパラメーターを用いる。特定のバリアントは、１つまたはそれ以上のアミノ酸配列変更（アミノ酸残基の付加、欠失、置換および／または挿入）を含んでもよい。
変更は、１つもしくはそれ以上のフレームワーク領域および／または１つもしくはそれ以上のＣＤＲにおいて行うことができる。バリアントは、場合により、ＣＤＲ突然変異誘発により提供される。変更は、通常、機能の喪失を結果としてもたらさないため、そのような変更されたアミノ酸配列を含む抗体は、抗原（例えば、ＩＣＯＳ）に結合する能力を保持してもよい。それは、例えば本明細書に記載されるアッセイにおいて測定された場合に、変更が行われていない抗体と同じ定量的な結合能力を保持してもよい。そのような変更されたアミノ酸配列を含む抗体は、抗原に結合する改善された能力を有してもよい。
変更は、１つもしくはそれ以上のアミノ酸残基を天然に存在しないもしくは非標準的なアミノ酸で置き換えること、１つもしくはそれ以上のアミノ酸残基を、天然に存在しないもしくは非標準的な形態に修飾すること、または１つもしくはそれ以上の天然に存在しないもしくは非標準的なアミノ酸を配列に挿入することを含んでもよい。本発明の配列中の変更の数および位置の例は本明細書の他の箇所に記載されている。天然に存在するアミノ酸は、それらの標準的な１文字表記でＧ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｐ、Ｆ、Ｗ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｙ、Ｃ、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｄ、Ｅとして同定される２０個の「標準的」なＬ－アミノ酸を包含する。非標準的なアミノ酸は、ポリペプチド骨格に組み込むことができるか、または既存のアミノ酸残基の修飾の結果としてもたらすことができる任意の他の残基を含む。非標準的なアミノ酸は、天然に存在するまたは天然に存在しないものであってもよい。
「バリアント」という用語は、本明細書において使用される場合、親ポリペプチドまたは核酸から１つまたはそれ以上のアミノ酸または核酸の欠失、置換または付加により異なるが、親分子の１つまたはそれ以上の特有の機能または生物学的活性を保持するペプチドまたは核酸を指す。アミノ酸置換は、アミノ酸が、異なる天然に存在するアミノ酸残基で置き換えられる変更を包含する。そのような置換は「保存的」として分類することができ、その場合、ポリペプチド中に含有されるアミノ酸残基は、極性、側鎖機能性またはサイズのいずれかに関して類似した特徴の別の天然に存在するアミノ酸で置き換えられる。そのような保存的置換は当該技術分野において周知である。本発明により包含される置換はまた「非保存的」であってもよく、その場合、ペプチド中に存在するアミノ酸残基は、異なる特性を有するアミノ酸、例えば異なる群からの天然に存在するアミノ酸で置換されるか（例えば、荷電性もしくは疎水性アミノ酸をアラニンで置換する）、または代替的に、天然に存在するアミノ酸は非従来型アミノ酸で置換される。一部の実施形態において、アミノ酸置換は保存的である。ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに関して使用される場合に用語バリアントに同様に包含されるものとして、これは、それぞれ参照ポリヌクレオチドまたはポリペプチドと比較して（例えば、野生型ポリヌクレオチドまたはポリペプチドと比較して）、一次、二次、または三次構造において異なり得るポリヌクレオチドまたはポリペプチドを指す。
一部の態様において、当該技術分野において周知の方法を使用して単離または生成された「合成バリアント」、「組換えバリアント」、または「化学的に改変された」ポリヌクレオチドバリアントもしくはポリペプチドバリアントを使用することができる。「改変されたバリアント」は、以下に記載されるように、保存的または非保存的アミノ酸変化を含むことができる。ポリヌクレオチド変化は、参照配列によりコードされるポリペプチドにおけるアミノ酸の置換、付加、欠失、融合および切断を結果としてもたらすことができる。一部の態様の使用は、挿入バリアント、欠失バリアントまたはアミノ酸の置換での置換バリアントを含み、これには、バリアントの基礎となるペプチド配列中に通常存在しないアミノ酸および他の分子の挿入および置換、例えば以下に限定されないが、ヒトタンパク質中に通常存在しないオルニチンの挿入が包含される。「保存的置換」という用語は、ポリペプチドを記載する場合、ポリペプチドの活性を実質的に変更しないポリペプチドのアミノ酸組成における変化を指す。例えば、保存的置換は、類似した化学的特性（例えば、酸性、塩基性、正または負荷電、極性または非極性など）を有する異なるアミノ酸残基にアミノ酸残基を置換することを指す。保存的アミノ酸置換は、ロイシンのイソロイシンもしくはバリンでの置換、アスパラギン酸のグルタミン酸での置換、またはスレオニンのセリンでの置換を包含する。機能的に類似したアミノ酸を提供する保存的置換表は当該技術分野において周知である。例えば、以下の６つの群は各々、互いに対して保存的置換であるアミノ酸を含有する：１）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；および６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）［５９］。一部の実施形態において、単一のアミノ酸または低いパーセンテージのアミノ酸を変更し、付加しまたは欠失させる個々の置換、欠失または付加もまた、変化がペプチドの活性を低減させない場合に、「保存的置換」と考えることができる。挿入または欠失は典型的には約１～５個のアミノ酸の範囲内である。保存的アミノ酸の選択は、ペプチド中の置換されるべきアミノ酸の位置、例えばアミノ酸がペプチドの外側にあり溶媒に露出されているのか、それとも内側にあり溶媒に露出されていないのかに基づいて選択することができる。
溶媒へのその露出を包含する、既存のアミノ酸の位置（すなわち、溶媒に露出されていない内側に局在化したアミノ酸と比較して、アミノ酸が溶媒に露出されているか、またはペプチドもしくはポリペプチドの外側表面上に存在するのかどうか）に基づいて既存のアミノ酸を置換するアミノ酸を選択することができる。そのような保存的アミノ酸置換の選択は当該技術分野において周知である［６０、６１、６２］。よって、タンパク質またはペプチドの外側にあるアミノ酸（すなわち溶媒に露出されているアミノ酸）のために好適な保存的アミノ酸置換を選択することができ、例えば、以下に限定されないが、以下の置換を使用することができる：ＹのＦでの置換、ＴのＳまたはＫでの置換、ＰのＡでの置換、ＥのＤまたはＱでの置換、ＮのＤまたはＧでの置換、ＲのＫでの置換、ＧのＮまたはＡでの置換、ＴのＳまたはＫでの置換、ＤのＮまたはＥでの置換、ＩのＬまたはＶでの置換、ＦのＹでの置換、ＳのＴまたはＡでの置換、ＲのＫでの置換、ＧのＮまたはＡでの置換、ＫのＲでの置換、ＡのＳ、ＫまたはＰでの置換。
代替的な実施形態において、タンパク質またはペプチドの内側にあるアミノ酸のために好適な包含される保存的アミノ酸置換を選択することができ、例えばタンパク質またはペプチドの内側にあるアミノ酸（すなわち溶媒に露出されていないアミノ酸）のための好適な保存的置換を使用することができ、例えば以下に限定されないが、以下の保存的置換を使用することができる：ＹのＦでの置換、ＴのＡまたはＳでの置換、ＩのＬまたはＶでの置換、ＷのＹでの置換、ＭのＬでの置換、ＮのＤでの置換、ＧのＡでの置換、ＴのＡまたはＳでの置換、ＤのＮでの置換、ＩのＬまたはＶでの置換、ＦのＹまたはＬでの置換、ＳのＡまたはＴでの置換およびＡのＳ、Ｇ、ＴまたはＶでの置換。一部の実施形態において、非保存的アミノ酸置換もまたバリアントの用語に包含される。
本明細書に開示される抗体は、例えば、１つもしくはそれ以上の抗体定常領域の配列操作および／または他の分子への融合、例えば、ＰＥＧ化により、またはアルブミンへの結合、例えばアルブミン結合性単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）の組込みにより、血清半減期を増加または減少させるように改変することができる。様々な半減期延長融合物が記載されている［６３］。
本発明の抗体は、ヒト抗体またはヒト可変領域および非ヒト（例えば、マウス）定常領域を含むキメラ抗体であってもよい。本発明の抗体は、例えば、ヒト可変領域を有し、場合によりヒト定常領域も有する。
そのため、抗体は、場合により、定常領域またはその部分、例えば、ヒト抗体定常領域またはその部分を含む。例えば、ＶＬドメインは、そのＣ末端において抗体軽鎖カッパまたはラムダ定常ドメインに取り付けることができる。同様に、抗体ＶＨドメインは、そのＣ末端において任意の抗体アイソタイプ、例えばＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥおよびＩｇＭならびにアイソタイプサブクラスのいずれか、例えばＩｇＧ１またはＩｇＧ４に由来する免疫グロブリン重鎖定常領域の全体または部分（例えばＣＨ１ドメインもしくはＦｃ領域）に取り付けることができる。ヒト抗体定常ドメインの例は表Ｃに示されている。
本発明の抗体の定常領域は代替的に非ヒト定常領域であってもよい。例えば、抗体がトランスジェニック動物（その例は本明細書の他の箇所に記載されている）において生成される場合、ヒト可変領域および非ヒト（宿主動物）定常領域を含むキメラ抗体を製造することができる。一部のトランスジェニック動物は完全にヒトの抗体を生成する。他のものは、キメラ重鎖および完全にヒトの軽鎖を含む抗体を生成するように操作されている。抗体が１つまたはそれ以上の非ヒト定常領域を含む場合、これらはヒト定常領域で置き換えることができ、それによりそれらの免疫原性が低減されるので、治療用組成物としてのヒトへの投与のためにより好適な抗体が提供される。
Ｆｃエフェクター機能、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰおよびＣＤＣ
上記で議論したように、抗体は、様々なアイソタイプにおいておよび異なる定常領域と共に提供することができる。ヒトＩｇＧ抗体重鎖定常領域配列の例は表Ｃに示されている。抗体のＦｃ領域は主に、Ｆｃ結合、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）活性、補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）活性および抗体依存性細胞ファゴサイトーシス（ＡＤＣＰ）活性の観点でのそのエフェクター機能を決定する。エフェクターＴ細胞機能とは別個のこれらの「細胞エフェクター機能」は、標的細胞の部位へのＦｃ受容体を有する細胞の動員を伴って、抗体結合細胞の殺傷を結果としてもたらす。ＡＤＣＣおよびＣＤＣに加えて、ＡＤＣＰ機序［６４］は、抗体結合Ｔ細胞を枯渇させ、そのため欠失のために高ＩＣＯＳ発現ＴＲｅｇを標的化する手段となる。
細胞エフェクター機能ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰおよび／またはＣＤＣはまた、Ｆｃ領域を欠いた抗体により呈されることがある。抗体は、複数の異なる抗原結合部位を含んでもよく、１つはＩＣＯＳに方向付けられており、別のものは標的分子のエンゲージメントがＡＤＣＣ、ＡＤＣＰおよび／またはＣＤＣを誘導するその標的分子に方向付けられており、例えば、抗体は、リンカーにより接合された２つのｓｃＦｖ領域を含み、１つのｓｃＦｖはエフェクター細胞にエンゲージメントすることができる。
本発明による抗体は、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰおよび／またはＣＤＣを呈するものであってもよい。代替的に、本発明による抗体は、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰおよび／またはＣＤＣ活性を欠いていてもよい。いずれの場合も、本発明による抗体は、１つまたはそれ以上のタイプのＦｃ受容体に結合するＦｃ領域を含んでもよいか、または場合によりそれを欠いてもよい。異なる抗体フォーマットの使用、ならびにＦｃＲ結合および細胞エフェクター機能の存在または非存在は、本明細書の他の箇所に議論されている特定の治療目的における使用のために抗体を適合させることを可能とする。
一部の治療応用のための好適な抗体フォーマットは野生型ヒトＩｇＧ１定常領域を用いる。定常領域は、エフェクター可能化ＩｇＧ１定常領域であってもよく、これは場合によりＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣおよび／またはＡＤＣＰ活性を有する。好適な野生型ヒトＩｇＧ１定常領域配列はＩＧＨＧ１＊０１である。ヒトＩｇＧ１定常領域のさらなる例は本明細書に示されている。
定常領域は、ＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣおよび／またはＡＤＣＰの増強のために操作することができる。Ｆｃ媒介性効果の効力は、様々な確立された技術によりＦｃドメインを操作することにより増強することができる。そのような方法は、ある特定のＦｃ受容体に対する親和性を増加させ、そのため活性化増強の潜在的な多様なプロファイルを作出する。これは、１つまたはいくつかのアミノ酸残基の改変により達成することができる［６５］。残基Ａｓｎ２９７において特有の突然変異または変更されたグリコシル化（例えば、Ｎ２９７Ｑ、ＥＵインデックスナンバリング）を含有するヒトＩｇＧ１定常領域は、Ｆｃ受容体への結合を増強することが示されている。例示的な突然変異は、ヒトＩｇＧ１定常領域について２３９、３３２および３３０から選択される残基（または他のＩｇＧアイソタイプ中の同等の位置）のうちの１つまたはそれ以上である。抗体は、そのため、Ｎ２９７Ｑ、Ｓ２３９Ｄ、Ｉ３３２ＥおよびＡ３３０Ｌ（ＥＵインデックスナンバリング）から独立して選択される１つまたはそれ以上の突然変異を有するヒトＩｇＧ１定常領域を含んでもよい。三重突然変異（Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ）を使用してＦｃＲｎへの結合を増強してもよく、ＦｃＲｎ結合に影響する他の突然変異は［６６］の表２において議論されており、これらのいずれも本発明において用いることができる。
Ｆｃ受容体に対する親和性の増加はまた、例えば、低フコシル化または脱フコシル化されたバリアントを生成することにより、Ｆｃドメインの天然のグリコシル化プロファイルを変更することにより達成することができる［６７］。非フコシル化抗体は、フコース残基を伴わずにＦｃの複合型Ｎ－グリカンのトリ－マンノシルコア構造を宿す。Ｆｃ Ｎ－グリカンからのコアフコース残基を欠いたこれらの糖操作型抗体は、ＦｃγＲＩＩＩａ結合能力の増強に起因して、フコシル化された同等物よりも強いＡＤＣＣを呈し得る。本発明による抗体は、フコシル化、非フコシル化、脱フコシル化または低フコシル化されたものであってもよい。
ＡＤＣＣを増加させるために、ヒンジ領域中の残基は、Ｆｃ－ガンマＲＩＩＩへの結合を増加させるために変更することができる［６８］。そのため、抗体は、野生型ヒトＩｇＧ重鎖定常領域のバリアントであるヒトＩｇＧ重鎖定常領域を含んでもよく、バリアントヒトＩｇＧ重鎖定常領域は、野生型ヒトＩｇＧ重鎖定常領域がヒトＦｃγ受容体に結合するよりも高い親和性でＦｃｙＲＩＩＢおよびＦｃｙＲＩＩＡからなる群から選択されるヒトＦｃγ受容体に結合する。抗体は、野生型ヒトＩｇＧ重鎖定常領域のバリアントであるヒトＩｇＧ重鎖定常領域を含んでもよく、バリアントヒトＩｇＧ重鎖定常領域は、野生型ヒトＩｇＧ重鎖定常領域がヒトＦｃγＲＩＩＢに結合するよりも高い親和性でヒトＦｃγＲＩＩＢに結合する。バリアントヒトＩｇＧ重鎖定常領域は、バリアントヒトＩｇＧ１、バリアントヒトＩｇＧ２、またはバリアントヒトＩｇＧ４重鎖定常領域であることができる。１つの実施形態において、バリアントヒトＩｇＧ重鎖定常領域は、Ｇ２３６Ｄ、Ｐ２３８Ｄ、Ｓ２３９Ｄ、Ｓ２６７Ｅ、Ｌ３２８Ｆ、およびＬ３２８Ｅ（ＥＵインデックスナンバリングシステム）から選択される１つまたはそれ以上のアミノ酸突然変異を含む。別の実施形態において、バリアントヒトＩｇＧ重鎖定常領域は：Ｓ２６７ＥおよびＬ３２８Ｆ；Ｐ２３８ＤおよびＬ３２８Ｅ；Ｐ２３８ＤならびにＥ２３３Ｄ、Ｇ２３７Ｄ、Ｈ２６８Ｄ、Ｐ２７１Ｇ、およびＡ３３０Ｒからなる群から選択される１つまたはそれ以上の置換；Ｐ２３８Ｄ、Ｅ２３３Ｄ、Ｇ２３７Ｄ、Ｈ２６８Ｄ、Ｐ２７１Ｇ、およびＡ３３０Ｒ；Ｇ２３６ＤおよびＳ２６７Ｅ；Ｓ２３９ＤおよびＳ２６７Ｅ；Ｖ２６２Ｅ、Ｓ２６７Ｅ、およびＬ３２８Ｆ；ならびにＶ２６４Ｅ、Ｓ２６７Ｅ、およびＬ３２８Ｆ（ＥＵインデックスナンバリングシステム）からなる群から選択されるアミノ酸突然変異のセットを含む。ＣＤＣの増強は、古典的な補体活性化カスケードの第１成分であるＣ１ｑに対する親和性を増加させるアミノ酸変化により達成することができる［６９］。別のアプローチは、Ｃ１ｑに対するＩｇＧ３のより高い親和性を活用するヒトＩｇＧ１およびヒトＩｇＧ３セグメントから作出されるキメラＦｃドメインを作出することである［７０］。本発明の抗体は、Ｃ１ｑ結合および／または低減もしくは消失されたＣＤＣ活性を変更するために残基３２９、３３１および／または３２２において突然変異したアミノ酸を含んでもよい。別の実施形態において、本明細書に開示される抗体または抗体断片は、残基２３１および２３９における改変を有するＦｃ領域を含有してもよく、該改変によりアミノ酸は、補体を固定する抗体の能力を変更するように置き換えられている。１つの実施形態において、抗体または断片は、Ｅ３４５Ｋ、Ｅ４３０Ｇ、Ｒ３４４ＤおよびＤ３５６Ｒから選択される１つまたはそれ以上の突然変異、特にＲ３４４ＤおよびＤ３５６Ｒ（ＥＵインデックスナンバリングシステム）を含む二重突然変異を含む定常領域を有する。
国際公開第２００８／１３７９１５号は、増強されたエフェクター機能を有する改変されたＦｃ領域を有する抗ＩＣＯＳ抗体を記載した。抗体は、ＶＨおよびＶＫドメインならびに野生型Ｆｃ領域を含む親抗体により媒介されるＡＤＣＣ活性のレベルと比較して増強されたＡＤＣＣ活性を媒介することが報告された。本発明による抗体は、それにおいて記載されているエフェクター機能を有するそのようなバリアントＦｃ領域を用いてもよい。
抗体のＡＤＣＣ活性は、本明細書に記載されているアッセイにおいて決定することができる。抗ＩＣＯＳ抗体のＡＤＣＣ活性は、本明細書に記載されているＩＣＯＳ陽性Ｔ細胞系を使用してｉｎ ｖｉｔｒｏで決定することができる。より一般には、抗体のＡＤＣＣ活性は、抗体により認識される抗原の細胞表面ディスプレイを呈する細胞を使用するＡＤＣＣアッセイにおいてｉｎ ｖｉｔｒｏで決定することができる。
一部の患者のために、Ｆｃエフェクター機能を有しない抗体を使用することが好ましいことがある。抗体は、定常領域なし、またはＦｃ領域なしで提供することができ、そのような抗体フォーマットの例は本明細書の他の箇所に記載されている。代替的に、抗体は、エフェクターヌルである定常領域を有してもよい。抗体は、Ｆｃγ受容体に結合しない重鎖定常領域を有してもよく、例えば定常領域は、Ｌｅｕ２３５Ｇｌｕ突然変異（すなわち、野生型ロイシン残基がグルタミン酸残基に突然変異している）を含んでもよい。重鎖定常領域のための別の場合による突然変異はＳｅｒ２２８Ｐｒｏであり、これは安定性を増加させる。重鎖定常領域は、Ｌｅｕ２３５Ｇｌｕ突然変異およびＳｅｒ２２８Ｐｒｏ突然変異の両方を含むＩｇＧ４であってもよい。この「ＩｇＧ４－ＰＥ」重鎖定常領域はエフェクターヌルである。
代替的なエフェクターヌルヒト定常領域は、不能化ＩｇＧ１である。不能化ＩｇＧ１重鎖定常領域は、位置２３５および／または２３７（ＥＵインデックスナンバリング）におけるアラニンを含有してもよく、例えば、それは、Ｌ２３５Ａおよび／またはＧ２３７Ａ突然変異（「ＬＡＧＡ」）を含むＩｇＧ１＊０１配列であってもよい。
バリアントヒトＩｇＧ重鎖定常領域は、ヒトＦｃγＲＩＩＩＡ、ヒトＦｃγＲＩＩＡ、またはヒトＦｃγＲＩに対するＩｇＧの親和性を低減させる１つまたはそれ以上のアミノ酸突然変異を含んでもよい。１つの実施形態において、ＦｃγＲＩＩＢは、マクロファージ、単球、Ｂ細胞、樹状細胞、内皮細胞、および活性化Ｔ細胞からなる群から選択される細胞上に発現される。１つの実施形態において、バリアントヒトＩｇＧ重鎖定常領域は、以下のアミノ酸突然変異Ｇ２３６Ａ、Ｓ２３９Ｄ、Ｆ２４３Ｌ、Ｔ２５６Ａ、Ｋ２９０Ａ、Ｒ２９２Ｐ、Ｓ２９８Ａ、Ｙ３００Ｌ、Ｖ３０５Ｉ、Ａ３３０Ｌ、Ｉ３３２Ｅ、Ｅ３３３Ａ、Ｋ３３４Ａ、Ａ３３９Ｔ、およびＰ３９６Ｌ（ＥＵインデックスナンバリングシステム）のうちの１つまたはそれ以上を含む。１つの実施形態において、バリアントヒトＩｇＧ重鎖定常領域は：Ｓ２３９Ｄ；Ｔ２５６Ａ；Ｋ２９０Ａ；Ｓ２９８Ａ；Ｉ３３２Ｅ；Ｅ３３３Ａ；Ｋ３３４Ａ；Ａ３３９Ｔ；Ｓ２３９ＤおよびＩ３３２Ｅ；Ｓ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｌ、およびＩ３３２Ｅ；Ｓ２９８Ａ、Ｅ３３３Ａ、およびＫ３３４Ａ；Ｇ２３６Ａ、Ｓ２３９Ｄ、およびＩ３３２Ｅ；ならびにＦ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００Ｌ、Ｖ３０５Ｉ、およびＰ３９６Ｌ（ＥＵインデックスナンバリングシステム）からなる群から選択されるアミノ酸突然変異のセットを含む。１つの実施形態において、バリアントヒトＩｇＧ重鎖定常領域は、Ｓ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｌ、またはＩ３３２Ｅアミノ酸突然変異（ＥＵインデックスナンバリングシステム）を含む。１つの実施形態において、バリアントヒトＩｇＧ重鎖定常領域は、Ｓ２３９ＤおよびＩ３３２Ｅアミノ酸突然変異（ＥＵインデックスナンバリングシステム）を含む。１つの実施形態において、バリアントヒトＩｇＧ重鎖定常領域は、Ｓ２３９ＤおよびＩ３３２Ｅアミノ酸突然変異（ＥＵインデックスナンバリングシステム）を含むバリアントヒトＩｇＧ１重鎖定常領域である。
抗体は、１つまたはそれ以上のタイプのＦｃ受容体に結合するが細胞エフェクター機能を誘導しない、すなわち、ＡＤＣＣ、ＣＤＣまたはＡＤＣＰ活性のいずれも媒介しない重鎖定常領域を有してもよい。そのような定常領域は、ＡＤＣＣ、ＣＤＣまたはＡＤＣＰ活性のトリガーとなることに関与する特定のＦｃ受容体に結合することができないものであってもよい。
抗ＩＣＯＳ抗体
抗ＩＣＯＳ剤は、ＩＣＯＳ細胞外ドメインに結合し、それによりＩＣＯＳを発現するＴ細胞を標的化する、ＩＣＯＳに対する抗体であってもよい。
抗ＩＣＯＳ抗体は、ＩＣＯＳ＋ Ｔ細胞への結合の結果としてもたらされる抗腫瘍効果を有することが報告されている。抗ＩＣＯＳ抗体は、様々な機序により免疫療法効果を提供してもよい。例えば、抗ＩＣＯＳ抗体は、ＩＣＯＳに対するアゴニスト効果を有し、そのため、ＩＦＮγの発現および分泌を増加させる能力により指し示されるように、ＴＥｆｆ細胞の機能を増強してもよい。抗ＩＣＯＳ抗体は、場合により、それらが結合する細胞を枯渇させるように操作することができ、これはＩＣＯＳ＋ ＴＲｅｇを優先的に下方調節し、エフェクターＴ細胞応答に対するこれらの細胞の抑制効果を解除し、そのためエフェクターＴ細胞応答を全体的に促進する効果を有するはずである。抗ＩＣＯＳ抗体ＫＹ１０４４は、本発明における免疫療法剤としての使用のために理想的な機能的なプロファイルを有するが、他の抗ＩＣＯＳ剤を代替的に使用することができる。
抗ＩＣＯＳ抗体は、以下の抗体のいずれかであってもよく、以下の抗体のいずれかのＶＨおよびＶＬドメインを含んでもよく、または以下の抗体のいずれかのＨＣＤＲおよび／もしくはＬＣＤＲを含んでもよい：
（ａ）ＫＹ１０４４
（ｂ）ＰＣＴ／ＧＢ２０１７／０５２３５２国際公開第２０１８／０２９４７４号または米国特許第９９５７３２３号（これらの内容を参照によって本明細書に組み入れる）に記載される抗ＩＣＯＳ抗体（例えば、ＳＴＩＭ００１、ＳＴＩＭ００２、ＳＴＩＭ００２Ｂ、ＳＴＩＭ００３、ＳＴＩＭ００４、ＳＴＩＭ００５、ＳＴＩＭ００６、ＳＴＩＭ００７、ＳＴＩＭ００８またはＳＴＩＭ００９）
（ｃ）ＰＣＴ／ＧＢ２０１８／０５３７０１国際公開第２０１９／１２２８８４号（その内容を参照によって本明細書に組み入れる））に記載される抗ＩＣＯＳ抗体（例えば、ＳＴＩＭ０１７、ＳＴＩＭ０２０、ＳＴＩＭ０２１、ＳＴＩＭ０２２、ＳＴＩＭ０２３、ＳＴＩＭ０３９、ＳＴＩＭ０４０、ＳＴＩＭ０４１、ＳＴＩＭ０４２、ＳＴＩＭ０４３、ＳＴＩＭ０４４、ＳＴＩＭ０５０、ＳＴＩＭ０５１、ＳＴＩＭ０５２、ＳＴＩＭ０５３、ＳＴＩＭ０５４、ＳＴＩＭ０５５、ＳＴＩＭ０５６、ＳＴＩＭ０５７、ＳＴＩＭ０５８、ＳＴＩＭ０５９、ＳＴＩＭ０６０、ＳＴＩＭ０６１、ＳＴＩＭ０６２、ＳＴＩＭ０６３、ＳＴＩＭ０６４、ＳＴＩＭ０６５またはＳＴＩＭ０６６）
（ｄ）ＰＣＴ／ＧＢ２０１８／０５３６９８国際公開第２０１９／１２２８８２号に記載される抗ＩＣＯＳ／ＰＤ－Ｌ１ ｍＡｂ２二特異性抗体
（ｅ）ボプラテリマブ
（ｆ）国際公開第２０１６／１５４１７７号または米国特許出願公開第２０１６／０３０４６１０号に記載される抗ＩＣＯＳ抗体（例えば、３７Ａ１０Ｓ７１３、７Ｆ１２、３７Ａ１０、３５Ａ９、３６Ｅ１０、１６Ｇ１０、３７Ａ１０Ｓ７１４、３７Ａ１０Ｓ７１５、３７Ａ１０Ｓ７１６、３７Ａ１０Ｓ７１７、３７Ａ１０Ｓ７１８、１６Ｇ１０Ｓ７１、１６Ｇ１０Ｓ７２、１６Ｇ１０Ｓ７３、１６Ｇ１０Ｓ８３、３５Ａ９Ｓ７９、３５Ａ９Ｓ７１０または３５Ａ９Ｓ８９）
（ｇ）国際公開第２０１６／１２０７８９号または米国特許出願公開第２０１６／０２１５０５９号に記載される抗ＩＣＯＳ抗体（例えば、４２２．２ Ｈ２Ｌ５）
（ｈ）国際公開第２０１８／１８７６１３号または米国特許出願公開第２０１８／０２８９７９０号に記載されている抗体Ｃ３９８．４またはそのヒト化抗体、例えば、ＩＣＯＳ．３３ ＩｇＧ１ｆ Ｓ２６７Ｅ、ＩＣＯＳ．４、ＩＣＯＳ３４ Ｇ１ｆ、ＩＣＯＳ３５ Ｇ１ｆ、１７Ｃ４、９Ｄ５、３Ｅ８、１Ｄ７ａ、１Ｄ７ｂまたは２６４４（配列について国際公開第２０１８１８７６１３号の表３５を参照）、例えば、ＮＣＴ０３２５１９２４における抗体ＢＭＳ－９８６２２６
（ｉ）国際公開第２０１０／０５６８０４号に記載される抗体ＪＭＡｂ １３６、「１３６」、または任意の他の抗体
（ｊ）国際公開第２０１２／１３１００４号、国際公開第２０１４／０３３３２７号または米国特許出願公開第２０１５／０２３９９７８号に記載される抗体３１４－８、ハイブリドーマＣＮＣＭ Ｉ－４１８０から産生される抗体、または任意の他の抗ＩＣＯＳ抗体
（ｋ）国際公開第２０１２／１３１００４号、米国特許第９，３７６，４９３号または米国特許出願公開第２０１６／０２６４６６６号に記載される抗体Ｉｃｏｓ１４５－１、ハイブリドーマＣＮＣＭ Ｉ－４１７９により産生される抗体、または任意の他の抗体
（ｌ）国際公開第９９／１５５５３号、米国特許第７，２５９，２４７号、米国特許第７，１３２，０９９号、米国特許第７，１２５，５５１号、米国特許第７，３０６，８００号、米国特許第７，７２２，８７２号、国際公開第０５／１０３０８６号、米国特許第８，３１８，９０５号または米国特許第８，９１６，１５５号に記載される抗体ＭＩＣ－９４４（ハイブリドーマＤＳＭＺ ２６４５から）、９Ｆ３（ＤＳＭＺ ２６４６）または任意の他の抗ＩＣＯＳ抗体
（ｍ）国際公開第９８／３８２１号、米国特許第７，９３２，３５８（Ｂ２）号、米国特許出願公開第２００２／１５６２４２号、米国特許第７，０３０，２２５号、米国特許第７，０４５，６１５号、米国特許第７，２７９，５６０号、米国特許第７，２２６，９０９号、米国特許第７，１９６，１７５号、米国特許第７，９３２，３５８号、米国特許第８，３８９，６９０号、国際公開第０２／０７００１０号、米国特許第７，４３８，９０５号、米国特許第７，４３８，９０５号、国際公開第０１／８７９８１号、米国特許第６，８０３，０３９号、米国特許第７，１６６，２８３号、米国特許第７，９８８，９６５号、国際公開第０１／１５７３２号、米国特許第７，４６５，４４５号または米国特許第７，９９８，４７８号に記載される抗ＩＣＯＳ抗体（例えば、ＪＭＡｂ－１２４、ＪＭＡｂ－１２６、ＪＭＡｂ－１２７、ＪＭＡｂ－１２８、ＪＭＡｂ－１３５、ＪＭＡｂ－１３６、ＪＭＡｂ－１３７、ＪＭＡｂ－１３８、ＪＭＡｂ－１３９、ＪＭＡｂ－１４０またはＪＭＡｂ－１４１、例えば、ＪＭＡｂ１３６）
（ｎ）国際公開第２０１４／０８９１１号に記載される抗ＩＣＯＳ抗体
（ｏ）国際公開第２０１２／１７４３３８号に記載される抗ＩＣＯＳ抗体
（ｐ）米国特許出願公開第２０１６／０１４５３４４号に記載される抗ＩＣＯＳ抗体
（ｑ）国際公開第２０１１／０２００２４号、米国特許出願公開第２０１６／００２３３６号、米国特許出願公開第２０１６／０２４２１１号または米国特許第８，８４０，８８９号に記載される抗ＩＣＯＳ抗体
（ｒ）米国特許第８，４９７，２４４号に記載される抗ＩＣＯＳ抗体
（ｓ）抗体クローンＩＳＡ－３（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、クローンＳＰ９８（Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）、クローン１ Ｇ１、クローン３Ｇ４（Ａｂｎｏｖａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、クローン６６９２２２（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、クローンＴＱ０９（Ｃｒｅａｔｉｖｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、クローン２Ｃ７（Ｄｅｎｇら、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｈｙｂｒｉｄｏｍｉｃｓ ２００４）、クローンＩＳＡ－３（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）またはクローン１７Ｇ９（ＭｃＡｄａｍら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０００）。
ＫＹ１０４４はヒト抗ＩＣＯＳサブクラスＧ１カッパモノクローナル抗体である。それは、二重の作用機序、すなわちＴＲｅｇの枯渇およびＴＥｆｆ細胞の共刺激（アゴニズム）を有する意図で開発された［７］。抗体ＫＹ１０４４の配列は本明細書の表Ｋにおいて示されている。
抗ＩＣＯＳ抗体は、ＫＹ１０４４の重鎖および軽鎖ＣＤＲを含む抗体（例えば、ヒトＩｇＧ１、またはｓｃＦｖ）とヒトＩＣＯＳへの結合について競合するものであってもよい。抗ＩＣＯＳ抗体は、ＫＹ１０４４と少なくとも同じ親和性で、またはＫＹ１０４４の親和性の５０％以内、２５％以内または１０％以内の親和性（例えば、チップ結合抗原またはチップ結合ＩｇＧ抗ＩＣＯＳ抗体を用いる表面プラズモン共鳴により決定される）でＩＣＯＳに結合してもよい。
本発明における抗ＩＣＯＳ抗体は、ＫＹ１０４４の１つもしくはそれ以上のＣＤＲ（例えば、６つすべてのＣＤＲ、もしくはＨＣＤＲおよび／もしくはＬＣＤＲのセット）または本明細書に記載されているそのバリアントを含んでもよい。
抗体は、ＣＤＲ ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含む抗体ＶＨドメインならびにＣＤＲ ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含む抗体ＶＬドメインを含んでもよく、ＨＣＤＲ３は、ＫＹ１０４４ ＨＣＤＲ３であるか、またはそのＨＣＤＲ３を１、２、３、４もしくは５つのアミノ酸変更と共に含む。ＨＣＤＲ２は、ＫＹ１０４４のＨＣＤＲ２であってもよく、またはそのＨＣＤＲ２を１、２、３、４もしくは５つのアミノ酸変更と共に含んでもよい。ＨＣＤＲ１は、ＫＹ１０４４のＨＣＤＲ１であってもよく、またはそのＨＣＤＲ１を１、２、３、４もしくは５つのアミノ酸変更と共に含んでもよい。
抗体は、ＣＤＲ ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含む抗体ＶＨドメインならびにＣＤＲ ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含む抗体ＶＬドメインを含んでもよく、ＬＣＤＲ３は、ＫＹ１０４４のＬＣＤＲ３であるか、またはそのＬＣＤＲ３を１、２、３、４もしくは５つのアミノ酸変更と共にを含む。ＬＣＤＲ２は、ＫＹ１０４４ ＬＣＤＲ２であってもよく、またはそのＬＣＤＲ２を１、２、３、４もしくは５つのアミノ酸変更と共に含んでもよい。ＬＣＤＲ１は、ＫＹ１０４４ ＬＣＤＲ１であってもよく、またはそのＬＣＤＲ１を１、２、３、４もしくは５つのアミノ酸変更と共に含んでもよい。
抗体は：
ＨＣＤＲ ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含む抗体ＶＨドメイン、ならびに
ＬＣＤＲ ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含む抗体ＶＬドメイン
を含んでもよく、
ＨＣＤＲは、ＫＹ１０４４のものであるか、もしくはＫＹ１０４４ ＨＣＤＲを１、２、３、４もしくは５つのアミノ酸変更と共に含み；および／または
ＬＣＤＲは、抗体ＫＹ１０４４のものであるか、もしくはＫＹ１０４４ ＬＣＤＲを１、２、３、４もしくは５つのアミノ酸変更と共に含む。
抗体は、ＨＣＤＲ ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３のセットを含むＶＨドメインを含んでもよく、
ＨＣＤＲ１は配列番号１のＫＹ１０４４のＨＣＤＲ１であり、
ＨＣＤＲ２は配列番号２のＫＹ１０４４のＨＣＤＲ２であり、
ＨＣＤＲ３は配列番号３のＫＹ１０４４のＨＣＤＲ３であるか、
またはＨＣＤＲのそのセットを１、２、３、４、５もしくは６つのアミノ酸変更と共に含む。
抗体は、ＬＣＤＲ ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３のセットを含むＶＬドメインを含んでもよく、
ＬＣＤＲ１は配列番号８のＫＹ１０４４のＬＣＤＲ１であり、
ＬＣＤＲ２は配列番号９のＫＹ１０４４のＬＣＤＲ２であり、
ＬＣＤＲ３は配列番号１０のＫＹ１０４４のＬＣＤＲ３であるか、
またはＬＣＤＲのそのセットを１、２、３もしくは４つのアミノ酸変更と共に含む。
アミノ酸変更（例えば、置換）はＣＤＲ中の任意の残基位置にあってもよい。
好ましくは、抗体は、ＫＹ１０４４の６つのＣＤＲの全セットを含むＩＣＯＳ結合部位を含む。
本発明による抗ＩＣＯＳ抗体は、配列番号５のＫＹ１０４４のＶＨドメインであるか、またはＫＹ１０４４抗体ＶＨドメイン配列に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有する抗体ＶＨドメインを含んでもよい。アミノ酸配列同一性は、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％であってもよい。
本発明による抗ＩＣＯＳ抗体は、配列番号１２のＫＹ１０４４のＶＬドメインであるか、またはＫＹ１０４４抗体ＶＬドメイン配列に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有する抗体ＶＬドメインを含んでもよい。アミノ酸配列同一性は少なくとも９５％であってもよい。
好ましくは、抗体はＫＹ１０４４ ＶＨおよびＶＬドメインを含む。
本明細書の他の箇所において詳述されるように、抗体は、定常領域、場合によりヒト重鎖および／または軽鎖定常領域を含んでもよい。例示的なアイソタイプは、ＩｇＧ、例えば、ヒトＩｇＧ１である。抗ＩＣＯＳ抗体は、配列番号７のＫＹ１０４４重鎖および／または配列番号１４のＫＹ１０４４軽鎖を含んでもよい。ＫＹ１０４４は、各々４５４アミノ酸残基の２つの重鎖、および各々２１５アミノ酸残基の２つの軽鎖として、ＩｇＧ１抗体に典型的な鎖間および鎖内ジスルフィド結合と共に組換えにより製造することができる。
免疫療法
免疫療法は、抗ＩＣＯＳ剤および／または抗ＴＲｅｇ剤であってもよい、免疫療法剤での処置を含む。それは、患者に薬学的製剤として、例えば、静脈内または皮下注射により、投与することができる。好ましい実施形態において、抗ＩＣＯＳおよび／または抗ＴＲｅｇ免疫療法は、抗ＩＣＯＳ抗体、例えばＫＹ１０４４の患者への投与を含む。
患者はまた、並行して、以前にまたはその後に、場合により手術を含む、患者のがんに対する標準治療による処置を与えられてもよい。マルチキナーゼ阻害剤であるソラフェニブは、ＨＣＣのために承認された最初の全身療法であった。２０１６年以来、３つのマルチキナーゼ阻害剤および１つの抗血管内皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）モノクローナル抗体を含む、４つの他の標的化された剤が、フェーズＩＩＩ臨床試験において、進行性ＨＣＣを有する患者に対して生存利益を提供することが実証されている［７１、７２、７３、７４］。複数の国の規制機関は、レンバチニブをＨＣＣに対するファーストライン全身療法として承認しており、レゴラフェニブ、カボザンチニブ、およびラムシルマブ（α－フェトプロテイン＞４００ｎｇ／ｍＬの患者に限定される）を、ソラフェニブで以前に処置されたＨＣＣを有する者の処置のために承認している。抗ＰＤ－１抗体もまた、進行性ＨＣＣにおけるセカンドライン処置として使用されている。
抗ＩＣＯＳおよび／または抗ＴＲｅｇ免疫療法と組み合わせるか、またはそれと置換することができる処置は、免疫学的細胞死を誘導する処置を包含し、免疫学的細胞死は、細胞からのＡＴＰおよびＨＭＧＢ１の放出ならびに形質膜上のカルレチクリンの露出により特徴付けられる［７５、７６］。免疫学的細胞死を誘導する処置は、放射線（例えば、ＵＶＣ光またはγ線を使用する細胞の電離照射）、化学療法剤（例えば、オキサリプラチン、アントラサイクリン、例えばドキソルビシン、イダルビシンもしくはミトキサントロン、ＢＫチャネルアゴニスト、例えばフロレチンもしくはピマル酸、ボルテゾミブ、心臓グリコシド、シクロホスファミド、ＧＡＤＤ３４／ＰＰ１阻害剤＋ミトマイシン、ＰＤＴ＋ヒペリシン、ポリイノシン酸－ポリシチジル酸、５－フルオロウラシル、ゲムシタビン、ゲフィチニブ、エルロチニブ、またはタプシガルギン＋シスプラチン）ならびに腫瘍関連抗原に対する抗体を包含する。腫瘍関連抗原は、同じ組織の非腫瘍細胞と比べて腫瘍細胞により過剰発現される任意の抗原、例えば、ＨＥＲ２、ＣＤ２０、ＥＧＦＲであることができる。好適な抗体は、ハーセプチン（抗ＨＥＲ２）、リツキシマブ（抗ＣＤ２０）、またはセツキシマブ（抗ＥＧＦＲ）を包含する。
抗ＩＣＯＳおよび／または抗ＴＲｅｇ免疫療法と組み合わせることができる他の処置、ならびに抗ＩＣＯＳ処置および／または併用療法を投与する方法は、参照によって全体を本明細書に組み入れる国際公開第２０１８／０２９４７４号において記載されている。
バイオマーカーを決定する方法および患者サンプルが１つまたはそれ以上のバイオマーカーにおける変化を含む応答シグネチャーについてモニターされる方法を包含する、本発明の方法は、これらのまたは他の処置の処方に情報を与えるために使用することができる。
腫瘍を除去しまたは低減させる手術を受ける患者は、手術の前および／または後に免疫療法を受けてもよい。手術後の免疫療法は、残存する腫瘍組織および／または他の残存する原発性腫瘍または転移を処置してもよい。
統計的方法およびモデリング
カプラン－マイヤー曲線およびログランク検定は単変量解析の例である。それらは、調査下の選択された因子のみにしたがって生存を記述する。代替的な方法はコックス比例ハザード（ＣＯＸ－ＰＨ）回帰分析であり、これは定量的な予測因子変量およびカテゴリカルな変量の両方のために機能する。さらには、コックス回帰モデルは、生存時間に対するいくつかのリスク因子の効果を同時に評価するために生存解析方法を拡張している。
添付の実施例において実証されるように、参照（カットオフ）値は、臨床的度合（例えば、ＯＳ）に関して統計的有意性と共に患者を区別することができる値として決定することができる。カットオフ値は、一連のカットオフ値を試験して、統計的有意性（例えば、ログランク検定によりｐ＜０．０５）を提供する値、好ましくは最も高い統計的有意性を有する値を同定することにより経験的に決定することができる。好ましくは、カットオフ値は、ＲＯＣ解析によるデータから決定される。［７７］（参照によって本明細書に組み入れる）を参照。場合により、カットオフ値は、バイオマーカーの中央値リーディング、バイオマーカーの上位四分位数リーディングまたはバイオマーカーの下位四分位数リーディングである。
参照値が算出される場合、所望される桁の値を表すために、それは乗算または除算係数を含むことが好都合であり得る。例えば、カットオフ値が０．００１であると決定された場合、１０００の乗算係数を含めることによりこれは好都合には１として表すことができる。試験サンプルからのバイオマーカーリーディングは次に、参照値に対する比較のために、同じ係数で乗算される。同様に、参照数およびバイオマーカーを変換して、任意の所望されるスケール（数値的、視覚的（例えば、色チャート）、聴覚的またはその他のいずれであれ）での他の値を生成することができ、同じ変換が一貫して行われる限り、バイオマーカーリーディングは依然として前記参照値に対して妥当に比較することができる。そのため、本発明は、バイオマーカーデータが提示される方式により制約される必要はない。むしろ、本発明において使用されるリーディングおよび参照値は、基礎となるデータの代表的なものであり、その結果、（例えば）腫瘍コア１ｍｍ２当たり１００個のＩＣＯＳ陽性細胞の密度を表すバイオマーカー参照値は、「１００細胞／ｍｍ２」または「０」として表すことができる。後者の事例において、１００の減算が適用されるため、１１０細胞／ｍｍ２の密度が算出された腫瘍サンプルは次に０の参照値に対して比較のために１０に変換される。
患者の予後および処置をガイドするために使用することができるバイオマーカー変量を同定するためのロジスティック回帰分析の使用の例は、Ｋａｇａｍｕらによる研究において見出される［２７］。その研究は、患者の末梢血中のＣＤ４＋ Ｔ細胞の状態を、ニボルマブ処置後に早期疾患進行を示す患者を同定することができるバイオマーカーとして同定しており、ノンレスポンダーまたはレスポンダーとしての患者の分類を可能にしている。著者らは、ノンレスポンダーを予測するために非小細胞肺がんを有する患者の末梢血中のＣＤ６２Ｌｌｏｗ ＣＤ４＋ Ｔ細胞およびＣＤ２５＋ ＦＯＸＰ３＋細胞のパーセンテージに基づく式を記載している。予測式は、ロジスティック回帰モデルと共に発見コホートデータを使用することにより開発された。予測式の性能が、独立した検証コホートデータを使用して評価された。生存曲線が、カプラン－マイヤー法を使用して概算された。すべてのＰ値は両側であり、ｐ＜０．０５が統計的に有意と考えられた。２つの集団の間の差異の試験は、スチューデントｔ検定を使用して行われた。多群比較は、チューキー事後分析と共に一元配置ＡＮＯＶＡを使用して行われた。
このタイプのモデリングは、例えば、予測される生存および／または処置に対する応答の可能性にしたがって、患者の意味のある分類を可能とするバイオマーカーおよびバイオマーカーの組合せを同定するためにがん患者からの臨床的なデータに一般に応用することができる。統計分析およびモデリングを実行するために多数のソフトウェアパッケージが利用可能であり、これには、ＳＡＳ ９．４（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｉｎｃ．）およびＰｒｉｓｍ ８（ＧｒａｐｈＰａｄ）が含まれる。
多くの情報を腫瘍組織切片から読み取ることができ、様々な異なる細胞タイプの分布、拡大、クラスター化および互いに対する近接性を包含する、細胞の空間的構成を観察することによりＴＭＥの性質についての洞察が獲得される。以前に、黒色腫細胞の２０μｍ以内の免疫細胞の密度は、免疫チェックポイント遮断剤に対する応答に関連することが報告された（Ｇｉｄｅら ２０２０）。本発明において、本発明者らは、ＴＭＥ中のＩＣＯＳおよび／またはＦＯＸＰ３を発現する免疫細胞の空間的構成は、疾患予後および免疫療法に対する応答のバイオマーカーであることを明らかにする。下記の実施例において、本発明者らは、ＨＣＣサンプルのＴＭＥ中のＩＣＯＳ陽性、ＦＯＸＰ３陽性およびＩＣＯＳ ＦＯＸＰ３二重陽性細胞の分析を記載して、これらの細胞の密度、比、細胞間距離および数の観点でＴＭＥを特徴付けている。本発明者らは、ＩＣＯＳおよびＦＯＸＰ３について共染色し、１ｍｍ２当たりのＩＣＯＳ単一陽性、ＦＯＸＰ３単一陽性およびＩＣＯＳ ＦＯＸＰ３二重陽性細胞の密度、異なる染色された細胞の比（例えば、ＦＯＸＰ３単一陽性細胞とＩＣＯＳ ＦＯＸＰ３二重陽性細胞との比）、異なる染色された細胞の間の距離（例えば、ＩＣＯＳ ＦＯＸＰ３二重陽性細胞のＩＣＯＳ単一陽性細胞までの平均距離）ならびにＩＣＯＳ単一陽性細胞の周囲の影響の領域（３０μＭの半径により定義される）中のＩＣＯＳ ＦＯＸＰ３二重陽性細胞の数を測定した。
本発明者らは、ＴＭＥのこれらの測定と臨床アウトカムまたは臨床メタデータとの間の関連性を調べた。本発明者らは、そのような測定が疾患予後（全生存期間を包含する）ならびに抗ＩＣＯＳおよび／または抗ＴＲｅｇ免疫療法に対する応答についてのバイオマーカーをどのように表すのかを記載する。
ＩＣＯＳ ＦＯＸＰ３二重陽性細胞は、免疫抑制性ＴＭＥに特徴的な、活性ＴＲｅｇとして同定される。ＨＣＣ腫瘍は、高い割合のＩＣＯＳ＋ ＴＲｅｇを含有することが見出され、強く免疫抑制性の環境を含意した。ＩＣＯＳ＋細胞のより高い密度、全ＦＯＸＰ３＋細胞に対するＩＣＯＳ＋ ＦＯＸＰ３＋二重陽性細胞のより高い比、ＩＣＯＳ＋ ＴＲｅｇと他のＩＣＯＳ＋細胞との間のより近い近接性、および影響の領域中のＩＣＯＳ＋ ＴＲｅｇのより多い数はすべて、より不良な全生存期間に関連していた。
本発明者らは、抗ＴＲｅｇ抗ＩＣＯＳおよび／または免疫療法が、ＴＭＥにおいてこれらのバイオマーカーを呈する患者において、生存の延長を包含する、臨床的利益をどのように提供し得るのかを記載する。抗ＩＣＯＳ抗体ＫＹ１０４４は理想的な候補治療剤であり、その理由は、ＩＣＯＳ陽性細胞を標的化し、ＩＣＯＳの高い発現を有する細胞を選択的に枯渇させて、高度免疫抑制性ＴＲｅｇを除去し、抗腫瘍免疫応答をブーストするその能力のためである。
腫瘍周囲と比べたＴＭＥにおけるＩＣＯＳ陽性ＴＲｅｇの数および比の増加
２０人のＨＣＣ患者のコホートにおいて隣接する正常組織と比較してＴＭＥにおいてＩＣＯＳ ＦＯＸＰ３二重陽性細胞が増加していることが以前に報告された［３］。本研究において、本発明者らは、先行する発見を確認および拡張する、患者の大きいコホートからのデータを評価した。本発明者らは、ＨＣＣサンプル中の腫瘍周囲組織と比較したＴＭＥにおけるＩＣＯＳ ＦＯＸＰ３二重陽性細胞の有意な増加を見出した。本発明者らはまた、腫瘍周囲と比べた腫瘍コアにおける全ＴＲｅｇ（ＦＯＸＰ３陽性細胞）に対するＩＣＯＳ陽性ＴＲｅｇ（ＩＣＯＳ ＦＯＸＰ３二重陽性細胞）の比における有意な増加（ｐ＜０．００１）を観察した。高密度の腫瘍浸潤性ＴＲｅｇは、ＨＣＣの望ましくない予後指標であると考えられる。ＩＣＯＳ＋ ＦＯＸＰ３＋細胞は、ＴＧＦ－βおよびＩＬ－１０の両方の産生を通じて高度に免疫抑制性であることが報告されているという事実［７８］と共に、本発明者らの発見は、ＨＣＣ腫瘍は、ＩＣＯＳ ＦＯＸＰ３二重陽性細胞を枯渇させることを目的とした戦略から強く利益を受けるはずであることを指し示す。ＩＣＯＳ陰性ＦＯＸＰ３陽性細胞に対するＩＣＯＳ ＦＯＸＰ３二重陽性細胞のより高い比を有する腫瘍は最も利益を受けるはずである。
腫瘍サンプル
腫瘍組織は元々、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｔａｉｗａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌ、Ｔａｉｐｅｉ、Ｔａｉｗａｎで肝切除術を受けたＨＣＣ患者から収集された。ホルマリン固定されたパラフィン包埋組織切片（５μｍの厚さ）を、アーカイブされた組織から本研究のために回収した。
患者データ
計１４２人の患者（男性：女性＝１１２：３０、年齢中央値６１．０歳）が研究コホートに登録された。患者の中で、８７人（６１．３％）は慢性Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染症を有し、３３人（２３．２％）は慢性Ｃ型肝炎（ＨＣＶ）感染症を有し、２２人（１５．５％）はＨＢＶ／ＨＣＶ感染症を有しなかった。ＨＢＶおよびＨＣＶについて二重陽性の患者はいなかった。ＡＦＰ＜２０ｎｇ／ｍＬまたは早期ステージ疾患を有する患者は、有意に改善された全生存期間（ＯＳ）中央値を有した。ＯＳは、肝切除術の日から、患者の死亡日または最終フォローアップ日までで算出した。ＯＳ中央値は、コホート中の患者の半数が依然として研究に残っている診断後の時間の長さとして算出した。このコホートにおいて、ＯＳ中央値は１００．３か月であった。年齢、性別およびウイルス病因は、ＯＳにおける変化と有意に関連していなかった。
免疫組織化学
以下のように、逐次的二重マルチプレックスＩＨＣアッセイを行って、５μｍの組織切片中のＩＣＯＳおよびＦＯＸＰ３発現細胞を検出した。組織スライドを脱パラフィン処理し、再水和させ、抗原賦活化のためにデクローキングチャンバーを使用してクエン酸緩衝液（ｐＨ ６．０）中で１０分間オートクレーブし、続いて過酸化水素および次にカゼイン含有ブロッキング試薬（Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ Ｓｎｉｐｅｒ、ＢｉｏＣａｒｅ Ｍｅｄｉｃａｌ）でブロッキングして非特異的なバックグラウンド染色を低減させた。スライドを次に抗ＩＣＯＳ抗体（希釈１：８００；クローンＤ１Ｋ２Ｔ；Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）と４℃で終夜インキュベートした。Ｄ１Ｋ２Ｔを検出する二次抗体を含む、ＭＡＣＨ１ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＨＲＰ－Ｐｏｌｙｍｅｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＢｉｏＣａｒｅ Ｍｅｄｉｃａｌ）を適用し、自動化されたＤＡＢ検出を生産者の推奨の通りに実行した。ＤＡＢ（３，３’－ジアミノベンジジン）はベンゼンの誘導体であり、褐色染色を提供する。
ブロッキング工程を繰り返し、スライドを次に抗ＦＯＸＰ３抗体（希釈１：８００；クローン２３６Ａ／Ｅ７；Ａｂｃａｍ）と４℃で終夜インキュベートした。検出用の二次抗体を含む、ＭＡＣＨ１ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＨＲＰ－Ｐｏｌｙｍｅｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔを適用し、Ｖｉｎａ Ｇｒｅｅｎ Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ Ｋｉｔ（ＢｉｏＣａｒｅ Ｍｅｄｉｃａｌ）を生産者の推奨の通りに実行した。Ｖｉｎａ Ｇｒｅｅｎ Ｃｈｒｏｍａｇｅｎは、ここでＦＯＸＰ３用の二次染色として使用される緑色染色を提供する。スライドをヘマトキシリンおよびブルーイング試薬で対比染色し、ブルーイング試薬は、核内のヘマトキシリンの初期可溶性赤色を不溶性青色に変換する。ブルーイング溶液のアルカリ性ｐＨはまた、媒染色素レーキが組織中で再形成されてより永久的となることを引き起こす。結果はすべての細胞核の染色であり、これは組織の全体的な構造を示し、２つのＩＨＣ色素原を観察することができる文脈的バックグラウンドを提供して、病理医またはコンピュータによるその後の分析を促す。最後に、標準的なＩＨＣ手順にしたがってすべてのスライドを機器から除去し、洗浄し、脱水し、永久的な封入剤中にマウントした。
デジタル病理学
５μｍのＩＨＣ染色組織スライドを２０倍の倍率でＨａｍａｍａｔｓｕ Ｎａｎｏｚｏｏｍｅｒデジタルスキャナーを使用して明視野モードにおいてスキャンした。全体スライド画像の二重ＩＨＣ分析をＩｎｄｉｃａ Ｌａｂｓ ＨＡＬＯ（登録商標）プラットフォームで行った。簡潔に述べれば、処理は、ＩＨＣ色素原（×２）および対比染色を分離するための３色素原デコンボリューションを伴った。細胞物体は、個々の色素原に重み付けされた光学密度値を適用することにより形成させた。各々の陽性細胞タイプを次に、定義されたサイズ、形状および細胞内区画染色パラメーターを使用して同定した。分類指標を開発し、アルゴリズムに統合して、分析のための関心対象の組織領域を自動的にセグメント化した。完成したアルゴリズムを研究におけるすべての組織切片画像に自動化された客観的な方式で応用して、詳細な細胞毎のデータを生成した。すべてのスキャンされた画像を調べ、以下の領域を定義し、手動でアノテーションした：
・浸潤性周縁部：病理医により定義される腫瘍の縁
・コア（ＴＭＥ）：浸潤性周縁部から内側に＞５００μｍの腫瘍中心
・腫瘍周囲間質：浸潤性周縁部から外側に＞５００μｍの腫瘍の周囲の組織。
組織ひだおよび／または染色アーチファクトを手動の除外により分析から省略した。
結果および結論
ＩＣＯＳ＋ ＦＯＸＰ３＋細胞の密度は、腫瘍周囲区画におけるよりもＴＭＥ（腫瘍コア）において有意により高かった（対応のあるＴ検定によりｐ＜０．００１）。図２。
全ＦＯＸＰ３細胞に対するＩＣＯＳ陽性ＴＲｅｇ（ＩＣＯＳ ＦＯＸＰ３二重陽性細胞）の比もまた、腫瘍周囲区画におけるよりもＴＭＥ（腫瘍コア）において有意により高かった（対応のあるＴ検定によりｐ＜０．００１）。図３。
これらの発見は、ＩＣＯＳ＋ ＴＲｅｇは腫瘍周囲区画におけるよりもＴＭＥにおいてよく見られたというＨＣＣにおける以前の研究［３］と合致する。
ＨＣＣ中のＩＣＯＳを発現するＴＲｅｇの高い数および割合は、これらの腫瘍における強く免疫抑制性の環境を含意する。抗ＩＣＯＳおよび／または抗ＴＲｅｇ免疫療法は、これらの特徴を有するＨＣＣにおいて利益となる可能性がある。
これらの効果は、ウイルス関連がんにおいてより著しく、結果は本研究において統計的有意性に達しなかったが、これは、ウイルス関連またはウイルス誘導性がん（例えば、ＨＢＶ陽性ＨＣＣ、ＨＣＶ陽性ＨＣＣ）は抗ＩＣＯＳおよび／または抗ＴＲｅｇ免疫療法に応答する可能性がより高い可能性があることを示唆する。
ＩＣＯＳは疾患予後のバイオマーカーである
実施例１におけるものと同じＨＣＣ患者コホートを使用して、本発明者らは、患者生存と、腫瘍サンプル中のＩＣＯＳ＋細胞の密度およびＩＣＯＳ＋ ＴＲｅｇの割合との関連を明らかにした。ＩＣＯＳ陽性細胞のより高い密度はより短いＯＳと関連した。ＩＣＯＳ陽性ＴＲｅｇのより高い割合もまたより短いＯＳと関連した。
サンプルの処理
実施例１に記載されるように、腫瘍サンプルを処理し、ＩＨＣおよびデジタル病理学研究を実行した。
データ分析
細胞測定と生存との間の関連性を、異なる細胞測定にしたがって分割された患者集団についてカプラン－マイヤー曲線を構築することにより分析した。患者集団の間の生存における差異をログランク検定により比較した。カプラン－マイヤーログランク分析をＧｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ８．３．１を使用して行った。
統計分析は、ＳＡＳ統計ソフトウェア（バージョン９．４、ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｉｎｃ．、Ｃａｒｙ、ＮＣ、ＵＳＡ）を使用して行った。＜０．０５の両側ｐ値を統計的に有意と考えた。異なる亜群中の患者のＯＳおよびＲＦＳをカプラン－マイヤー法を使用して概算し、ログランク検定を使用して比較した。対応のないＴ検定を使用して細胞密度における差異を比較した。
９５％信頼区画（ＣＩ）を伴うハザード比（ＨＲ、マンテル－ヘンツェル）も使用して、全ＴＲｅｇに対するＩＣＯＳ＋ ＴＲｅｇの比とＨＣＣがんの予後との間の関連性の程度を概算した。
結果および結論
ＨＣＣ予後に対する、ＩＣＯＳ＋ ＴＲｅｇの割合およびＩＣＯＳ＋細胞密度の効果を各々、カプラン－マイヤー曲線を構築することにより調べ、ＯＳにおける差異をログランク検定により比較した。ＩＣＯＳ＋ＦＯＸＰ３＋／全ＦＯＸＰ３＋細胞の高い比（ｐ＝０．０７４）またはＴＭＥ中の高いＩＣＯＳ＋細胞密度を有する患者はより短いＯＳに関連していた（ｐ＜０．０５）。
結果は、高いＩＣＯＳ細胞密度と不良な予後（不良な生存）との間の有意な相関を実証し、ＴＭＥ中のＩＣＯＳ＋細胞のより低い密度として現れる、低いＩＣＯＳ発現は、ＨＣＣを有する患者のより良好な生存の予測因子であることを示唆した。本発明者らは、ＴＭＥ中に１ｍｍ２当たり１２０個またはより多くのＩＣＯＳ陽性細胞を有する患者について、ＯＳ中央値は、他の患者と比較して半分より高いことを見出した。低い密度（＜１２０細胞／ｍｍ２）を有する患者は１４７．３か月の生存中央値を有した一方、高い密度（＞＝１２０細胞／ｍｍ２）を有する患者は６８．９か月の生存中央値を有した。図４。１２０細胞のカットオフは丸めた値である。統計的有意性が、他の類似したカットオフ数、例えば、１２３細胞／ｍｍ２で観察された。ＩＣＯＳ＋細胞の密度とＨＣＣがんの予後との間の関連性についての９５％信頼区画（ＣＩ）を伴うハザード比（ＨＲ、マンテル－ヘンツェル）は、ＣＩ ０．３３４６～０．９９６３と共に０．５７７４（ｐ＜０．０５）として算出された。
全生存期間（ＯＳ）ではなく無再発生存期間（ＲＦＳ）の数値と共に分析を行った場合、ログランク（マンテル－コックス）検定は、下位３つの四分位数（＜１２０細胞／ｍｍ２）と比べた最高四分位数（≦１２０細胞／ｍｍ２）にしたがって層化された患者集団についてＲＦＳ％における差異の統計的有意性を指し示さなかった。
ＴＲｅｇ集団中のＩＣＯＳ陽性ＴＲｅｇの高い割合もまた、生存についてのより不良な予後に関連していた。本発明者らは、ＴＲｅｇの５０％またはより多くがＩＣＯＳ陽性である患者について、ＯＳ中央値は他の患者と比較して半分であることを見出した。低い比（＜０．５）を有する患者は１４７．３か月の生存中央値を有した一方、高い比（＞＝０．５）を有する患者は６１．６か月の生存中央値を有した。図５。関連性についてのハザード比は、ＣＩ ０．３４８６～０．９８８５の信頼区画と共に０．５８７０（ｐ＝０．０４５１）であった。
この集団における０．５のカットオフ比が、生存時間に関して統計的有意性と共に患者を区別できる比として経験的に決定された。比の中央値（０．３３）を使用するコホートの分割は同様に患者を、より長い生存を有する患者およびより短い生存を有する患者に分割し、より高い比を有する患者はより長い生存を有したが、統計的有意性を満たさなかった。比の上位四分位数を有する患者と下位四分位数を有する患者にコホートを分割した場合に同じことが該当し、すなわち、差異が観察されたが統計的有意性を満たさなかった。
（ＯＳではなく）ＲＦＳに対する効果を評価した場合、０．５のカットオフ比でコホートを分離して、データの明確な分離が見られ、ＲＦＳ％は比＜０．５０を有する患者においてより高かった。これは、ＯＳで観察された同じ傾向を反映するが、ＲＦＳについての差異はログランク（マンテル－コックス）検定にしたがって統計的に有意でなかった。
結論として、ＴＭＥにおけるＩＣＯＳ＋細胞のより高い密度および／または全ＴＲｅｇに対するＩＣＯＳ＋ ＴＲｅｇのより高い比を有する患者はより不良な生存を有し、抗ＴＲｅｇ治療剤での処置は、ＩＣＯＳ＋ ＴＲｅｇの数を減少させ、および抗腫瘍応答をもたらすことによりこの少なくとも１つの原因に対処して、生存を改善するはずである。
ＩＣＯＳはＨＢＶ陽性ＨＣＣにおける予後バイオマーカーである
Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）による慢性感染症はＨＣＣの病理発生と関連している。実施例２からのデータのさらなる分析を通じて、本発明者らは、ＨＢＶ陽性腫瘍のＴＭＥ中の１ｍｍ２当たりのＩＣＯＳ陽性細胞の高い密度は予後不良に関連することを見出した。ＨＢＶ陽性ＨＣＣ腫瘍に焦点を当てた場合、結果は、高いＩＣＯＳ細胞密度と不良な予後との間の有意な相関を実証し、ＴＭＥ中のＩＣＯＳ＋細胞のより低い密度として現れる低いＩＣＯＳ発現は、ＨＢＶ感染症に関連するＨＣＣを有する患者のより良好な生存の予測因子であることを示唆した。
１２０細胞／ｍｍ２のカットオフ値を使用してＨＢＶ不可知論的ＨＣＣの患者集団を区別したが（実施例２）、１００細胞／ｍｍ２のより低いカットオフ値がＨＢＶ陽性ＨＣＣについて決定された。ＴＭＥ中の１００またはより多くのＩＣＯＳ陽性細胞／ｍｍ２またはより多くを伴う患者（上位四分位数）は２６．１か月のＯＳ中央値を呈した一方、ＯＳは１００ ＩＣＯＳ細胞／ｍｍ２未満の患者について定義されない／達しなかった（下位３つの四分位数）。図６。ログランク（マンテル－コックス）検定による統計的有意性はｐ＜０．０５であった。ＯＳではなくＲＦＳについての同じ分析は統計的有意性に達しなかった。
９５％信頼区画（ＣＩ）を伴うハザード比（ＨＲ、マンテル－ヘンツェル）を使用して、ＩＣＯＳ陽性細胞の密度とＨＣＣがんの予後（ＯＳ）との間の関連性の程度も概算した。０．４３４５のＨＲおよびＣＩ ０．２１３１～０．８８６１、ｐ＝０．０２１９。
ＩＣＯＳはＡＪＣＣステージ２ ＨＣＣにおける予後バイオマーカーである
実施例２からのデータのさらなる分析を通じて、本発明者らは、ＡＪＣＣステージ２ ＨＣＣ腫瘍のＴＭＥ中の１ｍｍ２当たりのＩＣＯＳ陽性細胞の高い密度は予後不良に関連することを見出した。実施例３と同様に、ＡＪＣＣ２ ＨＣＣ腫瘍に焦点を当てた場合、結果は、高いＩＣＯＳ細胞密度と不良な予後との間の有意な相関を実証することを本発明者らは見出し、ＴＭＥ中のＩＣＯＳ＋細胞のより低い密度として現れる低いＩＣＯＳ発現は、ＡＪＣＣ２ ＨＣＣを有する患者のより良好な生存の予測因子であることが示唆された。
１２０細胞／ｍｍ２のカットオフ値を使用してＨＢＶ不可知論的ＨＣＣの患者集団を区別したが（実施例２）、１００細胞／ｍｍ２のより低いカットオフ値がＡＪＣＣステージ２ ＨＣＣについて決定された。ＴＭＥ中の１００またはより多くのＩＣＯＳ陽性細胞／ｍｍ２またはより多くを伴う患者（上位四分位数）は、１００ ＩＣＯＳ細胞／ｍｍ２未満の患者（下位３つの四分位数）と比較してより低いＯＳ中央値を呈した。図７。ログランク（マンテル－コックス）検定による統計的有意性はｐ＜０．０１であった。
ＴＭＥ中の１００またはより多くのＩＣＯＳ陽性細胞／ｍｍ２またはより多くを伴う患者（上位四分位数）はまた、１００ ＩＣＯＳ細胞／ｍｍ２未満の患者（下位３つの四分位数）と比較してより低いＲＦＳ％を呈した。図８。ログランク（マンテル－コックス）検定による統計的有意性はｐ＜０．０５であった。
１００細胞／ｍｍ２のより低いカットオフ値はまた、より進行したステージのＨＣＣ、例えば、ステージ３ ＨＣＣのために適切であると本発明者らは考える。これは、本コホート中のステージ３ ＡＪＣＣを有する１８人の患者についてのサンプルおよび生存データの分析により検証することができるであろう。
細胞間距離は予後のバイオマーカーである
互いと比べた免疫細胞の分布は、患者の抗腫瘍免疫状態だけでなく、患者の生存にも影響を及ぼし得る。先行する実施例と同じＨＣＣ患者コホートからの腫瘍サンプルを使用して、本発明者らはＩＣＯＳ ＦＯＸＰ３二重陽性細胞とＩＣＯＳ単一陽性（ＩＣＯＳ陽性ＦＯＸＰ３陰性）細胞との間の距離を測定した。ＩＣＯＳ ＦＯＸＰ３二重陽性細胞は、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞およびＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞に対して高度に免疫抑制性の活性ＴＲｅｇを表す。ＩＣＯＳ単一陽性細胞は、非ＴＲｅｇリンパ球、例えば活性化されたＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞およびＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞として考えられる。そのためこの研究において本発明者らは、抗腫瘍免疫応答を媒介している可能性があるエフェクターＴ細胞と、その応答を抑制している可能性がある活性ＴＲｅｇとの間の間隔を調べた。細胞間距離はここでは死んだ組織において研究されたが、組織をサンプル採取および保存するために使用された方法、ならびに使用されたＩＨＣおよびデジタル病理学技術は組織の完全性を保存し、その結果、細胞間の距離は、サンプル採取の直前のｉｎ ｖｉｖｏでの腫瘍中のものを代表すると考えられる。
本発明者らは、ＩＣＯＳ単一陽性細胞から、最も近いＩＣＯＳ ＦＯＸＰ３二重陽性細胞までの平均距離は全生存期間と相関していることを発見した。細胞間のより短い距離はより短い生存に関連していた。
細胞：細胞近接性の測定
腫瘍コア、周縁部、および腫瘍周囲区画中の細胞密度およびＩＣＯＳまたはＦＯＸＰ３単一発現細胞とＩＣＯＳ／ＦＯＸＰ３二重発現細胞との間の距離を以下のようにデジタル病理学により定量化した。
定義された領域内の複数の色素生成マーカーについて陽性の細胞の定量化を行った。複数の色素生成マーカーが共局在する細胞の定量化を行った。
同定された異なる細胞集団の空間的関係性を調べた。ランダムフォレストアプローチを使用して分類アルゴリズムを開発し、各々の全体スライド画像に適用して、各々の領域（周縁部／コア／腫瘍周囲）内の生存組織を同定した。別々のカスタマイズされたマルチプレックスＩＨＣアルゴリズムを開発して、ＦＯＸＰ３およびＩＣＯＳ単一および二重ＩＣＯＳ／ＦＯＸＰ３ ＩＨＣ陽性染色細胞を定量化した。特に、ヘマトキシリンおよびＩＨＣ色素原染色剤を差次的に重み付けして、領域内の細胞をセグメント化し、正確な細胞カウントを確立した。閾値を各々の色素原のために調整して、ＦＯＸＰ３のみ（暗青緑色の核色素原）、ＩＣＯＳのみ（３，３’－ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）褐色色素原）および二重ＦＯＸＰ３／ＩＣＯＳについて陽性の細胞を決定した。ＦＯＸＰ３およびＩＣＯＳ単一および二重細胞カウントを、各々の領域について生存組織区画にわたり正規化して、各々の全体スライド画像についての領域当たりの組織１ｍｍ２当たりの陽性の細胞の数を得た。
細胞ベースの分析データをさらに利用して、腫瘍コア内の検出された細胞表現型の空間的位置をプロットした。これらのプロットをその後に使用して、Ｈａｌｏプラットフォーム内に組み込まれたＳｐａｔｉａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓモジュールを使用してＩＣＯＳ単一および二重ＦＯＸＰ３／ＩＣＯＳ細胞についての近接性および相対的空間分布データを生成した。がんタイプ毎の切片の各々のセットについて、全体スライド画像毎に腫瘍コア内のあらゆるＩＣＯＳ単一陽性細胞についてその最も近い二重ＦＯＸＰ３／ＩＣＯＳ陽性細胞までの平均距離データを最初に生成した。これに続いて、全体スライド画像毎に腫瘍コア内のあらゆるＩＣＯＳ単一陽性細胞の３０μｍ以内の二重ＦＯＸＰ３／ＩＣＯＳ陽性細胞の数を測定した。ＩＣＯＳ単一陽性細胞の３０μｍ以内の二重ＦＯＸＰ３／ＩＣＯＳ陽性細胞について近接性分析を次に行って、これらの細胞の、それらの最も近いＩＣＯＳ単一陽性細胞からの平均距離を生成した。
データ分析
データ分析は一般に、実施例２に記載されるように行った。
結果および結論
本発明者らは、Ｔａｉｗａｎ ＮＴＵコホートからの１４２個のＨＣＣサンプルの各々においてＩＣＯＳ単一陽性細胞からそれらの最も近いＩＣＯＳ ＦＯＸＰ３二重陽性細胞までの平均距離を算出した。このコホートにおける平均距離中央値は１０５μｍであった。コホートを層化するためのカットオフ値としてこの中央値を使用して、本発明者らは、１０５μｍ未満の平均距離を有する患者は、１０５μｍまたはより長い平均距離を有する患者よりも有意に短い全生存期間を有することを見出した。図９。この層化はＲＦＳと統計的に有意な関連性を示さなかった。９５％信頼区画（ＣＩ）を伴うハザード比（ＨＲ、マンテル－ヘンツェル）を使用して、ＩＣＯＳ＋単一陽性細胞から最も近いＩＣＯＳ ＦＯＸＰ３二重陽性細胞までの距離とＨＣＣがんの全生存期間との間の関連性の程度を概算した。本発明者らは１．６９２のＨＲ（長い距離対短い距離）を算出し、ＣＩは１．０６３～２．６９４（ｐ＝０．０２６６）であった。
そのため、ＩＣＯＳ＋ＦＯＸＰ３＋細胞とＩＣＯＳ＋ＦＯＸＰ３－細胞との間のより短い距離はより短いＯＳに有意に関連しており（ｐ＜０．０５）、ＩＣＯＳ＋ ＴＲｅｇはＨＣＣのＴＭＥにおいてＩＣＯＳ＋ ＴＥｆｆを活発に免疫抑制していることを示唆した。
ＴＥｆｆの半径中の免疫抑制性ＴＲｅｇの区域的影響
先行する実施例に続いて、本発明者らはＩＣＯＳ＋ ＦＯＸＰ３＋およびＩＣＯＳ＋単一陽性細胞の空間分布をさらに研究して、ＩＣＯＳ＋単一陽性細胞（潜在的にエフェクター細胞）の近くに高密度の高度免疫抑制性ＩＣＯＳ＋ＦＯＸＰ３＋二重陽性ＴＲｅｇを有することの潜在的な含意を同定した。ＴＭＥに集中して、本発明者らは、任意のＩＣＯＳ単一陽性細胞の３０μｍ以内にあるＩＣＯＳ ＦＯＸＰ３二重陽性細胞を同定し、その数をカウントした。
各々のＩＣＯＳ単一陽性細胞の周囲の３０μｍの半径を取ることにより区域を定義して、本発明者らは、ＴＭＥ中の任意の１つまたはそれ以上のそのような区域内に入るＩＣＯＳ ＦＯＸＰ３二重陽性細胞の総数を測定し、次にこの細胞カウントをＴＭＥ区画中のＩＣＯＳ単一陽性細胞の総数で除算して、本発明者らが区域的影響比と呼称する比を得た。
本発明者らは、全生存期間と区域的影響比との間の統計的に有意な関連性を同定した。＜０．１の区域的影響比を有する患者サンプルにおいて、（ＲＦＳはそうではなかったが）患者ＯＳは、≧０．１の平均を有するサンプルにおいて有意により長かった。図１０および表Ｅ６－１。
Figure 2023526044000002
免疫療法の価値
上記の実施例は、以下の特徴はすべて、より不良なＯＳに関連することを指し示す：
－ 腫瘍コア（ＴＭＥ）中のより高いＩＣＯＳ発現（ＩＣＯＳ＋細胞のより高い密度）
－ ＩＣＯＳ＋ＦＯＸＰ３＋／全ＦＯＸＰ３＋細胞のより高い比
－ ＩＣＯＳ＋ ＴＲｅｇと他のＩＣＯＳ＋細胞との間のより高い近接性（より短い距離）
－ ＩＣＯＳ単一陽性細胞の３０μｍ以内のＩＣＯＳ＋ＦＯＸＰ３＋ ＴＲｅｇのより多い数。
本発明者らは、免疫抑制性ＴＭＥはＨＣＣにおいて臨床的に意義深いことを結論付ける。ＴＲｅｇは、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋ ＴＥｆｆの機能および増殖を抑制できた。これは、ＴＭＥにおけるＴＲｅｇの増加およびＣＤ８＋ Ｔ細胞の減少は、ＨＣＣを包含する、固形腫瘍を有する患者において予後不良に関連していたという以前の研究と合致する［２］。
例えば、抗体、例えばＫＹ１０４４でのそのような腫瘍中のＩＣＯＳｈｉｇｈ陽性ＴＲｅｇの枯渇／低減は、免疫抑制を低減させることにより免疫的構成を改善し、これらの特色により特徴付けられるＨＣＣおよび他の腫瘍を有する患者において臨床的利益を提供するはずである。
ＫＹ１０４４は、がん患者においてＩＣＯＳ＋ＦＯＸＰ３＋ ＴＲｅｇを枯渇させることが示されている。ＫＹ１０４４単剤療法での臨床試験における患者の複数のコホートにおいて、ＫＹ１０４４は、ベースライン（スクリーニング）から、３回の週毎の間隔での投薬での投薬の第２のサイクルの８日後（Ｃ２Ｄ８）までにすべてのＦＯＸＰ３＋ ＴＲｅｇに対するＩＣＯＳ＋ＦＯＸＰ３＋ ＴＲｅｇの比を減少させた。図１１。
患者腫瘍サンプルからのバイオマーカーの算出
本発明者らは、実施例１～６において記載される患者コホートからの腫瘍サンプルからのバイオマーカーリーディングの決定の実例を示す。
組織スライドを腫瘍サンプルから調製し、ＩＣＯＳおよびＦＯＸＰ３について染色し、実施例１に記載されるようにデジタルで分析した。図１２～１４。
腫瘍コアの面積（ＡＲＥＡ＿ＴＭＥ）を定義し、定量化した。
以下のデータを腫瘍コア内の細胞について記録した：
－ ＩＣＯＳ単一陽性細胞の数（ＳＰＩＣＯＳ＿ＮＢ＿ＴＭＥ）；
－ ＦＯＸＰ３陽性細胞の数（ＴＯＴＦＯＸＰ＿ＮＢ＿ＴＭＥ）；
－ ＩＣＯＳ ＦＯＸＰ３二重陽性細胞の数（ＤＰ＿ＮＢ＿ＴＭＥ）；
－ ＩＣＯＳ＋ ＦＯＸＰ３＋細胞とＩＣＯＳ＋ ＦＯＸＰ３－細胞との間の細胞間近接性を表す、各々のＩＣＯＳ単一陽性細胞からその最も近いＩＣＯＳ ＦＯＸＰ３二重陽性細胞までの平均距離（ＤＩＳＴ＿ＳＰＩＣＯＳ＿ＴＭＥ）；この平均の算出は、その距離測定および細胞カウントデータからＨａｌｏ（登録商標）ソフトウェアにより自動的に行った；ならびに
－ 任意のＩＣＯＳ単一陽性細胞の３０μｍ以内にあるＩＣＯＳ ＦＯＸＰ３二重陽性細胞の数（ＤＰ＿ＮＢ＿３０ＵＭＳＰＩＣＯＳＲＯＩ＿ＴＭＥ）。
ＩＣＯＳ単一陽性細胞の数およびＩＣＯＳ ＦＯＸＰ３二重陽性細胞の数を合計することによりＩＣＯＳ陽性細胞の総数（ＴＯＴＩＣＯＳ＿ＮＢ＿ＴＭＥ）が得られる。
ＩＣＯＳ陽性細胞の総数を腫瘍コアの面積で除算することによりＩＣＯＳ陽性細胞の密度（ＴＯＴＩＣＯＳ＿ＤＥＮ＿ＴＭＥ）が得られる。
ＩＣＯＳ ＦＯＸＰ３二重陽性細胞の数をＦＯＸＰ３陽性細胞の総数で除算することによりＩＣＯＳ陽性であるＦＯＸＰ３陽性細胞の割合（「ＩＣＯＳ＋ ＴＲｅｇの割合」）（ＲＡＴＩＯ＿ＤＰ＿ＴＯ＿ＴＯＴＦＯＸＰ＿ＴＭＥ）が得られる。
任意のＩＣＯＳ単一陽性細胞の３０μｍ以内にあるＩＣＯＳ ＦＯＸＰ３二重陽性細胞の数をＴＭＥ中のＩＣＯＳ単一陽性細胞の総数で除算することにより区域的影響比（ＲＡＴＩＯ＿ＤＰ＿３０ＵＭＳＰＩＣＯＳＲＯＩ＿ＴＯ＿ＳＰＩＣＯＳ＿ＴＭＥ）が得られる。
Figure 2023526044000003
ＩＣＯＳ＋細胞密度、細胞間近接性、ＩＣＯＳ＋ ＴＲｅｇの割合、および区域的影響比の各々は、本発明における患者の予後診断および処置のためのバイオマーカーである。患者のバイオマーカーリーディングをコホートの参照値に対して比較することができる。ＩＣＯＳ陽性細胞の密度が１００ｍｍ２より高い、全ＦＯＸＰ３＋細胞に対するＩＣＯＳ＋ ＦＯＸＰ３＋細胞の比が０．５より高い、ＩＣＯＳ＋ ＦＯＸＰ３－細胞からその最も近いＩＣＯＳ＋ ＦＯＸＰ３＋細胞までの平均距離が１０５μｍ未満である、および区域的影響比が０．１より高いため、サンプルからの例示的なバイオマーカーデータは予後不良を指し示す。このデータを示すＨＣＣ腫瘍を有する患者は、他のＨＣＣ患者と比較して相対的に短い生存を有すると予想される。バイオマーカーデータは、患者は抗ＩＣＯＳおよび／または抗ＴＲｅｇ免疫療法剤での処置から利益を受け、これは患者の生存を延長させ得ることを指し示す。
ＩＣＯＳ＋ ＴＲｅｇの割合の算出
実施例１～６において記載された患者コホートからの別の腫瘍サンプルから組織スライドを調製した。組織の切片をＩＣＯＳおよびＦＯＸＰ３について染色し、実施例１に記載されるようにデジタルで分析した。図１５。
ＩＣＯＳ＋ ＴＲｅｇの割合についての分析リードアウトは以下の通りであった：
ＴＭＥ中のＩＣＯＳ ＦＯＸＰ３二重陽性細胞の数＝１１，０６６
ＴＭＥ中のＦＯＸＰ３単一陽性細胞の数＝１０，８４２
ＴＭＥ中の総ＦＯＸＰ３細胞＝２１，９０８
比＝１１，０６６／２１，９０８＝０．５１
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Figure 2023526044000004
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Claims (57)

  1. 患者におけるがん性固形腫瘍の予後診断方法であって、
    患者から得られた腫瘍コア組織のサンプルを提供すること、
    前記サンプルにおいて以下のバイオマーカー：
    （ｉ）ＩＣＯＳ単一陽性細胞の総数に対するＩＣＯＳ単一陽性細胞の周囲の定義された影響半径内のＩＣＯＳ ＦＯＸＰ３二重陽性細胞の数の比、
    （ｉｉ）各々のＩＣＯＳ陽性ＦＯＸＰ３陰性細胞とその最も近いＩＣＯＳ ＦＯＸＰ３二重陽性細胞との間の平均距離、
    （ｉｉｉ）ＩＣＯＳ陽性であるＦＯＸＰ３陽性細胞の割合、および
    （ｉｖ）ＩＣＯＳ陽性細胞の密度
    のうちの１つまたはそれ以上を決定すること、ならびに
    前記１つまたはそれ以上のバイオマーカーに基づいて患者のための予後診断を提供すること
    を含み、
    患者生存、無再発生存期間（ＲＦＳ）、無進行生存期間（ＰＦＳ）または無増悪期間（ＴＴＰ）のより短い持続期間は、
    ＩＣＯＳ単一陽性細胞の総数に対するＩＣＯＳ単一陽性細胞の周囲の定義された影響半径内のＩＣＯＳ ＦＯＸＰ３二重陽性細胞の数のより高い比、
    各々のＩＣＯＳ陽性ＦＯＸＰ３陰性細胞とその最も近いＩＣＯＳ ＦＯＸＰ３二重陽性細胞との間のより短い平均距離、
    ＩＣＯＳ陽性であるＦＯＸＰ３陽性細胞のより高い割合、および／または
    ＩＣＯＳ陽性細胞のより高い密度
    により指し示される、前記方法。
  2. ＩＣＯＳ単一陽性細胞の総数に対するＩＣＯＳ単一陽性細胞の周囲の定義された影響半径内のＩＣＯＳ ＦＯＸＰ３二重陽性細胞の数の比を決定すること、および
    前記比を参照値と比較すること
    を含み、
    前記参照値より高い比は、生存、ＲＦＳ、ＰＦＳまたはＴＴＰのより短い持続期間の予後を指し示す、請求項１に記載の方法。
  3. 腫瘍は肝細胞癌であり、参照値は、ＩＣＯＳ単一陽性細胞の総数に対するＩＣＯＳ単一陽性細胞の周囲の定義された影響半径内のＩＣＯＳ ＦＯＸＰ３二重陽性細胞の数の０．１の比である、請求項２に記載の方法。
  4. 各々のＩＣＯＳ陽性ＦＯＸＰ３陰性細胞とその最も近いＩＣＯＳ ＦＯＸＰ３二重陽性細胞との間の平均距離を決定すること、および
    前記距離を参照値と比較すること
    を含み、
    参照値より短い距離は、生存、ＲＦＳ、ＰＦＳまたはＴＴＰのより短い持続期間の予後を指し示す、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 腫瘍は肝細胞癌であり、参照値は、各々のＩＣＯＳ陽性ＦＯＸＰ３陰性細胞とその最も近いＩＣＯＳ ＦＯＸＰ３二重陽性細胞との間の１０５μｍの平均距離である、請求項４に記載の方法。
  6. ＩＣＯＳ陽性であるＦＯＸＰ３陽性細胞の割合を決定すること、および
    前記割合を参照値と比較すること
    を含み、
    参照値より高い割合は、生存、ＲＦＳ、ＰＦＳまたはＴＴＰのより短い持続期間の予後を指し示す、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 腫瘍は肝細胞癌であり、参照値は、ＦＯＸＰ３陽性細胞の半数がＩＣＯＳ陽性であることである、請求項６に記載の方法。
  8. ＩＣＯＳ陽性細胞の密度を決定すること、および
    前記密度を参照値と比較すること
    を含み、
    参照値より高い密度は、生存、ＲＦＳ、ＰＦＳまたはＴＴＰのより短い持続期間の予後を指し示す、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
  9. 腫瘍は肝細胞癌であり、参照値は、１２０ ＩＣＯＳ陽性細胞／ｍｍ２の密度である、請求項７に記載の方法。
  10. 腫瘍は、Ｂ型肝炎ウイルス感染症に関連する肝細胞癌であるか、またはステージ２もしくはその後のステージの肝細胞癌であり、参照値は、１００ ＩＣＯＳ陽性細胞／ｍｍ２の密度である、請求項７に記載の方法。
  11. 前記１つまたはそれ以上のバイオマーカーから、患者は、生存、ＲＦＳ、ＰＦＳまたはＴＴＰのより短い持続期間の予後を有することを決定することを含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。
  12. ＩＣＯＳ単一陽性細胞の総数に対するＩＣＯＳ単一陽性細胞の周囲の定義された影響半径内のＩＣＯＳ ＦＯＸＰ３二重陽性細胞の数の比を決定すること、および
    前記比を参照値と比較することであって、参照値より高い比は、生存、ＲＦＳ、ＰＦＳまたはＴＴＰのより短い持続期間の予後を指し示すこと、
    前記比は参照値より高いことを決定すること、および
    生存、ＲＦＳ、ＰＦＳまたはＴＴＰのより短い持続期間の予後診断を提供すること
    を含む、請求項１１に記載の方法。
  13. 前記１つまたはそれ以上のバイオマーカーから、患者は、生存、ＲＦＳ、ＰＦＳまたはＴＴＰのより長い持続期間の予後を有することを決定することを含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。
  14. ＩＣＯＳ単一陽性細胞の総数に対するＩＣＯＳ単一陽性細胞の周囲の定義された影響半径内のＩＣＯＳ ＦＯＸＰ３二重陽性細胞の数の比を決定すること、および
    前記比を参照値と比較することであって、参照値より高い比は、生存、ＲＦＳ、ＰＦＳまたはＴＴＰのより短い持続期間の予後を指し示すこと、
    前記比は参照値より低いことを決定すること、および
    生存、ＲＦＳ、ＰＦＳまたはＴＴＰのより長い持続期間の予後診断を提供すること
    を含む、請求項１３に記載の方法。
  15. 患者におけるがん性固形腫瘍の予後診断のためのバイオマーカーの使用であって、バイオマーカーは、患者からの腫瘍コア組織において決定される以下：
    （ｉ）ＩＣＯＳ単一陽性細胞の総数に対するＩＣＯＳ単一陽性細胞の周囲の定義された影響半径内のＩＣＯＳ ＦＯＸＰ３二重陽性細胞の数の比、
    （ｉｉ）各々のＩＣＯＳ陽性ＦＯＸＰ３陰性細胞とその最も近いＩＣＯＳ ＦＯＸＰ３二重陽性細胞との間の平均距離、
    （ｉｉｉ）ＩＣＯＳ陽性であるＦＯＸＰ３陽性細胞の割合、および
    （ｉｖ）ＩＣＯＳ陽性細胞の密度
    のうちの１つまたはそれ以上である、前記使用。
  16. 患者におけるがん性固形腫瘍の、抗ＩＣＯＳおよび／または抗ＴＲｅｇ免疫療法剤に応答する可能性を決定する方法であって、
    患者から得られた腫瘍コア組織のサンプルを提供すること、ならびに
    前記サンプルにおいて以下のバイオマーカー：
    （ｉ）ＩＣＯＳ単一陽性細胞の総数に対するＩＣＯＳ単一陽性細胞の周囲の定義された影響半径内のＩＣＯＳ ＦＯＸＰ３二重陽性細胞の数の比、
    （ｉｉ）各々のＩＣＯＳ陽性ＦＯＸＰ３陰性細胞とその最も近いＩＣＯＳ ＦＯＸＰ３二重陽性細胞との間の平均距離、
    （ｉｉｉ）ＩＣＯＳ陽性であるＦＯＸＰ３陽性細胞の割合、および
    （ｉｖ）ＩＣＯＳ陽性細胞の密度
    のうちの１つまたはそれ以上を決定すること
    を含み、
    免疫療法剤に応答する患者のより高い可能性は、
    ＩＣＯＳ単一陽性細胞の総数に対するＩＣＯＳ単一陽性細胞の周囲の定義された影響半径内のＩＣＯＳ ＦＯＸＰ３二重陽性細胞の数のより高い比、
    各々のＩＣＯＳ陽性ＦＯＸＰ３陰性細胞とその最も近いＩＣＯＳ ＦＯＸＰ３二重陽性細胞との間のより短い平均距離、
    ＩＣＯＳ陽性であるＦＯＸＰ３陽性細胞のより高い割合、および／または
    ＩＣＯＳ陽性細胞のより高い密度
    により指し示される、前記方法。
  17. ＩＣＯＳ単一陽性細胞の総数に対するＩＣＯＳ単一陽性細胞の周囲の定義された影響半径内のＩＣＯＳ ＦＯＸＰ３二重陽性細胞の数の比を決定すること、および
    前記比を参照値と比較すること
    を含み、
    参照値より高い比は、免疫療法剤に応答する増加した可能性を指し示す、請求項１６に記載の方法。
  18. 腫瘍は肝細胞癌であり、参照値は、ＩＣＯＳ単一陽性細胞の総数に対するＩＣＯＳ単一陽性細胞の周囲の定義された影響半径内のＩＣＯＳ ＦＯＸＰ３二重陽性細胞の０．１の比である、請求項１７に記載の方法。
  19. 各々のＩＣＯＳ陽性ＦＯＸＰ３陰性細胞とその最も近いＩＣＯＳ ＦＯＸＰ３二重陽性細胞との間の平均距離を決定すること、および
    前記距離を参照値と比較すること
    を含み、
    参照値より短い距離は、免疫療法剤に応答する増加した可能性を指し示す、請求項１６～１８のいずれか１項に記載の方法。
  20. 腫瘍は肝細胞癌であり、参照値は、各々のＩＣＯＳ陽性ＦＯＸＰ３陰性細胞とその最も近いＩＣＯＳ ＦＯＸＰ３二重陽性細胞との間の１０５μｍの平均距離である、請求項１９に記載の方法。
  21. ＩＣＯＳ陽性であるＦＯＸＰ３陽性細胞の割合を決定すること、および
    前記割合を参照値と比較すること
    を含み、
    参照値より高い割合は、免疫療法剤に応答する増加した可能性を指し示す、請求項１６～２０のいずれか１項に記載の方法。
  22. 腫瘍は肝細胞癌であり、参照値は、ＦＯＸＰ３陽性細胞の半数がＩＣＯＳ陽性であることである、請求項２１に記載の方法。
  23. ＩＣＯＳ陽性細胞の密度を決定すること、および
    前記密度を参照値と比較すること
    を含み、
    参照値より高い密度は、免疫療法剤に応答する増加した可能性を指し示す、請求項１６～２２のいずれか１項に記載の方法。
  24. 腫瘍は肝細胞癌であり、参照値は、１２０ ＩＣＯＳ陽性細胞／ｍｍ２の密度である、請求項２３に記載の方法。
  25. 腫瘍は、Ｂ型肝炎ウイルス感染症に関連する肝細胞癌であるか、またはステージ２もしくはその後のステージの肝細胞癌であり、参照値は、１００ ＩＣＯＳ陽性細胞／ｍｍ２の密度である、請求項２３に記載の方法。
  26. 免疫療法剤に応答する増加した可能性を有するとして患者を同定すること、および場合によりそれにより、前記患者の処置のために抗ＩＣＯＳおよび／または抗ＴＲｅｇ免疫療法剤を選択することを含む、請求項１６～２５のいずれか１項に記載の方法。
  27. ＩＣＯＳ単一陽性細胞の総数に対するＩＣＯＳ単一陽性細胞の周囲の定義された影響半径内のＩＣＯＳ ＦＯＸＰ３二重陽性細胞の数の比を決定すること、
    前記比を参照値と比較することであって、参照値より高い比は、免疫療法剤に応答する増加した可能性を指し示すこと、
    前記比は参照値より高いことを決定し、それにより、免疫療法剤に応答する増加した可能性を有するとして患者を同定すること
    を含む、請求項２６に記載の方法。
  28. 抗ＩＣＯＳおよび／または抗ＴＲｅｇ免疫療法剤を前記患者に投与することを含む、請求項２６または請求項２７に記載の方法。
  29. 患者におけるがん性腫瘍の、抗ＩＣＯＳおよび／または抗ＴＲｅｇ免疫療法剤に応答する可能性を決定するための、バイオマーカーの使用であって、バイオマーカーは、患者からの腫瘍コア組織において決定される以下：
    （ｉ）ＩＣＯＳ単一陽性細胞の総数に対するＩＣＯＳ単一陽性細胞の周囲の定義された影響半径内のＩＣＯＳ ＦＯＸＰ３二重陽性細胞の数の比、
    （ｉｉ）各々のＩＣＯＳ陽性ＦＯＸＰ３陰性細胞とその最も近いＩＣＯＳ ＦＯＸＰ３二重陽性細胞との間の平均距離、
    （ｉｉｉ）ＩＣＯＳ陽性であるＦＯＸＰ３陽性細胞の割合、および
    （ｉｖ）ＩＣＯＳ陽性細胞の密度
    のうちの１つまたはそれ以上である、前記使用。
  30. 患者においてがん性固形腫瘍を処置する方法であって、腫瘍は、以下のバイオマーカー：
    参照値より高い、ＩＣＯＳ単一陽性細胞の総数に対するＩＣＯＳ単一陽性細胞の周囲の定義された影響半径内のＩＣＯＳ ＦＯＸＰ３二重陽性細胞の数の比、
    参照値より短い、各々のＩＣＯＳ陽性ＦＯＸＰ３陰性細胞とその最も近いＩＣＯＳ ＦＯＸＰ３二重陽性細胞との間の平均距離、
    参照値より高い、ＩＣＯＳ陽性であるＦＯＸＰ３陽性細胞の割合、および
    参照値より高い、ＩＣＯＳ陽性細胞の密度
    のうちの１つまたはそれ以上を含むことが決定されており、
    該方法は、抗ＩＣＯＳおよび／または抗ＴＲｅｇ免疫療法剤を患者に投与することを含む、前記方法。
  31. 患者においてがん性固形腫瘍を処置する方法における使用のための抗ＩＣＯＳおよび／または抗ＴＲｅｇ免疫療法剤であって、腫瘍は、以下のバイオマーカー：
    参照値より高い、ＩＣＯＳ単一陽性細胞の総数に対するＩＣＯＳ単一陽性細胞の周囲の定義された影響半径内のＩＣＯＳ ＦＯＸＰ３二重陽性細胞の数の比、
    参照値より短い、各々のＩＣＯＳ陽性ＦＯＸＰ３陰性細胞とその最も近いＩＣＯＳ ＦＯＸＰ３二重陽性細胞との間の平均距離、
    参照値より高い、ＩＣＯＳ陽性であるＦＯＸＰ３陽性細胞の割合、および
    参照値より高い、ＩＣＯＳ陽性細胞の密度
    のうちの１つまたはそれ以上を含むことが決定されている、前記使用のための剤。
  32. 腫瘍は肝細胞癌であり、腫瘍は、以下のバイオマーカー：
    ０．１より高い、ＩＣＯＳ単一陽性細胞の総数に対するＩＣＯＳ単一陽性細胞の周囲の定義された影響半径内のＩＣＯＳ ＦＯＸＰ３二重陽性細胞の数の比、
    １０５μｍ未満の、各々のＩＣＯＳ陽性ＦＯＸＰ３陰性細胞とその最も近いＩＣＯＳ ＦＯＸＰ３二重陽性細胞との間の平均距離、
    半数より高い、ＩＣＯＳ陽性であるＦＯＸＰ３陽性細胞の割合、および
    １２０細胞／ｍｍ２より高い、ＩＣＯＳ陽性細胞の密度
    を含むことが決定されている、請求項３０に記載の方法、または請求項３１に記載の使用のための剤。
  33. 腫瘍は、Ｂ型肝炎ウイルス感染症に関連する肝細胞癌であるか、またはグレード２もしくはその後のグレードの肝細胞癌であり、腫瘍は、以下のバイオマーカー：
    ０．１より高い、ＩＣＯＳ単一陽性細胞の総数に対するＩＣＯＳ単一陽性細胞の周囲の定義された影響半径内のＩＣＯＳ ＦＯＸＰ３二重陽性細胞の数の比、
    １０５μｍ未満の、各々のＩＣＯＳ陽性ＦＯＸＰ３陰性細胞とその最も近いＩＣＯＳ ＦＯＸＰ３二重陽性細胞との間の平均距離、
    半数より高い、ＩＣＯＳ陽性であるＦＯＸＰ３陽性細胞の割合、および
    １００細胞／ｍｍ２より高い、ＩＣＯＳ陽性細胞の密度
    を含むことが決定されている、請求項３０に記載の方法、または請求項３１に記載の使用のための剤。
  34. 患者においてがん性固形腫瘍を処置する方法における使用のための抗ＩＣＯＳおよび／または抗ＴＲｅｇ免疫療法剤であって、方法は、
    請求項２６において定義されるように患者の処置のために抗ＩＣＯＳおよび／または抗ＴＲｅｇ免疫療法剤を選択すること、ならびに
    抗ＩＣＯＳおよび／または抗ＴＲｅｇ免疫療法剤を患者に投与すること
    を含む、前記使用のための剤。
  35. がん性固形腫瘍のための抗ＩＣＯＳおよび／または抗ＴＲｅｇ免疫療法剤に対する患者の応答をモニターする方法であって、
    抗ＩＣＯＳおよび／または抗ＴＲｅｇ免疫療法剤を与えられた患者から得られた腫瘍コア組織のサンプルを提供すること、
    前記サンプルにおいて以下のバイオマーカー：
    （ｉ）ＩＣＯＳ単一陽性細胞の総数に対するＩＣＯＳ単一陽性細胞の周囲の定義された影響半径内のＩＣＯＳ ＦＯＸＰ３二重陽性細胞の数の比、
    （ｉｉ）各々のＩＣＯＳ陽性ＦＯＸＰ３陰性細胞とその最も近いＩＣＯＳ ＦＯＸＰ３二重陽性細胞との間の平均距離、
    （ｉｉｉ）ＩＣＯＳ陽性であるＦＯＸＰ３陽性細胞の割合、および
    （ｉｖ）ＩＣＯＳ陽性細胞の密度
    のうちの１つまたはそれ以上を決定すること、
    前記サンプル中の前記１つまたはそれ以上のバイオマーカーを、前記免疫療法剤の投与の前に患者から得られた腫瘍コア組織のサンプル中の同じ１つまたはそれ以上のバイオマーカーと比較すること、ならびに
    変化が前記１つまたはそれ以上のバイオマーカーにおいて起こったかどうかを決定し、それにより、患者が免疫療法剤に応答しているかどうかを評価することを含み、応答は、前記免疫療法剤の投与の前のサンプルからの以下の変化：
    ＩＣＯＳ単一陽性細胞の総数に対するＩＣＯＳ単一陽性細胞の周囲の定義された影響半径内のＩＣＯＳ ＦＯＸＰ３二重陽性細胞の数の比における低減、
    各々のＩＣＯＳ陽性ＦＯＸＰ３陰性細胞とその最も近いＩＣＯＳ ＦＯＸＰ３二重陽性細胞との間の平均距離における増加、
    ＩＣＯＳ陽性であるＦＯＸＰ３陽性細胞の割合における低減、および／または
    ＩＣＯＳ陽性細胞の密度における低減
    のうちの１つまたはそれ以上により指し示される、前記方法。
  36. 療法の前と比較して、ＩＣＯＳ単一陽性細胞の総数に対するＩＣＯＳ単一陽性細胞の周囲の定義された影響半径内のＩＣＯＳ ＦＯＸＰ３二重陽性細胞の数の比における低減を測定すること、ならびに
    患者のために抗ＩＣＯＳおよび／または抗ＴＲｅｇ免疫療法剤での継続された処置を処方すること
    を含む、請求項３５に記載の方法。
  37. 各々のＩＣＯＳ陽性ＦＯＸＰ３陰性細胞とその最も近いＩＣＯＳ ＦＯＸＰ３二重陽性細胞との間の平均距離における増加を測定すること、ならびに
    患者のために抗ＩＣＯＳおよび／または抗ＴＲｅｇ免疫療法剤での継続された処置を処方すること
    を含む、請求項３５または請求項３６に記載の方法。
  38. ＩＣＯＳ陽性であるＦＯＸＰ３陽性細胞の割合における低減を測定すること、ならびに
    患者のために抗ＩＣＯＳおよび／または抗ＴＲｅｇ免疫療法剤での継続された処置を処方すること
    を含む、請求項３５～３７のいずれか１項に記載の方法。
  39. ＩＣＯＳ陽性細胞の密度における低減を測定すること、ならびに
    患者のために抗ＩＣＯＳおよび／または抗ＴＲｅｇ免疫療法剤での継続された処置を処方すること
    を含む、請求項３５～３８のいずれか１項に記載の方法。
  40. がん性固形腫瘍のための抗ＩＣＯＳおよび／または抗ＴＲｅｇ免疫療法剤に対する患者の応答をモニターするためのバイオマーカーの使用であって、バイオマーカーは、患者からの腫瘍コア組織において決定される以下：
    （ｉ）ＩＣＯＳ単一陽性細胞の総数に対するＩＣＯＳ単一陽性細胞の周囲の定義された影響半径内のＩＣＯＳ ＦＯＸＰ３二重陽性細胞の数の比、
    （ｉｉ）各々のＩＣＯＳ陽性ＦＯＸＰ３陰性細胞とその最も近いＩＣＯＳ ＦＯＸＰ３二重陽性細胞との間の平均距離、
    （ｉｉｉ）ＩＣＯＳ陽性であるＦＯＸＰ３陽性細胞の割合、および
    （ｉｖ）ＩＣＯＳ陽性細胞の密度
    のうちの１つまたはそれ以上であり、
    免疫療法剤に対する応答は、免疫療法剤の投与の前に得られた腫瘍コア組織のサンプルと比較して以下の変化：
    ＩＣＯＳ単一陽性細胞の総数に対するＩＣＯＳ単一陽性細胞の周囲の定義された影響半径内のＩＣＯＳ ＦＯＸＰ３二重陽性細胞の数の比における低減、
    各々のＩＣＯＳ陽性ＦＯＸＰ３陰性細胞とその最も近いＩＣＯＳ ＦＯＸＰ３二重陽性細胞との間の平均距離における増加、
    ＩＣＯＳ陽性であるＦＯＸＰ３陽性細胞の割合における低減、および
    ＩＣＯＳ陽性細胞の密度における低減
    のうちの１つまたはそれ以上により指し示される、前記使用。
  41. がん性固形腫瘍を有する患者を、患者の予測される予後または抗ＩＣＯＳおよび／もしくは抗ＴＲｅｇ免疫療法剤に対する予測される応答にしたがって分類するための参照値を同定する方法であって、
    疾患アウトカムが既知であるか、または抗ＩＣＯＳおよび／もしくは抗ＴＲｅｇ免疫療法剤に対する応答が既知である同じタイプのがん性固形腫瘍を有する患者の集団の各々から得られた腫瘍コア組織のサンプルを提供すること、
    前記サンプルの各々における以下のバイオマーカー：
    （ｉ）ＩＣＯＳ単一陽性細胞の総数に対するＩＣＯＳ単一陽性細胞の周囲の定義された影響半径内のＩＣＯＳ ＦＯＸＰ３二重陽性細胞の数の比、
    （ｉｉ）各々のＩＣＯＳ陽性ＦＯＸＰ３陰性細胞とその最も近いＩＣＯＳ ＦＯＸＰ３二重陽性細胞との間の平均距離、
    （ｉｉｉ）ＩＣＯＳ陽性であるＦＯＸＰ３陽性細胞の割合、および
    （ｉｖ）ＩＣＯＳ陽性細胞の密度
    のうちの１つまたはそれ以上を決定すること、
    前記１つまたはそれ以上のバイオマーカーの各々についてのデータを、各々の患者における疾患アウトカムまたは抗ＩＣＯＳおよび／もしくは抗ＴＲｅｇ免疫療法剤に対する応答についてのデータとペア化すること、ならびに
    前記１つまたはそれ以上のバイオマーカーの各々についてのデータをグループ分けして、疾患アウトカムまたは抗ＩＣＯＳおよび／もしくは抗ＴＲｅｇ免疫療法剤に対する応答についての統計的に有意なデータの２つの群を定義する数値的カットオフを同定することであって、
    前記カットオフは、同じタイプのがん性固形腫瘍を有する患者を、患者の予測される予後または抗ＩＣＯＳおよび／もしくは抗ＴＲｅｇ免疫療法剤に対する予測される応答にしたがって分類するための参照値を表すこと
    を含む、前記方法。
  42. サンプルは、肝臓がん、腎臓細胞がん、頭頸部がん、黒色腫、非小細胞肺がん、膀胱がん、卵巣がん、子宮頸がん、胃がん、膵臓がん、乳がん（トリプルネガティブ乳がんを包含する）、癌腫、平滑筋肉腫、肛門がん、扁平上皮細胞がんおよび食道がんを有する患者の集団から得られる、請求項４１に記載の方法。
  43. サンプルは、肝細胞癌を有する患者の集団から得られる、請求項４２に記載の方法。
  44. 免疫療法剤は抗ＩＣＯＳ抗体である、請求項１６～４３のいずれか１項に記載の方法、使用または使用のための免疫療法剤。
  45. 免疫療法剤はＴＲｅｇを選択的に枯渇させるかまたは阻害する、請求項１６～４４のいずれか１項に記載の方法、使用または使用のための免疫療法剤。
  46. 免疫療法剤は、ＴＲｅｇに結合して細胞エフェクター機能を媒介する抗体である、請求項１６～４５のいずれか１項に記載の方法、使用または使用のための免疫療法剤。
  47. 抗体は、細胞エフェクター機能を媒介するＦｃ領域を含むＩｇＧである、請求項４６に記載の方法、使用または使用のための免疫療法剤。
  48. 免疫療法剤は、ＩＣＯＳ、ＣＤ２５、ＣＣＲ８、ＣＴＬＡ－４、ＧＩＴＲまたはＦＯＸＰ３のＭＨＣ提示エピトープに結合する抗体である、請求項４５～４７のいずれか１項に記載の方法、使用または使用のための免疫療法剤。
  49. 抗体はＩＣＯＳに結合する、請求項４８に記載の方法、使用または使用のための免疫療法剤。
  50. １つまたはそれ以上のバイオマーカーはＩＣＯＳ陽性細胞の密度を含む、請求項４４または請求項４９に記載の方法、使用または使用のための免疫療法剤。
  51. 抗体は、ＫＹ１０４４のＣＤＲを含むＩＣＯＳ結合部位を含み、
    ＨＣＤＲ１は配列番号１であり、
    ＨＣＤＲ２は配列番号２であり、
    ＨＣＤＲ３は配列番号３であり、
    ＬＣＤＲ１は配列番号８であり、
    ＬＣＤＲ２は配列番号９であり、
    ＬＣＤＲ３は配列番号１０である、請求項４９または請求項５０に記載の方法、使用または使用のための免疫療法剤。
  52. 抗体は、配列番号５のＫＹ１０４４ ＶＨドメインに対して少なくとも９０％同一のＶＨドメインアミノ酸配列および配列番号１２のＫＹ１０４４ ＶＬドメインに対して少なくとも９０％同一のＶＬドメインアミノ酸配列を含む、請求項４９～５１のいずれか１項に記載の方法、使用または使用のための免疫療法剤。
  53. 抗体は、配列番号５のＫＹ１０４４ ＶＨドメインおよび配列番号１２のＫＹ１０４４ ＶＬドメインを含む、請求項５２に記載の方法、使用または使用のための免疫療法剤。
  54. 抗体は、配列番号７のＫＹ１０４４重鎖および配列番号１４のＫＹ１０４４軽鎖を含むヒトＩｇＧ１κである、請求項５３に記載の方法、使用または使用のための免疫療法剤。
  55. 抗体は、ＣＤ２５、ＣＣＲ８、ＣＴＬＡ－４、ＧＩＴＲまたはＦＯＸＰ３のＭＨＣ提示エピトープに結合する、請求項４８に記載の方法、使用または使用のための免疫療法剤。
  56. １つまたはそれ以上のバイオマーカーは、ＩＣＯＳ単一陽性細胞の総数に対するＩＣＯＳ単一陽性細胞の周囲の定義された影響半径内のＩＣＯＳ ＦＯＸＰ３二重陽性細胞の数の比、各々のＩＣＯＳ陽性ＦＯＸＰ３陰性細胞とその最も近いＩＣＯＳ ＦＯＸＰ３二重陽性細胞との間の平均距離、および／またはＩＣＯＳ陽性であるＦＯＸＰ３陽性細胞の割合を含む、請求項５５に記載の方法、使用または使用のための免疫療法剤。
  57. 疾患予後または抗ＩＣＯＳおよび／もしくは抗ＴＲｅｇ免疫療法剤での処置に対する応答についてのバイオマーカーとしての、ＴＭＥにおけるＩＣＯＳおよび／またはＦＯＸＰ３を発現する免疫細胞の空間的構成の使用。
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