JP2024514586A - 免疫チェックポイント阻害剤を用いたがんの治療方法｛Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｔｒｅａｔｉｎｇ Ｃａｎｃｅｒ Ｕｓｉｎｇ Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ｝ - Google Patents
免疫チェックポイント阻害剤を用いたがんの治療方法｛Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｔｒｅａｔｉｎｇ Ｃａｎｃｅｒ Ｕｓｉｎｇ Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ｝ Download PDFInfo
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Abstract
本発明は、免疫チェックポイント阻害剤を用いたがんの治療方法に関し、より具体的には、血液から分離された循環腫瘍細胞から免疫チェックポイントタンパク質及びリンパ系または骨髄系細胞特異的タンパク質の発現を確認し、免疫チェックポイントタンパク質の発現が陽性であり、リンパ系または骨髄系細胞特異的タンパク質の発現が陽性と確認される患者を免疫抗がん剤が適用可能な患者として選別し、前記患者に免疫チェックポイント阻害剤を投与してがんを治療する方法に関する。本発明による循環腫瘍細胞を用いたがんの治療方法は、液体生検で免疫チェックポイントタンパク質とリンパ系または骨髄系細胞特異的タンパク質の発現を同時に確認して患者を選別するため、組織検査との一致度が顕著に優れ、商業的活用度が高いため、本発明の方法はがんの診断及び治療に有用である。
Description
本発明は、免疫チェックポイント阻害剤を用いたがんの治療方法に関し、より具体的には、血液から分離された循環腫瘍細胞から免疫チェックポイントタンパク質及びリンパ系または骨髄系細胞特異的タンパク質の発現を確認し、免疫チェックポイントタンパク質の発現が陽性であり、リンパ系または骨髄系細胞特異的タンパク質の発現が陽性と確認される患者を免疫抗がん剤が適用可能な患者として選別し、前記患者に免疫チェックポイント阻害剤を投与してがんを治療する方法に関する。
がんは、人間の健康に最も致命的な脅威のうちの一つである。米国においてがんは、毎年約130万人の新規患者に影響を及ぼし、心臓病に次いで二番目の主要な死亡原因であり、4人のうち1人が死亡する。また、がんは、5年以内の死亡原因のうち1位で心血管疾患を凌ぐことが予想される。固形腫瘍は、このような死亡の大部分を占める。
がんを治療するための様々な方法が試されているが、患者それぞれの臨床的結果及び予後が報告されたデータと常に一致しないため、全てのがんの全体5年生存率は、過去20年間に約10%しか改善されていない。従って、がん患者の抗がん治療で治療薬物に対する反応性及び予後を事前に予測することにより、異質的な特性を有するがん患者に対して最も適切な治療法を提供し、不必要な治療に関連する毒性を避け、究極的に治療効果を高めることができるだろう。
このような必要性により、最近、患者の個人的な要因に対する体系化された分析結果を基に適切な標的抗がん剤及び治療方法を選別することができる承認された診断を意味するコンパニオン診断(Companion diagnostics)に関する研究が活発に進行されている。コンパニオン診断は、医師の診断による処方の明確な臨床的根拠を提示することができ、患者には適切な治療法を提示することができ、がんの治療効率を高めることができるだけでなく、標的抗がん剤の誤乱用を減らし、国家の健康保険財政の健全性にも寄与することができる。現在、コンパニオン診断市場は、乳がん、肺がん、大腸がん、胃がん、黒色腫等の治療分野で成長しており、特に乳がん及び肺がん分野が市場の成長を牽引することと期待されている。製薬会社の新薬開発費用節減、標的治療剤に対する需要が高まるにつれ、コンパニオン診断の世界市場は毎年高い成長率で成長している。
一方、免疫療法は、がんをその起源とは関係なく攻撃する患者自身の免疫系を用いる。免疫系は、バクテリア及びウイルスのような外部侵入者を攻撃するように進化した牽制及び均衡ネットワークによって調節される。しかし、がんは、免疫系ががん細胞を攻撃できないように阻害させるタンパク質、例えば、PD-L1及びPD-L2を発現することにより、免疫系を回避することができる。
特に、腫瘍細胞とT細胞との間の相互作用は、腫瘍細胞上の主組織適合性複合体(MHC)とT細胞上のT細胞受容体(TCR)との間の接触を含む。MHCとT細胞受容体との間の接触時、T細胞は活性化され、腫瘍細胞は破壊される。
腫瘍細胞がその表面上に免疫チェックポイントタンパク質PD-L1を発現すると、これはT細胞の免疫監視を回避することができる。PD-L1は存在時、T細胞によって発現されるPD-1に結合し、T細胞の活性化を遮断することにより、T細胞の免疫監視を阻害させる。
PD-L1／PD-1相互作用を遮断させることができる免疫チェックポイント阻害剤が開発されてきた。前記の薬物は、T細胞の免疫監視機構が再び正常に作用することができるように許容し、これにより、腫瘍細胞は対象体で正常な免疫反応によって破壊されることがある。T細胞上のCTLA-4の遮断も類似した効果を有することができる(Hodi et al., N. Engl. J. Med. Vol. 363, pp. 711-23, 2010)。
免疫チェックポイント阻害剤の効果的な使用に対する秘訣は、がんを患う特定の対象体が前記薬物に反応するかどうかを測定することである。PD-L1またはPD-1に結合し、免疫チェックポイント阻害剤として作用する抗体を、患者の腫瘍細胞がPD-L1を発現しない患者に投与した場合、治療は効果がないだろう。現在までに、このような免疫チェックポイント阻害剤の反応性は、現在までに20-30%に過ぎない実情である(Herbst RS, et al. The New England journal of medicine.Vol. 383(14), pp. 1328-39, 2020)。
PD-L1の発現率を測定する方法は、患者の組織細胞からPD-L1の腫瘍比率点数(tumor proportion score, TPS)を計算することが現在まで推奨される方法である。例えば、PD-1に特異的に作用する抗体であるペンブロリズマブ(Pembrolizumab、キイトルーダ)、ニボルマブ(Nivolumab、オプジーボ)が効果的に作動するためには、患者の組織検査でPD-L1の発現率が一定%以上検出されなければならず、健康保険給与適用になるためには、オプジーボはPD-L1 10%以上、キイトルーダは50%以上が検出されなければならず、アテゾリズマブ(Atezolizumab、テセントリク)は、腫瘍細胞と腫瘍浸潤免疫細胞の両方でPD-L1 5%以上の発現が検出されなければならない。
しかし、PD-L1発現調査のために腫瘍生検を通じてがん細胞を収得することは、患者に痛み及び不快感を与える点、単離された腫瘍部位の異常は調査することができない点、及びタンパク質の発現プロファイルが腫瘍の微細環境において時間が経過するとともに変化することがある潜在性を有する点をはじめ、深刻な欠点を有する。さらに、再生検(re-biopsy)もやはり侵襲性及びその他の複雑な問題を引き起こす。また、それぞれの免疫チェックポイント阻害剤の患者判別基準が互いに異なるため、患者に最も効果的な治療法を選択するのに大きな困難が伴うのが実状である。
このような欠点を克服するために、循環腫瘍細胞(circulating tumor cell, CTC)、循環無細胞核酸(circulating cell free DNA, cfDNA)及びエクソソームを含む液体生検が最近新しい解決策として注目されている(Rijavec E, et al., Cancers. Vol. 12(1):17, 2020)。血液基盤の生検は、腫瘍によって剥離されるか、または他に分離された細胞を実時間で順次的に追跡することができるという点で、組織生検よりも改善されたものである。
血液サンプルはより容易に収得することができ、患者からより頻繁に収得することができる。さらに、タンパク質の発現プロファイルの変化を時間経過に伴いモニタリングすることができる。循環腫瘍細胞(CTC)は、末梢血液から容易に単離することができ、組織生検から収得された腫瘍細胞に対する代替物として使用することができるがん関連細胞類型のうちの一つである。CTCは、固形腫瘍から血流内に分離された腫瘍細胞である。CTCは、がん腫、肉腫、神経芽細胞腫及び黒色腫の患者の血液から発見されることがある。血液基盤の生検から収得することができる追加の細胞類型を確認することが、免疫チェックポイント阻害剤を用いる治療が役立つがん患者を確認する前記技術の用途をさらに開発する上で重要である。
このような技術背景下に、本発明者らは、CTC基盤のがんの治療方法を開発するために鋭意努力した結果、免疫チェックポイントタンパク質とリンパ系または免疫系細胞特異的タンパク質の発現を同時に確認し、免疫チェックポイントタンパク質の発現が陽性であり、リンパ系または免疫系細胞特異的タンパク質の発現が陽性である患者に免疫チェックポイント阻害剤を投与する場合、組織検査を行わなくても組織検査と同じレベルのがんの治療効果が現れることを確認し、本発明を完成した。
本発明の目的は、免疫チェックポイント阻害剤の適用のための患者選別方法を提供することである。
本発明の他の目的は、がんの治療方法を提供することである。
本発明のもう一つの目的は、免疫チェックポイント阻害剤に対する感受性決定方法を提供することである。
本発明のもう一つの目的は、がん患者の免疫抗がん療法の選択方法を提供することである。
本発明の他の目的は、がんの治療方法を提供することである。
本発明のもう一つの目的は、免疫チェックポイント阻害剤に対する感受性決定方法を提供することである。
本発明のもう一つの目的は、がん患者の免疫抗がん療法の選択方法を提供することである。
前記目的を達成するために、本発明は(a)分離された血中循環がん細胞から免疫チェックポイントタンパク質及びリンパ系または骨髄系特異的タンパク質の発現を確認する段階；及び(b)免疫チェックポイントタンパク質の発現が陽性であり、リンパ系または骨髄系特異的タンパク質の発現が陽性と確認される患者を免疫抗がん剤を適用することができる患者として分類する段階を含む免疫抗がん剤の適用のための患者選別方法を提供する。
本発明はまた、
(a)分離された血中循環がん細胞から免疫チェックポイントタンパク質及びリンパ系または骨髄系特異的タンパク質の発現を確認する段階；及び(b)免疫チェックポイントタンパク質の発現が陽性であり、リンパ系または骨髄系特異的タンパク質の発現が陽性と確認される患者に免疫チェックポイント阻害剤を投与する段階を含むがんの治療方法を提供する。
(a)分離された血中循環がん細胞から免疫チェックポイントタンパク質及びリンパ系または骨髄系特異的タンパク質の発現を確認する段階；及び(b)免疫チェックポイントタンパク質の発現が陽性であり、リンパ系または骨髄系特異的タンパク質の発現が陽性と確認される患者に免疫チェックポイント阻害剤を投与する段階を含むがんの治療方法を提供する。
本発明はまた、
(a)分離された血中循環がん細胞から免疫チェックポイントタンパク質及びリンパ系または骨髄系特異的タンパク質の発現を確認する段階；及び(b)免疫チェックポイントタンパク質の発現が陽性であり、リンパ系または骨髄系特異的タンパク質の発現が陽性と確認される場合、免疫チェックポイント阻害剤に対する感受性があることと決定する段階を含む免疫チェックポイント阻害剤に対する感受性(susceptibility)決定方法を提供する。
(a)分離された血中循環がん細胞から免疫チェックポイントタンパク質及びリンパ系または骨髄系特異的タンパク質の発現を確認する段階；及び(b)免疫チェックポイントタンパク質の発現が陽性であり、リンパ系または骨髄系特異的タンパク質の発現が陽性と確認される場合、免疫チェックポイント阻害剤に対する感受性があることと決定する段階を含む免疫チェックポイント阻害剤に対する感受性(susceptibility)決定方法を提供する。
本発明はまた、
(a)分離された血中循環がん細胞から免疫チェックポイントタンパク質及びリンパ系または骨髄系特異的タンパク質の発現を確認する段階；及び(b)免疫チェックポイントタンパク質の発現が陽性であり、リンパ系または骨髄系特異的タンパク質の発現が陽性と確認される場合、免疫チェックポイント阻害剤を治療療法として選択する段階を含むがん患者の免疫抗がん療法の選択方法を提供する。
(a)分離された血中循環がん細胞から免疫チェックポイントタンパク質及びリンパ系または骨髄系特異的タンパク質の発現を確認する段階；及び(b)免疫チェックポイントタンパク質の発現が陽性であり、リンパ系または骨髄系特異的タンパク質の発現が陽性と確認される場合、免疫チェックポイント阻害剤を治療療法として選択する段階を含むがん患者の免疫抗がん療法の選択方法を提供する。
本発明はまた、
免疫チェックポイントタンパク質の発現が陽性であり、リンパ系または骨髄系特異的タンパク質の発現が陽性である個体を治療するための免疫チェックポイント阻害剤を含むがんの治療用薬学組成物を提供する。
免疫チェックポイントタンパク質の発現が陽性であり、リンパ系または骨髄系特異的タンパク質の発現が陽性である個体を治療するための免疫チェックポイント阻害剤を含むがんの治療用薬学組成物を提供する。
本発明はまた、免疫チェックポイントタンパク質の発現が陽性であり、リンパ系または骨髄系特異的タンパク質の発現が陽性である個体を治療するための治療用薬剤の製造のための免疫チェックポイント阻害剤の用途を提供する。
他に定義されない限り、本明細書で使用された全ての技術的及び科学的用語は、本発明が属する技術分野における熟練した専門家により通常理解されるものと同じ意味を有する。一般的に、本明細書で使用された命名法及び以下に記述する実験方法は、当該技術分野において周知であり、通常使用されるものである。
第1、第2、A、B等の用語は、様々な構成要素を説明するために使用することができるが、当該構成要素は、前記用語によって限定されず、単に一つの構成要素を他の構成要素から区別する目的でのみ使用される。例えば、以下に説明する技術の権利範囲を逸脱することなく、第1構成要素は第2構成要素と命名することができ、類似に第2構成要素も第1構成要素と命名することができる。及び／またはという用語は、複数の関連し記載された項目の組み合わせまたは複数の関連し記載された項目のうちいずれかの項目を含む。
本明細書で使用される用語において、単数の表現は、文脈上明らかに異なって解釈されない限り、複数の表現を含むものと理解されなければならず、「含む」等の用語は、説示された特徴、個数、段階、動作、構成要素、部分品またはこれらを組み合わせたものが存在することを意味するものであり、一つまたはそれ以上の他の特徴や個数、段階、動作、構成要素、部分品またはこれらを組み合わせたものの存在または付加可能性を排除しないものと理解されなければならない。
また、方法または動作方法を行うにあたり、前記方法を構成する各過程は、文脈上明らかに特定の順序を記載しない限り、明記された順序と異なって行われることがある。すなわち、各過程は、明記された順序と同じく行われることもあり、実質的に同時に行われることもあり、反対の順序で行われることもある。
本発明において、用語「抗体」は、最も広い意味で使用され、所望の抗原－結合活性を示す限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体(例えば、二重特異性抗体)及び抗体断片を非制限的に含み、様々な抗体構造を含む。
本発明において、用語「バイオマーカー」は、サンプルから検出することができる指標を指称する。バイオマーカーは、特定分子、病理的、組織学的及び／または臨床的特徴を特徴とする、疾患または障害(例えば、がん)の予測、診断及び／または予後の指標として作用することができる。
本発明において、用語「がん」及び「がん性」は、典型的に調節できない細胞成長を特徴とする哺乳動物の生理的病態を指称するか、説明する。がんの例は、がん腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫及び白血病またはリンパ様悪性腫瘍を非制限的に含む。このようながんのより具体的な例は、小細胞肺がん、非－小細胞肺がん、肺腺がん腫及び肺の扁平上皮がん腫を含む肺がん；膀胱がん(例えば、尿路上皮膀胱がん(UBC)、筋層浸潤性膀胱がん(MIBC)及びBCG－不応性非－筋層浸潤性膀胱がん(NMIBC))；腎臓または腎臓がん(例えば、腎細胞がん腫(RCC))；尿路がん；乳がん(例えば、エストロゲン受容体(ER-)、プロゲステロン受容体(PR-)及びHER2(HER2-)陰性であるHER2+乳がん及びトリプル－ネガティブ乳がん(TNBC))；去勢－抵抗性前立腺がん(CRPC)のような前立腺がん；腹膜がん；肝細胞がん；胃腸がん及び胃腸基質がんを含む胃または胃がん；膵臓がん；膠芽細胞腫；子宮頸がん；卵巣がん；肝臓がん；肝腫瘍；結腸がん；直腸がん；結腸直腸がん；子宮内膜または子宮がん腫；唾液腺がん腫；前立腺がん；外陰部がん；甲状腺がん；肝がん腫；肛門がん腫；陰茎がん腫；表在拡大型黒色腫、悪性黒子型黒色腫、末端黒子型黒色腫、及び結節型黒色腫を含む黒色腫；多発性骨髄腫及びB－細胞リンパ腫(低悪性度／濾胞性非－ホジキンリンパ腫(NHL)を含む；小リンパ球性(SL)NHL；中悪性度／濾胞性NHL；中悪性度びまん性NHL；高悪性度免疫芽球性NHL；高悪性度リンパ芽球性NHL；高悪性度の小さな非－切除細胞NHL；巨大疾患NHL；マントル細胞リンパ腫；AIDS－関連したリンパ腫；及びワルデンシュトレームマクログロブリン血症を含む)；慢性リンパ性白血病(CLL)；急性リンパ芽球性白血病(ALL)；急性骨髄性白血病(AML)；ヘアリー細胞白血病；慢性骨髄性白血病(CML)；移植後リンパ増殖性疾患(PTLD)；及び骨髄異形成症候群(MDS)、だけでなく、母斑症、浮腫(例えば、脳腫瘍関連)、メイグス症候群、脳腫瘍、頭頸部がん及び関連転移に関連する非正常血管増殖を非制限的に含む。
本発明において、用語「治療する」及び「治療」という用語は、その一般的で、通常の意味を有し、これは、対象体から腫瘍またはがんを完全にまたは部分的に除去すること、対象体から腫瘍のサイズを縮小させること、対象体から腫瘍またはがん細胞を死滅させること、及び対象体からがんまたは腫瘍の症状を好転させることのうち一つ以上のものを含む。治療は、免疫チェックポイント阻害剤を投与されていない対象体に対して、約1％～約100％程度除去、縮小、死滅または好転させることを意味する。望ましくは、除去、縮小、死滅または好転させるのは、約100％、約99％、約98％、約97％、約96％、約95％、約90％、約80％、約70％、約60％、約50％、約40％、約30％、約20％、約10％、約5％または約1％である。治療結果は、永久的であり得るか、または数日(例えば、1、2、3、4、5、6または7日)、数週(例えば、1、2、3または4週)、数ヶ月(例えば、1、2、3、4、5、6ヶ月以上)または数年(例えば、1、2、3、4、5、6年以上)の期間にわたって継続進行することができる。
本発明において、用語「阻害させる」、「阻害する」及び「阻害」という用語は、その一般的で、通常の意味を有し、これは、がんまたは腫瘍の確立、がんまたは腫瘍の発生、がんまたは腫瘍の成長及び転移を妨害するか、その進行を遅延させるか、遮断するか、阻止するか、または制止させることのうち一つ以上のものを含む。阻害とは、免疫チェックポイント阻害剤を投与されていない対象体に対して、約1％～約100％程度妨害することを意味する。望ましくは、妨害は、約100％、約99％、約98％、約97％、約96％、約95％、約90％、約80％、約70％、約60％、約50％、約40％、約30％、約20％、約10％、約5％または約1％である。阻害方法は、がんまたは腫瘍の臨床的症状が発症する以前に、それと同時に、またはその以後に対象体で行うことができる。従って、対象体は、がんまたは腫瘍を患う対象体であり得るか、または単にがんまたは腫瘍が発生しやすい対象体であり得る。阻害の結果は、永久的であり得るか、または数日(例えば、1、2、3、4、5、6または7日)、数週(例えば、1、2、3または4週)、数ヶ月(例えば、1、2、3、4、5、6ヶ月以上)または数年(例えば、1、2、3、4、5、6年以上)の期間にわたって継続進行することができる。
本発明において、用語「投与」は、投与量の化合物または組成物を提供する方法を意味する。本明細書に記載された方法に使用される化合物及び／または組成物は、例えば、静脈内に(例えば、静脈内注入によって)、皮下に、筋肉内に、真皮内に、経皮に、動脈内に、腹腔内に、病巣内に、頭蓋内に、関節内に、前立腺内に、肋膜内に、気管内に、鼻腔内に、硝子体内に、膣内に、直腸内に、局所的に、腫瘍内に、腹膜内に、結膜下に、膀胱内に、粘膜に、心膜内に、臍帯内に、眼球内に、経口に、吸入によって、注射で、注入によって、連続的注入によって、標的細胞を直接洗浄(bath)する局所化された灌流によって、カテーテルによって、洗浄によって、クリームで、または脂質組成物で投与することができる。投与方法は、様々な因子(例えば、投与される化合物または組成物及び治療される病態、疾患または障害の重症度)によって異なる場合がある。
免疫チェックポイント阻害剤、及び免疫チェックポイント阻害剤を含む製薬製剤は、考慮すべきいくつかの因子を例に挙げると、方法の特定の目的または目標；対象体の年齢及びサイズ；及び対象体の一般的な健康状態に依存して、対象体に異なるスケジュールで投与することができる。一般的に、免疫チェックポイント阻害剤及び製薬製剤は、治療または阻害過程の間にわたり、1回、または2回、3回、4回、5回、6回以上投与することができる。投薬スケジュールにおける各投薬の間のタイミングは、数日、数週、数ヶ月または数年の範囲であってもよく、毎1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30週以上の期間ごとに1回投与することを含む。投薬スケジュールの毎回の投薬時に同じ定量の免疫チェックポイント阻害剤を投与することができ、また毎回の投薬時の量は異なる場合がある。投薬スケジュールにおいて、各投薬時の免疫チェックポイント阻害剤のアイデンティティもまた異なる場合があり、また同じ状態に維持する場合がある。
本発明のそれぞれの方法において、免疫チェックポイント阻害剤、または免疫チェックポイント阻害剤を含む製薬製剤は、「治療学上の有効な量」で対象体に投与される。治療学上の有効な量は、対象体ごとに異なる。しかし、治療学上の有効な量は、本方法の目標または目的が阻害させようとするものであろうと、または治療しようとするものであろうと、それに関係なく、それを達成するために十分な量である。例として、本発明の方法において使用される免疫チェックポイント阻害剤の治療学上の有効な量は、典型的には、ペプチドを投与される対象体の体重1kgあたり免疫チェックポイント阻害剤が約0.1μg～約10,000μgである。治療学上の有効な量はまた、対象体の体重1kgあたり免疫チェックポイント阻害剤が約0．5μg～約5,000μg、約1μg～約500μg、約10μg～約200μg、約1μg～約800μg、約10μg～約1,000μg、約50μg～約5,000μg、約50μg～約500μg、約100μg～約1,000μg、約250μg～約2,500μg、約500μg～約2,000μg、約10μg～約800μg、約1μg～約300μg、及び約10μg～約300μgを含む。
末期がん患者のように状態が危篤な患者は、EGFR、ALK、ROS1等の特定の遺伝子検査によって標的抗がん剤治療が可能であるが、1年程度標的抗がん剤を服用すると、薬剤耐性が発生する可能性もあり、また、腫瘍も小さくなり、がんの周辺に線維化が発生し、組織検査を施行しても、がん細胞を採取することができない場合が多く発生する。それだけでなく、末期がん患者は手術ができず、反復的な組織検査も難しい場合が多く、免疫抗がん剤を処方するための組織検査または処方後の治療反応性をモニタリングすることも難しいのが実情である。
本発明においては、このような組織検査を行うことが困難な患者において、血液検査だけで組織検査と同じ診断効果を示すことができるバイオマーカーを開発し、その結果、免疫チェックポイントタンパク質及びリンパ系または骨髄系特異的タンパク質の発現を同時に確認する場合、免疫抗がん療法を高い正確度で選択することができることを確認した。
すなわち、本発明の一実施例においては、分離された血液から分離したCTCをPD-L1及びCD18抗体で染色し、これらの発現量を確認する場合、PD-L1の発現のみを確認する方法に比べ、組織検査結果と同じ結果が現れる比率が画期的に増加することを確認した(図1、図2)。
従って、本発明は一観点から、
次の段階を含む免疫抗がん剤の適用のための患者選別方法に関する：
(a)分離された血中循環がん細胞から免疫チェックポイントタンパク質及びリンパ系または骨髄系特異的タンパク質の発現を確認する段階；及び
(b)免疫チェックポイントタンパク質の発現が陽性であり、リンパ系または骨髄系特異的タンパク質の発現が陽性と確認される患者を免疫抗がん剤を適用することができる患者に分類する段階。
次の段階を含む免疫抗がん剤の適用のための患者選別方法に関する：
(a)分離された血中循環がん細胞から免疫チェックポイントタンパク質及びリンパ系または骨髄系特異的タンパク質の発現を確認する段階；及び
(b)免疫チェックポイントタンパク質の発現が陽性であり、リンパ系または骨髄系特異的タンパク質の発現が陽性と確認される患者を免疫抗がん剤を適用することができる患者に分類する段階。
本発明において、前記タンパク質の発現が「陽性」という意味は、血中循環がん細胞において当該タンパク質の存在が、通常の技術者に知られる様々な方法で確認されることを意味し、望ましくは、蛍光強度で確認することができるが、これに限定されない。
本発明において、前記タンパク質の発現を陽性と判断することは、前記タンパク質がそれぞれまたは全て発現する細胞の数、各タンパク質別の発現の強度(蛍光の強さ)を考慮して、特定の基準値(cut-off value)を基準に判断するか、基準母集団と比較して発現量が高いか低いかによって判断することができるが、これに限定されない。
本発明において、前記タンパク質の発現が「陰性」という意味は、血中循環がん細胞において当該タンパク質の存在が、通常の技術者に知られる様々な方法で確認されないことを意味し、望ましくは、蛍光強度で確認することができるが、これに限定されない。
本発明において、前記タンパク質の発現を陰性と判断することは、前記タンパク質がそれぞれまたは全て発現しない細胞の数、各タンパク質別の発現の強度(蛍光の強さ)を考慮して、特定の基準値(cut-off value)を基準に判断するか、基準母集団と比較して発現量が高いか低いかによって判断することができるが、これに限定されない。
本発明において、前記免疫チェックポイントタンパク質は、免疫チェックポイント関連シグナル伝達経路に関与するタンパク質であれば、制限なく使用することができ、望ましくは、CD27、CD28、CD40、CD122、CD137、OX40、GITR、ICOS、A2AR、B7-H3、BY-H4、CTLA-4、IDO、KIR、LAG3、NOX2、PD-1、PD-L1、TIM-3、VISTA及びSIGLEC7からなる群から選択してもよく、より望ましくは、PD-1、PD-L1及びCTLA-4からなる群から選択してもよく、最も望ましくは、PD-L1であってもよいが、これらに限定されない。
本発明において、前記リンパ系または骨髄系特異的タンパク質は、リンパ系または骨髄系細胞で発現するタンパク質であれば、制限なく使用することができ、望ましくは、CD18、CD29、CD61、CD104、ITGB5、ITGB6、ITGB7、ITGB8、CD49a、CD49b、CD49c、CD49d、CD49e、CD49f、ITGA7、ITGA8、ITGA9、ITGA10、ITGA11、CD11D、CD103、CD11a、CD11b、CD51、CD41、CD11c、CD64、CD32、CD16a、CD16b、CD23、CD89、FcRn、FcεRI及びFcα/μRからなる群から選択してもよく、より望ましくは、CD18、CD16、CD29、CD61、CD104、CD32、CD11b及びCD64からなる群から選択してもよく、最も望ましくは、CD18であってもよいが、これらに限定されない。
本発明において、前記分離された血中循環がん細胞は、次の段階を行って分離されることを特徴とすることができる：
(i)がん患者から血液を獲得する段階；及び
(ii)前記血液からバイオチップを用いてがん細胞を分離する段階。
(i)がん患者から血液を獲得する段階；及び
(ii)前記血液からバイオチップを用いてがん細胞を分離する段階。
本発明において、前記血中循環がん細胞(Circulating Tumor Cells, CTC)とは、悪性腫瘍患者の末梢血液で発見される腫瘍細胞を意味する。血中循環がん細胞は非常に稀であり、入手できる標本の量が非常に制限される。血中循環がん細胞の検出及び特性解析における技術は、多重逆転写定量ポリメラーゼ連鎖反応法、映像化基盤の接近法、そして微細濾過法及びマイクロチップ装置を含み、これらに局限されない。血中循環がん細胞は、液状生検検体で個別化された治療と治療後の経過観察を必然的に提供することができる腫瘍生物学的標識として作用することができる。また、血中循環がん細胞は、腫瘍の生物学的特性及び腫瘍細胞の播種を理解するための標的として使用することができるが、これに局限されない。
前記バイオチップとは、半導体のような無機物でできた固体基質に生物から由来するDNA、タンパク質、酵素、抗体、微生物、動植物細胞及び器官、神経細胞等の物質を高密度に集積化して組み合わせ、従来の半導体チップの形態で作製した混成素子であり、生体分子の固有の機能を用いて、遺伝子発現様相、遺伝子結合、タンパク質分布等の生物学的情報を得るか、生化学的工程及び反応速度または情報処理速度を高める道具や装置をいう。
前記高密度マイクロチップとは、バイオチップの作用原理に基づいて特定のサイズの物質を分離することができるバイオチップをいう。
前記高密度マイクロチップは、血液細胞のサイズ差に基づき、10分以内に約90%の回収率で血中循環がん細胞を捕捉することができる。
前記高密度マイクロチップとは、バイオチップの作用原理に基づいて特定のサイズの物質を分離することができるバイオチップをいう。
前記高密度マイクロチップは、血液細胞のサイズ差に基づき、10分以内に約90%の回収率で血中循環がん細胞を捕捉することができる。
本発明の実施例において、前記高密度マイクロチップの気孔サイズ(pore size)は、5.5～8.5μmが望ましいことがあり、より望ましくは、6.5～7.5μmであってもよい。気孔のサイズが5.5μmより小さい場合、赤血球及び白血球がチップを通過することができず、チップ上に引っかかって除去されず、気孔のサイズが8.5μmより大きい場合には、気孔のサイズが血中循環がん細胞のサイズより大きく、血中循環がん細胞がチップを通過して血中循環がん細胞を選択的に回収することができなくなる。本発明の一実施例において、前記高密度マイクロチップの気孔の形は、円形、四角形または楕円形であってもよく、望ましくは、四角形であってもよい。
本発明の一実施例において、前記高密度マイクロチップの気孔は、規則的なパターンで配列することができる。本発明の他の一実施例において、前記高密度マイクロチップは、具体的にステンレス鋼、ニッケル、アルミニウムまたは銅を素材として作製することができる。前記気孔は、メムス(MEMS, Micro-electro Mechanical Systems)技術を用いたエッチング(etching)によって形成することができる。
気孔のうち、隣接する二つの気孔との間の間隔は、血中循環がん細胞の直径より狭く形成されている。本発明の一実施例によると、二つの気孔との間の間隔は、血中循環がん細胞の直径に対して45～65％で形成することができる。前記高密度マイクロチップは、通路を流れる血液またはソリューションの圧力によって変形しない。血液は気孔を通過した後、外に排出され、血液内の血中循環がん細胞は気孔を通過することができず、表面に残留する。
非標的細胞、すなわち、血中循環がん細胞より変形率の高い赤血球は、気孔を容易に通過する。
非標的細胞、すなわち、血中循環がん細胞より変形率の高い赤血球は、気孔を容易に通過する。
血中循環がん細胞の濾過後、血中循環がん細胞は、ソリューションを逆方向または正方向に供給して外に排出させることができる。本発明の一実施例によると、ソリューションは、血中循環がん細胞の損傷を最小化することができるように逆方向に供給することができる。前記ソリューションは、注射器、シリンジポンプ、プランジャーポンプ等によって供給することができる。本発明の一実施例によると、前記ソリューションは、血液を希釈する希釈剤、水(Water)及び希釈用酸で構成することができる。前記ソリューションの供給によって外に排出される血中循環がん細胞をコンテナ(Container)、例えば、試験管、培養皿等に収去して容易に採集することができる。
一方、直径7.5～15μmの血中循環がん細胞は、約100mmHgの圧力が加わる時、直径8μmの管を通過する。直径8μmの管を通過する直径15μmの血中循環がん細胞は、約53%の変形率を有する。逆洗浄(Back washing)、すなわち、血液の流れと反対方向にソリューションを流して、直径7.5μmの血中循環がん細胞を外に排出させる時、血中循環がん細胞の変形率を考慮すると、二つの気孔との間の間隔は4μm以下が望ましい。例えば、非小細胞肺がんと乳がんは、そのがん細胞の直径が40μm程度に達することと知られている。逆洗浄時に直径40μmの血中循環がん細胞の変形率を考慮すると、二つの気孔との間の間隔は21μm以下に設定することが望ましい。直径7.5μmの血中循環がん細胞が間隔4μmを超過する二つの気孔との間に存在する時、血中循環がん細胞がソリューションの流れによって変形し、表面から脱落しないことがある。また、直径40μmのがん細胞も間隔21μmを超過する二つの気孔との間の表面から脱落しないことがある。本発明による高密度マイクロチップにおいて、ソリューションの圧力を考慮して、二つの気孔との間の間隔は、血中循環がん細胞の直径に対して45～65%で構成される。直径7.5μmの血中循環がん細胞は、間隔が65%を超過、すなわち、約4.9μmを超過する場合、逆洗浄によって二つの気孔との間の表面から脱落しないことがある。直径40μmの血中循環がん細胞は、間隔が65%を超過、すなわち、26μmを超過する場合、逆洗浄によって二つの気孔との間の表面から脱落しないことがある。二つの気孔との間の表面に付着した血中循環がん細胞を強制的に脱落させようとソリューションの圧力を高める場合、血中循環がん細胞の損傷が発生し、生きた血中循環がん細胞の採集率が低下する。直径7.5μmの血中循環がん細胞に対する間隔が45%未満、すなわち、約3.375μm未満である場合、血液とソリューションの流れによって前記高密度マイクロチップが破損する恐れが高い。
本発明の一実施例において、前記高密度マイクロチップで前記試料を繰り返し通過させることができる。具体的には、血中循環がん細胞が前記高密度マイクロチップで一度分離された後、前記分離された血中循環がん細胞をもう一度前記高密度マイクロチップにローディングして分離することができ、前記分離過程を繰り返すことができる。
本発明の一実施例において、前記高密度マイクロチップを通じた血中循環がん細胞の分離は、血中循環がん細胞が含まれる溶液を高密度マイクロチップにローディングした後、特定の人為的な圧力を加えることによって行われるのではなく、重力を用いて血中循環がん細胞の分離を行うことができる。本発明による高密度マイクロチップを通じた血中循環がん細胞分離は、血中循環がん細胞に人為的な圧力によるダメージを最小化することにより、患者の体内に存在していた状態そのままを維持させることができる。
本発明の一実施例において、前記高密度マイクロチップは、血中循環がん細胞が分離される時、前記高密度マイクロチップによる血中循環がん細胞ダメージを最小化させるか、前記高密度マイクロチップが、繰り返し使用がより効率的になるようにするため、または血中循環がん細胞の回収率をより効率的にするために、特定の物質でコーティングすることができる。前記特定の物質は、具体的には、血中循環がん細胞に特異的に結合することができる抗体になり得、細胞に物理的または化学的にダメージを与えない生体材料であれば可能である。本発明の一実施例によると、前記特定の物質は、BSA(Bovine Serum Albumin)または抗体であり得る。前記抗体は、例えば、抗上皮細胞接着分子抗体(Anti-Epithelial Cell Adhesion Molecule antibody, Anti-EpCAM antibody)、抗サイトケラチン抗体(Anti-Cytokeratin antibody, Anti-CK antibody)等で構成することができる。本発明の望ましい一実施例によると、前記特定の物質は、BSA(Bovine Serum Albumin)であり得る。
前記BSA(Bovine Serum Albumin)溶液とは、ウシ血清アルブミンをいう。分子量は約66.4 kDa程度のタンパク質であり、ほとんどの動物に多く存在するタンパク質である。BSAは生化学／生物学で細胞培養時に細胞の栄養分として添加することができ、また、タンパク質の定量で検量線を得るための標準物としても多く使われ、制限酵素を使用する時に少量の酵素(タンパク質)を使用しなければならないため、溶液内のタンパク質濃度を補完するために添加することもできる。そして、様々な生化学的実験(Western blot, Immunocytochemistry, ELISA等)で特定の抗体を検出しようとするタンパク質を付ける前に、非特異的結合(nonspecific binding)、すなわち、所望しないタンパク質あるいは所望しない位置に抗体が付着する非特異的結合を防ぐために使用することもできる。
本発明の一実施例によると、遠心分離法を用いて末梢血液を前記BSA溶液でコーティングされた高密度マイクロチップに反応させて、血中循環がん細胞を除く他の生体高分子を除去することができる。本発明の一実施例によると、前記高密度マイクロチップを用いた分離は重力で行うことができ、具体的には、大気圧1000～1020hPaで行うことができる。望ましくは、大気圧1000～1015hPaで行うことができる。より望ましくは、大気圧1000～1013hPaで行うことができる。
本発明の一実施例によると、前記BSA溶液は、前記高密度マイクロチップの上面、下面または前記気孔の内側面にコーティングすることができる。望ましくは、前記高密度マイクロチップの上面、下面及び前記気孔の内側面の全てにコーティングすることができる。
本発明の一実施例によると、前記BSA溶液コーティングは、0.05～0.15％の濃度で行うことができる。本発明の望ましい実施例によると、前記BSA溶液コーティングは、0.08～0.012％の濃度で行うことができる。
本発明の一実施例によると、前記BSA溶液コーティングは、5～15分間処理することができる。本発明の望ましい一実施例によると、前記BSA溶液コーティングは、8～12分間処理することができる。
本発明において、前記免疫チェックポイントタンパク質及びリンパ系または骨髄系特異的タンパク質の発現は、次の段階を行って確認することを特徴とすることができる：
(1)血中循環がん細胞に特異的に結合する蛍光標識；免疫チェックポイントタンパク質に特異的に結合する蛍光標識；及びリンパ系または骨髄系特異的タンパク質に特異的に結合する蛍光標識と反応させる段階；
(2)前記蛍光標識と反応させた血中循環がん細胞；免疫チェックポイントタンパク質；及びリンパ系または骨髄系特異的タンパク質を対象として、複数の波長範囲それぞれに対する光学イメージを受信する段階；
(3)前記複数の波長範囲の全体または一部の光学イメージから、前記血中循環がん細胞；免疫チェックポイントタンパク質；及びリンパ系または骨髄系特異的タンパク質に対する蛍光強度を測定し、1次フィルタリングを行う段階；
(4)前記複数の波長範囲の全体または一部の光学イメージから、前記血中循環がん細胞に対するモフォロジー(morphology)を測定し、2次フィルタリングを行う段階；及び
(5)前記複数の波長範囲それぞれに対する光学イメージのうち、全体または一部を併合した統合イメージから、前記血中循環がん細胞に対するモフォロジーを測定し、3次フィルタリングを行う段階。
(1)血中循環がん細胞に特異的に結合する蛍光標識；免疫チェックポイントタンパク質に特異的に結合する蛍光標識；及びリンパ系または骨髄系特異的タンパク質に特異的に結合する蛍光標識と反応させる段階；
(2)前記蛍光標識と反応させた血中循環がん細胞；免疫チェックポイントタンパク質；及びリンパ系または骨髄系特異的タンパク質を対象として、複数の波長範囲それぞれに対する光学イメージを受信する段階；
(3)前記複数の波長範囲の全体または一部の光学イメージから、前記血中循環がん細胞；免疫チェックポイントタンパク質；及びリンパ系または骨髄系特異的タンパク質に対する蛍光強度を測定し、1次フィルタリングを行う段階；
(4)前記複数の波長範囲の全体または一部の光学イメージから、前記血中循環がん細胞に対するモフォロジー(morphology)を測定し、2次フィルタリングを行う段階；及び
(5)前記複数の波長範囲それぞれに対する光学イメージのうち、全体または一部を併合した統合イメージから、前記血中循環がん細胞に対するモフォロジーを測定し、3次フィルタリングを行う段階。
本発明において、前記血中循環がん細胞に特異的に結合する蛍光標識は、血中循環がん細胞自体または内外部に存在する物質に特異的に結合することができる蛍光物質を意味する。本発明の一実施例によると、血中循環がん細胞を識別することができる蛍光標識は、細胞核に特異的に結合することができるか、細胞内外部に存在するタンパク質やDNA、RNA等に特異的に結合することができる。具体的には、細胞核にはDAPIが蛍光標識として使われることがあり、中間径フィラメントタンパク質であるビメンチン(vimentin)に特異的に結合する蛍光標識が使われることがあり、上皮細胞接着分子(EpCAM, epithelial cell adhesion molecule)とCK(cytokeratin)に特異的に結合する蛍光標識が使われることがあり、非標的細胞除去手段として使われるCD45に特異的に結合する蛍光標識が使われることがある。前記血中循環がん細胞に特異的に結合する蛍光標識は、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、核酸またはタンパク質で構成することができ、タンパク質でできた抗体であり得る。前記血中循環がん細胞に特異的に結合する蛍光標識は、血中循環がん細胞に特異的に結合して識別可能にする物質であれば可能である。
前記光学的イメージは、イメージングシステムによって生成することができる。本発明の一実施例によると、前記イメージングシステムは、細胞イメージングシステムであり得、前記細胞イメージングシステムは、例えば、スライドガラスのようなプラットフォーム上に染色された細胞を置き、様々な波長別に細胞を観察して撮影するシステムである。細胞イメージングシステムは、自動セルカウント(cell counting)モジュール、蛍光強度(intensity)分析モジュール、細胞学(cytology)基盤のセル分類／認識(cell classification/cognition)モジュールを含むことができる。また、使用者便宜機能として、測定(Measurement)機能、レポート(Report)自動生成機能、DB管理機能をユーザーインターフェースとして含むことができる。このような細胞イメージングシステムは、細胞、培養液、デブリス(debris)等を区別し、使用者が望む細胞を判別し計数するためのデジタル映像分析装備が含まれる。本発明の一実施例による細胞イメージングシステムは、光学的イメージから蛍光標識されたまたはマーカーが結合された標的細胞を正確に識別し計数することができる。
前記光学的イメージは、物体から反射された反射光によって撮像された光学イメージであり得る。細胞光学イメージは、細胞イメージング装置によって出力され、背景上に細胞とデブリス等が撮像されたものであり得る。この光学イメージは、特定の波長範囲それぞれに対して複数個の分割イメージをステッチ(stitching)して構成された一つのイメージファイルとして提供されるものであり得る。ここで、複数の波長範囲の光学イメージは、青色波長範囲イメージ、緑色波長範囲イメージ、及び赤色波長範囲イメージを含むことができる。青色波長範囲に対する光学イメージは、血中循環がん細胞の細胞核の判別に特に有用であり、緑色波長範囲及び赤色波長範囲に対する光学イメージは、血中循環がん細胞の細胞膜の判別に特に有用である。その他にも、様々な色(カラー)の波長範囲を用いて、特定の蛍光標識またはマーカーを識別することが可能である。
前記1次フィルタリングまたは2次フィルタリングにおいて、血中循環がん細胞、免疫チェックポイントタンパク質、リンパ系または骨髄系細胞特異的タンパク質の識別が所望のレベルで行われない場合、光学イメージデータに対するデータフィルタリングを経て、もう一度1次フィルタリングまたは2次フィルタリングを行うことも可能であり、データフィルタリングを複数回経ることも可能である。また、1次フィルタリングまたは2次フィルタリングが行われた以後には、イメージデータを保存し、これを出力することができる。
また、第1波長範囲に対する光学イメージで1次フィルタリング段階及び2次フィルタリング段階を行い、続いて第1波長範囲と異なる第2波長範囲に対する光学イメージで1次フィルタリング段階及び2次フィルタリング段階のうち一つ以上の段階をさらに行うことができる。
例えば、第1波長範囲は青色波長範囲、第2波長範囲は緑色または赤色波長範囲であり得る。この場合、青色波長範囲イメージから第1フィルタリング過程及び第2フィルタリング過程を行い、血中循環がん細胞の細胞核を判別することができる。また、緑色波長範囲イメージと赤色波長範囲イメージのうち一つ以上のイメージで第1フィルタリング過程を行い、血中循環がん細胞の細胞膜を判別することができる。このような1次及び2次フィルタリングを通じて、光学イメージから細胞を正確に識別することが可能になる。例えば、緑色及び赤色波長範囲イメージを通じて、例えば、白血球とがん細胞等の標的細胞に対する識別性が高くなる。
一方、2次フィルタリング過程では、血中循環がん細胞に対するモフォロジーを測定することになるが、ここで血中循環がん細胞に対するモフォロジーは、細胞面積(area)、細胞サイズ(diameter)、及び真円度(circularity)のうち一つ以上を含むことができる。
本発明の一実施例において、免疫チェックポイントタンパク質及びリンパ系または骨髄系細胞特異的タンパク質に対する蛍光強度測定は、免疫チェックポイントタンパク質及びリンパ系または骨髄系細胞特異的タンパク質に特異的に結合する蛍光標識から出てくる複数の波長範囲の全体または一部の光学イメージから蛍光強度を測定することによって行われ、これに対して1次フィルタリングを行うことができる。
免疫チェックポイントタンパク質及びリンパ系または骨髄系細胞特異的タンパク質以外に、血中循環がん細胞に対する蛍光強度を測定し、1次フィルタリングを行う過程をより具体的に見ると、複数の波長範囲の全体または一部の光学イメージで細胞のサイズを測定し、以後測定された細胞のサイズより予め定められた比率または量だけ大きい多角形または円で構成された領域を設定し、この領域内で細胞に対する蛍光強度を測定し、1次フィルタリングを行うことができる。
前記3次フィルタリング段階で、複数の波長範囲それぞれに対する光学イメージのうち、全体または一部を併合した統合イメージから、血中循環がん細胞に対するモフォロジーを測定し、3次フィルタリングを行う。ここで、血中循環がん細胞に対するモフォロジーは、細胞面積、細胞サイズ、及び真円度のうち一つ以上を含むことができる。
前記3次フィルタリングは、血中循環がん細胞の全体に対して行うことも可能であり、1次及び2次フィルタリングの過程で血中循環がん細胞の識別が難しかったことに対して補充的に行うことも可能である。追加識別が必要な場合には、別途のデータフィルタリングを経るか、3次フィルタリング過程を多数回経ることも可能である。
前記イメージ分析は、コンピュータプログラムによって実行することができる。このようなコンピュータプログラムは、プロセッサ、コントローラ、ALU(arithmetic logic unit)、デジタルシグナルプロセッサ(digital signal processor)、マイクロコンピュータ、FPGA(field programmable gate array)、PLU(programmable logic unit)、マイクロプロセッサ、または命令(instruction)を実行し応答することができる他のいかなる装置のように、一つ以上の汎用コンピュータまたは特殊目的コンピュータを用いて具現することができる。
本発明において、前記免疫チェックポイントタンパク質に特異的に結合する蛍光標識は、PD-1に特異的な抗体、PD-L1に特異的な抗体及びCTLA-4に特異的な抗体からなる群から選択されることを特徴とすることができるが、これらに限定されない。
本発明において、前記リンパ系または骨髄系タンパク質に特異的に結合する蛍光標識は、CD18に特異的な抗体、CD16に特異的な抗体、CD29に特異的な抗体、CD61に特異的な抗体、CD104に特異的な抗体、CD32に特異的な抗体、CD11bに特異的な抗体及びCD64に特異的な抗体からなる群から選択されることを特徴とすることができるが、これらに限定されない。
本発明において、前記免疫チェックポイント阻害剤は、免疫チェックポイントタンパク質の機能を阻害することができる物質であれば、制限なく使用することができ、タンパク質、化合物、天然物、DNA、RNA、ペプチド等であってもよく、望ましくは、抗体であってもよく、より望ましくは、モノクローナル抗体であってもよく、さらに望ましくは、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体であることを特徴とすることができる。
本発明において、前記免疫チェックポイント阻害剤は、PD-L1アンタゴニスト、PD-1アンタゴニスト、及びCTLA-4アンタゴニストからなる群から選択されるいずれか一つ以上であることを特徴とすることができるが、これらに限定されない。
本発明において、用語「PD-1アンタゴニスト」は、PD-1と一つ以上のその結合パートナー、例えば、PD-L1及び／またはPD-L2との相互作用から由来する信号形質導入を減少、遮断、阻害、廃止または妨害する分子である。一部の実施態様において、PD-1アンタゴニストは、PD-1のその結合パートナーに対する結合を阻害する分子である。具体的な態様において、PD-1アンタゴニストは、PD-1のPD-L1及び／またはPD-L2に対する結合を阻害する。例えば、PD-1アンタゴニストは、抗PD-1抗体及びこの抗原－結合フラグメント、免疫アドへシン、融合タンパク質、オリゴペプチド、小分子アンタゴニスト、ポリヌクレオチドアンタゴニスト及びPD-1とPD-L1及び／またはPD-L2との相互作用から由来する信号形質導入を減少、遮断、阻害、廃止または妨害する他の分子を含む。一実施態様において、PD-1アンタゴニストは、機能異常のT－細胞が機能異常でなくなるように、PD-1またはPD-L1を通じたシグナル伝達を媒介するTリンパ球及び他の細胞上で発現される細胞表面タンパク質によってまたは細胞表面タンパク質を通じて媒介される陰性シグナルを減少させる。一部の実施態様において、PD-1アンタゴニストは、抗－PD-1抗体である。
本発明において、用語「PD-L1アンタゴニスト」は、PD-L1と一つ以上のその結合パートナー、例えば、PD-1またはB7-1との相互作用による信号形質導入を減少、遮断、阻害、廃止または妨害する分子を指称する。一部の実施態様において、PD-L1アンタゴニストは、PD-L1のその結合パートナーに対する結合を阻害する分子である。具体的な態様において、PD-L1アンタゴニストは、PD-L1とPD-1及び／またはB7-1との結合を阻害する。一部の実施態様において、PD-L1アンタゴニストは、抗－PD-L1抗体、この抗原－結合フラグメント、免疫アドへシン、融合タンパク質、オリゴペプチド、及びPD-L1とその結合パートナー、例えば、PD-1またはB7-1との相互作用による信号形質導入を減少、遮断、阻害、廃止または妨害する他の分子を含む。一実施態様において、PD-L1アンタゴニストは、機能異常のT－細胞が機能異常でなくなるように(例えば、抗原認識に対する効果器反応を増進)、PD-L1を通じたシグナル伝達を媒介するTリンパ球上で発現される細胞表面タンパク質によってまたは細胞表面タンパク質を通じて媒介される陰性共通刺激シグナルを減少させる。一部の実施態様において、PD-L1アンタゴニストは、抗－PD-L1抗体である。
本発明において、用語「CTLA4アンタゴニスト」は、CTLA4と一つ以上のその結合パートナー、例えば、B7-1との相互作用による信号形質導入を減少、遮断、阻害、廃止または妨害する分子を指称する。一部の実施態様において、CTLA4アンタゴニストは、CTLA4のその結合パートナーに対する結合を阻害する分子である。具体的な態様において、CTLA4アンタゴニストは、CTLA4とB7-1との結合を阻害する。一部の実施態様において、CTLA4アンタゴニストは、抗－CTLA4抗体、この抗原－結合フラグメント、免疫アドへシン、融合タンパク質、オリゴペプチド、及びCTLA4とその結合パートナー、例えば、B7-1との相互作用による信号形質導入を減少、遮断、阻害、廃止または妨害する他の分子を含む。一実施態様において、CTLA4アンタゴニストは、機能異常のT－細胞が機能異常でなくなるように(例えば、抗原認識に対する効果器反応を増進)、CTLA4を通じたシグナル伝達を媒介するTリンパ球上で発現される細胞表面タンパク質によってまたは細胞表面タンパク質を通じて媒介される陰性共通刺激シグナルを減少させる。一部の実施態様において、CTLA4アンタゴニストは、抗－CTLA4抗体である。
本発明において、前記免疫チェックポイント阻害剤は、ペンブロリズマブ(Pembrolizumab、(キイトルーダ(Keytruda))、ニボルマブ(Nivolumab、(オプジーボ(Opdivo))、セミプリマブ(Cemiplimab、(リブタヨ(Lybtayo))、アテゾリズマブ(Atezolizumab、(テセントリク(Tecentriq))、アベルマブ(Avelumab、(バベンチオ(Bacencio))、デュルバルマブ(Durvalumab、(イミフィンジ(Imfinzi))、イピリムマブ(Ipilimumab、(ヤーボイ(Yervoy))及びトレメリムマブ(Tremelimumab)からなる群から選択されるいずれか一つ以上であることを特徴とすることができるが、これらに限定されない。
本発明において、前記がんは、肺がん、腎臓がん、膀胱がん、乳がん、結腸直腸がん、卵巣がん、膵臓がん、胃がん腫、食道がん、中皮腫、黒色腫、頭頸部がん、甲状腺がん、肉腫、前立腺がん、膠芽細胞腫、子宮頸がん、胸腺がん腫、白血病、リンパ腫、骨髄腫、菌状食肉腫、メルケル細胞がん、または血液性悪性腫瘍からなる群から選択されることを特徴とすることができ、望ましくは、肺がん、最も望ましくは、非小細胞肺がんであってもよいが、これらに限定されない。
本発明は、別の観点から、
次の段階を含むがんの治療方法に関する：
(a)分離された血中循環がん細胞から免疫チェックポイントタンパク質及びリンパ系または骨髄系特異的タンパク質の発現を確認する段階；及び
(b)免疫チェックポイントタンパク質の発現が陽性であり、リンパ系または骨髄系特異的タンパク質の発現が陽性である時、免疫チェックポイント阻害剤を投与する段階。
次の段階を含むがんの治療方法に関する：
(a)分離された血中循環がん細胞から免疫チェックポイントタンパク質及びリンパ系または骨髄系特異的タンパク質の発現を確認する段階；及び
(b)免疫チェックポイントタンパク質の発現が陽性であり、リンパ系または骨髄系特異的タンパク質の発現が陽性である時、免疫チェックポイント阻害剤を投与する段階。
本発明は、また別の観点から、
次の段階を含む免疫チェックポイント阻害剤に対する感受性(susceptibility)決定方法に関する：
(a)分離された血中循環がん細胞から免疫チェックポイントタンパク質及びリンパ系または骨髄系特異的タンパク質の発現を確認する段階；及び
(b)免疫チェックポイントタンパク質の発現が陽性であり、リンパ系または骨髄系特異的タンパク質の発現が陽性である時、免疫チェックポイント阻害剤に対する感受性があることと決定する段階。
次の段階を含む免疫チェックポイント阻害剤に対する感受性(susceptibility)決定方法に関する：
(a)分離された血中循環がん細胞から免疫チェックポイントタンパク質及びリンパ系または骨髄系特異的タンパク質の発現を確認する段階；及び
(b)免疫チェックポイントタンパク質の発現が陽性であり、リンパ系または骨髄系特異的タンパク質の発現が陽性である時、免疫チェックポイント阻害剤に対する感受性があることと決定する段階。
本発明は、また別の観点から、
次の段階を含むがん患者の免疫抗がん療法の選択方法に関する：
(a)分離された血中循環がん細胞から免疫チェックポイントタンパク質及びリンパ系または骨髄系特異的タンパク質の発現を確認する段階；及び
(b)免疫チェックポイントタンパク質の発現が陽性であり、リンパ系または骨髄系特異的タンパク質の発現が陽性である時、免疫チェックポイント阻害剤を治療療法として選択する段階。
次の段階を含むがん患者の免疫抗がん療法の選択方法に関する：
(a)分離された血中循環がん細胞から免疫チェックポイントタンパク質及びリンパ系または骨髄系特異的タンパク質の発現を確認する段階；及び
(b)免疫チェックポイントタンパク質の発現が陽性であり、リンパ系または骨髄系特異的タンパク質の発現が陽性である時、免疫チェックポイント阻害剤を治療療法として選択する段階。
本発明は、また別の観点から、
免疫チェックポイントタンパク質の発現が陽性であり、リンパ系または骨髄系特異的タンパク質の発現が陽性である個体を治療するための免疫チェックポイント阻害剤を含むがんの治療用薬学組成物に関する。
免疫チェックポイントタンパク質の発現が陽性であり、リンパ系または骨髄系特異的タンパク質の発現が陽性である個体を治療するための免疫チェックポイント阻害剤を含むがんの治療用薬学組成物に関する。
本発明は、また別の観点から、
免疫チェックポイントタンパク質の発現が陽性であり、リンパ系または骨髄系特異的タンパク質の発現が陽性である個体を治療するための治療用薬剤の製造のための免疫チェックポイント阻害剤の用途に関する。
免疫チェックポイントタンパク質の発現が陽性であり、リンパ系または骨髄系特異的タンパク質の発現が陽性である個体を治療するための治療用薬剤の製造のための免疫チェックポイント阻害剤の用途に関する。
以下、実施例を通じて、本発明をさらに詳細に説明する。これらの実施例は、ひとえに本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されるものと解釈されないことは、当業界における通常の知識を有する者にとって自明であろう。
実施例1. 血中CTC分離
本研究は、研究倫理委員会(IRB)の承認を受け、肺がん患者20人(表1)及び炎症患者20人(表2)の組織及び血液サンプルは事前同意を得て使用した。
本研究は、研究倫理委員会(IRB)の承認を受け、肺がん患者20人(表1)及び炎症患者20人(表2)の組織及び血液サンプルは事前同意を得て使用した。
前記患者の血液からSmartBiopsyTM cell Isolation kit(サイトジェン)及びSmartBiopsyTM cell Isolator(サイトジェン)を用いて、メーカーの指示に従ってCTCを分離した。SmartBiopsyTM cell Isolatorに適用される高密度マイクロチップは、5μmの気孔サイズ(pore size)のチップを使用することで、5μmより大きいサイズの標的細胞はチップ上に採集されるようにした。マイクロチップの気孔サイズは調節が可能なため、特定のサイズの細胞を選択的に回収することができるように考案されたマイクロチップである(US10,502,668, KR10-1254675)。
Smart BiopsyTM Cell Isolator (CIS030)
- Smart BiopsyTM Cell Isolatorは、溶液から標的とする対象(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)の高さを認識し、ADP(Air Displacement Pipette)で混合、運搬及びFilteringを自動的に進行する装備である。本装備のシステムは、X-Y Main Axis, ADP, Chip Handler, Consumable Tableで構成されている。基本的にSmart BiopsyTM Cell Isolatorの駆動は、ソフトウェアを使用してマニュアルの順序に従って作動する。
- Smart BiopsyTM Cell Isolatorは、溶液から標的とする対象(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)の高さを認識し、ADP(Air Displacement Pipette)で混合、運搬及びFilteringを自動的に進行する装備である。本装備のシステムは、X-Y Main Axis, ADP, Chip Handler, Consumable Tableで構成されている。基本的にSmart BiopsyTM Cell Isolatorの駆動は、ソフトウェアを使用してマニュアルの順序に従って作動する。
実施例2. 分離されたCTCの選別のためのマーカースクリーニング
2-1. CTC染色方法
Smart BiopsyTM IF Stainer (CST030)
- 自動免疫染色装備として、総12個のスライドの同時染色遂行が可能である。当該装備のシステムは、X-Y Main axis module、1ml pipette(ADP) module, covering module, consumable parts module, vision parts moduleで構成され、消耗品テーブル(Consumable table)が含まれている。Smart BiopsyTM Cell Isolatorは、自社製作のソフトウェアを使用し、マニュアルに従って作動させる。
2-1. CTC染色方法
Smart BiopsyTM IF Stainer (CST030)
- 自動免疫染色装備として、総12個のスライドの同時染色遂行が可能である。当該装備のシステムは、X-Y Main axis module、1ml pipette(ADP) module, covering module, consumable parts module, vision parts moduleで構成され、消耗品テーブル(Consumable table)が含まれている。Smart BiopsyTM Cell Isolatorは、自社製作のソフトウェアを使用し、マニュアルに従って作動させる。
血中循環腫瘍細胞の染色方法
[Smart BiopsyTM IF Stainer方式]
1. Smart BiopsyTM IF Stainer装備に細胞を固定させたスライドと必要な抗体(ex：EpCAM、Vimentin、PD-L1、CD18、CD45抗体)を装備内のBuffer tube)にそれぞれ入れた後、装備のマニュアルに従って作動する。
2. Washing、blocking、1次抗体／2次抗体染色、Mountingの過程が自動的に行われ、総6時間(12個のスライド基準)が所要される。
3. Smart BiopsyTM IF Stainerを通じた全ての染色プロセスは、以下[マニュアル方式]に従って作動する。
[Smart BiopsyTM IF Stainer方式]
1. Smart BiopsyTM IF Stainer装備に細胞を固定させたスライドと必要な抗体(ex：EpCAM、Vimentin、PD-L1、CD18、CD45抗体)を装備内のBuffer tube)にそれぞれ入れた後、装備のマニュアルに従って作動する。
2. Washing、blocking、1次抗体／2次抗体染色、Mountingの過程が自動的に行われ、総6時間(12個のスライド基準)が所要される。
3. Smart BiopsyTM IF Stainerを通じた全ての染色プロセスは、以下[マニュアル方式]に従って作動する。
[Manual方式]
1. 試料(スライド)に0.2% Triton X-100 50μｌを10分間処理した後、PBSを使用して5分間3回水洗過程(washing)を経る。
2. 非特異的結合を減らすために、1% BSAを使用して1時間ブロッキングを進行。
3. 必要な抗体(ex：免疫細胞のネガティブセレクションのためのAnti-CD45、リンパ系細胞のネガティブセレクションのためのAnti-CD18及びポジティブセレクションのためのPD-L1抗体)をそれぞれ1% BSAに希釈して1時間処理する。(1次抗体処理)
4. 二つの異なる波長を有する2次抗体('goat Anti-mouse Alexa Fluor 647', 'goat Anti-rabbit Alexa Fluor 546')を1% BSAに希釈した後、1時間常温保管する。(2次抗体処理)
5. 肺がん循環腫瘍細胞特異的抗体(PD-L1)との交差反応阻害のためにブロッキング過程を1時間処理する。
6. 循環腫瘍細胞標識である「Anti-EpCAM Alexa Fluor 488 conjugated」抗体を1時間常温保管する。
7. PBSを使用して5分間3回水洗過程(washing)を経る。
8. DAPI染色過程を経た後、cover glassを使用してMounting過程を進行する。
1. 試料(スライド)に0.2% Triton X-100 50μｌを10分間処理した後、PBSを使用して5分間3回水洗過程(washing)を経る。
2. 非特異的結合を減らすために、1% BSAを使用して1時間ブロッキングを進行。
3. 必要な抗体(ex：免疫細胞のネガティブセレクションのためのAnti-CD45、リンパ系細胞のネガティブセレクションのためのAnti-CD18及びポジティブセレクションのためのPD-L1抗体)をそれぞれ1% BSAに希釈して1時間処理する。(1次抗体処理)
4. 二つの異なる波長を有する2次抗体('goat Anti-mouse Alexa Fluor 647', 'goat Anti-rabbit Alexa Fluor 546')を1% BSAに希釈した後、1時間常温保管する。(2次抗体処理)
5. 肺がん循環腫瘍細胞特異的抗体(PD-L1)との交差反応阻害のためにブロッキング過程を1時間処理する。
6. 循環腫瘍細胞標識である「Anti-EpCAM Alexa Fluor 488 conjugated」抗体を1時間常温保管する。
7. PBSを使用して5分間3回水洗過程(washing)を経る。
8. DAPI染色過程を経た後、cover glassを使用してMounting過程を進行する。
2-2. CTC選別のためのマーカー選別
血液内のCTCをより明確に確認するために、患者血液内のPBMCで下記表3の抗体と二次抗体としてThermo Fisherのanti-Rabbit IgG、Alexa Fluor 546 (A-11010/ 2 mg/mL)とanti-mouse IgG、Alexa Fluor 546 (A-11003/ 2 mg/mL)を使用してマーカーの発現レベルを確認した結果、図3に記載したように、複数のマーカーのうち、CD18の発現量が最も高いことを確認した。
血液内のCTCをより明確に確認するために、患者血液内のPBMCで下記表3の抗体と二次抗体としてThermo Fisherのanti-Rabbit IgG、Alexa Fluor 546 (A-11010/ 2 mg/mL)とanti-mouse IgG、Alexa Fluor 546 (A-11003/ 2 mg/mL)を使用してマーカーの発現レベルを確認した結果、図3に記載したように、複数のマーカーのうち、CD18の発現量が最も高いことを確認した。
実施例3. 選別したマーカー基盤のCTC染色
Isolatorによって分離された細胞(約500～10000個以上)を細胞遠心分離法であるサイトスピン(cytospin)過程を行い、染色用スライドに固定させた。
Isolatorによって分離された細胞(約500～10000個以上)を細胞遠心分離法であるサイトスピン(cytospin)過程を行い、染色用スライドに固定させた。
免疫細胞のネガティブセレクションのためにCD45及びCTCのポジティブセレクションのためにEpCAM/Vimentin、PD-L1及びCD18マーカーを使用して分離されたCTCの特性を確認した。
抗体としては、EpCAM/Vimentin、PD-L1、CD18抗体及びCD45抗体を使用し、抗体情報は下記表4の通りである。最後に、細胞核を染色することができるDAPI(4′,6-diamidino-2-phenylindole)を追加してSmartBiopsyTM IF Stainer (CST030、サイトジェン)を使用し、メーカーの指示に従って細胞染色を進行した。
実施例4. CTC蛍光イメージ分析
SmartBiopsyTM Cell Image Analyzer (サイトジェン)を用いて蛍光標識CTCがローディングされたスライドのイメージを撮影し、EpCAM/Vimentin、PD-L1、CD18発現細胞の数と蛍光強度を測定した(図1、図2及び図4)。
SmartBiopsyTM Cell Image Analyzer (サイトジェン)を用いて蛍光標識CTCがローディングされたスライドのイメージを撮影し、EpCAM/Vimentin、PD-L1、CD18発現細胞の数と蛍光強度を測定した(図1、図2及び図4)。
炎症患者と肺がん患者の血液サンプルを用いてPD-L1及びCD18を発現するCTC細胞を確認した(図1)。本発明においては、PD-L1発現分析を通じた免疫抗がん療法の決定時、その正確度を高めるため、CD18マーカーをさらに導入した。
従って、全体CTC、すなわち、EpCAM&Vim(+)発現細胞を基準にEpCAM&Vim(+)/PD-L1(+)及びEpCAM&Vim(+)/PD-L1(+)/CD18(+)細胞の比を比較した。さらに、追加でPD-L1蛍光強度及びpure PD-L1(+)細胞数を一緒に分析し、正確度を高めることができた。
実施例5. CTC基盤のPD-L1発現分析
5-1. 肺がん患者群の分析
まず、肺がん患者群でCTC基盤のPD-L1発現を分析し、組織とその結果を比較した。
すなわち、EpCAM&Vim(+)を発現するCTCのうち、EpCAM&Vim(+)/PD-L1(+)及びEpCAM&Vim(+)/PD-L1(+)/CD18(+)細胞の比率を確認し、組織のTPS値と比較した。
5-1. 肺がん患者群の分析
まず、肺がん患者群でCTC基盤のPD-L1発現を分析し、組織とその結果を比較した。
すなわち、EpCAM&Vim(+)を発現するCTCのうち、EpCAM&Vim(+)/PD-L1(+)及びEpCAM&Vim(+)/PD-L1(+)/CD18(+)細胞の比率を確認し、組織のTPS値と比較した。
肺がん患者20人の組織におけるPD-L1発現分析は、ダコファームdx(DAKO pharmdx)クローン22c3及びVENTANA SP263で行い、同一患者のCTCでもPD-L1(+)及びPD-L1(+)/CD18(+)発現を比較した(表5)。肺がん患者の液体生検基盤の循環腫瘍細胞のPD-L1陽性細胞数を計数し、標的抗体特異的抗体の敏感度及び特異度を算出し、最終的に臨床現場のTPSと比較分析することにより、当該有効指標の代弁可能性を比較し、性能を検証した。
その結果、PD-L1マーカーのみを使用した場合よりもCD18を追加で使用した場合、組織との一致度が画期的に増加したことを確認した。すなわち、22C3のTPS(%)を基準にPD-L1(+)細胞(%)を比較する場合、おおよその一致度が65%から80%程度増加したことが分かる。従って、CTC基盤の免疫抗がん療法の決定のためのPD-L1発現分析は、CD18マーカーをさらに導入することで正確度及び組織との一致度を高めることができる。
ただし、組織と一致しない場合には、PD-L1(+)CTCの個数及び蛍光強度をさらに分析して比較検証した(表7)。
ただし、組織と一致しない場合には、PD-L1(+)CTCの個数及び蛍光強度をさらに分析して比較検証した(表7)。
5-2. 炎症患者群の分析
次に、炎症患者群において、肺がん患者群と同じ方法でPD-L1発現を検証した。
次に、炎症患者群において、肺がん患者群と同じ方法でPD-L1発現を検証した。
その結果、PD-L1マーカーのみを使用した場合、炎症患者の炎症細胞でも高い比率でPD-L1が発現していることが分かった。しかし、CD18(+)を追加マーカーとして使用した場合には、炎症細胞内のPD-L1を発現する細胞の比率が減少したことを確認した(表6)。PD-L1(+)発現細胞比が50%以上の場合を陽性とすると、PD-L1(+)発現細胞が30%程度から20%程度に減少したことを確認することができた。
前記表6において、PD-L1(+)の細胞比率は、全体CTC、すなわち、EpCAM&Vim(+)発現細胞を基準にEpCAM&Vim(+)/PD-L1(+)及びEpCAM&Vim(+)/PD-L1(+)/CD18(+)の細胞比率を求めた。
前記表6において、PD-L1(+)の細胞比率は、全体CTC、すなわち、EpCAM&Vim(+)発現細胞を基準にEpCAM&Vim(+)/PD-L1(+)及びEpCAM&Vim(+)/PD-L1(+)/CD18(+)の細胞比率を求めた。
実施例6. PD-L1(+)細胞の個数及び蛍光強度分析
表5において、組織と一致しない場合及び表6の炎症患者において、PD-L1(+)発現細胞が検出された場合、PD-L1(+)CTCの個数及び蛍光強度をさらに分析し、CTC基盤の免疫抗がん療法の決定方法を構築し検証した。
炎症患者の場合、PD-L1(+)細胞発現が検出された8人からPD-L1(+)/CD18(+)細胞数及び蛍光強度を確認した(表7)。
炎症患者の場合、PD-L1(+)細胞発現が検出された8人からPD-L1(+)/CD18(+)細胞数及び蛍光強度を確認した(表7)。
その結果、ほとんどの細胞数は1個、蛍光強度は平均11.2と現れた。
その次に、肺がん患者群の場合、組織TPSとCTCの結果が一致した患者と不一致した患者からPD-L1(+)/CD18(+)細胞数及び蛍光強度を確認した(表8)。
その次に、肺がん患者群の場合、組織TPSとCTCの結果が一致した患者と不一致した患者からPD-L1(+)/CD18(+)細胞数及び蛍光強度を確認した(表8)。
その結果、CGL08及びCGL19のように組織とCTCの両方が陽性で一致した場合には、細胞数3～10個、蛍光強度19.41～24.88と確認された。また、CGL21のように組織とCTCの両方が陰性で一致した場合には、細胞数3個、蛍光強度は14.8であった。CGL27、CGL29及びCGL30は細胞数が全て1個、蛍光強度は8.9～10.3であったが、組織TPSと一致するか、不一致であった。
前記の結果によると、PD-L1(+)/CD18(+)細胞数が3個以上及び蛍光強度が約19以上である場合、CTC基盤の免疫抗がん療法の決定時、陽性と判断することが可能である。また、PD-L1(+)/CD18(+)細胞数が3個以上及び蛍光強度が約15以下である場合、CTC基盤の免疫抗がん療法の決定時、陰性と判断することが可能である。
前記の結果を総合してみると、細胞数が1個以下である場合には、組織との一致度またはCTC基盤の免疫抗がん療法の決定方法が有効でないことと考えられる。炎症患者において、偽陽性と考えられるCTC細胞の数も全て1個以下のため、肺がん患者においても、1個以下のCTC細胞では免疫抗がん療法の決定が不可能と考えられる。
また、蛍光強度を見ると、炎症患者において、偽陽性と考えられるCTC細胞の蛍光強度の平均が11.2であったため、11.2以下の蛍光強度を示す場合、これを基準に免疫抗がん療法の決定時、陰性と判断することが可能であろう。肺がん患者群において、組織TPSと陰性で一致するCGL21の場合には、細胞数3個、平均蛍光強度14.8と示されたため、肺がん患者において、14.8以下の蛍光強度を示す場合には、免疫抗がん療法の決定時、陰性と判断することが可能であると考えられる。
以上、本発明の内容の特定の部分を詳細に記述したが、当業界における通常の知識を有する者にとって、このような具体的な技術は単に望ましい実施態様に過ぎず、これによって本発明の範囲が制限されない点は明らかであろう。従って、本発明の実質的な範囲は、添付の請求項とそれらの等価物によって定義されるといえる。
本発明による循環腫瘍細胞を用いたがんの治療方法は、液体生検で免疫チェックポイントタンパク質とリンパ系または骨髄系細胞特異的タンパク質の発現を同時に確認して患者を選別するため、組織検査との一致度が顕著に優れ、商業的活用度が高いため、本発明の方法はがんの診断及び治療に有用である。
Claims (19)
- 次の段階を含む免疫抗がん剤の適用のための患者選別方法：
(a)血中循環がん細胞から免疫チェックポイントタンパク質及びリンパ系または骨髄系特異的タンパク質の発現を確認する段階；及び
(b)免疫チェックポイントタンパク質の発現が陽性であり、リンパ系または骨髄系特異的タンパク質の発現が陽性と確認される患者を免疫抗がん剤が適用可能な患者として分類する段階。 - 前記免疫チェックポイントタンパク質は、PD-1、PD-L1及びCTLA-4からなる群から選択されることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 前記リンパ系または骨髄系特異的タンパク質は、CD18、CD16、CD29、CD61、CD104、CD32、CD11b及びCD64からなる群から選択されることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 前記分離された血中循環がん細胞は、次の段階を行って分離されることを特徴とする、請求項1に記載の方法：
(i)がん患者から血液を獲得する段階；及び
(ii)前記血液からバイオチップを用いて血中循環がん細胞を分離する段階。 - 前記免疫チェックポイントタンパク質及びリンパ系または骨髄系特異的タンパク質の発現は、次の段階を行って確認することを特徴とする、請求項1に記載の方法：
(1)血中循環がん細胞に特異的に結合する蛍光標識；免疫チェックポイントタンパク質に特異的に結合する蛍光標識；及びリンパ系または骨髄系特異的タンパク質に特異的に結合する蛍光標識と反応させる段階；
(2)前記蛍光標識と反応させた血中循環がん細胞；免疫チェックポイントタンパク質；及びリンパ系または骨髄系特異的タンパク質を対象として、複数の波長範囲それぞれに対する光学イメージを受信する段階；
(3)前記複数の波長範囲の全体または一部の光学イメージから、前記がん細胞；免疫チェックポイントタンパク質；及びリンパ系または骨髄系特異的タンパク質に対する蛍光強度を測定し、1次フィルタリングを行う段階；
(4)前記複数の波長範囲の全体または一部の光学イメージから、前記がん細胞に対するモフォロジー(morphology)を測定し、2次フィルタリングを行う段階；及び
(5)前記複数の波長範囲それぞれに対する光学イメージのうち、全体または一部を併合した統合イメージから、前記血中循環がん細胞に対するモフォロジーを測定し、3次フィルタリングを行う段階。 - 前記血中循環がん細胞に特異的に結合する蛍光標識は、ビメンチン(vimentin)に特異的な抗体、EpCAMに特異的な抗体及びCKに特異的な抗体からなる群から選択されることを特徴とする、請求項5に記載の方法。
- 前記免疫チェックポイントタンパク質に特異的に結合する蛍光標識は、PD-1に特異的な抗体、PD-L1に特異的な抗体及びCTLA-4に特異的な抗体からなる群から選択されることを特徴とする、請求項5に記載の方法。
- 前記リンパ系または骨髄系タンパク質に特異的に結合する蛍光標識は、CD18に特異的な抗体、CD16に特異的な抗体、CD29に特異的な抗体、CD61に特異的な抗体、CD104に特異的な抗体、CD32に特異的な抗体、CD11bに特異的な抗体及びCD64に特異的な抗体からなる群から選択されることを特徴とする、請求項5に記載の方法。
- 前記免疫チェックポイント阻害剤は、抗体であることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 前記免疫チェックポイント阻害剤は、モノクローナル抗体であることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 前記免疫チェックポイント阻害剤は、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体であることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 前記免疫チェックポイント阻害剤は、PD-L1アンタゴニスト、PD-1アンタゴニスト、及びCTLA-4アンタゴニストからなる群から選択されるいずれか一つ以上であることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 前記免疫チェックポイント阻害剤は、ペンブロリズマブ(Pembrolizumab、(キイトルーダ(Keytruda))、ニボルマブ(Nivolumab、(オプジーボ(Opdivo))、セミプリマブ(Cemiplimab、(リブタヨ(Lybtayo))、アテゾリズマブ(Atezolizumab、(テセントリク(Tecentriq))、アベルマブ(Avelumab、(バベンチオ(Bacencio))、デュルバルマブ(Durvalumab、(イミフィンジ(Imfinzi))、イピリムマブ(Ipilimumab、(ヤーボイ(Yervoy))及びトレメリムマブ(Tremelimumab)からなる群から選択されるいずれか一つ以上であることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 前記がんは、肺がん、腎臓がん、膀胱がん、乳がん、結腸直腸がん、卵巣がん、膵臓がん、胃がん腫、食道がん、中皮腫、黒色腫、頭頸部がん、甲状腺がん、肉腫、前立腺がん、膠芽細胞腫、子宮頸がん、胸腺がん腫、白血病、リンパ腫、骨髄腫、菌状食肉腫、メルケル細胞がん、または血液性悪性腫瘍からなる群から選択されることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 前記がんは、肺がんであることを特徴とする、請求項14に記載の方法。
- 前記がんは、非小細胞肺がんであることを特徴とする、請求項14に記載の方法。
- 次の段階を含むがん患者の免疫抗がん療法の選択方法：
(a)分離された血中循環がん細胞(circulating tumor cell, CTC)から免疫チェックポイントタンパク質及びリンパ系または骨髄系特異的タンパク質の発現を確認する段階；及び
(b)免疫チェックポイントタンパク質の発現が陽性であり、リンパ系または骨髄系特異的タンパク質の発現が陽性である場合、免疫チェックポイント阻害剤を治療療法として選択する段階。 - 次の段階を含むがんの治療方法：
(a)血中循環がん細胞から免疫チェックポイントタンパク質及びリンパ系または骨髄系特異的タンパク質の発現を確認する段階；及び
(b)免疫チェックポイントタンパク質の発現が陽性であり、リンパ系または骨髄系特異的タンパク質の発現が陽性である場合、免疫チェックポイント阻害剤を投与する段階。 - 次の段階を含む免疫チェックポイント阻害剤に対する感受性(susceptibility)決定方法：
(a)血中循環がん細胞から免疫チェックポイントタンパク質及びリンパ系または骨髄系特異的タンパク質の発現を確認する段階；及び
(b)免疫チェックポイントタンパク質の発現が陽性であり、リンパ系または骨髄系特異的タンパク質の発現が陽性である場合、免疫チェックポイント阻害剤に対する感受性があることと決定する段階。
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