JP5813908B2 - 化学療法剤に対する応答を予測するための遺伝子発現マーカー - Google Patents

Description

（発明の分野）
本発明は、癌の予後（ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ）においてその発現が重要である遺伝子のセットを提供する。詳細には、本発明は、癌患者が化学療法に対して有益な処置応答を有する可能性が高いか否かを予測するために有用な遺伝子発現情報を提供する。

（関連分野の説明）
腫瘍学者は、彼らにとって利用可能な多数の処置選択肢を有しており、それには「標準医療（ｓｔａｎｄａｒｄ ｏｆ ｃａｒｅ）」として特徴付けられる化学療法薬物および特定の癌について表示された効能を持たないが、その癌において明らかな有効性が存在する多数の薬物の種々の組み合わせが挙げられる。良好な処置転帰の見込みを最も高くするには、患者が利用可能な最適の癌処置に割り当てられること、およびこの割り当てが診断後できるだけ迅速に行われることが必要である。詳細には、「標準医療」化学療法に対する患者の応答の可能性を決定することが重要である。なぜなら、アントラサイクリンおよびタキサンのような化学療法薬物は、有効性が限られており、毒性であるからである。従って、応答する可能性が最大であるかまたは最小である患者の特定によって、これらの薬物が提供すべき正味の利点が増大され、さらに理にかなった患者選択によって、正味の罹患率および毒性が減少される。

現在のところ、臨床診療に用いられる診断試験は、単独の分析物であり、従って、多数の種々のマーカーの間の既知の関係の潜在的価値をとらえない。さらに、診断試験はしばしば、免疫組織化学のせいで定量的ではない。この方法はしばしば異なる実験室で異なる結果を生じる。その理由の一部は、この試薬が標準化されていないことであり、そしてその理由の一部は、解釈が主観的であって、容易に定量できないことである。ＲＮＡに基づく試験はしばしば、経時的なＲＮＡ分解の問題、そして分析用に患者から新鮮な組織サンプルを得ることが困難であるという事実のせいで用いられてきていない。固定されたパラフィン包埋組織は、より容易に利用可能であり、そして固定された組織中でＲＮＡを検出する方法は確立されている。しかし、これらの方法では代表的には、少量の物質由来の多数の遺伝子（ＤＮＡまたはＲＮＡ）の研究は可能にならない。従って、慣習的に、固定された組織は、タンパク質の免疫組織化学検出について以外にはほとんど用いられていない。

ここ２〜３年間で、いくつかのグループが、マイクロアレイ遺伝子発現分析による種々の癌のタイプの分類に関する研究を発表している（例えば、非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４を参照のこと）。遺伝子発現パターンに基づくヒト乳癌の特定の分類も報告されている（非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７；非特許文献８）。しかし、これらの研究はほとんど、乳癌を含む種々のタイプの癌の既に確立された分類を改善および強化することに集中しており、一般には示差的に発現される遺伝子の関係に対する新規な洞察を提供するものではなく、癌治療の臨床的転帰を改善するための処置ストラテジーに対する知見には関連しない。

現代の分子生物学および生物化学は、何百もの遺伝子であってその活性が腫瘍細胞の挙動、それらの分化の状態および特定の治療薬物に対するその感度または耐性に影響する遺伝子を明らかにしてきたが、わずかな例外があり、これらの遺伝子の状態は、薬物処置についての臨床的決定を慣用的に行うという目的に関しては開拓されていない。顕著な例外の１つは、タモキシフェンのような抗エストロゲン薬物での処置に対して患者を選択するための、乳癌におけるエストロゲンレセプター（ＥＲ）タンパク質発現の使用である。別の例外的な例は、Ｈｅｒ２アンタゴニスト薬物Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）での処置に対して患者を選択するための、乳癌におけるＥｒｂＢ２（Ｈｅｒ２）タンパク質発現の使用である。

最近の進歩にかかわらず、癌処置の課題は依然として、病原的に別個の腫瘍タイプに対する特定の処置レジメンを標的して、最終的に腫瘍処置を個人化して転帰を最良にすることである。従って、種々の処置の選択肢に対する患者応答について予測的な情報を同時に提供する試験の必要性が存在する。これは特に、その生物学が十分理解されていない乳癌についてあてはまる。２〜３のサブグループ、例えばＥｒｂＢ２陽性サブグループ、ならびにエストロゲンレセプター（ＥＲ）および２〜３のさらなる転写因子の遺伝子発現が低いか全くないことによって特徴付けられるサブグループへの乳癌の分類（非特許文献９）では、乳癌の細胞および分子の異質性を反映せず、患者の応答を最大化する処置ストラテジーの設計はできないということが明らかである。

乳癌は、米国における女性の間の最も一般的なタイプの癌であり、４０〜５９歳の女性の間の癌死亡の主要な原因である。従って特に、化学療法に対する患者応答を予測する臨床的に検証された乳癌試験の必要性は大きい。
Ｇｏｌｕｂら、Ｓｃｉｅｎｃｅ （１９９９年）２８６：５３１〜５３７ Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｊａｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ （２００１年）９８：１３７９０〜１３７９５ Ｃｈｅｎ−Ｈｓｉａｎｇら、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ （２００１年）１７（補遺．１）：Ｓ３１６−Ｓ３２２ Ｒａｍａｓｗａｍｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ （２００１年）９８：１５１４９〜１５１５４ Ｍａｒｔｉｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（２０００年）６０：２２３２〜２２３８ Ｗｅｓｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ （２００１年）９８：１１４６２〜１１４６７ Ｓｏｒｌｉｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ （２００１年）９８：１０８６９〜１０８７４ Ｙａｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（２００１年）６１：８３７５〜８３８０ Ｐｅｒｏｕら、Ｎａｔｕｒｅ （２０００年）４０６：７４７−７５２

（発明の要旨）
本発明は、化学療法に対する癌、例えば乳癌の患者の応答を予測するのに有用な遺伝子セットを提供する。さらに、本発明は、複数遺伝子ＲＮＡ分析（ｍｕｌｔｉ−ｇｅｎｅ ＲＮＡ ａｎａｌｙｓｉｓ）を用いる、化学療法に対する患者の応答を予測する、臨床的に検証された癌、例えば乳癌の試験を提供する。本発明は、関連の遺伝子セットにおける全てのマーカーのアッセイのための、保管されたパラフィン包埋生検材料の使用に適合し、従って、最も広く利用可能なタイプの生検材料と適合性である。

１局面では、本発明は、癌の診断をされた被験体の化学療法に対する応答を予測するための方法であって、この被験体から得られた癌細胞を含む生物学的サンプル中における１つ以上の予後予測ＲＮＡ転写物またはそれらの発現産物の発現レベルを決定する工程を包含し、この予測的なＲＮＡ転写物は、ＴＢＰ；ＩＬＴ．２；ＡＢＣＣ５；ＣＤ１８；ＧＡＴＡ３；ＤＩＣＥＲ１；ＭＳＨ３；ＧＢＰ１；ＩＲＳ１；ＣＤ３ｚ；ｆａｓ１；ＴＵＢＢ；ＢＡＤ；ＥＲＣＣ１；ＭＣＭ６；ＰＲ；ＡＰＣ；ＧＧＰＳ１；ＫＲＴ１８；ＥＳＲＲＧ；Ｅ２Ｆ１；ＡＫＴ２；Ａ．カテニン（Ｃａｔｅｎｉｎｅ）；ＣＥＧＰ１；ＮＰＤ００９；ＭＡＰＫ１４；ＲＵＮＸ１；ＩＤ２；Ｇ．カテニン；ＦＢＸＯ５；ＦＨＩＴ；ＭＴＡ１；ＥＲＢＢ４；ＦＵＳ；ＢＢＣ３；ＩＧＦ１Ｒ；ＣＤ９；ＴＰ５３ＢＰ１；ＭＵＣ１；ＩＧＦＢＰ５；ｒｈｏＣ；ＲＡＬＢＰ１；ＣＤＣ２０；ＳＴＡＴ３；ＥＲＫ１；ＨＬＡ．ＤＰＢ１；ＳＧＣＢ；ＣＧＡ；ＤＨＰＳ；ＭＧＭＴ；ＣＲＩＰ２；ＭＭＰ１２；ＥｒｂＢ３；ＲＡＰ１ＧＤＳ１；ＣＤＣ２５Ｂ；ＩＬ６；ＣＣＮＤ１；ＣＹＢＡ；ＰＲＫＣＤ；ＤＲ４；ヘプシン（Ｈｅｐｓｉｎ）；ＣＲＡＢＰ１；ＡＫ０５５６９９；コンティグ（Ｃｏｎｔｉｇ）．５１０３７；ＶＣＡＭ１；ＦＹＮ；ＧＲＢ７；ＡＫＡＰ．２；ＲＡＳＳＦ１；ＭＣＰ１；ＺＮＦ３８；ＭＣＭ２；ＧＢＰ２；ＳＥＭＡ３Ｆ；ＣＤ３１；ＣＯＬ１Ａ１；ＥＲ２；ＢＡＧ１；ＡＫＴ１；ＣＯＬ１Ａ２；ＳＴＡＴ１；Ｗｎｔ．５ａ；ＰＴＰＤ１；ＲＡＢ６Ｃ；ＴＫ１、ＥｒｂＢ２、ＣＣＮＢ１、ＢＩＲＣ５、ＳＴＫ６、ＭＫＩ６７、ＭＹＢＬ２、ＭＭＰ１１、ＣＴＳＬ２、ＣＤ６８、ＧＳＴＭ１、ＢＣＬ２、ＥＳＲ１からなる群より選択された１つ以上の遺伝子の転写物であり、
（ａ）ＩＬＴ．２；ＣＤ１８；ＧＢＰ１；ＣＤ３ｚ；ｆａｓ１；ＭＣＭ６；Ｅ２Ｆ１；ＩＤ２；ＦＢＸＯ５；ＣＤＣ２０；ＨＬＡ．ＤＰＢ１；ＣＧＡ；ＭＭＰ１２；ＣＤＣ２５Ｂ；ＩＬ６；ＣＹＢＡ；ＤＲ４；ＣＲＡＢＰ１；コンティグ．５１０３７；ＶＣＡＭ１；ＦＹＮ；ＧＲＢ７；ＡＫＡＰ．２；ＲＡＳＳＦ１；ＭＣＰ１；ＭＣＭ２；ＧＢＰ２；ＣＤ３１；ＥＲ２；ＳＴＡＴ１；ＴＫ１；ＥＲＢＢ２、ＣＣＮＢ１、ＢＩＲＣ５、ＳＴＫ６、ＭＫＩ６７、ＭＹＢＬ２、ＭＭＰ１１、ＣＴＳＬ２およびＣＤ６８のうちの１つ以上；または対応する発現産物の発現増大のあらゆる単位について、この被験体は、化学療法に対する応答の可能性が増大していると予測され；かつ
（ｂ）ＴＢＰ；ＡＢＣＣ５；ＧＡＴＡ３；ＤＩＣＥＲ１；ＭＳＨ３；ＩＲＳ１；ＴＵＢＢ；ＢＡＤ；ＥＲＣＣ１；ＰＲ；ＡＰＣ；ＧＧＰＳ１；ＫＲＴ１８；ＥＳＲＲＧ；ＡＫＴ２；Ａ．カテニン；ＣＥＧＰ１；ＮＰＤ００９；ＭＡＰＫ１４；ＲＵＮＸ１；Ｇ．カテニン；ＦＨＩＴ；ＭＴＡ１；ＥｒｂＢ４；ＦＵＳ；ＢＢＣ３；ＩＧＦ１Ｒ；ＣＤ９；ＴＰ５３ＢＰ１；ＭＵＣ１；ＩＧＦＢＰ５；ｒｈｏＣ；ＲＡＬＢＰ１；ＳＴＡＴ３；ＥＲＫ１；ＳＧＣＢ；ＤＨＰＳ；ＭＧＭＴ；ＣＲＩＰ２；ＥｒｂＢ３；ＲＡＰ１ＧＤＳ１；ＣＣＮＤ１；ＰＲＫＣＤ；ヘプシン；ＡＫ０５５６９９；ＺＮＦ３８；ＳＥＭＡ３Ｆ；ＣＯＬ１Ａ１；ＢＡＧ１；ＡＫＴ１；ＣＯＬ１Ａ２；Ｗｎｔ．５ａ；ＰＴＰＤ１；ＲＡＢ６Ｃ；ＧＳＴＭ１、ＢＣＬ２、ＥＳＲ１の１つ以上；または対応する発現産物の発現の増大のあらゆる単位について、この被験体は、化学療法に対する応答の可能性が減少していると予測される、方法に関する。

特定の実施形態では、上記の方法では、上記の予測的なＲＮＡ転写物は、ＴＢＰ；ＩＬＴ．２；ＡＢＣＣ５；ＣＤ１８；ＧＡＴＡ３；ＤＩＣＥＲ１；ＭＳＨ３；ＧＢＰ１；ＩＲＳ１；ＣＤ３ｚ；ｆａｓ１；ＴＵＢＢ；ＢＡＤ；ＥＲＣＣ１；ＭＣＭ６；ＰＲ；ＡＰＣ；ＧＧＰＳ１；ＫＲＴ１８；ＥＳＲＲＧ；Ｅ２Ｆ１；ＡＫＴ２；Ａ．カテニン；ＣＥＧＰ１；ＮＰＤ００９；ＭＡＰＫ１４；ＲＵＮＸ１；ＩＤ２；Ｇ．カテニン；ＦＢＸＯ５；ＦＨＩＴ；ＭＴＡ１；ＥＲＢＢ４；ＦＵＳ；ＢＢＣ３；ＩＧＦ１Ｒ；ＣＤ９；ＴＰ５３ＢＰ１；ＭＵＣ１；ＩＧＦＢＰ５；ｒｈｏＣ；ＲＡＬＢＰ１；ＣＤＣ２０；ＳＴＡＴ３；ＥＲＫ１；ＨＬＡ．ＤＰＢ１；ＳＧＣＢ；ＣＧＡ；ＤＨＰＳ；ＭＧＭＴ；ＣＲＩＰ２；ＭＭＰ１２；ＥｒｂＢ３；ＲＡＰ１ＧＤＳ１；ＣＤＣ２５Ｂ；ＩＬ６；ＣＣＮＤ１；ＣＹＢＡ；ＰＲＫＣＤ；ＤＲ４；ヘプシン；ＣＲＡＢＰ１；ＡＫ０５５６９９；コンティグ．５１０３７；ＶＣＡＭ１；ＦＹＮ；ＧＲＢ７；ＡＫＡＰ．２；ＲＡＳＳＦ１；ＭＣＰ１；ＺＮＦ３８；ＭＣＭ２；ＧＢＰ２；ＳＥＭＡ３Ｆ；ＣＤ３１；ＣＯＬ１Ａ１；ＥＲ２；ＢＡＧ１；ＡＫＴ１；ＣＯＬ１Ａ２；ＳＴＡＴ１；Ｗｎｔ．５ａ；ＰＴＰＤ１；ＲＡＢ６Ｃ；およびＴＫ１からなる群より選択される１つ以上の遺伝子の転写物である。

別の実施形態では、上記応答は病理学上の完全寛解である。

好ましい実施形態では、上記被験体はヒト患者である。

上記癌は、任意のタイプの癌であってもよいが、好ましくは、固形腫瘍、例えば、乳癌、卵巣癌、胃癌、結腸癌、膵臓癌、前立腺癌および肺癌である。

この腫瘍が乳癌である場合、これは、例えば、浸潤性の乳癌であっても、または第ＩＩ期もしくは第ＩＩＩ期の乳癌であってもよい。

特定の実施形態では、上記化学療法は補助化学療法である。

別の実施形態では、この化学療法は新補助化学療法である。

この新補助化学療法は、例えば、タキサン誘導体、例えば、ドセタキセルおよび／もしくはパクリタキセル、ならびに／または他の抗癌剤、例えば、アントラサイクリンクラスの抗癌剤のメンバー、ドキソルビシン、トポイソメラーゼインヒビターなどの投与を含んでもよい。

この方法は、上記で列挙した予後予測転写物またはその発現産物のうち少なくとも２つ、または少なくとも５つ、または少なくとも１０個、または少なくとも１５個の発現レベルの決定を包含してもよい。

上記生物学的サンプルは、例えば、癌細胞を含む組織サンプルであってもよく、この組織は、固定されても、パラフィン包埋されても、または新鮮であってももしくは凍結されてもよい。

特定の実施形態では、この組織は、微細な針、コアまたは他のタイプの生検由来である。

別の実施形態では、この組織サンプルは、微細針吸引、気管支洗浄または経気管支生検によって得られる。

上記予後予測ＲＮＡ転写物（単数または複数）の発現レベルは、例えば、ＲＴ−ＰＣＲまたは他のＰＣＲに基づく方法、免疫組織化学、プロテオミクス技術、もしくは当該分野で公知の任意の他の方法、またはそれらの組み合わせによって決定され得る。

ある実施形態では、この予後予測ＲＮＡ転写物またはそれらの発現産物の測定のためのアッセイは、キット（単数または複数）の様式で提供される。

別の局面では、本発明は、以下の遺伝子：ＴＢＰ；ＩＬＴ．２；ＡＢＣＣ５；ＣＤ１８；ＧＡＴＡ３；ＤＩＣＥＲ１；ＭＳＨ３；ＧＢＰ１；ＩＲＳ１；ＣＤ３ｚ；ｆａｓ１；ＴＵＢＢ；ＢＡＤ；ＥＲＣＣ１；ＭＣＭ６；ＰＲ；ＡＰＣ；ＧＧＰＳ１；ＫＲＴ１８；ＥＳＲＲＧ；Ｅ２Ｆ１；ＡＫＴ２；Ａ．カテニン；ＣＥＧＰ１；ＮＰＤ００９；ＭＡＰＫ１４；ＲＵＮＸ１；ＩＤ２；Ｇ．カテニン；ＦＢＸＯ５；ＦＨＩＴ；ＭＴＡ１；ＥＲＢＢ４；ＦＵＳ；ＢＢＣ３；ＩＧＦ１Ｒ；ＣＤ９；ＴＰ５３ＢＰ１；ＭＵＣ１；ＩＧＦＢＰ５；ｒｈｏＣ；ＲＡＬＢＰ１；ＣＤＣ２０；ＳＴＡＴ３；ＥＲＫ１；ＨＬＡ．ＤＰＢ１；ＳＧＣＢ；ＣＧＡ；ＤＨＰＳ；ＭＧＭＴ；ＣＲＩＰ２；ＭＭＰ１２；ＥｒｂＢ３；ＲＡＰ１ＧＤＳ１；ＣＤＣ２５Ｂ；ＩＬ６；ＣＣＮＤ１；ＣＹＢＡ；ＰＲＫＣＤ；ＤＲ４；ヘプシン；ＣＲＡＢＰ１；ＡＫ０５５６９９；コンティグ．５１０３７；ＶＣＡＭ１；ＦＹＮ；ＧＲＢ７；ＡＫＡＰ．２；ＲＡＳＳＦ１；ＭＣＰ１；ＺＮＦ３８；ＭＣＭ２；ＧＢＰ２；ＳＥＭＡ３Ｆ；ＣＤ３１；ＣＯＬ１Ａ１；ＥＲ２；ＢＡＧ１；ＡＫＴ１；ＣＯＬ１Ａ２；ＳＴＡＴ１；Ｗｎｔ．５ａ；ＰＴＰＤ１；ＲＡＢ６Ｃ；ＴＫ１、ＥｒｂＢ２、ＣＣＮＢ１、ＢＩＲＣ５、ＳＴＫ６、ＭＫＩ６７、ＭＹＢＬ２、ＭＭＰ１１、ＣＴＳＬ２、ＣＤ６８、ＧＳＴＭ１、ＢＣＬ２、ＥＳＲ１のうちの複数に対してハイブリダイズするポリヌクレオチドを含むアレイに関する。

ある実施形態では、このアレイは、以下の遺伝子：ＴＢＰ；ＩＬＴ．２；ＡＢＣＣ５；ＣＤ１８；ＧＡＴＡ３；ＤＩＣＥＲ１；ＭＳＨ３；ＧＢＰ１；ＩＲＳ１；ＣＤ３ｚ；ｆａｓ１；ＴＵＢＢ；ＢＡＤ；ＥＲＣＣ１；ＭＣＭ６；ＰＲ；ＡＰＣ；ＧＧＰＳ１；ＫＲＴ１８；ＥＳＲＲＧ；Ｅ２Ｆ１；ＡＫＴ２；Ａ．カテニン；ＣＥＧＰ１；ＮＰＤ００９；ＭＡＰＫ１４；ＲＵＮＸ１；ＩＤ２；Ｇ．カテニン；ＦＢＸＯ５；ＦＨＩＴ；ＭＴＡ１；ＥＲＢＢ４；ＦＵＳ；ＢＢＣ３；ＩＧＦ１Ｒ；ＣＤ９；ＴＰ５３ＢＰ１；ＭＵＣ１；ＩＧＦＢＰ５；ｒｈｏＣ；ＲＡＬＢＰ１；ＣＤＣ２０；ＳＴＡＴ３；ＥＲＫ１；ＨＬＡ．ＤＰＢ１；ＳＧＣＢ；ＣＧＡ；ＤＨＰＳ；ＭＧＭＴ；ＣＲＩＰ２；ＭＭＰ１２；ＥｒｂＢ３；ＲＡＰ１ＧＤＳ１；ＣＤＣ２５Ｂ；ＩＬ６；ＣＣＮＤ１；ＣＹＢＡ；ＰＲＫＣＤ；ＤＲ４；ヘプシン；ＣＲＡＢＰ１；ＡＫ０５５６９９；コンティグ．５１０３７；ＶＣＡＭ１；ＦＹＮ；ＧＲＢ７；ＡＫＡＰ．２；ＲＡＳＳＦ１；ＭＣＰ１；ＺＮＦ３８；ＭＣＭ２；ＧＢＰ２；ＳＥＭＡ３Ｆ；ＣＤ３１；ＣＯＬ１Ａ１；ＥＲ２；ＢＡＧ１；ＡＫＴ１；ＣＯＬ１Ａ２；ＳＴＡＴ１；Ｗｎｔ．５ａ；ＰＴＰＤ１；ＲＡＢ６Ｃ；ＴＫ１のうちの複数に対してハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む。

別の実施形態では、このアレイは、以下の遺伝子：ＩＬＴ．２；ＣＤ１８；ＧＢＰ１；ＣＤ３ｚ；ｆａｓ１；ＭＣＭ６；Ｅ２Ｆ１；ＩＤ２；ＦＢＸＯ５；ＣＤＣ２０；ＨＬＡ．ＤＰＢ１；ＣＧＡ；ＭＭＰ１２；ＣＤＣ２５Ｂ；ＩＬ６；ＣＹＢＡ；ＤＲ４；ＣＲＡＢＰ１；コンティグ．５１０３７；ＶＣＡＭ１；ＦＹＮ；ＧＲＢ７；ＡＫＡＰ．２；ＲＡＳＳＦ１；ＭＣＰ１；ＭＣＭ２；ＧＢＰ２；ＣＤ３１；ＥＲ２；ＳＴＡＴ１；ＴＫ１；ＥＲＢＢ２、ＣＣＮＢ１、ＢＩＲＣ５、ＳＴＫ６、ＭＫＩ６７、ＭＹＢＬ２、ＭＭＰ１１、ＣＴＳＬ２およびＣＤ６８のうちの複数に対してハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む。

さらに別の実施形態では、このアレイは、以下の遺伝子：ＩＬＴ．２；ＣＤ１８；ＧＢＰ１；ＣＤ３ｚ；ｆａｓ１；ＭＣＭ６；Ｅ２Ｆ１；ＩＤ２；ＦＢＸＯ５；ＣＤＣ２０；ＨＬＡ．ＤＰＢ１；ＣＧＡ；ＭＭＰ１２；ＣＤＣ２５Ｂ；ＩＬ６；ＣＹＢＡ；ＤＲ４；ＣＲＡＢＰ１；コンティグ．５１０３７；ＶＣＡＭ１；ＦＹＮ；ＧＲＢ７；ＡＫＡＰ．２；ＲＡＳＳＦ１；ＭＣＰ１；ＭＣＭ２；ＧＢＰ２；ＣＤ３１；ＥＲ２；ＳＴＡＴ１；ＴＫ１のうちの複数に対してハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む。

またさらなる実施形態では、このアレイは、以下の遺伝子：ＴＢＰ；ＡＢＣＣ５；ＧＡＴＡ３；ＤＩＣＥＲ１；ＭＳＨ３；ＩＲＳ１；ＴＵＢＢ；ＢＡＤ；ＥＲＣＣ１；ＰＲ；ＡＰＣ；ＧＧＰＳ１；ＫＲＴ１８；ＥＳＲＲＧ；ＡＫＴ２；Ａ．カテニン；ＣＥＧＰ１；ＮＰＤ００９；ＭＡＰＫ１４；ＲＵＮＸ１；Ｇ．カテニン；ＦＨＩＴ；ＭＴＡ１；ＥｒｂＢ４；ＦＵＳ；ＢＢＣ３；ＩＧＦ１Ｒ；ＣＤ９；ＴＰ５３ＢＰ１；ＭＵＣ１；ＩＧＦＢＰ５；ｒｈｏＣ；ＲＡＬＢＰ１；ＳＴＡＴ３；ＥＲＫ１；ＳＧＣＢ；ＤＨＰＳ；ＭＧＭＴ；ＣＲＩＰ２；ＥｒｂＢ３；ＲＡＰ１ＧＤＳ１；ＣＣＮＤ１；ＰＲＫＣＤ；ヘプシン；ＡＫ０５５６９９；ＺＮＦ３８；ＳＥＭＡ３Ｆ；ＣＯＬ１Ａ１；ＢＡＧ１；ＡＫＴ１；ＣＯＬ１Ａ２；Ｗｎｔ．５ａ；ＰＴＰＤ１；ＲＡＢ６Ｃ；ＧＳＴＭ１、ＢＣＬ２、ＥＳＲ１のうちの複数に対してハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む。

別の実施形態では、このアレイは、以下の遺伝子：ＴＢＰ；ＡＢＣＣ５；ＧＡＴＡ３；ＤＩＣＥＲ１；ＭＳＨ３；ＩＲＳ１；ＴＵＢＢ；ＢＡＤ；ＥＲＣＣ１；ＰＲ；ＡＰＣ；ＧＧＰＳ１；ＫＲＴ１８；ＥＳＲＲＧ；ＡＫＴ２；Ａ．カテニン；ＣＥＧＰ１；ＮＰＤ００９；ＭＡＰＫ１４；ＲＵＮＸ１；Ｇ．カテニン；ＦＨＩＴ；ＭＴＡ１；ＥｒｂＢ４；ＦＵＳ；ＢＢＣ３；ＩＧＦ１Ｒ；ＣＤ９；ＴＰ５３ＢＰ１；ＭＵＣ１；ＩＧＦＢＰ５；ｒｈｏＣ；ＲＡＬＢＰ１；ＳＴＡＴ３；ＥＲＫ１；ＳＧＣＢ；ＤＨＰＳ；ＭＧＭＴ；ＣＲＩＰ２；ＥｒｂＢ３；ＲＡＰ１ＧＤＳ１；ＣＣＮＤ１；ＰＲＫＣＤ；ヘプシン；ＡＫ０５５６９９；ＺＮＦ３８；ＳＥＭＡ３Ｆ；ＣＯＬ１Ａ１；ＢＡＧ１；ＡＫＴ１；ＣＯＬ１Ａ２；Ｗｎｔ．５ａ；ＰＴＰＤ１；ＲＡＢ６Ｃのうちの複数に対してハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む。

種々の実施形態では、このアレイは、このようなポリヌクレオチドのうちの少なくとも５つ、または少なくとも１０個、または少なくとも１５個、または少なくとも１０個を含む。

特定の実施形態では、このアレイは、上記で列挙された遺伝子のうちの全てに対してハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む。

別の特定の実施形態では、このアレイは、同じ遺伝子に対してハイブリダイズする１より多いポリヌクレオチドを含む。

別の実施形態では、このポリヌクレオチドのうちの少なくとも１つが、イントロンに基づく配列であって、その発現が対応するエキソン配列の発現と相関している配列を含む。

種々の実施形態では、このポリヌクレオチドはｃＤＮＡであってもまたはオリゴヌクレオチドであり得る。

別の局面では、本発明は、患者の個人化されたゲノミクスプロフィールを調製する方法であって、以下の工程：
（ａ）この患者から得た癌細胞において、ＴＢＰ；ＩＬＴ．２；ＡＢＣＣ５；ＣＤ１８；ＧＡＴＡ３；ＤＩＣＥＲ１；ＭＳＨ３；ＧＢＰ１；ＩＲＳ１；ＣＤ３ｚ；ｆａｓ１；ＴＵＢＢ；ＢＡＤ；ＥＲＣＣ１；ＭＣＭ６；ＰＲ；ＡＰＣ；ＧＧＰＳ１；ＫＲＴ１８；ＥＳＲＲＧ；Ｅ２Ｆ１；ＡＫＴ２；Ａ．カテニン；ＣＥＧＰ１；ＮＰＤ００９；ＭＡＰＫ１４；ＲＵＮＸ１；ＩＤ２；Ｇ．カテニン；ＦＢＸＯ５；ＦＨＩＴ；ＭＴＡ１；ＥＲＢＢ４；ＦＵＳ；ＢＢＣ３；ＩＧＦ１Ｒ；ＣＤ９；ＴＰ５３ＢＰ１；ＭＵＣ１；ＩＧＦＢＰ５；ｒｈｏＣ；ＲＡＬＢＰ１；ＣＤＣ２０；ＳＴＡＴ３；ＥＲＫ１；ＨＬＡ．ＤＰＢ１；ＳＧＣＢ；ＣＧＡ；ＤＨＰＳ；ＭＧＭＴ；ＣＲＩＰ２；ＭＭＰ１２；ＥｒｂＢ３；ＲＡＰ１ＧＤＳ１；ＣＤＣ２５Ｂ；ＩＬ６；ＣＣＮＤ１；ＣＹＢＡ；ＰＲＫＣＤ；ＤＲ４；ヘプシン；ＣＲＡＢＰ１；ＡＫ０５５６９９；コンティグ．５１０３７；ＶＣＡＭ１；ＦＹＮ；ＧＲＢ７；ＡＫＡＰ．２；ＲＡＳＳＦ１；ＭＣＰ１；ＺＮＦ３８；ＭＣＭ２；ＧＢＰ２；ＳＥＭＡ３Ｆ；ＣＤ３１；ＣＯＬ１Ａ１；ＥＲ２；ＢＡＧ１；ＡＫＴ１；ＣＯＬ１Ａ２；ＳＴＡＴ１；Ｗｎｔ．５ａ；ＰＴＰＤ１；ＲＡＢ６Ｃ；ＴＫ１、ＥｒｂＢ２、ＣＣＮＢ１、ＢＩＲＣ５、ＳＴＫ６、ＭＫＩ６７、ＭＹＢＬ２、ＭＭＰ１１、ＣＴＳＬ２、ＣＤ６８、ＧＳＴＭ１、ＢＣＬ２、ＥＳＲ１からなる群より選択される遺伝子または遺伝子セットのＲＮＡ転写物または発現産物の正規化された発現レベルを決定する工程と；
（ｂ）この遺伝子発現分析によって得られたデータを要約している報告を作成する工程と；を包含する方法に関する。

特定の実施形態では、ＩＬＴ．２；ＣＤ１８；ＧＢＰ１；ＣＤ３ｚ；ｆａｓ１；ＭＣＭ６；Ｅ２Ｆ１；ＩＤ２；ＦＢＸＯ５；ＣＤＣ２０；ＨＬＡ．ＤＰＢ１；ＣＧＡ；ＭＭＰ１２；ＣＤＣ２５Ｂ；ＩＬ６；ＣＹＢＡ；ＤＲ４；ＣＲＡＢＰ１；コンティグ．５１０３７；ＶＣＡＭ１；ＦＹＮ；ＧＲＢ７；ＡＫＡＰ．２；ＲＡＳＳＦ１；ＭＣＰ１；ＭＣＭ２；ＧＢＰ２；ＣＤ３１；ＥＲ２；ＳＴＡＴ１；ＴＫ１；ＥＲＢＢ２、ＣＣＮＢ１、ＢＩＲＣ５、ＳＴＫ６、ＭＫＩ６７、ＭＹＢＬ２、ＭＭＰ１１、ＣＴＳＬ２およびＣＤ６８のうちの１つ以上；またはその対応する発現産物の発現増大が確認される場合、上記報告は、上記患者が化学療法に対する応答の可能性が増大しているという予測を含む。この場合、特定の実施形態では、この方法は、化学療法剤を用いて上記患者を処置するさらなる工程を包含する。

前述の方法では、ＴＢＰ；ＡＢＣＣ５；ＧＡＴＡ３；ＤＩＣＥＲ１；ＭＳＨ３；ＩＲＳ１；ＴＵＢＢ；ＢＡＤ；ＥＲＣＣ１；ＰＲ；ＡＰＣ；ＧＧＰＳ１；ＫＲＴ１８；ＥＳＲＲＧ；ＡＫＴ２；Ａ．カテニン；ＣＥＧＰ１；ＮＰＤ００９；ＭＡＰＫ１４；ＲＵＮＸ１；Ｇ．カテニン；ＦＨＩＴ；ＭＴＡ１；ＥｒｂＢ４；ＦＵＳ；ＢＢＣ３；ＩＧＦ１Ｒ；ＣＤ９；ＴＰ５３ＢＰ１；ＭＵＣ１；ＩＧＦＢＰ５；ｒｈｏＣ；ＲＡＬＢＰ１；ＳＴＡＴ３；ＥＲＫ１；ＳＧＣＢ；ＤＨＰＳ；ＭＧＭＴ；ＣＲＩＰ２；ＥｒｂＢ３；ＲＡＰ１ＧＤＳ１；ＣＣＮＤ１；ＰＲＫＣＤ；ヘプシン；ＡＫ０５５６９９；ＺＮＦ３８；ＳＥＭＡ３Ｆ；ＣＯＬ１Ａ１；ＢＡＧ１；ＡＫＴ１；ＣＯＬ１Ａ２；Ｗｎｔ．５ａ；ＰＴＰＤ１；ＲＡＢ６Ｃ；ＧＳＴＭ１、ＢＣＬ２、ＥＳＲ１；または対応する発現産物のうちの１つ以上の発現増大が確認される場合、上記報告は、上記被験体が化学療法に対する応答の可能性が低下しているという予測を含む。

別の局面では、本発明は、化学療法に対する患者の応答の可能性を決定するための方法であって：
（ａ）以下の遺伝子ＡＣＴＢ、ＢＡＧ１、ＢＣＬ２、ＣＣＮＢ１、ＣＤ６８、ＳＣＵＢＥ２、ＣＴＳＬ２、ＥＳＲ１、ＧＡＰＤ、ＧＲＢ７、ＧＳＴＭ１、ＧＵＳＢ、ＥＲＢＢ２、ＭＫＩ６７、ＭＹＢＬ２、ＰＧＲ、ＲＰＬＰＯ、ＳＴＫ６、ＭＭＰ１１、ＢＩＲＣ５、ＴＦＲＣのＲＮＡ転写物、またはそれらの発現産物の発現レベルを決定する工程と；
（ｂ）再発スコア（ＲＳ）を算出する工程と；を包含する方法に関する。

ある実施形態では、ＲＳが５０を超える患者は、化学療法に対して応答する可能性が高い患者の上方の５０パーセントにある。

ある実施形態では、ＲＳが３５未満である患者は、化学療法に対して応答する可能性が高い患者の下方の５０パーセントにある。

さらなる実施形態では、ＲＳは、以下の遺伝子サブセット：
（ｉ）増殖因子サブセット：ＧＲＢ７およびＨＥＲ２；
（ｉｉ）エストロゲンレセプターサブセット：ＥＲ、ＰＲ、Ｂｃｌ２およびＣＥＧＰ１；
（ｉｉｉ）増殖サブセット：ＳＵＲＶ、Ｋｉ．６７、ＭＹＢＬ２、ＣＣＮＢ１、およびＳＴＫ１５；ならびに
（ｉｖ）浸潤サブセット：ＣＴＳＬ２、およびＳＴＭＹ３；
を作製する工程であって、
ここで、任意のサブセット（ｉ）〜（ｉｖ）内の遺伝子が、この腫瘍において０．４０以上というピアソン相関係数でこの遺伝子と同時発現する代替遺伝子によって置換され得る工程と；
（ｃ）サブセット（ｉ）〜（ｉｖ）の各々の寄与を重み付けすることによってこの被験体の乳癌再発に対する再発スコア（ＲＳ）を算出する工程と；によって、決定される。

前述の方法はさらに、ＣＤ６８、ＧＳＴＭ１およびＢＡＧ１のＲＮＡ転写物、もしくはそれらの発現産物、または対応する代替遺伝子もしくはそれらの発現産物を決定する工程と、ＲＳの算出において乳癌再発に対するこの遺伝子または代替遺伝子の寄与を含める工程とを包含し得る。

ＲＳは例えば、以下の式：
ＲＳ＝（０．２３〜０．７０）×ＧＲＢ７ａｘｉｓｔｈｒｅｓｈ−（０．１７〜０．５５）×ＥＲａｘｉｓ＋（０．５２〜１．５６）×ｐｒｏｌｉｆａｘｉｓｔｈｒｅｓｈ＋（０．０７〜０．２１）×ｉｎｖａｓｉｏｎａｘｉｓ＋（０．０３〜０．１５）×ＣＤ６８−（０．０４〜０．２５）×ＧＳＴＭ１−（０．０５〜０．２２）×ＢＡＧ１
を用いることによって決定され得、
ここで
（ｉ）ＧＲＢ７ ａｘｉｓ＝（０．４５〜１．３５）×ＧＲＢ７＋（０．０５〜０．１５）×ＨＥＲ２；
（ｉｉ）ＧＲＢ７ ａｘｉｓ＜−２であるならば、ＧＲＢ７ ａｘｉｓ ｔｈｒｅｓｈ＝−２であり、かつＧＲＢ７ ａｘｉｓ≧−２であるならば、ＧＲＢ７ ａｘｉｓ ｔｈｒｅｓｈ＝ＧＲＢ７ ａｘｉｓであり；
（ｉｉｉ）ＥＲ ａｘｉｓ＝（Ｅｓｔ１＋ＰＲ＋Ｂｃｌ２＋ＣＥＧＰ１）／４；
（ｉｖ）ｐｒｏｌｉｆａｘｉｓ＝（ＳＵＲＶ＋Ｋｉ．６７＋ＭＹＢＬ２＋ＣＣＮＢ１＋ＳＴＫ１５）／５；
（ｖ）ｐｒｏｌｉｆａｘｉｓ＜−３．５であるならば、ｐｒｏｌｉｆａｘｉｓｔｈｒｅｓｈ＝−３．５であり、
ｐｒｏｌｉｆａｘｉｓ≧−３．５であるならば、ｐｒｏｌｉｆａｘｉｓｈｒｅｓｈ＝ｐｒｏｌｉｆａｘｉｓであり；そして
（ｖｉ）ｉｎｖａｓｉｏｎａｘｉｓ＝（ＣＴＳＬ２＋ＳＴＭＹ３）／２
であり、
ここで（ｉｉｉ）、（ｉｖ）および（ｖｉ）における遺伝子の個々の寄与は、０．５〜１．５の係数で重み付けされ、かつＲＳが高いほど、乳癌再発の可能性の増大を示す。

別の実施形態では、ＲＳは以下の式：
ＲＳ（範囲、０〜１００）＝＋０．４７×ＨＥＲ２群スコア
−０．３４×ＥＲ群スコア
＋１．０４×増殖群スコア
＋０．１０×浸潤群スコア
＋０．０５×ＣＤ６８
−０．０８×ＧＳＴＭ１
−０．０７×ＢＡＧ１
を用いることによって決定される。

表１は、その発現が正にまたは負に相関する遺伝子のリストを、アドリアマイシンおよびタキサンの新補助化学療法に対する乳癌応答とともに示す。病理学上の完全寛解のエンドポイントでの臨床トライアルからの結果。統計学的な分析は、プロビットリンク関数とともに一変量一般化線形モデルを利用した。

表２は、その発現が化学療法に対する乳癌応答を予測する遺伝子のリストを示す。レトロスペクティブな臨床トライアルからの結果。この表は、遺伝子のアクセッション番号、ＰＣＲ増幅に用いた順方向プライマーおよび逆方向プライマー（それぞれ、「ｆ」および「ｒ」で示す）およびプローブ（「ｐ」で示す）の配列を含む。

表３は、示した遺伝子のＰＣＲ増幅において用いられるアンプリコン配列を示す。

（詳細な説明）
（Ａ．定義）
他のように定義されない限り、本明細書において用いられる技術用語および科学用語は、本発明が属する当該分野の当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら、Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２版、Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ １９９４），およびＭａｒｃｈ，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、第４版、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ １９９２）は、本出願において用いられる用語の多くについての一般的手引きを当業者に与える。

当業者は、本発明の実施において用いられ得る、本明細書に記載されるのと同様または等価である多くの方法および物質を認識する。実際、本発明は決して、記載される方法および物質に限定されるものではない。本発明の目的のために、以下の用語を下に規定する。

「マイクロアレイ」という用語は、基板上の、ハイブリダイズ可能なアレイエレメント、好ましくはポリヌクレオチドプローブの規則的な配置をいう。

「ポリヌクレオチド」という用語は一般に、単数または複数形で用いる場合、任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドをいい、これは、修飾されていないＲＮＡもしくはＤＮＡであってもよく、または修飾されたＲＮＡもしくはＤＮＡであってもよい。従って、例えば、本明細書に規定されるようなポリヌクレオチドとしては、限定はしないが、一本鎖および二本鎖のＤＮＡ、一本鎖および二本鎖の領域を含むＤＮＡ、一本鎖および二本鎖のＲＮＡ、ならびに一本鎖および二本鎖の領域を含むＲＮＡ、一本鎖であるか、またはより代表的には、二本鎖であり得る、一本鎖および二本鎖の領域を含み得るＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子が挙げられる。さらに、「ポリヌクレオチド」という用語は、本明細書において用いる場合、ＲＮＡもしくはＤＮＡ、またはＲＮＡおよびＤＮＡの両方を含む三本鎖領域をいう。このような領域における鎖は、同じ分子由来であっても、または異なる分子由来であってもよい。この領域は、１つ以上の分子の全てを含み得る、より代表的には、いくつかの分子のある領域のみを含み得る。三重らせん領域の分子の１つはしばしばオリゴヌクレオチドである。「ポリヌクレオチド」という用語は詳細にはｃＤＮＡを含む。この用語は、１つ以上の修飾された塩基を含む、ＤＮＡ（ｃＤＮＡを含む）およびＲＮＡを包含する。従って、安定性に関して、または他の理由に関して修飾された骨格を有するＤＮＡまたはＲＮＡが、その用語が本明細書において意図されるとおりの「ポリヌクレオチド」である。さらに、イノシンのような通常でない塩基、またはトリチウム化した塩基のような修飾された塩基を含むＤＮＡまたはＲＮＡは、本明細書に規定される「ポリヌクレオチド」という用語に含まれる。一般に、「ポリヌクレオチド」という用語は、修飾されていないポリヌクレオチドの全ての化学的に、酵素的におよび／または代謝的に修飾された形態、そしてウイルスならびに単純細胞および複雑型細胞を含む細胞に特徴的なＤＮＡおよびＲＮＡの化学的形態を包含する。

「オリゴヌクレオチド」という用語は、比較的短いポリヌクレオチドであって、限定はしないが、一本鎖デオキシリボヌクレオチド、一本鎖または二本鎖のリボヌクレオチド、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドおよび二本鎖ＤＮＡを含むポリヌクレオチドをいう。一本鎖ＤＮＡプローブオリゴヌクレオチドのようなオリゴヌクレオチドはしばしば、化学的方法によって、例えば、市販されている自動オリゴヌクレオチドシンセサイザーを用いて合成される。しかし、オリゴヌクレオチドは、インビトロの組み換えＤＮＡ媒介性技術を含む種々の他の方法によって、そして細胞および器官のＤＮＡの発現によって作成され得る。

「示差的に発現される遺伝子」、「示差的な遺伝子発現」という用語、および交換可能に用いられるそれらの同義語は、遺伝子であって、疾患、特に乳癌のような癌に罹患している被験体において、正常またはコントロールの被験体におけるその発現に対して、高レベルまたは低レベルまでその発現が活性化される遺伝子をいう。この用語はまた、遺伝子であって、同じ疾患の種々の段階で高レベルまたは低レベルまでその発現が活性化される遺伝子をいう。示差的に発現された遺伝子は、核酸レベルもしくはタンパク質レベルで活性化されても阻害されてもよく、または種々のポリペプチド産物を生じるように選択的スプライシングに供されてもよいということも理解される。このような相違は、例えば、ｍＲＮＡレベル、表面発現、分泌またはポリペプチドの他の区分における変化によって証明され得る。示差的な遺伝子発現は、正常な被験体と、疾患、詳細には癌に罹患している被験体との間で、または同じ疾患の種々の段階の間で異なる、２つ以上の遺伝子またはそれらの遺伝子産物の間の発現の比較、または２つ以上の遺伝子もしくはそれらの遺伝子産物の間の発現の比の比較、または同じ遺伝子の２つの示差的にプロセシングされた産物の比較さえ含み得る。示差的な発現としては、例えば、正常なおよび疾患の細胞の間での、または異なる疾患状態もしくは疾患段階を被っている細胞の間での、遺伝子またはその発現産物における一時的なまたは細胞の発現パターンにおける、定量的、そして定性的な相違の両方が挙げられる。本発明の目的に関しては、正常なおよび疾患の被験体において、または疾患状態の被験体における疾患の発達の種々の段階において、所定の遺伝子の発現の間に少なくとも約２倍、好ましくは少なくとも約４倍、より好ましくは少なくとも約６倍、最も好ましくは少なくとも約１０倍の相違が存在する場合に、「示差的な遺伝子発現」が存在するとみなされる。

遺伝子転写物または遺伝子発現産物に関して「正規化された（ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ）」という用語は、参照遺伝子のセットの転写物／産物の平均レベルに対する、その転写物または遺伝子発現産物のレベルをいい、ここで、この参照遺伝子は、それらの最小変動交差（ｍｉｎｉｍａｌ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ａｃｒｏｓｓ）、患者、組織もしくは処置（「ハウスキーピング遺伝子」）のいずれかに基づいて選択されるか、またはこの参照遺伝子は、試験された遺伝子の全体である。後者の場合、これは一般に「全体的な正規化（ｇｌｏｂａｌ ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ）」と呼ばれ、試験した遺伝子の総数が相対的に大きい、好ましくは５０より大きいことが重要である。詳細には、ＲＮＡ転写物に関する「正規化された」という用語は、１セットの参照遺伝子の転写物レベルの平均に対するこの転写物のレベルをいう。さらに詳細には、ＲＮＡ転写物の平均レベルとは、ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＲＴ−ＰＣＲによって測定した場合、１セットの参照遺伝子転写物のＣｔ値から平均Ｃｔ値を引いた値をいう。

「発現閾値」および「規定の発現閾値」という用語は、交換可能に用いられて、問題となっているある遺伝子または遺伝子産物のレベルであって、その遺伝子または遺伝子産物がそれを上回れば、ある薬物に対する患者の応答または耐性についての予測マーカーとして機能するレベルをいう。この閾値は代表的には、臨床研究から実験的に規定される。この発現閾値は、最大感度（例えば、薬物に対する全ての応答因子を検出するため）について、または最大選択性（例えば、薬物に対する唯一の応答因子を検出するため）について、または最小誤差についてのいずれかのために選択され得る。

「遺伝子増幅」という句は、遺伝子または遺伝子フラグメントの複数のコピーが特定の細胞または細胞株で形成されるプロセスをいう。重複領域（増幅したＤＮＡのストレッチ）はしばしば、「アンプリコン」と呼ばれる。しばしば、生成されたメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の量、すなわち遺伝子発現のレベルはまた、特定の遺伝子からなるコピーの数に対して割合が増大する。

「予後予測（ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ）」という用語は、本明細書において用いる場合、乳癌のような腫瘍性疾患の再発、転移性の伝播および薬物耐性を含む、癌が寄与する死亡または進行の可能性の予測を指す。「予測（ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ）」という用語は、本明細書において用いる場合、患者が薬物または薬物のセットに対して有利にまたは不利にかのいずれかで応答する可能性、およびまたそれらの応答の程度、または原発性腫瘍の外科的な除去、および／または特定の期間にわたる化学療法の後に、癌の再発なしに患者が生存することをいう。本発明の予測方法は、任意の特定の患者について最も適切な処置様式を選択することによって処置決定を行うために臨床上用いられ得る。本発明の予測方法は、患者が処置レジメン、例えば、外科的介入、所定の薬物もしくは薬物の併用での化学療法および／もしくは放射線療法に対して有利に応答する可能性が高いか否か、あるいは手術後および／または化学療法もしくは他の処置様式の終了後に、患者の長期生存の可能性が高いか否かを予測するのにおける有用なツールである。

「長期」生存という用語は、本明細書において用いる場合、外科手術または他の処置後、少なくとも３年間、より好ましくは少なくとも８年間、最も好ましくは少なくとも１０年間の生存をいう。

「腫瘍」という用語は、本明細書において用いる場合、悪性であろうと良性であろうと、全ての新生物細胞増殖および増殖、ならびに全ての前癌状態および癌性の細胞および組織をいう。

「癌」および「癌性の」という用語は、制御されない細胞増殖によって代表的には特徴付けられる、哺乳動物における生理学的状態を指すか、またはそれを表現する。癌の例としては、限定はしないが、乳癌、結腸癌、肺癌、前立腺癌、肝細胞性癌、胃癌、膵臓癌、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、尿路の癌、甲状腺癌、腎臓癌、癌腫、黒色腫および脳腫瘍が挙げられる。

癌の「病理」としては、患者の健康を損なう全ての現象が挙げられる。これには、限定はしないが、異常または制御不能の細胞増殖、転移、隣接する細胞の正常な機能の妨害、サイトカインまたは他の分泌産物の異常なレベルでの放出、炎症または免疫学的応答の抑制または悪化、新生物形成、前悪性状態、悪性腫瘍、周囲または別個の組織または器官、例えばリンパ節の浸潤などが挙げられる。

「患者応答（ｐａｔｉｅｎｔ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）」は、患者の利点を示す任意のエンドポイントを用いて評価され得、これには、限定はしないが、（１）腫瘍増殖のある程度までの阻害であって、減速および完全な増殖停止を含む阻害；（２）腫瘍細胞の数の減少；（３）腫瘍サイズの減少；（４）隣接する末梢の器官および／または組織への腫瘍細胞浸潤の阻害（すなわち、減少、減速または完全な停止）；（５）転移の阻害（すなわち、減少、減速または完全な停止）；（６）腫瘍の退行または拒絶を生じ得るが、必ずしも生じる必要はない、抗腫瘍免疫応答の強化；（７）腫瘍に関連する１つ以上の症状のある程度までの軽減；（８）処置後の生存の長さの増大；および／または（９）処置後の所定の時点での死亡率の減少、が挙げられる。

「新補助療法」とは、最初の（主な）治療の前に与えられる補助的なまたは補助の治療法である。新補助療法としては、例えば、化学療法、放射線療法、およびホルモン療法が挙げられる。従って、化学療法は、腫瘍を縮小させるために手術の前に投与されてもよく、その結果、手術がより有効なるか、または以前には処置不能であった腫瘍の場合も可能となり得る。

ハイブリダイゼーション反応の「ストリンジェンシー」は、当業者に容易に決定可能であり、そして一般には、プローブ長、洗浄温度および塩濃度に依存した、経験的な計算である。一般にはプローブが長いほど、適切なアニーリングには高い温度が必要になるが、プローブが短いほど、低い温度が必要である。ハイブリダイゼーションは一般に、相補的な鎖がそれらの融点より低い環境にある場合、変性されたＤＮＡが再アニーリングする能力に依存する。プローブとハイブリダイズ可能な配列との間の所望の相同性の程度が高いほど、用いられ得る相対的な温度は高い。結果として、相対的な温度が高いほど、よりストリンジェントな反応条件が行われる傾向であるが、温度が低いほど、ストリンジェンシーは低くなるということになる。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーのさらなる詳細および説明については、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９９５）を参照のこと。

「ストリンジェントな条件」または「高ストリンジェンシー条件」とは、本明細書において定義されるとおり、代表的には：（１）洗浄のために、低いイオン強度および高温、例えば、０．０１５Ｍの塩化ナトリウム／０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム／０．１％のドデシル硫酸ナトリウム、５０℃を使用するか；（２）ハイブリダイゼーションの間に、変性剤、例えば、ホルムアミド、例えば、５０％（ｖ／ｖ）のホルムアミドと０．１％のウシ血清アルブミン／０．１％のＦｉｃｏｌｌ／０．１％のポリビニルピロリドン／５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）と７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭのクエン酸ナトリウムとを４２℃で使用するか；または（３）５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５ＭのＮａＣｌ、０．０７５Ｍのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５×デンハート溶液、超音波処理したサケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％のＳＤＳ、および１０％硫酸デキストランを４２℃で使用し、４２℃で、０．２×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）および５０％ホルミアミドを用いて５５℃で洗浄し、続いて５５℃でＥＤＴＡを含む０．１×ＳＳＣからなる高ストリンジェンシーの洗浄をする。

「中度にストリンジェントな条件」とは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，１９８９によって記載されるように特定され得、そして上記で記載された条件よりもストリンジェントが低い洗浄溶液およびハイブリダイゼーション条件（例えば、温度、イオン強度およびＳＤＳの％）の使用を包含する。中度にストリンジェントな条件の例は、２０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート溶液、１０％硫酸デキストランおよび２０ｍｇ／ｍｌの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中での３７℃での一晩のインキュベーション、その後の１×ＳＳＣ中での約３７〜５０℃でのフィルターの洗浄である。当業者は、プローブ長などのような調節因子に対して必要な場合、温度、イオン強度などを調節する方法を承知している。

本発明の状況では、任意の特定の遺伝子セットに列挙された遺伝子の「少なくとも１つ」、「少なくとも２つ」、「少なくとも５つ」などに対する言及は、列挙された遺伝子のいずれか１つまたは任意のおよび全ての組み合わせを意味する。

（Ｂ．詳細な説明）
本発明の実施は、他に示さない限り、当該分野の技術の範囲内である、分子生物学（組み換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、および生物化学の従来の技術を使用する。このような技術は、文献、例えば、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」，第２版、（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４）；「Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ」（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編，１９８７）；「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；「Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、第４版（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ ＆ Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．，１９８７）；「Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ」（Ｊ．Ｍ．ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編１９８７）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編，１９８７）；および「ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ」、（Ｍｕｌｌｉｓら編，１９９４）に詳細に説明される。

（１．遺伝子発現プロファイリング）
遺伝子発現プロファイリングの方法としては、ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション分析に基づく方法、ポリヌクレオチドの配列決定に基づく方法、およびプロテオミクスに基づく方法が挙げられる。サンプル中のｍＲＮＡ発現の定量のために当該分野で公知の最も一般的に用いられる方法としては、ノーザンブロットおよびインサイチュハイブリダイゼーション（ＰａｒｋｅｒおよびＢａｒｎｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １０６：２４７−２８３（１９９９））；ＲＮＡｓｅ保護アッセイ（ＲＮＡｓｅ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｓｓａｙｓ）（Ｈｏｄ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １３：８５２〜８５４（１９９２））；およびＰＣＲに基づく方法、例えば、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）（Ｗｅｉｓら、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ８：２６３−２６４（１９９２））が挙げられる。あるいは、ＤＮＡ二重鎖、ＲＮＡ二重鎖およびＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二重鎖またはＤＮＡ−タンパク質二重鎖を含む特定の二重鎖を認識し得る抗体が使用され得る。配列決定に基づく遺伝子発現分析のための代表的な方法としては、連続遺伝子発現解析（Ｓｅｒｉａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）（ＳＡＧＥ）、および超並列的遺伝子ビーズクローン解析（ｍａｓｓｉｖｅｌｙ ｐａｒａｌｌｅｌ ｓｉｇｎａｔｕｒｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）（ＭＰＳＳ）が挙げられる。

（２．ＰＣＲベースの遺伝子発現プロファイリング方法）
（ａ．逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ））
最も高感度でかつ最も融通の利く定量的なＰＣＲベースの遺伝子発現プロファイリング方法の１つはＲＴ−ＰＣＲであり、これは、種々のサンプル集団における、正常組織および腫瘍組織において、ｍＲＮＡレベルを薬物処置の有無で比較して、遺伝子発現のパターンを特徴付けて、密接に関係するｍＲＮＡの間を識別し、そしてＲＮＡ構造を分析するために用いられ得る。

第一の工程は、標的サンプルからのｍＲＮＡの単離である。出発物質は代表的には、ヒト腫瘍または腫瘍細胞株から単離され、そしてそれぞれ正常な組織または細胞株に対応する、総ＲＮＡである。従って、ＲＮＡは、乳房、肺、結腸、前立腺、脳、肝臓、腎臓、膵臓、脾臓、胸腺、精巣、卵巣、子宮などの腫瘍または腫瘍細胞株を含む種々の原発性腫瘍から、健常なドナー由来のプールされたＤＮＡとともに単離され得る。ｍＲＮＡの供給源が、原発性腫瘍である場合、ｍＲＮＡは、例えば、凍結されるかまたは保管された、パラフィン包埋され、そして固定された（例えば、ホルマリン固定された）組織サンプルから抽出され得る。

ｍＲＮＡ抽出のための一般的方法は、当該分野で周知であり、そしてＡｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ（１９９７）を含む、分子生物学の標準的な教科書に開示されている。パラフィン包埋された組織からのＲＮＡ抽出のための方法は、例えば、ＲｕｐｐおよびＬｏｃｋｅｒ，Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ．５６：Ａ６７（１９８７），ならびにＤｅ Ａｎｄｒｅｓら，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １８：４２０４４（１９９５）に開示される。詳細には、ＲＮＡ単離は、商業的な製造業者、例えばＱｉａｇｅｎからの精製キット、緩衝液セットおよびプロテアーゼを用いて、製造業者の指示に従って行なわれ得る。例えば、培養中の細胞に由来する総ＲＮＡは、Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙミニカラムを用いて単離され得る。他の商業上利用可能なＲＮＡ単離キットとしては、ＭａｓｔｅｒＰｕｒｅ^ＴＭＣｏｍｐｌｅｔｅ ＤＮＡ ａｎｄ ＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ（登録商標），Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、およびＰａｒａｆｆｉｎ Ｂｌｏｃｋ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．）が挙げられる。組織サンプル由来の総ＲＮＡは、ＲＮＡ Ｓｔａｔ−６０（Ｔｅｌ−Ｔｅｓｔ）を用いて単離され得る。腫瘍から調製されたＲＮＡは、例えば、塩化セシウム密度勾配遠心分離によって単離され得る。

ＲＮＡは、ＰＣＲのためのテンプレートとして機能できないので、ＲＴ−ＰＣＲによる遺伝子発現プロファイリングにおける第一の工程は、ｃＤＮＡへのＲＮＡテンプレートの逆転写であり、その後にＰＣＲ反応におけるその指数関数的増幅が続く。２つの最も一般的に用いられる逆転写酵素は、トリ（ａｖｉｌｏ）骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素（ＡＭＶ−ＲＴ）およびモロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素（ＭＭＬＶ−ＲＴ）である。この逆転写の工程は代表的には、発現プロファイリングの状況および目的に依存して、特定のプライマー、ランダムなヘキサマーまたはオリゴ−ｄＴプライマーを用いてプライムされる。例えば、抽出されたＲＮＡは、製造業者の指示に従って、ＧｅｎｅＡｍｐ ＲＮＡ ＰＣＲキット（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて逆転写されてもよい。次いで、誘導されたｃＤＮＡは引き続くＰＣＲ反応におけるテンプレートとして用いられ得る。

ＰＣＲ工程は、種々の熱安定性ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを使用し得るが、これは代表的には、５’−３’のヌクレアーゼ活性を有するが、３’−５’のプルーフリーディングエンドヌクレアーゼ活性を欠く、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼを使用する。従って、ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲは代表的には、その標的アンプリコンに結合されたハイブリダイゼーションプローブにＴａｑポリメラーゼまたはＴｔｈポリメラーゼがハイブリダイズする５’−ヌクレアーゼ活性を利用するが、等価な５’ヌクレアーゼ活性を有する任意の酵素を用いてもよい。２つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ＰＣＲ反応の代表的なアンプリコンを生成する。第三のオリゴヌクレオチドまたはプローブは、２つのＰＣＲプライマーの間に位置するヌクレオチド配列を検出するように設計される。このプローブは、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ酵素によっては非伸長性であり、そしてレポーター蛍光色素およびクエンチャー蛍光色素で標識される。このレポーター色素からの任意のレーザー誘導性の発光は、２つの色素がプローブ上にあるように接近して一緒に配置される場合、クエンチング色素によってクエンチされる。増幅反応の間、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ酵素は、テンプレート依存性の様式でプローブを切断する。得られたプローブフラグメントは、溶液中で解離して、その遊離されたレポーター色素からのシグナルは、第二の発蛍光団のクエンチング効果を有さない。レポーター色素の１分子は、合成された各々の新しい分子について遊離されて、そしてクエンチされていないレポーター色素の検出によって、データの定量的解釈の基礎が提供される。

ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＲＴ−ＰＣＲは、市販の装備、例えば、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００^ＴＭ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ^ＴＭ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ−Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）、またはＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）などを用いて行われ得る。好ましい実施形態では、５’ヌクレアーゼ手順は、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００^ＴＭ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ^ＴＭのようなリアルタイムの定量的ＰＣＲデバイスで行われる。このシステムは、サーモサイクラー、レーザー、電荷結合素子（ＣＣＤ）、カメラおよびコンピューターから構成される。このシステムは、サーモサイクラー上の９６ウェルのフォーマットでサンプルを増幅する。増幅の間、レーザー誘導性蛍光シグナルは、９６ウェルすべてについて光ファイバーケーブルを通じてリアルタイムで集積されて、ＣＣＤで検出される。このシステムは、この装置を作動させるため、およびデータを分析するためのソフトウェアを備える。

５’−ヌクレアーゼのアッセイデータは最初は、Ｃｔとしてまたは閾値サイクルとして表される。上記で考察したとおり、蛍光値は、全サイクルの間記録されて、増幅反応におけるそのポイントに対して増幅された生成物の量を表す。蛍光シグナルが統計学的に有意であるとして最初に記録されるポイントが、閾値サイクル（Ｃｔ）である。

サンプル間の変動の誤差および効果を最小にするために、ＲＴ−ＰＣＲは通常、理想的には種々の組織の間で一定レベルで発現され、実験処理によって影響されない参照ＲＮＡを用いて行う。遺伝子発現のパターンを正規化するために最も高頻度に用いられるＲＮＡは、ハウスキーピング遺伝子のグリセルアルデヒド−３−リン酸−デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤ）およびβ−アクチン（ＡＣＴＢ）のｍＲＮＡである。

ＲＴ−ＰＣＲ技術のより最近のバリエーションは、リアルタイム定量ＰＣＲであり、これは二重標識された蛍光発生プローブ（すなわち、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ）を通じてＰＣＲ生成物の蓄積を測定する。リアルタイムＰＣＲは、各々の標的配列についての内部競合因子が正規化のために用いられる定量的競合的ＰＣＲとも、そしてサンプル内に含まれる正規化遺伝子、またはＲＴ−ＰＣＲのためのハウスキーピング遺伝子を用いる定量的競合的ＰＣＲとも適合する。さらなる詳細については、例えば、Ｈｅｌｄら，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６：９８６〜９９４（１９９６）を参照のこと。

（ｂ．ＭａｓｓＡＲＲＡＹシステム）
Ｓｅｑｕｅｎｏｍ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）によって開発された、ＭａｓｓＡＲＲＡＹベースの遺伝子発現プロファイリング方法では、ＲＮＡおよび逆転写酵素の単離後、得られたｃＤＮＡは、単独塩基以外の全ての位置で、標的されたｃＤＮＡ領域に適合しかつ内部標準として機能する合成ＤＮＡ分子（競合因子）でスパイクされる。このｃＤＮＡ／競合因子混合物をＰＣＲ増幅して、残りのヌクレオチドの脱ホスホリル化を生じるＰＣＲ後のエビアルカリホスファターゼ（ＳＡＰ）酵素処理に供する。アルカリホスファターゼの不活性化後、競合因子およびｃＤＮＡ由来のＰＣＲ生成物は、プライマー伸長に供され、これによって競合因子由来およびｃＤＮＡ由来のＰＣＲ産物についての別個の質量シグナルを作成する。精製後、これらの生成物は、チップアレイ上に分配され、これをマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ）分析での分析に必要な成分とともに事前ローディングする。次いで反応物中に存在するｃＤＮＡは、作成した質量スペクトルにおけるピーク面積の比を分析することによって定量される。さらなる詳細については、例えば、ＤｉｎｇおよびＣａｎｔｏｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １００：３０５９−３０６４（２００３）を参照のこと。

（ｃ．他のＰＣＲベースの方法）
さらなるＰＣＲベースの技術としては、例えば、ディファレンシャルディスプレイ（ＬｉａｎｇおよびＰａｒｄｅｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７：９６７〜９７１（１９９２））；増幅フラグメント長多形性（ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｌｅｎｇｔｈ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）（ｉＡＦＬＰ）（Ｋａｗａｍｏｔｏら，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．１２：１３０５〜１３１２（１９９９））；ＢｅａｄＡｒｒａｙ^ＴＭ技術（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ；Ｏｌｉｐｈａｎｔら，Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｏｆ Ｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓに対する補遺），２００２年６月；Ｆｅｒｇｕｓｏｎら，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ７２：５６１８（２０００））；遺伝子発現のための迅速なアッセイにおいて、市販のＬｕｍｉｎｅｘ^１００ＬａｂＭＡＰシステムおよび複数の色でコードされたミクロスフェア（Ｌｕｍｉｎｅｘ Ｃｏｒｐ．，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）を用いる、ＢｅａｄｓＡｒｒａｙ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（ＢＡＤＧＥ）（Ｙａｎｇら，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．１１：１８８８〜１８９８（２００１））；ならびにハイ・カバレッジ発現プロファイリング（ｈｉｇｈ ｃｏｖｅｒａｇｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ）（ＨｉＣＥＰ）分析（Ｆｕｋｕｍｕｒａら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．３１（１６）ｅ９４（２００３））が挙げられる。

（３．マイクロアレイ）
示差的遺伝子発現はまた、マイクロアレイ技術を用いて同定されてもよいし、確認されてもよい。従って、乳癌関連遺伝子の発現プロファイルは、マイクロアレイ技術を用いて、新鮮な腫瘍組織、またはパラフィン包埋された腫瘍組織のいずれかにおいて測定され得る。この方法では、目的のポリヌクレオチド配列（ｃＤＮＡおよびオリゴヌクレオチドを含む）を、マイクロチップ基板上にプレートするか、配列する。次いで、この配列された配列を目的の細胞または組織由来の特定のＤＮＡプローブとハイブリダイズさせる。ちょうどＲＴ−ＰＣＲ法でのとおり、ｍＲＮＡの供給源は、代表的には、ヒト腫瘍または腫瘍細胞株、および対応する正常な組織または細胞株から単離される総ＲＮＡである。従って、ＲＮＡは、種々の原発性腫瘍または腫瘍細胞株から単離され得る。ｍＲＮＡの供給源が原発性腫瘍である場合、ｍＲＮＡは、例えば、凍結されるかまたは保管された、パラフィン包埋され、そして固定された（例えば、ホルマリン固定された）組織サンプルであって、毎日の臨床実務で慣用的に調製されて保存されるサンプルから抽出され得る。

マイクロアレイ技術の特定の実施形態では、ｃＤＮＡクローンのＰＣＲ増幅されたインサートは、密度アレイにおいて基板に適用される。好ましくは、少なくとも１０，０００個のヌクレオチド配列が、この基板に適用される。マイクロチップ上で１０，０００個のエレメントの各々に固定されたマイクロアレイの遺伝子は、ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションに適切である。蛍光的に標識されたｃＤＮＡプローブは、目的の組織から抽出されたＲＮＡの逆転写による蛍光ヌクレオチドの組み込みを通じて、生成され得る。チップに適用された標識ｃＤＮＡプローブは、このアレイ上のＤＮＡの各々のスポットに対して特異的にハイブリダイズする。非特異的に結合したプローブを除去するためのストリンジェントな洗浄後、このチップは、共焦点レーザー顕微鏡によって、またはＣＣＤカメラのような別の検出方法によって、スキャンされる。各々の配列されたエレメントのハイブリダイゼーションの定量によって、対応するｍＲＮＡの量の評価が可能になる。二重の色の蛍光を用いて、ＲＮＡの２つの供給源から生成した別々に標識したｃＤＮＡプローブを、アレイに対して対合してハイブリダイズさせる。従って、各々の特定された遺伝子に対応する２つの供給源由来の転写物の相対的な量が、同時に決定される。ハイブリダイゼーションの規模の小型化によって、多数の遺伝子の発現パターンの便利でかつ迅速な評価が可能になる。このような方法は、１細胞あたり２〜３個のコピーで発現される、まれな転写物を検出するために必要な感度を有しており、発現レベルにおける少なくともほぼ２倍の相違を再現可能に検出することが示されている（Ｓｃｈｅｎａら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３（２）：１０６〜１４９（１９９６））。マイクロアレイ分析は、市販の装備によって、製造プロトコールに従って、例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎＣｈｉｐ技術、またはＩｎｃｙｔｅのマイクロアレイ技術を用いることによって行ってもよい。

遺伝子発現の大規模分析のためのマイクロアレイ方法の開発によって、癌の分類の分子マーカーおよび種々の腫瘍タイプにおける結果予測について体系的に調査することが可能になる。

（４．連続遺伝子発現解析（ＳＡＧＥ））
連続遺伝子発現解析（ｓｅｒｉａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）（ＳＡＧＥ）は、各々の転写物についての個々のハイブリダイゼーションプローブを提供する必要なしに、多数の遺伝子転写物の同時分析および定量分析を可能にする方法である。第一に、転写物を固有に同定するための十分な情報を含む短い配列タグ（約１０〜１４ｂｐ）が、このタグが各々の転写物内の固有の位置から得られるという条件下で、生成される。次いで、多くの転写物は、一緒に連結されて、長い連続分子を形成し、これが配列決定され得、これによって複数のタグを同時に同定する。転写物の任意の集団の発現パターンは、個々のタグの量を決定すること、および各々のタグに対応する遺伝子を同定することによって定量的に評価され得る。さらなる詳細については、例えば、Ｖｅｌｃｕｌｅｓｃｕら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４８４〜４８７（１９９５）；およびＶｅｌｃｕｌｅｓｃｕら，Ｃｅｌｌ ８８：２４３〜５１（１９９７）を参照のこと。

（５．超並列的遺伝子ビーズクローン解析（ｍａｓｓｉｖｅｌｙ ｐａｒａｌｌｅｌ ｓｉｇｎａｔｕｒｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）（ＭＰＳＳ）による遺伝子発現分析）
この方法は、Ｂｒｅｎｎｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １８：６３０〜６３４（２０００）によって記載されており、非ゲルベースのサイン（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）配列決定と、別々の５μｍの直径のマイクロビーズ上の数百万のテンプレートのインビトロクローニングとを組み合わせる配列決定アプローチである。第一に、ＤＮＡテンプレートのマイクロビーズのライブラリーは、インビトロクローニングによって構築される。この後に、テンプレート含有マイクロビーズの平面アレイのアセンブリが、フローセル中で高密度（代表的には、１ｃｍ^２あたり３×１０^６個より多いマイクロビーズ）で続く。各々のマイクロビーズ上のクローニングされたテンプレートの遊離の末端は、ＤＮＡフラグメント分離を要しない蛍光ベースのサイン配列決定方法を用いて、同時に分析される。この方法は、単回の操作で、酵母ｃＤＮＡライブラリーから何十万もの遺伝子のサイン（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）配列を同時にかつ正確に提供することが示されている。

（６．免疫組織化学）
免疫組織化学方法はまた、本発明の予測マーカーの発現レベルを検出するために適切である。従って、抗体および抗血清、好ましくはポリクローナル抗血清、そして最も好ましくは各々のマーカーに特異的なモノクローナル抗体を用いて発現を検出する。この抗体は、例えば、放射性標識、蛍光標識、ハプテン標識（例えば、ビオチン）、または酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ）を用いる抗体自体の直接標識によって検出され得る。あるいは、未標識の一次抗体は、一次抗体に特異的な抗血清、ポリクローナル抗血清またはモノクローナル抗体を含む、標識された二次抗体と組み合わせて用いられる。免疫組織化学プロトコールおよびキットは、当該分野で周知であり、そして市販される。

（７．プロテオミクス）
「プロテオーム（ｐｒｏｔｅｏｍｅ）」という用語は、特定の時点でサンプル（例えば、組織、生物体または細胞培養物）中に存在するタンパク質の全体として規定される。プロテオミクスとしては、とりわけ、サンプル中のタンパク質発現の全体的変化の研究を包含する（「発現プロテオミクス（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ）」とも呼ばれる）。プロテオミクスは代表的には、以下の工程を包含する：（１）２−Ｄゲル電気泳動（２−Ｄ ＰＡＧＥ）による、サンプル中の個々のタンパク質の分離；（２）例えば、ゲルから回収した個々のタンパク質の同定（例えば、質量分析法またはＮ末端配列決定）；ならびに（３）バイオインフォマティクスを用いるデータの分析。プロテオミクス法は、遺伝子発現プロファイリングの他の方法に対する有用な補完であり、本発明の予測マーカーの生成物を検出するために、単独で、または他の方法と組み合わせて使用され得る。

（８．ｍＲＮＡ単離、精製および増幅の一般的説明）
ｍＲＮＡ単離、精製、プライマー伸長および増幅を含む、ＲＮＡ供給源として固定されたパラフィン包埋組織を用いる、遺伝子発現をプロファイリングするために代表的なプロトコールの工程は、種々の公表された学術論文（例えば：Ｔ．Ｅ．Ｇｏｄｆｒｅｙら，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ２：８４〜９１［２０００］；Ｋ．Ｓｐｅｃｈｔら，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５８：４１９−２９［２００１］）に示される。要するに、代表的なプロセスは、パラフィン包埋された腫瘍組織サンプルの約１０μｍの厚みの切片を切断することで開始する。次いで、ＲＮＡを抽出し、そしてタンパク質およびＤＮＡを除去する。ＲＮＡ濃度の分析後、ＲＮＡ修復および／または増幅工程が、必要な場合に含まれてもよく、そしてＲＮＡは、遺伝子特異的プロモーター、続いてＲＴ−ＰＣＲを用いて逆転写される。最終的に、試験された腫瘍サンプルにおいて同定された特徴的な遺伝子発現パターンに基づいて、患者に対して利用可能な最適の処置の選択肢（単数または複数）を特定するために、このデータを分析する。

（９．癌化学療法）
癌処置において用いられる化学療法剤は、その作用機序に依存して、数個の群に分けることができる。いくつかの化学療法剤は、ＤＮＡおよびＲＮＡを直接損傷する。ＤＮＡの複製を破壊することによって、このような化学療法は、複製を完全に停止させるか、またはノンセンスＤＮＡまたはＲＮＡの生成を生じる。このカテゴリーとしては、例えば、シスプラチン（Ｐｌａｔｉｎｏｌ（登録商標））、ダウノルビシン（Ｃｅｒｕｂｉｄｉｎｅ（登録商標））、ドキソルビシン（Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ（登録商標））、およびエトポシド（ＶｅＰｅｓｉｄ（登録商標））が挙げられる。癌の化学療法剤の別の群は、ヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドの形成を妨げ、その結果ＲＮＡ合成および細胞複製がブロックされる。このクラスの薬物の例としては、メトトレキセート（Ａｂｉｔｒｅｘａｔｅ（登録商標））、メルカプトプリン（Ｐｕｒｉｎｅｔｈｏｌ（登録商標））、フルオロウラシル（Ａｄｒｕｃｉｌ（登録商標））、およびヒドロキシ尿素（Ｈｙｄｒｅａ（登録商標））が挙げられる。化学療法剤の第三のクラスは、紡錘体の合成または破壊を生じ、そして結果として、細胞分裂を中断する。このクラスの薬物の例としては、ビンブラスチン（Ｖｅｌｂａｎ（登録商標））、ビンクリスチン（Ｏｎｃｏｖｉｎ（登録商標））およびタキサン、例えば、パクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（登録商標））、およびトセタキセル（Ｔｏｃｅｔａｘｅｌ）（Ｔａｘｏｔｅｒｅ（登録商標））が挙げられる。トセタキセルは現在、米国において、先の化学療法の失敗後に局所的に進行するかまたは転移した乳癌を有する患者、および先の白金ベースの化学療法の失敗後に局所的に進行したかまたは転移性の非小細胞肺癌を有する患者を処置するために、承認されている。

化学療法による一般的な問題は、この処置アプローチの臨床的利点を制限する、アントラサイクリンおよびタキサンのような化学療法剤の高い毒性である。

ほとんどの患者は、腫瘍の外科的な除去後に直ちに化学療法を受ける。このアプローチは一般に、アジュバント療法と呼ばれる。しかし、化学療法はまた、いわゆる新補助処置として、外科手術の前に実施されてもよい。新補助化学療法の使用は、進行し、手術不能な乳癌の処置から始まったが、同様に他のタイプの癌の処置においても受け入れられている。新補助化学療法の有効性は、いくつかの臨床治験において試験されている。多施設のＮａｔｉｏｎａｌ Ｓｕｒｇｉｃａｌ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ｂｒｅａｓｔ ａｎｄ Ｂｏｗｅｌ Ｐｒｏｊｅｃｔ Ｂ−１８（ＮＳＡＢ Ｂ−１８）治験（Ｆｉｓｈｅｒら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌｏｇｙ １５：２００２−２００４（１９９７）；Ｆｉｓｈｅｒら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌｏｇｙ １６：２６７２−２６８５（１９９８））新補助療法は、アドリアマイシンおよびシクロホスファミドの組み合わせ（「ＡＣレジメン」）で行われた。別の臨床治験では、新補助療法は、５−フルオロウラシル、エピルビシンおよびシクロホスファミドの組み合わせ（「ＦＥＣレジメン」）を用いて実施された（ｖａｎ Ｄｅｒ Ｈａｇｅら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１９：４２２４−４２３７（２００１））。さらに新しい臨床治験はまた、タキサン含有新補助処置レジメンを用いている。例えば、Ｈｏｌｍｅｓら，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８３：１７９７−１８０５（１９９１）およびＭｏｌｉｔｅｒｎｉら，Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，２４：Ｓ１７−１０−Ｓ−１７−１４（１９９９）を参照のこと。乳癌についての新補助化学療法についてのさらなる情報については、Ｃｌｅａｔｏｒら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ−Ｒｅｌａｔｅｄ Ｃａｎｃｅｒ ９：１８３〜１９５（２００２）を参照のこと。

（１０．癌遺伝子セット、アッセイされた遺伝子サブ配列、および遺伝子発現データの臨床適用）
本発明の重要な局面は、乳癌組織による特定の遺伝子の発現の測定を用いて予後情報を提供することである。この目的のために、アッセイされたＲＮＡの量、用いられるＲＮＡの量の変動、および他の要因における相違（例えば、機械および操作者の相違）について補正（正規化する）ことが必要である。従って、このアッセイは代表的には、周知のハウスキーピング遺伝子（例えば、ＧＡＰＤおよびＡＣＴＢ）から転写されるＲＮＡを含む、参照ＲＮＡの使用を測定し、組み込む。遺伝子発現データを正規化するための正確な方法は、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；１９９７）のための「Ｕｓｅｒ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ＃２」に示されている。あるいは、正規化は、アッセイされた遺伝子の全てまたはその大きいサブセットの平均またはメジアンのシグナル（Ｃｔ）に基づいてもよい（全体的な正規化アプローチ）。以下の実施例に記載される研究では、いわゆる中央正規化ストラテジーが用いられたが、これは、正規化のために、臨床上の結果との相関が欠失することに基づいて選択されたスクリーニングされた遺伝子のサブセットを利用した。

（１１．治療スコアに対する再発および応答、ならびにそれらの適用）
２００３年７月１０日出願の同時係属中の出願番号第６０／４８６，３０２号は、癌再発の可能性および／または患者が処置様式によく応答する可能性を決定するためのアルゴリズムベースの予後試験を記載する。他の癌予後方法からそれを識別するアルゴリズムの特徴としては以下が挙げられる：１）再発の可能性を決定するために用いられる試験ｍＲＮＡ（または対応する遺伝子発現産物）の固有のセット、２）発現データを式に組み合わせるために用いられる特定の重量、および３）種々のレベルのリスクの群（例えば、低リスク、中リスクおよび高リスクの群）に患者を分けるために用いられる閾値。このアルゴリズムによって、数値的な再発スコア（ＲＳ）が得られるか、または処置に対する患者応答を評価する場合は治療に対する応答スコア（ＲＴＳ）が得られる。

この試験は、特定のｍＲＮＡまたはそれらの発現産物のレベルを測定するための実験室アッセイを必要とするが、患者から既に収集されて保管されている必要がある、ごく少量の新鮮な組織または凍結組織または固定され、パラフィン包埋された腫瘍生検標本を利用してもよい。従って、この試験は、非浸潤性であってもよい。これは、例えば、コア生検または細針吸引を介する、腫瘍組織回収のいくつかの種々の方法とも適合する。

本発明によれば、癌再発スコア（ＲＳ）は、以下：
（ａ）被験体から得た癌細胞を含む生物学的サンプルを、遺伝子またはタンパク質の発現プロファイリングに供する工程；
（ｂ）各々の遺伝子についての発現値を決定するために、複数の個々の遺伝子の発現レベル［すなわち、ｍＲＮＡまたはタンパク質のレベル］を定量する工程；
（ｃ）遺伝子発現値のサブセットであって、各々のサブセットが癌関連の生物学的機能によって、そして／または同時発現によって関連される遺伝子についての発現値を含むサブセットを作成する工程；
（ｄ）サブセット内の各々の遺伝子の発現レベルと、このサブセット内の治療に対する癌の再発または応答へのその相対的な寄与を反映する係数を掛けて、乗算の結果を加えてこのサブセットの項を得る工程；
（ｅ）各々のサブセットの項と、治療に対する癌の再発または応答へのその寄与を反映する係数とを掛ける工程；ならびに
（ｆ）この係数を掛けた各々のサブセットについての項の合計を算出して、再発スコア（ＲＳ）または治療に対する応答スコア（ＲＴＳ）を得る工程；
によって決定され、
ここで、治療に対する癌再発または応答との線形の相関を示さない各々のサブセットの寄与は、事前に決定された閾値レベルをわずかに超えて含まれ、そして
特定の遺伝子の発現増大が癌再発のリスクを下げるサブセットは、負の値を割り当てられ、特定の遺伝子の発現が癌の再発のリスクを増大するサブセットは正の値を割り当てられる。

特定の実施形態では、ＲＳは、以下：
（ａ）被験体から得られた腫瘍細胞を含む生物学的サンプルにおける、ＧＲＢ７、ＨＥＲ２、ＥｓｔＲ１、ＰＲ、Ｂｃｌ２、ＣＥＧＰ１、ＳＵＲＶ、Ｋｉ．６７、ＭＹＢＬ２、ＣＣＮＢ１、ＳＴＫ１５、ＣＴＳＬ２、ＳＴＭＹ３、ＣＤ６８、ＧＳＴＭ１、およびＢＡＧ１、またはそれらの発現産物の発現レベルを決定する工程；ならびに
（ｂ）以下の式：
ＲＳ＝（０．２３〜０．７０）×ＧＲＢ７ａｘｉｓｔｈｒｅｓｈ−（０．１７〜０．５１）×ＥＲａｘｉｓ＋（０．５３〜１．５６）×ｐｒｏｌｉｆａｘｉｓｔｈｒｅｓｈ＋（０．０７〜０．２１）×ｉｎｖａｓｉｏｎａｘｉｓ＋（０．０３〜０．１５）×ＣＤ６８−（０．０４〜０．２５）×ＧＳＴＭ１−（０．０５〜０．２２）×ＢＡＧ１
によって再発スコア（ＲＳ）を算出する工程であって、
ここで
（ｉ）ＧＲＢ７ ａｘｉｓ＝（０．４５〜１．３５）×ＧＲＢ７＋（０．０５〜０．１５）×ＨＥＲ２；
（ｉｉ）ＧＲＢ７ ａｘｉｓ＜−２であるならば、ＧＲＢ７ ａｘｉｓ ｔｈｒｅｓｈ＝−２であり、かつＧＲＢ７ ａｘｉｓ≧−２であるならば、ＧＲＢ７ ａｘｉｓ ｔｈｒｅｓｈ＝ＧＲＢ７ ａｘｉｓであり；
（ｉｉｉ）ＥＲ ａｘｉｓ＝（Ｅｓｔ１＋ＰＲ＋Ｂｃｌ２＋ＣＥＧＰ１）／４；
（ｉｖ）ｐｒｏｌｉｆａｘｉｓ＝（ＳＵＲＶ＋Ｋｉ．６７＋ＭＹＢＬ２＋ＣＣＮＢ１＋ＳＴＫ１５）／５；
（ｖ）ｐｒｏｌｉｆａｘｉｓ＜−３．５であるならば、ｐｒｏｌｉｆａｘｉｓｔｈｒｅｓｈ＝−３．５であり、
ｐｒｏｌｉｆａｘｉｓ≧−３．５であるならば、ｐｒｏｌｉｆａｘｉｓｈｒｅｓｈ＝ｐｒｏｌｉｆａｘｉｓであり；そして
（ｖｉ）ｉｎｖａｓｉｏｎａｘｉｓ＝（ＣＴＳＬ２＋ＳＴＭＹ３）／２
である工程、
によって決定され、
ここで範囲が特に示されない個々の遺伝子全てについての項は、約０．５〜１．５の間で変化し得、かつＲＳが高いほど、癌再発の可能性の増大を示す。

本発明のさらなる詳細は、以下の非限定的な実施例に記載される。

（浸潤性乳癌における新補助化学療法のレトロスペクティブ研究）
（パラフィン包埋されたコア生検組織の遺伝子発現プロファイリング）
これは、Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｈｅａｌｔｈ，Ｉｎｃ．，（Ｒｅｄｗｏｏｄ Ｃｉｔｙ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、およびＩｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｔｕｍｏｒｉ，Ｍｉｌａｎ，Ｉｔａｌｙが関与する共同研究であった。この研究の主な目的は、局所的に進行した乳癌において、処置前の分子プロフィールと新補助化学療法に対する病理学上の完全寛解（ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）（ｐＣＲ）との間の相関を調査することであった。

（患者包括判定基準）
侵襲性乳癌（手術日１９９８年〜２００２年）の組織学的診断；局所的に進行した乳癌の診断は、皮膚浸潤および／またはＮ２腋窩の節の状態およびまたは同側の鎖骨上の陽性節によって規定した；コア生検、新補助化学療法および外科的切除はＩｓｔｉｔｕｔｏ Ｎａｚｉｏｎａｌｅ Ｔｕｍｏｒｉ，Ｍｉｌａｎで行った；組織学的診断または診断手順について得られた生物学的物質を検索に用いるというインフォームドコンセントにサインをもらった；そして組織病理学的評価によって、この探索研究に包含するための腫瘍組織の適切な量が示される。

（除外判定基準）
遠位の転移；最初のコア生検から、もしくは外科的切除から入手可能な腫瘍ブロックがない；または病理学者がＨ＆Ｅスライドの試験で評価した場合ブロック中に腫瘍がないかごくわずかしかない（スライド上の全体的組織の５％未満）。

（研究のデザイン）
８９例の評価可能な患者（９６例の臨床上評価可能な患者のセット由来）を同定して研究した。３８４個のｍＲＮＡ種のレベルをＲＴ−ＰＣＲによって測定し、これによって生物医学的研究の文献から選択された候補の癌関連遺伝子の産物が示される。不十分なシグナルに起因して遺伝子の１つだけ欠失した。

患者の特徴は以下のとおりであった：平均年齢：５０歳；腫瘍グレード：２４％が良（Ｗｅｌｌ）、５５％が中（Ｍｏｄｅｒａｔｅ）、そして２１％が不良（Ｐｏｏｒ）；６３％の患者がＥＲ陽性｛免疫組織化学による｝；７０％の患者が陽性のリンパ節を有した。

全ての患者に予備的な新補助化学療法：ドキソルビシンに加えてタキソールを３週／３サイクル、続いてタキソール（登録商標）（パクリタキセル）を１週／１２サイクル、を与えた。腫瘍の外科的除去は化学療法の終了後とした。コア腫瘍生検の標本を化学療法の開始前に採取して、ＲＴ−ＰＣＲアッセイのためにＲＮＡの供給源として役立てた。

（材料および方法）
生検由来の固定されたパラフィン包埋（ＦＰＥ）腫瘍組織を、化学療法の前後に得た。コア生検は、化学療法の前に採取した。その場合、病理学者は、ほとんどの代表的な原発性の腫瘍ブロックを選択し、ＲＮＡ分析のために９つの１０ミクロンの切片にした。詳細には、全部で９つの切片（各々の厚みが１０ミクロン）を調製して、３つのＣｏｓｔａｒ Ｂｒａｎｄ Ｍｉｃｒｏｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ Ｔｕｂｅｓ（ポリプロピレン、１．７ｍＬ試験管、透明；各々の試験管に３切片）に入れて、プールした。

ＭａｓｔｅｒＰｕｒｅ^ＴＭＲＮＡ精製キット（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてメッセンジャーＲＮＡを抽出して、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（登録商標）蛍光法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｂｅｓ）によって定量した。定量的な遺伝子発現の分子アッセイは、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７９００^ＴＭＳｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ^ＴＭ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ−Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて、ＲＴ−ＰＣＲによって行った。ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７９００^ＴＭは、サーモサイクラー、レーザー、電荷結合素子（ＣＣＤ）、カメラおよびコンピューターから構成される。このシステムは、サーモサイクラー上で３８４−ウェルの形式においてサンプルを増幅する。増幅中、レーザー誘導性蛍光シグナルを、３８４ウェルの全てについてリアルタイムで収集し、ＣＣＤで検出する。このシステムは、装置の運転のため、およびデータの分析のためのソフトウェアを備える。

（分析および結果）
腫瘍組織を３８４遺伝子について分析した。各々の患者についての閾値サイクル（Ｃ_Ｔ）値を、臨床結果との相関がないことに基づいて選択した、その特定の患者についてスクリーニングされた遺伝子のサブセットの中央値に基づいて正規化した（中央正規化ストラテジー）。化学療法に対する患者の有益な応答は、病理学上の完全寛解（ｐＣＲ）と規定した。患者を全ての化学療法の終了の際に応答について正式に評価した。

臨床上の完全寛解（ｃｌｉｎｉｃａｌ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）（ｃＣＲ）には、身体的な検査または診断的な乳房の画像化のいずれかによる、全ての臨床上検出可能な疾患の完全な消失を必要とする。

病理学上の完全寛解（ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）（ｐＣＲ）には、予備的な化学療法後、生検した乳房組織、腫瘍摘出手術または乳房切除術の標本の組織学的な検査において残留する乳癌が存在しないことが必要である。インサイチュ腺管癌（ＤＣＩＳ）は残留して存在してもよい。局所のリンパ節における残留する癌は存在し得ない。８９例の評価可能な患者のうち１１（１２％）が、病理学上の完全寛解（ｐＣＲ）を有した。これらの患者のうち７例がＥＲ陰性であった。

部分的臨床応答は、腫瘍面積（最長の垂線の直径の積の合計）の５０％以上の減少か、または乳房および腋窩における複数の病変の最長の垂線の直径の積の合計における５０％以上の減少と規定した。疾患の領域が２５％よりも増大することはあり得ず、そして新しい病変が出現することもあり得ない。

正規化された遺伝子発現とｐＣＲまたは非ｐＣＲの２成分の結果との間の関係を比較することによって分析を行った。一変量一般化モデルを、プロビットまたはロジットリンクの関数とともに用いた。例えば、Ｖａｎ Ｋ．Ｂｏｒｏｏａｈ，ＬＯＧＩＴ ａｎｄ ＰＲＯＢＩＴ，Ｏｒｄｅｒｅｄ Ｍｕｌｔｉｎｏｍｉｎａｌ Ｍｏｄｅｌｓ，Ｓａｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐａｐｅｒ，２００２を参照のこと。

表１は、遺伝子発現との病理学上の応答の相関を示しており、８６個の遺伝子を列挙しており、群間の相違についてのｐ値は０．１未満であった。第二の欄（「方向（Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎ）」と頭書きしている）は、発現の増大が化学療法に対する応答の可能性の低下と関連するか、それとも増大と関連するかを示す。各々の遺伝子についての予後予測値の統計学的有意差は、Ｐ値（右側の欄）によって示される。

表１に示されるデータセットに基づいて、以下の遺伝子の発現増大は、処置に対する病理学上の完全寛解の可能性の増大と相関している：ＩＬＴ．２；ＣＤ１８；ＧＢＰ１；ＣＤ３ｚ；ｆａｓ１；ＭＣＭ６；Ｅ２Ｆ１；ＩＤ２；ＦＢＸＯ５；ＣＤＣ２０；ＨＬＡ．ＤＰＢ１；ＣＧＡ；ＭＭＰ１２；ＣＤＣ２５Ｂ；ＩＬ６；ＣＹＢＡ；ＤＲ４；ＣＲＡＢＰ１；コンティグ．５１０３７；ＶＣＡＭ１；ＦＹＮ；ＧＲＢ７；ＡＫＡＰ．２；ＲＡＳＳＦ１；ＭＣＰ１；ＭＣＭ２；ＧＢＰ２；ＣＤ３１；ＥＲ２；ＳＴＡＴ１；ＴＫ１。一方で、以下の遺伝子の発現増大は、処置に対する病理学上完全寛解の可能性の低下と相関している：ＴＢＰ；ＡＢＣＣ５；ＧＡＴＡ３；ＤＩＣＥＲ１；ＭＳＨ３；ＩＲＳ１；ＴＵＢＢ；ＢＡＤ；ＥＲＣＣ１；ＰＲ；ＡＰＣ；ＧＧＰＳ１；ＫＲＴ１８；ＥＳＲＲＧ；ＡＫＴ２；Ａ．カテニン；ＣＥＧＰ１；ＮＰＤ００９；ＭＡＰＫ１４；ＲＵＮＸ１；Ｇ．カテニン；ＦＨＩＴ；ＭＴＡ１；ＥｒｂＢ４；ＦＵＳ；ＢＢＣ３；ＩＧＦ１Ｒ；ＣＤ９；ＴＰ５３ＢＰ１；ＭＵＣ１；ＩＧＦＢＰ５；ｒｈｏＣ；ＲＡＬＢＰ１；ＳＴＡＴ３；ＥＲＫ１；ＳＧＣＢ；ＤＨＰＳ；ＭＧＭＴ；ＣＲＩＰ２；ＥｒｂＢ３；ＲＡＰ１ＧＤＳ１；ＣＣＮＤ１；ＰＲＫＣＤ；ヘプシン；ＡＫ０５５６９９；ＺＮＦ３８；ＳＥＭＡ３Ｆ；ＣＯＬ１Ａ１；ＢＡＧ１；ＡＫＴ１；ＣＯＬ１Ａ２；Ｗｎｔ．５ａ；ＰＴＰＤ１；ＲＡＢ６Ｃ；Ｂｃｌ２。

再発リスクアルゴリズム（同時係属の米国特許出願第６０／４８６，３０２号に記載）とｐＣＲとの間の関係も検討した。このアルゴリズムは、２１個のｍＲＮＡ種の測定したレベルを組み込む。１６個のｍＲＮＡ（以下に名前を挙げる）は候補の臨床マーカーであり、残りの５つ（ＡＣＴＢ、ＧＡＰＤ、ＧＵＳＢ、ＲＰＬＰＯおよびＴＦＲＣ）が参照遺伝子である。参照の正規化された発現の測定値は、０〜１５の範囲であり、ここで１単位の増大は、ＲＮＡの２倍の増大を反映する。

再発スコア（ＲＳ）は、４つのセットのマーカー遺伝子（エストロゲンレセプター群の４つの遺伝子−ＥＳＲ１、ＰＧＲ、ＢＣＬ２、およびＳＣＵＢＥ２；増幅セットの５つの遺伝子−ＭＫＩ６７、ＭＹＢＬ２、ＢＩＲＣ５、ＣＣＮＢ１、およびＳＴＫ６；ＨＥＲ２セットの２つの遺伝子−ＥＲＢＢ２およびＧＲＢ７、浸潤群の２つの遺伝子−ＭＭＰ１１およびＣＴＳＬ２）そして３つの他の個々の遺伝子−ＧＳＴＭ１、ＢＡＧ１、およびＣＤ６８の定量的発現から算出する。

この式で用いた遺伝子および増倍係数は、変化してもよいが、代表的な実施形態においては、以下の式を用いて、ＲＳを算出してもよい：
ＲＳ（範囲、０〜１００）＝＋０．４７×ＨＥＲ２群スコア
−０．３４×ＥＲ群スコア
＋１．０４×増殖群スコア
＋０．１０×浸潤群スコア
＋０．０５×ＣＤ６８
−０．０８×ＧＳＴＭ１
−０．０７×ＢＡＧ１。

臨床および遺伝子発現データセットを研究するためのこのアルゴリズムの適用によって、図１に示されるとおり、ｐＣＲ値に対してＲＳを関連させる連続曲線が得られる。これらのデータの試験によって、ＲＳが５０を超える患者は、化学療法に対する応答の可能性に関して患者の上方の５０パーセントにあること、そしてＲＳが３５未満の患者は、化学療法に対する応答の可能性に関して患者の下方の５０パーセントにあることが示される。

本開示を通じて引用された全ての引用文献は、本明細書において明白に参考として援用される。

本発明は特定の実施形態に基づいて強調して記載されてきたが、特定の方法および技術におけるバリエーションおよび改変が可能であるということは、当業者には明白である。従って、本発明は、以下の特許請求の範囲によって規定されるとおりの本発明の精神および範囲内に包含される全ての改変を包含する。

図１は、臨床トライアルからの結果に基づいて、再発スコア（ＲＳ）と化学療法に対する患者応答の可能性との間の関係を、病理学上の完全寛解のエンドポイントで示す。

Claims (14)

1. ヒト乳癌患者がアントラサイクリンおよびタキサンを含む化学療法治療に対して有益な応答をする可能性を予測するための方法であって、
   ａ）化学療法治療前の患者から得られた腫瘍サンプル中におけるＣＥＧＰ１のＲＮＡ転写物またはその発現産物の発現レベルを決定すること、
   ｂ）前記発現レベルを、前記腫瘍サンプルにおける参照遺伝子のセットのＲＮＡ転写物またはその発現産物の発現レベルに対して正規化して、正規化されたＣＥＧＰ１発現レベルを提供すること、そして、
   ｃ）前記正規化されたＣＥＧＰ１発現レベルの増大から、該患者がアントラサイクリンおよびタキサンを含む化学療法治療に対して有益な応答をする可能性の減少を予測することを含む、方法。
2. 前記アントラサイクリンがドキソルビシンである、請求項１に記載の方法。
3. 前記タキサンがドセタキセルである、請求項１又は２に記載の方法。
4. 前記タキサンがパクリタキセルである、請求項１又は２に記載の方法。
5. 前記腫瘍サンプルが固定されるか、パラフィン包埋されるか、または新鮮であるかもしくは凍結される、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
6. 前記ＲＮＡが、前記患者の固定されパラフィン包埋された乳癌組織試料から単離される、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
7. 前記有益な応答が臨床上の完全寛解である、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
8. 前記有益な応答が病理学上の完全寛解である、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
9. 前記ＲＮＡ転写物の発現レベルが、ＲＴ−ＰＣＲによって決定される、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
10. 前記正規化されたＣＥＧＰ１発現レベルを用いて再発スコア（ＲＳ）を算出する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
11. 前記ＲＳを算出する工程が、以下の遺伝子サブセット：
    （ｉ）増殖因子サブセット：ＧＲＢ７およびＨＥＲ２；
    （ｉｉ）エストロゲンレセプターサブセット：ＥＲ、ＰＲ、Ｂｃｌ２およびＣＥＧＰ１；
    （ｉｉｉ）増殖サブセット：ＳＵＲＶ、Ｋｉ．６７、ＭＹＢＬ２、ＣＣＮＢ１、およびＳＴＫ１５；ならびに
    （ｉｖ）浸潤サブセット：ＣＴＳＬ２、およびＳＴＭＹ３；
    に含まれる各遺伝子の正規化された発現レベルを用いて行われる、請求項１０に記載の方法。
12. ＣＤ６８、ＢＡＧ１およびＧＳＴＭ１のＲＮＡ転写物、もしくはそれらの発現産物の正規化された発現レベルを決定する工程をさらに含み、前記ＲＳの算出において当該正規化された発現レベルも用いられる、請求項１１に記載の方法。
13. 前記ＲＳが以下の式：
    ＲＳ＝（０．２３〜０．７０）×ＧＲＢ７ａｘｉｓｔｈｒｅｓｈ
    −（０．１７〜０．５５）×ＥＲａｘｉｓ
    ＋（０．５２〜１．５６）×ｐｒｏｌｉｆａｘｉｓｔｈｒｅｓｈ
    ＋（０．０７〜０．２１）×ｉｎｖａｓｉｏｎａｘｉｓ
    ＋（０．０３〜０．１５）×ＣＤ６８
    −（０．０４〜０．２５）×ＧＳＴＭ１
    −（０．０５〜０．２２）×ＢＡＧ１
    を用いることによって決定され、
    ここで
    （ｉ）ＧＲＢ７ ａｘｉｓ＝（０．４５〜１．３５）×ＧＲＢ７＋（０．０５〜０．１５）×ＨＥＲ２；
    （ｉｉ）ＧＲＢ７ ａｘｉｓ＜−２であるならば、ＧＲＢ７ａｘｉｓｔｈｒｅｓｈ＝−２であり、かつＧＲＢ７ ａｘｉｓ≧−２であるならば、ＧＲＢ７ａｘｉｓｔｈｒｅｓｈ＝ＧＲＢ７ ａｘｉｓであり；
    （ｉｉｉ）ＥＲａｘｉｓ＝（ＥＲ＋ＰＲ＋Ｂｃｌ２＋ＣＥＧＰ１）／４；
    （ｉｖ）ｐｒｏｌｉｆａｘｉｓ＝（ＳＵＲＶ＋Ｋｉ．６７＋ＭＹＢＬ２＋ＣＣＮＢ１＋ＳＴＫ１５）／５；
    （ｖ）ｐｒｏｌｉｆａｘｉｓ＜−３．５であるならば、ｐｒｏｌｉｆａｘｉｓｔｈｒｅｓｈ＝−３．５であり、
    ｐｒｏｌｉｆａｘｉｓ≧−３．５であるならば、ｐｒｏｌｉｆａｘｉｓｔｈｒｅｓｈ＝ｐｒｏｌｉｆａｘｉｓであり；そして
    （ｖｉ）ｉｎｖａｓｉｏｎａｘｉｓ＝（ＣＴＳＬ２＋ＳＴＭＹ３）／２
    であり、
    式中、ＧＲＢ７、ＨＥＲ２、ＥＲ、ＰＲ、Ｂｃｌ２、ＣＥＧＰ１、ＳＵＲＶ、Ｋｉ．６７、ＭＹＢＬ２、ＣＣＮＢ１、ＳＴＫ１５、ＣＴＳＬ２、ＳＴＭＹ３、ＣＤ６８、ＢＡＧ１およびＧＳＴＭ１は、各遺伝子の正規化された発現レベルを示し、
    ここで（ｉｉｉ）、（ｉｖ）および（ｖｉ）における遺伝子の個々の寄与は、０．５〜１．５の係数で重み付けされ、かつＲＳが高いほど、乳癌再発の可能性の増大を示す、請求項１２に記載の方法。
14. 前記ＲＳが以下の式：
    ＲＳ＝＋０．４７×ＧＲＢ７ａｘｉｓｔｈｒｅｓｈ
    −０．３４×ＥＲａｘｉｓ
    ＋１．０４×ｐｒｏｌｉｆａｘｉｓｔｈｒｅｓｈ
    ＋０．１０×ｉｎｖａｓｉｏｎａｘｉｓ
    ＋０．０５×ＣＤ６８
    −０．０８×ＧＳＴＭ１
    −０．０７×ＢＡＧ１
    を用いることによって決定される、請求項１３に記載の方法。

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