ES2905579T3 - Algoritmo del perfil de expresión y prueba para el pronóstico de la recaída del cáncer de mama - Google Patents

Abstract

Un método para determinar la probabilidad de recaída del cáncer de mama en un sujeto con cáncer de mama invasivo con ganglios linfáticos negativos que comprende: (a) determinar los niveles de expresión de los transcritos de ARN de Grb7, Her2, ER, PR, BC12, CEGP1, SURV, Ki.67, MYBL2, CCNB1, STK15, CTSL2, STMY3, GSTM1, BAG1 y CD68, o genes sustitutos correspondientes, en un muestra biológica que contiene células tumorales obtenidas de dicho sujeto; (b) crear los siguientes subconjuntos de genes: (i) subconjunto de factores de crecimiento: GRB7 y HER2 (ii) subconjunto de receptores de estrógeno: ER, PR, BCl2 y CEGP1 (iii) subconjunto de proliferación: SURV, Ki.67, MYBL2, CCNB1 y STK15; y (iv) subconjunto de invasión: CTSL2 y STMY3; en donde un gen dentro de cualquiera de los subconjuntos (i)-(iv) puede sustituirse por un gen sustituto que se coexpresa con dicho gen en dicho tumor con un coeficiente de correlación de Pearson de >0,40 mediante la determinación del intervalo de valores para el gen dentro de cualquiera de los subconjuntos (i)-(iv) y el gen sustituto en la población de pacientes y la aplicación de una transformada lineal para mapear los valores del gen sustituto en los valores correspondientes para el gen dentro de cualquiera de los subconjuntos (i)-(iv); y (c) calcular la puntuación de recaída (RS) para dicho sujeto mediante la siguiente ecuación: RS = (0,23 a 0,70) x umbral del eje GRB7 - (0,17 a 0,51) x eje ER + (0,52 a 1,56) x umbral del eje de prolif. + (0,07 a 0,21) x eje de invasión + (0,03 a 0,15) x CD68 - (0,04 a 0,25) x GSTM1 - (0,05 a 0,22) x BAG1, en donde (1) eje GRB7 = (0,45 a 1,35) x GRB7 + (0,05 a 0,15) x HER2; (2) si el eje GRB7 <-2, entonces el umbral del eje GRB7 =-2, y si el eje GRB7 >=-2, entonces el umbral del eje GRB7 = eje GRB7; (3) eje ER = (ER + PR + Bcl2 + CEGP1)/4; (4) eje de prolif. = (SURV + Ki.67 + MYBL2 + CCNB1 + Stk15)/5; (5) si el eje de prolif. <-3,5, entonces el umbral del eje de prolif. =-3,5, si el eje de prolif. >=-3,5, entonces el umbral del eje de prolif. = eje de prolif.; y (6) eje de invasión = (CTSL2 + STMY3)/2, en donde las contribuciones individuales de los genes en (3), (4) y (6) están ponderadas por un factor de 0,5 a 1,5, y en donde una RS más alta representa una mayor probabilidad de recaída del cáncer de mama.

Description

DESCRIPCIÓN

Algoritmo del perfil de expresión y prueba para el pronóstico de la recaída del cáncer de mama

Campo de la invención

La presente invención proporciona una prueba cuantitativa no invasiva para la determinación del pronóstico en pacientes con cáncer. La prueba se basa en mediciones de los niveles tumorales de determinados ARN mensajeros (ARNm) o los productos de expresión génica correspondientes. Estos niveles de ARNm o proteínas se ingresan en una fórmula polinomial (algoritmo) que produce una puntuación numérica, que indica el riesgo de recaída (puntuación de recaída) o la probabilidad de respuesta del paciente a la terapia (puntuación de respuesta).

Descripción de la técnica relacionada

Existe la necesidad de pruebas clínicas que ayuden a los oncólogos a tomar decisiones de tratamiento bien razonadas. Una de las decisiones más fundamentales a las que se enfrenta un oncólogo en la práctica diaria es si tratar o renunciar al tratamiento de un paciente en particular con agentes quimioterapéuticos. Los agentes terapéuticos actuales para el cáncer generalmente tienen una eficacia modesta acompañada de una toxicidad sustancial. Por lo tanto, es muy deseable determinar previamente qué pacientes (después de la resección del tumor primario) es probable que tengan recaída metastásica. Si hubiera una forma confiable de obtener esta información, los pacientes de alto riesgo podrían seleccionarse para la quimioterapia adyuvante y los pacientes con poca probabilidad de tener una recaída del cáncer podrían evitar la exposición innecesaria a los eventos adversos asociados con la quimioterapia. De manera similar, antes de someter a un paciente (antes o después de la resección de un tumor primario) a un tratamiento particular, sería deseable saber si es probable que el paciente responda a dicho tratamiento. Para los pacientes que es poco probable que respondan a una determinada modalidad de tratamiento (por ejemplo, tratamiento con determinados agentes quimioterapéuticos y/o radiología), pueden diseñarse y usarse otros tratamientos sin perder un tiempo valioso.

Aunque la biología molecular y la bioquímica moderna han revelado cientos de genes cuyas actividades influyen en el comportamiento y el estado de diferenciación de las células tumorales, y su sensibilidad o resistencia a determinados fármacos terapéuticos, salvo contadas excepciones, el estado de estos genes no ha sido explotado para la propósito de tomar decisiones clínicas de forma rutinaria sobre tratamientos farmacológicos. Una excepción notable es el uso de la expresión de la proteína del receptor de estrógeno (ER) en los carcinomas de mama para seleccionar pacientes para el tratamiento con fármacos antiestrógenos, tal como el tamoxifeno. Otro ejemplo excepcional es el uso de la expresión de la proteína ErbB2 (HER2) en los carcinomas de mama para seleccionar pacientes para el tratamiento con el anticuerpo anti-HER2, Herceptin® (Genentech, Inc., South San Francisco, CA).

La presente descripción se refiere al cáncer, tal como el cáncer de mama, cuya comprensión biológica aún es rudimentaria. Está claro que la clasificación del cáncer de mama en unos pocos subgrupos, tal como el subgrupo ErbB2 , y subgrupos caracterizados por una expresión génica baja o ausente del receptor de estrógeno (ER) y algunos factores adicionales (Perou y otros, Nature 406:747-752 (2000) no refleja la heterogeneidad celular y molecular del cáncer de mama y no permite optimizar el tratamiento y la atención de las pacientes. Lo mismo ocurre con otros tipos de cánceres, muchos de los cuales están mucho menos estudiados y comprendidos que el cáncer de mama.

Actualmente, las pruebas de diagnóstico usadas en la práctica clínica son de un solo analito y, por lo tanto, no logran captar el valor potencial de conocer las relaciones entre docenas de marcadores tumorales diferentes. Además, las pruebas de diagnóstico con frecuencia no son cuantitativas y se basan en la inmunohistoquímica. Este método a menudo produce resultados diferentes en diferentes laboratorios, en parte porque los reactivos no están estandarizados y en parte porque las interpretaciones son subjetivas y no pueden cuantificarse fácilmente. Las pruebas basadas en ARN no se han usado con frecuencia debido al problema de la degradación del ARN a lo largo del tiempo y al hecho de que es difícil obtener muestras de tejido fresco de los pacientes para su análisis. El tejido fijado, embebido en parafina está más disponible y se han establecido métodos para detectar ARN en tejido fijado. Sin embargo, estos métodos normalmente no permiten el estudio de un gran número de genes a partir de pequeñas cantidades de material. Por tanto, tradicionalmente, el tejido fijado rara vez se ha usado más que para la detección inmunohistoquímica de proteínas.

En los últimos años, varios grupos han publicado estudios sobre la clasificación de varios tipos de cáncer mediante análisis de expresión génica de micromatrices {véase, por ejemplo Golub y otros, Science 286:531-537 (1999); Bhattacharjae y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 98:13790-13795 (2001); Chen-Hsiang y otros, Bioinformatics 17 (Supl. 1):S316-S322 (2001); Ramaswamy y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 98:15149-15154 (2001)). También se han informado determinadas clasificaciones de cánceres de mama humanos basadas en patrones de expresión genética {Martin y otros, Cancer Res. 60:2232-2238 (2000); West y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 98:11462-11467 (2001)}. La mayoría de estos estudios se centran en mejorar y perfeccionar la clasificación ya establecida de varios tipos de cáncer, que incluye el cáncer de mama. Pocos estudios identifican patrones de expresión genética que pueden ser de pronóstico {Sorlie y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 98:10869-10874 (2001); Yan y otros, Cáncer Res. 61:8375-8380 (2001); Van De Vivjer y otros. New England Journal of Medicine 347:1999-2009 (2002)}, pero debido a un número inadecuado de pacientes examinados, aún no están lo suficientemente validados para ser usados clínicamente de forma generalizada.

Resumen de la invención

La invención, tal como se define en las reivindicaciones adjuntas, proporciona una prueba de pronóstico basada en algoritmos para determinar la probabilidad de recaída del cáncer de mama y/o la respuesta del paciente al tratamiento, en pacientes con cáncer de mama invasivo con ganglio linfático negativo. Por tanto, la invención encuentra utilidad en la toma de decisiones de tratamiento relativas a la terapia de pacientes con cáncer, tal como, por ejemplo, pacientes con cáncer de mama con ganglios linfáticos negativos que se han sometido a resección quirúrgica de sus tumores. Específicamente, el algoritmo y la prueba de pronóstico relacionada ayudan a guiar la decisión de tratar a dichos pacientes con quimioterapia complementaria y, si la respuesta es afirmativa, qué opciones de tratamiento elegir.

Las características del algoritmo que lo distinguen de otros métodos de pronóstico del cáncer de mama incluyen: 1) un conjunto único de ARNm de prueba (o los productos de expresión génica correspondientes) usados para determinar la probabilidad de recaída, 2) determinados pesos usados para combinar los datos de expresión en una fórmula, 3) umbrales usados para dividir a los pacientes en grupos de diferentes niveles de riesgo, tal como grupos de riesgo bajo, medio y alto. El algoritmo produce una puntuación de recaída (RS) numérica o, si se evalúa la respuesta del paciente al tratamiento, la puntuación de respuesta a la terapia (RTS). La prueba requiere un ensayo de laboratorio para medir los niveles de los ARNm especificados o sus productos de expresión, pero puede utilizar cantidades muy pequeñas de tejido fresco o tejido congelado o muestras de biopsia de tumor fijadas, embebidas en parafina que ya se han recolectado necesariamente de los pacientes y archivado. Por tanto, la prueba puede ser no invasiva. También es compatible con varios métodos diferentes de recolección de tejido tumoral, por ejemplo, mediante biopsia central o aspiración con aguja fina. El tejido tumoral puede, pero no es necesario, disecarse en gran medida del tejido normal. Además, para cada miembro del conjunto de genes, la descripción especifica las secuencias de oligonucleótidos que pueden usarse en la prueba. Los niveles de ARNm se normalizan frente a un conjunto específico de genes de referencia. La descripción abarca todas las subsecuencias de los genes de prueba y de referencia, que incluye las secuencias intrónicas y no traducidas 5' y 3'. Los niveles de proteínas pueden normalizarse de manera análoga.

Por tanto, en un aspecto, la divulgación se refiere a un método para clasificar un tumor de acuerdo con la probabilidad de recaída del cáncer o respuesta a la terapia en un sujeto mamífero, que comprende

(a) someter una muestra biológica que comprende células cancerosas obtenidas de dicho sujeto a un perfil de expresión de genes o proteínas;

(b) cuantificar el nivel de expresión de genes o proteínas de múltiples genes individuales para determinar un valor de expresión para cada gen;

(c) crear subconjuntos de valores de expresión de genes o proteínas, cada subconjunto que comprende los valores de expresión para genes o proteínas unidos por una función biológica relacionada con el cáncer y/o por coexpresión;

(d) multiplicar el nivel de expresión de cada gen dentro de un subconjunto por un coeficiente que refleja su contribución relativa a la recaída del cáncer o respuesta a la terapia dentro de dicho subconjunto y sumar los productos de la multiplicación para producir un término para dicho subconjunto;

(e) multiplicar el término de cada subconjunto por un factor que refleje su contribución a la recaída del cáncer o la respuesta a la terapia; y

(f) producir la suma de términos para cada subconjunto multiplicado por dicho factor para producir una puntuación de recaída (RS) o una puntuación de respuesta a la terapia (RTS),

en donde la contribución de cada subconjunto que no muestra una correlación lineal con la recaída del cáncer o la respuesta a la terapia se incluye solo por encima de un nivel de umbral previamente determinado, y

en donde a los subconjuntos en los que el aumento de la expresión de los genes o proteínas incluidos reduce el riesgo de recaída del cáncer se les asigna un valor negativo, y a los subconjuntos en los que el aumento de la expresión de los genes o proteínas incluidos aumenta el riesgo de recaída del cáncer se les asigna un valor positivo. El algoritmo es adecuado para evaluar el riesgo de recaída del cáncer o la respuesta a la terapia para cualquier tipo de cáncer, pero se ejemplifica, sin limitación, para el cáncer de mama.

En el caso del cáncer de mama, los genes que contribuyen al algoritmo de recaída incluyen 16 genes de prueba y 5 genes de referencia.

Los genes/ARNm de prueba especificados son: Grb7; Her2; ER; PR; BCl2; CEGP1; SURV; Ki-67; MYBL2; CCNB1; STK15; CTSL2; STMY3; GSTM1; BAG1; CD68.

Los genes/ARNm de referencia son: S-ACTINA; GAPDH; RPLPO; TFRC; GUS.

Para el cáncer de mama, el conjunto anterior de 16 genes de prueba incluye 4 subconjuntos multigénicos. Los miembros de genes de estos subconjuntos tienen en común tanto expresión correlacionada como categorías de función biológica: un subconjunto de proliferación que comprende SURV, Ki-67, MYBL2, CCNB1 y STK15; un subconjunto de factores de crecimiento que comprende Her2 y Grb7; un subconjunto de receptores de estrógenos que comprende ER, PR, BCl2 y CEGP1; un subconjunto de invasión que comprende genes para las proteasas invasoras CTSL2 y STMY3.

Por tanto, en un aspecto particular, la descripción se refiere a un método para determinar la probabilidad de recaída o respuesta del cáncer de mama a la terapia hormonal en un sujeto mamífero que comprende:

(a) determinar los niveles de expresión de los transcritos de ARN de GRB7, HER2, ER, PR, Bcl2, CEGP1, SURV, Ki.67, MYBL2, CCNB1, STK15, CTSL2 y STMY3, o sus productos de expresión, o los genes sustitutos correspondientes o sus productos de expresión, en una muestra biológica que contiene células tumorales obtenidas de dicho sujeto;

(b) crear los siguientes subconjuntos de genes:

(i) subconjunto de factores de crecimiento: GRB7 y HER2;

(ii) subconjunto de diferenciación (receptor de estrógeno): ER, PR, Bcl2 y CEGP1;

(iii) subconjunto de proliferación: SURV, Ki.67, MYBL2, CCNB1 y STK15; y

(iv) subconjunto de invasión: CTSL2 y STMY3;

en donde un gen dentro de cualquiera de los subconjuntos (i)-(iv) puede sustituirse por un gen sustituto que se coexpresa con dicho gen en dicho tumor con un coeficiente de correlación de Pearson de > 0,40; y (c) calcular la puntuación de recaída (RS) o la puntuación de respuesta a la terapia (RTS) para dicho sujeto ponderando las contribuciones de cada uno de los subconjuntos (i) -(iv), a la recaída del cáncer de mama o la respuesta a la terapia.

En una modalidad particular, el método comprende además determinar los niveles de expresión de los transcritos de ARN de CD68, GSTM1 y BAG1 o sus productos de expresión, o los correspondientes genes sustitutos o sus productos de expresión, e incluir la contribución de dichos genes o genes sustitutos a la recaída o respuesta a la terapia del cáncer de mama en el cálculo de RS o RTS,

en donde una RS o RTS más alta representa una mayor probabilidad de recaída del cáncer de mama o una menor probabilidad de respuesta a la terapia, según corresponda.

En un aspecto específico, la descripción se refiere a un método para determinar la probabilidad de recaída del cáncer de mama en un sujeto mamífero que comprende:

(a) determinar los niveles de expresión de GRB7, HER2, EstR1, PR, Bcl2, CEGP1, SURV, Ki.67, MYBL2, CCNB1, STK15, CTSL2, STMY3, CD68, GSTM1 y BAG1, o sus productos de expresión, en una muestra biológica que contenga células tumorales obtenidas de dicho sujeto; y

(b) calcular la puntuación de recaída (RS) mediante la siguiente ecuación:

RS = (0,23 a 0,70) * umbral del eje GRB7 -(0,17 a 0,51) * eje ER (0,53 a 1,56) * umbral del eje de prolif. (0,07 a 0,21) * eje de invasión (0,03 a 0,15) * CD68 -(0,04 a 0,25) * GSTM1 -(0,05 a 0,22) * BAG1

en donde

(i) Eje GRB7 = (0,45 a 1,35) * GRB7 (0,05 a 0,15) * HER2;

(ii) si el eje GRB7 < -2, entonces el umbral del eje GRB7 = -2, y

si el eje GRB7 > -2, entonces el umbral del eje GRB7 = eje GRB7;

(iii) Eje ER = (Est1 PR Bcl2 CEGP1)/4;

(iv) eje de prolif. = (SURV Ki.67 MYBL2 CCNB1 STK15)/5;

(v) si el eje de prolif. < -3,5, entonces el umbral del eje de prolif. = -3,5,

si el eje de prolif. > -3,5, entonces el umbral del eje de prolif. = eje de prolif.; y

(vi) eje de invasión = (CTSL2 STMY3)/2,

en donde los términos para todos los genes individuales para los que los intervalos no se muestran específicamente pueden variar entre aproximadamente 0,5 y 1,5, y en donde una RS más alta representa una mayor probabilidad de recaída del cáncer de mama.

El ensayo de laboratorio para la expresión génica puede usar una variedad de plataformas diferentes. La modalidad preferida para usar con tejidos fijados, embebidos en parafina es la reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa cuantitativa qRT-PCR. Sin embargo, las otras plataformas tecnológicas, que incluye la espectroscopia de masas y las micromatrices de ADN, también pueden usarse. En el caso de las micromatrices de ADN, las sondas polinucleotídicas pueden ser de ADNc ("matrices de ADNc") que típicamente tienen una longitud de aproximadamente 500 a 5000 bases, aunque también pueden usarse ADNc más cortos o más largos.

Alternativamente, los polinucleótidos pueden ser oligonucleótidos (micromatrices de ADN), que típicamente tienen una longitud de aproximadamente 20 a 80 bases, aunque también son adecuados oligonucleótidos más cortos y más largos. La superficie sólida puede ser, por ejemplo, vidrio o nailon, o cualquier otra superficie sólida que se use típicamente en la preparación de matrices, tales como micromatrices, y típicamente es vidrio.

Breve descripción de los dibujos

La tabla 1 enumera los genes de prueba y de referencia, cuya expresión se usa para construir el algoritmo de recaída del cáncer de mama. La tabla incluye números de acceso para los genes, secuencias para los cebadores directo e inverso (designados por "f" y "r", respectivamente) y sondas (designadas por "p") usadas para la amplificación por PCR.

La tabla 2 muestra las secuencias de los amplicones de los genes mencionados anteriormente.

Las figuras 1A y B presentan los resultados de un estudio clínico de 242 pacientes con cáncer de mama invasivo con ganglios linfáticos negativos, para los que se disponía de datos de recaída de 10 años. La figura 1A presenta la proporción de pacientes con recaída actual del cáncer (método de Kaplan-Meier) frente a las puntuaciones de recaída calculadas. Los pacientes se agrupan en unidades de percentiles 5, excepto los pacientes con puntuaciones <-4,5, que se agrupan todos. La figura 1B es similar a la figura 1A. También presenta la proporción de pacientes con recaída real del cáncer, pero en este caso los datos de recaída reales se grafican frente a percentiles de las puntuaciones de recaída. Los pacientes se agrupan en unidades de percentil 5, excepto los pacientes en el percentil 20 inferior, que se agrupan todos juntos.

La figura 2 ilustra la relación entre la puntuación de recaída {RS} y la tasa o probabilidad de recaída a distancia del cáncer de mama en 10 años. Los datos se toman de la población de pacientes NSABP B-14. Las líneas discontinuas representan intervalos de confianza del 95 %. Cada marca de verificación en el eje X indica que un paciente tiene la RS correspondiente.

Descripción detallada de las modalidades preferidas

A. Definiciones

A menos que se defina de cualquier otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente descripción tienen el mismo significado que se entiende habitualmente en la técnica a la que pertenece la invención. Singleton y otros, Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2da ed., J. Wiley & Sons (Nueva York, NY 1994), y March, Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure 4ta ed., John Wiley & Sons (Nueva York, NY 1992), proporcionan a un experto en la técnica una guía general de muchos de los términos usados en la presente solicitud.

Un experto en la técnica reconocerá muchos métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente descripción, que podrían usarse en la práctica de la presente descripción.

Para los fines de la presente descripción, los siguientes términos se definen más abajo.

El término "micromatriz" se refiere a una disposición ordenada de elementos de matriz hibridables, preferentemente sondas polinucleotídicas, sobre un sustrato.

El término "polinucleótido", cuando se usa en singular o plural generalmente se refiere a cualquier polirribonucleótido o polidesoxirribonucleótido, que puede ser ARN o ADN no modificado o ARN o ADN modificado. Por lo tanto, por ejemplo, los polinucleótidos como se definen en la presente descripción incluyen, sin limitación, ADN monocatenario y bicatenario, ADN que incluye regiones monocatenarias y bicatenarias, ARN monocatenario y bicatenario, y ARN que incluye regiones monocatenarias y bicatenarias, moléculas híbridas que comprenden ADN y ARN que pueden ser monocatenarias o, más típicamente, bicatenarias o incluyen regiones monocatenarias y bicatenarias. Además, el término "polinucleótido", como se usa en la presente descripción, se refiere a regiones tricatenarias que comprenden ARN o ADN o tanto ARN como ADN. Las cadenas en dichas regiones pueden ser de la misma molécula o de diferentes moléculas. Las regiones pueden incluir todas de una o más de las moléculas, pero más típicamente involucran solo una región de algunas de las moléculas. Una de las moléculas de una región de triple hélice a menudo es un oligonucleótido. El término "polinucleótido" incluye específicamente los ADNc. El término incluye ADN (que incluye ADNc) y ARN que contienen una o más bases modificadas. Por lo tanto, los ADN o ARN con cadenas principales modificadas para la estabilidad o por otras razones, son "polinucleótidos" como el término se entiende en la presente descripción. Además, los ADN o ARN que comprenden bases inusuales, tales como la inosina, o bases modificadas, tales como las bases tritiadas, se incluyen dentro del término "polinucleótidos" como se define en la presente descripción. En general, el término "polinucleótido" abarca todas las formas modificadas químicamente, enzimáticamente y/o metabólicamente de polinucleótidos no modificados, así como también las formas químicas de ADN y ARN características de virus y células, que incluyen las células simples y complejas.

El término "oligonucleótido" se refiere a un polinucleótido relativamente corto, que incluye, sin limitación, desoxirribonucleótidos monocatenarios, ribonucleótidos monocatenarios o bicatenarios, híbridos de ARN:ADN y ADN bicatenarios. Los oligonucleótidos, tales como los oligonucleótidos de sonda de ADN monocatenario, a menudo se sintetizan mediante métodos químicos, por ejemplo, mediante el uso de sintetizadores de oligonucleótidos automatizados que están disponibles comercialmente. Sin embargo, los oligonucleótidos pueden prepararse mediante una variedad de otros métodos, que incluyen técnicas in vitro mediadas por ADN recombinante y mediante la expresión de los ADN en células y organismos.

Los términos "gen expresado diferencialmente", "expresión diferencial de genes" y sus sinónimos, que se usan indistintamente, se refieren a un gen cuya expresión se activa a un nivel superior o inferior en un sujeto que padece una enfermedad, específicamente cáncer, tal como cáncer de mama, en relación con su expresión en un sujeto normal o de control. Los términos también incluyen genes cuya expresión se activa a un nivel más alto o más bajo en diferentes estadios de la misma enfermedad. También se entiende que un gen expresado diferencialmente puede activarse o inhibirse a nivel de ácido nucleico o de proteína, o puede someterse a un corte y empalme alternativo para dar como resultado un producto polipeptídico diferente. Dichas diferencias pueden evidenciarse por un cambio en los niveles de ARNm, expresión superficial, secreción u otro reparto de un polipéptido, por ejemplo. La expresión diferencial de genes puede incluir una comparación de la expresión entre dos o más genes o sus productos génicos, o una comparación de las proporciones de la expresión entre dos o más genes o sus productos génicos, o incluso una comparación de dos productos procesados de forma diferente del mismo gen, que difieren entre sujetos normales y sujetos que padecen una enfermedad, específicamente cáncer, o entre varios estadios de la misma enfermedad. La expresión diferencial incluye diferencias tanto cuantitativas como cualitativas en el patrón de expresión temporal o celular en un gen o sus productos de expresión entre, por ejemplo, células normales y enfermas, o entre células que han sufrido diferentes eventos o estadios de enfermedad. Para el presente propósito, se considera que la "expresión diferencial de genes" está presente cuando hay al menos aproximadamente dos veces, preferentemente al menos aproximadamente cuatro veces, con mayor preferencia al menos aproximadamente seis veces, con la máxima preferencia al menos aproximadamente diez veces de diferencia entre la expresión de un gen dado en sujetos normales y enfermos, o en varios estadios del desarrollo de la enfermedad en un sujeto enfermo.

La frase "amplificación de genes" se refiere a un proceso mediante el cual se forman múltiples copias de un gen o fragmento de gen en una célula o línea celular particular. La región duplicada (un tramo de ADN amplificado) a menudo se denomina "amplicón". Por lo general, la cantidad de ARN mensajero (ARNm) producido, es decir, el nivel de expresión génica, también aumenta en proporción al número de copias hechas del gen particular expresado. El término "pronóstico" se usa en la presente descripción para referirse a la predicción de la probabilidad de que la muerte o progresión atribuible al cáncer, que incluye recaída, diseminación metastásica y resistencia a fármacos, de una enfermedad neoplásica, tal como el cáncer de mama.

El término "predicción" se usa en la presente descripción para referirse a la probabilidad de que un paciente responda favorable o desfavorablemente a un fármaco o conjunto de fármacos, y también el alcance de esas respuestas, o que un paciente sobrevivirá, después de la extirpación quirúrgica o el tumor primario y/o quimioterapia durante un determinado período de tiempo sin recaída del cáncer. Los presentes métodos predictivos son herramientas valiosas para predecir si es probable que un paciente responda favorablemente a un régimen de tratamiento, tal como una intervención quirúrgica, quimioterapia con un fármaco determinado o una combinación de fármacos y/o radioterapia, o si la supervivencia a largo plazo del paciente, después de la cirugía y/o la finalización de la quimioterapia u otras modalidades de tratamiento.

El término supervivencia "a largo plazo" se usa en la presente descripción para referirse a la supervivencia durante al menos 5 años, con mayor preferencia durante al menos 8 años, con la máxima preferencia durante al menos 10 años después de la cirugía u otro tratamiento.

Los términos "tumor", como se usa en la presente descripción, se refiere a todo crecimiento y proliferación de células neoplásicas, ya sean maligna o benigna, y a todas las células y tejidos precancerosos y cancerosos.

Los términos "cáncer" y "canceroso" se refieren o describen la condición fisiológica en mamíferos que típicamente se caracteriza por un crecimiento celular no regulado. Los ejemplos de cáncer incluyen, pero no se limitan a, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer de pulmón, cáncer de próstata, cáncer hepatocelular, cáncer gástrico, cáncer de páncreas, cáncer de cuello uterino, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, cáncer del tracto urinario, cáncer de tiroides, cáncer renal, carcinoma, melanoma y cáncer de cerebro.

La “patología” del (tumor) cáncer incluye todos los fenómenos que comprometen el bienestar del paciente. Esto incluye, sin limitación, crecimiento celular anormal o incontrolable, metástasis, interferencia con el funcionamiento normal de las células vecinas, liberación de citocinas u otros productos secretores a niveles anormales, supresión o agravamiento de la respuesta inflamatoria o inmunológica, neoplasia, premalignidad, malignidad, invasión de tejidos u órganos circundantes o distantes, tal como ganglios linfáticos, etc.

El "rigor" de las reacciones de hibridación se determina fácilmente por un experto en la técnica, y generalmente es un cálculo empírico que depende de la longitud de la sonda, la temperatura de lavado, y la concentración de sal. En general, las sondas más largas requieren temperaturas más altas para una hibridación adecuada, mientras que las sondas más cortas necesitan temperaturas más bajas. La hibridación generalmente depende de la capacidad del ADN desnaturalizado para hibridar nuevamente cuando las cadenas complementarias están presentes en un entorno más abajo de su temperatura de fusión. Cuanto mayor sea el grado de homología deseada entre la sonda y la secuencia hibridable, mayor será la temperatura relativa que puede usarse. Como resultado, se deduce que las temperaturas relativas más altas tenderían a hacer que las condiciones de reacción sean más rigurosas, mientras que las temperaturas más bajas lo harán menos. Para detalles adicionales y explicación de la rigurosidad de las reacciones de hibridación, véase Ausubel y otros, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995).

"Condiciones rigurosas" o "condiciones de alta rigurosidad", como se define en la presente descripción, típicamente: (1) emplean baja fuerza iónica y alta temperatura para los lavados, por ejemplo cloruro de sodio 0,015 M/citrato de sodio 0,0015 M/dodecilsulfato de sodio 0,1 % a 50 °C; (2) emplean durante la hibridación un agente desnaturalizante, tal como formamida, por ejemplo, formamida 50 % (v/v) con albúmina de suero bovino 0,1 %/Ficoll 0,1 %/polivinilpirrolidona 0,1 %/tampón de fosfato de sodio 50 mM a pH 6,5 con cloruro de sodio 750 mM, citrato de sodio 75 mM a 42 °C; o (3) emplean formamida 50 %, SSC 5 x (NaCl 0,75 M, citrato de sodio 0,075 M), fosfato de sodio 50 mM (pH 6,8), pirofosfato de sodio 0,1 %, solución de Denhardt 5 x, ADN de esperma de salmón sonicado (50 pg/ml), s Ds 0,1 %, y sulfato de dextrano 10 % a 42 °C, con lavados a 42 °C en SSC 0,2 x (cloruro de sodio/citrato de sodio) y formamida 50 %, seguido de un lavado de alta rigurosidad que consiste en SSC 0,1 x que contiene EDTA a 55 °C.

Las "condiciones moderadamente rigurosas" pueden identificarse como se describe en Sambrook y otros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Nueva York: Cold Spring Harbor Press, 1989, e incluyen el uso de solución de lavado y condiciones de hibridación (por ejemplo, temperatura, fuerza iónica y % de SDS) menos riguroso que los descritos anteriormente. Un ejemplo de condiciones moderadamente rigurosas es la incubación durante la noche a 37 °C en una solución que comprende: formamida 20 %, SSC 5 x (NaCl 150 mM, citrato trisódico 15 mM), fosfato de sodio 50 mM (pH 7,6), solución de Denhardt 5 x, sulfato de dextrano 10 % y ADN fragmentado desnaturalizado de esperma de salmón 20 mg/ml, seguido de lavado de los filtros en SSC 1 x a aproximadamente 37-50 °C. El experto en la técnica reconocerá cómo ajustar la temperatura, la fuerza iónica, etcétera, como sea necesario para acomodar factores tales como la longitud de la sonda y similares.

En el contexto de la presente descripción, la referencia a "al menos uno", "al menos dos", "al menos cinco", etc., de los genes enumerados en cualquier conjunto de genes en particular significa cualquiera o todas y cada una de las combinaciones de los genes enumerados.

El término cáncer de "ganglios (linfáticos) negativos", tal como cáncer de mama de "(ganglios linfáticos) negativos", se usa en la presente descripción para referirse al cáncer que no se ha diseminado a los ganglios linfáticos.

El término "perfil de expresión génica" se usa en el sentido más amplio e incluye los métodos de cuantificación de ARNm y/o niveles de proteína en una muestra biológica.

El término "terapia adyuvante" se usa generalmente para el tratamiento que se administra además de un tratamiento primario (inicial). En el tratamiento del cáncer, el término "terapia adyuvante" se usa para referirse a la quimioterapia, terapia hormonal y/o radioterapia después de la extirpación quirúrgica del tumor, con el objetivo principal de reducir el riesgo de recaída del cáncer.

La "terapia neoadyuvante" es una terapia complementaria o adyuvante que se administra antes de la terapia primaria (principal). La terapia neoadyuvante incluye, por ejemplo, quimioterapia, radioterapia y terapia hormonal. Por tanto, la quimioterapia puede administrarse antes de la cirugía para encoger el tumor, de modo que la cirugía pueda ser más eficaz o, en el caso de tumores previamente intratables, posible.

El término "función biológica relacionada con el cáncer" se usa en la presente descripción para referirse a una actividad molecular que afecta el éxito del cáncer contra el huésped, que incluye, sin limitación, actividades que regulan la proliferación celular, muerte celular programada (apoptosis), diferenciación, invasión, metástasis, supresión del tumor, susceptibilidad a la vigilancia inmunitaria, angiogénesis, mantenimiento o adquisición de la inmortalidad.

B. Descripción detallada

La práctica de la presente descripción empleará, a menos que se indique de cualquier otra manera, las técnicas convencionales de biología molecular (que incluye las técnicas recombinantes), microbiología, biología celular y bioquímica, que se encuentran dentro de los conocimientos de la técnica. Dichas técnicas se explican completamente en la literatura, tal como, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2da edición (Sambrook y otros, 1989); "Oligonucleotide Synthesis" (M.J. Gait, ed., 1984); "Animal Cell Culture" (R.I. Freshney, ed., 1987); "Methods in Enzymology" (Academic Press, Inc.); "Handbook of Experimental Immunology", 4ta edición (D.M. Weir & C.C. Blackwell, eds., Blackwell Science Inc., 1987); "Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells" (J.M. Miller & M.P. Calos, ed., 1987); "Current Protocols in Molecular Biology" (F.M. Ausubel y otros, eds, 1987) y "PCR: The Polymerase Chain Reaction", (Mullis y otros, ed., 1994).

La presente descripción proporciona un algoritmo para determinar la probabilidad de recaída del cáncer o la respuesta a la terapia en pacientes con cáncer. El método se basa en (1) la identificación y agrupación de un conjunto de genes que pueden servir como marcadores de recaída del cáncer o la probabilidad de respuesta del paciente a una terapia en particular, (2) determinados pesos asignados a las agrupaciones y los genes individuales dentro los grupos que reflejan su valor para predecir la recaída del cáncer o la respuesta a la terapia y que se usan para combinar los datos de expresión en una fórmula; y la (3) determinación de los valores umbrales usados para dividir a los pacientes en grupos con diversos grados de riesgo de recaída del cáncer, o con una probabilidad variable de respuesta al tratamiento, tal como grupos de riesgo bajo, medio y alto o grupos en los que la probabilidad de que la respuesta del paciente a un tratamiento en particular es baja, media o alta. El algoritmo produce una puntuación de recaída (RS) numérica o una puntuación de respuesta al tratamiento (RTS), que puede usarse para tomar decisiones de tratamiento relacionadas con la terapia de pacientes con cáncer.

La primera etapa en la generación de datos para ser analizados por el presente algoritmo es el perfil de expresión de genes o proteínas.

1. Técnicas del perfil de expresión

La presente descripción requiere un ensayo para medir los niveles de genes especificados (ARNm) o sus productos de expresión (proteínas) en una muestra biológica que comprende células cancerosas. Normalmente, la muestra biológica es una muestra de tejido reciente o archivada obtenida de un tumor, por ejemplo, mediante biopsia o aspiración del tumor, pero también pueden usarse en el análisis fluidos biológicos que contienen células tumorales. En su forma más común, el perfil de expresión génica implica la determinación de los niveles de ARNm en una muestra de tejido, tal como una muestra de biopsia de tumor fijada, embebida en parafina, que ya se ha recogido del paciente y se ha archivado. Por lo tanto, la prueba puede ser completamente no invasiva. También es compatible con varios métodos diferentes de recolección de tejido tumoral, por ejemplo, biopsia central y aspiración con aguja fina. El tejido tumoral puede, pero no es necesario, disecarse en gran medida para separarlo del tejido normal. Los métodos del perfil de expresión génica dirigidos a medir los niveles de ARNm pueden dividirse en dos grandes grupos: métodos basados en el análisis de hibridación de polinucleótidos y métodos basados en secuenciación de polinucleótidos. Los métodos usados más comúnmente conocidos en la técnica para la cuantificación de la expresión de ARNm en una muestra incluyen transferencia Northern e hibridación in situ (Parker & Barnes, Methods in Molecular Biology 106:247-283 (1999)); ensayos de protección de RNAsa (Hod, Biotechniques 13:852-854 (1992)); y reacción en cadena de la polimesasa con transcriptasa inversa (RT-PCR) (Weis y otros, Trends in Genetics 8:263-264 (1992)). Alternativamente, pueden emplearse anticuerpos que puedan reconocer dúplex específicos, que incluyen dúplex de ADN, dúplex de ARN, y dúplex híbrido de ADN-ARN o dúplex de ADN-proteína. Los métodos representativos para el análisis de expresión génica basado en secuenciación incluyen el análisis en serie de la expresión génica (SAGE), y el análisis de expresión génica por secuenciación paralela masiva de la firma (MPSS).

En todas estas técnicas, la primera etapa es el aislamiento de ARNm de una muestra diana. El material de partida es típicamente ARN total aislado de tumores humanos o líneas de células tumorales, y tejidos o líneas celulares normales correspondientes, respectivamente. Por tanto, el ARN puede aislarse de una variedad de tumores primarios, que incluyen mama, pulmón, colon, próstata, cerebro, hígado, riñón, páncreas, bazo, timo, testículo, ovario, útero, etc., tumorales o líneas celulares tumorales, con ADN combinado de donantes sanos. Si la fuente de ARNm es un tumor primario, el ARNm puede extraerse, por ejemplo, de muestras de tejido congeladas o archivadas, embebidas en parafina y fijadas (por ejemplo, fijadas con formalina).

Los métodos generales para la extracción de ARNm se conocen bien en la técnica y se describen en los libros de texto estándar de biología molecular, que incluyen Ausubel y otros, Current Protocols of Molecular Biology, John Wiley and Sons (1997). Los métodos para la extracción de ^a Rⁿ de tejidos embebidos en parafina se describen, por ejemplo, en Rupp y Locker, Lab Invest. 56:A67 (1987) y De Andrés et al., BioTechniques 18:42044 (1995). En particular, el aislamiento de ARN puede realizarse mediante el uso de un kit de purificación, un conjunto de tampones y proteasa de fabricantes comerciales, tales como Qiagen, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Por ejemplo, el ARN total de las células en cultivo puede aislarse mediante el uso de minicolumnas Qiagen RNeasy. Otros kits de aislamiento de ARN disponibles comercialmente incluyen el kit de purificación de ADN y ARN completo MasterPure™ (EPICENTRE®, Madison, WI) y el kit de aislamiento de ARN en bloque de parafina (Ambion, Inc.). El ARN total de las muestras de tejido puede aislarse mediante el uso de RNA Stat-60 (Tel-Test). El ARN preparado a partir de tumor puede aislarse, por ejemplo, mediante centrifugación en gradiente de densidad de cloruro de cesio.

Si bien la práctica de la descripción se ilustrará con referencia a las técnicas desarrolladas para determinar los niveles de ARNm en una muestra biológica (por ejemplo, de tejido), otras técnicas, tal como los métodos de análisis proteómico, también se incluyen dentro del concepto amplio de perfil de expresión génica, y están dentro del alcance de la presente descripción. En general, un método de perfil de expresión génica preferido para usar con tejido embebido en parafina es la reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa cuantitativa (qRT-PCR), sin embargo, también pueden usarse otras plataformas tecnológicas, que incluyen la espectroscopia de masas y las micromatrices de ADN.

En las siguientes secciones, se discutirán con mayor detalle una serie de técnicas representativas, pero no exhaustivas, de elaboración de perfiles de expresión génica.

2. PCR con transcriptasa inversa (RT-PCR)

De las técnicas enumeradas anteriormente, el método cuantitativo más sensible y flexible es la qRT-PCR, que puede usarse para comparar los niveles de ARNm en diferentes poblaciones de muestras, en tejidos normales y tumorales, con o sin tratamiento farmacológico, para caracterizar patrones de expresión génica, para discriminar entre ARNm estrechamente relacionados y para analizar la estructura del ARN.

Como el ARN no puede servir como molde para la PCR, el primer paso en el perfil de expresión génica por RT-PCR es la transcripción inversa del molde de ARN en ADNc, seguida de su amplificación exponencial en una reacción de PCR. Las dos transcriptasas inversas usadas más comúnmente son la transcriptasa inversa del virus de la mieloblastosis aviar (AMV-RT) y la transcriptasa inversa del virus de la leucemia murina de Moloney (MMLV-RT). La etapa de transcripción inversa se ceba, típicamente, mediante el uso de cebadores específicos, hexámeros aleatorios, o cebadores oligo-dT, en dependencia de las circunstancias y del objetivo del perfil de expresión. Por ejemplo, el ARN que se extrae puede transcribirse de forma inversa mediante el uso de un kit de PCR de ARN GeneAmp (Perkin Elmer, CA, EE. UU.), siguiendo las instrucciones del fabricante. El ADNc obtenido puede usarse como molde en la reacción de PCR posterior.

Aunque la etapa de PCR puede usar una variedad de ADN polimerasas termoestables dependientes de ADN, típicamente emplea la ADN polimerasa Taq, que tiene una actividad nucleasa 5'-3' pero carece de una actividad endonucleasa correctora de pruebas 3'-5'. Por ejemplo, la PCR TaqMan® utiliza típicamente la actividad nucleasa 5' de la polimerasa Taq o Tth para hidrolizar una sonda de hibridación unida a su amplicón diana, pero puede usarse cualquier enzima con actividad nucleasa 5' equivalente. Se usan dos cebadores oligonucleotídicos para generar un amplicón típico de una reacción de PCR. Un tercer oligonucleótido, o sonda, está diseñado para detectar la secuencia de nucleótidos ubicada entre los dos cebadores de la PCR. La sonda no es extensible por la enzima Taq ADN polimerasa y está marcada con un colorante fluorescente reportero y un colorante fluorescente de inactivación. Cualquier emisión inducida por láser del tinte indicador es apagada por el tinte de enfriamiento cuando los dos tintes están ubicados muy juntos como lo están en la sonda. Durante la reacción de amplificación, la enzima Taq ADN polimerasa escinde la sonda de una manera dependiente del molde. Los fragmentos de la sonda resultantes se disocian en solución y la señal del colorante reportero liberado está libre del efecto de inactivación del segundo fluoróforo. Se libera una molécula de colorante reportero por cada nueva molécula sintetizada, y la detección del colorante reportero no inactivado proporciona la base para la interpretación cuantitativa de los datos.

La RT-PCR TaqMan® puede realizarse mediante el uso de equipos disponibles comercialmente, tales como, por ejemplo, ABI PRISM 7700TM Sequence Detection System (Perkin-Elmer-Applied Biosystems, Foster City, CA, EE. UU.), o LightCycler (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Alemania). En una modalidad preferida, el procedimiento de nucleasa 5' se ejecuta en un dispositivo de PCR cuantitativa en tiempo real como el ABI PRISM 7700TM Sequence Detection SystemTM. El sistema consiste en un termociclador, láser, dispositivo de carga acoplada (CCD), cámara y ordenador. El sistema incluye un programa informático para ejecutar el instrumento y analizar los datos.

Los datos del ensayo de la nucleasa 5' se expresan inicialmente como Ct, o el ciclo umbral. Como se discutió anteriormente, los valores de fluorescencia se registran durante cada ciclo y representa la cantidad de producto amplificado hasta ese punto en la reacción de amplificación. El punto en el que la señal fluorescente se registra por primera vez como estadísticamente significativa es el ciclo umbral (Ct).

Para minimizar los errores y el efecto de la variación de muestra a muestra, la RT-PCR usualmente se realiza mediante el uso de un estándar interno. El estándar interno ideal se expresa a un nivel constante entre diferentes tejidos y no se ve afectado por el tratamiento experimental. Los ARN que se usan más frecuentemente para normalizar los patrones de expresión génica son los ARNm de los genes constitutivos de gliceraldehído-3-fosfatodeshidrogenasa (GAPDH) y p-actina.

Una variación más reciente de la técnica RT-PCR es la PCR en tiempo real cuantitativo, que mide la acumulación de producto de PCR a través de una sonda fluorigénica doblemente marcada (es decir, sonda TaqMan®). La PCR en tiempo real es compatible tanto con la PCR competitiva cuantitativa, donde se usa un competidor interno para cada secuencia diana para la normalización, y con la PCR comparativa cuantitativa que usa un gen de normalización contenido en la muestra, o un gen constitutivo para la RT-PCR. Para más detalles, véase, por ejemplo, Held y otros, Genome Research 6:986-994 (1996).

3. Micromatrices

La expresión diferencial de genes también puede identificarse o confirmarse mediante el uso de la técnica de micromatrices. Por tanto, el perfil de expresión de genes asociados al cáncer de mama puede medirse en tejido tumoral fresco o embebido en parafina, mediante el uso de la tecnología de micromatrices. En este método, las secuencias de polinucleótidos de interés (que incluye los ADNc y los oligonucleótidos) se disponen en una placa, o matriz o en un sustrato de microchip. A continuación, las secuencias en matriz se hibridan con sondas de ADN específicas de células o tejidos de interés. Al igual que en el método de RT-PCR, la fuente de ARNm es típicamente ^a Rⁿ total aislado de tumores humanos o líneas de células tumorales y los tejidos normales o líneas celulares correspondientes. Por tanto, el ARN puede aislarse de una variedad de tumores primarios o líneas de células tumorales. Si la fuente de ARNm es un tumor primario, el ARNm puede extraerse, por ejemplo, de muestras de tejido congeladas o archivadas, embebidas en parafina y fijadas (por ejemplo, fijadas con formalina), que se preparan y conservan de forma rutinaria en la práctica clínica diaria.

En una modalidad específica de la técnica de micromatrices, se aplican insertos de clones de ADNc amplificados por PCR a un sustrato en una matriz densa. Preferentemente se aplican al sustrato al menos 10 000 secuencias de nucleótidos. Los genes en las micromatrices, inmovilizados en el microchip a 10 000 elementos cada uno, son adecuados para la hibridación en condiciones rigurosas. Las sondas de ADNc marcadas con fluorescencia pueden generarse mediante la incorporación de nucleótidos fluorescentes mediante transcripción inversa del ARN que se extrae de tejidos de interés. Las sondas de ADNc marcadas aplicadas al chip se hibridan con especificidad a cada punto del ADN en la matriz. Después de lavar en condiciones rigurosas para eliminar las sondas unidas de forma no específica, el chip se escanea mediante microscopía láser confocal o mediante otro método de detección, tal como una cámara CCD. La cuantificación de la hibridación de cada elemento en la matriz permite evaluar la abundancia del ARNm correspondiente. Con fluorescencia de doble color, las sondas de ADNc marcadas por separado generadas a partir de dos fuentes de ARN se hibridan por pares con la matriz. Por lo tanto, la abundancia relativa de los transcritos de las dos fuentes correspondientes a cada gen especificado se determina simultáneamente. La escala miniaturizada de la hibridación permite una evaluación conveniente y rápida del patrón de expresión para grandes cantidades de genes. Se ha demostrado que dichos métodos tienen la sensibilidad requerida para detectar transcritos raros, que se expresan en algunas copias por célula, y para detectar de manera reproducible las diferencias de al menos aproximadamente dos veces en los niveles de expresión (Schena y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 93(2):106-149 (1996)). El análisis de micromatrices puede realizarse mediante equipos disponibles comercialmente, siguiendo los protocolos del fabricante, tal como mediante el uso de la tecnología Affymetrix GenChip® o la tecnología de micromatrices de Incyte.

El desarrollo de métodos de micromatrices para el análisis a gran escala de la expresión génica hace posible la búsqueda sistemática de marcadores moleculares de la clasificación del cáncer y la predicción de resultados en una variedad de tipos de tumores.

4. Análisis en serie de la expresión génica (SAGE)

El análisis en serie de la expresión génica (SAGE) es un método que permite el análisis simultáneo y cuantitativo de una gran cantidad de transcritos de genes, sin la necesidad de proporcionar una sonda de hibridación individual para cada transcrito. Primero, se genera una etiqueta de secuencia corta (aproximadamente 10-14 pb) que contiene información suficiente para identificar de forma única un transcrito, siempre que la etiqueta se obtenga desde una posición única dentro de cada transcrito. Después, muchos transcritos se unen para formar moléculas seriales largas, que pueden secuenciarse, revelando la identidad de las múltiples etiquetas simultáneamente. El patrón de expresión de cualquier población de transcritos puede evaluarse cuantitativamente mediante la determinación de la abundancia de etiquetas individuales, e identificando el gen correspondiente a cada etiqueta. Para más detalles, véase, por ejemplo, Velculescu y otros, Science 270:484-487 (1995) y Velculescu y otros, Cell 88:243-51 (1997).

5. Análisis de expresión genética mediante secuenciación paralela masiva de la firma (MPSS)

Este método, descrito por Brenner y otros, Nature Biotechnology 18:630-634 (2000), es un método de secuenciación que combina la secuenciación de firmas no basada en gel con la clonación in vitro de millones de moldes en microperlas de 5 pm de diámetro separadas. En primer lugar, se construye una biblioteca de microperlas de moldes de ^a Dⁿ mediante clonación in vitro. A esto le sigue el ensamblaje de una matriz plana de microperlas que contienen la plantilla en una celda de flujo a una densidad alta (típicamente mayor de 3 x 106 microperlas/cm2). Los extremos libres de las plantillas clonadas en cada microperla se analizan simultáneamente, mediante el uso de un método de secuenciación de firmas basado en fluorescencia que no requiere la separación de fragmentos de ADN. Se ha demostrado que este método proporciona de forma simultánea y precisa, en una sola operación, cientos de miles de secuencias de firma genética de una biblioteca de ADNc de levadura.

6. Inmunohistoquímica

Los métodos de inmunohistoquímica también son adecuados para detectar los niveles de expresión de los marcadores de pronóstico de la presente descripción.

Por tanto, se usan anticuerpos o antisueros, preferentemente antisueros policlonales, y con la máxima preferencia anticuerpos monoclonales específicos para cada marcador para detectar la expresión. Los anticuerpos pueden detectarse mediante el marcado directo de los propios anticuerpos, por ejemplo, con marcadores radiactivos, marcadores fluorescentes, marcadores de hapteno tales como biotina, o una enzima tal como la peroxidasa de rábano picante o la fosfatasa alcalina. Alternativamente, el anticuerpo primario no marcado puede usarse junto con un anticuerpo secundario marcado, que comprende antisueros, antisueros policlonales o un anticuerpo monoclonal específico para el anticuerpo primario. Los protocolos y kits de inmunohistoquímica se conocen bien en la técnica y están disponibles comercialmente.

7. Proteómica

El término "proteoma" se define como la totalidad de las proteínas presentes en una muestra (por ejemplo, tejido, organismo, o cultivo celular) en un determinado momento. La proteómica incluye, entre otras cosas, el estudio de los cambios globales de la expresión de proteínas en una muestra (referida, además, como "proteómica de la expresión"). La proteómica, típicamente, incluye las siguientes etapas: (1) separación de proteínas individuales en una muestra mediante electroforesis en gel 2-D (2-D PAGE); (2) identificación de las proteínas individuales recuperadas del gel, por ejemplo, por espectrometría de masas o secuenciación N-terminal, y (3) análisis de los datos mediante el uso de la bioinformática. Los métodos proteómicos son complementos valiosos de otros métodos de determinación del perfil de expresión génica y pueden usarse, solos o en combinación con otros métodos, para detectar los productos de los marcadores de pronóstico presentes.

8. Conjunto de genes de cáncer. Subsecuencias génicas analizadas y aplicación clínica de los datos de expresión génica

Un aspecto importante es usar la expresión medida de determinados genes, o sus productos de expresión, por cáncer, por ejemplo, cáncer de mama, tejido para proporcionar información de pronóstico. Para este propósito, es necesario corregir (normalizar) tanto las diferencias en la cantidad de ARN ensayado como la variabilidad en la calidad del ARN usado. Por lo tanto, el ensayo típicamente mide e incorpora la expresión de determinados genes normalizadores, que incluye los genes constitutivos bien conocidos, tales como GAPDH y ¡5- ACTIN. Alternativamente, la normalización puede basarse en la media o mediana de la señal (CT) de todos los genes analizados o un gran subconjunto de estos (enfoque de normalización global). En toda la descripción, a menos que se indique de cualquier otra manera, la referencia a los niveles de expresión de un gen supone una expresión normalizada con respecto al conjunto de referencia, aunque esto no siempre se indica explícitamente.

9. Algoritmo para generar una puntuación de recaída del cáncer

Cuando se usa qRT-PCR para medir los niveles de ARNm, las cantidades de ARNm se expresan en unidades de Ct (ciclo umbral) (Held y otros, Genome Research 6:986-994 (1996)). La suma promediada de ARNm de referencia Ct se establece en cero, y cada ARNm de prueba Ct medido se da en relación con este punto cero. Por ejemplo, si, para una determinada muestra de tumor de un paciente, el promedio de Ct de los 5 genes de referencia que se encuentra es 31 y el Ct del gen de prueba CRB7 es 35, el valor informado para GRB7 es -4 (es decir, 31-35).

Como primera etapa después de la determinación cuantitativa de los niveles de ARNm, los genes identificados en la muestra de tumor y que se sabe que se asocian con la patología molecular del cáncer se agrupan en subconjuntos. Por tanto, los genes que se sabe que se asocian con la proliferación constituirán el "subconjunto de proliferación" (eje). Los genes que se sabe que se asocian con la invasión del cáncer constituirán el "subconjunto de invasión" (eje). Los genes asociados con la o las vías clave del receptor del factor de crecimiento constituirán el "subconjunto del factor de crecimiento" (eje). Los genes que se sabe que participan en la activación o la señalización a través del receptor de estrógeno (ER) constituirán el "subconjunto del receptor de estrógeno" (eje). Esta lista de subconjuntos, por supuesto, no es limitante. Los subconjuntos (ejes) creados dependerán del cáncer en particular, es decir, cáncer de mama, próstata, páncreas, pulmón, etc. En general, los genes cuya expresión se sabe que se correlaciona entre sí o que se sabe que están implicados en la misma vía se agrupan en el mismo eje.

En la siguiente etapa, el nivel tumoral medido de cada ARNm en un subconjunto se multiplica por un coeficiente que refleja su contribución relativa dentro del conjunto al riesgo de recaída del cáncer y este producto se agrega a los otros productos entre los niveles de ARNm en el subconjunto y sus coeficientes, para producir un término, por ejemplo, un término de proliferación, un término de invasión, un término de factor de crecimiento, etc. Por ejemplo, en el caso de cáncer de mama invasivo con ganglios linfáticos negativos, el término del factor de crecimiento es (0,45 a 1,35) x GRB7 (0,05 a 0,15) x Her2 (véase el ejemplo más abajo).

La contribución de cada término a la puntuación general de recaída se ponderó mediante el uso de un coeficiente. Por ejemplo, en el caso del cáncer de mama invasivo con ganglios linfáticos negativos, el coeficiente del término del factor de crecimiento puede estar entre 0,23 y 0,70.

Además, para algunos términos, tal como el factor de crecimiento y los términos de proliferación, se realiza una etapa adicional. Si la relación entre el término y el riesgo de recaída no es lineal, se usa una transformada funcional no lineal del término, tal como un umbral. Así, en el cáncer de mama invasivo con ganglios linfáticos negativos, cuando se encuentra el término del factor de crecimiento en <-2, el valor se fija en -2. Cuando el término de proliferación se encuentra en <-3,5, el valor se fija en -3,5.

La suma de los términos obtenidos proporciona la puntuación de recaída (RS).

Se encontró una relación entre la puntuación de recaída (RS) y el riesgo de recaída tras medir la expresión de los genes de prueba y de referencia en biopsias de muestras tumorales de una población de pacientes con ganglios linfáticos negativos con cáncer de mama invasivo y aplicar el algoritmo.

Se observa que la escala de RS generada por el algoritmo puede ajustarse de varias formas. Por tanto, mientras que la escala de RS descrita específicamente anteriormente va efectivamente de -4,5 a -2,0, el intervalo podría seleccionarse de manera que la escala vaya de 0 a 10, de 0 a 50, o de 0 a 100, por ejemplo.

Por ejemplo, en un enfoque de escala particular, la puntuación de recaída (RS) escalada se calcula en una escala de 0 a 100. Por conveniencia, se adicionan 10 unidades de Ct a cada valor de Ct medido, y la RS no escalada se calcula como se describió anteriormente. Los valores de puntuación de recaída escalados (SRS) se calculan mediante el uso de las ecuaciones que se muestran más abajo.

Puntuación umbral GRB7 = 0,9 x GRB7 0,1 x HER2

r , , ( 8 si la puntuación GRB7 es < 8

^{Puntuación umbral GRB7 =} ( ^_Punt ^.uación ^„ GR ^„J37 d ^,e cua ^,lquier otra manera

Puntuación ER = (0,8 x Esrt1 1,2 x PR+Bel2+CEGP1)/4

Puntuación de proliferación = (SURV+Ki-67+MYBL2+CCNB1+STK15)/5

Proüf. Puntuación umbral = 6,5 á Puntuación de Proliferación es < 6,5

_(Puntuación de proliferación de cualquier otra manera

Puntuación de invasión = (CTSL2+STYM3)/2

0 á 20x(R5 — 6,7) < 0

SRS 100 si 20^k(RS — 6,7) > 100

20k(R5 — 6,7} de cualquier otra manera

donde

RS = 0,47 x Puntuación umbral del grupo GRB7

-0,34 x Puntuación del grupo ER

1,04 x Puntuación umbral del grupo de proliferación

0,10 x Puntuación del grupo de invasión

0,05 x CD68

-+0,08 x GSTM1

-0,07 x Puntuación anterior de BAG1

Pacientes asignados a varias categorías de riesgo mediante el uso de las siguientes puntuaciones de recaída:

Este enfoque escalado se usó para calcular las puntuaciones de recaída que se muestran en la figura 2.

10. Uso de las puntuaciones de recaída y respuesta al tratamiento

Las puntuaciones de recaída (RS) o las puntuaciones de respuesta al tratamiento (RTS), según lo determinado por el presente algoritmo, brindan herramientas valiosas para que el médico en ejercicio tome decisiones críticas sobre el tratamiento. Por tanto, si la RS de un paciente en particular es baja, el médico podría decidir que la quimioterapia después de la extirpación quirúrgica del cáncer, por ejemplo, el cáncer de mama, no es necesaria para asegurar la supervivencia a largo plazo del paciente. Como resultado, el paciente no estará sujeto a los efectos secundarios a menudo muy graves del tratamiento quimioterapéutico estándar de atención. Si, por otro lado, se determina que la RS es alta, esta información puede usarse para decidir qué quimioterapia u otra opción de tratamiento (tal como radioterapia) es la más adecuada para tratar al paciente. De manera similar, si la puntuación RTS de un paciente para un tratamiento en particular es baja, se usarán otras modalidades de tratamiento más efectivas para combatir el cáncer en ese paciente en particular.

A modo de ejemplo, las opciones quimioterapéuticas estándar de atención actual para el tratamiento del cáncer de mama incluyen la administración de antraciclinas más ciclofosfamida (AC); o a C más taxanos (ACT); o C más metotrexato más 5-fluorouracilo (CMF); o la administración de cualquiera de estos fármacos solos o en cualquier combinación. Otros fármacos quimioterapéuticos usados a menudo en el tratamiento del cáncer, por ejemplo, cáncer de mama, incluyen, por ejemplo, Herceptin®, vinblastina, actinomicina D, etopósido, cisplatino y doxorrubicina. La determinación de la RS para un paciente particular mediante el presente algoritmo permitirá al médico adaptar el tratamiento del paciente de manera que el paciente tenga la mejor posibilidad de supervivencia a largo plazo mientras se minimizan los efectos secundarios no deseados.

Por lo tanto, los pacientes con un bajo riesgo de recaída del cáncer están típicamente asignados a tratamiento hormonal solo, o el tratamiento hormonal y un régimen de tratamiento quimioterapéutico menos tóxicos, por ejemplo, mediante el uso de Herceptin®. Por otro lado, los pacientes cuyo riesgo de recaída del cáncer se ha determinado que es intermedio o alto se someten típicamente a una quimioterapia más agresiva, tal como, por ejemplo, regímenes de tratamiento basados en antraciclinas y/o taxanos.

El valor de la RS también puede usarse para decidir si tratar al paciente con fármacos terapéuticos que actualmente no forman parte del protocolo de tratamiento de primera línea para un cáncer en particular, tal como, por ejemplo, inhibidores del EGFR y/o mediante otras opciones de tratamiento, tal como la radioterapia sola o antes o después del tratamiento quimioterapéutico.

Se proporcionarán más detalles de la descripción en los siguientes ejemplos no limitantes.

Ejemplo 1

Algoritmo para predecir la recaída del cáncer de mama

El algoritmo se basa en las mediciones de los niveles tumorales de 16 marcadores de ARNm, que se seleccionaron mediante dos criterios principales: 1) correlación univariante con la recaída del cáncer de mama en el estudio clínico que se describe más abajo, y 2) implicación en la patología tumoral según lo indicado por literatura científica publicada.

Los marcadores seleccionados indican las funciones de varios comportamientos y vías celulares en la recaída del cáncer: por ejemplo, factor de crecimiento Her2; receptor de estrógeno, proliferación e invasión. De acuerdo con la comprensión actual de la patología molecular del cáncer de mama, el aumento de los niveles de ARNm que representan genes en los ejes de proliferación e invasión del factor de crecimiento, se correlaciona con un mayor riesgo de recaída, mientras que el aumento de los niveles de ARNm que representan genes en el eje del receptor de estrógeno se correlaciona con un riesgo reducido de recaída. Los genes relevantes en estas vías no solo están vinculados por la función biológica, sino también por la coexpresión, como lo indican los coeficientes de correlación de Pearson (datos no mostrados). Para el cálculo del coeficiente de correlación de Pearson, véase, por ejemplo K. Pearson y A. Lee, Biometrika 2:357 (1902).

Se construyó un algoritmo sopesando las contribuciones de determinados genes coexpresados en las vías anteriores. El modelo se optimizó iterativamente mediante selección para obtener la mejor correlación con el riesgo de recaída. El ajuste del modelo incluyó la selección de los mejores genes que representan los ejes funcionales y de coexpresión anteriores y la selección de los coeficientes de ecuación óptimos.

Además, se incluyeron otros genes que no estaban estrechamente correlacionados en la expresión con ninguno de los genes anteriores o entre sí, pero que también se encontró que contribuían de forma independiente a la predicción de la recaída del cáncer. En vista de la evidencia acumulada en la literatura biomédica de que los macrófagos tumorales confieren un mal pronóstico en el cáncer (M. Orre and P.A Rogers Gynecol. Oncol. 73: 47-50 [1999]; L.M. Coussens y otros. Cell 103: 481-90 [2000]; S. Huang y otros. J. Natl. Cancer Inst. 94:1134-42 [2002]; M.A. Cobleigh y otros. Proceedings of A.S.C.O. 22: Resumen 3415 [2003]), el marcador de macrófagos CD68 también se incluyó en el conjunto de genes de prueba. Finalmente, se identificó un modelo que incluía los genes: Grb7; Her2; ER; PR; BCl2; CEGP1; SURV; Ki-67; MYBL2; CCNB1; STK15; CTSL2; STMY3; GSTM1; BAG1; CD68. El algoritmo proporciona una puntuación de riesgo de recaída (RS). Específicamente, la RS se deriva de la siguiente manera:

1. Definir el eje GRB7

Eje GRB7 = (0,45 a 1,35) x GRB7 (0,05 a 0,15) x HER2

2. Definir el umbral del eje GRB7

si el eje GRB7 <-2

entonces el umbral GRB7GT = -2,

si no el umbral GRB7GT = eje GRB7

3. Definir el eje ER

Eje Er = (EstR1 PR Bcl2 CEGP1)/4, donde las contribuciones individuales de los genes enumerados pueden ponderarse por un factor que varía entre 0,5 y 1,5, inclusive.

4. Definir el eje de proliferación, eje de prolif.

eje de prolif. = (SURV Ki.67 MYBL2 CCNB1 STK15)/5, donde las contribuciones individuales de los genes enumerados pueden ponderarse por un factor entre 0,5 y 1,5, inclusive.

5. Definir el umbral del eje de proliferación, umbral del eje de prolif.

si el eje de prolif. <-3,5

entonces el umbral del eje de prolif. = -3.5

si no el umbral del eje de prolif. = eje de prolif.

6. Definir el eje de invasión

eje de invasión = (CTSL2 STMY3)/2, donde las contribuciones individuales de los genes enumerados pueden ponderarse por un factor entre 0,5 y 1,5, inclusive.

7. Calcular la puntuación de recaída (RS)

RS = (0,23 a 0,70) x umbral GRB7GT -(0,17 a 0,51) x eje ER (0,52 a 1,56) x umbral del eje de prolif. (0,07 a 0,21) x eje de invasión (0,03 a 0,15) x CD68 -(0,04 a 0,25) x GSTM1 -(0,05 a 0,22) x BAG1.

En una modalidad particular, la RS se calcula de la siguiente manera:

RS = 0,47 x umbral GRB7GT - 0,34 x eje ER 1,04 x umbral del eje de prolif. 0,14 x eje de invasión 0,11 x CD68 - 0,17 x GSTM1 - 0,15 BAG1.

Un experto en la técnica comprenderá que pueden sustituirse otros genes por los 16 genes de prueba especificados anteriormente. En términos generales, cualquier gen que se coexprese con un gen en el panel de prueba de los 16 genes, con un coeficiente de correlación de Pearson > 0,40 puede sustituirse por ese gen en el algoritmo. Para reemplazar el gen X por el gen Y correlacionado, se determina el intervalo de valores del gen X en la población de pacientes, el intervalo de valores del gen Y en la población de pacientes, y se aplica una transformada lineal para mapear los valores del gen Y en los valores correspondientes para el gen X. Por ejemplo, si el intervalo de valores para el gen X en la población de pacientes es de 0 a 10, y el intervalo de valores para el gen Y en la población de pacientes es de 0 a 5, la transformación apropiada es multiplicar valores del gen Y por 2.

A modo de ejemplo, los siguientes genes que se encuentran dentro del amplicón Her2, son algunos de los genes que pueden sustituirse en el subconjunto de genes del factor de crecimiento: Q9BRT3; TCAP; PNMT; ML64; IPPD; Q9H7G1; Q9HBS1; Q9Y220; PSMD3 y CSF3

A modo de ejemplo, algunos de los genes que pueden sustituirse en el subconjunto de genes de proliferación son: C20.orfl, TOP2A, CDC20, KNSL2, MELK, TK1, NEK2, LMNB1, PTTG1, BUB1, CCNE2, FLJ20354, MCM2, RAD54L, PRO2000, PCNA, Chkl, NME1, TS, FOXM1, AD024 y HNRPAB.

A modo de ejemplo, algunos de los genes que pueden sustituirse en el subconjunto del receptor de estrógenos (ER) son: HNF3A, ErbB3, GATA3, BECN1, IGF1R, AKT2, DHPS, BAG1, hENT1, TOP2B, MDM2, CCND1, DKFZp586M0723, NPD009, B catenina, IRS1, Bclx, RBM5, PTEN, A catenin, KRT18, ZNF217, ITGA7, GSN, MTA1, G catenin, DR5, RAD51C, BAD, TP53BP1, RIZ1, IGFBP2, RUNX1, PPM1D, TFF3, S100A8, P28, SFRS5 e IGFBP2. A modo de ejemplo, algunos de los genes que pueden sustituirse en el eje de invasión son: upa, COL1A1, COL1A2 y TIMP2.

Algunos de los genes que pueden sustituir a CD68 son: CTSB, CD18, CTSL, HLA.DPB1, MMP9.

Algunos de los genes que pueden sustituir a GSTM1 son: GSTM3.2, MYH11.1, GSN.3, ID1.1.

Algunos de los genes que pueden sustituir a BAG1 son: Bcl2.2, GATA3.3, DHPS.3, HNF3A.1.

Los valores de la RS determinados pueden usarse para guiar la decisión binaria (sí o no) de si tratar pacientes con cáncer de mama con ganglios linfáticos negativos con quimioterapia adyuvante. Para ello, puede definirse un umbral que separe a los pacientes de alto riesgo de los de bajo riesgo. Como se señaló anteriormente, puede ser más informativo definir tres categorías: riesgo alto, moderado y bajo, que requiere dos puntos de corte de la RS. Los puntos de corte pueden seleccionarse para los subgrupos de pacientes en las categorías de riesgo deseadas mediante la aplicación del algoritmo a determinados datos de estudios clínicos. Por ejemplo, es posible que los oncólogos deseen evitar el tratamiento de pacientes con cáncer de mama con ganglios linfáticos negativos que tienen un riesgo de recaída inferior al 10 % en diez años. La aplicación del algoritmo a los datos de ensayos clínicos descritos en el ejemplo 2 indica que los pacientes con RS<-3,9 tienen menos del 10 % de riesgo de recaída en diez años, mientras que los pacientes con RS>-3,5 tienen un riesgo de recaída superior al 39 % en diez años. Los pacientes con valores intermedios de RS pueden considerarse en la categoría de riesgo moderado. Los oncólogos pueden proporcionar los resultados de RS en una figura continua que relaciona la puntuación de recaída con la supervivencia de Kaplan Meier a diez años.

Ejemplo 2

Estudio de la expresión genética en 242 tumores de mama malignos

Se diseñó y realizó un estudio de expresión génica para determinar los valores de la puntuación de recaída (RS) en una población de pacientes con cáncer de mama invasivo con ganglios negativos y explorar la correlación entre los valores de RS y la supervivencia libre de enfermedad. El estudio utilizó bloques tumorales embebidos en parafina fijados y archivados como fuente de ARN y los registros de pacientes archivados coincidentes.

Diseño del estudio.

Se realizaron ensayos moleculares en tejidos de tumores de mama primarios fijados con formalina, embebidos en parafina obtenidos de 252 pacientes individuales diagnosticadas con cáncer de mama invasivo. Todos los pacientes tenían ganglios linfáticos negativos, ER positivo y fueron tratados con tamoxifeno. La edad media fue de 52 años y el tamaño medio del tumor clínico fue de 2 cm. La mediana de seguimiento fue de 10,9 años. Al 1 de enero de 2003, 41 pacientes tenían recaída de la enfermedad local o distante o muerte por cáncer de mama. Los pacientes se incluyeron en el estudio solo si la evaluación histopatológica, realizada como se describe en la sección de materiales y métodos, indicó cantidades adecuadas de tejido tumoral y patología homogénea.

Materiales y métodos:

Cada bloque de tumor representativo se caracterizó por histopatología estándar para el diagnóstico, evaluación semicuantitativa de la cantidad de tumor y el grado del tumor. Cuando el área del tumor era menos del 70 % de la sección, el área del tumor se diseccionó en gran medida y se tomó tejido de 6 secciones (10 micrones). De lo contrario, se prepararon un total de 3 secciones (también de 10 micrones de espesor cada una). Las secciones se colocaron en dos tubos de microcentrífuga de la marca Costar (polipropileno, tubos de 1,7 ml, transparentes). Si se obtuvo más de un bloque tumoral como parte del procedimiento quirúrgico, se utilizó para el análisis el bloque más representativo de la patología. Análisis de expresión genética; el ARNm se extrajo y se purificó a partir de muestras de tejido fijadas, embebidas en parafina, y se prepararon para el análisis de expresión génica como se describió anteriormente. Los ensayos moleculares de la expresión génica cuantitativa se realizaron mediante RT-PCR, mediante el uso del ABI PRISM 7900™ Sequence Detection System™ (Perkin-Elmer-Applied Biosystems, Foster City, CA, EE. UU.). ABI PRISM 7900™ consiste en un termociclador, láser, dispositivo de carga acoplada (CCD), cámara y ordenador. El sistema amplifica las muestras en un formato de 384 pocillos en un termociclador. El sistema incluye un programa informático para ejecutar el instrumento y analizar los datos.

Resultados:

Los valores de expresión génica normalizados se obtuvieron a partir de las muestras de los pacientes anteriores y se usaron para calcular la RS para cada paciente, que se comparó con los datos de supervivencia de 10 años de Kaplan-Meier respectivos como se muestra en las figuras 1A y B. Como se muestra, los pacientes con valores de RS inferiores a aproximadamente -3,75 tienen ~90 % de probabilidad de supervivencia libre de recaída a 10 años. Las tasas de recaída aumentan bruscamente a valores de RS >-3,3. En la RS ~-3,0, el riesgo de recaída en 10 años es de aproximadamente 30 %, y en la RS ~-2,0, el riesgo de recaída en 10 años es >50 %. La figura 1B revela que aproximadamente el 70 % de los pacientes se encuentran en la categoría de riesgo más baja.

Por tanto, los resultados demuestran una estrecha correspondencia entre los valores de la RS determinados por la prueba y el algoritmo descrito y el riesgo de recaída del cáncer de mama.

Ejemplo 3

validación del algoritmo

Se llevó a cabo un estudio de validación clínica prospectiva para examinar el rendimiento de un ensayo de RT-PCR multigénico para extraer y cuantificar ARN de tejido tumoral fijado, embebido en parafina en pacientes inscritos en el grupo de tamoxifeno solo del Proyecto Nacional Quirúrgico Adyuvante de Senos e Intestinos (NSABP)

Estudio B-14: un estudio de laboratorio para validar clínicamente si los perfiles de expresión de tumores genómicos pueden definir la probabilidad de recaída en pacientes con cáncer de mama invasivo primario, ganglios axilares negativos y tumores con receptores de estrógenos positivos. El estudio NSABP B-14 se realizó para evaluar la eficacia del tratamiento con tamoxifeno posterior a la mastectomía en pacientes con cáncer de mama primario con ganglios negativos e incluyó un total de 2892 pacientes que calificaron y recibieron tratamiento durante cinco años. El protocolo se llevó a cabo de forma aleatoria, doble ciego, con un grupo de pacientes que recibieron tamoxifeno en una dosis de 10 mg dos veces al día y un grupo de control de pacientes que recibieron tabletas de placebo físicamente idénticas. Se realizaron comparaciones del ensayo multigénico con medidas histopatológicas y moleculares estándar de clasificación tumoral.

Se obtuvieron puntuaciones de recaída específicas del paciente derivadas del ensayo multigénico para un total de 668 pacientes elegibles del brazo de tamoxifeno solo del estudio NSABP B-14 (tiempo medio de seguimiento, 14,1 años). Los análisis estadísticos revelaron que las puntuaciones de recaída específicas del paciente resultantes (Figura 2) están significativamente correlacionadas (P = 6,5 E-9) con la probabilidad de recaída a distancia y brindan información significativa más allá de las medidas clínicas estándar de clasificación tumoral, incluida la edad del paciente en el momento de la cirugía, tamaño del tumor y grado clínico del tumor.

Se encontró que el ensayo y el algoritmo proporcionan medidas reproducibles e informativas de la probabilidad de recaída a distancia del tejido tumoral recolectado en el momento de la cirugía para pacientes con cáncer de mama primario con ganglios negativos, ER+, tratadas con tamoxifeno. La puntuación de recaída del paciente generada por el presente método proporciona información significativa (P <0,0001) más allá de las medidas histopatológicas y moleculares estándar de la clasificación tumoral comúnmente usada en la práctica clínica, que incluye la edad, el tamaño clínico del tumor y el grado del tumor. A diferencia de otras medidas comúnmente clínicas, la puntuación de recaída del paciente es altamente reproducible y, a diferencia de otras pruebas moleculares, aprovecha simultáneamente la información a través de múltiples marcadores genómicos, que incluyen ER, PR y HER2.

Claims (14)

REIVINDICACIONESi. Un método para determinar la probabilidad de recaída del cáncer de mama en un sujeto con cáncer de mama invasivo con ganglios linfáticos negativos que comprende:(a) determinar los niveles de expresión de los transcritos de ARN de Grb7, Her2, ER, PR, BC12, CEGP1, SURV, Ki.67, MYBL2, CCNB1, STK15, CTSL2, STMY3, GSTM1, BAG1 y CD68, o genes sustitutos correspondientes, en un muestra biológica que contiene células tumorales obtenidas de dicho sujeto; (b) crear los siguientes subconjuntos de genes:(i) subconjunto de factores de crecimiento: GRB7 y HER2(ii) subconjunto de receptores de estrógeno: ER, PR, BCl2 y CEGP1(iii) subconjunto de proliferación: SURV, Ki.67, MYBL2, Cc Nb 1 y STK15; y(iv) subconjunto de invasión: CTSL2 y STMY3;en donde un gen dentro de cualquiera de los subconjuntos (i)-(iv) puede sustituirse por un gen sustituto que se coexpresa con dicho gen en dicho tumor con un coeficiente de correlación de Pearson de >0,40 mediante la determinación del intervalo de valores para el gen dentro de cualquiera de los subconjuntos (i)-(iv) y el gen sustituto en la población de pacientes y la aplicación de una transformada lineal para mapear los valores del gen sustituto en los valores correspondientes para el gen dentro de cualquiera de los subconjuntos (i)-(iv); y(c) calcular la puntuación de recaída (RS) para dicho sujeto mediante la siguiente ecuación:RS = (0,23 a 0,70) x umbral del eje GRB7 -(0,17 a 0,51) x eje ER (0,52 a 1,56) x umbral del eje de prolif. (0,07 a 0,21) x eje de invasión (0,03 a 0,15) x CD68 -(0,04 a 0,25) x GSTM1 -(0,05 a 0,22) x BAG1,en donde
1. (1) eje GRB7 = (0,45 a 1,35) x GRB7 (0,05 a 0,15) x HER2;

   (2) si el eje GRB7 <-2, entonces el umbral del eje GRB7 =-2, y si el eje GRB7 >-2, entonces el umbral del eje GRB7 = eje GRB7;

   (3) eje ER = (ER PR Bcl2 CEGP1)/4;

   (4) eje de prolif. = (SURV Ki.67 MYBL2 CCNB1 Stk15)/5;

   (5) si el eje de prolif. <-3,5, entonces el umbral del eje de prolif. =-3,5, si el eje de prolif. >-3,5, entonces el umbral del eje de prolif. = eje de prolif.; y

   (6) eje de invasión = (CTSL2 STMY3)/2,

   en donde las contribuciones individuales de los genes en (3), (4) y (6) están ponderadas por un factor de 0,5 a 1,5, y en donde una RS más alta representa una mayor probabilidad de recaída del cáncer de mama.
2. 2. El método de la reivindicación 1, en donde los genes sustitutos para el subconjunto del factor de crecimiento (i) se seleccionan del grupo que consiste en Q9BRT3; TCa P; PNMT; ML64; IPPD; Q9H7G1; Q9HBS1; Q9Y220; PSMD3 y CSF3, o en donde los genes sustitutos para el subconjunto de receptores de estrógenos se seleccionan del grupo que consiste en HNF3A, ErbB3, GATA3, BECN1, IGF1R, A^kT2, DHPS, BAG1, hENT1, TOP2B, MDM2, CCND1, DKFZp586M0723, NPD009, B. Catenina, IRS1, Bclx, RBM5, PTEN, A. Catenina, KRT18, ZNF217, ITGA7, GSN, MTA1, G. Catenina, DR5, RAD51C, BAD, TP53BP1, RIZ1, IGFBP2, RUNX1, PPM1D, TFF3 P28, S100A8 SFRS5 e IGFBP2, o en donde los genes sustitutos para el subconjunto de proliferación (iii) se seleccionan del grupo que consiste en C20.orf1, TOP2A, CDC20, KNSL2, MELK, TK1, NEK2, LMNB1, PTTG1, BUB1, CCNE2, FLJ20354, MCM2, RAD54L, PRO2000, PCNA, Chk1, NME1, TS, FOXM1, AD024 y HNRPAB, o en donde los genes sustitutos para el subconjunto de invasión (iv) se seleccionan del grupo que consiste en upa, COL1A1, COL1A2 y TIMP2, o en donde los genes sustitutos para CD68 se seleccionan del grupo que consiste en CTSB, CD 18, CTSL, HLA.DPB1 y MMP9, o en donde los genes sustitutos para GSTM1 se seleccionan del grupo que consiste en GSTM2, GSTM3, GSTM4, GSTM5, MYH11, GSN e ID 1, o en donde los genes sustitutos para BAGI se seleccionan del grupo que consiste en Bcl2, GATA3, DHPS y HNF3A.
3. 3. El método de la reivindicación 1, en donde la expresión de los genes SURV, KI67, MYBL2, CCNB1, STK15, CTSL2, STMY3, CD68, GSTM1 y BAG1 se mide mediante la determinación de los niveles de expresión de proteínas.
4. 4. El método de la reivindicación 1, en donde dicho sujeto es un ser humano.
5. 5. El método de la reivindicación 1, que comprende ponderar igualmente las contribuciones individuales de los genes enumerados en el subconjunto (i), o sus productos de expresión, a la recaída del cáncer de mama, en donde la contribución total de todos los genes enumerados en el subconjunto (i) está representada por 1, o que comprende ponderar igualmente las contribuciones individuales de cada gen enumerado en el subconjunto (ii), o sus productos de expresión, a la recaída del cáncer de mama, en donde la contribución total de todos los genes enumerados en el subconjunto (ii) está representada por 1, o que comprende ponderar igualmente las contribuciones individuales de los genes enumerados en el subconjunto (iii), o sus productos de expresión, a la recaída del cáncer de mama, en donde la contribución total de todos los genes enumerados en el subconjunto (iii) está representada por 1, o que comprende ponderar igualmente las contribuciones individuales de cada gen enumerado en el subconjunto (iv), o sus productos de expresión, a la recaída del cáncer de mama, en donde la contribución total de todos los genes enumerados en el subconjunto (iv) está representada por 1.
6. 6. El método de la reivindicación 1, en donde el aumento de los niveles de los transcritos de ARN de los genes en los subconjuntos (i), (iii) y (iv), o sus productos de expresión, se asocian con un mayor riesgo de recaída del cáncer de mama y se les asigna un valor positivo, o en donde el aumento de los niveles de los transcritos de ARN de los genes en los genes del grupo (ii), o sus productos de expresión, se asocian con un menor riesgo de recaída del cáncer de mama y se les asigna un valor negativo.
7. 7. El método de la reivindicación 1, en donde el aumento del nivel del transcrito de ARN de CD68, o su producto de expresión, se asocia con un mayor riesgo de recaída del cáncer de mama y se le asigna un valor positivo, o en donde el aumento de los niveles de los transcritos de ARN de GSTM1 y BAG1, o sus productos de expresión, se asocia con un menor riesgo de recaída del cáncer de mama y se les asigna un valor negativo.
8. 8. El método de la reivindicación 1, en donde dicha muestra biológica se selecciona del grupo que consiste en tejido tumoral fresco y aspirados con aguja fina.
9. 9. El método de la reivindicación 1, en donde dicha muestra biológica es una muestra de tumor, preferentemente en donde dicha muestra de tumor se obtiene de un tejido tumoral fijado, embebido en parafina.
10. 10. El método de la reivindicación 9, en donde dicho tejido se ha obtenido mediante biopsia.
11. 11. El método de la reivindicación 9, en donde los niveles de expresión de dichos transcritos de ARN se determinan mediante RT-PCR.
12. 12. El método de la reivindicación 9, en donde dicho ARN está fragmentado.
13. 13. El método de la reivindicación 1, que comprende además la etapa de crear un informe que resume los resultados de dicho cálculo, preferentemente en donde dicho informe incluye una recomendación de tratamiento para dicho sujeto.
14. 14. Un método para determinar una opción de tratamiento para un sujeto diagnosticado con cáncer de mama invasivo con ganglios linfáticos negativos, que comprende

    (a) determinar los niveles de expresión de los transcritos de ARN de GRB7, HER2, ER, PR, Bcl2, CEGP1, SURV, Ki.67, MYBL2, CCNB1, STK15, CTSL2, STMY3, CD68, GSTM1 y BAG1, o genes sustitutos correspondientes en un muestra biológica que contiene células tumorales obtenidas de dicho sujeto; (b) crear los siguientes subconjuntos multigénicos:

    (i) GRB7 y HER2;

    (ii) ER, PR, Bcl2 y CEGP1;

    (iii) SURV, Ki.67, MYBL2, CCNB1 y STK15

    (iv) CTSL2 y STMY3;

    en donde un gen dentro de cualquiera de los subconjuntos (i)-(iv) puede sustituirse por un gen sustituto que se coexpresa con dicho gen en dicho tumor con un coeficiente de correlación de Pearson de >0,40 mediante la determinación del intervalo de valores para el gen dentro de cualquiera de subconjuntos (i)-(iv) y el gen sustituto en la población de pacientes y la aplicación de una transformada lineal para mapear los valores del gen sustituto en los valores correspondientes para el gen dentro de cualquiera de los subconjuntos (i)-(iv)

    (c) calcular la puntuación de recaída (RS) para dicho sujeto mediante la siguiente ecuación:

    RS = (0,23 a 0,70) x umbral del eje GRB7 -(0,17 a 0,51) x eje ER (0,52 a 1,56) x umbral del eje de prolif. (0,07 a 0,21) x eje de invasión (0,03 a 0,15) x CD68 -(0,04 a 0,25) x GSTM1 -(0,05 a 0,22) x BAG1,

    en donde

    (1) eje GRB7 = (0,45 a 1,35) x GRB7 (0,05 a 0,15) x HER2;

    (2) si el eje GRB7 <-2, entonces el umbral del eje GRB7 =-2, y si el eje GRB7 >-2, entonces el umbral del eje GRB7 = eje GRB7;

    (3) eje ER = (ER PR Bcl2 CEGP1 )/4;

    (4) eje de prolif. = (SURV Ki.67 MYBL2 CCNB1 Stk15)/5;

    (5) si el eje de prolif. <-3,5, entonces el umbral del eje de prolif. =-3,5, si el eje de prolif. >-3,5, entonces el umbral del eje de prolif. = eje de prolif.; y

    (6) eje de invasión = (CTSL2 STMY3)/2,

    en donde las contribuciones individuales de los genes en (3), (4) y (6) están ponderadas por un factor de 0,5 a 1,5

    (d) clasificar al sujeto en un grupo de riesgo bajo, intermedio o alto; y

    (e) recomendar el no tratamiento o terapia hormonal sola o terapia hormonal más otros tratamientos menos tóxicos si el sujeto está en el grupo de bajo riesgo; recomendar tratamiento quimioterapéutico si el sujeto está en el grupo de riesgo intermedio o en el grupo de alto riesgo.