ES2488845T5 - Predicción de la probabilidad de recidiva de cáncer - Google Patents

Description

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Predicción de la probabilidad de recidiva de cáncer

Antecedentes de la invención

Campo de la invención

La presente descripción proporciona conjuntos de genes cuya expresión es importante en el diagnóstico y/o pronóstico del cáncer.

Descripción de la técnica relacionada

Los oncólogos disponen de varias opciones de tratamiento, incluyendo diferentes combinaciones de fármacos quimioterápicos que se caracterizan como “tratamiento de referencia”, y varios fármacos que no tienen una declaración en la etiqueta para un cáncer particular, pero para los que hay pruebas de eficacia en ese cáncer. La mejor probabilidad de un buen desenlace del tratamiento requiere que se asignen los pacientes al tratamiento contra el cáncer disponible óptimo, y que esta asignación se realice lo más rápidamente posible tras el diagnóstico.

Actualmente, las pruebas de diagnóstico usadas en la práctica clínica son de un único analito, y por tanto no capturan el posible valor de conocer relaciones entre docenas de marcadores diferentes. Además, con frecuencia las pruebas de diagnóstico no son cuantitativas, basándose en la inmunohistoquímica. Con frecuencia este método proporciona resultados diferentes en diferentes laboratorios, en parte porque los reactivos no están normalizados yen parte porque las interpretaciones son subjetivas y no pueden cuantificarse fácilmente. No se han usado pruebas basadas en ARN de manera frecuente debido al problema de la degradación del ARN a lo largo del tiempo y al hecho de que es difícil obtener muestras de tejido recientes de pacientes para su análisis. El tejido incrustado en parafina, fijado, está más fácilmente disponible y se han establecido métodos para detectar ARN en tejido fijado. Sin embargo, estos métodos normalmente no permiten el estudio de grandes números de genes (ADN o ARN) a partir de pequeñas cantidades de material. Por tanto, tradicionalmente el tejido fijado se ha usado con poca frecuencia salvo para la detección mediante inmunohistoquímica de proteínas.

En los últimos años, varios grupos han publicado estudios relacionados con la clasificación de diversos tipos de cáncer mediante análisis de expresión génica en micromatriz (véase, por ejemplo Golub et al., Science 286:531-537 (1999); Bhattacharjae et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:13790-13795 (2001); Chen-Hsiang et al., Bioinformatics 17 (sup. 1): S316-S322 (2001); Ramaswamy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:15149-15154 (2001)). También se han notificado determinadas clasificaciones de cánceres de mama humanos basándose en patrones de expresión génica (Martin et al., Cancel Res. 60:2232-2238 (2000); West et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:11462-11467 (2001); Sorlie et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 98:10869-10874 (2001); Yan et al., Cancer Res. 61:8375-8380 (2001)). Sin embargo, estos estudios se centran principalmente en mejorar y refinar la clasificación ya establecida de diversos tipos de cáncer, incluyendo cáncer de mama, y generalmente no proporcionan nuevos conocimientos sobre la relación de los genes expresados de manera diferencial, y no vinculan los hallazgos con estrategias de tratamiento con el fin de mejorar el desenlace clínico de la terapia contra el cáncer.

Ahmad et al., Am. J. Pathol. 152:721-728 (1998) dan a conocer estromelisina 3 como un factor de pronóstico independiente para la supervivencia libre de recidiva en cáncer de mama de ganglios positivos.

Engel et al., Int. J. Cancer 58:830-835 (1994) dan a conocer una correlación entre el nivel de ARNm de estromelisina 3 y el desenlace en el cáncer de mama humano.

Chenard et al. Int. J. Cancer 69:448-451 (1996) dan a conocer niveles altos de estromelisina 3 que se correlacionan con un mal pronóstico en pacientes con carcinoma de mama.

Nakopoulou et al. Modern Pathology 2002; 15 (11):1154-1161 dan a conocer que la expresión de la proteína estromelisina 3 está asociada con una supervivencia global adversa en cáncer de mama invasivo.

Aunque la biología molecular y la bioquímica modernas han revelado cientos de genes cuyas actividades influyen sobre el comportamiento de células tumorales, el estado de su diferenciación y su sensibilidad o resistencia a determinados fármacos terapéuticos, con pocas excepciones, no se ha aprovechado el estado de estos genes para el fin de tomar decisiones clínicas de manera rutinaria sobre tratamientos farmacológicos. Una excepción notable es el uso de la expresión de la proteína receptora de estrógenos (ER) en carcinomas de mama para seleccionar pacientes para un tratamiento con fármacos antiestrógenos, tales como tamoxifeno. Otro ejemplo excepcional es el uso de la expresión de proteína Herceptin® (Genentech, Inc., South San Francisco, CA).

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A pesar de los recientes avances, el desafío del tratamiento contra el cáncer sigue siendo dirigir regímenes de tratamiento específicos a tipos de tumores patogénicamente diferenciados, y en última instancia personalizar el tratamiento contra el tumor con el fin de maximizar el desenlace. Por tanto, existe la necesidad de pruebas que proporcionen simultáneamente información predictiva sobre las respuestas del paciente a la variedad de opciones de tratamiento. Esto es particularmente cierto para el cáncer de mama, cuya biología no se entiende mucho. Queda claro que la clasificación del cáncer de mama en unos pocos subgrupos, tales como subgrupo ErbB2+, y subgrupos caracterizados por una expresión génica de baja a ausente del receptor de estrógenos (ER) y unos pocos factores transcripcionales adicionales (Perou et al., Nature 406:747-752 (2000)) no refleja la heterogenicidad celular y molecular del cáncer de mama, y no permite el diseño de estrategias de tratamiento que maximicen la respuesta del paciente.

En particular, una vez que a un paciente se le diagnostica cáncer, tal como cáncer de mama o de ovarios, existe una gran necesidad de métodos que le permitan al médico predecir la evolución esperada de la enfermedad, incluyendo la probabilidad de recidiva de cáncer, la supervivencia a largo plazo del paciente, y similares, y seleccionar en consecuencia la opción de tratamiento más apropiada.

Sumario de la invención

Según un aspecto de la presente invención, se proporciona un método de predicción de la probabilidad de supervivencia libre de enfermedad de un paciente con cáncer de mama ductal invasivo, positivo para ER, de ganglios negativos, sin la recidiva de cáncer, tal como se especifica en la reivindicación 1.

En una realización, el ARN comprende ARN intrónico.

En una realización de este método, el ARN se aísla de una muestra de tejido de cáncer de mama incrustada en cera, fijada, del paciente.

En otra realización, el ARN se aísla de tejido de biopsia con aguja gruesa o células de aspirado con aguja fina. En otra realización, el tejido de mama se obtiene de una muestra de biopsia incrustada en parafina, fijada, en la que el ARN puede estar fragmentado.

Descripción detallada de la realización preferida

A.DEFINICIONES

A menos que se defina lo contrario, los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que el entendido comúnmente por un experto habitual en la técnica a la que pertenece esta invención. Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2ª ed., J. Wiley & Sons (Nueva York, NY 1994), y March, Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure 4ª ed, John Wiley & Sons (Nueva York, NY 1992), proporciona a un experto en la técnica una guía general a muchos de los términos usados en la presente solicitud.

Un experto en la técnica reconocerá muchos métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento, que pueden usarse en la práctica de la presente invención. De hecho, la presente invención no se limita de ninguna manera a los métodos y materiales descritos. Para fines de la presente invención, a continuación se definen los siguientes términos.

El término “micromatriz” se refiere a una disposición ordenada de elementos de matriz hibridables, preferiblemente sondas polinucleotídicas, sobre un sustrato.

El término “polinucleótido”, cuando se usa en singular o en plural, se refiere de manera general a cualquier polirribonucleótido o polidesoxirribonucleótido, que puede ser ARN o ADN sin modificar o ARN o ADN modificados. Por tanto, por ejemplo, los polinucleótidos tal como se definen en el presente documento incluyen, sin limitación, ADN mono y bicatenario, ADN que incluye regiones mono y bicatenarias, ARN mono y bicatenario, y ARN que incluye regiones mono y bicatenarias, moléculas híbridas que comprenden ADN y ARN que pueden ser monocatenarios o, más normalmente, bicatenarios o incluyen regiones mono y bicatenarias. Además, el término “polinucleótido” tal como se usa en el presente documento se refiere a regiones tricatenarias que comprenden ARN o ADN o tanto ARN como ADN. Las cadenas en tales regiones pueden ser de la misma molécula o de moléculas diferentes. Las regiones pueden incluir la totalidad de una o más de las moléculas, pero más normalmente implican sólo una región de algunas de las moléculas. Con frecuencia, una de las moléculas de una región de triple hélice es un oligonucleótido. El término “polinucleótido” incluye específicamente ADNc. El término incluye ADN se define en el presente documento se incluyen ADN o ARN que comprenden bases no habituales, tales como inosina, o bases modificadas, tales como bases tritiadas. En general, el término “polinucleótido” abarca todas las formas química, enzimática y/o metabólicamente modificadas de polinucleótidos no modificados; así como las formas químicas de ADN y ARN característicos de virus y células, incluyendo células simples y complejas.

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El término “oligonucleótido” se refiere a un polinucleótido relativamente corto, incluyendo, sin limitación, desoxirribonucleótidos monocatenarios, ribonucleótidos mono o bicatenarios, híbridos ARN:ADN y ADN bicatenarios. Con frecuencia los oligonucleótidos, tales como oligonucleótidos de sondas de ADN monocatenarios, se sintetizan mediante métodos químicos, por ejemplo usando sintetizadores de oligonucleótidos automatizados que están disponibles comercialmente. Sin embargo, pueden prepararse oligonucleótidos mediante una variedad de otros métodos, incluyendo técnicas mediadas por ADN recombinante in vitro y mediante la expresión de ADN en células y organismos.

Los términos “gen expresado de manera diferencial”, “expresión génica diferencial” y sus sinónimos, que se usan de manera intercambiable, se refieren a un gen cuya expresión está activada hasta un nivel superior o inferior en un sujeto que padece una enfermedad, específicamente cáncer, tal como cáncer de mama, con respecto a su expresión en un sujeto normal o control. Los términos también incluyen genes cuya expresión está activada hasta un nivel superior o inferior en diferentes estadios de la misma enfermedad. También se entiende que un gen expresado de manera diferencial puede estar o bien activado o bien inhibido a nivel de ácido nucleico o a nivel de proteína, o puede someterse a corte y empalme alternativo para dar como resultado un producto polipeptídico diferente. Tales diferencias pueden demostrarse mediante un cambio en los niveles de ARNm, expresión superficial, secreción u otro reparto de un polipéptido, por ejemplo. La expresión génica diferencial puede incluir una comparación de la expresión entre dos o más genes o sus productos génicos, o una comparación de las razones de la expresión entre dos o más genes o sus productos génicos, o incluso una comparación de dos productos procesados de manera diferente del mismo gen, que se diferencian entre sujetos normales y sujetos que padecen una enfermedad, específicamente cáncer, o entre diversos estadios de la misma enfermedad. La expresión diferencial incluye diferencias tanto cuantitativas como cualitativas, diferencias en el patrón de expresión temporal o celular en un gen o sus productos de expresión, por ejemplo, entre células normales y enfermas, o entre células que se han sometido a diferentes acontecimientos de enfermedad o estadios de enfermedad. Para el fin de esta invención, se considera que está presente “expresión génica diferencial” cuando hay una diferencia de al menos aproximadamente dos veces, preferiblemente al menos aproximadamente cuatro veces, más preferiblemente al menos aproximadamente seis veces, lo más preferiblemente al menos aproximadamente diez veces entre la expresión de un gen dado en sujetos normales y enfermos, o en diversos estadios del desarrollo de la enfermedad en un sujeto enfermo.

El término “sobreexpresión” con respecto a un transcrito de ARN se usa para hacer referencia al nivel del transcrito determinado mediante normalización con respecto al nivel de ARNm de referencia, que pueden ser todos transcritos medidos en la muestra o un conjunto de referencia particular de ARNm.

La frase “amplificación génica” se refiere a un procedimiento mediante el cual se forman múltiples copias de un gen o fragmento génico en una célula o línea celular particular. Con frecuencia la región duplicada (un tramo de ADN amplificado) se denomina “amplicón”. Habitualmente, la cantidad del ARN mensajero (ARNm) producido, es decir, el nivel de expresión génica, también aumenta en la proporción del número de copias realizadas del gen particular expresado.

El término “pronóstico” se usa en el presente documento para hacer referencia a la predicción de la probabilidad de muerte atribuible al cáncer o progresión, incluyendo recidiva, propagación metastásica y resistencia a fármacos, de una enfermedad neoplásica, tal como cáncer de mama.

El término “predicción” se usa en el presente documento para hacer referencia a la probabilidad de que un paciente responda o bien favorablemente o bien desfavorablemente a un fármaco o conjunto de fármacos, y también el grado de esas respuestas, o de que un paciente sobreviva, tras extirpación quirúrgica del tumor primario y/o quimioterapia durante un determinado periodo de tiempo sin recidiva de cáncer. Los métodos predictivos de la presente invención pueden usarse clínicamente para tomar decisiones de tratamiento eligiendo las modalidades de tratamiento más apropiadas para cualquier paciente particular. Los métodos predictivos de la presente invención son herramientas valiosas en la predicción de si es probable que un paciente responda favorablemente a un régimen de tratamiento, tal como intervención quirúrgica, quimioterapia con un fármaco o combinación de fármacos dados, y/o radioterapia, o si es probable la supervivencia a largo plazo del paciente, tras cirugía y/o terminación de quimioterapia u otras modalidades de tratamiento.

El término supervivencia “a largo plazo” se usa en el presente documento para hacer referencia a la neoplásicas, ya sean malignos o benignos, y todas las células y tejidos precancerosos y cancerosos. Los términos “cáncer” y “canceroso” se refieren al, describen el, estado fisiológico en mamíferos que se caracteriza normalmente por un crecimiento celular no regulado. Los ejemplos de cáncer incluyen, pero no se limitan a, cáncer de mama, cáncer de ovarios, cáncer de colon, cáncer de pulmón, cáncer de próstata, cáncer hepatocelular, cáncer gástrico, cáncer pancreático, cáncer de cuello uterino, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, cáncer de las vías urinarias, cáncer de tiroides, cáncer renal; carcinoma, melanoma y cáncer de cerebro.

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La “patología” del cáncer incluye todos los fenómenos que ponen en peligro el bienestar del paciente. Esto incluye, sin limitación, crecimiento celular anómalo o no controlable, metástasis, interferencia con el funcionamiento normal de células vecinas, liberación de citocinas u otros productos de secreción a niveles anómalos, supresión o agravamiento de la respuesta inflamatoria o inmunológica, neoplasia, tumores premalignos, tumores malignos, invasión de tejidos u órganos circundantes o distantes, tales como ganglios linfáticos, etc.

La “rigurosidad” de reacciones de hibridación puede determinarla fácilmente un experto habitual en la técnica, y generalmente es un cálculo empírico que depende de la longitud de sonda, temperatura de lavado y concentración de sal. En general, sondas más largas requieren temperaturas superiores para un apareamiento apropiado, mientras que sondas más cortas necesitan temperaturas inferiores. La hibridación depende generalmente de la capacidad del ADN desnaturalizado para volver a aparearse cuando están presentes cadenas complementarias en un entorno por debajo de su temperatura de fusión. Cuanto mayor es el grado de homología deseada entre la sonda y la secuencia hibridable, mayor es la temperatura relativa que puede usarse. Como resultado, se desprende que temperaturas relativas superiores tenderán a hacer que las condiciones de reacción sean más rigurosas, mientras que temperaturas inferiores las vuelven menos rigurosas. Para detalles adicionales y una explicación de la rigurosidad de reacciones de hibridación, véase Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995).

Las “condiciones rigurosas” o “condiciones de alta rigurosidad”, tal como se definen en el presente documento, normalmente: (1) emplean baja fuerza iónica y alta temperatura para el lavado, por ejemplo cloruro de sodio 0,015 M/citrato de sodio 0,0015 M/dodecilsulfato de sodio al 0,1% a 50ºC; (2) emplean durante la hibridación un agente desnaturalizante, tal como formamida, por ejemplo, formamida al 50% (v/v) con albúmina de suero bovino al 0,1%/Ficoll al 0,1%/polivinilpirrolidona al 0,1%/tampón fosfato de sodio 50 mM a pH 6,5 con cloruro de sodio 750 mM, citrato de sodio 75 mM a 42ºC; o (3) emplean formamida al 50%, 5 x SSC (NaCl 0,75 M, citrato de sodio 0,075 M), fosfato de sodio 50 mM (pH 6,8), pirofosfato de sodio al 0,1%, 5 x solución de Denhardt, ADN de esperma de salmón sonicado (50 ıg/ml), SDS al 0,1% y sulfato de dextrano al 10% a 42ºC, con lavados a 42ºC en 0,2 x SSC (cloruro de sodio/citrato de sodio) y formamida al 50% a 55ºC, seguido por un lavado de alta rigurosidad que consiste en 0,1 x SSC que contiene EDTA a 55ºC.

Las “condiciones de rigurosidad moderada” pueden identificarse tal como se describe por Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989, e incluyen el uso de disolución de lavado y condiciones de hibridación (por ejemplo, temperatura, fuerza iónica y % de SDS) menos rigurosas que las descritas anteriormente. Un ejemplo de condiciones de rigurosidad moderada es incubación durante la noche a 37ºC en una disolución que comprende: formamida al 20%, 5 x SSC (NaCl 150 mM, citrato de trisodio 15 mM), fosfato de sodio 50 mM (pH 7,6), 5 x solución de Denhardt, sulfato de dextrano al 10% y ADN de esperma de salmón fragmentado desnaturalizado 20 mg/ml, seguido por lavar los filtros en 1 x SSC a aproximadamente 37-50ºC. El experto en la técnica reconocerá cómo ajustar la temperatura, fuerza iónica, etc. según sea necesario para adaptarse a factores tales como longitud de sonda y similares.

En el contexto de la presente invención, la referencia a “al menos uno”, “al menos dos”, “al menos cinco”, etc. de los genes indicados en cualquier conjunto de genes particular significa uno cualquiera o todas y cada una de las combinaciones de los genes indicados. El término cáncer “de ganglios negativos”, tal como cáncer de mama “de ganglios negativos”, se usa en el presente documento para hacer referencia a cáncer que no se ha propagado a los ganglios linfáticos.

Los términos “corte y empalme” y “corte y empalme de ARN” se usan de manera intercambiable y se refieren a procesamiento de ARN que elimina intrones y une exones para producir ARNm maduro con secuencia codificante continua que se mueve en el citoplasma de una célula eucariota. En teoría, el término “exón” se refiere a cualquier segmento de un gen interrumpido que está representado en el producto de ARN maduro (B. Lewin. Genes IV Cell Press, Cambridge Mass. 1990).

En teoría el término “intrón” se refiere a cualquier segmento de ADN que se transcribe pero se elimina del secuencias intermedias dentro del ADN genómico de un gen, intercaladas entre secuencias de exones y que tienen secuencias consenso de corte y empalme GT y AG en sus límites en 5’ y 3’.

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B.DESCRIPCIÓN DETALLADA

La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de biología molecular (incluyendo técnicas recombinantes), microbiología, biología celular y bioquímica, que están dentro de la experiencia de la técnica. Tales técnicas se explican completamente en la bibliografía, tales como, “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 2ª edición (Sambrook et al., 1989); “Oligonucleotide Synthesis” (M.J. Gait, ed., 1984); “Animal Cell Culture” (R.I. Freshney, ed., 1987); “Methods in Enzymology” (Academic Press, Inc.); “Handbook of Experimental Immunology”, 4ª edición

(D.M. Weir & C.C. Blackwell, eds., Blackwell Science Inc., 1987); “Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells” (J.M. Miller & M.P. Calos, eds., 1987); “Current Protocols in Molecular Biology” (F.M. Ausubel et al., eds., 1987); y “PCR: The Polymerase Chain Reaction”, (Mullis et al., eds., 1994).

1.

Obtención del perfil de expresión génica

Los métodos de obtención del perfil de expresión génica incluyen métodos basados en análisis de hibridación de polinucleótidos, métodos basados en secuenciación de polinucleótidos y métodos basados en proteómica. Los métodos más comúnmente usados conocidos en la técnica para la cuantificación de la expresión de ARNm en una muestra incluyen transferencia de tipo Northern e hibridación in situ (Parker & Barnes, Methods in Molecular Biology 106:247-283 (1999)); ensayos de protección de ARNasa (Hod, Biotechniques 13:852-854 (1992)); y métodos basados en PCR, tales como reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR) (Weis et al., Trends in Genetics 8:263-264 (1992)). Alternativamente, pueden emplearse anticuerpos que pueden reconocer dúplex específicos, incluyendo dúplex de ADN, dúplex de ARN y dúplex híbridos de ADN-ARN o dúplex de ADN proteína. Los métodos representativos para el análisis de la expresión génica basado en secuenciación incluyen análisis en serie de la expresión génica (SAGE), y análisis de la expresión génica mediante determinación de secuencias distintivas en paralelo de manera masiva (MPSS).

2.

Métodos de obtención del perfil de expresión génica basados en PCR

a.PCR con transcriptasa inversa (RT-PCR)

De las técnicas indicadas anteriormente, el método cuantitativo más sensible y más flexible es la RT-PCR, que puede usarse para comparar niveles de ARNm en diferentes poblaciones de muestras, en tejidos normales y tumorales, con o sin tratamiento farmacológico, para caracterizar patrones de expresión génica, para distinguir entre ARNm estrechamente relacionados y para analizar la estructura del ARN.

La primera etapa es el aislamiento de ARNm de una muestra diana. El material de partida es normalmente ARN total aislado de tumores o líneas celulares tumorales humanos, y tejidos o líneas celulares normales correspondientes, respectivamente. Por tanto, puede aislarse ARN de una variedad de tumores primarios, incluyendo tumor o líneas celulares tumorales de mama, pulmón, colon, próstata, cerebro, hígado, riñón, páncreas, bazo, timo, testículos, ovarios, útero, etc., con ADN combinado de donantes sanos. Si la fuente de ARNm es un tumor primario, puede extraerse ARNm, por ejemplo, de muestras de tejido incrustadas en parafina congeladas o archivadas, y fijadas (por ejemplo fijadas en formalina).

En la técnica se conocen bien métodos generales para la extracción de ARNm y se dan a conocer en libros de texto convencionales de biología molecular, incluyendo Ausubel et al., Current Protocols of Molecular Biology, John Wiley and Sons (1997). Se dan a conocer métodos para la extracción de ARN a partir de tejidos incrustados en parafina, por ejemplo, en Rupp y Locker, Lab Invest. 56: A67 (1987), y De Andrés et al., BioTechniques 18:42044 (1995). En particular, el aislamiento de ARN puede realizarse usando un kit de purificación, conjunto de tampones y proteasa de fabricantes comerciales, tales como Qiagen, según las instrucciones del fabricante. Por ejemplo, puede aislarse ARN total a partir de células en cultivo usando mini-columnas RNeasy de Qiagen. Otros kits de aislamiento de ARN disponibles comercialmente incluyen kit de purificación de ADN y ARN completo MasterPure™ (EPICENTRE®, Madison, WI) y kit de aislamiento de ARN en bloques de parafina (Ambion, Inc.). Puede aislarse ARN total a partir de muestras de tejido usando RNA Stat-60 (Tel-Test). Puede aislarse ARN preparado a partir de un tumor, por ejemplo, mediante centrifugación con gradiente de densidad de cloruro de cesio.

Dado que el ARN no puede servir como molde para la PCR, la primera etapa en la obtención del perfil de expresión génica mediante RT-PCR es la transcripción inversa del molde de ARN para dar ADNc, seguido por su amplificación exponencial en una reacción de PCR. Las dos transcriptasas inversas más comúnmente usadas son transcriptasa inversa del virus de la mieloblastosis aviar (AMV-RT) y la inversa se ceba normalmente usando cebadores específicos, hexámeros al azar o cebadores de oligo-dT, dependiendo de las circunstancias y del objetivo de la obtención del perfil de expresión. Por ejemplo, ARN extraído puede someterse a transcripción inversa usando un kit de PCR de ARN de GeneAmp (Perkin Elmer, CA, EE.UU.), siguiendo las instrucciones del fabricante. Entonces puede usarse el ADNc derivado como molde en la reacción de PCR posterior.

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Aunque la etapa de PCR puede usar una variedad de ADN polimerasas dependientes de ADN termoestables, normalmente emplea la ADN polimerasa de Taq, que tiene una actividad nucleasa en 5’-3’ pero carece de actividad endonucleasa de corrección en 3’-5’. Por tanto, la PCR TaqMan® utiliza normalmente la actividad nucleasa en 5’ de polimerasa de Taq o Tth para hidrolizar una sonda de hibridación unida a su amplicón diana, pero puede usarse cualquier enzima con actividad nucleasa en 5’ equivalente. Se usan dos cebadores oligonucleotídicos para generar un amplicón típico de una reacción de PCR. Se diseña un tercer oligonucleótido, o sonda, para detectar una secuencia de nucleótidos ubicada entre los dos cebadores de PCR. La sonda no puede extenderse mediante la enzima ADN polimerasa de Taq, y está marcada con un tinte fluorescente indicador y un tinte fluorescente extintor. Cualquier emisión inducida por láser del tinte indicador se extingue por el tinte extintor cuando los dos tintes están ubicados cerca uno del otro como lo están en la sonda. Durante la reacción de amplificación, la enzima ADN polimerasa de Taq escinde la sonda de una manera dependiente del molde. Los fragmentos de sonda resultantes se disocian en disolución y la señal del tinte indicador liberado está libre del efecto extintor del segundo fluoróforo. Se libera una molécula de tinte indicador por cada nueva molécula sintetizada y la detección del tinte indicador no extinguido proporciona la base para la interpretación cuantitativa de los datos.

La RT-PCR TaqMan® puede realizarse usando equipo disponible comercialmente, tal como, por ejemplo, ABI PRISM 7700™ Sequence Detection System™ (Perkin-Elmer-Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.), o Lightcycler (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Alemania). En una realización preferida, el procedimiento de nucleasa en 5’ se realiza en un dispositivo de PCR cuantitativa en tiempo real tal como el ABI PRISM 7700™ Sequence Detection System™. El sistema consiste en un termociclador, láser, dispositivo de carga acoplada (CCD), cámara y ordenador. El sistema amplifica muestras en un formato de 96 pocillos en un termociclador. Durante la amplificación, se recoge en tiempo real una señal fluorescente inducida por láser a través de cables de fibra óptica para los 96 pocillos y se detecta en el CCD. El sistema incluye software para hacer funcionar el instrumento y para analizar los datos.

Los datos del ensayo de nucleasa en 5’ se expresan inicialmente como Ct, o el ciclo umbral. Tal como se comentó anteriormente, se registran valores de fluorescencia durante cada ciclo y representan la cantidad de producto amplificado hasta ese punto en la reacción de amplificación. El punto en el que se registra por primera vez que la señal fluorescente es estadísticamente significativa es el ciclo umbral (Ct).

Para minimizar errores y el efecto de la variación de muestra a muestra, la RT-PCR se realiza habitualmente usando un patrón interno. El patrón interno ideal se expresa a un nivel constante entre diferentes tejidos y no se ve afectado por el tratamiento experimental. Los ARN usados con mayor frecuencia para normalizar patrones de expresión génica son ARNm para los genes de mantenimiento gliceraldehído-3-fosfato-deshidrogenasa (GAPDH) y acción .

Una variación más reciente de la técnica de RT-PCR es la PCR cuantitativa en tiempo real, que mide la acumulación de producto de PCR a través de una sonda fluorigénica con doble marcador (es decir, sonda TaqMan®). La PCR en tiempo real es compatible tanto con la PCR de competencia cuantitativa, en la que se usa un competidor interno para cada secuencia diana para la normalización, como con PCR comparativa cuantitativa que usa un gen de normalización contenido dentro de la muestra o un gen de mantenimiento para RT-PCR. Para más detalles, véase, por ejemplo Held et al., Genome Research 6:986-994 (1996).

Las etapas de un protocolo representativo para obtener el perfil de expresión génica usando tejidos incrustados en parafina, fijados, como fuente de ARN, incluyendo aislamiento de ARNm, purificación, extensión por cebadores y amplificación, se facilitan en diversos artículos de revistas publicados {por ejemplo: T.E. Godfrey et al. J. Molec. Diagnostics 2: 84-91 [2000]; K. Specht et al., Am. J. Pathol. 158: 419-29 [2001]}. En resumen, un procedimiento representativo comienza con cortar secciones de aproximadamente 10 ım de grosor de muestras de tejido tumoral incrustadas en parafina. Entonces se extrae el ARN y se retiran las proteínas y el ADN. Tras el análisis de la concentración de ARN, pueden incluirse etapas de reparación y/o amplificación de ARN, si es necesario, y se somete el ARN a transcripción inversa usando promotores específicos del gen seguido por RT-PCR.

b. Sistema MassARRAY

En el método de obtención del perfil de expresión génica basado en MassARRAY, desarrollado por

Sequenom, Inc. (San Diego, CA) tras el aislamiento de ARN y transcripción inversa, al ADNc obtenido se le añaden cantidades conocidas de una molécula de ADN sintético (competidor), que se corresponde con la región de ADNc seleccionada como diana en todas las posiciones, excepto en una única base, y sirve como patrón interno. Se amplifica mediante PCR la mezcla de ADNc/competidor y se somete a un tratamiento con enzima fosfatasa alcalina de gamba (SAP) tras la PCR, que da como resultado la desfosforilación de los nucleótidos restantes. Tras la inactivación de la fosfatasa alcalina, se someten los productos de PCR del competidor y el ADNc a extensión por cebador, que genera señales de masa diferenciadas para los productos de PCR derivados de competidor y de ADNc. Tras la purificación, se dispensan estos productos sobre una matriz en chip, que se carga previamente con componentes necesarios para el análisis con un análisis de espectrometría de masas por desorción/ionización mediante láser asistida por matriz – tiempo de vuelo (EM por MALDI-TOF). Entonces se cuantifica el ADNc presente en la reacción analizando las razones de las áreas de picos en el espectro de masas generado. Para más detalles véase, por ejemplo, Ding y Cantor, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:30593064 (2003).

c. Otros métodos basados en PCR

Las técnicas basadas en PCR adicionales incluyen, por ejemplo, presentación diferencial (Liang y Pardee, Science 257:967-971 (1992)); polimorfismo de longitud de fragmentos amplificados (iAFLP) (Kawamoto et al., Genome Res. 12:1305-1312 (1999)); tecnología BeadArray™ (Illumina, San Diego, CA; Oliphant et al., Discovery of Markers for Disease (Supplement to Biotechniques), junio de 2002; Ferguson et al., Analytical Chemistry 72:5618 (2000)); BeadsArray para la detección de expresión génica (BADGE), usando el sistema Luminex100 LabMAP disponible comercialmente y microesferas codificadas por múltiples colores (Luminex Corp., Austin, TX) en un ensayo rápido para determinar la expresión génica (Yang et al., Genome Res. 11:1888-1898 (2001)); y análisis de obtención de perfiles de expresión de alta cobertura (HiCEP) (Fukumura et al., Nucl. Acids. Res. 31(16) e94 (2003)).

3. Micromatrices

También puede identificarse o confirmarse la expresión génica diferencial usando la técnica de micromatrices. Por tanto, puede medirse el perfil de expresión de genes asociados con cáncer de mama en tejido tumoral o bien reciente o bien incrustado en parafina, usando tecnología de micromatrices. En este método, se recubren o disponen en matriz secuencias de polinucleótido de interés (incluyendo ADNc y oligonucleótidos) sobre un sustrato de microchip. Entonces se hibridan las secuencias dispuestas en matriz con sondas de ADN específicas de células o tejidos de interés. Al igual que en el método de RT-PCR, la fuente de ARNm es normalmente ARN total aislado de tumores o líneas de células tumorales humanos, y tejidos o líneas celulares normales correspondientes. Por tanto, puede aislarse ARN de una variedad de tumores primarios o líneas de células tumorales. Si la fuente de ARNm es un tumor primario, puede extraerse ARNm, por ejemplo, de muestras de tejido incrustadas en parafina congeladas o archivadas, y fijadas (por ejemplo fijadas en formalina), que se preparan y se conservan de manera rutinaria en la práctica clínica diaria.

En una realización específica de la técnica de micromatrices, se aplican insertos amplificados por PCR de clones de ADNc a un sustrato en una matriz densa. Preferiblemente se aplican al menos 10.000 secuencias de nucleótidos al sustrato. Los genes dispuestos en micromatriz, inmovilizados sobre el microchip a 10.000 elementos cada uno, son adecuados para su hibridación en condiciones rigurosas. Pueden generarse sondas de ADNc marcadas con fluorescencia mediante incorporación de nucleótidos fluorescentes mediante transcripción inversa de ARN extraído a partir de tejidos de interés. Sondas de ADNc marcadas aplicadas al chip se hibridan con especificidad a cada punto de ADN en la matriz. Tras un lavado riguroso para eliminar sondas unidas de manera no específica, se explora el chip mediante microscopía confocal láser o mediante otro método de detección, tal como una cámara CCD. La cuantificación de la hibridación de cada elemento dispuesto en matriz permite la evaluación de la abundancia del ARNm correspondiente. Con fluorescencia de doble color, se hibridan por parejas a la matriz sondas de ADNc marcadas por separado generadas a partir de dos fuentes de ARN. Por tanto, se determina simultáneamente la abundancia relativa de los transcritos de las dos fuentes correspondientes a cada gen especificado. La escala miniaturizada de la hibridación proporciona una evaluación rápida y conveniente del patrón de expresión para grandes números de genes. Se ha mostrado que tales métodos tienen la sensibilidad requerida para detectar transcritos poco frecuentes, que se expresan a pocas copias por célula, y para detectar de manera reproducible diferencias de al menos aproximadamente dos veces entre los niveles de expresión (Schena et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93(2):106-149 (1996)). Pueden realizarse análisis en micromatriz mediante equipo disponible comercialmente, siguiendo protocolos del fabricante, tal como usando la tecnología GenChip de Affymetrix o la tecnología de micromatriz de Incyte.

El desarrollo de métodos de micromatriz para el análisis a gran escala de la expresión génica hace posible buscar de manera sistemática marcadores moleculares de clasificación del cáncer y predicción del desenlace en una variedad de tipos de tumores.

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4.

Análisis en serie de la expresión génica (SAGE)

El análisis en serie de la expresión génica (SAGE) es un método que permite el análisis simultáneo y cuantitativo de un gran número de transcritos génicos, sin necesidad de proporcionar una sonda de hibridación individual para cada transcrito. En primer lugar, se genera una etiqueta de secuencia corta (aproximadamente 10-14 pb) que contiene información suficiente para identificar de manera única un transcrito, siempre que se obtenga la etiqueta de una posición única dentro de cada transcrito. Después, se unen entre sí muchos transcritos para formar moléculas en serie largas, que pueden secuenciarse, revelando simultáneamente la identidad de las etiquetas múltiples. El patrón de expresión de cualquier población de transcritos puede evaluarse cuantitativamente determinando la abundancia de etiquetas individuales e identificando el gen correspondiente a cada etiqueta. Para más detalles véase, por ejemplo, Velculescu et al., Science 270:484-487 (1995); y Velculescu et al., Cell 88:243-51 (1997).

5.

Análisis de la expresión génica mediante determinación de secuencias distintivas en paralelo de manera masiva (MPSS)

Este método, descrito por Brenner et al., Nature Biotechnology 1, 8:630-634 (2000), es un enfoque de secuenciación que combina la determinación de secuencias distintivas no basada en gel con la clonación in vitro de millones de moldes sobre microperlas separadas de 5 ım de diámetro. En primer lugar, se construye una biblioteca de microperlas de moldes de ADN mediante clonación in vitro. Esto va seguido por el montaje de una matriz plana de las microperlas que contienen moldes en una célula de flujo a alta densidad (normalmente superior a 3 x 106 microperlas/cm2). Se analizan simultáneamente los extremos libres de los moldes clonados sobre cada microperla, usando un método de determinación de secuencias distintivas basado en fluorescencia que no requiere separación de fragmentos de ADN. Se ha mostrado que este método proporciona simultáneamente y con precisión, en una única operación, cientos de miles de secuencias distintivas génicas a partir de una biblioteca de ADNc de levadura.

6.

Inmunohistoquímica

Los métodos inmunohistoquímicos también son adecuados para detectar los niveles de expresión de los marcadores de pronóstico de la presente invención. Por tanto, se usan anticuerpos o antisueros, preferiblemente antisueros policlonales, y lo más preferiblemente anticuerpos monoclonales específicos para cada marcador, para detectar la expresión. Los anticuerpos pueden detectarse mediante marcaje directo de los propios anticuerpos, por ejemplo, con marcadores radiactivos, marcadores fluorescentes, marcadores de hapteno tales como biotina, o una enzima tal como peroxidasa del rábano o fosfatasa alcalina. Alternativamente, se usa anticuerpo primario no marcado junto con un anticuerpo secundario marcado, comprendiendo antisueros, antisueros policlonales o un anticuerpo monoclonal específico para el anticuerpo primario. En la técnica se conocen bien protocolos y kits de inmunohistoquímica y están disponibles comercialmente.

7.

Proteómica

El término “proteoma” se define como la totalidad de las proteínas presentes en una muestra (por ejemplo tejido, organismo o cultivo celular) en un determinado punto de tiempo. La proteómica incluye, entre otras cosas, el estudio de los cambios globales de la expresión de proteínas en una muestra (también denominado “proteómica de expresión”). La proteómica incluye normalmente las siguientes etapas: (1) separación de proteínas individuales en una muestra mediante electroforesis en gel en 2-D (2-D PAGE);

(2) identificación de las proteínas individuales recuperadas del gel, por ejemplo mediante espectrometría de masas o secuenciación N-terminal, y (3) análisis de los datos usando bioinformática. Los métodos de proteómica son complementos valiosos para otros métodos de obtención del perfil de expresión génica, y pueden usarse, solos o en combinación con otros métodos, para detectar los productos de los marcadores de pronóstico de la presente invención.

8. Descripción general del aislamiento, la purificación y la amplificación de ARNm

Las etapas de un protocolo representativo para obtener el perfil de expresión génica usando tejidos incrustados en parafina, fijados, como fuente de ARN, incluyendo aislamiento, purificación, extensión por cebadores y amplificación de ARNm, se proporcionan en diversos artículos de revistas publicados (por ejemplo: T.E. Godfrey et al,. J. Molec. Diagnostics 2: 84-91 [2000]; K. Specht et al., Am. J. Pathol. 158: 419-29 [2001]). En resumen, un procedimiento representativo comienza con cortar secciones de aproximadamente 10 ım de grosor de muestras de tejido tumoral incrustadas en parafina. Entonces se extrae el ARN y se retiran las proteínas y el ADN. Tras el análisis de la concentración de ARN, pueden incluirse etapas de reparación y/o amplificación de ARN, si es necesario, y se somete el ARN a transcripción inversa usando promotores específicos del gen seguido por RT-PCR. Finalmente, se analizan los datos para identificar la(s) mejor(es) opción/opciones de tratamiento disponible(s) para el paciente basándose en el patrón de expresión génica característico identificado en la muestra tumoral

examinada, dependiendo de la probabilidad predicha de recidiva de cáncer.

9.

Conjunto de genes de cáncer de mama, subsecuencias de genes sometidos a ensayo y aplicación clínica de los datos de expresión génica

Un aspecto importante de la presente invención es usar la expresión medida de determinados genes por tejido de cáncer de mama para proporcionar información de pronóstico. Para ello, es necesario corregir (separar por normalización) tanto diferencias en la cantidad de ARN sometido a ensayo como variabilidad en la calidad del ARN usado. Por tanto, normalmente el ensayo mide e incorpora la expresión de determinados genes de normalización, incluyendo genes de mantenimiento bien conocidos, tales como GAPDH y Cyp1. Alternativamente, la normalización puede basarse en la media o mediana de la señal (Ct) de todos los genes sometidos a ensayo o un gran subconjunto de los mismos (enfoque de normalización global). Basándose en cada gen, se compara la cantidad normalizada medida del ARNm tumoral de un paciente con la cantidad encontrada en un conjunto de referencia de tejido de cáncer de mama. El número (N) de tejidos de cáncer de mama en este conjunto de referencia debe ser lo suficientemente alto como para garantizar que diferentes conjuntos de referencia (en su totalidad) se comportan esencialmente de la misma manera. Si se cumple esta condición, la identidad de los tejidos de cáncer de mama individuales presentes en un conjunto particular no tendrá ningún impacto significativo sobre las cantidades relativas de los genes sometidos a ensayo. Habitualmente, el conjunto de referencia de tejido de cáncer de mama consiste en al menos aproximadamente 30, preferiblemente al menos aproximadamente 40 muestras de tejido de cáncer de mama FPE diferentes. A menos que se indique lo contrario, los niveles de expresión normalizados para cada ARNm/tumor sometido a prueba/paciente se expresarán como porcentaje del nivel de expresión medido en el conjunto de referencia. Más específicamente, el conjunto de referencia con un número suficientemente alto (por ejemplo 40) de tumores proporciona una distribución de niveles normalizados de cada especie de ARNm. El nivel medido en una muestra tumoral particular que va a analizarse se encuentra en algún percentil dentro de este intervalo, que puede determinarse mediante métodos bien conocidos en la técnica. A continuación, a menos que se indique lo contrario, la referencia a niveles de expresión de un gen supone la expresión normalizada con respecto al conjunto de referencia aunque no siempre se mencione esto de manera explícita.

10.

Diseño de cebadores y sondas de PCR basados en intrones

Según un aspecto de la presente invención, se diseñan cebadores y sondas de PCR basándose en secuencias de intrones presentes en el gen que va a amplificarse. Por consiguiente, la primera etapa en el diseño de cebadores/sondas es la delineación de secuencias de intrones dentro de los genes. Esto puede realizarse mediante software públicamente disponible, tal como el software DNA BLAT desarrollado por Kent, W.J., Genome Res. 12(4):656-64 (2002), o mediante el software BLAST incluyendo sus variaciones. Las etapas posteriores siguen métodos bien establecidos de diseño de cebadores y sondas de PCR.

Con el fin de evitar señales no específicas, es importante enmascarar secuencias de repetición dentro de los intrones cuando se diseñan los cebadores y las sondas. Esto puede lograrse fácilmente usando el programa Repeat Masker disponible en línea a través del Baylor College of Medicine, que examina secuencias de ADN frente a una biblioteca de elementos de repetición y devuelve una secuencia de consulta en la que los elementos de repetición están enmascarados. Entonces pueden usarse las secuencias de intrones enmascaradas para diseñar secuencias de cebadores y sondas usando cualquier paquete de diseño de cebadores/sondas disponible comercialmente o públicamente de otro modo, tales como Primer Express (Applied Biosystems); MGB assay-by-design (Applied Biosystems); Primer3 (Steve Rozen y Helen J. Skaletsky (2000) Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers. En: Krawetz S, Misener S (eds) Bioinformatics Methods and Protocols: Methods in Molecular Biology. Humana Press, Totowa, NJ, págs. 365-386).

Los factores más importantes considerados en el diseño de cebadores de PCR incluyen longitud de cebador, temperatura de fusión (Tf) y contenido de G/C, especificidad, secuencias de cebador complementarias y secuencia en el extremo 3’. En general, los cebadores de PCR óptimos tienen generalmente 17-30 bases de longitud y contienen aproximadamente el 20-80%, tal como, por ejemplo, aproximadamente el 50-60% de bases G+C. Normalmente se prefieren Tf de entre 50 y 80ºC, por ejemplo de aproximadamente 50 a 70ºC.

Para directrices adicionales para el diseño de cebadores y sondas de PCR véase, por ejemplo Dieffenbach, C.W. et al., “General Concepts for PCR Primer Design” en: PCR Primer, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York, 1995, págs. 133-155; Innis y Gelfand, “Optimization of PCRs” en: PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, CRC Press, Londres, 1994, págs. 5-11; y Plasterer, T.N. Primerselect: Primer and probe design. Methods Mol. Biol. 70:520-527 (1997). En el siguiente ejemplo no limitativo se describirán detalles adicionales de la invención.

Ejemplo

Estudio de fase II de la expresión génica en 242 tumores de mama malignos

Se diseñó y se realizó un estudio de la expresión génica con el objetivo principal de caracterizar molecularmente la expresión génica en muestras de tejido incrustadas en parafina, fijadas, de carcinoma ductal de mama invasivo, y explorar la correlación entre tales perfiles moleculares y la supervivencia libre de enfermedad.

Diseño del estudio

Se realizaron ensayos moleculares con tejidos de tumor de mama primario, incrustados en parafina, fijados en formalina, obtenidos de 252 pacientes individuales con diagnóstico de cáncer de mama invasivo. Todos los pacientes tenían ganglios linfáticos negativos, eran positivos para ER y se trataron con tamoxifeno. La edad media era de 52 años y el tamaño de tumor clínico medio era de 2 cm. La mediana del seguimiento fue de 10,9 años. A fecha del 1 de enero de 2003, 41 pacientes tenían recidiva de enfermedad local o distante o habían muerto por cáncer de mama. Los pacientes sólo se incluyeron en el estudio si la evaluación histopatológica, realizada tal como se describe en la sección de materiales y métodos, indicó cantidades adecuadas de tejido tumoral y patología homogénea.

Materiales y métodos

Se caracterizó cada bloque de tumor representativo mediante histopatología convencional para el diagnóstico, evaluación semicuantitativa de la cantidad de tumor y clasificación tumoral. Cuando el área tumoral era inferior al 70% de la sección, se sometió el área tumoral a disección macroscópica y se tomó tejido de 6 secciones (10 micrómetros). De lo contrario, se prepararon un total de 3 secciones (también de 10 micrómetros de grosor cada una). Se colocaron las secciones en dos tubos de microcentrifugadora de marca Costar (tubos de polipropileno, de 65 1,7 ml, transparentes). Si se obtuvo más de un bloque de tumor como parte del procedimiento quirúrgico, se usó para el análisis el bloque más representativo de la patología.

Análisis de la expresión génica

Se extrajo ARNm y se purificó a partir de muestras de tejido incrustadas en parafina, fijadas, y se preparó para el análisis de la expresión génica tal como se describió en el capítulo 6 anterior. Se realizaron ensayos moleculares de la expresión génica cuantitativa mediante RT-PCR, usando el ABI PRISM 7900™ Sequence Detection System™ (Perkin-Elmer-Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.). ABI PRISM 7900™ consiste en un termociclador, láser, dispositivo de carga acoplada (CCD), cámara y ordenador. El sistema amplifica muestras en un formato de 384 pocillos en un termociclador. Durante la amplificación, se recoge en tiempo real una señal fluorescente inducida por láser a través de cables de fibra óptica para los 384 pocillos y se detecta en el CCD. El sistema incluye software para hacer funcionar el instrumento y para analizar los datos.

Análisis y resultados

Se analizó tejido tumoral para detectar 187 genes relacionados con cáncer y 5 genes de referencia. Se obtuvieron perfiles de RT-PCR adecuados de 242 de los 252 pacientes. Se normalizaron los valores de ciclo umbral (CT) para cada paciente basándose en la mediana de los 7 genes de referencia para ese paciente particular. Había datos de desenlace clínico disponibles para todos los pacientes a partir de una revisión de datos de registro e historias clínicas de pacientes seleccionados. Los desenlaces se clasificaron como:

Acontecimiento: Vivo con recidiva de cáncer de mama local, regional o distante o muerte debido a cáncer de mama.

Sin acontecimiento: Vivo sin recidiva de cáncer de mama local, regional o distante o vivo con recidiva de cáncer de mama contralateral o vivo con segundo cáncer primario distinto de mama o muerte antes de la recidiva de cáncer de mama.

El análisis se realizó mediante:

A:Determinación de la relación entre la expresión génica normalizada y los desenlaces binarios de 0 ó 1;

B.Análisis de la relación entre la expresión génica normalizada y el tiempo hasta el desenlace (0 ó 1 tal como se definió anteriormente) en el que se censuraron los pacientes que estaban vivos sin recidiva de cáncer de mama o que murieron debido a una causa distinta al cáncer de mama. Este enfoque se usó

para evaluar el impacto del pronóstico de genes individuales y también conjuntos de múltiples genes.

Análisis de pacientes con carcinomas de mama invasivos mediante enfoque binario

5 En el primer enfoque (binario) se realizó el análisis con los 242 pacientes con carcinoma de mama invasivo. Se realizó una prueba de la t con los grupos de pacientes clasificados como o bien sin recidiva o bien sin muerte relacionada con cáncer de mama a los 10 años, frente a recidiva o muerte relacionada con cáncer de mama a los 10 años, y se calcularon los valores de p para las diferencias entre los grupos para cada gen.

10 La tabla 1 indica los 33 genes para los que el valor de p para las diferencias entre los grupos fue <0,05. La primera columna de valores de expresión medios se refiere a pacientes que tenían una recidiva metastásica de, o murieron por, cáncer de mama. La segunda columna de valores de expresión medios se refiere a pacientes que ni tenían recidiva metastásica ni murieron por cáncer de mama.

15 Tabla 1

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En la tabla 1 anterior, valores de t negativos indican una mayor expresión, asociada con mejores

5 desenlaces, y a la inversa, valores de t superiores (positivos) indican una mayor expresión asociada con peores desenlaces. Por tanto, por ejemplo, una expresión elevada del gen CCNB1 (valor de t = 3,02; CT media vivos < CT media muertos) indica una probabilidad reducida de supervivencia libre de enfermedad. De manera similar, la expresión elevada del gen GSTM1 (valor de t = -3,56; CT media vivos > CT media muertos) indica una probabilidad aumentada de supervivencia libre de enfermedad.

10 Por tanto, basándose en los datos expuestos en la tabla 1, la expresión de cualquiera de los siguientes genes en el cáncer de mama indica una probabilidad reducida de supervivencia sin recidiva de cáncer: C20_orf1; CCNB1; CDC20; CDH1; CTSL2; EpCAM; GRB7; HER2; KNSL2; LMNB1; MCM2; MMP9; MYBL2; NEK2; PCNA; PREP; PTTG1; STMY3; SURV; TS; MELK. Basándose en los datos expuestos en

15 la tabla 1, la expresión de cualquiera de los siguientes genes en el cáncer de mama indica un mejor pronóstico para la supervivencia sin recidiva de cáncer: BAG1; BCatenin; CEGP1; CIAP1; cMYC; DKFZp586M07; EstR1; GSTM1; GSTM3; ID1; ITGA7; PR.

Análisis de múltiples genes e indicadores del desenlace

20 Se tomaron dos enfoques con el fin de determinar si usar múltiples genes proporcionaba una mejor distinción entre desenlaces. En primer lugar, se realizó un análisis de distinción usando un enfoque de avance gradual. Se generaron modelos que clasificaron el desenlace con mayor distinción que la que se obtuvo con cualquier gen individual solo. Según un segundo enfoque (enfoque de tiempo hasta el

25 acontecimiento), para cada gen se definió un modelo de riesgos proporcionales de Cox (véase, por ejemplo Cox, D. R., y Oakes, D. (1984), Analysis of Survival Data, Chapman and Hall, Londres, Nueva York) con tiempo hasta la recidiva o muerte como la variable dependiente, y el nivel de expresión del gen como la variable independiente. Se identificaron los genes que tienen un valor de p < 0,05 en el modelo de Cox. Para cada gen, el modelo de Cox proporciona el riesgo relativo (RR) de recidiva o muerte para

30 un cambio de una unidad en la expresión del gen. Puede elegirse repartir los pacientes en subgrupos a cualquier valor umbral de la expresión medida (en la escala de CT), en el que todos los pacientes con valores de expresión por encima del umbral tienen un riesgo mayor y todos los pacientes con valores de expresión por debajo del umbral tienen un riesgo menor, o viceversa, dependiendo de si el gen es un indicador de un pronóstico malo (RR>1,01) o bueno (RR<1,01). Por tanto, cualquier valor umbral definirá

35 subgrupos de pacientes con riesgo respectivamente aumentado o reducido. Los resultados se resumen en la tabla 2, que indica los 42 genes para los que el valor de p para las diferencias entre los 5 grupos era <0,05

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5 Basándose en los datos expuestos en la tabla 2, la expresión de cualquiera de los siguientes genes en el cáncer de mama indica una probabilidad reducida de supervivencia sin recidiva de cáncer: GRB7; SURV; LMNB1; MYBL2; HER2; MELK; C20_orf1; PTTG1; BUB1; CDC20; CCNB1; STMY3; KNSL2; CTSL2; MCM2; NEK2; Ki_67; CCNE2; TOP2A-4; PCNA; PREP; FOXM1; NME1; STK15; HNRPAB; MMP9; TS; Src; MMP12; TFRC.

10 Basándose en los datos expuestos en la tabla 2, la expresión de cualquiera de los siguientes genes en el cáncer de mama indica un mejor pronóstico para la supervivencia sin recidiva de cáncer: PR; GSTM11; DR5; CEGP1; BAG1; EstR1; DKFZp586M07; BIN1; NPD009; RPLPO; GSTM3; IGF1R.

15 Los análisis binario y de tiempo hasta el acontecimiento, con pocas excepciones, identificaron los mismos genes como marcadores de pronóstico. Por ejemplo, la comparación de las tablas 1 y 2 muestra que genes estaban representados entre los 15 genes más importantes en ambas listas. Además, cuando ambos análisis identificaron el mismo gen a [p<0,10], lo que sucedió para 26 genes, siempre concordaban con respecto al sentido (signo positivo o negativo) de la correlación con la

20 supervivencia/recidiva. En conjunto, estos resultados refuerzan la conclusión de que los marcadores identificados tienen un valor de pronóstico significativo.

Análisis génico de múltiples variables de 242 pacientes con carcinoma de mama invasivo

25 Para modelos de Cox que comprenden más de dos genes (modelos de múltiples variables), se realiza la introducción gradual de cada gen individual en el modelo, en el que el primer gen introducido se selecciona previamente de los genes que tienen valores de p para una variable significativos, y el gen manera el ajuste del modelo a los datos. Este análisis puede realizarse con cualquier número total de genes. En el análisis cuyos resultados se muestran a continuación, se realizó la introducción gradual para hasta 10 genes.

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5 Se realizó un análisis de múltiples variables usando la siguiente ecuación:

RR = exp[coef(genA) x Ct(genA) + coef(genB) x Ct(genB) + coef(genC) x Ct(genC) + …………….].

En esta ecuación, los coeficientes para los genes que son factores pronóstico de un desenlace

10 beneficioso son números positivos y los coeficientes para genes que son factores pronóstico de un desenlace desfavorable son números negativos. Los valores de “Ct” en la ecuación son ıCt, es decir, reflejan la diferencia entre el valor de Ct normalizado promedio para una población y el Ct normalizado medido para el paciente en cuestión. El convenio usado en el presente análisis ha sido que ıCt por debajo y por encima del promedio de la población tienen signos positivos y signos negativos, respectivamente

15 (reflejando una mayor o menor abundancia de ARNm). El riesgo relativo (RR) calculado resolviendo esta ecuación indicará si el paciente tiene una probabilidad potenciada o reducida de supervivencia a largo plazo sin recidiva de cáncer.

Se realizó un análisis gradual de múltiples variables, usando el modelo de riesgos proporcionales de Cox,

20 sobre los datos de expresión génica obtenidos para los 242 pacientes con carcinoma de mama invasivo. Mediante este análisis se identificó que el siguiente conjunto de diez genes tenía un valor predictivo particularmente fuerte de la supervivencia de pacientes: GRB7; LMNB1; ER; STMY3; KLK10; PR; KRT5; FGFR1; MCM6; SNRPF. En este conjunto de genes, ER, PR, KRT5 y MCM6 contribuyen a un buen pronóstico, mientras que GRB7, LMNB1, STMY3, KLK10, FGFR1 y SNRPF contribuyen a un mal

25 pronóstico.

Aunque se ha descrito la presente invención con referencia a lo que se considera que son las realizaciones específicas, debe entenderse que la invención no se limita a tales realizaciones. Por el contrario, se pretende que la invención cubra diversas modificaciones y equivalentes incluidos dentro del

30 alcance de las reivindicaciones adjuntas.

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Claims (8)

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   REIVINDICACIONES

   1.Método de predicción de la probabilidad de supervivencia libre de enfermedad de un paciente con

   5 cáncer de mama ductal invasivo, de ganglios negativos, positivo para ER, que comprende determinar el nivel de expresión del transcrito de ARN de STMY3 en una muestra de célula o tejido de cáncer de mama obtenida del paciente, normalizado frente al nivel de expresión de un conjunto de referencia de transcritos de ARN, comparar el nivel de expresión normalizado de STMY3 del paciente con un nivel de expresión normalizado de STMY3 en un conjunto de referencia de tejido de cáncer de mama que comprende

   10 pacientes que (a) estaban vivos sin recidiva de cáncer de mama local, regional o distante, (b) estaban vivos con recidiva de cáncer de mama contralateral, (c) estaban vivos con un segundo cáncer primario distinto de mama, o (d) murieron antes de la recidiva de cáncer de mama, en el que un nivel de expresión normalizado aumentado de STMY3 del paciente indica una probabilidad reducida de supervivencia libre de enfermedad.

   15

2. 2.

   Método según la reivindicación 1, en el que dicho ARN comprende ARN intrónico.

3. 3.

   Método según la reivindicación 1 ó 2, en el que dicho ARN se aísla de una muestra de tejido de cáncer

   de mama incrustada en cera, fijado, de dicho paciente. 20
4. 4. Método según la reivindicación 1, 2 ó 3, en el que dicho ARN se aísla de tejido de biopsia con aguja gruesa.
5. 5. Método según cualquier reivindicación anterior, en el que dicho ARN se aísla de células de aspirado 25 con aguja fina.
6. 6. Método según cualquier reivindicación anterior, en el que el nivel de expresión de dicho transcrito de ARN se determina mediante el uso de una matriz que comprende un polinucleótido que se hibrida con el gen inmovilizado sobre una superficie sólida.

   30
7. 7. Método según cualquier reivindicación anterior, en el que el nivel de expresión de dicho transcrito de ARN se determina mediante reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR).
8. 8. Método según cualquier reivindicación anterior, en el que el ARN está fragmentado. 35

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