CN112626218A - 一种用于预测胰腺癌转移风险的基因表达分类器、体外诊断试剂盒 - Google Patents
一种用于预测胰腺癌转移风险的基因表达分类器、体外诊断试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种用于预测胰腺癌转移风险的基因表达分类器、体外诊断试剂盒。所述基因表达分类器为5‑基因表达分类器，5个基因分别为HMGA2、PPL、DTX4、CDH3和ST6GALNAC2。本发明基因表达分类器能作为一种有效的预后诊断手段将胰腺癌中具有不良预后的转移患者分离出来，能预测胰腺癌患者的转移风险，研究成果可对术后仍有转移风险患者进行检测从而预防性用药，对肿瘤复发转移病人进行靶向药物治疗。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学检测技术领域，特别是涉及一种用于预测胰腺癌转移风险的基因表达分类器、体外诊断试剂盒。
背景技术
胰腺癌是一种恶性程度很高，极易转移的消化道恶性肿瘤，90％起源于腺管上皮的导管腺癌。其发病率和死亡率近年来明显上升，是预后最差的恶性肿瘤之一。胰腺癌早期的确诊率不高，手术死亡率较高，治愈率很低。胰腺癌极具侵袭性且被确诊时已存在高转移风险，因此，研究胰腺癌转移发生、发展及其机制就有重要的价值。胰腺癌恶性生物学行为的一个重要特点就是具有明显的侵袭和转移性，在胰腺癌早期就可以发生胰外播散，浸润至局部淋巴结、肠系膜血管、门静脉、胰周脏器和脂肪组织以及腹膜后神经丛等，或通过血行性转移至肺、肝等远处器官，导致3/4以上的胰腺癌患者就诊时丧失了根治性手术治疗的机会，使胰腺癌有较高的死亡率，5年生存率低于5％。现如今，癌症已经成为人类生命安全的最大威胁因素，造成了全球每年大概有700多万人因恶性肿瘤而死亡的局面。其中，胰腺恶性肿瘤是当今最难诊断，最难治疗的恶性肿瘤之一，因此，早期发现、早期干预胰腺恶性肿瘤非常重要。
目前，在世界各地的许多实验室都在探寻利用基因生物标志物更早确诊胰腺癌，并提供预后信息。随着组学技术的高速发展，以基因组学，转录组学，蛋白质组学，代谢组学为主的多组学技术结合生物信息学方法被用来探索肿瘤甚至转移的生物标志物。同时，计算机处理能力的提升和相关医疗数据的发展促使AI被普遍应用于医疗，卫生和健康领域，而机器学习作为人工智能领域中最能体现智能的一个分支，其针对智能医疗领域的研究，尤其是辅助疾病诊断领域的研究工作在不断加深，医生逐渐开始将机器学习的手段应用于辅助癌症的诊断。应用范围主要包括癌症的前期诊断、癌症预后和复发的判断。研究表明，机器学习方法在辅助诊断方面的应用已使癌症诊断与预测的准确率相比于过去的几年，提高了15％-20％。
公开号为CN107292127A的发明专利申请公开了一种预测肺癌病人预后的基因表达分类器的构建方法，包括：数据训练阶段和验证阶段，所述训练阶段包括第一阶段和第二阶段，所述第一阶段使用有监督的机器学习方法建立能预测肺癌病人预后的基因表达分类器雏形，所述第二阶段进一步使用机器学习的方法获得预测肺癌病人预后的基因表达分类器。本发明运用了有监督的机器学习方法获得了一种基因表达分类器，可以精准地预测非小细胞肺癌病人的预后。该基因表达分类器具有非常强的临床转化价值。通过进行基因群组(panel)的基因表达检测，高风险的基因风险评分的非小细胞肺癌病人应该接受辅助治疗，而低风险的基因风险评分的非小细胞肺癌病人应该接受低剂量或免于辅助治疗。
然而，现有技术中还缺少预测患者胰腺癌转移风险的基因表达分类器。
发明内容
本发明针对现有技术中存在的上述问题，从TCGA公共数据库内胰腺癌患者的转录组测序数据及其临床预后信息出发，运用监督机器学习方法，从整个转录组中获得一种5-基因表达分类器，准确预测胰腺癌患者转移风险的情况。
本发明首先提供了一种用于预测胰腺癌转移风险的基因表达分类器，为5-基因表达分类器，5个基因分别为HMGA2、PPL、DTX4、CDH3和ST6GALNAC2。
其中，所述的基因表达分类器，HMGA2、PPL、DTX4、CDH3和ST6GALNAC2的权重系数分别为：0.2056、0.1985、0.1366、0.1209和0.0688。
所述的基因表达分类器，
其中Coefi是基因表达分类器中各基因的权重系数，xi是基因表达分类器中各基因的表达量，n是基因表达分类器中基因的数量；风险评分越高，则胰腺癌转移风险越高。
本发明又提供了一种基因表达分类器的构建方法，所述基因表达分类器用于预测胰腺癌转移风险，所述构建方法包括：
(1)使用TCGA数据库中胰腺腺癌患者的基因表达信息和临床信息，以及GEO数据库中关于转移的胰腺癌细胞株的数据集，采用有监督的机器学习方法来筛选与转移风险高度相关的基因；
(2)筛选R0切除后发生转移和未发生转移的患者作为转移组和非转移组，获得训练集；
(3)在训练集中，数据输入中胰腺癌转移组赋值1，胰腺癌非转移组赋值0，根据风险评分公式如下：
使用LASSO算法筛选最佳的基因类别和数目，并通过logistic回归建立所述基因表达分类器。
所述的构建方法，还包括：筛选TNM分期中T3期时发生淋巴结转移和未发生淋巴结转移的患者作为转移组和非转移组，获得验证集；在验证集上验证构建的基因表达分类器的准确性。为了排除原发灶肿瘤大小不一致导致转移程度不同的问题，我们设置了统一的起点，筛选TNM分期中T3期时发生淋巴结转移和未发生淋巴结转移的患者作为转移性胰腺癌患者组和非转移性胰腺癌患者组。
使用基因表达分类器计算用于验证的患者的风险系数，预测其转移风险，通过比较真实转移情况和预测转移风险的一致性，验证所述基因表达分类器的性能。
使用GEO数据库内的胰腺癌患者的基因表达芯片数据集验证以上所获得基因表达分类器；在一个独立的数据集中，那些分数值高于最佳截断值的病人被划为高风险组，而其余为低风险组；KM分析用来比较高风险组和低风险组的生存曲线；时序检验p值＜0.05表示有统计学差异。
对训练数据和验证数据，通过单因素和多因素的Cox比例风险回归模型计算相关临床指标的p值，按照p值从小到大对临床指标重新排序，排在越前面的临床指标，Cox回归p值越小，与预后的相关性越大。
本发明还提供了一种用于预测胰腺癌转移风险的体外诊断试剂盒，包括分别用于检测HMGA2、PPL、DTX4、CDH3和ST6GALNAC2这5个基因表达量的检测试剂。
本发明还提供了检测基因标签组表达量的试剂在制备用于预测胰腺癌转移风险的体外诊断试剂盒中的应用，基因标签组包括HMGA2、PPL、DTX4、CDH3和ST6GALNAC2。优选的，HMGA2、PPL、DTX4、CDH3和ST6GALNAC2的权重系数分别为：0.2056、0.1985、0.1366、0.1209和0.0688；
其中Coefi是各基因的权重系数，xi是各基因的表达量，n是基因表达分类器中基因的数量；风险评分越高，则胰腺癌转移风险越高。
检测基因标签组表达量的试剂包括用RT-PCR方法检测基因标签组中各基因表达量的试剂。当然，也可以通过其他任何能够用于检测基因表达量的方法和试剂和进行检测。
本发明提供一种基因表达分类器，能作为一种有效的预后诊断手段将胰腺癌中具有不良预后的转移患者分离出来。
发明运用有监督的机器学习的方法建立了一种基因表达分类器来精准预测胰腺癌患者转移的风险。该基因表达分类器具有以下几种明显的优点：能预测胰腺癌患者的转移风险。研究成果可对术后仍有转移风险患者进行检测从而预防性用药，对肿瘤复发转移病人进行靶向药物治疗。
另一方面，本发明是基于机器学习来预测胰腺癌转移患者风险的基因表达分类器的构建方法，通过LASSO回归可以筛选出对胰腺癌转移影响较大的属性，采用Logistic构建胰腺癌转移风险预测方法，能达到相比于其他预测方法更好的预测效果。
附图说明
图1是本发明预测胰腺癌转移风险的5-基因表达分类器方法流程图。
图2是训练集(A)和验证集(B)的分类器的ROC示意图。
图3是在训练集(A)和验证集(B)中，TCGA胰腺腺癌患者的高5-基因风险评分和低5-基因风险评分患者的KM分析图。
图4是对5-基因风险评分和临床指标的单变量和多变量COX分析的森林图。对训练集和验证集合的5-基因风险评分、年龄、性别、组织学分级和TNM分期(如果有)进行单变量和多变量COX分析。横线上的绿色方格表示危险比(HR)，红色横线表示95％CI。风险评分和年龄是连续变量，性别、组织学分级和TNM分期是不连续变量。图4A是训练集的单变量COX分析，分析的指标分别是5-基因风险评分、年龄、性别、组织学分级和TNM分期；图4B是训练集的多变量COX分析；图4C和D分别是验证集的单变量和多变量COX分析。
具体实施方式
实施例1
图1是本发明预测胰腺癌转移风险的5-基因表达分类器方法流程图。
1、研究材料和方法
1.1、TCGA(The Cancer Genome Altas)和GEO(Gene ExpressionOmnibus)数据集的下载
1.2、转移差异基因筛选
在GEO、TCGA数据库下载基因芯片数据和胰腺癌患者测序数据后，芯片数据通过R软件3.6.2(https：//www.r-project.org/)的“limma”软件包，测序数据通过R软件3.6.2(https：//www.r-project.org/)的“Deseq”软件包，筛选了不同组别之间差异表达的mRNA。|log2FC|＞1和P＜0.05设置为截止标准。提取以上调和下调为特征的GEO和TCGA等测序数据集的配对样本中的重叠DEG。
1.3、基因表达分类器的构建
基因表达分类器的构建方法分为训练和验证两个阶段。
1.3.1、训练阶段
分组：TCGA的胰腺腺癌(PAAD)患者的基因表达数据和临床数据被用来进行第一阶段的特征降维。为了排除因手术没切干净而导致转移程度不同的问题，我们筛选R0切除后发生转移和未发生转移的患者作为转移组和非转移组，满足条件的胰腺腺癌病人共96位，作为训练集。在验证集筛选中，同样我们为了排除原发灶肿瘤大小不一致导致转移程度不同的问题，我们设置了统一的起点，筛选TNM分期中T3期(原发灶都是一样大小的肿瘤)时发生淋巴结转移和未发生淋巴结转移的患者作为转移组和非转移组。
在训练集中，数据输入中胰腺癌转移组赋值1，胰腺癌非转移组赋值0，应用最小绝对收缩选择算子(LASSO)回归算法。以最低标准选择特征基因来构建风险特征，模型给定筛选后的特征基因及其系数，根据风险评分公式如下：
其中是Coefi系数，xi是每个特征选定基因的表达量。
计算TGGA训练集中每个样本的风险得分，并根据最佳截断值分为低风险组和高风险组。计算模型的AUC值为0.781(图2A)。同时KM分析用来比较高低风险组的生存曲线，高风险组和低风险组之间的OS有显着差异(图3A)。
1.3.2、验证阶段
在验证集上，我们对每位患者计算风险评分，计算模型AUC为0.821(图2B)。同时高风险组和低风险组之间的OS也有显着差异(图3B)。验证是否风险评分高的组更倾向于定义的转移组从而验证预测胰腺癌转移模型的准确性，对训练集和验证集应用风险评分进行热图分析，并将两组的病理等级，是否转移等临床因素考虑进来。这些分析可以评估我们选择的基因和构建的风险模型是否有良好的预测价值。
2、研究结果
2.1、胰腺癌转移风险模型的建立
在转移差异基因筛选阶段，将TCGA胰腺腺癌患者基因表达数据与数据集GSE21654、GSE23952的差异基因取交集，得到32个差异基因，分别是14个上调差异基因和18个下调差异基因(表1和表2)。
为了建立更加简洁有效的分类器，进一步通过最小绝对收缩和选择算子(LASSO)回归算法对上述32个基因筛选，根据最低标准获得了5-基因表达分类器模型。5个基因分别是HMGA2，PPL，DTX4，CDH3，ST6GALNAC2。每个基因的系数如表3。每个病人可计算出相应的5-基因表达风险评分值。KM生存分析的结果发现，在TCGA的训练集和验证集中，低5-基因表达风险评分的生存时间明显比高5-基因表达风险评分的生存时间长。
表1是14个上调差异基因的差异倍数和PValue。
表2是18个上调差异基因的差异倍数和PValue。
表3是最终5-基因表达分类器模型中的基因及其系数
2.2、5-基因表达分类器诊断预测效能验证
为了验证5-基因表达分类器的好坏，作ROC曲线图，根据AUC值的大小来评估模型，训练集和验证集的AUC值分别为0.781和0.821，结果证明了利用5个基因构建的胰腺癌转移风险的模型是一个很好的分类器。对训练集和验证集应用风险评分进行热图分析，结果显示TCGA数据集中高风险组里，筛选出的特征基因是高表达的。两组的病理等级(P＜0.05)，性别(P＜0.05)，是否转移(P＜0.01)这些因素的有显著意义。这些分析表明我们选择的基因和构建的风险模型有良好的预测价值。
2.3、5-基因表达分类器是胰腺癌独立的预后指标
为了独立于临床病理特征来验证五个特征基因的预后价值，我们进行了COX单变量和多变量分析，其中包括风险评分，年龄，性别，组织学分级和TNM分期。通过COX分析发现这些因素均是危险因素，风险比都大于1，在单变量分析中，发现无论是训练集还是验证集中只有5-基因表达分类器的p值小于0.05(图4A、B)，多变量COX分析也显示即使在每个数据集中考虑了其他临床因素后，5-基因表达分类器确实与OS显著相关(图4C、D)。这些发现表明，从EMT相关基因获得的5-基因表达分类器是胰腺癌患者的独立预后指标。
3、讨论
本发明为了准确预测胰腺癌患者的转移风险，通过监督学习的机器学习算法确定了5个EMT相关差异基因来预测胰腺癌转移的情况，且这五个特征基因得出的风险评分也是独立的预后风险指标。
本发明开发的5-基因分类器可以将TCGA病人的高转移风险组和低转移风险组有效区分开，说明该5-基因表达分类器可以开发成为一种体外诊断产品，研究成果可对术后仍有转移风险患者进行检测从而预防性用药，对肿瘤复发转移病人进行靶向药物治疗。
本发明构建的5-基因表达分类器提供了一种新型的评分系统，其中基因的表达值是相对表达量。5-基因分别是HMGA2，PPL，DTX4，CDH3，ST6GALNAC2，其中HMGA2具有最高的系数值，表明该基因的重要性可能与肿瘤的转移有关。据报道，HMGA2与致癌RAS/MEK信号通路相关，是维持胰腺癌细胞增殖和间充质状态所必需的，且HMGA蛋白的过表达与癌症的进展和转移有关，可以作为诊断分子标记。对于PPL，DTX4，T6GALNAC2这三个生物标记物，先前研究没有提到它们是胰腺癌转移相关的基因。所以这是我们首次发现PPL，DTX4，T6GALNAC2与胰腺癌转移有密切联系。
本发明不仅证明了基于5-基因表达分类器的风险评分模型预测胰腺癌转移的有效性，还证实了与其他已知的特征相比，它是胰腺癌患者OS预后的独立有效因素。与其他的预测模型相比，我们的模型是从更全面的数据库中获得的，更具有普遍性，且基因数量较少。
综上所述，本发明构建了一种5-基因表达分类器系统可准确预测胰腺癌病人的转移风险，并可为胰腺癌患者术后辅助治疗的选择提供精准判断依据。
Claims (9)
1.一种用于预测胰腺癌转移风险的基因表达分类器，其特征在于，为5-基因表达分类器，5个基因分别为HMGA2、PPL、DTX4、CDH3和ST6GALNAC2。
2.根据权利要求1所述的基因表达分类器，其特征在于，HMGA2、PPL、DTX4、CDH3和ST6GALNAC2的权重系数分别为：0.2056、0.1985、0.1366、0.1209和0.0688。
3.根据权利要求2所述的基因表达分类器，其特征在于，
风险评分越高，则胰腺癌转移风险越高。
4.一种基因表达分类器的构建方法，所述基因表达分类器用于预测胰腺癌转移风险，其特征在于，所述构建方法包括
(1)使用TCGA数据库中胰腺腺癌患者的基因表达信息和临床信息，以及GEO数据库中关于转移的胰腺癌细胞株的数据集，采用有监督的机器学习方法来筛选与转移风险高度相关的基因；
(2)筛选R0切除后发生转移和未发生转移的患者作为转移组和非转移组，获得训练集；
(3)在训练集中，数据输入中胰腺癌转移组赋值1，胰腺癌非转移组赋值0，根据风险评分公式如下：
使用LASSO算法筛选最佳的基因类别和数目，并通过logistic回归建立所述基因表达分类器。
5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，还包括：筛选TNM分期中T3期时发生淋巴结转移和未发生淋巴结转移的患者作为转移组和非转移组，获得验证集；在验证集上验证构建的基因表达分类器的准确性。
6.一种用于预测胰腺癌转移风险的体外诊断试剂盒，其特征在于，包括分别用于检测HMGA2、PPL、DTX4、CDH3和ST6GALNAC2这5个基因表达量的检测试剂。
7.检测基因标签组表达量的试剂在制备用于预测胰腺癌转移风险的体外诊断试剂盒中的应用，其特征在于，基因标签组包括HMGA2、PPL、DTX4、CDH3和ST6GALNAC2。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，HMGA2、PPL、DTX4、CDH3和ST6GALNAC2的权重系数分别为：0.2056、0.1985、0.1366、0.1209和0.0688；
风险评分越高，则胰腺癌转移风险越高。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，检测基因标签组表达量的试剂包括用RT-PCR方法检测基因标签组中各基因表达量的试剂。
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