JP2017127330A - 乳癌の予後を予測するための遺伝子発現プロフィール - Google Patents
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Abstract
【課題】乳癌の予後を予測するための遺伝子発現プロフィールの提供。【解決手段】乳癌を有する対象を分類するための、および予後を評価するための方法が提供される。これらの方法は、乳癌固有のサブタイプに基づいて対象を層化するように調教された教師付きアルゴリズムを用いる、乳癌サブタイプの予測を含む。予測モデルは、表1に記載の固有の遺伝子の遺伝子発現プロフィールに基づく。この予測モデルは、乳癌と診断されたかまたはそれが疑われる対象の固有のサブタイプを正確に予測するために用いることができる。乳癌と診断されたかまたはそれが疑われる対象の予後または療法への応答を予測するための組成物および方法が、さらに提供される。これらの方法は、乳癌を患っている対象のために治療選択肢を指導するかまたは決定するために有用である。【選択図】なし
Description
本発明は、乳癌検体をサブタイプに分類するための方法、ならびに乳癌患者の予後および療法への応答を評価するための方法に関する。
乳癌は、米国の女性の間では、皮膚癌に次いで2番目に一般的な癌である。米国の女性は、生涯の間に8分の1の確率で乳癌を発症し、American Cancer Societyは、2007年に侵襲性乳癌の178,480を超える新症例が米国で報告されると推定する。乳癌は、女性の癌死の第二の主な原因であり、毎年40,000人を超える死亡者が出る。過去10年間の改善された検出方法、集団スクリーニングおよび治療の進歩は、乳癌と診断された女性の展望をかなり改善した。今日、乳癌症例の約80%は、生存率が最高である疾患の初期段階で診断されている。その結果、乳癌患者の約85%は、診断の少なくとも5年後に生存している。これらの進歩にもかかわらず、初期乳癌と診断された女性の約20%は10年予後が不良であり、この期間内で疾患の再発、転移または死を経験する。
かなりの研究が、乳癌の予後を評価し、治療応答を予測するための方法および因子を特定することに集中した(一般には、Ross and Hortobagyi編(2005年)Molecular Oncology of Breast Cancer(Jones and Bartlett Publishers、Boston、MA)およびそこに引用されている参考文献を参照)。予後の指標には、従来の因子、例えば腫瘍サイズ、結節の状態および組織学的段階、ならびに予後および特定の治療に対する可能性の高い応答に関して多少の情報を提供する分子マーカーが含まれる。例えば、エストロゲン(ER)およびプロゲステロン(PgR)ステロイドホルモンの受容体の状態の判定が、乳癌患者の評価において常用される方法になっている。例えば、非特許文献1を参照。ホルモン受容体陽性である腫瘍は、ホルモン療法に応答する可能性がより高いうえに攻撃性が一般的により低く、それによってER+/PgR+の腫瘍を有する患者のためにより良好な予後をもたらす。膜貫通チロシンキナーゼ受容体タンパク質であるヒト上皮成長因子受容体2(HER−2/neu)の過剰発現は、不良な乳癌予後と相関し(例えば、非特許文献2を参照)、乳房腫瘍でのHER−2の発現レベルは、抗HER−2モノクローナル抗体治療薬トラスツズマブ(Herceptin(登録商標)、Genentech、South San Francisco、CA)への応答を予測するために用いられる。
Fitzgibbonsら、Arch. Pathol. Lab. Med.(2000年)124巻:966〜78頁
Rossら、The Oncologist(2003年)8巻:307〜25頁
乳癌を有する対象を分類するための、ならびに予後および治療を評価するための方法が提供される。これらの方法は、乳癌固有のサブタイプに基づいて対象を層化するように調教された教師付きアルゴリズム(supervised algorithm)を用いる、乳癌サブタイプの予測を含む。予測モデルは、表1に列挙される固有遺伝子の遺伝子発現プロフィールに基づく。一部の実施形態では、アルゴリズムは、マイクロアレイ予測分析(PAM)アルゴリズムに類似した、最近傍セントロイドアルゴリズムである。このアルゴリズムは、National Center for Biotechnology
Information Gene Expression Omnibusにアクセッション番号GSE10886として寄託されている遺伝子発現プロフィールから得られるデータに基づいて調教することができる。本明細書でPAM50分類モデルと呼ぶこの予測モデルは、乳癌と診断されたかまたはそれが疑われる対象の固有のサブタイプを正確に予測するために用いることができる。
Information Gene Expression Omnibusにアクセッション番号GSE10886として寄託されている遺伝子発現プロフィールから得られるデータに基づいて調教することができる。本明細書でPAM50分類モデルと呼ぶこの予測モデルは、乳癌と診断されたかまたはそれが疑われる対象の固有のサブタイプを正確に予測するために用いることができる。
乳癌と診断されたかまたはそれが疑われる対象の予後または療法への応答を予測するための組成物および方法が、さらに提供される。これらの方法は、乳癌を患っている対象のために治療選択肢を指導するかまたは決定するために有用である。本発明の方法は、マイクロアレイおよび定量的ポリメラーゼ連鎖反応アッセイを含む、遺伝子発現プロフィールを評価するための手段、ならびに本発明の方法を実施するための試薬を含むキットをさらに含む。
本発明は例えば、以下の項目を提供する:
(項目1)
試験試料で乳癌固有のサブタイプを分類する方法であって、
a) 乳癌固有のサブタイプによって分類された複数のトレーニング乳癌試料の各々の遺伝子発現プロフィールを得る工程であって、管腔A(LumA)、管腔B(LumB)、基底様(基底)、HER2富化(HER2)、および正常様(正常)の固有サブタイプの各々が前記複数の乳癌試料で提示され、前記遺伝子発現プロフィールが、表1に列挙される固有遺伝子の実質的にすべての発現に基づく、工程と、
b) 教師付きアルゴリズムを用いて前記トレーニングセットの乳癌固有のサブタイプの各々のセントロイドを構築する工程と、
c) 前記試験試料の遺伝子発現プロフィールを得る工程であって、前記遺伝子発現プロフィールが、表1に列挙される固有遺伝子の発現に基づく工程と、
d) 前記試験試料の遺伝子発現プロフィールを工程(b)で構築されるセントロイドと比較する工程と、
e) 前記セントロイドの各々までの、前記試験試料の遺伝子発現プロフィールの距離を計算する工程と、
f) 前記試験試料を、最近傍セントロイドに基づいて乳癌固有のサブタイプの1つに割り当てる工程とを含む、方法。
(項目2)
乳癌を有する対象でネオアジュバント療法への応答を予測する方法であって、項目1に記載の方法によって前記対象を分類する工程を含み、固有の腫瘍サブタイプが、前記療法への応答を示す、方法。
(項目3)
前記療法がネオアジュバント内分泌療法であり、前記固有のサブタイプが、前記ネオアジュバント内分泌療法の開始後に前記対象から収集される試料から予測される、項目2に記載の方法。
(項目4)
前記試料が前記ネオアジュバント内分泌療法の開始の少なくとも1カ月後に収集される、項目3に記載の方法。
(項目5)
乳癌を有する試験対象で予後を予測する方法であって、
a) 乳癌固有のサブタイプによって分類された複数のトレーニング乳癌試料の各々の遺伝子発現プロフィールを得る工程であって、管腔A(LumA)、管腔B(LumB)、基底様(基底)、HER2富化(HER2)、および正常様(正常)の固有サブタイプの各々が前記複数の乳癌試料で提示され、前記試料の予後が公知であり、前記遺伝子発現プロフィールが、表1に列挙される固有遺伝子の実質的にすべての発現に基づく、工程と、
b) 教師付きアルゴリズムを用いて前記トレーニングセットの乳癌固有のサブタイプの各々のセントロイドを構築する工程と、
c) 工程(a)で得られる遺伝子発現プロフィールに回帰モデルをあてはめることによって各トレーニング乳癌試料の危険スコアを計算する工程であって、前記回帰モデルが、工程(b)で構築されるセントロイドへの各遺伝子発現プロフィールの類似性の説明となる、工程と、
d) 工程(c)で得られる危険スコアをより高い、およびより低い危険群に層化する工程と、
e) 前記試験対象からの乳癌試料から遺伝子発現プロフィールを得る工程であって、前記遺伝子発現プロフィールが、表1に列挙される固有遺伝子の実質的にすべての発現に基づく、工程と、
f) 前記試験試料の遺伝子発現プロフィールを工程(b)で構築されるセントロイドと比較する工程と、
g) 前記セントロイドの各々までの、前記試験試料の遺伝子発現プロフィールの距離を計算する工程と、
h) 工程(c)の回帰モデルおよび工程(f)で得られる各セントロイドまでの距離を用いて危険スコアを計算する工程と、
i) 工程(h)で得られる危険スコアを工程(d)で割り当てられる危険群と比較することによって、前記試験対象がより高い危険群か、またはより低い危険群に入るかを決定する工程であって、より低い危険群への帰属はより好ましい予後を示し、より高い危険群への帰属はより好ましくない予後を示す工程とを含む、方法。
(項目6)
前記危険スコアが独立変数の加重和を用いて計算される、項目5に記載の方法。
(項目7)
予後が乳癌特異的生存、無事象生存または療法への応答である、項目5に記載の方法。(項目8)
前記教師付きアルゴリズムが、National Center for Biotechnology Information Gene Expression Omnibusにアクセッション番号GSE2845として寄託されている遺伝子発現データを用いて調教され、前記危険スコアが、式:
ROR−S=[(0.05*基底)+(0.11*Her2)+(−0.25*LumA)+(0.07*LumB)+(−0.11*正常)]
を用いて計算される、項目5に記載の方法。
(項目9)
前記回帰モデルが、予後を1つまたは複数の臨床変数にさらに相関させる、項目5に記載の方法。
(項目10)
前記臨床変数が、腫瘍サイズ、結節の状態、組織学的段階、エストロゲンホルモン受容体の状態、プロゲステロンホルモン受容体の状態、HER−2レベルおよび腫瘍倍数性からなる群より選択される、項目9に記載の方法。
(項目11)
前記教師付きアルゴリズムが、National Center for Biotechnology Information Gene Expression Omnibusにアクセッション番号GSE2845として寄託されている遺伝子発現データを用いて調教され、再発危険が、式:
ROR−C=[(0.05*基底)+(0.1*Her2)+(−0.19*LumA)+(0.05*LumB)+(−0.09*正常)+(0.16*T)+(0.08*N)]を用いて計算される、項目9に記載の方法。
(項目12)
予後が療法への応答であり、1つまたは複数の療法エンドポイント基準によって測定される、項目7に記載の方法。
(項目13)
前記1つまたは複数の療法エンドポイント基準が、臨床上の応答(RECIST基準)、病理学的腫瘍サイズ、二値化Ki67値または再発事象から選択される、項目12に記載の方法。
(項目14)
前記教師付きアルゴリズムが、National Center for Biotechnology Information Gene Expression Omnibusにアクセッション番号GSE2845として寄託されている遺伝子発現データを用いて調教され、再発危険が、式:
RSp=[(−0.0129*基底)+(0.106*Her2)+(−0.112*LumA)+(0.039*LumB)+(−0.069*正常)+(0.272*Prolif)]
を用いて計算される、項目13に記載の方法。
(項目15)
前記教師付きアルゴリズムが最近傍セントロイドアルゴリズムである、項目1または5に記載の方法。
(項目16)
前記セントロイドが、National Center for Biotechnology Information Gene Expression Omnibusにアクセッション番号GSE10886として寄託されている遺伝子発現データから構築される、項目1に記載の方法。
(項目17)
前記試験試料の遺伝子発現プロフィールが、前記固有遺伝子の各々に特異的なプライマーによる逆転写およびリアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)を用いて得られる、項目1または5に記載の方法。
(項目18)
前記試験試料の遺伝子発現プロフィールが、前記固有遺伝子の各々の発現生成物に特異的なプローブによるマイクロアレイ分析を用いて得られる、項目1または5に記載の方法。
(項目19)
前記トレーニング試料の遺伝子発現プロフィールおよび前記試験試料の遺伝子発現プロフィールから得られるデータが、分析の前に正規化方法を通して処理される、項目1または5に記載の方法。
(項目20)
前記処理がハウスキーピング遺伝子のセットへの正規化を含む、項目19に記載の方法。
(項目21)
前記ハウスキーピング遺伝子が、MRPL19、PSMC4、SF3A1、PUM1、ACTB、GAPD、GUSB、RPLP0およびTFRCから選択される、項目20に記載の方法。
(項目22)
表1に列挙される固有遺伝子の検出に十分な試薬を含むキット。
本発明は例えば、以下の項目を提供する:
(項目1)
試験試料で乳癌固有のサブタイプを分類する方法であって、
a) 乳癌固有のサブタイプによって分類された複数のトレーニング乳癌試料の各々の遺伝子発現プロフィールを得る工程であって、管腔A(LumA)、管腔B(LumB)、基底様(基底)、HER2富化(HER2)、および正常様(正常)の固有サブタイプの各々が前記複数の乳癌試料で提示され、前記遺伝子発現プロフィールが、表1に列挙される固有遺伝子の実質的にすべての発現に基づく、工程と、
b) 教師付きアルゴリズムを用いて前記トレーニングセットの乳癌固有のサブタイプの各々のセントロイドを構築する工程と、
c) 前記試験試料の遺伝子発現プロフィールを得る工程であって、前記遺伝子発現プロフィールが、表1に列挙される固有遺伝子の発現に基づく工程と、
d) 前記試験試料の遺伝子発現プロフィールを工程(b)で構築されるセントロイドと比較する工程と、
e) 前記セントロイドの各々までの、前記試験試料の遺伝子発現プロフィールの距離を計算する工程と、
f) 前記試験試料を、最近傍セントロイドに基づいて乳癌固有のサブタイプの1つに割り当てる工程とを含む、方法。
(項目2)
乳癌を有する対象でネオアジュバント療法への応答を予測する方法であって、項目1に記載の方法によって前記対象を分類する工程を含み、固有の腫瘍サブタイプが、前記療法への応答を示す、方法。
(項目3)
前記療法がネオアジュバント内分泌療法であり、前記固有のサブタイプが、前記ネオアジュバント内分泌療法の開始後に前記対象から収集される試料から予測される、項目2に記載の方法。
(項目4)
前記試料が前記ネオアジュバント内分泌療法の開始の少なくとも1カ月後に収集される、項目3に記載の方法。
(項目5)
乳癌を有する試験対象で予後を予測する方法であって、
a) 乳癌固有のサブタイプによって分類された複数のトレーニング乳癌試料の各々の遺伝子発現プロフィールを得る工程であって、管腔A(LumA)、管腔B(LumB)、基底様(基底)、HER2富化(HER2)、および正常様(正常)の固有サブタイプの各々が前記複数の乳癌試料で提示され、前記試料の予後が公知であり、前記遺伝子発現プロフィールが、表1に列挙される固有遺伝子の実質的にすべての発現に基づく、工程と、
b) 教師付きアルゴリズムを用いて前記トレーニングセットの乳癌固有のサブタイプの各々のセントロイドを構築する工程と、
c) 工程(a)で得られる遺伝子発現プロフィールに回帰モデルをあてはめることによって各トレーニング乳癌試料の危険スコアを計算する工程であって、前記回帰モデルが、工程(b)で構築されるセントロイドへの各遺伝子発現プロフィールの類似性の説明となる、工程と、
d) 工程(c)で得られる危険スコアをより高い、およびより低い危険群に層化する工程と、
e) 前記試験対象からの乳癌試料から遺伝子発現プロフィールを得る工程であって、前記遺伝子発現プロフィールが、表1に列挙される固有遺伝子の実質的にすべての発現に基づく、工程と、
f) 前記試験試料の遺伝子発現プロフィールを工程(b)で構築されるセントロイドと比較する工程と、
g) 前記セントロイドの各々までの、前記試験試料の遺伝子発現プロフィールの距離を計算する工程と、
h) 工程(c)の回帰モデルおよび工程(f)で得られる各セントロイドまでの距離を用いて危険スコアを計算する工程と、
i) 工程(h)で得られる危険スコアを工程(d)で割り当てられる危険群と比較することによって、前記試験対象がより高い危険群か、またはより低い危険群に入るかを決定する工程であって、より低い危険群への帰属はより好ましい予後を示し、より高い危険群への帰属はより好ましくない予後を示す工程とを含む、方法。
(項目6)
前記危険スコアが独立変数の加重和を用いて計算される、項目5に記載の方法。
(項目7)
予後が乳癌特異的生存、無事象生存または療法への応答である、項目5に記載の方法。(項目8)
前記教師付きアルゴリズムが、National Center for Biotechnology Information Gene Expression Omnibusにアクセッション番号GSE2845として寄託されている遺伝子発現データを用いて調教され、前記危険スコアが、式:
ROR−S=[(0.05*基底)+(0.11*Her2)+(−0.25*LumA)+(0.07*LumB)+(−0.11*正常)]
を用いて計算される、項目5に記載の方法。
(項目9)
前記回帰モデルが、予後を1つまたは複数の臨床変数にさらに相関させる、項目5に記載の方法。
(項目10)
前記臨床変数が、腫瘍サイズ、結節の状態、組織学的段階、エストロゲンホルモン受容体の状態、プロゲステロンホルモン受容体の状態、HER−2レベルおよび腫瘍倍数性からなる群より選択される、項目9に記載の方法。
(項目11)
前記教師付きアルゴリズムが、National Center for Biotechnology Information Gene Expression Omnibusにアクセッション番号GSE2845として寄託されている遺伝子発現データを用いて調教され、再発危険が、式:
ROR−C=[(0.05*基底)+(0.1*Her2)+(−0.19*LumA)+(0.05*LumB)+(−0.09*正常)+(0.16*T)+(0.08*N)]を用いて計算される、項目9に記載の方法。
(項目12)
予後が療法への応答であり、1つまたは複数の療法エンドポイント基準によって測定される、項目7に記載の方法。
(項目13)
前記1つまたは複数の療法エンドポイント基準が、臨床上の応答(RECIST基準)、病理学的腫瘍サイズ、二値化Ki67値または再発事象から選択される、項目12に記載の方法。
(項目14)
前記教師付きアルゴリズムが、National Center for Biotechnology Information Gene Expression Omnibusにアクセッション番号GSE2845として寄託されている遺伝子発現データを用いて調教され、再発危険が、式:
RSp=[(−0.0129*基底)+(0.106*Her2)+(−0.112*LumA)+(0.039*LumB)+(−0.069*正常)+(0.272*Prolif)]
を用いて計算される、項目13に記載の方法。
(項目15)
前記教師付きアルゴリズムが最近傍セントロイドアルゴリズムである、項目1または5に記載の方法。
(項目16)
前記セントロイドが、National Center for Biotechnology Information Gene Expression Omnibusにアクセッション番号GSE10886として寄託されている遺伝子発現データから構築される、項目1に記載の方法。
(項目17)
前記試験試料の遺伝子発現プロフィールが、前記固有遺伝子の各々に特異的なプライマーによる逆転写およびリアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)を用いて得られる、項目1または5に記載の方法。
(項目18)
前記試験試料の遺伝子発現プロフィールが、前記固有遺伝子の各々の発現生成物に特異的なプローブによるマイクロアレイ分析を用いて得られる、項目1または5に記載の方法。
(項目19)
前記トレーニング試料の遺伝子発現プロフィールおよび前記試験試料の遺伝子発現プロフィールから得られるデータが、分析の前に正規化方法を通して処理される、項目1または5に記載の方法。
(項目20)
前記処理がハウスキーピング遺伝子のセットへの正規化を含む、項目19に記載の方法。
(項目21)
前記ハウスキーピング遺伝子が、MRPL19、PSMC4、SF3A1、PUM1、ACTB、GAPD、GUSB、RPLP0およびTFRCから選択される、項目20に記載の方法。
(項目22)
表1に列挙される固有遺伝子の検出に十分な試薬を含むキット。
概要
最近の進歩にもかかわらず、癌治療の挑戦は、異なる病因を有する異なる腫瘍型を特定の治療計画の標的にし、最終的には予後を最大にするために腫瘍治療をカスタマイズすることにとどまる。詳細には、患者が乳癌などの癌と診断されると、医師が、癌再発の可能性、患者の長期生存などを含む疾患の予想される過程を予測し、それに応じて最も適当な治療選択肢を選択することを可能にする方法が必要である。
最近の進歩にもかかわらず、癌治療の挑戦は、異なる病因を有する異なる腫瘍型を特定の治療計画の標的にし、最終的には予後を最大にするために腫瘍治療をカスタマイズすることにとどまる。詳細には、患者が乳癌などの癌と診断されると、医師が、癌再発の可能性、患者の長期生存などを含む疾患の予想される過程を予測し、それに応じて最も適当な治療選択肢を選択することを可能にする方法が必要である。
本発明のために、「乳癌」は、例えば、生検または組織像によって悪性の病状と分類される状態を含む。乳癌診断の臨床上の描写は、医学では周知である。当業技術者は、乳癌が、例えば癌腫および肉腫を含む、乳房組織のあらゆる悪性腫瘍を指すことを理解する。乳癌の特定の形態には、非浸潤性乳管癌(DCIS)、非浸潤性小葉癌(LCIS)または粘液癌が含まれる。乳癌は、浸潤性の乳管癌(IDC)または浸潤性の小葉癌(ILC)も指す。本発明のほとんどの実施形態では、関心のある対象は、乳癌が疑われるか、または実際に乳癌と診断されるヒト患者である。
乳癌は、分子変化および細胞組成物に関して不均一な疾患である。この多様性は、臨床的に意味がある分類を開発しようと努力する研究者にとって難題となる。マイクロアレイによる遺伝子発現プロファイリングは、乳房腫瘍の複雑性への洞察を提供し、標準の病理パラメータ(1〜7)を越える予後情報を提供するために用いることができる。
乳癌の発現プロファイリングは、異なる治療法を必要とすることがある、生物学的および臨床的に異なる分子サブタイプを特定する[van’t Veer 2005][Loi 2007][Cheang 2008a]。管腔(Luminal)A、管腔(Luminal)B、HER2富化、基底様と呼ばれる乳癌の主な固有サブタイプは、異なる臨床上の特徴、再発危険および治療応答を有する[Sorlie 2003]。管腔A(LumA)、管腔B(LumB)、HER2富化、基底様および正常様として公知の「固有の」サブタイプは、マイクロアレイデータの教師なし階層的クラスタリングを用いて発見された(1,8)。Perouら(2000年)Nature406巻:747〜752頁に記載の固有の遺伝子は、同じ個体からの生物試料反復間で低い発現変動を有し、異なる個体からの試料全体では高い発現変動を有するように、統計学的に選択される。したがって、固有の遺伝子は、乳癌分類のためのクラシファイヤー遺伝子である。乳癌固有のサブタイプを導くために臨床上の情報を用いなかったが、この分類は予後の有意性を有することが判明した(1,6,9,10)。
「管腔」サブタイプの乳房腫瘍はER陽性であり、乳管管腔内側の上皮細胞と類似したケラチン発現プロフィールを有する(それぞれ参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Taylor−Papadimitriouら(1989年)J Cell Sci 94巻:403〜413頁およびPerouら(2000年)New Technologies for Life Sciences: A Trends Guide
67〜76頁)。逆に、ER陰性腫瘍は、2つの主なサブタイプ、すなわち、HER−2およびGRB7を過剰発現する(およびそれについてDNA増幅される)もの(HER−2富化)、ならびに基底上皮に類似した発現プロフィールを有して、ケラチン5、6Bおよび17を発現する「基底様」腫瘍に分類することができる。これらの両方の腫瘍サブタイプは攻撃的であり、一般的に管腔腫瘍よりも致死性である。しかし、異なる予後を有するサブタイプの管腔腫瘍がある。予後不良の管腔腫瘍は、より高い度数である組織病理学的特徴、および高度に発現する増殖遺伝子の分子的特徴を一貫して共有する。
67〜76頁)。逆に、ER陰性腫瘍は、2つの主なサブタイプ、すなわち、HER−2およびGRB7を過剰発現する(およびそれについてDNA増幅される)もの(HER−2富化)、ならびに基底上皮に類似した発現プロフィールを有して、ケラチン5、6Bおよび17を発現する「基底様」腫瘍に分類することができる。これらの両方の腫瘍サブタイプは攻撃的であり、一般的に管腔腫瘍よりも致死性である。しかし、異なる予後を有するサブタイプの管腔腫瘍がある。予後不良の管腔腫瘍は、より高い度数である組織病理学的特徴、および高度に発現する増殖遺伝子の分子的特徴を一貫して共有する。
多数の試料および遺伝子を組織することにおいて、小さな遺伝子セットを用いて個々の試料を分類することよりも教師なしクラスタリングがより適しているので、臨床アッセイへの固有のサブタイプの翻訳は困難である。
したがって、乳癌固有のサブタイプを分類するための改善された方法および組成物が、本明細書で提供される。本方法は、乳癌固有のサブタイプに従って対象試料を分類するために、教師付きアルゴリズムを利用する。本明細書でPAM50分類モデルと呼ばれるこのアルゴリズムは、乳癌固有のサブタイプを分類するために、および乳癌と診断された対象で再発の危険および/または療法への応答を予測するために優れていると本明細書で特定された、固有遺伝子の既定のサブセットの遺伝子発現プロフィールに基づく。遺伝子のサブセットを、それらの検出に特異的なプライマーとともに表1に示す。
一部の実施形態では、表1に記載の遺伝子の少なくとも約40個が、PAM50分類モデルで用いられる。他の実施形態では、表1に列挙される固有遺伝子の少なくとも41個、少なくとも43個、少なくとも44個、少なくとも45個、少なくとも46個、少なくとも47個、少なくとも48個、少なくとも49個または50個すべてがモデルに用いられる。本明細書に開示される方法は、表1に記載の遺伝子の1個または2,3個だけで用いることを意図していない。実際、固有のサブタイプの最も精確な分類および予後または処置に対する治療応答の予測を可能にするのは、固有遺伝子の実質的にすべての組合せである。したがって、様々な実施形態では、本明細書に開示される方法は、表1に記載の実質的にすべての遺伝子の遺伝子プロフィールを得ることを包含する。「実質的にすべて」は、表1に記載の遺伝子の少なくとも47個、少なくとも48個、少なくとも49個または50個すべてを包含することができる。特に明記しない限り、「実質的にすべて」は、表1に記載の遺伝子の少なくとも49個を指す。表1に記載の遺伝子の1つのサブセットを用いて、乳癌サブタイプまたは予後を予測するようにアルゴリズムに教えることができ、遺伝子の別のサブセットを用いて個々の対象を特徴づけることができることも、当業技術者によく理解される。好ましくは、50個すべての遺伝子を用いてアルゴリズムを調教し、遺伝子の少なくとも49個を用いて対象を特徴づける。
臨床変数
本明細書に記載のPAM50分類モデルは、再発(ROR)予測因子の連続的危険を生成するために、臨床変数に関する情報とさらに組み合わせることができる。本明細書に記載のように、いくつかの臨床上および予後の乳癌因子が当技術分野で公知であり、治療予後および疾患再発の可能性を予測するために用いられる。そのような因子には、例えば、リンパ節関与、腫瘍サイズ、組織学的度数、エストロゲンおよびプロゲステロンホルモン受容体の状態、HER−2レベルおよび腫瘍倍数性が含まれる。
本明細書に記載のPAM50分類モデルは、再発(ROR)予測因子の連続的危険を生成するために、臨床変数に関する情報とさらに組み合わせることができる。本明細書に記載のように、いくつかの臨床上および予後の乳癌因子が当技術分野で公知であり、治療予後および疾患再発の可能性を予測するために用いられる。そのような因子には、例えば、リンパ節関与、腫瘍サイズ、組織学的度数、エストロゲンおよびプロゲステロンホルモン受容体の状態、HER−2レベルおよび腫瘍倍数性が含まれる。
一実施形態では、再発危険(ROR)スコアは、乳癌と診断されるかまたはそれが疑われる対象のために提供される。このスコアは、PAM50分類モデルを、結節の状態(N)および腫瘍サイズ(T)の臨床上の因子と一緒に用いる。臨床変数の評価は、乳癌病期診断のためのAmerican Joint Committee on Cancer(AJCC)の標準システムに基づく。このシステムでは、一次腫瘍サイズは、0〜4のスケール(T0:一次腫瘍の証拠がない;T1:≦2cm;T2:>2cm〜≦5cm;T3:>5cm;T4:胸壁または皮膚への直接的拡大を有する任意のサイズの腫瘍)で分類される。リンパ節の状態は、N0〜N3に分類される(N0:所属リンパ節の転移がない;N1:可動性の同側腋窩リンパ節への転移;N2:お互いに、または他の構造に固定される同側リンパ節への転移;N3:胸骨下の同側リンパ節への転移)。乳癌患者を特定して疾患を病期診断する方法は周知であり、手動検査、生検、患者および/または家族の病歴の精査、および画像化技術、例えばマモグラフィー、磁気共鳴画像化(MRI)および陽電子放出断層撮影法(PET)を含めることができる。
本発明のPAM50分類法を用いて、乳癌患者の予後を、これらの臨床上の因子の評価と無関係に、またはそれと組み合わせて判定することができる。一部の実施形態では、本明細書に開示されるPAM50の乳癌固有サブタイプ分類法をこれらの臨床上の因子の評価と組み合わせることは、より精確な危険評価を可能にすることができる。本発明の方法は、例えば、エストロゲン受容体(ER)およびプロゲステロン受容体(PgR)の状態、および/またはHER−2発現レベルの分析とさらに一緒にすることができる。本発明の方法を通して乳癌予後を評価する場合、患者の臨床病歴、家族歴および閉経状態などの他の因子を考慮することもできる。
試料源
本発明の一実施形態では、乳癌サブタイプは、1つまたは複数の対象試料中の、表1に列挙される固有遺伝子の発現のパターンまたはプロフィールの評価を通して調査される。議論において、用語対象、または対象試料とは、健康状態および/または疾患状態に関係なく個体を指す。対象は、対象、試験参加者、対照対象、スクリーニング対象、または本発明の文脈で試料が得られ、評価される任意の他のクラスの個体であることができる。したがって、対象は、乳癌と診断されていてもよく、乳癌の1つまたは複数の症状、または家族歴(遺伝性)または病歴(医療)因子などの乳癌の素因を抱えてもよく、乳癌のための治療または療法を受けていてもよい、などである。あるいは、対象は、前記の因子または基準のいずれかに関して健康であってもよい。用語「健康」は、任意の絶対的評価または状態に対応するように定義することができないので、本明細書で用いる用語「健康」は、乳癌状態と比較したものであることが理解される。したがって、任意の特定の疾患または疾患基準に関して健康と定義される個体は、実際、乳癌以外の1つまたは複数の癌を含む任意の他の1つまたは複数の疾患と診断することができるか、または任意の他の1つまたは複数の疾患基準を示すことができる。しかし、健康な対照は、好ましくはいかなる癌も有しない。
本発明の一実施形態では、乳癌サブタイプは、1つまたは複数の対象試料中の、表1に列挙される固有遺伝子の発現のパターンまたはプロフィールの評価を通して調査される。議論において、用語対象、または対象試料とは、健康状態および/または疾患状態に関係なく個体を指す。対象は、対象、試験参加者、対照対象、スクリーニング対象、または本発明の文脈で試料が得られ、評価される任意の他のクラスの個体であることができる。したがって、対象は、乳癌と診断されていてもよく、乳癌の1つまたは複数の症状、または家族歴(遺伝性)または病歴(医療)因子などの乳癌の素因を抱えてもよく、乳癌のための治療または療法を受けていてもよい、などである。あるいは、対象は、前記の因子または基準のいずれかに関して健康であってもよい。用語「健康」は、任意の絶対的評価または状態に対応するように定義することができないので、本明細書で用いる用語「健康」は、乳癌状態と比較したものであることが理解される。したがって、任意の特定の疾患または疾患基準に関して健康と定義される個体は、実際、乳癌以外の1つまたは複数の癌を含む任意の他の1つまたは複数の疾患と診断することができるか、または任意の他の1つまたは複数の疾患基準を示すことができる。しかし、健康な対照は、好ましくはいかなる癌も有しない。
特定の実施形態では、乳癌固有のサブタイプを予測する方法は、癌の細胞または組織を含む生体試料、例えば乳房組織試料または一次乳房腫瘍組織試料を収集することを含む。「生体試料」は、固有の遺伝子の発現を検出することができる細胞、組織または体液の任意のサンプリングを意味するものとする。そのような生体試料の例には、生検材料および塗抹標本が含まれるが、これらに限定されない。本発明で有用な体液には、血液、リンパ、尿、唾液、乳首吸引液、婦人科体液または任意の他の体分泌物またはそれらの派生物が含まれる。血液には、全血、血漿、血清、または血液の任意の派生物を含めることができる。一部の実施形態では、生体試料には、乳房細胞、特に生検からの乳房組織、例えば乳房腫瘍組織試料が含まれる。生体試料は、例えば、領域を削り取るかスワビングすること、針を用いて細胞もしくは体液を吸引すること、または組織試料(生検材料)を取り出すことを含む、様々な技術によって対象から得ることができる。様々な生体試料を収集する方法は、当技術分野で周知である。一部の実施形態では、乳房組織試料は、例えば針吸引生検、コア針生検または摘出生検によって得られる。検体を保存するために、および検査を容易にするために、固定剤および染色溶液を細胞または組織に加えてもよい。生体試料、特に乳房組織試料をスライドガラスへ移し、拡大して観察してもよい。一実施形態では、生体試料はホルマリン固定され、パラフィン包埋された乳房組織試料、特に一次乳房腫瘍試料である。様々な実施形態では、組織試料は、実施例4に記載の病理学者によって導かれた組織コア試料から得られる。
発現プロファイリング
様々な実施形態では、本発明は、対象で乳癌を分類するか、予後を決定するか、または監視するための方法を提供する。この実施形態では、固有遺伝子の発現の分析から得られるデータを、1つまたは複数のパターン認識アルゴリズムを用いて評価する。そのような分析法は、試験データを分類するために用いることができる、予測モデルを形成するために用いることができる。例えば、第一に公知のサブタイプの試料(例えば、特定の乳癌固有のサブタイプ、LumA、LumB、基底様、HER2富化または正常様を有することが公知の対象から)からのデータ(「モデル化データ」)を用いてモデル(「予測数理モデル」)を形成し、第二にサブタイプに従って未知の試料(例えば、「試験試料」)を分類するために、1つの便利で特に有効な分類方法は、多変量解析モデル化を使用する。
様々な実施形態では、本発明は、対象で乳癌を分類するか、予後を決定するか、または監視するための方法を提供する。この実施形態では、固有遺伝子の発現の分析から得られるデータを、1つまたは複数のパターン認識アルゴリズムを用いて評価する。そのような分析法は、試験データを分類するために用いることができる、予測モデルを形成するために用いることができる。例えば、第一に公知のサブタイプの試料(例えば、特定の乳癌固有のサブタイプ、LumA、LumB、基底様、HER2富化または正常様を有することが公知の対象から)からのデータ(「モデル化データ」)を用いてモデル(「予測数理モデル」)を形成し、第二にサブタイプに従って未知の試料(例えば、「試験試料」)を分類するために、1つの便利で特に有効な分類方法は、多変量解析モデル化を使用する。
パターン認識法は、例えば、言語学、フィンガープリント、化学および心理学にわたる多くの異なる種類の問題を特徴づけるために、広く用いられている。本明細書に記載の方法との関連では、パターン認識は、データを分析し、それによって試料を分類し、様々な観察値に基づいていくつかの従属変数の値を予測するための、パラメトリックおよびノンパラメトリックの両方の多変量統計学の使用である。2つの主な手法がある。1セットの方法は「教師なし」と言われ、これらは単に合理的な方法でデータの複雑性を低減させ、さらに、ヒトの目によって解釈することができるディスプレイプロットを生成する。しかし、この種の手法は、予測アルゴリズムを調教するために用いられる最初の試料集団とは独立に、対象に由来する試料を分類するために用いることができる臨床アッセイの開発には適さないかもしれない。
他の手法は「教師付き」と呼ばれ、それによって、独立した検証データセットで次に評価される数理モデルを生成するために、公知のクラスまたは予後を有する試料のトレーニングセットが用いられる。ここでは、固有遺伝子発現データの「トレーニングセット」は、各試料の「サブタイプ」を正しく予測する統計モデルを構築するために用いられる。このトレーニングセットを、独立データ(検定セットまたは検証セットと呼ばれる)で次に検定し、コンピュータに基づくモデルの頑健性を決定する。これらのモデルは「エキスパートシステム」と呼ばれることもあるが、様々な異なる数学的手法に基づくことができる。教師付き方法は減少した次元数(例えば、最初の数主成分)のデータセットを用いることができるが、一般的に、全次元数の未削減データを用いる。すべての場合に、本方法は、その固有の遺伝子発現プロフィールに関して各サブタイプを特徴づけて、分離する、多変量境界の定量的な記述を可能にする。任意の予測に関して、例えば適合度に置かれる確率のレベルなどの信頼限界を得ることも可能である(例えばKowalskiら、1986年を参照)。選択された試料を分析から除外することによって、交差検証を用いて、予測モデルの頑健性を確認することもできる。
本明細書に記載のPAM50分類モデルは、表1に記載される固有遺伝子を用いて、複数の対象試料の遺伝子発現プロフィールに基づく。複数の試料は、各サブタイプクラスに属する対象に由来する十分な数の試料を含む。この関係において「十分な試料」または「代表的な数」は、各サブタイプに由来する、各サブタイプと群の他のすべてとを確実に区別することができる分類モデルを構築するのに十分である試料の数量を意味するものとする。教師付き予測アルゴリズムは、アルゴリズムを「調教する」ための、客観的に選択されたプロトタイプ試料のプロフィールに基づいて開発される。拡張された固有遺伝子を用い、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際特許出願公開第WO2007/061876号に開示される方法によって試料を選択し、サブタイプに分ける。あるいは、試料は、乳癌サブタイプの分類のための任意の公知のアッセイによってサブタイプに分けることができる。サブタイプに従ってトレーニング試料を層化した後に、セントロイド(centroid)に基づく予測アルゴリズムを用いて、表1に列挙される固有遺伝子セットの発現プロフィールに基づいてセントロイドを構築する。
一実施形態では、予測アルゴリズムは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるNarashimanおよびChu(2002年)PNAS 99巻:6567〜6572頁に記載されているものに関係がある、最近傍セントロイド方法論である。本発明では、本方法は各サブタイプの標準化されたセントロイドを計算する。このセントロイドは、その遺伝子のクラス内の標準偏差によって割った、各サブタイプ(または「クラス」)の各遺伝子の平均遺伝子発現である。最近傍セントロイド分類は、新しい試料の遺伝子発現プロフィールをとり、それをこれらのクラスセントロイドの各々と比較する。サブタイプ予測は、5個のセントロイドとの各試験例のスピアマン順位相関を計算し、最近傍セントロイドに基づいて試料をサブタイプに割り当てることによって実行される。
固有遺伝子の発現の検出 表1に列挙される固有遺伝子の発現を検出するために当技術分野で利用可能な任意の方法が、本明細書に包含される。「発現を検出する」ことは、固有遺伝子のRNA転写産物またはその発現生成物の量または存在を決定することを意味するものとする。
本発明の固有遺伝子の発現を検出する方法、すなわち遺伝子発現プロファイリングには、ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション分析に基づく方法、ポリヌクレオチドの配列決定に基づく方法、免疫組織化学方法およびプロテオミクスに基づく方法が含まれる。これらの方法は、一般に、表1に列挙される固有遺伝子の発現生成物(例えば、mRNA)を検出する。好ましい実施形態では、PCRに基づく方法、例えば逆転写PCR(RT−PCR)(Weisら、TIG 8巻:263〜64頁、1992年)、およびアレイに基づく方法、例えばマイクロアレイ(Schenaら、Science 270巻:467〜70頁、1995年)が用いられる。「マイクロアレイ」は、ハイブリダイズすることが可能なアレイ要素、例えばポリヌクレオチドプローブの、基質上での順序通りの配置を意味するものとする。用語「プローブ」は、特異的に目的とする標的生体分子、例えば、固有遺伝子によってコードされるかまたはそれに対応するヌクレオチド転写産物またはタンパク質に選択的に結合することができる任意の分子を指す。プローブは、当業技術者が合成することができるか、または適当な生物学的調製物から得ることができる。プローブは、標識されるように特異的に設計することができる。プローブとして利用することができる分子の例には、RNA、DNA、タンパク質、抗体および有機分子が含まれるが、これらに限定されない。
多くの発現検出方法が、単離されたRNAを用いる。一般的に、出発物質は、生体試料、例えば腫瘍または腫瘍細胞系、およびそれぞれ対応する正常な組織または細胞系から単離される総RNAである。RNAの原料が一次腫瘍である場合、RNA(例えば、mRNA)は、例えば、凍結またはアーカイブされた、パラフィン包埋および固定された(例えば、ホルマリン固定)組織試料(例えば、病理学者によって導かれた組織コア試料)から抽出することができる。
RNA抽出のための一般方法は当技術分野で周知であって、Ausubelら編、Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley & Sons、New York 1987〜1999年を含む、分子生物学の標準教科書に開示されている。パラフィン包埋組織からのRNA抽出の方法は、例えば、RuppおよびLocker(Lab Invest. 56巻:A67頁、1987年)およびDe Andresら(Biotechniques 18巻:42〜44頁、1995年)に開示されている。詳細には、RNA単離は、Qiagen(Valencia、CA)などの民間の製造業者からの精製キット、緩衝液セットおよびプロテアーゼを製造業者の指示通りに用いて実施することができる。例えば、培養細胞からの総RNAは、Qiagen RNeasyミニカラムを用いて単離することができる。他の市販のRNA単離キットには、MASTERPURE(商標)完全DNAおよびRNA精製キット(Epicentre、Madison、Wis.)およびパラフィンブロックRNA単離キット(Ambion、Austin、TX)が含まれる。組織試料からの総RNAは、例えばRNA Stat−60(Tel−Test、Friendswood、TX)を用いて単離することができる。腫瘍から調製されるRNAは、例えば塩化セシウム密度勾配遠心法によって単離することができる。さらに、当業者に周知である技術、例えばChomczynski(米国特許第4,843,155号)のシングルステップRNA単離法を用いて、多数の組織試料を容易に処理することができる。
単離されたRNAは、それらに限定されないがPCR分析およびプローブアレイを含む、ハイブリダイゼーションまたは増幅アッセイで用いることができる。RNAレベルの検出のための1つの方法は、単離されたRNAを、検出する遺伝子によってコードされるmRNAにハイブリダイズすることができる核酸分子(プローブ)と接触させることを含む。核酸プローブは、例えば完全長cDNAまたはその部分、例えば長さが少なくとも7、15、30、60、100、250または500個のヌクレオチドであり、ストリンジェントな条件の下で本発明の固有遺伝子または任意の誘導体DNAもしくはRNAに特異的にハイブリダイズするのに十分であるオリゴヌクレオチドであってもよい。プローブとのmRNAのハイブリダイゼーションは、問題の固有遺伝子が発現されていることを示す。
一実施形態では、例えば単離されたmRNAをアガロースゲルの上に流し、ゲルからニトロセルロースなどの膜へmRNAを移すことによって、mRNAを固体表面に固定し、プローブと接触させる。代替の実施形態では、例えばAgilent遺伝子チップアレイで、プローブを固体表面に固定し、mRNAをプローブと接触させる。当業者は、本発明の固有遺伝子の発現レベルの検出で用いるために、公知のmRNA検出方法を容易に応用することができる。
試料中の固有遺伝子の発現生成物のレベルを測定するための代替法は、例えば、RT−PCR(米国特許第4,683,202号)、リガーゼ連鎖反応(Barany、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88巻:189〜93頁、1991年)、自律的配列複製(Guatelliら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87巻:1874〜78頁、1990年)、転写増幅系(Kwohら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86巻:1173〜77頁、1989年)、Q−βレプリカーゼ(Lizardiら、Bio/Technology
6巻:1197頁、1988年)、ローリングサークル複製(米国特許第5,854,033号)による核酸増幅の工程、または任意の他の核酸増幅法と、それに続く、当業者に周知である技術を用いる増幅分子の検出とを含む。これらの検出スキームは、そのような分子が非常に少数存在する場合、核酸分子の検出に特に有用である。
6巻:1197頁、1988年)、ローリングサークル複製(米国特許第5,854,033号)による核酸増幅の工程、または任意の他の核酸増幅法と、それに続く、当業者に周知である技術を用いる増幅分子の検出とを含む。これらの検出スキームは、そのような分子が非常に少数存在する場合、核酸分子の検出に特に有用である。
本発明の特定の態様では、固有遺伝子の発現は、定量的RT−PCRによって評価される。多数の異なるPCRまたはQPCRプロトコルが当技術分野で公知であり、本明細書の下に例示されており、表1に列挙される固有遺伝子の検出および/または定量のためのここに記載の組成物を用いる用途のために、直接に適用または応用することができる。一般に、PCRでは、標的ポリヌクレオチド配列は、少なくとも1つのオリゴヌクレオチドプライマーまたは1対のオリゴヌクレオチドプライマーとの反応によって増幅される。プライマーは標的核酸の相補的領域にハイブリダイズし、DNAポリメラーゼは標的配列を増幅するためにプライマーを伸長させる。ポリメラーゼに基づく核酸増幅生成物を提供するのに十分な条件の下で、1つのサイズの核酸断片が反応生成物(増幅生成物である標的ポリヌクレオチド配列)を支配する。単一の標的ポリヌクレオチド配列の濃度を高めるために、増幅サイクルを繰り返す。PCRのために通常用いられる任意のサーモサイクラーで反応を実行することができる。しかし、リアルタイム蛍光測定能力を有するサイクラー、例えば、SMARTCYCLER(登録商標)(Cepheid、Sunnyvale、CA)、ABI PRISM 7700(登録商標)(Applied Biosystems、Foster City、Calif.)、ROTOR−GENE(商標)(Corbett Research、Sydney、Australia)、LIGHTCYCLER(登録商標)(Roche Diagnostics Corp.、Indianapolis、Ind.)、ICYCLER(登録商標)(Biorad Laboratories、Hercules、Calif.)およびMX4000(登録商標)(Stratagene、La Jolla、Calif.)が好ましい。
定量測定値を提供するだけでなく、時間および汚染を低減するので、状況によっては定量的PCR(QPCR)(リアルタイムPCRとも呼ばれる)が好ましい。場合によっては、完全な遺伝子発現プロファイリング技術の利用可能性は、新鮮な凍結組織および専門化された実験機器の要件のために制限され、臨床でのそのような技術の常用を困難にしている。しかし、QPCR遺伝子測定は、標準のホルマリン固定パラフィン包埋臨床腫瘍ブロック、例えばアーカイブ組織バンクおよび常用の外科的病理検体で用いられるものに応用することができる(Croninら(2007年)Clin Chem 53巻:1084〜91頁)[Mullins2007][Paik2004]。本明細書で用いるように、「定量的PCR(または「リアルタイムQPCR」)は、反応生成物の反復サンプリングを必要としない、その発生と平行してのPCR増幅の進捗の直接モニタリングを指す。定量的PCRでは、反応生成物は、それらが生成されるにしたがってシグナル伝達機構(例えば、蛍光)を通して監視することができ、そのシグナルがバックグラウンドレベルを超えた後であるが、反応がプラトーに到達する前に追跡される。蛍光の検出可能なまたは「閾値」レベルを達成するために必要とされるサイクル数は、PCR工程の初めの増幅可能な標的の濃度に比例するので、試料中の標的核酸の量の測定値をリアルタイムで提供するためのシグナル強度の測定を可能にしている。
本発明の別の実施形態では、発現プロファイリングのためにマイクロアレイが用いられる。マイクロアレイは、異なる実験の間の再現性のために、この目的のために特によく適している。DNAマイクロアレイは、多数の遺伝子の発現レベルの同時測定のために、1つの方法を提供する。各アレイは、固体支持体に結合されている捕捉プローブの再現可能なパターンからなる。標識RNAまたはDNAは、アレイ上の相補的プローブにハイブリダイズされ、レーザー走査によって次に検出される。アレイ上の各プローブのハイブリダイゼーション強度が判定され、相対遺伝子発現レベルを表す定量値に変換される。例えば、米国特許第6,040,138号、第5,800,992号および第6,020,135号、第6,033,860号および第6,344,316号を参照。試料中の多数のRNAの遺伝子発現プロフィールを決定するために、高密度のオリゴヌクレオチドアレイが特に有用である。
物理的合成法を用いるこれらのアレイの合成技術は、例えば米国特許第5,384,261号に記載されている。プレーナーアレイ表面が一般に用いられるが、このアレイは、実質的にいかなる形の表面にも、または複数の表面にさえ形成することができる。アレイは、ビーズ、ゲル、重合体表面、線維(光ファイバーなど)、ガラスまたは任意の他の適当な基質の上の核酸(またはペプチド)であることができる。例えば、米国特許第5,770,358号、第5,789,162号、第5,708,153号、第6,040,193号および第5,800,992号を参照。アレイは、診断または全部込みの器具の他の操作を可能にする方法でパックすることができる。例えば、米国特許第5,856,174号および第5,922,591号を参照。
マイクロアレイ技術の具体的な実施形態では、cDNAクローンのPCR増幅挿入断片が、高密度アレイの基質に適用される。マイクロチップの上に固定されているマイクロアレイ遺伝子は、ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションに適する。蛍光標識cDNAプローブは、関心のある組織から抽出されるRNAの逆転写によって、蛍光ヌクレオチドの組込みを通して生成することができる。チップに適用される標識cDNAプローブは、アレイの上のDNAの各スポットと特異的にハイブリダイズする。非特異的に結合したプローブを除去するストリンジェントな洗浄の後、共焦レーザー顕微鏡、またはCCDカメラなどの別の検出方法によってチップをスキャンする。各整列要素のハイブリダイゼーションの定量化は、対応するmRNAの存在量の評価を可能にする。
二色蛍光により、2つのRNA源から生成される、別々に標識されているcDNAプローブを、アレイにペアでハイブリダイズさせる。したがって、各特定遺伝子に対応する2つの源からの転写産物の相対存在量が、同時に測定される。ハイブリダイゼーションの小規模化は、多数の遺伝子の発現パターンの便利で速やかな評価を提供する。そのような方法は、細胞あたり少数で発現される稀な転写産物を検出するために、および発現レベルの少なくとも約2倍の差を再現的に検出するために必要とされる感度を有することが示された(Schenaら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93巻:106〜49頁、1996年)。マイクロアレイ分析は、製造業者のプロトコルに従って市販の機器によって、例えばAffymetrix GenChip技術またはAgilentインクジェットマイクロアレイ技術を用いて実施することができる。遺伝子発現の大規模分析のためのマイクロアレイ法の開発は、様々な腫瘍型における癌分類および予後予測の分子マーカーの系統的検索を可能にする。
データ処理
例えば、欠落データ、翻訳、スケーリング、正規化、重み付け、その他に対処することによって、遺伝子発現データを前処理することがしばしば有用である。多変量予測法、例えば主成分解析(PCA)および部分最小二乗解析(PLS)は、いわゆるスケーリング感受性法である。研究するデータの種類についての事前の知識および経験を用いることにより、多変量モデル化の前のデータの質は、スケーリングおよび/または重み付けによって高めることができる。十分なスケーリングおよび/または重み付けは、データ内に隠されている重要で興味深い変動を明らかにすることができ、したがって、以降の多変量モデル化をより効率的にすることができる。スケーリングおよび重み付けは、研究系についての知識および経験に基づいてデータを正しい距離に置くために用いることができ、したがって、データに既に本来的に存在するパターンを明らかにすることができる。
例えば、欠落データ、翻訳、スケーリング、正規化、重み付け、その他に対処することによって、遺伝子発現データを前処理することがしばしば有用である。多変量予測法、例えば主成分解析(PCA)および部分最小二乗解析(PLS)は、いわゆるスケーリング感受性法である。研究するデータの種類についての事前の知識および経験を用いることにより、多変量モデル化の前のデータの質は、スケーリングおよび/または重み付けによって高めることができる。十分なスケーリングおよび/または重み付けは、データ内に隠されている重要で興味深い変動を明らかにすることができ、したがって、以降の多変量モデル化をより効率的にすることができる。スケーリングおよび重み付けは、研究系についての知識および経験に基づいてデータを正しい距離に置くために用いることができ、したがって、データに既に本来的に存在するパターンを明らかにすることができる。
可能な場合、欠落データ、例えばカラム値のギャップは回避するべきである。しかし、必要に応じて、そのような欠落データは、例えば、カラムの平均値(「平均充足」);ランダムな値(「ランダム充足」);または主成分解析に基づく値(「主成分充足」)で置換または「充足」することができる。
記述子座標軸の「翻訳」が有用となることがある。そのような翻訳の例には、正規化および平均センタリングが含まれる。「正規化」は、試料間の変動を除去するために用いることができる。マイクロアレイデータについては、正規化の過程は、2つの標識色素の蛍光強度のバランスをとることによって系統的誤差を除去することを目的とする。色素の偏りは、色素標識効率、熱および光感度の差、ならびに2つのチャンネルを走査するためのスキャナ設定を含む様々な発生源から来る可能性がある。正規化因子を計算するために通常用いられるいくつかの方法には、以下のものが含まれる。(i)アレイ上のすべての遺伝子を用いる全体的正規化、(ii)継続的に発現されるハウスキーピング/不変遺伝子を用いるハウスキーピング遺伝子正規化、および(iii)ハイブリダイゼーションの間に加えられる外因性対照遺伝子の公知の量を用いる内部対照正規化(Quackenbush(2002年)Nat. Genet. 32巻(補遺)、496〜501頁)。一実施形態では、本明細書に開示される固有遺伝子は、対照ハウスキーピング遺伝子に正規化することができる。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第2008/0032293号に記載のハウスキーピング遺伝子を正規化のために用いることができる。例示的なハウスキーピング遺伝子には、MRPL19、PSMC4、SF3A1、PUM1、ACTB、GAPD、GUSB、RPLP0およびTFRCが含まれる。本明細書に開示される方法は、任意の特定のハウスキーピング遺伝子への正規化に縛られず、当技術分野で公知である任意の適するハウスキーピング遺伝子を用いることができることは、当業技術者に理解されよう。
多くの正規化手法が可能であり、それらは分析のいくつかのポイントのいずれかで、しばしば適用することができる。一実施形態では、正規化機能を平滑化する全体的局所的に加重される散布図である、LOWESS法を用いてマイクロアレイデータを正規化する。別の実施形態では、qPCRデータは、複数のハウスキーピング遺伝子のセットの幾何平均に正規化される。
解釈を単純化するために、「平均センタリング」を用いることもできる。通常、各記述子について、すべての試料のその記述子の平均値が引かれる。この方法で、記述子の平均は起点と一致し、すべての記述子はゼロに「センタリング」される。「単位分散スケーリング」では、データを同等の分散にスケーリングすることができる。通常、各記述子の値は、1/StDevによってスケーリングされ、そこにおいて、StDevはすべての試料についてその記述子の標準偏差である。「パレートスケーリング」は、ある意味では、平均センタリングと単位分散スケーリングとの間の中間である。パレートスケーリングでは、各記述子の値は、1/sqrt(StDev)スケーリングされ、そこにおいて、StDevはすべての試料についてその記述子の標準偏差である。この方法で、各記述子は、その最初の標準偏差に数値的に同等である分散を有する。パレートスケーリングは、例えば、生データまたは平均センタリングデータについて実施することができる。
データが正のスキューを有する場合、および/またはデータが大幅に、例えば数桁にわたって広がる場合に解釈を支援するために、「対数スケーリング」を用いることができる。通常、各記述子について、値はその値の対数によって置換される。「同等範囲スケーリング」では、各記述子は、すべての試料についてその記述子の範囲で割られる。この方法で、すべての記述子は、同じ範囲、すなわち1を有する。しかし、この方法は、外れ点の存在に影響される。「自動スケーリング」では、各データベクターは平均センタリングされ、単位分散がスケーリングされる。この技術は非常に有用であるが、その理由は、各記述子が次に等しく加重され、大きな値および小さな値が同等の強調で処理されるからである。このことは、非常に低いが、まだ検出可能なレベルで発現される遺伝子にとって重要となることがある。
一実施形態では、1つまたは複数の試験試料についてデータを収集し、本明細書に記載のPAM50分類モデルを用いて分類する。複数の分析からのデータを比較する場合(例えば、1つまたは複数の試験試料の発現プロフィールを、独立した試験で収集、分析された試料から構築されたセントロイドと比較する)、これらのデータセット全般にわたってデータを正規化する必要が生じる。一実施形態では、これらのデータセットを一緒にするために、距離加重識別(DWD)が用いられる(参照によりその全体が本明細書に組み込まれるBenitoら(2004年)Bioinformatics 20巻(1号):105〜114頁)。DWDは、別々のデータセットに存在する系統的偏りを特定し、これらの偏りを補償するために次に全体的に調整することができる多変量解析ツールである。本質的には、各別々のデータセットはデータポイントの多次元クラウドであり、DWDは2つのポイントのクラウドをとり、それがより最適に他に重なるように1つをシフトさせる。
その方法を実施すること、および/または結果を記録することができる任意の装置を用いて、本明細書に記載の方法を実施すること、および/または結果を記録することができる。用いることができる装置の例には、すべての型のコンピュータを含む電子計算装置が含まれるが、これらに限定されない。本明細書に記載の方法を実施し、および/またはコンピュータに記録する場合、その方法の工程を実施するためのコンピュータを構成するために用いることができるコンピュータプログラムは、コンピュータプログラムを内蔵することができる任意のコンピュータ可読媒体に内蔵されてもよい。用いることができるコンピュータ可読媒体の例には、ディスケット、CD−ROM、DVD、ROM、RAM、ならびに他のメモリおよびコンピュータ記憶装置が含まれるが、これらに限定されない。これらの方法の工程を実施し、および/または結果を記録するためのコンピュータを構成するために用いることができるコンピュータプログラムは、電子ネットワーク上で、例えばインターネット、イントラネットまたは他のネットワーク上で提供されてもよい。
再発危険の計算
固有のサブタイプおよび任意選択で他の臨床変数との関連で乳癌予後を予測する方法が、本明細書で提供される。予後は、全体のもしくは疾患特異的生存期間、無事象生存期間、または特定の治療もしくは療法に応じる予後を指すことができる。特に、本方法は、長期の、無病生存期間の確率を予測するために用いることができる。「乳癌患者の生存確率を予測する」ことは、患者が根底にある乳癌の結果として死に至る危険を評価することを意味するものとする。「長期の、無病生存期間」は、患者が、初期診断または治療から少なくとも5年または少なくとも10年以上の間に根底にある乳癌から死亡しないか、またはその再発を起こさないことを意味するものとする。
固有のサブタイプおよび任意選択で他の臨床変数との関連で乳癌予後を予測する方法が、本明細書で提供される。予後は、全体のもしくは疾患特異的生存期間、無事象生存期間、または特定の治療もしくは療法に応じる予後を指すことができる。特に、本方法は、長期の、無病生存期間の確率を予測するために用いることができる。「乳癌患者の生存確率を予測する」ことは、患者が根底にある乳癌の結果として死に至る危険を評価することを意味するものとする。「長期の、無病生存期間」は、患者が、初期診断または治療から少なくとも5年または少なくとも10年以上の間に根底にある乳癌から死亡しないか、またはその再発を起こさないことを意味するものとする。
一実施形態では、予後は、サブタイプに従う対象の分類に基づいて予測される。この分類は、表1に列挙される固有遺伝子のリストを用いる発現プロファイリングに基づく。実施例1に記載のように、PAM50モデルによる腫瘍サブタイプは、標準の臨床マーカー分類よりも化学療法への応答をより表した。臨床マーカーを用いてHER2+と分類されたが、PAM50モデルを用いてHER2富化とされなかった腫瘍は、パクリタキセル、5フルオロウラシル、アドリアマイシンおよびシクロホスファミド(T/FAC)の治療計画に対して、臨床的にHER2+と分類され、HER2富化発現サブタイプに属するとされた腫瘍よりも低い病理学的著効(pCR)を示した。同様に、三重陰性(ER−、PgR−およびHER2−)と臨床的に評価されなかった基底様腫瘍は、PAM50によって基底様ではなかった三重陰性腫瘍と比較して、より高いpCRを有した。したがって、PAM50モデルは、化学療法に対する応答を標準の臨床マーカーよりも正確に予測するために用いることができる。
サブタイプ帰属を提供することに加えて、PAM50バイオインフォマティクスモデルは、疾患状態および治療選択肢に関係なく任意の患者集団で用いることができる再発危険(ROR)スコアに翻訳される、全4つのサブタイプへの試験試料の類似性の測定法を提供する。固有のサブタイプおよびRORは、例えば、ネオアジュバントのタキサンおよびアントラサイクリンによる化学療法で治療される女性での、病理学的著効の予測においても価値がある[Rouzier 2005]。したがって、本発明の様々な実施形態では、予後を予測するために再発危険(ROR)モデルが用いられる。これらの危険モデルを用いて、対象を、低、中、高の再発危険群に層化することができる。RORの計算は、治療決定の指針となる、および/または療法への応答を監視するための予後情報を提供することができる。
本明細書に記載の一部の実施形態では、PAM50によって規定される固有のサブタイプおよび/または他の臨床パラメータの予後診断性能は、危険率およびその信頼区間の推定を提供する生存データのための回帰法である、Cox Proportional Hazards Model解析を用いて評価される。Coxモデルは、患者の生存と特定の変数との間の関係を探究するための、よく認識されている統計技術である。この統計的方法は、彼らの予後変数(例えば、本明細書に記載のように、追加の臨床因子を有するかまたは有しない固有遺伝子発現プロフィール)が与えられると、個人の危険(すなわち、リスク)の推定を可能にする。「危険率」は、特定の予後変数を提示する患者の、任意の所与の時点での死の危険性である。一般には、Spruanceら、Antimicrob. Agents & Chemo. 48巻:2787〜92頁、2004年を参照。
上記のように、本明細書に記載のPAM50分類モデルは、サブタイプ距離(または相関関係)を単独で用いるか、またはサブタイプ距離を臨床変数と一緒に用いて、再発危険について調教することができる。一実施形態では、試験試料の危険スコアは、以下の方程式を用いて固有のサブタイプ距離を単独で用いて計算される。
ROR=0.05*基底+0.11*Her2+−0.25*LumA+0.07*LumB+−0.11*正常、式中、変数「基底」、「Her2」、「LumA」、「LumB」および「正常」は、試験試料からの発現プロフィールを、アクセッション番号GSE2845でGene Expression Omnibus(GEO)に寄託されている遺伝子発現データを用いて構築されるセントロイドと比較したときの、各クラシファイヤーそれぞれについてのセントロイドまでの距離である。このデータには、インターネットアドレスwww.ncbi.nlm.nih.gov/geoでアクセスすることができる。類似したCoxモデル係数を誘導するために、他のデータセットを用いることができる可能性もある。GSE2845として寄託されているデータセットを誘導するために用いた試料以外の試料セットから予測モデルを生成するために、表1に示す固有遺伝子のリストを用いる場合、この代わりの試料セットから再発危険を計算するための式を構築するために、実施例1または実施例3に記載の方法を用いることができる。
ROR=0.05*基底+0.11*Her2+−0.25*LumA+0.07*LumB+−0.11*正常、式中、変数「基底」、「Her2」、「LumA」、「LumB」および「正常」は、試験試料からの発現プロフィールを、アクセッション番号GSE2845でGene Expression Omnibus(GEO)に寄託されている遺伝子発現データを用いて構築されるセントロイドと比較したときの、各クラシファイヤーそれぞれについてのセントロイドまでの距離である。このデータには、インターネットアドレスwww.ncbi.nlm.nih.gov/geoでアクセスすることができる。類似したCoxモデル係数を誘導するために、他のデータセットを用いることができる可能性もある。GSE2845として寄託されているデータセットを誘導するために用いた試料以外の試料セットから予測モデルを生成するために、表1に示す固有遺伝子のリストを用いる場合、この代わりの試料セットから再発危険を計算するための式を構築するために、実施例1または実施例3に記載の方法を用いることができる。
危険スコアは、同じく、試験発現プロフィールを、アクセッション番号GSE2845としてGEOに寄託されている遺伝子発現データを用いて構築されたセントロイドと比較する場合、乳癌サブタイプと臨床変数腫瘍サイズ(T)および結節の状態(N)との組合せを用いて、以下の方程式、ROR(完全)=0.05*基底+0.1*Her2+−0.19*LumA+0.05*LumB+−0.09*正常+0.16*T+0.08*N、を用いて計算することもできる。
さらに別の実施形態では、試験試料の危険スコアは、以下の方程式を用いて固有のサブタイプ距離を単独で用いて計算される。
ROR−S=0.05*基底+0.12*Her2+−0.34*LumA+0.0.23*LumB、
式中、変数「基底」、「Her2」、「LumA」および「LumB」は上記の通りであり、試験発現プロフィールは、アクセッション番号GSE2845としてGEOに寄託されている遺伝子発現データを用いて構築されたセントロイドと比較される。
ROR−S=0.05*基底+0.12*Her2+−0.34*LumA+0.0.23*LumB、
式中、変数「基底」、「Her2」、「LumA」および「LumB」は上記の通りであり、試験発現プロフィールは、アクセッション番号GSE2845としてGEOに寄託されている遺伝子発現データを用いて構築されたセントロイドと比較される。
さらに別の実施形態では、危険スコアは、乳癌サブタイプと臨床変数腫瘍サイズ(T)との組合せを用いて、以下の方程式(変数は上記の通り)
ROR−C=0.05*基底+0.11*Her2+−0.23*LumA+0.09*LumB+0.17*Tを用いて計算することもできる。
ROR−C=0.05*基底+0.11*Her2+−0.23*LumA+0.09*LumB+0.17*Tを用いて計算することもできる。
療法への応答の予測
乳癌は、例えば、手術、放射線療法、ホルモン療法、化学療法またはそのなんらかの組合せを含むことができる、いくつかの代替戦略によって管理される。当技術分野で公知であるように、個々の乳癌患者のための治療決定は、腫瘍の内分泌応答性、患者の閉経状態、関与する患者リンパ節の場所および数、腫瘍のエストロゲンおよびプロゲステロン受容体の状態、原発腫瘍のサイズ、患者の年齢、および診断時の疾患の病期に基づくことができる。様々な臨床因子および臨床試験の分析は、St.Gallen Conference(2005年)のInternational Consensus Panelによる初期乳癌のための推奨および治療ガイドラインの進展をもたらした。Goldhirschら、Annals Oncol. 16巻:1569〜83頁、2005年を参照。ガイドラインは、患者に、内分泌非応答性疾患のための化学療法を;内分泌応答性疾患のための一次療法としての内分泌療法を、このカテゴリーの一部の中間およびすべての高リスク群のために化学療法を加えて、ならびに低リスク群の者を除く、未確定内分泌応答カテゴリーのすべての患者のために化学療法および内分泌療法の両方を提供するよう推奨する。
乳癌は、例えば、手術、放射線療法、ホルモン療法、化学療法またはそのなんらかの組合せを含むことができる、いくつかの代替戦略によって管理される。当技術分野で公知であるように、個々の乳癌患者のための治療決定は、腫瘍の内分泌応答性、患者の閉経状態、関与する患者リンパ節の場所および数、腫瘍のエストロゲンおよびプロゲステロン受容体の状態、原発腫瘍のサイズ、患者の年齢、および診断時の疾患の病期に基づくことができる。様々な臨床因子および臨床試験の分析は、St.Gallen Conference(2005年)のInternational Consensus Panelによる初期乳癌のための推奨および治療ガイドラインの進展をもたらした。Goldhirschら、Annals Oncol. 16巻:1569〜83頁、2005年を参照。ガイドラインは、患者に、内分泌非応答性疾患のための化学療法を;内分泌応答性疾患のための一次療法としての内分泌療法を、このカテゴリーの一部の中間およびすべての高リスク群のために化学療法を加えて、ならびに低リスク群の者を除く、未確定内分泌応答カテゴリーのすべての患者のために化学療法および内分泌療法の両方を提供するよう推奨する。
PAM50モデルを用いる再発危険および本明細書に開示される危険スコアによる患者の層化は、追加のまたは代替の治療決定因子を提供する。この方法は、任意選択で1つまたは複数の臨床変数、例えば結節の状態、腫瘍サイズおよびER状態と一緒にPAM50分類モデルを用いて、再発危険を評価することを含む。危険スコアは、治療決定の指針とするために用いることができる。例えば、低い危険スコアを有する対象は、特定の種類の療法から利益を受けることができないが、高い危険スコアを有する対象には、より攻撃的な療法を指示することができる。
本発明の方法は、初期乳癌患者のための適当な治療の選択において、特に有用である。疾患の初期段階で診断される乳癌患者の大多数は、さらなるアジュバント療法なしで、手術および/または放射線療法の後に長期生存する。しかし、これらの患者のかなりの割合(約20%)が疾患の再発または死を経験するので、一部またはすべての初期乳癌患者がアジュバント療法を受けるべきであるとの臨床上の推奨が導かれる。本発明の方法は、初期乳癌患者のこの高リスクの予後不良な集団を特定し、それによってどの患者にとって、継続的および/またはより攻撃的な療法ならびに治療後の綿密なモニタリングが有益となるのかを決定することにおいて有用である。例えば、本明細書に開示の方法によって高い危険スコアを有すると評価される初期乳癌患者は、手術および/または放射線治療に続いて、より攻撃的なアジュバント療法、例えば化学療法のために選択することができる。特定の実施形態では、本発明の方法は、医師がより情報に基づいた乳癌治療の決定を下すことができるように、St.Gallen Conferenceによって確立された治療ガイドラインと共に用いることができる。
様々な実施形態では、PAM50分類モデルは、免疫組織化学または他の組織学的分析などの標準の臨床アッセイを用いて得ることができない、乳癌サブタイプに関する情報を提供する。例えば、エストロゲン受容体(ER)陽性および/またはプロゲステロン受容体(PR)陽性と評価された対象には、従来のガイドラインに従って内分泌療法が指示されるであろう。実施例2で述べるように、本明細書で開示されるモデルは、ERまたはPgR状態単独に基づくと指示されなかったであろうより攻撃的な療法の必要性を指示することができる、基底様と分類されるこれらのER+/PgR+症例のサブセットを特定することができる。
したがって、本明細書で開示される方法は、選択された治療に対する乳癌患者の応答を予測することにおいても有用である。「選択された治療に対する乳癌患者の応答を予測する」ことは、患者が特定の治療で正または負の予後を経験する可能性を評価することを意味するものとする。本明細書で用いるように、「正の治療予後を示す」は、選択された治療から患者が有益な結果(例えば、完全または部分的な寛解、腫瘍サイズの縮小など)を経験する可能性の増大を指す。「負の治療予後を示す」は、根底にある乳癌の進行に関して、選択された治療から患者が利益を享受できない可能性の増大を意味するものとする。
一部の実施形態では、予後または無病生存時間を評価するための関連する時間は、腫瘍の外科的除去、または腫瘍増殖の抑制、緩和もしくは阻害から始まる。別の実施形態では、PAM50に基づく危険スコアは、内分泌療法などのネオアジュバント療法の開始後に得られる試料に基づいて計算される。試料は、療法の開始後の任意の時間にとることができるが、不応性患者でネオアジュバント療法を化学療法に切り替えることができるように、好ましくは約1カ月後に得られる。手術の前に内分泌治療が指示される腫瘍のサブセットは、この療法に非応答性であることが示されている。本明細書で提供されるモデルは、腫瘍がエストロゲンおよび/またはプロゲステロン受容体に陽性である場合でも、内分泌療法におそらく治療抵抗性である攻撃的な腫瘍を特定するために用いることができる。この実施形態では、増殖加重PAM50危険スコアは、以下の方程式に従って得られる。RSp=(−0.0129*基底)+(0.106*Her2)+(−0.112*LumA)+(0.039*LumB)+(−0.069*正常)+(0.272*Prolif)、式中、増殖スコア(「prolif」)は、以下の遺伝子の平均測定値として割り当てられる(正規化後):CCNB1、UBE2C、BIRC5、KNTC2、CDC20、PTTG1、RRM2、MKI67、TYMS、CEP55およびCDCA1。他のすべての変数は、下に記載のRS方程式と同じである。実施例2で述べるように、療法の開始後の危険スコアの評価は、少なくともネオアジュバント内分泌療法を受けているER+患者集団では、治療予後においてより予測的である。
キット
本発明は、乳癌固有のサブタイプを分類するために、および/または予後情報を提供するために有用なキットも提供する。これらのキットは、表1に列挙される固有遺伝子に特異的な捕捉プローブおよび/またはプライマーのセット、ならびに固有遺伝子の発現生成物の検出および/または定量化を促進するのに十分な試薬を含む。キットは、コンピュータ可読媒体をさらに含むことができる。
本発明は、乳癌固有のサブタイプを分類するために、および/または予後情報を提供するために有用なキットも提供する。これらのキットは、表1に列挙される固有遺伝子に特異的な捕捉プローブおよび/またはプライマーのセット、ならびに固有遺伝子の発現生成物の検出および/または定量化を促進するのに十分な試薬を含む。キットは、コンピュータ可読媒体をさらに含むことができる。
本発明の一実施形態では、捕捉プローブは、アレイの上に固定化される。「アレイ」は、ペプチドまたは核酸プローブがその支持体または基質に結合している、固体支持体または基質を意味するものとする。アレイは、異なる公知の場所にある基質の表面に結合している、複数の異なる捕捉プローブを一般に含む。本発明のアレイは、固有遺伝子の発現生成物に特異的に結合することができる複数の捕捉プローブを有する基質を含む。基質上の捕捉プローブの数は、アレイの目的によって異なる。アレイは、低密度アレイまたは高密度アレイであることができ、4個以上、8個以上、12個以上、16個以上、32個以上のアドレスを含むことができるが、表1に記載の50個の固有遺伝子のための捕捉プローブを最小限含む。
物理的合成法を用いるこれらのアレイの合成技術は、例えば、すべての目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第5,384,261号に記載されている。このアレイは、実質的にいかなる形の表面にも、または複数の表面にさえ形成することができる。アレイは、ビーズ、ゲル、重合体表面、光ファイバーなどの線維、ガラスまたは他の任意の適当な基質の上のプローブ(例えば、核酸結合性プローブ)であることができる。それぞれはすべての目的のために本明細書にその全体が組み込まれる、米国特許第5,770,358号、第5,789,162号、第5,708,153号、第6,040,193号および第5,800,992号を参照。アレイは、装置の上で診断または他の操作を可能にする方法でパックすることができる。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第5,856,174号および第5,922,591号を参照。
別の実施形態では、キットは、表1に列挙される固有遺伝子の各々の検出および/または定量化に十分な、オリゴヌクレオチドプライマーセットを含む。オリゴヌクレオチドプライマーは、凍結乾燥または再構成された形で提供されてもよく、またはヌクレオチド配列セットとして提供されてもよい。一実施形態では、プライマーはマイクロプレートフォーマットで提供され、そこでは各プライマーセットがマイクロプレートの1つのウェル(または反復試験区の場合のように複数のウェル)を占める。下に述べるように、マイクロプレートは、1つまたは複数のハウスキーピング遺伝子の検出に十分なプライマーをさらに含むことができる。キットは、表1に記載の遺伝子からの発現生成物の増幅に十分な、試薬および指示書をさらに含むことができる。
例えば、比較、精査、回収および/または改変のために速いアクセスを容易にするために、分子シグナチュア/発現プロフィールは、一般的にデータベースに記録される。最も一般的には、データベースはコンピュータ装置によってアクセス可能なリレーショナルデータベースであるが、他のフォーマット、例えば、写真、アナログまたはデジタル画像読み出し情報、表計算ソフト、その他のような、手動でアクセス可能な発現プロフィールの索引ファイルを用いることができる。最初に記録される発現パターンの性質がアナログまたはデジタルであるかを問わず、発現パターン、発現プロフィール(総体的な発現パターン)および分子シグナチュア(相関する発現パターン)はデジタル的に保存され、データベースによってアクセスされる。一般的に、データベースは編集され、中央設備に維持されて、アクセスはローカルにおよび/または遠隔操作で利用可能である。
本明細書で冠詞「a」および「an」は、1つまたは複数(すなわち、少なくとも1つ)の冠詞の文法上の目的語を指すために用いられる。例として、「要素」は、1つまたは複数の要素を意味する。
明細書全体を通して、単語「含んでいる」または変形形態の「含む」もしくは「含んでいる」などは、明示された要素、整数もしくは段階、または要素、整数もしくは段階の群が含まれることを意味するが、いかなる他の要素、整数もしくは段階、または要素、整数もしくは段階の群の除外を意味するものではないと理解される。
以下の実施例は例示のために提供され、限定するものではない。
(実施例1)
方法
試料および臨床データ:
トレーニングおよび試験セットのための患者コホートは、公開ドメイン(Loiら(2007年)J. Clin. Oncol. 25巻:1239〜1246頁;va de Vijverら(2002年)N Engl J Med 247巻:1999〜2009頁;Wangら(2005年)Lancet 365巻:671〜679頁;Ishvinaら(2006年)Cancer Res 66巻:10292〜10301頁およびHessら(2006年)J Clin Oncol 24巻:4236〜4244頁、それぞれは参照によりその全体が組み込まれる)中の既存のデータを有する試料、ならびにそれぞれの施設で施設内審査委員会承認のプロトコルの下で収集された新鮮凍結ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)組織からなった。
方法
試料および臨床データ:
トレーニングおよび試験セットのための患者コホートは、公開ドメイン(Loiら(2007年)J. Clin. Oncol. 25巻:1239〜1246頁;va de Vijverら(2002年)N Engl J Med 247巻:1999〜2009頁;Wangら(2005年)Lancet 365巻:671〜679頁;Ishvinaら(2006年)Cancer Res 66巻:10292〜10301頁およびHessら(2006年)J Clin Oncol 24巻:4236〜4244頁、それぞれは参照によりその全体が組み込まれる)中の既存のデータを有する試料、ならびにそれぞれの施設で施設内審査委員会承認のプロトコルの下で収集された新鮮凍結ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)組織からなった。
189個の乳房腫瘍試料および29個の正常な試料のトレーニングセットを、University of North Carolina at Chapel Hill、The University of Utah、Thomas Jefferson UniversityおよびWashington Universityで承認されたIRBプロトコルの下、新鮮凍結およびFFPE組織として手に入れた。マイクロアレイおよびqRT−PCRによってプロファイリングされた遺伝子発現であったトレーニングセットは、49カ月の中間の追跡調査を有し、彼らの病期、ERおよびHER2状態によって決定された治療標準に従う、不均一に治療された患者を表す。長期の疾患特異的生存期間を有する279個の乳癌の試験セットは、qRT−PCRによってFFPEからプロファイリングされた遺伝子発現であった。qRT−PCRによって分析されたトレーニングおよび試験セットの臨床データを、表2および3に示す。
核酸抽出:
Qiagen RNeasy Midi Kitを用いるマイクロアレイのために、製造業者のプロトコル(Qiagen、Valencia CA)に従って、全RNAを新鮮凍結試料から精製した。RNAの完全性は、Agilent2100 Bioanalyzer(Agilent Technologies、Palo Alto、CA)を用いて判定した。qRT−PCRのためにFFPE組織(2×10ミクロンまたは1.5mmのパンチ)からRNAを抽出するために、High Pure RNA Paraffin Kit(Roche Applied Science、Indianapolis、IN)を用いた。混入したDNAは、Turbo DNアーゼ(Ambion、Austin、TX)を用いて除去した。総RNAの収量は、NanoDrop ND−1000分光光度計(NanoDrop Technologies,Inc.、Rockland、DE)を用いて評価した。
Qiagen RNeasy Midi Kitを用いるマイクロアレイのために、製造業者のプロトコル(Qiagen、Valencia CA)に従って、全RNAを新鮮凍結試料から精製した。RNAの完全性は、Agilent2100 Bioanalyzer(Agilent Technologies、Palo Alto、CA)を用いて判定した。qRT−PCRのためにFFPE組織(2×10ミクロンまたは1.5mmのパンチ)からRNAを抽出するために、High Pure RNA Paraffin Kit(Roche Applied Science、Indianapolis、IN)を用いた。混入したDNAは、Turbo DNアーゼ(Ambion、Austin、TX)を用いて除去した。総RNAの収量は、NanoDrop ND−1000分光光度計(NanoDrop Technologies,Inc.、Rockland、DE)を用いて評価した。
逆転写およびリアルタイム定量PCR:
第一鎖cDNAは、Superscript III逆転写酵素(第一鎖キット;Invitrogen、Carlsbad、CA)ならびにランダム六量体および遺伝子特異的プライマーの混合物を用いて、1.2μgの総RNAから合成した。反応を、55℃で60分間、次に70℃で15分間保持した。cDNAをQIAquick PCR精製カラム(Qiagen Inc.、Valencia、CA)で洗浄し、さらなる使用時まで25mMトリス、1mM EDTA中に−80℃で保存した。各5μLのPCR反応は、関心のある試料からの1.25ng(0.625ng/μL)のcDNAまたは参照のために10ng(5ng/μL)、2pmolの上流および下流のプライマー、ならびに2×のLightCycler 480 SYBR Green I Master Mix(Roche Applied Science、Indianapolis、IN)を含んでいた。各ランは、試験試料、参照試料および陰性対照のために2反復でプロファイリングされた単一の遺伝子を含んでいた。参照試料cDNAは、ヒト参照総RNA(Stratagene、La Jolla、CA)および乳房細胞系MCF7、ME16CおよびSKBR3の同等の寄与量を含んでいた。PCR増幅は、初期変性段階(95℃、8分)と、続く45サイクルの変性(95℃、4秒)、アニーリング(56℃、6秒で2.5℃/秒の遷移)および伸長(72℃、6秒で2℃/秒の遷移)を用いて、LightCycler 480(Roche Applied Science、Indianapolis、IN)で実施した。dsDNA色素SYBR Green Iからの蛍光(530nm)を、各サイクルで伸長段階の後に得た。PCRの特異性は、増幅後融解曲線解析によって判定した−試料を65℃に冷却し、蛍光を連続的に(1℃ごとに10回取得)監視しながら、2℃/秒の速度で99℃まで徐々に加熱した。各遺伝子の相対的なコピー数は、10ngに設定したラン内キャリブレータから、1.9のPCR効率を用いて判定した。PAM50クラシファイヤー遺伝子の各々を、5つのハウスキーパーの幾何平均に正規化した。
第一鎖cDNAは、Superscript III逆転写酵素(第一鎖キット;Invitrogen、Carlsbad、CA)ならびにランダム六量体および遺伝子特異的プライマーの混合物を用いて、1.2μgの総RNAから合成した。反応を、55℃で60分間、次に70℃で15分間保持した。cDNAをQIAquick PCR精製カラム(Qiagen Inc.、Valencia、CA)で洗浄し、さらなる使用時まで25mMトリス、1mM EDTA中に−80℃で保存した。各5μLのPCR反応は、関心のある試料からの1.25ng(0.625ng/μL)のcDNAまたは参照のために10ng(5ng/μL)、2pmolの上流および下流のプライマー、ならびに2×のLightCycler 480 SYBR Green I Master Mix(Roche Applied Science、Indianapolis、IN)を含んでいた。各ランは、試験試料、参照試料および陰性対照のために2反復でプロファイリングされた単一の遺伝子を含んでいた。参照試料cDNAは、ヒト参照総RNA(Stratagene、La Jolla、CA)および乳房細胞系MCF7、ME16CおよびSKBR3の同等の寄与量を含んでいた。PCR増幅は、初期変性段階(95℃、8分)と、続く45サイクルの変性(95℃、4秒)、アニーリング(56℃、6秒で2.5℃/秒の遷移)および伸長(72℃、6秒で2℃/秒の遷移)を用いて、LightCycler 480(Roche Applied Science、Indianapolis、IN)で実施した。dsDNA色素SYBR Green Iからの蛍光(530nm)を、各サイクルで伸長段階の後に得た。PCRの特異性は、増幅後融解曲線解析によって判定した−試料を65℃に冷却し、蛍光を連続的に(1℃ごとに10回取得)監視しながら、2℃/秒の速度で99℃まで徐々に加熱した。各遺伝子の相対的なコピー数は、10ngに設定したラン内キャリブレータから、1.9のPCR効率を用いて判定した。PAM50クラシファイヤー遺伝子の各々を、5つのハウスキーパーの幾何平均に正規化した。
マイクロアレイ:
AgilentヒトIAv2マイクロアレイまたはオーダー設計されたAgilentヒト22kのアレイでの総RNAの単離、標識化およびハイブリダイゼーションは、Huら(6)に記載のプロトコルを用いて実施した。すべてのマイクロアレイデータは、アクセッション番号GSE10886の下で、GEO(インターネットアドレスwww.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)に寄託した。すべてのマイクロアレイトレーニングおよび試験データセットの出典を、表4に示す。
AgilentヒトIAv2マイクロアレイまたはオーダー設計されたAgilentヒト22kのアレイでの総RNAの単離、標識化およびハイブリダイゼーションは、Huら(6)に記載のプロトコルを用いて実施した。すべてのマイクロアレイデータは、アクセッション番号GSE10886の下で、GEO(インターネットアドレスwww.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)に寄託した。すべてのマイクロアレイトレーニングおよび試験データセットの出典を、表4に示す。
マイクロアレイデータの前処理:
トレーニングセット(189個の試料)のマイクロアレイデータは、University of North Carolina(UNC)マイクロアレイデータベースから抽出された。両チャネルからの生のシグナル強度をチップによってlowess正規化し、プローブは、それらが少なくとも70%の実験の両チャネルで少なくとも30のシグナル強度を有していない場合、データ分析から除外した。このセットの正規化データは、GEO(GSE10886)に置いた。トレーニングセットは中央にセンタリングし、遺伝子記号は製造業者によって提供された注釈を用いて割り当てた。重複遺伝子記号は、各試料内で平均することによって折りたたんだ。
トレーニングセット(189個の試料)のマイクロアレイデータは、University of North Carolina(UNC)マイクロアレイデータベースから抽出された。両チャネルからの生のシグナル強度をチップによってlowess正規化し、プローブは、それらが少なくとも70%の実験の両チャネルで少なくとも30のシグナル強度を有していない場合、データ分析から除外した。このセットの正規化データは、GEO(GSE10886)に置いた。トレーニングセットは中央にセンタリングし、遺伝子記号は製造業者によって提供された注釈を用いて割り当てた。重複遺伝子記号は、各試料内で平均することによって折りたたんだ。
すべての試験セットの正規化データは、GEO(GSE2845、GSE6532、GSE4922、GSE2034、GSE10886)、またはインターネットアドレスbioinformatics.mdanderson.org/pubdataで見出される公開データからダウンロードした(表5を参照)。すべての強度測定値(NKIデータの比)を、対数変換した。最近傍セントロイドの計算の前に、Hessら(bioinformatics.mdanderson.org/pubdata)、van de
Vijverら(GSE2845)およびWangら(GSE2034)データセットを中央にセンタリングして、プラットホーム効果を最小化した。このような調整は、トレーニングセットと比較的類似した集団のサンプリングを仮定する。Loiら(GSE6532)およびIvshinaら(GSE4922)データセットは、トレーニングセットと比較してER+試料にかなり富み、したがって、根底にある仮説はこれらのセットでは破られる可能性がある。これらの2つの例では、トレーニングセットの遺伝子は、ER+試料の中央にセンタリングされた(すべての試料全体での中央と対照的に)。トレーニングセットと同様に、遺伝子記号は、製造業者によって提供された注釈を用いて割り当て、重複遺伝子記号は、各試料内で平均することによって折りたたんだ。
Vijverら(GSE2845)およびWangら(GSE2034)データセットを中央にセンタリングして、プラットホーム効果を最小化した。このような調整は、トレーニングセットと比較的類似した集団のサンプリングを仮定する。Loiら(GSE6532)およびIvshinaら(GSE4922)データセットは、トレーニングセットと比較してER+試料にかなり富み、したがって、根底にある仮説はこれらのセットでは破られる可能性がある。これらの2つの例では、トレーニングセットの遺伝子は、ER+試料の中央にセンタリングされた(すべての試料全体での中央と対照的に)。トレーニングセットと同様に、遺伝子記号は、製造業者によって提供された注釈を用いて割り当て、重複遺伝子記号は、各試料内で平均することによって折りたたんだ。
プロトタイプ固有のサブタイプ試料および遺伝子の同定:
4つの過去の試験(1、6、9、11)で見出された遺伝子を主に含む拡張された「固有」遺伝子セットを最初に用いて、プロトタイプの腫瘍試料を同定した。正常様クラスは、乳房縮小術または肉眼的に無関係な組織からの真の「正常体」を用いて表した。1906個の「固有」遺伝子全体にわたる189個の乳房腫瘍を階層的クラスタリング(特徴/遺伝子、ピアソンの相関、平均連結法によって中央にセンタリングした)(12)によって分析し、試料デンドログラムは、「SigClust」(13)を用いて分析した。SigClustアルゴリズムは、試料の群が単一のクラスターからのものであるとの帰無仮説を検定することによって、有意/特異な群を統計的に特定し、そこにおいて、クラスターは多変量正規分布として特徴づけられる。SigClustは、根元から始まり、検定がもはや有意でない(p>0.001)ときに停止するデンドログラムの各節で実行した。
4つの過去の試験(1、6、9、11)で見出された遺伝子を主に含む拡張された「固有」遺伝子セットを最初に用いて、プロトタイプの腫瘍試料を同定した。正常様クラスは、乳房縮小術または肉眼的に無関係な組織からの真の「正常体」を用いて表した。1906個の「固有」遺伝子全体にわたる189個の乳房腫瘍を階層的クラスタリング(特徴/遺伝子、ピアソンの相関、平均連結法によって中央にセンタリングした)(12)によって分析し、試料デンドログラムは、「SigClust」(13)を用いて分析した。SigClustアルゴリズムは、試料の群が単一のクラスターからのものであるとの帰無仮説を検定することによって、有意/特異な群を統計的に特定し、そこにおいて、クラスターは多変量正規分布として特徴づけられる。SigClustは、根元から始まり、検定がもはや有意でない(p>0.001)ときに停止するデンドログラムの各節で実行した。
プロトタイプ試料およびqRT−PCRを用いる、遺伝子セットの削減:
qRT−PCRおよびマイクロアレイによってプロファイリングされた189人の個体からの122の乳癌は、SigClustによる判定でプロトタイプのプロフィールを有していた(表2)。最小化遺伝子セットは、Mullinsら(14)で確立されたFFPE性能基準に合格した161の遺伝子のqRT−PCRデータを用いて、これらのプロトタイプ試料から誘導された。各群のトップ「N」t検定統計(15)、トップクラスター索引スコア(16)、および改変t検定統計の「収縮」の後に残された遺伝子(17)を含め、いくつかの最小化方法が使用された。最小化遺伝子セットの頑健性を評価するために、交差妥当化(50サイクルの各々でランダムな10%が残された)を用いた。最も低いCV誤差を有するので、「N」t検定法が選択された。
qRT−PCRおよびマイクロアレイによってプロファイリングされた189人の個体からの122の乳癌は、SigClustによる判定でプロトタイプのプロフィールを有していた(表2)。最小化遺伝子セットは、Mullinsら(14)で確立されたFFPE性能基準に合格した161の遺伝子のqRT−PCRデータを用いて、これらのプロトタイプ試料から誘導された。各群のトップ「N」t検定統計(15)、トップクラスター索引スコア(16)、および改変t検定統計の「収縮」の後に残された遺伝子(17)を含め、いくつかの最小化方法が使用された。最小化遺伝子セットの頑健性を評価するために、交差妥当化(50サイクルの各々でランダムな10%が残された)を用いた。最も低いCV誤差を有するので、「N」t検定法が選択された。
試料サブタイプ予測:
最小化遺伝子セットを、3つのセントロイドに基づく予測法、すなわち、マイクロアレイの予測分析(PAM)(17)、単純最近傍セントロイド(6)、および最近傍セントロイドの分類(ClaNC)(18)にわたる分類の再現性のために比較した。サブタイプの予測は、各試験例と5個のセントロイド(LumA、LumB、HER2富化、基底様および正常様)とのスピアマンの順位相関を計算することによって実行し、最近傍セントロイドに基づいてクラスを割り当てた。GSE10886で提供されるデータを用いて、PAMアルゴリズムのために記載されている(17)通りにセントロイドを構築した。しかし、「収縮」は用いず、スピアマン順位相関を距離測定のために用いた。大きな最小化遺伝子セットからのサブタイプ予測のその再現性のため、この方法をクラシファイヤーとして選択した。6つのマイクロアレイデータセットおよび1つのqRT−PCRデータセットでサブタイプを予測するために、最終の50の遺伝子のクラシファイヤー(以降、PAM50と呼ぶ)を用いた(表4)。Hessらのデータセット(19)は予後データを有さず、臨床マーカー、サブタイプおよびネオアジュバント応答に基づいて評価される。
最小化遺伝子セットを、3つのセントロイドに基づく予測法、すなわち、マイクロアレイの予測分析(PAM)(17)、単純最近傍セントロイド(6)、および最近傍セントロイドの分類(ClaNC)(18)にわたる分類の再現性のために比較した。サブタイプの予測は、各試験例と5個のセントロイド(LumA、LumB、HER2富化、基底様および正常様)とのスピアマンの順位相関を計算することによって実行し、最近傍セントロイドに基づいてクラスを割り当てた。GSE10886で提供されるデータを用いて、PAMアルゴリズムのために記載されている(17)通りにセントロイドを構築した。しかし、「収縮」は用いず、スピアマン順位相関を距離測定のために用いた。大きな最小化遺伝子セットからのサブタイプ予測のその再現性のため、この方法をクラシファイヤーとして選択した。6つのマイクロアレイデータセットおよび1つのqRT−PCRデータセットでサブタイプを予測するために、最終の50の遺伝子のクラシファイヤー(以降、PAM50と呼ぶ)を用いた(表4)。Hessらのデータセット(19)は予後データを有さず、臨床マーカー、サブタイプおよびネオアジュバント応答に基づいて評価される。
臨床および分子サブタイプデータを用いる予後:
再発(すなわち任意の事象)までの時間をエンドポイントとして一変量および多変量解析を用いて、固有サブタイプの分類の予後診断上の有意性を標準の臨床変数(腫瘍サイズ(T)、結節の状態(N)およびER状態)とともに評価した。入手可能な臨床データ、サブタイプデータ、ならびに臨床および分子変数の組合せのモデルを比較するために、尤度比検定を実施した。カテゴリーによる生存率分析は、ログランク検定を用いて実施し、カプラン−マイヤープロットで視覚化した。
再発(すなわち任意の事象)までの時間をエンドポイントとして一変量および多変量解析を用いて、固有サブタイプの分類の予後診断上の有意性を標準の臨床変数(腫瘍サイズ(T)、結節の状態(N)およびER状態)とともに評価した。入手可能な臨床データ、サブタイプデータ、ならびに臨床および分子変数の組合せのモデルを比較するために、尤度比検定を実施した。カテゴリーによる生存率分析は、ログランク検定を用いて実施し、カプラン−マイヤープロットで視覚化した。
臨床および分子データによる危険モデルの開発:
サブタイプ単独、およびサブタイプを臨床情報と用いて、再発危険(ROR)予測のためにモデルを調教した。いずれの場合も、リッジ回帰を用いる多変量のコックスモデルをNKI295コホートの未処置のサブセットに適合させた(20)。危険スコアは、サブタイプ単独との相関を用いて(ROR;モデル1)、または完全モデルをサブタイプ相関および2つの臨床変数と用いて(ROR(完全);モデル2)各試験例に割り当てた:
(1)ROR=0.05*基底+0.11*Her2+−0.25*LumA+0.07*LumB+−0.11*正常
(2)ROR(完全)=0.05*基底+0.1*Her2+−0.19*LumA+0.05*LumB+−0.09*正常+0.16*T+0.08*N
コックスモデルからの係数の合計は、各患者の「再発危険」スコアである。試料を特定の危険群に分類するために、高い危険群に入るためにLumA試料を必要とせず、低い危険群に入るために基底様試料を必要としないNKIトレーニングセットから閾値を選択した。閾値はトレーニングセットから決定し、試験例を評価するときにも不変であった。サブタイプだけおよび組合せモデルの予測は、C指数(インターネットアドレスlib.stat.cmu.edu/S/Harrell/Design.html)を用いて比較した。RORスコアと無再発生存との間の関係を特徴づけるために、サイザー分析を実施した(21)。RORスコアの95%信頼区間は二項信頼区間のローカルバージョンであり、ローカル試料サイズは、ウインド幅のSheather−Jones選択に基づいて、ガウシアンカーネル密度推定量から計算される(22)。
サブタイプ単独、およびサブタイプを臨床情報と用いて、再発危険(ROR)予測のためにモデルを調教した。いずれの場合も、リッジ回帰を用いる多変量のコックスモデルをNKI295コホートの未処置のサブセットに適合させた(20)。危険スコアは、サブタイプ単独との相関を用いて(ROR;モデル1)、または完全モデルをサブタイプ相関および2つの臨床変数と用いて(ROR(完全);モデル2)各試験例に割り当てた:
(1)ROR=0.05*基底+0.11*Her2+−0.25*LumA+0.07*LumB+−0.11*正常
(2)ROR(完全)=0.05*基底+0.1*Her2+−0.19*LumA+0.05*LumB+−0.09*正常+0.16*T+0.08*N
コックスモデルからの係数の合計は、各患者の「再発危険」スコアである。試料を特定の危険群に分類するために、高い危険群に入るためにLumA試料を必要とせず、低い危険群に入るために基底様試料を必要としないNKIトレーニングセットから閾値を選択した。閾値はトレーニングセットから決定し、試験例を評価するときにも不変であった。サブタイプだけおよび組合せモデルの予測は、C指数(インターネットアドレスlib.stat.cmu.edu/S/Harrell/Design.html)を用いて比較した。RORスコアと無再発生存との間の関係を特徴づけるために、サイザー分析を実施した(21)。RORスコアの95%信頼区間は二項信頼区間のローカルバージョンであり、ローカル試料サイズは、ウインド幅のSheather−Jones選択に基づいて、ガウシアンカーネル密度推定量から計算される(22)。
結果
プロトタイプ試料および遺伝子に基づく新しいサブタイプモデルの作製:
乳癌固有のサブタイプと、予後(1、6、9)、遺伝的変化(23)および薬剤応答(24)との間の相互作用を分析した多数の試験がある。ここに記載される方法の目的は、臨床および研究目的のために、固有のサブタイプの分類を標準化および検証することであった。「SigClust」は、クラスター化マイクロアレイデータから5つの固有の乳房サブタイプを客観的に特定した。これらのプロトタイプを次に用いて、最小限の50の遺伝子のセットを誘導した(PAM50)。最後に、最良の分類法を選択してPAM50と一緒に用い、マイクロアレイおよびqRT−PCRのデータから複数の試験セットについてサブタイプを予測した。予後データ(表4)による5つのマイクロアレイ試験のうち、UNCコホートは、他より有意に不良な予後を有した。組み合わせたマイクロアレイ試験セットへのサブタイプ予測は、すべての患者にわたって、内分泌物治療単独を受けた患者で、および全身アジュバント療法を投与されなかったリンパ節陰性患者で、予後有意性を示した(図1)。
プロトタイプ試料および遺伝子に基づく新しいサブタイプモデルの作製:
乳癌固有のサブタイプと、予後(1、6、9)、遺伝的変化(23)および薬剤応答(24)との間の相互作用を分析した多数の試験がある。ここに記載される方法の目的は、臨床および研究目的のために、固有のサブタイプの分類を標準化および検証することであった。「SigClust」は、クラスター化マイクロアレイデータから5つの固有の乳房サブタイプを客観的に特定した。これらのプロトタイプを次に用いて、最小限の50の遺伝子のセットを誘導した(PAM50)。最後に、最良の分類法を選択してPAM50と一緒に用い、マイクロアレイおよびqRT−PCRのデータから複数の試験セットについてサブタイプを予測した。予後データ(表4)による5つのマイクロアレイ試験のうち、UNCコホートは、他より有意に不良な予後を有した。組み合わせたマイクロアレイ試験セットへのサブタイプ予測は、すべての患者にわたって、内分泌物治療単独を受けた患者で、および全身アジュバント療法を投与されなかったリンパ節陰性患者で、予後有意性を示した(図1)。
生存の分子的および臨床上の予測因子を、1451人の患者について、一変量および多変量解析で評価した(表5)。一変量解析では、LumA、LumBおよびHER2富化サブタイプは、すべて有意であることがわかり、臨床変数ER、TおよびNも同様であった。LumAおよびHER2富化サブタイプおよび臨床変数は、多変量解析でも有意であって、最も包括的なモデルはサブタイプおよび臨床情報を含むべきであることを示唆した。この仮説の検定は、組合せモデルが、サブタイプまたは臨床変数単独よりも有意に大きな生存の変動(両試験でp<0.0001)を説明することを明らかにした。
ER陽性およびER陰性の腫瘍にわたる生物学的サブタイプの分布:
組合せマイクロアレイ試験セットのすべてのER陽性腫瘍のうち、73%は管腔(AおよびB)、10%はHER2富化、5%は基底様であった(表6)。逆に、ER陰性腫瘍を考慮した場合、約13%は管腔(AおよびB)、31%はHER2富化、48%は基底様であった。正常様サブタイプと特定された腫瘍は、ER陽性(11%)およびER陰性(8%)腫瘍の間でほとんど等しく分割された。したがって、サブタイプ提示はER状態によって分布が著しく変化したが、すべてのサブタイプがER陽性およびER陰性両方のカテゴリーで提示された。ER陽性症例単独におけるサブタイプの予後プロットは、無再発生存について有意であって、すべての侵襲性乳房疾患を考慮した場合に見られるのと同じ傾向を辿った。
組合せマイクロアレイ試験セットのすべてのER陽性腫瘍のうち、73%は管腔(AおよびB)、10%はHER2富化、5%は基底様であった(表6)。逆に、ER陰性腫瘍を考慮した場合、約13%は管腔(AおよびB)、31%はHER2富化、48%は基底様であった。正常様サブタイプと特定された腫瘍は、ER陽性(11%)およびER陰性(8%)腫瘍の間でほとんど等しく分割された。したがって、サブタイプ提示はER状態によって分布が著しく変化したが、すべてのサブタイプがER陽性およびER陰性両方のカテゴリーで提示された。ER陽性症例単独におけるサブタイプの予後プロットは、無再発生存について有意であって、すべての侵襲性乳房疾患を考慮した場合に見られるのと同じ傾向を辿った。
サブタイプおよびネオアジュバントT/FAC治療への応答:
パクリタキセル、5−フルオロウラシル、アドリアマイシンおよびシクロホスファミド(T/FAC)のレジメンを投与された患者からの腫瘍でマイクロアレイを実施したHessらの試験(19)は、PAM50サブタイプ、臨床マーカーの間の関係の研究、および各々が病理学的完全寛解(pCR)とどのように関係するかについての研究を可能にした。HER2状態については、臨床アッセイでHER2陽性(HER2+clinと呼ばれる、FISH+および/またはIHC3+)であった腫瘍の64%は、HER2富化発現サブタイプに分類され、HER2+clinの残りの大部分は、管腔サブタイプに関連していた。HER2+clinであったがHER2富化発現サブタイプではなかった腫瘍は、HER2+clinおよびHER2富化発現サブタイプであったもの(52%)に対して、低いpCR率(16%)を有した。
パクリタキセル、5−フルオロウラシル、アドリアマイシンおよびシクロホスファミド(T/FAC)のレジメンを投与された患者からの腫瘍でマイクロアレイを実施したHessらの試験(19)は、PAM50サブタイプ、臨床マーカーの間の関係の研究、および各々が病理学的完全寛解(pCR)とどのように関係するかについての研究を可能にした。HER2状態については、臨床アッセイでHER2陽性(HER2+clinと呼ばれる、FISH+および/またはIHC3+)であった腫瘍の64%は、HER2富化発現サブタイプに分類され、HER2+clinの残りの大部分は、管腔サブタイプに関連していた。HER2+clinであったがHER2富化発現サブタイプではなかった腫瘍は、HER2+clinおよびHER2富化発現サブタイプであったもの(52%)に対して、低いpCR率(16%)を有した。
別の関連する臨床上の相違は、「三重陰性」腫瘍(ER−、PgR−およびHER2−)の分類であり、その65%はPAM50によって基底様と呼ばれ、残りはHER2富化(15%)、LumA(4%)、LumB(4%)および正常様(12%)と呼ばれた。三重陰性と評価されなかった基底様腫瘍が、PAM50によって基底様でなかった三重陰性腫瘍(22%pCR、表7)と比較して50%pCRを有していた点で、基底様のPAM50分類は、pCR率に関して臨床三重陰性より優れているようである。
生物学的サブタイプに基づく危険予測:
固有サブタイプおよび臨床変数との関連で予後を予測するために、教師付き危険クラシファイヤーを開発した。再発危険(ROR)モデルを調教し、カットオフを選択するために、NKIマイクロアレイデータセットから未処置のコホートを選択した。組合せマイクロアレイ試験セットを用いて、2つのコックスモデル(1つはサブタイプ単独に基づき、もう1つはサブタイプ、腫瘍サイズおよび結節の状態に基づく)を検証した。臨床変数を除外すると、サブタイプのみのモデルは、低、中、高の危険の再発群への患者の層化において、成績がよかった(c指数=0.65[0.61〜0.69])。しかし、完全モデル(サブタイプ、腫瘍サイズ、結節の状態)は成績がよりよく(c指数=0.70[0.66〜0.74])、実際上、病期が説明を必要とするパラメータである(図2)。図3は、完全モデルを用いて連続線形目盛としてプロットされる、5年時の無再発生存の確率を示す。
固有サブタイプおよび臨床変数との関連で予後を予測するために、教師付き危険クラシファイヤーを開発した。再発危険(ROR)モデルを調教し、カットオフを選択するために、NKIマイクロアレイデータセットから未処置のコホートを選択した。組合せマイクロアレイ試験セットを用いて、2つのコックスモデル(1つはサブタイプ単独に基づき、もう1つはサブタイプ、腫瘍サイズおよび結節の状態に基づく)を検証した。臨床変数を除外すると、サブタイプのみのモデルは、低、中、高の危険の再発群への患者の層化において、成績がよかった(c指数=0.65[0.61〜0.69])。しかし、完全モデル(サブタイプ、腫瘍サイズ、結節の状態)は成績がよりよく(c指数=0.70[0.66〜0.74])、実際上、病期が説明を必要とするパラメータである(図2)。図3は、完全モデルを用いて連続線形目盛としてプロットされる、5年時の無再発生存の確率を示す。
qRT−PCRによって分析したPAM50クラシファイヤーを、1976年〜1995年にアーカイブされた不均一に処置されたコホートに適用した。サブタイプ分類は、マイクロアレイデータで見られるのと同じ生存傾向を辿り、RORスコアは長期再発予測について有意であった。この老齢試料セットは、免疫組織化学(IHC)によって標準の臨床マーカー(ERおよびHER2)についても評価し、遺伝子発現に基づく試験と比較した。遺伝子発現によるESR1およびERBB2の分析は、IHCアッセイと比較して高い感度および特異性を示した。
考察
乳癌の固有サブタイプのための臨床診断試験を提供する目的で、統計的に誘導した遺伝子および試料セットを用いてPAM50クラシファイヤーを開発し、複数のコホートおよびプラットホームにわたって検証した。大きくて多様な試験セットは、集団レベルでの、および標準の分子マーカーに関してアッセイの性能の評価を可能にした。これらの分析からの重要な知見は、臨床的に定義されたER陽性およびER陰性の腫瘍サブセットに固有サブタイプのすべてが存在し、ER陽性患者のサブタイプ指定が予後の有意性を示すことである。したがって、分子サブタイプは、単にER状態に基づく分類の別の方法ではない。
乳癌の固有サブタイプのための臨床診断試験を提供する目的で、統計的に誘導した遺伝子および試料セットを用いてPAM50クラシファイヤーを開発し、複数のコホートおよびプラットホームにわたって検証した。大きくて多様な試験セットは、集団レベルでの、および標準の分子マーカーに関してアッセイの性能の評価を可能にした。これらの分析からの重要な知見は、臨床的に定義されたER陽性およびER陰性の腫瘍サブセットに固有サブタイプのすべてが存在し、ER陽性患者のサブタイプ指定が予後の有意性を示すことである。したがって、分子サブタイプは、単にER状態に基づく分類の別の方法ではない。
個々のサブタイプに関して、他の重要な知見もあった。例えば、HER2富化発現サブタイプに分類される腫瘍のいくつかはHER2+clinではなく、HER2遺伝子増幅によって誘起されないER陰性非基底サブタイプの存在を示唆した。約10%の乳癌が正常様に分類され、ER陽性またはER陰性のいずれかであることができ、中間の予後を有することも見出された。これらの腫瘍は正常な乳房組織でのトレーニングによって予測されたので、正常様クラスは、腫瘍検体中の高率の正常な「汚染」を有することのアーチファクトであり得る。他の可能性は、これらが、増殖遺伝子の高発現を欠く増殖の遅い基底様腫瘍であるか、または低クラウディン腫瘍と呼ばれているおそらく新しいサブタイプであるということである(25)。これらの問題を解決するために、これらの症例の詳細な組織学的、免疫組織化学的およびさらなる遺伝子発現分析が必要である。
サブタイプと標準の分子マーカーとの間の相違は、重要な治療上の意味合いを有する。例えば、ER陽性またはPgR陽性と評価された基底様サブタイプ腫瘍の患者は、内分泌療法によっておそらく治療され、基底様特異的療法(例えば白金含有療法)の開発を目的とするプロトコルに適格でないであろう。Hessらのデータセット(19)のこれらの分析は、LumAサブタイプを有する患者は攻撃的なネオアジュバント療法を投与した場合にpCRを有しなかったが、基底様腫瘍のpCR率は59%であったことを示した。さらに、三重陰性(ER−、PR−、HER2−)表現型が基底様発現サブタイプと同じであるかどうかについての議論があった26。3744個の腫瘍の最近の組織マイクロアレイ試験は、三重陰性症例の予後不良を確認したが、すべてのマーカーを欠く腫瘍が、1つまたは2つの基底様マーカー(すなわち、CK5/6またはHER1)に陽性のものと同じ行動を取らないことも明らかにした(27)。臨床上のERおよびPgR状態とは無関係に基底様診断を下すべきとの考えに一致して、三重陰性であるが基底様でないと特定されたもの(22%)に対して、基底様であるが三重陰性でないと特定された対象(50%)で、T/FACへのより高い治療応答が見出された。このことは、高度の化学療法感受性を有する腫瘍の特定において、基底様サブタイプ指定が、三重陰性定義より優れていることが最終的に証明される可能性を示唆する。
腫瘍は別々の生物学的実体として存在しないので、絶対的なサブタイプ分類を提供することは、いくぶん人工的である。各サブタイプセントロイドまでの距離に基づく低〜中〜高の危険群への腫瘍の分類(すなわちRORモデル)は、この問題を扱う試みであり、有意な生存上の分離を与えた。すべての試験症例を組み合わせた場合、または内分泌療法だけを投与されたコホート、もしくは全身アジュバント治療が無投与のコホートへの層化の後、このことは真であった。ROR予測因子の主要な利点の1つは、再発の危険が非常に低く、アジュバント化学療法が有益である可能性が低いLumA患者の同定である。この関係において、サブタイプに基づくROR予測因子は、ER陽性、リンパ節陰性患者のOncotypeDx再発スコアに類似した情報を提供する(4、5)。しかし、PAM50に基づくアッセイは、ER陰性疾患の患者を含むすべての患者について、再発危険スコアを提供する。
要約すると、このサブタイプ予測因子およびRORクラシファイヤーは、予後診断および治療にとって重要である乳房腫瘍の分子的特徴を効果的に特定する。qRT−PCRアッセイは、アーカイブされた乳房組織を用いて実施することができ、それは、後向き研究および前向き臨床試験のために有用である。
序論および背景データ
この技術は、ネオアジュバント内分泌療法場面での予測的および予後診断のシグナチュアとしての、PAM50に基づく固有サブタイプのクラシファイヤーの使用も含む。第2期および3期のERおよび/またはPgR陽性乳癌を有する閉経後患者は、乳房周囲の組織に侵入した腫瘍の状況で臨床予後を改善するために、すなわち乳房保存手術の使用を促進するために、または手術の可能性を向上させるために、手術の前に内分泌剤で、一般的にはアロマターゼ阻害薬またはタモキシフェンで治療することができる。個々の患者がネオアジュバント内分泌療法に応答するという信頼性を増加させる予測的試験は、かなりの進歩である。
概要
内分泌剤による治療の開始後に収集されるER+乳癌からの試料に適用される場合、PAM50に基づく固有サブタイプおよび増殖加重の危険スコアは、内分泌剤による長期療法を受けるER+乳癌患者のために、ネオアジュバント内分泌療法への応答を予測して、予後を決定するために用いることができる。治療の前に取られた腫瘍試料で調教された予後診断遺伝子発現モデル(PAM50増殖加重危険スコア−本明細書の他に記載される)を、ネオアジュバント内分泌療法の開始後に取られた試料に適用した。遺伝子発現プロフィールと予後との相互作用に関する過去の研究は、処置前試料を調べただけで、これらのモデルを処置後試料に決して適用しなかったので、この手法は特異である。ベースライン試料でのPAM50の固有サブタイプおよび増殖加重予後診断モデルの予後診断および予測特性を、ネオアジュバント内分泌療法の開始から1カ月後に取られた試料に適用された同じモデルと比較する。処置後1カ月試料へのPAM50の固有サブタイプおよび増殖加重再発危険モデルの適用は、ネオアジュバントまたはアジュバント内分泌治療に応答しない攻撃的な腫瘍を正確に特定する。これらの劣る腫瘍は内分泌療法抵抗性の攻撃的な疾患として行動するので、これらの腫瘍患者は、化学療法などの代替ネオアジュバント治療を直ちに優先するべきである。高度の相関がKi67増殖マーカーと増殖加重PAM50の危険スコアとの間で確立され、PAM50の増殖加重危険スコアが予後診断特性を有するとの主張を支持する。しかし、内分泌剤に曝露させた腫瘍から収集された試料にこの分析を適用する場合、これらの予後診断特性は著しく高められる。実際上、決定的な手術の前に内分泌剤を数週間処方することによって、または不応性腫瘍を同定するためにネオアジュバント内分泌治療の早期に腫瘍を再サンプリングすることによって、これを容易に達成することができる。
内分泌剤による治療の開始後に収集されるER+乳癌からの試料に適用される場合、PAM50に基づく固有サブタイプおよび増殖加重の危険スコアは、内分泌剤による長期療法を受けるER+乳癌患者のために、ネオアジュバント内分泌療法への応答を予測して、予後を決定するために用いることができる。治療の前に取られた腫瘍試料で調教された予後診断遺伝子発現モデル(PAM50増殖加重危険スコア−本明細書の他に記載される)を、ネオアジュバント内分泌療法の開始後に取られた試料に適用した。遺伝子発現プロフィールと予後との相互作用に関する過去の研究は、処置前試料を調べただけで、これらのモデルを処置後試料に決して適用しなかったので、この手法は特異である。ベースライン試料でのPAM50の固有サブタイプおよび増殖加重予後診断モデルの予後診断および予測特性を、ネオアジュバント内分泌療法の開始から1カ月後に取られた試料に適用された同じモデルと比較する。処置後1カ月試料へのPAM50の固有サブタイプおよび増殖加重再発危険モデルの適用は、ネオアジュバントまたはアジュバント内分泌治療に応答しない攻撃的な腫瘍を正確に特定する。これらの劣る腫瘍は内分泌療法抵抗性の攻撃的な疾患として行動するので、これらの腫瘍患者は、化学療法などの代替ネオアジュバント治療を直ちに優先するべきである。高度の相関がKi67増殖マーカーと増殖加重PAM50の危険スコアとの間で確立され、PAM50の増殖加重危険スコアが予後診断特性を有するとの主張を支持する。しかし、内分泌剤に曝露させた腫瘍から収集された試料にこの分析を適用する場合、これらの予後診断特性は著しく高められる。実際上、決定的な手術の前に内分泌剤を数週間処方することによって、または不応性腫瘍を同定するためにネオアジュバント内分泌治療の早期に腫瘍を再サンプリングすることによって、これを容易に達成することができる。
方法論:
これらの主張を支持する証拠は、アロマターゼ阻害薬レトロゾールによるネオアジュバント療法のNational Cancer Instituteが支援する第2相試験(NCI助成金番号R01 CA095614)からもたらされる。試験の適格性は、ERおよび/またはPgR陽性の第2期および3期の乳癌を有する閉経後の女性であった。患者は4カ月の療法を受け、その後手術を受けた。凍結腫瘍試料をベースライン、1カ月および手術の時点で得た。試料を凍結切片によって分析し、標準の方法を用いて腫瘍に富む検体からRNAを抽出し、Agilent 1×44Kアレイを用いる遺伝子発現分析にかけた。PAM50クラシファイヤーを調教するために用いたデータセットにデータを正規化し(上記の方法)、2つの読み出し情報を生成した:固有の分類(LumA、LumB、HER2富化、基底様、正常様)および増殖加重PAM50危険スコア。この試験の狙いは、ネオアジュバント内分泌療法の予後を、ベースライン試料および1カ月時に取られた処置後試料の両方に由来する固有の分類および増殖加重危険スコアに関連させることであった。
これらの主張を支持する証拠は、アロマターゼ阻害薬レトロゾールによるネオアジュバント療法のNational Cancer Instituteが支援する第2相試験(NCI助成金番号R01 CA095614)からもたらされる。試験の適格性は、ERおよび/またはPgR陽性の第2期および3期の乳癌を有する閉経後の女性であった。患者は4カ月の療法を受け、その後手術を受けた。凍結腫瘍試料をベースライン、1カ月および手術の時点で得た。試料を凍結切片によって分析し、標準の方法を用いて腫瘍に富む検体からRNAを抽出し、Agilent 1×44Kアレイを用いる遺伝子発現分析にかけた。PAM50クラシファイヤーを調教するために用いたデータセットにデータを正規化し(上記の方法)、2つの読み出し情報を生成した:固有の分類(LumA、LumB、HER2富化、基底様、正常様)および増殖加重PAM50危険スコア。この試験の狙いは、ネオアジュバント内分泌療法の予後を、ベースライン試料および1カ月時に取られた処置後試料の両方に由来する固有の分類および増殖加重危険スコアに関連させることであった。
結果:
PAM50固有サブタイプおよび増殖加重危険スコアは、療法から1カ月後に顕著な変化を示した(表8)。移行のほとんどがLumB群で起こり、大多数がLumAに変化したが、16%は治療にもかかわらずLumBカテゴリーのままであった。対照的に、ほとんどのLumA腫瘍は、療法後もLumAにとどまった。処置後試料においてPAM50増殖加重危険スコアが類似した移行を示し、高危険と分類された腫瘍の大部分(68%)は中または低の危険になったので、これらの移行は、LumB群の増殖クラスターの抑制によるものであった。Ki67免疫組織化学との緊密な相関は、この結論をさらに鮮明に示す。ベースラインKi67値とPAM50増殖加重危険スコアとの相関は高かった(P=2.8×E−8)。同様に、1カ月時Ki67値および1カ月時PAM50増殖スコアも、緊密に相関していた(P=3.8E−10)。しかし、ベースラインPAM50増殖加重危険スコアサブタイプは試験終了時Ki67値と非常に弱い相関を示しただけである(P=0.04)が、1カ月時PAM50増殖加重危険スコアと試験終了時Ki67値との間には緊密な相関があり、そのほとんどは4〜6カ月後の手術時に得られた(P=6.8E−11)。この最後の観察は、最終手術試料が低い増殖速度などの好ましいバイオマーカー特徴を有するかどうか予測するために、早期の処置後PAM50に基づく試験を用いることができるとの主張を強く支持する。
PAM50固有サブタイプおよび増殖加重危険スコアは、療法から1カ月後に顕著な変化を示した(表8)。移行のほとんどがLumB群で起こり、大多数がLumAに変化したが、16%は治療にもかかわらずLumBカテゴリーのままであった。対照的に、ほとんどのLumA腫瘍は、療法後もLumAにとどまった。処置後試料においてPAM50増殖加重危険スコアが類似した移行を示し、高危険と分類された腫瘍の大部分(68%)は中または低の危険になったので、これらの移行は、LumB群の増殖クラスターの抑制によるものであった。Ki67免疫組織化学との緊密な相関は、この結論をさらに鮮明に示す。ベースラインKi67値とPAM50増殖加重危険スコアとの相関は高かった(P=2.8×E−8)。同様に、1カ月時Ki67値および1カ月時PAM50増殖スコアも、緊密に相関していた(P=3.8E−10)。しかし、ベースラインPAM50増殖加重危険スコアサブタイプは試験終了時Ki67値と非常に弱い相関を示しただけである(P=0.04)が、1カ月時PAM50増殖加重危険スコアと試験終了時Ki67値との間には緊密な相関があり、そのほとんどは4〜6カ月後の手術時に得られた(P=6.8E−11)。この最後の観察は、最終手術試料が低い増殖速度などの好ましいバイオマーカー特徴を有するかどうか予測するために、早期の処置後PAM50に基づく試験を用いることができるとの主張を強く支持する。
これらの内分泌療法によって誘導された、固有の乳癌サブタイプおよび危険スコアの変化に関連する臨床上の相関を決定するために、以下の4つのエンドポイントを調べた:臨床上の応答(RECIST基準)、病理学的Tサイズ(T1対より高いもの−治療による病理学的ダウンステージングの証拠として)、二分Ki67値(1以下のKi67自然対数値を示す腫瘍は、好ましいプロフィールを示しているとみなす)、および再発事象。ベースラインサブタイプまたは危険スコアは、これらのエンドポイントのいずれかを予測するための納得のいく能力を示さず、それは、再発に関して、この試験の小さい試料サイズの作用であろう(表9)。対照的に、また小さい試料サイズにもかかわらず、1カ月時のPAM50固有サブタイプ(表10)は、臨床上の応答(P=0.01)、好ましい処置終了時Ki67値(P=0.0003)および再発(0.009)と統計的に有意な関係を示した。これらの強い関係は、処置後検体で「非管腔」または管腔Bと指定された腫瘍に関連する極めて劣る予後によって誘起された。PAM50増殖加重危険スコアは、類似した特性を有していた。ベースラインのPAM50増殖加重危険スコアは、あまり効果的にはネオアジュバントまたは長期予後を予測しなかった(表11)。しかし、1カ月時に高危険と指定された腫瘍は、調べた4つのエンドポイントのすべてにおいて、予後不良と有意な相関、すなわち劣る臨床応答(P=0.02)、低い病理学的ダウンステージング(p=0.02)、好ましからぬ処置終了後Ki67値(P=0.0001)および再発(p=0.001)を示した(表12)。
したがって、内分泌剤で手術前処置を受けた一次ER+乳癌から収集された腫瘍試料への、PAM50に基づく固有サブタイプおよび危険スコアの適用は、以下の目的のために用いることができる:
1)ネオアジュバント内分泌療法に対する不応答の予測
2)その後アジュバント内分泌治療を受けるER+乳癌を有する患者の予後の判定。
1)ネオアジュバント内分泌療法に対する不応答の予測
2)その後アジュバント内分泌治療を受けるER+乳癌を有する患者の予後の判定。
正常様クラスをモデルから除いたこと以外は、実施例1に記載の試料で再発危険分析を実施した。正常様クラスは、乳房縮小術または肉眼的に無関係な組織からの真の「正常体」を用いて表した。したがって、このクラスはすべての予後分析から除かれ、この分類は品質管理測定とみなされる。下に記載されない方法は、実施例1に記載の方法と同一である。
方法
臨床および分子サブタイプデータを用いる予後診断および予測モデル:
無処置患者およびネオアジュバント化学療法を投与された患者で固有のサブタイプ(LumA、LumB、HER2富化、および基底様)の有意性を決定するために、一変量および多変量解析を用いた。予後診断のために、再発(すなわち、任意の事象)までの時間をエンドポイントとして、サブタイプを標準の臨床変数(T、N、ER状態および組織学的段階)と比較した。病理学的病期分類が適用不可であるので、ネオアジュバント設定での予測のために、サブタイプを段階および分子マーカー(ER、プロゲステロン受容体(PR)、HER2)と比較した。入手可能な臨床データ、サブタイプデータ、ならびに臨床および分子変数の組合せの比較されたモデルに対して尤度比検定を実施した。カテゴリーによる生存分析は、ログランク検定を用いて実施し、カプラン−マイヤープロットで視覚化した。
臨床および分子サブタイプデータを用いる予後診断および予測モデル:
無処置患者およびネオアジュバント化学療法を投与された患者で固有のサブタイプ(LumA、LumB、HER2富化、および基底様)の有意性を決定するために、一変量および多変量解析を用いた。予後診断のために、再発(すなわち、任意の事象)までの時間をエンドポイントとして、サブタイプを標準の臨床変数(T、N、ER状態および組織学的段階)と比較した。病理学的病期分類が適用不可であるので、ネオアジュバント設定での予測のために、サブタイプを段階および分子マーカー(ER、プロゲステロン受容体(PR)、HER2)と比較した。入手可能な臨床データ、サブタイプデータ、ならびに臨床および分子変数の組合せの比較されたモデルに対して尤度比検定を実施した。カテゴリーによる生存分析は、ログランク検定を用いて実施し、カプラン−マイヤープロットで視覚化した。
臨床および分子データによる危険モデルの開発
van de Vijverら(2002年)のコホートのリンパ節陰性未処置サブセットへのリッジ回帰適合を用いて、サブタイプ危険モデルを多変量コックスモデルで調教した。サブタイプ単独(1)(ROR−S)との相関を用いて、またはサブタイプ相関を腫瘍サイズ(2)(ROR−C)とともに用いて、RORスコアを各試験症例に割り当てた:
(1)ROR−S=0.05*基底+0.12*Her2+−0.34*LumA +0.023*LumB
(2)ROR−C=0.05*基底+0.11*Her2+−0.23*LumA+0.09*LumB+0.17*T
コックスモデルからの係数の合計は、各患者のRORスコアである。特定の危険群へ試料を分類するために、実施例1に記載のトレーニングセットから閾値を選択した。RORスコアと無再発生存との間の関係を特徴づけるために、サイザー分析を実施した。RORスコアの95%CIは二項CIのローカルバージョンであり、ローカル試料サイズは、ウインド幅のSheather−Jones選択に基づいて、ガウシアンカーネル密度推定量から計算される。
van de Vijverら(2002年)のコホートのリンパ節陰性未処置サブセットへのリッジ回帰適合を用いて、サブタイプ危険モデルを多変量コックスモデルで調教した。サブタイプ単独(1)(ROR−S)との相関を用いて、またはサブタイプ相関を腫瘍サイズ(2)(ROR−C)とともに用いて、RORスコアを各試験症例に割り当てた:
(1)ROR−S=0.05*基底+0.12*Her2+−0.34*LumA +0.023*LumB
(2)ROR−C=0.05*基底+0.11*Her2+−0.23*LumA+0.09*LumB+0.17*T
コックスモデルからの係数の合計は、各患者のRORスコアである。特定の危険群へ試料を分類するために、実施例1に記載のトレーニングセットから閾値を選択した。RORスコアと無再発生存との間の関係を特徴づけるために、サイザー分析を実施した。RORスコアの95%CIは二項CIのローカルバージョンであり、ローカル試料サイズは、ウインド幅のSheather−Jones選択に基づいて、ガウシアンカーネル密度推定量から計算される。
再発予測モデルの比較
再発の予測のために4つのモデルを比較した:(1)臨床変数単独(腫瘍サイズ、段階およびER状態)のモデル、(2)ROR−S、(3)ROR−C、および(4)サブタイプ、腫瘍サイズおよび段階を組み合わせたモデル。様々なモデルの強さを比較するために、C指数を選択した。各モデルについて、2/3のトレーニングセットおよび1/3の試験セットへの、未処置コホートの100個の無作為化からC指数を推定した。各試験セットについてC指数を計算して各モデルの推定を生成し、2つの試料のt検定を用いて、C指数推定値をモデル全体で比較した。
再発の予測のために4つのモデルを比較した:(1)臨床変数単独(腫瘍サイズ、段階およびER状態)のモデル、(2)ROR−S、(3)ROR−C、および(4)サブタイプ、腫瘍サイズおよび段階を組み合わせたモデル。様々なモデルの強さを比較するために、C指数を選択した。各モデルについて、2/3のトレーニングセットおよび1/3の試験セットへの、未処置コホートの100個の無作為化からC指数を推定した。各試験セットについてC指数を計算して各モデルの推定を生成し、2つの試料のt検定を用いて、C指数推定値をモデル全体で比較した。
結果
リンパ節陰性乳癌における予後のための再発危険モデル
固有のサブタイプを単独で、および臨床変数と一緒に用いてコックスモデルを検定した。表13は、無処置患者の独立コホートにおけるこれらのモデルの多変数解析を示す(実施例1を参照)。モデルAでは、サブタイプ、腫瘍サイズ(T1以上)および組織学的段階が、RORの有意な因子であることが見出された。大多数の基底様腫瘍(95.9%)は、中または高の段階であることが見出され、したがって、段階のない分析であるモデルBでは、基底様が有意になる。モデルCは、リンパ節陰性集団でサブタイプの有意性を示す。サブタイプおよび臨床変数を含んでいたすべてのモデルは、臨床単独(P<0.0001)またはサブタイプ単独(P<0.0001)よりも有意に良好であった。固有サブタイプおよび臨床変数との関連で予後を予測するために、再発クラシファイヤーを調教した。RORモデルを調教し、カットオフを選択するために、van de Vijverら(2002)のマイクロアレイデータセットからリンパ節陰性の無全身治療コホート(n=141)を選択した。有効な臨床変数だけのモデルと比較して、サブタイプ(ROR−S)による生成で明白な改善があった(Parkerら(2009年)J Clin Oncol 27巻(8号):1160〜1167頁を参照)。臨床変数およびサブタイプの組合せ(ROR−C)も、個々の予測因子のいずれかよりも有意に改善されている。しかし、段階に関する情報は、組合せモデルでのC指数を有意に改善せず、段階の予後診断値が、固有サブタイプモデルによって提供される情報によって取って代わられたことを示した。未処置のリンパ節陰性患者の予後診断試験セットでRORのためにROR−Cを用いる場合、LumA群だけが低危険患者を含み、低、中、高の危険の3クラス識別が予後診断能を有した。また、ROR−Cスコアは、5年後の再発の確率と線形関係を有する。
リンパ節陰性乳癌における予後のための再発危険モデル
固有のサブタイプを単独で、および臨床変数と一緒に用いてコックスモデルを検定した。表13は、無処置患者の独立コホートにおけるこれらのモデルの多変数解析を示す(実施例1を参照)。モデルAでは、サブタイプ、腫瘍サイズ(T1以上)および組織学的段階が、RORの有意な因子であることが見出された。大多数の基底様腫瘍(95.9%)は、中または高の段階であることが見出され、したがって、段階のない分析であるモデルBでは、基底様が有意になる。モデルCは、リンパ節陰性集団でサブタイプの有意性を示す。サブタイプおよび臨床変数を含んでいたすべてのモデルは、臨床単独(P<0.0001)またはサブタイプ単独(P<0.0001)よりも有意に良好であった。固有サブタイプおよび臨床変数との関連で予後を予測するために、再発クラシファイヤーを調教した。RORモデルを調教し、カットオフを選択するために、van de Vijverら(2002)のマイクロアレイデータセットからリンパ節陰性の無全身治療コホート(n=141)を選択した。有効な臨床変数だけのモデルと比較して、サブタイプ(ROR−S)による生成で明白な改善があった(Parkerら(2009年)J Clin Oncol 27巻(8号):1160〜1167頁を参照)。臨床変数およびサブタイプの組合せ(ROR−C)も、個々の予測因子のいずれかよりも有意に改善されている。しかし、段階に関する情報は、組合せモデルでのC指数を有意に改善せず、段階の予後診断値が、固有サブタイプモデルによって提供される情報によって取って代わられたことを示した。未処置のリンパ節陰性患者の予後診断試験セットでRORのためにROR−Cを用いる場合、LumA群だけが低危険患者を含み、低、中、高の危険の3クラス識別が予後診断能を有した。また、ROR−Cスコアは、5年後の再発の確率と線形関係を有する。
T/FACで治療した患者からの腫瘍に対してマイクロアレイを実施したHessら(2006年)の試験は、サブタイプと臨床マーカーとの間の関係、および各々がどのようにpCR>に関係するかの研究を可能にした。表14は、臨床分子マーカー(ER、PR、HER2)と一緒の、および組織学的段階と一緒の(モデルA)または一緒でない(モデルB)サブタイプの多変数解析を示す。この試験との関連で唯一の有意変数は、固有サブタイプであった。pCRを予測するためにROR−Sモデルを用いた場合、化学療法に不応答なものの特定について、94%感受性および97%陰性予測値が見出された。高危険スコアとpCRのより高い確率との間の関係は、無痛性ER陽性腫瘍(LumA)が化学療法により不応答性であるという結論と一貫している。しかし、予後診断のためのRORとは異なり、ROR対pCRの確率についてプラトーに到達するようであり、最も高い危険の腫瘍の間でのかなりの化学療法耐性の存在を確認する。
この試験では、エストロゲン受容体陽性であって彼らの唯一のアジュバント全身療法としてタモキシフェンで治療された、一般的な臨床上重要な女性群でPAM50クラシファイヤーの予後診断値を評価するために、qRT−PCRおよびそれ以前に確立された切点(実施例1を参照)を用いた。ほとんどの過去の報告とは異なり、この均一に治療された試験コホートは、大きな割合のリンパ節陽性患者を含む。入手可能な詳細な長期追跡調査は、すべての標準の臨床病理学的危険因子と比較して、無再発生存だけでなく、乳癌疾患特異的死の危険の評価も可能にする。
方法
患者:
試験コホートは、1986年〜1992年にブリティッシュコロンビア州で新たに診断された侵襲性の乳癌女性患者に由来する。組織は州周辺の様々な病院で摘出され、冷凍され、バンクーバー病院の中央エストロゲン受容体(ER)研究室に運ばれた。受領した材料の組織学的参照としてホルマリン固定およびパラフィン包埋された部分を、この試験で用いる。検体に関連付けられた臨床情報には、年齢、組織学、段階、腫瘍サイズ、関与した腋窩リンパ節の数、リンパまたは血管への侵入、DCC法によるER状態、局所および最初のアジュバント全身療法の種類、診断日、最初の局所、領域または遠隔の再発、死亡日および死因が含まれる。この患者コホートの特性は、予後診断モデルADJUVANT!を検証した集団に基づく試験[Olivotto 2005]でそれ以前に詳細に記載されており、ER[Cheang 2006]およびHER2[Chia 2008]発現について特徴づけられた組織マイクロアレイを組み立てるために、同じソースブロックが用いられた。この試験のために、免疫組織化学によるER陽性腫瘍を有し、彼らの唯一のアジュバント全身療法としてタモキシフェンを投与された患者を選定した。これらの患者が彼らの治療を投与された間、リンパ血管性侵入などの、いくらか高い危険の特徴が存在したER陽性腫瘍を有する閉経後の女性のために、州のガイドラインはアジュバントタモキシフェンを推奨した。高い危険の特徴のない類似した患者は、アジュバント全身療法なしで主に治療した。ほとんどの場合、化学療法は閉経前の女性だけに提供された。
患者:
試験コホートは、1986年〜1992年にブリティッシュコロンビア州で新たに診断された侵襲性の乳癌女性患者に由来する。組織は州周辺の様々な病院で摘出され、冷凍され、バンクーバー病院の中央エストロゲン受容体(ER)研究室に運ばれた。受領した材料の組織学的参照としてホルマリン固定およびパラフィン包埋された部分を、この試験で用いる。検体に関連付けられた臨床情報には、年齢、組織学、段階、腫瘍サイズ、関与した腋窩リンパ節の数、リンパまたは血管への侵入、DCC法によるER状態、局所および最初のアジュバント全身療法の種類、診断日、最初の局所、領域または遠隔の再発、死亡日および死因が含まれる。この患者コホートの特性は、予後診断モデルADJUVANT!を検証した集団に基づく試験[Olivotto 2005]でそれ以前に詳細に記載されており、ER[Cheang 2006]およびHER2[Chia 2008]発現について特徴づけられた組織マイクロアレイを組み立てるために、同じソースブロックが用いられた。この試験のために、免疫組織化学によるER陽性腫瘍を有し、彼らの唯一のアジュバント全身療法としてタモキシフェンを投与された患者を選定した。これらの患者が彼らの治療を投与された間、リンパ血管性侵入などの、いくらか高い危険の特徴が存在したER陽性腫瘍を有する閉経後の女性のために、州のガイドラインはアジュバントタモキシフェンを推奨した。高い危険の特徴のない類似した患者は、アジュバント全身療法なしで主に治療した。ほとんどの場合、化学療法は閉経前の女性だけに提供された。
RNA調製:
RNAは、病理学者によって指導された組織コアから単離した。簡潔には、各ブロックからのH&E切片が、病理学者によって精査された。代表的な侵襲性乳癌を含む領域を選択し、ソースブロックを囲んだ。1.0mmパンチ針を用いて、少なくとも2つの腫瘍コアを円領域から抽出した。高純度RNAパラフィンキット(Roche Applied
Science、Indianapolis IN)を用いてRNAを回収し、Turbo Dnase(Ambion、Austin TX)でDNAを除去し、ND−1000分光光度計(NanoDrop Technologies、Rockland DE)を用いてRNA収量を評価した。
RNAは、病理学者によって指導された組織コアから単離した。簡潔には、各ブロックからのH&E切片が、病理学者によって精査された。代表的な侵襲性乳癌を含む領域を選択し、ソースブロックを囲んだ。1.0mmパンチ針を用いて、少なくとも2つの腫瘍コアを円領域から抽出した。高純度RNAパラフィンキット(Roche Applied
Science、Indianapolis IN)を用いてRNAを回収し、Turbo Dnase(Ambion、Austin TX)でDNAを除去し、ND−1000分光光度計(NanoDrop Technologies、Rockland DE)を用いてRNA収量を評価した。
qRT−PCR:
ランダム六量体および遺伝子特異的プライマーの混合物を用いてcDNA合成を実施し、qPCRは前述の通り、Roche LightCycler480器具で実施した[Mullins 2007]。各384ウェルプレートは、試料を2反復で(反応につき2.5ngのcDNA)、キャリブレータを3反復で(反応につき10ngのcDNA)含んだ。参照対照(ACTB、PSMC4、RPLP0、MRPL19またはSF3A1)のいずれかが失敗した場合、腫瘍試料は品質不十分とみなされた。PCRは、73%の例で全50の識別遺伝子について、別の15%の例では50のうちの49について技術的に成功した。欠落遺伝子情報に対するPAM50アッセイ結果の寛容性を評価するために、増大する数の遺伝子のランダムな擬似除去に続いて、ROR−C値をデータで評価した。1つの遺伝子の減少は、危険スコアの0〜2単位の変化をもたらし、これは、10年後の疾患特異的生存の1%の増加/減少に対応した。
ランダム六量体および遺伝子特異的プライマーの混合物を用いてcDNA合成を実施し、qPCRは前述の通り、Roche LightCycler480器具で実施した[Mullins 2007]。各384ウェルプレートは、試料を2反復で(反応につき2.5ngのcDNA)、キャリブレータを3反復で(反応につき10ngのcDNA)含んだ。参照対照(ACTB、PSMC4、RPLP0、MRPL19またはSF3A1)のいずれかが失敗した場合、腫瘍試料は品質不十分とみなされた。PCRは、73%の例で全50の識別遺伝子について、別の15%の例では50のうちの49について技術的に成功した。欠落遺伝子情報に対するPAM50アッセイ結果の寛容性を評価するために、増大する数の遺伝子のランダムな擬似除去に続いて、ROR−C値をデータで評価した。1つの遺伝子の減少は、危険スコアの0〜2単位の変化をもたらし、これは、10年後の疾患特異的生存の1%の増加/減少に対応した。
臨床試料への生物学的サブタイプの割り当て:
管腔A、管腔B、HER2富化、基底様および正常様サブタイプに対応する遺伝子発現セントロイドは、実施例1およびParkerら(参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、2007 J. Clin. Oncol. 27巻(8号):1160〜7頁)に記載の固有の50遺伝子パネルを用いて構築した。検体は、スピアマンの順位相関によって計算された最近傍セントロイド距離に基づいて、予後データに盲検化された試験担当医によって固有のサブタイプに割り当てられた。
管腔A、管腔B、HER2富化、基底様および正常様サブタイプに対応する遺伝子発現セントロイドは、実施例1およびParkerら(参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、2007 J. Clin. Oncol. 27巻(8号):1160〜7頁)に記載の固有の50遺伝子パネルを用いて構築した。検体は、スピアマンの順位相関によって計算された最近傍セントロイド距離に基づいて、予後データに盲検化された試験担当医によって固有のサブタイプに割り当てられた。
臨床予後とのPAM50サブタイプの関係:
統計分析は、SPSS v16.0およびR v2.8.0を用いて行った。乳癌の遠隔無再発性および乳癌疾患特異的生存に対する腫瘍サブタイプの一変量解析は、カプラン−マイヤー解析によって実施し、有意性のためにはログランク検定を用いた。多変量解析は、腫瘍サイズ、結節の状態(検査した全体に対する陽性リンパ節の割合)、組織学的段階、患者の年齢およびHER2状態の標準の臨床パラメータに対して実施した(組織マイクロアレイに組み立てられ、臨床同等プロトコルを用いる免疫染色およびFISH分析にかけた、同じソースブロックからの隣接したコアに基づく[Chia 2008])。qPCRによって割り当てられた乳癌サブタイプの調整危険率を推定するために、コックス回帰モデル[Cox 1984]を構築した[Truong 2005]。すべての共変量のための情報を有する場合だけが、解析に含まれた。比例危険仮説を評価するために、加重Schoenfeld残差の平滑化プロットを用いた[Grambsch 1994]。
統計分析は、SPSS v16.0およびR v2.8.0を用いて行った。乳癌の遠隔無再発性および乳癌疾患特異的生存に対する腫瘍サブタイプの一変量解析は、カプラン−マイヤー解析によって実施し、有意性のためにはログランク検定を用いた。多変量解析は、腫瘍サイズ、結節の状態(検査した全体に対する陽性リンパ節の割合)、組織学的段階、患者の年齢およびHER2状態の標準の臨床パラメータに対して実施した(組織マイクロアレイに組み立てられ、臨床同等プロトコルを用いる免疫染色およびFISH分析にかけた、同じソースブロックからの隣接したコアに基づく[Chia 2008])。qPCRによって割り当てられた乳癌サブタイプの調整危険率を推定するために、コックス回帰モデル[Cox 1984]を構築した[Truong 2005]。すべての共変量のための情報を有する場合だけが、解析に含まれた。比例危険仮説を評価するために、加重Schoenfeld残差の平滑化プロットを用いた[Grambsch 1994]。
臨床上の予後との再発危険(ROR)スコアとの関係:
RORスコアアルゴリズム(管腔A、管腔B、HER2富化、および基底様サブタイプとの試料の相関を組み込むROR−S;この情報に加えて腫瘍サイズを組み込むROR−C)を、マイクロアレイによってプロファイリングされた3つの乳癌系およびqPCRによってプロファイリングされた1つの乳癌系で調教し、検証した。管腔A患者が高危険カテゴリーに分類されず、基底様患者が低危険カテゴリーに分類されないように、危険層化カットポイントをトレーニングセットに割り当てた。カプラン−マイヤーおよびコックス回帰分析を、上記のように行った。
RORスコアアルゴリズム(管腔A、管腔B、HER2富化、および基底様サブタイプとの試料の相関を組み込むROR−S;この情報に加えて腫瘍サイズを組み込むROR−C)を、マイクロアレイによってプロファイリングされた3つの乳癌系およびqPCRによってプロファイリングされた1つの乳癌系で調教し、検証した。管腔A患者が高危険カテゴリーに分類されず、基底様患者が低危険カテゴリーに分類されないように、危険層化カットポイントをトレーニングセットに割り当てた。カプラン−マイヤーおよびコックス回帰分析を、上記のように行った。
結果
15〜20年前にホルマリン固定およびパラフィン包埋された手術検体を元に、991の症例について侵襲性の乳癌の病理学者によって特定された領域から腫瘍コアを抽出した。RNA抽出の後、815個の試料は、少なくとも25ng/μLの濃度の少なくとも1.2μgの総RNAを与え、PCR分析に進行した。鋳型は、806個でqRT−PCRについて技術的に十分な品質であった(内部のハウスキーパー遺伝子対照に基づく)。これらの症例の間で、合計711個の検体が、PAM50識別遺伝子のうちの少なくとも49個の高品質qRT−PCR定量データを与え、以降の臨床および生存分析に含まれた。これらの711人の患者の臨床特性を、表15に示す。
15〜20年前にホルマリン固定およびパラフィン包埋された手術検体を元に、991の症例について侵襲性の乳癌の病理学者によって特定された領域から腫瘍コアを抽出した。RNA抽出の後、815個の試料は、少なくとも25ng/μLの濃度の少なくとも1.2μgの総RNAを与え、PCR分析に進行した。鋳型は、806個でqRT−PCRについて技術的に十分な品質であった(内部のハウスキーパー遺伝子対照に基づく)。これらの症例の間で、合計711個の検体が、PAM50識別遺伝子のうちの少なくとも49個の高品質qRT−PCR定量データを与え、以降の臨床および生存分析に含まれた。これらの711人の患者の臨床特性を、表15に示す。
固有の生物学的サブタイプは、カプラン−マイヤー分析によって、高い予後診断能を有した(図4)。この試験のための試料獲得時のブリティッシュコロンビア州の集団では、臨床的に低い危険プロフィールを有する多くの患者は、アジュバント全身療法を投与されなかった[Olivotto 2005]。対照的に、この試験の対象であるアジュバントタモキシフェンを投与された患者は、より高い臨床危険群を含み、全体の10年遠隔無再発生存が62%、乳癌疾患特異的生存率が72%であった。PAM50アッセイによって管腔Aプロフィールを有すると判定された患者は、管腔B、HER2富化または基底様腫瘍よりも有意に良好な予後(10年無再発生存74%、疾患特異的生存=83%)を有した。
この試験のすべての症例は、中央評価免疫組織化学[Cheang 2006]によってエストロゲン受容体陽性であって、98.7%は、臨床デキストラン−チャコールコーティング生化学アッセイによっても陽性であった。これにもかかわらず、PAM50遺伝子の発現の公開データセットを調べた場合に以前に観察されたように、PAM50のqPCRパネルは、症例の10%を非管腔サブタイプに、その大部分はHER2富化に割り当てた(実施例2)。
彼女らの唯一のアジュバント全身療法として一様にタモキシフェンで治療された、臨床的にエストロゲン受容体陽性の女性のこのコホートについては、多変量コックスモデルを構築して、患者の年齢ならびに腫瘍サイズ、結節の状態、組織学的段階およびHER2発現(表16)の標準の臨床病理学的因子に対してPAM50サブタイプの独立値を検定した。固有の生物学的サブタイプは、結節の状態および腫瘍サイズと同様に多変量モデルで有意のままであったが、このコホートの一変量解析で有意である段階および臨床上のHER2状態は、PAM50結果を組み込んでいた多変量モデルでは、無再発または疾患特異的生存について有意な独立予後診断情報に寄与しなかった。
図6に示すように、ROR−Cアルゴリズムは、リンパ節陰性患者の間で予後診断能が非常に高いだけでなく、リンパ節陽性患者の間で疾患特異的生存のさらに広い差も明らかにする。本アルゴリズムは、リンパ節陽性であるにもかかわらず、低危険と分類される臨床的ER陽性患者(化学療法ではなくアジュバントタモキシフェンで治療された)の16%を特定し、これらの女性は89%の10年後疾患特異的生存率を有する。
連続変数として、ROR−Cは、陽性リンパ節の割合との有意な相互作用、およびリンパ節段階との境界線上の有意な相互作用を有する(表17)。リンパ節段階は、中〜高のROR−C値(>23.5)を有する患者の間で有意な予測因子であるが、低いROR−Cスコアを有する患者の間では、予後は結節の状態に関係なく良好である(図7および図8)。
乳癌患者のコホートで、Adjuvant!モデルによって予測された予後とRORモデルによって予測された予後との比較を行った。このコホートは、1986年〜1992年に、侵襲性のエストロゲン受容体陽性乳癌と診断された806人の患者からなる。すべての患者は、一次手術およびタモキシフェン単独でアジュバント全身療法を受けた。これらの患者のすべては、化学療法で治療されなかった。患者の年齢、腫瘍サイズ、組織学的段階、リンパ血管侵襲および陽性リンパ節の数の標準の臨床病理学的特徴を用いて10年後の乳癌特異的生存(BCSS)の確率を計算するために、Adjuvant予後診断モデルを用いた。すべての患者はER陽性であって、乳癌死の危険はアジュバントタモキシフェン療法について調整された。
806人の患者のうち、748人はBCSSのAdjuvant推定を得るために十分な臨床病理学的データを有した。残りの58人の患者は、腫瘍サイズまたはリンパ節のデータが欠落していた。平均Adjuvant予測BCSSは、73.7%であった。これは、73.2%のBCSS観察値に対応する。次に、10年後のAdjuvant予測BCSSに基づいてコホートをサブグループに分割した(表20)。
中危険群では、ROR−Sは、低危険対より高い危険の患者を特定する能力に優れる。80〜90%群(図10A)および70〜80%群(図10B)の両方において、ROR−Sは10年BCSS>90%のサブグループを特定する。ROR−Sは化学療法なしでうまくいく高危険患者を伝統的に特定するので、これは重要な結果である。
Adjuvant!によって特定される非常に高い危険のサブグループ(予測BCSS<70%)でも、ROR−Sは、異なる予後診断群を特定することがまだできる(図10C)。
考察
過去の試験は、いくつかの遺伝子発現マイクロアレイプラットホームでプロファイリングされた、複数の異なる機関からの乳癌コホートにおいて、管腔A、管腔B、HER2富化および基底様サブタイプの特徴を示す固有の生物学的シグナチュアが存在し、予後診断の有意性を有することを証明した[Calza 2006][Kapp 2006][Hu 2006][Fan 2006]。標準のホルマリン固定パラフィン包埋病理検体でこれらのサブタイプを特定するために、50の遺伝子のパネルに基づいてこれらのサブタイプを特定する、定量的逆転写酵素PCR試験を開発した[Mullins 2007]。
過去の試験は、いくつかの遺伝子発現マイクロアレイプラットホームでプロファイリングされた、複数の異なる機関からの乳癌コホートにおいて、管腔A、管腔B、HER2富化および基底様サブタイプの特徴を示す固有の生物学的シグナチュアが存在し、予後診断の有意性を有することを証明した[Calza 2006][Kapp 2006][Hu 2006][Fan 2006]。標準のホルマリン固定パラフィン包埋病理検体でこれらのサブタイプを特定するために、50の遺伝子のパネルに基づいてこれらのサブタイプを特定する、定量的逆転写酵素PCR試験を開発した[Mullins 2007]。
ここで報告される分析は、長期の詳細な追跡調査を有する一連の比較的古い(15〜20年)パラフィンブロックに適用された、qPCRに基づく試験から専らなり、無再発生存だけでなく、乳癌疾患特異的生存の分析を可能にする。本試験は、彼女らの唯一のアジュバント治療としてホルモン療法(タモキシフェン)を投与された、特に臨床上重要で現代的関連性のある群である、エストロゲン受容体陽性乳癌の女性からなる。エストロゲン受容体およびHER2状態を中心に判定した。これらの女性の70%は、受診時リンパ節陽性であって、現在の慣行では、アジュバント化学療法の投与が通常推奨されるであろう。PCRによって判定されるPAM50サブタイプ割り当ては、これらの女性で高い予後診断能を有する。サブタイプは多変量解析で有意のままであるが、段階および臨床上のHER2状態はそうではない。通常使用される無再発生存の代わりのエンドポイントを用いる知見は、すべてが乳癌疾患特異的生存に通用する。
このコホートからの患者は20年を超える前に治療されたが、この研究からの知見は、中程度の再発危険を有する乳癌患者の治療に今でも重要である。そのような患者はアジュバントホルモン療法から有意な利益を導くことができるが、化学療法のさらなる追加は適度の効果(10年無再発生存の2〜5%の改善)を有することができる。アジュバント化学療法の続行の決定は、患者および担当腫瘍学者が下す個々の決定であるが、向上した予後判定は治療上の意思決定を容易にする。
再発危険スコアを開発し、無再発生存のエンドポイントに対して、アジュバント全身療法を投与されなかったリンパ節陰性患者からのマイクロアレイデータ(実施例2)で検証した。このアルゴリズムは、133人の患者の公開されたネオアジュバントT/FAC治験データセットで病理的完全寛解を予測すること、およびそのqPCRフォーマットで、不均一に治療された279人の乳癌女性のコホートで無再発生存を予測することが示されている。パラフィンブロック検体からqPCRによって生成されたRORスコアは、リンパ節陰性およびリンパ節陽性の両サブセットで、タモキシフェンで治療されたエストロゲン陽性女性でも予後診断能がある。ROR−Cは、結節の状態でさえ予測因子でなく、したがって、例えば、第3世代化学療法治療計画および胸壁放射線を含む、リンパ節陽性患者のために通常留保される治療手法を必要としない可能性があるであろう低危険患者群を特定する。
PAM50クラシファイヤーを一次乳癌の大きなセットからのDNAマイクロアレイデータに適用した場合の12%と比較して、PCRアッセイを用いると、極めて少ない症例(1.3%)が正常様に分類される。DNAマイクロアレイ分析は、腫瘍に富ませるための肉眼的解剖にもかかわらずかなりの量の正常乳房組織をまだ含む可能性のある、ホモジナイズした腫瘍検体を利用する。対照的に、PAM50のqPCRアッセイは、ソースブロック中の純粋な腫瘍の代表的領域の直接顕微鏡的同定に基づいて、病理学者の指導による組織コアで実施される。この差は、パラフィンブロックに適用されたPAM50のqPCR法を用いて得られた、正常様プロフィールのずっと低い頻度を説明するようである。隣接組織から抽出される組織マイクロアレイコアで表される組織像の精査は、9つのうちの8つの正常様症例で正常様プロフィールの原因である不十分な腫瘍提示と一貫している。
PAM50クラシファイヤーを有する公開データセットの調査に基づいて前に指摘したように、このアッセイは、免疫組織化学的アッセイおよびリガンド結合アッセイの両方によって腫瘍が陽性である場合でさえ、臨床的ER陽性の女性の間でER陰性の生物学的サブタイプを特定する。優に10%の症例が非管腔のサブタイプに再割り当てされ、これらのタモキシフェンで治療された女性は予後不良であって、ホルモン非依存性の生物学的現実に矛盾しない。ERおよびHER2状態の臨床上の測定は、それ自体で乳癌患者を予後診断および予測サブグループに層化することができる[Hayes 2007]。しかも、乳癌の予後診断および治療を割り当てるために単一の遺伝子(ER、PR)の測定に依存することは、偽陽性および陰性の単一の測定の問題だけでなく、腫瘍の根底の生物学がホルモン非依存性である(経路の1つのメンバーがタンパク質レベルで発現されるにもかかわらず)可能性の危険を冒す。この点に関し、他の生物学的サブタイプの陽性マーカーと一緒にエストロゲン応答性経路の他のものを含む、50遺伝子を並行して測定することによって提供される情報は、根底にある腫瘍生物学のより精確な反映であろう[Oh 2006]。
より大きな免疫組織化学的代用パネルが、発現プロフィールのゴールドスタンダードに関連付けられ、ER、PRおよびHER2の単純測定よりも多くの情報を提供することができる[Cheang 2008b][Cheang 2009]。限られた抗体パネルが標準のパラフィンブロックに容易に適用され、標準の臨床病理学的危険因子を越える有意な予後診断情報を加えることができる[Ross 2008]。この研究において、50遺伝子のqPCRアッセイに対する、確立された6つの免疫染色パネル(ER、PR、HER2、Ki67、サイトケラチン5/6および上皮成長因子受容体)の直接比較を、同じソースブロックを用いて行った。各方法は、標準の因子を越えて有意な予後診断情報を加える。しかし、臨床的ER陽性患者のこのセットでは、固有の生物学的サブタイプに対する多くの矛盾した割り当てがあり、qPCR手法はこれらの症例での予後の予測でより良好であった。
主な臨床危険因子を組み込む多変量解析では、PAM50サブタイプまたはRORが含まれる場合、段階はもはや有意ではない。再発スコアおよびゲノム段階指数などの他のシグナチュアと比較すると[Paik 2004][Ivshina 2006][Sotiriou 2006]、PAM50は、高危険症例を、全身療法選択肢(例えば、ホルモン、抗HER2およびアントラサイクリン対非アントラサイクリン化学療法治療)に異なる応答をするであろう管腔B、HER2富化および基底様サブタイプに区別する利点も有する。このアッセイは、凍結組織[Glas 2006]も切断切片の手動顕微手術[Paik 2004]も必要とせず、臨床試験からのものなどのアーカイブ組織を含む標準のパラフィンブロックに容易に適用することができるので、実施するのもより簡単である。しかし、このアッセイは所望によりこの種の試料で実施することができる。PAM50アッセイは乳癌の根底にある生物学の主要な特徴を反映するように設計されたので、特定の集団での予後に対して最適化されるのと対照的に、それは他の患者コホートにうまく外挿され、予測能を保持する可能性が特にある[Rouzier 2005]。この研究では、PAM50のqPCRアッセイが、リンパ節陽性であろうがリンパ節陰性であろうが、エストロゲン受容体陽性のタモキシフェンで治療された女性の間で、有意で独立した予後診断能力を有することが初めて証明された。本アッセイは、ER陽性である(免疫組織化学およびリガンド結合アッセイによって)と臨床的に決定された最高10%の症例がER陰性高危険群に分類されることを確認し、多変量の予後診断モデルで段階およびHER2状態を置換し、免疫組織化学的サブタイプ分類および臨床危険クラシファイヤーより優れている。
上記発明は理解の明快さの目的のために例示および実施例としてある程度詳細に記載されているが、添付の特許請求の範囲の範囲内で、ある変更および修正を加えることができることが明らかとなる。
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