KR20200117916A - Cfdna를 이용한 췌장암 진단방법 - Google Patents
Cfdna를 이용한 췌장암 진단방법 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20200117916A KR20200117916A KR1020200041243A KR20200041243A KR20200117916A KR 20200117916 A KR20200117916 A KR 20200117916A KR 1020200041243 A KR1020200041243 A KR 1020200041243A KR 20200041243 A KR20200041243 A KR 20200041243A KR 20200117916 A KR20200117916 A KR 20200117916A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- cfdna
- marker
- cancer
- probe
- gene
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 109
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 title claims description 48
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 title claims description 48
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 title claims description 48
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 title claims description 48
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 441
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 171
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 claims abstract description 53
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 46
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 claims abstract description 29
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 claims abstract description 10
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 claims abstract description 10
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 claims abstract description 9
- 210000004910 pleural fluid Anatomy 0.000 claims abstract description 7
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 298
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 230
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 claims description 216
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 204
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 claims description 110
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 claims description 108
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 claims description 108
- 239000011616 biotin Substances 0.000 claims description 108
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 claims description 106
- 238000009739 binding Methods 0.000 claims description 105
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 103
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 74
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims description 69
- -1 poly(acetylene) Polymers 0.000 claims description 68
- 239000002070 nanowire Substances 0.000 claims description 63
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 60
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 claims description 58
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 57
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 56
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 47
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 claims description 47
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims description 41
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 41
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 37
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 36
- 102100025475 Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 5 Human genes 0.000 claims description 32
- 101000914324 Homo sapiens Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 5 Proteins 0.000 claims description 32
- 239000002801 charged material Substances 0.000 claims description 31
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 claims description 28
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 claims description 28
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 claims description 28
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 27
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 27
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims description 25
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 claims description 24
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 claims description 24
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims description 24
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 claims description 22
- 101000623901 Homo sapiens Mucin-16 Proteins 0.000 claims description 19
- 102100023123 Mucin-16 Human genes 0.000 claims description 19
- 239000000107 tumor biomarker Substances 0.000 claims description 19
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 18
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 18
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 18
- 229920001940 conductive polymer Polymers 0.000 claims description 11
- 102100030708 GTPase KRas Human genes 0.000 claims description 9
- 101000584612 Homo sapiens GTPase KRas Proteins 0.000 claims description 9
- 101001133056 Homo sapiens Mucin-1 Proteins 0.000 claims description 9
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 claims description 9
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 claims description 9
- 102100034256 Mucin-1 Human genes 0.000 claims description 9
- 239000002096 quantum dot Substances 0.000 claims description 9
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 claims description 9
- 230000010365 information processing Effects 0.000 claims description 8
- 230000004044 response Effects 0.000 claims description 8
- 229920000123 polythiophene Polymers 0.000 claims description 6
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 claims description 4
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 claims description 4
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 claims description 4
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 claims description 4
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 claims description 4
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 claims description 4
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 claims description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 4
- 229920000128 polypyrrole Polymers 0.000 claims description 4
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 claims description 4
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 claims description 4
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 claims description 4
- GKWLILHTTGWKLQ-UHFFFAOYSA-N 2,3-dihydrothieno[3,4-b][1,4]dioxine Chemical compound O1CCOC2=CSC=C21 GKWLILHTTGWKLQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229920001609 Poly(3,4-ethylenedioxythiophene) Polymers 0.000 claims description 3
- 229920000265 Polyparaphenylene Polymers 0.000 claims description 3
- HSFWRNGVRCDJHI-UHFFFAOYSA-N alpha-acetylene Natural products C#C HSFWRNGVRCDJHI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229920000553 poly(phenylenevinylene) Polymers 0.000 claims description 3
- 229920001197 polyacetylene Polymers 0.000 claims description 3
- 229920000767 polyaniline Polymers 0.000 claims description 3
- 229920000069 polyphenylene sulfide Polymers 0.000 claims description 3
- HRNLUBSXIHFDHP-UHFFFAOYSA-N N-(2-aminophenyl)-4-[[[4-(3-pyridinyl)-2-pyrimidinyl]amino]methyl]benzamide Chemical compound NC1=CC=CC=C1NC(=O)C(C=C1)=CC=C1CNC1=NC=CC(C=2C=NC=CC=2)=N1 HRNLUBSXIHFDHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 6
- 102100034540 Adenomatous polyposis coli protein Human genes 0.000 claims 3
- 108010062802 CD66 antigens Proteins 0.000 claims 3
- 102100024533 Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 1 Human genes 0.000 claims 3
- 102100032610 Guanine nucleotide-binding protein G(s) subunit alpha isoforms XLas Human genes 0.000 claims 3
- 101000924577 Homo sapiens Adenomatous polyposis coli protein Proteins 0.000 claims 3
- 101001014590 Homo sapiens Guanine nucleotide-binding protein G(s) subunit alpha isoforms XLas Proteins 0.000 claims 3
- 101001014594 Homo sapiens Guanine nucleotide-binding protein G(s) subunit alpha isoforms short Proteins 0.000 claims 3
- 101000576802 Homo sapiens Mesothelin Proteins 0.000 claims 3
- 101001014610 Homo sapiens Neuroendocrine secretory protein 55 Proteins 0.000 claims 3
- 101000797903 Homo sapiens Protein ALEX Proteins 0.000 claims 3
- 102100025096 Mesothelin Human genes 0.000 claims 3
- 102100025725 Mothers against decapentaplegic homolog 4 Human genes 0.000 claims 3
- 101710143112 Mothers against decapentaplegic homolog 4 Proteins 0.000 claims 3
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 claims 2
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 claims 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 abstract description 162
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 abstract description 29
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 abstract description 7
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 7
- 239000007788 liquid Substances 0.000 abstract description 6
- 238000012123 point-of-care testing Methods 0.000 abstract description 4
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 abstract description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 164
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 104
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 82
- 102000052116 epidermal growth factor receptor activity proteins Human genes 0.000 description 70
- 108700015053 epidermal growth factor receptor activity proteins Proteins 0.000 description 70
- YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N n-[3-[[6-[3-(trifluoromethyl)anilino]pyrimidin-4-yl]amino]phenyl]cyclopropanecarboxamide Chemical compound FC(F)(F)C1=CC=CC(NC=2N=CN=C(NC=3C=C(NC(=O)C4CC4)C=CC=3)C=2)=C1 YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 70
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 description 61
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 54
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 54
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 54
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 51
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 51
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 51
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 45
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 45
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 44
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 41
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 39
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 39
- 229920006317 cationic polymer Polymers 0.000 description 38
- 108700021042 biotin binding protein Proteins 0.000 description 35
- 102000043871 biotin binding protein Human genes 0.000 description 35
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 description 34
- 102100035139 Folate receptor alpha Human genes 0.000 description 34
- 101001023230 Homo sapiens Folate receptor alpha Proteins 0.000 description 34
- 102100035703 Prostatic acid phosphatase Human genes 0.000 description 34
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 description 34
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 description 34
- 102100027943 Carnitine O-palmitoyltransferase 1, liver isoform Human genes 0.000 description 33
- 101710120614 Carnitine O-palmitoyltransferase 1, liver isoform Proteins 0.000 description 33
- 208000024770 Thyroid neoplasm Diseases 0.000 description 33
- 201000002510 thyroid cancer Diseases 0.000 description 33
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 32
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 32
- 101001012157 Homo sapiens Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Proteins 0.000 description 31
- 102100030086 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Human genes 0.000 description 31
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 31
- 101000599940 Homo sapiens Interferon gamma Proteins 0.000 description 30
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 29
- 101150084967 EPCAM gene Proteins 0.000 description 29
- 101000914321 Homo sapiens Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 7 Proteins 0.000 description 28
- 101000617725 Homo sapiens Pregnancy-specific beta-1-glycoprotein 2 Proteins 0.000 description 28
- 108010077991 O-GlcNAc transferase Proteins 0.000 description 28
- 102000005520 O-GlcNAc transferase Human genes 0.000 description 28
- 101150057140 TACSTD1 gene Proteins 0.000 description 28
- 239000002086 nanomaterial Substances 0.000 description 28
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 27
- 108010074708 B7-H1 Antigen Proteins 0.000 description 26
- 101001001272 Homo sapiens Prostatic acid phosphatase Proteins 0.000 description 26
- 102100024216 Programmed cell death 1 ligand 1 Human genes 0.000 description 26
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 25
- 102000012804 EPCAM Human genes 0.000 description 23
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 23
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 23
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 23
- 201000009036 biliary tract cancer Diseases 0.000 description 23
- 208000020790 biliary tract neoplasm Diseases 0.000 description 23
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 23
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 23
- 230000029918 bioluminescence Effects 0.000 description 21
- 238000005415 bioluminescence Methods 0.000 description 21
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 21
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 21
- 101000611936 Homo sapiens Programmed cell death protein 1 Proteins 0.000 description 20
- 102100040678 Programmed cell death protein 1 Human genes 0.000 description 20
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 20
- 102100038358 Prostate-specific antigen Human genes 0.000 description 18
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 18
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 17
- 108010034949 Thyroglobulin Proteins 0.000 description 16
- 102100033504 Thyroglobulin Human genes 0.000 description 16
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 16
- 229960002175 thyroglobulin Drugs 0.000 description 16
- 108091005957 yellow fluorescent proteins Proteins 0.000 description 16
- 102100041003 Glutamate carboxypeptidase 2 Human genes 0.000 description 15
- 108091005948 blue fluorescent proteins Proteins 0.000 description 15
- 108010082025 cyan fluorescent protein Proteins 0.000 description 15
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 15
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 102100033420 Keratin, type I cytoskeletal 19 Human genes 0.000 description 14
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 14
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 14
- 230000022811 deglycosylation Effects 0.000 description 14
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 14
- 108010087904 neutravidin Proteins 0.000 description 14
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 14
- 108010081020 traptavidin Proteins 0.000 description 14
- 102100033793 ALK tyrosine kinase receptor Human genes 0.000 description 13
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 13
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 13
- 102100036961 Nuclear mitotic apparatus protein 1 Human genes 0.000 description 13
- 108010022181 Phosphopyruvate Hydratase Proteins 0.000 description 13
- 102000012288 Phosphopyruvate Hydratase Human genes 0.000 description 13
- 101000606129 Homo sapiens Tyrosine-protein kinase receptor TYRO3 Proteins 0.000 description 12
- 108010072866 Prostate-Specific Antigen Proteins 0.000 description 12
- 102100039127 Tyrosine-protein kinase receptor TYRO3 Human genes 0.000 description 12
- 108010036226 antigen CYFRA21.1 Proteins 0.000 description 12
- 102100025064 Cellular tumor antigen p53 Human genes 0.000 description 11
- 101001024605 Homo sapiens Next to BRCA1 gene 1 protein Proteins 0.000 description 11
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 11
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 description 11
- 108010078814 Tumor Suppressor Protein p53 Proteins 0.000 description 11
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 11
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 11
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 description 11
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 11
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 11
- 102200048955 rs121434569 Human genes 0.000 description 11
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 description 11
- 102100038518 Calcitonin Human genes 0.000 description 10
- 102100027842 Fibroblast growth factor receptor 3 Human genes 0.000 description 10
- 101710182396 Fibroblast growth factor receptor 3 Proteins 0.000 description 10
- 102100028652 Gamma-enolase Human genes 0.000 description 10
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 description 10
- 101001058231 Homo sapiens Gamma-enolase Proteins 0.000 description 10
- 101000998011 Homo sapiens Keratin, type I cytoskeletal 19 Proteins 0.000 description 10
- 101000577877 Homo sapiens Stromelysin-3 Proteins 0.000 description 10
- 102100028847 Stromelysin-3 Human genes 0.000 description 10
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 10
- 230000008569 process Effects 0.000 description 10
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 9
- 102100033587 DNA topoisomerase 2-alpha Human genes 0.000 description 9
- 101000892862 Homo sapiens Glutamate carboxypeptidase 2 Proteins 0.000 description 9
- 101000807354 Homo sapiens Ubiquitin-conjugating enzyme E2 C Proteins 0.000 description 9
- 108010046308 Type II DNA Topoisomerases Proteins 0.000 description 9
- 102100037256 Ubiquitin-conjugating enzyme E2 C Human genes 0.000 description 9
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 9
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 9
- 102100032340 G2/mitotic-specific cyclin-B1 Human genes 0.000 description 8
- 101000868643 Homo sapiens G2/mitotic-specific cyclin-B1 Proteins 0.000 description 8
- 101000911790 Homo sapiens Sister chromatid cohesion protein DCC1 Proteins 0.000 description 8
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 8
- 102100027040 Sister chromatid cohesion protein DCC1 Human genes 0.000 description 8
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 8
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 8
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 8
- 230000001678 irradiating effect Effects 0.000 description 8
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 8
- 108010043671 prostatic acid phosphatase Proteins 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 239000000439 tumor marker Substances 0.000 description 8
- IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N D-Luciferin Chemical compound OC(=O)[C@H]1CSC(C=2SC3=CC=C(O)C=C3N=2)=N1 IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N 0.000 description 7
- CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N Dehydro-luciferin Natural products OC(=O)C1=CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N Fivefly Luciferin Natural products OC(=O)C1CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N Luciferin Natural products CCc1c(C)c(CC2NC(=O)C(=C2C=C)C)[nH]c1Cc3[nH]c4C(=C5/NC(CC(=O)O)C(C)C5CC(=O)O)CC(=O)c4c3C DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 241000186983 Streptomyces avidinii Species 0.000 description 7
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 7
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 7
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 7
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 7
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 7
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 7
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 7
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 7
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 7
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 7
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 7
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 7
- 108010036112 nuclear matrix protein 22 Proteins 0.000 description 7
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 7
- 108090000369 Glutamate Carboxypeptidase II Proteins 0.000 description 6
- 101000598160 Homo sapiens Nuclear mitotic apparatus protein 1 Proteins 0.000 description 6
- 101001091365 Homo sapiens Plasma kallikrein Proteins 0.000 description 6
- 101000605534 Homo sapiens Prostate-specific antigen Proteins 0.000 description 6
- 101000873927 Homo sapiens Squamous cell carcinoma antigen recognized by T-cells 3 Proteins 0.000 description 6
- 101000801481 Homo sapiens Tissue-type plasminogen activator Proteins 0.000 description 6
- 239000002146 L01XE16 - Crizotinib Substances 0.000 description 6
- 206010041067 Small cell lung cancer Diseases 0.000 description 6
- 102100035748 Squamous cell carcinoma antigen recognized by T-cells 3 Human genes 0.000 description 6
- 102100033571 Tissue-type plasminogen activator Human genes 0.000 description 6
- 229960005061 crizotinib Drugs 0.000 description 6
- KTEIFNKAUNYNJU-GFCCVEGCSA-N crizotinib Chemical compound O([C@H](C)C=1C(=C(F)C=CC=1Cl)Cl)C(C(=NC=1)N)=CC=1C(=C1)C=NN1C1CCNCC1 KTEIFNKAUNYNJU-GFCCVEGCSA-N 0.000 description 6
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 6
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 6
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 6
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 6
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 6
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 6
- 208000000587 small cell lung carcinoma Diseases 0.000 description 6
- 102000010400 1-phosphatidylinositol-3-kinase activity proteins Human genes 0.000 description 5
- 102100036512 7-dehydrocholesterol reductase Human genes 0.000 description 5
- 102100033393 Anillin Human genes 0.000 description 5
- 102100031936 Anterior gradient protein 2 homolog Human genes 0.000 description 5
- 102100036451 Apolipoprotein C-I Human genes 0.000 description 5
- 102100027937 Aurora kinase A and ninein-interacting protein Human genes 0.000 description 5
- 102100021663 Baculoviral IAP repeat-containing protein 5 Human genes 0.000 description 5
- 206010004593 Bile duct cancer Diseases 0.000 description 5
- 102100039398 C-X-C motif chemokine 2 Human genes 0.000 description 5
- 102100036189 C-X-C motif chemokine 3 Human genes 0.000 description 5
- 102000014819 CACNA1B Human genes 0.000 description 5
- 108010083123 CDX2 Transcription Factor Proteins 0.000 description 5
- 102100035671 Cadherin EGF LAG seven-pass G-type receptor 3 Human genes 0.000 description 5
- 102100024153 Cadherin-15 Human genes 0.000 description 5
- 108010052500 Calgranulin A Proteins 0.000 description 5
- 101710124171 Calpain-1 catalytic subunit Proteins 0.000 description 5
- 102100025172 Calpain-1 catalytic subunit Human genes 0.000 description 5
- 102100024485 Cell division cycle-associated protein 7 Human genes 0.000 description 5
- 108010091675 Cellular Apoptosis Susceptibility Protein Proteins 0.000 description 5
- 102100038445 Claudin-2 Human genes 0.000 description 5
- 102100033601 Collagen alpha-1(I) chain Human genes 0.000 description 5
- 102100031519 Collagen alpha-1(VI) chain Human genes 0.000 description 5
- 102100036217 Collagen alpha-1(X) chain Human genes 0.000 description 5
- 102100033825 Collagen alpha-1(XI) chain Human genes 0.000 description 5
- 102100039551 Collagen triple helix repeat-containing protein 1 Human genes 0.000 description 5
- 102100038387 Cystatin-SN Human genes 0.000 description 5
- 102100035300 Cystine/glutamate transporter Human genes 0.000 description 5
- 102100039524 DNA endonuclease RBBP8 Human genes 0.000 description 5
- 102100024829 DNA polymerase delta catalytic subunit Human genes 0.000 description 5
- 102100021420 Defensin-5 Human genes 0.000 description 5
- 102100020743 Dipeptidase 1 Human genes 0.000 description 5
- 102100040322 E3 ubiquitin-protein ligase RNF183 Human genes 0.000 description 5
- 102100031814 EGF-containing fibulin-like extracellular matrix protein 1 Human genes 0.000 description 5
- 102100028067 EGF-containing fibulin-like extracellular matrix protein 2 Human genes 0.000 description 5
- 102100035087 Ectoderm-neural cortex protein 1 Human genes 0.000 description 5
- 102100032029 Epidermal growth factor-like protein 6 Human genes 0.000 description 5
- 102100029091 Exportin-2 Human genes 0.000 description 5
- 102100040671 F-box only protein 39 Human genes 0.000 description 5
- 108010027673 Fanconi Anemia Complementation Group C protein Proteins 0.000 description 5
- 108010026653 Fanconi Anemia Complementation Group D2 protein Proteins 0.000 description 5
- 102000013601 Fanconi Anemia Complementation Group D2 protein Human genes 0.000 description 5
- 102100027285 Fanconi anemia group B protein Human genes 0.000 description 5
- 102100026167 Fez family zinc finger protein 2 Human genes 0.000 description 5
- 102100027628 Fibrous sheath-interacting protein 1 Human genes 0.000 description 5
- 108010008599 Forkhead Box Protein M1 Proteins 0.000 description 5
- 102100023374 Forkhead box protein M1 Human genes 0.000 description 5
- 102100022627 Fructose-2,6-bisphosphatase Human genes 0.000 description 5
- 102100025564 Glutamate-rich protein 3 Human genes 0.000 description 5
- 102100034227 Grainyhead-like protein 2 homolog Human genes 0.000 description 5
- 102100034221 Growth-regulated alpha protein Human genes 0.000 description 5
- 102100031624 Heat shock protein 105 kDa Human genes 0.000 description 5
- 102100028006 Heme oxygenase 1 Human genes 0.000 description 5
- 102100039381 Heparan-sulfate 6-O-sulfotransferase 2 Human genes 0.000 description 5
- 102100022057 Hepatocyte nuclear factor 1-alpha Human genes 0.000 description 5
- 102100031671 Homeobox protein CDX-2 Human genes 0.000 description 5
- 102100021090 Homeobox protein Hox-A9 Human genes 0.000 description 5
- 102100021088 Homeobox protein Hox-B13 Human genes 0.000 description 5
- 101000928720 Homo sapiens 7-dehydrocholesterol reductase Proteins 0.000 description 5
- 101000959046 Homo sapiens Aldehyde dehydrogenase family 1 member A3 Proteins 0.000 description 5
- 101000732632 Homo sapiens Anillin Proteins 0.000 description 5
- 101000775021 Homo sapiens Anterior gradient protein 2 homolog Proteins 0.000 description 5
- 101000928628 Homo sapiens Apolipoprotein C-I Proteins 0.000 description 5
- 101000697944 Homo sapiens Aurora kinase A and ninein-interacting protein Proteins 0.000 description 5
- 101000889128 Homo sapiens C-X-C motif chemokine 2 Proteins 0.000 description 5
- 101000947193 Homo sapiens C-X-C motif chemokine 3 Proteins 0.000 description 5
- 101000715671 Homo sapiens Cadherin EGF LAG seven-pass G-type receptor 3 Proteins 0.000 description 5
- 101000762242 Homo sapiens Cadherin-15 Proteins 0.000 description 5
- 101000714553 Homo sapiens Cadherin-3 Proteins 0.000 description 5
- 101000980893 Homo sapiens Cell division cycle-associated protein 7 Proteins 0.000 description 5
- 101000882901 Homo sapiens Claudin-2 Proteins 0.000 description 5
- 101000748988 Homo sapiens Cochlin Proteins 0.000 description 5
- 101000941581 Homo sapiens Collagen alpha-1(VI) chain Proteins 0.000 description 5
- 101000875027 Homo sapiens Collagen alpha-1(X) chain Proteins 0.000 description 5
- 101000710623 Homo sapiens Collagen alpha-1(XI) chain Proteins 0.000 description 5
- 101000746121 Homo sapiens Collagen triple helix repeat-containing protein 1 Proteins 0.000 description 5
- 101000868333 Homo sapiens Cyclin-dependent kinase 1 Proteins 0.000 description 5
- 101000884768 Homo sapiens Cystatin-SN Proteins 0.000 description 5
- 101000746134 Homo sapiens DNA endonuclease RBBP8 Proteins 0.000 description 5
- 101000909198 Homo sapiens DNA polymerase delta catalytic subunit Proteins 0.000 description 5
- 101001041589 Homo sapiens Defensin-5 Proteins 0.000 description 5
- 101000932213 Homo sapiens Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 5
- 101001104297 Homo sapiens E3 ubiquitin-protein ligase RNF183 Proteins 0.000 description 5
- 101001065272 Homo sapiens EGF-containing fibulin-like extracellular matrix protein 1 Proteins 0.000 description 5
- 101001060248 Homo sapiens EGF-containing fibulin-like extracellular matrix protein 2 Proteins 0.000 description 5
- 101000813747 Homo sapiens ETS translocation variant 4 Proteins 0.000 description 5
- 101000877456 Homo sapiens Ectoderm-neural cortex protein 1 Proteins 0.000 description 5
- 101000921196 Homo sapiens Epidermal growth factor-like protein 6 Proteins 0.000 description 5
- 101000892313 Homo sapiens F-box only protein 39 Proteins 0.000 description 5
- 101000914679 Homo sapiens Fanconi anemia group B protein Proteins 0.000 description 5
- 101000912440 Homo sapiens Fez family zinc finger protein 2 Proteins 0.000 description 5
- 101000862364 Homo sapiens Fibrous sheath-interacting protein 1 Proteins 0.000 description 5
- 101000823456 Homo sapiens Fructose-2,6-bisphosphatase Proteins 0.000 description 5
- 101001056890 Homo sapiens Glutamate-rich protein 3 Proteins 0.000 description 5
- 101001069929 Homo sapiens Grainyhead-like protein 2 homolog Proteins 0.000 description 5
- 101001069921 Homo sapiens Growth-regulated alpha protein Proteins 0.000 description 5
- 101000866478 Homo sapiens Heat shock protein 105 kDa Proteins 0.000 description 5
- 101001079623 Homo sapiens Heme oxygenase 1 Proteins 0.000 description 5
- 101001035622 Homo sapiens Heparan-sulfate 6-O-sulfotransferase 2 Proteins 0.000 description 5
- 101001045751 Homo sapiens Hepatocyte nuclear factor 1-alpha Proteins 0.000 description 5
- 101001041145 Homo sapiens Homeobox protein Hox-B13 Proteins 0.000 description 5
- 101000839066 Homo sapiens Hypoxia-inducible lipid droplet-associated protein Proteins 0.000 description 5
- 101001053263 Homo sapiens Insulin gene enhancer protein ISL-1 Proteins 0.000 description 5
- 101000599056 Homo sapiens Interleukin-6 receptor subunit beta Proteins 0.000 description 5
- 101000605522 Homo sapiens Kallikrein-1 Proteins 0.000 description 5
- 101000605528 Homo sapiens Kallikrein-2 Proteins 0.000 description 5
- 101001091385 Homo sapiens Kallikrein-6 Proteins 0.000 description 5
- 101000994455 Homo sapiens Keratin, type I cytoskeletal 23 Proteins 0.000 description 5
- 101001056473 Homo sapiens Keratin, type II cytoskeletal 5 Proteins 0.000 description 5
- 101000971638 Homo sapiens Kinesin-like protein KIF1A Proteins 0.000 description 5
- 101000590482 Homo sapiens Kinetochore protein Nuf2 Proteins 0.000 description 5
- 101000677545 Homo sapiens Long-chain specific acyl-CoA dehydrogenase, mitochondrial Proteins 0.000 description 5
- 101000958332 Homo sapiens Lymphocyte antigen 6 complex locus protein G6d Proteins 0.000 description 5
- 101000958312 Homo sapiens Lymphocyte antigen 6 complex locus protein G6f Proteins 0.000 description 5
- 101000990912 Homo sapiens Matrilysin Proteins 0.000 description 5
- 101000949825 Homo sapiens Meiotic recombination protein DMC1/LIM15 homolog Proteins 0.000 description 5
- 101000798109 Homo sapiens Melanotransferrin Proteins 0.000 description 5
- 101000896657 Homo sapiens Mitotic checkpoint serine/threonine-protein kinase BUB1 Proteins 0.000 description 5
- 101000957259 Homo sapiens Mitotic spindle assembly checkpoint protein MAD2A Proteins 0.000 description 5
- 101000635965 Homo sapiens Myosin-binding protein C, slow-type Proteins 0.000 description 5
- 101001024714 Homo sapiens Nck-associated protein 1 Proteins 0.000 description 5
- 101001023833 Homo sapiens Neutrophil gelatinase-associated lipocalin Proteins 0.000 description 5
- 101000978926 Homo sapiens Nuclear receptor subfamily 1 group D member 1 Proteins 0.000 description 5
- 101000741899 Homo sapiens POTE ankyrin domain family member G Proteins 0.000 description 5
- 101000572950 Homo sapiens POU domain, class 3, transcription factor 4 Proteins 0.000 description 5
- 101000595669 Homo sapiens Pituitary homeobox 2 Proteins 0.000 description 5
- 101001064779 Homo sapiens Plexin domain-containing protein 2 Proteins 0.000 description 5
- 101001009588 Homo sapiens Probable glutathione peroxidase 8 Proteins 0.000 description 5
- 101000794329 Homo sapiens Probable tubulin polyglutamylase TTLL2 Proteins 0.000 description 5
- 101001090538 Homo sapiens Proline-rich protein 7 Proteins 0.000 description 5
- 101001069749 Homo sapiens Prospero homeobox protein 1 Proteins 0.000 description 5
- 101000817237 Homo sapiens Protein ECT2 Proteins 0.000 description 5
- 101001062754 Homo sapiens Protein FAM13C Proteins 0.000 description 5
- 101001046894 Homo sapiens Protein HID1 Proteins 0.000 description 5
- 101000685726 Homo sapiens Protein S100-A2 Proteins 0.000 description 5
- 101000821881 Homo sapiens Protein S100-P Proteins 0.000 description 5
- 101000686031 Homo sapiens Proto-oncogene tyrosine-protein kinase ROS Proteins 0.000 description 5
- 101000639806 Homo sapiens Putative uncharacterized protein RUSC1-AS1 Proteins 0.000 description 5
- 101001130243 Homo sapiens RAD51-associated protein 1 Proteins 0.000 description 5
- 101001096541 Homo sapiens Rac GTPase-activating protein 1 Proteins 0.000 description 5
- 101000825957 Homo sapiens Radial spoke head protein 9 homolog Proteins 0.000 description 5
- 101000686909 Homo sapiens Resistin Proteins 0.000 description 5
- 101000575639 Homo sapiens Ribonucleoside-diphosphate reductase subunit M2 Proteins 0.000 description 5
- 101000665140 Homo sapiens Scm-like with four MBT domains protein 2 Proteins 0.000 description 5
- 101000864793 Homo sapiens Secreted frizzled-related protein 4 Proteins 0.000 description 5
- 101000777293 Homo sapiens Serine/threonine-protein kinase Chk1 Proteins 0.000 description 5
- 101001056878 Homo sapiens Squalene monooxygenase Proteins 0.000 description 5
- 101000701446 Homo sapiens Stanniocalcin-2 Proteins 0.000 description 5
- 101000990915 Homo sapiens Stromelysin-1 Proteins 0.000 description 5
- 101000577874 Homo sapiens Stromelysin-2 Proteins 0.000 description 5
- 101000586264 Homo sapiens Synaptonemal complex protein 2-like Proteins 0.000 description 5
- 101000662909 Homo sapiens T cell receptor beta constant 1 Proteins 0.000 description 5
- 101000837810 Homo sapiens Testis-expressed protein 38 Proteins 0.000 description 5
- 101000834948 Homo sapiens Tomoregulin-2 Proteins 0.000 description 5
- 101000687911 Homo sapiens Transcription factor SOX-3 Proteins 0.000 description 5
- 101000855256 Homo sapiens Uncharacterized protein C16orf74 Proteins 0.000 description 5
- 101000638886 Homo sapiens Urokinase-type plasminogen activator Proteins 0.000 description 5
- 101000935123 Homo sapiens Voltage-dependent N-type calcium channel subunit alpha-1B Proteins 0.000 description 5
- 101000771659 Homo sapiens WD repeat- and FYVE domain-containing protein 4 Proteins 0.000 description 5
- 101000818517 Homo sapiens Zinc-alpha-2-glycoprotein Proteins 0.000 description 5
- 101001098818 Homo sapiens cGMP-inhibited 3',5'-cyclic phosphodiesterase A Proteins 0.000 description 5
- 102100024392 Insulin gene enhancer protein ISL-1 Human genes 0.000 description 5
- 102100037795 Interleukin-6 receptor subunit beta Human genes 0.000 description 5
- 102100026153 Junction plakoglobin Human genes 0.000 description 5
- 102100038356 Kallikrein-2 Human genes 0.000 description 5
- 102100034866 Kallikrein-6 Human genes 0.000 description 5
- 102100032705 Keratin, type I cytoskeletal 23 Human genes 0.000 description 5
- 102100025756 Keratin, type II cytoskeletal 5 Human genes 0.000 description 5
- 102100021527 Kinesin-like protein KIF1A Human genes 0.000 description 5
- 102100032431 Kinetochore protein Nuf2 Human genes 0.000 description 5
- 102100021644 Long-chain specific acyl-CoA dehydrogenase, mitochondrial Human genes 0.000 description 5
- 102100038210 Lymphocyte antigen 6 complex locus protein G6d Human genes 0.000 description 5
- 102100030417 Matrilysin Human genes 0.000 description 5
- 102100035285 Meiotic recombination protein DMC1/LIM15 homolog Human genes 0.000 description 5
- 102100032239 Melanotransferrin Human genes 0.000 description 5
- 102100021691 Mitotic checkpoint serine/threonine-protein kinase BUB1 Human genes 0.000 description 5
- 102100038792 Mitotic spindle assembly checkpoint protein MAD2A Human genes 0.000 description 5
- 102100030735 Myosin-binding protein C, slow-type Human genes 0.000 description 5
- 102100036954 Nck-associated protein 1 Human genes 0.000 description 5
- 102100035405 Neutrophil gelatinase-associated lipocalin Human genes 0.000 description 5
- 102100023170 Nuclear receptor subfamily 1 group D member 1 Human genes 0.000 description 5
- 108091007960 PI3Ks Proteins 0.000 description 5
- 102100038759 POTE ankyrin domain family member G Human genes 0.000 description 5
- 102100026450 POU domain, class 3, transcription factor 4 Human genes 0.000 description 5
- 102100036090 Pituitary homeobox 2 Human genes 0.000 description 5
- 102100031889 Plexin domain-containing protein 2 Human genes 0.000 description 5
- 108010000598 Polycomb Repressive Complex 1 Proteins 0.000 description 5
- 102100030285 Probable glutathione peroxidase 8 Human genes 0.000 description 5
- 102100030202 Probable tubulin polyglutamylase TTLL2 Human genes 0.000 description 5
- 102100034740 Proline-rich protein 7 Human genes 0.000 description 5
- 102100038955 Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 Human genes 0.000 description 5
- 102100033880 Prospero homeobox protein 1 Human genes 0.000 description 5
- 102100040437 Protein ECT2 Human genes 0.000 description 5
- 102100030559 Protein FAM13C Human genes 0.000 description 5
- 102100023089 Protein S100-A2 Human genes 0.000 description 5
- 102100032442 Protein S100-A8 Human genes 0.000 description 5
- 102100021494 Protein S100-P Human genes 0.000 description 5
- 102100033947 Protein regulator of cytokinesis 1 Human genes 0.000 description 5
- 102100023347 Proto-oncogene tyrosine-protein kinase ROS Human genes 0.000 description 5
- 102100028286 Proto-oncogene tyrosine-protein kinase receptor Ret Human genes 0.000 description 5
- 102100034462 Putative uncharacterized protein RUSC1-AS1 Human genes 0.000 description 5
- 102100031535 RAD51-associated protein 1 Human genes 0.000 description 5
- 102100037414 Rac GTPase-activating protein 1 Human genes 0.000 description 5
- 102100022764 Radial spoke head protein 9 homolog Human genes 0.000 description 5
- 102100024735 Resistin Human genes 0.000 description 5
- 102100026006 Ribonucleoside-diphosphate reductase subunit M2 Human genes 0.000 description 5
- 102100034187 S-methyl-5'-thioadenosine phosphorylase Human genes 0.000 description 5
- 101710136206 S-methyl-5'-thioadenosine phosphorylase Proteins 0.000 description 5
- 108091006241 SLC7A11 Proteins 0.000 description 5
- 108091006730 SLCO1B3 Proteins 0.000 description 5
- 102100038691 Scm-like with four MBT domains protein 2 Human genes 0.000 description 5
- 102100030052 Secreted frizzled-related protein 4 Human genes 0.000 description 5
- 102100031081 Serine/threonine-protein kinase Chk1 Human genes 0.000 description 5
- 102000015661 Solute Carrier Organic Anion Transporter Family Member 1B3 Human genes 0.000 description 5
- 101710168942 Sphingosine-1-phosphate phosphatase 1 Proteins 0.000 description 5
- 102100030684 Sphingosine-1-phosphate phosphatase 1 Human genes 0.000 description 5
- 102100025560 Squalene monooxygenase Human genes 0.000 description 5
- 102100030510 Stanniocalcin-2 Human genes 0.000 description 5
- 102100030416 Stromelysin-1 Human genes 0.000 description 5
- 102100028848 Stromelysin-2 Human genes 0.000 description 5
- 108010002687 Survivin Proteins 0.000 description 5
- 102100030116 Synaptonemal complex protein 2-like Human genes 0.000 description 5
- 102100037272 T cell receptor beta constant 1 Human genes 0.000 description 5
- 102100028512 Testis-expressed protein 38 Human genes 0.000 description 5
- 102100026160 Tomoregulin-2 Human genes 0.000 description 5
- 102100024276 Transcription factor SOX-3 Human genes 0.000 description 5
- 102100026591 Uncharacterized protein C16orf74 Human genes 0.000 description 5
- 102100031358 Urokinase-type plasminogen activator Human genes 0.000 description 5
- 102100029466 WD repeat- and FYVE domain-containing protein 4 Human genes 0.000 description 5
- 102100021144 Zinc-alpha-2-glycoprotein Human genes 0.000 description 5
- 108010029483 alpha 1 Chain Collagen Type I Proteins 0.000 description 5
- 102100037093 cGMP-inhibited 3',5'-cyclic phosphodiesterase A Human genes 0.000 description 5
- 239000013256 coordination polymer Substances 0.000 description 5
- 108010027263 homeobox protein HOXA9 Proteins 0.000 description 5
- 238000011528 liquid biopsy Methods 0.000 description 5
- 108010078587 pseudouridylate synthetase Proteins 0.000 description 5
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 5
- 102200055464 rs113488022 Human genes 0.000 description 5
- 102100029783 tRNA pseudouridine synthase A Human genes 0.000 description 5
- 229940121358 tyrosine kinase inhibitor Drugs 0.000 description 5
- 101710137984 4-O-beta-D-mannosyl-D-glucose phosphorylase Proteins 0.000 description 4
- 102100039864 ATPase family AAA domain-containing protein 2 Human genes 0.000 description 4
- 102100039075 Aldehyde dehydrogenase family 1 member A3 Human genes 0.000 description 4
- 102100030718 Ankyrin repeat and SOCS box protein 9 Human genes 0.000 description 4
- 108700020463 BRCA1 Proteins 0.000 description 4
- 102000036365 BRCA1 Human genes 0.000 description 4
- 101150072950 BRCA1 gene Proteins 0.000 description 4
- 102100024423 Carbonic anhydrase 9 Human genes 0.000 description 4
- 102100025473 Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 6 Human genes 0.000 description 4
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 4
- 102100031196 Choriogonadotropin subunit beta 3 Human genes 0.000 description 4
- 102100031552 Coactosin-like protein Human genes 0.000 description 4
- 102100040996 Cochlin Human genes 0.000 description 4
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 description 4
- 102100032522 Cyclin-dependent kinases regulatory subunit 2 Human genes 0.000 description 4
- 108010014790 DAX-1 Orphan Nuclear Receptor Proteins 0.000 description 4
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 4
- 102100036109 Dual specificity protein kinase TTK Human genes 0.000 description 4
- 102100039578 ETS translocation variant 4 Human genes 0.000 description 4
- 102000018825 Fanconi Anemia Complementation Group C protein Human genes 0.000 description 4
- 102100024515 GDP-L-fucose synthase Human genes 0.000 description 4
- 102100026265 Histone-lysine N-methyltransferase ASH1L Human genes 0.000 description 4
- 101000779641 Homo sapiens ALK tyrosine kinase receptor Proteins 0.000 description 4
- 101000887284 Homo sapiens ATPase family AAA domain-containing protein 2 Proteins 0.000 description 4
- 101000703112 Homo sapiens Ankyrin repeat and SOCS box protein 9 Proteins 0.000 description 4
- 101000910338 Homo sapiens Carbonic anhydrase 9 Proteins 0.000 description 4
- 101000914326 Homo sapiens Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 6 Proteins 0.000 description 4
- 101000776619 Homo sapiens Choriogonadotropin subunit beta 3 Proteins 0.000 description 4
- 101000940352 Homo sapiens Coactosin-like protein Proteins 0.000 description 4
- 101000942317 Homo sapiens Cyclin-dependent kinases regulatory subunit 2 Proteins 0.000 description 4
- 101000659223 Homo sapiens Dual specificity protein kinase TTK Proteins 0.000 description 4
- 101001052793 Homo sapiens GDP-L-fucose synthase Proteins 0.000 description 4
- 101000785963 Homo sapiens Histone-lysine N-methyltransferase ASH1L Proteins 0.000 description 4
- 101001034844 Homo sapiens Interferon-induced transmembrane protein 1 Proteins 0.000 description 4
- 101000691574 Homo sapiens Junction plakoglobin Proteins 0.000 description 4
- 101000994460 Homo sapiens Keratin, type I cytoskeletal 20 Proteins 0.000 description 4
- 101000629400 Homo sapiens Mesoderm-specific transcript homolog protein Proteins 0.000 description 4
- 101001133081 Homo sapiens Mucin-2 Proteins 0.000 description 4
- 101000604110 Homo sapiens Palmitoleoyl-protein carboxylesterase NOTUM Proteins 0.000 description 4
- 101000579425 Homo sapiens Proto-oncogene tyrosine-protein kinase receptor Ret Proteins 0.000 description 4
- 101000692109 Homo sapiens Syndecan-2 Proteins 0.000 description 4
- 101000625727 Homo sapiens Tubulin beta chain Proteins 0.000 description 4
- 101000788517 Homo sapiens Tubulin beta-2A chain Proteins 0.000 description 4
- 102100028891 Hypoxia-inducible lipid droplet-associated protein Human genes 0.000 description 4
- 101710150697 Inositol monophosphatase 1 Proteins 0.000 description 4
- 101710126181 Insulin-like growth factor 2 mRNA-binding protein 1 Proteins 0.000 description 4
- 102100040021 Interferon-induced transmembrane protein 1 Human genes 0.000 description 4
- 102100032700 Keratin, type I cytoskeletal 20 Human genes 0.000 description 4
- 102100023974 Keratin, type II cytoskeletal 7 Human genes 0.000 description 4
- 102100024299 Maternal embryonic leucine zipper kinase Human genes 0.000 description 4
- 101710154611 Maternal embryonic leucine zipper kinase Proteins 0.000 description 4
- 102100039809 Matrix Gla protein Human genes 0.000 description 4
- 101710147263 Matrix Gla protein Proteins 0.000 description 4
- 102100026821 Mesoderm-specific transcript homolog protein Human genes 0.000 description 4
- 102100029083 Minor histocompatibility antigen H13 Human genes 0.000 description 4
- 102100034263 Mucin-2 Human genes 0.000 description 4
- 102100039019 Nuclear receptor subfamily 0 group B member 1 Human genes 0.000 description 4
- 102100038424 Palmitoleoyl-protein carboxylesterase NOTUM Human genes 0.000 description 4
- 102100026087 Syndecan-2 Human genes 0.000 description 4
- 102000003978 Tissue Plasminogen Activator Human genes 0.000 description 4
- 108090000373 Tissue Plasminogen Activator Proteins 0.000 description 4
- 102100024717 Tubulin beta chain Human genes 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 4
- QRMZSPFSDQBLIX-UHFFFAOYSA-N homovanillic acid Chemical compound COC1=CC(CC(O)=O)=CC=C1O QRMZSPFSDQBLIX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 229960000187 tissue plasminogen activator Drugs 0.000 description 4
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 4
- OXEUETBFKVCRNP-UHFFFAOYSA-N 9-ethyl-3-carbazolamine Chemical compound NC1=CC=C2N(CC)C3=CC=CC=C3C2=C1 OXEUETBFKVCRNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 3
- 108010066687 Epithelial Cell Adhesion Molecule Proteins 0.000 description 3
- 102000018651 Epithelial Cell Adhesion Molecule Human genes 0.000 description 3
- 102100027893 Homeobox protein Nkx-2.1 Human genes 0.000 description 3
- 101000632178 Homo sapiens Homeobox protein Nkx-2.1 Proteins 0.000 description 3
- 101000975502 Homo sapiens Keratin, type II cytoskeletal 7 Proteins 0.000 description 3
- 101000581981 Homo sapiens Neural cell adhesion molecule 1 Proteins 0.000 description 3
- 101000585555 Homo sapiens PCNA-associated factor Proteins 0.000 description 3
- 101000695522 Homo sapiens Synaptophysin Proteins 0.000 description 3
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 3
- 102100027347 Neural cell adhesion molecule 1 Human genes 0.000 description 3
- 102100029879 PCNA-associated factor Human genes 0.000 description 3
- 102100028706 Synaptophysin Human genes 0.000 description 3
- 102100034593 Tripartite motif-containing protein 26 Human genes 0.000 description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- RIIWUGSYXOBDMC-UHFFFAOYSA-N benzene-1,2-diamine;hydron;dichloride Chemical compound Cl.Cl.NC1=CC=CC=C1N RIIWUGSYXOBDMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 3
- 201000003146 cystitis Diseases 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 239000002122 magnetic nanoparticle Substances 0.000 description 3
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 3
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 3
- 102200003022 rs1057519698 Human genes 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 108010088201 squamous cell carcinoma-related antigen Proteins 0.000 description 3
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 3
- QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-L (5-bromo-4-chloro-1h-indol-3-yl) phosphate Chemical compound C1=C(Br)C(Cl)=C2C(OP([O-])(=O)[O-])=CNC2=C1 QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- PKYCWFICOKSIHZ-UHFFFAOYSA-N 1-(3,7-dihydroxyphenoxazin-10-yl)ethanone Chemical compound OC1=CC=C2N(C(=O)C)C3=CC=C(O)C=C3OC2=C1 PKYCWFICOKSIHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 4-Nitrophenyl Phosphate Chemical compound OP(O)(=O)OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 2
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 102100024351 Dedicator of cytokinesis protein 7 Human genes 0.000 description 2
- 102000001301 EGF receptor Human genes 0.000 description 2
- 102100023593 Fibroblast growth factor receptor 1 Human genes 0.000 description 2
- 101710182386 Fibroblast growth factor receptor 1 Proteins 0.000 description 2
- 101001052952 Homo sapiens Dedicator of cytokinesis protein 7 Proteins 0.000 description 2
- 101000851181 Homo sapiens Epidermal growth factor receptor Proteins 0.000 description 2
- 101000605639 Homo sapiens Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit alpha isoform Proteins 0.000 description 2
- 101001104566 Homo sapiens Proteasome assembly chaperone 3 Proteins 0.000 description 2
- 101000597045 Homo sapiens Transcriptional enhancer factor TEF-3 Proteins 0.000 description 2
- 101710183399 Keratin, type I cytoskeletal 19 Proteins 0.000 description 2
- 108010066302 Keratin-19 Proteins 0.000 description 2
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 2
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 102100038332 Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit alpha isoform Human genes 0.000 description 2
- 108010039918 Polylysine Proteins 0.000 description 2
- 102100041010 Proteasome assembly chaperone 3 Human genes 0.000 description 2
- 108010005173 SERPIN-B5 Proteins 0.000 description 2
- 102100030333 Serpin B5 Human genes 0.000 description 2
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 2
- 102100035148 Transcriptional enhancer factor TEF-3 Human genes 0.000 description 2
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 208000009956 adenocarcinoma Diseases 0.000 description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 2
- OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N azane;(2e)-3-ethyl-2-[(e)-(3-ethyl-6-sulfo-1,3-benzothiazol-2-ylidene)hydrazinylidene]-1,3-benzothiazole-6-sulfonic acid Chemical compound [NH4+].[NH4+].S/1C2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N(CC)C\1=N/N=C1/SC2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N1CC OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 2
- 230000036765 blood level Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- HWYHZTIRURJOHG-UHFFFAOYSA-N luminol Chemical compound O=C1NNC(=O)C2=C1C(N)=CC=C2 HWYHZTIRURJOHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 229920002037 poly(vinyl butyral) polymer Polymers 0.000 description 2
- 229920000656 polylysine Polymers 0.000 description 2
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 2
- 208000017497 prostate disease Diseases 0.000 description 2
- 108010054624 red fluorescent protein Proteins 0.000 description 2
- 238000012552 review Methods 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 238000001878 scanning electron micrograph Methods 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine Chemical compound CC1=C(N)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(N)=C(C)C=2)=C1 UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KJDSORYAHBAGPP-UHFFFAOYSA-N 4-(3,4-diaminophenyl)benzene-1,2-diamine;hydron;tetrachloride Chemical compound Cl.Cl.Cl.Cl.C1=C(N)C(N)=CC=C1C1=CC=C(N)C(N)=C1 KJDSORYAHBAGPP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CXNVOWPRHWWCQR-UHFFFAOYSA-N 4-Chloro-ortho-toluidine Chemical compound CC1=CC(Cl)=CC=C1N CXNVOWPRHWWCQR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 5,5-dimethyl-2,4-dioxo-1,3-oxazolidine-3-carboxamide Chemical compound CC1(C)OC(=O)N(C(N)=O)C1=O QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000017904 ADRA2C Human genes 0.000 description 1
- 101150009379 AS1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100032153 Adenylate cyclase type 8 Human genes 0.000 description 1
- 102100039736 Adhesion G protein-coupled receptor L1 Human genes 0.000 description 1
- 102100028117 Annexin A10 Human genes 0.000 description 1
- 102100036150 C-X-C motif chemokine 5 Human genes 0.000 description 1
- 102100028742 CAP-Gly domain-containing linker protein 4 Human genes 0.000 description 1
- 108090000932 Calcitonin Gene-Related Peptide Proteins 0.000 description 1
- 102000004414 Calcitonin Gene-Related Peptide Human genes 0.000 description 1
- ZEOWTGPWHLSLOG-UHFFFAOYSA-N Cc1ccc(cc1-c1ccc2c(n[nH]c2c1)-c1cnn(c1)C1CC1)C(=O)Nc1cccc(c1)C(F)(F)F Chemical compound Cc1ccc(cc1-c1ccc2c(n[nH]c2c1)-c1cnn(c1)C1CC1)C(=O)Nc1cccc(c1)C(F)(F)F ZEOWTGPWHLSLOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100324551 Chlamydomonas reinhardtii ARSA1 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000005443 Circulating Neoplastic Cells Diseases 0.000 description 1
- 102000004360 Cofilin 1 Human genes 0.000 description 1
- 108090000996 Cofilin 1 Proteins 0.000 description 1
- 241000239250 Copepoda Species 0.000 description 1
- 241000938605 Crocodylia Species 0.000 description 1
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 description 1
- 206010063057 Cystitis noninfective Diseases 0.000 description 1
- 102100034157 DNA mismatch repair protein Msh2 Human genes 0.000 description 1
- 241000199914 Dinophyceae Species 0.000 description 1
- QXNVGIXVLWOKEQ-UHFFFAOYSA-N Disodium Chemical compound [Na][Na] QXNVGIXVLWOKEQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 1
- 208000000461 Esophageal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 102100026745 Fatty acid-binding protein, liver Human genes 0.000 description 1
- 102100035421 Forkhead box protein O3 Human genes 0.000 description 1
- 102100028461 Frizzled-9 Human genes 0.000 description 1
- 102100037858 G1/S-specific cyclin-E1 Human genes 0.000 description 1
- 102100028447 Galanin receptor type 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100039999 Histone deacetylase 2 Human genes 0.000 description 1
- 101000959328 Homo sapiens Adenylate cyclase type 3 Proteins 0.000 description 1
- 101000775481 Homo sapiens Adenylate cyclase type 8 Proteins 0.000 description 1
- 101000959588 Homo sapiens Adhesion G protein-coupled receptor L1 Proteins 0.000 description 1
- 101000720032 Homo sapiens Alpha-2C adrenergic receptor Proteins 0.000 description 1
- 101000768069 Homo sapiens Annexin A10 Proteins 0.000 description 1
- 101000947186 Homo sapiens C-X-C motif chemokine 5 Proteins 0.000 description 1
- 101000767061 Homo sapiens CAP-Gly domain-containing linker protein 4 Proteins 0.000 description 1
- 101001134036 Homo sapiens DNA mismatch repair protein Msh2 Proteins 0.000 description 1
- 101000911317 Homo sapiens Fatty acid-binding protein, liver Proteins 0.000 description 1
- 101000877681 Homo sapiens Forkhead box protein O3 Proteins 0.000 description 1
- 101001061405 Homo sapiens Frizzled-9 Proteins 0.000 description 1
- 101000738568 Homo sapiens G1/S-specific cyclin-E1 Proteins 0.000 description 1
- 101001061554 Homo sapiens Galanin receptor type 1 Proteins 0.000 description 1
- 101001035011 Homo sapiens Histone deacetylase 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000852815 Homo sapiens Insulin receptor Proteins 0.000 description 1
- 101000605006 Homo sapiens Lysosome-associated membrane glycoprotein 5 Proteins 0.000 description 1
- 101000986598 Homo sapiens Mas-related G-protein coupled receptor member X3 Proteins 0.000 description 1
- 101001055346 Homo sapiens Mediator of RNA polymerase II transcription subunit 30 Proteins 0.000 description 1
- 101001032837 Homo sapiens Metabotropic glutamate receptor 6 Proteins 0.000 description 1
- 101001030211 Homo sapiens Myc proto-oncogene protein Proteins 0.000 description 1
- 101000991410 Homo sapiens Nucleolar and spindle-associated protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000984753 Homo sapiens Serine/threonine-protein kinase B-raf Proteins 0.000 description 1
- 101000980900 Homo sapiens Sororin Proteins 0.000 description 1
- 101000922131 Homo sapiens Tyrosine-protein kinase CSK Proteins 0.000 description 1
- 101001054878 Homo sapiens Tyrosine-protein kinase Lyn Proteins 0.000 description 1
- 101000671855 Homo sapiens Ubiquitin-associated and SH3 domain-containing protein A Proteins 0.000 description 1
- 241000341655 Human papillomavirus type 16 Species 0.000 description 1
- 102100036721 Insulin receptor Human genes 0.000 description 1
- 241000254158 Lampyridae Species 0.000 description 1
- 208000019693 Lung disease Diseases 0.000 description 1
- 102100038212 Lysosome-associated membrane glycoprotein 5 Human genes 0.000 description 1
- 229910015837 MSH2 Inorganic materials 0.000 description 1
- 102100028178 Mas-related G-protein coupled receptor member X3 Human genes 0.000 description 1
- 108010072582 Matrilin Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100033670 Matrilin-3 Human genes 0.000 description 1
- 102100026176 Mediator of RNA polymerase II transcription subunit 30 Human genes 0.000 description 1
- 102100038300 Metabotropic glutamate receptor 6 Human genes 0.000 description 1
- 102100038895 Myc proto-oncogene protein Human genes 0.000 description 1
- 108010082699 NADPH Oxidase 4 Proteins 0.000 description 1
- 102100021872 NADPH oxidase 4 Human genes 0.000 description 1
- 108020001364 NR0 subfamily Proteins 0.000 description 1
- 206010029260 Neuroblastoma Diseases 0.000 description 1
- 108090000770 Neuropilin-2 Proteins 0.000 description 1
- 102100030991 Nucleolar and spindle-associated protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 206010030155 Oesophageal carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 208000009565 Pharyngeal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010034811 Pharyngeal cancer Diseases 0.000 description 1
- 241000254064 Photinus pyralis Species 0.000 description 1
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 101100146539 Podospora anserina RPS15 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010064218 Poly (ADP-Ribose) Polymerase-1 Proteins 0.000 description 1
- 102100023712 Poly [ADP-ribose] polymerase 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100034433 Protein kinase C-binding protein NELL2 Human genes 0.000 description 1
- 241000242739 Renilla Species 0.000 description 1
- 241000242743 Renilla reniformis Species 0.000 description 1
- 102100027103 Serine/threonine-protein kinase B-raf Human genes 0.000 description 1
- 102100024483 Sororin Human genes 0.000 description 1
- 206010041848 Squamous cell carcinoma of the cervix Diseases 0.000 description 1
- 101001045447 Synechocystis sp. (strain PCC 6803 / Kazusa) Sensor histidine kinase Hik2 Proteins 0.000 description 1
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 206010062129 Tongue neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108010088412 Trefoil Factor-1 Proteins 0.000 description 1
- 108010088411 Trefoil Factor-2 Proteins 0.000 description 1
- 102100039175 Trefoil factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100039172 Trefoil factor 2 Human genes 0.000 description 1
- 102100031167 Tyrosine-protein kinase CSK Human genes 0.000 description 1
- 102100026857 Tyrosine-protein kinase Lyn Human genes 0.000 description 1
- 241000607598 Vibrio Species 0.000 description 1
- 206010047741 Vulval cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000004354 Vulvar Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 238000009098 adjuvant therapy Methods 0.000 description 1
- 229960001611 alectinib Drugs 0.000 description 1
- KDGFLJKFZUIJMX-UHFFFAOYSA-N alectinib Chemical compound CCC1=CC=2C(=O)C(C3=CC=C(C=C3N3)C#N)=C3C(C)(C)C=2C=C1N(CC1)CCC1N1CCOCC1 KDGFLJKFZUIJMX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- OHDRQQURAXLVGJ-AXMZSLBLSA-N azane;(2z)-3-ethyl-2-[(z)-(3-ethyl-6-sulfo-1,3-benzothiazol-2-ylidene)hydrazinylidene]-1,3-benzothiazole-6-sulfonic acid Chemical compound [NH4+].[NH4+].S/1C2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N(CC)C\1=N\N=C1/SC2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N1CC OHDRQQURAXLVGJ-AXMZSLBLSA-N 0.000 description 1
- 208000026900 bile duct neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 201000006612 cervical squamous cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 208000006990 cholangiocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 108091092240 circulating cell-free DNA Proteins 0.000 description 1
- DIOQZVSQGTUSAI-UHFFFAOYSA-N decane Chemical compound CCCCCCCCCC DIOQZVSQGTUSAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UKWLRLAKGMZXJC-QIECWBMSSA-L disodium;[4-chloro-3-[(3r,5s)-1-chloro-3'-methoxyspiro[adamantane-4,4'-dioxetane]-3'-yl]phenyl] phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].O1OC2([C@@H]3CC4C[C@H]2CC(Cl)(C4)C3)C1(OC)C1=CC(OP([O-])([O-])=O)=CC=C1Cl UKWLRLAKGMZXJC-QIECWBMSSA-L 0.000 description 1
- 235000014103 egg white Nutrition 0.000 description 1
- 210000000969 egg white Anatomy 0.000 description 1
- 230000005684 electric field Effects 0.000 description 1
- 238000001839 endoscopy Methods 0.000 description 1
- 108700020302 erbB-2 Genes Proteins 0.000 description 1
- 201000004101 esophageal cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 201000010536 head and neck cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000014829 head and neck neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000006750 hematuria Diseases 0.000 description 1
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 1
- VTPSNRIENVXKCI-UHFFFAOYSA-N n-(2,4-dimethylphenyl)-3-hydroxynaphthalene-2-carboxamide Chemical compound CC1=CC(C)=CC=C1NC(=O)C1=CC2=CC=CC=C2C=C1O VTPSNRIENVXKCI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- 108091027963 non-coding RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000042567 non-coding RNA Human genes 0.000 description 1
- 208000002154 non-small cell lung carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 210000003101 oviduct Anatomy 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 210000005267 prostate cell Anatomy 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 102220197962 rs1057519785 Human genes 0.000 description 1
- 102220198074 rs1057519859 Human genes 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 231100000241 scar Toxicity 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 125000003831 tetrazolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 210000001685 thyroid gland Anatomy 0.000 description 1
- 201000006134 tongue cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000029729 tumor suppressor gene on chromosome 11 Diseases 0.000 description 1
- 230000002485 urinary effect Effects 0.000 description 1
- 206010046885 vaginal cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000013139 vaginal neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 201000005102 vulva cancer Diseases 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
- C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2527/00—Reactions demanding special reaction conditions
- C12Q2527/101—Temperature
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2563/00—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties
- C12Q2563/125—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties the label being enzymatic, i.e. proteins, and non proteins, such as nucleic acid with enzymatic activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2563/00—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties
- C12Q2563/131—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties the label being a member of a cognate binding pair, i.e. extends to antibodies, haptens, avidin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2563/00—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties
- C12Q2563/155—Particles of a defined size, e.g. nanoparticles
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/118—Prognosis of disease development
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/158—Expression markers
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Pathology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Oncology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Abstract
본 발명의 진단 방법은 소변, 뇌척수액, 혈장, 혈액, 흉수, 또는 체액 등의 액체 시료로부터 작은 크기의 cfDNA를 농축하고 분리한 후, PCR 없이 특정 암에서 과발현되는 바이오마커를 초고감도로 검출하는 기술에 관한 것이다. 본 발명의 일 실시예 따른 검출 방법은 PCR 증폭 반응이 필요 없어짐에 따라 암을 진단하기까지 걸리는 시간을 크게 줄일 수 있다. 또한, 현장에서 바로 분석할 수 있으며, 빠른 시간 내에 다수의 유전자를 동시에 검색할 수 있는 현장 진단용 검사(Point-Of-Care Testing, POCT)로 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 이중 나선 구조를 가지는 세포유리 DNA를 이용한 암 진단방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 췌장암에서 특이적으로 발현되거나 또는 과발현되는 바이오마커의 유전자를 증폭하는 과정 없이 검출하는 방법 및 이를 이용하기 위한 장치에 관한 것이다.
최근 전 세계적으로 암 질환의 조기 진단 중요성이 크게 부각되고 있다. 따라서 암 조기 진단 방법에 관한 연구가 증가하고 있다. 그러나 현재까지 암 진단 방법은 조직 샘플의 채취 및 내시경 검사와 같은 침습적인 방법으로 이루어지고 있다. 특히, 조직검사는 질병이 의심되는 부위의 일부를 적출해 현미경으로 관찰하는 방식으로 이루어지고 있다. 따라서, 조직 샘플을 채취하기 위해 침이나 펀치, 내시경 또는 복강경을 이용하기 위해서는, 인체를 절개하여야 하므로, 환자가 느끼는 불편함이 적지 않을 뿐 아니라 흉터가 남고 회복하는데 오랜 시간이 걸린다.
침습적인 진단 및 검사 방법의 대안으로 액체 생체 검사를 이용한 분자진단법이 주목받고 있다. 액체 생체 검사는 비침습적인(non-invasive) 방법을 사용하기 때문에, 검사 결과를 신속하게 확인할 수 있다. 그뿐 아니라, 질병의 일부분만 분석할 수 있었던 조직 샘플과 달리, 액체 생체 검사는 질병에 대해 다각도로 분석을 수행할 수 있다. 특히, 액체 생체 검사는 암의 진단에 탁월한 효용성을 발휘할 것으로 전망된다. 특히, 혈액, 소변 등의 체액 검사만으로 신체 부위별 혈액 내에 존재하는 암세포 유래 DNA를 분석하여 암 발생 및 전이 등에 대한 상세한 관찰이 가능할 것으로 예측된다.
분자진단법은 체외진단의 대표적인 기술로서, 혈액, 소변 등의 유전자 정보가 들어 있는 시료로부터, DNA 또는 RNA 변화를 수치 또는 영상을 통해 검출해 진단하는 기법이다. 이는 정확도가 높으며 조직검사를 하지 않아도 된다는 장점이 있기 때문에, 유전체 분석기술의 급속한 발전과 함께 비용 절감의 장점을 바탕으로 암 진단 기술에 적용하려는 시도가 이루어지고 있다.
한편, 세포유리 DNA(cell-free DNA, 이하 cfDNA라 함)는 혈장에 존재하는 세포에서 유래한 DNA를 의미한다. 상기 cfDNA는 통상 이중나선구조를 가질 뿐 아니라, 코일드코일 구조를 가지는 경우가 많다. 상기 cfDNA는 종양 세포에서 유래된 것일 수 있다. 또한, 암 환자로부터 수득된 혈액, 혈장 또는 소변 등과 같은 체액에서는 종양 세포에서 유래된 cfDNA를 발견할 수 있다.
암 환자에서 발견되는 cfDNA는 세포 괴사, 세포 사멸 또는 비뇨 기관의 정상세포 및/또는 암세포에서 유래하는 경우가 많다. 이러한, cfDNA는 다양한 과정을 통해 소변, 혈액 등으로 방출된다. 따라서, 혈액, 혈장 또는 소변 등의 생물학적 시료 내의 cfDNA를 분리하고 검출하는 기술이 발전함에 따라, 액체 생체 검사가 암 위험군 환자를 모니터링 하는데 보다 효과적이고 신뢰할 수 있는 도구가 될 것으로 예측되고 있다. 특히, 소변, 뇌척수액(cerebrospinal fluid, CSF), 혈장, 흉수, 복수, 혈액 또는 체액은 쉽게 얻을 수 있는 시료이므로, 반복적인 샘플링을 통해 단순하고 비침습적인 방법으로 대량의 검체 수집이 가능하다.
그러나, 혈액, 소변 등 액체 시료 내 cfDNA를 분석하고 유전자에 존재하는 변이를 발견하여 암을 조기에 진단하는 방법은 현재의 기술 수준상 많은 어려움이 있다. 따라서, 용이하게 cfDNA를 검출하는 방법의 개발뿐 아니라, 검출 민감도의 향상 및 정확한 암 조기진단을 위한 기술이 요구되고 있는 실정이다.
한편, 한국등록특허 제10-1751962호에는 cfDNA를 검출하기 위하여 프라이머를 이용하여 연쇄중합반응을 하고, 이때, cfDNA에 상보적으로 결합할 수 있는 프로브를 이용하여 cfDNA를 정량화할 수 있다는 점이 개시되어 있다. 그러나 연쇄중합반응을 하기 위하여는 별도의 중합효소 및 실험기자재가 필요하다는 문제점이 여전히 존재할 뿐 아니라, 현장 진단이 용이하지 않다는 문제점이 있다.
또한, 한국등록특허 제10-1701618호에서는 cfDNA를 효과적으로 분리하기 위하여 전기장 변화를 통해 표면의 성질이 변할 수 있는 나노구조체를 개시하고 있다. 상기 나노구조체는 전기변화를 통해, cfDNA를 결합시키거나 해리시킬 수 있어 시료로부터 용이하게 cfDNA를 분리할 수 있다. 그러나, 어떠한 cfDNA가 존재하는지를 확인하기 위하여는 여전히 연쇄중합반응을 이용하여야 하는 한계가 있다.
연쇄중합반응을 수행하여 cfDNA를 증폭하기 위해서는 여러 종류의 프라이머 세트가 필요할 뿐 아니라, 복잡한 단계를 수행해야 하므로 많은 시간이 소요된다. 따라서, PCR을 수행해야만 하는 한계를 극복하고, cfDNA를 높은 정확도로 분석하기 위한 방법을 개발하기 위한 연구가 지속적으로 이루어지고 있다. 뿐만 아니라, cfDNA가 액체 시료에서 극히 낮은 수준으로 발견되기 때문에, 높은 정확도와 적은 시료 양으로 DNA 수득 및 분석 방법을 개발하기 위한 연구 및 효율적인 분석 방법에 대한 연구가 지속적으로 이루어지고 있다.
종래에 cfDNA를 검출하기 위하여는 cfDNA와 상보적인 프라이머가 결합될 수 있도록 이중가닥의 cfDNA를 단일가닥의 DNA로 만드는 변성과정이 필수적이다. 따라서, cfDNA를 검출하기 위하여는 열을 가하는 과정이 필수적이고, 중합효소 등과 반응하는 과정이 필수적이다.
그러나, 본 발명자는 암 세포에서 DNA 전사과정이 활발하게 일어나 전사과정 중 이중가닥의 DNA가 단일가닥으로 풀린 DNA 구간이 많이 존재하고, 이러한 암세포로부터 유리된 cfDNA는 변성과정 없이도 프로브가 cfDNA와 결합할 수 있다는 점을 발견하여 본 발명을 착안하였다.
따라서, 본 발명의 일 측면은 cfDNA에 상보적인 서열을 갖는 프로브를 이용하여 혈장 또는 소변과 같은 액체 시료에 존재하는 암 세포에서 특이적으로 발현되거나 과발현되는 바이오마커를 PCR이나 핵산의 증폭단계없이 검출하는 방법을 제공한다.
또 다른 측면에 따르면, 암세포 바이오마커의 돌연변이(예, SNP)를 PCR이나 핵산의 증폭단계 없이 검출하는 방법을 제공한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 측면은, a) 세포유리 DNA(cell-free DNA, 이하 cfDNA)가 포함된 개체로부터 분리된 생물학적 시료 및 양전하를 띠는 물질을 혼합하는 단계; b) cfDNA가 결합된 양전하를 띠는 물질을 분리하는 단계; c) 상기 혼합물에 상기 cfDNA에 상보적인 서열을 갖는 프로브 및 표지자를 순차적으로 또는 동시에 혼합하는 단계; d) cfDNA에 결합하지 않은 프로브 및 표지자를 제거하는 단계; 및 e) 상기 표지자를 검출하는 단계를 포함하는, 상기 시료로부터, 증폭없이, 췌장암세포 유래의 유전자를 검출하여 췌장암을 진단하는 방법으로서, 상기 cfDNA는 췌장암세포에서 유래된 것이며, 상기 cfDNA에 상보적인 서열을 갖는 프로브는 췌장암 바이오마커로 알려진 유전자에 상보적으로 결합하는 것인, 췌장암을 진단하는 방법을 제공한다.
본 발명의 암 진단 방법은 소변, 뇌척수액, 혈장, 혈액, 흉수, 또는 체액 등의 액체 시료로부터 작은 크기의 cfDNA를 분리한 후, PCR 없이 췌장암에서 특이적으로 또는 과발현되는 바이오마커를 초고감도로 검출하는 기술에 관한 것이다. 본 발명의 일 실시예 따른 검출 방법은 PCR 증폭 반응이 필요 없어짐에 따라 암을 진단하기까지 걸리는 시간을 크게 줄일 수 있다. 또한, 현장에서 바로 분석할 수 있으며, 빠른 시간 내에 다수의 유전자를 동시에 검색할 수 있는 현장 진단용 검사(Point-Of-Care Testing, POCT)로 사용될 수 있다. 특히, 본 발명의 방법에 따르면, 정상인의 혈액에 존재하는 cfDNA와 암환자의 혈액에 존재하는 cfDNA를 구분할 수 있기 때문에 췌장암을 효과적으로 검출할 수 있다.
도 1a는 양전하를 띠는 나노와이어(PEI/Ppy NW)의 주사전자현미경(SEM) 이미지를 나타낸 것이다.
도 1b는 HRP/스트렙타비딘이 결합된 나노입자의 주사전자현미경 이미지를 나타낸 것이다.
도 2a는 양이온성 고분자인 폴리에틸렌이민(polyethyleneimine, PEI)이 표면에 결합된 나노구조체(PEI/mPpy NW)의 제조 및 이를 이용하여 cfDNA를 검출 및 회수하는 방법에 대한 개념적 모식도를 나타낸 도면이다.
도 2b는 양이온성 고분자인 폴리에틸렌이민(polyethyleneimine, PEI)이 표면에 결합된 자성나노구조체(PEI/mPpy NW)를 이용하여 cfDNA를 검출 및 회수하는 과정을 촬영하여 과정별로 나타낸 도면이다.
도 3은 에펜도르프 튜브를 이용하여 cfDNA를 회수하는 과정을 도식화한 도면이다.
도 4 및 도 5는 PD-L1 양성 암세포주 또는 PD-L1 음성 암세포주의 cfDNA로부터 PD-L1 DNA 발현(PD-L1 DNA expression) 및 PD-L1 mRNA 발현 정도를 측정하여 나타낸 도면이다.
도 6 및 도 7은 EpCAM 양성 암세포주 또는 EpCAM 음성 암세포주의 cfDNA로부터 EpCAM DNA 발현(EpCAM DNA expression) 및 EpCAM mRNA 발현 정도를 측정하여 나타낸 도면이다.
도 8 및 도 9는 FOLR1 양성 암세포주 또는 FOLR1 음성 암세포주의 cfDNA로부터 FOLR1 DNA 발현(FOLR1 DNA expression) 및 FOLR1 mRNA 발현 정도를 측정하여 나타낸 도면이다.
도 10 및 도 11은 EGFR 양성 암세포주 또는 EGFR 음성 암세포주의 cfDNA로부터 EGFR DNA 발현(EGFR DNA expression) 및 EGFR mRNA 발현 정도를 측정하여 나타낸 도면이다.
도 12 및 도 13은 ERBB2 양성 암세포주 또는 ERBB2 음성 암세포주의 cfDNA로부터 ERBB2 DNA 발현(ERBB2 DNA expression) 및 ERBB2 mRNA 발현 정도를 측정하여 나타낸 도면이다.
도 14 및 도 15는 OGT 양성 암세포주 또는 OGT 음성 암세포주의 cfDNA로부터 OGT DNA 발현(OGT DNA expression) 정도를 측정하여 나타낸 도면이다.
도 16 내지 도 18은 CEA 양성 암세포주 또는 CEA 음성 암세포주의 cfDNA로부터 CEA DNA 발현(CEA DNA expression) 정도를 측정하여 나타낸 도면이다.
도 19 및 도 20은 PSA 양성 암세포주 또는 PSA 음성 암세포주의 cfDNA로부터 PSA DNA 발현(PSA DNA expression) 정도를 측정하여 나타낸 도면이다.
도 21 및 도 22는 CA19-9 양성 암세포주 또는 CA19-9 음성 암세포주의 cfDNA로부터 CA19-9 DNA 발현(CA19-9 DNA expression) 정도를 측정하여 나타낸 도면이다.
도 23 및 도 24는 CA125 양성 암세포주 또는 CA125 음성 암세포주의 cfDNA로부터 CA125 DNA 발현(CA125 DNA expression) 정도를 측정하여 나타낸 도면이다.
도 25 및 도 26는 AFP 양성 암세포주 또는 AFP 음성 암세포주의 cfDNA로부터 AFP DNA 발현(AFP DNA expression) 정도를 측정하여 나타낸 도면이다.
도 27 내지 도 29는 전립선암 환자로부터 수득한 혈장을 이용하여 PSA, PSMA, PAP 및 PAC3의 DNA 발현 정도를 측정하여 나타낸 도면이다.
도 30 내지 도 32는 정상인으로부터 수득한 혈장을 이용하여 PSA, PSMA, PAP 및 PAC3의 DNA 발현 정도를 측정하여 나타낸 도면이다.
도 33 및 도 34는 폐암 환자로부터 수득한 혈장을 이용하여 NSE, SCC, CEA, Cyfra21-1 및 TPA의 DNA 발현 정도를 측정하여 나타낸 도면이다.
도 35는 정상인으로부터 수득한 혈장을 이용하여 NSE, SCC, CEA, Cyfra21-1 및 TPA의 DNA 발현 정도를 측정하여 나타낸 도면이다.
도 36 내지 도 38은 갑상선암 환자로부터 수득한 혈장을 이용하여 CEA, NSE, TG 및 CALCA의 DNA 발현 정도를 측정하여 나타낸 도면이다.
도 39 및 도 40은 정상인으로부터 수득한 혈장을 이용하여 CEA, NSE, TG 및 CALCA의 DNA 발현 정도를 측정하여 나타낸 도면이다.
도 41 및 도 42는 방광암 환자로부터 수득한 소변을 이용하여 OGT, FGFR3, TP53, NMP22 및 Cyfra21-1의 DNA 발현 정도를 측정하여 나타낸 도면이다.
도 43 및 도 44는 방광염증 환자로부터 수득한 소변을 이용하여 OGT, FGFR3, TP53, NMP22 및 Cyfra21-1의 DNA 발현 정도를 측정하여 나타낸 도면이다.
도 45 및 도 46은 정상인으로부터 수득한 소변을 이용하여 OGT, FGFR3, TP53, NMP22 및 Cyfra21-1의 DNA 발현 정도를 측정하여 나타낸 도면이다.
도 47 및 도 48은 유방암 환자로부터 수득한 혈장을 이용하여 CA27-29, CA15-3 및 CEA의 DNA 발현 정도를 측정하여 나타낸 도면이다.
도 49 및 도 50은 정상인으로부터 수득한 혈장을 이용하여 CA27-29, CA15-3 및 CEA의 DNA 발현 정도를 측정하여 나타낸 도면이다.
도 51 및 도 52는 대장암 환자로부터 수득한 혈장을 이용하여 CEA 및 CA19-9의 DNA 발현 정도를 측정하여 나타낸 도면이다.
도 53 내지 도 55는 정상인으로부터 수득한 혈장을 이용하여 CEA 및 CA19-9의 DNA 발현 정도를 측정하여 나타낸 도면이다.
도 56은 담도암 환자로부터 수득한 혈장을 이용하여 CA19-9, CA125 및 CEA의 DNA 발현 정도를 측정하여 나타낸 도면이다.
도 57 및 도 58은 정상인으로부터 수득한 혈장을 이용하여 CA19-9, CA125 및 CEA의 DNA 발현 정도를 측정하여 나타낸 도면이다.
도 59는 위암 환자로부터 수득한 혈장을 이용하여 CEA, CA19-9, CGB 및 Cyfra21-1의 DNA 발현 정도를 측정하여 나타낸 도면이다.
도 60 및 도 61은 정상인으로부터 수득한 혈장을 이용하여 CEA, CA19-9, CGB 및 Cyfra21-1의 DNA 발현 정도를 측정하여 나타낸 도면이다.
도 62 내지 도 65는 췌장암 환자로부터 수득한 혈장을 이용하여 CA19-9, CA125 및 CEA의 DNA 발현 정도를 측정하여 나타낸 도면이다.
도 66 내지 도 69는 정상인으로부터 수득한 혈장을 이용하여 CA19-9, CA125 및 CEA의 DNA 발현 정도를 측정하여 나타낸 도면이다.
도 70은 폐암 환자로부터 수득한 혈장을 이용해 CPT1A의 DNA 발현 정도를 측정하여 나타낸 도면이다.
도 71은 정상인으로부터 수득한 혈장을 이용해 CPT1A의 DNA 발현 정도를 측정하여 나타낸 도면이다.
도 72는 방광암 환자로부터 수득한 소변을 이용해 CPT1A의 DNA 발현 정도를 측정하여 나타낸 도면이다.
도 73은 정상인으로부터 수득한 소변을 이용해 CPT1A의 DNA 발현 정도를 측정하여 나타낸 도면이다.
도 74는 IFN-γ를 처리하지 않은 PD-L1 양성 암세포주 또는 PD-L1 음성 암세포주의 cfDNA로부터 PD-L1의 DNA 발현 정도와 본 발명의 일 구체예의 방법으로 PD-L1의 검출 여부를 측정하여 나타낸 도면이다.
도 75는 IFN-γ를 처리하지 않은 PD-L1 양성 암세포주 또는 PD-L1 음성 암세포주의 cfDNA로부터 IFNG(IFN-γ)의 DNA 발현 정도를 측정하여 나타낸 도면이다.
도 76은 IFN-γ를 처리하지 않은 PD-L1 양성 암세포주 또는 PD-L1 음성 암세포주의 cfDNA로부터 IFNR1(IFN-γ receptor)의 DNA 발현 정도를 측정하여 나타낸 도면이다.
도 77 내지 도 79는 IFN-γ를 처리한 PD-L1 양성 암세포주 또는 PD-L1 음성 암세포주의 cfDNA로부터 PD-L1, IFNG 및 IFNR1의 DNA 발현 정도를 측정하여 나타낸 도면이다.
도 80은 IFN-γ의 처리유무에 따라 PD-L1 양성 암세포주 또는 PD-L1 음성 암세포주의 cfDNA로부터 PD-L1의 DNA 발현 정도를 측정하여 나타낸 도면이다.
도 81은 IFN-γ의 처리유무에 따라 PD-L1 양성 암세포주 또는 PD-L1 음성 암세포주의 cfDNA로부터 IFN-γ의 DNA 발현 정도를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 82는 IFN-γ의 처리유무에 따라 PD-L1 양성 암세포주 또는 PD-L1 음성 암세포주의 cfDNA로부터 IFNR1의 DNA 발현 정도를 측정하여 나타낸 도면이다.
도 83은 IFN-γ의 처리유무에 따라 PD-L1 양성 암세포주 또는 PD-L1 음성 암세포주의 cfDNA로부터 PD-L1의 DNA 발현 정도를 측정하여 나타낸 도면이다.
도 84는 본 발명의 검출 단계를 도식화한 것이다.
도 84a는 폴리에틸렌이민(PEI)이 표면에 결합된 나노와이어(PEI/Ppy NW)를 이용하여 환자의 체액으로부터 cfDNA를 수득한 후 프로브 및 HRP/스트렙타비딘-나노입자(HRP/st-tagged NP)와의 반응을 통하여 유전자 변이를 약 60분 이내에 분석하는 방법에 대한 모식도를 나타낸 것이다.
도 84b는 나노와이어, 프로브 및 HRP/스트렙타비딘 나노입자를 이용하여 불안정한 cfDNA를 검출하는 방법을 도식화한 것이다.
도 84c는 자성 나노입자를 포함하지 않은 나노와이어를 사용하여 스핀 컬럼(spin column)을 통해 유전자변이를 검출하는 과정을 나타낸 도면이다. 본 발명의 일 구체예에서 라이시스 버퍼를 처리하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.
도 84d는 혈액, 뇌척수액 또는 흉수와 같은 시료에서 불안정한 cfDNA를 검출하기 위한 방법을 시계열적 흐름으로 나타난 것이다.
도 84e는 소변과 같은 시료에서 불안정한 cfDNA를 검출하기 위한 방법을 시계열적 흐름으로 나타난 것이다.
도 84f는 혈액에서 취득한 cfDNA의 상태에 따른 변성 조건의 차이를 도식화한 것이다.
도 84g는 소변, 타액 및 객담에서 취득한 cfDNA의 상태에 따른 변성 조건의 차이를 도식화한 것이다.
도 85는 자성 나노입자를 포함하지 않은 나노와이어를 사용한 스핀 컬럼(spin column)을 통해 cfDNA를 분리한 것을 나타낸 도면이다. 위 사진은 원심분리 전 스핀 컬럼의 SEM 이미지이며, 아래 사진은 원심분리 후 cfDNA가 분리된 스핀 컬럼의 SEM 이미지이다.
도 86은 주사바늘을 이용해 폐암환자로부터 수득한 혈액으로부터 AKL Fusion 및 PIK3CA 등의 암 관련 바이오 마커의 DNA 발현 정도를 측정한 도면이다.
도 87은 랜싯을 이용해 폐암환자로부터 수득한 혈액으로부터 AKL Fusion 및 PIK3CA 등의 암 관련 바이오 마커의 DNA 발현 정도를 측정한 도면이다.
도 88은 주사바늘을 이용해 정상인으로부터 수득한 혈액으로부터 AKL Fusion 등의 암 관련 바이오 마커의 DNA 발현 정도를 측정한 도면이다.
도 89는 랜싯을 이용해 정상인으로부터 수득한 혈액으로부터 AKL Fusion 등의 암 관련 바이오 마커의 DNA 발현 정도를 측정한 도면이다.
도 90은 EML4-ALK variant 3a/b positive cell(H2228) 및 EML4-ALK negative cell(A549, H1993, PC9, RT4) 암세포주의 cfDNA로부터 EML4-ALK의 발현 정도를 RT-PCR을 통해 확인한 도면이다.
도 91은 EML4-ALK variant 3a/b positive cell(H2228) 및 EML4-ALK negative cell(A549, H1993, PC9, RT4) 암세포주의 cfDNA로부터 EML4-ALK의 발현 정도를 웨스턴 블랏을 통해 확인한 도면이다.
도 92는 EML4-ALK variant 3a/b positive cell(H2228) 및 EML4-ALK negative cell(A549, H1993, PC9, RT4) 암세포주의 cfDNA로부터 EML4-ALK의 발현 정도를 RT-PCR 및 웨스턴 블랏을 통해 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 93은 EML4-ALK variant 3a/b positive cell(H2228) 및 EML4-ALK negative cell(A549, H1993, PC9, RT4) 암세포주의 cfDNA로부터 EML4-ALK fusion var.1 또는 EML4-ALK fusion var.3의 DNA 발현 정도를 측정하여 나타낸 도면이다.
도 94는 EML4-ALK variant 3a/b positive cell(H2228) 및 EML4-ALK negative cell(A549, H1993, PC9, RT4) 암세포주의 cfDNA로부터 EML4-ALK fusion var.1 또는 EML4-ALK fusion var.3의 DNA 발현 정도를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 95는 소세포폐암 환자로부터 수득한 혈액으로부터 EML4-ALK fusion var.3, KRAS, SYP, NCAM1, NKX2-1 등의 암 관련 바이오 마커의 DNA 발현 정도를 측정한 도면이다. 그 결과, EML4-ALK fusion이 암조직과 혈액 내 ctDNA에서 동일하게 발견되고, ctDNA 결과로 EML4-ALK fusion이 var.1이 아닌 var.3임을 알게됨으로써, ALK TKI인 Crizotinib이 잘 반응하지 않는다는 것을 알게되었다.
도 96은 암 환자로부터 수득한 혈액으로부터 EML4-ALK fusion var.1 등의 암 관련 바이오 마커의 DNA 발현 정도를 측정한 도면이다. 그 결과, EML4-ALK fusion이 암 조직과 혈액 내 ctDNA에서 동일하게 발견되고, ctDNA 결과로 EML4-ALK fusion이 var.3가 아닌 var.1임을 알게됨으로써, ALK TKI인 Crizotinib이 잘 반응하여 partial response (PR)의 환자 반응을 얻게 되었다.
도 97은 암 환자로부터 수득한 혈액으로부터 EML4-ALK fusion var.3 등의 암 관련 바이오 마커의 DNA 발현 정도를 측정한 도면이다. 그 결과, EML4-ALK fusion이 암조직과 혈액 내 ctDNA에서 동일하게 발견되고, ctDNA 결과로 EML4-ALK fusion이 var.1이 아닌 var.3임을 알게됨으로써, ALK TKI인 Crizotinib이 잘 반응하지 않을 것이기 때문에, 처음부터 alectinib을 처방하여 환자의 반응을 기다리고 있다.
도 98은 암 환자로부터 수득한 혈액으로부터 EML4-ALK fusion var.3, BRAFV800E, TP53 등의 암 관련 바이오 마커의 DNA 발현 정도를 측정한 도면이다. 그 결과, EML4-ALK fusion이 암조직과 혈액 내 ctDNA에서 동일하게 발견되고, ctDNA 결과로 EML4-ALK fusion이 var.1이 아닌 var.3임을 알게됨으로써, ALK TKI인 Crizotinib이 잘 반응하지 않는다는 것(PD)을 알게 되었다.
도 99는 암 환자로부터 수득한 혈액으로부터 EML4-ALK fusion var.1 등의 암 관련 바이오 마커의 DNA 발현 정도를 측정한 도면이다. 그 결과, EML4-ALK fusion 이 암조직과 혈액 내 ctDNA에서 동일하게 발견되고, ctDNA 결과로 EML4-ALK fusion이 var.3가 아닌 var.1임을 알게됨으로써, ALK TKI인 Crizotinib이 잘 반응하여 partial response(PR)의 환자 반응을 얻게 되었다.
도 100은 암 환자로부터 수득한 혈액으로부터 EML4-ALK fusion var.1 등의 암 관련 바이오 마커의 DNA 발현 정도를 측정한 도면이다. 그 결과, EML4-ALK fusion 이 암조직과 혈액 내 ctDNA에서 동일하게 발견되고, ctDNA 결과로 EML4-ALK fusion이 var.3가 아닌 var.1임을 알게됨으로써, ALK TKI가 잘 반응하여 partial response(PR)의 환자 반응을 얻게 되었다.
도 101은 in vitro 상에서 각 암세포주의 cfDNA로부터 OGT의 단백질 발현 정도를 웨스턴 블랏을 통해 확인한 도면이다.
도 102는 in vitro 상에서 각 암세포주의 cfDNA로부터 OGT의 mRNA 발현 정도를 RT-PCR을 통해 확인한 도면이다.
도 103은 in vitro 상에서 각 암세포주의 cfDNA로부터 OGT의 mRNA 발현 정도를 RT-PCR을 통해 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 104는 in vitro 상에서 각 세포주의 cfDNA로부터 OGT의 DNA 발현 정도를 측정한 도면이다.
도 105는 in vitro 상에서 각 세포주의 cfDNA로부터 OGT의 DNA 발현 정도를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 106은 in vitro 상에서 각 세포주로부터 OGT의 발현 정도를 웨스턴블랏, RT-PCR 및 cfDNA 검출을 통해 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 107은 in vitro 상에서 각 세포주로부터 자성 나노입자를 포함하지 않은 나노와이어에 검출된 OGT의 cfDNA를 촬영한 사진이다.
도 108은 정상인, 방광염 환자 및 방광암 환자의 소변으로부터 수득한 cfDNA를 정량한 그래프이다.
도 109는 정상인, 방광염 환자 및 방광암 환자의 소변으로부터 수득한 cfDNA로부터 OGT의 DNA 발현 정도를 분석한 그래프이다.
도 110은 정상인, 방광염 환자 및 방광암 환자의 소변으로부터 수득한 cfDNA로부터 OGT의 DNA 발현 정도를 분석한 그래프이다.
도 111 내지 도 113은 블라인드 테스트로 여러 암 환자의 소변으로부터 수득한 cfDNA로부터 OGT의 DNA 발현 정도를 분석한 도면이다.
도 114 내지 도 116은 갑상선암 환자의 조직으로부터 수득한 cfDNA로부터 BRAF V600E 및 TERT C250T의 DNA 발현 정도를 분석한 도면이다.
도 117 및 도 121은 소세포폐암 환자로부터 수득한 혈액을 이용해 SYP, CgA, NCAM1, NKX2-1 등의 암 관련 바이오 마커의 DNA 발현 정도를 측정한 도면이다. 특히, 도 120의 환자의 경우, small-cell-lung cancer(SCLC)로 원자력 병원에서 확인했으며, crizotinib을 처방했으나 효과가 없음이 확인되었다.
도 122는 비소세포폐암 환자로부터 수득한 혈액을 이용해 SYP, CgA, NCAM1, NKX2-1의 DNA 발현 정도를 측정한 도면이다.
도 123은 항암 치료 전과 후의 폐암환자로부터 수득한 혈액을 이용해 CEA의 DNA 발현 정도 및 환자의 예후를 나타낸 도면이다.
도 124 내지 도 128은 폐암 환자로부터 수득한 혈액을 이용해 NSE, CEA 등의 암 관련 바이오 마커의 DNA 발현 정도를 측정한 도면이다.
도 129 내지 도 133는 정상인으로부터 수득한 혈액을 이용해 NSE, CEA 등의 암 관련 바이오 마커의 DNA 발현 정도를 측정한 도면이다.
도 134는 전립선암 환자로부터 수득한 혈액을 이용해 PSA, PSMA, PAP, PCA3 등의 암 관련 바이오마커의 DNA 발현정도를 측정한 도면이다.
도 135는 정상인으로부터 수득한 혈액을 이용해 PSA, PSMA, PAP, PCA3 등의 암 관련 바이오마커의 DNA 발현 정도를 측정한 도면이다.
도 136은 전립선암 환자 및 정상인으로부터 수득한 혈액을 이용해 TMPRSS2-ERG fusion의 DNA 발현 정도를 측정한 도면이다.
도 137은 갑상선암 환자로부터 수득한 혈액을 이용해 CEA, NSE, TG(Thyroglobulin) 및 CALCA의 DNA 발현 정도를 측정한 도면이다.
도 138은 정상인으로부터 수득한 혈액을 이용해 CEA, NSE, TG(Thyroglobulin) 및 CALCA의 DNA 발현 정도를 측정한 도면이다.
도 139는 갑상선암 환자 및 정상인으로부터 수득한 혈액을 이용해 BRAF mutation(V600E), TERT Promotor mutation(C228T, C250T)의 DNA 발현 정도를 측정한 도면이다.
도 140은 방광암 환자, 혈뇨환자 및 정상인으로부터 수득한 소변을 이용해 OGT, FGFR3, TP53, NMP22 및 Cyfra21-1의 DNA 발현 정도를 측정한 도면이다.
도 141은 유방암 환자 및 정상인으로부터 수득한 혈액을 이용해 CA27-29 및 CEA의 DNA 발현 정도를 측정한 도면이다.
도 142는 대장암 환자 및 정상인으로부터 수득한 혈액을 이용해 CEA 및 CA19-9의 DNA 발현 정도를 측정한 도면이다.
도 143 및 도 144는 담도암 환자 및 정상인으로부터 수득한 혈액을 이용해 CA 19-9, CEA 및 CA123의 DNA 발현 정도를 측정한 도면이다.
도 145는 위암 환자 및 정상인으로부터 수득한 혈액을 이용해 CEA, CA19-9, CGB 및 Cyfra21-1의 DNA 발현 정도를 측정한 도면이다.
도 146은 난소암 환자 및 정상인으로부터 수득한 혈액을 이용해 CA125 및 CEA의 DNA 발현 정도를 측정한 도면이다.
도 147은 췌장암 환자로부터 수득한 혈액을 이용해 CEA, CA19-9 및 CA125의 DNA 발현 정도를 측정한 도면이다.
도 148은 정상인으로부터 수득한 혈액을 이용해 CEA, CA19-9 및 CA125의 DNA 발현 정도를 측정한 도면이다.
도 149 및 도 150은 정상인으로부터 수득한 혈액을 이용해 암 관련 바이오마커의 DNA 발현 정도를 측정하여 조기 진단을 실시한 결과이다(PC: Positive control, PC는 조기 암진단 실험이 정확하게 진행되었는지 확인하는 도구로서, 조기 암진단 결과와 무관하다).
도 151 및 도 152는 본 발명의 일 실시예에서 사용한 암종별 바이오마커를 정리한 도면이다.
도 153은 HPV 양성 자궁경부암 환자(HPV16(+) 및 HPV18(+)) 및 HPV 음성 건강 대조군(HPV-)의 소변에 존재하는 cfDNA와 HPV 18 또는 HPV 16에 특이적인 프로브의 결합 여부를 흡광도를 통하여 확인한 것이다.
도 154는 자궁경부암 환자의 소변에서 분리한 cfDNA에 HPV 16, EGFR19 deletion, HPV 18, 및 EGFR 21 L858R에 특이적인 프로브를 순차적으로 반응시킨 후, cfDNA와 각 프로브의 결합여부를 확인한 것이다.
도 155는 151명의 폐암 환자들의 혈장으로부터 수득한 cfDNA를 이용하여 폐암 환자의 유전자 변이를 분석한 표이다.
도 156는 EGFR 변이가 없는 환자(Wild type), EGFR exon19 deletion이 있는 환자 및 EGFR exon 21 L858R을 가진 폐암 환자의 혈장으로부터 cfDNA를 수득한 후, EGFR exon19 Del에 특이적인 프로브를 혼합한 후, UV 스펙트럼의 흡광도(ΔOD, 500 nm 내지 650 nm) 값의 분석을 통하여 폐암 환자의 유전자 변이를 확인한 것이다.
도 157은 EGFR exon19 deletion이 있는 폐암 환자의 혈장으로부터 cfDNA를 수득한 후, EGFR exon19 Del에 특이적인 프로브를 혼합한 후, 유전자 변이의 특이도와 민감도를 분석한 것이다.
도 158은 EGFR 변이가 없는 환자(Wild type), EGFR exon19 deletion이 있는 환자 및 EGFR exon 21 L858R을 가진 폐암 환자의 혈장으로부터 cfDNA를 수득한 후, EGFR exon21 L858R에 특이적인 프로브를 첨가한 후, UV 스펙트럼의 흡광도(ΔOD, 500 nm 내지 650 nm) 값의 분석을 통하여 환자의 유전자 변이를 확인한 것이다.
도 159는 EGFR exon 21 L858R이 있는 폐암 환자의 혈장으로부터 cfDNA를 수득한 후, EGFR exon 21 L858R에 특이적인 프로브를 추가한 후, 환자의 유전자 변이의 특이도와 민감도를 분석한 것이다.
도 160은 EGFR exon 19 deletion의 CP 및 DP의 서열을 나타낸 것이다. 본 연구에서는 CP_1 및 DP를 사용하여 폐암 환자의 cfDNA 유전자 변이를 분석하였다. 이때, CP는 변이가 있는 부분을 포함하거나 인접한 서열에 상보적으로 결합하도록 디자인한 프로브이며, DP는 변이 서열에서 이격된 부분에 상보적으로 결합하도록 디자인된 프로브를 의미한다.
도 161은 EGFR exon 20 T790M의 CP 및 DP의 서열을 나타낸 것이다. 본 연구에서는 CP2 및 DP를 사용하여 폐암 환자의 cfDNA 유전자 변이를 분석하였다.
도 162는 EGFR exon 21 L858R의 CP 및 DP의 서열을 나타낸 것이다. 본 연구에서는 CP2 및 DP를 사용하여 폐암 환자의 cfDNA 유전자 변이를 분석하였다.
도 163은 EGFR exon 19 deletion 및 EGFR exon 20 T790M 유전자 변이를 가진 폐암 환자의 혈장으로부터 수득된 cfDNA를 EGFR exon 19 deletion(Del19), EGFR exon 20 T790M 및 EGFR exon 21 L858R에 특이적인 프로브를 이용하여 반응시킨 후 HRP/스트렙타비딘 나노입자(다량의 HRP를 포함)를 첨가하여 cfDNA의 검출여부를 색깔 변화 및 UV 흡광도로 확인한 것이다.
도 164는 도 163과 동일한 EGFR exon 19 deletion 및 EGFR exon 20 T790M 유전자 변이를 가진 폐암 환자의 혈장으로부터 수득된 cfDNA를 EGFR exon 19 deletion(Del19), EGFR exon 20 T790M 및 EGFR exon 21 L858R에 특이적인 프로브를 이용하여 반응시킨 후 HRP/스트렙타비딘 복합체(HRP와 스트렙타비딘이 1:1로 결합된 복합체)를 첨가하여 cfDNA의 검출여부를 색깔 변화 및 UV 흡광도로 확인한 것이다. HRP/스트렙타비딘 나노입자에 비해 HRP/스트렙타비딘 복합체의 경우 노이즈가 생성됨을 확인한 것이다.
도 165는 5명의 EGFR exon19 deletion 및 exon20 T790M 유전자 변이를 가진 폐암 환자의 혈장에서 cfDNA를 추출한 후 EGFR exon 19 Del, EGFR exon 20 T790M, EGFR exon 21 L858R에 특이적인 프로브 및 HRP/스트렙타비딘 나노입자(HRP/st-tagged NP)와 반응시킨 결과와 EGFR exon19 Del, EGFR exon 20 T790M, EGFR exon 21 L858R에 특이적인 프로브와 HRP/스트렙타비딘 복합체(HRP와 스트렙타비딘이 1:1로 결합)를 반응시킨 결과의 분석을 통하여 암조직과 유전형과의 일치성을 확인 및 비교한 것이다.
도 166은 EGFR exon 20 T790M 및 EGFR exon 21 L861Q 유전자 변이를 가진 폐암 환자의 혈장으로부터 수득된 cfDNA의 유전자 변이 검출을 위해 EGFR exon 19 deletion(19 Del), EGFR exon 20 T790M, EGFR exon 21 L858R 및 EGFR exon L861Q에 특이적인 프로브 및 HRP/st-tagged NP을 한꺼번에 혼합한 결과 암조직과 동일하게 EGFR exon 20 T790M 및 EGFR exon 21 L861Q 에서만 유전자변이가 관찰됨을 UV 흡광도로 확인한 것이다.
도 167은 ALK-EML4 fusion 및 ALK point mutation(I1171N/T) 유전자 변이를 가진 폐암 환자의 혈장으로부터 수득된 cfDNA의 유전자 변이 검출을 위해 ALK-EML4 fusion 및 ALK point mutation(T1151, L1152P, L1152R, C1156Y, I1171N/T)에 특이적인 프로브 및 HRP/st-tagged NP을 한꺼번에 혼합한 결과 암조직과 동일하게 ALK-EML4 fusion 및 ALK point mutation(I1171N/T) 유전형이 검출되는 것을 확인하였다.
도 168은 BRAF V600E 유전자 변이를 가진 갑상선암 환자의 혈장으로부터 수득된 cfDNA의 유전자 변이 검출을 위해 BRAF V600E에 특이적인 프로브 및 HRP/st-tagged NP을 한꺼번에 혼합하였다. 그 결과 BRAF V600E 유전자 변이가 환자의 유전형과 동일하게 검출되는 것을 확인하였다.
도 169는 정상인의 혈액에서 채취한 시료를 여러가지 온도 조건으로 변성 시킨 후, 처리조건에 따라 불안정한 cfDNA의 검출 결과를 나타낸 것이다.
도 170은 환자의 혈액에서 채취한 시료를 여러가지 온도 조건으로 변성 시킨 후, 처리조건에 따라 불안정한 cfDNA의 검출 결과를 나타낸 것이다.
도 171은 돌연변이 세포주에서 얻은 fDNA를 여러가지 온도 조건으로 변성 시킨 후, 처리조건에 따라 불안정한 cfDNA의 검출 결과를 나타낸 것이다.
도 172는 돌연변이 세포주에서 얻은 fDNA를 DNase로 37℃, 30분간 처리 후, 처리조건에 따라 불안정한 cfDNA의 검출 결과를 나타낸 것이다.
도 173은 돌연변이 세포주에서 얻은 fDNA를 DNase로 37℃, 60분간 처리 후, 처리조건에 따라 불안정한 cfDNA의 검출 결과를 나타낸 것이다.
도 174는 돌연변이 세포주에서 얻은 fDNA를 DNase로 37℃, 120분간 처리 후, 처리조건에 따라 불안정한 cfDNA의 검출 결과를 나타낸 것이다.
도 175는 DNase의 활성에 따른 불안정한 cfDNA와 안정한 cfDNA의 차이점을 확인하기 위하여, DNase 1 ㎕ 또는 2 ㎕를 24℃, 120분간 처리한 결과를 나타낸 것이다.
도 176은 DNase의 활성에 따른 불안정한 cfDNA와 안정한 cfDNA의 차이점을 확인하기 위하여, DNase 1 ㎕ 또는 2 ㎕를 3℃, 120분간 처리한 결과를 나타낸 것이다.
도 177은 본 발명의 일 실시예로서 폐암환자의 혈장에서 cfDNA를 이용하여 EML4-ALK fusion gene을 검출할 때 cutoff 값의 일 구체예를 나타낸 것이다.
도 1b는 HRP/스트렙타비딘이 결합된 나노입자의 주사전자현미경 이미지를 나타낸 것이다.
도 2a는 양이온성 고분자인 폴리에틸렌이민(polyethyleneimine, PEI)이 표면에 결합된 나노구조체(PEI/mPpy NW)의 제조 및 이를 이용하여 cfDNA를 검출 및 회수하는 방법에 대한 개념적 모식도를 나타낸 도면이다.
도 2b는 양이온성 고분자인 폴리에틸렌이민(polyethyleneimine, PEI)이 표면에 결합된 자성나노구조체(PEI/mPpy NW)를 이용하여 cfDNA를 검출 및 회수하는 과정을 촬영하여 과정별로 나타낸 도면이다.
도 3은 에펜도르프 튜브를 이용하여 cfDNA를 회수하는 과정을 도식화한 도면이다.
도 4 및 도 5는 PD-L1 양성 암세포주 또는 PD-L1 음성 암세포주의 cfDNA로부터 PD-L1 DNA 발현(PD-L1 DNA expression) 및 PD-L1 mRNA 발현 정도를 측정하여 나타낸 도면이다.
도 6 및 도 7은 EpCAM 양성 암세포주 또는 EpCAM 음성 암세포주의 cfDNA로부터 EpCAM DNA 발현(EpCAM DNA expression) 및 EpCAM mRNA 발현 정도를 측정하여 나타낸 도면이다.
도 8 및 도 9는 FOLR1 양성 암세포주 또는 FOLR1 음성 암세포주의 cfDNA로부터 FOLR1 DNA 발현(FOLR1 DNA expression) 및 FOLR1 mRNA 발현 정도를 측정하여 나타낸 도면이다.
도 10 및 도 11은 EGFR 양성 암세포주 또는 EGFR 음성 암세포주의 cfDNA로부터 EGFR DNA 발현(EGFR DNA expression) 및 EGFR mRNA 발현 정도를 측정하여 나타낸 도면이다.
도 12 및 도 13은 ERBB2 양성 암세포주 또는 ERBB2 음성 암세포주의 cfDNA로부터 ERBB2 DNA 발현(ERBB2 DNA expression) 및 ERBB2 mRNA 발현 정도를 측정하여 나타낸 도면이다.
도 14 및 도 15는 OGT 양성 암세포주 또는 OGT 음성 암세포주의 cfDNA로부터 OGT DNA 발현(OGT DNA expression) 정도를 측정하여 나타낸 도면이다.
도 16 내지 도 18은 CEA 양성 암세포주 또는 CEA 음성 암세포주의 cfDNA로부터 CEA DNA 발현(CEA DNA expression) 정도를 측정하여 나타낸 도면이다.
도 19 및 도 20은 PSA 양성 암세포주 또는 PSA 음성 암세포주의 cfDNA로부터 PSA DNA 발현(PSA DNA expression) 정도를 측정하여 나타낸 도면이다.
도 21 및 도 22는 CA19-9 양성 암세포주 또는 CA19-9 음성 암세포주의 cfDNA로부터 CA19-9 DNA 발현(CA19-9 DNA expression) 정도를 측정하여 나타낸 도면이다.
도 23 및 도 24는 CA125 양성 암세포주 또는 CA125 음성 암세포주의 cfDNA로부터 CA125 DNA 발현(CA125 DNA expression) 정도를 측정하여 나타낸 도면이다.
도 25 및 도 26는 AFP 양성 암세포주 또는 AFP 음성 암세포주의 cfDNA로부터 AFP DNA 발현(AFP DNA expression) 정도를 측정하여 나타낸 도면이다.
도 27 내지 도 29는 전립선암 환자로부터 수득한 혈장을 이용하여 PSA, PSMA, PAP 및 PAC3의 DNA 발현 정도를 측정하여 나타낸 도면이다.
도 30 내지 도 32는 정상인으로부터 수득한 혈장을 이용하여 PSA, PSMA, PAP 및 PAC3의 DNA 발현 정도를 측정하여 나타낸 도면이다.
도 33 및 도 34는 폐암 환자로부터 수득한 혈장을 이용하여 NSE, SCC, CEA, Cyfra21-1 및 TPA의 DNA 발현 정도를 측정하여 나타낸 도면이다.
도 35는 정상인으로부터 수득한 혈장을 이용하여 NSE, SCC, CEA, Cyfra21-1 및 TPA의 DNA 발현 정도를 측정하여 나타낸 도면이다.
도 36 내지 도 38은 갑상선암 환자로부터 수득한 혈장을 이용하여 CEA, NSE, TG 및 CALCA의 DNA 발현 정도를 측정하여 나타낸 도면이다.
도 39 및 도 40은 정상인으로부터 수득한 혈장을 이용하여 CEA, NSE, TG 및 CALCA의 DNA 발현 정도를 측정하여 나타낸 도면이다.
도 41 및 도 42는 방광암 환자로부터 수득한 소변을 이용하여 OGT, FGFR3, TP53, NMP22 및 Cyfra21-1의 DNA 발현 정도를 측정하여 나타낸 도면이다.
도 43 및 도 44는 방광염증 환자로부터 수득한 소변을 이용하여 OGT, FGFR3, TP53, NMP22 및 Cyfra21-1의 DNA 발현 정도를 측정하여 나타낸 도면이다.
도 45 및 도 46은 정상인으로부터 수득한 소변을 이용하여 OGT, FGFR3, TP53, NMP22 및 Cyfra21-1의 DNA 발현 정도를 측정하여 나타낸 도면이다.
도 47 및 도 48은 유방암 환자로부터 수득한 혈장을 이용하여 CA27-29, CA15-3 및 CEA의 DNA 발현 정도를 측정하여 나타낸 도면이다.
도 49 및 도 50은 정상인으로부터 수득한 혈장을 이용하여 CA27-29, CA15-3 및 CEA의 DNA 발현 정도를 측정하여 나타낸 도면이다.
도 51 및 도 52는 대장암 환자로부터 수득한 혈장을 이용하여 CEA 및 CA19-9의 DNA 발현 정도를 측정하여 나타낸 도면이다.
도 53 내지 도 55는 정상인으로부터 수득한 혈장을 이용하여 CEA 및 CA19-9의 DNA 발현 정도를 측정하여 나타낸 도면이다.
도 56은 담도암 환자로부터 수득한 혈장을 이용하여 CA19-9, CA125 및 CEA의 DNA 발현 정도를 측정하여 나타낸 도면이다.
도 57 및 도 58은 정상인으로부터 수득한 혈장을 이용하여 CA19-9, CA125 및 CEA의 DNA 발현 정도를 측정하여 나타낸 도면이다.
도 59는 위암 환자로부터 수득한 혈장을 이용하여 CEA, CA19-9, CGB 및 Cyfra21-1의 DNA 발현 정도를 측정하여 나타낸 도면이다.
도 60 및 도 61은 정상인으로부터 수득한 혈장을 이용하여 CEA, CA19-9, CGB 및 Cyfra21-1의 DNA 발현 정도를 측정하여 나타낸 도면이다.
도 62 내지 도 65는 췌장암 환자로부터 수득한 혈장을 이용하여 CA19-9, CA125 및 CEA의 DNA 발현 정도를 측정하여 나타낸 도면이다.
도 66 내지 도 69는 정상인으로부터 수득한 혈장을 이용하여 CA19-9, CA125 및 CEA의 DNA 발현 정도를 측정하여 나타낸 도면이다.
도 70은 폐암 환자로부터 수득한 혈장을 이용해 CPT1A의 DNA 발현 정도를 측정하여 나타낸 도면이다.
도 71은 정상인으로부터 수득한 혈장을 이용해 CPT1A의 DNA 발현 정도를 측정하여 나타낸 도면이다.
도 72는 방광암 환자로부터 수득한 소변을 이용해 CPT1A의 DNA 발현 정도를 측정하여 나타낸 도면이다.
도 73은 정상인으로부터 수득한 소변을 이용해 CPT1A의 DNA 발현 정도를 측정하여 나타낸 도면이다.
도 74는 IFN-γ를 처리하지 않은 PD-L1 양성 암세포주 또는 PD-L1 음성 암세포주의 cfDNA로부터 PD-L1의 DNA 발현 정도와 본 발명의 일 구체예의 방법으로 PD-L1의 검출 여부를 측정하여 나타낸 도면이다.
도 75는 IFN-γ를 처리하지 않은 PD-L1 양성 암세포주 또는 PD-L1 음성 암세포주의 cfDNA로부터 IFNG(IFN-γ)의 DNA 발현 정도를 측정하여 나타낸 도면이다.
도 76은 IFN-γ를 처리하지 않은 PD-L1 양성 암세포주 또는 PD-L1 음성 암세포주의 cfDNA로부터 IFNR1(IFN-γ receptor)의 DNA 발현 정도를 측정하여 나타낸 도면이다.
도 77 내지 도 79는 IFN-γ를 처리한 PD-L1 양성 암세포주 또는 PD-L1 음성 암세포주의 cfDNA로부터 PD-L1, IFNG 및 IFNR1의 DNA 발현 정도를 측정하여 나타낸 도면이다.
도 80은 IFN-γ의 처리유무에 따라 PD-L1 양성 암세포주 또는 PD-L1 음성 암세포주의 cfDNA로부터 PD-L1의 DNA 발현 정도를 측정하여 나타낸 도면이다.
도 81은 IFN-γ의 처리유무에 따라 PD-L1 양성 암세포주 또는 PD-L1 음성 암세포주의 cfDNA로부터 IFN-γ의 DNA 발현 정도를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 82는 IFN-γ의 처리유무에 따라 PD-L1 양성 암세포주 또는 PD-L1 음성 암세포주의 cfDNA로부터 IFNR1의 DNA 발현 정도를 측정하여 나타낸 도면이다.
도 83은 IFN-γ의 처리유무에 따라 PD-L1 양성 암세포주 또는 PD-L1 음성 암세포주의 cfDNA로부터 PD-L1의 DNA 발현 정도를 측정하여 나타낸 도면이다.
도 84는 본 발명의 검출 단계를 도식화한 것이다.
도 84a는 폴리에틸렌이민(PEI)이 표면에 결합된 나노와이어(PEI/Ppy NW)를 이용하여 환자의 체액으로부터 cfDNA를 수득한 후 프로브 및 HRP/스트렙타비딘-나노입자(HRP/st-tagged NP)와의 반응을 통하여 유전자 변이를 약 60분 이내에 분석하는 방법에 대한 모식도를 나타낸 것이다.
도 84b는 나노와이어, 프로브 및 HRP/스트렙타비딘 나노입자를 이용하여 불안정한 cfDNA를 검출하는 방법을 도식화한 것이다.
도 84c는 자성 나노입자를 포함하지 않은 나노와이어를 사용하여 스핀 컬럼(spin column)을 통해 유전자변이를 검출하는 과정을 나타낸 도면이다. 본 발명의 일 구체예에서 라이시스 버퍼를 처리하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.
도 84d는 혈액, 뇌척수액 또는 흉수와 같은 시료에서 불안정한 cfDNA를 검출하기 위한 방법을 시계열적 흐름으로 나타난 것이다.
도 84e는 소변과 같은 시료에서 불안정한 cfDNA를 검출하기 위한 방법을 시계열적 흐름으로 나타난 것이다.
도 84f는 혈액에서 취득한 cfDNA의 상태에 따른 변성 조건의 차이를 도식화한 것이다.
도 84g는 소변, 타액 및 객담에서 취득한 cfDNA의 상태에 따른 변성 조건의 차이를 도식화한 것이다.
도 85는 자성 나노입자를 포함하지 않은 나노와이어를 사용한 스핀 컬럼(spin column)을 통해 cfDNA를 분리한 것을 나타낸 도면이다. 위 사진은 원심분리 전 스핀 컬럼의 SEM 이미지이며, 아래 사진은 원심분리 후 cfDNA가 분리된 스핀 컬럼의 SEM 이미지이다.
도 86은 주사바늘을 이용해 폐암환자로부터 수득한 혈액으로부터 AKL Fusion 및 PIK3CA 등의 암 관련 바이오 마커의 DNA 발현 정도를 측정한 도면이다.
도 87은 랜싯을 이용해 폐암환자로부터 수득한 혈액으로부터 AKL Fusion 및 PIK3CA 등의 암 관련 바이오 마커의 DNA 발현 정도를 측정한 도면이다.
도 88은 주사바늘을 이용해 정상인으로부터 수득한 혈액으로부터 AKL Fusion 등의 암 관련 바이오 마커의 DNA 발현 정도를 측정한 도면이다.
도 89는 랜싯을 이용해 정상인으로부터 수득한 혈액으로부터 AKL Fusion 등의 암 관련 바이오 마커의 DNA 발현 정도를 측정한 도면이다.
도 90은 EML4-ALK variant 3a/b positive cell(H2228) 및 EML4-ALK negative cell(A549, H1993, PC9, RT4) 암세포주의 cfDNA로부터 EML4-ALK의 발현 정도를 RT-PCR을 통해 확인한 도면이다.
도 91은 EML4-ALK variant 3a/b positive cell(H2228) 및 EML4-ALK negative cell(A549, H1993, PC9, RT4) 암세포주의 cfDNA로부터 EML4-ALK의 발현 정도를 웨스턴 블랏을 통해 확인한 도면이다.
도 92는 EML4-ALK variant 3a/b positive cell(H2228) 및 EML4-ALK negative cell(A549, H1993, PC9, RT4) 암세포주의 cfDNA로부터 EML4-ALK의 발현 정도를 RT-PCR 및 웨스턴 블랏을 통해 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 93은 EML4-ALK variant 3a/b positive cell(H2228) 및 EML4-ALK negative cell(A549, H1993, PC9, RT4) 암세포주의 cfDNA로부터 EML4-ALK fusion var.1 또는 EML4-ALK fusion var.3의 DNA 발현 정도를 측정하여 나타낸 도면이다.
도 94는 EML4-ALK variant 3a/b positive cell(H2228) 및 EML4-ALK negative cell(A549, H1993, PC9, RT4) 암세포주의 cfDNA로부터 EML4-ALK fusion var.1 또는 EML4-ALK fusion var.3의 DNA 발현 정도를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 95는 소세포폐암 환자로부터 수득한 혈액으로부터 EML4-ALK fusion var.3, KRAS, SYP, NCAM1, NKX2-1 등의 암 관련 바이오 마커의 DNA 발현 정도를 측정한 도면이다. 그 결과, EML4-ALK fusion이 암조직과 혈액 내 ctDNA에서 동일하게 발견되고, ctDNA 결과로 EML4-ALK fusion이 var.1이 아닌 var.3임을 알게됨으로써, ALK TKI인 Crizotinib이 잘 반응하지 않는다는 것을 알게되었다.
도 96은 암 환자로부터 수득한 혈액으로부터 EML4-ALK fusion var.1 등의 암 관련 바이오 마커의 DNA 발현 정도를 측정한 도면이다. 그 결과, EML4-ALK fusion이 암 조직과 혈액 내 ctDNA에서 동일하게 발견되고, ctDNA 결과로 EML4-ALK fusion이 var.3가 아닌 var.1임을 알게됨으로써, ALK TKI인 Crizotinib이 잘 반응하여 partial response (PR)의 환자 반응을 얻게 되었다.
도 97은 암 환자로부터 수득한 혈액으로부터 EML4-ALK fusion var.3 등의 암 관련 바이오 마커의 DNA 발현 정도를 측정한 도면이다. 그 결과, EML4-ALK fusion이 암조직과 혈액 내 ctDNA에서 동일하게 발견되고, ctDNA 결과로 EML4-ALK fusion이 var.1이 아닌 var.3임을 알게됨으로써, ALK TKI인 Crizotinib이 잘 반응하지 않을 것이기 때문에, 처음부터 alectinib을 처방하여 환자의 반응을 기다리고 있다.
도 98은 암 환자로부터 수득한 혈액으로부터 EML4-ALK fusion var.3, BRAFV800E, TP53 등의 암 관련 바이오 마커의 DNA 발현 정도를 측정한 도면이다. 그 결과, EML4-ALK fusion이 암조직과 혈액 내 ctDNA에서 동일하게 발견되고, ctDNA 결과로 EML4-ALK fusion이 var.1이 아닌 var.3임을 알게됨으로써, ALK TKI인 Crizotinib이 잘 반응하지 않는다는 것(PD)을 알게 되었다.
도 99는 암 환자로부터 수득한 혈액으로부터 EML4-ALK fusion var.1 등의 암 관련 바이오 마커의 DNA 발현 정도를 측정한 도면이다. 그 결과, EML4-ALK fusion 이 암조직과 혈액 내 ctDNA에서 동일하게 발견되고, ctDNA 결과로 EML4-ALK fusion이 var.3가 아닌 var.1임을 알게됨으로써, ALK TKI인 Crizotinib이 잘 반응하여 partial response(PR)의 환자 반응을 얻게 되었다.
도 100은 암 환자로부터 수득한 혈액으로부터 EML4-ALK fusion var.1 등의 암 관련 바이오 마커의 DNA 발현 정도를 측정한 도면이다. 그 결과, EML4-ALK fusion 이 암조직과 혈액 내 ctDNA에서 동일하게 발견되고, ctDNA 결과로 EML4-ALK fusion이 var.3가 아닌 var.1임을 알게됨으로써, ALK TKI가 잘 반응하여 partial response(PR)의 환자 반응을 얻게 되었다.
도 101은 in vitro 상에서 각 암세포주의 cfDNA로부터 OGT의 단백질 발현 정도를 웨스턴 블랏을 통해 확인한 도면이다.
도 102는 in vitro 상에서 각 암세포주의 cfDNA로부터 OGT의 mRNA 발현 정도를 RT-PCR을 통해 확인한 도면이다.
도 103은 in vitro 상에서 각 암세포주의 cfDNA로부터 OGT의 mRNA 발현 정도를 RT-PCR을 통해 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 104는 in vitro 상에서 각 세포주의 cfDNA로부터 OGT의 DNA 발현 정도를 측정한 도면이다.
도 105는 in vitro 상에서 각 세포주의 cfDNA로부터 OGT의 DNA 발현 정도를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 106은 in vitro 상에서 각 세포주로부터 OGT의 발현 정도를 웨스턴블랏, RT-PCR 및 cfDNA 검출을 통해 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 107은 in vitro 상에서 각 세포주로부터 자성 나노입자를 포함하지 않은 나노와이어에 검출된 OGT의 cfDNA를 촬영한 사진이다.
도 108은 정상인, 방광염 환자 및 방광암 환자의 소변으로부터 수득한 cfDNA를 정량한 그래프이다.
도 109는 정상인, 방광염 환자 및 방광암 환자의 소변으로부터 수득한 cfDNA로부터 OGT의 DNA 발현 정도를 분석한 그래프이다.
도 110은 정상인, 방광염 환자 및 방광암 환자의 소변으로부터 수득한 cfDNA로부터 OGT의 DNA 발현 정도를 분석한 그래프이다.
도 111 내지 도 113은 블라인드 테스트로 여러 암 환자의 소변으로부터 수득한 cfDNA로부터 OGT의 DNA 발현 정도를 분석한 도면이다.
도 114 내지 도 116은 갑상선암 환자의 조직으로부터 수득한 cfDNA로부터 BRAF V600E 및 TERT C250T의 DNA 발현 정도를 분석한 도면이다.
도 117 및 도 121은 소세포폐암 환자로부터 수득한 혈액을 이용해 SYP, CgA, NCAM1, NKX2-1 등의 암 관련 바이오 마커의 DNA 발현 정도를 측정한 도면이다. 특히, 도 120의 환자의 경우, small-cell-lung cancer(SCLC)로 원자력 병원에서 확인했으며, crizotinib을 처방했으나 효과가 없음이 확인되었다.
도 122는 비소세포폐암 환자로부터 수득한 혈액을 이용해 SYP, CgA, NCAM1, NKX2-1의 DNA 발현 정도를 측정한 도면이다.
도 123은 항암 치료 전과 후의 폐암환자로부터 수득한 혈액을 이용해 CEA의 DNA 발현 정도 및 환자의 예후를 나타낸 도면이다.
도 124 내지 도 128은 폐암 환자로부터 수득한 혈액을 이용해 NSE, CEA 등의 암 관련 바이오 마커의 DNA 발현 정도를 측정한 도면이다.
도 129 내지 도 133는 정상인으로부터 수득한 혈액을 이용해 NSE, CEA 등의 암 관련 바이오 마커의 DNA 발현 정도를 측정한 도면이다.
도 134는 전립선암 환자로부터 수득한 혈액을 이용해 PSA, PSMA, PAP, PCA3 등의 암 관련 바이오마커의 DNA 발현정도를 측정한 도면이다.
도 135는 정상인으로부터 수득한 혈액을 이용해 PSA, PSMA, PAP, PCA3 등의 암 관련 바이오마커의 DNA 발현 정도를 측정한 도면이다.
도 136은 전립선암 환자 및 정상인으로부터 수득한 혈액을 이용해 TMPRSS2-ERG fusion의 DNA 발현 정도를 측정한 도면이다.
도 137은 갑상선암 환자로부터 수득한 혈액을 이용해 CEA, NSE, TG(Thyroglobulin) 및 CALCA의 DNA 발현 정도를 측정한 도면이다.
도 138은 정상인으로부터 수득한 혈액을 이용해 CEA, NSE, TG(Thyroglobulin) 및 CALCA의 DNA 발현 정도를 측정한 도면이다.
도 139는 갑상선암 환자 및 정상인으로부터 수득한 혈액을 이용해 BRAF mutation(V600E), TERT Promotor mutation(C228T, C250T)의 DNA 발현 정도를 측정한 도면이다.
도 140은 방광암 환자, 혈뇨환자 및 정상인으로부터 수득한 소변을 이용해 OGT, FGFR3, TP53, NMP22 및 Cyfra21-1의 DNA 발현 정도를 측정한 도면이다.
도 141은 유방암 환자 및 정상인으로부터 수득한 혈액을 이용해 CA27-29 및 CEA의 DNA 발현 정도를 측정한 도면이다.
도 142는 대장암 환자 및 정상인으로부터 수득한 혈액을 이용해 CEA 및 CA19-9의 DNA 발현 정도를 측정한 도면이다.
도 143 및 도 144는 담도암 환자 및 정상인으로부터 수득한 혈액을 이용해 CA 19-9, CEA 및 CA123의 DNA 발현 정도를 측정한 도면이다.
도 145는 위암 환자 및 정상인으로부터 수득한 혈액을 이용해 CEA, CA19-9, CGB 및 Cyfra21-1의 DNA 발현 정도를 측정한 도면이다.
도 146은 난소암 환자 및 정상인으로부터 수득한 혈액을 이용해 CA125 및 CEA의 DNA 발현 정도를 측정한 도면이다.
도 147은 췌장암 환자로부터 수득한 혈액을 이용해 CEA, CA19-9 및 CA125의 DNA 발현 정도를 측정한 도면이다.
도 148은 정상인으로부터 수득한 혈액을 이용해 CEA, CA19-9 및 CA125의 DNA 발현 정도를 측정한 도면이다.
도 149 및 도 150은 정상인으로부터 수득한 혈액을 이용해 암 관련 바이오마커의 DNA 발현 정도를 측정하여 조기 진단을 실시한 결과이다(PC: Positive control, PC는 조기 암진단 실험이 정확하게 진행되었는지 확인하는 도구로서, 조기 암진단 결과와 무관하다).
도 151 및 도 152는 본 발명의 일 실시예에서 사용한 암종별 바이오마커를 정리한 도면이다.
도 153은 HPV 양성 자궁경부암 환자(HPV16(+) 및 HPV18(+)) 및 HPV 음성 건강 대조군(HPV-)의 소변에 존재하는 cfDNA와 HPV 18 또는 HPV 16에 특이적인 프로브의 결합 여부를 흡광도를 통하여 확인한 것이다.
도 154는 자궁경부암 환자의 소변에서 분리한 cfDNA에 HPV 16, EGFR19 deletion, HPV 18, 및 EGFR 21 L858R에 특이적인 프로브를 순차적으로 반응시킨 후, cfDNA와 각 프로브의 결합여부를 확인한 것이다.
도 155는 151명의 폐암 환자들의 혈장으로부터 수득한 cfDNA를 이용하여 폐암 환자의 유전자 변이를 분석한 표이다.
도 156는 EGFR 변이가 없는 환자(Wild type), EGFR exon19 deletion이 있는 환자 및 EGFR exon 21 L858R을 가진 폐암 환자의 혈장으로부터 cfDNA를 수득한 후, EGFR exon19 Del에 특이적인 프로브를 혼합한 후, UV 스펙트럼의 흡광도(ΔOD, 500 nm 내지 650 nm) 값의 분석을 통하여 폐암 환자의 유전자 변이를 확인한 것이다.
도 157은 EGFR exon19 deletion이 있는 폐암 환자의 혈장으로부터 cfDNA를 수득한 후, EGFR exon19 Del에 특이적인 프로브를 혼합한 후, 유전자 변이의 특이도와 민감도를 분석한 것이다.
도 158은 EGFR 변이가 없는 환자(Wild type), EGFR exon19 deletion이 있는 환자 및 EGFR exon 21 L858R을 가진 폐암 환자의 혈장으로부터 cfDNA를 수득한 후, EGFR exon21 L858R에 특이적인 프로브를 첨가한 후, UV 스펙트럼의 흡광도(ΔOD, 500 nm 내지 650 nm) 값의 분석을 통하여 환자의 유전자 변이를 확인한 것이다.
도 159는 EGFR exon 21 L858R이 있는 폐암 환자의 혈장으로부터 cfDNA를 수득한 후, EGFR exon 21 L858R에 특이적인 프로브를 추가한 후, 환자의 유전자 변이의 특이도와 민감도를 분석한 것이다.
도 160은 EGFR exon 19 deletion의 CP 및 DP의 서열을 나타낸 것이다. 본 연구에서는 CP_1 및 DP를 사용하여 폐암 환자의 cfDNA 유전자 변이를 분석하였다. 이때, CP는 변이가 있는 부분을 포함하거나 인접한 서열에 상보적으로 결합하도록 디자인한 프로브이며, DP는 변이 서열에서 이격된 부분에 상보적으로 결합하도록 디자인된 프로브를 의미한다.
도 161은 EGFR exon 20 T790M의 CP 및 DP의 서열을 나타낸 것이다. 본 연구에서는 CP2 및 DP를 사용하여 폐암 환자의 cfDNA 유전자 변이를 분석하였다.
도 162는 EGFR exon 21 L858R의 CP 및 DP의 서열을 나타낸 것이다. 본 연구에서는 CP2 및 DP를 사용하여 폐암 환자의 cfDNA 유전자 변이를 분석하였다.
도 163은 EGFR exon 19 deletion 및 EGFR exon 20 T790M 유전자 변이를 가진 폐암 환자의 혈장으로부터 수득된 cfDNA를 EGFR exon 19 deletion(Del19), EGFR exon 20 T790M 및 EGFR exon 21 L858R에 특이적인 프로브를 이용하여 반응시킨 후 HRP/스트렙타비딘 나노입자(다량의 HRP를 포함)를 첨가하여 cfDNA의 검출여부를 색깔 변화 및 UV 흡광도로 확인한 것이다.
도 164는 도 163과 동일한 EGFR exon 19 deletion 및 EGFR exon 20 T790M 유전자 변이를 가진 폐암 환자의 혈장으로부터 수득된 cfDNA를 EGFR exon 19 deletion(Del19), EGFR exon 20 T790M 및 EGFR exon 21 L858R에 특이적인 프로브를 이용하여 반응시킨 후 HRP/스트렙타비딘 복합체(HRP와 스트렙타비딘이 1:1로 결합된 복합체)를 첨가하여 cfDNA의 검출여부를 색깔 변화 및 UV 흡광도로 확인한 것이다. HRP/스트렙타비딘 나노입자에 비해 HRP/스트렙타비딘 복합체의 경우 노이즈가 생성됨을 확인한 것이다.
도 165는 5명의 EGFR exon19 deletion 및 exon20 T790M 유전자 변이를 가진 폐암 환자의 혈장에서 cfDNA를 추출한 후 EGFR exon 19 Del, EGFR exon 20 T790M, EGFR exon 21 L858R에 특이적인 프로브 및 HRP/스트렙타비딘 나노입자(HRP/st-tagged NP)와 반응시킨 결과와 EGFR exon19 Del, EGFR exon 20 T790M, EGFR exon 21 L858R에 특이적인 프로브와 HRP/스트렙타비딘 복합체(HRP와 스트렙타비딘이 1:1로 결합)를 반응시킨 결과의 분석을 통하여 암조직과 유전형과의 일치성을 확인 및 비교한 것이다.
도 166은 EGFR exon 20 T790M 및 EGFR exon 21 L861Q 유전자 변이를 가진 폐암 환자의 혈장으로부터 수득된 cfDNA의 유전자 변이 검출을 위해 EGFR exon 19 deletion(19 Del), EGFR exon 20 T790M, EGFR exon 21 L858R 및 EGFR exon L861Q에 특이적인 프로브 및 HRP/st-tagged NP을 한꺼번에 혼합한 결과 암조직과 동일하게 EGFR exon 20 T790M 및 EGFR exon 21 L861Q 에서만 유전자변이가 관찰됨을 UV 흡광도로 확인한 것이다.
도 167은 ALK-EML4 fusion 및 ALK point mutation(I1171N/T) 유전자 변이를 가진 폐암 환자의 혈장으로부터 수득된 cfDNA의 유전자 변이 검출을 위해 ALK-EML4 fusion 및 ALK point mutation(T1151, L1152P, L1152R, C1156Y, I1171N/T)에 특이적인 프로브 및 HRP/st-tagged NP을 한꺼번에 혼합한 결과 암조직과 동일하게 ALK-EML4 fusion 및 ALK point mutation(I1171N/T) 유전형이 검출되는 것을 확인하였다.
도 168은 BRAF V600E 유전자 변이를 가진 갑상선암 환자의 혈장으로부터 수득된 cfDNA의 유전자 변이 검출을 위해 BRAF V600E에 특이적인 프로브 및 HRP/st-tagged NP을 한꺼번에 혼합하였다. 그 결과 BRAF V600E 유전자 변이가 환자의 유전형과 동일하게 검출되는 것을 확인하였다.
도 169는 정상인의 혈액에서 채취한 시료를 여러가지 온도 조건으로 변성 시킨 후, 처리조건에 따라 불안정한 cfDNA의 검출 결과를 나타낸 것이다.
도 170은 환자의 혈액에서 채취한 시료를 여러가지 온도 조건으로 변성 시킨 후, 처리조건에 따라 불안정한 cfDNA의 검출 결과를 나타낸 것이다.
도 171은 돌연변이 세포주에서 얻은 fDNA를 여러가지 온도 조건으로 변성 시킨 후, 처리조건에 따라 불안정한 cfDNA의 검출 결과를 나타낸 것이다.
도 172는 돌연변이 세포주에서 얻은 fDNA를 DNase로 37℃, 30분간 처리 후, 처리조건에 따라 불안정한 cfDNA의 검출 결과를 나타낸 것이다.
도 173은 돌연변이 세포주에서 얻은 fDNA를 DNase로 37℃, 60분간 처리 후, 처리조건에 따라 불안정한 cfDNA의 검출 결과를 나타낸 것이다.
도 174는 돌연변이 세포주에서 얻은 fDNA를 DNase로 37℃, 120분간 처리 후, 처리조건에 따라 불안정한 cfDNA의 검출 결과를 나타낸 것이다.
도 175는 DNase의 활성에 따른 불안정한 cfDNA와 안정한 cfDNA의 차이점을 확인하기 위하여, DNase 1 ㎕ 또는 2 ㎕를 24℃, 120분간 처리한 결과를 나타낸 것이다.
도 176은 DNase의 활성에 따른 불안정한 cfDNA와 안정한 cfDNA의 차이점을 확인하기 위하여, DNase 1 ㎕ 또는 2 ㎕를 3℃, 120분간 처리한 결과를 나타낸 것이다.
도 177은 본 발명의 일 실시예로서 폐암환자의 혈장에서 cfDNA를 이용하여 EML4-ALK fusion gene을 검출할 때 cutoff 값의 일 구체예를 나타낸 것이다.
<용어의 정의>
본 명세서에서 사용된 용어, "세포유리(cell-free) DNA"는 cfDNA로도 불린다. 또한, cfDNA는 종양 세포에서 기인하여 암 환자로부터 유래된 소변, 뇌척수액, 혈장, 혈액, 또는 체액 등의 생물학적 시료에서 발견될 수 있는 암세포 유래 DNA인 순환 종양 DNA(circulating tumor DNA, ctDNA)일 수도 있다. 또한, 소변, 뇌척수액, 흉수, 복수, 혈장, 혈액, 타액, 객담, 또는 체액 등의 생물학적 시료 내에 cfDNA가 존재할 수 있다. 이때, cfDNA는 약 80 bp 내지 약 10 kbp, 약 100 bp 내지 약 1 kbp, 약 120 bp 내지 약 500 bp의 크기를 가질 수 있다. 또한, cfDNA는 약 150 bp 내지 약 200 bp의 크기를 가질 수 있으며, 통상, 약 165 bp 내지 약 170 bp의 크기를 가질 수 있다. 뿐만 아니라, 상기 cfDNA는 약 80 bp 또는 그 이하의 작은 크기의 cfDNA를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "불안정한 cfDNA"는 "안정한 cfDNA"에 비해 열역학적으로 불안정한 cfDNA를 의미한다. 즉, 안정한 cfDNA가 변성이 되는 조건보다 덜 가혹한 조건에서 불안정한 cfDNA는 변성이 될 수 있다. 상기 불안정한 cfDNA가 생성되는 이유는 불안정한 cfDNA는 불안정한 이중 나선 구조를 가지기 때문이다. 구체적으로, 암세포에서 과발현되는 유전자에서 유래되는 cfDNA는 불안정한 cfDNA의 일 구체예 일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "불안정한 이중 나선 구조를 가지는 cfDNA"는 안정한 이중 나선 구조를 가지는 cfDNA에 비해 낮은 Tm 값을 갖거나, 안정한 이중 나선 구조를 가지는 cfDNA가 변성되지 않는 조건에서 변성이 되는 것을 특징으로 한다. 상기 Tm은 녹는 온도(melting temperature)를 뜻하며, 이중 가닥 DNA의 50%가 단일 가닥 DNA로 바뀌는 온도를 의미한다. Tm 값은 DNA의 길이에 비례하고, 뉴크레오티드 서열에 따라 상이할 수 있다. 다만, 게놈 DNA는 많은 수의 뉴클레오티드가 수소 결합을 하고 있으므로, 약 92℃ 내지 약 95℃로 5분 이상 가열하거나, 약 98℃에서 2분 이상 가열해야 한다. 또한, 약 90℃보다 낮은 온도에서는 게놈 DNA는 변성(denaturation)이 용이하게 일어나지 않는다. 이때, 안정한 이중 나선 구조를 가지는 cfDNA는 평균 약 170 bp의 뉴클레오티드를 갖는다고 가정하면, 게놈 DNA와 유사한 Tm 값을 가질 수 있다.
그러나, 상기 "불안정한 이중 나선 구조를 가지는 cfDNA"는 안정한 이중 나선 구조를 가지는 cfDNA 보다 낮은 Tm 값을 가진다. 따라서, 안정한 이중 나선 구조를 가지는 cfDNA를 i) 상온에서 약 1분 내지 약 120분 방치하는 조건; ii) 약 90℃ 내지 약 95℃에서 약 1초 내지 약 3분간 가열하는 조건; iii) 약 75℃ 내지 약 90℃에서 약 1초 내지 약 5분간 가열하는 조건; iv) 약 60℃ 내지 약 75℃에서 약 30초 내지 약 60분간 가열하는 조건; v) 약 25℃ 내지 약 40℃에서 약 10분 내지 약 120분 가열하는 조건; vi) 프로테아제로 약 10초 내지 약 30분 처리하는 조건; vii) DNase로 약 10초 내지 약 30분 처리하는 조건; 및 viii) 화학물질(예, 수산화나트륨, DMSO, 계면활성제 등)을 처리하는 조건으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 조건으로 변성을 시킨 후에 cfDNA의 일부 서열에 상보적인 서열을 갖는 약 15머 내지 약 30머 프로브와 결합 반응을 수행하였을 때, 안정한 이중 나선 구조를 가지는 cfDNA는 상기 프로브와 결합을 하지 않는다. 이때, "상온"은 실온을 의미하며, 약 18℃ 내지 약 25℃일 수 있다. 또한, 상기 조건 외에도 약 40℃ 내지 약 65℃에서 약 5분 내지 약 80분간 가열하는 조건을 더 포함할 수 있다.
그러나, 불안정한 이중 나선 구조를 가지는 cfDNA는 상술한 i) 내지 viii) 중 어느 하나의 조건으로 처리한 후, 약 15머 내지 약 30머 프로브와 결합 반응을 수행하였을 때, 상기 프로브와 결합을 하는 것을 확인하였다. 이때, 상기 프로브는 약 15머 내지 약 30머 또는 약 20머 내지 약 25머일 수 있으며, 약 21머, 약 22머, 약 23머, 약 24머의 프로브일 수 있다.
이때, 상기 불안정한 이중 나선 구조를 가지는 cfDNA는 순환 종양 DNA(circulating tumor DNA, 이하 ctDNA)일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "프로브(probe)"는 타겟 cfDNA를 검출하기 위한 DNA 또는 RNA를 의미한다. 프로브는 불안정한 cfDNA에 상보적인 결합을 할 수 있도록 디자인된 서열을 가질 수 있다. 본 명세서에서 사용된 용어, "cfDNA에 상보적인 서열을 갖는 프로브"는 혈장와 같은 fluid sample에 존재하는 검출하기를 원하는 목적 이중 나선 구조의 cfDNA에 상보적으로 결합할 수 있는 핵산 서열을 갖는 프로브를 의미한다.
이때, 프로브는 두가지 방식으로 제작될 수 있다. 하나는 유전자에 손상이 일어난 부분에 결합할 수 있도록 디자인된 제1 프로브(이하 CP라 함)이며, 다른 하나는 손상된 부분의 주변에 결합할 수 있도록 디자인된 제2 프로브(이하 DP라 함) 일 수 있다. DP는 표적이 되는 DNA 서열 또는 손상이 일어난 영역으로부터 약 10 bp 내지 약 100 bp, 약 20 bp 내지 약 50 bp 떨어진 위치의 서열에 상보적으로 결합하도록 디자인 될 수 있다.
여기에서, 상보적으로(complementary) 결합한다고 하는 것은, 적절한 hybridization conditions에서 probe가 target cfDNA에 결합하여 duplex를 형성할 수 있는 것을 의미하고, cfDNA의 타겟 서열에 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 약 100% 상보적인 서열을 갖는다.
혼성화 조건은, 예를 들어 프로브의 길이, 프로브의 상보성, 혼성화 완충액 중의 염 농도(즉, 이온 강도)와 같이 당업자에 의해 실험적으로 결정될 수 있다. 일반적으로, 엄격한 혼성화 조건은 폴리뉴클레오티드가 그의 상보적인 서열에 우선적으로 결합할 수 있으며, 또한, 표적상의 임의의 다른 영역에 비해 높은 친화 도로 결합할 수 있는 조건이다. 20 개 염기를 갖는 폴리 뉴클레오티드 서열의 상보체에 대한 하이브리드화를 위한 예시적인 엄격한 조건은 약 50% G+C 함량, 50 mM 염(Na+) 및 어닐링 온도 60℃일 수 있다. 더 긴 서열의 경우, 더 높은 온도에서 혼성화가 수행될 수 있다. 일반적으로, 엄격한 조건은 어닐링이 폴리 뉴클레오티드의 녹는점(melting temperature)에서 약 5℃ 미만에서 수행되는 조건이다. "녹는점"은 소정의 이온 강도, pH 및 폴리뉴클레오티드 농도에서 표적 폴리뉴클레오티드에 상보적인 폴리뉴클레오티드의 50%가 상보적인 결합하는 하는 온도이다.
본 명세서에서는 제1 프로브 및 제2 프로브를 동시에 사용하거나, 제1 프로브 또는 제2 프로브를 각각 사용하여도 손상된 cfDNA를 효과적으로 검출할 수 있음을 확인하였다. 또한, 상기 프로브는 표지자와 결합하기 위하여 바이오틴과 같은 물질이 결합된 형태일 수 있다. 또는 상기 프로브는 표지자가 직접 결합되거나, 링커를 통해 결합된 것일 수 있다. 이때, 표지자는 나노입자, 형광염료, 형광단백질 또는 효소 일 수 있다. 또한, 상기 프로브는 표지자와 동시에 첨가될 수 있으며, 순차적으로 첨가될 수 있다.
본 발명의 일 구체예로 타겟 cfDNA에 상보적인 결합을 할 수 있는 프로브는 하기 암세포에 특이적인 서열을 포함하는 영역에 상보적으로 결합할 수 있다. 예를 들어, 난소암 또는 유방암에 특이적인 서열의 경우 BRCA1 exon 7, BRCA1 exon 10, BRCA1 exon 11, BRCA1 exon 15에 존재하는 SNP일 수 있다. 또한, 위암에 특이적으로 서열의 경우에는 TP53, 대장암은 MSH2에 존재하는 SNP일 수 있다. 폐암에 특이적으로 서열의 경우 EGFR에 존재하는 SNP일 수 있다. 또한, 간암에 특이적으로 서열의 경우에는 FGFR3에 존재하는 SNP에서 선택될 수 있다.
암세포로부터 유래되며 암세포에 특이적인 biomarker gene은 당업자들에게 알려져 있다. 예를 들면, 다음과 같은 문헌을 참조할 수 있다: Circulating Cell-Free DNA in Plasma/Serum of Lung Cancer Patients as a Potential Screening and Prognostic Tool, Pathak et al, Clinical Chemistry October 2006 vol. 52 no. 10 1833-1842; Cell-free Tumor DNA in Blood Plasma As a Marker for Circulating Tumor Cells in Prostate Cancer, Schwarzenbach et al, Clin Cancer Res Feb. 1, 2009 15; 1032; Cell-free DNA: measurement in various carcinomas and establishment of normal reference range, Wua et al, Clinica Chimica Acta, Volume 321, Issues 1-2, July 2002, Pages 77-87; Detection of Circulating Tumour DNA in the Blood (Plasma/Serum) of Cancer Patients, Anker et al, Cancer and Metastasis Reviews 1999, Volume 18, Issue 1, pp 65-73; Cell-free nucleic acids as biomarkers in cancer patients, Schwarzenbach et al, Nature Reviews Cancer 11, 426-437 (June 2011); Circulating Tumor-Specific DNA: A Marker for Monitoring Efficacy of Adjuvant Therapy in Cancer Patients, Fiegl et al, Cancer Res Feb. 15, 2005 65; 1141.
본 발명의 일 구체예로 타겟 cfDNA에 상보적인 결합을 할 수 있는 프로브는 하기 암세포에서 과발현되는 영역에 상보적으로 결합할 수 있다. 이와 같이, 암세포에서 과발현되는 영역은 암세포의 바이오마커일 수 있다. 이러한 암세포의 바이오마커는 도 151 및 도 152에 나타난 유전자일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 본 명세서 전반에 걸쳐, 특정 종양/암 세포에 대한 다양한 바이오마커 유전자 및 바이오마커 유전자에 상보적으로 결합하는 예시적 프로브가 실시예에 의해 설명된다. 또한, 상기 프로브는 바이오틴 또는 아비딘 계열의 단백질을 더 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 표지자는 아비딘(avidin), 스트렙타비딘(streptavidin) 또는 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나를 더 포함할 수 있다. 바람직하게는 프로브는 바이오틴이 결합된 형태일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "분리된 생물학적 시료"는 인체로부터 분리된 소변, 타액, 뇌척수액, 흉수, 복수, 혈장, 혈액, 객담 또는 체액 시료를 의미한다. 상기 분리된 생물학적 시료는 인체에서 분리된 액상 시료일 수 있다. 이때, 혈장은 혈액에서 수득될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "양전하를 띠는 물질"은 양전하를 띠는 소재로서, 나노입자, 나노와이어, 망구조 또는 필터의 형태로 이용할 수 있으나, 그 형상에 제한되는 것은 아니다. 상기 "양전하를 띠는 물질"의 일 구체예로는 표면이 양전하를 띠는 나노와이어 또는 멤브레인일 수 있다. 상기 나노와이어 또는 멤브레인은 전도성 고분자를 이용하여 제조할 수 있다. 상기 전도성 고분자는 폴리아세틸렌(poly(acetylene)), 폴리피롤(poly(pyrrole)), 폴리티오펜(poly(thiophene)), 폴리파라페닐렌(poly(para-phenylene)), 폴리(3,4-에틸렌디옥시테오펜(poly(3,4-ethylenedioxythiophene)), 폴리페닐렌설파이드(poly(phenylene sulfide)), 폴리(파라-페닐렌비닐렌)(poly(para-phenylene vinylene)) 및 폴리아닐린(polyaniline)으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것일 수 있다. 제작 방법에 따라 길이 및 직경이 적절히 조절될 수 있으나, 나노와이어의 경우, 직경은 약 50 nm 내지 약 500 nm, 약 100 nm 내지 약 500 nm, 약 100 nm 내지 약 400 nm, 약 150 nm 내지 약 350 nm, 약 200 nm 내지 약 400 nm, 또는 약 100 nm 내지 약 300 nm의 범위에서 선택될 수 있고, 길이는 수 ㎛에서 약 100 ㎛, 약 10 ㎛ 내지 약 100 ㎛, 약 15 ㎛ 내지 약 50 ㎛, 약 15 ㎛ 내지 약 40 ㎛, 또는 약 15 ㎛ 내지 약 30 ㎛의 범위에서 선택될 수 있다.
일 실시예로는 직경은 약 200 nm을 가지며, 길이는 약 18 ㎛를 가지는 나노와이어일 수 있다. 또한, 상기 나노와이어는 바이오틴을 결합한 형태로 제작할 수 있다.
상기 나노와이어 또는 멤브레인의 표면은 양이온 고분자에 의해 개질될 수 있다. 상기 양이온성 고분자는 그 종류에 제한이 없다. 양이온성 고분자의 일 구체예로는 폴리에틸렌이민(polyethyleneimine, PEI) 또는 폴리라이신(polylysine, PLL)일 수 있다. 또한, 양이온성 가지형 고분자 폴리에틸렌이민(cationic branched polymer polyethyleneimene)일 수 있다. 이러한 양이온성 고분자로 개질된 나노와이어 또는 멤브레인은 표면이 양전하를 띨 수 있다. cfDNA를 포획하기 위하여는 나노와이어 또는 멤브레인의 표면 전하(surface charge)가 약 20 mV 내지 약 80 mV일 수 있으며, 약 30 mV 내지 약 60 mV 일 수 있으며, 약 35 mV 내지 약 50 mV 일 수 있다. 또한, 상기 표면 전하는 약 36 mV, 약 37 mV, 약 38 mV, 약 39 mV, 약 40 mV, 약 41 mV, 약 42 mV, 약 43 mV, 또는 약 44 mV 일 수 있다.
일 구체예로 양전하를 띠는 나노와이어는 낮은 농도에서도 효율적으로 cfDNA를 성공적으로 포집할 수 있다. 특히, DNA 등의 표적 분자와의 결합을 위한 넓은 표면적, DNA와의 상호 작용 촉진을 위한 향상된 이동성과 같은 나노와이어의 특징으로 인해, 효과적으로 cfDNA를 포집할 수 있다.
본 명세서 사용된 용어, "표지자"는 암세포에서 유래한 이중 나선 구조를 가진 cfDNA를 효과적으로 검출 및/또는 정량하기 위한 물질로서, 구체적으로, 양자점, 특정 기질을 분해하여 발색 반응을 나타내게 하는 물질, 특정 파장을 조사했을 때 발광을 나타내게 하는 물질 등일 수 있다. 구체적으로, 상기 표지자는 GFP(Green Fluorescent Protein). YFP(Yellow Fluorescent Protein), RFP(Red Fluorescent Protein) 또는 CFP(Cyan Fluorescent Protein)와 같은 형광 단백질 일 수 있다. 또는 상기 표지자는 알칼라인포스파타제(alkaline phosphatase, AP), HRP(Horseradish peroxidase), 또는 베타-갈락토시다제(β-galactosidase, BGAL)와 같은 발색효소 또는 생물발광효소일 수 있다.
상기 발색효소는 기질과 반응함으로써 발색반응 또는 발광반응을 매개한다. 이러한 기질로는 HRP의 경우 ABTS, OPD, AmplexRed, DAB, AEC, TMB, Homovanillic acid 및 Luminol 등이 사용될 수 있고, AP의 경우 BCIP(5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl Phosphate)/NBT(nitriblue tetrazolium), pNPP(p-Nitrophenyl Phosphate), Fast Red TR/Naphthol AS-MX 및 CDP-Star(Disodium 2-chloro-5-(4-methoxyspiro[1,2-dioxetane-3,2'-(5-chlorotricyclo[3.3.1.13.7]decan])-4-yl]-1-phenyl phosphate) 등이 사용될 수 있으며, BGAL의 경우 X-gal(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-d-galactopyranoside) 또는 ONPG(ortho-Nitrophenyl-β-galactoside)를 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 기질을 함께 사용할 수 있다. 상기 생물발광효소는 개똥벌레(Photinus pyralis), 바다팬지(Renilla sp.), 요각류인 Metridiia longa, Vibrio 속 세균, 또는 상편모조류(dinoflagellate) 유래의 루시퍼라제일 수 있다.
상기 표지자는 프로브에 결합할 수 있는 물질을 추가적으로 포함할 수 있다. 구체적으로, 프로브에 바이오틴이 결합되어 있는 경우, 상기 표지자는 아비딘 계열의 단백질을 더 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 표지자는 아비딘(avidin), 스트렙타비딘(streptavidin) 또는 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나를 더 포함할 수 있다.
또한, 표지자는 바이오틴을 포함할 수 있다. 이러한 경우 프로브는 아비딘 계열의 단백질을 더 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 표지자는 아비딘(avidin), 스트렙타비딘(streptavidin) 또는 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나를 더 포함할 수 있다.
이러한 표지자의 일 구체예로는 전도성 고분자 및 히알루론산으로 구성된 나노입자에 스트렙타비딘 및 HRP를 결합시킨 나노입자의 형태로 이용될 수 있다. 이때, 상기 전도성 고분자는 상술한 바와 같으며, 바람직하게는 폴리피롤일 수 있다. 또 다른 구체예로는 전도성 고분자 및 히알루론산으로 구성된 나노입자에 스트렙타비딘 및 형광단백질이 결합된 나노입자의 형태로 이용될 수 있다. 상기 HRP 나노입자의 크기는 약 20 nm 내지 약 150 nm일 수 있으며, 약 30 nm 내지 약 120 nm, 약 40 nm 내지 약 100 nm일 수 있다. 또한, 상기 HRP 나노입자는 약 50 nm, 약 60 nm, 약 65 nm, 약 70 nm, 약 75 nm, 또는 약 80 nm 일 수 있다.
또한, 표지자의 발색 반응을 일으키기 위해서 표지자에 적합한 기질을 함께 사용할 수 있다. 이때, 기질은 표지자와 동시에 첨가할 수도 있으나, 표지자를 첨가하기 전후로 첨가할 수 있다. 표지자 및 기질의 사용은 공지된 방법으로 사용할 수 있다. 일 구체예로, HRP를 표지자로 사용시에 ABTS(2,2'-Azinobis [3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid]-diammonium salt), OPD (o-Phenylenediamine dihydrochloride), AmplexRed, DAB(3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride), AEC(3-Amino-9-ethylcarbazole), TMB(3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine), Homovanillic acid 또는 Luminol을 기질로 사용할 수 있다. 또한, 일 구체예로, 형광단백질을 사용할 경우에는 기질이 아닌 특정 파장의 빛을 조사한 후 방출되는 파장의 빛 존재 여부로 표지자를 검출할 수 있다.
일 구체예에 따르면, 본 진단방법은 고도의 정밀도와 정확도로 target cfDNA를 검출할 수 있고, 예를 들면 생물학적 시료에 target cfDNA가 극미량으로 포함되어 있는 경우에도 효과적으로 검출이 가능하다. 따라서, 초기 단계의 암 세포 검출에 유용하게 사용될 수 있다.
생체 시료내에 존재하는, 특정 비정상 세포/조직, 예를 들면 특정 암의 바이오마커를 코딩하는 cfDNA의 존재 유무를 검출함으로써, 해당 암의 diagnosis, prognosis, 또는 metastatis 상태를 알 수 있으며, 기존 치료방법에 대한 resistance/tolerance를 예측할 수도 있다.
<전립선암>
전립선암 진단 방법
본 발명의 일 측면은, a) 세포유리 DNA(cell-free DNA, 이하 cfDNA)가 포함된 개체로부터 분리된 생물학적 시료 및 양전하를 띠는 물질을 혼합하는 단계; b) cfDNA가 결합된 양전하를 띠는 물질을 분리하는 단계; c) 상기 혼합물에 상기 cfDNA에 상보적인 서열을 갖는 프로브 및 표지자를 순차적으로 또는 동시에 혼합하는 단계; d) cfDNA에 결합하지 않은 프로브 및 표지자를 제거하는 단계; 및 e) 상기 표지자를 검출하는 단계를 포함하는, 상기 시료로부터, 증폭없이, 전립선암세포 유래의 유전자를 검출하여 전립선암을 진단하는 방법으로서, 상기 cfDNA에 상보적인 서열을 갖는 프로브는 전립선암 바이오마커로 알려진 유전자에 상보적으로 결합하는 것인, 전립선암을 진단하는 방법을 제공한다. 이때, 전립선암 바이오마커로 알려진 유전자는 전립선암에서 과발현되는 단백질을 코딩하는 유전자 일 수 있다.
구체적으로, 상기 cfDNA에 상보적인 서열을 갖는 프로브는 KLK3, FOLH1, PCA3, PDE4D7, SFMBT2, EFEMP1, RETN, ACADL, AGR2, COL1A1, FAM13C, GPX8, GRHL2, HNF1A, HOXB13, KLK2, MYBPC1, NR0B1, PITX2, SFRP4, SLCO1B3, TMEFF2, TMPRSS2-ERG 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나의 유전자에서 상보적으로 결합하는 것일 수 있다.
또한, 상기 분리된 생물학적 시료를 사용하는 목적은 시료 내에 존재하는 cfDNA를 검출하기 위함이다. 따라서, 시료내의 cfDNA를 다양한 방법으로 분리 및/또는 농축시켜 사용할 수 있다. 일 구체예로 핵산에 강한 친화성이 있는 니트로셀룰로오스 막(nitrocellulose membrane)을 이용할 수 있다. 또한, 일 구체예로 음전하를 띄고 있는 cfDNA를 포집하기 위하여 양전하를 띄고 있는 물질을 이용할 수 있다. 상기 양전하를 띠고 있는 물질은 나노입자, 나노와이어, 망구조 또는 양전하를 띤 필터일 수 있으나, 그 형상에 제한되는 것은 아니다. 상기 "양전하를 띄고 있는 물질"의 일 구체예로는 양전하를 띈 나노구조체 또는 양전하를 띤 멤브레인일 수 있다.
나노구조체의 일 실시예는 양이온 고분자를 포함하는 것일 수 있다. 상기 양이온성 고분자는 그 종류에 있어서 제한이 없다. 양이온성 고분자의 일 구체예로는 폴리에틸렌이민(polyethyleneimine, PEI)일 수 있으며, 양이온성 가지형 고분자 폴리에틸렌이민(cationic branched polymer polyethyleneimene)일 수 있다.
또한, 아비딘 계열 단백질이 표지된 나노와이어를 바이오틴이 결합된 PEI 용액과 혼합하여, 바이오틴-아비딘 계열 단백질의 상호 작용을 통해 나노와이어에 양이온성 분지형 폴리에틸렌이민(cationic branched PEI)을 추가로 결합시킬 수 있다. 그 결과, 양이온성 고분자인 폴리에틸렌이민이 표면에 결합된 나노구조체(PEI/mPpy NW)안에 나노입자가 높은 밀도로, 불규칙하게 분포되어 매립될 수 있다.
이러한 나노와이어는 높은 효율로 낮은 농도에서도 게놈 DNA 및 cfDNA 성공적으로 포집할 수 있다. 특히, DNA 등의 표적 분자와의 결합을 위한 넓은 표면적, DNA와의 상호 작용 촉진을 위한 향상된 이동성과 같은 나노와이어의 특징으로 인해, 효율적이고 효과적으로 표적 cfDNA를 포집할 수 있다.
이때, 상기 표적 cfDNA는 검출하려는 목적 cfDNA를 의미한다. 본 명세서에서 cfDNA는 이중가닥을 가진다. 이때, 상기 cfDNA의 일부가 이중가닥이 풀려있을 수 있다. 또한, 상기 cfDNA는 전립선암 세포의 유전자로부터 유래된 것일 수 있다. 구체적으로, cfDNA는 전립선암세포에서 과발현되는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 상기 암세포에서 과발현되는 핵산 서열은 정상세포에는 적정 발현수준을 보이나, 특정 암세포에서 과발현되는 핵산 서열을 의미한다.
구체적으로, 상기 핵산 서열의 암세포에서 과발현되는 정도 또는 기준(cutoff)은 표지자를 이용한 흡광도(optical density)를 측정하였을 때, OD값이 0.007 이상인 경우일 수 있다. 보다 구체적으로는, 상기 핵산 서열의 암세포에서 과발현되는 정도 또는 기준은 표지자를 이용한 흡광도를 측정한 후, 수신자 조작 특성 곡선을 그려 민감도와 특이도의 최대값에서 정해진 OD값이 기준이 될 수 있다. 이때, 상기 흡광도 측정을 위해 조사하는 파장은 표지자에 따라 적절히 정해질 수 있다. 상기 cfDNA는 이중가닥이 풀린 DNA(unwinding of DNA)일 수 있다. 또한, 목적에 따라 cfDNA는 적절히 정해질 수 있다.
또한, 상기 전립선암세포에서 유래된 cfDNA는 i) 정상 세포에서 유래된 이중 나선 구조를 가지는 cfDNA에 비해 낮은 Tm 값을 갖거나, ii) 정상 세포에서 유래된 이중 나선 구조를 가지는 cfDNA가 변성되지 않는 조건에서 변성이 되는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.
또한, 상기 cfDNA는 하기의 조건 중 어느 하나의 조건에서 cfDNA 상보적으로 결합 가능한 약 15머 내지 약 30머 프로브와 결합할 수 있다: i) 상온에서 약 1분 내지 약 120분 방치하는 조건; ii) 약 90℃ 내지 약 95℃에서 약 1초 내지 약 3분간 가열하는 조건; iii) 약 75℃ 내지 약 90℃에서 약 1초 내지 약 5분간 가열하는 조건; iv) 약 60℃ 내지 약 75℃에서 약 30초 내지 약 30분간 가열하는 조건; v) 약 25℃ 내지 약 40℃에서 약 10분 내지 약 120분간 가열하는 조건; vi) 프로테아제로 약 1분 내지 약 30분 처리하는 조건; vii) DNase로 약 1분 내지 약 30분 처리하는 조건; 및 viii) 화학물질(예, 수산화나트륨, DMSO, 계면활성제 등)을 처리하는 조건.
상기 전립선암세포에서 과발현 되는 유전자는 KLK3(NCBI Gene ID: 354), FOLH1(NCBI Gene ID: 2346), ACPP(NCBI Gene ID: 55), PCA3(NCBI Gene ID: 50652), PDE4D7(NCBI Gene ID: 5144), SFMBT2(NCBI Gene ID: 57713), EFEMP1(NCBI Gene ID: 2202), RETN(NCBI Gene ID: 56729), ACADL(NCBI Gene ID: 33), AGR2(NCBI Gene ID: 10551), COL1A1(NCBI Gene ID: 1277), FAM13C(NCBI Gene ID: 220965), GPX8(NCBI Gene ID: 493869), GRHL2(NCBI Gene ID: 79977), HNF1A(NCBI Gene ID: 6927), HOXB13(NCBI Gene ID: 10481), KLK2(NCBI Gene ID: 3817), MYBPC1(NCBI Gene ID: 4604), NR0B1(NCBI Gene ID: 190), PITX2(NCBI Gene ID: 5308), SFRP4(NCBI Gene ID: 6424), SLCO1B3(NCBI Gene ID: 28234), TMEFF2(NCBI Gene ID: 23671), CPT1A(NCBI Gene ID: 1374), IFNG(NCBI Gene ID: 3458), CD274(NCBI Gene ID: 29126), FOLR1(NCBI Gene ID: 2348), EPCAM(NCBI Gene ID: 4072), OGT(NCBI Gene ID: 8473), TMPRSS2-ERG 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
일 구체예로서, 전립선암에 특이적으로 존재하는 유전자는 KLK3, FOLH1, PCA3, PDE4D7, SFMBT2, EFEMP1, RETN, ACADL, AGR2, COL1A1, FAM13C, GPX8, GRHL2, HNF1A, HOXB13, KLK2, MYBPC1, NR0B1, PITX2, SFRP4, SLCO1B3, TMEFF2, TMPRSS2-ERG 유전자 일수 있으며, 추가적으로, ACPP, CPT1A, IFNG, CD279, CD274, ERBB2, EGFR, FOLR1 및 EPCAM로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 추가 마커 유전자를 추가적으로 검출하여 전립선암을 진단할 수 있다. 상기 추가 마커 유전자는 전립선암 특이적 마커 유전자는 아니나 상기 전립선암에 특이적으로 존재하는 유전자와 조합하여 사용할 경우 전립선암 진단방법의 민감도 및 특이도를 대폭 향상시킬 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "KLK3"이란, kallikrein-3, gamma-seminoprotein 또는 전립선 특이 항원(prostate specific antigen, PSA)을 코딩하고 있는 유전자를 의미한다. 상기 PSA는 전립선의 상피세포에서 합성되는 단백분해 효소로 전립선 이외의 조직에서는 거의 발현되지 않아 전립선암의 선별에 이용되는 유용한 종양표지자이다. 또한, PSA는 전립선암의 선별 검사뿐만 아니라 수술 후 재발 판정에도 유용하게 이용되고 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "FOLH1"이란, 전립선 특이 세포막 항원(prostate-specific membrane antigen, PSMA)을 코딩하고 있는 유전자를 의미한다. 상기 PSMA는 전립선에서 높게 발현되며, 전립선암세포에서 PSMA는 정상 전립선 세포보다 약 8배 내지 약 12배 정도 발현이 증가되는 것으로 알려져 있다. 이러한 PSMA는 전립선암의 진단을 위한 종양 표지자로 이용되고 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "ACPP"란, 전립선 산성 인산 가수분해 효소(Prostatic acid phosphatase, PAP)를 코딩하고 있는 유전자를 의미한다. 상기 PAP는 전립선에서 생산되는 효소이다. 상기 PAP는 전립선암 또는 전립선 질환을 앓고 있는 남성에서 그 발현이 증가되는 양상을 보여, 전립선암 또는 전립선 질환의 지표로 이용되고 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "PCA3"이란, 사람의 전립선 조직에서 non-coding RNA 형태로 발현되는 유전자를 의미한다. 상기 PCA3은 사람의 전립선 조직에서만 발현되며, 전립선암세포에서 매우 과발현된다. 이러한, PCA3은 전립선암의 종양 표지자로서 이용되고 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "프로브(probe)"는 cfDNA를 검출하기 위한 DNA 또는 RNA를 의미한다. 프로브는 cfDNA에 상보적인 결합을 할 수 있도록 특정 서열을 가질 수 있다. 상기 cfDNA에 상보적인 서열을 갖는 프로브는 혈장에 존재하는 검출하기를 원하는 목적 이중가닥의 cfDNA에 상보적인 결합할 수 있는 핵산 서열을 갖는 프로브를 의미한다. 이때, 상기 프로브는 바이오틴(biotin)이 결합된 것일 수 있다. 상기 프로브는 바이오틴 결합 단백질과 결합된 표지자와 결합될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "표지자"는, cfDNA와 결합된 프로브를 검출하기 위해 이용되는 물질을 의미한다. 상기 표지자는 나노입자, 형광염료, 형광단백질 또는 효소일 수 있다. 구체적으로, 상기 표지자는 양자점, HRP 및 형광단백질로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다. 일 구체예로는, 상기 표지자는 GFP(green fluorescent protein), BFP(blue fluorescent protein), BFP(cyan fluorescent protein), YFP(yellow fluorescent protein) 또는 HRP(horse radish peroxidase)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 표지자는 바이오틴 결합 단백질이 결합된 것일 수 있다. 상기 바이오틴 결합 단백질은 아비딘(avidin) 계열 단백질인 아비딘(avidin), 스트렙타비딘, 트랩타비딘(traptavidin) 또는 뉴트라비딘(neutravidin)일 수 있으나, 바이오틴과 특이적으로 결합할 수 있는 단백질이면 제한없이 사용할 수 있다. 일 구체예로서, 상기 표지자는 스트렙타비딘이 결합된 것일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "아비딘"은 조류, 파충류 및 양서류의 난관에서 생산되는 동형사량체 단백질로서, 난백에 분포되어 있으며, 바오틴과 고친화성을 가지고 결합하며, 천연에서의 그 기능은 아지 규명되지 않고 있으나, 세균의 증식에 필수적인 바이오틴에 결합함으로써 세균의 증식을 억제하는 용도로 추정되고 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "스트렙타비딘"은 스트렙토마이세스 아비디니(Streptomyces avidinii)로부터 분리되는 분자량 약 60 kDa의 4량체 바이오틴 결합 단백질이다. 상기 아비딘과는 매우 낮은 상동성을 가지나 그 구조는 매우 유사하다. 아비딘과 마찬가지로 항균활성을 가지며 바이오틴에 대해 매우 높은 결합력을 갖는다. 한편 아비딘과는 달리 탄수화물을 포함하지 않으며 산성 등전점(pI=5)을 나타내고 아비딘에 비해 현저히 낮은 용해도를 갖는다. 상업적으로 사용가능한 스트렙타비딘 예컨대, Thermo Scientific Pierce Streptavidin은 약 53 kDa의 분자량을 갖는 재조합 형태의 스트렙타비딘으로 중성에 가까운 등전점(pI=6.8 내지 7.5)를 갖는다. 스트렙타비딘의 당화결여 및 낮은 pI가 아비딘과 비교하여 낮은 수준의 비특이적 결합(특히, 렉틴결합)을 갖도록 한다. 이러한 스트렙타비딘의 특성이 많은 검출시스템에 이상적인 시약으로 선택될 수 있도록 한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "트렙타비딘(traptavidin)"은 스트렙타비딘의 변이체(variant or mutein)를 지칭하는 용어로, 약 10배 가량 느린 바이오틴에 대한 해리속도를 나타내며, 기계적 강도가 증가되고, 열적 안정성이 향상된 단백질이다. 트렙타비딘 역시 바이오틴에 특이적으로 결합한다.
본 발명의 용어 "뉴트라비딘(neutravidin)"은 "탈당화아비딘"이라고도 하며 천연형의 아비딘과 스트렙타비딘의 주된 단점을 피하고자 제조된 것으로 이름에 나타난 바와 같이 아비딘을 탈당화하여 생성되는 것으로 아비딘에 비해 감소된 분자량(약 60 kDa)을 가지면서도 높은 바이오틴 결합력을 유지하는 단백질이다. 상기 아비딘의 탈당화는 검출되지 않는 수준으로 렉틴의 결합을 감소시키며 등전점을 낮추어(pI= 약 6.3) 아비딘에 대한 비특이적인 결합의 주된 원인을 효과적으로 제거한다. 라이신 잔기는 사용가능한 채로 유지되므로 스트렙타비딘과 같이 용이하게 유도체화하거나 복합체화할 수 있다. 또한 높은 바이오틴 결합력 및 낮은 비특이적 결합을 나타나므로 이상적인 바이오틴 결합 단백질로 다양하게 이용될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "표지자를 검출하는 단계"란, 프로브와 바이오틴-에비딘 반응을 통해 결합된 표지자를 검출하는 단계를 의미한다. 상기 표지자의 검출은 색깔 변화, UV 흡광도 변화, 생물발광 여부, 형광반응 변화, 또는 전기화학적 변화에 의해 측정될 수 있다. 구체적으로, 상기 표지자를 검출하는 방법은 사용한 표지자에 따라 다르게 수행될 수 있는데, 예를 들어, HRP를 표지자로 사용한 경우에는 과산화수소와 기질과의 반응을 통한 발색반응을 관찰하여 표지자를 검출할 수 있다. 또한, 표지자가 GFP와 같은 형광단백질일 경우에는 특정 파장의 빛을 조사한 후 나오는 검출되는 빛을 관찰하여 표지자의 존재 여부를 검출할 수 있다. 아울러, 표지자가 루시퍼레이즈일 경우 루시페린과 같은 기질을 첨가한 후 나타나는 생물발광을 생물발광계로 측정함으로써 표지자의 존재를 검출할 수 있다.
또한, 본 발명의 진단 방법은 cfDNA를 변성단계를 더 포함할 수 있다. 이때, 상기 변성단계는 정상적인 이중가닥 cfDNA는 변성시키지 않으나, 전립선암에서 유래한 cfDNA만을 선별적으로 변성시킬 수 있도록 수행될 수 있다. 이를 위해, 상기 변성 단계의 조건은 약 50℃ 내지 약 100℃에서 약 0.1초 내지 약 5분간 수행될 수 있다. 변성 온도의 일 구체예는 약 95℃일 수 있으며, 변성시간은 통상 약 0.1초 내지 약 8분 정도 수행될 수 있다. 또한, 약 1초, 약 5초, 약 10초, 약 30초, 약 60초 또는 약 90초간 변성될 수 있다. 일 구체예에서 상기 cfDNA를 변성시키는 단계는 상기 c) 단계 전에 수행될 수 있다.
구체적으로, 상기 c) 단계 이전에 시료 또는 양전하를 띠는 물질에 결합된 cfDNA를 i) 상온에서 약 1분 내지 약 10분 방치하는 조건; ii) 약 90℃ 내지 약 95℃에서 1초 내지 1분간 가열하는 조건; iii) 약 75℃ 내지 약 90℃에서 약 10초 내지 약 3분간 가열하는 조건; iv) 약 60℃ 내지 약 75℃에서 약 1분 내지 약 30분간 가열하는 조건; v) 약 25℃ 내지 약 40℃에서 약 5분 내지 약 60분간 가열하는 조건; vi) 프로테아제로 약 1분 내지 약 10분 처리하는 조건; 및 vii) DNaseI로 약 1분 내지 약 10분 처리하는 조건으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 조건에서 변성시키는 단계를 더 포함할 수 있다. 이러한 변성단계는 정상세포에서 유래한 이중가닥 cfDNA는 변성시키지 않으나, 암세포에서 유래한 cfDNA만을 선별적으로 변성시킴으로서, 프로부와의 결합을 더욱 용이하게 할 수 있다. 상기 i) 내지 vii)의 변성 조건은 시료를 수득한 후 수행할 수 있다. 또한, 상기 i) 내지 vii)의 변성 조건은 양전하를 띠는 물질에 결합된 cfDNA를 수득한 후 수행할 수 있다. 또한, 상기 i) 내지 vii)의 변성 조건의 온도, 프로테아제 및 DNase 처리 시간은 안정한 cfDNA를 변성시키지 않는 한 적절히 조정될 수 있다.
진립선암 진단 키트
본 발명의 다른 측면은, 전립선암에 특이적으로 발현하는 유전자에 상보적으로 결합하는 바이오틴이 결합된 프로브; 양전하를 띠는 물질; 아비딘 계열의 단백질이 결합된 표지자 및 설명서를 포함하는 전립선암 진단 키트를 제공하는 것이다.
이때, 상기 전립선암에 특이적으로 발현하는 유전자는 KLK3, FOLH1, PCA3, PDE4D7, SFMBT2, EFEMP1, RETN, ACADL, AGR2, COL1A1, FAM13C, GPX8, GRHL2, HNF1A, HOXB13, KLK2, MYBPC1, NR0B1, PITX2, SFRP4, SLCO1B3, TMEFF2, TMPRSS2-ERG 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
또한, 상기 설명서는 상기 키트 구성이 하기와 같은 프로토콜에 의해 전립선암을 진단할 수 있는 것으로 기재된 것일 수 있다: a) 개체로부터 분리된 생물학적 시료로부터 키트 내에 포함된 양전하를 띠는 물질을 이용하여 cfDNA를 분리하시오; b) 상기 분리된 cfDNA에 키트내에 포함된 바이오틴이 결합된 프로브 및 키트내에 포함된 표지자를 순차적 또는 동시에 혼합하시오; c) cfDNA에 결합하지 않은 프로브 및 표지자를 제거하시오; 및 d) 상기 표지자의 신호를 검출하시오.
또한, ACPP, CPT1A, IFNG, CD274, FOLR1, EPCAM, OGT 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나의 유전자에 상보적으로 결합하는 바이오틴이 결합된 프로브를 추가적으로 포함할 수 있다.
또한, 상기 프로브, 양전하를 띠는 물질 및 표지자는 상술한 바와 같다.
진립선암 진단 장치
본 발명의 다른 측면은, a) cfDNA가 포함된 개체로부터 분리된 생물학적 시료 및 양전하를 띠는 물질을 혼합시키는 혼합부; b) cfDNA가 결합된 양전하를 띠는 물질을 제외한 시료를 제거하기 위한 수득부; c) 상기 cfDNA가 결합된 양전하를 띠는 물질에, 상기 전립선암에 특이적으로 발현하는 유전자에 상보적으로 결합할 수 있는 바이오틴이 결합된 프로브; 및 스트렙타비딘 및 표지자를 포함하는 나노입자를 순차적으로 또는 동시에 첨가시키는 반응부; d) 표지자를 검출하는 검출부; 및 e) 표지자의 검출 여부에 따라 상기 시료에 프로브에 상보적인 서열을 가지며, 전립선암에서 유래된 cfDNA가 존재한다고 결정하는 정보 처리부를 포함하는, 상기 시료로부터, 증폭없이, 전립선암세포 유래의 유전자를 검출하여 전립선암을 진단하는 장치를 제공하는 것이다.
이때, 상기 전립선암에 특이적으로 발현하는 유전자는 KLK3, FOLH1, PCA3, PDE4D7, SFMBT2, EFEMP1, RETN, ACADL, AGR2, COL1A1, FAM13C, GPX8, GRHL2, HNF1A, HOXB13, KLK2, MYBPC1, NR0B1, PITX2, SFRP4, SLCO1B3, TMEFF2, TMPRSS2-ERG 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
또한, ACPP, CPT1A, IFNG, CD274, FOLR1, EPCAM, OGT 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나의 유전자에 상보적으로 결합하는 바이오틴이 결합된 프로브를 추가적으로 포함할 수 있다.
<폐암>
폐암 진단 방법
본 발명의 일 측면은, a) 세포유리 DNA(cell-free DNA, 이하 cfDNA)가 포함된 개체로부터 분리된 생물학적 시료 및 양전하를 띠는 물질을 혼합하는 단계; b) cfDNA가 결합된 양전하를 띠는 물질을 분리하는 단계; c) 상기 혼합물에 상기 cfDNA에 상보적인 서열을 갖는 프로브 및 표지자를 순차적으로 또는 동시에 혼합하는 단계; d) cfDNA에 결합하지 않은 프로브 및 표지자를 제거하는 단계; 및 e) 상기 표지자를 검출하는 단계를 포함하는, 상기 시료로부터, 증폭없이, 폐암세포 유래의 유전자를 검출하여 폐암을 진단하는 방법으로서, 상기 cfDNA에 상보적인 서열을 갖는 프로브는 폐암 바이오마커로 알려진 유전자에 상보적으로 결합하는 것인, 폐암을 진단하는 방법을 제공한다. 이때, 폐암 바이오마커로 알려진 유전자는 폐암에서 과발현되는 단백질을 코딩하는 유전자 일 수 있다.
구체적으로, 상기 cfDNA에 상보적인 서열을 갖는 프로브는 ENO2, SART3, KRT19, PLAT, EGFR, ALK, ROS1, RET, ERBB2, PI3K, S100P, MMP11, CDCA7, S100A2, ETV4, TOP2A, UBE2C 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나의 유전자에서 상보적으로 결합하는 것일 수 있다.
또한, 상기 분리된 생물학적 시료를 사용하는 목적은 시료 내에 존재하는 cfDNA를 검출하기 위함이다. 따라서, 시료내의 cfDNA를 다양한 방법으로 분리 및/또는 농축시켜 사용할 수 있다. 일 구체예로 핵산에 강한 친화성이 있는 니트로셀룰로오스 막(nitrocellulose membrane)을 이용할 수 있다. 또한, 일 구체예로 음전하를 띄고 있는 cfDNA를 포집하기 위하여 양전하를 띄고 있는 물질을 이용할 수 있다. 상기 양전하를 띠고 있는 물질은 나노입자, 나노와이어, 망구조 또는 양전하를 띤 필터일 수 있으나, 그 형상에 제한되는 것은 아니다. 상기 "양전하를 띄고 있는 물질"의 일 구체예로는 양전하를 띈 나노구조체 또는 양전하를 띤 멤브레인일 수 있다.
나노구조체의 일 실시예는 양이온 고분자를 포함하는 것일 수 있다. 상기 양이온성 고분자는 그 종류에 있어서 제한이 없다. 양이온성 고분자의 일 구체예로는 폴리에틸렌이민(polyethyleneimine, PEI)일 수 있으며, 양이온성 가지형 고분자 폴리에틸렌이민(cationic branched polymer polyethyleneimene)일 수 있다.
또한, 스트렙타비딘이 표지된 나노와이어를 바이오틴이 결합된 PEI 용액과 혼합하여, 바이오틴-스트렙타비딘의 상호 작용을 통해 나노와이어에 양이온성 분지형 폴리에틸렌이민(cationic branched PEI)를 추가로 결합시킬 수 있다. 그 결과, 양이온성 고분자인 폴리에틸렌이민이 표면에 결합된 나노구조체(PEI/mPpy NW)안에 나노입자가 높은 밀도로, 불규칙하게 분포되어 매립될 수 있다.
이러한 나노와이어는 높은 효율로 낮은 농도에서도 게놈 DNA 및 cfDNA 성공적으로 포집할 수 있다. 특히, DNA 등의 표적 분자와의 결합을 위한 넓은 표면적, DNA와의 상호 작용 촉진을 위한 향상된 이동성과 같은 나노와이어의 특징으로 인해, 효율적이고 효과적으로 표적 cfDNA를 포집할 수 있다.
이때, 상기 표적 cfDNA는 검출하려는 목적 cfDNA를 의미한다. 본 명세서에서 cfDNA는 이중가닥을 가진다. 이때, 상기 cfDNA의 일부가 이중가닥이 풀려있을 수 있다. 또한, 상기 cfDNA는 폐암 세포의 유전자로부터 유래된 것일 수 있다. 구체적으로, cfDNA는 폐암세포에서 과발현되는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 상기 암세포에서 과발현되는 핵산 서열은 정상세포에는 적정 발현수준을 보이나, 특정 암세포에서 과발현되는 핵산 서열을 의미한다. 구체적으로, 상기 핵산 서열의 암세포에서 과발현되는 정도 또는 기준(cutoff)은 표지자를 이용한 흡광도(optical density)를 측정하였을 때, OD값이 약 0.010 이상인 경우일 수 있다. 보다 구체적으로는, 상기 핵산 서열의 암세포에서 과발현되는 정도 또는 기준은 표지자를 이용한 흡광도를 측정하였을 때, OD값이 약 0.012 또는 약 약 0.015 이상인 경우일 수 있다. 이때, 상기 흡광도 측정을 위해 조사하는 파장은 표지자에 따라 적절히 정해질 수 있다. 상기 cfDNA는 이중가닥이 풀린 DNA(unwinding of DNA)일 수 있다. 또한, 목적에 따라 cfDNA는 적절히 정해질 수 있다.
또한, 상기 폐암세포에서 유래된 cfDNA는 i) 정상 세포에서 유래된 이중 나선 구조를 가지는 cfDNA에 비해 낮은 Tm 값을 갖거나, ii) 정상 세포에서 유래된 이중 나선 구조를 가지는 cfDNA가 변성되지 않는 조건에서 변성이 되는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.
또한, 상기 cfDNA는 하기의 조건 중 어느 하나의 조건에서 cfDNA 상보적으로 결합 가능한 약 15머 내지 약 30머 프로브와 결합할 수 있다: i) 상온에서 약 1분 내지 약 120분 방치하는 조건; ii) 약 90℃ 내지 약 95℃에서 약 1초 내지 약 3분간 가열하는 조건; iii) 약 75℃ 내지 약 90℃에서 약 1초 내지 약 5분간 가열하는 조건; iv) 약 60℃ 내지 약 75℃에서 약 30초 내지 약 30분간 가열하는 조건; v) 약 25℃ 내지 약 40℃에서 10분 내지 120분간 가열하는 조건; vi) 프로테아제로 약 1분 내지 약 30분 처리하는 조건; 및 vii) DNase로 약 1분 내지 약 30분 처리하는 조건.
상기 폐암세포에서 과발현 되는 유전자는 ENO2(NCBI Gene ID: 2026), SART3(NCBI Gene ID: 9733), ACPP(NCBI Gene ID: 55), KRT19(NCBI Gene ID: 3880), PLAT(NCBI Gene ID: 5327), EGFR(NCBI Gene ID: 1956), KRAS(NCBI Gene ID: 3845), ALK(NCBI Gene ID: 238), ROS1(NCBI Gene ID: 6098), RET(NCBI Gene ID: 5979), ERBB2(NCBI Gene ID: 2064), PI3K(NCBI Gene ID: 5291), S100P(NCBI Gene ID: 6286), MMP11(NCBI Gene ID: 4320), CDCA7(NCBI Gene ID: 83879), S100A2(NCBI Gene ID: 6273), ETV4(NCBI Gene ID: 2118), TOP2A(NCBI Gene ID: 7153), UBE2C(NCBI Gene ID: 11065), CPT1A(NCBI Gene ID: 1374), IFNG(NCBI Gene ID: 3458), CD274(NCBI Gene ID: 29126), FOLR1(NCBI Gene ID: 2348), EPCAM(NCBI Gene ID: 4072), OGT(NCBI Gene ID: 8473) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
일 구체예로서, 폐암에 특이적으로 존재하는 유전자는 SART3, PLAT, ALK, ROS1, PI3K, S100P, CDCA7, S100A2, ETV4 유전자 일수 있으며, 추가적으로, ENO2, ACPP, KRT19, EGFR, KRAS, RET, ERBB2, MMP11, TOP2A, UBE2C, CPT1A, IFNG, CD279, CD274, ERBB2, EGFR, FOLR1 또는 EPCAM 유전자를 검출하여 폐암을 진단할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "ENO2"란, Gamma-enolase 또는 enolase 2 또는 NSE(neuron specific enolase)으로 알려진 효소를 코딩하는 유전자를 의미한다. 상기 NSE는 소세포폐암(작은세포허파암, small cell lung cancer), 신경모세포종(neuroblastoma), 갑상선수양암(medullary thyroid cancer)의 종양표지자로 이용되고 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "SART3"이란, 편평세포암 항원(Squamous Cell Carcinoma Antigen, SCCA)을 코딩하고 있는 유전자를 의미한다. 상기 SCCA는 자궁경부의 편평상피암뿐만 아니라 외음암, 질암, 식도암, 설암, 인두암 등 많은 편평상피암의 환자혈중이 양성을 나타내어 종양표지자로서 이용되고 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "KRT19"란, Cyfra 21-1, CK-19(cytokeratin-19) 또는 K19(keratin-19) 로 알려진 단백질을 코딩하고 있는 유전자를 의미한다. 상기 Cyfra 21-1는 폐암 및 두경부암과 같은 상피세포 기원의 암과 관련이 있음이 알려져있다. 또한, Cyfra 21-1은 폐렴 또는 폐질환을 앓는 환자에서 정상인보다 혈중 수치가 증가됨이 보고된 바 있으며, 종양지표자로서 이용되고 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "PLAT"란, 혈병 붕괴에 관여하는 단백질인 TPA(Tissue plasminogen activator)를 코딩하고 있는 유전자를 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "프로브(probe)"는 cfDNA를 검출하기 위한 DNA 또는 RNA를 의미한다. 프로브는 cfDNA에 상보적인 결합을 할 수 있도록 특정 서열을 가질 수 있다. 상기 cfDNA에 상보적인 서열을 갖는 프로브는 혈장에 존재하는 검출하기를 원하는 목적 이중가닥의 cfDNA에 상보적인 결합할 수 있는 핵산 서열을 갖는 프로브를 의미한다. 이때, 상기 프로브는 바이오틴(biotin)이 결합된 것일 수 있다. 상기 프로브는 바이오틴 결합 단백질과 결합된 표지자와 결합될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "표지자"는, cfDNA와 결합된 프로브를 검출하기 위해 이용되는 물질을 의미한다. 상기 표지자는 나노입자, 형광염료, 형광단백질 또는 효소일 수 있다. 구체적으로, 상기 표지자는 양자점, HRP 및 형광단백질로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다. 일 구체예로는, 상기 표지자는 GFP(green fluorescent protein), BFP(blue fluorescent protein), CFP(cyan fluorescent protein), YFP(yellow fluorescent protein) 또는 HRP(horse radish peroxidase)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 표지자는 바이오틴 결합 단백질이 결합된 것일 수 있다. 상기 바이오틴 결합 단백질은 아비딘(avidin) 계열 단백질인 스트렙타비딘, 트랩타비딘(traptavidin) 또는 뉴트라비딘(neutravidin)일 수 있으나, 바이오틴과 특이적으로 결합할 수 있는 단백질이면 제한없이 사용할 수 있다. 일 구체예로서, 상기 표지자는 스트렙타비딘이 결합된 것일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "스트렙타비딘"은 스트렙토마이세스 아비디니(Streptomyces avidinii)로부터 분리되는 분자량 60 kDa의 4량체 바이오틴 결합 단백질이다. 상기 아비딘과는 매우 낮은 상동성을 가지나 그 구조는 매우 유사하다. 아비딘과 마찬가지로 항균활성을 가지며 바이오틴에 대해 매우 높은 결합력을 갖는다. 한편 아비딘과는 달리 탄수화물을 포함하지 않으며 산성 등전점(pI= 약 5)을 나타내고 아비딘에 비해 현저히 낮은 용해도를 갖는다. 상업적으로 사용가능한 스트렙타비딘 예컨대, Thermo Scientific Pierce Streptavidin은 약 53 kDa의 분자량을 갖는 재조합 형태의 스트렙타비딘으로 중성에 가까운 등전점(pI= 약 6.8 내지 약 7.5)를 갖는다. 스트렙타비딘의 당화결여 및 낮은 pI가 아비딘과 비교하여 낮은 수준의 비특이적 결합(특히, 렉틴결합)을 갖도록 한다. 이러한 스트렙타비딘의 특성이 많은 검출시스템에 이상적인 시약으로 선택될 수 있도록 한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "트렙타비딘(traptavidin)"은 스트렙타비딘의 변이체(variant or mutein)를 지칭하는 용어로, 약 10배 가량 느린 바이오틴에 대한 해리속도를 나타내며, 기계적 강도가 증가되고, 열적 안정성이 향상된 단백질이다. 트렙타비딘 역시 바이오틴에 특이적으로 결합한다.
본 발명의 용어 "뉴트라비딘(neutravidin)"은 "탈당화아비딘"이라고도 하며 천연형의 아비딘과 스트렙타비딘의 주된 단점을 피하고자 제조된 것으로 이름에 나타난 바와 같이 아비딘을 탈당화하여 생성되는 것으로 아비딘에 비해 감소된 분자량(60 kDa)을 가지면서도 높은 바이오틴 결합력을 유지하는 단백질이다. 상기 아비딘의 탈당화는 검출되지 않는 수준으로 렉틴의 결합을 감소시키며 등전점을 낮추어(pI= 약 6.3) 아비딘에 대한 비특이적인 결합의 주된 원인을 효과적으로 제거한다. 라이신 잔기는 사용가능한 채로 유지되므로 스트렙타비딘과 같이 용이하게 유도체화하거나 복합체화할 수 있다. 또한 높은 바이오틴 결합력 및 낮은 비특이적 결합을 나타나므로 이상적인 바이오틴 결합 단백질로 다양하게 이용될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "표지자를 검출하는 단계"란, 프로브와 바이오틴-에비딘 반응을 통해 결합된 표지자를 검출하는 단계를 의미한다. 상기 표지자의 검출은 색깔 변화, UV 흡광도 변화, 생물발광 여부, 형광반응 변화, 또는 전기화학적 변화에 의해 측정될 수 있다. 구체적으로, 상기 표지자를 검출하는 방법은 사용한 표지자에 따라 다르게 수행될 수 있는데, 예를 들어, HRP를 표지자로 사용한 경우에는 과산화수소와 기질과의 반응을 통한 발색반응을 관찰하여 표지자를 검출할 수 있다. 또한, 표지자가 GFP와 같은 형광단백질일 경우에는 특정 파장의 빛을 조사한 후 나오는 검출되는 빛을 관찰하여 표지자의 존재 여부를 검출할 수 있다. 아울러, 표지자가 루시퍼레이즈일 경우 루시페린과 같은 기질을 첨가한 후 나타나는 생물발광을 생물발광계로 측정함으로써 표지자의 존재를 검출할 수 있다.
또한, 본 발명의 진단 방법은 cfDNA를 변성단계를 더 포함할 수 있다. 이때, 상기 변성단계는 정상적인 이중가닥 cfDNA는 변성시키지 않으나, 폐암에서 유래한 cfDNA만을 선별적으로 변성시킬 수 있도록 수행될 수 있다. 이를 위해, 상기 변성 단계의 조건은 약 50℃ 내지 약 100℃에서 약 0.1초 내지 약 5분간 수행될 수 있다. 변성 온도의 일 구체예는 약 95℃일 수 있으며, 변성시간은 통상 약 0.1초 내지 약 8분 정도 수행될 수 있다. 또한, 약 1초, 약 5초, 약 10초, 약 30초, 약 60초 또는 약 90초간 변성될 수 있다. 일 구체예에서 상기 cfDNA를 변성시키는 단계는 상기 c) 단계 전에 수행될 수 있다.
구체적으로, 상기 c) 단계 이전에 시료 또는 양전하를 띠는 물질에 결합된 cfDNA를 i) 상온에서 약 1분 내지 약 10분 방치하는 조건; ii) 약 90℃ 내지 약 95℃에서 약 1초 내지 약 1분간 가열하는 조건; iii) 약 75℃ 내지 약 90℃에서 약 10초 내지 약 3분간 가열하는 조건; iv) 약 60℃ 내지 약 75℃에서 약 1분 내지 약 30분간 가열하는 조건; v) 약 25℃ 내지 약 40℃에서 약 5분 내지 약 60분간 가열하는 조건; vi) 프로테아제로 약 1분 내지 약 10분 처리하는 조건; 및 vii) DNaseI로 약 1분 내지 약 10분 처리하는 조건으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 조건에서 변성시키는 단계를 더 포함할 수 있다. 이러한 변성단계는 정상세포에서 유래한 이중가닥 cfDNA는 변성시키지 않으나, 암세포에서 유래한 cfDNA만을 선별적으로 변성시킴으로서, 프로부와의 결합을 더욱 용이하게 할 수 있다. 상기 i) 내지 vii)의 변성 조건은 시료를 수득한 후 수행할 수 있다. 또한, 상기 i) 내지 vii)의 변성 조건은 양전하를 띠는 물질에 결합된 cfDNA를 수득한 후 수행할 수 있다. 또한, 상기 i) 내지 vii)의 변성 조건의 온도, 프로테아제 및 DNase 처리 시간은 안정한 cfDNA를 변성시키지 않는 한 적절히 조정될 수 있다.
폐암 진단 키트
본 발명의 다른 측면은, 폐암에 특이적으로 발현하는 유전자에 상보적으로 결합하는 바이오틴이 결합된 프로브; 양전하를 띠는 물질; 아비딘 계열의 단백질이 결합된 표지자 및 설명서를 포함하는 폐암 진단 키트를 제공하는 것이다.
이때, 상기 폐암에 특이적으로 발현하는 유전자는 SART3, PLAT, ALK, ROS1, PI3K, S100P, CDCA7, S100A2, ETV4 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
또한, 상기 설명서는 상기 키트 구성이 하기와 같은 프로토콜에 의해 폐암을 진단할 수 있는 것으로 기재된 것일 수 있다: a) 개체로부터 분리된 생물학적 시료로부터 키트 내에 포함된 양전하를 띠는 물질을 이용하여 cfDNA를 분리하시오; b) 상기 분리된 cfDNA에 키트내에 포함된 바이오틴이 결합된 프로브 및 키트내에 포함된 표지자를 순차적 또는 동시에 혼합하시오; c) cfDNA에 결합하지 않은 프로브 및 표지자를 제거하시오; 및 d) 상기 표지자의 신호를 검출하시오.
또한, ENO2, ACPP, KRT19, EGFR, KRAS, RET, ERBB2, MMP11, TOP2A, UBE2C, CPT1A, IFNG, CD279, CD274, ERBB2, EGFR, FOLR1 또는 EPCAM 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나의 유전자에 상보적으로 결합하는 바이오틴이 결합된 프로브를 추가적으로 포함할 수 있다.
또한, 상기 프로브, 양전하를 띠는 물질 및 표지자는 상술한 바와 같다.
폐암 진단 장치
본 발명의 다른 측면은, a) cfDNA가 포함된 개체로부터 분리된 생물학적 시료 및 양전하를 띠는 물질을 혼합시키는 혼합부; b) cfDNA가 결합된 양전하를 띠는 물질을 제외한 시료를 제거하기 위한 수득부; c) 상기 cfDNA가 결합된 양전하를 띠는 물질에, 상기 폐암에 특이적으로 발현하는 유전자에 상보적으로 결합할 수 있는 바이오틴이 결합된 프로브; 및 스트렙타비딘 및 표지자를 포함하는 나노입자를 순차적으로 또는 동시에 첨가시키는 반응부; d) 표지자를 검출하는 검출부; 및 e) 표지자의 검출 여부에 따라 상기 시료에 프로브에 상보적인 서열을 가지며, 폐암에서 유래된 cfDNA가 존재한다고 결정하는 정보 처리부를 포함하는, 상기 시료로부터, 증폭없이, 폐암세포 유래의 유전자를 검출하여 폐암을 진단하는 장치를 제공하는 것이다.
이때, 상기 폐암에 특이적으로 발현하는 유전자는 SART3, PLAT, ALK, ROS1, PI3K, S100P, CDCA7, S100A2, ETV4 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
또한, ENO2, ACPP, KRT19, EGFR, KRAS, RET, ERBB2, MMP11, TOP2A, UBE2C, CPT1A, IFNG, CD279, CD274, ERBB2, EGFR, FOLR1 또는 EPCAM 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나의 유전자에 상보적으로 결합하는 바이오틴이 결합된 프로브를 추가적으로 포함할 수 있다.
<갑상선암>
갑상선암 진단 방법
본 발명의 일 측면은, a) 세포유리 DNA(cell-free DNA, 이하 cfDNA)가 포함된 개체로부터 분리된 생물학적 시료 및 양전하를 띠는 물질을 혼합하는 단계; b) cfDNA가 결합된 양전하를 띠는 물질을 분리하는 단계; c) 상기 혼합물에 상기 cfDNA에 상보적인 서열을 갖는 프로브 및 표지자를 순차적으로 또는 동시에 혼합하는 단계; d) cfDNA에 결합하지 않은 프로브 및 표지자를 제거하는 단계; 및 e) 상기 표지자를 검출하는 단계를 포함하는, 상기 시료로부터, 증폭없이, 갑상선암세포 유래의 유전자를 검출하여 갑상선암을 진단하는 방법으로서, 상기 cfDNA에 상보적인 서열을 갖는 프로브는 갑상선암 바이오마커로 알려진 유전자에 상보적으로 결합하는 것인, 갑상선암을 진단하는 방법을 제공한다. 이때, 갑상선암 바이오마커로 알려진 유전자는 갑상선암에서 과발현되는 단백질을 코딩하는 유전자 일 수 있다.
구체적으로, 상기 cfDNA에 상보적인 서열을 갖는 프로브는 TG, CALCA, APOC1, HIG2 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나의 유전자에서 상보적으로 결합하는 것일 수 있다.
또한, 상기 분리된 생물학적 시료를 사용하는 목적은 시료 내에 존재하는 cfDNA를 검출하기 위함이다. 따라서, 시료내의 cfDNA를 다양한 방법으로 분리 및/또는 농축시켜 사용할 수 있다. 일 구체예로 핵산에 강한 친화성이 있는 니트로셀룰로오스 막(nitrocellulose membrane)을 이용할 수 있다. 또한, 일 구체예로 음전하를 띄고 있는 cfDNA를 포집하기 위하여 양전하를 띄고 있는 물질을 이용할 수 있다. 상기 양전하를 띠고 있는 물질은 나노입자, 나노와이어, 망구조 또는 양전하를 띤 필터일 수 있으나, 그 형상에 제한되는 것은 아니다. 상기 "양전하를 띄고 있는 물질"의 일 구체예로는 양전하를 띈 나노구조체 또는 양전하를 띤 멤브레인일 수 있다.
나노구조체의 일 실시예는 양이온 고분자를 포함하는 것일 수 있다. 상기 양이온성 고분자는 그 종류에 있어서 제한이 없다. 양이온성 고분자의 일 구체예로는 폴리에틸렌이민(polyethyleneimine, PEI)일 수 있으며, 양이온성 가지형 고분자 폴리에틸렌이민(cationic branched polymer polyethyleneimene)일 수 있다.
또한, 스트렙타비딘이 표지된 나노와이어를 바이오틴이 결합된 PEI 용액과 혼합하여, 바이오틴-스트렙타비딘의 상호 작용을 통해 나노와이어에 양이온성 분지형 폴리에틸렌이민(cationic branched PEI)를 추가로 결합시킬 수 있다. 그 결과, 양이온성 고분자인 폴리에틸렌이민이 표면에 결합된 나노구조체(PEI/mPpy NW)안에 나노입자가 높은 밀도로, 불규칙하게 분포되어 매립될 수 있다.
이러한 나노와이어는 높은 효율로 낮은 농도에서도 게놈 DNA 및 cfDNA 성공적으로 포집할 수 있다. 특히, DNA 등의 표적 분자와의 결합을 위한 넓은 표면적, DNA와의 상호 작용 촉진을 위한 향상된 이동성과 같은 나노와이어의 특징으로 인해, 효율적이고 효과적으로 표적 cfDNA를 포집할 수 있다.
이때, 상기 표적 cfDNA는 검출하려는 목적 cfDNA를 의미한다. 본 명세서에서 cfDNA는 이중가닥을 가진다. 이때, 상기 cfDNA의 일부가 이중가닥이 풀려있을 수 있다. 또한, 상기 cfDNA는 갑상선암 세포의 유전자로부터 유래된 것일 수 있다. 구체적으로, cfDNA는 갑상선암세포에서 과발현되는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 상기 암세포에서 과발현되는 핵산 서열은 정상세포에는 적정 발현수준을 보이나, 특정 암세포에서 과발현되는 핵산 서열을 의미한다.
구체적으로, 상기 핵산 서열의 암세포에서 과발현되는 정도 또는 기준(cutoff)은 표지자를 이용한 흡광도(optical density)를 측정하였을 때, OD값이 0.010 이상인 경우일 수 있다. 보다 구체적으로는, 상기 핵산 서열의 암세포에서 과발현되는 정도 또는 기준은 표지자를 이용한 흡광도를 측정하였을 때, OD값이 0.012 또는 0.015 이상인 경우일 수 있다. 이때, 상기 흡광도 측정을 위해 조사하는 파장은 표지자에 따라 적절히 정해질 수 있다. 상기 cfDNA는 이중가닥이 풀린 DNA(unwinding of DNA)일 수 있다. 또한, 목적에 따라 cfDNA는 적절히 정해질 수 있다.
또한, 상기 갑상선암세포에서 유래된 cfDNA는 i) 정상 세포에서 유래된 이중 나선 구조를 가지는 cfDNA에 비해 낮은 Tm 값을 갖거나, ii) 정상 세포에서 유래된 이중 나선 구조를 가지는 cfDNA가 변성되지 않는 조건에서 변성이 되는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.
또한, 상기 cfDNA는 하기의 조건 중 어느 하나의 조건에서 cfDNA 상보적으로 결합 가능한 약 15머 내지 약 30머 프로브와 결합할 수 있다: i) 상온에서 약 1분 내지 약 120분 방치하는 조건; ii) 약 90℃ 내지 약 95℃에서 약 1초 내지 약 3분간 가열하는 조건; iii) 약 75℃ 내지 약 90℃에서 약 1초 내지 약 5분간 가열하는 조건; iv) 약 60℃ 내지 약 75℃에서 약 30초 내지 약 30분간 가열하는 조건; v) 약 25℃ 내지 약 40℃에서 약 10분 내지 약 120분간 가열하는 조건; vi) 프로테아제로 약 1분 내지 약 30분 처리하는 조건; vii) DNase로 약 1분 내지 약 30분 처리하는 조건; 및 viii) 화학물질(예, 수산화나트륨, DMSO, 계면활성제 등)을 처리하는 조건.
상기 갑상선암세포에서 과발현 되는 유전자는 ACPP(NCBI Gene ID: 55), ENO2(NCBI Gene ID: 2026), TG(NCBI Gene ID: 7038), CALCA(NCBI Gene ID: 796), APOC1(NCBI Gene ID: 341), HIG2(NCBI Gene ID: 29923), TYRO3(NCBI Gene ID: 7301), CPT1A(NCBI Gene ID: 1374), IFNG(NCBI Gene ID: 3458), CD274(NCBI Gene ID: 29126), FOLR1(NCBI Gene ID: 2348), EPCAM(NCBI Gene ID: 4072) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
일 구체예로서, 갑상선암에 특이적으로 존재하는 유전자는 TG, CALCA, APOC1, HIG2 유전자 일수 있으며, 추가적으로, ENO2, ACPP, TYRO3, CPT1A, IFNG, CD279, CD274, ERBB2, EGFR, FOLR1 또는 EPCAM 유전자를 검출하여 갑상선암을 진단할 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "TG"란, 티로글로불린(thyroglobulin, Tg)을 코딩하고 있는 유전자를 의미한다. 상기 티로글로불린은 인체 내 갑상선에서만 생산되며, 갑상선암이 발병 또는 전이되는 경우 혈중 티로글로불린 수치가 증가하게 된다. 혈중 티로글로불린 수치는 갑상선암 표지자로서 이용되고 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "CALCA"란, 칼시토닌 유전자 관련 펩타이드(calcitonin gene-related peptide)를 코딩하고 있는 유전자를 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "프로브(probe)"는 cfDNA를 검출하기 위한 DNA 또는 RNA를 의미한다. 프로브는 cfDNA에 상보적인 결합을 할 수 있도록 특정 서열을 가질 수 있다. 상기 cfDNA에 상보적인 서열을 갖는 프로브는 혈장에 존재하는 검출하기를 원하는 목적 이중가닥의 cfDNA에 상보적인 결합할 수 있는 핵산 서열을 갖는 프로브를 의미한다. 이때, 상기 프로브는 바이오틴(biotin)이 결합된 것일 수 있다. 상기 프로브는 바이오틴 결합 단백질과 결합된 표지자와 결합될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "표지자"는, cfDNA와 결합된 프로브를 검출하기 위해 이용되는 물질을 의미한다. 상기 표지자는 나노입자, 형광염료, 형광단백질 또는 효소일 수 있다. 구체적으로, 상기 표지자는 양자점, HRP 및 형광단백질로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다. 일 구체예로는, 상기 표지자는 GFP(green fluorescent protein), BFP(blue fluorescent protein), CFP(cyan fluorescent protein), YFP(yellow fluorescent protein) 또는 HRP(horse radish peroxidase)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 표지자는 바이오틴 결합 단백질이 결합된 것일 수 있다. 상기 바이오틴 결합 단백질은 아비딘(avidin) 계열 단백질인 스트렙타비딘, 트랩타비딘(traptavidin) 또는 뉴트라비딘(neutravidin)일 수 있으나, 바이오틴과 특이적으로 결합할 수 있는 단백질이면 제한없이 사용할 수 있다. 일 구체예로서, 상기 표지자는 스트렙타비딘이 결합된 것일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "스트렙타비딘"은 스트렙토마이세스 아비디니(Streptomyces avidinii)로부터 분리되는 분자량 60 kDa의 4량체 바이오틴 결합 단백질이다. 상기 아비딘과는 매우 낮은 상동성을 가지나 그 구조는 매우 유사하다. 아비딘과 마찬가지로 항균활성을 가지며 바이오틴에 대해 매우 높은 결합력을 갖는다. 한편 아비딘과는 달리 탄수화물을 포함하지 않으며 산성 등전점(pI=5)을 나타내고 아비딘에 비해 현저히 낮은 용해도를 갖는다. 상업적으로 사용가능한 스트렙타비딘 예컨대, Thermo Scientific Pierce Streptavidin은 53 kDa의 분자량을 갖는 재조합 형태의 스트렙타비딘으로 중성에 가까운 등전점(pI=6.8 내지 7.5)를 갖는다. 스트렙타비딘의 당화결여 및 낮은 pI가 아비딘과 비교하여 낮은 수준의 비특이적 결합(특히, 렉틴결합)을 갖도록 한다. 이러한 스트렙타비딘의 특성이 많은 검출시스템에 이상적인 시약으로 선택될 수 있도록 한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "트렙타비딘(traptavidin)"은 스트렙타비딘의 변이체(variant or mutein)를 지칭하는 용어로, 약 10배 가량 느린 바이오틴에 대한 해리속도를 나타내며, 기계적 강도가 증가되고, 열적 안정성이 향상된 단백질이다. 트렙타비딘 역시 바이오틴에 특이적으로 결합한다.
본 발명의 용어 "뉴트라비딘(neutravidin)"은 "탈당화아비딘"이라고도 하며 천연형의 아비딘과 스트렙타비딘의 주된 단점을 피하고자 제조된 것으로 이름에 나타난 바와 같이 아비딘을 탈당화하여 생성되는 것으로 아비딘에 비해 감소된 분자량(60 kDa)을 가지면서도 높은 바이오틴 결합력을 유지하는 단백질이다. 상기 아비딘의 탈당화는 검출되지 않는 수준으로 렉틴의 결합을 감소시키며 등전점을 낮추어(pI=6.3) 아비딘에 대한 비특이적인 결합의 주된 원인을 효과적으로 제거한다. 라이신 잔기는 사용가능한 채로 유지되므로 스트렙타비딘과 같이 용이하게 유도체화하거나 복합체화할 수 있다. 또한 높은 바이오틴 결합력 및 낮은 비특이적 결합을 나타나므로 이상적인 바이오틴 결합 단백질로 다양하게 이용될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "표지자를 검출하는 단계"란, 프로브와 바이오틴-에비딘 반응을 통해 결합된 표지자를 검출하는 단계를 의미한다. 상기 표지자의 검출은 색깔 변화, UV 흡광도 변화, 생물발광 여부, 형광반응 변화, 또는 전기화학적 변화에 의해 측정될 수 있다. 구체적으로, 상기 표지자를 검출하는 방법은 사용한 표지자에 따라 다르게 수행될 수 있는데, 예를 들어, HRP를 표지자로 사용한 경우에는 과산화수소와 기질과의 반응을 통한 발색반응을 관찰하여 표지자를 검출할 수 있다. 또한, 표지자가 GFP와 같은 형광단백질일 경우에는 특정 파장의 빛을 조사한 후 나오는 검출되는 빛을 관찰하여 표지자의 존재 여부를 검출할 수 있다. 아울러, 표지자가 루시퍼레이즈일 경우 루시페린과 같은 기질을 첨가한 후 나타나는 생물발광을 생물발광계로 측정함으로써 표지자의 존재를 검출할 수 있다.
또한, 본 발명의 진단 방법은 cfDNA를 변성단계를 더 포함할 수 있다. 이때, 상기 변성단계는 정상적인 이중가닥 cfDNA는 변성시키지 않으나, 이를 위해, 상기 변성 단계의 조건은 약 50℃ 내지 약 100℃에서 약 0.1초 내지 약 5분간 수행될 수 있다. 변성 온도의 일 구체예는 약 95℃일 수 있으며, 변성시간은 통상 약 0.1초 내지 약 8분 정도 수행될 수 있다. 또한, 약 1초, 약 5초, 약 10초, 약 30초, 약 60초 또는 약 90초간 변성될 수 있다. 일 구체예에서 상기 cfDNA를 변성시키는 단계는 상기 c) 단계 전에 수행될 수 있다.
구체적으로, 상기 c) 단계 이전에 시료 또는 양전하를 띠는 물질에 결합된 cfDNA를 i) 상온에서 약 1분 내지 약 10분 방치하는 조건; ii) 약 90℃ 내지 약 95℃에서 1초 내지 1분간 가열하는 조건; iii) 약 75℃ 내지 약 90℃에서 약 10초 내지 약 3분간 가열하는 조건; iv) 약 60℃ 내지 약 75℃에서 약 1분 내지 약 30분간 가열하는 조건; v) 약 25℃ 내지 약 40℃에서 약 5분 내지 약 60분간 가열하는 조건; vi) 프로테아제로 약 1분 내지 약 10분 처리하는 조건; 및 vii) DNaseI로 약 1분 내지 약 10분 처리하는 조건으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 조건에서 변성시키는 단계를 더 포함할 수 있다. 이러한 변성단계는 정상세포에서 유래한 이중가닥 cfDNA는 변성시키지 않으나, 암세포에서 유래한 cfDNA만을 선별적으로 변성시킴으로서, 프로부와의 결합을 더욱 용이하게 할 수 있다. 상기 i) 내지 vii)의 변성 조건은 시료를 수득한 후 수행할 수 있다. 또한, 상기 i) 내지 vii)의 변성 조건은 양전하를 띠는 물질에 결합된 cfDNA를 수득한 후 수행할 수 있다. 또한, 상기 i) 내지 vii)의 변성 조건의 온도, 프로테아제 및 DNase 처리 시간은 안정한 cfDNA를 변성시키지 않는 한 적절히 조정될 수 있다.
갑상선암 진단 키트
본 발명의 다른 측면은, 갑상선암에 특이적으로 발현하는 유전자에 상보적으로 결합하는 바이오틴이 결합된 프로브; 양전하를 띠는 물질; 아비딘 계열의 단백질이 결합된 표지자 및 설명서를 포함하는 갑상선암 진단 키트를 제공하는 것이다.
이때, 상기 갑상선암에 특이적으로 발현하는 유전자는 TG, CALCA, APOC1, HIG2 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
또한, 상기 설명서는 상기 키트 구성이 하기와 같은 프로토콜에 의해 갑상선암을 진단할 수 있는 것으로 기재된 것일 수 있다: a) 개체로부터 분리된 생물학적 시료로부터 키트 내에 포함된 양전하를 띠는 물질을 이용하여 cfDNA를 분리하시오; b) 상기 분리된 cfDNA에 키트내에 포함된 바이오틴이 결합된 프로브 및 키트내에 포함된 표지자를 순차적 또는 동시에 혼합하시오; c) cfDNA에 결합하지 않은 프로브 및 표지자를 제거하시오; 및 d) 상기 표지자의 신호를 검출하시오.
또한, ENO2, ACPP, TYRO3, CPT1A, IFNG, CD279, CD274, ERBB2, EGFR, FOLR1, EPCAM 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나의 유전자에 상보적으로 결합하는 바이오틴이 결합된 프로브를 추가적으로 포함할 수 있다.
또한, 상기 프로브, 양전하를 띠는 물질 및 표지자는 상술한 바와 같다.
갑상선암 진단 장치
본 발명의 다른 측면은, a) cfDNA가 포함된 개체로부터 분리된 생물학적 시료 및 양전하를 띠는 물질을 혼합시키는 혼합부; b) cfDNA가 결합된 양전하를 띠는 물질을 제외한 시료를 제거하기 위한 수득부; c) 상기 cfDNA가 결합된 양전하를 띠는 물질에, 상기 갑상선암에 특이적으로 발현하는 유전자에 상보적으로 결합할 수 있는 바이오틴이 결합된 프로브; 및 스트렙타비딘 및 표지자를 포함하는 나노입자를 순차적으로 또는 동시에 첨가시키는 반응부; d) 표지자를 검출하는 검출부; 및 e) 표지자의 검출 여부에 따라 상기 시료에 프로브에 상보적인 서열을 가지며, 갑상선암에서 유래된 cfDNA가 존재한다고 결정하는 정보 처리부를 포함하는, 상기 시료로부터, 증폭없이, 갑상선암세포 유래의 유전자를 검출하여 갑상선암을 진단하는 장치를 제공하는 것이다.
이때, 상기 갑상선암에 특이적으로 발현하는 유전자는 TG, CALCA, APOC1, HIG2 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
또한, ENO2, ACPP, TYRO3, CPT1A, IFNG, CD279, CD274, ERBB2, EGFR, FOLR1, EPCAM 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나의 유전자에 상보적으로 결합하는 바이오틴이 결합된 프로브를 추가적으로 포함할 수 있다.
<방광암>
방광암 진단 방법
본 발명의 일 측면은, a) 세포유리 DNA(cell-free DNA, 이하 cfDNA)가 포함된 개체로부터 분리된 생물학적 시료 및 양전하를 띠는 물질을 혼합하는 단계; b) cfDNA가 결합된 양전하를 띠는 물질을 분리하는 단계; c) 상기 혼합물에 상기 cfDNA에 상보적인 서열을 갖는 프로브 및 표지자를 순차적으로 또는 동시에 혼합하는 단계; d) cfDNA에 결합하지 않은 프로브 및 표지자를 제거하는 단계; 및 e) 상기 표지자를 검출하는 단계를 포함하는, 상기 시료로부터, 증폭없이, 방광암세포 유래의 유전자를 검출하여 방광암을 진단하는 방법으로서, 상기 cfDNA에 상보적인 서열을 갖는 프로브는 방광암 바이오마커로 알려진 유전자에 상보적으로 결합하는 것인, 방광암을 진단하는 방법을 제공한다. 이때, 방광암 바이오마커로 알려진 유전자는 방광암에서 과발현되는 단백질을 코딩하는 유전자 일 수 있다.
구체적으로, 상기 cfDNA에 상보적인 서열을 갖는 프로브는 OGT, FGFR3, TP53, NUMA1, COCH, CELSR3, HMOX1, KIF1A, MGC17624, MTAP, PFKFB4, S100A8, RSPH9, FOXM1, FANCB, FANCC, FANCD2, RUSC1-AS1, CACNA1B, IMP-1, PDE3A, POU3F4, SOX3, DMC1, PLXDC2, ZNF312, SYCP2L, HOXA9, ISL1, ALDH1A3 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나의 유전자에서 상보적으로 결합하는 것일 수 있다.
또한, 상기 분리된 생물학적 시료를 사용하는 목적은 시료 내에 존재하는 cfDNA를 검출하기 위함이다. 따라서, 시료내의 cfDNA를 다양한 방법으로 분리 및/또는 농축시켜 사용할 수 있다. 일 구체예로 핵산에 강한 친화성이 있는 니트로셀룰로오스 막(nitrocellulose membrane)을 이용할 수 있다. 또한, 일 구체예로 음전하를 띄고 있는 cfDNA를 포집하기 위하여 양전하를 띄고 있는 물질을 이용할 수 있다. 상기 양전하를 띠고 있는 물질은 나노입자, 나노와이어, 망구조 또는 양전하를 띤 필터일 수 있으나, 그 형상에 제한되는 것은 아니다. 상기 "양전하를 띄고 있는 물질"의 일 구체예로는 양전하를 띈 나노구조체 또는 양전하를 띤 멤브레인일 수 있다.
나노구조체의 일 실시예는 양이온 고분자를 포함하는 것일 수 있다. 상기 양이온성 고분자는 그 종류에 있어서 제한이 없다. 양이온성 고분자의 일 구체예로는 폴리에틸렌이민(polyethyleneimine, PEI)일 수 있으며, 양이온성 가지형 고분자 폴리에틸렌이민(cationic branched polymer polyethyleneimene)일 수 있다.
또한, 스트렙타비딘이 표지된 나노와이어를 바이오틴이 결합된 PEI 용액과 혼합하여, 바이오틴-스트렙타비딘의 상호 작용을 통해 나노와이어에 양이온성 분지형 폴리에틸렌이민(cationic branched PEI)를 추가로 결합시킬 수 있다. 그 결과, 양이온성 고분자인 폴리에틸렌이민이 표면에 결합된 나노구조체(PEI/mPpy NW)안에 나노입자가 높은 밀도로, 불규칙하게 분포되어 매립될 수 있다.
이러한 나노와이어는 높은 효율로 낮은 농도에서도 게놈 DNA 및 cfDNA 성공적으로 포집할 수 있다. 특히, DNA 등의 표적 분자와의 결합을 위한 넓은 표면적, DNA와의 상호 작용 촉진을 위한 향상된 이동성과 같은 나노와이어의 특징으로 인해, 효율적이고 효과적으로 표적 cfDNA를 포집할 수 있다.
이때, 상기 표적 cfDNA는 검출하려는 목적 cfDNA를 의미한다. 본 명세서에서 cfDNA는 이중가닥을 가진다. 이때, 상기 cfDNA의 일부가 이중가닥이 풀려있을 수 있다. 또한, 상기 cfDNA는 방광암 세포의 유전자로부터 유래된 것일 수 있다. 구체적으로, cfDNA는 방광암세포에서 과발현되는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 상기 암세포에서 과발현되는 핵산 서열은 정상세포에는 적정 발현수준을 보이나, 특정 암세포에서 과발현되는 핵산 서열을 의미한다.
구체적으로, 상기 핵산 서열의 암세포에서 과발현되는 정도 또는 기준(cutoff)은 표지자를 이용한 흡광도(optical density)를 측정하였을 때, OD값이 0.010 이상인 경우일 수 있다. 보다 구체적으로는, 상기 핵산 서열의 암세포에서 과발현되는 정도 또는 기준은 표지자를 이용한 흡광도를 측정하였을 때, OD값이 0.012 또는 0.015 이상인 경우일 수 있다. 이때, 상기 흡광도 측정을 위해 조사하는 파장은 표지자에 따라 적절히 정해질 수 있다. 상기 cfDNA는 이중가닥이 풀린 DNA(unwinding of DNA)일 수 있다. 또한, 목적에 따라 cfDNA는 적절히 정해질 수 있다.
또한, 상기 방광암세포에서 유래된 cfDNA는 i) 정상 세포에서 유래된 이중 나선 구조를 가지는 cfDNA에 비해 낮은 Tm 값을 갖거나, ii) 정상 세포에서 유래된 이중 나선 구조를 가지는 cfDNA가 변성되지 않는 조건에서 변성이 되는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.
또한, 상기 cfDNA는 하기의 조건 중 어느 하나의 조건에서 cfDNA 상보적으로 결합 가능한 약 15머 내지 약 30머 프로브와 결합할 수 있다: i) 상온에서 약 1분 내지 약 120분 방치하는 조건; ii) 약 90℃ 내지 약 95℃에서 약 1초 내지 약 3분간 가열하는 조건; iii) 약 75℃ 내지 약 90℃에서 약 1초 내지 약 5분간 가열하는 조건; iv) 약 60℃ 내지 약 75℃에서 약 30초 내지 약 30분간 가열하는 조건; v) 약 25℃ 내지 약 40℃에서 약 10분 내지 약 120분간 가열하는 조건; vi) 프로테아제로 약 1분 내지 약 30분 처리하는 조건; vii) DNase로 약 1분 내지 약 30분 처리하는 조건; 및 viii) 화학물질(예, 수산화나트륨, DMSO, 계면활성제 등)을 처리하는 조건.
상기 방광암세포에서 과발현 되는 유전자는 OGT(NCBI Gene ID: 8473), FGFR3(NCBI Gene ID: 2261), TP53(NCBI Gene ID: 7157), NUMA1(NCBI Gene ID: 4926), KRT19(NCBI Gene ID: 3880), COCH(NCBI Gene ID: 1690), CELSR3(NCBI Gene ID: 1951), HMOX1(NCBI Gene ID: 3162), KIF1A(NCBI Gene ID: 547), MGC17624(NCBI Gene ID: 404550), MTAP(NCBI Gene ID: 4507), PFKFB4(NCBI Gene ID: 5210), S100A8(NCBI Gene ID: 6279), RSPH9(NCBI Gene ID: 221421), CCNB1(NCBI Gene ID: 891), FOXM1(NCBI Gene ID: 2305), FANCB(NCBI Gene ID: 2187), FANCC(NCBI Gene ID: 2176), FANCD2(NCBI Gene ID: 2177), RUSC1-AS1(NCBI Gene ID: 284618), CACNA1B(NCBI Gene ID: 774), IMP-1(NCBI Gene ID: 10642), PDE3A(NCBI Gene ID: 5139), POU3F4(NCBI Gene ID: 5456), SOX3(NCBI Gene ID: 6658), DMC1(NCBI Gene ID: 11144), PLXDC2(NCBI Gene ID: 84898), ZNF312(NCBI Gene ID: 55079), SYCP2L(NCBI Gene ID: 221711), HOXA9(NCBI Gene ID: 3205), ISL1(NCBI Gene ID: 3670), ALDH1A3(NCBI Gene ID: 220), CPT1A(NCBI Gene ID: 1374), IFNG(NCBI Gene ID: 3458), CD274(NCBI Gene ID: 29126), FOLR1(NCBI Gene ID: 2348), EPCAM(NCBI Gene ID: 4072) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
일 구체예로서, 방광암에 특이적으로 존재하는 유전자는 OGT, FGFR3, TP53, NUMA1, COCH, CELSR3, HMOX1, KIF1A, MGC17624, MTAP, PFKFB4, S100A8, RSPH9, FOXM1, FANCB, FANCC, FANCD2, RUSC1-AS1, CACNA1B, IMP-1, PDE3A, POU3F4, SOX3, DMC1, PLXDC2, ZNF312, SYCP2L, HOXA9, ISL1, ALDH1A3 유전자 일수 있으며, 추가적으로, KRT19, CCNB1, CPT1A, IFNG, CD279, CD274, ERBB2, EGFR, FOLR1 또는 EPCAM 유전자를 검출하여 방광암을 진단할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "OGT"란, O-GlcNAc transferase를 코딩하고 있는 유전자를 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "FGFR1"이란, 섬유아세포 증식인자 수용체 1(fibroblast growth factor receptor 1)을 코딩하고 있는 유전자를 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "NUMA1"이란, NMP22(nuclear matrix protein-22)를 코딩하고 있는 유전자를 의미한다. 상기 NMP22는 방광암을 포함한 일부 유형의 암을 가진 환자의 소변에서 정상 수치보다 높게 발견되어 방광암 표지자로 널리 사용되고 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "프로브(probe)"는 cfDNA를 검출하기 위한 DNA 또는 RNA를 의미한다. 프로브는 cfDNA에 상보적인 결합을 할 수 있도록 특정 서열을 가질 수 있다. 상기 cfDNA에 상보적인 서열을 갖는 프로브는 혈장에 존재하는 검출하기를 원하는 목적 이중가닥의 cfDNA에 상보적인 결합할 수 있는 핵산 서열을 갖는 프로브를 의미한다. 이때, 상기 프로브는 바이오틴(biotin)이 결합된 것일 수 있다. 상기 프로브는 바이오틴 결합 단백질과 결합된 표지자와 결합될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "표지자"는, cfDNA와 결합된 프로브를 검출하기 위해 이용되는 물질을 의미한다. 상기 표지자는 나노입자, 형광염료, 형광단백질 또는 효소일 수 있다. 구체적으로, 상기 표지자는 양자점, HRP 및 형광단백질로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다. 일 구체예로는, 상기 표지자는 GFP(green fluorescent protein), BFP(blue fluorescent protein), CFP(cyan fluorescent protein), YFP(yellow fluorescent protein) 또는 HRP(horse radish peroxidase)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 표지자는 바이오틴 결합 단백질이 결합된 것일 수 있다. 상기 바이오틴 결합 단백질은 아비딘(avidin) 계열 단백질인 스트렙타비딘, 트랩타비딘(traptavidin) 또는 뉴트라비딘(neutravidin)일 수 있으나, 바이오틴과 특이적으로 결합할 수 있는 단백질이면 제한없이 사용할 수 있다. 일 구체예로서, 상기 표지자는 스트렙타비딘이 결합된 것일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "스트렙타비딘"은 스트렙토마이세스 아비디니(Streptomyces avidinii)로부터 분리되는 분자량 60 kDa의 4량체 바이오틴 결합 단백질이다. 상기 아비딘과는 매우 낮은 상동성을 가지나 그 구조는 매우 유사하다. 아비딘과 마찬가지로 항균활성을 가지며 바이오틴에 대해 매우 높은 결합력을 갖는다. 한편 아비딘과는 달리 탄수화물을 포함하지 않으며 산성 등전점(pI=5)을 나타내고 아비딘에 비해 현저히 낮은 용해도를 갖는다. 상업적으로 사용가능한 스트렙타비딘 예컨대, Thermo Scientific Pierce Streptavidin은 53 kDa의 분자량을 갖는 재조합 형태의 스트렙타비딘으로 중성에 가까운 등전점(pI=6.8 내지 7.5)를 갖는다. 스트렙타비딘의 당화결여 및 낮은 pI가 아비딘과 비교하여 낮은 수준의 비특이적 결합(특히, 렉틴결합)을 갖도록 한다. 이러한 스트렙타비딘의 특성이 많은 검출시스템에 이상적인 시약으로 선택될 수 있도록 한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "트렙타비딘(traptavidin)"은 스트렙타비딘의 변이체(variant or mutein)를 지칭하는 용어로, 약 10배 가량 느린 바이오틴에 대한 해리속도를 나타내며, 기계적 강도가 증가되고, 열적 안정성이 향상된 단백질이다. 트렙타비딘 역시 바이오틴에 특이적으로 결합한다.
본 발명의 용어 "뉴트라비딘(neutravidin)"은 "탈당화아비딘"이라고도 하며 천연형의 아비딘과 스트렙타비딘의 주된 단점을 피하고자 제조된 것으로 이름에 나타난 바와 같이 아비딘을 탈당화하여 생성되는 것으로 아비딘에 비해 감소된 분자량(60 kDa)을 가지면서도 높은 바이오틴 결합력을 유지하는 단백질이다. 상기 아비딘의 탈당화는 검출되지 않는 수준으로 렉틴의 결합을 감소시키며 등전점을 낮추어(pI=6.3) 아비딘에 대한 비특이적인 결합의 주된 원인을 효과적으로 제거한다. 라이신 잔기는 사용가능한 채로 유지되므로 스트렙타비딘과 같이 용이하게 유도체화하거나 복합체화할 수 있다. 또한 높은 바이오틴 결합력 및 낮은 비특이적 결합을 나타나므로 이상적인 바이오틴 결합 단백질로 다양하게 이용될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "표지자를 검출하는 단계"란, 프로브와 바이오틴-에비딘 반응을 통해 결합된 표지자를 검출하는 단계를 의미한다. 상기 표지자의 검출은 색깔 변화, UV 흡광도 변화, 생물발광 여부, 형광반응 변화, 또는 전기화학적 변화에 의해 측정될 수 있다. 구체적으로, 상기 표지자를 검출하는 방법은 사용한 표지자에 따라 다르게 수행될 수 있는데, 예를 들어, HRP를 표지자로 사용한 경우에는 과산화수소와 기질과의 반응을 통한 발색반응을 관찰하여 표지자를 검출할 수 있다. 또한, 표지자가 GFP와 같은 형광단백질일 경우에는 특정 파장의 빛을 조사한 후 나오는 검출되는 빛을 관찰하여 표지자의 존재 여부를 검출할 수 있다. 아울러, 표지자가 루시퍼레이즈일 경우 루시페린과 같은 기질을 첨가한 후 나타나는 생물발광을 생물발광계로 측정함으로써 표지자의 존재를 검출할 수 있다.
또한, 본 발명의 진단 방법은 cfDNA를 변성단계를 더 포함할 수 있다. 이때, 상기 변성단계는 정상적인 이중가닥 cfDNA는 변성시키지 않으나, 방광암에서 유래한 cfDNA만을 선별적으로 변성시킬 수 있도록 수행될 수 있다. 이를 위해, 상기 변성 단계의 조건은 약 50℃ 내지 약 100℃에서 약 0.1초 내지 약 5분간 수행될 수 있다. 변성 온도의 일 구체예는 약 95℃일 수 있으며, 변성시간은 통상 약 0.1초 내지 약 8분 정도 수행될 수 있다. 또한, 약 1초, 약 5초, 약 10초, 약 30초, 약 60초 또는 약 90초간 변성될 수 있다. 일 구체예에서 상기 cfDNA를 변성시키는 단계는 상기 c) 단계 전에 수행될 수 있다.
구체적으로, 상기 c) 단계 이전에 시료 또는 양전하를 띠는 물질에 결합된 cfDNA를 i) 상온에서 약 1분 내지 약 10분 방치하는 조건; ii) 약 90℃ 내지 약 95℃에서 1초 내지 1분간 가열하는 조건; iii) 약 75℃ 내지 약 90℃에서 약 10초 내지 약 3분간 가열하는 조건; iv) 약 60℃ 내지 약 75℃에서 약 1분 내지 약 30분간 가열하는 조건; v) 약 25℃ 내지 약 40℃에서 약 5분 내지 약 60분간 가열하는 조건; vi) 프로테아제로 약 1분 내지 약 10분 처리하는 조건; 및 vii) DNaseI로 약 1분 내지 약 10분 처리하는 조건으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 조건에서 변성시키는 단계를 더 포함할 수 있다. 이러한 변성단계는 정상세포에서 유래한 이중가닥 cfDNA는 변성시키지 않으나, 암세포에서 유래한 cfDNA만을 선별적으로 변성시킴으로서, 프로부와의 결합을 더욱 용이하게 할 수 있다. 상기 i) 내지 vii)의 변성 조건은 시료를 수득한 후 수행할 수 있다. 또한, 상기 i) 내지 vii)의 변성 조건은 양전하를 띠는 물질에 결합된 cfDNA를 수득한 후 수행할 수 있다. 또한, 상기 i) 내지 vii)의 변성 조건의 온도, 프로테아제 및 DNase 처리 시간은 안정한 cfDNA를 변성시키지 않는 한 적절히 조정될 수 있다.
방광암 진단 키트
본 발명의 다른 측면은, 방광암에 특이적으로 발현하는 유전자에 상보적으로 결합하는 바이오틴이 결합된 프로브; 양전하를 띠는 물질; 아비딘 계열의 단백질이 결합된 표지자 및 설명서를 포함하는 방광암 진단 키트를 제공하는 것이다.
이때, 상기 방광암에 특이적으로 발현하는 유전자는 OGT, FGFR3, TP53, NUMA1, COCH, CELSR3, HMOX1, KIF1A, MGC17624, MTAP, PFKFB4, S100A8, RSPH9, FOXM1, FANCB, FANCC, FANCD2, RUSC1-AS1, CACNA1B, IMP-1, PDE3A, POU3F4, SOX3, DMC1, PLXDC2, ZNF312, SYCP2L, HOXA9, ISL1, ALDH1A3 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
또한, 상기 설명서는 상기 키트 구성이 하기와 같은 프로토콜에 의해 방광암을 진단할 수 있는 것으로 기재된 것일 수 있다: a) 개체로부터 분리된 생물학적 시료로부터 키트 내에 포함된 양전하를 띠는 물질을 이용하여 cfDNA를 분리하시오; b) 상기 분리된 cfDNA에 키트내에 포함된 바이오틴이 결합된 프로브 및 키트내에 포함된 표지자를 순차적 또는 동시에 혼합하시오; c) cfDNA에 결합하지 않은 프로브 및 표지자를 제거하시오; 및 d) 상기 표지자의 신호를 검출하시오.
또한, KRT19, CCNB1, CPT1A, IFNG, CD279, CD274, ERBB2, EGFR, FOLR1, EPCAM 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나의 유전자에 상보적으로 결합하는 바이오틴이 결합된 프로브를 추가적으로 포함할 수 있다.
또한, 상기 프로브, 양전하를 띠는 물질 및 표지자는 상술한 바와 같다.
방광암 진단 장치
본 발명의 다른 측면은, a) cfDNA가 포함된 개체로부터 분리된 생물학적 시료 및 양전하를 띠는 물질을 혼합시키는 혼합부; b) cfDNA가 결합된 양전하를 띠는 물질을 제외한 시료를 제거하기 위한 수득부; c) 상기 cfDNA가 결합된 양전하를 띠는 물질에, 상기 방광암에 특이적으로 발현하는 유전자에 상보적으로 결합할 수 있는 바이오틴이 결합된 프로브; 및 스트렙타비딘 및 표지자를 포함하는 나노입자를 순차적으로 또는 동시에 첨가시키는 반응부; d) 표지자를 검출하는 검출부; 및 e) 표지자의 검출 여부에 따라 상기 시료에 프로브에 상보적인 서열을 가지며, 방광암에서 유래된 cfDNA가 존재한다고 결정하는 정보 처리부를 포함하는, 상기 시료로부터, 증폭없이, 방광암세포 유래의 유전자를 검출하여 방광암을 진단하는 장치를 제공하는 것이다.
이때, 상기 방광암에 특이적으로 발현하는 유전자는 OGT, FGFR3, TP53, NUMA1, COCH, CELSR3, HMOX1, KIF1A, MGC17624, MTAP, PFKFB4, S100A8, RSPH9, FOXM1, FANCB, FANCC, FANCD2, RUSC1-AS1, CACNA1B, IMP-1, PDE3A, POU3F4, SOX3, DMC1, PLXDC2, ZNF312, SYCP2L, HOXA9, ISL1, ALDH1A3 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
또한, KRT19, CCNB1, CPT1A, IFNG, CD279, CD274, ERBB2, EGFR, FOLR1, EPCAM 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나의 유전자에 상보적으로 결합하는 바이오틴이 결합된 프로브를 추가적으로 포함할 수 있다.
<유방암>
유방암 진단 방법
본 발명의 일 측면은, a) 세포유리 DNA(cell-free DNA, 이하 cfDNA)가 포함된 개체로부터 분리된 생물학적 시료 및 양전하를 띠는 물질을 혼합하는 단계; b) cfDNA가 결합된 양전하를 띠는 물질을 분리하는 단계; c) 상기 혼합물에 상기 cfDNA에 상보적인 서열을 갖는 프로브 및 표지자를 순차적으로 또는 동시에 혼합하는 단계; d) cfDNA에 결합하지 않은 프로브 및 표지자를 제거하는 단계; 및 e) 상기 표지자를 검출하는 단계를 포함하는, 상기 시료로부터, 증폭없이, 유방암세포 유래의 유전자를 검출하여 유방암을 진단하는 방법으로서, 상기 cfDNA에 상보적인 서열을 갖는 프로브는 유방암 바이오마커로 알려진 유전자에 상보적으로 결합하는 것인, 유방암을 진단하는 방법을 제공한다. 이때, 유방암 바이오마커로 알려진 유전자는 유방암에서 과발현되는 단백질을 코딩하는 유전자 일 수 있다.
구체적으로, 상기 cfDNA에 상보적인 서열을 갖는 프로브는 MEST, NR1D1, BIRC5, RACGAP1, DHCR7, STC2, AZGP1, RBBP8, IL6ST, MGP, TRBC1, MMP11, COL10A1, C10orf64, COL11A1, POTEG, FSIP1, HER2 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나의 유전자에서 상보적으로 결합하는 것일 수 있다.
또한, 상기 분리된 생물학적 시료를 사용하는 목적은 시료 내에 존재하는 cfDNA를 검출하기 위함이다. 따라서, 시료내의 cfDNA를 다양한 방법으로 분리 및/또는 농축시켜 사용할 수 있다. 일 구체예로 핵산에 강한 친화성이 있는 니트로셀룰로오스 막(nitrocellulose membrane)을 이용할 수 있다. 또한, 일 구체예로 음전하를 띄고 있는 cfDNA를 포집하기 위하여 양전하를 띄고 있는 물질을 이용할 수 있다. 상기 양전하를 띠고 있는 물질은 나노입자, 나노와이어, 망구조 또는 양전하를 띤 필터일 수 있으나, 그 형상에 제한되는 것은 아니다. 상기 "양전하를 띄고 있는 물질"의 일 구체예로는 양전하를 띈 나노구조체 또는 양전하를 띤 멤브레인일 수 있다.
나노구조체의 일 실시예는 양이온 고분자를 포함하는 것일 수 있다. 상기 양이온성 고분자는 그 종류에 있어서 제한이 없다. 양이온성 고분자의 일 구체예로는 폴리에틸렌이민(polyethyleneimine, PEI)일 수 있으며, 양이온성 가지형 고분자 폴리에틸렌이민(cationic branched polymer polyethyleneimene)일 수 있다.
또한, 스트렙타비딘이 표지된 나노와이어를 바이오틴이 결합된 PEI 용액과 혼합하여, 바이오틴-스트렙타비딘의 상호 작용을 통해 나노와이어에 양이온성 분지형 폴리에틸렌이민(cationic branched PEI)를 추가로 결합시킬 수 있다. 그 결과, 양이온성 고분자인 폴리에틸렌이민이 표면에 결합된 나노구조체(PEI/mPpy NW)안에 나노입자가 높은 밀도로, 불규칙하게 분포되어 매립될 수 있다.
이러한 나노와이어는 높은 효율로 낮은 농도에서도 게놈 DNA 및 cfDNA 성공적으로 포집할 수 있다. 특히, DNA 등의 표적 분자와의 결합을 위한 넓은 표면적, DNA와의 상호 작용 촉진을 위한 향상된 이동성과 같은 나노와이어의 특징으로 인해, 효율적이고 효과적으로 표적 cfDNA를 포집할 수 있다.
이때, 상기 표적 cfDNA는 검출하려는 목적 cfDNA를 의미한다. 본 명세서에서 cfDNA는 이중가닥을 가진다. 이때, 상기 cfDNA의 일부가 이중가닥이 풀려있을 수 있다. 또한, 상기 cfDNA는 유방암 세포의 유전자로부터 유래된 것일 수 있다. 구체적으로, cfDNA는 유방암세포에서 과발현되는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 상기 암세포에서 과발현되는 핵산 서열은 정상세포에는 적정 발현수준을 보이나, 특정 암세포에서 과발현되는 핵산 서열을 의미한다.
구체적으로, 상기 핵산 서열의 암세포에서 과발현되는 정도 또는 기준(cutoff)은 표지자를 이용한 흡광도(optical density)를 측정하였을 때, OD값이 0.010 이상인 경우일 수 있다. 보다 구체적으로는, 상기 핵산 서열의 암세포에서 과발현되는 정도 또는 기준은 표지자를 이용한 흡광도를 측정하였을 때, OD값이 0.012 또는 0.015 이상인 경우일 수 있다. 이때, 상기 흡광도 측정을 위해 조사하는 파장은 표지자에 따라 적절히 정해질 수 있다. 상기 cfDNA는 이중가닥이 풀린 DNA(unwinding of DNA)일 수 있다. 또한, 목적에 따라 cfDNA는 적절히 정해질 수 있다.
또한, 상기 유방암세포에서 유래된 cfDNA는 i) 정상 세포에서 유래된 이중 나선 구조를 가지는 cfDNA에 비해 낮은 Tm 값을 갖거나, ii) 정상 세포에서 유래된 이중 나선 구조를 가지는 cfDNA가 변성되지 않는 조건에서 변성이 되는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.
또한, 상기 cfDNA는 하기의 조건 중 어느 하나의 조건에서 cfDNA 상보적으로 결합 가능한 약 15머 내지 약 30머 프로브와 결합할 수 있다: i) 상온에서 약 1분 내지 약 120분 방치하는 조건; ii) 약 90℃ 내지 약 95℃에서 약 1초 내지 약 3분간 가열하는 조건; iii) 약 75℃ 내지 약 90℃에서 약 1초 내지 약 5분간 가열하는 조건; iv) 약 60℃ 내지 약 75℃에서 약 30초 내지 약 30분간 가열하는 조건; v) 약 25℃ 내지 약 40℃에서 약 10분 내지 약 120분간 가열하는 조건; vi) 프로테아제로 약 1분 내지 약 30분 처리하는 조건; vii) DNase로 약 1분 내지 약 30분 처리하는 조건; 및 viii) 화학물질(예, 수산화나트륨, DMSO, 계면활성제 등)을 처리하는 조건.
상기 유방암세포에서 과발현 되는 유전자는 MUC1(NCBI Gene ID: 4582), ACPP(NCBI Gene ID: 55), MEST(NCBI Gene ID: 4232), TYRO3(NCBI Gene ID: 7301), NR1D1(NCBI Gene ID: 9572), UBE2C(NCBI Gene ID: 11065), BIRC5(NCBI Gene ID: 332), RACGAP1(NCBI Gene ID: 29127), DHCR7(NCBI Gene ID: 1717), STC2(NCBI Gene ID: 8614), AZGP1(NCBI Gene ID: 563), RBBP8(NCBI Gene ID: 5932), IL6ST(NCBI Gene ID: 3572), MGP(NCBI Gene ID: 4256), TRBC1(NCBI Gene ID: 28639), MMP11(NCBI Gene ID: 4320), COL10A1(NCBI Gene ID: 1300), C10orf64(NCBI Gene ID: 57705), COL11A1(NCBI Gene ID: 1301), POTEG(NCBI Gene ID: 404785), FSIP1(NCBI Gene ID: 161835), HER2(NCBI Gene ID: 2064), CPT1A(NCBI Gene ID: 1374), IFNG(NCBI Gene ID: 3458), CD274(NCBI Gene ID: 29126), FOLR1(NCBI Gene ID: 2348), EPCAM(NCBI Gene ID: 4072) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
일 구체예로서, 유방암에 특이적으로 존재하는 유전자는 MEST, NR1D1, BIRC5, RACGAP1, DHCR7, STC2, AZGP1, RBBP8, IL6ST, MGP, TRBC1, MMP11, COL10A1, C10orf64, COL11A1, POTEG, FSIP1, HER2 유전자 일수 있으며, 추가적으로, MUC1, ACPP, TYRO3, UBE2C, CPT1A, IFNG, CD279, CD274, ERBB2, EGFR, FOLR1 또는 EPCAM 유전자를 검출하여 유방암을 진단할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "MUC1"이란, CA 15-3(Carcinoma Antigen 15-3) 및 CA 27-29 를 포함하는 단백질을 코딩하고 있는 유방암 관련 유전자를 의미한다. 상기 CA15-3은 유방암에서 조기 재발 가능성이 증가하는 것으로 나타났으며, 유방암 표지자로서 이용되고 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "프로브(probe)"는 cfDNA를 검출하기 위한 DNA 또는 RNA를 의미한다. 프로브는 cfDNA에 상보적인 결합을 할 수 있도록 특정 서열을 가질 수 있다. 상기 cfDNA에 상보적인 서열을 갖는 프로브는 혈장에 존재하는 검출하기를 원하는 목적 이중가닥의 cfDNA에 상보적인 결합할 수 있는 핵산 서열을 갖는 프로브를 의미한다. 이때, 상기 프로브는 바이오틴(biotin)이 결합된 것일 수 있다. 상기 프로브는 바이오틴 결합 단백질과 결합된 표지자와 결합될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "표지자"는, cfDNA와 결합된 프로브를 검출하기 위해 이용되는 물질을 의미한다. 상기 표지자는 나노입자, 형광염료, 형광단백질 또는 효소일 수 있다. 구체적으로, 상기 표지자는 양자점, HRP 및 형광단백질로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다. 일 구체예로는, 상기 표지자는 GFP(green fluorescent protein), BFP(blue fluorescent protein), CFP(cyan fluorescent protein), YFP(yellow fluorescent protein) 또는 HRP(horse radish peroxidase)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 표지자는 바이오틴 결합 단백질이 결합된 것일 수 있다. 상기 바이오틴 결합 단백질은 아비딘(avidin) 계열 단백질인 스트렙타비딘, 트랩타비딘(traptavidin) 또는 뉴트라비딘(neutravidin)일 수 있으나, 바이오틴과 특이적으로 결합할 수 있는 단백질이면 제한없이 사용할 수 있다. 일 구체예로서, 상기 표지자는 스트렙타비딘이 결합된 것일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "스트렙타비딘"은 스트렙토마이세스 아비디니(Streptomyces avidinii)로부터 분리되는 분자량 60 kDa의 4량체 바이오틴 결합 단백질이다. 상기 아비딘과는 매우 낮은 상동성을 가지나 그 구조는 매우 유사하다. 아비딘과 마찬가지로 항균활성을 가지며 바이오틴에 대해 매우 높은 결합력을 갖는다. 한편 아비딘과는 달리 탄수화물을 포함하지 않으며 산성 등전점(pI=5)을 나타내고 아비딘에 비해 현저히 낮은 용해도를 갖는다. 상업적으로 사용가능한 스트렙타비딘 예컨대, Thermo Scientific Pierce Streptavidin은 53 kDa의 분자량을 갖는 재조합 형태의 스트렙타비딘으로 중성에 가까운 등전점(pI=6.8 내지 7.5)를 갖는다. 스트렙타비딘의 당화결여 및 낮은 pI가 아비딘과 비교하여 낮은 수준의 비특이적 결합(특히, 렉틴결합)을 갖도록 한다. 이러한 스트렙타비딘의 특성이 많은 검출시스템에 이상적인 시약으로 선택될 수 있도록 한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "트렙타비딘(traptavidin)"은 스트렙타비딘의 변이체(variant or mutein)를 지칭하는 용어로, 약 10배 가량 느린 바이오틴에 대한 해리속도를 나타내며, 기계적 강도가 증가되고, 열적 안정성이 향상된 단백질이다. 트렙타비딘 역시 바이오틴에 특이적으로 결합한다.
본 발명의 용어 "뉴트라비딘(neutravidin)"은 "탈당화아비딘"이라고도 하며 천연형의 아비딘과 스트렙타비딘의 주된 단점을 피하고자 제조된 것으로 이름에 나타난 바와 같이 아비딘을 탈당화하여 생성되는 것으로 아비딘에 비해 감소된 분자량(60 kDa)을 가지면서도 높은 바이오틴 결합력을 유지하는 단백질이다. 상기 아비딘의 탈당화는 검출되지 않는 수준으로 렉틴의 결합을 감소시키며 등전점을 낮추어(pI=6.3) 아비딘에 대한 비특이적인 결합의 주된 원인을 효과적으로 제거한다. 라이신 잔기는 사용가능한 채로 유지되므로 스트렙타비딘과 같이 용이하게 유도체화하거나 복합체화할 수 있다. 또한 높은 바이오틴 결합력 및 낮은 비특이적 결합을 나타나므로 이상적인 바이오틴 결합 단백질로 다양하게 이용될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "표지자를 검출하는 단계"란, 프로브와 바이오틴-에비딘 반응을 통해 결합된 표지자를 검출하는 단계를 의미한다. 상기 표지자의 검출은 색깔 변화, UV 흡광도 변화, 생물발광 여부, 형광반응 변화, 또는 전기화학적 변화에 의해 측정될 수 있다. 구체적으로, 상기 표지자를 검출하는 방법은 사용한 표지자에 따라 다르게 수행될 수 있는데, 예를 들어, HRP를 표지자로 사용한 경우에는 과산화수소와 기질과의 반응을 통한 발색반응을 관찰하여 표지자를 검출할 수 있다. 또한, 표지자가 GFP와 같은 형광단백질일 경우에는 특정 파장의 빛을 조사한 후 나오는 검출되는 빛을 관찰하여 표지자의 존재 여부를 검출할 수 있다. 아울러, 표지자가 루시퍼레이즈일 경우 루시페린과 같은 기질을 첨가한 후 나타나는 생물발광을 생물발광계로 측정함으로써 표지자의 존재를 검출할 수 있다.
또한, 본 발명의 진단 방법은 cfDNA를 변성단계를 더 포함할 수 있다. 이때, 상기 변성단계는 정상적인 이중가닥 cfDNA는 변성시키지 않으나, 유방암에서 유래한 cfDNA만을 선별적으로 변성시킬 수 있도록 수행될 수 있다. 이를 위해, 상기 변성 단계의 조건은 약 50℃ 내지 약 100℃에서 약 0.1초 내지 약 5분간 수행될 수 있다. 변성 온도의 일 구체예는 약 95℃일 수 있으며, 변성시간은 통상 약 0.1초 내지 약 8분 정도 수행될 수 있다. 또한, 약 1초, 약 5초, 약 10초, 약 30초, 약 60초 또는 약 90초간 변성될 수 있다. 일 구체예에서 상기 cfDNA를 변성시키는 단계는 상기 c) 단계 전에 수행될 수 있다.
구체적으로, 상기 c) 단계 이전에 시료 또는 양전하를 띠는 물질에 결합된 cfDNA를 i) 상온에서 약 1분 내지 약 10분 방치하는 조건; ii) 약 90℃ 내지 약 95℃에서 1초 내지 1분간 가열하는 조건; iii) 약 75℃ 내지 약 90℃에서 약 10초 내지 약 3분간 가열하는 조건; iv) 약 60℃ 내지 약 75℃에서 약 1분 내지 약 30분간 가열하는 조건; v) 약 25℃ 내지 약 40℃에서 약 5분 내지 약 60분간 가열하는 조건; vi) 프로테아제로 약 1분 내지 약 10분 처리하는 조건; 및 vii) DNaseI로 약 1분 내지 약 10분 처리하는 조건으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 조건에서 변성시키는 단계를 더 포함할 수 있다. 이러한 변성단계는 정상세포에서 유래한 이중가닥 cfDNA는 변성시키지 않으나, 암세포에서 유래한 cfDNA만을 선별적으로 변성시킴으로서, 프로부와의 결합을 더욱 용이하게 할 수 있다. 상기 i) 내지 vii)의 변성 조건은 시료를 수득한 후 수행할 수 있다. 또한, 상기 i) 내지 vii)의 변성 조건은 양전하를 띠는 물질에 결합된 cfDNA를 수득한 후 수행할 수 있다. 또한, 상기 i) 내지 vii)의 변성 조건의 온도, 프로테아제 및 DNase 처리 시간은 안정한 cfDNA를 변성시키지 않는 한 적절히 조정될 수 있다.
유방암 진단 키트
본 발명의 다른 측면은, 유방암에 특이적으로 발현하는 유전자에 상보적으로 결합하는 바이오틴이 결합된 프로브; 양전하를 띠는 물질; 아비딘 계열의 단백질이 결합된 표지자 및 설명서를 포함하는 유방암 진단 키트를 제공하는 것이다.
이때, 상기 유방암에 특이적으로 발현하는 유전자는 MEST, NR1D1, BIRC5, RACGAP1, DHCR7, STC2, AZGP1, RBBP8, IL6ST, MGP, TRBC1, MMP11, COL10A1, C10orf64, COL11A1, POTEG, FSIP1, HER2 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
또한, 상기 설명서는 상기 키트 구성이 하기와 같은 프로토콜에 의해 유방암을 진단할 수 있는 것으로 기재된 것일 수 있다: a) 개체로부터 분리된 생물학적 시료로부터 키트 내에 포함된 양전하를 띠는 물질을 이용하여 cfDNA를 분리하시오; b) 상기 분리된 cfDNA에 키트내에 포함된 바이오틴이 결합된 프로브 및 키트내에 포함된 표지자를 순차적 또는 동시에 혼합하시오; c) cfDNA에 결합하지 않은 프로브 및 표지자를 제거하시오; 및 d) 상기 표지자의 신호를 검출하시오.
또한, MUC1, ACPP, TYRO3, UBE2C, CPT1A, IFNG, CD279, CD274, ERBB2, EGFR, FOLR1, EPCAM 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나의 유전자에 상보적으로 결합하는 바이오틴이 결합된 프로브를 추가적으로 포함할 수 있다.
또한, 상기 프로브, 양전하를 띠는 물질 및 표지자는 상술한 바와 같다.
유방암 진단 장치
본 발명의 다른 측면은, a) cfDNA가 포함된 개체로부터 분리된 생물학적 시료 및 양전하를 띠는 물질을 혼합시키는 혼합부; b) cfDNA가 결합된 양전하를 띠는 물질을 제외한 시료를 제거하기 위한 수득부; c) 상기 cfDNA가 결합된 양전하를 띠는 물질에, 상기 유방암에 특이적으로 발현하는 유전자에 상보적으로 결합할 수 있는 바이오틴이 결합된 프로브; 및 스트렙타비딘 및 표지자를 포함하는 나노입자를 순차적으로 또는 동시에 첨가시키는 반응부; d) 표지자를 검출하는 검출부; 및 e) 표지자의 검출 여부에 따라 상기 시료에 프로브에 상보적인 서열을 가지며, 유방암에서 유래된 cfDNA가 존재한다고 결정하는 정보 처리부를 포함하는, 상기 시료로부터, 증폭없이, 유방암세포 유래의 유전자를 검출하여 유방암을 진단하는 장치를 제공하는 것이다.
이때, 상기 유방암에 상보적으로 발현하는 유전자는 MEST, NR1D1, BIRC5, RACGAP1, DHCR7, STC2, AZGP1, RBBP8, IL6ST, MGP, TRBC1, MMP11, COL10A1, C10orf64, COL11A1, POTEG, FSIP1, HER2 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
또한, MUC1, ACPP, TYRO3, UBE2C, CPT1A, IFNG, CD279, CD274, ERBB2, EGFR, FOLR1, EPCAM 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나의 유전자에 상보적으로 결합하는 바이오틴이 결합된 프로브를 추가적으로 포함할 수 있다.
<대장암>
대장암 진단 방법
본 발명의 일 측면은, a) 세포유리 DNA(cell-free DNA, 이하 cfDNA)가 포함된 개체로부터 분리된 생물학적 시료 및 양전하를 띠는 물질을 혼합하는 단계; b) cfDNA가 결합된 양전하를 띠는 물질을 분리하는 단계; c) 상기 혼합물에 상기 cfDNA에 상보적인 서열을 갖는 프로브 및 표지자를 순차적으로 또는 동시에 혼합하는 단계; d) cfDNA에 결합하지 않은 프로브 및 표지자를 제거하는 단계; 및 e) 상기 표지자를 검출하는 단계를 포함하는, 상기 시료로부터, 증폭없이, 대장암세포 유래의 유전자를 검출하여 대장암을 진단하는 방법으로서, 상기 cfDNA에 상보적인 서열을 갖는 프로브는 대장암 바이오마커로 알려진 유전자에 상보적으로 결합하는 것인, 대장암을 진단하는 방법을 제공한다. 이때, 대장암 바이오마커로 알려진 유전자는 대장암에서 과발현되는 단백질을 코딩하는 유전자 일 수 있다.
구체적으로, 상기 cfDNA에 상보적인 서열을 갖는 프로브는 NCKAP1, AUNIP, NOTUM, KRT5, TUBB, COL6A1, JUP, CDX2, MELTF, EFEMP2, DEFA5, CHEK1, MAD2L1, ENC1, CSE1L, RAD51AP1, ERICH3, SLC7A11, KRT23, PLAU, CDCA1, KLK6, DPEP1, CDH3, ANLN, CXCL1, CTHRC1, LCN2, HS6ST2, EGFL6, CXCL3, CA9, PROX1, SPP1, CST1, CXCL2, TSTA3, RRM2, MMP3, MMP7, MMP10, CXCL5, SERPINB5, TEAD4, BUB1, CDC2, CLDN2, HSPH1, LY6G6D, PRC1, PUS1, SQLE, TTK, ECT2, RNF183, FBXO39, TEX38, TTLL2, PRR7, CANP, KIAA010 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나의 유전자에서 상보적으로 결합하는 것일 수 있다.
또한, 상기 분리된 생물학적 시료를 사용하는 목적은 시료 내에 존재하는 cfDNA를 검출하기 위함이다. 따라서, 시료내의 cfDNA를 다양한 방법으로 분리 및/또는 농축시켜 사용할 수 있다. 일 구체예로 핵산에 강한 친화성이 있는 니트로셀룰로오스 막(nitrocellulose membrane)을 이용할 수 있다. 또한, 일 구체예로 음전하를 띄고 있는 cfDNA를 포집하기 위하여 양전하를 띄고 있는 물질을 이용할 수 있다. 상기 양전하를 띠고 있는 물질은 나노입자, 나노와이어, 망구조 또는 양전하를 띤 필터일 수 있으나, 그 형상에 제한되는 것은 아니다. 상기 "양전하를 띄고 있는 물질"의 일 구체예로는 양전하를 띈 나노구조체 또는 양전하를 띤 멤브레인일 수 있다.
나노구조체의 일 실시예는 양이온 고분자를 포함하는 것일 수 있다. 상기 양이온성 고분자는 그 종류에 있어서 제한이 없다. 양이온성 고분자의 일 구체예로는 폴리에틸렌이민(polyethyleneimine, PEI)일 수 있으며, 양이온성 가지형 고분자 폴리에틸렌이민(cationic branched polymer polyethyleneimene)일 수 있다.
또한, 스트렙타비딘이 표지된 나노와이어를 바이오틴이 결합된 PEI 용액과 혼합하여, 바이오틴-스트렙타비딘의 상호 작용을 통해 나노와이어에 양이온성 분지형 폴리에틸렌이민(cationic branched PEI)를 추가로 결합시킬 수 있다. 그 결과, 양이온성 고분자인 폴리에틸렌이민이 표면에 결합된 나노구조체(PEI/mPpy NW)안에 나노입자가 높은 밀도로, 불규칙하게 분포되어 매립될 수 있다.
이러한 나노와이어는 높은 효율로 낮은 농도에서도 게놈 DNA 및 cfDNA 성공적으로 포집할 수 있다. 특히, DNA 등의 표적 분자와의 결합을 위한 넓은 표면적, DNA와의 상호 작용 촉진을 위한 향상된 이동성과 같은 나노와이어의 특징으로 인해, 효율적이고 효과적으로 표적 cfDNA를 포집할 수 있다.
이때, 상기 표적 cfDNA는 검출하려는 목적 cfDNA를 의미한다. 본 명세서에서 cfDNA는 이중가닥을 가진다. 이때, 상기 cfDNA의 일부가 이중가닥이 풀려있을 수 있다. 또한, 상기 cfDNA는 대장암 세포의 유전자로부터 유래된 것일 수 있다. 구체적으로, cfDNA는 대장암세포에서 과발현되는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 상기 암세포에서 과발현되는 핵산 서열은 정상세포에는 적정 발현수준을 보이나, 특정 암세포에서 과발현되는 핵산 서열을 의미한다.
구체적으로, 상기 핵산 서열의 암세포에서 과발현되는 정도 또는 기준(cutoff)은 표지자를 이용한 흡광도(optical density)를 측정하였을 때, OD값이 0.010 이상인 경우일 수 있다. 보다 구체적으로는, 상기 핵산 서열의 암세포에서 과발현되는 정도 또는 기준은 표지자를 이용한 흡광도를 측정하였을 때, OD값이 0.012 또는 0.015 이상인 경우일 수 있다. 이때, 상기 흡광도 측정을 위해 조사하는 파장은 표지자에 따라 적절히 정해질 수 있다. 상기 cfDNA는 이중가닥이 풀린 DNA(unwinding of DNA)일 수 있다. 또한, 목적에 따라 cfDNA는 적절히 정해질 수 있다.
또한, 상기 대장암세포에서 유래된 cfDNA는 i) 정상 세포에서 유래된 이중 나선 구조를 가지는 cfDNA에 비해 낮은 Tm 값을 갖거나, ii) 정상 세포에서 유래된 이중 나선 구조를 가지는 cfDNA가 변성되지 않는 조건에서 변성이 되는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.
또한, 상기 cfDNA는 하기의 조건 중 어느 하나의 조건에서 cfDNA 상보적으로 결합 가능한 약 15머 내지 약 30머 프로브와 결합할 수 있다: i) 상온에서 약 1분 내지 약 120분 방치하는 조건; ii) 약 90℃ 내지 약 95℃에서 약 1초 내지 약 3분간 가열하는 조건; iii) 약 75℃ 내지 약 90℃에서 약 1초 내지 약 5분간 가열하는 조건; iv) 약 60℃ 내지 약 75℃에서 약 30초 내지 약 30분간 가열하는 조건; v) 약 25℃ 내지 약 40℃에서 약 10분 내지 약 120분간 가열하는 조건; vi) 프로테아제로 약 1분 내지 약 30분 처리하는 조건; vii) DNase로 약 1분 내지 약 30분 처리하는 조건; 및 viii) 화학물질(예, 수산화나트륨, DMSO, 계면활성제 등)을 처리하는 조건.
상기 대장암세포에서 과발현 되는 유전자는 ACPP(NCBI Gene ID: 55), FLU3(NCBI Gene ID: 837968), TYRO3(NCBI Gene ID: 7301), NCKAP1(NCBI Gene ID: 10787), AUNIP(NCBI Gene ID: 79000), NOTUM(NCBI Gene ID: 147111), KRT5(NCBI Gene ID: 3852), TUBB(NCBI Gene ID: 203068), COL6A1(NCBI Gene ID: 1291), JUP(NCBI Gene ID: 3728), COTL1(NCBI Gene ID: 23406), CK7(NCBI Gene ID: 3855), CK20(NCBI Gene ID: 54474), CDX2(NCBI Gene ID: 1045), MUC2(NCBI Gene ID: 4583), MELTF(NCBI Gene ID: 4241), SDC2(NCBI Gene ID: 6383), EFEMP2(NCBI Gene ID: 30008), DEFA5(NCBI Gene ID: 1670), ASB9(NCBI Gene ID: 140462), CHEK1(NCBI Gene ID: 1111), MAD2L1(NCBI Gene ID: 4085), ENC1(NCBI Gene ID: 8507), CSE1L(NCBI Gene ID: 1434), RAD51AP1(NCBI Gene ID: 10635), ERICH3(NCBI Gene ID: 127524), SLC7A11(NCBI Gene ID: 23657), KRT23(NCBI Gene ID: 25984), PLAU(NCBI Gene ID: 5328), CCNB1(NCBI Gene ID: 891), MELK(NCBI Gene ID: 9833), CDCA1(NCBI Gene ID: 83540), KLK6(NCBI Gene ID: 5653), CKS2(NCBI Gene ID: 1164), IFITM1(NCBI Gene ID: 8519), DPEP1(NCBI Gene ID: 1800), CDH3(NCBI Gene ID: 1001), ANLN(NCBI Gene ID: 54443), CXCL1(NCBI Gene ID: 2919), CTHRC1(NCBI Gene ID: 115908), CEACAM6(NCBI Gene ID: 4680), LCN2(NCBI Gene ID: 3934), HS6ST2(NCBI Gene ID: 90161), EGFL6(NCBI Gene ID: 25975), CXCL3(NCBI Gene ID: 2921), CA9(NCBI Gene ID: 768), ATAD2(NCBI Gene ID: 29028), PROX1(NCBI Gene ID: 5629), SPP1(NCBI Gene ID: 6696), CST1(NCBI Gene ID: 1469), CXCL2(NCBI Gene ID: 2920), TSTA3(NCBI Gene ID: 7264), RRM2(NCBI Gene ID: 6241), MMP3(NCBI Gene ID: 4314), MMP7(NCBI Gene ID: 4316), MMP10(NCBI Gene ID: 4319), CXCL5(NCBI Gene ID: 6374), SERPINB5(NCBI Gene ID: 5268), TEAD4(NCBI Gene ID: 7004), BUB1(NCBI Gene ID: 699), CDC2(NCBI Gene ID: 983), CLDN2(NCBI Gene ID: 9075), HSPH1(NCBI Gene ID: 10808), LY6G6D(NCBI Gene ID: 58530), PRC1(NCBI Gene ID: 9055), PUS1(NCBI Gene ID: 80324), SQLE(NCBI Gene ID: 6713), TOP2A(NCBI Gene ID: 7153), TTK(NCBI Gene ID: 7272), DSCC1(NCBI Gene ID: 79075), ECT2(NCBI Gene ID: 1894), RNF183(NCBI Gene ID: 138065), FBXO39(NCBI Gene ID: 162517), TEX38(NCBI Gene ID: 374973), TTLL2(NCBI Gene ID: 83887), PRR7(NCBI Gene ID: 80758), CANP(NCBI Gene ID: 823), KIAA0101(NCBI Gene ID: 9768), CPT1A(NCBI Gene ID: 1374), IFNG(NCBI Gene ID: 3458), CD274(NCBI Gene ID: 29126), FOLR1(NCBI Gene ID: 2348), EPCAM(NCBI Gene ID: 4072), KRAS(NCBI Gene ID: 3845) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
일 구체예로서, 대장암에 특이적으로 존재하는 유전자는 NCKAP1, AUNIP, NOTUM, KRT5, TUBB, COL6A1, JUP, CDX2, MELTF, EFEMP2, DEFA5, CHEK1, MAD2L1, ENC1, CSE1L, RAD51AP1, ERICH3, SLC7A11, KRT23, PLAU, CDCA1, KLK6, DPEP1, CDH3, ANLN, CXCL1, CTHRC1, LCN2, HS6ST2, EGFL6, CXCL3, CA9, PROX1, SPP1, CST1, CXCL2, TSTA3, RRM2, MMP3, MMP7, MMP10, CXCL5, SERPINB5, TEAD4, BUB1, CDC2, CLDN2, HSPH1, LY6G6D, PRC1, PUS1, SQLE, TTK, ECT2, RNF183, FBXO39, TEX38, TTLL2, PRR7, CANP, KIAA010 유전자 일수 있으며, 추가적으로, ACPP, FLU3, TYRO3, COTL1, CK7, CK20, MUC2, SDC2, ASB9, CCNB1, MELK, CKS2, IFITM1, CEACAM6, ATAD2, TOP2A, CPT1A, DSCC1, IFNG, CD279, CD274, ERBB2, EGFR, FOLR1 또는 EPCAM 유전자를 검출하여 대장암을 진단할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "FLU3"이란, CA19-9(Carcinoma Antigen 19-9)를 포함하는 단백질을 코딩하고 있는 유전자를 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "프로브(probe)"는 cfDNA를 검출하기 위한 DNA 또는 RNA를 의미한다. 프로브는 cfDNA에 상보적인 결합을 할 수 있도록 특정 서열을 가질 수 있다. 상기 cfDNA에 상보적인 서열을 갖는 프로브는 혈장에 존재하는 검출하기를 원하는 목적 이중가닥의 cfDNA에 상보적인 결합할 수 있는 핵산 서열을 갖는 프로브를 의미한다. 이때, 상기 프로브는 바이오틴(biotin)이 결합된 것일 수 있다. 상기 프로브는 바이오틴 결합 단백질과 결합된 표지자와 결합될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "표지자"는, cfDNA와 결합된 프로브를 검출하기 위해 이용되는 물질을 의미한다. 상기 표지자는 나노입자, 형광염료, 형광단백질 또는 효소일 수 있다. 구체적으로, 상기 표지자는 양자점, HRP 및 형광단백질로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다. 일 구체예로는, 상기 표지자는 GFP(green fluorescent protein), BFP(blue fluorescent protein), CFP(cyan fluorescent protein), YFP(yellow fluorescent protein) 또는 HRP(horse radish peroxidase)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 표지자는 바이오틴 결합 단백질이 결합된 것일 수 있다. 상기 바이오틴 결합 단백질은 아비딘(avidin) 계열 단백질인 스트렙타비딘, 트랩타비딘(traptavidin) 또는 뉴트라비딘(neutravidin)일 수 있으나, 바이오틴과 특이적으로 결합할 수 있는 단백질이면 제한없이 사용할 수 있다. 일 구체예로서, 상기 표지자는 스트렙타비딘이 결합된 것일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "스트렙타비딘"은 스트렙토마이세스 아비디니(Streptomyces avidinii)로부터 분리되는 분자량 60 kDa의 4량체 바이오틴 결합 단백질이다. 상기 아비딘과는 매우 낮은 상동성을 가지나 그 구조는 매우 유사하다. 아비딘과 마찬가지로 항균활성을 가지며 바이오틴에 대해 매우 높은 결합력을 갖는다. 한편 아비딘과는 달리 탄수화물을 포함하지 않으며 산성 등전점(pI=5)을 나타내고 아비딘에 비해 현저히 낮은 용해도를 갖는다. 상업적으로 사용가능한 스트렙타비딘 예컨대, Thermo Scientific Pierce Streptavidin은 53 kDa의 분자량을 갖는 재조합 형태의 스트렙타비딘으로 중성에 가까운 등전점(pI=6.8 내지 7.5)를 갖는다. 스트렙타비딘의 당화결여 및 낮은 pI가 아비딘과 비교하여 낮은 수준의 비특이적 결합(특히, 렉틴결합)을 갖도록 한다. 이러한 스트렙타비딘의 특성이 많은 검출시스템에 이상적인 시약으로 선택될 수 있도록 한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "트렙타비딘(traptavidin)"은 스트렙타비딘의 변이체(variant or mutein)를 지칭하는 용어로, 약 10배 가량 느린 바이오틴에 대한 해리속도를 나타내며, 기계적 강도가 증가되고, 열적 안정성이 향상된 단백질이다. 트렙타비딘 역시 바이오틴에 특이적으로 결합한다.
본 발명의 용어 "뉴트라비딘(neutravidin)"은 "탈당화아비딘"이라고도 하며 천연형의 아비딘과 스트렙타비딘의 주된 단점을 피하고자 제조된 것으로 이름에 나타난 바와 같이 아비딘을 탈당화하여 생성되는 것으로 아비딘에 비해 감소된 분자량(60 kDa)을 가지면서도 높은 바이오틴 결합력을 유지하는 단백질이다. 상기 아비딘의 탈당화는 검출되지 않는 수준으로 렉틴의 결합을 감소시키며 등전점을 낮추어(pI=6.3) 아비딘에 대한 비특이적인 결합의 주된 원인을 효과적으로 제거한다. 라이신 잔기는 사용가능한 채로 유지되므로 스트렙타비딘과 같이 용이하게 유도체화하거나 복합체화할 수 있다. 또한 높은 바이오틴 결합력 및 낮은 비특이적 결합을 나타나므로 이상적인 바이오틴 결합 단백질로 다양하게 이용될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "표지자를 검출하는 단계"란, 프로브와 바이오틴-에비딘 반응을 통해 결합된 표지자를 검출하는 단계를 의미한다. 상기 표지자의 검출은 색깔 변화, UV 흡광도 변화, 생물발광 여부, 형광반응 변화, 또는 전기화학적 변화에 의해 측정될 수 있다. 구체적으로, 상기 표지자를 검출하는 방법은 사용한 표지자에 따라 다르게 수행될 수 있는데, 예를 들어, HRP를 표지자로 사용한 경우에는 과산화수소와 기질과의 반응을 통한 발색반응을 관찰하여 표지자를 검출할 수 있다. 또한, 표지자가 GFP와 같은 형광단백질일 경우에는 특정 파장의 빛을 조사한 후 나오는 검출되는 빛을 관찰하여 표지자의 존재 여부를 검출할 수 있다. 아울러, 표지자가 루시퍼레이즈일 경우 루시페린과 같은 기질을 첨가한 후 나타나는 생물발광을 생물발광계로 측정함으로써 표지자의 존재를 검출할 수 있다.
또한, 본 발명의 진단 방법은 cfDNA를 변성단계를 더 포함할 수 있다. 이때, 상기 변성단계는 정상적인 이중가닥 cfDNA는 변성시키지 않으나, 대장암에서 유래한 cfDNA만을 선별적으로 변성시킬 수 있도록 수행될 수 있다. 이를 위해, 상기 변성 단계의 조건은 약 50℃ 내지 약 100℃에서 약 0.1초 내지 약 5분간 수행될 수 있다. 변성 온도의 일 구체예는 약 95℃일 수 있으며, 변성시간은 통상 약 0.1초 내지 약 8분 정도 수행될 수 있다. 또한, 약 1초, 약 5초, 약 10초, 약 30초, 약 60초 또는 약 90초간 변성될 수 있다. 일 구체예에서 상기 cfDNA를 변성시키는 단계는 상기 c) 단계 전에 수행될 수 있다.
구체적으로, 상기 c) 단계 이전에 시료 또는 양전하를 띠는 물질에 결합된 cfDNA를 i) 상온에서 약 1분 내지 약 10분 방치하는 조건; ii) 약 90℃ 내지 약 95℃에서 1초 내지 1분간 가열하는 조건; iii) 약 75℃ 내지 약 90℃에서 약 10초 내지 약 3분간 가열하는 조건; iv) 약 60℃ 내지 약 75℃에서 약 1분 내지 약 30분간 가열하는 조건; v) 약 25℃ 내지 약 40℃에서 약 5분 내지 약 60분간 가열하는 조건; vi) 프로테아제로 약 1분 내지 약 10분 처리하는 조건; 및 vii) DNaseI로 약 1분 내지 약 10분 처리하는 조건으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 조건에서 변성시키는 단계를 더 포함할 수 있다. 이러한 변성단계는 정상세포에서 유래한 이중가닥 cfDNA는 변성시키지 않으나, 암세포에서 유래한 cfDNA만을 선별적으로 변성시킴으로서, 프로부와의 결합을 더욱 용이하게 할 수 있다. 상기 i) 내지 vii)의 변성 조건은 시료를 수득한 후 수행할 수 있다. 또한, 상기 i) 내지 vii)의 변성 조건은 양전하를 띠는 물질에 결합된 cfDNA를 수득한 후 수행할 수 있다. 또한, 상기 i) 내지 vii)의 변성 조건의 온도, 프로테아제 및 DNase 처리 시간은 안정한 cfDNA를 변성시키지 않는 한 적절히 조정될 수 있다.
대장암 진단 키트
본 발명의 다른 측면은, 대장암에 특이적으로 발현하는 유전자에 상보적으로 결합하는 바이오틴이 결합된 프로브; 양전하를 띠는 물질; 아비딘 계열의 단백질이 결합된 표지자 및 설명서를 포함하는 대장암 진단 키트를 제공하는 것이다.
이때, 상기 대장암에 특이적으로 발현하는 유전자는 NCKAP1, AUNIP, NOTUM, KRT5, TUBB, COL6A1, JUP, CDX2, MELTF, EFEMP2, DEFA5, CHEK1, MAD2L1, ENC1, CSE1L, RAD51AP1, ERICH3, SLC7A11, KRT23, PLAU, CDCA1, KLK6, DPEP1, CDH3, ANLN, CXCL1, CTHRC1, LCN2, HS6ST2, EGFL6, CXCL3, CA9, PROX1, SPP1, CST1, CXCL2, TSTA3, RRM2, MMP3, MMP7, MMP10, CXCL5, SERPINB5, TEAD4, BUB1, CDC2, CLDN2, HSPH1, LY6G6D, PRC1, PUS1, SQLE, TTK, ECT2, RNF183, FBXO39, TEX38, TTLL2, PRR7, CANP, KIAA0101 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
또한, 상기 설명서는 상기 키트 구성이 하기와 같은 프로토콜에 의해 대장암을 진단할 수 있는 것으로 기재된 것일 수 있다: a) 개체로부터 분리된 생물학적 시료로부터 키트 내에 포함된 양전하를 띠는 물질을 이용하여 cfDNA를 분리하시오; b) 상기 분리된 cfDNA에 키트내에 포함된 바이오틴이 결합된 프로브 및 키트내에 포함된 표지자를 순차적 또는 동시에 혼합하시오; c) cfDNA에 결합하지 않은 프로브 및 표지자를 제거하시오; 및 d) 상기 표지자의 신호를 검출하시오.
또한, ACPP, FLU3, TYRO3, COTL1, CK7, CK20, MUC2, SDC2, ASB9, CCNB1, MELK, CKS2, IFITM1, CEACAM6, ATAD2, TOP2A, CPT1A, DSCC1, IFNG, CD279, CD274, ERBB2, EGFR, FOLR1, EPCAM 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나의 유전자에 상보적으로 결합하는 바이오틴이 결합된 프로브를 추가적으로 포함할 수 있다.
또한, 상기 프로브, 양전하를 띠는 물질 및 표지자는 상술한 바와 같다.
대장암 진단 장치
본 발명의 다른 측면은, a) cfDNA가 포함된 개체로부터 분리된 생물학적 시료 및 양전하를 띠는 물질을 혼합시키는 혼합부; b) cfDNA가 결합된 양전하를 띠는 물질을 제외한 시료를 제거하기 위한 수득부; c) 상기 cfDNA가 결합된 양전하를 띠는 물질에, 상기 대장암에 특이적으로 발현하는 유전자에 상보적으로 결합할 수 있는 바이오틴이 결합된 프로브; 및 스트렙타비딘 및 표지자를 포함하는 나노입자를 순차적으로 또는 동시에 첨가시키는 반응부; d) 표지자를 검출하는 검출부; 및 e) 표지자의 검출 여부에 따라 상기 시료에 프로브에 상보적인 서열을 가지며, 대장암에서 유래된 cfDNA가 존재한다고 결정하는 정보 처리부를 포함하는, 상기 시료로부터, 증폭없이, 대장암세포 유래의 유전자를 검출하여 대장암을 진단하는 장치를 제공하는 것이다.
이때, 상기 대장암에 특이적으로 발현하는 유전자는 NCKAP1, AUNIP, NOTUM, KRT5, TUBB, COL6A1, JUP, CDX2, MELTF, EFEMP2, DEFA5, CHEK1, MAD2L1, ENC1, CSE1L, RAD51AP1, ERICH3, SLC7A11, KRT23, PLAU, CDCA1, KLK6, DPEP1, CDH3, ANLN, CXCL1, CTHRC1, LCN2, HS6ST2, EGFL6, CXCL3, CA9, PROX1, SPP1, CST1, CXCL2, TSTA3, RRM2, MMP3, MMP7, MMP10, CXCL5, SERPINB5, TEAD4, BUB1, CDC2, CLDN2, HSPH1, LY6G6D, PRC1, PUS1, SQLE, TTK, ECT2, RNF183, FBXO39, TEX38, TTLL2, PRR7, CANP, KIAA0101 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
또한, ACPP, FLU3, TYRO3, COTL1, CK7, CK20, MUC2, SDC2, ASB9, CCNB1, MELK, CKS2, IFITM1, CEACAM6, ATAD2, TOP2A, CPT1A, DSCC1, IFNG, CD279, CD274, ERBB2, EGFR, FOLR1, EPCAM 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나의 유전자에 상보적으로 결합하는 바이오틴이 결합된 프로브를 추가적으로 포함할 수 있다.
<담도암>
담도암 진단 방법
본 발명의 일 측면은, a) 세포유리 DNA(cell-free DNA, 이하 cfDNA)가 포함된 개체로부터 분리된 생물학적 시료 및 양전하를 띠는 물질을 혼합하는 단계; b) cfDNA가 결합된 양전하를 띠는 물질을 분리하는 단계; c) 상기 혼합물에 상기 cfDNA에 상보적인 서열을 갖는 프로브 및 표지자를 순차적으로 또는 동시에 혼합하는 단계; d) cfDNA에 결합하지 않은 프로브 및 표지자를 제거하는 단계; 및 e) 상기 표지자를 검출하는 단계를 포함하는, 상기 시료로부터, 증폭없이, 담도암세포 유래의 유전자를 검출하여 담도암을 진단하는 방법으로서, 상기 cfDNA에 상보적인 서열을 갖는 프로브는 담도암 바이오마커로 알려진 유전자에 상보적으로 결합하는 것인, 담도암을 진단하는 방법을 제공한다. 이때, 담도암 바이오마커로 알려진 유전자는 담도암에서 과발현되는 단백질을 코딩하는 유전자 일 수 있다.
구체적으로, 상기 cfDNA에 상보적인 서열을 갖는 프로브는 MUC16, ASH1L, DOCK70 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나의 유전자에서 상보적으로 결합하는 것일 수 있다.
또한, 상기 분리된 생물학적 시료를 사용하는 목적은 시료 내에 존재하는 cfDNA를 검출하기 위함이다. 따라서, 시료내의 cfDNA를 다양한 방법으로 분리 및/또는 농축시켜 사용할 수 있다. 일 구체예로 핵산에 강한 친화성이 있는 니트로셀룰로오스 막(nitrocellulose membrane)을 이용할 수 있다. 또한, 일 구체예로 음전하를 띄고 있는 cfDNA를 포집하기 위하여 양전하를 띄고 있는 물질을 이용할 수 있다. 상기 양전하를 띠고 있는 물질은 나노입자, 나노와이어, 망구조 또는 양전하를 띤 필터일 수 있으나, 그 형상에 제한되는 것은 아니다. 상기 "양전하를 띄고 있는 물질"의 일 구체예로는 양전하를 띈 나노구조체 또는 양전하를 띤 멤브레인일 수 있다.
나노구조체의 일 실시예는 양이온 고분자를 포함하는 것일 수 있다. 상기 양이온성 고분자는 그 종류에 있어서 제한이 없다. 양이온성 고분자의 일 구체예로는 폴리에틸렌이민(polyethyleneimine, PEI)일 수 있으며, 양이온성 가지형 고분자 폴리에틸렌이민(cationic branched polymer polyethyleneimene)일 수 있다.
또한, 스트렙타비딘이 표지된 나노와이어를 바이오틴이 결합된 PEI 용액과 혼합하여, 바이오틴-스트렙타비딘의 상호 작용을 통해 나노와이어에 양이온성 분지형 폴리에틸렌이민(cationic branched PEI)를 추가로 결합시킬 수 있다. 그 결과, 양이온성 고분자인 폴리에틸렌이민이 표면에 결합된 나노구조체(PEI/mPpy NW)안에 나노입자가 높은 밀도로, 불규칙하게 분포되어 매립될 수 있다.
이러한 나노와이어는 높은 효율로 낮은 농도에서도 게놈 DNA 및 cfDNA 성공적으로 포집할 수 있다. 특히, DNA 등의 표적 분자와의 결합을 위한 넓은 표면적, DNA와의 상호 작용 촉진을 위한 향상된 이동성과 같은 나노와이어의 특징으로 인해, 효율적이고 효과적으로 표적 cfDNA를 포집할 수 있다.
이때, 상기 표적 cfDNA는 검출하려는 목적 cfDNA를 의미한다. 본 명세서에서 cfDNA는 이중가닥을 가진다. 이때, 상기 cfDNA의 일부가 이중가닥이 풀려있을 수 있다. 또한, 상기 cfDNA는 담도암 세포의 유전자로부터 유래된 것일 수 있다. 구체적으로, cfDNA는 담도암세포에서 과발현되는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 상기 암세포에서 과발현되는 핵산 서열은 정상세포에는 적정 발현수준을 보이나, 특정 암세포에서 과발현되는 핵산 서열을 의미한다.
구체적으로, 상기 핵산 서열의 암세포에서 과발현되는 정도 또는 기준(cutoff)은 표지자를 이용한 흡광도(optical density)를 측정하였을 때, OD값이 0.010 이상인 경우일 수 있다. 보다 구체적으로는, 상기 핵산 서열의 암세포에서 과발현되는 정도 또는 기준은 표지자를 이용한 흡광도를 측정하였을 때, OD값이 0.012 또는 0.015 이상인 경우일 수 있다. 이때, 상기 흡광도 측정을 위해 조사하는 파장은 표지자에 따라 적절히 정해질 수 있다. 상기 cfDNA는 이중가닥이 풀린 DNA(unwinding of DNA)일 수 있다. 또한, 목적에 따라 cfDNA는 적절히 정해질 수 있다.
또한, 상기 담도암세포에서 유래된 cfDNA는 i) 정상 세포에서 유래된 이중 나선 구조를 가지는 cfDNA에 비해 낮은 Tm 값을 갖거나, ii) 정상 세포에서 유래된 이중 나선 구조를 가지는 cfDNA가 변성되지 않는 조건에서 변성이 되는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.
또한, 상기 cfDNA는 하기의 조건 중 어느 하나의 조건에서 cfDNA 상보적으로 결합 가능한 약 15머 내지 약 30머 프로브와 결합할 수 있다: i) 상온에서 약 1분 내지 약 120분 방치하는 조건; ii) 약 90℃ 내지 약 95℃에서 약 1초 내지 약 3분간 가열하는 조건; iii) 약 75℃ 내지 약 90℃에서 약 1초 내지 약 5분간 가열하는 조건; iv) 약 60℃ 내지 약 75℃에서 약 30초 내지 약 30분간 가열하는 조건; v) 약 25℃ 내지 약 40℃에서 약 10분 내지 약 120분간 가열하는 조건; vi) 프로테아제로 약 1분 내지 약 30분 처리하는 조건; vii) DNase로 약 1분 내지 약 30분 처리하는 조건; 및 viii) 화학물질(예, 수산화나트륨, DMSO, 계면활성제 등)을 처리하는 조건.
상기 담도암세포에서 과발현 되는 유전자는 ACPP(NCBI Gene ID: 55), FLU3(NCBI Gene ID: 837968), MUC16(NCBI Gene ID: 94025), ASH1L(NCBI Gene ID: 55870), DOCK7(NCBI Gene ID: 85440), CPT1A(NCBI Gene ID: 1374), IFNG(NCBI Gene ID: 3458), CD274(NCBI Gene ID: 29126), FOLR1(NCBI Gene ID: 2348), EPCAM(NCBI Gene ID: 4072), CA125(NCBI Gene ID: 94025), CEACAM5(NCBI Gene ID: 1048) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
일 구체예로서, 담도암에 특이적으로 존재하는 유전자는 MUC16, ASH1L, DOCK70 유전자 일수 있으며, 추가적으로, ACPP, FLU3, CPT1A, DSCC1, IFNG, CD279, CD274, ERBB2, EGFR, FOLR1 또는 EPCAM 유전자를 검출하여 담도암을 진단할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "MUC16"이란, CA-125(Carcinoma Antigen 125)를 코딩하고 있는 유전자를 의미한다. 상기 CA-125는 특정 유형의 암을 가진 일부 환자의 혈액에서 양성인 종양 표지자 또는 생체 표지자로 이용되고 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "프로브(probe)"는 cfDNA를 검출하기 위한 DNA 또는 RNA를 의미한다. 프로브는 cfDNA에 상보적인 결합을 할 수 있도록 특정 서열을 가질 수 있다. 상기 cfDNA에 상보적인 서열을 갖는 프로브는 혈장에 존재하는 검출하기를 원하는 목적 이중가닥의 cfDNA에 상보적인 결합할 수 있는 핵산 서열을 갖는 프로브를 의미한다. 이때, 상기 프로브는 바이오틴(biotin)이 결합된 것일 수 있다. 상기 프로브는 바이오틴 결합 단백질과 결합된 표지자와 결합될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "표지자"는, cfDNA와 결합된 프로브를 검출하기 위해 이용되는 물질을 의미한다. 상기 표지자는 나노입자, 형광염료, 형광단백질 또는 효소일 수 있다. 구체적으로, 상기 표지자는 양자점, HRP 및 형광단백질로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다. 일 구체예로는, 상기 표지자는 GFP(green fluorescent protein), BFP(blue fluorescent protein), CFP(cyan fluorescent protein), YFP(yellow fluorescent protein) 또는 HRP(horse radish peroxidase)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 표지자는 바이오틴 결합 단백질이 결합된 것일 수 있다. 상기 바이오틴 결합 단백질은 아비딘(avidin) 계열 단백질인 스트렙타비딘, 트랩타비딘(traptavidin) 또는 뉴트라비딘(neutravidin)일 수 있으나, 바이오틴과 특이적으로 결합할 수 있는 단백질이면 제한없이 사용할 수 있다. 일 구체예로서, 상기 표지자는 스트렙타비딘이 결합된 것일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "스트렙타비딘"은 스트렙토마이세스 아비디니(Streptomyces avidinii)로부터 분리되는 분자량 60 kDa의 4량체 바이오틴 결합 단백질이다. 상기 아비딘과는 매우 낮은 상동성을 가지나 그 구조는 매우 유사하다. 아비딘과 마찬가지로 항균활성을 가지며 바이오틴에 대해 매우 높은 결합력을 갖는다. 한편 아비딘과는 달리 탄수화물을 포함하지 않으며 산성 등전점(pI=5)을 나타내고 아비딘에 비해 현저히 낮은 용해도를 갖는다. 상업적으로 사용가능한 스트렙타비딘 예컨대, Thermo Scientific Pierce Streptavidin은 53 kDa의 분자량을 갖는 재조합 형태의 스트렙타비딘으로 중성에 가까운 등전점(pI=6.8 내지 7.5)를 갖는다. 스트렙타비딘의 당화결여 및 낮은 pI가 아비딘과 비교하여 낮은 수준의 비특이적 결합(특히, 렉틴결합)을 갖도록 한다. 이러한 스트렙타비딘의 특성이 많은 검출시스템에 이상적인 시약으로 선택될 수 있도록 한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "트렙타비딘(traptavidin)"은 스트렙타비딘의 변이체(variant or mutein)를 지칭하는 용어로, 약 10배 가량 느린 바이오틴에 대한 해리속도를 나타내며, 기계적 강도가 증가되고, 열적 안정성이 향상된 단백질이다. 트렙타비딘 역시 바이오틴에 특이적으로 결합한다.
본 발명의 용어 "뉴트라비딘(neutravidin)"은 "탈당화아비딘"이라고도 하며 천연형의 아비딘과 스트렙타비딘의 주된 단점을 피하고자 제조된 것으로 이름에 나타난 바와 같이 아비딘을 탈당화하여 생성되는 것으로 아비딘에 비해 감소된 분자량(60 kDa)을 가지면서도 높은 바이오틴 결합력을 유지하는 단백질이다. 상기 아비딘의 탈당화는 검출되지 않는 수준으로 렉틴의 결합을 감소시키며 등전점을 낮추어(pI=6.3) 아비딘에 대한 비특이적인 결합의 주된 원인을 효과적으로 제거한다. 라이신 잔기는 사용가능한 채로 유지되므로 스트렙타비딘과 같이 용이하게 유도체화하거나 복합체화할 수 있다. 또한 높은 바이오틴 결합력 및 낮은 비특이적 결합을 나타나므로 이상적인 바이오틴 결합 단백질로 다양하게 이용될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "표지자를 검출하는 단계"란, 프로브와 바이오틴-에비딘 반응을 통해 결합된 표지자를 검출하는 단계를 의미한다. 상기 표지자의 검출은 색깔 변화, UV 흡광도 변화, 생물발광 여부, 형광반응 변화, 또는 전기화학적 변화에 의해 측정될 수 있다. 구체적으로, 상기 표지자를 검출하는 방법은 사용한 표지자에 따라 다르게 수행될 수 있는데, 예를 들어, HRP를 표지자로 사용한 경우에는 과산화수소와 기질과의 반응을 통한 발색반응을 관찰하여 표지자를 검출할 수 있다. 또한, 표지자가 GFP와 같은 형광단백질일 경우에는 특정 파장의 빛을 조사한 후 나오는 검출되는 빛을 관찰하여 표지자의 존재 여부를 검출할 수 있다. 아울러, 표지자가 루시퍼레이즈일 경우 루시페린과 같은 기질을 첨가한 후 나타나는 생물발광을 생물발광계로 측정함으로써 표지자의 존재를 검출할 수 있다.
또한, 본 발명의 진단 방법은 cfDNA를 변성단계를 더 포함할 수 있다. 이때, 상기 변성단계는 정상적인 이중가닥 cfDNA는 변성시키지 않으나, 담도암에서 유래한 cfDNA만을 선별적으로 변성시킬 수 있도록 수행될 수 있다. 이를 위해, 상기 변성 단계의 조건은 약 50℃ 내지 약 100℃에서 약 0.1초 내지 약 5분간 수행될 수 있다. 변성 온도의 일 구체예는 약 95℃일 수 있으며, 변성시간은 통상 약 0.1초 내지 약 8분 정도 수행될 수 있다. 또한, 약 1초, 약 5초, 약 10초, 약 30초, 약 60초 또는 약 90초간 변성될 수 있다. 일 구체예에서 상기 cfDNA를 변성시키는 단계는 상기 c) 단계 전에 수행될 수 있다.
구체적으로, 상기 c) 단계 이전에 시료 또는 양전하를 띠는 물질에 결합된 cfDNA를 i) 상온에서 약 1분 내지 약 10분 방치하는 조건; ii) 약 90℃ 내지 약 95℃에서 1초 내지 1분간 가열하는 조건; iii) 약 75℃ 내지 약 90℃에서 약 10초 내지 약 3분간 가열하는 조건; iv) 약 60℃ 내지 약 75℃에서 약 1분 내지 약 30분간 가열하는 조건; v) 약 25℃ 내지 약 40℃에서 약 5분 내지 약 60분간 가열하는 조건; vi) 프로테아제로 약 1분 내지 약 10분 처리하는 조건; 및 vii) DNaseI로 약 1분 내지 약 10분 처리하는 조건으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 조건에서 변성시키는 단계를 더 포함할 수 있다. 이러한 변성단계는 정상세포에서 유래한 이중가닥 cfDNA는 변성시키지 않으나, 암세포에서 유래한 cfDNA만을 선별적으로 변성시킴으로서, 프로부와의 결합을 더욱 용이하게 할 수 있다. 상기 i) 내지 vii)의 변성 조건은 시료를 수득한 후 수행할 수 있다. 또한, 상기 i) 내지 vii)의 변성 조건은 양전하를 띠는 물질에 결합된 cfDNA를 수득한 후 수행할 수 있다. 또한, 상기 i) 내지 vii)의 변성 조건의 온도, 프로테아제 및 DNase 처리 시간은 안정한 cfDNA를 변성시키지 않는 한 적절히 조정될 수 있다.
담도암 진단 키트
본 발명의 다른 측면은, 담도암에 특이적으로 발현하는 유전자에 상보적으로 결합하는 바이오틴이 결합된 프로브; 양전하를 띠는 물질; 아비딘 계열의 단백질이 결합된 표지자 및 설명서를 포함하는 담도암 진단 키트를 제공하는 것이다.
이때, 상기 담도암에 특이적으로 발현하는 유전자는 MUC16, ASH1L, DOCK7 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
또한, 상기 설명서는 상기 키트 구성이 하기와 같은 프로토콜에 의해 담도암을 진단할 수 있는 것으로 기재된 것일 수 있다: a) 개체로부터 분리된 생물학적 시료로부터 키트 내에 포함된 양전하를 띠는 물질을 이용하여 cfDNA를 분리하시오; b) 상기 분리된 cfDNA에 키트내에 포함된 바이오틴이 결합된 프로브 및 키트내에 포함된 표지자를 순차적 또는 동시에 혼합하시오; c) cfDNA에 결합하지 않은 프로브 및 표지자를 제거하시오; 및 d) 상기 표지자의 신호를 검출하시오.
또한, ACPP, FLU3, CPT1A, DSCC1, IFNG, CD279, CD274, ERBB2, EGFR, FOLR1, EPCAM 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나의 유전자에 상보적으로 결합하는 바이오틴이 결합된 프로브를 추가적으로 포함할 수 있다.
또한, 상기 프로브, 양전하를 띠는 물질 및 표지자는 상술한 바와 같다.
담도암 진단 장치
본 발명의 다른 측면은, a) cfDNA가 포함된 개체로부터 분리된 생물학적 시료 및 양전하를 띠는 물질을 혼합시키는 혼합부; b) cfDNA가 결합된 양전하를 띠는 물질을 제외한 시료를 제거하기 위한 수득부; c) 상기 cfDNA가 결합된 양전하를 띠는 물질에, 상기 담도암에 특이적으로 발현하는 유전자에 상보적으로 결합할 수 있는 바이오틴이 결합된 프로브; 및 스트렙타비딘 및 표지자를 포함하는 나노입자를 순차적으로 또는 동시에 첨가시키는 반응부; d) 표지자를 검출하는 검출부; 및 e) 표지자의 검출 여부에 따라 상기 시료에 프로브에 상보적인 서열을 가지며, 담도암에서 유래된 cfDNA가 존재한다고 결정하는 정보 처리부를 포함하는, 상기 시료로부터, 증폭없이, 담도암세포 유래의 유전자를 검출하여 담도암을 진단하는 장치를 제공하는 것이다.
이때, 상기 담도암에 특이적으로 발현하는 유전자는 ACPP, FLU3, CPT1A, DSCC1, IFNG, CD279, CD274, ERBB2, EGFR, FOLR1, EPCAM 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
또한, ACPP, FLU3, CPT1A, DSCC1, IFNG, CD279, CD274, ERBB2, EGFR, FOLR1, EPCAM 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나의 유전자에 특이적으로 결합하는 바이오틴이 결합된 프로브를 추가적으로 포함할 수 있다.
<위암>
위암 진단 방법
본 발명의 일 측면은, a) 세포유리 DNA(cell-free DNA, 이하 cfDNA)가 포함된 개체로부터 분리된 생물학적 시료 및 양전하를 띠는 물질을 혼합하는 단계; b) cfDNA가 결합된 양전하를 띠는 물질을 분리하는 단계; c) 상기 혼합물에 상기 cfDNA에 상보적인 서열을 갖는 프로브 및 표지자를 순차적으로 또는 동시에 혼합하는 단계; d) cfDNA에 결합하지 않은 프로브 및 표지자를 제거하는 단계; 및 e) 상기 표지자를 검출하는 단계를 포함하는, 상기 시료로부터, 증폭없이, 위암세포 유래의 유전자를 검출하여 위암을 진단하는 방법으로서, 상기 cfDNA에 상보적인 서열을 갖는 프로브는 위암 바이오마커로 알려진 유전자에 상보적으로 결합하는 것인, 위암을 진단하는 방법을 제공한다. 이때, 위암 바이오마커로 알려진 유전자는 위암에서 과발현되는 단백질을 코딩하는 유전자 일 수 있다.
구체적으로, 상기 cfDNA에 상보적인 서열을 갖는 프로브는 CGB, PARP1, FOXO3A, MED30, CCNE1, MYC, TFF1, FABP1, LAMP5, MATN3, CLIP4, NOX4, ADRA2C, CSK, FZD9, GALR1, GRM6, INSR, LPHN1, LYN, MRGPRX3, ADCY3, HDAC2, CFL1, NRP2, ANXA10, TFF2, CDCA5, NUSAP1 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나의 유전자에서 상보적으로 결합하는 것일 수 있다.
또한, 상기 분리된 생물학적 시료를 사용하는 목적은 시료 내에 존재하는 cfDNA를 검출하기 위함이다. 따라서, 시료내의 cfDNA를 다양한 방법으로 분리 및/또는 농축시켜 사용할 수 있다. 일 구체예로 핵산에 강한 친화성이 있는 니트로셀룰로오스 막(nitrocellulose membrane)을 이용할 수 있다. 또한, 일 구체예로 음전하를 띄고 있는 cfDNA를 포집하기 위하여 양전하를 띄고 있는 물질을 이용할 수 있다. 상기 양전하를 띠고 있는 물질은 나노입자, 나노와이어, 망구조 또는 양전하를 띤 필터일 수 있으나, 그 형상에 제한되는 것은 아니다. 상기 "양전하를 띄고 있는 물질"의 일 구체예로는 양전하를 띈 나노구조체 또는 양전하를 띤 멤브레인일 수 있다.
나노구조체의 일 실시예는 양이온 고분자를 포함하는 것일 수 있다. 상기 양이온성 고분자는 그 종류에 있어서 제한이 없다. 양이온성 고분자의 일 구체예로는 폴리에틸렌이민(polyethyleneimine, PEI)일 수 있으며, 양이온성 가지형 고분자 폴리에틸렌이민(cationic branched polymer polyethyleneimene)일 수 있다.
또한, 스트렙타비딘이 표지된 나노와이어를 바이오틴이 결합된 PEI 용액과 혼합하여, 바이오틴-스트렙타비딘의 상호 작용을 통해 나노와이어에 양이온성 분지형 폴리에틸렌이민(cationic branched PEI)를 추가로 결합시킬 수 있다. 그 결과, 양이온성 고분자인 폴리에틸렌이민이 표면에 결합된 나노구조체(PEI/mPpy NW)안에 나노입자가 높은 밀도로, 불규칙하게 분포되어 매립될 수 있다.
이러한 나노와이어는 높은 효율로 낮은 농도에서도 게놈 DNA 및 cfDNA 성공적으로 포집할 수 있다. 특히, DNA 등의 표적 분자와의 결합을 위한 넓은 표면적, DNA와의 상호 작용 촉진을 위한 향상된 이동성과 같은 나노와이어의 특징으로 인해, 효율적이고 효과적으로 표적 cfDNA를 포집할 수 있다.
이때, 상기 표적 cfDNA는 검출하려는 목적 cfDNA를 의미한다. 본 명세서에서 cfDNA는 이중가닥을 가진다. 이때, 상기 cfDNA의 일부가 이중가닥이 풀려있을 수 있다. 또한, 상기 cfDNA는 위암 세포의 유전자로부터 유래된 것일 수 있다. 구체적으로, cfDNA는 위암세포에서 과발현되는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 상기 암세포에서 과발현되는 핵산 서열은 정상세포에는 적정 발현수준을 보이나, 특정 암세포에서 과발현되는 핵산 서열을 의미한다.
구체적으로, 상기 핵산 서열의 암세포에서 과발현되는 정도 또는 기준(cutoff)은 표지자를 이용한 흡광도(optical density)를 측정하였을 때, OD값이 0.010 이상인 경우일 수 있다. 보다 구체적으로는, 상기 핵산 서열의 암세포에서 과발현되는 정도 또는 기준은 표지자를 이용한 흡광도를 측정하였을 때, OD값이 0.012 또는 0.015 이상인 경우일 수 있다. 이때, 상기 흡광도 측정을 위해 조사하는 파장은 표지자에 따라 적절히 정해질 수 있다. 상기 cfDNA는 이중가닥이 풀린 DNA(unwinding of DNA)일 수 있다. 또한, 목적에 따라 cfDNA는 적절히 정해질 수 있다.
또한, 상기 위암세포에서 유래된 cfDNA는 i) 정상 세포에서 유래된 이중 나선 구조를 가지는 cfDNA에 비해 낮은 Tm 값을 갖거나, ii) 정상 세포에서 유래된 이중 나선 구조를 가지는 cfDNA가 변성되지 않는 조건에서 변성이 되는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.
또한, 상기 cfDNA는 하기의 조건 중 어느 하나의 조건에서 cfDNA 상보적으로 결합 가능한 약 15머 내지 약 30머 프로브와 결합할 수 있다: i) 상온에서 약 1분 내지 약 120분 방치하는 조건; ii) 약 90℃ 내지 약 95℃에서 약 1초 내지 약 3분간 가열하는 조건; iii) 약 75℃ 내지 약 90℃에서 약 1초 내지 약 5분간 가열하는 조건; iv) 약 60℃ 내지 약 75℃에서 약 30초 내지 약 30분간 가열하는 조건; v) 약 25℃ 내지 약 40℃에서 약 10분 내지 약 120분간 가열하는 조건; vi) 프로테아제로 약 1분 내지 약 30분 처리하는 조건; vii) DNase로 약 1분 내지 약 30분 처리하는 조건; 및 viii) 화학물질(예, 수산화나트륨, DMSO, 계면활성제 등)을 처리하는 조건.
상기 위암세포에서 과발현 되는 유전자는 ACPP(NCBI Gene ID: 55), FLU3(Gene ID: 837968), CGB(NCBI Gene ID: 1082), KRT19(NCBI Gene ID: 3880), PARP1(NCBI Gene ID: 142), FOXO3A(NCBI Gene ID: 2309), MED30(NCBI Gene ID: 90390), ERBB2(NCBI Gene ID: 2064), CCNE1(NCBI Gene ID: 898), MYC(NCBI Gene ID: 4609), EGFR(NCBI Gene ID: 1956), KRAS(NCBI Gene ID: 3845), TFF1(NCBI Gene ID: 7031), FABP1(NCBI Gene ID: 2168), CK20(NCBI Gene ID: 54474), MUC2(NCBI Gene ID: 4583), SDC2(NCBI Gene ID: 6383), LAMP5(NCBI Gene ID: 24141), MATN3(NCBI Gene ID: 4148), CLIP4(NCBI Gene ID: 79745), NOX4(NCBI Gene ID: 50507), ADRA2C(NCBI Gene ID: 152), CSK(NCBI Gene ID: 1445), FZD9(NCBI Gene ID: 8326), GALR1(NCBI Gene ID: 2587), GRM6(NCBI Gene ID: 2916), INSR(NCBI Gene ID: 3643), LPHN1(NCBI Gene ID: 22859), LYN(NCBI Gene ID: 4067), MRGPRX3(NCBI Gene ID: 117195), ADCY3(NCBI Gene ID: 109), HDAC2(NCBI Gene ID: 3066), CFL1(NCBI Gene ID: 1072), COTL1(NCBI Gene ID: 23406), NRP2(NCBI Gene ID: 8828), ANXA10(NCBI Gene ID: 11199), TFF2(NCBI Gene ID: 7032), CDCA5(NCBI Gene ID: 113130), ATAD2(NCBI Gene ID: 29028), ASB9(NCBI Gene ID: 140462), MMP1(NCBI Gene ID: 4312), CEACAM6(NCBI Gene ID: 4680), DSCC1(NCBI Gene ID: 79075), CKS2(NCBI Gene ID: 1164), CST1(NCBI Gene ID: 1469), IFITM1(NCBI Gene ID: 8519), NUSAP1(NCBI Gene ID: 51203), MELK(NCBI Gene ID: 9833), LGALS3BP(NCBI Gene ID: 3959), CPT1A(NCBI Gene ID: 1374), IFNG(NCBI Gene ID: 3458), CD274(NCBI Gene ID: 29126), FOLR1(NCBI Gene ID: 2348), EPCAM(NCBI Gene ID: 4072), CEACAM5(NCBI Gene ID: 1048) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
일 구체예로서, 위암에 특이적으로 존재하는 유전자는CGB, PARP1, FOXO3A, MED30, CCNE1, MYC, TFF1, FABP1, LAMP5, MATN3, CLIP4, NOX4, ADRA2C, CSK, FZD9, GALR1, GRM6, INSR, LPHN1, LYN, MRGPRX3, ADCY3, HDAC2, CFL1, NRP2, ANXA10, TFF2, CDCA5, NUSAP1 유전자 일수 있으며, 추가적으로, ACPP, FLU3, KRT19, ERBB2, EGFR, KRAS, DSCC1, CK20, MUC2, SDC2, COTL1, ATAD2, ASB9, MMP1, CEACAM6, DSCC1, CKS2, CST1, IFITM1, MELK, LGALS3BP, CPT1A, IFNG, CD279, CD274, ERBB2, EGFR, FOLR1 또는 EPCAM 유전자를 검출하여 위암을 진단할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "CGB"란, hCG(Human chorionic gonadotropin) 호르몬을 코딩하는 유전자를 의미한다. 일부 암은 hCG 호르몬을 생성하기도 한다. 따라서 환자가 임신하지 않을 때 측정한 hCG 호르몬 수치가 높으면 암 진단을 받을 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "프로브(probe)"는 cfDNA를 검출하기 위한 DNA 또는 RNA를 의미한다. 프로브는 cfDNA에 상보적인 결합을 할 수 있도록 특정 서열을 가질 수 있다. 상기 cfDNA에 상보적인 서열을 갖는 프로브는 혈장에 존재하는 검출하기를 원하는 목적 이중가닥의 cfDNA에 상보적인 결합할 수 있는 핵산 서열을 갖는 프로브를 의미한다. 이때, 상기 프로브는 바이오틴(biotin)이 결합된 것일 수 있다. 상기 프로브는 바이오틴 결합 단백질과 결합된 표지자와 결합될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "표지자"는, cfDNA와 결합된 프로브를 검출하기 위해 이용되는 물질을 의미한다. 상기 표지자는 나노입자, 형광염료, 형광단백질 또는 효소일 수 있다. 구체적으로, 상기 표지자는 양자점, HRP 및 형광단백질로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다. 일 구체예로는, 상기 표지자는 GFP(green fluorescent protein), BFP(blue fluorescent protein), CFP(cyan fluorescent protein), YFP(yellow fluorescent protein) 또는 HRP(horse radish peroxidase)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 표지자는 바이오틴 결합 단백질이 결합된 것일 수 있다. 상기 바이오틴 결합 단백질은 아비딘(avidin) 계열 단백질인 스트렙타비딘, 트랩타비딘(traptavidin) 또는 뉴트라비딘(neutravidin)일 수 있으나, 바이오틴과 특이적으로 결합할 수 있는 단백질이면 제한없이 사용할 수 있다. 일 구체예로서, 상기 표지자는 스트렙타비딘이 결합된 것일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "스트렙타비딘"은 스트렙토마이세스 아비디니(Streptomyces avidinii)로부터 분리되는 분자량 60 kDa의 4량체 바이오틴 결합 단백질이다. 상기 아비딘과는 매우 낮은 상동성을 가지나 그 구조는 매우 유사하다. 아비딘과 마찬가지로 항균활성을 가지며 바이오틴에 대해 매우 높은 결합력을 갖는다. 한편 아비딘과는 달리 탄수화물을 포함하지 않으며 산성 등전점(pI=5)을 나타내고 아비딘에 비해 현저히 낮은 용해도를 갖는다. 상업적으로 사용가능한 스트렙타비딘 예컨대, Thermo Scientific Pierce Streptavidin은 53 kDa의 분자량을 갖는 재조합 형태의 스트렙타비딘으로 중성에 가까운 등전점(pI=6.8 내지 7.5)를 갖는다. 스트렙타비딘의 당화결여 및 낮은 pI가 아비딘과 비교하여 낮은 수준의 비특이적 결합(특히, 렉틴결합)을 갖도록 한다. 이러한 스트렙타비딘의 특성이 많은 검출시스템에 이상적인 시약으로 선택될 수 있도록 한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "트렙타비딘(traptavidin)"은 스트렙타비딘의 변이체(variant or mutein)를 지칭하는 용어로, 약 10배 가량 느린 바이오틴에 대한 해리속도를 나타내며, 기계적 강도가 증가되고, 열적 안정성이 향상된 단백질이다. 트렙타비딘 역시 바이오틴에 특이적으로 결합한다.
본 발명의 용어 "뉴트라비딘(neutravidin)"은 "탈당화아비딘"이라고도 하며 천연형의 아비딘과 스트렙타비딘의 주된 단점을 피하고자 제조된 것으로 이름에 나타난 바와 같이 아비딘을 탈당화하여 생성되는 것으로 아비딘에 비해 감소된 분자량(60 kDa)을 가지면서도 높은 바이오틴 결합력을 유지하는 단백질이다. 상기 아비딘의 탈당화는 검출되지 않는 수준으로 렉틴의 결합을 감소시키며 등전점을 낮추어(pI=6.3) 아비딘에 대한 비특이적인 결합의 주된 원인을 효과적으로 제거한다. 라이신 잔기는 사용가능한 채로 유지되므로 스트렙타비딘과 같이 용이하게 유도체화하거나 복합체화할 수 있다. 또한 높은 바이오틴 결합력 및 낮은 비특이적 결합을 나타나므로 이상적인 바이오틴 결합 단백질로 다양하게 이용될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "표지자를 검출하는 단계"란, 프로브와 바이오틴-에비딘 반응을 통해 결합된 표지자를 검출하는 단계를 의미한다. 상기 표지자의 검출은 색깔 변화, UV 흡광도 변화, 생물발광 여부, 형광반응 변화, 또는 전기화학적 변화에 의해 측정될 수 있다. 구체적으로, 상기 표지자를 검출하는 방법은 사용한 표지자에 따라 다르게 수행될 수 있는데, 예를 들어, HRP를 표지자로 사용한 경우에는 과산화수소와 기질과의 반응을 통한 발색반응을 관찰하여 표지자를 검출할 수 있다. 또한, 표지자가 GFP와 같은 형광단백질일 경우에는 특정 파장의 빛을 조사한 후 나오는 검출되는 빛을 관찰하여 표지자의 존재 여부를 검출할 수 있다. 아울러, 표지자가 루시퍼레이즈일 경우 루시페린과 같은 기질을 첨가한 후 나타나는 생물발광을 생물발광계로 측정함으로써 표지자의 존재를 검출할 수 있다.
또한, 본 발명의 진단 방법은 cfDNA를 변성단계를 더 포함할 수 있다. 이때, 상기 변성단계는 정상적인 이중가닥 cfDNA는 변성시키지 않으나, 위암에서 유래한 cfDNA만을 선별적으로 변성시킬 수 있도록 수행될 수 있다. 이를 위해, 상기 변성 단계의 조건은 약 50℃ 내지 약 100℃에서 약 0.1초 내지 약 5분간 수행될 수 있다. 변성 온도의 일 구체예는 약 95℃일 수 있으며, 변성시간은 통상 약 0.1초 내지 약 8분 정도 수행될 수 있다. 또한, 약 1초, 약 5초, 약 10초, 약 30초, 약 60초 또는 약 90초간 변성될 수 있다. 일 구체예에서 상기 cfDNA를 변성시키는 단계는 상기 c) 단계 전에 수행될 수 있다.
구체적으로, 상기 c) 단계 이전에 시료 또는 양전하를 띠는 물질에 결합된 cfDNA를 i) 상온에서 약 1분 내지 약 10분 방치하는 조건; ii) 약 90℃ 내지 약 95℃에서 1초 내지 1분간 가열하는 조건; iii) 약 75℃ 내지 약 90℃에서 약 10초 내지 약 3분간 가열하는 조건; iv) 약 60℃ 내지 약 75℃에서 약 1분 내지 약 30분간 가열하는 조건; v) 약 25℃ 내지 약 40℃에서 약 5분 내지 약 60분간 가열하는 조건; vi) 프로테아제로 약 1분 내지 약 10분 처리하는 조건; 및 vii) DNaseI로 약 1분 내지 약 10분 처리하는 조건으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 조건에서 변성시키는 단계를 더 포함할 수 있다. 이러한 변성단계는 정상세포에서 유래한 이중가닥 cfDNA는 변성시키지 않으나, 암세포에서 유래한 cfDNA만을 선별적으로 변성시킴으로서, 프로부와의 결합을 더욱 용이하게 할 수 있다. 상기 i) 내지 vii)의 변성 조건은 시료를 수득한 후 수행할 수 있다. 또한, 상기 i) 내지 vii)의 변성 조건은 양전하를 띠는 물질에 결합된 cfDNA를 수득한 후 수행할 수 있다. 또한, 상기 i) 내지 vii)의 변성 조건의 온도, 프로테아제 및 DNase 처리 시간은 안정한 cfDNA를 변성시키지 않는 한 적절히 조정될 수 있다.
위암 진단 키트
본 발명의 다른 측면은, 위암에 특이적으로 발현하는 유전자에 상보적으로 결합하는 바이오틴이 결합된 프로브; 양전하를 띠는 물질; 아비딘 계열의 단백질이 결합된 표지자 및 설명서를 포함하는 위암 진단 키트를 제공하는 것이다.
이때, 상기 위암에 특이적으로 발현하는 유전자는 CGB, PARP1, FOXO3A, MED30, CCNE1, MYC, TFF1, FABP1, LAMP5, MATN3, CLIP4, NOX4, ADRA2C, CSK, FZD9, GALR1, GRM6, INSR, LPHN1, LYN, MRGPRX3, ADCY3, HDAC2, CFL1, NRP2, ANXA10, TFF2, CDCA5, NUSAP1 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
또한, 상기 설명서는 상기 키트 구성이 하기와 같은 프로토콜에 의해 위암을 진단할 수 있는 것으로 기재된 것일 수 있다: a) 개체로부터 분리된 생물학적 시료로부터 키트 내에 포함된 양전하를 띠는 물질을 이용하여 cfDNA를 분리하시오; b) 상기 분리된 cfDNA에 키트내에 포함된 바이오틴이 결합된 프로브 및 키트내에 포함된 표지자를 순차적 또는 동시에 혼합하시오; c) cfDNA에 결합하지 않은 프로브 및 표지자를 제거하시오; 및 d) 상기 표지자의 신호를 검출하시오.
또한, ACPP, FLU3, KRT19, ERBB2, EGFR, KRAS, DSCC1, CK20, MUC2, SDC2, COTL1, ATAD2, ASB9, MMP1, CEACAM6, DSCC1, CKS2, CST1, IFITM1, MELK, LGALS3BP, CPT1A, IFNG, CD279, CD274, ERBB2, EGFR, FOLR1, EPCAM 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나의 유전자에 상보적으로 결합하는 바이오틴이 결합된 프로브를 추가적으로 포함할 수 있다.
또한, 상기 프로브, 양전하를 띠는 물질 및 표지자는 상술한 바와 같다.
위암 진단 장치
본 발명의 다른 측면은, a) cfDNA가 포함된 개체로부터 분리된 생물학적 시료 및 양전하를 띠는 물질을 혼합시키는 혼합부; b) cfDNA가 결합된 양전하를 띠는 물질을 제외한 시료를 제거하기 위한 수득부; c) 상기 cfDNA가 결합된 양전하를 띠는 물질에, 상기 위암에 특이적으로 발현하는 유전자에 상보적으로 결합할 수 있는 바이오틴이 결합된 프로브; 및 스트렙타비딘 및 표지자를 포함하는 나노입자를 순차적으로 또는 동시에 첨가시키는 반응부; d) 표지자를 검출하는 검출부; 및 e) 표지자의 검출 여부에 따라 상기 시료에 프로브에 상보적인 서열을 가지며, 위암에서 유래된 cfDNA가 존재한다고 결정하는 정보 처리부를 포함하는, 상기 시료로부터, 증폭없이, 위암세포 유래의 유전자를 검출하여 위암을 진단하는 장치를 제공하는 것이다.
이때, 상기 위암에 특이적으로 발현하는 유전자는 CGB, PARP1, FOXO3A, MED30, CCNE1, MYC, TFF1, FABP1, LAMP5, MATN3, CLIP4, NOX4, ADRA2C, CSK, FZD9, GALR1, GRM6, INSR, LPHN1, LYN, MRGPRX3, ADCY3, HDAC2, CFL1, NRP2, ANXA10, TFF2, CDCA5, NUSAP1 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
또한, ACPP, FLU3, KRT19, ERBB2, EGFR, KRAS, DSCC1, CK20, MUC2, SDC2, COTL1, ATAD2, ASB9, MMP1, CEACAM6, DSCC1, CKS2, CST1, IFITM1, MELK, LGALS3BP, CPT1A, IFNG, CD279, CD274, ERBB2, EGFR, FOLR1, EPCAM 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나의 유전자에 상보적으로 결합하는 바이오틴이 결합된 프로브를 추가적으로 포함할 수 있다.
<췌장암>
췌장암 진단 방법
본 발명의 일 측면은, a) 세포유리 DNA(cell-free DNA, 이하 cfDNA)가 포함된 개체로부터 분리된 생물학적 시료 및 양전하를 띠는 물질을 혼합하는 단계; b) cfDNA가 결합된 양전하를 띠는 물질을 분리하는 단계; c) 상기 혼합물에 상기 cfDNA에 상보적인 서열을 갖는 프로브 및 표지자를 순차적으로 또는 동시에 혼합하는 단계; d) cfDNA에 결합하지 않은 프로브 및 표지자를 제거하는 단계; 및 e) 상기 표지자를 검출하는 단계를 포함하는, 상기 시료로부터, 증폭없이, 췌장암세포 유래의 유전자를 검출하여 췌장암을 진단하는 방법으로서, 상기 cfDNA에 상보적인 서열을 갖는 프로브는 췌장암 바이오마커로 알려진 유전자에 상보적으로 결합하는 것인, 췌장암을 진단하는 방법을 제공한다. 이때, 췌장암 바이오마커로 알려진 유전자는 췌장암에서 과발현되는 단백질을 코딩하는 유전자 일 수 있다.
구체적으로, 상기 cfDNA에 상보적인 서열을 갖는 프로브는 SMAD4, APC, GNAS 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나의 유전자에서 상보적으로 결합하는 것일 수 있다.
또한, 상기 분리된 생물학적 시료를 사용하는 목적은 시료 내에 존재하는 cfDNA를 검출하기 위함이다. 따라서, 시료내의 cfDNA를 다양한 방법으로 분리 및/또는 농축시켜 사용할 수 있다. 일 구체예로 핵산에 강한 친화성이 있는 니트로셀룰로오스 막(nitrocellulose membrane)을 이용할 수 있다. 또한, 일 구체예로 음전하를 띄고 있는 cfDNA를 포집하기 위하여 양전하를 띄고 있는 물질을 이용할 수 있다. 상기 양전하를 띠고 있는 물질은 나노입자, 나노와이어, 망구조 또는 양전하를 띤 필터일 수 있으나, 그 형상에 제한되는 것은 아니다. 상기 "양전하를 띄고 있는 물질"의 일 구체예로는 양전하를 띈 나노구조체 또는 양전하를 띤 멤브레인일 수 있다.
나노구조체의 일 실시예는 양이온 고분자를 포함하는 것일 수 있다. 상기 양이온성 고분자는 그 종류에 있어서 제한이 없다. 양이온성 고분자의 일 구체예로는 폴리에틸렌이민(polyethyleneimine, PEI)일 수 있으며, 양이온성 가지형 고분자 폴리에틸렌이민(cationic branched polymer polyethyleneimene)일 수 있다.
또한, 스트렙타비딘이 표지된 나노와이어를 바이오틴이 결합된 PEI 용액과 혼합하여, 바이오틴-스트렙타비딘의 상호 작용을 통해 나노와이어에 양이온성 분지형 폴리에틸렌이민(cationic branched PEI)를 추가로 결합시킬 수 있다. 그 결과, 양이온성 고분자인 폴리에틸렌이민이 표면에 결합된 나노구조체(PEI/mPpy NW)안에 나노입자가 높은 밀도로, 불규칙하게 분포되어 매립될 수 있다.
이러한 나노와이어는 높은 효율로 낮은 농도에서도 게놈 DNA 및 cfDNA 성공적으로 포집할 수 있다. 특히, DNA 등의 표적 분자와의 결합을 위한 넓은 표면적, DNA와의 상호 작용 촉진을 위한 향상된 이동성과 같은 나노와이어의 특징으로 인해, 효율적이고 효과적으로 표적 cfDNA를 포집할 수 있다.
이때, 상기 표적 cfDNA는 검출하려는 목적 cfDNA를 의미한다. 본 명세서에서 cfDNA는 이중가닥을 가진다. 이때, 상기 cfDNA의 일부가 이중가닥이 풀려있을 수 있다. 또한, 상기 cfDNA는 췌장암 세포의 유전자로부터 유래된 것일 수 있다. 구체적으로, cfDNA는 췌장암세포에서 과발현되는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 상기 암세포에서 과발현되는 핵산 서열은 정상세포에는 적정 발현수준을 보이나, 특정 암세포에서 과발현되는 핵산 서열을 의미한다.
구체적으로, 상기 핵산 서열의 암세포에서 과발현되는 정도 또는 기준(cutoff)은 표지자를 이용한 흡광도(optical density)를 측정하였을 때, OD값이 0.010 이상인 경우일 수 있다. 보다 구체적으로는, 상기 핵산 서열의 암세포에서 과발현되는 정도 또는 기준은 표지자를 이용한 흡광도를 측정하였을 때, OD값이 0.012 또는 0.015 이상인 경우일 수 있다. 이때, 상기 흡광도 측정을 위해 조사하는 파장은 표지자에 따라 적절히 정해질 수 있다. 상기 cfDNA는 이중가닥이 풀린 DNA(unwinding of DNA)일 수 있다. 또한, 목적에 따라 cfDNA는 적절히 정해질 수 있다.
또한, 상기 췌장암세포에서 유래된 cfDNA는 i) 정상 세포에서 유래된 이중 나선 구조를 가지는 cfDNA에 비해 낮은 Tm 값을 갖거나, ii) 정상 세포에서 유래된 이중 나선 구조를 가지는 cfDNA가 변성되지 않는 조건에서 변성이 되는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.
또한, 상기 cfDNA는 하기의 조건 중 어느 하나의 조건에서 cfDNA 상보적으로 결합 가능한 약 15머 내지 약 30머 프로브와 결합할 수 있다: i) 상온에서 약 1분 내지 약 120분 방치하는 조건; ii) 약 90℃ 내지 약 95℃에서 약 1초 내지 약 3분간 가열하는 조건; iii) 약 75℃ 내지 약 90℃에서 약 1초 내지 약 5분간 가열하는 조건; iv) 약 60℃ 내지 약 75℃에서 약 30초 내지 약 30분간 가열하는 조건; v) 약 25℃ 내지 약 40℃에서 약 10분 내지 약 120분간 가열하는 조건; vi) 프로테아제로 약 1분 내지 약 30분 처리하는 조건; vii) DNase로 약 1분 내지 약 30분 처리하는 조건; 및 viii) 화학물질(예, 수산화나트륨, DMSO, 계면활성제 등)을 처리하는 조건.
상기 췌장암세포에서 과발현 되는 유전자는 KRAS(NCBI Gene ID: 3845), SMADA4(NCBI Gene ID: 4089), APC(NCBI Gene ID: 324), GNAS(NCBI Gene ID: 2788), MUC1(NCBI Gene ID: 4582), CEACAM5(NCBI Gene ID: 1048), CEACAM1(NCBI Gene ID: 634), MUC16(NCBI Gene ID: 94025) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
일 구체예로서, 췌장암에 특이적으로 존재하는 유전자는 SMAD4, APC, GNAS 유전자 일수 있으며, 추가적으로, KRAS, MUC1, MSLN, CEACAM1, CEACAM5 또는 MUC16 유전자를 검출하여 췌장암을 진단할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "프로브(probe)"는 cfDNA를 검출하기 위한 DNA 또는 RNA를 의미한다. 프로브는 cfDNA에 상보적인 결합을 할 수 있도록 특정 서열을 가질 수 있다. 상기 cfDNA에 상보적인 서열을 갖는 프로브는 혈장에 존재하는 검출하기를 원하는 목적 이중가닥의 cfDNA에 상보적인 결합할 수 있는 핵산 서열을 갖는 프로브를 의미한다. 이때, 상기 프로브는 바이오틴(biotin)이 결합된 것일 수 있다. 상기 프로브는 바이오틴 결합 단백질과 결합된 표지자와 결합될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "표지자"는, cfDNA와 결합된 프로브를 검출하기 위해 이용되는 물질을 의미한다. 상기 표지자는 나노입자, 형광염료, 형광단백질 또는 효소일 수 있다. 구체적으로, 상기 표지자는 양자점, HRP 및 형광단백질로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다. 일 구체예로는, 상기 표지자는 GFP(green fluorescent protein), BFP(blue fluorescent protein), CFP(cyan fluorescent protein), YFP(yellow fluorescent protein) 또는 HRP(horse radish peroxidase)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 표지자는 바이오틴 결합 단백질이 결합된 것일 수 있다. 상기 바이오틴 결합 단백질은 아비딘(avidin) 계열 단백질인 스트렙타비딘, 트랩타비딘(traptavidin) 또는 뉴트라비딘(neutravidin)일 수 있으나, 바이오틴과 특이적으로 결합할 수 있는 단백질이면 제한없이 사용할 수 있다. 일 구체예로서, 상기 표지자는 스트렙타비딘이 결합된 것일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "스트렙타비딘"은 스트렙토마이세스 아비디니(Streptomyces avidinii)로부터 분리되는 분자량 60 kDa의 4량체 바이오틴 결합 단백질이다. 상기 아비딘과는 매우 낮은 상동성을 가지나 그 구조는 매우 유사하다. 아비딘과 마찬가지로 항균활성을 가지며 바이오틴에 대해 매우 높은 결합력을 갖는다. 한편 아비딘과는 달리 탄수화물을 포함하지 않으며 산성 등전점(pI=5)을 나타내고 아비딘에 비해 현저히 낮은 용해도를 갖는다. 상업적으로 사용가능한 스트렙타비딘 예컨대, Thermo Scientific Pierce Streptavidin은 53 kDa의 분자량을 갖는 재조합 형태의 스트렙타비딘으로 중성에 가까운 등전점(pI=6.8 내지 7.5)를 갖는다. 스트렙타비딘의 당화결여 및 낮은 pI가 아비딘과 비교하여 낮은 수준의 비특이적 결합(특히, 렉틴결합)을 갖도록 한다. 이러한 스트렙타비딘의 특성이 많은 검출시스템에 이상적인 시약으로 선택될 수 있도록 한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "트렙타비딘(traptavidin)"은 스트렙타비딘의 변이체(variant or mutein)를 지칭하는 용어로, 약 10배 가량 느린 바이오틴에 대한 해리속도를 나타내며, 기계적 강도가 증가되고, 열적 안정성이 향상된 단백질이다. 트렙타비딘 역시 바이오틴에 특이적으로 결합한다.
본 발명의 용어 "뉴트라비딘(neutravidin)"은 "탈당화아비딘"이라고도 하며 천연형의 아비딘과 스트렙타비딘의 주된 단점을 피하고자 제조된 것으로 이름에 나타난 바와 같이 아비딘을 탈당화하여 생성되는 것으로 아비딘에 비해 감소된 분자량(60 kDa)을 가지면서도 높은 바이오틴 결합력을 유지하는 단백질이다. 상기 아비딘의 탈당화는 검출되지 않는 수준으로 렉틴의 결합을 감소시키며 등전점을 낮추어(pI=6.3) 아비딘에 대한 비특이적인 결합의 주된 원인을 효과적으로 제거한다. 라이신 잔기는 사용가능한 채로 유지되므로 스트렙타비딘과 같이 용이하게 유도체화하거나 복합체화할 수 있다. 또한 높은 바이오틴 결합력 및 낮은 비특이적 결합을 나타나므로 이상적인 바이오틴 결합 단백질로 다양하게 이용될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "표지자를 검출하는 단계"란, 프로브와 바이오틴-에비딘 반응을 통해 결합된 표지자를 검출하는 단계를 의미한다. 상기 표지자의 검출은 색깔 변화, UV 흡광도 변화, 생물발광 여부, 형광반응 변화, 또는 전기화학적 변화에 의해 측정될 수 있다. 구체적으로, 상기 표지자를 검출하는 방법은 사용한 표지자에 따라 다르게 수행될 수 있는데, 예를 들어, HRP를 표지자로 사용한 경우에는 과산화수소와 기질과의 반응을 통한 발색반응을 관찰하여 표지자를 검출할 수 있다. 또한, 표지자가 GFP와 같은 형광단백질일 경우에는 특정 파장의 빛을 조사한 후 나오는 검출되는 빛을 관찰하여 표지자의 존재 여부를 검출할 수 있다. 아울러, 표지자가 루시퍼레이즈일 경우 루시페린과 같은 기질을 첨가한 후 나타나는 생물발광을 생물발광계로 측정함으로써 표지자의 존재를 검출할 수 있다.
또한, 본 발명의 진단 방법은 cfDNA를 변성단계를 더 포함할 수 있다. 이때, 상기 변성단계는 정상적인 이중가닥 cfDNA는 변성시키지 않으나, 췌장암에서 유래한 cfDNA만을 선별적으로 변성시킬 수 있도록 수행될 수 있다. 이를 위해, 상기 변성 단계의 조건은 약 50℃ 내지 약 100℃에서 약 0.1초 내지 약 5분간 수행될 수 있다. 변성 온도의 일 구체예는 약 95℃일 수 있으며, 변성시간은 통상 약 0.1초 내지 약 8분 정도 수행될 수 있다. 또한, 약 1초, 약 5초, 약 10초, 약 30초, 약 60초 또는 약 90초간 변성될 수 있다. 일 구체예에서 상기 cfDNA를 변성시키는 단계는 상기 c) 단계 전에 수행될 수 있다.
구체적으로, 상기 c) 단계 이전에 시료 또는 양전하를 띠는 물질에 결합된 cfDNA를 i) 상온에서 약 1분 내지 약 10분 방치하는 조건; ii) 약 90℃ 내지 약 95℃에서 1초 내지 1분간 가열하는 조건; iii) 약 75℃ 내지 약 90℃에서 약 10초 내지 약 3분간 가열하는 조건; iv) 약 60℃ 내지 약 75℃에서 약 1분 내지 약 30분간 가열하는 조건; v) 약 25℃ 내지 약 40℃에서 약 5분 내지 약 60분간 가열하는 조건; vi) 프로테아제로 약 1분 내지 약 10분 처리하는 조건; 및 vii) DNaseI로 약 1분 내지 약 10분 처리하는 조건으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 조건에서 변성시키는 단계를 더 포함할 수 있다. 이러한 변성단계는 정상세포에서 유래한 이중가닥 cfDNA는 변성시키지 않으나, 암세포에서 유래한 cfDNA만을 선별적으로 변성시킴으로서, 프로부와의 결합을 더욱 용이하게 할 수 있다. 상기 i) 내지 vii)의 변성 조건은 시료를 수득한 후 수행할 수 있다. 또한, 상기 i) 내지 vii)의 변성 조건은 양전하를 띠는 물질에 결합된 cfDNA를 수득한 후 수행할 수 있다. 또한, 상기 i) 내지 vii)의 변성 조건의 온도, 프로테아제 및 DNase 처리 시간은 안정한 cfDNA를 변성시키지 않는 한 적절히 조정될 수 있다.
췌장암 진단 키트
본 발명의 다른 측면은, 췌장암에 특이적으로 발현하는 유전자에 상보적으로 결합하는 바이오틴이 결합된 프로브; 양전하를 띠는 물질; 아비딘 계열의 단백질이 결합된 표지자 및 설명서를 포함하는 췌장암 진단 키트를 제공하는 것이다.
이때, 상기 췌장암에 특이적으로 발현하는 유전자는 SMAD4, APC, GNAS 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
또한, 상기 설명서는 상기 키트 구성이 하기와 같은 프로토콜에 의해 췌장암을 진단할 수 있는 것으로 기재된 것일 수 있다: a) 개체로부터 분리된 생물학적 시료로부터 키트 내에 포함된 양전하를 띠는 물질을 이용하여 cfDNA를 분리하시오; b) 상기 분리된 cfDNA에 키트내에 포함된 바이오틴이 결합된 프로브 및 키트내에 포함된 표지자를 순차적 또는 동시에 혼합하시오; c) cfDNA에 결합하지 않은 프로브 및 표지자를 제거하시오; 및 d) 상기 표지자의 신호를 검출하시오.
또한, KRAS, MUC1, MSLN, CEACAM1, CEACAM5 또는 MUC16 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나의 유전자에 상보적으로 결합하는 바이오틴이 결합된 프로브를 추가적으로 포함할 수 있다.
또한, 상기 프로브, 양전하를 띠는 물질 및 표지자는 상술한 바와 같다.
췌장암 진단 장치
본 발명의 다른 측면은, a) cfDNA가 포함된 개체로부터 분리된 생물학적 시료 및 양전하를 띠는 물질을 혼합시키는 혼합부; b) cfDNA가 결합된 양전하를 띠는 물질을 제외한 시료를 제거하기 위한 수득부; c) 상기 cfDNA가 결합된 양전하를 띠는 물질에, 상기 췌장암에 특이적으로 발현하는 유전자에 상보적으로 결합할 수 있는 바이오틴이 결합된 프로브; 및 스트렙타비딘 및 표지자를 포함하는 나노입자를 순차적으로 또는 동시에 첨가시키는 반응부; d) 표지자를 검출하는 검출부; 및 e) 표지자의 검출 여부에 따라 상기 시료에 프로브에 상보적인 서열을 가지며, 췌장암에서 유래된 cfDNA가 존재한다고 결정하는 정보 처리부를 포함하는, 상기 시료로부터, 증폭없이, 췌장암세포 유래의 유전자를 검출하여 췌장암을 진단하는 장치를 제공하는 것이다.
이때, 상기 췌장암에 특이적으로 발현하는 유전자는 SMAD4, APC, GNAS 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
또한, KRAS, MUC1, MSLN, CEACAM1, CEACAM5 또는 MUC16 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나의 유전자에 상보적으로 결합하는 바이오틴이 결합된 프로브를 추가적으로 포함할 수 있다.
<조기진단 및 예후예측>
암 진단 방법
본 발명의 일 측면은, a) 세포유리 DNA(cell-free DNA, 이하 cfDNA)가 포함된 개체로부터 분리된 생물학적 시료 및 양전하를 띠는 물질을 혼합하는 단계; b) cfDNA가 결합된 양전하를 띠는 물질을 분리하는 단계; c) 상기 혼합물에 상기 cfDNA에 상보적인 서열을 갖는 프로브 및 표지자를 순차적으로 또는 동시에 혼합하는 단계; d) cfDNA에 결합하지 않은 프로브 및 표지자를 제거하는 단계; 및 e) 상기 표지자를 검출하는 단계를 포함하는, 상기 시료로부터, 증폭없이, 암세포 유래의 유전자를 검출하여 암을 조기진단 또는 예후예측하는 방법으로서, 상기 cfDNA에 상보적인 서열을 갖는 프로브는 암 바이오마커로 알려진 유전자에 상보적으로 결합하는 것인, 암을 조기진단 또는 예후를 예측하는 방법을 제공한다.
구체적으로, 상기 cfDNA에 상보적인 서열을 갖는 프로브는 CPT1A, IFNG, IFNGR1, CD279, CD274 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나의 유전자에서 상보적으로 결합하는 것일 수 있다. 이때, 바람직하게는 상기 군에서 선택되는 2개 이상의 유전자를 조합시킬 수 있다.
상기 암은 폐암, 대장암, 전립선암, 갑상선암, 유방암, 뇌암, 두경부암, 식도암, 피부암, 흉선압, 위암, 결장암, 간압, 난소암, 자궁암, 방광암, 직장암, 담낭암, 담도암, 췌장암, 림프종, 급성 백혈병, 다발성 골수종 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다
또한, 상기 분리된 생물학적 시료를 사용하는 목적은 시료 내에 존재하는 cfDNA를 검출하기 위함이다. 따라서, 시료내의 cfDNA를 다양한 방법으로 분리 및/또는 농축시켜 사용할 수 있다. 일 구체예로 핵산에 강한 친화성이 있는 니트로셀룰로오스 막(nitrocellulose membrane)을 이용할 수 있다. 또한, 일 구체예로 음전하를 띄고 있는 cfDNA를 포집하기 위하여 양전하를 띄고 있는 물질을 이용할 수 있다. 상기 양전하를 띠고 있는 물질은 나노입자, 나노와이어, 망구조 또는 양전하를 띤 필터일 수 있으나, 그 형상에 제한되는 것은 아니다. 상기 "양전하를 띄고 있는 물질"의 일 구체예로는 양전하를 띈 나노구조체 또는 양전하를 띤 멤브레인일 수 있다.
나노구조체의 일 실시예는 양이온 고분자를 포함하는 것일 수 있다. 상기 양이온성 고분자는 그 종류에 있어서 제한이 없다. 양이온성 고분자의 일 구체예로는 폴리에틸렌이민(polyethyleneimine, PEI)일 수 있으며, 양이온성 가지형 고분자 폴리에틸렌이민(cationic branched polymer polyethyleneimene)일 수 있다.
또한, 스트렙타비딘이 표지된 나노와이어를 바이오틴이 결합된 PEI 용액과 혼합하여, 바이오틴-스트렙타비딘의 상호 작용을 통해 나노와이어에 양이온성 분지형 폴리에틸렌이민(cationic branched PEI)를 추가로 결합시킬 수 있다. 그 결과, 양이온성 고분자인 폴리에틸렌이민이 표면에 결합된 나노구조체(PEI/mPpy NW)안에 나노입자가 높은 밀도로, 불규칙하게 분포되어 매립될 수 있다.
이러한 나노와이어는 높은 효율로 낮은 농도에서도 게놈 DNA 및 cfDNA 성공적으로 포집할 수 있다. 특히, DNA 등의 표적 분자와의 결합을 위한 넓은 표면적, DNA와의 상호 작용 촉진을 위한 향상된 이동성과 같은 나노와이어의 특징으로 인해, 효율적이고 효과적으로 표적 cfDNA를 포집할 수 있다.
이때, 상기 표적 cfDNA는 검출하려는 목적 cfDNA를 의미한다. 본 명세서에서 cfDNA는 이중가닥을 가진다. 이때, 상기 cfDNA의 일부가 이중가닥이 풀려있을 수 있다. 또한, 상기 cfDNA는 암 세포의 유전자로부터 유래된 것일 수 있다. 구체적으로, cfDNA는 암세포에서 과발현되는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 상기 암세포에서 과발현되는 핵산 서열은 정상세포에는 적정 발현수준을 보이나, 특정 암세포에서 과발현되는 핵산 서열을 의미한다.
구체적으로, 상기 핵산 서열의 암세포에서 과발현되는 정도 또는 기준(cutoff)은 표지자를 이용한 흡광도(optical density)를 측정하였을 때, OD값이 0.010 이상인 경우일 수 있다. 보다 구체적으로는, 상기 핵산 서열의 암세포에서 과발현되는 정도 또는 기준은 표지자를 이용한 흡광도를 측정하였을 때, OD값이 0.012 또는 0.015 이상인 경우일 수 있다. 이때, 상기 흡광도 측정을 위해 조사하는 파장은 표지자에 따라 적절히 정해질 수 있다. 상기 cfDNA는 이중가닥이 풀린 DNA(unwinding of DNA)일 수 있다. 또한, 목적에 따라 cfDNA는 적절히 정해질 수 있다.
또한, 상기 암세포에서 유래된 cfDNA는 i) 정상 세포에서 유래된 이중 나선 구조를 가지는 cfDNA에 비해 낮은 Tm 값을 갖거나, ii) 정상 세포에서 유래된 이중 나선 구조를 가지는 cfDNA가 변성되지 않는 조건에서 변성이 되는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.
또한, 상기 cfDNA는 하기의 조건 중 어느 하나의 조건에서 cfDNA 상보적으로 결합 가능한 약 15머 내지 약 30머 프로브와 결합할 수 있다: i) 상온에서 약 1분 내지 약 120분 방치하는 조건; ii) 약 90℃ 내지 약 95℃에서 약 1초 내지 약 3분간 가열하는 조건; iii) 약 75℃ 내지 약 90℃에서 약 1초 내지 약 5분간 가열하는 조건; iv) 약 60℃ 내지 약 75℃에서 약 30초 내지 약 30분간 가열하는 조건; v) 약 25℃ 내지 약 40℃에서 약 10분 내지 약 120분간 가열하는 조건; vi) 프로테아제로 약 1분 내지 약 30분 처리하는 조건; vii) DNase로 약 1분 내지 약 30분 처리하는 조건; 및 viii) 화학물질(예, 수산화나트륨, DMSO, 계면활성제 등)을 처리하는 조건.
상기 암세포에서 과발현 되는 유전자는 FNG(NCBI Gene ID: 3458), IFNGR1(NCBI Gene ID: 3459), CD279(NCBI Gene ID: 5133) 및 CD274(NCBI Gene ID: 29126) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다. 일 구체예로서, 상기 암세포에서 과발현되는 유전자의 조합이 2개인 경우 IFNG/ IFNGR1, IFNG/CD274 또는 IFNG/CD279일 수 있으며, 상기 암세포에서 과발현 되는 유전자의 조합이 3개인 경우, IFNG/IFNGR1/CD274, IFNG/CD274/CD279 또는 IFNGR1/CD274/CD279일 수 있으며, 상기 암세포에서 과발현되는 유전자의 조합이 4개인 경우는 INFG/IFNGR1/CD274/CD279일 수 있다. 상기 암세포에서 과발현되는 유전자를 2개 이상 분석할 경우, 분석 결과의 신뢰도가 향상될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "IFNG"란, 인터페론 감마(interferon gamma)를 코딩하고 있는 유전자를 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "IFNGR1"란, 인터페론 감마 리셉터 1(Interferon gamma receptor 1)을 코딩하고 있는 유전자를 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "CD274"이란, PD-L1(Programmed death-ligand 1)을 코딩하고 있는 유전자를 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "프로브(probe)"는 cfDNA를 검출하기 위한 DNA 또는 RNA를 의미한다. 프로브는 cfDNA에 상보적인 결합을 할 수 있도록 특정 서열을 가질 수 있다. 상기 cfDNA에 상보적인 서열을 갖는 프로브는 혈장에 존재하는 검출하기를 원하는 목적 이중가닥의 cfDNA에 상보적인 결합할 수 있는 핵산 서열을 갖는 프로브를 의미한다. 이때, 상기 프로브는 바이오틴(biotin)이 결합된 것일 수 있다. 상기 프로브는 바이오틴 결합 단백질과 결합된 표지자와 결합될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "표지자"는, cfDNA와 결합된 프로브를 검출하기 위해 이용되는 물질을 의미한다. 상기 표지자는 나노입자, 형광염료, 형광단백질 또는 효소일 수 있다. 구체적으로, 상기 표지자는 양자점, HRP 및 형광단백질로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다. 일 구체예로는, 상기 표지자는 GFP(green fluorescent protein), BFP(blue fluorescent protein), CFP(cyan fluorescent protein), YFP(yellow fluorescent protein) 또는 HRP(horse radish peroxidase)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 표지자는 바이오틴 결합 단백질이 결합된 것일 수 있다. 상기 바이오틴 결합 단백질은 아비딘(avidin) 계열 단백질인 스트렙타비딘, 트랩타비딘(traptavidin) 또는 뉴트라비딘(neutravidin)일 수 있으나, 바이오틴과 특이적으로 결합할 수 있는 단백질이면 제한없이 사용할 수 있다. 일 구체예로서, 상기 표지자는 스트렙타비딘이 결합된 것일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "스트렙타비딘"은 스트렙토마이세스 아비디니(Streptomyces avidinii)로부터 분리되는 분자량 60 kDa의 4량체 바이오틴 결합 단백질이다. 상기 아비딘과는 매우 낮은 상동성을 가지나 그 구조는 매우 유사하다. 아비딘과 마찬가지로 항균활성을 가지며 바이오틴에 대해 매우 높은 결합력을 갖는다. 한편 아비딘과는 달리 탄수화물을 포함하지 않으며 산성 등전점(pI=5)을 나타내고 아비딘에 비해 현저히 낮은 용해도를 갖는다. 상업적으로 사용가능한 스트렙타비딘 예컨대, Thermo Scientific Pierce Streptavidin은 53 kDa의 분자량을 갖는 재조합 형태의 스트렙타비딘으로 중성에 가까운 등전점(pI=6.8 내지 7.5)를 갖는다. 스트렙타비딘의 당화결여 및 낮은 pI가 아비딘과 비교하여 낮은 수준의 비특이적 결합(특히, 렉틴결합)을 갖도록 한다. 이러한 스트렙타비딘의 특성이 많은 검출시스템에 이상적인 시약으로 선택될 수 있도록 한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "트렙타비딘(traptavidin)"은 스트렙타비딘의 변이체(variant or mutein)를 지칭하는 용어로, 약 10배 가량 느린 바이오틴에 대한 해리속도를 나타내며, 기계적 강도가 증가되고, 열적 안정성이 향상된 단백질이다. 트렙타비딘 역시 바이오틴에 특이적으로 결합한다.
본 발명의 용어 "뉴트라비딘(neutravidin)"은 "탈당화아비딘"이라고도 하며 천연형의 아비딘과 스트렙타비딘의 주된 단점을 피하고자 제조된 것으로 이름에 나타난 바와 같이 아비딘을 탈당화하여 생성되는 것으로 아비딘에 비해 감소된 분자량(60 kDa)을 가지면서도 높은 바이오틴 결합력을 유지하는 단백질이다. 상기 아비딘의 탈당화는 검출되지 않는 수준으로 렉틴의 결합을 감소시키며 등전점을 낮추어(pI=6.3) 아비딘에 대한 비특이적인 결합의 주된 원인을 효과적으로 제거한다. 라이신 잔기는 사용가능한 채로 유지되므로 스트렙타비딘과 같이 용이하게 유도체화하거나 복합체화할 수 있다. 또한 높은 바이오틴 결합력 및 낮은 비특이적 결합을 나타나므로 이상적인 바이오틴 결합 단백질로 다양하게 이용될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "표지자를 검출하는 단계"란, 프로브와 바이오틴-에비딘 반응을 통해 결합된 표지자를 검출하는 단계를 의미한다. 상기 표지자의 검출은 색깔 변화, UV 흡광도 변화, 생물발광 여부, 형광반응 변화, 또는 전기화학적 변화에 의해 측정될 수 있다. 구체적으로, 상기 표지자를 검출하는 방법은 사용한 표지자에 따라 다르게 수행될 수 있는데, 예를 들어, HRP를 표지자로 사용한 경우에는 과산화수소와 기질과의 반응을 통한 발색반응을 관찰하여 표지자를 검출할 수 있다. 또한, 표지자가 GFP와 같은 형광단백질일 경우에는 특정 파장의 빛을 조사한 후 나오는 검출되는 빛을 관찰하여 표지자의 존재 여부를 검출할 수 있다. 아울러, 표지자가 루시퍼레이즈일 경우 루시페린과 같은 기질을 첨가한 후 나타나는 생물발광을 생물발광계로 측정함으로써 표지자의 존재를 검출할 수 있다.
또한, 본 발명의 진단 방법은 cfDNA를 변성단계를 더 포함할 수 있다. 이때, 상기 변성단계는 정상적인 이중가닥 cfDNA는 변성시키지 않으나, 암에서 유래한 cfDNA만을 선별적으로 변성시킬 수 있도록 수행될 수 있다. 이를 위해, 상기 변성 단계의 조건은 약 50℃ 내지 약 100℃에서 약 0.1초 내지 약 5분간 수행될 수 있다. 변성 온도의 일 구체예는 약 95℃일 수 있으며, 변성시간은 통상 약 0.1초 내지 약 8분 정도 수행될 수 있다. 또한, 약 1초, 약 5초, 약 10초, 약 30초, 약 60초 또는 약 90초간 변성될 수 있다. 일 구체예에서 상기 cfDNA를 변성시키는 단계는 상기 c) 단계 전에 수행될 수 있다.
구체적으로, 상기 c) 단계 이전에 시료 또는 양전하를 띠는 물질에 결합된 cfDNA를 i) 상온에서 약 1분 내지 약 10분 방치하는 조건; ii) 약 90℃ 내지 약 95℃에서 1초 내지 1분간 가열하는 조건; iii) 약 75℃ 내지 약 90℃에서 약 10초 내지 약 3분간 가열하는 조건; iv) 약 60℃ 내지 약 75℃에서 약 1분 내지 약 30분간 가열하는 조건; v) 약 25℃ 내지 약 40℃에서 약 5분 내지 약 60분간 가열하는 조건; vi) 프로테아제로 약 1분 내지 약 10분 처리하는 조건; 및 vii) DNaseI로 약 1분 내지 약 10분 처리하는 조건으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 조건에서 변성시키는 단계를 더 포함할 수 있다. 이러한 변성단계는 정상세포에서 유래한 이중가닥 cfDNA는 변성시키지 않으나, 암세포에서 유래한 cfDNA만을 선별적으로 변성시킴으로서, 프로부와의 결합을 더욱 용이하게 할 수 있다. 상기 i) 내지 vii)의 변성 조건은 시료를 수득한 후 수행할 수 있다. 또한, 상기 i) 내지 vii)의 변성 조건은 양전하를 띠는 물질에 결합된 cfDNA를 수득한 후 수행할 수 있다. 또한, 상기 i) 내지 vii)의 변성 조건의 온도, 프로테아제 및 DNase 처리 시간은 안정한 cfDNA를 변성시키지 않는 한 적절히 조정될 수 있다.
암 진단 키트
본 발명의 다른 측면은, 암에 특이적으로 발현하는 유전자에 상보적으로 결합하는 바이오틴이 결합된 프로브; 양전하를 띠는 물질; 아비딘 계열의 단백질이 결합된 표지자 및 설명서를 포함하는 암 조기진단 또는 예후예측을 위한 키트를 제공하는 것이다.
이때, 상기 암에 특이적으로 발현하는 유전자는 CPT1A, IFNG, IFNGR1, CD279 및 CD274 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
또한, 상기 설명서는 상기 키트 구성이 하기와 같은 프로토콜에 의해 암을 조기진단 또는 암의 예후를 예측할 수 있는 것으로 기재된 것일 수 있다: a) 개체로부터 분리된 생물학적 시료로부터 키트 내에 포함된 양전하를 띠는 물질을 이용하여 cfDNA를 분리하시오; b) 상기 분리된 cfDNA에 키트내에 포함된 바이오틴이 결합된 프로브 및 키트내에 포함된 표지자를 순차적 또는 동시에 혼합하시오; c) cfDNA에 결합하지 않은 프로브 및 표지자를 제거하시오; 및 d) 상기 표지자의 신호를 검출하시오.
또한, 상기 프로브, 양전하를 띠는 물질 및 표지자는 상술한 바와 같다.
암 진단 장치
본 발명의 다른 측면은, a) cfDNA가 포함된 개체로부터 분리된 생물학적 시료 및 양전하를 띠는 물질을 혼합시키는 혼합부; b) cfDNA가 결합된 양전하를 띠는 물질을 제외한 시료를 제거하기 위한 수득부; c) 상기 cfDNA가 결합된 양전하를 띠는 물질에, 상기 암에 특이적으로 발현하는 유전자에 상보적으로 결합할 수 있는 바이오틴이 결합된 프로브; 및 스트렙타비딘 및 표지자를 포함하는 나노입자를 순차적으로 또는 동시에 첨가시키는 반응부; d) 표지자를 검출하는 검출부; 및 e) 표지자의 검출 여부에 따라 상기 시료에 프로브에 상보적인 서열을 가지며, 암에서 유래된 cfDNA가 존재한다고 결정하는 정보 처리부를 포함하는, 상기 시료로부터, 증폭없이, 암세포 유래의 유전자를 검출하여 암을 조기진단 또는 암의 예후를 예측하는 장치를 제공하는 것이다.
이때, 상기 암에 특이적으로 발현하는 유전자는 CPT1A, IFNG, IFNGR1, CD279, CD274 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
<암>
암, 암의 전이 및 암의 약물에 대한 저항성 확인 방법
본 발명의 일 측면은, a) 세포유리 DNA(cell-free DNA, 이하 cfDNA)가 포함된 개체로부터 분리된 생물학적 시료 및 양전하를 띠는 물질을 혼합하는 단계; b) cfDNA가 결합된 양전하를 띠는 물질을 분리하는 단계; c) 상기 혼합물에 상기 cfDNA에 상보적인 서열을 갖는 프로브 및 표지자를 순차적으로 또는 동시에 혼합하는 단계; d) cfDNA에 결합하지 않은 프로브 및 표지자를 제거하는 단계; 및 e) 상기 표지자를 검출하는 단계를 포함하는, 상기 시료로부터, 증폭없이, 암세포 유래의 유전자를 검출하여 암의 존재 여부, 암의 전이상태 여부 및/또는 저항성 여부를 판단하는 방법으로서, 상기 cfDNA는 암세포에서 유래된 것이며, 상기 cfDNA에 상보적인 서열을 갖는 프로브는 암의 존재 여부, 암의 전이 indicator 혹은 resistance 바이오마커로 알려진 유전자에 상보적으로 결합하는 것인, 암의 전이상태 혹은 저항성 여부를 결정하는 방법을 제공한다. 이때, 암, 암의 전이여부 혹은 resistance 바이오마커로 알려진 유전자는 암에서 single nucleotide polymorphism(snp)를 포함하는 유전자 일 수 있다(실시예 6 및 실시예 7 참조).
구체적으로, 상기 cfDNA에 상보적인 서열을 갖는 프로브는 CPT1A, IFNG, IFNGR1, CD279, CD274G 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나의 유전자에서 상보적으로 결합하는 것일 수 있다.
상기 cfDNA에 상보적인 서열을 갖는 프로브는 암세포에서 과발현 되는 유전자, 암에서 특이적으로 존재하는 유전자, 전이와 관련된 유전자 또는 약물 내성과 관련된 유전자에 상보적으로 결합하는 것일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 암세포에서 과발현 되는 유전자는 CPT1A, IFNG, IFNGR1, CD279, CD274, NSE, SCC, CEA, cyfra21-1, TPA, NMP22, OGT, Thyroglobulin(TG), Calcitonin(CALCA), BRAF V600E, TERT C228T/C250T, AFP, β-HCG(CGB). CA19-9, PSA,PSMA, PAP, PCA3, TMPRSS2-ERG, CA125, HIF-1a, VEGF, CA15-3, HER2, SCC(SART3), TOP2A, MCM2, p16INK4a(CDKN2A), Ki-67(MKI167), HE4(WEDC2) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 암에서 특이적으로 존재하는 유전자는 CPT1A, IFNG, IFNGR1, CD279, CD274 유전자 일수 있으며, 추가적으로, NSE, SCC, CEA, cyfra21-1, TPA, NMP22, OGT, Thyroglobulin(TG), Calcitonin(CALCA), BRAF V600E, TERT C228T/C250T, AFP, β-HCG(CGB). CA19-9, PSA, PSMA, PAP, PCA3, TMPRSS2-ERG, CA125, HIF-1a, VEGF, CA15-3, HER2, SCC(SART3), TOP2A, MCM2, p16INK4a(CDKN2A), Ki-67(MKI167), 또는 HE4(WEDC2) 유전자를 검출하여 암 종류를 진단할 수 있다.
일 구체예로서, 상기 암의 전이와 관련된 유전자는 "proliferation" 및 "invasion" 관련 유전자들 일 수 있으며, 예를 들어, Ki67, STK15, Survivin, Cyclin B1, MYBL2, Stromelysin3, Cathepsin L2 일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 약물 내성에 관련된 유전자는 약물 및 암종에 따라 정해질 수 있다. 일 구체예로 EGFR-TKI에 획득 내성에 관련된 유전자는 EGFR T790M, PI3K, BRAF, MAPK1, HER2, KRAS, NRAS, RB deletion, p53 deletion, PTEN 및 NFkB로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 일 수 있다.
또한, 상기 분리된 생물학적 시료를 사용하는 목적은 시료 내에 존재하는 cfDNA를 검출하기 위함이다. 따라서, 시료내의 cfDNA를 다양한 방법으로 분리 및/또는 농축시켜 사용할 수 있다. 일 구체예로 핵산에 강한 친화성이 있는 니트로셀룰로오스 막(nitrocellulose membrane)을 이용할 수 있다. 또한, 일 구체예로 음전하를 띄고 있는 cfDNA를 포집하기 위하여 양전하를 띄고 있는 물질을 이용할 수 있다. 상기 양전하를 띠고 있는 물질은 나노입자, 나노와이어, 망구조 또는 양전하를 띤 필터일 수 있으나, 그 형상에 제한되는 것은 아니다. 상기 "양전하를 띄고 있는 물질"의 일 구체예로는 양전하를 띈 나노구조체 또는 양전하를 띤 멤브레인일 수 있다.
나노구조체의 일 실시예는 양이온 고분자를 포함하는 것일 수 있다. 상기 양이온성 고분자는 그 종류에 있어서 제한이 없다. 양이온성 고분자의 일 구체예로는 폴리에틸렌이민(polyethyleneimine, PEI)일 수 있으며, 양이온성 가지형 고분자 폴리에틸렌이민(cationic branched polymer polyethyleneimene)일 수 있다.
또한, 스트렙타비딘이 표지된 나노와이어를 바이오틴이 결합된 PEI 용액과 혼합하여, 바이오틴-스트렙타비딘의 상호 작용을 통해 나노와이어에 양이온성 분지형 폴리에틸렌이민(cationic branched PEI)를 추가로 결합시킬 수 있다. 그 결과, 양이온성 고분자인 폴리에틸렌이민이 표면에 결합된 나노구조체(PEI/mPpy NW)안에 나노입자가 높은 밀도로, 불규칙하게 분포되어 매립될 수 있다.
이러한 나노와이어는 높은 효율로 낮은 농도에서도 게놈 DNA 및 cfDNA 성공적으로 포집할 수 있다. 특히, DNA 등의 표적 분자와의 결합을 위한 넓은 표면적, DNA와의 상호 작용 촉진을 위한 향상된 이동성과 같은 나노와이어의 특징으로 인해, 효율적이고 효과적으로 표적 cfDNA를 포집할 수 있다.
이때, 상기 표적 cfDNA는 검출하려는 목적 cfDNA를 의미한다. 본 명세서에서 cfDNA는 이중가닥을 가진다. 이때, 상기 cfDNA의 일부가 이중가닥이 풀려있을 수 있다. 또한, 상기 cfDNA는 암 세포의 유전자로부터 유래된 것일 수 있다. 구체적으로, cfDNA는 암세포에서 과발현되는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 상기 암세포에서 과발현되는 핵산 서열은 정상세포에는 적정 발현수준을 보이나, 특정 암세포에서 과발현되는 핵산 서열을 의미한다.
구체적으로, 상기 핵산 서열의 암세포에서 과발현되는 정도 또는 기준(cutoff)은 표지자를 이용한 흡광도(optical density)를 측정하였을 때, OD값이 0.010 이상인 경우일 수 있다. 보다 구체적으로는, 상기 핵산 서열의 암세포에서 과발현되는 정도 또는 기준은 표지자를 이용한 흡광도를 측정하였을 때, OD값이 0.012 또는 0.015 이상인 경우일 수 있다. 이때, 상기 흡광도 측정을 위해 조사하는 파장은 표지자에 따라 적절히 정해질 수 있다. 상기 cfDNA는 이중가닥이 풀린 DNA(unwinding of DNA)일 수 있다. 또한, 목적에 따라 cfDNA는 적절히 정해질 수 있다.
또한, 상기 암세포에서 유래된 cfDNA는 i) 정상 세포에서 유래된 이중 나선 구조를 가지는 cfDNA에 비해 낮은 Tm 값을 갖거나, ii) 정상 세포에서 유래된 이중 나선 구조를 가지는 cfDNA가 변성되지 않는 조건에서 변성이 되는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.
또한, 상기 cfDNA는 하기의 조건 중 어느 하나의 조건에서 cfDNA 상보적으로 결합 가능한 약 15머 내지 약 30머 프로브와 결합할 수 있다: i) 상온에서 약 1분 내지 약 120분 방치하는 조건; ii) 약 90℃ 내지 약 95℃에서 약 1초 내지 약 3분간 가열하는 조건; iii) 약 75℃ 내지 약 90℃에서 약 1초 내지 약 5분간 가열하는 조건; iv) 약 60℃ 내지 약 75℃에서 약 30초 내지 약 30분간 가열하는 조건; v) 약 25℃ 내지 약 40℃에서 약 10분 내지 약 120분간 가열하는 조건; vi) 프로테아제로 약 1분 내지 약 30분 처리하는 조건; vii) DNase로 약 1분 내지 약 30분 처리하는 조건; 및 viii) 화학물질(예, 수산화나트륨, DMSO, 계면활성제 등)을 처리하는 조건.
본 명세서에서 사용된 용어, "프로브(probe)"는 cfDNA를 검출하기 위한 DNA 또는 RNA를 의미한다. 프로브는 cfDNA에 상보적인 결합을 할 수 있도록 특정 서열을 가질 수 있다. 상기 cfDNA에 상보적인 서열을 갖는 프로브는 혈장에 존재하는 검출하기를 원하는 목적 이중가닥의 cfDNA에 상보적인 결합할 수 있는 핵산 서열을 갖는 프로브를 의미한다. 이때, 상기 프로브는 바이오틴(biotin)이 결합된 것일 수 있다. 상기 프로브는 바이오틴 결합 단백질과 결합된 표지자와 결합될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "표지자"는, cfDNA와 결합된 프로브를 검출하기 위해 이용되는 물질을 의미한다. 상기 표지자는 나노입자, 형광염료, 형광단백질 또는 효소일 수 있다. 구체적으로, 상기 표지자는 양자점, HRP 및 형광단백질로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다. 일 구체예로는, 상기 표지자는 GFP(green fluorescent protein), BFP(blue fluorescent protein), CFP(cyan fluorescent protein), YFP(yellow fluorescent protein) 또는 HRP(horse radish peroxidase)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 표지자는 바이오틴 결합 단백질이 결합된 것일 수 있다. 상기 바이오틴 결합 단백질은 아비딘(avidin) 계열 단백질인 스트렙타비딘, 트랩타비딘(traptavidin) 또는 뉴트라비딘(neutravidin)일 수 있으나, 바이오틴과 특이적으로 결합할 수 있는 단백질이면 제한없이 사용할 수 있다. 일 구체예로서, 상기 표지자는 스트렙타비딘이 결합된 것일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "스트렙타비딘"은 스트렙토마이세스 아비디니(Streptomyces avidinii)로부터 분리되는 분자량 60 kDa의 4량체 바이오틴 결합 단백질이다. 상기 아비딘과는 매우 낮은 상동성을 가지나 그 구조는 매우 유사하다. 아비딘과 마찬가지로 항균활성을 가지며 바이오틴에 대해 매우 높은 결합력을 갖는다. 한편 아비딘과는 달리 탄수화물을 포함하지 않으며 산성 등전점(pI=5)을 나타내고 아비딘에 비해 현저히 낮은 용해도를 갖는다. 상업적으로 사용가능한 스트렙타비딘 예컨대, Thermo Scientific Pierce Streptavidin은 53 kDa의 분자량을 갖는 재조합 형태의 스트렙타비딘으로 중성에 가까운 등전점(pI=6.8 내지 7.5)를 갖는다. 스트렙타비딘의 당화결여 및 낮은 pI가 아비딘과 비교하여 낮은 수준의 비특이적 결합(특히, 렉틴결합)을 갖도록 한다. 이러한 스트렙타비딘의 특성이 많은 검출시스템에 이상적인 시약으로 선택될 수 있도록 한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "트렙타비딘(traptavidin)"은 스트렙타비딘의 변이체(variant or mutein)를 지칭하는 용어로, 약 10배 가량 느린 바이오틴에 대한 해리속도를 나타내며, 기계적 강도가 증가되고, 열적 안정성이 향상된 단백질이다. 트렙타비딘 역시 바이오틴에 특이적으로 결합한다.
본 발명의 용어 "뉴트라비딘(neutravidin)"은 "탈당화아비딘"이라고도 하며 천연형의 아비딘과 스트렙타비딘의 주된 단점을 피하고자 제조된 것으로 이름에 나타난 바와 같이 아비딘을 탈당화하여 생성되는 것으로 아비딘에 비해 감소된 분자량(60 kDa)을 가지면서도 높은 바이오틴 결합력을 유지하는 단백질이다. 상기 아비딘의 탈당화는 검출되지 않는 수준으로 렉틴의 결합을 감소시키며 등전점을 낮추어(pI=6.3) 아비딘에 대한 비특이적인 결합의 주된 원인을 효과적으로 제거한다. 라이신 잔기는 사용가능한 채로 유지되므로 스트렙타비딘과 같이 용이하게 유도체화하거나 복합체화할 수 있다. 또한 높은 바이오틴 결합력 및 낮은 비특이적 결합을 나타나므로 이상적인 바이오틴 결합 단백질로 다양하게 이용될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "표지자를 검출하는 단계"란, 프로브와 바이오틴-에비딘 반응을 통해 결합된 표지자를 검출하는 단계를 의미한다. 상기 표지자의 검출은 색깔 변화, UV 흡광도 변화, 생물발광 여부, 형광반응 변화, 또는 전기화학적 변화에 의해 측정될 수 있다. 구체적으로, 상기 표지자를 검출하는 방법은 사용한 표지자에 따라 다르게 수행될 수 있는데, 예를 들어, HRP를 표지자로 사용한 경우에는 과산화수소와 기질과의 반응을 통한 발색반응을 관찰하여 표지자를 검출할 수 있다. 또한, 표지자가 GFP와 같은 형광단백질일 경우에는 특정 파장의 빛을 조사한 후 나오는 검출되는 빛을 관찰하여 표지자의 존재 여부를 검출할 수 있다. 아울러, 표지자가 루시퍼레이즈일 경우 루시페린과 같은 기질을 첨가한 후 나타나는 생물발광을 생물발광계로 측정함으로써 표지자의 존재를 검출할 수 있다.
또한, 본 발명의 진단 방법은 cfDNA를 변성단계를 더 포함할 수 있다. 이때, 상기 변성단계는 정상적인 이중가닥 cfDNA는 변성시키지 않으나, 암에서 유래한 cfDNA만을 선별적으로 변성시킬 수 있도록 수행될 수 있다. 이를 위해, 상기 변성 단계의 조건은 약 50℃ 내지 약 100℃에서 약 0.1초 내지 약 5분간 수행될 수 있다. 변성 온도의 일 구체예는 약 95℃일 수 있으며, 변성시간은 통상 약 0.1초 내지 약 8분 정도 수행될 수 있다. 또한, 약 1초, 약 5초, 약 10초, 약 30초, 약 60초 또는 약 90초간 변성될 수 있다. 일 구체예에서 상기 cfDNA를 변성시키는 단계는 상기 c) 단계 전에 수행될 수 있다.
구체적으로, 상기 c) 단계 이전에 시료 또는 양전하를 띠는 물질에 결합된 cfDNA를 i) 상온에서 약 1분 내지 약 10분 방치하는 조건; ii) 약 90℃ 내지 약 95℃에서 1초 내지 1분간 가열하는 조건; iii) 약 75℃ 내지 약 90℃에서 약 10초 내지 약 3분간 가열하는 조건; iv) 약 60℃ 내지 약 75℃에서 약 1분 내지 약 30분간 가열하는 조건; v) 약 25℃ 내지 약 40℃에서 약 5분 내지 약 60분간 가열하는 조건; vi) 프로테아제로 약 1분 내지 약 10분 처리하는 조건; 및 vii) DNaseI로 약 1분 내지 약 10분 처리하는 조건으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 조건에서 변성시키는 단계를 더 포함할 수 있다. 이러한 변성단계는 정상세포에서 유래한 이중가닥 cfDNA는 변성시키지 않으나, 암세포에서 유래한 cfDNA만을 선별적으로 변성시킴으로서, 프로부와의 결합을 더욱 용이하게 할 수 있다. 상기 i) 내지 vii)의 변성 조건은 시료를 수득한 후 수행할 수 있다. 또한, 상기 i) 내지 vii)의 변성 조건은 양전하를 띠는 물질에 결합된 cfDNA를 수득한 후 수행할 수 있다. 또한, 상기 i) 내지 vii)의 변성 조건의 온도, 프로테아제 및 DNase 처리 시간은 안정한 cfDNA를 변성시키지 않는 한 적절히 조정될 수 있다.
암 진단 키트
본 발명의 다른 측면은, 암에 특이적으로 발현하는 유전자에 상보적으로 결합하는 바이오틴이 결합된 프로브; 양전하를 띠는 물질; 아비딘 계열의 단백질이 결합된 표지자 및 설명서를 포함하는 암 진단 키트를 제공하는 것이다.
이때, 상기 암에 특이적으로 발현하는 유전자는 CPT1A, IFNG, IFNGR1, CD279, CD274G 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
또한, 상기 설명서는 상기 키트 구성이 하기와 같은 프로토콜에 의해 암을 진단할 수 있는 것으로 기재된 것일 수 있다: a) 개체로부터 분리된 생물학적 시료로부터 키트 내에 포함된 양전하를 띠는 물질을 이용하여 cfDNA를 분리하시오; b) 상기 분리된 cfDNA에 키트내에 포함된 바이오틴이 결합된 프로브 및 키트내에 포함된 표지자를 순차적 또는 동시에 혼합하시오; c) cfDNA에 결합하지 않은 프로브 및 표지자를 제거하시오; 및 d) 상기 표지자의 신호를 검출하시오.
또한, NSE, SCC, CEA, cyfra21-1, TPA, NMP22, OGT, Thyroglobulin(TG), Calcitonin(CALCA), BRAF V600E, TERT C228T/C250T, AFP, β-HCG(CGB). CA19-9, PSA, PSMA, PAP, PCA3, TMPRSS2-ERG, CA125, HIF-1a, VEGF, CA15-3, HER2, SCC(SART3), TOP2A, MCM2, p16INK4a(CDKN2A), Ki-67(MKI167), HE4(WEDC2) 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나의 유전자에 상보적으로 결합하는 바이오틴이 결합된 프로브를 추가적으로 포함할 수 있다.
또한, 상기 프로브, 양전하를 띠는 물질 및 표지자는 상술한 바와 같다.
암 진단 장치
본 발명의 다른 측면은, a) cfDNA가 포함된 개체로부터 분리된 생물학적 시료 및 양전하를 띠는 물질을 혼합시키는 혼합부; b) cfDNA가 결합된 양전하를 띠는 물질을 제외한 시료를 제거하기 위한 수득부; c) 상기 cfDNA가 결합된 양전하를 띠는 물질에, 상기 암에 특이적으로 발현하는 유전자에 상보적으로 결합할 수 있는 바이오틴이 결합된 프로브; 및 스트렙타비딘 및 표지자를 포함하는 나노입자를 순차적으로 또는 동시에 첨가시키는 반응부; d) 표지자를 검출하는 검출부; 및 e) 표지자의 검출 여부에 따라 상기 시료에 프로브에 상보적인 서열을 가지며, 암에서 유래된 cfDNA가 존재한다고 결정하는 정보 처리부를 포함하는, 상기 시료로부터, 증폭없이, 암세포 유래의 유전자를 검출하여 암을 진단하는 장치를 제공하는 것이다.
이때, 상기 암에 특이적으로 발현하는 유전자는 CPT1A, IFNG, IFNGR1, CD279 및 CD274 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
또한, NSE, SCC, CEA, cyfra21-1, TPA, NMP22, OGT, Thyroglobulin(TG), Calcitonin(CALCA), BRAF V600E, TERT C228T/C250T, AFP, β-HCG(CGB). CA19-9, PSA, PSMA, PAP, PCA3, TMPRSS2-ERG, CA125, HIF-1a, VEGF, CA15-3, HER2, SCC(SART3), TOP2A, MCM2, p16INK4a(CDKN2A), Ki-67(MKI167), HE4(WEDC2) 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나의 유전자에 상보적으로 결합하는 바이오틴이 결합된 프로브를 추가적으로 포함할 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.
실험 방법 1. 종양 특이적 유전자에서 유래한 cfDNA 검출 방법
1 단계 : 샘플 준비 및 나노와이어 추가
환자의 혈장, 소변, 침 또는 가래 등을 받은 즉시 3000ⅹg에서 4℃, 10분간 원심분리하였다. 환자의 혈장, 소변, 침 또는 가래 등을 DPBS에 일정한 비율로 희석하였다. 혈장의 경우, 혈장 1 ㎕ 내지 30 ㎕를 150 ㎕ DW에 섞어서 스핀 컬럼(Spin column)(Type G 또는 Type Q)에 넣고 PEI/Ppy 나노와이어(150 μl)를 첨가하여 thermomixer를 이용하여 실온에서 1,200 rpm의 속도로 20분간 혼합하였다.
2 단계 : Vacuum/Washing/온도변성
스핀 컬럼을 진공(vacuum) 흡입 장치에 장착한 후 550 mBar에서 석션을 수행하였다. 400 μl의 1x DPBS를 넣고 다시 석션을 하였다. 같은 과정을 1회 더 반복하였다. 2단계 스텝을 통하여 획득된 나노와이어-DNA 복합체만 스핀 컬럼에 걸렸다. 온도변성이 필요한 경우 95℃로 예열되어 있는 히트블럭(heating block)에 석션이 완료된 스핀 컬럼을 넣고, 95℃에서 1분간 인큐베이션한 후 바로 꺼냈다. 온도 변성 단계가 필요 없는 조건의 샘플들은 이 과정을 거치지 않았다.
자성 나노입자를 포함하지 않은 나노와이어를 사용한 스핀 컬럼(spin column)을 통해 cfDNA를 분리한 것을 보여주었다(도 85). 위 사진은 원심분리 전 스핀 컬럼의 SEM 이미지이며, 아래 사진은 원심분리 후 cfDNA가 분리된 스핀 컬럼의 SEM 이미지이다.
3 단계 : 프로브 및 HRP/STR NPs 추가
실험에 맞는 프로브(200 μl) 및 HRP/STR NPs solution(200 ㎕)를 스핀 컬럼에 각각 넣어주었다. 써모믹서(Thermomixer)를 이용하여 실온에서 850 rpm 내지 1,000 rpm의 속도로 30분간 혼합하였다. 스핀 컬럼을 진공 장치에 장착한 후 석션을 수행하였다. 400 ㎕의 1x DPBS를 넣고 다시 석션을 수행 하였다. 같은 과정을 1회 더 반복하였다.
4 단계 : 유전자변이 검출을 위한 TMB 반응
수거 튜브(collection tube)를 새 것으로 교체한 후, 스핀 컬럼에 200 ㎕ sodium acetate buffer(0.2 M, pH 7.0), 50 ㎕ H2O2(0.1 M)을 실린지 펌프(syringe pump)를 이용하여 차례대로 스핀 컬럼에 첨가한 후 3분간 인큐베이션을 수행하였다. 인큐베이션이 끝나면, 스핀 컬럼을 3,500 rpm 내지 5,000 rpm 속도로 30초동안 원심분리하였다. 수거 튜브(collection tube)에 모인 용액을 200 ㎕씩 96 well로 옮긴 후, UV/VIS 스펙트로포토미터(spectrophotometer)를 이용하여 500 nm 내지 850 nm 파장대의 흡광도를 측정하였다.
검출 방법 개요
본 발명의 검출 단계를 도 84a 내지 도 85g에 도식화하였다. 도 84a는 폴리에틸렌이민(PEI)이 표면에 결합된 polypyrrole 나노와이어(PEI/Ppy NW)를 이용하여 환자의 체액으로부터 cfDNA를 수득한 후, 타겟 cfDNA에 상보적으로 결합하는 프로브 및 HRP/스트렙타비딘-나노입자(HRP/st-tagged NP)와의 반응을 통하여 암세포 유래의 유전자를 60분 이내에 분석하는 방법에 대한 모식도이다. 나노와이어, 프로브 및 HRP/스트렙타비딘 나노입자를 이용하여 암세포 유래의 cfDNA를 검출하는 방법을 도식화한 것이다(도 84b). 나노와이어를 사용하여 스핀 컬럼(spin column)을 통해 암세포 유래의 유전자를 검출하는 과정을 나타낸 도면이다(도 84c). 또한, 본 발명의 일 구체예에서 라이시스 버퍼를 처리하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다. 혈액, 뇌척수액 또는 흉수와 같은 시료에서 암세포 유래의 cfDNA를 검출하기 위한 방법을 시계열적 흐름으로 나타난 것이다(도 84d). 소변과 같은 시료에서 암세포 유래의 cfDNA를 검출하기 위한 방법을 시계열적 흐름으로 나타난 것이다(도 84e). 혈액에서 취득한 cfDNA의 상태에 따른 변성 조건의 차이를 도식화한 것이다(도 84f). 소변, 타액 및 객담에서 취득한 cfDNA의 상태에 따른 변성 조건의 차이를 도식화한 것이다(도 84g).
제조예 1. 양이온성 고분자로 표면처리된 나노와이어의 제조
도 1a에 나타낸 바와 같이, 양이온성 고분자인 폴리에틸렌이민(polyethyleneimine, PEI)이 표면에 접합된 나노와이어를 제조하였다. 양극산화 알루미늄(anodic aluminium oxide, AAO)의 한 면을 Q150T 모듈러 코팅 시스템(Quorum Technologies, UK)을 사용하여 5Х10-3 mbar 및 50 mA에서 600초 동안 금(Au) 층(약 150 ㎚ 두께)으로 코팅하였다. 모든 전기화학적 실험은 금(Au) 코팅된 AAO 주형에서 백금 와이어 상대 전극과 Ag/AgCl(3.0 M NaCl type) 비교 전극을 구비한 potentiostat/galvanostat(BioLogic SP-150)를 사용하여 측정하였다.
양이온성 고분자로 표면 처리된 나노와이어(PEI/Ppy NW)의 제조를 위해 AAO 주형의 기공에 0.01 M 폴리(4-스티렌설폰산)(poly(4-styrene sulfonic acid)) 및 1 ㎎/㎖ 의 바이오틴(biotin)을 함유하는 0.01 M 피롤용액과 함께 1.0 V(vs. Ag/AgCl)에서 7분 동안 크로노암페로메트리(chronoamperometry)를 적용하여 전기화학적 증착을 수행하였다.
생성된 AAO 주형을 증류수로 여러 번 세척하고, 2 M의 수산화나트륨(NaOH) 용액에 3시간 동안 담근 후, 초음파 처리를 위해(Bioruptor UCD-200, Diagenode)에 넣어 바이오틴 분자가 도핑된 프리-스탠딩 폴리피롤 나노와이어(free-standing Ppy NWs)를 얻었다. 그 후, 생성된 나노와이어에 30 mM N-(3-dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimide hydrochloride(EDC) 및 6 mM N-hydroxysuccinimide(NHS)를 첨가하여 카복실산(-COOH, carboxylic acid)기를 활성화하였다. 이후, PEI 용액을 첨가한 후 상온에서 1시간 동안 반응시키고, 물로 세척하여, 폴리에틸렌이민이 표면에 접합된 나노구조체(PEI/Ppy NW)를 수득하였다. 수득된 나노구조체(PEI/Ppy NW)는 탈이온수에 분산시키고 사용할 때까지 실온에서 보관하였다.
이러한 제조방법으로 인해, AAO 주형이 선택적으로 용해된 후, 각각의 폴리피롤(Ppy) 나노와이어가 AAO 주형으로부터 방출되고, 나노와이어에 바이오틴-스트렙타비딘의 상호 작용을 통해 양이온성 분지형 폴리에틸렌이민(cationic branched PEI, 25 kDa)을 추가로 접합시켰다.
제조예 2. 양이온성 고분자로 표면처리된 나노와이어의 제조
상기 제조예 1과 실질적으로 동일한 방법에 따라, 폴리에틸렌이민 대신에 폴리리신을 표면에 접합시킨 나노구조체 (PL/Ppy NW)를 얻었다.
제조예 3. HRP 및 스트렙타비딘이 표지된 폴리피롤 나노입자 제조
HRP 및 스트렙타비딘이 결합된 나노입자의 제조를 위해, 폴리비닐피롤(polyvinylpyrrolidone, PVP) 0.5 g을 12.5 ㎖의 3차 증류수에 넣고 30분간 교반한 후, 65 ㎕의 피롤(pyrrole)을 넣고 10분간 더 교반하였다. 그 후, 0.75 g/㎖ 농도의 FeCl3 용액을 0.5 ㎖ 첨가하여 3시간 반응시켰다. 그 후, 히알루론산 수용액(400 ㎎/20 ㎖) 20 ㎖을 첨가하여 3시간 동안 교반시킴으로써 폴리피롤-히알루론산 나노입자(Ppy-HA-NPs)를 제조하였다.
MWCO: 50,000 pore-size의 멤브레인을 이용하여 3차 증류수에 2일간 투석한다. 큰 사이즈의 particles aggregates를 1,200 rpm으로 3분간 원심분리하여 제거한 후 동결건조시켰다. 상기에서 제조된 200 ㎍의 Ppy-HA-NPs를 3차 증류수 1 ㎖에 넣은 후, 100 mM EDC/50 mM NHS 용액을 첨가하여 45분간 반응시켜 히알루론산의 카르복시 그룹을 활성화시켰다. 15,000 rpm으로 10분간 원심분리하여 상층액을 제거하면서 세척을 2번씩 진행하였다. Ppy-HA-NPs에 1 ㎎의 HRP 및 1 ㎎의 스트렙타비딘을 첨가하여 4℃ 온도에서 혼합하였다. 이후, 15,000 rpm으로 10분간 원심분리하여 상층액을 제거한 후 3차 증류수에 보관하였다. HRP 및 스트렙타비딘이 표면에 접합된 나노입자(HRP/st-tagged NP)의 형태는 주사전자현미경을 이용하여 관찰하였다(도 1b).
제조예 4. 프로브 제작
불안정한 이중 나선 구조를 가지는 cfDNA를 검출하기 위하여 프로브를 제작하였다. 프로브 제작은 검출을 원하는 암종 cfDNA에 따라 다르게 제작되었다. 이때, 상기 프로브는 바이오틴을 결합시켰다. 상기 프로브의 구체적인 핵산서열 정보는 진단 대상 암종에 따라 표 1, 5, 9 및 11 내지 28에 나타난 바와 같다.
I. 암세포주 유래의 유전자 검출 정확도 확인
실시예 1. 암세포주에서 발현 유전자 검출
실시예 1.1. PD-L1 검출 정확도 확인
ATCC 및 한국세포주은행으로부터 입수한 PD-L1 양성 암세포주로 알려진 MDA-MB-231, HCC827, H1975, PC9 및 H460 암세포주와 PD-L1 음성 암세포주로 알려진 A549, MDA-MB-468, HeLa 및 MCF7 암세포주를 이용하여 PD-L1 검출 정확도 확인하였다. 이때, PD-L1 양성 암세포주 및 PD-L1 음성 암세포주는 CCLE(Cancer Cell Line Encyclopedia)에서 제공하는 각 암세포주의 PD-L1의 mRNA 레벨(mRNA level)을 기준으로 분류하였다.
구체적으로, 각각의 PD-L1 양성 암세포주 및 PD-L1 음성 암세포주에서 유전체(genomic) DNA를 추출한 후, 음파처리(sonication)하여 fDNA(fragmented DNA) 형태로 만들었다. 50 ng/㎕ fDNA를 PBS에 넣은 후, 제조예 1에서 제조한 나노와이어를 추가하여 20분 동안 반응시켜 분리(isolation)하였다. 그 후, 95℃ 온도에서 1분 동안 온도변성과정을 거친 후에, 바이오틴이 표지된 PD-L1 프로브(biotinylated PD-L1 probe)를 추가하여 20분 더 반응시켰다. 이때, 사용된 프로브는 하기 표 1에 나타내었다.
서열정보(5'-> 3') | 서열번호 | |
biotinylated PD-L1 probe 1(Exon5) | TGGGAGCCATCTTATTATGCC | 1 |
biotinylated PD-L1 probe 2(Exon5) | CGGAAGATGAATGTCAGTGC | 2 |
biotinylated PD-L1 probe 3(Exon2) | CCTACTGGCATTTGCTGAACG | 3 |
biotinylated PD-L1 probe 4(Exon3) | ACCATAGCTGATCATGCAGCG | 4 |
비색검출(Colorimetric detection)을 위해 TMB(3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine) 및 H2O2를 아세트산 나트륨(Sodium acetate) 버퍼에 추가한 용액을 처리하여 검출 결과를 확인하였다. 각 암세포주의 DNA 기반 PD-L1 발현(ΔOD)을 분석한 결과, 두번의 반복실험에서 MDA-MB-231, HCC827, H1975, PC9 및 H460 암세포주의 fDNA에서만 명확한 PD-L1 DNA 발현(ΔOD; cutoff OD > 0.012)이 나타났다. 반면, A549, MDA-MB-461, HeLa, MCF7 암세포주에서는 2번의 반복실험에서 모두 PD-L1 DNA 발현이 나타나지 않았다(도 4 및 도 5). 또한, 상기 각 암세포주들의 PD-L1 DNA 발현 결과와 CCLE(cancer cell line encyclopedia)로부터 얻은 각 암세포주의 PD-L1(CD274) mRNA 발현 결과를 비교하였다. 각 암세포주의 PD-L1(CD274) mRNA 값은 하기 표 2에 나타내었다.
암세포주 | CD274 |
MDAMB231_BREAST | 3.474506 |
HCC827_LUNG | 3.426417 |
NCIH1975_LUNG | 2.513606 |
PC9_LUNG | 1.098854 |
NCIH460_LUNG | 0.903786 |
A549_LUNG | 0.735843 |
MDAMB468_BREAST | -0.38864 |
MCF7_BREAST | -4.06132 |
그 결과, MDA-MB-231, HCC827, H1975, PC9 및 H460 암세포주에서 높은 mRNA 발현을 보였다. 반면, A549, MDA-MB-461, HeLa 및 MCF7 암세포주에서는 mRNA 발현을 거의 보이지 않았다.
실시예 1.2. EpCAM 검출 정확도 확인
ATCC 및 한국세포주은행으로부터 입수한 EpCAM 양성 암세포주로 알려진 MDA-MB468, HCC827, MCF7, H1975 및 MDA-MB-231 암세포주와 EpCAM 음성 암세포주로 알려진 A549, H460 및 Hela 암세포주를 이용하여 EpCAM 검출 정확도 확인하였다. 이때, EpCAM 양성 암세포주 및 EpCAM 음성 암세포주는 CCLE(Cancer Cell Line Encyclopedia)에서 제공하는 각 암세포주의 EpCAM의 mRNA 레벨을 기준으로 분류하였다.
구체적으로, EpCAM 양성 암세포주 및 EpCAM 음성 암세포주에서 유전체 DNA를 추출한 후, 음파처리하여 fDNA 형태로 만들었다. 50 ng/㎕ fDNA를 PBS에 넣은 후, 제조예 1에서 제조한 나노와이어를 추가하여 20분 동안 반응시켜 분리하였다. 그 후, 95℃ 온도에서 1분 동안 온도변성과정을 거친 후에, 바이오틴이 표지된 EpCAM 프로브(biotinylated EpCAM probe)를 추가하여 20분 더 반응시켰다. 이때, 사용된 프로브는 하기 표 3에 나타내었다.
서열정보(5'->3') | 서열번호 | |
biotinylated EpCAM probe 1(Exon1) | ACAGAGCGCTAGTCCTTCGGC | 5 |
biotinylated EpCAM probe 2(Exon4) | AACCTTATGATAGTAAAAGTT | 6 |
biotinylated EpCAM probe 3(Exon7) | GGTCTAAAAGCTGGTGTTATT | 7 |
biotinylated EpCAM probe 4(Exon9) | GAAACTGGCTTTACCAATCTT | 8 |
비색 검출을 위해 TMB 및 H2O2를 아세트산 나트륨 버퍼에 추가한 용액을 처리하여 검출 결과를 확인하였다. 각 암세포주의 DNA 기반 EpCAM 발현(ΔOD)을 분석한 결과, 2번의 반복실험에서 PC9, MDA-MB468, HCC827, MCF7, H1975 및 MDA-MB-231 암세포주의 fDNA에서만 명확한 EpCAM DNA 발현(ΔOD; cutoff OD > 0.012)이 나타났다. 반면, H460 및 Hela 암세포주에서는 2번의 반복실험에서 EpCAM DNA 발현이 나타나지 않았다(도 6 및 도 7). 또한, 상기 각 암세포주들의 EpCAM DNA 발현 결과와 CCLE(cancer cell line encyclopedia)로부터 얻은 각 암세포주의 EpCAM mRNA 발현 결과를 비교하였다. 각 암세포주의 EpCAM mRNA 값은 하기 표 4에 나타내었다.
유전자 | EpCAM |
MDAMB468_BREAST | 7.391754 |
HCC827_LUNG | 7.394143 |
MCF7_BREAST | 7.506349 |
NCIH1975_LUNG | 6.241641 |
MDAMB231_BREAST | 3.334 |
A549_LUNG | 1.727828 |
NCIH460_LUNG | -0.448733 |
HRLA_CERVIX | -0.00781 |
그 결과, PC9, MDA-MB468, HCC827, MCF7, H1975 및 MDA-MB-231 암세포주에서 높은 mRNA 발현을 보였다. 반면, H460 및 Hela 암세포주에서는 mRNA 발현을 거의 보이지 않았다.
실시예 1.3. FOLR1 검출 정확도 확인
ATCC 및 한국세포주은행으로부터 입수한 FOLR1 양성 암세포주로 알려진 HeLa, MDA-MB-468, HCC827, MCF7 및 MDA-MB-231 암세포주와 FOLR1 음성 암세포주로 알려진 H460, PC9, H1975 및 A549 암세포주를 이용하여 FOLR1 검출 정확도 확인하였다. 이때, FOLR1 양성 암세포주 및 FOLR1 음성 암세포주는 CCLE(Cancer Cell Line Encyclopedia)에서 제공하는 각 암세포주의 FOLR1의 mRNA 레벨을 기준으로 분류하였다.
구체적으로, FOLR1 양성 암세포주 및 FOLR1 음성 암세포주에서 유전체 DNA를 추출한 후, 음파처리하여 fDNA 형태로 만들었다. 50 ng/㎕ fDNA를 PBS에 넣은 후, 제조예 1에서 제조한 나노와이어를 추가하여 20분 동안 반응시켜 분리하였다. 그 후, 95℃ 온도에서 1분 동안 온도변성과정을 거친 후에, 바이오틴이 표지된 FOLR1 프로브(biotinylated FOLR1 probe)를 추가하여 20분 더 반응시켰다. 이때, 사용된 프로브는 하기 표 5에 나타내었다.
서열정보(5'-> 3') | 서열번호 | |
biotinylated FOLR1 probe 1(Exon4) | TGTTCTACCAACACCAGCCAG | 9 |
biotinylated FOLR1 probe 2(Exon2) | ACTGAACCCAAAGGATCACCT | 10 |
biotinylated FOLR1 probe 3(Exon1) | CCTAGGCCACTAAACCACAGC | 11 |
biotinylated FOLR1 probe 4(Exon5) | GGCTGGGCCCTGGGCAGCCTG | 12 |
비색 검출을 위해 TMB 및 H2O2를 아세트산 나트륨(Sodium acetate) 버퍼에 추가한 용액을 처리하여 검출 결과를 확인하였다. 각 암세포주의 DNA 기반 FOLR1 발현(ΔOD)을 분석한 결과, 2번의 반복실험에서 HeLa, MDA-MB468, HCC827, MCF7 및 MDA-MB-231 암세포주의 fDNA에서만 명확한 FOLR1 DNA 발현(ΔOD; cutoff OD > 0.012)이 나타났다. 반면, H460, PC9, H1975 및 A549 암세포에서는 2번의 반복실험에서 FOLR1 DNA 발현이 나타나지 않았다(도 8 및 도 9). 또한, 상기 각 암세포주들의 FOLR1 DNA 발현 결과와 CCLE(cancer cell line encyclopedia)로부터 얻은 각 암세포주의 FOLR1 mRNA 결과를 비교하였다. 각 암세포주의 FOLR1 mRNA 값은 하기 표 6에 나타내었다.
암세포주 | FOLR1 |
NCIH460_LUNG | -4.67303 |
A549_LUNG | -2.67569 |
NCIH1975_LUNG | -2.1258 |
PC9_LUNG | -1.3628 |
MDAMB231_BREAST | 0.92787 |
MDAMB468_BREAST | 1.029144 |
MCF7_BREAST | 1.137905 |
HCC827_LUNG | 2.13759 |
HRLA_CERVIX | 6.756305 |
그 결과, HeLa, MDA-MB-468, HCC827, MCF7 및 MDA-MB-231 암세포주에서 높은 mRNA 발현을 보였다. 반면, H460, PC9, H1975 및 A549 암세포주에서는 mRNA 발현을 거의 보이지 않았다.
실시예 1.4. EGFR 검출 정확도 확인
ATCC 및 한국세포주은행으로부터 입수한 EGFR 양성 암세포주로 알려진 HeLa, PC9, A549, H1975, H460, MDA-MB-468, MCF7 및 MDA-MB-231 암세포주와 EGFR 음성 암세포주로 알려진 MCF7 암세포주를 이용하여 EGFR 검출 정확도 확인하였다. 이때, EGFR 양성 암세포주 및 EGFR 음성 암세포주는 CCLE(Cancer Cell Line Encyclopedia)에서 제공하는 각 암세포주의 EGFR의 mRNA 레벨을 기준으로 분류하였다.
구체적으로, EGFR 양성 암세포주 및 EGFR 음성 암세포주에서 유전체 DNA를 추출한 후, 음파처리하여 fDNA 형태로 만들었다. 50 ng/㎕ fDNA를 PBS에 넣은 후, 제조예 1에서 제조한 나노와이어를 추가하여 20분 동안 반응시켜 분리하였다. 그 후, 95℃ 온도에서 1분 동안 온도변성과정을 거친 후에, 바이오틴이 표지된 EGFR 프로브(biotinylated EGFR probe)를 추가하여 20분 더 반응시켰다. 이때, 사용된 프로브는 하기 표 7에 나타내었다.
서열정보(5'-> 3') | 서열번호 | |
biotinylated EGFR probe 1(Exon1) | AACGCCACAACCACCGCGCAC | 13 |
biotinylated EGFR probe 2(Exon21) | GGACCGTCGCTTGGTGCACCG | 14 |
biotinylated EGFR probe 3(Exon19) | TCTGGACCCAGAAGGTGAGAA | 15 |
biotinylated EGFR probe 4(Exon20) | TGCTGGGCATCTGCCTCACCT | 16 |
비색 검출을 위해 TMB 및 H2O2를 아세트산 나트륨 버퍼에 추가한 용액을 처리하여 검출 결과를 확인하였다. 각 암세포주의 DNA 기반 EGFR 발현(ΔOD)을 분석한 결과, 2번의 반복실험에서 HCC827, PC9, MDA-MB468, MCF7 및 MDA-MB-231 암세포주의 fDNA에서만 명확한 EGFR DNA 발현(ΔOD; cutoff OD > 0.012)이 나타났다. 반면, MCF7 암세포주에서는 2번의 반복실험에서 EGFR DNA 발현이 나타나지 않았다(도 10 및 도 11). 또한, 상기 각 암세포주들의 EGFR DNA 발현 결과와 CCLE로부터 각 암세포주의 EGFR mRNA 발현 결과를 비교하였다. 각 암세포주의 EGFR mRNA 값은 하기 표 8에 나타내었다.
유전자 | EGFR |
MCF7_BREAST | -2.6082 |
NCIH460_LUNG | 2.290725 |
HRLA_CERVIX | 3.548315 |
NCIH1975_LUNG | 4.722316 |
A549_LUNG | 4.772873 |
MDAMB231_BREAST | 5.060244 |
PC9_LUNG | 6.4006 |
MDAMB468_BREAST | 8.505156 |
HCC827_LUNG | 8.98461 |
그 결과, HeLa, H460, PC9, H1975, MDA-MB-468, MCF7 및 MDA-MB-231 암세포주에서 높은 mRNA 발현을 보였다. 반면, MCF7 암세포주에서는 mRNA 발현을 거의 보이지 않았다.
실시예 1.5. ERBB2(HER2) 검출 정확도 확인
ATCC 및 한국세포주은행으로부터 입수한 ERBB2 양성 암세포주로 알려진 MCF7, PC9, A549, H1975, H460, MDA-MB468, MCF7 및 MDA-MB-231 암세포주와 ERBB2 음성 암세포주로 알려진 H460 암세포주를 이용하여 ERBB2 검출 정확도 확인하였다. 이때, ERBB2 양성 암세포주 및 ERBB2 음성 암세포주는 CCLE(Cancer Cell Line Encyclopedia)에서 제공하는 각 암세포주의 ERBB2의 mRNA 레벨을 기준으로 분류하였다.
구체적으로, ERBB2 양성 암세포주 및 ERBB2 음성 암세포주에서 유전체 DNA를 추출한 후, 음파처리하여 fDNA 형태로 만들었다. 50 ng/㎕ fDNA를 PBS에 넣은 후, 제조예 1에서 제조한 나노와이어를 추가하여 20분 동안 반응시켜 분리하였다. 그 후, 95℃ 온도에서 1분 동안 온도변성과정을 거친 후에, 바이오틴이 표지된 ERBB2 프로브(biotinylated ERBB2 probe)를 추가하여 20분 더 반응시켰다. 이때, 사용된 프로브는 하기 표 9에 나타내었다.
서열정보(5'->3') | 서열번호 | |
biotinylated ERBB2 probe 1(Exon1) | TCGCAGCACCCCGCGCCCCGC | 17 |
biotinylated ERBB2 probe 2(Exon5) | CCTGTTCTCCGATGTGTAAGG | 18 |
biotinylated ERBB2 probe 3(Exon10) | CCGCTCCAGCCAGAGCAGCTC | 19 |
biotinylated ERBB2 probe 4(Exon17) | AAGATCCGGAAGTACACGATG | 20 |
비색 검출을 위해 TMB 및 H2O2를 아세트산 나트륨 버퍼에 추가한 용액을 처리하여 검출 결과를 확인하였다. 각 암세포주의 DNA 기반 ERBB2 발현(ΔOD)을 분석한 결과, 2번의 반복실험에서 MCF7, PC9, A549, H1975, MDA-MB468, MCF7 및 MDA-MB-231 암세포주의 fDNA에서만 명확한 ERBB2 DNA 발현(ΔOD; cutoff OD > 0.010)이 나타났다. 반면, H460 암세포주에서는 2번의 반복실험에서 ERBB2 DNA 발현이 나타나지 않았다(도 12 및 도 13). 또한, 상기 각 암세포주들의 ERBB2 DNA 발현 결과와 CCLE로부터 각 암세포주의 ERBB2 mRNA 발현 결과를 비교하였다. 각 암세포주의 EGFR mRNA 값은 하기 표 10에 나타내었다.
유전자 | ERBB2 |
MCF7_BREAST | 4.64588 |
NCIH1975_LUNG | 4.314726 |
HRLA_CERVIX | 4.056006 |
HCC827_LUNG | 4.077482 |
MDAMB231_BREAST | 3.681573 |
MDAMB468_BREAST | 3.576987 |
A549_LUNG | 3.298639 |
NCIH460_LUNG | 2.948514 |
그 결과, 실험에서 MCF7, PC9, A549, H1975, MDA-MB468, MCF7, H460 및 MDA-MB-231 암세포주에서 높은 mRNA 발현을 보였다.
실시예 1.6. OGT(O-linked ß-N-acetylglucosamine transferase) 검출 정확도 확인
ATCC 및 한국세포주은행으로부터 입수한 OGT 양성 암세포주로 알려진 UMUC3, KU19-19, 253J, J82, T24, MBT2 암세포주와 OGT 음성 암세포주로 알려진 RT4, MDCK, HBL EpC, Jurkat 암세포주를 이용하여 OGT 검출 정확도 확인하였다. 이때, OGT 양성 암세포주 및 OGT 음성 암세포주는 CCLE(Cancer Cell Line Encyclopedia)에서 제공하는 각 암세포주의 OGT의 mRNA 레벨을 기준으로 분류하였다.
구체적으로, OGT 양성 암세포주 및 OGT 음성 암세포주에서 유전체(genomic) DNA를 추출한 후, 음파처리하여 fDNA 형태로 만들었다. 50 ng/㎕ fDNA를 PBS에 넣은 후, 제조예 1에서 제조한 나노와이어를 추가하여 20분 동안 반응시켜 분리하였다. 그 후, 95℃ 온도에서 1분 동안 온도변성과정을 거친 후에, 바이오틴이 표지된 OGT 프로브(biotinylated OGT probe)를 추가하여 20분 더 반응시켰다. 이때, 사용된 프로브는 하기 표 11에 나타내었다.
서열정보(5'->3') | 서열번호 | |
biotinylated OGT(O-GlcNAc transferase) probe 1 | ATGGCGTCTTCCGTGGGC | 21 |
OGT_R biotinylated OGT(O-GlcNAc transferase) probe 2 | TGCCCTGTGGCCATGGAC | 22 |
비색 검출을 위해 TMB 및 H2O2를 아세트산 나트륨 버퍼에 추가한 용액을 처리하여 검출 결과를 확인하였다. OGT 양성 암세포주 및 OGT 음성 암세포주에서 추출한 fDNA를 제조예 1에서 제조한 나노와이어로 검출한 후, DNA 기반 OGT 발현(ΔOD)을 분석한 결과, 2번의 반복실험에서 UMUC3, KU19-19, 253J, J82, T24, MBT2 암세포주의 fDNA에서만 명확한 OGT DNA 발현(ΔOD; cutoff OD > 0.010)이 나타났다. 반면, 양성 방광암 세포주인 RT4 및 정상 방광암 세포주인 MDCK 및 HBL_EpC, 또는 Jurkat T-lymphocyte 세포들에서는 2번의 실험 모두에서 OGT DNA 발현이 나타나지 않았다(도 14 및 도 15).
II. 암세포주 유래의 종양 표지자 검출
실시예 2. 암세포주 유래 바이오마커 검출
실시예 2.1. CEA 검출
ATCC 및 한국세포주은행으로부터 입수한 CEA 양성 암세포주로 알려진 LoVo, MKN45 및 SW1116 암세포주와 CEA 음성 암세포주로 알려진 HCT8, HCT15, HeLa 및 MDA-MB-231 암세포주를 이용하여 CEA를 검출하였다. 이때, CEA 양성 암세포주 및 CEA 음성 암세포주는 CCLE(Cancer Cell Line Encyclopedia)에서 제공하는 각 암세포주의 CEA의 mRNA 레벨을 기준으로 분류하였다.
구체적으로, CEA 양성 암세포주 및 CEA 음성 암세포주에서 유전체 DNA를 추출한 후, 음파처리하여 fDNA 형태로 만들었다. 50 ng/㎕ fDNA를 PBS에 넣은 후, 나노와이어를 추가하여 20분 동안 반응시켜 분리하였다. 그 후, 95℃ 온도에서 1분 동안 온도변성과정을 거친 후에, 바이오틴이 표지된 CEA 프로브(biotinylated CEA probe)를 추가하여 20분 더 반응시켰다. 이때, 사용된 프로브는 하기 표 12에 나타내었다.
서열정보(5'->3') | 서열번호 | |
biotinylated CEA(Prostatic Acid Phosphatase; ACPP gene) probe 1 | AATCTGAACCTCTCCTGCCAC | 23 |
biotinylated CEA(Prostatic Acid Phosphatase; ACPP gene) probe 2 | ACCCTTCATCACCAGCAACAA | 24 |
biotinylated CEA(Prostatic Acid Phosphatase; ACPP gene) probe 3 | TATTCTTGGCTGATTGATGGG | 25 |
biotinylated CEA(Prostatic Acid Phosphatase; ACPP gene) probe 4 | CAGCAACAACTCCAAACCCGT | 26 |
비색 검출을 위해 TMB 및 H2O2를 아세트산 나트륨 버퍼에 추가한 용액을 처리하여 검출 결과를 확인하였다. 각 암세포주의 DNA 기반 CEA 발현(ΔOD)을 분석한 결과, 3번의 반복실험에서 LoVo, MKN45 및 SW1116 암세포주의 fDNA에서만 명확한 CEA DNA 발현(ΔOD; cutoff OD > 0.010)이 나타났다. 반면, HCT8, HCT15, HeLa 및 MDA-MB-231 암세포주에서는 3번의 실험 모두에서 CEA DNA 발현이 나타나지 않았다(도 16 내지 도 18).
실시예 2.2. PSA 검출
ATCC 및 한국세포주은행으로부터 입수한 PSA 양성 암세포주로 알려진 LNE 및 LNCaP 암세포주와 PSA 음성 암세포주로 알려진 PC3, DU145 및 MCF7 암세포주를 이용하여 PSA를 검출하였다. 이때, PSA 양성 암세포주 및 PSA 음성 암세포주는 CCLE(Cancer Cell Line Encyclopedia)에서 제공하는 각 암세포주의 PSA의 mRNA 레벨을 기준으로 분류하였다.
구체적으로, PSA 양성 암세포주 및 PSA 음성 암세포주에서 유전체 DNA를 추출한 후, 음파처리하여 fDNA 형태로 만들었다. 50 ng/㎕ fDNA를 PBS에 넣은 후, 제조예 1에서 제조한 나노와이어를 추가하여 20분 동안 반응시켜 분리하였다. 그 후, 95℃ 온도에서 1분 동안 온도변성과정을 거친 후에, 바이오틴이 표지된 PSA 프로브(biotinylated PSA probe)를 추가하여 20분 더 반응시켰다. 이때, 사용된 프로브는 하기 표 13에 나타내었다.
서열정보(5'-> 3') | 서열번호 | |
biotinylated PSA(KLK3) probe 1 | CAGTCTGCGGCGGTGTTCTGG | 27 |
biotinylated PSA(KLK3) probe 2 | GCAAGTTCACCCTCAGAAGGT | 28 |
biotinylated PSA(KLK3) probe 3 | GAGGTCCAGGGTTGCTAGGAA | 29 |
비색 검출을 위해 TMB 및 H2O2를 아세트산 나트륨 버퍼에 추가한 용액을 처리하여 검출 결과를 확인하였다. 각 암세포주의 DNA 기반 PSA 발현(ΔOD)을 분석한 결과, 2번의 반복실험에서 LNE 및 LNCaP 암세포주의 fDNA에서만 명확한 PSA DNA 발현(ΔOD; cutoff OD > 0.010)이 나타났다. 반면, PC3, DU145 및 MCF7 암세포주에서는 2번의 실험 모두에서 PSA DNA 발현이 나타나지 않았다(도 19 및 도 20).
실시예 2.3. CA19-9 검출
ATCC 및 한국세포주은행으로부터 입수한 CA19-9 양성 암세포주로 알려진 Capan1, Capn2 및 AsPC1 암세포주와 CA19-9 음성 암세포주로 알려진 MIA-PaCa2 및 Panc1 암세포주를 이용하여 CA19-9를 검출하였다. 이때, CA19-9 양성 암세포주 및 CA19-9 음성 암세포주는 CCLE(Cancer Cell Line Encyclopedia)에서 제공하는 각 암세포주의 CA19-9 의 mRNA 레벨을 기준으로 분류하였다.
구체적으로, CA19-9 양성 암세포주 및 CA19-9 음성 암세포주에서 유전체 DNA를 추출한 후, 음파처리하여 fDNA 형태로 만들었다. 50 ng/㎕ fDNA를 PBS에 넣은 후, 나노와이어를 추가하여 20분 동안 반응시켜 분리하였다. 그 후, 95℃ 온도에서 1분 동안 온도변성과정을 거친 후에, 바이오틴이 표지된 CA19-9 프로브(biotinylated CA19-9 probe)를 추가하여 20분 더 반응시켰다. 이때, 사용된 프로브는 하기 표 14에 나타내었다.
서열정보(5'-> 3') | 서열번호 | |
biotinylated CA19-9(FLU3 gene) probe 1 | GATCATCACGGCACGGTC | 30 |
biotinylated CA19-9(FLU3 gene) probe 2 | GTGCAGAGAGATCATCACGGC | 31 |
biotinylated CA19-9(FLU3 gene) probe 3 | TCTCTCTTACCTGGGACCTCA | 32 |
비색 검출을 위해 TMB 및 H2O2를 아세트산 나트륨 버퍼에 추가한 용액을 처리하여 검출 결과를 확인하였다. 각 암세포주의 DNA 기반 CA19-9 발현(ΔOD)을 분석한 결과, 2번의 반복실험에서 Capan1, Capn2 및 AsPC1 암세포주의 fDNA에서만 명확한 CA19-9 DNA 발현(ΔOD; cutoff OD > 0.010)이 나타났다. 반면, MIA-PaCa2 및 Panc1 암세포주에서는 2번의 실험 모두에서 CA19-9 DNA 발현이 나타나지 않았다(도 21 및 도 22).
실시예 2.4. CA125 검출
ATCC 및 한국세포주은행으로부터 입수한 CA125 양성 암세포주로 알려진 A549 암세포주와 CA125 음성 암세포주로 알려진 A431 암세포주를 이용하여 CA125를 검출하였다. 이때, CA125 양성 암세포주 및 CA125 음성 암세포주는 CCLE(Cancer Cell Line Encyclopedia)에서 제공하는 각 암세포주의 CA125의 mRNA 레벨을 기준으로 분류하였다.
구체적으로, CA125 양성 암세포주 및 CA125 음성 암세포주에서 유전체 DNA를 추출한 후, 음파처리하여 fDNA 형태로 만들었다. 50 ng/㎕ fDNA를 PBS에 넣은 후, 나노와이어를 추가하여 20분 동안 반응시켜 분리하였다. 그 후, 95℃ 온도에서 1분 동안 온도변성과정을 거친 후에, 바이오틴이 표지된 CA125 프로브(biotinylated CA125 probe)를 추가하여 20분 더 반응시켰다. 이때, 사용된 프로브는 하기 표 15에 나타내었다.
서열정보(5'->3') | 서열번호 | |
biotinylated CA125(MUC16 gene) probe 1 | CTGGAACTGATTCTATCAACC | 33 |
biotinylated CA125(MUC16 gene) probe 2 | TGTGGCAGAAACCAGCTATCC | 34 |
biotinylated CA125(MUC16 gene) probe 3 | GAGGTCCTGAGGATGTGTCAT | 35 |
비색 검출을 위해 TMB 및 H2O2를 아세트산 나트륨 버퍼에 추가한 용액을 처리하여 검출 결과를 확인하였다. 각 암세포주의 DNA 기반 CA125 발현(ΔOD)을 분석한 결과, 2번의 반복실험에서 A549 암세포주의 fDNA에서만 명확한 CA125 DNA 발현(ΔOD; cutoff OD > 0.010)이 나타났다. 반면, A431 암세포주에서는 2번의 실험 모두에서 CA125 DNA 발현이 나타나지 않았다(도 23 및 도 24).
실시예 2.5. AFP 검출
ATCC 및 한국세포주은행으로부터 입수한 AFP 양성 암세포주로 알려진 Huh7, HepG2, Hep3B 및 PLC 암세포주와 AFP 음성 암세포주로 알려진 SNU475, SNU387, SNU423, SNU449, SK Hep1 및 HeLa 암세포주를 이용하여 AFP를 검출하였다. 이때, AFP 양성 암세포주 및 AFP 음성 암세포주는 CCLE(Cancer Cell Line Encyclopedia)에서 제공하는 각 암세포주의 AFP의 mRNA 레벨을 기준으로 분류하였다.
구체적으로, AFP 양성 암세포주 및 AFP 음성 암세포주에서 유전체 DNA를 추출한 후, 음파처리하여 fDNA 형태로 만들었다. 50 ng/㎕ fDNA를 PBS에 넣은 후, 나노와이어를 추가하여 20분 동안 반응시켜 분리하였다. 그 후, 95℃ 온도에서 1분 동안 온도변성과정을 거친 후에, 바이오틴이 표지된 AFP 프로브(biotinylated AFP probe)를 추가하여 20분 더 반응시켰다. 이때, 사용된 프로브는 하기 표 16에 나타내었다.
서열정보(5'-> 3') | 서열번호 | |
biotinylated AFP probe 1 | TGAGTCAGAAGTTTACCAAAG | 36 |
biotinylated AFP probe 2 | TGCAAACTGACCACGCTGGAA | 37 |
biotinylated AFP probe 3 | CTTGAATGCCAAGATAAAGGA | 38 |
비색 검출을 위해 TMB 및 H2O2를 아세트산 나트륨 버퍼에 추가한 용액을 처리하여 검출 결과를 확인하였다. 각 암세포주의 DNA 기반 AFP 발현(ΔOD)을 분석한 결과, 2번의 반복실험에서 Huh7, HepG2, Hep3B 및 PLC 암세포주의 fDNA에서만 명확한 AFP DNA 발현(ΔOD; cutoff OD > 0.010)이 나타났다. 반면, SNU475, SNU387, SNU423, SNU449, SK Hep1 및 HeLa 암세포주에서는 2번의 실험 모두에서 AFP DNA 발현이 나타나지 않았다(도 25 및 도 26).
III. 암환자의 혈장 또는 소변을 이용한 바이오마커 검출 확인
실시예 3. 암환자 유래 바이오마커 검출
실시예 3.1. 전립선암 환자의 혈장을 이용한 종양 표지자 검출 확인
정상인 또는 전립선암 환자로부터 수득한 혈장으로부터 PSA, PSMA, PAP, PCA3 전립선암 종양표지자를 검출하였다. 전립선암 표지자로써 PSA, PSMA, PAP, PAC3는 전립선암 환자에게서 높이 발현되며, 현재 암조직 및 혈액 검사를 통하여 전립선암 항원(PSA, PSMA, PAP, PAC3)의 수치를 확인함으로 전립선암 감별에 사용되고 있다.
구체적으로, 정상인 또는 전립선암 환자로부터 혈장을 수득한 후, 나노와이어를 추가하여 20분 동안 반응시켜 ctDNA(Circulating tumor DNA)를 분리하였다. 이때, ctDNA는 나노와이어에 붙어 복합체를 이룬다. ctDNA와 나노와이어 복합체를 i) 온도변성 없이 27℃ 온도에서 사용하는 경우와 ii) 95℃ 온도에서 1분 동안 온도변성과정을 거친 후에 사용하는 경우로 나누어 실험을 진행하였다. 그 후, 바이오틴이 표지된 각각의 프로브(biotinylated probe) 및 HRP 및 스트렙타비딘 표지된 폴리피롤 나노입자(HRP/st-tagged NPs)를 추가하여 20분 더 반응시켰다. 이때, 사용된 프로브는 하기 표 17에 나타내었다.
서열정보(5'-> 3') | 서열번호 | |
biotinylated PSA(KLK3) probe 1 | CAGTCTGCGGCGGTGTTCTGG | 26 |
biotinylated PSA(KLK3) probe 2 | GCAAGTTCACCCTCAGAAGGT | 27 |
biotinylated PSA(KLK3) probe 3 | GAGGTCCAGGGTTGCTAGGAA | 28 |
biotinylated PSMA(FOLH1) probe 1 | CATAGTGCTCCCTTTTGATTG | 39 |
biotinylated PSMA(FOLH1) probe 2 | AGTGGAAAGAATTTGGCCTGG | 40 |
biotinylated PSMA(FOLH1) probe 3 | ACCTAGAAGAACAATTTTGTT | 41 |
biotinylated PAP(Prostatic Acid Phosphatase; ACPP gene) probe 1 | GCAGCATTATGAACTTGGAGA | 42 |
biotinylated PAP(Prostatic Acid Phosphatase; ACPP gene) probe 2 | TCGGAATGAGACGCAGCACGA | 43 |
biotinylated PCA3(Prostate cancer antigen 3; PCA3 gene) probe 1 | CTTAGTGTTTCAATGAACACC | 44 |
biotinylated PCA3(Prostate cancer antigen 3; PCA3 gene) probe 2 | GCTTAGCCTTGTACTGAGGCT | 45 |
비색 검출을 위해 TMB 및 H2O2를 아세트산 나트륨 버퍼에 추가한 용액을 처리하여 PSA, PSMA, PAP, PAC3의 발현을 확인하였다. PSA, PSMA, PAP, PAC3 ctDNA 발현(ΔOD)을 분석한 결과, 전립선암 환자에게서 온도변성이 없을 경우 또는 온도변성과정을 거친 경우에 명확한 PSA, PSMA, PAP, PAC3 ctDNA 발현(ΔOD; cutoff OD > 0.015)이 나타났다. 반면, 정상인에게서는 온도변성이 없을 경우와 온도변성과정을 거친 경우 모두 PSA, PSMA, PAP, PAC3 ctDNA 발현(ΔOD; cutoff OD > 0.015)이 나타나지 않았다(도 27 내지 도 32).
실시예 3.2. 폐암 환자의 혈장을 이용한 종양 표지자 검출 확인
정상인 또는 폐암 환자로부터 수득한 혈장으로부터 NSE, SCC, CEA, Cyfra21-1, TPA 폐암 종양표지자를 검출하였다. 폐암 표지자로써 NSE, SCC, CEA, Cyfra21-1, TPA는 폐암 환자에게서 높이 발현되며, 현재 암조직 및 혈액 검사를 통하여 폐암 항원(NSE, SCC, CEA, Cyfra21-1, TPA)의 수치를 확인함으로써 폐암 감별에 사용되고 있다.
구체적으로, 정상인 또는 폐암 환자로부터 혈장을 수득한 후, 나노와이어를 추가하여 20분 동안 반응시켜 ctDNA(Circulating tumor DNA)를 분리하였다. 이때, ctDNA는 나노와이어에 붙어 복합체를 이룬다. ctDNA와 나노와이어 복합체를 i) 온도변성 없이 27℃ 온도에서 사용하는 경우와 ii) 95℃ 온도에서 1분 동안 온도변성과정을 거친 후에 사용하는 경우로 나누어 실험을 진행하였다. 그 후, 바이오틴이 표지된 각각의 프로브(biotinylated probe) 및 HRP 및 스트렙타비딘 표지된 폴리피롤 나노입자(HRP/st-tagged NPs)를 추가하여 20분 더 반응시켰다. 이때, 사용된 프로브는 하기 표 18에 나타내었다.
서열정보(5'-> 3') | 서열번호 | |
biotinylated NSE(Neuron-Specific Enolase; ENO2 gene) probe 1 | CCATAGAGAAGATCTGGGCCC | 46 |
biotinylated NSE(Neuron-Specific Enolase; ENO2 gene) probe 2 | GATCCTCCCAGTGGGAGCTGA | 47 |
biotinylated NSE(Neuron-Specific Enolase; ENO2 gene) probe 3 | GGTCATGGTGAGTCATCGCTC | 48 |
biotinylated SCC(Squamous Cell Carcinoma Antigen; SART3 gene) probe 1 | GCTGGAGTGGCTGCATGACGA | 49 |
biotinylated SCC(Squamous Cell Carcinoma Antigen; SART3 gene) probe 2 | GCGCCCTGGTCGAGAACTGCC | 50 |
biotinylated SCC(Squamous Cell Carcinoma Antigen; SART3 gene) probe 3 | GTGGCTAGAGTATTACAACCT | 51 |
biotinylated SCC(Squamous Cell Carcinoma Antigen; SART3 gene) probe 4 | TCGAGAACAGCATCCCTGCAG | 52 |
biotinylated CEA(Prostatic Acid Phosphatase; ACPP gene) probe 1 | AATCTGAACCTCTCCTGCCAC | 23 |
biotinylated CEA(Prostatic Acid Phosphatase; ACPP gene) probe 2 | ACCCTTCATCACCAGCAACAA | 24 |
biotinylated CEA(Prostatic Acid Phosphatase; ACPP gene) probe 3 | TATTCTTGGCTGATTGATGGG | 25 |
biotinylated CEA(Prostatic Acid Phosphatase; ACPP gene) probe 4 | CAGCAACAACTCCAAACCCGT | 26 |
biotinylated Cyfra21-1(cytokeratin 19-fragments; KRT19 gene) probe 1 | CTGGCCTCCTACCTGGACAA | 53 |
biotinylated Cyfra21-1(cytokeratin 19-fragments; KRT19 gene) probe 2 | GACCTGGAGATGCAGATCGAA | 54 |
biotinylated Cyfra21-1(cytokeratin 19-fragments; KRT19 gene) probe 3 | GTCGCTGGCCACACGGAGCAG | 55 |
biotinylated TPA(Tissue plasminogen activator; PLAT gene) probe 1 | GCTGTGAAGCAATCATGGATG | 56 |
biotinylated TPA(Tissue plasminogen activator; PLAT gene) probe 2 | GCACCTGCCAGCAGGCCCTGT | 57 |
biotinylated TPA(Tissue plasminogen activator; PLAT gene) probe 3 | ACTGGACGGAGTGTGAGCTCT | 58 |
비색 검출을 위해 TMB 및 H2O2를 아세트산 나트륨 버퍼에 추가한 용액을 처리하여 NSE, SCC, CEA, Cyfra21-1, TPA의 발현을 확인하였다. ctDNA 기반 NSE, SCC, CEA, Cyfra21-1, TPA ctDNA 발현(ΔOD)을 분석한 결과, 2명의 폐암 환자에게서 온도변성이 없을 경우 또는 온도변성과정을 거친 경우에 명확한 NSE, SCC, CEA, Cyfra21-1, TPA ctDNA 발현(ΔOD; cutoff OD > 0.010)이 나타났다. 반면, 정상인에게서는 온도변성이 없을 경우와 온도변성과정을 거친 경우에 NSE, SCC, CEA, Cyfra21-1, TPA ctDNA 발현(ΔOD; cutoff OD > 0.010)이 나타나지 않았다(도 33 내지 도 35).
실시예 3.3. 갑상선암 환자의 혈장을 이용한 종양 표지자 검출 확인
정상인 또는 갑상선암 환자로부터 수득한 혈장으로부터 CEA, NSE, TG, CALCA 갑상선암 종양표지자를 검출하였다. 갑상선암 표지자로써 CEA, NSE, TG, CALCA는 갑상선암 환자에게서 높이 발현되며, 현재 암조직 및 혈액 검사를 통하여 갑상선암 항원(CEA, NSE, TG, CALCA)의 수치를 확인함으로 갑상선암 감별에 사용되고 있다.
구체적으로, 정상인 또는 갑상선암 환자로부터 혈장을 수득한 후, 나노와이어를 추가하여 20분 동안 반응시켜 ctDNA(Circulating tumor DNA)를 분리하였다. 이때, ctDNA는 나노와이어에 붙어 복합체를 이룬다. ctDNA와 나노와이어 복합체를 i) 온도변성 없이 27℃ 온도에서 사용하는 경우와 ii) 95℃ 온도에서 1분 동안 온도변성과정을 거친 후에 사용하는 경우로 나누어 실험을 진행하였다. 그 후, 바이오틴이 표지된 각각의 프로브(Biotinylated probe) 및 HRP 및 스트렙타비딘 표지된 폴리피롤 나노입자(HRP/st-tagged NPs)를 추가하여 20분 더 반응시켰다. 이때, 사용된 프로브는 하기 표 19에 나타내었다.
서열정보(5'-> 3') | 서열번호 | |
biotinylated CEA(Prostatic Acid Phosphatase; ACPP gene) probe 1 | AATCTGAACCTCTCCTGCCAC | 23 |
biotinylated CEA(Prostatic Acid Phosphatase; ACPP gene) probe 2 | ACCCTTCATCACCAGCAACAA | 24 |
biotinylated CEA(Prostatic Acid Phosphatase; ACPP gene) probe 3 | TATTCTTGGCTGATTGATGGG | 25 |
biotinylated CEA(Prostatic Acid Phosphatase; ACPP gene) probe 4 | CAGCAACAACTCCAAACCCGT | 26 |
biotinylated NSE(Neuron-Specific Enolase; ENO2 gene) probe 1 | CCATAGAGAAGATCTGGGCCC | 46 |
biotinylated NSE(Neuron-Specific Enolase; ENO2 gene) probe 2 | GATCCTCCCAGTGGGAGCTGA | 47 |
biotinylated NSE(Neuron-Specific Enolase; ENO2 gene) probe 3 | GGTCATGGTGAGTCATCGCTC | 48 |
biotinylated Thyroglobulin(TG gene) probe 1 | CAACACCACAGACATGATGAT | 59 |
biotinylated Thyroglobulin(TG gene) probe 2 | TGCGGCCTGGCTCGAGCAGCA | 60 |
biotinylated Thyroglobulin(TG gene) probe 3 | AATCAATCACTATCCAGCCAG | 61 |
biotinylated Thyroglobulin(TG gene) probe 4 | ACTCTCTGGAGCACTCCACGG | 62 |
biotinylated Calcitonin(Calcitonin Gene-Related Peptide; CALCA gene) probe 1 | GAGGTGTCATGGGCTTCCAAA | 63 |
biotinylated Calcitonin(Calcitonin Gene-Related Peptide; CALCA gene) probe 2 | GTAATCTGAGTACTTGCATGC | 64 |
비색 검출을 위해 TMB 및 H2O2를 아세트산 나트륨 버퍼에 추가한 용액을 처리하여 CEA, NSE, TG, CALCA의 발현을 확인하였다. ctDNA 기반 CEA, NSE, TG, CALCA ctDNA 발현(ΔOD)을 분석한 결과, 갑상선암 환자에게서 온도변성이 없을 경우 또는 온도변성과정을 거친 경우에 명확한 CEA, NSE, TG, CALCA ctDNA 발현(ΔOD; cutoff OD > 0.010)이 나타났다. 반면, 정상인에게서는 온도변성이 없을 경우와 온도변성과정을 거친 경우에도 CEA, NSE, TG, CALCA ctDNA 발현(ΔOD; cutoff OD > 0.010)이 나타나지 않았다(도 36 내지 도 40).
실시예 3.4. 방광암 환자의 소변을 이용한 종양 표지자 검출 확인
정상인 또는 방광암 환자로부터 수득한 소변으로부터 OGT, FGFR3, TP53, NMP22, Cyfra21-1 방광암 종양표지자를 검출하였다. 방광암 표지자로써 OGT, FGFR3, TP53, NMP22, Cyfra21-1는 방광암 환자의 소변에서 높은 수치를 보임에 따라, 방광암 감별에 사용될 수 있다.
구체적으로, 정상인 또는 방광암 환자로부터 소변을 수득한 후, 나노와이어를 추가하여 20분 동안 반응시켜 ctDNA(Circulating tumor DNA)를 분리하였다. 이때, ctDNA는 나노와이어에 붙어 복합체를 이룬다. ctDNA와 나노와이어 복합체를 i) 온도변성 없이 27℃ 온도에서 사용하는 경우와 ii) 95℃ 온도에서 1분 동안 온도변성과정을 거친 후에 사용하는 경우로 나누어 실험을 진행하였다. 그 후, 바이오틴이 표지된 각각의 프로브(biotinylated probe) 및 HRP 및 스트렙타비딘 표지된 폴리피롤 나노입자(HRP/st-tagged NPs)를 추가하여 20분 더 반응시켰다. 이때, 사용된 프로브는 하기 표 20에 나타내었다.
서열정보(5'-> 3') | 서열번호 | |
biotinylated OGT(O-GlcNAc transferase) probe 1 | ATGGCGTCTTCCGTGGGC | 21 |
biotinylated OGT(O-GlcNAc transferase) probe 2 | TGCCCTGTGGCCATGGAC | 22 |
biotinylated FGFR3 probe 1 | AGTGGCGGTGGTGGTGAGGGAG | 65 |
biotinylated FGFR3 probe 2 | CCCACAGCTTCTGCCCCCGA | 66 |
biotinylated FGFR3 probe 3 | GGGCATCCATGGGAGCC | 67 |
biotinylated FGFR3 probe 4 | CAGCGTGGGCCGAGGT | 68 |
biotinylated FGFR3 probe 5 | CCCTGAGATGCTGGGAGCAG | 69 |
biotinylated FGFR3 probe 6 | GTGTGGGAAGGCGGTGTTG | 70 |
biotinylated TP53 probe 1 | GCCCTGACTTTCAACTCTG | 71 |
biotinylated TP53 probe 2 | ACGACAGGGCTGGTTGCC | 72 |
biotinylated TP53 probe 3 | TCCCCAGGCCTCTGATTCC | 73 |
biotinylated TP53 probe 4 | CCTCCAGGTGAGCAGTAG | 74 |
biotinylated TP53 probe 5 | CTTGGGCCTGTGTTATCTC | 75 |
biotinylated TP53 probe 6 | CCCACCTCTTACCGATTT | 76 |
biotinylated TP53 probe 7 | ACAAGGGTGGTTGGGAGTAG | 77 |
biotinylated TP53 probe 8 | GGACAAGAAGCGGTGGAGG | 78 |
biotinylated Cyfra21-1(cytokeratin 19-fragments; KRT19 gene) probe 1 | CTGGCCTCCTACCTGGACAA | 53 |
biotinylated Cyfra21-1(cytokeratin 19-fragments; KRT19 gene) probe 2 | GACCTGGAGATGCAGATCGAA | 54 |
biotinylated Cyfra21-1(cytokeratin 19-fragments; KRT19 gene) probe 3 | GTCGCTGGCCACACGGAGCAG | 55 |
biotinylated NMP22(nuclear matrix protein-22; NUMA1 gene) probe 1 | ATGGCACTGAAGAGGGACAGC | 79 |
biotinylated NMP22(nuclear matrix protein-22; NUMA1 gene) probe 2 | GCCAAGGAAGAGCTGGAGCAG | 80 |
biotinylated NMP22(nuclear matrix protein-22; NUMA1 gene) probe 3 | GAGCAGCTAGAGGTATTTCAG | 81 |
biotinylated NMP22(nuclear matrix protein-22; NUMA1 gene) probe 4 | AGGTAGAATCCCTGGAGAGTC | 82 |
비색 검출을 위해 TMB 및 H2O2를 아세트산 나트륨 버퍼에 추가한 용액을 처리하여 OGT, FGFR3, TP53, NMP22, Cyfra21-1의 발현을 확인하였다. ctDNA 기반 OGT, FGFR3, TP53, NMP22, Cyfra21-1 ctDNA 발현(ΔOD)을 분석한 결과, 방광암 환자에게서 온도변성이 없을 경우 또는 온도변성과정을 거친 경우에 명확한 OGT, FGFR3, TP53, NMP22, Cyfra21-1 ctDNA 발현(ΔOD; cutoff OD > 0.010)이 나타났다. 반면, 정상인 및 방광염증 환자들에게서는 온도변성이 없을 경우 또는 온도변성과정을 거친 경우에도 OGT, FGFR3, TP53, NMP22, Cyfra21-1 ctDNA 발현(ΔOD; cutoff OD > 0.010)이 나타나지 않았다(도 41 내지 도 46).
실시예 3.5. 유방암 환자의 혈장을 이용한 종양 표지자 검출 확인
정상인 또는 유방암 환자로부터 수득한 혈장으로부터 CA27-29, CA15-3, CEA 유방암 종양표지자를 검출하였다. 유방암 표지자로써 CA27-29, CA15-3, CEA 는 유방암 환자에게서 높이 발현되며, 현재 암조직 및 혈액 검사를 통하여 유방암 항원(CA27-29, CA15-3, CEA)의 수치를 확인함으로 유방암 감별에 사용되고 있다.
구체적으로, 정상인 또는 유방암 환자로부터 혈장을 수득한 후, 나노와이어를 추가하여 20분 동안 반응시켜 ctDNA(Circulating tumor DNA)를 분리하였다. 이때, ctDNA는 나노와이어에 붙어 복합체를 이룬다. ctDNA와 나노와이어 복합체를 i) 온도변성 없이 27℃ 온도에서 사용하는 경우와 ii) 95℃ 온도에서 1분 동안 온도변성과정을 거친 후에 사용하는 경우로 나누어 실험을 진행하였다. 그 후, 바이오틴이 표지된 각각의 프로브(biotinylated probe) 및 HRP 및 스트렙타비딘 표지된 폴리피롤 나노입자(HRP/st-tagged NPs)를 추가하여 20분 더 반응시켰다. 이때, 사용된 프로브는 하기 표 21에 나타내었다.
서열정보(5'-> 3') | 서열번호 | |
biotinylated CA27.29/CA15-3(Carcinoma Antigen 15-3; MUC1 gene) probe 1 | GCGCCTGCCTGAATCTGTTCT | 83 |
biotinylated CA27.29/CA15-3(Carcinoma Antigen 15-3; MUC1 gene) probe 2 | TTCTGGGCCTCTCCAATATTA | 84 |
biotinylated CA27.29/CA15-3(Carcinoma Antigen 15-3; MUC1 gene) probe 3 | GGATACCTACCATCCTATGAG | 85 |
biotinylated CEA(Prostatic Acid Phosphatase; ACPP gene) probe 1 | AATCTGAACCTCTCCTGCCAC | 23 |
biotinylated CEA(Prostatic Acid Phosphatase; ACPP gene) probe 2 | ACCCTTCATCACCAGCAACAA | 24 |
biotinylated CEA(Prostatic Acid Phosphatase; ACPP gene) probe 3 | TATTCTTGGCTGATTGATGGG | 25 |
biotinylated CEA(Prostatic Acid Phosphatase; ACPP gene) probe 4 | CAGCAACAACTCCAAACCCGT | 26 |
비색 검출을 위해 TMB 및 H2O2를 아세트산 나트륨 버퍼에 추가한 용액을 처리하여 CA27-29, CA15-3, CEA의 발현을 확인하였다. ctDNA 기반 CA27-29, CA15-3, CEA ctDNA 발현(ΔOD)을 분석한 결과, 유방암 환자에게서 온도변성이 없을 경우 또는 온도변성과정을 거친 경우에 명확한 CA27-29, CA15-3, CEA ctDNA 발현(ΔOD; cutoff OD > 0.010)이 나타났다. 반면, 정상인에게서는 온도변성이 없을 경우 또는 온도변성과정을 거친 경우에도 CA27-29, CA15-3, CEA ctDNA 발현(ΔOD; cutoff OD > 0.010)이 나타나지 않았다(도 47 내지 도 50).
실시예 3.6. 대장암 환자의 혈장을 이용한 종양 표지자 검출 확인
정상인 또는 대장암 환자로부터 수득한 혈장으로부터 CEA, CA19-9 대장암 종양표지자를 검출하였다. 대장암 표지자로써 CEA, CA19-9는 대장암 환자에게서 높이 발현되며, 현재 암조직 및 혈액 검사를 통하여 대장암 항원(CEA, CA19-9)의 수치를 확인함으로 대장암 감별에 사용되고 있다.
구체적으로, 정상인 또는 대장암 환자로부터 혈장을 수득한 후, 나노와이어를 추가하여 20분 동안 반응시켜 ctDNA(Circulating tumor DNA)를 분리하였다. 이때, ctDNA는 나노와이어에 붙어 복합체를 이룬다. ctDNA와 나노와이어 복합체를 i) 온도변성 없이 27℃ 온도에서 사용하는 경우와 ii) 95℃ 온도에서 1분 동안 온도변성과정을 거친 후에 사용하는 경우로 나누어 실험을 진행하였다. 그 후, 바이오틴이 표지된 각각의 프로브(biotinylated probe) 및 HRP 및 스트렙타비딘 표지된 폴리피롤 나노입자(HRP/st-tagged NPs)를 추가하여 20분 더 반응시켰다. 이때, 사용된 프로브는 하기 표 22에 나타내었다.
서열정보(5'-> 3') | 서열번호 | |
biotinylated CEA(Prostatic Acid Phosphatase; ACPP gene) probe 1 | AATCTGAACCTCTCCTGCCAC | 23 |
biotinylated CEA(Prostatic Acid Phosphatase; ACPP gene) probe 2 | ACCCTTCATCACCAGCAACAA | 24 |
biotinylated CEA(Prostatic Acid Phosphatase; ACPP gene) probe 3 | TATTCTTGGCTGATTGATGGG | 25 |
biotinylated CEA(Prostatic Acid Phosphatase; ACPP gene) probe 4 | CAGCAACAACTCCAAACCCGT | 26 |
biotinylated CA19-9(FLU3 gene) probe 1 | GATCATCACGGCACGGTC | 30 |
biotinylated CA19-9(FLU3 gene) probe 2 | GTGCAGAGAGATCATCACGGC | 31 |
biotinylated CA19-9(FLU3 gene) probe 3 | TCTCTCTTACCTGGGACCTCA | 32 |
비색 검출을 위해 TMB 및 H2O2를 아세트산 나트륨 버퍼에 추가한 용액을 처리하여 CEA, CA19-9의 발현을 확인하였다. ctDNA 기반 CEA, CA19-9 ctDNA 발현(ΔOD)을 분석한 결과, 대장암 환자에게서 온도변성이 없을 경우 또는 온도변성과정을 거친 경우에 명확한 CEA, CA19-9 ctDNA 발현(ΔOD; cutoff OD > 0.010)이 나타났다. 반면, 정상인에게서는 온도변성이 없을 경우와 온도변성과정을 거친 경우에도 CEA, CA19-9 ctDNA 발현(ΔOD; cutoff OD > 0.010)이 나타나지 않았다(도 51 내지 도 55).
실시예 3.7. 담도암 환자의 혈장을 이용한 종양 표지자 검출 확인
정상인 또는 담도암 환자로부터 수득한 혈장으로부터 CEA, CA19-9, CA125 담도암 종양표지자를 검출하였다. 담도암 표지자로써 CA19-9, CA125, CEA 는 담도암 환자에게서 높이 발현되며, 혈액 검사를 통하여 담도암 항원(CA19-9, CA125, CEA)의 수치를 확인함으로 담도암 감별에 사용될 수 있다.
구체적으로, 정상인 또는 담도암 환자로부터 혈장을 수득한 후, 나노와이어를 추가하여 20분 동안 반응시켜 ctDNA(Circulating tumor DNA)를 분리하였다. 이때, ctDNA는 나노와이어에 붙어 복합체를 이룬다. ctDNA와 나노와이어 복합체를 i) 온도변성 없이 27℃ 온도에서 사용하는 경우와 ii) 95℃ 온도에서 1분 동안 온도변성과정을 거친 후에 사용하는 경우로 나누어 실험을 진행하였다. 그 후, 바이오틴이 표지된 각각의 프로브(biotinylated probe) 및 HRP 및 스트렙타비딘 표지된 폴리피롤 나노입자(HRP/st-tagged NPs)를 추가하여 20분 더 반응시켰다. 이때, 사용된 프로브는 하기 표 23에 나타내었다.
서열정보(5'->3') | 서열번호 | |
biotinylated CEA(Prostatic Acid Phosphatase; ACPP gene) probe 1 | AATCTGAACCTCTCCTGCCAC | 23 |
biotinylated CEA(Prostatic Acid Phosphatase; ACPP gene) probe 2 | ACCCTTCATCACCAGCAACAA | 24 |
biotinylated CEA(Prostatic Acid Phosphatase; ACPP gene) probe 3 | TATTCTTGGCTGATTGATGGG | 25 |
biotinylated CEA(Prostatic Acid Phosphatase; ACPP gene) probe 4 | CAGCAACAACTCCAAACCCGT | 26 |
biotinylated CA19-9(FLU3 gene) probe 1 | GATCATCACGGCACGGTC | 30 |
biotinylated CA19-9(FLU3 gene) probe 2 | GTGCAGAGAGATCATCACGGC | 31 |
biotinylated CA19-9(FLU3 gene) probe 3 | TCTCTCTTACCTGGGACCTCA | 32 |
biotinylated CA125(MUC16 gene) probe 1 | CTGGAACTGATTCTATCAACC | 33 |
biotinylated CA125(MUC16 gene) probe 2 | TGTGGCAGAAACCAGCTATCC | 34 |
biotinylated CA125(MUC16 gene) probe 3 | GAGGTCCTGAGGATGTGTCAT | 35 |
비색 검출을 위해 TMB 및 H2O2를 아세트산 나트륨 버퍼에 추가한 용액을 처리하여 CEA, CA19-9, CA125의 발현을 확인하였다. ctDNA 기반 CEA, CA19-9, CA125 ctDNA 발현(ΔOD)을 분석한 결과, 담도암 환자에게서 온도변성이 없을 경우 또는 온도변성과정을 거친 경우에 명확한 CEA, CA19-9, CA125 ctDNA 발현(ΔOD; cutoff OD > 0.010)이 나타났다. 반면, 정상인에게서는 온도변성이 없을 경우와 온도변성과정을 거친 경우에도 CEA, CA19-9, CA125 ctDNA 발현(ΔOD; cutoff OD > 0.010)이 나타나지 않았다(도 56 내지 도 58).
실시예 3.8. 위암 환자의 혈장을 이용한 종양 표지자 검출 확인
정상인 또는 위암 환자로부터 수득한 혈장으로부터 CEA, CA19-9, CGB, Cyfra21-1 위암 종양표지자를 검출하였다. 위암 표지자로써 CEA, CA19-9, CGB, Cyfra21-1는 위암 환자에게서 높이 발현되며, 혈액 검사를 통하여 위암 항원(CEA, CA19-9, CGB, Cyfra21-1)의 수치를 확인함으로 위암 감별에 사용될 수 있다.
구체적으로, 정상인 또는 위암 환자로부터 혈장을 수득한 후, 나노와이어를 추가하여 20분 동안 반응시켜 ctDNA(Circulating tumor DNA)를 분리하였다. 이때, ctDNA는 나노와이어에 붙어 복합체를 이룬다. ctDNA와 나노와이어 복합체를 i) 온도변성 없이 27℃ 온도에서 사용하는 경우와 ii) 95℃ 온도에서 1분 동안 온도변성과정을 거친 후에 사용하는 경우로 나누어 실험을 진행하였다. 그 후, 바이오틴이 표지된 각각의 프로브(biotinylated probe) 및 HRP 및 스트렙타비딘 표지된 폴리피롤 나노입자(HRP/st-tagged NPs)를 추가하여 20분 더 반응시켰다. 이때, 사용된 프로브는 하기 표 24에 나타내었다.
서열정보(5'-> 3') | 서열번호 | |
biotinylated CEA(Prostatic Acid Phosphatase; ACPP gene) probe 1 | AATCTGAACCTCTCCTGCCAC | 23 |
biotinylated CEA(Prostatic Acid Phosphatase; ACPP gene) probe 2 | ACCCTTCATCACCAGCAACAA | 24 |
biotinylated CEA(Prostatic Acid Phosphatase; ACPP gene) probe 3 | TATTCTTGGCTGATTGATGGG | 25 |
biotinylated CEA(Prostatic Acid Phosphatase; ACPP gene) probe 4 | CAGCAACAACTCCAAACCCGT | 26 |
biotinylated CA19-9(FLU3 gene) probe 1 | GATCATCACGGCACGGTC | 30 |
biotinylated CA19-9(FLU3 gene) probe 2 | GTGCAGAGAGATCATCACGGC | 31 |
biotinylated CA19-9(FLU3 gene) probe 3 | TCTCTCTTACCTGGGACCTCA | 32 |
biotinylated Beta-HCG(human chorionic gonadotropin; CGB gene) probe 1 | TGCTGAGCATGGGCGGGACAT | 86 |
biotinylated Beta-HCG(human chorionic gonadotropin; CGB gene) probe 2 | TGGCTCTCAGCTGTCAATGTG | 87 |
biotinylated Cyfra21-1(cytokeratin 19-fragments; KRT19 gene) probe 1 | CTGGCCTCCTACCTGGACAA | 53 |
biotinylated Cyfra21-1(cytokeratin 19-fragments; KRT19 gene) probe 2 | GACCTGGAGATGCAGATCGAA | 54 |
biotinylated Cyfra21-1(cytokeratin 19-fragments; KRT19 gene) probe 3 | GTCGCTGGCCACACGGAGCAG | 55 |
비색 검출을 위해 TMB 및 H2O2를 아세트산 나트륨 버퍼에 추가한 용액을 처리하여 CEA, CA19-9, CGB, Cyfra21-1의 발현을 확인하였다. ctDNA 기반 CEA, CA19-9, CGB, Cyfra21-1 ctDNA 발현(ΔOD)을 분석한 결과, 위암 환자에게서 온도변성이 없을 경우 또는 온도변성과정을 거친 경우에 명확한 CEA, CA19-9, CGB, Cyfra21-1 ctDNA 발현(ΔOD; cutoff OD > 0.010)이 나타났다. 반면, 정상인에게서는 온도변성이 없을 경우와 온도변성과정을 거친 경우에도 CEA, CA19-9, CGB, Cyfra21-1 ctDNA 발현(ΔOD; cutoff OD > 0.010)이 나타나지 않았다(도 59 내지 도 61).
실시예 3.9. 췌장암 환자의 혈장을 이용한 종양 표지자 검출 확인
정상인 또는 췌장암 환자로부터 수득한 혈장으로부터 CA19-9, CA125, CEA 췌장암 종양표지자를 검출하였다.
구체적으로, 정상인 또는 췌장암 환자로부터 혈장을 수득한 후, 나노와이어를 추가하여 20분 동안 반응시켜 ctDNA(Circulating tumor DNA)를 분리하였다. 이때, ctDNA는 나노와이어에 붙어 복합체를 이룬다. ctDNA와 나노와이어 복합체를 i) 온도변성 없이 27℃ 온도에서 사용하는 경우와 ii) 95℃ 온도에서 1분 동안 온도변성과정을 거친 후에 사용하는 경우로 나누어 실험을 진행하였다. 그 후, 바이오틴이 표지된 각각의 프로브(biotinylated probe) 및 HRP 및 스트렙타비딘 표지된 폴리피롤 나노입자(HRP/st-tagged NPs)를 추가하여 20분 더 반응시켰다. 이때, 사용된 프로브는 하기 표 25에 나타내었다.
서열정보(5'->3') | 서열번호 | |
biotinylated CEA(Prostatic Acid Phosphatase; ACPP gene) probe 1 | AATCTGAACCTCTCCTGCCAC | 23 |
biotinylated CEA(Prostatic Acid Phosphatase; ACPP gene) probe 2 | ACCCTTCATCACCAGCAACAA | 24 |
biotinylated CEA(Prostatic Acid Phosphatase; ACPP gene) probe 3 | TATTCTTGGCTGATTGATGGG | 25 |
biotinylated CEA(Prostatic Acid Phosphatase; ACPP gene) probe 4 | CAGCAACAACTCCAAACCCGT | 26 |
biotinylated CA19-9(FLU3 gene) probe 1 | GATCATCACGGCACGGTC | 30 |
biotinylated CA19-9(FLU3 gene) probe 2 | GTGCAGAGAGATCATCACGGC | 31 |
biotinylated CA19-9(FLU3 gene) probe 3 | TCTCTCTTACCTGGGACCTCA | 32 |
비색 검출을 위해 TMB 및 H2O2를 아세트산 나트륨 버퍼에 추가한 용액을 처리하여 CEA, CA19-9, CA125의 발현을 확인하였다. ctDNA 기반 CEA, CA19-9, CA125 ctDNA 발현(ΔOD)을 분석한 결과, 췌장암 환자에게서 온도변성이 없을 경우에 명확한 CEA, CA19-9, CA125 ctDNA 발현(ΔOD; cutoff OD > 0.010)이 나타났다. 반면, 정상인에게서는 온도변성이 없을 경우에 CEA, CA19-9, CA125 ctDNA 발현(ΔOD; cutoff OD > 0.010)이 나타나지 않았다(도 62 내지 도 69).
IV. 암 조기진단 및 예후예측을 위한 종양 표지자 검출 평가
실시예 4. 암환자 유래 바이오마커 검출
실시예 4.1. 암환자의 혈장 또는 소변을 이용한 CPT1A 검출
정상인 또는 폐암 환자로부터 수득한 혈장 및 소변으로부터 CPT1A(Carnitine palmitoyltransferase 1A)을 검출하였다. 또한, 방광암 환자로부터 수득한 소변으로부터 CPTA1을 검출하였다. 암조직에서 CPT1A의 발현은 정상조직보다 현저하게 증가하는 것으로 알려져 있어 암의 진단표적으로 활용가능하다.
구체적으로, 상기 수득한 혈장 또는 소변을 수득한 후, 나노와이어를 추가하여 20분 동안 반응시켜 ctDNA(Circulating tumor DNA)를 분리하였다. 이때, ctDNA는 나노와이어에 붙어 복합체를 이룬다. ctDNA와 나노와이어 복합체를 i) 온도변성 없이 27℃ 온도에서 사용하는 경우와 ii) 95℃ 온도에서 1분 동안 온도변성과정을 거친 후에 사용하는 경우로 나누어 실험을 진행하였다. 그 후, 바이오틴이 표지된 각각의 프로브(biotinylated probe) 및 HRP 및 스트렙타비딘 표지된 폴리피롤 나노입자(HRP/st-tagged NPs)를 추가하여 20분 더 반응시켰다. 이때, 사용된 프로브는 하기 표 26에 나타내었다.
서열정보(5'->3') | 서열번호 | |
biotinylated CPT1A probe 1 | GAGCCATGAAGCTCTTAGACA | 88 |
biotinylated CPT1A probe 2 | CTTCCAGACATCGCTGCCTCG | 89 |
biotinylated CPT1A probe 3 | TGGACAATACCTCGGAGCCTC | 90 |
biotinylated CPT1A probe 4 | CATGACCCGGCTCTTCCGAGA | 91 |
비색 검출을 위해 TMB 및 H2O2를 아세트산 나트륨 버퍼에 추가한 용액을 처리하여 CPT1A의 발현을 확인하였다. ctDNA 기반 CPT1A ctDNA 발현(ΔOD)을 분석한 결과, 폐암 또는 방광암 환자에게서 온도변성이 없을 경우 또는 온도변성과정을 거친 경우에 명확한 CPT1A ctDNA 발현(ΔOD; cutoff OD > 0.010)이 나타났다. 반면, 정상인에게서는 온도변성이 없을 경우와 온도변성과정을 거친 경우에도 CPT1A ctDNA 발현(ΔOD; cutoff OD > 0.010)이 나타나지 않았다(도 70 내지 73).
실시예 4.2. 암세포주를 이용한 IFN-γ, IFN-γ receptor 및 PD-L1 발현 확인
ATCC 및 한국세포주은행으로부터 입수한 PD-L1 양성 암세포주로 알려진 MDA-MB-231, HCC827, H1975, PC9 및 H460 암세포주와 PD-L1 음성 암세포주로 알려진 A549, MDA-MB-461, HeLa 및 MCF7 암세포주를 이용하여 IFN-γ, IFN-γ receptor 및 PD-L1 검출 정확도를 평가하였다. 이때, PD-L1 양성 암세포주 및 PD-L1 음성 암세포주는 CCLE(Cancer Cell Line Encyclopedia)에서 제공하는 각 암세포주의 PD-L1의 mRNA 레벨을 기준으로 분류하였다. 100 ㎜ 디쉬에 1x106개의 같은 세포를 배양한 후에 한 디쉬는 10 nmol INF-γ를 추가하고, 다른 디쉬는 IFN-γ를 처리하지 않은채 하루동안 배양시킨 후, PD-L1 양성 암세포주 및 PD-L1 음성 암세포주에서 유전체(genomic) DNA를 추출하였다.
그 후, 음파처리하여 200 bp이하로 fDNA 형태로 만들었다. 50 ng/㎕ fDNA를 PBS에 넣은 후, 나노와이어를 추가하여 20분 동안 반응시켜 분리하였다. 그 후, 95℃ 온도에서 1분 동안 온도변성과정을 거친 후에, 바이오틴이 표지된 프로브(Biotinylated probe) 및 스트렙타비딘 표지된 폴리피롤 나노입자(HRP/st-tagged NPs)를 추가하여 20분 더 반응시켰다. 이때, 사용된 프로브는 하기 표 27에 나타내었다.
서열정보(5'->3') | 서열번호 | |
Biotinylated PD-L1 probe 1 | TGGGAGCCATCTTATTATGCC | 1 |
Biotinylated PD-L1 probe 2 | CGGAAGATGAATGTCAGTGC | 2 |
Biotinylated PD-L1 probe 3 | CCTACTGGCATTTGCTGAACG | 3 |
Biotinylated PD-L1 probe 4 | ACCATAGCTGATCATGCAGCG | 4 |
Biotinylated IFN-γ probe 1 | ATCGTATATTGGGAGTACCAG | 92 |
Biotinylated IFN-γ probe 2 | TAAATGGAGACGAGCAGGAAG | 93 |
Biotinylated IFN-γ probe 3 | TAGTGCTTAGCCTGGTATTCA | 94 |
Biotinylated PD1 probe 1 | GTACCGCATGAGCCCCAGCAA | 95 |
Biotinylated PD1 probe 2 | GTTCCAAACCCTGGTGGTTGG | 96 |
Biotinylated PD1 probe 3 | GAGCAGACGGAGTATGCCAC | 97 |
Biotinylated IFN-γreceptor probe 1 | ATCGTATATTGGGAGTACCAG | 98 |
Biotinylated IFN-γ receptor probe 2 | TAAATGGAGACGAGCAGGAAG | 99 |
Biotinylated IFN-γ receptor probe 3 | TAGTGCTTAGCCTGGTATTCA | 100 |
비색 검출을 위해 TMB 및 H2O2를 아세트산 나트륨 버퍼에 추가한 용액을 처리하여 IFN-γ, IFN-γ receptor 및 PD-L1 검출 결과를 확인하였다. 먼저, IFN-γ를 추가하지 않은 암세포주들의 DNA 기반 PD-L1 발현(ΔOD)을 분석한 결과, 3번의 실험 모두에게서 MDA-MB-231, HCC827, H1975, PC9, H460 암세포주의 경우에만 fDNA에서 명확한 PD-L1 DNA 발현(cutoff: OD > 0.6)이 나타났다. 반면, A549, MDA-MB-461, HeLa, MCF7 암세포주들에게서는 3번의 실험 모두에게서 PD_L1 DNA 발현이 나타나지 않았다(도 74 내지 도 76).그러나, IFN-γ를 추가한 경우에 암세포주들의 DNA 기반 PD-L1 발현(ΔOD)을 분석한 결과, 3번의 실험 모두에게서 MDA-MB-231, HCC827, H1975, PC9, H460 PD-L1 양성 암세포주뿐만 아니라, PD-L1 음성 암세포주, 즉 A549, MDA-MB-461, HeLa, MCF7들에게서도 fDNA 기반 명확한 PD-L1 DNA 발현(cutoff: OD > 0.6)이 나타났다(도 77). 또한, MDA-MB-231, HCC827, H1975, PC9, H460의 PD-L1 양성 암세포주 및 PD-L1 음성 암세포주, 즉 A549, MDA-MB-461, HeLa, MCF7들의 fDNA를 통해 IFN-γ및 IFN-γ receptor를 확인한 결과, 3번의 실험 모두에게서 IFN-γ를 추가 여부에 관계없이 IFN-γ는 확인되지 않았으며, IFN-γ receptor는 모든 세포주에서 확인되었다(도 78 및 도 79).나아가, IFN-γ를 추가하지 않은 경우 및 IFN-γ를 추가한 경우에, MDA-MB-231, HCC827, H1975, PC9, H460의 PD-L1 양성 암세포주 및 A549, MDA-MB-461, HeLa, MCF7의 PD-L1 음성 암세포주들의 fDNA를 통해 PD-L1, IFN-γ및 IFN-γ receptor를 3번의 반복실험을 통하여 분석한 그래프에서 IFN-γ를 추가한 경우 PD-L1 음성 암세포주들에게서 높은 PD-L1 발현을 확인한 반면, IFN-γ 추가 여부에 관계없이 IFN-γ는 확인되지 않았으며, IFN-γ receptor는 모든 세포주에서 확인되었다(도 80 내지 도 83).
PD-L1 양성 및 음성 암세포주에 IFN-γ를 추가하기 전 및 추가한 후에 암세포주들의 DNA 기반 PD-L1 발현(ΔOD)을 분석한 그래프를 나타내었다(도 80 내지 도 83).
V. 수득 방법에 따른 암 관련 cfDNA의 검출 가능성 확인
실시예 5. 샘플 채취에 방법 따른 바이오마커 검출 확인
상술한 방법과 동일한 방법으로 폐암 환자 및 정상인에서 cfDNA를 검출하였다. 다만, 채취 방법은 주사바늘을 이용하여 정맥혈에서 채취하고, 랜싯(Lancet)을 이용하여 모세혈에서 채취하였다. 사용한 나노와이어 및 프로브는 제조예 1과 제조예 3에 따라 제조한 것을 사용하였다. 주사바늘을 이용해 폐암환자로부터 수득한 혈액으로부터 AKL Fusion 및 PIK3CA 등의 암 관련 바이오 마커의 DNA 발현 정도를 나타내었다(도 86). 또한, 랜싯을 이용해 폐암환자로부터 수득한 혈액으로부터 AKL Fusion 및 PIK3CA 등의 암 관련 바이오 마커의 DNA 발현 정도를 나타내었다(도 87). 주사바늘을 이용해 정상인으로부터 수득한 혈액으로부터 AKL Fusion 및 PIK3CA 등의 암 관련 바이오 마커의 DNA 발현 정도를 나타내었다(도 88). 또한, 랜싯을 이용해 정상인으로부터 수득한 혈액으로부터 AKL Fusion 및 PIK3CA 등의 암 관련 바이오 마커의 DNA 발현 정도를 측정하였다(도 89). 그 결과, 정맥혈과 모세혈에서 동일하게 암 유래의 바이오마커를 검출할 수 있음을 확인하였다.
VI. 폐암 관련 cfDNA의 검출 가능성 확인
실시예 6. 폐암 세포주에서 돌연변이 바이오마커 검출 확인
암 특이적 유전자에서 발생하는 돌연변이(snp)의 여부는 특정 치료방법에 대한 resistance 가 존재하는지 혹은 resistance를 갖게 되는 지의 여부를 확인하고, 그에 따라 적절한 치료방법을 찾는데 유용한 정보를 제공한다.
폐암 세포주의 돌연변이도 검출가능한지 확인하기 위하여 EML4-ALK 유전자를 분석하였다. 먼저, 발현량을 확인하기 위하여 RT-PCR로 EML4-ALK 유전자의 발현량을 확인하였다. EML4-ALK variant 3a/b positive cell(H2228) 및 EML4-ALK negative cell(A549, H1993, PC9, RT4) 암세포주의 cfDNA로부터 EML4-ALK의 발현 정도를 RT-PCR을 통해 확인하였다(도 90). 또한, EML4-ALK variant 3a/b positive cell(H2228) 및 EML4-ALK negative cell(A549, H1993, PC9, RT4) 암세포주의 cfDNA로부터 EML4-ALK의 발현 정도를 웨스턴 블랏을 통해 확인하였다(도 91). 또한, EML4-ALK variant 3a/b positive cell(H2228) 및 EML4-ALK negative cell(A549, H1993, PC9, RT4) 암세포주의 cfDNA로부터 EML4-ALK의 발현 정도를 RT-PCR 및 웨스턴 블랏을 통해 확인한 결과를 나타내었다(도 92).
그 후, 본 명세서에서 기술한 fDNA를 이용한 방법으로 EML4-ALK를 검출하였다. 검출 방법은 상술한 방법과 동일한 방법으로 수행하였다. 그 결과, EML4-ALK도 fDNA 검출방법을 이용하여 검출 가능함을 확인하였다. EML4-ALK variant 3a/b positive cell(H2228) 및 EML4-ALK negative cell(A549, H1993, PC9, RT4) 암세포주의 cfDNA로부터 EML4-ALK fusion var.1 또는 EML4-ALK fusion var.3의 DNA 발현 정도를 측정하여 나타내었다(도 93). 또한, EML4-ALK variant 3a/b positive cell(H2228) 및 EML4-ALK negative cell(A549, H1993, PC9, RT4) 암세포주의 cfDNA로부터 EML4-ALK fusion var.1 또는 EML4-ALK fusion var.3의 DNA 발현 정도를 측정하여 나타내었다(도 94).
EGFR | Probe sequences |
KRAS exon2-probe | CP1: AAATGACTGAATATAAACTTG (서열번호 127)DP: GAGTGCCTTGACGATACAGCT (서열번호 128) |
ALK-EML4 variant 1-probe | CP2: TAGAGCCCACACCTGGGAAA (서열번호 129)DP: CGGAGCTTGCTCAGCTTGTA (서열번호 130) |
ALK-EML4 variant 3-probe | CP3: GCATAAAGATGTCATCATCAACCAAG (서열번호 131)DP: CGGAGCTTGCTCAGCTTGTA (서열번호 132) |
실시예 7. 폐암 환자에서 돌연변이 바이오마커 검출 확인 : 약물 저항성
상술한 방법과 동일하게 폐암 환자에서 다양한 돌연변이를 검출하였다. 이때, 폐암 환자의 cfDNA를 검출하기 위한 프로브는 상술한 폐암 바이오마커 유전자에 상보적으로 결합하는 핵산 서열을 이용하였다. 환자 정보 및 분석 유전자는 도면에 기술한 바와 같다.
구체적으로, 소세포폐암 환자로부터 수득한 혈액으로부터 EML4-ALK fusion var.3, KRAS, SYP, NCAM1, NKX2-1 등의 암 관련 바이오 마커의 DNA 발현 정도를 측정하였다(도 95). 그 결과, EML4-ALK fusion이 암조직과 혈액 내 ctDNA에서 동일하게 발견되고, ctDNA 결과로 EML4-ALK fusion이 var.1이 아닌 var.3임을 알게됨으로써, ALK TKI인 Crizotinib이 잘 반응하지 않는다는 것을 알게되었다.
또한, 암 환자로부터 수득한 혈액으로부터 EML4-ALK fusion var.1 등의 암 관련 바이오 마커의 DNA 발현 정도를 측정하였다(도 96). 그 결과, EML4-ALK fusion이 암 조직과 혈액 내 ctDNA에서 동일하게 발견되고, ctDNA 결과로 EML4-ALK fusion이 var.3가 아닌 var.1임을 알게됨으로써, ALK TKI인 Crizotinib이 잘 반응하여 partial response (PR)의 환자 반응을 얻게 되었다.
또한, 암 환자로부터 수득한 혈액으로부터 EML4-ALK fusion var.3 등의 암 관련 바이오 마커의 DNA 발현 정도를 측정하였다(도 97). 그 결과, EML4-ALK fusion이 암조직과 혈액 내 ctDNA에서 동일하게 발견되고, ctDNA 결과로 EML4-ALK fusion이 var.1이 아닌 var.3임을 알게됨으로써, ALK TKI인 Crizotinib이 잘 반응하지 않을 것이기 때문에, 처음부터 alectinib을 처방하여 환자의 반응을 기다리고 있다.
또한, 암 환자로부터 수득한 혈액으로부터 EML4-ALK fusion var.3, BRAFV800E, TP53 등의 암 관련 바이오 마커의 DNA 발현 정도를 측정하였다(도 98). 그 결과, EML4-ALK fusion이 암조직과 혈액 내 ctDNA에서 동일하게 발견되고, ctDNA 결과로 EML4-ALK fusion이 var.1이 아닌 var.3임을 알게됨으로써, ALK TKI인 Crizotinib이 잘 반응하지 않는다는 것(PD)을 알게 되었다.
또한, 암 환자로부터 수득한 혈액으로부터 EML4-ALK fusion var.1 등의 암 관련 바이오 마커의 DNA 발현 정도를 측정하였다(도 99). 그 결과, EML4-ALK fusion 이 암조직과 혈액 내 ctDNA에서 동일하게 발견되고, ctDNA 결과로 EML4-ALK fusion이 var.3가 아닌 var.1임을 알게됨으로써, ALK TKI인 Crizotinib이 잘 반응하여 partial response (PR)의 환자 반응을 얻게 되었다.
또한, 암 환자로부터 수득한 혈액으로부터 EML4-ALK fusion var.1 등의 암 관련 바이오 마커의 DNA 발현 정도를 측정하였다(도 100). 그 결과, EML4-ALK fusion 이 암조직과 혈액 내 ctDNA에서 동일하게 발견되고, ctDNA 결과로 EML4-ALK fusion이 var.3가 아닌 var.1임을 알게됨으로써, ALK TKI가 잘 반응하여 partial response(PR)의 환자 반응을 얻게 되었다.
VII. OGT 검출을 통한 방광암 진단 가능성 확인
실시예 8. 암세포주 유래의 OGT에서 발현량 및 fDNA 검출 가능성 확인
암 세포주에서 OGT의 발현량 및 환자 혈장에서 검출 가능성을 확인하기 위하여 상술한 방법과 동일한 방법으로 in vitro 실험 및 환자 혈액 샘플을 이용하여 실험하였다. 도 101에는 in vitro 상에서 각 암세포주의 cfDNA로부터 OGT의 단백질 발현 정도를 웨스턴 블랏을 통해 확인한 결과를 나타내었다. 또한, 도 102에는 in vitro 상에서 각 암세포주의 cfDNA로부터 OGT의 mRNA 발현 정도를 RT-PCR을 통해 확인한 결과를 나타내었다. 도 103에는 in vitro 상에서 각 암세포주의 cfDNA로부터 OGT의 mRNA 발현 정도를 RT-PCR을 통해 확인한 결과를 나타내었다. 도 104에는 in vitro 상에서 각 세포주의 cfDNA로부터 OGT의 DNA 발현 정도를 측정한 결과를 나타내었다. 도 105에는 in vitro 상에서 각 세포주의 cfDNA로부터 OGT의 DNA 발현 정도를 측정한 결과를 나타내었다. 도 106에는 in vitro 상에서 각 세포주로부터 OGT의 발현 정도를 웨스턴블랏, RT-PCR 및 cfDNA 검출을 통해 확인한 결과를 나타내었다. 도 107에는 in vitro 상에서 각 세포주로부터 자성 나노입자를 포함하지 않은 나노와이어에 검출된 OGT의 cfDNA를 촬영한 사진을 나타내었다.
실시예 9. OGT 유래 cfDNA 검출 확인
상술한 바와 동일한 본 발명의 검출 방법을 이용하여 방광암 환자의 진단 가능성을 확인하였다. 그 결과는 도 108 내지 도 113에 나타내었다. 도 108에는 정상인, 방광염 환자 및 방광암 환자의 소변으로부터 수득한 cfDNA를 정량한 그래프를 나타내었다. 도 109에는 정상인, 방광염 환자 및 방광암 환자의 소변으로부터 수득한 cfDNA로부터 OGT의 DNA 발현 정도를 분석한 결과를 나타내었다. 도 110에는 정상인, 방광염 환자 및 방광암 환자의 소변으로부터 수득한 cfDNA로부터 OGT의 DNA 발현 정도를 분석한 결과를 나타내었다. 도 111 내지 도 113에는 블라인드 테스트로 여러 암 환자의 소변으로부터 수득한 cfDNA로부터 OGT의 DNA 발현 정도를 분석한 결과를 나타내었다. 그 결과, 상술한 방법을 이용하여 OGT의 검출하여, 방광암을 진단할 수 있음을 확인하였다.
VIII. 각종 암 진단 가능성 확인
실시예 10. 갑상선암 진단 가능성 확인
상술한 바와 동일한 방법을 이용하여, 환자의 cfDNA를 검출하여 갑상선암의 진단이 가능한지 확인하였다. 도 114 내지 도 116에는 갑상선암 환자의 조직으로부터 수득한 cfDNA로부터 BRAF V600E 및 TERT C250T의 DNA 발현 정도를 분석한 결과를 나타내었다. 분석 결과, 본 발명의 분석법을 통해 갑상선암을 정확하게 진단할 수 있음을 확인하였다.
실시예 11. 소세포폐암(SCLC) 진단 가능성 확인
상술한 바와 동일한 방법을 이용하여, 소세포폐암 환자로부터 수득한 혈액을 이용해 SYP, CgA, NCAM1, NKX2-1 등의 암 관련 바이오 마커를 분석하였다(도 117 내지 도 121). 환자 정보 및 샘플 정보는 도면에 나타낸 바와 같다. 분석 결과, 본 발명의 분석법을 통해 소세포폐암을 정확하게 진단할 수 있음을 확인하였다.
실시예 12. 비소세포폐암(NSCLC) 진단 가능성 확인
상술한 바와 동일한 방법을 이용하여, 비소세포폐암 환자로부터 수득한 혈액을 이용해, SYP, CgA, NCAM1, NKX2-1의 바이오마커를 분석하였다(도 122). 환자 정보 및 샘플 정보는 도면에 나타낸 바와 같다. 분석 결과, 본 발명의 분석법을 통해 비소세포폐암을 정확하게 진단할 수 있음을 확인하였다.
실시예 13. 항암 치료 전후에 따른 바이오마커 검출 비교
상술한 바와 동일한 방법을 이용하여, 항암 치료 전과 후의 폐암환자로부터 수득한 혈액을 이용해 CEA의 DNA 발현 정도 및 환자의 예후를 나타낸 결과이다(도 123). 분석 결과, 본 발명의 분석법을 통해 암 치료 후 예후를 정확하게 확인할 수 있음을 확인하였다.
실시예 14. 폐암 진단 가능성 확인
상술한 바와 동일한 방법을 이용하여, 폐암 환자로부터 수득한 혈액을 이용해 NSE, CEA 등의 암 관련 바이오 마커를 분석한 결과를 나타낸 것이다(도 124 내지 도 128). 또한, 정상인으로부터 수득한 혈액을 이용해 NSE, CEA 등의 암 관련 바이오 마커를 분석한 결과를 나타낸 것이다(도 129 내지 도 133). 분석 결과, 본 발명의 분석법을 통해 폐암을 정확하게 진단할 수 있음을 확인하였다.
실시예 15. 전립선암 진단 가능성 확인
상술한 바와 동일한 방법을 이용하여, 전립선암 환자로부터 수득한 혈액을 이용해 PSA, PSMA, PAP, PCA3 등의 암 관련 바이오마커를 분석하였다(도 134). 또한, 정상인으로부터 수득한 혈액을 이용해 PSA, PSMA, PAP, PCA3 등의 암 관련 바이오마커를 분석하였다(도 135). 또한, 전립선암 환자 및 정상인으로부터 수득한 혈액을 이용해 TMPRSS2-ERG fusion의 바이오마커를 분석하였다(도 136). 분석 결과, 본 발명의 분석법을 통해 전립선암을 정확하게 진단할 수 있음을 확인하였다.
실시예 16. 갑상선암 진단 가능성 확인
상술한 바와 동일한 방법을 이용하여, 갑상선암 환자로부터 수득한 혈액을 이용해 CEA, NSE, TG(Thyroglobulin) 및 CALCA의 바이오마커를 분석한 결과이다(도 137은). 또한, 정상인으로부터 수득한 혈액을 이용해 CEA, NSE, TG(Thyroglobulin) 및 CALCA의 분석하였다(도 138). 또한, 갑상선암 환자 및 정상인으로부터 수득한 혈액을 이용해 BRAF mutation(V600E), TERT Promotor mutation(C228T, C250T)의 DNA 발현 정도를 측정하였다(도 139). 분석 결과, 본 발명의 분석법을 통해 갑상선암을 정확하게 진단할 수 있음을 확인하였다.
실시예 17. 방광암 진단 가능성 확인
상술한 바와 동일한 방법을 이용하여, 방광암 환자, 혈뇨환자 및 정상인으로부터 수득한 소변을 이용해 OGT, FGFR3, TP53, NMP22 및 Cyfra21-1의 DNA 발현 정도를 측정하였다(도 140). 분석 결과, 본 발명의 분석법을 통해 방광암을 정확하게 진단할 수 있음을 확인하였다.
실시예 18. 유방암 진단 가능성 확인
상술한 바와 동일한 방법을 이용하여, 유방암 환자 및 정상인으로부터 수득한 혈액을 이용해 CA27-29 및 CEA의 DNA 발현 정도를 측정하였다(도 141). 분석 결과, 본 발명의 분석법을 통해 유방암을 정확하게 진단할 수 있음을 확인하였다.
실시예 19. 대장암 진단 가능성 확인
상술한 바와 동일한 방법을 이용하여, 대장암 환자 및 정상인으로부터 수득한 혈액을 이용해 CEA 및 CA19-9의 DNA 발현 정도를 측정하였다(도 142). 분석 결과, 본 발명의 분석법을 통해 대장암을 정확하게 진단할 수 있음을 확인하였다.
실시예 20. 담도암 진단 가능성 확인
상술한 바와 동일한 방법을 이용하여, 담도암 환자 및 정상인으로부터 수득한 혈액을 이용해 CA 19-9, CEA 및 CA123의 DNA 발현 정도를 측정하였다(도 143 및 도 144). 분석 결과, 본 발명의 분석법을 통해 담도암을 정확하게 진단할 수 있음을 확인하였다.
실시예 21. 위암 진단 가능성 확인
상술한 바와 동일한 방법을 이용하여, 위암 환자 및 정상인으로부터 수득한 혈액을 이용해 CEA, CA19-9, CGB 및 Cyfra21-1의 DNA 발현 정도를 측정하였다(도 145). 분석 결과, 본 발명의 분석법을 통해 위암을 정확하게 진단할 수 있음을 확인하였다.
실시예 22. 난소암 진단 가능성 확인
상술한 바와 동일한 방법을 이용하여, 난소암 환자 및 정상인으로부터 수득한 혈액을 이용해 CA125 및 CEA의 DNA 발현 정도를 측정하였다(도 146). 분석 결과, 본 발명의 분석법을 통해 난소암을 정확하게 진단할 수 있음을 확인하였다.
실시예 23. 췌장암 진단 가능성 확인
상술한 바와 동일한 방법을 이용하여, 췌장암 환자로부터 수득한 혈액을 이용해 CEA, CA19-9 및 CA125의 DNA 발현 정도를 측정하였다(도 147). 정상인으로부터 수득한 혈액을 이용해 CEA, CA19-9 및 CA125의 DNA 발현 정도를 측정하였다(도 148). 본 발명의 분석법을 통해 췌장암을 정확하게 진단할 수 있음을 확인하였다.
실시예 24. 정상인 샘플에서 다양한 암 바이오마커 검출을 통한 cfDNA를 이용한 검출법의 정확도 확인
상술한 바와 동일한 방법을 이용하여, 정상인으로부터 수득한 혈액을 이용해 암 관련 바이오마커의 DNA 발현 정도를 측정하는 것을 통해, 정상인에서는 암 관련 바이오마커가 검출되지 않는 것을 확인하였다(도 149 및 도 150)(PC: Positive control).
실시예 25. 자궁경부암 진단 가능성 확인
상술한 바와 동일한 방법을 이용하여, HPV 양성 자궁경부암 환자(HPV16(+) 및 HPV18(+)) 및 HPV 음성 건강 대조군(HPV-)의 소변에 존재하는 cfDNA와 HPV 18 또는 HPV 16에 특이적인 프로브의 결합 여부를 흡광도를 통하여 확인하였다(도 153). 또한, 자궁경부암 환자의 소변에서 분리한 cfDNA에 HPV 16, EGFR19 deletion, HPV 18, 및 EGFR 21 L858R에 특이적인 프로브를 순차적으로 반응시킨 후, cfDNA와 각 프로브의 결합여부를 확인하였다(도 154). 본 발명의 분석법을 통해 자궁경부암을 정확하게 진단할 수 있음을 확인하였다.
실시예 26. 폐암 진단 가능성 확인
상술한 바와 동일한 방법을 이용하여, 폐암 환자의 혈액을 이용하여 폐암 바이오마커를 검출하였다. 도 155는 151명의 폐암 환자들의 혈장으로부터 수득한 cfDNA를 이용하여 폐암 환자의 유전자 변이를 분석한 표이다. 또한, EGFR 변이가 없는 환자(Wild type), EGFR exon19 deletion이 있는 환자 및 EGFR exon 21 L858R을 가진 폐암 환자의 혈장으로부터 cfDNA를 수득한 후, EGFR exon19 Del에 특이적인 프로브를 혼합한 후, UV 스펙트럼의 흡광도(ΔOD, 500 nm 내지 650 nm) 값의 분석을 통하여 폐암 환자의 유전자 변이를 확인하였다(도 156).
또한, EGFR exon19 deletion이 있는 폐암 환자의 혈장으로부터 cfDNA를 수득한 후, EGFR exon19 Del에 특이적인 프로브를 혼합한 후, 유전자 변이의 특이도와 민감도를 분석하였다(도 157). EGFR 변이가 없는 환자(Wild type), EGFR exon19 deletion이 있는 환자 및 EGFR exon 21 L858R을 가진 폐암 환자의 혈장으로부터 cfDNA를 수득한 후, EGFR exon21 L858R에 특이적인 프로브를 첨가한 후, UV 스펙트럼의 흡광도(ΔOD, 500 nm 내지 650 nm) 값의 분석을 통하여 환자의 유전자 변이를 확인하였다(도 158). 또한, EGFR exon 21 L858R이 있는 폐암 환자의 혈장으로부터 cfDNA를 수득한 후, EGFR exon 21 L858R에 특이적인 프로브를 추가한 후, 환자의 유전자 변이의 특이도와 민감도를 분석하였다(도 159).
또한, EGFR exon 19 deletion의 CP 및 DP의 서열을 나타낸 것이다(도 160). 본 연구에서는 CP_1 및 DP를 사용하여 폐암 환자의 cfDNA 유전자 변이를 분석하였다. 이때, CP는 변이가 있는 부분을 포함하거나 인접한 서열에 상보적으로 결합하도록 디자인한 프로브이며, DP는 변이 서열에서 이격된 부분에 상보적으로 결합하도록 디자인된 프로브를 의미한다.
또한, EGFR exon 20 T790M의 CP 및 DP의 서열을 나타낸 것이다. 본 연구에서는 CP2 및 DP를 사용하여 폐암 환자의 cfDNA 유전자 변이를 분석하였다(도 161).
또한, EGFR exon 21 L858R의 CP 및 DP의 서열을 나타낸 것이다. 본 연구에서는 CP2 및 DP를 사용하여 폐암 환자의 cfDNA 유전자 변이를 분석하였다(도 162).
또한, EGFR exon 19 deletion 및 EGFR exon 20 T790M 유전자 변이를 가진 폐암 환자의 혈장으로부터 수득된 cfDNA를 EGFR exon 19 deletion(Del19), EGFR exon 20 T790M 및 EGFR exon 21 L858R에 특이적인 프로브를 이용하여 반응시킨 후 HRP/스트렙타비딘 나노입자(다량의 HRP를 포함)를 첨가하여 cfDNA의 검출여부를 색깔 변화 및 UV 흡광도로 확인하였다(도 163).
또한, 도 164는 도 47과 동일한 EGFR exon 19 deletion 및 EGFR exon 20 T790M 유전자 변이를 가진 폐암 환자의 혈장으로부터 수득된 cfDNA를 EGFR exon 19 deletion(Del19), EGFR exon 20 T790M 및 EGFR exon 21 L858R에 특이적인 프로브를 이용하여 반응시킨 후 HRP/스트렙타비딘 복합체(HRP와 스트렙타비딘이 1:1로 결합된 복합체)를 첨가하여 cfDNA의 검출여부를 색깔 변화 및 UV 흡광도로 확인한 것이다. HRP/스트렙타비딘 나노입자에 비해 HRP/스트렙타비딘 복합체의 경우 노이즈가 생성됨을 확인한 것이다.
또한, 도 165는 5명의 EGFR exon19 deletion 및 exon20 T790M 유전자 변이를 가진 폐암 환자의 혈장에서 cfDNA를 추출한 후 EGFR exon 19 Del, EGFR exon 20 T790M, EGFR exon 21 L858R에 특이적인 프로브 및 HRP/스트렙타비딘 나노입자(HRP/st-tagged NP)와 반응시킨 결과와 EGFR exon19 Del, EGFR exon 20 T790M, EGFR exon 21 L858R에 특이적인 프로브와 HRP/스트렙타비딘 복합체(HRP와 스트렙타비딘이 1:1로 결합)를 반응시킨 결과의 분석을 통하여 암조직과 유전형과의 일치성을 확인 및 비교한 것이다.
또한, 도 166은 EGFR exon 20 T790M 및 EGFR exon 21 L861Q 유전자 변이를 가진 폐암 환자의 혈장으로부터 수득된 cfDNA의 유전자 변이 검출을 위해 EGFR exon 19 deletion(19 Del), EGFR exon 20 T790M, EGFR exon 21 L858R 및 EGFR exon L861Q에 특이적인 프로브 및 HRP/st-tagged NP을 한꺼번에 혼합한 결과 암조직과 동일하게 EGFR exon 20 T790M 및 EGFR exon 21 L861Q 에서만 유전자변이가 관찰됨을 UV 흡광도로 확인한 것이다.
또한, 도 167은 ALK-EML4 fusion 및 ALK point mutation(I1171N/T) 유전자 변이를 가진 폐암 환자의 혈장으로부터 수득된 cfDNA의 유전자 변이 검출을 위해 ALK-EML4 fusion 및 ALK point mutation(T1151, L1152P, L1152R, C1156Y, I1171N/T)에 특이적인 프로브 및 HRP/st-tagged NP을 한꺼번에 혼합한 결과 암조직과 동일하게 ALK-EML4 fusion 및 ALK point mutation(I1171N/T) 유전형이 검출되는 것을 확인하였다.
또한, 도 168은 BRAF V600E 유전자 변이를 가진 갑상선암 환자의 혈장으로부터 수득된 cfDNA의 유전자 변이 검출을 위해 BRAF V600E에 특이적인 프로브 및 HRP/st-tagged NP을 한꺼번에 혼합하였다. 그 결과 BRAF V600E 유전자 변이가 환자의 유전형과 동일하게 검출되는 것을 확인하였다.
IX. 시료의 변성 조건에 따른 암 유래 cfDNA 검출
실시예 27. 온도 조건에 따른 암 환자에서 수득한 시료 변성 후 cfDNA 검출
시료 변성 조건에 따라 암 유래 cfDNA와 정상인 유래 cfDNA가 구분될 수 있는지를 확인하기 위하여 실험을 수행하였다. 구체적으로, EGFR 19 deletion을 검출할 수 있는 프로브를 이용하여, 정상인과 폐암환자(0208-343, 20190311_LC#1, Tissue 결과 : E19del)에서 채취한 혈장에 다양한 변성 조건을 준 후, 불안정한 cfDNA와 안정한 cfDNA가 구분 가능한지 확인하였다.
프로브는 EGFR 엑손 19, deletion을 검출할 수 있는 프로브인 ggaattaaga gaagcaacat ctcc(서열번호 105)를 이용하였다. 이때, 프로브는 바이오틴이 결합된 것을 이용하였다. PEI/Ppy 나노와이어를 이용하였고, HRP/스트렙타비딘이 응집된 나노입자를 표지자로 이용하였다.
구체적으로, 나노와이어로 cfDNA를 분리하기 전에 샘플을 다음과 같이 다양한 조건으로 처리하였다. 시료를 30℃에서 15분 및 0분간 가열하였다. 또한, 60℃, 5분 및 0분간 가열하였다. 또한, 95℃, 1분 및 0분간 가열하였다. 다른 단계는 상술한 방법과 같이 수행하였다.
그 결과 EGFR 19 deletion 돌연변이가 없는 정상인에서는 어떠한 변성 조건에서 불안정한 cfDNA가 검출되지 않았다(도 169). 그러나, E19del 환자에서는 여러가지 변성 조건에서 모두 불안정한 cfDNA가 검출되었음을 확인하였다(도 170). 이러한 결과를 통해 불안정한 cfDNA의 존재 유무를 통해, 폐암환자가 E19del 변이가 있다는 정보를 제공할 수 있다.
실시예 28. 온도 조건에 따른 암세포주 유래의 cfDNA 검출
인체에서 수득한 시료뿐 아니라, 세포주에 존재하는 변이 위치를 확인하기 위한 실험을 수행하였다. 구체적으로, HCC2279(Exon19Del), HCC827(Exon19Del), H1975(T790M, L858R) 및 A549(EGFR wildtype)에서 cfDNA와 유사한 크기를 가지는 fDNA를 수득하였다.
그 결과, 95℃, 1분 및 0분간 가열하는 변성조건에서, 불안정한 cfDNA만이 상보적으로 프로브와 결합하고, 표지자와 결합하여 검출되는 것을 확인하였다((도 171). 이러한 결과를 통해 세포주에서 수득한 시료에서도 불안정한 cfDNA의 존재 유무를 확인할 수 있음을 검증하였다.
실시예 29. DNase 처리에 따른 암유래 cfDNA 검출
암세포 유래의 불안정한 cfDNA와 안정한 cfDNA가 온도 조건뿐 아니라, DNA 분해 효소에 의해서도 차이가 나는지를 확인하기 위하여, 불안정한 cfDNA와 안정한 cfDNA에 DNase 처리 후 프로브와의 반응성을 확인하였다. 이때, 시료는 고온을 이용한 변성을 수행하지 않았다.
구체적으로, HCC2279(Exon19Del), HCC827(Exon19Del), H1975(T790M, L858R) 및 A549(EGFR wildtype)에서 PEI/Ppy 나노와이어를 이용하여 수득한 fDNA를 PBS에 현탁시킨 후, DNase 1 ㎕를 처리하였다. 37℃, 60분을 처리한 결과, 불안정한 cfDNA와 안정한 cfDNA는 프로브와 반응성에서 차이가 남을 확인하였다(도 172). 또한, DNase 처리 시간을 37℃, 60분으로 처리하였음에도 동일한 효과가 나타남을 확인하였다(도 173). 이러한 결과를 바탕으로, 안정한 cfDNA는 DNase 효소에 의해서 분해가 쉽게 일어나지 않는다는 점을 확인할 수 있었다.
그러나, 37℃, 120분간 DNase 1 ㎕ 또는 2 ㎕를 처리한 결과, 안정한 cfDNA도 처리 시간이 길어지거나, DNase 양이 증가할 경우, 프로브와 반응을 한다는 점을 확인하였다(도 174). 이러한 실험 결과를 통해, 불안정한 cfDNA와 안정한 cfDNA의 안정성의 차이를 확인할 수 있었다.
또한, DNase의 활성에 따른 불안정한 cfDNA와 안정한 cfDNA의 차이점을 확인하기 위하여, 24℃, 120분간, DNase 1 ㎕ 또는 2 ㎕를 처리한 결과를 도 60에 나타내었다. 그 결과 24℃에서는 효소의 활성이 저하되었음에도, 프로브 반응성 측면에서 불안정한 cfDNA와 안정한 cfDNA이 차이가 남을 확인하였다(도 175).
또한, DNase의 활성에 따른 불안정한 cfDNA와 안정한 cfDNA의 차이점을 확인하기 위하여, 3℃, 120분간, DNase 1 ㎕ 또는 2 ㎕를 처리한 결과를 도 58에 나타내었다. 그 결과 3℃에서는 효소의 활성이 저하되었음에도, 프로브 반응성 측면에서 불안정한 cfDNA와 안정한 cfDNA이 차이가 남을 확인하였다(도 176).
<110> Genopsy Co., Ltd.
<120> METHOD FOR DIAGNOSING PANCREATIC CANCER USING CFDNA
<130> SPD20-015
<160> 166
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide seqeunce for biotinylated PD-L1 probe 1(Exon5)
<400> 1
tgggagccat cttattatgc c 21
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide seqeunce for biotinylated PD-L1 probe 2(Exon5)
<400> 2
cggaagatga atgtcagtgc 20
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide seqeunce for biotinylated PD-L1 probe 3(Exon2)
<400> 3
cctactggca tttgctgaac g 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide seqeunce for biotinylated PD-L1 probe 4(Exon3)
<400> 4
accatagctg atcatgcagc g 21
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide seqeunce for biotinylated EpCAM probe 1(Exon1)
<400> 5
acagagcgct agtccttcgg c 21
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide seqeunce for biotinylated EpCAM probe 2(Exon4)
<400> 6
aaccttatga tagtaaaagt t 21
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide seqeunce for biotinylated EpCAM probe 3(Exon7)
<400> 7
ggtctaaaag ctggtgttat t 21
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide seqeunce for biotinylated EpCAM probe 4(Exon9)
<400> 8
gaaactggct ttaccaatct t 21
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide seqeunce for biotinylated FOLR1 probe 1(Exon4)
<400> 9
tgttctacca acaccagcca g 21
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide seqeunce for biotinylated FOLR1 probe 2(Exon2)
<400> 10
actgaaccca aaggatcacc t 21
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide seqeunce for biotinylated FOLR1 probe 3(Exon1)
<400> 11
cctaggccac taaaccacag c 21
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide seqeunce for biotinylated FOLR1 probe 4(Exon5)
<400> 12
ggctgggccc tgggcagcct g 21
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide seqeunce for biotinylated EGFR probe 1(Exon1)
<400> 13
aacgccacaa ccaccgcgca c 21
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide seqeunce for biotinylated EGFR probe 2(Exon21)
<400> 14
ggaccgtcgc ttggtgcacc g 21
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide seqeunce for biotinylated EGFR probe 3(Exon19)
<400> 15
tctggaccca gaaggtgaga a 21
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide seqeunce for biotinylated EGFR probe 4(Exon20)
<400> 16
tgctgggcat ctgcctcacc t 21
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide seqeunce for biotinylated ERBB2 probe 1(Exon1)
<400> 17
tcgcagcacc ccgcgccccg c 21
<210> 18
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide seqeunce for biotinylated ERBB2 probe 2(Exon5)
<400> 18
cctgttctcc gatgtgtaag g 21
<210> 19
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide seqeunce for biotinylated ERBB2 probe 3(Exon10)
<400> 19
ccgctccagc cagagcagct c 21
<210> 20
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide seqeunce for biotinylated ERBB2 probe 4(Exon17)
<400> 20
aagatccgga agtacacgat g 21
<210> 21
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide seqeunce for Biotinylated OGT (O-GlcNAc transferase)
probe 1
<400> 21
atggcgtctt ccgtgggc 18
<210> 22
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide seqeunce for Biotinylated OGT (O-GlcNAc transferase)
probe 2
<400> 22
tgccctgtgg ccatggac 18
<210> 23
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide seqeunce for biotinylated CEA (Prostatic Acid
Phosphatase; ACPP gene) probe 1
<400> 23
aatctgaacc tctcctgcca c 21
<210> 24
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide seqeunce for biotinylated CEA (Prostatic Acid
Phosphatase; ACPP gene) probe 2
<400> 24
acccttcatc accagcaaca a 21
<210> 25
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide seqeunce for biotinylated CEA (Prostatic Acid
Phosphatase; ACPP gene) probe 3
<400> 25
tattcttggc tgattgatgg g 21
<210> 26
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide seqeunce for biotinylated CEA (Prostatic Acid
Phosphatase; ACPP gene) probe 4
<400> 26
cagcaacaac tccaaacccg t 21
<210> 27
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide seqeunce for biotinylated PSA (KLK3) probe 1
<400> 27
cagtctgcgg cggtgttctg g 21
<210> 28
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide seqeunce for biotinylated PSA (KLK3) probe 2
<400> 28
gcaagttcac cctcagaagg t 21
<210> 29
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide seqeunce for biotinylated PSA (KLK3) probe 3
<400> 29
gaggtccagg gttgctagga a 21
<210> 30
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide seqeunce for biotinylated CA19-9 probe 1
<400> 30
gatcatcacg gcacggtc 18
<210> 31
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide seqeunce for biotinylated CA19-9 probe 2
<400> 31
gtgcagagag atcatcacgg c 21
<210> 32
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide seqeunce for biotinylated CA19-9 probe 3
<400> 32
tctctcttac ctgggacctc a 21
<210> 33
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide seqeunce for biotinylated C125 (MUC16 gene) probe 1
<400> 33
ctggaactga ttctatcaac c 21
<210> 34
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide seqeunce for biotinylated C125 (MUC16 gene) probe 2
<400> 34
tgtggcagaa accagctatc c 21
<210> 35
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide seqeunce for biotinylated C125 (MUC16 gene) probe 3
<400> 35
gaggtcctga ggatgtgtca t 21
<210> 36
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide seqeunce for biotinylated AFP probe 1
<400> 36
tgagtcagaa gtttaccaaa g 21
<210> 37
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide seqeunce for biotinylated AFP probe 2
<400> 37
tgcaaactga ccacgctgga a 21
<210> 38
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide seqeunce for biotinylated AFP probe 3
<400> 38
cttgaatgcc aagataaagg a 21
<210> 39
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide seqeunce for biotinylated PSMA (FOLH1) probe 1
<400> 39
catagtgctc ccttttgatt g 21
<210> 40
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide seqeunce for biotinylated PSMA (FOLH1) probe 2
<400> 40
agtggaaaga atttggcctg g 21
<210> 41
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide seqeunce for biotinylated PSMA (FOLH1) probe 3
<400> 41
acctagaaga acaattttgt t 21
<210> 42
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide seqeunce for biotinylated PAP (Prostatic Acid
Phosphatase; ACPP gene) probe 1
<400> 42
gcagcattat gaacttggag a 21
<210> 43
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide seqeunce for biotinylated PAP (Prostatic Acid
Phosphatase; ACPP gene) probe 2
<400> 43
tcggaatgag acgcagcacg a 21
<210> 44
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide seqeunce for biotinylated PCA3 (Prostate cancer
antigen 3; PCA3 gene) probe 1
<400> 44
cttagtgttt caatgaacac c 21
<210> 45
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide seqeunce for biotinylated PCA3 (Prostate cancer
antigen 3; PCA3 gene) probe 2
<400> 45
gcttagcctt gtactgaggc t 21
<210> 46
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide seqeunce for biotinylated NSE (Neuron-Specific
Enolase; ENO2 gene) probe 1
<400> 46
ccatagagaa gatctgggcc c 21
<210> 47
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide seqeunce for biotinylated NSE (Neuron-Specific
Enolase; ENO2 gene) probe 2
<400> 47
gatcctccca gtgggagctg a 21
<210> 48
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide seqeunce for biotinylated NSE (Neuron-Specific
Enolase; ENO2 gene) probe 3
<400> 48
ggtcatggtg agtcatcgct c 21
<210> 49
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide seqeunce for biotinylated SCC (Squamous Cell Carcinoma
Antigen; SART3 gene) probe 1
<400> 49
gctggagtgg ctgcatgacg a 21
<210> 50
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide seqeunce for biotinylated SCC (Squamous Cell Carcinoma
Antigen; SART3 gene) probe 2
<400> 50
gcgccctggt cgagaactgc c 21
<210> 51
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide seqeunce for biotinylated SCC (Squamous Cell Carcinoma
Antigen; SART3 gene) probe 3
<400> 51
gtggctagag tattacaacc t 21
<210> 52
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide seqeunce for biotinylated SCC (Squamous Cell Carcinoma
Antigen; SART3 gene) probe 4
<400> 52
tcgagaacag catccctgca g 21
<210> 53
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide seqeunce for biotinylated Cyfra21-1 (cytokeratin
19-fragments; KRT19 gene) probe 1
<400> 53
ctggcctcct acctggacaa 20
<210> 54
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide seqeunce for biotinylated Cyfra21-1 (cytokeratin
19-fragments; KRT19 gene) probe 2
<400> 54
gacctggaga tgcagatcga a 21
<210> 55
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide seqeunce for biotinylated Cyfra21-1 (cytokeratin
19-fragments; KRT19 gene) probe 3
<400> 55
gtcgctggcc acacggagca g 21
<210> 56
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide seqeunce for biotinylated TPA (Tissue plasminogen
activator; PLAT gene) probe 1
<400> 56
gctgtgaagc aatcatggat g 21
<210> 57
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide seqeunce for biotinylated TPA (Tissue plasminogen
activator; PLAT gene) probe 2
<400> 57
gcacctgcca gcaggccctg t 21
<210> 58
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide seqeunce for biotinylated TPA (Tissue plasminogen
activator; PLAT gene) probe 3
<400> 58
actggacgga gtgtgagctc t 21
<210> 59
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide seqeunce for biotinylated Thyroglobulin (TG gene)
probe 1
<400> 59
caacaccaca gacatgatga t 21
<210> 60
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide seqeunce for biotinylated Thyroglobulin (TG gene)
probe 2
<400> 60
tgcggcctgg ctcgagcagc a 21
<210> 61
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide seqeunce for biotinylated Thyroglobulin (TG gene)
probe 3
<400> 61
aatcaatcac tatccagcca g 21
<210> 62
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide seqeunce for biotinylated Thyroglobulin (TG gene)
probe 4
<400> 62
actctctgga gcactccacg g 21
<210> 63
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide seqeunce for biotinylated Calcitonin (Calcitonin
Gene-Related Peptide; CALCA gene) probe 1
<400> 63
gaggtgtcat gggcttccaa a 21
<210> 64
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide seqeunce for biotinylated Calcitonin (Calcitonin
Gene-Related Peptide; CALCA gene) probe 2
<400> 64
gtaatctgag tacttgcatg c 21
<210> 65
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide seqeunce for biotinylated FGFR3 probe 1
<400> 65
agtggcggtg gtggtgaggg ag 22
<210> 66
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide seqeunce for biotinylated FGFR3 probe 2
<400> 66
cccacagctt ctgcccccga 20
<210> 67
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide seqeunce for biotinylated FGFR3 probe 3
<400> 67
gggcatccat gggagcc 17
<210> 68
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide seqeunce for biotinylated FGFR3 probe 4
<400> 68
cagcgtgggc cgaggt 16
<210> 69
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide seqeunce for biotinylated FGFR3 probe 5
<400> 69
ccctgagatg ctgggagcag 20
<210> 70
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide seqeunce for biotinylated FGFR3 probe 6
<400> 70
gtgtgggaag gcggtgttg 19
<210> 71
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide seqeunce for biotinylated TP53 probe 1
<400> 71
gccctgactt tcaactctg 19
<210> 72
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide seqeunce for biotinylated TP53 probe 2
<400> 72
acgacagggc tggttgcc 18
<210> 73
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide seqeunce for biotinylated TP53 probe 3
<400> 73
tccccaggcc tctgattcc 19
<210> 74
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide seqeunce for biotinylated TP53 probe 4
<400> 74
cctccaggtg agcagtag 18
<210> 75
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide seqeunce for biotinylated TP53 probe 5
<400> 75
cttgggcctg tgttatctc 19
<210> 76
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide seqeunce for biotinylated TP53 probe 6
<400> 76
cccacctctt accgattt 18
<210> 77
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide seqeunce for biotinylated TP53 probe 7
<400> 77
acaagggtgg ttgggagtag 20
<210> 78
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide seqeunce for biotinylated TP53 probe 8
<400> 78
ggacaagaag cggtggagg 19
<210> 79
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide seqeunce for biotinylated NMP22 (nuclear matrix
protein-22; NUMA1 gene) probe 1
<400> 79
atggcactga agagggacag c 21
<210> 80
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide seqeunce for biotinylated NMP22 (nuclear matrix
protein-22; NUMA1 gene) probe 2
<400> 80
gccaaggaag agctggagca g 21
<210> 81
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide seqeunce for biotinylated NMP22 (nuclear matrix
protein-22; NUMA1 gene) probe 3
<400> 81
gagcagctag aggtatttca g 21
<210> 82
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide seqeunce for biotinylated NMP22 (nuclear matrix
protein-22; NUMA1 gene) probe 4
<400> 82
aggtagaatc cctggagagt c 21
<210> 83
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide seqeunce for biotinylated CA27.29/CA15-3 (Carcinoma
Antigen 15-3; MUC1 gene) probe 1
<400> 83
gcgcctgcct gaatctgttc t 21
<210> 84
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide seqeunce for biotinylated CA27.29/CA15-3 (Carcinoma
Antigen 15-3; MUC1 gene) probe 2
<400> 84
ttctgggcct ctccaatatt a 21
<210> 85
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide seqeunce for biotinylated CA27.29/CA15-3 (Carcinoma
Antigen 15-3; MUC1 gene) probe 3
<400> 85
ggatacctac catcctatga g 21
<210> 86
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide seqeunce for biotinylated biotinylated Beta-HCG (human
chorionic gonadotropin; CGB gene) probe 1
<400> 86
tgctgagcat gggcgggaca t 21
<210> 87
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide seqeunce for biotinylated biotinylated Beta-HCG (human
chorionic gonadotropin; CGB gene) probe 2
<400> 87
tggctctcag ctgtcaatgt g 21
<210> 88
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide seqeunce for biotinylated CPT1A probe 1
<400> 88
gagccatgaa gctcttagac a 21
<210> 89
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide seqeunce for biotinylated CPT1A probe 2
<400> 89
cttccagaca tcgctgcctc g 21
<210> 90
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide seqeunce for biotinylated CPT1A probe 3
<400> 90
tggacaatac ctcggagcct c 21
<210> 91
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide seqeunce for biotinylated CPT1A probe 4
<400> 91
catgacccgg ctcttccgag a 21
<210> 92
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide seqeunce for biotinylated IFN-gamma probe 1
<400> 92
atcgtatatt gggagtacca g 21
<210> 93
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide seqeunce for biotinylated IFN-gamma probe 2
<400> 93
taaatggaga cgagcaggaa g 21
<210> 94
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide seqeunce for biotinylated IFN-gamma probe 3
<400> 94
tagtgcttag cctggtattc a 21
<210> 95
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide seqeunce for biotinylated PD1 probe 1
<400> 95
gtaccgcatg agccccagca a 21
<210> 96
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide seqeunce for biotinylated PD1 probe 2
<400> 96
gttccaaacc ctggtggttg g 21
<210> 97
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide seqeunce for biotinylated PD1 probe 3
<400> 97
gagcagacgg agtatgccac 20
<210> 98
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide seqeunce for biotinylated IFN-gamma receptor probe 1
<400> 98
atcgtatatt gggagtacca g 21
<210> 99
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide seqeunce for biotinylated IFN-gamma receptor probe 2
<400> 99
taaatggaga cgagcaggaa g 21
<210> 100
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide seqeunce for biotinylated IFN-gamma receptor probe 3
<400> 100
tagtgcttag cctggtattc a 21
<210> 101
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HPV 16-CP
<400> 101
gaggaggagg atgaaataga tggt 24
<210> 102
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HPV 16-DP
<400> 102
ttggaagacc tgttaatggg c 21
<210> 103
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HPV 18-CP
<400> 103
cacattgtgg cacaatcttt ta 22
<210> 104
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HPV 18-DP
<400> 104
gccatatcgc tttcatctgt 20
<210> 105
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EGFR 19-CP
<400> 105
ggaattaaga gaagcaacat ctcc 24
<210> 106
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EGFR 19-DP
<400> 106
aacctcaggc ccacctttt 19
<210> 107
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EGFR 21-CP
<400> 107
ccaggaacgt actggtgaaa a 21
<210> 108
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EGFR 21-DP
<400> 108
ggaagagaaa gaataccatg ca 22
<210> 109
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EGFR Exon 19-probe1 CP1
<400> 109
ggaattaaga gaagcaacat ctcc 24
<210> 110
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EGFR Exon 19-probe1 DP
<400> 110
aacctcaggc ccaccttt 18
<210> 111
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EGFR Exon 19-probe2 CP2
<400> 111
aaaattcccg tcgctatcaa g 21
<210> 112
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EGFR Exon 19-probe2 DP
<400> 112
aacctcaggc ccacctttt 19
<210> 113
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EGFR Exon 19-probe3 CP3
<400> 113
ggactctgga tcccagaagg tgag 24
<210> 114
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EGFR Exon 19-probe3 DP
<400> 114
aacctcaggc ccacctttt 19
<210> 115
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EGFR Exon 20-probe1 CP1
<400> 115
ccatgagtac gtattttgaa actc 24
<210> 116
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EGFR Exon 20-probe1 DP
<400> 116
gcaagagttt gccatgggga tatg 24
<210> 117
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EGFR Exon 20-probe2 CP2
<400> 117
ccaccgtgca gctcatcacg cagctca 27
<210> 118
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EGFR Exon 20-probe2 DP
<400> 118
gcaagagttt gccatgggga tatg 24
<210> 119
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EGFR Exon 20-probe3 CP3
<400> 119
gaagcctacg tgatggccag cgt 23
<210> 120
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EGFR Exon 20-probe3 DP
<400> 120
gcaagagttt gccatgggga tatg 24
<210> 121
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EGFR Exon 21-probe1 CP1
<400> 121
ccaggaacgt actggtgaaa a 21
<210> 122
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EGFR Exon 21-probe1 DP
<400> 122
ggaagagaaa gaataccatg ca 22
<210> 123
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EGFR Exon 21-probe2 CP2
<400> 123
aagatcacag attttgggcg gg 22
<210> 124
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EGFR Exon 21-probe2 DP
<400> 124
ggaagagaaa gaataccatg ca 22
<210> 125
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EGFR Exon 21-probe3 CP3
<400> 125
ggcatgaact acttggagga ccgt 24
<210> 126
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EGFR Exon 21-probe3 DP
<400> 126
ggaagagaaa gaataccatg ca 22
<210> 127
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> KRAS exon2-probe CP1
<400> 127
aaatgactga atataaactt g 21
<210> 128
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> KRAS exon2-probe DP
<400> 128
gagtgccttg acgatacagc t 21
<210> 129
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ALK-EML4 variant 1-probe CP2
<400> 129
tagagcccac acctgggaaa 20
<210> 130
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ALK-EML4 variant 1-probe DP
<400> 130
cggagcttgc tcagcttgta 20
<210> 131
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ALK-EML4 variant 3-probe CP3
<400> 131
gcataaagat gtcatcatca accaag 26
<210> 132
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ALK-EML4 variant 3-probe DP
<400> 132
cggagcttgc tcagcttgta 20
<210> 133
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BRCA1 Exon 7 of normal cell
<400> 133
caaagtatgg gctacagaaa ccgtgccaaa ag 32
<210> 134
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BRCA1 Exon 7 of cancer cell
<400> 134
caaagtatgg gcttcagaaa ccgtgccaaa ag 32
<210> 135
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BRCA1 Exon 10 of normal cell
<400> 135
tgggaaaacc tatcggaaga aggcaagcct cc 32
<210> 136
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BRCA1 Exon 10 of cancerl cell
<400> 136
tgggaaaacc tatcggtaga aggcaagcct cc 32
<210> 137
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BRCA1 Exon 11 of normal cell
<400> 137
ggggccaaga aattagagtc ctcagaagag 30
<210> 138
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BRCA1 Exon 11 of cancer cell
<400> 138
ggggccaaga aaattagagt cctcagaaga g 31
<210> 139
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BRCA1 Exon 15 of normal cell
<400> 139
atatacagga tatgcgaatt aagaagaaac aaa 33
<210> 140
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BRCA1 Exon 15 of cancer cell
<400> 140
atatacagga tatgtgaatt aagaagaaac aaa 33
<210> 141
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TP53 of normal cell
<400> 141
taggaggccg agctctgttg cttcgaactc ca 32
<210> 142
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TP53 of cancer cell
<400> 142
taggaggccg agctctttgc ttcgaactcc a 31
<210> 143
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MSH2 of normal cell
<400> 143
tgaggaggtt tcgacatggc ggtgcagccg a 31
<210> 144
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MSH2 of cancer cell
<400> 144
tgaggaggtt tcgacctggc ggtgcagccg a 31
<210> 145
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EGFR of normal cell
<400> 145
aaaaagatca aagtgctggg ctccggtgcg tt 32
<210> 146
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EGFR of cancer cell
<400> 146
aaaaagatca aagtgctgag ctccggtgcg tt 32
<210> 147
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FGFR3 of normal cell
<400> 147
atcctctctc tgaaatcact gagcaggaga aag 33
<210> 148
<211> 33
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EGFR Exon 19 Deletion amino acid sequence
<400> 148
Gly Leu Trp Ile Pro Glu Gly Glu Lys Val Lys Ile Pro Val Ala Ile
1 5 10 15
Lys Glu Leu Arg Glu Ala Thr Ser Pro Lys Ala Asn Lys Glu Ile Leu
20 25 30
Asp
<210> 149
<211> 120
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Exon 19 deletion
<400> 149
gcagcatgtg gcaccatctc acaattgcca gttaacgtct tccttctctc tctgtcatag 60
gtgagtttct gctttgctgt gtgggggtcc atggctctga acctcaggcc caccttttct 120
120
<210> 150
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CP_!
<400> 150
ggaattaaga gaagcaacat ctcc 24
<210> 151
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DP_1
<400> 151
aaaaggtggg cctgaggtt 19
<210> 152
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CP_2
<400> 152
aaaattcccg tcgctatcaa g 21
<210> 153
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CP_3
<400> 153
ggactctgga tcccagaagg tgag 24
<210> 154
<211> 238
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Exon 19 deletion
<400> 154
agggactctg gatcccagaa ggtgagaaag ttaaaattcc cgtcgctatc aaggaattaa 60
gagaagcaac atctccgaaa gccaacaagg aaatcctcga tgtgagtttc tgctttgctg 120
tgtgggggtc catggctctg aacctcaggc ccaccttttc tcatgtctgg cagctgctct 180
gctctagacc ctgctcatct ccacatccta aatgttcact ttctatgtct ttcccttt 238
<210> 155
<211> 658
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EGFR Exon 20 T790M
<400> 155
ccagatgcac ccaggagggg ccctctccca ctgcatctgt cacttcacag ccctgcgtaa 60
acgtccctgt gctaggtctt ttgcaggcac agcttttcct ccatgagtac gtattttgaa 120
actcaagatc gcattcatgc gtcttcacct ggaaggggtc catgtgcccc tccttctggc 180
caccatgcga agccacactg acgtgcctct ccctccctcc aggaagccta cgtgatggcc 240
agcgtggaca acccccacgt gtgccgcctg ctgggcatct gcctcacctc caccgtgcag 300
ctcatcacgc agctcatgcc cttcggctgc ctcctggact atgtccggga acacaaagac 360
aatattggct cccagtacct gctcaactgg tgtgtgcaga tcgcaaaggt aatcagggaa 420
gggagatacg gggaggggag ataaggagcc aggatcctca catgcggtct gcgctcctgg 480
gatagcaaga gtttgccatg gggatatgtg tgtgcgtgca tgcagcacac acacattcct 540
ttattttgga ttcaatcaag ttgatcttct tgtgcacaaa tcagtgcctg tcccatctgc 600
atgtggaaac tctcatcaat cagctacctt tgaagaattt tctctttatt gagtgctc 658
<210> 156
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CP1
<400> 156
ccatgagtac gtattttgaa actc 24
<210> 157
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DP1
<400> 157
catatcccca tggcaaactc ttgc 24
<210> 158
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CP2
<400> 158
ccaccgtgca gctcatcatg ca 22
<210> 159
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CP3
<400> 159
gaagcctacg tgatggccag cgt 23
<210> 160
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EGFR Exon 21 L858R
<400> 160
gtcaagatca cagattttgg gctggccaaa ctgctg 36
<210> 161
<211> 156
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EGFR Exon 21 L858R
<400> 161
ggcatgaact acttggagga ccgtcgcttg gtgcaccgcg acctggcagc caggaacgta 60
ctggtgaaaa caccgcagca tgtcaagatc acagattttg ggctggccaa actgctgggt 120
gcggaagaga aagaatacca tgcagaagga ggcaaa 156
<210> 162
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CP1
<400> 162
ccaggagcgt actggtgaaa a 21
<210> 163
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DP
<400> 163
ggaagagaaa gaataccatg ca 22
<210> 164
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CP2
<400> 164
aagatcacag attttgggcg gg 22
<210> 165
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CP3
<400> 165
ggcatgaact acttggagga ccgt 24
<210> 166
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FGFR3 of cancer cell
<400> 166
atcctctctc tgaaatcact gcgcaggaga aag 33
Claims (30)
- a) 세포유리 DNA(cell-free DNA, 이하 cfDNA)가 포함된 개체로부터 분리된 생물학적 시료 및 양전하를 띠는 물질을 혼합하는 단계;
b) cfDNA가 결합된 양전하를 띠는 물질을 분리하는 단계;
c) 상기 혼합물에 상기 cfDNA에 상보적인 서열을 갖는 프로브 및 표지자를 순차적으로 또는 동시에 혼합하는 단계;
d) cfDNA에 결합하지 않은 프로브 및 표지자를 제거하는 단계; 및
e) 상기 표지자를 검출하는 단계를 포함하는,
상기 시료로부터, 증폭없이, 췌장암세포 유래의 유전자를 검출하여 췌장암을 진단하는 방법으로서,
상기 cfDNA는 췌장암세포에서 유래된 것이며,
상기 cfDNA에 상보적인 서열을 갖는 프로브는 췌장암 바이오마커로 알려진 유전자에 상보적으로 결합하는 것인,
췌장암을 진단하는 방법. - 제1항에 있어서,
상기 췌장암세포에서 유래된 cfDNA는
i) 정상 세포에서 유래된 이중 나선 구조를 가지는 cfDNA에 비해 낮은 Tm 값을 갖거나,
ii) 정상 세포에서 유래된 이중 나선 구조를 가지는 cfDNA가 변성되지 않는 조건에서 변성이 되는 것을 특징으로 하는 것인, 췌장암을 진단하는 방법. - 제1항에 있어서,
상기 췌장암세포에서 유래된 cfDNA는 하기의 조건 중 어느 하나의 조건에서 cfDNA 상보적으로 결합 가능한 15머 내지 30머 프로브와 결합할 수 있는 것인, 췌장암을 진단하는 방법:
i) 상온에서 1분 내지 120분 방치하는 조건;
ii) 90℃ 내지 95℃에서 1초 내지 3분간 가열하는 조건;
iii) 75℃ 내지 90℃에서 1초 내지 5분간 가열하는 조건;
iv) 60℃ 내지 75℃에서 30초 내지 30분간 가열하는 조건;
v) 25℃ 내지 40℃에서 10분 내지 120분간 가열하는 조건;
vi) 프로테아제로 1분 내지 10분 처리하는 조건;
vii) DNase로 1분 내지 10분 처리하는 조건; 및
viii) 화학물질(예, 수산화나트륨, DMSO, 계면활성제 등)을 처리하는 조건. - 제1항에 있어서,
상기 췌장암세포에서 유래된 cfDNA는 췌장암에서 유래된 순환 종양 DNA(circulating tumor DNA)인 것인, 췌장암을 진단하는 방법. - 제4항에 있어서,
상기 cfDNA에 상보적인 서열을 갖는 프로브는 SMAD4, APC, GNAS 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나의 유전자에서 상보적으로 결합하는 것인, 췌장암을 진단하는 방법. - 제1항에 있어서,
상기 c) 단계 이전에 시료 또는 양전하를 띠는 물질에 결합된 cfDNA를 하기의 조건 중 어느 하나의 조건에서 변성시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 것인, 췌장암을 진단하는 방법:
i) 상온에서 1분 내지 10분 방치하는 조건;
ii) 90℃ 내지 95℃에서 1초 내지 1분간 가열하는 조건;
iii) 75℃ 내지 90℃에서 10초 내지 3분간 가열하는 조건;
iv) 60℃ 내지 75℃에서 1분 내지 30분간 가열하는 조건;
v) 25℃ 내지 40℃에서 5분 내지 60분간 가열하는 조건;
vi) 프로테아제로 1분 내지 10분 처리하는 조건;
vii) DNase로 1분 내지 10분 처리하는 조건; 및
viii) 화학물질(예, 수산화나트륨, DMSO, 계면활성제 등)을 처리하는 조건. - 제1항에 있어서,
상기 시료는 소변, 뇌척수액, 혈장, 혈액, 흉수, 복수, 타액, 객담 및 체액으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것인, 췌장암을 진단하는 방법. - 제1항에 있어서,
상기 양전하를 띠는 물질은 양전하를 띠는 나노와이어인 것인, 췌장암을 진단하는 방법. - 제8항에 있어서,
상기 나노와이어는 전도성 고분자를 포함하는 것인, 췌장암을 진단하는 방법. - 제9항에 있어서,
상기 나노와이어는 추가적으로 바이오틴을 더 포함하는 것인, 췌장암을 진단하는 방법. - 제9항에 있어서,
상기 전도성 고분자는 폴리아세틸렌(poly(acetylene)), 폴리피롤(poly(pyrrole)), 폴리티오펜(poly(thiophene)), 폴리파라페닐렌(poly(para-phenylene)), 폴리(3,4-에틸렌디옥시테오펜(poly(3,4-ethylenedioxythiophene)), 폴리페닐렌설파이드(poly(phenylene sulfide)), 폴리(파라-페닐렌비닐렌)(poly(para-phenylene vinylene)) 및 폴리아닐린(polyaniline)으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것인, 췌장암을 진단하는 방법. - 제1항에 있어서,
상기 프로브는 15머 내지 30머의 뉴클레오티드로 구성된 것인, 췌장암을 진단하는 방법. - 제1항에 있어서,
상기 프로브에 적어도 하나의 바이오틴(biotin)이 결합된 것인, 췌장암을 진단하는 방법. - 제1항에 있어서,
상기 표지자는 양자점, HRP(horse-radish peroxidase), 형광단백질, 형광체, 알카라인포스파타제 및 루시퍼라제로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나인 것인, 췌장암을 진단하는 방법. - 제14항에 있어서,
상기 표지자에 아비딘(avidin) 계열 단백질이 결합된 것인, 췌장암을 진단하는 방법. - 제14항에 있어서,
상기 아비딘 계열 단백질은 아비딘(avidin), 스트렙타비딘(streptavidin) 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인, 췌장암을 진단하는 방법. - 제1항에 있어서,
상기 표지자는 전도성 고분자; 히알루론산; 아비딘(avidin) 또는 스트렙타비딘(streptavidin); 및 HRP(horse-radish peroxidase) 또는 형광단백질;을 포함하는 나노입자인 것인, 췌장암을 진단하는 방법. - 제1항에 있어서,
상기 cfDNA는 KRAS, MUC1, MSLN, CEACAM1, CEACAM5 또는 MUC16 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나의 유전자로부터 유래한 것을 추가적으로 더 포함하는 것인, 췌장암을 진단하는 방법. - 제1항에 있어서,
상기 e) 단계에서 상기 표지자는 색깔 변화, UV 흡광도 변화, 형광반응 변화, 또는 전기화학적 변화에 의해 검출되는 것인, 췌장암을 진단하는 방법. - 췌장암에 특이적으로 발현하는 유전자에 상보적으로 결합하는 바이오틴이 결합된 프로브;
양전하를 띠는 물질;
아비딘 계열의 단백질이 결합된 표지자 및
설명서를 포함하는 췌장암 진단 키트로서,
상기 설명서는 상기 키트 구성이 하기와 같은 프로토콜에 의해 췌장암을 유전자 증폭없이 진단할 수 있는 것으로 기재된 것인, 진단 키트:
a) 개체로부터 분리된 생물학적 시료로부터 키트 내에 포함된 양전하를 띠는 물질을 이용하여 cfDNA를 분리하시오; b) 상기 분리된 cfDNA에 키트내에 포함된 바이오틴이 결합된 프로브 및 키트내에 포함된 표지자를 순차적 또는 동시에 혼합하시오; c) cfDNA에 결합하지 않은 프로브 및 표지자를 제거하시오; 및 d) 상기 표지자의 신호를 검출하시오. - 제20항에 있어서,
상기 췌장암에 특이적으로 발현하는 유전자는 SMAD4, APC, GNAS 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자인 것인, 진단 키트. - 제20항에 있어서,
KRAS, MUC1, MSLN, CEACAM1, CEACAM5, MUC16 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나의 유전자에 상보적으로 결합하는 바이오틴이 결합된 프로브를 추가적으로 포함하는, 진단 키트. - 제20항에 있어서,
상기 양전하를 띠는 물질은 양전하를 띠는 나노와이어인 것인, 진단 키트. - 제23항에 있어서,
상기 나노와이어는 전도성 고분자를 포함하는 것인, 진단 키트. - 제24항에 있어서,
상기 나노와이어는 추가적으로 바이오틴을 더 포함하는 것인, 진단 키트. - 제23항에 있어서,
상기 전도성 고분자는 폴리아세틸렌(poly(acetylene)), 폴리피롤(poly(pyrrole)), 폴리티오펜(poly(thiophene)), 폴리파라페닐렌(poly(para-phenylene)), 폴리(3,4-에틸렌디옥시테오펜(poly(3,4-ethylenedioxythiophene)), 폴리페닐렌설파이드(poly(phenylene sulfide)), 폴리(파라-페닐렌비닐렌)(poly(para-phenylene vinylene)) 및 폴리아닐린(polyaniline)으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것인, 진단 키트. - 제20항에 있어서,
상기 표지자는 전도성 고분자; 히알루론산; 아비딘(avidin) 또는 스트렙타비딘(streptavidin); 및 HRP(horse-radish peroxidase) 또는 형광단백질;을 포함하는 나노입자인 것인, 진단 키트. - a) cfDNA가 포함된 개체로부터 분리된 생물학적 시료 및 양전하를 띠는 물질을 혼합시키는 혼합부;
b) cfDNA가 결합된 양전하를 띠는 물질을 제외한 시료를 제거하기 위한 수득부;
c) 상기 cfDNA가 결합된 양전하를 띠는 물질에, 췌장암에 특이적으로 발현하는 유전자에 상보적으로 결합할 수 있는 바이오틴이 결합된 프로브; 및 스트렙타비딘 및 표지자를 포함하는 나노입자를 순차적으로 또는 동시에 첨가시키는 반응부;
d) 표지자를 검출하는 검출부; 및
e) 표지자의 검출 여부에 따라 상기 시료에 프로브에 상보적인 서열을 가지며, 췌장암에서 유래된 cfDNA가 존재한다고 결정하는 정보 처리부를 포함하는,
상기 시료로부터, 증폭없이, 췌장암세포 유래의 유전자를 검출하여 췌장암을 진단하는 장치. - 제28항에 있어서,
상기 췌장암에 특이적으로 발현하는 유전자는 SMAD4, APC, GNAS 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나의 유전자에 상보적으로 결합하는 바이오틴이 결합된 프로브를 추가적으로 포함하는, 췌장암을 진단하는 장치. - 제29항에 있어서,
KRAS, MUC1, MSLN, CEACAM1, CEACAM5, MUC16 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나의 유전자에 상보적으로 결합하는 바이오틴이 결합된 프로브를 추가적으로 포함하는, 췌장암을 진단하는 장치.
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR20190039974 | 2019-04-05 | ||
KR1020190039974 | 2019-04-05 | ||
KR20190157368 | 2019-11-29 | ||
KR1020190157368 | 2019-11-29 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
KR20200117916A true KR20200117916A (ko) | 2020-10-14 |
Family
ID=72666861
Family Applications (10)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
KR1020200041230A KR102526913B1 (ko) | 2019-04-05 | 2020-04-03 | Cfdna를 이용한 대장암 진단방법 |
KR1020200041220A KR20200117907A (ko) | 2019-04-05 | 2020-04-03 | Cfdna를 이용한 전립선암 진단방법 |
KR1020200041223A KR102372425B1 (ko) | 2019-04-05 | 2020-04-03 | Cfdna를 이용한 폐암 진단방법 |
KR1020200041239A KR102526916B1 (ko) | 2019-04-05 | 2020-04-03 | Cfdna를 이용한 위암 진단방법 |
KR1020200041228A KR102526906B1 (ko) | 2019-04-05 | 2020-04-03 | Cfdna를 이용한 유방암 진단방법 |
KR1020200041245A KR20200117917A (ko) | 2019-04-05 | 2020-04-03 | Cfdna를 이용한 암 진단방법 |
KR1020200041226A KR20200117910A (ko) | 2019-04-05 | 2020-04-03 | Cfdna를 이용한 갑상선암 진단방법 |
KR1020200041227A KR20200117911A (ko) | 2019-04-05 | 2020-04-03 | Cfdna를 이용한 방광암 진단방법 |
KR1020200041243A KR20200117916A (ko) | 2019-04-05 | 2020-04-03 | Cfdna를 이용한 췌장암 진단방법 |
KR1020200041233A KR20200117914A (ko) | 2019-04-05 | 2020-04-03 | Cfdna를 이용한 담도암 진단방법 |
Family Applications Before (8)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
KR1020200041230A KR102526913B1 (ko) | 2019-04-05 | 2020-04-03 | Cfdna를 이용한 대장암 진단방법 |
KR1020200041220A KR20200117907A (ko) | 2019-04-05 | 2020-04-03 | Cfdna를 이용한 전립선암 진단방법 |
KR1020200041223A KR102372425B1 (ko) | 2019-04-05 | 2020-04-03 | Cfdna를 이용한 폐암 진단방법 |
KR1020200041239A KR102526916B1 (ko) | 2019-04-05 | 2020-04-03 | Cfdna를 이용한 위암 진단방법 |
KR1020200041228A KR102526906B1 (ko) | 2019-04-05 | 2020-04-03 | Cfdna를 이용한 유방암 진단방법 |
KR1020200041245A KR20200117917A (ko) | 2019-04-05 | 2020-04-03 | Cfdna를 이용한 암 진단방법 |
KR1020200041226A KR20200117910A (ko) | 2019-04-05 | 2020-04-03 | Cfdna를 이용한 갑상선암 진단방법 |
KR1020200041227A KR20200117911A (ko) | 2019-04-05 | 2020-04-03 | Cfdna를 이용한 방광암 진단방법 |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
KR1020200041233A KR20200117914A (ko) | 2019-04-05 | 2020-04-03 | Cfdna를 이용한 담도암 진단방법 |
Country Status (7)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20220170108A1 (ko) |
EP (1) | EP3950962A4 (ko) |
JP (1) | JP2022528278A (ko) |
KR (10) | KR102526913B1 (ko) |
CN (1) | CN113677808A (ko) |
TW (1) | TW202104598A (ko) |
WO (1) | WO2020204674A2 (ko) |
Families Citing this family (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA3156589A1 (en) * | 2019-11-06 | 2021-05-14 | David M. Kurtz | Methods and systems for analyzing nucleic acid molecules |
WO2022203093A1 (ko) * | 2021-03-22 | 2022-09-29 | 이원다이애그노믹스(주) | 암 발생여부를 진단 또는 예측하는 방법 |
US11783912B2 (en) | 2021-05-05 | 2023-10-10 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Methods and systems for analyzing nucleic acid molecules |
CN113718031B (zh) * | 2021-08-17 | 2022-05-20 | 浙江大学医学院附属妇产科医院 | 一种卵巢癌早期诊断组合物的建立 |
CN116219012A (zh) * | 2022-12-15 | 2023-06-06 | 华中科技大学同济医学院附属同济医院 | 基于血浆cfDNA片段分布特征预测宫颈癌新辅助化疗效果或复发高危分类的系统及方法 |
Family Cites Families (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2017538404A (ja) * | 2014-11-14 | 2017-12-28 | リキッド ジェノミクス,インコーポレイティド | 癌を診断及び/又は観察するための循環無細胞rnaの使用 |
KR101751962B1 (ko) | 2015-04-30 | 2017-06-30 | 주식회사 넥스바이오 | 세포-유리형 dna의 위암 진단 용도 |
KR101701618B1 (ko) | 2015-06-23 | 2017-02-13 | 국립암센터 | 전도성 고분자를 이용한 세포 유리 dna 검출용 구조체 및 이의 용도 |
US11149299B2 (en) * | 2015-06-25 | 2021-10-19 | Ramesh Vallabhaneni | Method and system for multiplex profiling of chromosomes in biological samples using target-specific DNA probes |
KR101925125B1 (ko) | 2016-06-16 | 2018-12-04 | 울산대학교 산학협력단 | Nckap1을 유효성분으로 포함하는 대장암 진단 또는 대장암 전이 예후 예측용 바이오마커 조성물 |
KR101980819B1 (ko) * | 2016-12-23 | 2019-05-21 | 주식회사 제놉시 | 자성 나노 입자가 탑재된 전도성 고분자 및 양이온성 고분자를 포함하는 세포-유리(cell-free) DNA 검출 및 회수용 자성 나노 구조체 |
AU2018266162A1 (en) * | 2017-05-10 | 2020-01-02 | Nantomics, Llc | Circulating RNA for detection, prediction, and monitoring of cancer |
JP2021526029A (ja) * | 2018-06-01 | 2021-09-30 | ジェノプシー・カンパニー・リミテッドGenopsy Co., Ltd. | 不安定セルフリーdnaを検出する方法およびそれを使用するデバイス |
-
2020
- 2020-04-03 KR KR1020200041230A patent/KR102526913B1/ko active IP Right Grant
- 2020-04-03 KR KR1020200041220A patent/KR20200117907A/ko not_active Application Discontinuation
- 2020-04-03 KR KR1020200041223A patent/KR102372425B1/ko active IP Right Grant
- 2020-04-03 CN CN202080027434.4A patent/CN113677808A/zh active Pending
- 2020-04-03 JP JP2021560412A patent/JP2022528278A/ja active Pending
- 2020-04-03 KR KR1020200041239A patent/KR102526916B1/ko active IP Right Grant
- 2020-04-03 EP EP20782477.2A patent/EP3950962A4/en active Pending
- 2020-04-03 KR KR1020200041228A patent/KR102526906B1/ko active IP Right Grant
- 2020-04-03 WO PCT/KR2020/004602 patent/WO2020204674A2/ko unknown
- 2020-04-03 KR KR1020200041245A patent/KR20200117917A/ko not_active Application Discontinuation
- 2020-04-03 KR KR1020200041226A patent/KR20200117910A/ko not_active Application Discontinuation
- 2020-04-03 US US17/594,063 patent/US20220170108A1/en active Pending
- 2020-04-03 KR KR1020200041227A patent/KR20200117911A/ko not_active Application Discontinuation
- 2020-04-03 KR KR1020200041243A patent/KR20200117916A/ko not_active Application Discontinuation
- 2020-04-03 KR KR1020200041233A patent/KR20200117914A/ko not_active Application Discontinuation
- 2020-04-06 TW TW109111543A patent/TW202104598A/zh unknown
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
KR102526916B1 (ko) | 2023-05-02 |
KR102526913B1 (ko) | 2023-05-02 |
KR20200117914A (ko) | 2020-10-14 |
US20220170108A1 (en) | 2022-06-02 |
KR20200117913A (ko) | 2020-10-14 |
EP3950962A4 (en) | 2023-01-11 |
KR20200117909A (ko) | 2020-10-14 |
KR20200117917A (ko) | 2020-10-14 |
KR20200117912A (ko) | 2020-10-14 |
KR20200117915A (ko) | 2020-10-14 |
KR20200117911A (ko) | 2020-10-14 |
WO2020204674A3 (ko) | 2020-12-17 |
CN113677808A (zh) | 2021-11-19 |
JP2022528278A (ja) | 2022-06-09 |
KR102526906B1 (ko) | 2023-05-02 |
KR20200117907A (ko) | 2020-10-14 |
WO2020204674A2 (ko) | 2020-10-08 |
KR102372425B1 (ko) | 2022-03-10 |
KR20200117910A (ko) | 2020-10-14 |
EP3950962A2 (en) | 2022-02-09 |
TW202104598A (zh) | 2021-02-01 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
KR102526916B1 (ko) | Cfdna를 이용한 위암 진단방법 | |
Xiong et al. | Recent progress in detection and profiling of cancer cell‐derived exosomes | |
JP2003532389A5 (ko) | ||
KR101701618B1 (ko) | 전도성 고분자를 이용한 세포 유리 dna 검출용 구조체 및 이의 용도 | |
TW201217787A (en) | Urine markers for detection of bladder cancer | |
Dolezal et al. | Elevated levels of glycosylphosphatidylinositol (GPI) anchored proteins in plasma from human cancers detected by C. septicum alpha toxin | |
WO2014062845A1 (en) | Compositions and methods for detecting sessile serrated adenomas/polyps | |
KR102381444B1 (ko) | 불안정한 세포유리 dna 검출 방법 및 이를 이용한 장치 | |
KR101388711B1 (ko) | 암 진단 마커로서의 보체 c9 | |
Pellitero et al. | Aptamer-based electrochemical approaches to meet some of the challenges in the fight against cancer | |
Popow-Stellmaszyk et al. | Design, synthesis, and enzymatic evaluation of novel ZnO quantum dot-based assay for detection of proteinase 3 activity | |
EP2557159A1 (en) | Prognostic method for pulmonary adenocarcinoma, pulmonary adenocarcinoma detection kit, and pharmaceutical composition for treating pulmonary adenocarcinoma | |
KR102194215B1 (ko) | 위암 진단용 바이오마커 및 이의 용도 | |
US11384126B2 (en) | Compositions and methods for inhibiting DHHC-type palmitoyltransferases for cancer treatment | |
US20050003405A1 (en) | Treatment and diagnostics of cancer | |
KR101289454B1 (ko) | 소세포폐암 및 비소세포폐암 진단 마커로서의 보체 c9 | |
JPWO2020204674A5 (ko) | ||
KR102253304B1 (ko) | 위암 재발 예측용 바이오 마커 | |
Koushanpour et al. | Molecular biointerfacing of electrochemical aptamer-based sensors for breast cancer biomarkers | |
CN1662255A (zh) | 用于治疗肿瘤的物质的用途 | |
JP2012075341A (ja) | 消化管間質腫瘍の検出用マーカー |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
E902 | Notification of reason for refusal |