JP5103398B2 - 両末端配列決定(pairedendsequencing) - Google Patents
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Description
本願は、米国仮特許出願第60/688,042号(2005年6月6日出願)、同第60/717,964号(2005年9月16日出願)、および同第60/771,818号(2006年2月8日出願)(これらの内容は、本明細書中に参考として援用される)に基づく優先権を主張する。
本発明は、NIHによって授与された助成金番号R01 HG003562の下で米国政府支援によって行なわれた。米国政府は、本発明において特定の権利を有し得る。
本発明は、核酸配列決定、ゲノム配列決定、およびその配列決定結果の隣接する配列へのアセンブリ(assembly)の分野に関する。
大きい標的核酸(例えば、ヒトゲノム)を配列決定する1つのアプローチは、ショットガン配列決定の使用である。ショットガン配列決定において、上記標的核酸は、一連のオーバーラップする核酸フラグメントを生成し、そしてこれらのフラグメントの配列を決定するために、断片化またはサブクローニングされる。オーバーラップおよび各フラグメントの配列の知見に基づいて、標的核酸の完全な配列が、アセンブリされ得る。
Smith,M.W.ら、Nature Genetics、1994年、第7巻、p.40−47
本発明の1つの実施形態は、生物体のゲノム由来の大きいセグメントであり得る標的核酸の2つの末端領域を含むDNA構築物を得るための方法に関する。その方法は、以下の工程:
(a)標的核酸を生成するために、大きい核酸分子を断片化する工程;
(b)第1の環状核酸分子を形成するために、上記標的核酸に捕捉エレメントをライゲーションする工程;
(c)上記捕捉エレメントによって分割された上記標的核酸の2つの末端を含む直鎖状核酸を生成ために、上記標的核酸を切断するが上記捕捉エレメントを切断しない制限エンドヌクレアーゼによって上記第1の環状核酸を消化する工程;
(d)第2の環状核酸を形成するために、分割エレメントを有する上記直鎖状核酸をライゲーションする工程;
(e)上記第2の環状核酸を環状の一本鎖核酸に変換する工程;
(f)一本鎖のローリングサークル型増幅(rolling circle amplification)産物を生成するために、第1のオリゴヌクレオチドを上記環状の一本鎖核酸にアニーリングさせそしてローリングサークル型増幅によって上記環状の一本鎖核酸を増幅する工程;
(g)上記一本鎖のローリング型増幅産物中に複数の二本鎖領域を形成するために、第2のオリゴヌクレオチドを上記一本鎖のローリングサークル型増幅産物にアニーリングさせる工程;および
(h)標的核酸の2つの末端領域を含む上記DNA構築物を生成するために、上記複数の二本鎖領域を切断する制限エンドヌクレアーゼによって上記一本鎖のローリングサークル型増幅産物を小さいフラグメントへと消化する工程;
を包含する。
(a)標的核酸を生成するために、大きい核酸分子を断片化する工程;
(b)アダプターを上記標的核酸の各末端にライゲーションする工程;
(c)環状核酸分子を形成するために、表示タグを上記標的核酸にライゲーションする工程;
(d)標的核酸の2つの末端領域を含む上記DNA構築物を生成するために、上記標的核酸を切断するが上記アダプターまたは上記表示タグを切断しない制限エンドヌクレアーゼによって環状核酸を消化する工程;
を包含する。
他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が関連する分野の当業者によって一般的に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書中に記載されるものと類似するかまたは等価である多くの方法および材料が、本発明の実施において使用され得るが、好ましい材料および方法は、本明細書中に記載される。
1つの実施形態において、両末端配列決定は、以下の工程において行われ得る:
(工程1A)
出発材料は、任意の核酸であり得、それらとしては、例えば、ゲノムDNA、cDNA、RNA、PCR産物、エピソームなどが挙げられる。本発明の方法が、核酸出発材料の長いストレッチ(stretch)に対して特に有効である一方で、本発明はまた、小さい核酸(例えば、コスミド、プラスミド、小さいPCR産物、ミトコンドリアDNAなど)に対して適用可能である。
上記フラグメントのサイズが、所望されるよりも変えられる場合、その核酸フラグメントは、このサイズのバリエーションを減少させるためにサイズ分画(size fractionation)され得る。
この工程において、「捕捉エレメント」が、調製される。捕捉エレメントは、先の工程由来の核酸フラグメントをライゲーションするために使用される一本鎖末端または二本鎖末端を有し得る直鎖状二本鎖核酸である。「捕捉エレメント」は、順方向アダプター末端および逆方向アダプター末端(円の厚い領域として図1Cに示される)を含む環状核酸(例えば、図1Cに示されるようなプラスミド)として増殖され得る。この環状プラスミドは、上記捕捉エレメントが使用される前に切断され得る。これらのアダプター末端は、その後の工程において可能性のあるPCRプライマーおよび配列決定プライマーに対するハイブリダイゼーション部位として機能し得る核酸配列を含む。
上記捕捉エレメントは、制限エンドヌクレアーゼ消化などの公知の技術を使用して直鎖状にされる(平滑末端または粘着末端は、異なるフラグメントの調製のために使用され得る;以下および図1Dを参照のこと)。コンカテマー形成(すなわち、互いに対する複数の捕捉エレメントのライゲーション)を防止するために、上記捕捉エレメントは、TAクローニング用のトポイソメラーゼによって脱リン酸化または改変され得る。
上記捕捉エレメントは、1つの捕捉エレメントと標的DNAの1つのフラグメントとを含む環状核酸を形成するために、工程Aまたは工程Bのフラグメント(またはサイズ分画されたフラグメント)にライゲーションされる(図1E)。上記捕捉エレメントおよび標的DNAは、周知の方法論(例えば、DNAリガーゼによるライゲーション)またはトポイソメラーゼクローニングストラテジーによって連結される。
先の工程の結果は、かなりのサイズのDNAフラグメントにライゲーションされた捕捉エレメントの収集物(collection)をもたらす。本工程は、標的DNAフラグメントの大きい内部領域を削除して、自動化されたDNA配列決定に対してより適切であり得るサイズのクローニングされた挿入部分をもたらすために使用される(図1F)。
この工程において、公知の配列の二本鎖核酸である「分割エレメント」は、環状核酸を形成するために、先の工程の消化されたゲノム材料の末端の間にライゲーションされる(図1G)。この「分割エレメント」は、2つの目的を果たす。第1に、上記分割エレメントは、ミニサークル(minicircle)のローリングサークル型増幅のためのプライミング部位(priming site)を含み得る(以下、工程Iを参照のこと)。第2に、上記分割エレメントの配列は、公知であるので、その分割エレメントは、対応した(paired)ゲノム末端の末端を標識する同定因子として機能し得る(連結した末端のトリミングおよび容易なソフトフェア分析を可能にするため)。すなわち、ゲノムフラグメントのその後の配列決定の間、上記分割エレメントの配列は、そのゲノムフラグメント全体が配列決定されたこと示す。このような分割エレメントはまた、さらなるエレメント(例えば、制限エンドヌクレアーゼ認識部位および/または制限エンドヌクレアーゼ切断部位、抗生物質耐性マーカー、原核生物または真核生物の複製起点あるいはこれらのエレメントの組み合わせを含み得る。抗生物質耐性マーカーおよび複製起点のようなエレメントの必要に応じた存在にもかかわらず、本発明の方法の利点の1つは、この方法が核酸のクローニング、増幅または他の操作のために宿主細胞(例えば、E.coli)の使用を必要としないことである。上記分割エレメントはまた、両配列末端配列決定法のために、ビオチン化される得るか、あるいはそうでなければ容易な精製または核酸濃縮のためのマーカーまたはタグによってタグ化され得る。
最後の工程から産生された環状核酸(すなわち、ミニサークル)は、一本鎖核酸を生じる傾向にある一本鎖である。これは、溶液の塩、温度またはpHを変えることによる標準的なDNA編成技術を使用して行なわれる。他のDNA変性技術は、当該分野において公知である。変性の後、おなじミニサークル由来のDNA環は、依然として連結しているが、これは、本発明の方法に影響を及ぼさない(図1H)。
プライマーは、そのプライマーにアニーリングされ得る配列をを含む分割エレメントにアニーリングする。したがって、この分割配列は、ローリングサークル型増幅のためのイニシエーターとして機能する(図1I)。
上記サンプルは、長い一本鎖産物を産生するために、ローリングサークル型増幅によって増幅される(図1J)。このローリングサークル型増幅工程の1つの利点は、分割エレメントを含まないエレメントが増幅されずかつ環が閉じていないエレメントがほとんど増幅されないことである。
1つ以上のキャッピングオリゴは、順方向アダプターおよび逆方向アダプター(それらをこれらの領域において二本鎖にする)に隣接(flank)する一本鎖の制限酵素認識部位にアニーリングされる(図1L)。キャッピングオリゴは、上記捕捉エレメントの少なくとも一部、アダプター領域の少なくとも一部、またはそれらの両方と相補的であり得る。
キャッピングされた一本鎖DNAは、キャッピングされた部位にて小さいフラグメントへと切断される(図1M)。これらの小さいフラグメントは、公知の配列の末端を有し、そして従来の増幅技術(例えば、PCR)を使用して容易に増幅され得る。
第2の実施形態において、両末端配列決定は、以下の工程において行われ得る:
(工程2A−サンプルDNAの断片化)
標的核酸の断片化およびサイズ分画サイズ分画は、先の実施形態に関するものと同じである。
所望される場合、断片化された標的核酸は、任意のメチラーゼによってメチル化され得る。好ましいメチラーゼは、制限エンドヌクレアーゼ消化に影響を及ぼすものである。メチラーゼは、少なくとも2つの異なるストラテジーにおいて使用され得る。1つの好ましい実施形態において、メチラーゼは、メチル化された制限酵素認識部位のみを切断する制限エンドヌクレアーゼによる切断を可能にする。別の好ましい実施形態において、メチラーゼは、メチル化されていないDNAを切断するだけの制限エンドヌクレアーゼによる切断を防止する。
この工程において、アダプターが、両方の末端にアダプターを有するフラグメントを生成するために、標的核酸フラグメントの末端にライゲーションされる(図2、I)。上記アダプターは任意のサイズであり得るが、10〜30塩基のサイズが好ましく、そして12〜15塩基のサイズがより好ましい。アダプターおよび/または標的核酸フラグメントのコンカテマーの形成を防止するために、上記アダプターは、平滑末端および適合しない粘着末端(すなわち、5’突出または3’突出を有する末端)を含み得る。上記アダプターが上記DNAフラグメントにライゲーションされ、そしてリガーゼが除去された後、上記粘着末端は、ポリメラーゼおよびdNTPを用いて充填され得る。
2つのヘアピンアダプターにライゲーションされるDNAフラグメントは、エキソヌクレアーゼを使用して精製され得る。このエキソヌクレアーゼ精製は、両方の末端上でヘアピンアダプターにライゲーションした二本鎖DNAが露出した5’末端または3’末端を有さないDNA分子であるという利点をとる。ライゲーション混合物中の他のDNA(例えば、一方のみがヘアピンアダプターにライゲーションされた二本鎖DNAフラグメント、ライゲーションされていないDNAフラグメントおよびライゲーションされていないアダプター)は、エキソヌクレアーゼに感受性である(図6B)。したがって、エキソヌクレアーゼに対する上記ライゲーション混合物の曝露は、2つのヘアピンアダプターおよびヘアピンアダプターダイマーにライゲーションしたDNAフラグメントを除くほとんどのDNAを除去する。ヘアピンアダプターダイマーは、そのDNAフラグメントと著しく類似するので、そのヘアピンアダプターダイマーは、サイズ分画サイズ分画カラム(例えば、スピンカラム)またはアガロースゲル電気泳動もしくはアクリルアミドゲル電気泳動などの公知の技術、あるいは当該分野において公知でありそして/または本開示において他で考察される他のポリヌクレオチドのサイズを区別する方法のうちの1つを使用して除去され得る。
標的核酸フラグメントの両方の末端に対してアダプターを付加した後、そのフラグメントは、環化される。
多くの方法が、環化のために使用され得る。
表示タグの付加および自己環化の後において、上記標的核酸フラグメントは、さらに消化または断片化される。断片化は、本開示において列挙される任意の断片化手順を使用して行なわれ得る。例えば、上記の工程1Aを参照のこと。あるいは、1種以上の制限エンドヌクレアーゼは、標的DNAを消化してフラグメントを生成するために使用され得る。
必要に応じた工程において、上記表示タグを含むフラグメントは、表示タグを有さないフラグメントに対して濃縮され得る。濃縮ための1つの方法は、サンプル調製工程においてビオチン化された表示タグの使用を含む。断片化の後に、上記表示タグを含むフラグメントは、ビオチン化される、そしてそのフラグメントは、溶液中のストレプトアビジンカラムまたはストレプトアビジンビーズを使用して精製され得る。
両末端配列決定は、第3の方法によって行なわれ得る。
この方法において、工程A〜工程Eは、第2の方法において記載された通り(すなわち、工程2A〜工程2Eの通り)に行われ得る。さらに、第3の方法において、各アダプターは、制限エンドヌクレアーゼ認識部位から約15〜25bp離れて直接DNAを切断し得るIIS型制限エンドヌクレアーゼ部位を含む。異なるIIS型制限エンドヌクレアーゼがエンドヌクレアーゼ認識部位からの種々の距離にて切断すること、およびこの距離に適応する異なるIIS型制限エンドヌクレアーゼの使用が企図されることが、公知である。
工程3Fは、表示タグが使用されないことを除いて第2の方法(工程2F)に従って行われ得る(図6Dを参照のこと)。
本発明の任意の方法において、エキソヌクレアーゼは、環化されていないフラグメントを除去するため、そしてコンカテマーになったフラグメントの存在を減少させるために、ライゲーション後に使用され得る。適切に再環化されたDNAフラグメントは、露出した5’末端または露出した3’末端を有さないので、そのDNAフラグメントは、エキソヌクレアーゼ消化に対して抵抗性である。さらに、より大きいコンカテマーは、ニックに起因して、露出した5’末端または露出した3’末端を有するより高い機会を有する。エキソヌクレアーゼ処理はまた、ニックを有するこれらのコンカテマーを除去する。
上記環化されたDNAは、ローリングサークル型増幅によって増幅され得る。簡単にいうと、オリゴヌクレオチドが、上記再環化されたDNAの一方の鎖にハイブリダイズさせるために使用され得る。このオリゴヌクレオチドプライマーは、ポリメラーゼによって伸長される。鋳型は、環状であるので、上記ポリメラーゼは、標的DNAの複数の反復を有する一本鎖コンカテマーを産生する。この一本鎖コンカテマーは、第2のプライマーをそれにハイブリダイズさせ、そしてこの第2のプライマーから伸長させることによって二本鎖になり得る。例えば、この第2のプライマーは、この一本鎖コンカテマーのアダプター配列と相補的であり得る。得られた二本鎖コンカテマーは、次の工程に直接使用され得る。
この工程において、ローリングサークル型増幅由来の環化された核酸またはコンカテマーになった核酸は、IIS型制限エンドヌクレアーゼによって消化される(図6D)。工程3Aについて記載される通り、各アダプターは、少なくとも1つのIIS型制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含む。IIS型制限エンドヌクレアーゼは、上記アダプター上のIIS型制限エンドヌクレアーゼ切断部位を認識し、そして約10〜20塩基対離れて核酸を切断する。IIS型制限エンドヌクレアーゼの例は、MmeI(約20bp)、EcoP151(25bp)またはBpmI(14bp)を含む。
本発明の任意の方法の産物は、手動か、または自動化された配列決定技術によって配列決定され得る。サンガー配列決定法またはまきサム−ギルバート配列決定法のような方法による手動の配列決定法は、周知である。自動化された配列決定法は、例えば、454 Life Sciences Corporation(Branford、CT)によって開発された454 SequencingTMのような自動化された配列決定法(これはまた、出願WO/05003375(2004年1月28日出願)ならびに同時係属中の米国特許出願USSN:10/767,779(2004年1月28日出願)、同USSN:60/476,602(2003年6月6日出願);同USSN:60/476,504(2003年6月6日出願);同USSN:60/443,471(2003年1月29日出願);同USSN:60/476,313(2003年6月6日出願);同USSN:60/476,592(2003年6月6日出願);同USSN:60/465,071(23、2003年4月23日出願);および同USSN:60/497,985(25、2003年8月25日出願)に記載される))を使用することによって行なわれ得る。
両末端配列決定は、図12に概説されるような両末端読み取りPETランダム断片化(Paired−Read PET Random Fragmentation)と称される上記に記載された方法のバリエーションを使用して行なわれ得る。この第4の方法に従う実験からの結果は、図13に示される。
この方法において、工程A〜工程Dは、第2の方法または第3の方法(すなわち、工程2A〜工程2Dまたは工程3A〜工程3D)において記載される通りに行われ得る。代替として、工程4Dは、エキソヌクレアーゼ処理したフラグメントを精製するために、SPRI(可逆的固定法(solid−phase reversible immobilization))を使用して行なわれ得る。例えば、図12中の核酸フラグメントは、ビオチン化されたプライマーにライゲーションされ、そしてその核酸フラグメントは、例えば、ストレプトアビジンでコーティングされたビーズ、アビジンでコーティングされたビーズ、減少した親和性のストレプトアビジンでコーティングされたビーズまたは減少した親和性のアビジンでコーティングされたビーズを使用して精製され得る。
自己環化の後、断片化は、本開示に列挙される任意の断片化手順を使用して行なわれ得る。1つの好ましい方法は、フラグメント上記環状核酸を機械的せん断を使用して断片化することである。機械的せん断は、例えば、ボルテックスすることによってか、小さい開口部を通して溶液中の核酸に力を銜えることによってか、または本開示において他で記載される他の類似する手順によって行なわれ得る。機械的せん断の1つの利点は、異なる長さの核酸が生成され得ることである(図12における工程Gの後の核酸を参照のこと)。
方法4の産物は、利用可能な任意の手動または自動の方法を使用して配列決定され得る。このような方法は、上記の工程3Hにおいて詳細に記載される。
両末端配列決定は、図15において概説されるような上に記載された方法のバリエーションを使用して行なわれ得る。
この方法において、工程Aは、実質的に、工程1Aに関して記載されるように行なわれ得る。標的DNAは、上に記載されるように、当該分野において公知である任意の物理的方法または生化学的方法によって断片化され得る。必要に応じて、得られたフラグメントは、本開示において他で記載される任意のサイズ分画方法によってサイズ分画され得る。
標的DNAの末端は、本明細書中に記載される任意の研磨方法によって研磨され得、そしてその末端は、アダプターでタグ化された標的DNAを形成するために、上に記載されるデオキシイノシンヘアピンアダプターにライゲーションされ得る。
上記ライゲーション反応は、1種以上のエキソヌクレアーゼ(本明細書中で他に考察されるような)によって処理され得、そして所望の反応産物を濃縮するために、本明細書中で記載される任意の方法によってサイズ分画され得る。
上記アダプターでタグ化された標的核酸は、EndoVによって切断される。切断反応についての条件は、Yaoらによって記載される条件のいずれか(Yao MおよびKowYW、J Biol Chem.1995、270(48):28609−16;Yao MおよびKow YW、J Biol Chem.1994、269(50):31390−6;Yao Mら、Ann N Y Acad Sci.1994、726:315−6;ならびにYao Mら、J Biol Chem.1994、269(23):16260−8)であり得る。当業者は、同様の条件がまた使用され得ることを認識する。
この第5の方法において、工程F〜工程Hは、第2の方法、第3の方法、または第4の方法において記載される(すなわち、工程2F〜工程2Hまたは工程3F〜工程3Hまたは工程4F〜工程4H)ように行なわれ得る。
さらなる実施形態において、両末端配列決定は、図17および図18において記載される通り、以下の工程のいくつかまたは全てを包含する方法によって行なわれ得る。
第6の方法に従って、標的DNAサンプル(例えば、ゲノムDNA)のポリヌクレオチド分子は、約500塩基より長いか、約1000塩基より長いか、約2000塩基より長いか、約5000塩基より長いか、約10000塩基より長いか、約20,000塩基より長いか、約50,000塩基より長いか、約100,000塩基より長いか、約250,000塩基より長いか、約100万塩基より長いか、または約500万塩基より長い分子へと断片化される。好ましい実施形態において、上記フラグメントは、約1.5kb長〜約5kb長の範囲である。上記断片化は、本開示において他で記載される任意の物理的方法および/または生化学的方法によって達成され得る。好ましい実施形態において、標的DNAは、物理的な力(例えば、HydroShear(登録商標)装置(Genomic Solutions)の使用)によってランダムにせん断される。上記せん断されたDNAは、次いで、所望のフラグメントサイズに関して精製され得る。この必要に応じたサイズ選択は、当該分野において公知でありそして本明細書中に記載される任意のサイズ選択方法(例えば、電気泳動および/または液体クロマトグラフィー)によって達成され得る。好ましい実施形態において、上記せん断されたDNAサンプルは、SPRI(登録商標)サイズ排除ビース(Agencourt;Hawkinsら、Nucleic Acids Res.1995(23):4742−4743)における精製によってサイズについて選択される。例えば、約2〜2.5kbのフラグメントの末端(対である)を配列決定することは、代表的な細菌ゲノム配列決定実験においてコンティグの順序付けを可能にし得る。より大きいフラグメントは、より高等な生物体(例えば、真菌、植物および動物)のゲノムの配列決定に有益であり得る。
下に記載されるように、標的DNAフラグメントに対するアダプターのライゲーションの後、そのアダプターは、環化のための調製において1種以上の制限酵素によって切断され得る。選択した制限酵素による標的DNAの消化を防止するために、その標的DNAは、対応するメチラーゼを用いた改変によって消化に対して保護される。好ましい実施形態において、上記アダプターは、ヘアピンアダプターであり、そしてそのアダプターは、EcoRI制限酵素認識部位を保有する(図18A)。したがって、好ましい実施形態において、サンプルDNAフラグメントに存在するEcoRI制限酵素認識部位は、EcoRI付着末端が上記ヘアピンアダプターから産生される場合、それらの完全性を保存するために、ライゲーションによる環化の前にEcoRIメチラーゼを使用してメチル化される。
DNAの流体力学的なせん断は、磨り減った末端(一本鎖突出)を有するいくつかのフラグメントをもたらす。平滑末端は、その後のアダプターライゲーションに好ましい。したがって、必要に応じて、任意の磨り減った末端は、酵素的にDNAポリメラーゼを用いて「充填(filling−in)」するかそして/またはエキソヌクレアーゼ(例えば、Mung Beanヌクレアーゼ)を用いて「チューイングバック(chewing−back)」するかのいずれかによって、平ら(blunt)にされ得、そしてライゲーションのために準備され得る。有益には、いくつかのDNAポリメラーゼは、エキソヌクレアーゼ活性も有する。必要に応じて、平滑化反応に次いで、好ましくは上記フラグメントの5’末端は、ポリヌクレオチドキナーゼによってリン酸化される。好ましい実施形態において、T4 DNAポリメラーゼおよびT4ポリヌクレオチドキナーゼ(T4 PNK)は、それぞれ、充填およびリン酸化のために使用される。T4 DNAポリメラーゼは、その5’→3’ポリメラーゼ活性によってDNAの3’−陥凹末端(5’−突出)を「充填する」ために使用されるが、その一本鎖3’→5’エキソヌクレアーゼ活性は、3’−突出末端を除去する。T4 PNKのキナーゼ活性は、5’−ヒドロキシ末端にリン酸基を付加する。
本発明に従って、二本鎖オリゴヌクレオチドアダプターは、標的DNAフラグメントの末端にライゲーションされる。好ましい実施形態において、上記アダプターは、ヘアピンアダプターである(図18A)。ヘアピンアダプターの1つの利点は、アダプター−アダプターライゲーション事象がアダプターダイマーのみを生じる(すなわち、マルチマーアダプターコンカテマーの形成が防止される)ことである。さらに、それらのヘアピン構造は、ライゲーションしていないフラグメントを除去するために使用されるエキソヌクレアーゼ消化からサンプルフラグメントを保護する(工程6E)。図18Aに示される1つの好ましいヘアピンアダプターの設計は、EcoRI制限酵素認識部位およびMmeI制限酵素認識部位を含む。EcoRIは、各フラグメントの末端上に付着末端を形成して(工程6F)、それらの環化を可能にする(工程6G)ために使用され得、MmeIは、その認識部位から20bp離れてDNAを切断するIIs型制限酵素である;それは、環化されたサンプルフラグメントの末端に切込みを入れて配列決定される両末端タグを産生するために使用される。当業者は、EcoRIが、上記アダプターオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列における同時変化、および標的DNAフラグメントの保護のための適切なメチラーゼの使用を伴って任意の多数の他のエンドヌクレアーゼによって置換され得ることを、認識する。同様に、MmeIは、選択した酵素が、下流配列のアセンブリに十分な長さである両末端を産生するのに十分なその制限酵素認識部位からの距離にて切断する限り、他のIIs型制限酵素によって置換され得る。好ましい実施形態において、上記ヘアピンアダプターは、例えば、図18Aに示される部位にてビオチン化される。他のビオチン化部位もまた、適切であり、そしてそのビオチン化部位は、当業者によって選択され得る。上記ビオチン部分は、両末端アダプターのライゲーションの間、充填反応(フラグメントの修復)の間、および両末端ライブラリーの増幅の間に、アダプターを含有する両末端フラグメントの必要に応じた選択および両末端ライブラリーフラグメント(MmeI消化後)の必要に応じた固定化を可能にする。
好ましくは、エキソヌクレアーゼ消化は、両方の末端にてヘアピンアダプターと適切に適合していないあらゆるDNAを除去するために、ヘアピンアダプターのライゲーションに続き;そしてSPRIサイズ排除ビーズにおける精製は、小さな望まれない分子種(例えば、アダプター−アダプターダイマー)を除去する。上記エキソヌクレアーゼ消化は、当該分野において周知である種々のエキソヌクレアーゼの1種以上によって行なわれ得る。好ましくは、その消化は、3’→5’方向および5’→3’方向の両方において一本鎖DNAおよび二本鎖DNAの消化を同時に可能にする活性の組み合わせによって達成される。好ましい実施形態において、エキソヌクレアーゼ混合物は、E.coliエキソヌクレアーゼI(3’→5’一本鎖エキソヌクレアーゼ)、ファージλエキソヌクレアーゼ(5’→3’一本鎖エキソヌクレアーゼおよび5’→3’二本鎖エキソヌクレアーゼ)およびファージT7エキソヌクレアーゼ(5’→3’二本鎖エキソヌクレアーゼ、ギャップおよびニックにて開始され得る)を含む。
好ましい実施形態において、EcoRlによるエンドヌクレアーゼ的切断は、上記ヘアピンアダプターを切断すること(図18A)によって各フラグメントの末端上に付着末端を形成し、そしてフラグメントの環化を可能にするために使用される。EcoRIによる消化は、上記フラグメントの末端においてヘアピン構造を除去し、付着末端を残す。サンプルDNAに存在する内部のEcoRI部位は、工程6Bにおいてより早期に行なわれるメチル化によって保護される。
次いで上記フラグメントは、それらの付着EcoRI末端の分子内ライゲーション環化される。したがって、上記ライゲーションの部位は、2つの部分的なヘアピンアダプター(再構成されたEcoRI部位と直結する;合計44bp)を有し、それらの部分的なヘアピンアダプターは、サンプルフラグメントの末端によっていずれかの側においてフランキングされる(flanked)。別のエキソヌクレアーゼ消化は、あらゆる環化されていないDNAを除去するために行なわれる。
次いで上記環化されたDNAフラグメントは、MmeIによって制限される。このIIs型制限酵素は、その制限酵素認識部位から約20bp離れて切断する(2ntの3’−突出を残す、すなわちその切り口は、20/18ntにある;その酵素はまた、その部位から19〜22bpの範囲の切り口を有するいくつかの少数の産物を産生する)。MmeI部位は、サンプルDNAフラグメントにライゲーションされるヘアピンアダプターの末端に存在する(図18A);これらの部位における制限は、両末端DNAライブラリーフラグメントを産生し、その両末端DNAライブラリーフラグメントは、それぞれ、ライゲーションされた「二重(double)」ヘアピンアダプター(44bp)およびサンプルフラグメントの2つの20bp末端(合計で84bpの長さにわたる)を含む。
ビオチンタグを欠如することで、ライゲーションされた「二重」ヘアピンアダプターを有さないMmeI制限フラグメントは、必要に応じて、この工程において排除され得る。両末端フラグメントのライブラリーは、ストレプトアビジンビーズまたはアビジンビーズに対する上記ヘアピンアダプターに存在するビオチンタグの結合によって、固定化され得る(そして、他のMmeI制限フラグメントから単離され得る)。
この工程において、工程6Hにおいて産生され、そして必要に応じて工程6Iにおいて精製された両末端ライブラリーフラグメントの末端は、両末端ライブラリーアダプターまたは両末端アダプターと称される二本鎖アダプターにライゲーションされる(図18B)。これらの両末端アダプターは、増幅およびヌクレオチド配列決定の両方を補助するプライミング領域を提供し、そしてその両末端アダプターはまた、454 SequencingTM System上で良好に見出すために有用な短い(例えば、4ヌクレオチド)「配列決定キー(sequencing key)」配列を含み得る。上記アダプターは、「縮合(degenerate)」した2塩基の一本鎖3’突出を有し得る。縮合は、2つの突出する塩基がランダムである(すなわち、それらが、それぞれ、G、A、T、またはCのいずれかであり得る)ことを意味する。MmeI以外の酵素が使用された場合、当業者は、他の酵素と適合性である両末端アダプターを容易に設計し得る。図18Bに示される例示のアダプターは、各アダプターを有する両末端ライブラリーフラグメントに対する指向性ライゲーションを強力に指示するように設計され、その各アダプターは、MmeIによって産生された両末端ライブラリーフラグメントの末端に専らライゲーションし得る、それらの3’末端における縮合した2bpの3’−突出を含む(但し、そのアダプターの5’末端は、リン酸化されていない、以下を参照のこと)。アダプターは、両末端ライブラリーフラグメントの利用を最大化すること、および両末端ライブラリーフラグメントのコンカテマーを形成する可能性を最小化することの両方のために、大きく過剰なモルのアダプター(15:1のアダプター:フラグメント比)を含むライゲーション反応において両末端ライブラリーフラグメントと合わせられ得る。上記アダプター自体は、アダプターダイマーの形成を最小化するために、リン酸化されない可能性があるが、結果として、ライゲーション産物は、次いで、充填反応(工程6K)によって修復されなければならない。
工程6Jにおいてライゲーションされた両末端アダプターが、リン酸化されていない場合、ギャップが、両末端ライブラリーDNAフラグメントとのそれらの3’結合部に存在する。これらの2つの「ギャップ」または「ニック」は、鎖置換型DNAポリメラーゼを使用して修復され得、ここでそのポリメラーゼは、そのニックを認識し、ニックを有する鎖を(各アダプターの自由な3’末端に)置換し、そしてニックの修復および完全長dsDNAの形成を生じる様式でその鎖を伸長する。好ましい実施形態において、Bst DNAポリメラーゼ(ラージフラグメント(Large Fragment))が、使用される。当該分野において公知である他の鎖置換型DNAポリメラーゼもまた、この工程に適している(例えば、phi29 DNAポリメラーゼ、DNAポリメラーゼI(クレノウフラグメント)、またはVent(登録商標)DNAポリメラーゼ)。
必要に応じて、「適合した(adapted)」両末端DNAライブラリーは、増幅され得る。好ましくは、その増幅は、PCRによって行なわれるが、当該分野において公知でありそして/または本明細書中に記載される他の核酸増幅方法もまた、使用され得る。好ましくは、図18Bに示されるF−PCRおよびR−PCRのオリゴヌクレオチドは、PCRプライマーとして使用され得る。
(表1.両末端読み取りの深さ分布および長さに対するMmeIキャリアDNAの効果)
本発明はまた、核酸分子の環化のための方法を包含する。一般的に、核酸分子の環化は、低い核酸濃度におけるライゲーションによって達成される。低濃度は、二次(またはより高次)反応速度論に従う分子間事象よりも、一次反応速度論に従う所望の分子内ライゲーション反応(すなわち環化)に有利に機能する(F.M.Ausubelら(編)、2001、Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley & Sons Inc.)。しかし、高い希釈度においてさえ、分子間事象を、防止できず、そして核酸の極端な希釈度は、実用的ではない。分子間ライゲーション(コンカテマー、二重の環(double−circle)など)の発生は、所望の分子内環化事象の産生を減少させる。いくつかのシナリオにおいて、分子間ライゲーション産物は、下流の適用に不利であり得る。要約すると、従来のアプローチは、少なくとも2つの主要な欠点を有する。第1に、出発核酸を希釈する必要性は、反応容量および関連する試薬のコストを増大させる。高い希釈度はまた、反応産物の効率的な回収を困難にする。第2に、多数の分子間ライゲーション事象が、起こり、所望の分子内ライゲーション産物の産生を減少させる。
ライゲーションの後、そのライゲーション反応は、停止され得、そしてエマルションは、「破壊される」(当該分野において「脱乳化(demulsification)」とも称される)。エマルションを破壊する多くの方法(例えば、米国特許第5,989,892号およびその中に引用された参考文献を参照のこと)が、存在し、そして当業者は、適切な方法を選択し得る。脱乳化に次いで、核酸を単離するための任意の適切な方法によって行われ得る核酸単離工程が行われ得る。一旦核酸が単離されると、ライゲーションされていない材料は、この課題に適した任意の方法によって除去され得、その方法の1つは、サンプルのエキソヌクレアーゼ消化を行うことである。使用される特定のエキソヌクレアーゼ酵素は、部分的に、作用される分子の型(一本鎖または二本鎖、DNAまたはRNA)および他の考慮(例えば、その工程に都合よく組み込まれる反応温度)に依存する。上記環化された材料は、上記エキソヌクレアーゼ処理の後に当該分野において公知である多くの手順(例えば、フェノール/クロロホルム抽出またはこの目的に適した任意の市販の精製キット)のうちの1つによって精製されるなければならない。
エマルションは、他の相に顕微鏡的かまたはコロイド的なサイズではない液滴として分散される1つのを含む2つの不混和性液相の不均一な系である。本発明のエマルションは、マイクロカプセル(マイクロリアクター)の形成を可能にしなければならない。エマルションは、不混和性液体の任意の適切な組み合わせから産生され得る。本発明のエマルションは、微細に分かれた液滴の形態で存在する相(分散する、内部相または不連続相)として親水性の相(生化学的成分を含む)を有し、かつこれらの液滴が懸濁されるマトリックス(分散しない、連続相または外部相)として疎水性の不混和性液体(「油」)を有する。このようなエマルションは、「油中水型」(W/O)と称される。これは、生化学的成分を含む水相全体が分離した液滴(内部相)に区分されるという利点を有する。疎水性の油である外部相は、一般に、生化学的成分を含まず、したがって不活性である。
本発明のエマルションは、1種以上の表面活性剤(エマルション安定化剤;界面活性剤)の添加によって安定化され得る。これらの界面活性剤は、乳化剤とも称され、そして相の分離を防止する(または少なくとも遅延させる)ように水/油界面にて作用する。多くの油および多くの乳化剤は、油中水型エマルションの産生に使用され得る;最近の編集物は、16,000種を超える界面活性剤を記載し、それらの多くは、乳化剤として使用される(Ash,M.およびAsh,I.(1993)Handbook of industrial surfactants.Gower、Aldershot)。本発明の方法において使用されるエマルション安定化剤としては、Atlox 4912、モノソルビタンモノオレエート(Span80;ICI)、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート(Tween80;ICI)ならびに他の認識された適切な安定化剤および市販の適切な安定化剤が挙げられる。種々の実施形態において、上記界面活性剤は、0.5〜50%、好ましくは、10〜45%、より好ましくは、30〜40%のエマルションの油相中のv/v濃度にて提供される。
この実験において使用されるオリゴヌクレオチドは、以下の通りに設計および合成される。
100μl中のE.Coli K12 DNA(20μg)を、標準的なHydroShearアセンブリ(Genomic Solutions、Ann Arbor、MI、USA)を使用して速度10で20サイクルにわたってハイドロシアー(hydroshear)した。メチル化反応を、50μlのDNA(5μg)、34.75μlのH2O、10μlのメチラーゼ緩衝液、0.25μlの32mM SAM、および5μlのEcoRlメチラーゼ(40,000ユニット/ml、New England Biolabs(NEB)、Ipswich、MA、USA)を添加することによってそのせん断したDNAにおいて行った。その反応を、37℃にて30分間インキュベートした。そのメチル化反応の後、そのせん断しメチル化したDNAを、製造業者の説明書に従ってQiagen MinElute PCR精製カラムを使用して精製した。その精製したDNAを、10μlのEB緩衝液によってカラムから溶出させた。
100μl容量におけるE.Coli K12 DNA(5μg)を、鎖アセンブリ(HydroShear、上記の通り)を使用して速度11において20サイクルにわたってハイドロシアーした。そのせん断したDNAを、製造業者の説明書に従ってQiagen MinElute PCR精製カラムにおいて精製し、そして23μlのEB緩衝液によって溶出させた。その精製しせん断したDNAを、23μlのDNAと、5μlの10×研磨緩衝液と、5μlの1mg/mlウシ血清アルブミンと、5μlの10mM ATPと、3μlの10mM dNTPと、5μlの10U/μl T4ポリヌクレオチドキナーゼと、5μlの3U/μl T4 DNAポリメラーゼとを含む反応混合物において平滑末端研磨に供した。その反応を、12℃にて15分間インキュベートし、次いでその温度を、さらに15分間にわたって25℃まで上昇させた。その反応を、次いで製造業者の説明書に従ってQiagen MinElute PCR精製カラムにおいて精製した。非ヘアピンアダプターのライゲーションを、25μlの2×Quickリガーゼ緩衝液と、18.5μlの10μM非ヘアピンアダプターと、2.5μlのQuickリガーゼ(上記の通り)とを含む反応混合物において2μgのそのせん断し精製したDNAを使用して行った。そのライゲーション反応を、25℃にて15分間インキュベートし、次いでそのサンプルを、Sephacryl 5−400スピンカラムに通し、次いでQiagen MinElute PCR精製カラムに通した。そのDNAを、次いで、10μlのEB緩衝液によってそのカラムから溶出させた。
E.coliコンティグは、4回の60×60の実行(約130万の読み取り)からの通常の454配列からもたらされた:1000bpよりも大きい303個のコンティグが、もたらされ、それは、16,858bpの平均サイズ、および94,060bpの最大サイズを有した。表3は、上記の手順を使用して得たさらなる結果を含む。
Claims (37)
- 標的核酸の2つの末端領域を含むDNA構築物を得るための方法であって、
(a)大きい核酸分子を断片化して標的核酸を生成する工程;
(b)ヘアピンアダプターを工程(a)からの該標的核酸の両端にライゲーションし、エキソヌクレアーゼを用いて消化して露出された5’末端もしくは3’末端を持つ核酸を除去し、そして、該ヘアピンアダプターを切断して環化のための粘着末端を作製する工程;
(c)表示タグを該粘着末端にライゲーションして環状核酸分子を形成する工程;
(d)該標的核酸を切断するが、該ヘアピンアダプターまたは該表示タグは切断しない制限エンドヌクレアーゼを用いて該環状核酸を消化し、該標的核酸の2つの末端領域を含むDNA構築物を生成する工程;
(e)PCRプライマーを該DNA構築物の両端にライゲーションする工程;および
(f)該DNA構築物をPCRにより増幅する工程
を包含する、方法。 - 前記制限エンドヌクレアーゼは、I型制限エンドヌクレアーゼまたはIIS型制限エンドヌクレアーゼである、請求項1に記載の方法。
- 前記標的核酸は、少なくとも50kb、少なくとも20kb、少なくとも10kbまたは少なくとも5kbである、請求項1に記載の方法。
- 前記標的核酸は、50kbと3kbとの間、20kbと3kbとの間、または10kbと3kbとの間である、請求項1に記載の方法。
- 前記表示タグは、マーカー遺伝子または複製起点を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記ヘアピンアダプターまたは前記表示タグは、ビオチン化される、請求項1に記載の方法。
- 前記消化する工程の後に、表示タグまたはヘアピンアダプターを含む核酸フラグメントを単離する工程をさらに包含する、請求項6に記載の方法。
- 標的核酸の2つの末端領域を含むDNA構築物を得るための方法であって、
(a)大きい核酸分子を断片化して標的核酸を生成する工程;
(b)第1のヘアピンアダプターを該標的核酸の一方の末端に、そして、第2のヘアピンアダプターを該標的核酸の第2の末端にライゲーションして、アダプターがタグ化された標的核酸を形成する工程であって、該第1のヘアピンアダプターおよび該第2のヘアピンアダプターは、ヘアピンエレメントを含み、そして、少なくとも一方のヘアピンアダプターがビオチン化される、工程;
(c)該アダプターがタグ化された標的核酸の該第1のヘアピンアダプターおよび該第2のヘアピンアダプターから該ヘアピンエレメントを切断して、該第1のヘアピンアダプターおよび該第2のヘアピンアダプター上に切断された末端を生成する工程;
(d)該第1のヘアピンアダプターの切断された末端を、該第2のヘアピンアダプターの切断された末端にライゲーションすることによって、該アダプターがタグ化された標的核酸を環化し、標的核酸領域とアダプター領域とを含む環状核酸分子を形成する工程;
(e)該環状核酸分子を断片化して、少なくとも1つの該標的核酸の2つの末端領域を含むDNA構築物を生成する工程であって、該DNA構築物は、該2つの末端領域の間にライゲーションされたアダプター領域を持つ、工程;ならびに
(f)アビジンまたはストレプトアビジンでコーティングされた固体支持体を用いるアフィニティー精製によって、該DNA構築物を濃縮する工程
を包含する、方法。 - 前記大きい核酸または前記標的核酸は、工程(b)の前にメチラーゼを用いてメチル化される、請求項8に記載の方法。
- 前記メチル化は、1種以上の制限エンドヌクレアーゼによる前記標的核酸の制限エンドヌクレアーゼ切断を防ぐ、請求項9に記載の方法。
- 工程(b)の後に以下の工程:
(b1)前記アダプターがタグ化された標的核酸をエキソヌクレアーゼで処理して、両端のヘアピンアダプターにライゲーションされていないあらゆる標的核酸を消化する工程;
(b2)該アダプターがタグ化された標的核酸から該エキソヌクレアーゼを除去する工程
をさらに包含する、請求項8に記載の方法。 - 前記ヘアピンエレメントの消化が、前記第1のヘアピンアダプターおよび前記第2のヘアピンアダプターを切断し、かつ該標的核酸は切断しない制限エンドヌクレアーゼを用いて、前記アダプターがタグ化された標的核酸を消化し、前記切断された末端を持つアダプターがタグ化された標的核酸を生成することを含む、請求項8に記載の方法。
- 工程(d)の後に、環化されていない標的核酸を除去する工程をさらに包含する、請求項8に記載の方法。
- 前記環化されていない標的核酸を除去する工程が、前記標的核酸をエキソヌクレアーゼに接触させる工程を包含する、請求項13に記載の方法。
- 工程(e)が機械的せん断によって行われる、請求項8に記載の方法。
- 前記標的核酸は、少なくとも50kb、少なくとも20kb、少なくとも10kbまたは少なくとも5kbである、請求項8に記載の方法。
- 前記標的核酸は、50kbと3kbとの間、20kbと3kbとの間、または10kbと3kbとの間である、請求項8に記載の方法。
- 前記標的核酸は、少なくとも500bp〜1kbの間、1kbと3kbとの間または500bpと3kbとの間である、請求項8に記載の方法。
- 前記標的核酸の2つの末端領域を含むDNA構築物は、10kb未満のサイズである、請求項8に記載の方法。
- 前記標的核酸の2つの末端領域を含むDNA構築物は、20kb未満のサイズである、請求項8に記載の方法。
- 前記標的核酸の2つの末端領域を含むDNA構築物は、40kb未満のサイズである、請求項8に記載の方法。
- 前記標的核酸の2つの末端領域を含むDNA構築物は、5kb未満のサイズである、請求項8に記載の方法。
- 前記標的核酸の2つの末端領域を含むDNA構築物は、3kb未満のサイズである、請求項8に記載の方法。
- 前記標的核酸の2つの末端領域を含むDNA構築物は、1kb未満のサイズである、請求項8に記載の方法。
- 前記標的核酸の2つの末端領域を含むDNA構築物は、500bp未満のサイズである、請求項8に記載の方法。
- 前記標的核酸の2つの末端領域を含むDNA構築物は、300bp未満のサイズである、請求項8に記載の方法。
- 工程(e)において、前記環状核酸分子は、制限エンドヌクレアーゼを用いる消化によって断片化される、請求項8に記載の方法。
- 前記制限エンドヌクレアーゼは、MmeIである、請求項2または27のいずれか1項に記載の方法。
- MmeI制限酵素認識部位を含むキャリアDNAが、前記MmeI消化の間に添加される、請求項28に記載の方法。
- 前記キャリアDNAの量は、前記環状核酸を上回るモルで添加される、請求項29に記載の方法。
- MmeI酵素および前記キャリアDNA中のMmeI部位は、化学量論の量で存在する、請求項29に記載の方法。
- 前記ヘアピンアダプターは、その二本鎖領域の各鎖中に少なくとも1個のデオキシイノシンを有し、そして前記エンドヌクレアーゼは、エンドヌクレアーゼVである、請求項12に記載の方法。
- 標的核酸の2つの末端領域を含むDNA構築物を得るための方法であって、
(a)大きい核酸分子を断片化して標的核酸を生成する工程であって、該大きい核酸または該標的核酸は、メチラーゼを用いてメチル化される、工程;
(b)ヘアピンを含む第1のアダプターを該標的核酸の一方の末端に、そして、ヘアピンを含む第2のアダプターを該標的核酸の第2の末端にライゲーションして、アダプターがタグ化された標的核酸を形成する工程;
(b1)該アダプターがタグ化された標的核酸をエキソヌクレアーゼで処理して、両端の該ヘアピンアダプターにライゲーションされていないあらゆる標的核酸を消化する工程;
(b2)該アダプターがタグ化された標的核酸から該エキソヌクレアーゼを除去する工程;
(b3)該第1のヘアピンアダプターおよび該第2のアダプターから該ヘアピンを切断し、かつ該標的核酸は切断しない制限エンドヌクレアーゼを用いて、該アダプターがタグ化された標的核酸を消化し、両端に切断されたアダプターを持つアダプターがタグ化された標的核酸を生成する工程;
(c)該第1のアダプターを、該第2のアダプターにライゲーションすることによって、該アダプターがタグ化された標的核酸を環化し、標的核酸領域とアダプター領域とを含む環状核酸分子を形成する工程;ならびに
(d)該標的核酸領域において該環状核酸分子を断片化して、該標的核酸の2つの末端領域を含むDNA構築物を生成する工程
を包含する、方法。 - 前記第1のアダプターまたは前記第2のアダプターの少なくとも一方がビオチン化される、請求項33に記載の方法。
- 工程(d)の後に、アビジンまたはストレプトアビジンでコーティングされた固体支持体を用いるアフィニティー精製によって、前記アダプターがタグ化された標的核酸を精製する工程をさらに包含する、請求項33に記載の方法。
- 前記第1のアダプターまたは前記第2のアダプターの少なくとも一方がさらにIIS型制限酵素認識部位を含み、工程(d)における前記断片化がIIS型制限酵素によって達成される、請求項33に記載の方法。
- 工程(d)の前記断片化が機械的せん断によって達成される、請求項33に記載の方法。
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