WO2012029577A1 - 単分子dnaから形成される環状dnaの作成方法 - Google Patents

単分子dnaから形成される環状dnaの作成方法 Download PDF

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晋一 水野
宏司 長藤
孝 岡村
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    • C12Q2525/30—Oligonucleotides characterised by their secondary structure
    • C12Q2525/307—Circular oligonucleotides

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing circular DNA formed only from single-molecule DNA, a novel adapter used in such a method, and a circular DNA production kit comprising the novel adapter.
  • the present invention relates to a gene identification and / or detection method using the unimolecular circular DNA obtained by the above method.
  • the present invention relates to a method for identifying and / or detecting a fusion gene that causes various pathological conditions.
  • a conventional gene analysis method includes a vector method.
  • the sequence of the full length of a gene obtained by incorporating the gene to be analyzed into a vector and growing it is determined by a sequencer.
  • the vector method requires a culture operation, it is necessary to analyze the full length of the gene with a sequencer.
  • Fig. 1 schematically shows an outline of gene analysis by the mate pair method.
  • a base sequence for binding (restriction enzyme recognition site) is bound to both ends of an analysis target gene, and the target gene is circularized.
  • the circularized gene is cut mainly at the restriction enzyme recognition site, usually using Type II restriction enzyme, and cut at 15 or more bases before and after the recognition site, preferably 25 bases or more and tens of bases or less.
  • the base sequence of the amplified and excised partial gene is determined.
  • a mate pair is a set of sequence data of base sequences obtained by decoding both ends of a single DNA fragment.
  • a method of cutting out a gene with a certain number of bases a method that cuts a predetermined number of bases by cutting a site away from the recognition site using Type II restriction enzyme, and a linker by physically cutting circular DNA with Sonication etc.
  • a method is used in which the fragments are collected with biotin attached to the DNA and the fragments are amplified by PCR and sequenced.
  • a known gene in the mate pair method, can be identified by reading a certain base sequence before and after the binding portion in a circularized gene by binding both ends of DNA. Basically, if the base sequence of a part of the head portion and tail portion of a gene is read, the sequences can be reliably differentiated for each gene, so the mate pair method has been adopted as a reliable and simple gene analysis method ( Non-Patent Documents 1 and 2). In addition, the mate-pair method is applied to next-generation sequence analysis, and is becoming increasingly important with the advent of high-speed sequencers.
  • DNA when DNA is circularized for gene analysis by the mate pair method, in addition to self-circularization with a single gene, DNA (single molecule), circularization with multiple DNA (multiple molecules) or multiple molecules (2 A linear bond of more than molecules).
  • a linear molecule composed of a plurality of molecules is separated and removed from a cyclic molecule by a subsequent operation.
  • a cyclic molecule composed of a plurality of molecules cannot be separated from a cyclic molecule composed of a single molecule and becomes a contaminant.
  • Multi-molecule circulars inhibit individual gene analysis and greatly reduce analysis specificity for the reasons described below. Specifically, when three kinds of cDNAs are to be self-circulated as shown in FIG.
  • the gene analysis by the mate pair method is to specify a gene by the base sequences of both ends of the target gene. Specifically, after binding adapters for circularization are bound to both ends of each gene, the genes are bound and circularized at both adapter sites, and then a fixed number of base sequences are formed around the adapter sites. Then, the gene is identified by cutting and analyzing the partial base sequence from each end of the initial gene as a result. Therefore, in the cyclized product of a plurality of molecules, there are a plurality of adapter sites, and both ends bound to the adapter are each one end of a different gene. Therefore, as described above, in gene analysis, the gene analysis is performed by cutting into a constant base sequence at both ends binding to the adapter by either of the two methods described above.
  • the gene fragment for analysis obtained from the circularized product contains one end of each of the different genes, and one gene is not analyzed.
  • the probability of circularization of multiple DNA molecules usually varies from several percent to several tens of percent, depending on the method, but in the analysis of known genes, it is recognized as an abnormal base sequence and can be almost excluded from the analysis sequence. As a result, complications arise, but the accuracy is only slightly reduced.
  • the mate pair method is used to detect the presence of an abnormal gene such as a fusion gene from a group of normal genes, if multiple normal genes are circularized, it is determined that the abnormal gene is present. Therefore, the presence of an abnormal gene such as a fusion gene cannot be confirmed accurately.
  • a fusion gene is a gene in which multiple (two) genes are joined together to construct a gene with a new function.
  • cancer cells have abnormal chromosomal structures such as deletion, duplication, recombination, and translocation.
  • Gene splitting and linking occur at the DNA level, and a fusion gene is formed when a structural gene is present at each breakpoint.
  • fusion genes are lethal to cells, meaningless, and in many cases do not cause clinical problems.
  • the fusion protein produced from the fusion gene inhibits the regulation of cell proliferation and thereby abnormally promotes cell proliferation, it becomes clinically prominent as a tumor or the like.
  • the fusion gene was said to be expressed mainly in hematopoietic tumors, but in recent years, it has been estimated that the fusion gene is also involved in epithelial solid tumors (Non-patent Document 3). Among them, responsible fusion genes were discovered from prostate cancer and lung cancer (Non-patent Documents 4 and 5).
  • fusion genes that is, confirmation of their presence
  • cancers cancers
  • rapid diagnosis of a disease state becomes possible by detecting a known fusion gene known to correspond to the disease state.
  • discovery of new fusion genes will also lead to the discovery of drug discovery targets.
  • Non-patent Document 6 chromosomal analysis has been limited for solid tumors, and analysis and confirmation of fusion genes has been extremely difficult, but recently, new methods such as cDNA functional expression analysis by Mano et al. Have been developed. However, this technique is still insufficient due to operational complexity and accuracy problems (Patent Document 1). Recently, various gene next-generation high-speed sequencers have been developed, and high-speed sequence analysis of genes has been remarkably advanced, and analysis in a short time is becoming possible. This has led to the search for fusion genes by high-speed, large-scale base sequence analysis of tumor genomes and genes (Non-patent Document 6).
  • FIG. 4 A schematic diagram in the case of analyzing the fusion gene by the mate pair method is shown in FIG.
  • FIG. 4 A schematic diagram in the case of analyzing the fusion gene by the mate pair method is shown in FIG.
  • FIG. 4 there is a possibility that a plurality of cDNAs may form one circular DNA.
  • sequence analysis using the mate pair method is performed, even if it is a normal gene, it appears as if it is a fusion gene. Results. If this is excluded because it does not exist in the conventional gene sequence, the fusion gene will be excluded as well, and it will be virtually impossible to confirm the presence of the fusion gene.
  • an object of the present invention is to provide a method that enables one circular DNA to be prepared from one DNA.
  • the present inventors can form a circular DNA consisting of only a single molecule by introducing an adapter having a specific structure containing a unique sequence recognition site into a single DNA molecule and performing two-step ligation. I found what I could do. The present inventors have found a method that ensures that only single-molecule DNA is circularized and does not cause circularization between multiple molecules by a plurality of DNAs.
  • the present invention provides a method for producing circular DNA comprising circular DNA formed from single-molecule DNA and not including circular DNA formed from multiple-molecule DNA, comprising the following steps: 1) First-stage circularization adapter (A) is bound to one end of each target DNA molecule, and adapter (b) and adapter (A) for second-stage circularization are included at the other end ( B) binding step; where the adapter (B) binds to the DNA molecule via the adapter (b) side, and the adapter (A) in the adapter (B) is the DNA molecule and the adapter (b) Located outside the bond with, here, Adapter (A) contains a cleavage site that produces a cleavage end that binds non-specifically to the cleavage end of any adapter (A): Adapter (b) contains a cleavage site that produces a cleavage end that specifically binds only to the cleavage end from the same adapter (b); 2) a first cleavage step
  • the adapter (b) specifically binds only to the cleavage ends derived from the same adapter (b), and thus linearization due to circularization of a plurality of DNA molecules substantially occurs.
  • the DNA that is circularized without any change becomes a single molecule DNA.
  • linear DNA molecules that are not circularized must be removed as described above.
  • step 6 a very small amount of single-molecule DNA that was cleaved in step 5) and not recombined in part and multiple DNA molecules were circularized in most of step 3).
  • step 5 it is single-molecule or multi-molecule DNA that could not be recombined after cleaving each adapter (b).
  • the adapter (A) is a double-stranded DNA containing restriction enzyme sites whose cut ends recognize sequences complementary to each other, such as a restriction that recognizes a palindromic sequence. Double-stranded DNA containing enzyme sites.
  • the present invention provides a method for producing a single circular DNA comprising the circular DNA formed from single-molecule DNA and not including circular DNA formed from a plurality of molecular DNAs, comprising the following steps: I will provide a: 1) First-stage circularization adapter (A) is bound to one end of each target DNA molecule, and adapter (b) and adapter (A) for second-stage circularization are included at the other end ( B) binding step; where the adapter (B) binds to the DNA molecule via the adapter (b) side, and the adapter (A) in the adapter (B) is the DNA molecule and the adapter (b) Located outside the bond with, here,
  • the adapter (A) is a double-stranded DNA containing a restriction enzyme site that recognizes a palindromic sequence,
  • the adapter (B) includes the adapter (b) and the adapter (A), and the adapter (b) includes the same nicking enzyme recognition site or restriction enzyme site oriented in the opposite directions and in the opposite
  • a double-stranded DNA comprising a double-stranded DNA sequence having a sequence unique to each adapter (b) between the aligned nicking enzyme recognition sites or restriction enzyme sites, and oriented in the opposite direction
  • the cleavage site recombines only with the cleavage site derived from the same adapter (b); 2) a first cleavage step of cleaving the DNA molecule obtained in step 1) with a restriction enzyme that recognizes a restriction enzyme site contained in the adapter (A); 3) a first-stage circularization step in which both ends of the DNA molecule obtained in step 2) are ligated and circularized; 4) A step of removing DNA in which the single molecule and the plurality of molecules bound in the step 3) are linearized without being circularized; 5) a second cleavage step of cleaving the circular DNA molecule obtained in step 3) and step 4) with the nicking enzyme or restriction enzyme that recognize
  • the second aspect of the present invention is further formed by circularizing the adapter (b) by binding via partially different cleavage sequence sites (miss annealing) in the step 6).
  • the adapter (A) is a double-stranded DNA comprising a restriction enzyme site X that recognizes a palindromic sequence
  • the adapter (B) is a double-stranded DNA composed of mutually complementary double-stranded DNAs having the following structure y 1 -Yy 2 -X: [In the structure, X is a double-stranded DNA that is a restriction enzyme site that recognizes a palindromic sequence; y 1 and y 2 are double stranded DNAs containing identical nicking enzyme recognition sites or restriction enzyme sites oriented in opposite directions to each other; Y is a double-stranded DNA sequence having a sequence unique to each DNA molecule to be circularized, n is an integer of 1 to 40, and N 1 to N n may be the same or different even if well, dAMP, dCMP, a deoxyribonucleotide selected from the group consisting of dGMP and dTMP, n
  • y 1 and y 2 comprise a nicking enzyme recognition site, more preferably the nicking enzyme is Nb.BtsI with 6 base recognition or Nt.BsqQI with 7 base recognition.
  • y 1 and y 2 may include restriction enzyme sites.
  • the present invention provides an adapter for producing circular DNA comprising double-stranded DNAs complementary to each other having the following structure y 1 -Yy 2 -X:
  • X is a double-stranded DNA that is a restriction enzyme site that recognizes a palindromic sequence
  • y 1 and y 2 are double stranded DNAs containing identical nicking enzyme recognition sites or restriction enzyme sites oriented in opposite directions to each other
  • Y is a double-stranded DNA sequence having a sequence unique to each DNA molecule to be circularized
  • n is an integer of 1 to 40, and N 1 to N n may be the same or different even if well, dAMP, dCMP, a deoxyribonucleotide selected from the group consisting of dGMP and dTMP, n '1 ⁇ n' n , respectively to the n 1 ⁇ n n below:
  • k is an integer from 1 to n].
  • the adapter according to the third aspect of the present invention corresponds to the adapter (B) according to the second aspect of the present invention, and is composed of circular DNA formed from the unimolecular DNA of the present invention, and is formed from multiple molecular DNA. It is preferably used in a method for producing circular DNA that does not contain circular DNA.
  • y 1 and y 2 comprise a nicking enzyme recognition site, more preferably the nicking enzyme is Nb.BtsI with 6 base recognition or Nt.BsqQI with 7 base recognition. is there.
  • y 1 and y 2 may include restriction enzyme sites.
  • the present invention further provides the adapter according to the third aspect described above in the fourth aspect (also simply referred to as adapter (B)), and the same restriction enzyme site as the restriction enzyme site in X contained in the adapter (B).
  • a kit for producing a circular DNA comprising an adapter composed of a double-stranded DNA comprising (also simply referred to as adapter (A)) is provided.
  • the present invention also provides, in the fifth aspect, a method for preparing a cDNA library using the method of the first or second aspect.
  • the present invention further provides, in the sixth aspect, a method for identifying a gene by subjecting the circular DNA molecule obtained by using the method of the first or second aspect to the mate pair method, comprising the following steps: To: 1) Decoding a base sequence of 15 to 600 bases adjacent to both sides of the adapter (B) in the circular DNA molecule obtained by using the method of the first or second aspect; 2) A step of identifying a gene contained in a circular DNA molecule by comparing the decoded base sequence with sequences at both ends of a known gene.
  • the base sequence to be decoded is 15 to 100 bases, more preferably 25 to 35 bases.
  • the method of the present invention can be carried out even if 600 bases or more are decoded.
  • the present invention further provides a method for detecting a fusion gene by subjecting the circular DNA molecule obtained by using the method of the first or second aspect to the mate pair method, which comprises the following steps: provide: 1) Decoding a base sequence of 15 to 600 bases adjacent to both sides of the adapter (B) in the circular DNA molecule obtained by using the method of the first or second aspect; 2) A step of comparing the decoded base sequence with the sequences at both ends of a known gene, where the genes contained in the circular DNA molecule are fusion genes when the genes at both ends correspond to known different genes Identified.
  • the base sequence to be decoded is 15 to 100 bases, more preferably 25 to 35 bases.
  • the method of the present invention can be carried out even if 600 bases or more are decoded.
  • the known fusion gene when the sequences on both sides adjacent to both sides of the adapter (B) correspond to the ends on both sides of the known fusion gene, the known fusion gene is detected.
  • a method for detecting a disease characterized by expression of the fusion gene using the fusion gene detected by the method of the seventh aspect as a marker is provided Is done.
  • the sequences adjacent to both sides of the adapter (B) correspond to the end sequences of different genes and do not correspond to the ends of both sides of the known fusion gene, the gene contained in the circular DNA molecule is newly fused. Identified as a gene.
  • the detected novel fusion gene is suitably used for drug discovery screening.
  • the present invention in the circularization of DNA, by providing a circularization method of only single molecule DNA that substantially prevents circularization by a plurality of molecules, there is a problem of contamination in gene analysis such as mate pair analysis. This solves the problem and enables highly accurate analysis. Further, by applying the method of the present invention to detection / analysis of fusion genes, it becomes possible to analyze fusion genes with high accuracy and provide an effective diagnostic tool.
  • FIG. 1 schematically shows an outline of gene analysis by the mate pair method.
  • FIG. 2 schematically shows problems in gene analysis by the mate pair method.
  • FIG. 3 shows a schematic diagram when the fusion gene is analyzed by the mate pair method.
  • FIG. 4 schematically shows problems in analyzing a fusion gene by the mate pair method.
  • FIG. 5 schematically shows the first cutting step of the two-stage cyclization method according to the present invention.
  • FIG. 6 schematically shows the first cyclization, second cutting, and second cyclization steps of the two-stage cyclization method according to the present invention.
  • FIG. 7 shows a schematic diagram when the method of the present invention is applied to cDNA synthesized from mRNA.
  • FIG. 8 shows a schematic diagram when the method of the present invention is applied to a genomic library.
  • FIG. 9 shows the experimental results of Example 4 that demonstrate that application of the method of the present invention reduces the amount of circularized DNA produced by multiple molecules.
  • the present invention comprises a circular DNA formed from single-molecule DNA, comprising the following steps, and does not include circular DNA formed from multiple-molecule DNA.
  • the first aspect of the present invention is a technique that substantially allows circularization from only one gene (DNA) and prevents circularization from a plurality of genes (DNA).
  • the method of the first aspect of the present invention is characterized by two-stage cyclization.
  • the method of the first aspect will be described in the order of steps.
  • a first-step circularization adapter (A) is bound to one end of each target DNA molecule, and the adapter (b) and the adapter (A) are included at the other end.
  • the adapter (B) is bound to the DNA molecule via the adapter (b) side, so that the adapter (A) in the adapter (B) is outside the bond between the DNA molecule and the adapter (b).
  • the adapter (A) is bound to one end of each target DNA molecule, and the adapter (B) is bound to the other end, and the adapter (A) in the adapter (B) is located on the end side of the adapter (b).
  • the adapter (A) is positioned at both ends of each target DNA molecule.
  • the adapter (A) includes a cleavage site that generates a cleavage end that non-specifically binds to the cleavage end of any adapter (A), and the adapter (b) is a cleavage end derived from the same adapter (b). It contains a cleavage site that produces a cleavage end that specifically binds only. That is, the adapter (A) does not exhibit binding specificity, and can be non-selectively bound between the cleavage ends derived from any adapter (A). On the other hand, the adapter (b) has a different structure for each target DNA molecule, and can be recombined only with a cleavage end derived from the same adapter (b). It cannot be rejoined.
  • Step 2) is a first cleavage step of cleaving the DNA molecule obtained in step 1) at the cleavage site of the adapter (A). Since the adapter (A) is bound to both ends of the DNA molecule obtained in step 1), the first cleavage step generates a cleavage end derived from the adapter (A) at both ends of each DNA molecule.
  • Step 3) is a first-stage circularization step in which both ends of the DNA molecule obtained in Step 2) are combined to be circularized.
  • the first-stage circularization is circularization by the adapter (A), and the cleavage ends derived from the adapter (A) generated at both ends of each DNA molecule are bonded to each other to cause circularization.
  • the adapter (B) is incorporated into the cyclic molecule together with the adapter (A) during the first-stage cyclization.
  • the function of the adapter (A) has no specificity and does not have selectivity due to rebinding of both ends of the target DNA molecule.
  • Step 4) is a step of removing DNA in which a single molecule and a plurality of molecules that are linearized without being circularized in Step 3) are bound.
  • Step 5) is a second cleavage step of cleaving the circular DNA molecule obtained in Step 3) and Step 4) at the cleavage site of the adapter (b). That is, cleavage is performed at the adapter (b) incorporated into each DNA molecule that has been circularized in step 3) to produce a linear molecule.
  • cleavage ends derived from the adapter (b) are generated at both ends of each DNA molecule.
  • the cleavage end generated by cleavage is substantially incapable of binding with a cleavage end derived from another cyclic molecule.
  • Step 6) is a second-stage circularization step in which both ends of the DNA molecule obtained in Step 5) are combined and circularized. That is, there are cleavage ends derived from the adapter (b) at both ends of each DNA molecule obtained in step 5).
  • the adapter (b) has a different configuration for each target DNA molecule. And can be recombined only with a cleavage end derived from the same adapter (b) and cannot be recombined with a cleavage end derived from a different adapter (b).
  • Second-stage cyclization is performed by joining the cut ends. Due to the specificity of this adapter (b), only a single molecule of each target DNA molecule is circularized.
  • the adapter (b) has binding specificity, and when the portion of each adapter (b) is cleaved, at the time of rebinding cyclization, only the portion that was bound in the original cyclized product is rebound. It cannot be recombined with other parts. Therefore, in the case of recombination cyclization in the case of cyclization of a plurality of molecules, there is nothing other than the recombination cyclization in the original plurality of molecules, and this probability is extremely low and substantially as described later. 0.
  • the probability of cyclization with a single molecule is generally high from its concentration, resulting in substantially only unimolecular cyclization.
  • the linear molecules that are not circularized can be separated and eliminated by the action of exonuclease.
  • the structures of the adapters (A) and (b) are not particularly limited as long as they fulfill the above functions.
  • examples of adapters (A) include those containing restriction enzyme sites that recognize palindromic structures
  • examples of adapters (b) include at least 4 bases, preferably Is a double-stranded DNA composed of nucleic acids complementary to each other having 5 or more bases, and those that produce complementary single-stranded ends upon cleavage are exemplified.
  • the adapters (A) and (b) are not limited to these.
  • a substance that is cleaved and becomes a key and keyhole relation may be used.
  • the method of the present invention can be carried out even in the case of a non-palindromic sequence cleavage site, in which case the upstream adapter (A1) and the downstream adapter (A2) are distinguished, and (A1) (A2) are It is set as the structure which mutually couple
  • the circularized product of a plurality of genes (multiple molecules), which becomes a contaminant, is eliminated, and the circularized product of only a single molecule (one gene) is excluded. Can be created.
  • the second aspect of the present invention is a circular DNA comprising a circular DNA formed from a single molecule DNA and not including a circular DNA formed from a plurality of molecular DNAs, comprising the following steps: Provides a way to create: 1) First-stage circularization adapter (A) is bound to one end of each target DNA molecule, and adapter (b) and adapter (A) for second-stage circularization are included at the other end ( B) binding step; where the adapter (B) binds to the DNA molecule via the adapter (b) side, and the adapter (A) in the adapter (B) is the DNA molecule and the adapter (b) Located outside the bond with, here,
  • the adapter (A) is a double-stranded DNA containing a restriction enzyme site that recognizes a palindromic sequence,
  • the adapter (B) includes the adapter (b) and the adapter (A), and the adapter (b) includes the same nicking enzyme recognition site or restriction enzyme site
  • a double-stranded DNA comprising a double-stranded DNA sequence having a sequence unique to each adapter (b) between the aligned nicking enzyme recognition sites or restriction enzyme sites, and oriented in the opposite direction
  • the cleavage site recombines only with the cleavage site derived from the same adapter (b); 2) a first cleavage step of cleaving the DNA molecule obtained in step 1) with a restriction enzyme that recognizes a restriction enzyme site contained in the adapter (A); 3) a first-stage circularization step in which both ends of the DNA molecule obtained in step 2) are ligated and circularized; 4) A step of removing DNA in which the single molecule and the plurality of molecules bound in the step 3) are linearized without being circularized; 5) a second cleavage step of cleaving the circular DNA molecule obtained in step 3) and step 4) with the nicking enzyme or restriction enzyme that recognize
  • step 6 circularized DNA formed by binding and circularizing the adapter (b) through partially different cleavage sites is obtained using an endonuclease. It is preferable to further include a step of decomposing.
  • step 1) as schematically shown in FIG. 5, a first-stage circularization adapter (A) is bound to one end of each target DNA molecule, and the adapter (b) and the adapter are connected to the other end.
  • the second-stage circularization adapter (B) containing (A) is bound.
  • the adapter (B) binds to the DNA molecule via the adapter (b) side, and the adapter (A) in the adapter (B) is located outside the bond between the DNA molecule and the adapter (b). To do.
  • the adapter (A) is a double-stranded DNA containing a restriction enzyme site that recognizes a palindromic sequence
  • the adapter (B) includes the adapter (b) and the adapter (A)
  • the adapter (b) Includes the same nicking enzyme recognition sites or restriction enzyme sites oriented in opposite directions, and between each of the same nicking enzyme recognition sites or restriction enzyme sites oriented in the opposite directions, each adapter (b)
  • the double-stranded DNA comprising a double-stranded DNA sequence having a unique sequence in The cleavage site recombines only with the cleavage site derived from the same adapter (b).
  • Adapter (A) This adapter is a sequence for cleaving with a restriction enzyme in the first step and then performing gene ligation in anticipation of circular DNA. Therefore, any restriction enzyme site that recognizes a palindromic sequence may be included. Preferably, it contains a restriction enzyme site that recognizes a rare gene sequence that does not cut the target DNA as much as possible. Examples of restriction enzyme sites contained in the adapter (A) include NotI and EcoRI.
  • This nick-created enzyme recognition site or restriction enzyme site is for cleaving in the second stage to form a gene-cutting overhang specific for each molecule.
  • the nicking enzyme cuts only one of the DNA strands, and the restriction enzyme cuts both double strands of the DNA strand at the same time, but can be introduced at any recognition site.
  • the adapter (b) When the adapter (b) is cleaved by the same nicking enzyme recognition site or restriction enzyme site oriented in opposite directions, a cleavage site is generated, and this cleavage site is regenerated only with a cleavage site derived from the same adapter (b). It is to be combined.
  • the length of the cleavage site is not limited in the case of a nicking enzyme, but in the case of a restriction enzyme, a restriction occurs as shown in the following example. Therefore, the nicking enzyme is preferable in order to freely adjust the length of the cleavage site.
  • nicked enzyme recognition site In the case of the nick creation enzyme recognition site In case of restriction enzyme 1 In case of restriction enzyme 2 In case of restriction enzyme 3 In the case of this format, it is necessary to prepare two equivalent N sequences by using a primer extension method from a loop structure.
  • the cleavage site is a portion corresponding to each molecule-specific gene cut overhang.
  • the number of bases is limited when the restriction enzyme is used, but the length can be freely set with the nick preparation enzyme. To increase the specificity, the longer the number of bases at the cleavage site, the better. However, when the length is too long, the possibility of gene binding due to mismatch increases.
  • the sequence of the cleavage site is a random combination and is designed to be different for each DNA molecule.
  • an adapter (B) having the following sequence can be prepared by nucleic acid synthesis and used in the method of the present invention.
  • Step 2) is a first cleavage step of cleaving the DNA molecule obtained in step 1) with a restriction enzyme that recognizes a restriction enzyme site contained in the adapter (A) (FIG. 5).
  • Step 3) is a first-stage circularization step in which both ends of the DNA molecule obtained in step 2) are ligated and circularized (FIG. 6: first circularization).
  • Step 4) is a step of removing DNA in which a single molecule and a plurality of molecules that are linearized without being circularized in Step 3) are bound.
  • Step 5) is a second cleavage that cleaves the circular DNA molecule obtained in step 3) and step 4) with a nicking enzyme or restriction enzyme that recognizes the nicking enzyme recognition site or restriction enzyme site in adapter (b). It is a process.
  • Step 6) is a second stage circularization step in which both ends of the DNA molecule obtained in Step 5) are ligated and circularized (FIG. 6: cleavage recirculation).
  • FIG. 6 cleavage recirculation
  • the adapter (A) is a double-stranded DNA containing a restriction enzyme site X that recognizes a palindromic sequence
  • the adapter (B) has the following structure y 1 -Yy 2.
  • a double-stranded DNA consisting of double-stranded DNAs complementary to each other having -X [In the structure, X is a double-stranded DNA that is a restriction enzyme site that recognizes a palindromic sequence; y 1 and y 2 are double stranded DNAs containing identical nicking enzyme recognition sites or restriction enzyme sites oriented in opposite directions to each other; Y is a double-stranded DNA sequence having a sequence unique to each DNA molecule to be circularized, n is an integer of 1 to 40, and N 1 to N n may be the same or different even if well, dAMP, dCMP, a deoxyribonucleotide selected from the group consisting of dGMP and dTMP, n '1 ⁇ n' n , respectively to the n 1 ⁇ n n below: Where k is an integer from 1 to n].
  • n is 1 to 40, preferably n is 4 to 15, and more preferably n
  • Y Y site is a pair of base sequences randomly combined. For example, if Y is composed of 8 base sequences, the combination is 4 to the 8th power. As a result, it is possible to specify (select) the formation of the circular pair, and to recombine only with the original pair. As a result, only a single DNA can be recircularized, and the Y part of other molecules has a different structure and cannot be recombined.
  • N the number of nucleic acids in the Y portion
  • the method for producing the Y portion of the adapter (B) can be basically produced by synthesizing the main chain by random sequential condensation that defines N (number) and does not define nucleic acid, and polymerase extension reaction using a primer of a common sequence. .
  • y 1 and y 2 comprise a nicking enzyme recognition site, more preferably the nicking enzyme is Nb.BtsI.
  • y 1 and y 2 may include a restriction enzyme site.
  • the third aspect of the present invention is a suitable adapter (B) used in the method of the second aspect of the present invention, that is, the following structure y 1 -Yy 2 -X
  • an adapter for producing circular DNA comprising double-stranded DNAs complementary to each other having: [In the structure, X is a double-stranded DNA that is a restriction enzyme site that recognizes a palindromic sequence; y 1 and y 2 are double stranded DNAs containing identical nicking enzyme recognition sites or restriction enzyme sites oriented in opposite directions to each other; Y is a double-stranded DNA sequence having a sequence unique to each DNA molecule to be circularized, n is an integer of 1 to 40, and N 1 to N n may be the same or different even if well, dAMP, dCMP, a deoxyribonucleotide selected from the group consisting of dGMP and dTMP, n '1 ⁇ n'
  • y 1 and y 2 comprise a nicking enzyme recognition site, more preferably the nicking enzyme is Nb.BtsI or Nt.BsqQI. It is. y 1 and y 2 may include a restriction enzyme site.
  • the fourth aspect of the present invention provides a kit for producing circular DNA comprising a suitable adapter (A) and adapter (B) used in the method of the second aspect of the present invention.
  • a suitable adapter (A) and adapter (B) used in the method of the second aspect of the present invention comprising a suitable adapter (A) and adapter (B) used in the method of the second aspect of the present invention.
  • the adapter (A) comprising a double-stranded DNA containing the same restriction enzyme site as the restriction enzyme site in X described in the third aspect
  • the adapter (B) described in the third aspect A kit for producing circular DNA is provided.
  • the kit for producing circular DNA of the present invention comprises an adapter (A) and an adapter (B), which are bound to both ends of the target DNA molecule, and the two-step circularization according to the first or second aspect of the present invention.
  • the fifth aspect of the present invention provides a method for preparing a cDNA library using the two-step circularization method according to the first or second aspect of the present invention.
  • a cDNA library containing circularized DNA consisting only of unimolecular DNA can be prepared.
  • the sixth aspect of the present invention is to subject a circular DNA molecule obtained using the method according to the first or second aspect of the present invention to the mate pair method, comprising the following steps: Provides a method for identifying genes by: 1) Decoding a base sequence of 15 to 600 bases adjacent to both sides of the adapter (B) in the circular DNA molecule obtained by using the method according to the first or second aspect of the present invention; and , 2) A step of identifying a gene contained in a circular DNA molecule by comparing the decoded base sequence with sequences at both ends of a known gene.
  • Step 1) of the method of the sixth aspect of the present invention comprises 15 each adjacent to both sides of the adapter (B) in the circular DNA molecule obtained using the method according to the first or second aspect of the present invention. It is a step of decoding a base sequence of not less than 600 bases.
  • the base sequence to be decoded is 15 to 100 bases, more preferably 25 to 35 bases.
  • the method of the present invention can be carried out even if 600 bases or more are decoded.
  • the base sequence can be decoded using methods and sequencers well known to those skilled in the art.
  • Step 2) of the method of the sixth aspect of the present invention is a step of identifying a gene contained in a circular DNA molecule by comparing the decoded base sequence with sequences at both ends of a known gene. If it is confirmed that the decoded base sequence corresponding to the both ends of the target DNA molecule is identical to the both ends of the known gene, the target DNA molecule is identified as the known gene. .
  • the seventh aspect of the present invention is to subject the circular DNA molecule obtained by using the method according to the first or second aspect of the present invention to the mate pair method, comprising the following steps: Provides a method for detecting a fusion gene by: 1) Decoding a base sequence of 15 to 600 bases adjacent to both sides of the adapter (B) in the circular DNA molecule obtained by using the method according to the first or second aspect of the present invention; and , 2) A step of comparing the decoded base sequence with the sequences at both ends of a known gene, where the genes contained in the circular DNA molecule are fusion genes when the genes at both ends correspond to known different genes Identified.
  • Step 1) of the method of the seventh aspect of the present invention comprises 15 each adjacent to both sides of the adapter (B) in the circular DNA molecule obtained using the method according to the first or second aspect of the present invention. It is a step of decoding a base sequence of not less than 600 bases.
  • the base sequence to be decoded is 15 to 100 bases, more preferably 25 to 35 bases.
  • the method of the present invention can be carried out even if 600 bases or more are decoded.
  • the base sequence can be decoded using methods and sequencers well known to those skilled in the art.
  • Step 2) of the method of the seventh aspect of the present invention is a step of comparing the decoded base sequence with the sequences at both ends of a known gene.
  • the gene contained in the circular DNA molecule is identified as a fusion gene. That is, the portion corresponding to one end of the decoded base sequence corresponding to the both ends of the target DNA molecule is the same as one end of the known gene, and the portion corresponding to the other end is another known If it is the same as one end of the gene, the target DNA molecule is identified as a fusion gene composed of two known genes.
  • the target DNA is detected as a known fusion gene.
  • the relationship between the expression of a known fusion gene and a disease is known, it is possible to detect a disease characterized by the expression of the fusion gene by using the fusion gene detected by such a method as a marker. .
  • the gene contained in the circular DNA molecule is a new fusion gene. Is identified.
  • the novel fusion gene detected by such a method can be used in drug discovery screening.
  • Example 1 Application of the method of the present invention to discovery of a fusion gene using cDNA synthesized from mRNA
  • a complementary strand DNA is synthesized with reverse transcriptase using an oligonucleotide (1) having a polyT sequence complementary to the polyA site at the 3 ′ end of mRNA.
  • a specific oligonucleotide sequence (2) is incorporated at the 5 ′ end of the mRNA as shown in FIG.
  • DNA synthesis is performed from an oligonucleotide complementary to this specific sequence, or a cDNA library is prepared by PCR.
  • the adapter (B) is introduced into the oligonucleotide (1) sequence having a polyT sequence complementary to the polyA site at the 3 ′ end of mRNA.
  • a cDNA library is synthesized by adding an adapter (A) to the nucleotide (2) sequence, it automatically has the basic structure of the present invention, and a new sequence needs to be bound to the right end and the left end. You can proceed to the next step.
  • a cDNA library is further amplified by PCR, a specific N base sequence is amplified if it is amplified as it is.
  • a 5 'phosphate group-added primer is used as the upstream primer
  • the downstream primer is amplified using a primer containing N bases, and the phosphate group primer is incorporated after PCR.
  • the other strand is digested with ⁇ exonuclease, and then the primer-extension is performed again from the upstream primer to complete a cDNA library that maintains diversity by N bases.
  • this process is not necessary for the adapter binding method, and the following adapter binding method is performed in order to introduce the adapter of the present invention after modification such as fragmentation of the library.
  • restriction enzyme sequences can be introduced at the 3 ′ end and 5 ′ end, respectively, as shown in FIG. .
  • the normal palindromic sequence can be used as a restriction enzyme, or a non-palindromic sequence can be used to distinguish the ends. It is also possible to bind the adapter to the shape of the protruding base. This method is desirable for introducing the adapter of the present invention after modifying the library.
  • Example 2 Application of the method of the present invention to mate pair analysis of genomes
  • a genome is targeted, the situation is different from that of a cDNA library.
  • genomic fragments cannot distinguish between left and right DNA fragments. Therefore, the adapter at the left end and the adapter at the right end are both bound as shown in FIG. 8, and both adapters are bound appropriately, that is, only (a) in FIG.
  • the sequence can be selected by inserting a non-palindromic sequence as a sequence, or by installing a plurality of restriction enzyme sites at the same site using a restriction enzyme (such as BstXI) containing the N region.
  • a restriction enzyme such as BstXI
  • the adapters (A) and (B) are added to both ends of the DNA molecule by using the following procedure, respectively.
  • the adapter (A) is first bound to a plurality of DNA groups having a certain concentration determined according to the number of target DNA molecules.
  • the amount of adapter (A) added is less than the target DNA molecular weight present.
  • it may be the same as the number of target DNA molecules, or a single base overhang may be enzymatically created in a DNA fragment and a complementary adapter may be bound.
  • the concentration of may be excessive.
  • the adapter (A) is bound to the end of the DNA molecule.
  • the adapter (B) is bound.
  • the second circularization after nick cutting cannot be formed and is eliminated.
  • the first cyclization is impossible as a single molecule and is removed.
  • circularization with a plurality of DNAs can be formed (for example, two-molecule coupling by (b) type molecule and (c) type molecule). Since this DNA fragment originally has different N sequences at both ends, the second circularization after nick cutting is impossible and eliminated.
  • BstXI is charged outside the restriction enzyme site of (A). That is, in the following restriction enzyme site BstXI site, CCANNNNNNTGG is incorporated, for example, EcoRI site so as to be CCAGAATTCTGG. That is, in this method, the restriction enzyme site of the adapter (A) contained in the adapter (A) and the adapter (B) is, for example, an EcoRI site.
  • the sequence outside the EcoRI site is, for example, a BstXI recognition sequence. That is, the adapter (A) sequence is CCAGAATTCTGG.
  • the adapter (A) included in the adapter (B) includes the EcoRI site, but does not incorporate the recognition sequence of BstXI so that it is not cleaved by BstXI.
  • the adapters (A) are at both ends and are associated with each other, the circularization can be opened and eliminated by cutting with BstXI.
  • the adapter (B) does not have a BstXI recognition sequence, so it is not cleaved by BstXI.
  • Example 3 The possibility of gene recombination between the same genes in a multi-molecule circular DNA can be ignored sufficiently stochastically. The basis for this will be described below.
  • Example 4 Preparation of circularized DNA by single molecule DNA In order to verify that the efficiency of circularization by single molecule DNA is increased by the two-step DNA ligation method and the noise of circularization by multiple DNA molecules is reduced, the following is performed. Such an experiment was conducted.
  • Plasmid ⁇ A and Plasmid B Two types of plasmids, Plasmid ⁇ A and Plasmid B, were prepared. Each plasmid was cleaved with a restriction enzyme and then ligated as it was (i), and the one obtained by ligating the adapter of the present invention and ligated in two steps (ii) were compared.
  • (i) and (ii) in the mixed solution contained (1) circular DNA by a single molecule of Plasmid A, (2) circular DNA by a single molecule of PlasmidPB, and (3) multiple molecules of PlasmaPA. It is predicted that (4) circular DNA by plural molecules of Plasmid B and (5) circular DNA by plural molecules including PlasmidPA and Plasmid B.
  • the amount of (5) in the mixed solution produced from (i) and (ii) was evaluated as a representative, and quantitative PCR was performed with PCR primers specific to Plasmid A and Plasmid B.
  • the amount of circularized DNA due to multiple molecules that are subject to noise as in (5) can be reduced to about 1/100 compared to the method in (i) by introducing the method of the present invention (ii). It was confirmed that.
  • the present invention in the circularization of DNA, by providing a circularization method of only single molecule DNA that substantially prevents circularization by a plurality of molecules, there is a problem of contamination in gene analysis such as mate pair analysis. This solves the problem and enables highly accurate analysis. Further, by applying the method of the present invention to detection / analysis of fusion genes, it becomes possible to analyze fusion genes with high accuracy and provide an effective diagnostic tool.

Abstract

　単分子DNAから形成される環状DNAからなり、複数分子DNAから形成される環状DNAを含まない、環状DNAの作成方法を提供する。本発明の方法により、単分子DNAのみから形成される環状DNA分子が確実に作成される。

Description

単分子DNAから形成される環状DNAの作成方法
　本発明は、単分子DNAのみから形成される環状DNAの作成方法、かかる方法に使用される新規アダプターおよび新規アダプターを含む環状DNA作成用キットに関する。
　更には、上記の方法により得られた単分子環状ＤＮＡを用いた、遺伝子の同定及び／または検出方法に関する。とりわけ、種々の病態を引き起こす融合遺伝子の同定及び／または検出方法に関する。
　従来の遺伝子解析方法としてはベクター法が挙げられる。ベクター法では、解析対象遺伝子をベクターに組み込み、増殖させて得た遺伝子の全長の配列をシーケンサーにより決定する。しかし、ベクター法には培養操作が必要であるという問題がある他、シーケンサーで遺伝子の全長を解析する必要がある。
　近年、遺伝子解析における、高速シーケンサーの開発がなされ、それに伴い遺伝子解析手段としてのメイトペア法が注目されている。
　図１にメイトペア法による遺伝子解析の概略を模式的に示す。メイトペア法では、解析対象遺伝子の両末端に結合用塩基配列（制限酵素認識サイト）を結合させ、対象遺伝子を環状化する。そして、環状化された遺伝子を制限酵素認識サイトを中心に、通常TypeII制限酵素を用いて、その認識部位から前後の15塩基以上、好ましくは25塩基以上数十塩基以下で切り取り、これをPCRで増幅し、切り取られた部分遺伝子の塩基配列を決定する。これにより、対象遺伝子の両末端の配列が決定されると、既知の配列データを用いて遺伝子を特定することができる。メイトペアとは、１本のDNA断片の両端を解読した塩基配列の１組の配列データである。
　一定塩基数の遺伝子を切り取る方法としては、TypeII制限酵素を用いて認識部位から離れた部位をカットすることで所定の塩基数を切り取る方法と、環状DNAをSonication等で物理的に裁断してリンカーにつけておいたビオチンで回収しその断片をPCRで増殖し配列を決定させる方法が実際に行われている。
　即ち、メイトペア法では、DNAの両末端を結合させ、環状化した遺伝子において、結合部分の前後の一定の塩基配列を読み取ることによって、既知の遺伝子を特定することができる。基本的に遺伝子のヘッド部分とテイル部分の一部の塩基配列を読み取れば、その配列は遺伝子個々で確実に差別化出来るため、メイトペア法は、確実かつ簡便な遺伝子解析方法として採用されている（非特許文献１および２）。また、メイトペア法は、次世代のシーケンス解析に適用され、高速シーケンサーの登場により、ますます重要となってきている。
　しかし、メイトペア法による遺伝子解析に供するためにDNAを環状化させる場合、単一の遺伝子、DNA（単一分子）による自己環状化以外に複数のDNA（複数分子）による環状化や複数分子（2分子以上）の直線的結合が起こる。複数分子による直線状分子は、その後の操作により環状分子と分離除去されるが、複数分子からなる環状分子は単分子からなる環状分子との分離はできず、夾雑物となる。複数分子環状物は下記に記載する理由により、個々の遺伝子解析を阻害し、分析特異性を大幅に低下させる。具体的には、図２に示すように３種類のcDNAを自己環状化させようとした場合、（Ｂ）に示すように、単分子DNAのみが環状化されている場合、メイトペア法により正確な配列によって遺伝子が特定できる。しかし、（Ｂ）のように単分子の環状化が起こる他、（Ｃ）のように環状化されない直線状のものが生じたり、（Ｄ）のように２つ乃至それ以上のcDNAでの環状化が生じたりしてしまう。（Ｃ）の場合はDNAエキソヌクレアーゼにより排除できるが、（Ｄ）のように複数cDNAが環状化されたものは環状化分子として認識され、排除することが出来ずメイトペア法遺伝子解析における夾雑物となる。
　メイトペア法での遺伝子解析は、対象遺伝子の両末端塩基配列により遺伝子を特定するものである。具体的には、個々の遺伝子の両末端に環状化のための結合用アダプターを結合させ、両アダプター部位で遺伝子を結合環状化させた後、アダプター部位を中心に一定数の塩基配列となるように、切断し、この結果当初遺伝子のそれぞれの末端からの一部分の塩基配列を解析することで遺伝子を特定する。従って、複数分子による環状化物では、アダプター部位が複数あり、アダプターに結合する両端はそれぞれ、異なる遺伝子の一末端となる。従って、上記したように、遺伝子解析にあたり、前記した2方法のいずれかにより、アダプターを中心に結合する両端の一定数の塩基配列となるように切断して遺伝子解析を行うことから、複数分子による環状化物より得られる、解析用の遺伝子断片は、異なる遺伝子のそれぞれの一末端を含むこととなり、一遺伝子の解析がなされない。
　このように、メイトペア法による遺伝子解析においては、複数分子による環状化物の存在は、各遺伝子解析を阻害することとなる。
　複数DNA分子の環状化の確率は通常数％から十数％と方法によって差はあるが、既知の遺伝子の解析においては、異常な塩基配列として認識され、解析配列からの排除がほぼ可能であることから、煩雑さが生じるが、若干精度が落ちるにすぎない。しかしながら、メイトペア法を、正常な遺伝子群のなかから融合遺伝子のような異常な遺伝子の存在の検出に用いる場合は、複数の正常な遺伝子が環状化した場合、あたかも異常遺伝子が存在すると判断されてしまうため、正確に融合遺伝子などの異常遺伝子の存在を確認することが出来なくなってしまう。
　融合遺伝子とは、複数（２個）の遺伝子が結合して、新規機能の遺伝子を構築したものである。例えば癌細胞では、欠損や重複、組換え、転座といった染色体構造の異常がみられる。DNAレベルでの遺伝子の分断とつなぎ合わせが起こり、それぞれの切断点に構造遺伝子が存在すると融合遺伝子が形成される。
　通常、融合遺伝子は細胞にとって致死的であったり、無意味であったり、多くの場合は臨床的に問題になることはない。しかし融合遺伝子から産生される融合タンパク質が細胞増殖の調節を阻害することにより、細胞増殖が異常に促進される場合、臨床的にも腫瘍等として顕著化してくる。
　融合遺伝子は、主に造血系腫瘍で発現されるといわれていたが、近年、上皮性固形腫瘍においても融合遺伝子の関与が推測されている（非特許文献３）。そのなかで、前立腺癌と肺癌から、責任融合遺伝子が発見された（非特許文献４および５）。
　このことから、融合遺伝子の解析、即ち存在の確認は、腫瘍（癌）等の新規な診断方法として注目されている。具体的には、病態に対応することが知られている既知の融合遺伝子を検出することにより、迅速な病態の診断が可能となる。さらに、新規な融合遺伝子の発見は、創薬ターゲットの発見にもつながる。
　一方、従来、固形腫瘍においては染色体分析に限界があり、融合遺伝子の解析・確認は極めて困難であったが、最近、ManoらによるcDNA機能的発現解析法など、新規な方法が開発されてきているが、操作の煩雑性、精度の問題等により、いまだに不十分な技術である（特許文献１）。また、最近、各種の遺伝子次世代高速シーケンサーが開発され、遺伝子の高速シーケンス解析が格段に進歩しており、短時間での解析が可能となりつつある。このことから、腫瘍ゲノム・遺伝子の高速・大量塩基配列解析による融合遺伝子の探索が始まっている（非特許文献６）。
　メイトペア法を用いたシークエンス解析により融合遺伝子を同定するためには、１つのcDNA分子から確実に１つの環状DNAを作成することが必須である。融合遺伝子をメイトペア法により解析する場合の模式図を図３に示す。しかし、図４に示すように、複数のcDNAが１つの環状DNAを形成してしまう可能性があり、メイトペア法を用いたシークエンス解析を行うと、正常遺伝子であってもあたかも融合遺伝子であるような結果がでてしまう。これを従来の遺伝子配列にはないという理由から排除すれば、同様に融合遺伝子も排除されることとなってしまい、融合遺伝子の存在を確認することが実質的に不可能になってしまう。
　メイトペア法で、融合遺伝子をそのシーケンス解析によって検出しようとする場合には、複数遺伝子による環状化cDNAの排除が必須である。
特許第４３０３３０３号公報
蛋白質核酸酵素、２００９年８月号（1233-1247, 1271-1275） 「疾患遺伝子の探索と超高速シーケンス」実験医学増刊、Vol27、No12（2009年、113(1929)-143(1959)） Mitelman et al., 2004, Nature Genetics, Vol.36, No.4, p.331-334 Chinnaiyan et al., 2005, Science, Vol310, p.644-648 Soda et al., 2007, Nature, Vol.448, p.561-566 Bashir et al., April 2008、PLoS Computational Biology, Vol4, Issue 4, e1000051
　単分子DNAのみから形成される環状DNA分子を確実に作成する方法が求められている。即ち、本発明は、１つのDNAから１つの環状化DNAを作成することを可能とする方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは、DNA単分子に、固有の配列認識部位を含む特定の構造を有するアダプターを導入し、２段階のライゲーションを行うことにより、単分子のみからなる環状化DNAの形成を可能とすることができることを見いだした。本発明者らは、確実に単分子DNAのみが環状化し、複数のDNAによる多分子間での環状化を起こさせない方法を見いだした。
　本発明は、第一の態様において、以下の工程を含む、単分子DNAから形成される環状DNAからなり、複数分子DNAから形成される環状DNAを含まない、環状DNAの作成方法を提供する：
１）各目的DNA分子の一方の末端に第一段階環状化用アダプター（Ａ）を結合させ、他方の末端に、アダプター（ｂ）と前記アダプター（Ａ）を含む第二段階環状化用アダプター（Ｂ）を結合させる工程；ここで、アダプター（Ｂ）は、DNA分子にアダプター（ｂ）側を介して結合して、アダプター（Ｂ）中のアダプター（Ａ）は、DNA分子とアダプター（ｂ）との結合の外側に位置する、
　ここで、
　アダプター（Ａ）は、いずれのアダプター（Ａ）の切断末端とも非特異的に結合する切断末端を生じさせる切断部位を含む：
　アダプター（ｂ）は、同一のアダプター（ｂ）由来の切断末端にのみ特異的に結合する切断末端を生じさせる切断部位を含む；
２）アダプター（Ａ）の切断部位において、工程１）で得られたDNA分子を切断する第一切断工程、
３）工程２）で得られたDNA分子の両末端を結合させて環状化させる第一段階環状化工程；
４）工程３）において、環状化せず直線状となった単分子および複数分子が結合したDNAを除去する工程；
５）アダプター（ｂ）の切断部位において、工程３）および工程４）で得られた環状DNA分子を切断する第二切断工程、および、
６）工程５）で得られたDNA分子の両末端を結合させて環状化させる第二段階環状化工程。
　第二段階環状化工程においては、アダプター（ｂ）が同一のアダプター（ｂ）由来の切断末端にのみ特異的に結合することから、複数のＤＮＡ分子の環状化による直線状化は実質的に生じなく環状化されるＤＮＡは単分子ＤＮＡとなる。この時、環状化されない直線状のＤＮＡ分子は、上記同様に除去する必要がある。
　工程６）において環状化されない直線状のＤＮＡは、極めて微量の工程５）において切断された（ｂ）部分の再結合がなされなかった単分子ＤＮＡと大半の工程３）で複数ＤＮＡ分子が環状化し、工程５）において、各アダプター（ｂ）の切断後、再結合できなかった、単分子または複数分子のＤＮＡである。
　本発明の第一の態様において、好ましくは、アダプター（Ａ）は、切断末端が互いに相補的な配列を認識する制限酵素サイトを含む二本鎖DNAであり、例えば、パリンドローム配列を認識する制限酵素サイトを含む二本鎖DNAである。
　また、本発明は、第二の態様において、以下の工程を含む、単分子DNAから形成される環状DNAからなり、複数分子DNAから形成される環状DNAを含まない、単一環状DNAの作成方法を提供する：
１）各目的DNA分子の一方の末端に第一段階環状化用アダプター（Ａ）を結合させ、他方の末端に、アダプター（ｂ）と前記アダプター（Ａ）を含む第二段階環状化用アダプター（Ｂ）を結合させる工程；ここで、アダプター（Ｂ）は、DNA分子にアダプター（ｂ）側を介して結合して、アダプター（Ｂ）中のアダプター（Ａ）は、DNA分子とアダプター（ｂ）との結合の外側に位置する、
　ここで、
　アダプター（Ａ）は、パリンドローム配列を認識する制限酵素サイトを含む二本鎖DNAであり、
　アダプター（Ｂ）は、アダプター（ｂ）と前記アダプター（Ａ）を含み、アダプター（ｂ）は、互いに逆向きに配向した互いに同一のニック作成酵素認識サイトまたは制限酵素サイトを含み、その逆向きに配向した互いに同一のニック作成酵素認識サイトまたは制限酵素サイトの間に、個々のアダプター（ｂ）に固有の配列を有する二本鎖DNA配列を含む二本鎖DNAであり、該逆向きに配向した互いに同一のニック作成酵素認識サイトまたは制限酵素サイトによりアダプター（ｂ）が開裂した場合、該開裂部位は、同一のアダプター（ｂ）由来の開裂部位とのみ再結合するものである；
２）アダプター（Ａ）に含まれる制限酵素サイトを認識する制限酵素により、工程１）で得られたDNA分子を切断する第一切断工程、
３）工程２）で得られたDNA分子の両末端をライゲーションさせて環状化させる第一段階環状化工程；
４）工程３）において、環状化せず直線状となった単分子および複数分子が結合したDNAを除去する工程；
５）アダプター（ｂ）におけるニック作成酵素認識サイトまたは制限酵素サイトを認識するニック作成酵素または制限酵素により、工程３）および工程４）で得られた環状DNA分子を切断する第二切断工程、および、
６）工程５）で得られたDNA分子の両末端をライゲーションさせて環状化させる第二段階環状化工程。
　好ましくは、本発明の上記第二の態様は、さらに、上記工程６）において、アダプター（ｂ）が部分的に異なる切断配列部位を介して結合して（ミス・アニーリング）環状化することにより形成される環状化DNAを、エンドヌクレアーゼを用いて分解する工程を含む。これにより、複数分子からなる環状ＤＮＡをより確実に排除することができる。
　本発明の第二の態様において、好ましくは、アダプター（Ａ）は、パリンドローム配列を認識する制限酵素サイトＸを含む二本鎖DNAであり、
　アダプター（Ｂ）は下記構造ｙ１－Ｙ－ｙ２－Ｘを有する互いに相補的な二本鎖DNAからなる二本鎖DNAである：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
 ［構造中、
Ｘは、パリンドローム配列を認識する制限酵素サイトである二本鎖DNAであり；
ｙ１およびｙ２は、互いに逆向きに配向した互いに同一のニック作成酵素認識サイトまたは制限酵素サイトを含む二本鎖DNAであり；
Ｙは、環状化させる個々のDNA分子に固有の配列を有する二本鎖DNA配列であって、ｎは１以上４０以下の整数であり、Ｎ１～Ｎｎは、それぞれ同一であっても異なっていてもよく、ｄＡＭＰ、ｄＣＭＰ、ｄＧＭＰおよびｄＴＭＰからなる群から選択されるデオキシリボヌクレオチドであり、Ｎ’１～Ｎ’ｎは、前記Ｎ１～Ｎｎに対してそれぞれ下記：
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
 のデオキシリボヌクレオチドであり、ここで、ｋは１～ｎの整数である］。
　上記構造において、ｎは１～４０であり、好ましくは、ｎは４～１５、さらに好ましくはｎは５～１０である。ただし、ｎが４０を超えても本発明の方法を実施することができる。
　この態様において、好ましくは、ｙ１およびｙ２はニック作成酵素認識サイトを含み、さらに好ましくは、ニック作成酵素は６塩基認識のNb.BtsIまたは７塩基認識のNt.BsqQIである。あるいは、ｙ１およびｙ２が制限酵素サイトを含むものでもよい。
　本発明は、第三の態様において、下記構造ｙ１－Ｙ－ｙ２－Ｘを有する互いに相補的な二本鎖DNAからなる環状DNA作成用アダプターを提供する：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
 ［構造中、
Ｘは、パリンドローム配列を認識する制限酵素サイトである二本鎖DNAであり；
ｙ１およびｙ２は、互いに逆向きに配向した互いに同一のニック作成酵素認識サイトまたは制限酵素サイトを含む二本鎖DNAであり；
Ｙは、環状化させる個々のDNA分子に固有の配列を有する二本鎖DNA配列であって、ｎは１以上４０以下の整数であり、Ｎ１～Ｎｎは、それぞれ同一であっても異なっていてもよく、ｄＡＭＰ、ｄＣＭＰ、ｄＧＭＰおよびｄＴＭＰからなる群から選択されるデオキシリボヌクレオチドであり、Ｎ’１～Ｎ’ｎは、前記Ｎ１～Ｎｎに対してそれぞれ下記：
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
 のデオキシリボヌクレオチドであり、ここで、ｋは１～ｎの整数である］。
　上記構造において、ｎは１～４０であり、好ましくは、ｎは４～１５、さらに好ましくはｎは５～１０である。ただし、ｎが４０を超えても本発明の方法を実施することができる。
　本発明の第三の態様の上記アダプターは、本発明の第二の態様におけるアダプター（Ｂ）に相当し、本発明の単分子DNAから形成される環状DNAからなり、複数分子DNAから形成される環状DNAを含まない、環状DNAの作成方法に好適に用いられる。
　本発明の第三の態様において、好ましくは、ｙ１およびｙ２はニック作成酵素認識サイトを含み、さらに好ましくは、ニック作成酵素は６塩基認識のNb.BtsIまたは７塩基認識のNt.BsqQIである。あるいは、ｙ１およびｙ２が制限酵素サイトを含むものでもよい。
　本発明はさらに第四の態様において、上記第三の態様において記載のアダプター（単に、アダプター（Ｂ）とも称する）と、該アダプター（Ｂ）に含まれるＸにおける制限酵素サイトと同一の制限酵素サイトを含む二本鎖DNAからなるアダプター（単にアダプター（Ａ）とも称する）とを含む環状DNA作成用キットを提供する。
　本発明はまた、第五の態様において、上記第一または第二の態様の方法を用いる、ｃＤＮＡライブラリーの作成方法を提供する。
　本発明はさらに、第六の態様において、以下の工程を含む、上記第一または第二の態様の方法を用いて得られた環状DNA分子をメイトペア法に供することにより遺伝子を同定する方法を提供する：
１）上記第一または第二の態様の方法を用いて得られた環状DNA分子における、アダプター（Ｂ）の両側に隣接するそれぞれ１５塩基以上６００塩基以下の塩基配列を解読する工程；および、
２）解読した塩基配列を既知の遺伝子の両末端の配列と比較することにより、環状DNA分子に含まれる遺伝子を同定する工程。
　好ましくは、解読する塩基配列は、１５～１００塩基、さらに好ましくは２５～３５塩基である。ただし、６００塩基以上を解読しても本発明の方法を実施することができる。
　本発明はさらに、第七の態様において、以下の工程を含む、上記第一または第二の態様の方法を用いて得られた環状DNA分子をメイトペア法に供することにより融合遺伝子を検出する方法を提供する：
１）上記第一または第二の態様の方法を用いて得られた環状DNA分子における、アダプター（Ｂ）の両側に隣接するそれぞれ１５塩基以上６００塩基以下の塩基配列を解読する工程；および、
２）解読した塩基配列を既知の遺伝子の両末端の配列と比較する工程、ここで、両末端の遺伝子が既知の相異なる遺伝子に対応する場合、環状DNA分子に含まれる遺伝子は融合遺伝子であると同定される。
　好ましくは、解読する塩基配列は、１５～１００塩基、さらに好ましくは２５～３５塩基である。ただし、６００塩基以上を解読しても本発明の方法を実施することができる。
　本発明の第七の態様において、アダプター（Ｂ）の両側に隣接する両側の配列が、既知融合遺伝子の両側の末端に対応する場合、既知の融合遺伝子が検出される。かかる既知の融合遺伝子と疾患との関係が知られている場合、第七の態様の方法により検出された融合遺伝子をマーカーとして用いる、該融合遺伝子の発現を特徴とする疾患を検出する方法が提供される。
　一方、アダプター（Ｂ）の両側に隣接する配列が、相異なる遺伝子の末端配列に対応し、かつ既知融合遺伝子の両側の末端には対応しない場合には、環状DNA分子に含まれる遺伝子が新規融合遺伝子であると同定される。この場合、検出された新規融合遺伝子は創薬スクリーニングにおける使用に好適に使用される。
　本発明のアダプターおよび方法を用いることにより、遺伝子解析の精度が劇的に改善される。また、従来にない高精度のメイトペア解析が可能となり、ゲノム解析に極めて有用なツールが提供される。特に、本発明の方法をcDNAライブラリーの作成に応用することで、新規の融合遺伝子が高い可能性で発見される可能性がある。すなわち、単一DNA分子の環状化を確実に達成することにより、新たな診断ツール・方法が開発可能となる。
　本発明によると、DNAの環状化において、複数分子による環状化を実質的に防止する、単分子DNAのみの環状化方法が提供されることにより、メイトペア解析などの遺伝子解析におけるコンタミネーションの問題が解決され、高精度の解析が可能となる。また、本発明の方法を融合遺伝子の検出・解析に適用することにより、高精度の融合遺伝子の解析が可能となり、有効な診断ツールを提供することができる。
図１は、メイトペア法による遺伝子解析の概略を模式的に示す。 図２は、メイトペア法による遺伝子解析における問題点を模式的に示す。 図３は、融合遺伝子をメイトペア法により解析する場合の模式図を示す。 図４は、融合遺伝子をメイトペア法により解析する場合の問題点を模式的に示す。 図５は、本発明による二段階環状化方法の第一切断工程を模式的に示す。 図６は、本発明による二段階環状化方法の第一環状化、第二切断、第二環状化工程を模式的に示す。 図７は、ｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡに本発明の方法を適用する場合の模式図を示す。 図８は、ゲノムライブラリーに本発明の方法を適用する場合の模式図を示す。 図９は、本発明の方法の適用により、複数分子による環状化DNAの生成量が減少することを実証する、実施例４の実験結果を示す。
本発明の第一の態様について
　本発明は、第一の態様において、以下の工程を含む、単分子DNAから形成される環状DNAからなり、複数分子DNAから形成される環状DNAを含まない、環状DNAの作成方法を提供する：
１）各目的DNA分子の一方の末端に第一段階環状化用アダプター（Ａ）を結合させ、他方の末端に、アダプター（ｂ）と前記アダプター（Ａ）を含む第二段階環状化用アダプター（Ｂ）を結合させる工程；ここで、アダプター（Ｂ）は、DNA分子にアダプター（ｂ）側を介して結合して、アダプター（Ｂ）中のアダプター（Ａ）は、DNA分子とアダプター（ｂ）との結合の外側に位置する、
　ここで、
　アダプター（Ａ）は、いずれのアダプター（Ａ）の切断末端とも非特異的に結合する切断末端を生じさせる切断部位を含む：
　アダプター（ｂ）は、同一のアダプター（ｂ）由来の切断末端にのみ特異的に結合する切断末端を生じさせる切断部位を含む；
２）アダプター（Ａ）の切断部位において、工程１）で得られたDNA分子を切断する第一切断工程、
３）工程２）で得られたDNA分子の両末端を結合させて環状化させる第一段階環状化工程；
４）工程３）において、環状化せず直線状となった単分子および複数分子が結合したDNAを除去する工程；
５）アダプター（ｂ）の切断部位において、工程３）および工程４）で得られた環状DNA分子を切断する第二切断工程、および、
６）工程５）で得られたDNA分子の両末端を結合させて環状化させる第二段階環状化工程。
　本発明の上記第一の態様は、実質的に１遺伝子（DNA）からのみ環状化を生じ、複数の遺伝子（DNA）からの環状化を阻止することを可能とした技術である。
　具体的には、本発明の第一の態様の方法は、２段階の環状化によることを特徴とする。
　以下、第一の態様の方法を工程の順に説明する。
　工程１）は、各目的DNA分子の一方の末端に第一段階環状化用アダプター（Ａ）を結合させ、他方の末端に、アダプター（ｂ）と前記アダプター（Ａ）を含む第二段階環状化用アダプター（Ｂ）を結合させる工程である。ここで、アダプター（Ｂ）は、DNA分子にアダプター（ｂ）側を介して結合させることにより、アダプター（Ｂ）中のアダプター（Ａ）は、DNA分子とアダプター（ｂ）との結合の外側に位置する。即ち、各目的DNA分子の一端には、アダプター（Ａ）を、他端にはアダプター（Ｂ）を結合させ、アダプター（Ｂ）中のアダプター（Ａ）をアダプター（ｂ）よりも末端側に位置させることにより、アダプター（Ａ）を各目的DNA分子の両末端に位置させる。
　なお、アダプター（Ａ）は、いずれのアダプター（Ａ）の切断末端とも非特異的に結合する切断末端を生じさせる切断部位を含み、アダプター（ｂ）は、同一のアダプター（ｂ）由来の切断末端にのみ特異的に結合する切断末端を生じさせる切断部位を含む。即ち、アダプター（Ａ）は結合特異性を示さず、あらゆるアダプター（Ａ）由来の切断末端同士で非選択的に結合することができる。一方、アダプター（ｂ）は個々の目的DNA分子毎に異なる構成をしており、同一のアダプター（ｂ）由来の切断末端とのみ再結合可能であり、異なるアダプター（ｂ）由来の切断末端との再結合はできない。
　工程２）は、アダプター（Ａ）の切断部位において、工程１）で得られたDNA分子を切断する第一切断工程である。
　工程１）で得られたDNA分子はその両端にアダプター（Ａ）が結合しているため、この第一切断工程により、各DNA分子の両端にアダプター（Ａ）由来の切断末端が生じる。
　工程３）は、工程２）で得られたDNA分子の両末端を結合させて環状化させる第一段階環状化工程である。一段目の環状化はアダプター（Ａ）による環状化であり、各DNA分子の両端に生じたアダプター（Ａ）由来の切断末端が互いに結合して環状化が起こる。ここで、アダプター（Ｂ）は、第一段目の環状化の際に環状分子内にアダプター（Ａ）と共に取り込まれる。上記のように、アダプター（Ａ）の機能は、特異性はなく、目的DNA分子両末端の再結合による選択性はない。このことから、単分子DNA分子での両末端のアダプター（Ａ）部分での結合の他に、複数のDNA分子のそれぞれの両末端の結合による結合環状化も起こることになる。即ち、アダプター（Ａ）の機能から、単分子環状化とともに、複数分子の環状化も生じる。複数分子の環状化物には、当然、複数のアダプター（Ｂ）が存在することとなる。
　工程４）は、工程３）において、環状化せず直線状となった単分子および複数分子が結合したDNAを除去する工程である。
　工程５）は、アダプター（ｂ）の切断部位において、工程３）および工程４）で得られた環状DNA分子を切断する第二切断工程である。即ち、工程３）で環状化した各DNA分子に取り込まれたアダプター（ｂ）において開裂を行い、線状分子を生じさせる。第二切断工程により、各DNA分子の両端にアダプター（ｂ）由来の切断末端が生じる。この工程において、切断によって生じる切断末端は、他の環状分子由来の切断末端との結合が実質的に出来ないものである。
　工程６）は、工程５）で得られたDNA分子の両末端を結合させて環状化させる第二段階環状化工程である。即ち、工程５）で得られた各DNA分子の両端にはアダプター（ｂ）由来の切断末端が存在し、上記のように、アダプター（ｂ）は個々の目的DNA分子毎に異なる構成をしており、同一のアダプター（ｂ）由来の切断末端とのみ再結合可能であり、異なるアダプター（ｂ）由来の切断末端との再結合はできないため、同一のDNA分子の両端のアダプター（ｂ）由来の切断末端同士の結合により、２段目の環状化が行われる。このアダプター（ｂ）の特異性によって、各目的DNA分子は単分子のみが環状化されることとなる。即ち、アダプター（ｂ）は、結合特異性を有し、それぞれのアダプター（ｂ）の部分が開裂した場合、再結合環状化に際して、元の環状化物において結合していた部分とのみ再結合し、他の部分との再結合はできない。従って、複数分子の環状化の場合に再結合環状化をする場合には、もとの複数分子での再結合環状化以外にあり得なく、この確率は、後述のように、極めて低く実質的に０である。単分子での環状化の確率は、一般的にその濃度から高く、その結果実質的には単分子環状化のみが起こる。環状化せず、直線状の分子のままについては、エキソヌクレアーゼを作用させることにより、分離排除することができる。
　アダプター（Ａ）および（ｂ）は、上記の機能を果たす限り、特にその構造は限定されない。例えば、これらアダプターが二本鎖DNAである場合、アダプター（Ａ）としては、回文構造を認識する制限酵素サイトを含むものが例示され、アダプター（ｂ）としては、例えば、少なくとも４塩基、好ましくは５塩基以上の互いに相補的な核酸からなる二本鎖DNAであって、切断により互いに相補的な一本鎖末端を生じるものが挙げられる。しかし、アダプター（Ａ）および（ｂ）はこれらに限定されない。例えば、アダプター（ｂ）のその他の例として、開裂して鍵と鍵穴関係になる物質などでもよく、要するに、開裂した場合、その後再結合させる時は、実質的に開裂前のアダプターとなるものとのみ、再結合可能なものであればよい。但し、ノン・パリンドローム配列の切断部位である場合も本発明の方法は実施可能であり、かかる場合には上流アダプター（A1）、下流アダプター（A2）が区別され、（A1）（A2）が互いに結合する構成とする。この場合、若干ではあるが通常のアダプター（A）より第一段階での単分子環状DNAの効率が上がることが期待される。
　本発明の第一の態様により、例えば、メイトペア法による遺伝子解析、遺伝子同定において、きょう雑物となる、複数遺伝子（複数分子）による環状化物を排除し、単分子（１遺伝子）のみの環状化物を作成することが可能となる。
本発明の第二の態様について
　本発明の第二の態様は、以下の工程を含む、単分子DNAから形成される環状DNAからなり、複数分子DNAから形成される環状DNAを含まない、環状DNAの作成方法を提供する：
１）各目的DNA分子の一方の末端に第一段階環状化用アダプター（Ａ）を結合させ、他方の末端に、アダプター（ｂ）と前記アダプター（Ａ）を含む第二段階環状化用アダプター（Ｂ）を結合させる工程；ここで、アダプター（Ｂ）は、DNA分子にアダプター（ｂ）側を介して結合して、アダプター（Ｂ）中のアダプター（Ａ）は、DNA分子とアダプター（ｂ）との結合の外側に位置する、
　ここで、
　アダプター（Ａ）は、パリンドローム配列を認識する制限酵素サイトを含む二本鎖DNAであり、
　アダプター（Ｂ）は、アダプター（ｂ）と前記アダプター（Ａ）を含み、アダプター（ｂ）は、互いに逆向きに配向した互いに同一のニック作成酵素認識サイトまたは制限酵素サイトを含み、その逆向きに配向した互いに同一のニック作成酵素認識サイトまたは制限酵素サイトの間に、個々のアダプター（ｂ）に固有の配列を有する二本鎖DNA配列を含む二本鎖DNAであり、該逆向きに配向した互いに同一のニック作成酵素認識サイトまたは制限酵素サイトによりアダプター（ｂ）が開裂した場合、該開裂部位は、同一のアダプター（ｂ）由来の開裂部位とのみ再結合するものである；
２）アダプター（Ａ）に含まれる制限酵素サイトを認識する制限酵素により、工程１）で得られたDNA分子を切断する第一切断工程、
３）工程２）で得られたDNA分子の両末端をライゲーションさせて環状化させる第一段階環状化工程；
４）工程３）において、環状化せず直線状となった単分子および複数分子が結合したDNAを除去する工程；
５）アダプター（ｂ）におけるニック作成酵素認識サイトまたは制限酵素サイトを認識するニック作成酵素または制限酵素により、工程３）および工程４）で得られた環状DNA分子を切断する第二切断工程、および、
６）工程５）で得られたDNA分子の両末端をライゲーションさせて環状化させる第二段階環状化工程。
　本発明の第二の態様において、上記工程６）において、アダプター（ｂ）が部分的に異なる切断部位を介して結合して環状化することにより形成される環状化DNAを、エンドヌクレアーゼを用いて分解する工程をさらに含むことが好ましい。
　以下、本発明の第二の態様を工程に沿って図５および６を参照して説明する。
　工程１）は、図５に模式的に示すように、各目的DNA分子の一方の末端に第一段階環状化用アダプター（Ａ）を結合させ、他方の末端に、アダプター（ｂ）と前記アダプター（Ａ）を含む第二段階環状化用アダプター（Ｂ）を結合させる工程である。ここで、アダプター（Ｂ）は、DNA分子にアダプター（ｂ）側を介して結合して、アダプター（Ｂ）中のアダプター（Ａ）は、DNA分子とアダプター（ｂ）との結合の外側に位置する。
　ここで、アダプター（Ａ）は、パリンドローム配列を認識する制限酵素サイトを含む二本鎖DNAであり、アダプター（Ｂ）は、アダプター（ｂ）と前記アダプター（Ａ）を含み、アダプター（ｂ）は、互いに逆向きに配向した互いに同一のニック作成酵素認識サイトまたは制限酵素サイトを含み、その逆向きに配向した互いに同一のニック作成酵素認識サイトまたは制限酵素サイトの間に、個々のアダプター（ｂ）に固有の配列を有する二本鎖DNA配列を含む二本鎖DNAであり、該逆向きに配向した互いに同一のニック作成酵素認識サイトまたは制限酵素サイトによりアダプター（ｂ）が開裂した場合、該開裂部位は、同一のアダプター（ｂ）由来の開裂部位とのみ再結合するものである。
　アダプター（Ａ）および（ｂ）について以下に詳細に説明する。
　アダプター（Ａ）：このアダプターは、第一段階目に制限酵素で切断し、その後に環状DNAを期待して遺伝子結合（ligation）を行うための配列である。従って、パリンドローム配列を認識する制限酵素サイトであれば如何なる制限酵素サイトを含むものでもよい。好ましくは、目的DNAをなるべく切断しないような稀な遺伝子配列を認識する制限酵素のサイトを含むものである。アダプター（Ａ）に含まれる制限酵素サイトとしては、例えば、NotIやEcoRIが挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
　アダプター（ｂ）：互いに逆向きに配向した互いに同一のニック作成酵素認識サイトまたは制限酵素サイトを含み、その逆向きに配向した互いに同一のニック作成酵素認識サイトまたは制限酵素サイトの間に、個々のアダプター（ｂ）に固有の配列を有する二本鎖DNA配列を含む二本鎖DNAである。このニック作成酵素認識サイトまたは制限酵素サイトは第二段階目に切断し各分子に特異的な遺伝子切断断端（overhang）を形成するためのものである。ニック作成酵素は、DNA鎖の一方のみニック切断するものであり、制限酵素は、同時にDNA鎖の2本鎖双方を切断するものであるが、いずれの認識サイトでも導入可能である。逆向きに配向した互いに同一のニック作成酵素認識サイトまたは制限酵素サイトによりアダプター（ｂ）が開裂した場合、開裂部位が生じ、該開裂部位は、同一のアダプター（ｂ）由来の開裂部位とのみ再結合するものである。該開裂部位の長さは、ニック作成酵素の場合は限定されないが、制限酵素の場合は以下の例にあげるように、制限が生じる。そのため該開裂部位の長さを自由に調整するためにはニック作成酵素の方が好ましい。
　以下にニック作成酵素認識サイトおよび制限酵素サイトのそれぞれの具体例を挙げる。
ニック作成酵素認識サイトの場合
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
 制限酵素の場合１
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
 制限酵素の場合２
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
 制限酵素の場合３
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
 　この形式の場合、ループ構造からのプライマー伸長法等を用いて、同等のN配列を２カ所に準備する必要がある。
　次いで、逆向きに配向した互いに同一のニック作成酵素認識サイトまたは制限酵素サイトによりアダプター（ｂ）が開裂した場合の、開裂部位について説明する。
　開裂部位は、各分子特異的な遺伝子切断断端（overhang）に相当する部分である。上記のように制限酵素で作成する場合は塩基数に制限があるが、ニック作成酵素では自由に長さを設定することができる。特異性を高くするためには開裂部位の塩基数は長い程よいが、長すぎる時にはミスマッチで遺伝子結合する可能性が高くなる。ゲノムなど複雑性が増す場合には開裂部位の塩基数をより長く設定し、同時にミスマッチ結合（ミス・アニーリング）の可能性に対してエンドヌクレアーゼによる分解過程を追加することが望ましい。なお、開裂部位の配列はランダムな組合せとし、DNA分子１つ１つについて異なるものとなるよう設計する。
　以下に例として塩基数を「５」に設定して具体例を記載する。例として以下のような配列のアダプター（Ｂ）を核酸合成により作成することで本発明の方法に用いることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
　工程２）は、アダプター（Ａ）に含まれる制限酵素サイトを認識する制限酵素により、工程１）で得られたDNA分子を切断する第一切断工程である（図５）。
　工程３）は、工程２）で得られたDNA分子の両末端をライゲーションさせて環状化させる第一段階環状化工程である（図６：第１環状化）。
　工程４）は、工程３）において、環状化せず直線状となった単分子および複数分子が結合したDNAを除去する工程である。
　工程５）は、アダプター（ｂ）におけるニック作成酵素認識サイトまたは制限酵素サイトを認識するニック作成酵素または制限酵素により、工程３）および工程４）で得られた環状DNA分子を切断する第二切断工程である。
　工程６）は、工程５）で得られたDNA分子の両末端をライゲーションさせて環状化させる第二段階環状化工程である（図６：開裂再環状化）。この工程では、開裂部位の配列の特異性により、同一DNAに結合させたアダプター（ｂ）由来の開裂部位同士でのみ結合が可能である。
　本発明の第二の態様において、好ましくは、アダプター（Ａ）はパリンドローム配列を認識する制限酵素サイトＸを含む二本鎖DNAであり、アダプター（Ｂ）は下記構造ｙ１－Ｙ－ｙ２－Ｘを有する互いに相補的な二本鎖DNAからなる二本鎖DNAである：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
 ［構造中、
Ｘは、パリンドローム配列を認識する制限酵素サイトである二本鎖DNAであり；
ｙ１およびｙ２は、互いに逆向きに配向した互いに同一のニック作成酵素認識サイトまたは制限酵素サイトを含む二本鎖DNAであり；
Ｙは、環状化させる個々のDNA分子に固有の配列を有する二本鎖DNA配列であって、ｎは１以上４０以下の整数であり、Ｎ１～Ｎｎは、それぞれ同一であっても異なっていてもよく、ｄＡＭＰ、ｄＣＭＰ、ｄＧＭＰおよびｄＴＭＰからなる群から選択されるデオキシリボヌクレオチドであり、Ｎ’１～Ｎ’ｎは、前記Ｎ１～Ｎｎに対してそれぞれ下記：
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
 のデオキシリボヌクレオチドであり、ここで、ｋは１～ｎの整数である］。
　上記構造において、ｎは１～４０であり、好ましくは、ｎは４～１５、さらに好ましくはｎは５～１０である。ただし、ｎが４０を超えても本発明の方法を実施することができる。
　Ｙ部位は塩基配列をそれぞれランダムに組み合わせたペアとしている。たとえばＹが８個の塩基配列により構成されるとすれば、４の８乗個の組み合わせとなる。これにより、環状化のペア形成を特異化（選択）することができ、元のペアのみと再結合することが可能となる。これにより、単一のDNAのみ、再環状化が出来、他の分子のＹ部分は構造が異なるため、再結合することができない。
　Ｙ部分の核酸の個数については、４種類の核酸を重複順列的に組み合わせるため、Ｎ個の核酸数とするとその配列の数は４のＮ乗個となる。従って、Ｎが５個の場合には４の５乗＝１０１６種類のＹ部分、Ｎ＝７であれば、１６０００以上となり、Ｎ＝７で実質的には十分となる。但し、８個以上でも差し支えない。仮に、Ｎが大きい場合、部分的に異なっても、ハイブリダイズし、結合可能であるが、そのようにミスマッチを含む場合は、エンドヌクレアーゼを適用することにより、分解可能である。アダプター（Ｂ）のＹ部分の製造方法は、基本的にＮ（個数）を規定し、核酸を規定しないランダムな逐次縮合による主鎖の合成および共通配列のプライマーによるポリメラーゼ伸展反応により製造可能である。
　本発明の第二の態様において、好ましくは、ｙ１およびｙ２がニック作成酵素認識サイトを含み、さらに好ましくは、ニック作成酵素はNb.BtsIである。ｙ１およびｙ２は制限酵素サイトを含むものでもよい。
本発明の第三の態様について
　本発明の第三の態様は、上記本発明の第二の態様の方法において用いられる好適なアダプター（Ｂ）、即ち、下記構造ｙ１－Ｙ－ｙ２－Ｘを有する互いに相補的な二本鎖DNAからなる環状DNA作成用アダプターを提供する：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
 ［構造中、
Ｘは、パリンドローム配列を認識する制限酵素サイトである二本鎖DNAであり；
ｙ１およびｙ２は、互いに逆向きに配向した互いに同一のニック作成酵素認識サイトまたは制限酵素サイトを含む二本鎖DNAであり；
Ｙは、環状化させる個々のDNA分子に固有の配列を有する二本鎖DNA配列であって、ｎは１以上４０以下の整数であり、Ｎ１～Ｎｎは、それぞれ同一であっても異なっていてもよく、ｄＡＭＰ、ｄＣＭＰ、ｄＧＭＰおよびｄＴＭＰからなる群から選択されるデオキシリボヌクレオチドであり、Ｎ’１～Ｎ’ｎは、前記Ｎ１～Ｎｎに対してそれぞれ下記：
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000018
 のデオキシリボヌクレオチドであり、ここで、ｋは１～ｎの整数である］。
　上記構造において、ｎは１～４０であり、好ましくは、ｎは４～１５、さらに好ましくはｎは５～１０である。ただし、ｎが４０を超えても本発明を実施することができる。
　上記第二の態様と同様に、本発明の第三の態様において、好ましくは、ｙ１およびｙ２がニック作成酵素認識サイトを含み、さらに好ましくは、ニック作成酵素はNb.BtsIまたはNt.BsqQIである。ｙ１およびｙ２は制限酵素サイトを含むものでもよい。
本発明の第四の態様について
　本発明の第四の態様は、上記本発明の第二の態様の方法において用いられる好適なアダプター（Ａ）およびアダプター（Ｂ）とを含む環状DNA作成用キット提供する。即ち、上記第三の態様に記載のＸにおける制限酵素サイトと同一の制限酵素サイトを含む二本鎖DNAからなるアダプター（Ａ）と、上記第三の態様に記載のアダプター（Ｂ）とを含む、環状DNA作成用キットを提供する。
　本発明のかかる環状DNA作成用キットは、アダプター（Ａ）およびアダプター（Ｂ）を含み、これらを目的DNA分子の両末端に結合させ、本発明の第一または第二の態様による二段階環状化方法を行うことにより、単分子DNAのみからなる環状化DNAを含み、複数分子のDNAからなる環状化DNAを含まない環状化DNAを提供することができる。
本発明の第五の態様について
　本発明の第五の態様は、本発明の第一または第二の態様による二段階環状化方法を用いる、ｃＤＮＡライブラリーの作成方法を提供する。本発明の第一または第二の態様による方法を直鎖状ｃＤＮＡからなるライブラリーに適用することにより、単分子DNAのみからなる環状化DNAを含むｃＤＮＡライブラリーを作成することができる。
本発明の第六の態様について
　本発明の第六の態様は、以下の工程を含む、本発明の第一または第二の態様による方法を用いて得られた環状DNA分子をメイトペア法に供することにより遺伝子を同定する方法を提供する：
１）本発明の第一または第二の態様による方法を用いて得られた環状DNA分子における、アダプター（Ｂ）の両側に隣接するそれぞれ１５塩基以上６００塩基以下の塩基配列を解読する工程；および、
２）解読した塩基配列を既知の遺伝子の両末端の配列と比較することにより、環状DNA分子に含まれる遺伝子を同定する工程。
　本発明の第六の態様の方法の、工程１）は、本発明の第一または第二の態様による方法を用いて得られた環状DNA分子における、アダプター（Ｂ）の両側に隣接するそれぞれ１５塩基以上６００塩基以下の塩基配列を解読する工程である。好ましくは、解読する塩基配列は、１５～１００塩基、さらに好ましくは２５～３５塩基である。ただし、６００塩基以上を解読しても本発明の方法を実施することができる。塩基配列の解読は当業者に周知の方法、シークエンサーを用いて解読することができる。
　本発明の第六の態様の方法の、工程２）は、解読した塩基配列を既知の遺伝子の両末端の配列と比較することにより、環状DNA分子に含まれる遺伝子を同定する工程である。目的DNA分子の両末端配列に対応する、解読した塩基配列が、既知の遺伝子の両末端配列と同一であることが確認されれば、目的DNA分子は、当該既知の遺伝子であると同定される。
本発明の第七の態様について
　本発明の第七の態様は、以下の工程を含む、本発明の第一または第二の態様による方法を用いて得られた環状DNA分子をメイトペア法に供することにより融合遺伝子を検出する方法を提供する：
１）本発明の第一または第二の態様による方法を用いて得られた環状DNA分子における、アダプター（Ｂ）の両側に隣接するそれぞれ１５塩基以上６００塩基以下の塩基配列を解読する工程；および、
２）解読した塩基配列を既知の遺伝子の両末端の配列と比較する工程、ここで、両末端の遺伝子が既知の相異なる遺伝子に対応する場合、環状DNA分子に含まれる遺伝子は融合遺伝子であると同定される。
　本発明の第七の態様の方法の、工程１）は、本発明の第一または第二の態様による方法を用いて得られた環状DNA分子における、アダプター（Ｂ）の両側に隣接するそれぞれ１５塩基以上６００塩基以下の塩基配列を解読する工程である。好ましくは、解読する塩基配列は、１５～１００塩基、さらに好ましくは２５～３５塩基である。ただし、６００塩基以上を解読しても本発明の方法を実施することができる。塩基配列の解読は当業者に周知の方法、シークエンサーを用いて解読することができる。
　本発明の第七の態様の方法の、工程２）は、解読した塩基配列を既知の遺伝子の両末端の配列と比較する工程である。ここで、両末端の遺伝子が既知の相異なる遺伝子に対応する場合、環状DNA分子に含まれる遺伝子は融合遺伝子であると同定される。即ち、目的DNA分子の両末端配列に対応する、解読した塩基配列の一方の末端に対応する部分が、既知の遺伝子の片側末端と同一であり、他方の末端に対応する部分が、別の既知の遺伝子の片側末端と同一であれば、目的DNA分子は、２つの既知の遺伝子からなる融合遺伝子であると同定される。
　例えば、アダプター（Ｂ）の両側に隣接する両側の配列が、既知融合遺伝子の両側の末端に対応する場合、目的DNAは既知融合遺伝子であると検出される。既知融合遺伝子の発現と疾患との関係が知られている場合、かかる方法により検出された融合遺伝子をマーカーとして用いることにより、該融合遺伝子の発現を特徴とする疾患を検出することが可能である。
　また例えば、アダプター（Ｂ）の両側に隣接する配列が、相異なる遺伝子の末端配列に対応し、かつ既知融合遺伝子の両側の末端には対応しない場合、環状DNA分子に含まれる遺伝子は新規融合遺伝子であると同定される。かかる方法により検出された新規融合遺伝子は創薬スクリーニングにおいて使用することができる。
　以下の実施例において、目的DNA分子の両端（目的DNA分子の左端、右端）にアダプターを結合させる具体的方法について説明する。
実施例１：mRNAから合成したcDNAを用いる融合遺伝子発見への本発明の方法の応用
　mRNAからcDNAライブラリーを合成する場合、現在使用されている最も一般的な方法（Clontech SMART cDNA method) では、図７のようにmRNAの3’末端のpolyAサイトに相補的なpolyT配列を有するオリゴヌクレオチド （１）を用いて、まず相補鎖DNAを逆転写酵素で合成する。合成終了時にmRNAの5’末端において図７のように特定オリゴヌクレオチド配列 （２）が取り込まれる。次にこの特定配列へ相補的なオリゴヌクレオチドからDNA合成を行う、あるいはPCRでcDNAライブラリーが作成される。
　cDNA合成の際に同時に本発明のアダプターを組み込む場合
　この場合、mRNAの3’末端のpolyAサイトに相補的なpolyT配列を有するオリゴヌクレオチド（１）配列にアダプター（Ｂ）を導入しておき、オリゴヌクレオチド（２）配列にアダプター（Ａ）を付加しておくことでcDNAライブラリーが合成されたときには、自動的に本発明の基本形の構造になっており、右端左端に新たな配列を結合させる必要もなく、そのまま次のステップへ進むことができる。この方法で、さらにcDNAライブラリーをPCR増幅する際に、そのまま増幅したのではある特定のN塩基配列が増幅されてしまう。そのためN塩基の多様性を維持するため、例えば、上流primerとして5’リン酸基付加primerを使用し、下流primerにはN塩基を含むprimer を用いて増幅し、PCR後にリン酸基primerを取り込んだ側のストランドをλexonucleaseで分解し、再度上流primerからprimer-extensionを行い、N塩基による多様性を維持したcDNAライブラリーを完成させる、等の手続きを行う。但し、アダプター結合法であればこの過程は必要なく、ライブラリーの断片化などの修飾を行った上で本発明のアダプターを導入するためには、次のアダプター結合法を行う。
　通常のcDNA合成の後に本発明のアダプターを組み込む場合
　cDNAライブラリーを作成した場合、図７の（３）のように3’末端、5’末端にそれぞれ制限酵素配列を導入しておくことができる。この場合の制限酵素としては通常のパリンドローム配列を使用することも、末端を区別するためにノン・パリンドローム配列を使用することも可能であり、またアダプター結合を確実にするため平滑末端からA突出塩基の形状へアダプターを結合することも可能である。ライブラリーの修飾を行った上に本発明のアダプターを導入するためにはこちらの方法が望ましい。
実施例２： ゲノムのメイトペア法解析への本発明の方法の応用
　ゲノムを対象とする場合はcDNAライブラリーとは状況が異なる。ゲノム断片にはcDNAと異なりDNA断片の左右を区別することができない。従って図８のように左端のアダプター、右端のアダプターを双方結合させて、双方のアダプターが適切に結合したもの、即ち図８の( a ) のみをPCR法やビオチン法、あるいは両端のX制限酵素配列としてノン・パリンドローム配列を挿入することや、N領域を含む制限酵素（BstXI等）により同一部位に制限酵素サイトを複数設置する方法等、で選択してゆくことができる。
　アダプター（Ａ）と（Ｂ）をDNA分子の両末端にそれぞれ付加することについて
　基本的に、以下のような手法をとることによりアダプター（Ａ）と（Ｂ）をDNA分子の両末端にそれぞれ付加する。第一に、目的DNA分子数に応じて、ある程度の濃度を決定した複数のDNA群に、先ず、アダプター（Ａ）を結合させる。この場合、アダプター（Ａ）の添加量は存在する対象DNA分子量よりも少なめとする。ただし、量論的には、対象DNA分子数と同数であっても、あるいは、DNA断片に一塩基突出を酵素的に作成し、相補的なアダプターを結合させてもよく、この場合は特にアダプターの濃度は過剰であっても構わない。これにより、アダプター（Ａ）をDNA分子の末端に結合させる。次いで、アダプター（Ｂ）を結合させる。
　本発明においては、図８の（ａ）に記載のように一方の末端にアダプター（Ａ）、他方の末端にアダプター（Ｂ）が結合した分子を作成する必要がある。ここで、図８の（ｂ）や（ｃ）に記載のように、アダプター（Ａ）のみ結合したDNA分子（図８の（ｂ））およびアダプター（Ｃ）のみが結合したDNA分子（図８の（ｃ））は排除する必要がある。以下その方法について説明する。
・第１制限酵素X部位にノン・パリンドローム配列を使う場合
　図８の(ａ)タイプの分子の場合、第１環状化、ニックによる切断、第２環状化が問題なく行われ、問題なく目的の環状化DNAが作成される。
　一方、図８の(ｂ)タイプの分子の場合、第１環状化は、単分子としては不可であるため除去される。しかし複数DNAとの環状化は形成しうる（例えば、(ｂ)タイプの分子と(ｃ)タイプの分子による２分子結合）。この複数DNA分子は必ず結合先として(ａ)または(ｃ)タイプの分子と結合することになる。従って、両側は必ずＮ配列のある特異配列との結合となる。このため、ニック切断後の第２環状化は形成不可となり排除される。
　また、図８の(Ｃ)タイプの分子の場合、第１環状化は単分子としては不可で除去される。しかし複数DNAとの環状化は形成しうる（例えば、(ｂ)タイプの分子と(ｃ)タイプの分子による２分子結合）。このDNA断片はもともと両端に異なるＮ配列があるため、ニック切断後の第２環状化は不可であり排除される。
・第１制限酵素X部位にパリンドローム配列を使う場合
　図８の(ａ) タイプの分子の場合、第１環状化、ニックによる切断、第２環状化が問題なく行われ、問題なく目的の環状化DNAが作成される。
　一方、図８の(ｂ)タイプの分子の場合、第１環状化は可能であるが、ニック配列を有さないためニック切断が行われずに環状化DNAのまま残ってしまい排除できない。これを防ぐ方法例として、下記ののBstXI法がある。
　また図８の(ｃ)タイプの分子の場合、第１環状化およびニックによる切断は可能であるが、もともと両端に異なるＮ配列があるため、ニック切断後の第２環状化は不可であり排除される。
・BstXI法について
　両端にアダプター（Ａ）が付加された場合、第一段階でライゲーションされるが、第二段階の開裂が起きないため、このままでは環状のままとどまるという問題を解決する方法として、アダプター（Ａ）の制限酵素サイトを含む外側に例えばBstXIを仕込むことが挙げられる。つまり、下記制限酵素サイトBstXI部位において、CCANNNNNNTGGを、例えば、 CCAGAATTCTGGとなるようにEcoRIサイトを組み込む。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
 　即ち、この方法では、アダプター（Ａ）ならびにアダプター（Ｂ）に含まれるアダプター（Ａ）の制限酵素サイトを例えばEcoRIサイトとする。そして、アダプター（Ａ）だけ、EcoRIサイトの外側の配列を、例えば、BstXIの認識配列とする。つまり、アダプター（Ａ）の配列をCCAGAATTCTGGとする。一方、アダプター（Ｂ）に含まれるアダプター（Ａ）には、EcoRIサイトを含めるが、BstXIの認識配列は組み込まず、BstXIでは切断されないようにする。
　こうるすことにより、もしアダプター（Ａ）同士が両端につき、それ同士が会合した場合、BstXIで切断することで、環状化を開き、排除することができる。もちろんアダプター（Ａ）および（Ｂ）とが結合した場合にはアダプター（Ｂ）にはBstXIの認識配列がないため、BstXIでは開裂されない。
　以上のような方法により、cDNAのように上流・下流を区別できないゲノムDNA断片であっても本発明の方法を導入し単分子環状DNAを作成することが可能であり、メイトペア解析の精度を著しく向上させることができる。
実施例３：複数分子環状DNAにおいて同遺伝子同士の遺伝子再結合の可能性について
　かかる可能性は確率論的に十分無視できるが、その根拠を以下に説明する。
　確立論的に分離した遺伝子同士が再び会合する可能性を推定するため、（１）DNA分子の体積と反応溶液量（体積）で推定する場合、（２）反応溶液中の分子数から推定する場合（これらの時、Ｙ部分のＮ塩基数が十分に長く特異性が高いと仮定しておく）、さらに（３）Ｎ塩基数が十分に長くはなく決まっている場合、の３つに分けて可能性を概算する。
（１）DNA分子の体積と反応溶液量（体積）で推定する場合
　まずDNA１分子を球状として体積を推定し、反応系で一度分離された分子同士が互いに球体として溶液中で会合する可能性を概算する。
　一塩基の長さ：0.34 nm (0.34 x 10e-9 m = 3.4 x 10e-8 mm)
　3kbp (3000 bp) のプラスミドの長さ：1 x 10e-4 mm
　球体として占めると推定した体積は：4/3 x 3.14 x (1 x 10e-4) x (1 x 10e-4) x (1 x 10e-4) mm3 = 4 x 10e-12 mm3
　一分子の体積を4 x 10e-12 mm3と仮定すると100 ul中には球体として：100 mm3 / 4 x 10e-12 mm3 = 2.5 x 10e13となる。
　従って、均一であるとすると、ある球体に相補的とされる同等な球体が会合する可能性は、(1 / (2.5 x 10e13)) = 4 x 10e-14と極めて小さい。
（２）反応溶液中の分子数から推定する場合
　一方、分子数を計算すると、
　3kbpのプラスミドの分子量は：625 x 3000 = 1.8 x 10e6
　１モルのプラスミド質量は：1 mol/L = 1.8 x 10e6 g / 1L = 1.8 x 10e12 ug / 1L 
　3 ugのプラスミドのモル数は：1 (mol/L) x 3 ug / (1.8 x 10e12) ug = 3 /1.8 x 10e-12 mol/L = 1.6 x 10e-12 mol/L = 1.6 x 10e-9 mol/ml
　アボガドロ数を　6 x 10e23 とすると、3ugプラスミドを1ml中に溶かした時の分子数は：1.6 x 10e-9 mol/ml x 6 x 10e23 = 1.6 x 6 x 10e14 = 1 x 10e15 個
　従って、100 ul の反応系に 3ugのプラスミドが存在すると：100 ul = 10 e-1 mm3であるので、1 x 10e14 分子数あることになる。
　この分子数の溶液中である分子が、その分子に相補的とされる同等な分子に会合する可能性は、1 / 1 x 10e14と極めて小さい。
（３）以上より、むしろＹ部分のＮ塩基数の特異性の方が、分離された遺伝子同士が再結合する可能性に寄与すると推測される。
　Ｎ塩基数が「５」である場合、同じ遺伝子断端同士を有して２つの同遺伝子が再結合する可能性は：((1/4) x (1/4) x (1/4) x (1/4) x (1/4)) x ((1/4) x (1/4) x (1/4) x (1/4) x (1/4)) = 1 x 10e-6
　従ってこれらの概算から、複数のDNAが環状形成した後に分離した場合に、その際と同じDNA同士で再結合する可能性は極めて低く、十分に無視できると結論できる。
実施例４：単分子DNAによる環状化DNA作成
　２段階DNA結合（ligation）法により単分子DNAによる環状化の効率を上げ、複数DNA分子による環状化のノイズを減少させることを検証するため以下のような実験を行った。
　２種類のプラスミド、Plasmid AおよびPlasmid Bを準備した。それぞれのプラスミドを制限酵素で切断した後に、そのままライゲーションしたもの（i）と、本発明のアダプターをライゲーションして２段階ライゲーションしたもの（ii）を比較した。
　本発明の方法を適用した（ii）は、アダプターとして任意の塩基Nを６塩基としてランダム合成し、アダプターライゲーション後にアダプターの末端に存在するNcoIサイトで切断した後に、これらプラスミドの混合物を１段階目のライゲーションにより環状化し、さらにNick酵素で６塩基の任意Nの前後にNickを入れ環状化を解いた後に、再度のライゲーションにより２段階目の環状化を行ったものである。
　この時、混合溶液中（i）および（ii）には、（１）Plasmid Aの単分子による環状化DNA、（２）Plasmid Bの単分子による環状化DNA、（３）Plasmid Aの複数分子による環状化DNA、（４）Plasmid Bの複数分子による環状化DNAそして（５）Plasmid AとPlasmid Bを含む複数分子による環状化DNAが含まれると予測される。
　本発明によると、（i）と比較して（ii）では、（３）（４）（５）の環状化DNAが大幅に減少していることが期待された。
　そこでこれら(i)および(ii)から生成した混合溶液中の、（５）の量を代表として評価することとし、Plasmid AおよびPlasmid Bに特異的なPCRプライマーで定量的PCRを行った。
　その結果、（５）のようなノイズにあたる複数分子による環状化DNA量が、本発明の方法の導入(ii)によって、(i)の方法と比べて約１００分の１に減少させることが可能であることが確認された。
　本発明のアダプターおよび方法を用いることにより、遺伝子解析の精度が劇的に改善される。また、従来にない高精度のメイトペア解析が可能となり、ゲノム解析に極めて有用なツールが提供される。特に、本発明の方法をcDNAライブラリーの作成に応用することで、新規の融合遺伝子が高い可能性で発見される可能性がある。すなわち、単一DNA分子の環状化を確実に達成することにより、新たな診断ツール・方法が開発可能となる。
　本発明によると、DNAの環状化において、複数分子による環状化を実質的に防止する、単分子DNAのみの環状化方法が提供されることにより、メイトペア解析などの遺伝子解析におけるコンタミネーションの問題が解決され、高精度の解析が可能となる。また、本発明の方法を融合遺伝子の検出・解析に適用することにより、高精度の融合遺伝子の解析が可能となり、有効な診断ツールを提供することができる。

Claims (19)

  1. 　以下の工程を含む、単分子DNAから形成される環状DNAからなり、複数分子DNAから形成される環状DNAを含まない、環状DNAの作成方法：
    １）各目的DNA分子の一方の末端に第一段階環状化用アダプター（Ａ）を結合させ、他方の末端に、アダプター（ｂ）と前記アダプター（Ａ）を含む第二段階環状化用アダプター（Ｂ）を結合させる工程；ここで、アダプター（Ｂ）は、DNA分子にアダプター（ｂ）側を介して結合して、アダプター（Ｂ）中のアダプター（Ａ）は、DNA分子とアダプター（ｂ）との結合の外側に位置する、
    　ここで、
    　アダプター（Ａ）は、いずれのアダプター（Ａ）の切断末端とも非特異的に結合する切断末端を生じさせる切断部位を含む：
    　アダプター（ｂ）は、同一のアダプター（ｂ）由来の切断末端にのみ特異的に結合する切断末端を生じさせる切断部位を含む；
    ２）アダプター（Ａ）の切断部位において、工程１）で得られたDNA分子を切断する第一切断工程、
    ３）工程２）で得られたDNA分子の両末端を結合させて環状化させる第一段階環状化工程；
    ４）工程３）において、環状化せず直線状となった単分子および複数分子が結合したDNAを除去する工程；
    ５）アダプター（ｂ）の切断部位において、工程３）および工程４）で得られた環状DNA分子を切断する第二切断工程、および、
    ６）工程５）で得られたDNA分子の両末端を結合させて環状化させる第二段階環状化工程。
  2. 　以下の工程を含む、単分子DNAから形成される環状DNAからなり、複数分子DNAから形成される環状DNAを含まない、環状DNAの作成方法：
    １）各目的DNA分子の一方の末端に第一段階環状化用アダプター（Ａ）を結合させ、他方の末端に、アダプター（ｂ）と前記アダプター（Ａ）を含む第二段階環状化用アダプター（Ｂ）を結合させる工程；ここで、アダプター（Ｂ）は、DNA分子にアダプター（ｂ）側を介して結合して、アダプター（Ｂ）中のアダプター（Ａ）は、DNA分子とアダプター（ｂ）との結合の外側に位置する、
    　ここで、
    　アダプター（Ａ）は、パリンドローム配列を認識する制限酵素サイトを含む二本鎖DNAであり、
    　アダプター（Ｂ）は、アダプター（ｂ）と前記アダプター（Ａ）を含み、アダプター（ｂ）は、互いに逆向きに配向した互いに同一のニック作成酵素認識サイトまたは制限酵素サイトを含み、その逆向きに配向した互いに同一のニック作成酵素認識サイトまたは制限酵素サイトの間に、個々のアダプター（ｂ）に固有の配列を有する二本鎖DNA配列を含む二本鎖DNAであり、該逆向きに配向した互いに同一のニック作成酵素認識サイトまたは制限酵素サイトによりアダプター（ｂ）が開裂した場合、該開裂部位は、同一のアダプター（ｂ）由来の開裂部位とのみ再結合するものである；
    ２）アダプター（Ａ）に含まれる制限酵素サイトを認識する制限酵素により、工程１）で得られたDNA分子を切断する第一切断工程、
    ３）工程２）で得られたDNA分子の両末端をライゲーションさせて環状化させる第一段階環状化工程；
    ４）工程３）において、環状化せず直線状となった単分子および複数分子が結合したDNAを除去する工程；
    ５）アダプター（ｂ）におけるニック作成酵素認識サイトまたは制限酵素サイトを認識するニック作成酵素または制限酵素により、工程３）および工程４）で得られた環状DNA分子を切断する第二切断工程、および、
    ６）工程５）で得られたDNA分子の両末端をライゲーションさせて環状化させる第二段階環状化工程。
  3. 　請求項２に記載の工程６）において、アダプター（ｂ）が部分的に異なる切断配列部位を介して結合して環状化することにより形成される環状化DNAを、エンドヌクレアーゼを用いて分解する工程をさらに含む請求項２に記載の方法。
  4. 　アダプター（Ａ）がパリンドローム配列を認識する制限酵素サイトＸを含む二本鎖DNAであり、
    　アダプター（Ｂ）が下記構造ｙ１－Ｙ－ｙ２－Ｘを有する互いに相補的な二本鎖DNAからなる二本鎖DNAである請求項２記載の方法：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     ［構造中、
    Ｘは、パリンドローム配列を認識する制限酵素サイトである二本鎖DNAであり；
    ｙ１およびｙ２は、互いに逆向きに配向した互いに同一のニック作成酵素認識サイトまたは制限酵素サイトを含む二本鎖DNAであり；
    Ｙは、環状化させる個々のDNA分子に固有の配列を有する二本鎖DNA配列であって、ｎは１以上４０以下の整数であり、Ｎ１～Ｎｎは、それぞれ同一であっても異なっていてもよく、ｄＡＭＰ、ｄＣＭＰ、ｄＧＭＰおよびｄＴＭＰからなる群から選択されるデオキシリボヌクレオチドであり、Ｎ’１～Ｎ’ｎは、前記Ｎ１～Ｎｎに対してそれぞれ下記：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
     のデオキシリボヌクレオチドであり、ここで、ｋは１～ｎの整数である］。
  5. 　ｙ１およびｙ２がニック作成酵素認識サイトを含む請求項４記載の方法。
  6. 　ニック作成酵素がNb.BtsIまたはNt.BsqQIである請求項５記載の方法。
  7. 　ｙ１およびｙ２が制限酵素サイトを含む請求項５記載の方法。
  8. 　下記構造ｙ１－Ｙ－ｙ２－Ｘを有する互いに相補的な二本鎖DNAからなる環状DNA作成用アダプター：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     ［構造中、
    Ｘは、パリンドローム配列を認識する制限酵素サイトである二本鎖DNAであり；
    ｙ１およびｙ２は、互いに逆向きに配向した互いに同一のニック作成酵素認識サイトまたは制限酵素サイトを含む二本鎖DNAであり；
    Ｙは、環状化させる個々のDNA分子に固有の配列を有する二本鎖DNA配列であって、ｎは１以上４０以下の整数であり、Ｎ１～Ｎｎは、それぞれ同一であっても異なっていてもよく、ｄＡＭＰ、ｄＣＭＰ、ｄＧＭＰおよびｄＴＭＰからなる群から選択されるデオキシリボヌクレオチドであり、Ｎ’１～Ｎ’ｎは、前記Ｎ１～Ｎｎに対してそれぞれ下記：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
     のデオキシリボヌクレオチドであり、ここで、ｋは１～ｎの整数である］。
  9. 　ｙ１およびｙ２がニック作成酵素認識サイトを含む請求項８記載のアダプター。
  10. 　ニック作成酵素がNb.BtsIまたはNt.BsqQIである請求項９記載のアダプター。
  11. 　ｙ１およびｙ２が制限酵素サイトを含む請求項８記載のアダプター。
  12. 　請求項８に記載のＸにおける制限酵素サイトと同一の制限酵素サイトを含む二本鎖DNAからなるアダプター（Ａ）と、請求項８～１０のいずれかに記載のアダプター（Ｂ）とを含む、環状DNA作成用キット。
  13. 　請求項１から７いずれか記載の方法を用いる、ｃＤＮＡライブラリーの作成方法。
  14. 　以下の工程を含む、請求項１から７いずれか記載の方法を用いて得られた環状DNA分子をメイトペア法に供することにより遺伝子を同定する方法：
    １）請求項１から７いずれか記載の方法を用いて得られた環状DNA分子における、アダプター（Ｂ）の両側に隣接するそれぞれ１５塩基以上６００塩基以下の塩基配列を解読する工程；および、
    ２）解読した塩基配列を既知の遺伝子の両末端の配列と比較することにより、環状DNA分子に含まれる遺伝子を同定する工程。
  15. 　以下の工程を含む、請求項１から７いずれか記載の方法を用いて得られた環状DNA分子をメイトペア法に供することにより融合遺伝子を検出する方法：
    １）請求項１から７いずれか記載の方法を用いて得られた環状DNA分子における、アダプター（Ｂ）の両側に隣接するそれぞれ１５塩基以上６００塩基以下の塩基配列を解読する工程；および、
    ２）解読した塩基配列を既知の遺伝子の両末端の配列と比較する工程、ここで、両末端の遺伝子が既知の相異なる遺伝子に対応する場合、環状DNA分子に含まれる遺伝子は融合遺伝子であると同定される。
  16. 　アダプター（Ｂ）の両側に隣接する両側の配列が、既知融合遺伝子の両側の末端に対応する、請求項１５に記載の融合遺伝子の検出方法。
  17. 　請求項１５に記載の方法により検出された融合遺伝子をマーカーとして用いる、該融合遺伝子の発現を特徴とする疾患を検出する方法。
  18. 　アダプター（Ｂ）の両側に隣接する配列が、相異なる遺伝子の末端配列に対応し、かつ既知融合遺伝子の両側の末端には対応しないことにより、環状DNA分子に含まれる遺伝子が新規融合遺伝子であると同定される請求項１５に記載の方法。
  19. 　請求項１８に記載の方法により検出された新規融合遺伝子の創薬スクリーニングにおける使用。
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