JP4303303B2 - Ｅｍｌ４−ａｌｋ融合遺伝子 - Google Patents

Description

本願発明は、新規な融合蛋白質であるポリペプチド、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有するベクター、該ベクターを含有する形質転換細胞、前記融合蛋白質又はポリヌクレオチドの検出方法、癌治療剤のスクリーニング方法及び癌治療剤に関する。

現在までに、癌化関連遺伝子はいくつか知られており、特に、チロシンキナーゼ遺伝子は細胞の増殖を直接制御する重要な酵素をコードしており、アミノ酸配列の置換や欠失などによる自己リン酸化の亢進として検出されるキナーゼ活性の自発活性化により細胞を癌化に導くことが知られている。

例えば、未分化大細胞リンパ腫 (ALCL)ではNPMとALKチロシンキナーゼとの融合遺伝子NPM/ALKが半数以上の症例で認められるが、NPM/ALKによる腫瘍細胞の増殖にはALKキナーゼの活性化が重要である事が示された（非特許文献２５、非特許文献１４）。

肺癌の約1割に存在する新規な異常キナーゼの存在が報告されているが具体的な分子に関する言及はない（非特許文献２）。

エキノダームマイクロチューブルアソシエートプロテインライク４（echinoderm microtubule-associated protein like protein 4； EML4）（非特許文献３）は、アミノ末端に塩基性領域を有し、さらにそのカルボキシル末端側にWDドメインを有している（非特許文献８）。EML4の生理的機能はほとんど知られていない。

一方、アナプラスチックリンフォーマキナーゼ（Anaplastic Lymphoma Kinase； ALK）（非特許文献４）は受容体型チロシンキナーゼであり、中央部に細胞膜貫通領域を有し、そのカルボキシル末端側にチロシンキナーゼ領域、アミノ末端側に細胞外領域を有する蛋白質である（非特許文献５）。

これまでに、神経芽細胞腫、神経膠芽腫、乳癌、メラノーマなど幾つかの外胚葉を起源とする癌細胞において全長ALKが発現していることが報告されている（非特許文献１３）が内胚葉及び中胚葉を起源とする癌細胞においては全長ALKの発現は観察されていない。神経芽細胞腫細胞株の多くで全長ALKが発現しているが、これら神経芽腫細胞株ではALKの自己リン酸化が観察されず、また神経芽細胞腫患者でのコホート解析からALKの発現と癌化との関連性は低いことが報告されており、神経芽細胞腫でのALKの発現は癌化との関連性というよりはむしろ正常の神経分化における発現を反映している可能性が示唆されている（非特許文献１０）。一方で、プレイオトロフィン（pleiotrophin）やミッドカイン（midkine）といったリガンドやALK自身の遺伝子増幅によりALKの自己リン酸化の増加や細胞内シグナルが動員される例も報告されており、ALKが癌細胞の増殖に寄与している可能性も報告されている(非特許文献１２)。

また、ヒト悪性リンパ腫や炎症性筋線維芽細胞腫瘍（inflammatory myofibroblastic tumor）の一部の症例において、ALK遺伝子が染色体転座又は逆位の結果他の遺伝子(NPM、CLTCL、TFG 、CARS、SEC31L1など)と融合し、融合型チロシンキナーゼを作ることが報告されている（非特許文献９、１１、１４〜１９、非特許文献２６〜２８）。また、ALK抗体を用いてALKと融合体を形成する蛋白質を同定する方法が報告されていた（非特許文献６）。一方、ＥＭＬ４とＡＬＫとの融合遺伝子は報告されていない。また、パートナー分子の多くは複合体形成ドメインを有していることから、融合体自身も複合体を形成していると考えられており、この複合体形成がＡＬＫのチロシンキナーゼ活性の制御不能を引き起こし、細胞内シグナルが異常に活性化され癌化を惹き起こしていると考えられている（非特許文献１０）。実際にＡＬＫ融合体を発現したリンパ腫細胞に対して、ＡＬＫのｓｈＲＮＡやＡＬＫのキナーゼ抑制化合物を用いることで、細胞増殖抑制及び細胞死を誘導できることが報告されていることから、上記ＡＬＫ融合体がリンパ腫や炎症性筋線維芽細胞腫瘍の治療ターゲットとなる可能性が示唆されている（非特許文献２０〜２２）。また、前述のようにＡＬＫが増殖に関与するその他の癌に対して、ＡＬＫが治療ターゲットとなる可能性があることが示唆されている（非特許文献２１〜２２）。

JAK3チロシンキナーゼ抑制物質として利用されていたWHI-P131およびWHI-P154がNPM-ALKの活性を抑制すること（非特許文献２２）、また、低分子量ALK該抑制剤がNPM-ALK発現リンパ腫細胞株の細胞死を誘導することが報告されている（非特許文献２１）。その他にも、複数のALK抑制活性を有する低分子化合物が報告されている（非特許文献２３、非特許文献２４、特許文献１〜３）。

国際公開第２００４／０８０９８０号パンフレット 国際公開第２００５／００９３８９号パンフレット 国際公開第２００５／０１６８９４号パンフレット

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癌の新たな原因遺伝子であるポリヌクレオチドを解明し、これにより、当該ポリヌクレオチドの検出方法及びそのためのキット、癌治療剤のスクリーニング方法、並びに治療方法及び治療剤を提供することを課題とする。

本発明者らは、肺癌患者から得た試料から、染色体逆位によって産生される、ＥＭＬ４遺伝子の一部とキナーゼであるＡＬＫ遺伝子の一部とが融合した新規な融合ポリヌクレオチド（以下、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリヌクレオチドｖ１）のｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡの一部を単離することに成功した（実施例１、実施例２）。また、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリヌクレオチドｖ１とは異なる部分で融合している新規融合ポリヌクレオチドであるＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリヌクレオチドｖ２のｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡの一部、並びに新規融合ポリヌクレオチドであるＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリヌクレオチドｖ３のｃＤＮＡを単離することに成功した（実施例４（１）、実施例３（３）、実施例11（1））。臨床検体を用いた解析により、前記ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリヌクレオチドｖ１、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリヌクレオチドｖ２又はＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリヌクレオチドｖ3が肺癌患者の一部に存在していることを見出した（実施例３、実施例11（1））。一方、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリヌクレオチドは腫瘍形成能を示す癌の原因遺伝子であること（実施例６、実施例10（3）、実施例11（2））から、ＥＭＬ４とＡＬＫの融合ポリペプチドは、前記融合ポリヌクレオチドが陽性である癌の治療剤スクリーニングのツールとなることを明らかにした。これらの知見をもとに、本発明者らは、被験者から得た試料における前記融合ポリヌクレオチド又は融合ポリペプチドの検出方法（実施例３、実施例４（２）、実施例５（２）、実施例９、実施例11（3））、ついで、癌の原因となる前記融合ポリヌクレオチド及び／又は前記融合ポリペプチドの抑制剤（即ち前記融合ポリヌクレオチドが陽性の癌の治療剤）をスクリーニングする方法を構築し（実施例７、実施例１０（３）、実施例11（4）（5）（8））、スクリーニングにより得られた化合物が抗腫瘍効果を示すことを確認した（実施例８（３）（７）（８）、実施例11（6）（9））。これらにより、前記融合ポリヌクレオチドが検出された被験者は、該融合ポリヌクレオチド及び／又はそれによりコードされるポリペプチドの抑制剤による癌治療が可能である。前記検出方法により治療剤の適用対象を選別することができ、これにより、前記抑制剤による治療の高い有効性が期待されるテーラーメード医療が実践できる。

これらの知見から、本発明者らは、スクリーニングツールとして有用な新規ポリヌクレオチド、ポリペプチド、スクリーニング方法、並びにＥＭＬ４遺伝子とＡＬＫ遺伝子との融合遺伝子陽性の癌治療用医薬組成物を提供した。また、ＥＭＬ４遺伝子とＡＬＫ遺伝子との融合遺伝子陽性の癌を検出するのに有用な検出方法を提供して本発明を完成させた。
すなわち本発明は、
［１］配列番号２、配列番号７又は配列番号130で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、キナーゼ活性を有するポリペプチド、あるいは、配列番号２、配列番号７又は配列番号130で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、しかもキナーゼ活性を有するポリペプチド、
［２］配列番号２、配列番号７又は配列番号130で表されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかもキナーゼ活性を有するポリペプチド、
［３］配列番号２、配列番号７又は配列番号130で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
［４］［１］乃至［３］に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
［５］［４］に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター、

［６］［５］に記載の発現ベクターで形質転換された細胞、
［７］ポリペプチドの発現に適した条件下で［６］に記載の形質転換された細胞を培養すること、及び前記ポリペプチドを細胞から回収することを含んでなる、［１］乃至［３］のポリペプチドの製造方法、
［８］被験者から得た試料中の、［１］乃至［３］に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの存在を検出する工程を含むことを特徴とする、ＥＭＬ４遺伝子とＡＬＫ遺伝子との融合遺伝子の検出方法、
［９］被験者から得た試料中の、［１］乃至［３］に記載のポリペプチドの存在を検出する工程を含むことを特徴とする、ＥＭＬ４遺伝子とＡＬＫ遺伝子との融合遺伝子によってコードされる融合蛋白質の検出方法、
［１０］［１］乃至［３］に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを特異的に増幅できるように設計したセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを含む、ＥＭＬ４遺伝子とＡＬＫ遺伝子との融合遺伝子の検出用キット、

［１１］ＥＭＬ４遺伝子とＡＬＫ遺伝子との融合遺伝子を検出するためのプライマーセットであって、下記ａ）〜ｃ)からなる群より選択されるプライマーセット；
ａ）［４］に記載のポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子からなるアンチセンスプライマー及び該ポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸分子からなるセンスプライマーを含むプライマーセット、
ｂ）配列番号４で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子からなるアンチセンスプライマー及び該ポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸分子からなるセンスプライマーを含むプライマーセット、
ｃ）配列番号５で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子からなるアンチセンスプライマー及び該ポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸分子からなるセンスプライマーを含むプライマーセット、
［１２］配列番号１の塩基番号１から１７５９間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号１の塩基番号１７６０から３９２６間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセットであって、センスプライマーとアンチセンスセンスプライマーにより増幅される増幅産物の大きさが１ｋｂ以下である前記プライマーセット又はその相補鎖からなるプライマーセット、
［１３］配列番号６の塩基番号１から２２４２の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号６の塩基番号２２４３から３９３３の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセットであって、センスプライマーとアンチセンスセンスプライマーにより増幅される増幅産物の大きさが１ｋｂ以下である前記プライマーセット又はその相補鎖からなるプライマーセット、
［１４］配列番号４の塩基番号１から3629間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号４の塩基番号3630から3979間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセットであって、センスプライマーとアンチセンスセンスプライマーにより増幅される増幅産物の大きさが１ｋｂ以下である前記プライマーセット又はその相補鎖からなるプライマーセット、
［１５］配列番号５の塩基番号１から５７９の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号５の塩基番号５８０から８５３の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット又はその相補鎖からなるプライマーセット、

［１６］配列番号129の塩基番号１から700間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号129の塩基番号701から1691間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセットであって、センスプライマーとアンチセンスセンスプライマーにより増幅される増幅産物の大きさが１ｋｂ以下である前記プライマーセット又はその相補鎖からなるプライマーセット、
［１７］（１）［１］乃至［３］に記載のポリペプチド又は前記ポリペプチドを発現している細胞に試験物質を接触させる工程、（２）前記ポリペプチドが抑制されるか否かを分析する工程、及び（３）前記ポリペプチドを抑制する物質を選択する工程を含むことを特徴とする前記ポリペプチドを抑制する物質をスクリーニングする方法、
［１８］［１］乃至［３］に記載のポリペプチドを抑制する物質がＥＭＬ４遺伝子とＡＬＫ遺伝子との融合遺伝子陽性の癌の治療剤である、［１７］のスクリーニングする方法、
［１９］［１］乃至［３］に記載のポリペプチドを抑制する物質を含有する、ＥＭＬ４遺伝子とＡＬＫ遺伝子との融合遺伝子陽性の癌治療用医薬組成物、
［２０］［１］乃至［３］に記載のポリペプチドを抑制する物質が、５−クロロ−Ｎ^４−［２−（イソプロピルスルホニル）フェニル］−Ｎ^２−｛２−メトキシ−４−［４−（４−メチルピペラジン−１−イル）ピペリジン−１−イル］フェニル｝ピリミジン−２，４−ジアミン又は２−［（５−ブロモ−２−｛［２−メトキシ−４−（４−メチルピペラジン−１−イル）フェニル］アミノ｝ピリミジン−４−イル）アミノ］−Ｎ−メチルベンゼンスルホンアミドである［１９］に記載のＥＭＬ４遺伝子とＡＬＫ遺伝子との融合遺伝子陽性の癌治療用医薬組成物、

［２１］二重鎖部分が配列番号１の第１７４３番から第１７６１ 番、第１７４４番から第１７６２番、第１７５０番から第１７６８番、第１７５３番から第１７７１番、第１７５６番から第１７７４番又は第１７５７番から第１７７５番に記載の塩基に基づいて設計される、［１］乃至［３］に記載のポリペプチドの発現抑制活性を有する二重鎖核酸、
［２２］［２１］に記載の二重鎖核酸を有効成分とする、ＥＭＬ４遺伝子とＡＬＫ遺伝子との融合遺伝子陽性の癌治療用医薬組成物
に関する。

前記何れの文献にも、EML4遺伝子とALK遺伝子とが融合遺伝子を形成すること、ましてやEML4遺伝子とALK遺伝子との融合遺伝子が一部の癌患者に発現しているという報告は全くなく、EML4遺伝子とALK遺伝子とが融合遺伝子を形成し、一部の癌患者に発現していることは、本発明者らが初めて見出した知見であり、EML4遺伝子とALK遺伝子との融合遺伝子を用いたスクリーニング方法は、本発明者らが初めて行なった発明である。また、該融合遺伝子陽性の癌の検出を行うのに有用な該融合遺伝子の検出方法、該検出に有用なプライマーセット、及び検出用キットは、上記本発明者らが見出した知見によって、初めて提供された発明である。５−クロロ−Ｎ^４−［２−（イソプロピルスルホニル）フェニル］−Ｎ^２−｛２−メトキシ−４−［４−（４−メチルピペラジン−１−イル）ピペリジン−１−イル］フェニル｝ピリミジン−２，４−ジアミン又は２−［（５−ブロモ−２−｛［２−メトキシ−４−（４−メチルピペラジン−１−イル）フェニル］アミノ｝ピリミジン−４−イル）アミノ］−Ｎ−メチルベンゼンスルホンアミドを含む種々のALK阻害剤（特許文献３〜４、非特許文献２０〜２２、非特許文献２４、本願第一優先日後第二優先日前に出版された文献であるPNAS,2007,Jan2, 104(1), 270-275 Epub2006 Dec）及びALK阻害剤がNPM-ALK融合体を発現しているリンパ腫細胞において増殖抑制及び細胞死を誘導できること（非特許文献２０〜２２）、リンパ腫を抑制したこと（本願第一優先日後第二優先日前に出版された文献であるPNAS,2007,Jan2, 104(1), 270-275 Epub2006 Dec）が報告されていたが、これらが、EML4遺伝子とALK遺伝子との融合遺伝子陽性の癌（特には肺癌）治療の用途を有することは全く知られておらず、EML4遺伝子とALK遺伝子との融合遺伝子陽性の癌（特には肺癌）治療用医薬組成物は、上記本発明者らが見出した知見によって、初めて提供された発明である。

本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、発現ベクター及び細胞は、本発明のポリペプチドを抑制する物質（特にはＥＭＬ４遺伝子とＡＬＫ遺伝子との融合遺伝子陽性の肺癌治療剤）のスクリーニングに用いることができる。また、本発明のポリペプチド及び／又はポリヌクレオチドの存在を指標にすることにより、ＥＭＬ４遺伝子とＡＬＫ遺伝子との融合遺伝子陽性の対象（特には肺癌患者）の検出を行うことが可能である。本発明のスクリーニング方法により、ＥＭＬ４遺伝子とＡＬＫ遺伝子との融合遺伝子陽性の癌治療剤（特には肺癌治療剤）のスクリーニングを行うことができる。本発明のプライマー及び検出用キットは、本発明のＥＭＬ４遺伝子とＡＬＫ遺伝子との融合遺伝子陽性を検出するために利用することができ、本発明の検出方法は、ＥＭＬ４遺伝子とＡＬＫ遺伝子との融合遺伝子陽性の癌（特には肺癌）を検出する方法として利用できる。また、本発明の検出方法により、本発明の治療剤の適用対象者であるか否かを鑑別することができる。本発明のポリペプチドを抑制する物質は、ＥＭＬ４遺伝子とＡＬＫ遺伝子との融合遺伝子陽性の癌、特に肺癌の治療剤として有用である。

以下に本発明について詳細に説明する。本明細書における遺伝子操作技術は特に断りのない限り「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」 Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊら、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８９年等の公知技術に従って実施可能であり、蛋白質操作技術は特に断りのない限り「タンパク実験プロトコール」（秀潤社、１９９７年）等の公知技術に従って実施可能である。

本明細書における「本発明のポリペプチドが抑制される」とは、「本発明のポリペプチドの発現が抑制される」と「本発明のポリペプチドの活性が抑制される」との両方を含み、「本発明のポリペプチドを抑制する物質」とは、「発明のポリペプチドの発現を抑制する物質」と「本発明のポリペプチドの活性を抑制する物質」との両方を含む。

本明細書における「スクリーニング」とは、多数の試験物質の中から目的の活性を有する物質を篩い分けること、及び、ある試験物質について、その物質が目的の性質を有する物質であるか否かを検出することの両方を含む。

＜本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、発現ベクター、形質転換された細胞、及びポリペプチドの製造方法＞
本発明のポリペプチドには、
（１）配列番号２、配列番号７又は配列番号130で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（２）（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、キナーゼ活性を有するポリペプチド、あるいは、配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも、キナーゼ活性を有するポリペプチド（以下、ｖ１機能的等価改変体）；
（ｂ）配列番号７で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、キナーゼ活性を有するポリペプチド、あるいは、配列番号７で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも、キナーゼ活性を有するポリペプチド（以下、ｖ２機能的等価改変体）；
（ｃ）配列番号130で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、キナーゼ活性を有するポリペプチド、あるいは、配列番号130で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも、キナーゼ活性を有するポリペプチド（以下、ｖ3機能的等価改変体）；
（以下、ｖ１機能的等価改変体、ｖ２機能的等価改変体及びｖ3機能的等価改変体を総称して機能的等価改変体と称する）；及び
（３）（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも、キナーゼ活性を有するポリペプチド（以下、ｖ１相同ポリペプチド）；
（ｂ）配列番号７で表されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも、キナーゼ活性を有するポリペプチド（以下、ｖ２相同ポリペプチド）；
（ｃ）配列番号130で表されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも、キナーゼ活性を有するポリペプチド（以下、ｖ3相同ポリペプチド）；
（以下、ｖ１相同ポリペプチド、ｖ２相同ポリペプチド及びｖ3相同ポリペプチドを総称して相同ポリペプチドと称する）；
が含まれる。

「機能的等価改変体」としては、「配列番号２、配列番号７又は配列番号130で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個、好ましくは１〜数個、更に好ましくは１〜７個、最も好ましくは１〜５個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも、キナーゼ活性を有するポリペプチド」が好ましく、「配列番号２、配列番号７又は配列番号130で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、キナーゼ活性を有するポリペプチド」が特に好ましい。

「相同ポリペプチド」は、「配列番号２、配列番号７又は配列番号130で表されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも、キナーゼ活性を有するポリペプチド」であるが、該同一性が、好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上であるアミノ酸配列を含むポリペプチドが好ましい。

なお、本明細書における前記「同一性」とは、ＮＥＥＤＬＥ ｐｒｏｇｒａｍ（Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １９７０； ４８： ４４３−４５３）検索によりデフォルトで用意されているパラメータを用いて得られた値Ｉｄｅｎｔｉｔｙを意味する。前記のパラメータは以下のとおりである。
Ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｙ ＝ １０
Ｅｘｔｅｎｄ ｐｅｎａｌｔｙ ＝ ０．５
Ｍａｔｒｉｘ ＝ ＥＢＬＯＳＵＭ６２

「キナーゼ活性を有する」とは、チロシンをリン酸化する酵素としての活性を有することを意味する。あるポリペプチドが「キナーゼ活性を有する」ことは、実施例７（２）の方法で確認する。機能的等価改変体及び相同ポリペプチドは、キナーゼ活性を有することに加え、腫瘍形成能を併せ持つことが更に好ましい。腫瘍形成能を有することは、実施例6（1）の方法で確認する。

以上、本発明のポリペプチドについて説明したが、配列番号２、配列番号７又は配列番号130で表されるアミノ酸からなるポリペプチド、機能的等価改変体、及び相同ポリペプチドを総称して、以下、「本発明のポリペプチド」と称する。本発明のポリペプチドのうち、配列番号２で表されるアミノ酸からなるポリペプチド、ｖ１機能的等価改変体、及びｖ１相同ポリペプチドを総称して「本発明のポリペプチドｖ１型」、配列番号７で表されるアミノ酸からなるポリペプチド、ｖ２機能的等価改変体、及びｖ２相同ポリペプチドを総称して「本発明のポリペプチドｖ２型」、配列番号130で表されるアミノ酸からなるポリペプチド、ｖ3機能的等価改変体、及びｖ3相同ポリペプチドを総称して「本発明のポリペプチドｖ3型」と称する。配列番号２で表されるアミノ酸からなるポリペプチドである蛋白質を「ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドｖ１」と称し、配列番号７で表されるアミノ酸からなるポリペプチドである蛋白質を「ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドｖ２」と称し、配列番号130で表されるアミノ酸からなるポリペプチドである蛋白質を「ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドｖ3」と称する。「ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドｖ１」、「ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドｖ２」及び「ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドｖ3」を総称して「ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチド」と称する。

本発明のポリペプチドとしては、「配列番号２、配列番号７又は配列番号130で表されるアミノ酸配列を含み、キナーゼ活性を有するポリペプチド」が好ましく、「配列番号２、配列番号７又は配列番号130で表されるアミノ酸配列を含み、キナーゼ活性及び腫瘍形成能を有するポリペプチド」がより好ましい。「配列番号２、配列番号７又は配列番号130で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド」が最も好ましい。

また、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（以下、「本発明のポリヌクレオチド」と称する）は、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチド、機能的等価改変体、又は、相同ポリペプチドをコードする塩基配列で表されるポリヌクレオチドなら何れでもよい。好ましくは、配列番号２、配列番号７又は配列番号130記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドであり、さらに好ましくは、配列番号１（特に好ましくは配列番号１の第２７１番から第３４４７番）、配列番号６又は配列番号129記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドである。

本発明のポリヌクレオチドのうち、本発明のポリペプチドｖ１型をコードする遺伝子を「本発明のポリヌクレオチドｖ１型」と称し、本発明のポリペプチドｖ２型をコードする遺伝子を「本発明のポリヌクレオチドｖ２型」と称し、本発明のポリペプチドｖ3型をコードする遺伝子を「本発明のポリヌクレオチドｖ3型」と称する。

本明細書における「ＥＭＬ４遺伝子とＡＬＫ遺伝子との融合遺伝子」とは、上記本発明のポリヌクレオチドのことをいう。本発明のＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドｖ１をコードするポリヌクレオチドを「ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリヌクレオチドｖ１」、本発明のＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドｖ２をコードするポリヌクレオチドを「ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリヌクレオチドｖ２」、本発明のＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドｖ3をコードするポリヌクレオチドを「ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリヌクレオチドｖ3」と称する。ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリヌクレオチドｖ１、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリヌクレオチドｖ２及びＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリヌクレオチドｖ3を総称して「ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリヌクレオチド」と称する。

本明細書において、「ＥＭＬ４遺伝子とＡＬＫ遺伝子との融合遺伝子陽性の」とは、本発明のポリヌクレオチドが陽性である（すなわち本発明のポリヌクレオチドが存在している）ことをいい、好ましくはＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリヌクレオチドが陽性である（すなわちＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリヌクレオチドが存在している）ことをいう。

本発明のポリヌクレオチドの製造方法は、特に限定されるものではないが、（１）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いた方法、（２）常法の遺伝子工学的手法（すなわちｃＤＮＡライブラリーで形質転換した形質転換株から所望のアミノ酸配列を含む形質転換株を選択する方法）を用いる方法、又は（３）化学合成法を挙げることができる。各製造方法については、ＷＯ０１／３４７８５に記載されているのと同様に実施できる。ただし、上記特許出願明細書における「本発明の新規蛋白」を本発明のポリペプチドからなる蛋白質、「本発明の遺伝子」を本発明のポリヌクレオチドと読み替える。

ＰＣＲを用いた方法では、例えば、ＷＯ０１／３４７８５の「発明の実施の形態」１）蛋白質遺伝子の製造方法ａ）第１製造法に記載された手順により、本発明のポリヌクレオチドを製造することができる。本発明の蛋白質を産生する能力を有する細胞あるいは組織、例えば、ヒト肺癌患者由来肺組織からｍＲＮＡを抽出する。次いで、このｍＲＮＡをランダムプライマー又はオリゴｄＴプライマーの存在下で、逆転写酵素反応を行い、第一鎖ｃＤＮＡを合成することが出来る。得られた第一鎖ｃＤＮＡを用い、目的遺伝子の一部の領域をはさんだ２種類のプライマーを用いてＰＣＲに供し、本発明のポリヌクレオチドを得ることができる。より具体的には、例えば実施例４（１）、実施例11（１）又は実施例11（７）記載の方法により本発明のポリヌクレオチドを製造することが出来る。

人工的に、本発明のポリヌクレオチドを部分的にそれぞれ逆転写（ＲＴ）−ＰＣＲで合成して得たのち、得られた各部分を融合させることでも本発明のポリヌクレオチドの製造が可能である。例えば、（ａ）本発明のポリヌクレオチドｖ１型の場合は、ＥＭＬ４のエキソン１からエキソン１３までの１４８９塩基を、本発明のポリヌクレオチドｖ２型の場合はＥＭＬ４のエキソン１からエキソン２０までの２２４２塩基を内在性にＥＭＬ４を発現してる細胞（例えばＨｅＬａ細胞等）又は組織から抽出したｍＲＮＡを鋳型にして、目的遺伝子の領域をはさんだ２種類のプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲを行って増幅する。一方、例えば、（ｂ）本発明のポリヌクレオチドｖ１型の場合も本発明のポリヌクレオチドｖ２型の場合も、ＡＬＫのエキソン２１からエキソン３０までの１６９１塩基を、内在性にＡＬＫを発現している細胞（例えばＲｈ３０、Ｕ−８７ＭＧ細胞等）又は組織から抽出したｍＲＮＡを鋳型にして、目的遺伝子の領域をはさんだ２種類のプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲを行って増幅する。増幅された（ａ）及び（ｂ）のＰＣＲ産物を融合させることで、本発明のポリヌクレオチドを得ることができる。融合には、上記（ａ）及び（ｂ）のＲＴ−ＰＣＲを行う際に用いるプライマーに工夫を加えると実施できる。例えば、上記（ａ）の断片をＲＴ−ＰＣＲを行って増幅する際のアンチセンスプライマーの５’末端側にＡＬＫのエキソン２１の５’末端のアンチセンス側の塩基配列を１０塩基程度付加したプライマーを作製しアンチセンスプライマーとして用いて（ａ）の断片を増幅する。また、上記（ｂ）の断片をＲＴ−ＰＣＲを行って増幅する際のセンスプライマーの５’末端側に、本発明のポリヌクレオチドｖ１型の場合はＥＭＬ４のエキソン１３の３’末端のセンス側の塩基配列を１０塩基程度、本発明のポリヌクレオチドｖ２型の場合の場合はEML4のエキソン２０の３’末端のセンス側の塩基配列を10塩基程度付加したプライマーを作製しセンスプライマーとして（ｂ）の断片を増幅する。得られたＰＣＲ産物２種類を鋳型として、ＥＭＬ４の開始コドンを含むセンスプライマーとＡＬＫの停止コドンを含むアンチセンスプライマーを用いてＰＣＲを行うことで本発明のポリヌクレオチドを得ることができる。または、ＥＭＬ４の開始コドンを含むセンスプライマーとＡＬＫの停止コドンを含むアンチセンスプライマーを用いずに上記で得られたＰＣＲ産物２種類のみを用いて、アニーリングと伸長反応を行うことでも本発明のポリヌクレオチドを得ることができる。

本発明の発現ベクター、形質転換された細胞、ポリペプチドの製造方法は、例えば、ＷＯ０１／３４７８５の「発明の実施の形態」２）本発明のベクター、本発明の宿主細胞、本発明の組換え蛋白の製造方法に記載された方法により実施できる。単離された本発明のポリヌクレオチドを、適当なベクターＤＮＡに再び組込むことにより、真核生物又は原核生物の宿主細胞を形質転換させることができる。また、これらのベクターに適当なプロモーター及び形質発現にかかわる配列を導入することにより、それぞれの宿主細胞においてポリヌクレオチドを発現させることが可能である。

本発明の発現ベクターは、本発明のポリヌクレオチドを含み、本発明のポリペプチドを発現させる限り、特に限定されるものではなく、例えば、用いる宿主細胞に応じて適宜選択した公知の発現ベクターに、本発明のポリヌクレオチドを挿入することにより得られる発現ベクターを挙げることができる。

また、本発明の細胞も、本発明の前記発現ベクターでトランスフェクション又はインフェクションにより核酸導入され、本発明のポリヌクレオチドを含む限り、特に限定されるものではなく、本発明のポリヌクレオチドが、宿主細胞の染色体に組み込まれた細胞であることもできるし、あるいは、本発明によるポリヌクレオチドを含む発現ベクターの形で含有する細胞であることもできる。本発明の細胞は、例えば、本発明の発現ベクターにより、所望の細胞をトランスフェクション又はインフェクションすることにより得ることができる。より具体的には、例えば、実施例１に記載のように、本発明によるポリヌクレオチドを含む発現ベクターとパッケージング用プラスミド（例えばｐＧＰ、ｐＥ−ｅｃｏ）とを市販のトランスフェクション試薬リポフェクトアミンを用いてＢＯＳＣ２３細胞に導入することで発現レトロウィルスを作製することができ、これをＢＡ／Ｆ３細胞に感染させる（すなわちインフェクションする）ことにより本発明の形質転換細胞を製造することができる。

上記で得られる所望の形質転換細胞は、常法に従い培養することができ、該培養により本発明のポリペプチドからなる蛋白質が生産される。該培養に用いられる培地としては、採用した宿主細胞に応じて慣用される各種のものを適宜選択でき、例えば上記ＢＡ／Ｆ３細胞であれば牛胎児血清（ＦＢＳ）等の血清成分を添加したＲＰＭＩ１６４０等の培地を使用できる。

上記により、形質転換細胞に生産される本発明のポリペプチドは、該ポリペプチドの物理的性質や生化学的性質等を利用した各種の公知の分離操作法により、分離及び精製することができる。本発明のポリペプチドはマーカー配列とインフレームで融合して発現させることで、該蛋白質の発現の確認、精製等が可能になる。

＜本発明のプライマーセット＞
本発明には、本発明のポリヌクレオチドの存在を検出するために有用なプライマーセットが含まれる。

即ち、本発明には、
（１）ＥＭＬ４遺伝子とＡＬＫ遺伝子との融合遺伝子を検出するためのプライマーセットであって、下記ａ）〜ｃ)からなる群より選択されるプライマーセット；
ａ）本発明のポリヌクレオチド［本発明のポリヌクレオチドｖ１型（好ましくは、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリヌクレオチドｖ１、更に好ましくは配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド）、本発明のポリヌクレオチドｖ２型（好ましくは、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリヌクレオチドｖ２、更に好ましくは配列番号６で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド）、及び／又は本発明のポリヌクレオチドｖ3型（好ましくは、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリヌクレオチドｖ3、更に好ましくは配列番号129で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド）］にストリンジェントな条件下（好ましくは、よりストリンジェントな条件下）でハイブリダイズする連続した少なくとも１６塩基の核酸分子からなるアンチセンスプライマー及び該ポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件下（好ましくは、よりストリンジェントな条件下）でハイブリダイズする連続した少なくとも１６塩基の核酸分子からなるセンスプライマーを含むプライマーセット、ｂ）ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリヌクレオチドｖ１のゲノムの融合点を含む配列の一つである配列番号４の塩基配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下（好ましくは、よりストリンジェントな条件下）でハイブリダイズする連続した少なくとも１６塩基の核酸分子からなるアンチセンスプライマー及び該ポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件下（好ましくは、よりストリンジェントな条件下）でハイブリダイズする連続した少なくとも１６塩基の核酸分子からなるセンスプライマーを含むプライマーセット、及び／又はｃ）ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリヌクレオチドｖ２のゲノムの融合点を含む配列の一つである配列番号５の塩基配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下（好ましくは、よりストリンジェントな条件下）でハイブリダイズする連続した少なくとも１６塩基の核酸分子からなるアンチセンスプライマー及び該ポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件下（好ましくは、よりストリンジェントな条件下）でハイブリダイズする連続した少なくとも１６塩基の核酸分子からなるセンスプライマーを含むプライマーセット、

（２）配列番号１の塩基番号１から１７５９（好ましくは塩基番号２７１から１７５９）の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号１の塩基番号１７６０から３９２６（好ましくは塩基番号１７６０から３４４７）の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセットであって、配列番号１におけるセンスプライマーとアンチセンスセンスプライマーの選択位置の間隔が１ｋｂ以下である又はセンスプライマーとアンチセンスセンスプライマーにより増幅される増幅産物の大きさが１ｋｂ以下である前記プライマーセット又はその相補鎖からなるプライマーセット、

（３）配列番号６の塩基番号１から２２４２の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号６の塩基番号２２４３から３９３３の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセットであって、配列番号６におけるセンスプライマーとアンチセンスセンスプライマーの選択位置の間隔が１ｋｂ以下である又はセンスプライマーとアンチセンスセンスプライマーにより増幅される増幅産物の大きさが１ｋｂ以下である前記プライマーセット又はその相補鎖からなるプライマーセット、

（４）配列番号４の塩基番号１から3629間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号４の塩基番号3630から3979間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセットであって、配列番号４におけるセンスプライマーとアンチセンスセンスプライマーの選択位置の間隔が１ｋｂ以下である又はセンスプライマーとアンチセンスセンスプライマーにより増幅される増幅産物の大きさが１ｋｂ以下である前記プライマーセット又はその相補鎖からなるプライマーセット、

（５）配列番号５の塩基番号１から５７９の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号５の塩基番号５８０から８５３の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット又はその相補鎖からなるプライマーセット、

（６）配列番号129の塩基番号１から700間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号129の塩基番号701から1691間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセットであって、配列番号129におけるセンスプライマーとアンチセンスセンスプライマーの選択位置の間隔が１ｋｂ以下である又はセンスプライマーとアンチセンスセンスプライマーにより増幅される増幅産物の大きさが１ｋｂ以下である前記プライマーセット又はその相補鎖からなるプライマーセットが含まれるが、好ましいプライマーセットとしては、
（７）(i)配列番号8と配列番号9,(ii)配列番号15と配列番号16、配列番号17と配列番号18、配列番号19と配列番号20、配列番号21と配列番号22、配列番号23と配列番号24、配列番号25と配列番号26、配列番号27と配列番号28、配列番号29と配列番号30、配列番号31と配列番号32、又は、配列番号33と配列番号34、(iii)配列番号35と配列番号36、配列番号37と配列番号38、配列番号39と配列番号18、配列番号41と配列番号20、配列番号43と配列番号22、配列番号45と配列番号24、配列番号47と配列番号26、配列番号49と配列番号28、配列番号51と配列番号52、配列番号53と配列番号54、又は、配列番号55と配列番号34、(iv)配列番号61と配列番号62、配列番号63と配列番号64、配列番号65と配列番号66、配列番号67と配列番号68、配列番号69と配列番号70、配列番号71と配列番号72、配列番号73と配列番号74、配列番号75と配列番号76、配列番号77と配列番号78、又は、配列番号79と配列番号80、 (v)配列番号81と配列番号62、配列番号83と配列番号84、配列番号85と配列番号68、配列番号87と配列番号88、配列番号89と配列番号70、配列番号91と配列番号92、配列番号93と配列番号74、配列番号95と配列番号96、配列番号97と配列番号98、又は配列番号99と配列番号100、あるいは、(vi)配列番号131と配列番号82、配列番号132と配列番号62、配列番号133と配列番号64、配列番号134と配列番号66、配列番号135と配列番号68、配列番号136と配列番号70、配列番号137と配列番号72、配列番号138と配列番号74、配列番号139と配列番号76、配列番号140と配列番号78、又は配列番号141と配列番号80で表されるセンスプライマーとアンチセンスプライマーである上記（１）乃至（６）記載のプライマーセット又はその相補鎖からなるプライマーセット
が挙げられる。上記（７）（ｉ）は実施例３（１）、上記（７）（ｉｉ）は実施例３（２）、上記（７）（ｉｉｉ）は実施例３（３）、上記（７）（ｉｖ）及び（ｖ）は実施例４（２）、上記（７）（ｖｉ）は実施例11（1）、（３）において、本発明のポリヌクレオチドの存在を検出するために使用したプライマーセットである。

本明細書における融合点とは、EML4遺伝子由来の部分とALK遺伝子由来の部分とが融合した点を意味する。配列番号1における融合点は、第1-1759番の塩基配列を有するポリヌクレオチドと第1760-3926番の塩基配列を有するポリヌクレオチドが融合した点である。配列番号6における融合点は、第1-2242番の塩基配列を有するポリヌクレオチドと第2243-3933番の塩基配列を有するポリヌクレオチドが融合した点である。配列番号4における融合点は、第1-3629番の塩基配列を有するポリヌクレオチドと第3630-3979番の塩基配列を有するポリヌクレオチドが融合した点である。配列番号5における融合点は、第1-579番の塩基配列を有するポリヌクレオチドと第580-853番の塩基配列を有するポリヌクレオチドが融合した点である。配列番号129における融合点は、第1-700番の塩基配列を有するポリヌクレオチドと第701-1691番の塩基配列を有するポリヌクレオチドが融合した点である。

本明細書における「ストリンジェントな条件」とは、ハイブリダイゼーションのための条件として、「５×ＳＳＰＥ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、２００μｇ／ｍｌ鮭精子ＤＮＡ、４２℃オーバーナイト」、洗浄のための条件として、「０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４２℃」の条件である。「よりストリンジェントな条件」とは、ハイブリダイゼーションのための条件として、「５×ＳＳＰＥ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、２００μｇ／ｍｌ鮭精子ＤＮＡ、４２℃オーバーナイト」、洗浄のための条件として、「０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃」の条件である。

本発明のプライマーは、本発明のポリヌクレオチドを増幅及び検出するためのプライマーとして利用することが可能である。プライマーとして用いる場合には、通常、１５〜４０塩基、好ましくは１６〜２４塩基、更に好ましくは１８〜２４塩基、特に好ましくは２０〜２４塩基の鎖長を有する。

本発明のプライマーの製造方法は、特に限定されるものではないが、上記本発明のポリヌクレオチドの製造方法における化学合成法によって製造することができる。

＜本発明の検出方法／検出用キット＞
本発明には、本発明ポリヌクレオチドの検出方法及び本発明のポリペプチドの検出方法が含まれる。具体的には、次の工程を含む態様が例示される。すなわち、本発明のポリヌクレオチドの検出方法においては、
（１）被験者から得た試料における、本発明のポリヌクレオチドの存在を検出する工程、である。

被験者から得た試料としては、被験者からの採取物（生体から分離した試料）、具体的には、任意の採取された体液（好ましくは血液）、肺胞・気管支洗浄液、生検された試料、喀痰試料を用いるが、好適には、被験者の肺患部の生検試料又は喀痰試料を用いる。試料からゲノムＤＮＡを抽出して用いることができ、またその転写産物（ゲノムが転写及び翻訳される結果生じる産物；例えばｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、蛋白質）を用いることができる。特にはｍＲＮＡ又はｃＤＮＡを調製して用いることが好ましい。

本発明のポリヌクレオチドの検出方法における「ポリヌクレオチドの存在を検出する工程」は、被験者から得た試料のゲノム中の配列番号４（融合点を含むゲノム配列）又は配列番号５（融合点を含むゲノム配列）で表されるポリヌクレオチドの存在を検出すること、あるいは、被験者から得た試料から抽出したゲノムＤＮＡの転写産物（例えばｍＲＮＡ又はｃＤＮＡ）を調製し、本発明のポリヌクレオチドｖ１型（好ましくはＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリヌクレオチドｖ１）、本発明のポリヌクレオチドｖ２型（好ましくはＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリヌクレオチドｖ２）又は本発明のポリヌクレオチドｖ3型（好ましくはＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリヌクレオチドｖ3）に対応するｍＲＮＡ又はｃＤＮＡの存在を検出することにより実施する。

ゲノムＤＮＡの抽出は公知の方法で行なうことができ、市販のＤＮＡ抽出キットを用いて簡便に行なうことができる。

工程（１）における検出工程は公知の遺伝子解析法（例えば遺伝子検出法として常用されるPCR,LCR(Ligase chain reaction),SDA(Strand displacement amplification)、NASBA(Nucleic acid sequence-based amplification)、ICAN(Isothermal and chimeric primer-initiated amplification of nucleic acids)、LAMP(Loop-mediated isothermal amplification)法、TMA法(Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ’ｓ ＴＭＡ ｓｙｓｔｅｍ)、更にマイクロアレーなど周知の方法）に従って実施することができる。例えば、本発明のポリヌクレオチドにハイブリダイズする核酸をプローブとしたハイブリダイゼーション技術、又は、本発明のポリヌクレオチドにハイブリダイズするＤＮＡをプライマーとした遺伝子増幅技術等を利用する。具体的には、被験者から得た試料由来の核酸、例えばｍＲＮＡ等を用いて測定する。ｍＲＮＡ量の測定は、本発明のポリヌクレオチド配列を特異的に増幅できるように設計したプライマーを用いて遺伝子増幅反応方法にて測定する。本発明の検出方法に用いられるプライマー、又は、検出用キットに含まれるプライマーは、本発明のポリヌクレオチド配列を特異的に増幅できるものであれば、特には限定されず、本発明のポリヌクレオチドの塩基配列に基づいて設計する。ＰＣＲ増幅モニター法におけるプライマー設計は、プライマー設計ソフトウェアＰｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ （ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）などを利用してできる。また、ＰＣＲ産物のサイズが大きくなると増幅効率が悪くなるため、センスプライマーとアンチセンスプライマーは、ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡを対象に増幅したときの増幅産物の大きさが１ｋｂ以下になるように設定するのが適切である。より具体的には、センスプライマー（５’−プライマー）をＥＭＬ４をコードする部分（例えば、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリヌクレオチド(特にはｃＤＮＡ)のＥＭＬ４遺伝子領域内の任意の部分）から、アンチセンスプライマー（３’−プライマー）をＡＬＫをコードする部分（例えば、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリヌクレオチド（特にはｃＤＮＡ）中のＡＬＫ遺伝子領域内の任意の部分）から設計する。好ましくは、本発明の検出用キットに含まれるプライマーを用い、更に好ましくは、検出用キットに最も好適に含まれるプライマーを用いる。各増幅技術に適した方法によって目的とした遺伝子（全体又はその特異的部分）が増幅されたか否かを確認することができる。例えば、ＰＣＲ法では、ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動によって分析し、エチジウムブロマイド染色等によって目的とするサイズの増幅断片が得られたか否かを確認できる。目的とするサイズの増幅断片が得られた場合は、被験者から得た試料において、本発明のポリヌクレオチドが存在していたことになる。このように、本発明のポリヌクレオチドの存在を検出することができる。

ハイブリダイゼーション技術を利用した検出は、例えば、ノーザンハイブリダイゼーション、ドットブロット法、ＤＮＡマイクロアレイ法などを使用して行う。ハイブリダイゼーションに用いるプローブとしては、本発明のポリヌクレオチド又はそれらの相補鎖にストリンジェントな条件下で（好ましくはよりストリンジェントな条件下で）ハイブリダイズする連続した少なくとも３２塩基の核酸分子であって、配列番号１で表される塩基配列の第１７４４番〜第１７７５番、配列番号６で表される塩基配列の第２２２７番〜第２２５８番、配列番号１２９で表される塩基配列の第６８５番〜第７１６番、配列番号４で表される塩基配列の第３６１４番〜第３６４５番、配列番号５で表される塩基配列の第５６４番〜第５９５番；又はそれらの相補鎖を含むプローブを用いることができる。

さらには、ＲＴ−ＰＣＲ等の遺伝子増幅技術を利用することができる。ＲＴ−ＰＣＲ法においては、遺伝子の増幅過程においてＰＣＲ増幅モニター（リアルタイムＰＣＲ）法（Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．，６（１０），９８６，１９９６）を用いることにより、本発明のポリヌクレオチドの存在について、より定量的な解析を行うことが可能である。ＰＣＲ増幅モニター法としては、例えば、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ７９００（ＰＥバイオシステムズ社）を用いることが出来る。リアルタイムＰＣＲは公知の方法であり、そのための装置およびキットは市販されており、これらを利用して簡便に行える。

本発明のポリヌクレオチドによってコードされる融合蛋白質の検出方法においては、
（２）被験者から得た試料における、本発明のポリペプチドの存在を検出する工程、を実施する。

このような検出する工程は、被験者から得た試料（例えば、被験者から得た癌組織や細胞）由来の可溶化液を調製し、その中に含まれる本発明のポリペプチド（特には、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドｖ１）を、抗ＥＭＬ４抗体と抗ＡＬＫ抗体を組み合わせることによる免疫学的測定法又は酵素活性測定法等により実施できる。好適には、本発明のポリペプチド（特には、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドｖ１）に特異的なモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体を用いた、酵素免疫測定法、２抗体サンドイッチＥＬＩＳＡ法、蛍光免疫測定法、放射免疫測定法、ウェスタンブロッティング法等の手法を用いることができる。

より好ましくは、実施例９で示したように、本発明のポリペプチドが存在している可能性のある細胞の細胞抽出液に対し、抗ＥＭＬ４抗体で免疫沈降を行い、その沈降物に対して抗ＡＬＫ抗体で検出することで本発明のポリペプチドの存在を検出することができる。実施例９の方法において、抗ＡＬＫ抗体で免疫沈降し、抗ＥＭＬ４抗体で検出するのでも良い。上記の通り、免疫沈降と検出をした後、更には、検出抗体により、検出した蛋白質が目的の本発明のポリペプチドの大きさであることを確認することが好ましい。この検出に用いる抗体は、ＥＭＬ４に関してはエクソン１からエクソン２０まで（好ましくは、エクソン１からエクソン１３まで、更に好ましくはエクソン１からエクソン６まで）、ＡＬＫに関してはエクソン２１からエクソン３０までの範囲のポリペプチドに特異的に結合できる抗体であればどれでもよく、モノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよい。

本発明のポリヌクレオチド又は本発明のポリペプチドが、被験者から得た試料から検出された場合は、当該被験者は、本発明のポリヌクレオチド陽性の癌を有する対象（患者）であり、本発明の医薬組成物の適用対象となる。

本発明の検出用キットには、少なくとも、本発明のポリヌクレオチドを特異的に増幅できるように設計したセンス及びアンチセンスプライマーが含まれる。センス及びアンチセンスプライマーセットは、本発明のポリヌクレオチド増幅用のプライマーとして機能するポリヌクレオチドのセットである。その例として、上記＜本発明のプライマーセット＞の（１）〜（７）に記載のプライマーセットが挙げられる。（２）〜（７）に記載のプライマーセットが好ましく、より好ましいプライマーセットは（７）のプライマーセットである。

本発明の検出用キットに含めることができる他の試薬としては、ＰＣＲを行うのに必要な試薬（例えば、Ｔａｑポリメラーゼ、ヌクレオチド基質、緩衝液など）などを挙げることができる。

＜本発明のスクリーニングする方法＞
本発明のスクリーニングする方法には、［１］本発明のポリペプチドを抑制する物質をスクリーニングする方法と、［２］本発明のポリヌクレオチド陽性の癌（好ましくは肺癌）治療剤をスクリーニングする方法とが含まれる。
［１］本発明のポリペプチドを抑制（本発明のポリペプチドの活性及び／又は発現を抑制）する物質をスクリーニングする方法
本発明のポリペプチドを抑制する物質のスクリーニング方法は、下記工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）を含む限り、特に限定されるものではない：
（ｉ）本発明のポリペプチド又は本発明のポリペプチドを発現している細胞に試験物質を接触させる工程、
（ｉｉ）前記ポリペプチドが抑制されるか否かを分析する工程、及び
（ｉｉｉ）前記ポリペプチドを抑制する物質を選択する工程。

好ましくは実施例７（３）〜（４）、実施例８（５）、実施例８（６）、実施例１０（３）、又は実施例１１（４）、（５）、（８）に記載の方法により本発明のポリペプチドを抑制する物質をスクリーニングすることができる。

本スクリーニング方法には、以下の方法が含まれる。
（ａ）インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）型スクリーニング方法；
（１）本発明のポリペプチドに試験物質を接触させる工程、（２）前記ポリペプチドの活性が抑制されるか否かを分析する工程、及び（３）前記ポリペプチドの活性を抑制する物質を選択する工程を含むことを特徴とする前記ポリペプチドの活性を抑制する物質をスクリーニングする方法。

（ｂ）細胞型スクリーニング方法；
（１）本発明のポリペプチドを発現している細胞に試験物質を接触させる工程、（２）前記ポリペプチドの活性が抑制されるか否かを分析する工程、及び（３）前記ポリペプチドの活性を抑制する物質を選択する工程を含むことを特徴とする前記ポリペプチドの活性を抑制する物質をスクリーニングする方法。

（ｃ）発現抑制型スクリーニング方法；
（１）本発明のポリペプチドを発現している細胞に試験物質を接触させる工程、（２）前記ポリペプチドの発現が抑制されるか否かを分析する工程、及び（３）前記ポリペプチドの発現を抑制する物質を選択する工程を含むことを特徴とする前記ポリペプチドの発現を抑制する物質をスクリーニングする方法。

各スクリーニング方法について以下に説明する。本発明のポリペプチドを発現している細胞には、本発明のポリペプチドを天然に発現している細胞（例えば、NCI-H2228）と本発明のポリヌクレオチドを含むベクターで細胞を形質転換することにより、本発明のポリペプチドを発現させた細胞とが含まれるが、本発明のポリペプチドを発現している細胞としては、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターで細胞を形質転換することにより、本発明のポリペプチドを発現させた細胞が好ましい。

（ａ）インビトロ型スクリーニング方法
インビトロ型スクリーニング方法には、精製した本発明のポリペプチドに試験物質を添加して接触させ（接触させる工程）、該試験物質により本発明のポリペプチドの活性が抑制されたか否かを、試験物質を接触させなかった場合の本発明のポリペプチドの活性に比較して分析し（分析する工程）、本発明のポリペプチドの活性を抑制する物質（即ち癌治療剤、特には肺癌治療剤）を選択する方法が含まれる。

本発明のスクリーニング方法において、各工程は、具体的には、例えば、以下のように実施できる。精製した本発明のポリぺプチドに試験物質を添加し接触させた後、ＡＴＰを添加し、該ポリペプチドの活性を測定する。コントロールとして、前記精製したポリぺプチドと試験物質の溶媒（例えばＤＭＳＯ）とを混合し接触させた後、ＡＴＰを添加し該ポリペプチドの活性を測定する。バックグラウンドコントロールとして、ＡＴＰを添加しない条件を設定することができる。試験物質により本発明のポリペプチドの活性が抑制されたか否かを分析する。試験物質により本発明のポリペプチドの活性（即ち自己リン酸化活性）が抑制されたか否かは、試験物質による本発明のポリペプチドのチロシンリン酸化レベルの変化を分析することにより判定できる。即ち、溶媒コントロール添加（即ち接触）時に比較し、試験物質添加（即ち接触）時に本発明のポリペプチドの活性（即ち自己リン酸化活性）が抑制されていた場合、その試験物質を、本発明のポリペプチドの活性を抑制する物質（即ち癌治療剤、特には肺癌治療剤）として選択する。上記工程において、ATPを添加する前にペプチド基質を添加して混合すること、及び、本発明のポリペプチドの活性を本発明のポリペプチドのペプチド基質に対するリン酸化活性として分析する（すなわち、試験物質により本発明のポリペプチドの活性が抑制されたか否かを、本発明のポリペプチドによるペプチド基質のリン酸化レベルの試験物質による変化を分析する）以外は上記と同様にして行うスクリーニング方法も本発明のインビトロ型スクリーニング方法に含まれる。本発明のスクリーニングする方法の内、インビトロ型スクリーニング方法としては、実施例７（３）又は実施例１１（４）に記載の条件で実施することが好ましい。上記記載の方法で、５０％以上活性を抑制する濃度が１０μＭ以下、好ましくは１μＭ以下、更に好ましくは０．１μＭ以下のものを本発明のポリペプチドの活性を抑制する物質として選択する。

（ｂ）細胞型スクリーニング方法
細胞型スクリーニング方法には、本発明のポリペプチドを発現している細胞と試験物質を混合（即ち添加）して接触させ（接触させる工程）、該試験物質により本発明のポリペプチドの活性が抑制されたか否かを、試験物質を接触させなかった場合の本発明のポリペプチドの活性に比較して分析し（分析する工程）、本発明のポリペプチドの活性を抑制する物質（即ち癌治療剤、特には肺癌治療剤）を選択する方法が含まれる。具体的には、例えば以下のように実施できる。

まず、本発明のポリペプチドを発現している細胞と試験物質又は溶媒コントロール（例えばＤＭＳＯ）とをそれぞれ接触させる。一定時間細胞を培養した後、培養した細胞を溶解して調製した細胞溶解液を用いて、公知のＳＤＳ電気泳動法及び抗リン酸化ＡＬＫ抗体（例えばＣｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）を用いたイムノブロッティングにより本発明のポリペプチドの活性（即ち自己リン酸化活性）を測定することによって、試験物質により本発明のポリペプチドの活性（即ち自己リン酸化活性）が抑制されたか否かを分析する。試験物質により本発明のポリペプチドの活性が抑制されたか否かは、試験物質による本発明のポリペプチドのチロシンリン酸化レベルの変化を分析することにより判定できる。即ち、溶媒コントロール添加（即ち接触）時に比較し、試験物質添加（即ち接触）時に本発明のポリペプチドの活性が抑制されていた場合、その試験物質を、本発明のポリペプチドの活性を抑制する物質（即ち癌治療剤、特には肺癌治療剤）として選択する。本発明のスクリーニングする方法の内、細胞型スクリーニング方法としては、実施例７（４）、実施例１０（３）、実施例１１（５）又は実施例１１（８）に記載の条件で実施することが好ましい。上記記載の方法で、５０％以上活性を抑制する濃度が１０μＭ以下、好ましくは１μＭ以下、更に好ましくは０．１μＭ以下のものを選択する。

（ｃ）発現抑制型スクリーニング方法
発現抑制型スクリーニング方法には、本発明のポリペプチドを発現している細胞と試験物質を混合（即ち添加）して接触させ（接触させる工程）、該試験物質により本発明のポリペプチドの発現が抑制されたか否かを、試験物質を接触させなかった場合の本発明のポリペプチドの発現に比較して分析し（分析する工程）、本発明のポリペプチドの発現を抑制する物質（即ち本発明のポリヌクレオチド陽性の癌治療剤、特には肺癌治療剤）を選択する方法が含まれる。具体的には、例えば以下のように実施できる。

本発明のポリペプチドを発現している任意の細胞と試験物質又は溶媒コントロール（例えばＤＭＳＯ）とをそれぞれ接触させる。培養後、細胞の抽出物を調製し、次いで、抽出物を用いて、試験物質が本発明のポリペプチドの発現を抑制したか否かを分析する。本発明のポリペプチドの発現を抑制したか否かは、本発明のポリペプチドのｍＲＮＡ又は蛋白質の発現を抑制するか否かにより分析することができる。より具体的には、前記細胞抽出液に存在する本発明のポリペプチドのｍＲＮＡ又は蛋白質の量を公知の発現量分析方法、例えば、ノーザンブロット法や定量的ＰＣＲ法又はイムノブロット法やＥＬＩＳＡ法等で同定する。より具体的には、実施例８（５）や（６）に記載した方法で、本発明のポリペプチドのｍＲＮＡやポリペプチドの発現抑制を分析することができる。試験物質により本発明のポリペプチドの発現が抑制されたか否かは、試験物質による本発明のポリペプチドの発現量の変化を分析することにより判定できる。即ち、溶媒コントロール接触時に比較し、試験物質接触時に本発明のポリペプチドの発現量（ｍＲＮＡ又は蛋白質量）が抑制されていた場合、その試験物質を、本発明のポリペプチドの発現を抑制する物質（即ち癌治療剤、特には肺癌治療剤）として選択する。本発明のスクリーニングする方法の内、発現抑制型スクリーニング方法としては、実施例８（５）（６）に記載の条件で実施することが好ましい。上記記載の方法で、５０％以上活性を抑制する濃度が１０μＭ以下、好ましくは１μＭ以下、更に好ましくは０．１μＭ以下のものを選択する。何れの細胞を用いた場合でも上記抑制活性を有する被検物質を選択することが好ましいが、一つの細胞において上記抑制活性を有する被検物質も選択することができる。

［２］本発明のポリヌクレオチド陽性の癌治療剤をスクリーニングする方法
ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリヌクレオチドは癌の原因遺伝子であることが示され（実施例6、実施例11(2)）、一部の肺癌患者にＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリヌクレオチドの存在が検出された。更に、本発明のポリペプチドの活性及び／又は発現を抑制することにより足場非依存性の細胞増殖が抑制される（即ち抗癌作用が示される）という本発明者らが見出した新規な知見（実施例８、実施例11）から、本発明のポリペプチドを抑制（本発明のポリペプチドの活性及び／又は発現を抑制）する物質は、癌治療効果を有することがわかった。即ち、本発明のポリペプチドを抑制（本発明のポリペプチドの活性及び／又は発現を抑制）する物質をスクリーニングする方法は、本発明のポリヌクレオチド陽性の癌（好ましくは肺癌）治療剤をスクリーニングする方法として利用できる。即ち、本発明のポリヌクレオチド陽性の癌治療剤をスクリーニングする方法は、上記［１］本発明のポリペプチドを抑制する物質をスクリーニングする方法のi)、ｉｉ）及びｉｉｉ）を含む。

本発明のポリヌクレオチド陽性の癌治療剤をスクリーニングする方法では、本発明のポリペプチドを抑制するか否かを分析し、本発明のポリペプチドを抑制する物質を選択した後、選択された試験物質が、本発明のポリヌクレオチド陽性の癌（特には肺癌）治療活性を有することを確認する工程を更に含むことが好ましい。

選択された試験物質が、本発明のポリヌクレオチド陽性の癌治療活性を有することを確認する工程；
選択された物質が本発明のポリヌクレオチド陽性の癌（特には肺癌）治療活性を有することを確認する工程としては、公知の評価方法又はそれを改良した方法、例えば、選択された物質の癌（特には肺癌）治療活性を本発明のポリペプチドを発現した培養細胞や腫瘍モデル動物に処置し分析する方法を実施する工程が挙げられる（臨床腫瘍学 セカンドエディション、癌と化学療法社）。

選択された物質が本発明のポリヌクレオチド陽性の癌（特には肺癌）治療活性を有することを確認する工程として好ましいのは、ヒト癌（特には肺癌）由来の内在的に本発明のポリペプチドを発現する癌細胞（例えばNCI-H2228）を用いて、（１）選択された試験物質が前記細胞の増殖抑制作用及び／若しくは細胞死誘導作用を有することを確認する工程、（２）選択された試験物質が本発明のポリペプチドを発現させた形質転換細胞の足場非依存的増殖に対する抑制作用を有することを確認する工程、並びに／又は、（３）選択された試験物質が本発明のポリヌクレオチドを発現する細胞をヌードマウスに接種し形成した腫瘍増殖に対する抑制作用を有することを確認する工程である。

上記ヌードマウスを用いた方法では、本発明のポリペプチドを内在性に発現する癌細胞（例えばNCI-H2228）や、本発明のポリペプチドの発現により形質転換させた細胞を皮下、皮内、腹腔や各臓器に移植した腫瘍モデル動物である担癌モデル動物（例えば本発明のポリペプチドを発現させたＮＩＨ３Ｔ３細胞を移植したヌードマウスなど）を用いることができる。

好ましくは実施例８（７）〜（９）、実施例１１（６）、又は実施例１１（９）に記載の方法により本発明のポリヌクレオチド陽性の癌治療剤をスクリーニングすることができる。

本発明のスクリーニング法で使用する試験物質としては、特に限定されるものではないが、例えば、市販の化合物（ペプチドを含む）、ケミカルファイルに登録されている種々の公知化合物（ペプチドを含む）、コンビナトリアル・ケミストリー技術（Ｎ．Ｔｅｒｒｅｔｔ ｅｔ ａｌ．， Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ． Ｔｏｄａｙ， ４（１）：４１，１９９９）によって得られた化合物群、微生物の培養上清、植物や海洋生物由来の天然成分、動物組織抽出物、二重鎖核酸、抗体又は抗体断片、あるいは、本発明のスクリーニング法により選択された化合物（ペプチドを含む）を化学的又は生物学的に修飾した化合物（ペプチドを含む）を挙げることができる。

＜本発明のポリヌクレオチド陽性の癌治療用医薬組成物及び二重鎖核酸＞
本発明には、本発明のポリペプチドを抑制する物質（例えば、本発明のスクリーニングする方法によって得られた物質［例えば、二重鎖核酸（ｓｉＲＮＡを含む）、蛋白質（抗体又は抗体断片を含む）、ペプチド、又はそれ以外の化合物］）を有効成分とする本発明のポリヌクレオチド陽性の癌治療用医薬組成物が包含される。

本発明の医薬組成物における有効成分は、本発明のスクリーニングする方法により選択することができる。本発明のスクリーニングする方法で選択された物質としては、例えば後述の実施例７及び実施例８記載の化合物Ａ〜Ｄ及び二重鎖核酸を挙げることができる。また、公知のＡＬＫ阻害活性を有する低分子化合物（ＡＬＫ阻害剤）から本発明のスクリーニング方法によって選択した化合物を本発明の医薬組成物における有効成分として用いることができる。ＡＬＫ阻害剤としては、ＷＯ２００５／０９７７６５、又はＷＯ２００５／０１６８９４に記載のＡＬＫ阻害剤を例示することができる。特に、Ｗａｎ Ｗ ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ １０７： １６１７−１６２３， ２００６．に記載の化合物、ＷＨＩ−Ｐ１３１(４−（４’−ヒドロキシフェニル）アミノ−６，７−ジメトキシキナゾリン)およびＷＨＩ−Ｐ１５４(４−［（３’−ブロモ−４’−ヒドロキシフェニル）アミノ］−６，７−ジメトキシキナゾリン；以下、化合物A)（共にＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社；Ｍａｒｚｅｃ Ｍ ｅｔ ａｌ．， Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ ８５： １５４４−１５５４， ２００５．）を用いることができる。また、Ｎ−［２−（３−クロロフェニル）エチル］−２−［（｛［４−（トリフルオロメトキシ）フェノキシ］アセチル｝アミノ）メチル］−１，３−チアゾール−４−カルボキサミド（ＷＯ２００５／０９７７６５、以下、化合物Ｂ）、５−クロロ−Ｎ^４−［２−（イソプロピルスルホニル）フェニル］−Ｎ^２−｛２−メトキシ−４−［４−（４−メチルピペラジン−１−イル）ピペリジン−１−イル］フェニル｝ピリミジン−２，４−ジアミン（ＷＯ２００５／０１６８９４、以下、化合物Ｃ）、２−［（５−ブロモ−２−｛［２−メトキシ−４−（４−メチルピペラジン−１−イル）フェニル］アミノ｝ピリミジン−４−イル）アミノ］−Ｎ−メチルベンゼンスルホンアミド（ＷＯ２００５／０１６８９４、以下、化合物Ｄ）をＡＬＫ阻害剤として用いることができる。

本発明の医薬組成物の有効成分として例示される二重鎖核酸は、二重鎖の核酸（ＲＮＡ又はＤＮＡ）部分と、好ましくはセンス鎖及びアンチセンス鎖の３’末端のオーバーハングとからなり、ＲＮＡｉを誘導する。ＲＮＡｉは進化的に保存された現象で、ＲＮａｓｅＩＩＩエンドヌクレアーゼによって生じる２１〜２３塩基の二重鎖核酸を介して起こる（Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． １５， ４８５−４９０， ２００１）。３’側のオーバーハングはそれぞれ１又は２塩基の任意の核酸であるが、２塩基が好ましい。なお、前記塩基数（２１〜２３塩基）は、オーバーハングを含むセンス鎖又はアンチセンス鎖の各々の塩基数である。また、センス鎖及びアンチセンス鎖は、同じ塩基数であることもできるし、異なる塩基数であることもできるが、同じ塩基数であることが好ましい。

二重鎖核酸の３’側オーバーハングを構成するリボ核酸としては、例えば、Ｕ（ウリジン）、Ａ（アデノシン）、Ｇ（グアノシン）、又はＣ（シチジン）を用いることができ、３’側のオーバーハングを構成するデオキシリボ核酸としては、例えば、ｄＴ（デオキシチミジン）、ｄＡ（デオキシアデノシン）、ｄＧ（デオキシグアノシン）、又はｄＣ（デオキシシチジン）を用いることができる。

本発明の医薬組成物の有効成分として用いることのできる二重鎖核酸は、二重鎖部分が配列番号１の第１７４３番から第１７６１番、第１７４４番から第１７６２番、第１７５０番から第１７６８番、第１７５３番から第１７７１番、第１７５６番から第１７７４番又は第１７５７番から第１７７５番に記載の塩基に基づいて設計される、本発明のポリペプチドの発現抑制活性を有する二重鎖核酸（以下、本発明の二重鎖核酸と称する）であり、そのような二重鎖核酸の好ましい態様としては、実施例８に記載のｓｉＲＮＡ−１〜ｓｉＲＮＡ−６（即ち、二重鎖の一方の鎖が配列番号１１１、もう一方の鎖が配列番号１１２で表される塩基配列からなる二重鎖核酸、二重鎖の一方の鎖が配列番号１１３、もう一方の鎖が配列番号１１４で表される塩基配列からなる二重鎖核酸、二重鎖の一方の鎖が配列番号１１５、もう一方の鎖が配列番号１１６で表される塩基配列からなる二重鎖核酸、二重鎖の一方の鎖が配列番号１１７、もう一方の鎖が配列番号１１８で表される塩基配列からなる二重鎖核酸、二重鎖の一方の鎖が配列番号１１９、もう一方の鎖が配列番号１２０で表される塩基配列からなる二重鎖核酸、二重鎖の一方の鎖が配列番号１２１、もう一方の鎖が配列番号１２２で表される塩基配列からなる二重鎖核酸）が挙げられる。本発明の二重鎖核酸は、常法（例えば、Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， １２０， １１８２０−１１８２１， １９９８； 及びＭｅｔｈｏｄｓ， ２３， ２０６−２１７， ２００１）により製造することができる。また、二重鎖核酸を委託製造する会社（例えば、ＲＮＡｉ社）は、当業者によく知られており、二重鎖核酸の製造に利用できる。上記ｓｉＲＮＡ−１〜ｓｉＲＮＡ−６はsiRNA配列設計システム（商用siDirect（登録商標）、RNAi社）により、そのターゲット配列が本発明のポリペプチドに特異的であることが確認された。

ｓｉＲＮＡ−1〜ｓｉＲＮＡ−６がターゲットとするＤＮＡ塩基配列（配列番号１の第１７４３番から第１７６１番、第１７４４番から第１７６２番、第１７５０番から第１７６８番、第１７５３番から第１７７１番、第１７５６番から第１７７４番又は第１７５７番から第１７７５番に記載の塩基）に基づいて本発明の二重鎖核酸を設計することができ、このような二重鎖核酸は、上記ｓｉＲＮＡ−１〜ｓｉＲＮＡ−６と同様に本発明のポリペプチドを抑制する。例えば、二重鎖部分が、上記ターゲットＤＮＡ塩基配列をそのまま全てＲＮＡ配列に変換したＲＮＡ塩基配列からなる、ｓｉＲＮＡを設計することができ、また任意の一部をＲＮＡに変換したＤＮＡとＲＮＡのキメラ型二重鎖核酸（同一鎖にＲＮＡとＤＮＡが含まれる）を設計することもできる。更に、一方の鎖がＤＮＡでありもう一方の鎖がＲＮＡであるハイブリッド型二重鎖核酸を設計、製造し用いることができる。なお、本明細書において、ＤＮＡ塩基配列をＲＮＡ塩基配列に変換するとは、ＤＮＡ塩基配列におけるｄＴをＵに変換し、それ以外の塩基、すなわち、ｄＡ、ｄＧ、及びｄＣを、それぞれ、Ａ、Ｇ、及びＣに変換することを意味する。

本発明の二重鎖核酸は、本発明のポリペプチドを発現している細胞の足場非依存性の増殖に対して抑制作用を示した（実施例８（７））ことから、本発明のポリヌクレオチド陽性の癌治療用医薬組成物の有効成分として用いることができる。

なお、本発明のポリヌクレオチド陽性の癌治療効果があることの確認は、当業者に公知の方法、あるいは、それを改良した方法を用いることにより実施することができる（上記「選択された試験物質が本発明のポリヌクレオチド陽性の癌治療活性を有することを確認する工程」参照）。

本発明のポリペプチドを抑制する物質（例えば、本発明のスクリーニング方法により得られた物質［例えば、二重鎖核酸、蛋白質（抗体又は抗体断片を含む）、ペプチド、又はそれ以外の化合物］）を有効成分とする製剤は、前記有効成分のタイプに応じて、それらの製剤化に通常用いられる薬理学上許容される担体、賦形剤、及び／又はその他の添加剤を用いて、医薬組成物として調製することができる。

投与としては、例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、又は経口用液剤などによる経口投与、あるいは、静注（点滴を含む）、筋注、若しくは皮下注などの注射剤、坐剤、経皮投与剤、又は経粘膜投与剤などによる非経口投与を挙げることができる。特に胃で消化されるペプチドにあっては、静注等の非経口投与が好ましい。

経口投与のための固体組成物においては、１又はそれ以上の活性物質と、少なくとも一つの不活性な希釈剤、例えば、乳糖、マンニトール、ブドウ糖、微結晶セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、デンプン、ポリビニルピロリドン、又はメタケイ酸アルミン酸マグネシウムなどと混合することができる。前記組成物は、常法に従って、不活性な希釈剤以外の添加剤、例えば、滑沢剤、崩壊剤、安定化剤、又は溶解若しくは溶解補助剤などを含有することができる。錠剤又は丸剤は、必要により糖衣又は胃溶性若しくは腸溶性物質などのフィルムで被覆することができる。

経口のための液体組成物は、例えば、乳濁剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤、又はエリキシル剤を含むことができ、一般的に用いられる不活性な希釈剤、例えば、精製水又はエタノールを含むことができる。前記組成物は、不活性な希釈剤以外の添加剤、例えば、湿潤剤、懸濁剤、甘味剤、芳香剤、又は防腐剤を含有することができる。

非経口のための注射剤としては、無菌の水性若しくは非水性の溶液剤、懸濁剤、又は乳濁剤を含むことができる。水溶性の溶液剤又は懸濁剤には、希釈剤として、例えば、注射用蒸留水又は生理用食塩水などを含むことができる。非水溶性の溶液剤又は懸濁剤の希釈剤としては、例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油（例えば、オリーブ油）、アルコール類（例えば、エタノール）、又はポリソルベート８０等を含むことができる。前記組成物は、更に湿潤剤、乳化剤、分散剤、安定化剤、溶解若しくは溶解補助剤、又は防腐剤などを含むことができる。前記組成物は、例えば、バクテリア保留フィルターを通す濾過、殺菌剤の配合、又は照射によって無菌化することができる。また、無菌の固体組成物を製造し、使用の際に、無菌水又はその他の無菌用注射用媒体に溶解し、使用することもできる。

投与量は、有効成分すなわち本発明のスクリーニングする方法により得られた物質の活性の強さ、症状、投与対象の年齢、又は性別等を考慮して、適宜決定することができる。好ましくは、腫瘍付近の血中濃度又は腫瘍内濃度が薬剤が本発明のポリペプチドの活性又は発現を５０％抑制する濃度の３〜３０倍、例えば、１０倍になるような量で、投与量は経路によって算出することができる。例えば、経口投与の場合、その投与量は、通常、成人（体重６０ｋｇとして）において、１日につき約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは０．１〜５０ｍｇである。非経口投与の場合、注射剤の形では、１日につき０．０１〜５０ｍｇ、好ましくは０．０１〜１０ｍｇである。

本発明の医薬組成物による治療対象は、本発明のポリヌクレオチド及び／又は本発明のポリペプチドの存在が検出された被験者（即ち、本発明のポリヌクレオチド陽性の癌患者）である。ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリヌクレオチドによって癌化した細胞が本発明のポリペプチドを抑制する物質により死滅することから、本発明のポリペプチドを抑制する物質が本発明のポリヌクレオチド陽性の癌（特には肺癌）の有効な治療剤になる。

以下、実施例によって本発明を詳述するが、本発明は該実施例によって限定されるものではない。なお、特に断りがない場合は、公知の方法に従って実施可能である。また、市販の試薬やキット等を用いる場合には市販品の指示書に従って実施可能である。

全長ＡＬＫ ｃＤＮＡはＳｔ． Ｊｕｄｅ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＨｏｓｐｉｔａｌのＳｔｅｖｅ Ｍｏｒｒｉｓ博士より供与していただいた。また本研究プロジェクトは自治医科大学遺伝子解析研究倫理審査委員会により認可された。

抗リン酸化ＡＬＫ抗体は、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社のものを、抗ＡＬＫ抗体は、ＮＥＯＭＡＲＫＥＲＳ社ものを用いた。

［実施例１］ ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリヌクレオチドｖ１の単離
（１）ｃＤＮＡライブラリーの構築
インフォームドコンセントが得られた６２才男性の肺腺癌切除検体より、ＲＮＡ精製キット（ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉカラム；Ｑｉａｇｅｎ社）によりＲＮＡを抽出し、逆転写酵素（ＰｏｗｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）とプライマー（配列番号４２のオリゴヌクレオチドおよびＣＤＳ ｐｒｉｍｅｒ ＩＩＡ）（全てＣｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いてｃＤＮＡを合成した。さらにプライマー（５’−ＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒ ＩＩＡ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）とポリメラーゼ（ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳＤＮＡポリメラーゼ；タカラバイオ）を用いたポリメラーゼ連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ （ＰＣＲ））（９８℃１０秒、６８℃６分を１７サイクル）により完全長ｃＤＮＡを選択的に増幅した後、ｃＤＮＡの両端にＢｓｔＸＩアダプター（インビトロジェン社）を結合させた。得られたｃＤＮＡをレトロウィルスプラスミドに結合させ、大腸菌ＤＨ１０Ｂ（インビトロジェン社）に導入することでレトロウィルスプラスミドライブラリーを構築した。その結果、計１５０万コロニー形成ユニットを超えるクローン数からなるプラスミドライブラリーを構築することに成功した。

（２）フォーカス形成アッセイ
上述のライブラリーのプラスミド２μｇをパッケージング用プラスミド各０．５μｇ（ｐＧＰ、ｐＥ−ｅｃｏ、共にタカラバイオ）と共にトランスフェクション試薬を用いてＢＯＳＣ２３パッケージング細胞に導入した。導入２日後の培養上清を、組み換えレトロウィルスライブラリー溶液として回収し、ポリブレン（ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ；Ｓｉｇｍａ社）を４μｇ／ｍｌの濃度で添加した後、マウス３Ｔ３細胞にＭＯＩ（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）０．１の濃度で添加した。２日後に３Ｔ３細胞の培養上清をＤＭＥＭ−Ｆ１２培地（インビトロジェン社）に５％牛血清（インビトロジェン社）および２ｍＭ Ｌ−グルタミンを添加したものに交換し、さらに２週間培養を続けることで１０種類以上の形質転換フォーカスを得た。それぞれの３Ｔ３細胞クローンを単離した後別々に培養を続け、各クローンのゲノムＤＮＡを抽出した。該ゲノムＤＮＡ１０ｎｇを鋳型として、５’−ＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒ ＩＩＡプライマー及びＤＮＡポリメラーゼ(PrimeStar HS DNAポリメラーゼ;タカラバイオ）を用いてＰＣＲ（９８℃１０秒、６８℃６分を３０サイクル）を行い、各３Ｔ３クローンに組み込まれたウィルスのｃＤＮＡを増幅回収し、ｐＴ７Ｂｌｕｅ−２ベクターにクローニングした。

得られたｃＤＮＡの一つは３９２６塩基対の長さを持ち、新規な１０５９残基の蛋白質（配列番号２）をコードする単一のオープンリーディングフレーム（配列番号１の第２７１−３４４７塩基）を有していた（配列番号１）。本明細書では、配列番号２で表されるポリペプチドをＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドｖ１と称し、配列番号２で表されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリヌクレオチドｖ１と称している。配列番号２のアミノ末端側の約半分（配列番号２の１−４９６アミノ酸残基）はＥＭＬ４（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ． ＮＭ＿０１９０６３）の１−４９６残基と完全に一致しており、一方カルボキシル末端側の約半分（配列番号２の４９７−１０５９残基）はＡＬＫ（ ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ． ＡＢ２０９４７７）のアミノ酸配列と完全に一致した。また配列番号１の塩基配列も３５−１７５９塩基が、既報のヒトＥＭＬ４ ｃＤＮＡの１−１７２５塩基と９９．９％一致しており、配列番号１の１７６０−３６７７塩基がヒトＡＬＫ ｃＤＮＡの３６１３−５５３０塩基と９９．９％一致していた。なおそれぞれの配列中僅かに既報塩基配列と異なる箇所があるが、いずれも蛋白質のアミノ酸置換には結びつかないため、遺伝子配列多型である可能性が示唆された。以上より配列番号１で表されるｃＤＮＡは、ＥＭＬ４ ｃＤＮＡの一部とＡＬＫ ｃＤＮＡの一部との融合ｃＤＮＡと考えられた。なお、配列番号１には、ＡＬＫのチロシンキナーゼドメインが含まれていた。

［実施例２］ ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリヌクレオチドｖ１の確認
ヒトにおいてＥＭＬ４とＡＬＫ遺伝子はどちらも２番染色体の短腕上にマップされ反対向き（ｈｅａｄ−ｔｏ−ｈｅａｄの方向）に位置している。配列番号１のポリヌクレオチドが作られるためには、ＥＭＬ４遺伝子エクソン１３の下流イントロンとＡＬＫ遺伝子のエクソン２１の上流イントロンにおいてゲノムがそれぞれ切断され、片方が逆位となって再結合する必要がある。このことを直接証明するために、配列番号４０（ＥＭＬ４遺伝子エクソン１３の３’末端のセンス側に設計）及び配列番号３６（ＡＬＫ遺伝子エクソン２１内のアンチセンス側に設計）で表される塩基配列のプライマーを用いて、患者ゲノムＤＮＡ（ＩＤ ３３）およびコントロールゲノムＤＮＡ（健常女性（４６，ＸＸ）末梢血単核球ゲノムＤＮＡ）を鋳型としてＤＮＡポリメラーゼ（ＬＡ Ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；タカラバイオ）を用いてＰＣＲ（９４℃１分の後、９８℃２０秒、６８℃９分を４０サイクル）を行った。

その結果、図１に示すように本患者ゲノムＤＮＡにおいてのみ約４ｋｂｐのＰＣＲ産物が得られた。すなわち予測通りゲノムレベルでＥＭＬ４遺伝子とＡＬＫ遺伝子のイントロンが一旦切断された後、逆位となって再結合していることが確認された。またこの約４ｋｂｐのＰＣＲ産物をｐＴ７Ｂｌｕｅ−２ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社）にクローニングし、全塩基配列を決定したところ、ＥＭＬ４遺伝子エクソン１３より下流約３．６ｋｂｐの箇所と、ＡＬＫ遺伝子エクソン２１より上流２９７ｂｐの箇所でそれぞれ切断が生じていることが明らかになった。塩基配列を配列番号４に示す。配列番号４はＥＭＬ４遺伝子とＡＬＫ遺伝子の融合点を含むゲノム配列である。

［実施例３］臨床検体でのＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリヌクレオチドのスクリーニング
（１）ｃＤＮＡを用いたＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリヌクレオチドの検出
本実施例１及び２に用いた症例（ＩＤ３３）を含む３３例の臨床検体（非小細胞肺癌切除標本）および健常者（４６，ＸＸ）１例の末梢血単核球よりｃＤＮＡを合成した。

ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリヌクレオチドｖ１のｃＤＮＡを検出する目的で、上記臨床検体及び健常者より作製したｃＤＮＡを基質として、配列番号８及び配列番号９で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーとして、定量的ＰＣＲキット（ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ；Ｑｉａｇｅｎ社）を用いたＰＣＲ（９４℃ １５秒、６０℃ ３０秒、７２℃ １分を５０サイクル）を行った。同じ検体を用い、コントロールとしてグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ；以下ＧＡＰＤＨ）遺伝子ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅を試みた。ＧＡＰＤＨ ｃＤＮＡの検出のためには、配列番号１０及び配列番号１１で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いた。サイズマーカーＤＮＡ（Ｍａｒｋｅｒ； ５０ｂｐ ｌａｄｄｅｒ， インビトロジェン社）とともに、増幅した各サンプルを電気泳動した。その結果、図２上段に示すように、ＩＤ３３を含む計３例の症例においてＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリヌクレオチドｖ１のｃＤＮＡ断片が検出された。なお。解析した全例においてＧＡＰＤＨ ｃＤＮＡの増幅が明瞭に確認された（図２下段）。なおＩＤ２０およびＩＤ３９の症例で同定されたＰＣＲ産物の塩基配列を解析した結果、ＩＤ３３のものと全く同じ配列（ＥＭＬ４遺伝子とＡＬＫ遺伝子の融合点を含む２４７ｂｐ；配列番号１４）である事が確認された。すなわち非小細胞肺癌症例３３例の解析の結果、９．１％の症例（３／３３例）においてＥＭＬ４遺伝子とＡＬＫ遺伝子との融合が生じていることが確認された。

肺癌の原因の一つとして、ＥＧＦＲ遺伝子の変異が知られている。上記解析した３３例の検体において、公知の方法に従いＥＧＦＲ遺伝子塩基配列異常の有無を解析したところ、６例においてエクソン１９の部分欠失が確認された。ＥＧＦＲ遺伝子変異を有する症例とＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリヌクレオチド陽性症例は異なったサブグループであった。即ち、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリヌクレオチド陽性の肺癌患者には、ＥＧＦＲ遺伝子変異による肺癌の治療剤である既存の治療剤は有効ではないと予想される。

また、全長ＡＬＫ遺伝子が存在しているか否かを上記解析した３３例の検体において調べたところ、８例において存在していることが分かった。この８例のうち７例はＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリヌクレオチドが存在していない検体であった。即ち、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリヌクレオチドが陽性であった３例中２例では全長ＡＬＫ遺伝子は存在していなかった。

さらに、上述と同様の方法で、別の非小細胞肺癌症例４２例の解析を行ったところ、４．８％の症例（２／４２例）でＩＤ３３、ＩＤ２０及びＩＤ３９の症例で検出されたＰＣＲ産物よりも大きい約１ｋｂｐのＰＣＲ産物が得られた。これをｐＴ７Ｂｌｕｅ−２ベクターにクローニングして塩基配列を解析した結果、ＥＭＬ４遺伝子のエキソン１３ではなく、ＥＭＬ４遺伝子のエキソン２０とＡＬＫ遺伝子のエキソン２１が融合したものであった（配列番号３）。つまり、融合しているＡＬＫ遺伝子断片は同じだが、ＥＭＬ４遺伝子の切断点が異なるものであった。配列番号３で見出されたＥＭＬ４遺伝子とＡＬＫ遺伝子の融合点を含む、ＥＭＬ４遺伝子エキソン１〜２０とＡＬＫ遺伝子のエキソン２１〜３０の融合遺伝子のｃＤＮＡ配列を配列番号６に、コードされるポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号７に示す。本明細書では、配列番号７で表されるポリペプチドをＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドｖ２と称し、配列番号７で表されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリヌクレオチドｖ２と称している。ここで作製したＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリヌクレオチドｖ２ｃＤＮＡ部分断片をクローニングしたプラスミドを、ＥＭＬ４−ＡＬＫｖ２ ｐａｒｔｉａｌ／ｐＴ７Ｂｌｕｅ−２と命名した。

（２）ゲノムＤＮＡを用いたＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリヌクレオチドｖ１の検出
実施例２のように、被験者の臨床検体（特には肺組織）から抽出したゲノムＤＮＡサンプルを用いて、ＰＣＲにより、被験者から得た試料中のＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリヌクレオチドの存在を検出できることが分かった。そこで、下記の通り、種々のプライマーを用いて、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリヌクレオチドｖ１の検出を試みた。上記で作製した約４ｋｂｐのＰＣＲ産物をクローニングしたｐＴ７Ｂｌｕｅ−２ベクターを鋳型として１ｎｇ用い、プライマーセット（配列番号１５と配列番号１６、配列番号１７と配列番号１８、配列番号１９と配列番号２０、配列番号２１と配列番号２２、配列番号２３と配列番号２４、配列番号２５と配列番号２６、配列番号２７と配列番号２８、配列番号２９と配列番号３０、配列番号３１と配列番号３２、及び、配列番号３３と配列番号３４）をそれぞれ用いて、ＤＮＡポリメラーゼ（ｒＴａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；タカラバイオ）によりＰＣＲ反応（９４℃１５秒、５５℃３０秒、７２℃１分を３０サイクル）を行った。その結果、それぞれ期待されるサイズ（約２７０から３８０ｂｐ）の単一のＤＮＡ断片が増幅された。以上から、臨床検体から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型としてＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリヌクレオチドｖ１の存在を特異的に検出すると考えられる種々のプライマーセットを用いてＰＣＲを行うことにより、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリヌクレオチドｖ１の存在を検出可能であることが明らかとなった。

（３）ゲノムＤＮＡを用いたＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリヌクレオチドｖ２の検出
ＥＭＬ４エクソン２０内に配列番号３５で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをセンスプライマーとして、ＡＬＫエクソン２１内のアンチセンス側に配列番号３６で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをアンチセンスプライマーとしてそれぞれ設計した。これらを用いて、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリヌクレオチドｖ２のｃＤＮＡが検出された患者（ＩＤ＃ＫＬ−３１２１）のゲノムＤＮＡを鋳型として、ＤＮＡポリメラーゼ（ＬＡ Ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；タカラバイオ）を用いてＰＣＲ （９４℃１分の後、９８℃２０秒、６８℃６分を４０サイクル）を行ったところ、約８５０ｂｐのＰＣＲ産物が得られた。そのＰＣＲ産物をｐＴ７Ｂｌｕｅ−２ベクターにクローニングして塩基配列を決定し、配列番号５で示す８５３ｂｐの配列を得た。その配列を解析したところ、ＥＭＬ４エクソン２０の３’末端の３５ｂｐと、ＥＭＬ４エクソン２０より下流のイントロン配列の５４４ｂｐがＡＬＫエクソン２１より上流のイントロン配列の２３３ｂｐと、ＡＬＫエクソン２１の５’末端の４１ｂｐと繋がったものであった。つまり、この患者のゲノム上で、ＥＭＬ４エクソン２０より下流５４４ｂｐの箇所と、ＡＬＫエクソン２１より上流２３３ｂｐの箇所でそれぞれゲノムの切断が生じていることが明らかになった。上記で作製した８５３ｂｐのＰＣＲ産物をクローニングしたｐＴ７Ｂｌｕｅ−２ベクターを鋳型として１ｎｇ用い、プライマーセット（配列番号３７と配列番号３８、配列番号３９と配列番号１８、配列番号４１と配列番号２０、配列番号４３と配列番号２２、配列番号４５と配列番号24、配列番号４７と配列番号２６、配列番号４９と配列番号２８、配列番号５１と配列番号５２、配列番号５３と配列番号５４、及び配列番号５５と配列番号３４）をそれぞれ用いて、実施例３（２）と同じ条件でＰＣＲ反応を行った。その結果、それぞれ期待されるサイズ（約２７０から３８０ｂｐ）の単一のＤＮＡ断片が増幅された。以上から、臨床検体から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型としてＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリヌクレオチドｖ２を特異的に検出すると考えられるプライマーセットを用いることによりＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリヌクレオチドｖ２の存在が検出可能であることが明らかとなった。

［実施例４］ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリヌクレオチドｍＲＮＡの検出法
（１）ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドｖ１発現ベクターの構築及びＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリヌクレオチドｖ２のクローニング
ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリヌクレオチドｖ１が正方向にクローニングされたクローン（これをＥＭＬ４−ＡＬＫｖ１／ｐＴ７Ｂｌｕｅ−２と命名）について、さらに制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＳａｌＩで消化することによりインサートを取り出し、ｐＭＸＳ（ＪＢＣ ２７５，２４９４５−２４９５２，２０００）のＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩサイトにサブクローニングした。これをＥＭＬ４−ＡＬＫｖ１／ｐＭＸＳと命名した。また、ＥＭＬ４−ＡＬＫｖ１／ｐＴ７Ｂｌｕｅ−２プラスミドを鋳型として配列番号５９及び配列番号６０で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＤＮＡポリメラーゼ（ＰｒｉｍｅＳｔａｒ ＨＳ ＤＮＡポリメラーゼ）を用いてＰＣＲ （９８℃ １０秒、６８℃５分を２５サイクル）行い、両端に制限酵素ＥｃｏＲＩで認識されるサイトを持つｃＤＮＡ（配列番号１の第277番〜第3450番）を増幅した。これをＥｃｏＲＩで消化した後、Ｎ末端にＦＬＡＧタグを付加して発現できるように改変した発現ベクターｐｃＤＮＡ３のＥｃｏＲＩサイトに挿入し、Ｎ末端にＦＬＡＧタグが付加されたＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドｖ１（以下、ＦＬＡＧ−ＥＭＬ４−ＡＬＫｖ１）の発現プラスミド（ＦＬＡＧ−ＥＭＬ４−ＡＬＫｖ１／ｐｃＤＮＡ３）を作製した。また、さらにこのベクターから制限酵素ＨｉｎｄIII及びＸｂａＩによる消化によりＦＬＡＧ−ＥＭＬ４−ＡＬＫｖ１のｃＤＮＡを取り出し、両端を平滑末端にした後、ＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩ−ＢａｍＨＩ ａｄａｐｔｏｒ（タカラバイオ）を両端にライゲーションさせ、挿入ｃＤＮＡと細胞表面抗原ＣＤ８を同時に発現可能なベクター（ｂｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃｖｅｃｔｏｒ ｐＭＸ−ｉｒｅｓＣＤ８；Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２００１年， ２７６巻， ｐ．３９０１２−３９０２０）のＥｃｏＲＩサイトに挿入して、ＦＬＡＧ−ＥＭＬ４−ＡＬＫｖ１とＣＤ８の両方を発現するベクターを作製した。これをＦＬＡＧ−ＥＭＬ４−ＡＬＫｖ１／ｐＭＸ−ｉｒｅｓＣＤ８と命名した。

ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリヌクレオチドｖ２を以下の通りクローニングした。
ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリヌクレオチドｖ２のＥＭＬ４をコードするポリヌクレオチド断片を取得する鋳型として、"Genomics", (US), 2000, Vol. 68, p. 348-350を参考にｐＴ７Ｂｌｕｅ−２にクローニングしたＥＭＬ４全長ポリヌクレオチドを用い、ＥＭＬ４遺伝子エクソン１の開始コドンＡＴＧの５’末端側に制限酵素ＥｃｏＲＩの切断配列を付加した配列番号５７で表されるオリゴヌクレオチドと、ＥＭＬ４遺伝子エクソン２０の３’末端２０塩基に対するアンチセンス配列の５’末端側にＡＬＫ遺伝子エクソン２１の５’末端のアンチセンス配列１０塩基を融合した塩基配列からなる配列番号５８で表されるオリゴヌクレオチドをそれぞれセンス、アンチセンスプライマーとして、ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；タカラバイオ）を用いてＰＣＲ（９４℃２０秒、６０℃３０秒、７２℃１分を２５サイクル）を行い、約２２６０ｂｐのＰＣＲ産物を得た。これをＰＣＲ産物Ａとした。

一方、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリヌクレオチドｖ２のＡＬＫポリヌクレオチド断片を取得する鋳型として、本実施例４（１）で製造したＥＭＬ４−ＡＬＫｖ１／ｐＴ７Ｂｌｕｅ−２を用い、ＡＬＫ遺伝子エクソン２１の５’末端のセンス配列２０塩基の５’末端側にＥＭＬ４遺伝子エクソン２０の３’末端のセンス配列１０塩基が融合した塩基配列からなる配列番号１０１で表されるオリゴヌクレオチドと、ＡＬＫ遺伝子エクソン３０に存在する停止コドンを含む部位のアンチセンス配列の５’末端側に制限酵素ＸｂａＩの切断配列を付加した配列番号１０２で表されるオリゴヌクレオチドをそれぞれセンス、アンチセンスプライマーとして、ＰＣＲ産物Ａを取得したのと同じ条件でＰＣＲを行い、約１７００ｂｐのＰＣＲ産物を得た。これをＰＣＲ産物Ｂとした。

上記のＰＣＲ産物ＡとＢを混ぜ、ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；タカラバイオ）を用いて、アニーリングと伸張反応（９４℃１分、５５℃３０秒、７２℃２分３０秒）を３サイクル行い、約４０００ｂｐの産物を得た。この産物をＴＯＰＯ ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇキット（インビトロジェン社）を用いてｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクターにＴＡクローニングして塩基配列を解析した結果、配列番号６に示す、ＥＭＬ４遺伝子の開始コドンＡＴＧからエキソン２０までの２２４２塩基と、ＡＬＫ遺伝子エキソン２１からエキソン３０の停止コドンまでの１６９１塩基からなる融合ポリヌクレオチドを取得した。

（２）ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリヌクレオチドｖ１及びｖ２のｍＲＮＡを検出する方法
ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリヌクレオチドｖ１の鋳型として上述の（１）のＦＬＡＧ−ＥＭＬ４−ＡＬＫｖ１／ｐＭＸ−ｉｒｅｓＣＤ８を、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリヌクレオチドｖ２の鋳型として実施例３のＥＭＬ４−ＡＬＫｖ２ ｐａｒｔｉａｌ／ｐＴ７Ｂｌｕｅ−２を１ｎｇ用い、プライマーセット（ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリヌクレオチドｖ１用；配列番号６１と配列番号６２、配列番号６３と配列番号６４、配列番号６５と配列番号６６、配列番号６７と配列番号６８、配列番号６９と配列番号７０、配列番号７１と配列番号７２、配列番号７３と配列番号７４、配列番号７５と配列番号７６、配列番号７７と配列番号７８、及び配列番号７９と配列番号８０のプライマーセット）、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリヌクレオチドｖ２用；配列番号８１と配列番号62、配列番号８３と配列番号８４、配列番号８５と配列番号68、配列番号８７と配列番号８８、配列番号８９と配列番号70、配列番号９１と配列番号９２、配列番号９３と配列番号74、配列番号９５と配列番号９６、配列番号９７と配列番号９８、及び配列番号９９と配列番号１００のプライマーセット）をそれぞれを用いて、ＤＮＡポリメラーゼ（ｒＴａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；タカラバイオ）によりＰＣＲ（９４℃１５秒、５５℃３０秒、７２℃１分を３０サイクル）を行った。その結果、全てのプライマーセットにおいて、それぞれ期待されるサイズ（約２６０から３５０ｂｐ）の単一のＤＮＡ断片が増幅された。以上の結果から、被験者から得た試料から抽出したｍＲＮＡを鋳型としてＲＴ−ＰＣＲを本実施例に従って行うことにより、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリヌクレオチドのｖ１及び／又はｖ２の存在を検出することが可能であることが確認された。

以上実施例３及び４（２）の結果から、被験者から得た臨床検体より作製したｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡのいずれを用いても、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリヌクレオチドｖ１及びｖ２の存在が検出できることがわかった。このことは、本発明のポリヌクレオチドを有している患者を選定することが可能であることを示しており、本発明のポリペプチド及び／又はポリヌクレオチド抑制剤を投与する患者を事前に選定し治療するという、テーラーメード医療が実践可能であることを示している。

［実施例５］喀痰中に存在するＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリヌクレオチドｖ１の検出
（１）ＦＬＡＧ−ＥＭＬ４−ＡＬＫｖ１発現マウスＢＡ／Ｆ３細胞の作製
ＦＬＡＧ−ＥＭＬ４−ＡＬＫｖ１／ｐＭＸ−ｉｒｅｓＣＤ８及び空ベクター（ｐＭＸ−ｉｒｅｓＣＤ８）を用いて実施例1（1）と同様の方法で組み換えレトロウィルスを作製し、マウスリンパ系細胞株ＢＡ／Ｆ３細胞に感染させた。細胞分離用磁気ビーズ試薬及び精製カラム（ＣＤ８に対する磁気ビーズ結合モノクローナル抗体とＭｉｎｉＭＡＣＳ純化カラム；共にＭｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社）を用いて、細胞表面ＣＤ８発現細胞を簡便に純化した。

（２）喀痰でのＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリヌクレオチドｖ１の検出
健常人の喀痰に上記ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリヌクレオチドｖ１を発現したＢＡ／Ｆ３細胞（以下、ｖ１発現ＢＡ／Ｆ３細胞）を０個／ｍＬ、１０個／ｍＬ、１００個／ｍＬ、１０００個／ｍＬ、１００００個／ｍＬになるよう混合した後、常法によりｃＤＮＡを合成した。喀痰中のＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリヌクレオチドｖ１の存在を上記ｃＤＮＡを基質として、配列番号８及び配列番号９で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーとして定量的ＰＣＲキット（ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ；Ｑｉａｇｅｎ社）を用いたＰＣＲ反応（５０℃ ２分、９５℃ １５分、さらに以下の反応を４０サイクル（９４℃ １５秒、６０℃ ３０秒、７２℃ １分））を行いＰＣＲ産物を得た。その結果、０個／ｍＬ以外の全ての場合においてＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリヌクレオチドｖ１の存在を確認できた。

これまで肺がんの診断には喀痰を試料とした病理細胞診が重要な診断手法であった。これは喀痰中の細胞の異形性から肺がんを診断するものであるが、喀痰中に多くの肺がん細胞が存在しないと信頼性良い診断は不可能であった。しかしそのような症例は既に進行期の肺がんであることが殆どであり有効な肺がんの早期診断は不可能に近かった。上記発明により喀痰中にＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリヌクレオチドｖ１が存在すれば、微量であってもＰＣＲにより検出できることがわかった。

［実施例６］ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドｖ１の形質転換能及び腫瘍形成能の検討
（１）ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドｖ１の解析
ＥＭＬ４−ＡＬＫｖ１／ｐＭＸＳを基質として変異導入キット（ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキット；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を用いてＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドｖ１の５８９番目のアミノ酸（ＡＴＰ結合部位）であるリジン残基をメチオニンに置換したＥＭＬ４−ＡＬＫ（Ｋ５８９Ｍ）／ｐＭＸＳを作製した。反応には配列番号１０３及び１０４からなるオリゴヌクレオチドを使用した。ＡＬＫ ｃＤＮＡ（Ｍｏｒｒｉｓ，ＳＷ ａｔ ａｌ， Ｓｃｉｅｎｃｅ． １９９４ Ｍａｒ ４；２６３（５１５１）：１２８１−４）は定法に従いレトロウィルスベクターｐＭＸＳにクローニングした（ＡＬＫ／ｐＭＸＳと命名した）。

上記ＥＭＬ４−ＡＬＫｖ１／ｐＭＸＳ、ＡＬＫ／ｐＭＸＳ、ＥＭＬ４−ＡＬＫ（Ｋ５８９Ｍ）／ｐＭＸＳ発現プラスミドおよびｃＤＮＡを挿入しない空ベクター（ｐＭＸＳ）をリン酸カルシウム法で３Ｔ３繊維芽細胞に導入し２１日間培養したところ、図３上段にあるようにＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドｖ１発現ベクターを導入した場合に限り多数の形質転換フォーカスが観察された。スケールバーは１００μｍを示す。また同じ導入３Ｔ３細胞をヌードマウスの皮下に５×１０^５個ずつ接種し２０日観察したところ、やはりＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドｖ１発現細胞においてのみ腫瘍が形成された。また腫瘍形成数（Ｔｕｍｏｒ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（３Ｔ３細胞接種箇所数と、そのうち何カ所に腫瘍が形成されたか）は以下の通りであった。全長ＡＬＫ発現細胞の腫瘍形成数は８個中０個であり、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドｖ１発現細胞は８個中８個であった。また、ＥＭＬ４−ＡＬＫ（Ｋ５８９Ｍ）発現細胞の腫瘍形成数は８個中０個だった。これらの結果から、全長ＡＬＫポリペプチドを発現させても腫瘍形成能は無く、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドｖ１が腫瘍形成能があることからＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリヌクレオチドｖ１は癌の原因遺伝子であることが示された。また、ＥＭＬ４−ＡＬＫの腫瘍形成能はＥＭＬ４−ＡＬＫ（Ｋ５８９Ｍ）では観察されなかったことから腫瘍形成能はキナーゼ活性に依存していると考えられた。以下、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドｖ１発現プラスミドを導入し、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドｖ１を発現させた３Ｔ３細胞をｖ１発現３Ｔ３細胞と称する。

（２）ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリヌクレオチドｖ１の各種欠失変異体の解析
ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリヌクレオチドｖ１のＥＭＬ４部分の各種欠失変異体（ΔＢａｓｉｃ欠失変異体（ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドｖ１の３１−１４０番目のアミノ酸を欠失）、ΔＨＥＬＰ欠失変異体（ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドｖ１の２２０−２９６番目のアミノ酸を欠失）、ΔＷＤ欠失変異体（ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドｖ１の３０５−４７５番目のアミノ酸を欠失））を、クローニングキット（ＥｘＳｉｔｅ ＰＣＲ−ｂａｓｅｄ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を用いてＦＬＡＧ−ＥＭＬ４−ＡＬＫｖ１／ｐＭＸ−ｉｒｅｓＣＤ８を鋳型にしたＰＣＲ反応により作製した。これら欠失変異体プラスミドを用いて実施例１と同様の方法でレトロウィルス溶液を作製し、感染３Ｔ３細胞を得た。これら各感染細胞をヌードマウスの皮下に接種し腫瘍形成を検討したところ、ΔＨＥＬＰ欠失変異体及びΔＷＤ欠失変異体発現３Ｔ３細胞において腫瘍が形成された。ΔＢａｓｉｃ欠失変異体、ΔＨＥＬＰ欠失変異体、ΔＷＤ欠失変異体をそれぞれ発現した３Ｔ３細胞の腫瘍形成数はそれぞれ８個中０個、８個中７個、８個中８個であった。ΔＢａｓｉｃ欠失変異体では腫瘍形成が観察されなかったことから、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドｖ１の３１−１４０番目のアミノ酸が腫瘍形成に重要であることが示された。ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドｖ２もＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドｖ１と同様に上記３１−１４０番目のアミノ酸及びＡＬＫキナーゼ領域を含んでいると考えられることから、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリヌクレオチドｖ２は、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリヌクレオチドｖ１と同様に３Ｔ３細胞に対する形質転換及び腫瘍形成能を有するポリペプチドをコードする癌の原因遺伝子であると考えられた。

［実施例７］ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチド抑制剤のスクリーニング方法
（１）ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドｖ１の取得
ｖ１発現ＢＡ／Ｆ３細胞（実施例５（１））を１０％仔牛胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地にて培養し２．７×１０^９個の細胞を得た。ＰＢＳにて３回洗浄後、細胞を溶解液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００、５ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ ＥＧＴＡ、１ｍＭ ＮａＶＯ_４、１ｍＭ ＤＴＴ、プロテアーゼ抑制剤カクテルｃｏｍｐｌｅｔｅ）にて溶解した。遠心後得られた上清中に存在するＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドｖ１を抗フラッグＭ２抗体アフィニティゲル（ＡＮＴＩ−ＦＬＡＧ Ｍ２ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｇｅｌ；ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社）を用いて製品情報に記載された方法に従って精製した。洗浄及び溶出はそれぞれ洗浄液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％Ｂｒｉｊ３５、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＥＧＴＡ、１ｍＭ ＮａＶＯ_４、１ｍＭ ＤＴＴ、ｃｏｍｐｌｅｔｅ）、溶出液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％Ｂｒｉｊ３５、１ｍＭ ＤＴＴ、０．５ｍｇ／ｍＬ ＦＬＡＧ ｐｅｐｔｉｄｅ）を使用した。溶出液に対して抗ＡＬＫ抗体及び抗フラッグＭ２抗体（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社）を用いたイムノブロッティングならびに銀染色を行い、約１３０ｋＤａのＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドｖ１を検出した。この方法によりＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドｖ１の取得が可能であることが示された。

（２）ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドｖ１のインビトロキナーゼ活性の検出
上記で精製したＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドｖ１を反応液（１５ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、０．２５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０、２ｍＭ ＤＴＴ）にて希釈後、ＡＴＰ未添加及びＡＴＰ２０μＭ添加後それぞれ室温にて１時間反応した。その後、ＡＬＫの１６０４番目のチロシン残基がリン酸化されたものを特異的に認識する抗リン酸化ＡＬＫ抗体及び抗ＡＬＫ抗体を用いたイムノブロッティングにより自己リン酸化したＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドｖ１及びＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドｖ１の検出を行い、画像解析システム（ＶｅｒｓａＤｏｃ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ；Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）により定量化した。リン酸化量は自己リン酸化ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドｖ１のカウントをＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドｖ１のカウントで除して補正算出した。その結果、ＡＴＰ添加条件において約１３０ｋＤａの位置にＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドｖ１の自己リン酸化のバンドが検出され、このリン酸化量はＡＴＰ未添加に比べて約２０５倍増加していた。

また、ペプチド基質に対するリン酸化活性をキナーゼ活性検出キット（ＨＴＲＦ ＫｉｎＥＡＳＥ−ＴＫ；Ｃｉｓｂｉｏ社）を用いて検討した。キット同封のＴＫ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ １を基質に用い、ＡＴＰ未添加及びＡＴＰ１００μＭ添加後それぞれ室温にて１時間反応し、キット推奨に従いＨＴＲＦのカウントを検出した結果、ＡＴＰ未添加に対しＡＴＰ添加ではＨＴＲＦのカウント（即ちペプチド基質のリン酸化）が約１２倍増加していることが明らかとなった。以上のように、抗リン酸化ＡＬＫ抗体やキナーゼ活性検出キットを用いることにより、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドｖ１のインビトロキナーゼ活性を検出することが可能であった。

（３）ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドｖ１インビトロキナーゼ活性に対する化合物の抑制作用
ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドｖ１のインビトロキナーゼ活性に対する化合物Ａ〜Ｄの抑制作用を抗リン酸化ＡＬＫ抗体及び上記キナーゼ活性検出キットを用いて検討した。各化合物を最終濃度１０μＭ又は１０ｎＭになるようＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドｖ１を含む反応液中に添加し、ついで、ＡＴＰを添加又は添加せずに反応させた。その他は、上述の（２）の方法に従って行った。化合物非存在下でのＡＴＰ未添加及び添加時のリン酸化のカウントをそれぞれ１００％抑制、０％抑制として、化合物によるＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドｖ１のキナーゼ活性の抑制％を以下の式より算出した。
［化合物によるキナーゼ活性抑制（％）］＝（１−［化合物添加ＡＴＰ添加時のリン酸化のカウント−化合物未添加ＡＴＰ未添加時のリン酸化のカウント］／［化合物未添加ＡＴＰ添加時のリン酸化のカウント−化合物未添加ＡＴＰ未添加時のリン酸化のカウント］）×１００

その結果、精製ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドｖ１の自己ならびにペプチド基質に対するリン酸化活性を化合物Ａ〜Ｄが抑制すること見出した（表１）。化合物Ａ及びＢを、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドｖ1の活性を５０％以上抑制する濃度が１０μＭ以下の物質として、化合物Ｃ及びＤを５０％以上ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドｖ1の活性を抑制する濃度が０．１μＭ以下の物質として選択することができた。

以上より、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドを取得しインビトロキナーゼ活性を指標とすることで、本発明のポリペプチドの活性を抑制する物質のスクリーニング（インビトロ型スクリーニング）が可能であることが示された。

（４）細胞内自己リン酸化に対するＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドｖ１抑制剤の抑制作用
（４−１）ＢＡ／Ｆ３細胞
ｖ１発現ＢＡ／Ｆ３細胞（実施例５（１））の培養液に化合物Ａ（１μＭ、５μＭ、１０μＭ）を添加及び未添加の条件で３時間培養した。また、ＦＬＡＧが付加されるようにＥＭＬ４−ＡＬＫ（Ｋ５８９Ｍ）を組み込んだｐＭＸ-ｉｒｅｓＣＤ８ベクターを用いて、ＦＬＡＧ−ＥＭＬ４−ＡＬＫｖ１（Ｋ５８９Ｍ）発現ＢＡ／Ｆ３細胞を作製し培養した。これらを培養後、細胞数を計測し抗リン酸化ＡＬＫ抗体を用いたイムノブロッティングによりＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドｖ１のチロシンリン酸化レベルを測定した。また同じメンブレンについて、抗ＦＬＡＧタグ抗体（Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ社）によるイムノブロッティング解析を行い、ＦＬＡＧ付加ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドｖ１の総蛋白量を測定した。図４上段にあるように、ｖ１発現ＢＡ／Ｆ３細胞においてＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドｖ１のチロシンリン酸化レベルが検出されたが、ＥＭＬ４−ＡＬＫ（Ｋ５８９Ｍ）を発現させた場合ではチロシンリン酸化は検出されなかった。このことは、ＢＡ／Ｆ３細胞で検出されたＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドｖ１のチロシンリン酸化がＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドｖ１自身による自己リン酸化であることを示している。また、化合物Ａが細胞内のＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドｖ１の自己リン酸化を濃度依存性に抑制することを確認した。なお、全てのサンプル中のＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドｖ１の蛋白発現量自体はほぼ一定であることが示された（図４下段）。

細胞内自己リン酸化に対する化合物Ｂ〜Ｄの抑制効果を上記と同様に試験した。ただし、化合物添加後の培養時間は６時間とし、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドｖ１の総蛋白量は抗ＡＬＫ抗体を用いて測定した。また、実施例７（２）と同様に定量化してリン酸化量を算出した。また、化合物Ａについても本条件で実験し定量化してリン酸化量を算出した。抑制率は化合物未添加（化合物の溶媒であるＤＭＳＯ添加）時の値を対照（抑制率０％）として化合物添加時のリン酸化量から算出した。各化合物はＢＡ／Ｆ３細胞内のＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドｖ１のキナーゼ活性を明らかに抑制した（表２）。化合物Ａ及びＢを５０％以上ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドｖ1の活性を抑制する濃度が１０μＭ以下の物質として、化合物Ｃ及びＤを５０％以上ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドｖ1の活性を抑制する濃度が０．１μＭ以下の物質として選択することができ、本発明のポリペプチドの活性を抑制する物質のスクリーニング（細胞型スクリーニング）が可能であることが示された。

（４−２）３Ｔ３細胞
ｖ１発現３Ｔ３細胞（実施例６(１)）に化合物Ａ〜Ｄを１０μＭ又は１０ｎＭ濃度で添加して４時間培養した以外は、（４−１）と同様にＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドｖ１のチロシンリン酸化量及びＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドｖ１の総蛋白質量を測定し各化合物の細胞内キナーゼ活性抑制率を算出した。各化合物はｖ１発現３Ｔ３細胞内のＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドｖ１のキナーゼ活性を明らかに抑制した（表２）。本発明の細胞型スクリーニング方法における、本発明のポリペプチドを発現している細胞として、ＢＡ／Ｆ３細胞や３Ｔ３細胞などの種々の細胞が利用できることがわかった。

以上より、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリヌクレオチドｖ１を発現した細胞の細胞内自己リン酸化を指標とすることでＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドのキナーゼ活性抑制化合物の取得が可能であることが示された。

［実施例８］ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリヌクレオチドｖ１を発現した細胞に対するＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチド抑制剤の増殖抑制作用
（１）ｖ１発現ＢＡ／Ｆ３細胞の増殖能
ＣＤ８蛋白質のみを発現するＢＡ／Ｆ３細胞（実施例５（１））、ＣＤ８と共にＡＬＫ、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドｖ１（実施例５（１））又はキナーゼ失活型ＥＭＬ４−ＡＬＫ（Ｋ５８９Ｍ）を発現するＢＡ／Ｆ３細胞の増殖を、増殖因子であるＩＬ−３の存在下又は非存在下で８×１０^５個から培養したときの経時的な細胞数の変化をカウントした。結果を図５に示す。ｖ１発現ＢＡ／Ｆ３細胞は、ＩＬ−３の有無にかかわらず増殖が可能であった。しかしＣＤ８のみを発現するＢＡ／Ｆ３細胞の場合はＩＬ−３存在下では増殖したもののＩＬ−３を除くと急速に死滅した。このことはＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリヌクレオチドｖ１が癌遺伝子としての活性を有していることを示している。また、全長ヒトＡＬＫ発現細胞や、キナーゼ失活型ＥＭＬ４−ＡＬＫ（Ｋ５８９Ｍ）発現ＢＡ／Ｆ３細胞も同様にＩＬ−３非存在下では死滅した。これらの結果は、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリヌクレオチドｖ１を発現することにより、増殖因子非存在下でも細胞が増殖能を獲得すること、さらにその増殖能はＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドｖ１のキナーゼ活性に依存していることを示している。全長ＡＬＫを発現するＢＡ／Ｆ３細胞は、実施例５（１）に準じて得た。

（２）ｖ１発現ＢＡ／Ｆ３細胞に対するＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチド抑制剤の増殖抑制作用
次に、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドｖ１を発現することでＩＬ−３非依存性に増殖可能になったＢＡ／Ｆ３細胞に対してＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドｖ１を抑制する物質である化合物Ａを添加して、細胞増殖への影響を検討した。まずＩＬ−３存在下で増殖するＣＤ８発現コントロールＢＡ／Ｆ３細胞に対して１μＭ、５μＭ又は１０μＭの化合物Ａを添加し又は添加しない（０μＭ）条件で細胞増殖を計測したところ、図６（ａ）にあるように僅かな増殖抑制は認められるものの細胞は増殖可能であった。一方ｖ１発現ＢＡ／Ｆ３細胞がＩＬ−３非存在下で増殖している状態で化合物Ａを添加すると、図６(ｂ)に示すように、化合物Ａの濃度依存性に細胞増殖が著明に抑制され細胞死が誘導された。すなわちＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリヌクレオチド（癌遺伝子）依存性に増殖している細胞がＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドｖ１抑制剤によって細胞死に至ることが確認された。

（３）ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドｖ１及び全長ＡＬＫポリペプチド発現細胞に対するＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチド抑制剤の足場非依存的細胞増殖抑制作用
足場非依存的な細胞増殖の測定（コロニー法など）は、化合物の抗癌作用（薬理効果）を検討する系として知られている（臨床腫瘍学 セカンドエディション、癌と化学療法社）。コロニー法に変わる細胞非接着性の増殖を測定する方法として、以下のようなスフェロイドプレートを用いる方法がある。

９６ウェルスフェロイドプレート（スミロンセルタイトスフェロイド９６Ｕ；住友ベークライト）に、ｖ１発現３Ｔ３細胞（実施例6(1)）、及び内在的に全長ＡＬＫポリペプチドを発現しており、EML4-ALK融合ポリヌクレオチドを内在的に発現していないヒト神経膠腫細胞の一つであるＵ−８７ＭＧ細胞を、１ウェル当り３０００細胞となるように１０％牛胎児血清を含む培地（ｖ１発現３Ｔ３細胞はＤＭＥＭ、Ｕ−８７ＭＧはＲＰＭＩ１６４０）で播種した。５％ＣＯ_２存在下、３７℃にて一晩培養後、化合物ＡとＢは最終濃度１０μM、化合物ＣとＤは最終濃度１０ｎＭ、及びネガティブコントロールとして化合物の溶媒であるＤＭＳＯを化合物と同濃度になるように添加した。同時に薬剤未添加の細胞数も測定した（Ｄａｙ０とする）。その後、５％ＣＯ_２存在下、３７℃で３日間培養し、細胞数測定試薬（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ^ＴＭＬｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ；Ｐｒｏｍｅｇａ社）を添加し２０分撹拌した後、発光測定装置（ＭＬ３０００ ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ ｐｌａｔｅ ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ； Ｄｙｎａｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を用いて測定した（Ｄａｙ３とする）。その結果、全ての化合物はｖ１発現３Ｔ３細胞に対して増殖抑制活性を示し、一方、Ｕ−８７ＭＧ細胞に対してはほとんど抑制活性を示さなかった。Ｄａｙ０、Ｄａｙ３の細胞数をそれぞれ１００％抑制、０％抑制として化合物の抑制率を算出した（表３）。

以上の結果から、化合物Ａ〜ＤはＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドｖ１のキナーゼ活性を抑制することにより、ｖ１発現３Ｔ３細胞の足場非依存的細胞増殖を抑制したことが示された。さらに全長ＡＬＫポリペプチドを発現するＵ−８７ＭＧ細胞の足場非依存的細胞増殖をこれら化合物は抑制できないことが明らかとなった。この結果は、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドを発現する癌細胞や腫瘍の増殖をＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチド抑制剤が抑制できることを示している。

（４）ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリヌクレオチドｖ１に対するｓｉＲＮＡの作製
ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリヌクレオチドｖ１の一つである配列番号１の融合部分に１００％相同性を示しＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリヌクレオチドｖ１の発現抑制作用が期待されるｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ−１〜ｓｉＲＮＡ−６）として、配列番号１１１，１１３，１１５，１１７，１１９，又は１２１で示した塩基配列からなるセンス鎖と配列番号１１２，１１４，１１６，１１８，１２０，又は１２２で示した塩基配列からなるアンチセンス鎖により構成されるｓｉＲＮＡを作製した。また、配列番号１のＡＬＫ遺伝子由来の部分に１００％相同性を示しＡＬＫ遺伝子の発現抑制作用が期待されるｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ−７，ｓｉＲＮＡ−８）として、配列番号１２３又は１２５で示した塩基配列からなるセンス鎖と配列番号１２４又は１２６で示した塩基配列からなるアンチセンス鎖により構成されるｓｉＲＮＡをｓｉＲＮＡ配列設計システム（商用siDirect（登録商標）、RNAi社）により設計し作製した。ｓｉＲＮＡ−１〜ｓｉＲＮＡ−８に対応する塩基配列が、配列番号1、ＡＬＫ遺伝子以外のポリヌクレオチドに１００％の相同性を示さないことをsiRNA配列設計システム（商用siDirect（登録商標）、RNAi社）により確認した。非特異的なｓｉＲＮＡの影響を検討する対照実験のために、哺乳類細胞に存在しない塩基配列に対応するｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ−９）として、配列番号１２７で示した塩基配列からなるセンス鎖と配列番号１２８の塩基配列からなるアンチセンス鎖により構成されるｓｉＲＮＡを作製した。ｓｉＲＮＡ−１は配列番号１１１（センス鎖）と配列番号１１２（アンチセンス鎖）をアニールしたものになり、ｓｉＲＮＡ−２以下も同様である（図7）。

（５）ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリヌクレオチドｖ１及び全長ＡＬＫ発現細胞に対するｓｉＲＮＡの導入によるＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリヌクレオチドｖ１及びＡＬＫ遺伝子のｍＲＮＡ発現抑制作用
ｖ１発現３Ｔ３細胞及びＵ−８７ＭＧ細胞をそれぞれ５０，０００個及び１５０、０００個になるよう１２ウェルプレート（ＩＷＡＫＩ；アサヒテクノグラス）に播種した。４時間後、ｓｉＲＮＡ−１〜ｓｉＲＮＡ−９をトランスフェクション試薬（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭａｘ；インビトロジェン社）を用いて、添付指示書に従い終濃度２０ｎＭになるように調製し導入した。また、コントロールとしてｓｉＲＮＡ未導入の条件も準備した。７２時間経過後に培地を除去した後、総ＲＮＡの抽出し、ｃＤＮＡを作製した。

ｖ１発現３Ｔ３細胞内のＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリヌクレオチドｖ１のｍＲＮＡ発現量及び及びＵ−８７ＭＧ細胞内のＡＬＫ遺伝子のｍＲＮＡ発現量を上記ｃＤＮＡを鋳型とした定量的ＰＣＲ試薬（Ｐｏｗｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）にて定量した（ＰＣＲ反応は９５℃１０分インキュベーションした後、９５℃１５秒、６０℃６０秒からなるサイクルを４５サイクルし、その後９５℃１５秒、６０℃１５秒、９５℃１５秒を１サイクル行い終了とした）。また、発現量の補正のため、ｖ１発現３Ｔ３細胞に対してはマウスサイクロフィリンＢ遺伝子を、Ｕ−８７ＭＧ細胞に対してはヒトＧＡＰＤＨ遺伝子の発現量を同様に定量した。解析はシークエンスディテクター（ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７９００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ；Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて行った。

ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリヌクレオチドｖ１の一つである配列番号１で表されるポリヌクレオチド、マウスサイクロフィリンＢ遺伝子、ヒトＡＬＫ遺伝子、及びヒトＧＡＰＤＨ遺伝子を特異的に認識するプライマーセットは、それぞれ配列番号４４と４８、配列番号５０と５６、配列番号４４と４８、配列番号１２と１３で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして用いた。また、各ｍＲＮＡ発現量算出の標準曲線を得るために、配列番号１で表されるポリヌクレオチド、ヒトＡＬＫ遺伝子及びヒトＧＡＰＤＨ遺伝子に対してはヒトゲノムＤＮＡ（クロンテック社）を、マウスサイクロフィリンＢ遺伝子に対してはマウスゲノムＤＮＡ（クロンテック社）を鋳型として、前記プライマーセットを用いて同条件のＰＣＲを行った。尚、配列番号１で表されるポリヌクレオチドの検出にはヒトＡＬＫポリヌクレオチドのエクソン２９に対応するプライマーセットを用いているため、ヒトゲノムＤＮＡを用いて標準曲線を得ることが可能である。各試料における配列番号１で表されるポリヌクレオチド及びヒトＡＬＫ遺伝子発現量は、マウスサイクロフィリンＢ遺伝子及びヒトＧＡＰＤＨ遺伝子の発現量で補正し補正発現量とした。さらに、ｓｉＲＮＡ未導入時の配列番号１で表されるポリヌクレオチド及びヒトＡＬＫ遺伝子補正発現量をそれぞれ１００％としたときの、各ｓｉＲＮＡ導入時の配列番号１で表されるポリヌクレオチド及びヒトＡＬＫ遺伝子補正発現量の相対的発現量を求め発現抑制率を算出した（表４）。

その結果、配列番号１で表されるポリヌクレオチドに対応するｓｉＲＮＡであるｓｉＲＮＡ−１〜ｓｉＲＮＡ−８は配列番号１で表されるポリヌクレオチドの発現を５０％以上抑制した。ヒトＡＬＫ遺伝子についてはヒトＡＬＫ遺伝子に対応するｓｉＲＮＡであるｓｉＲＮＡ−７及びｓｉＲＮＡ−８が５０％以上の抑制を示した。ネガティブコントロールのｓｉＲＮＡ−９は配列番号１で表されるポリヌクレオチド及びヒトＡＬＫ遺伝子に対して強い発現抑制作用を示さなかった。これにより、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリヌクレオチドの発現を抑制する物質をスクリーニングすることが可能であることが確認された。

（６）ｖ１発現３Ｔ３細胞におけるｓｉＲＮＡのＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドｖ１発現抑制並びに自己リン酸化抑制作用
実施例8（5）と同様の方法でｖ１発現３Ｔ３細胞５０，０００個を１２ウェルプレートに播種し、４時間後、ｓｉＲＮＡ−１〜ｓｉＲＮＡ−９を導入した。また、コントロールとしてｓｉＲＮＡ未導入の条件も準備した。導入から７２時間経過後に培地を除去し、実施例７（４）と同様の方法で細胞内のＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドｖ１の自己リン酸化及びＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドｖ１の蛋白質量を定量化した。また各測定サンプル中の総蛋白質がそろっていることを確認するために抗アクチン抗体（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社）でアクチン蛋白質量も定量した。ｓｉＲＮＡ−１〜ｓｉＲＮＡ−８はｖ１発現３Ｔ３細胞内のＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドｖ１の発現及びキナーゼ活性を明らかに抑制した。

（７）ｖ１発現３Ｔ３細胞及び全長ＡＬＫ発現細胞におけるｓｉＲＮＡの増殖抑制作用
各ｓｉＲＮＡを先に９６ウェルスフェロイドプレートに添加し、その後、ｖ１発現３Ｔ３細胞及びＵ−８７ＭＧ細胞を播き３日間培養する以外は実施例８（３）と同様の方法でｓｉＲＮＡ導入及び未添加条件での細胞増殖抑制率を算出した。

この結果を表５に示す。実施例８（６）でＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドｖ１の発現及びキナーゼ活性を抑制することが示されたｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ−１〜ｓｉＲＮＡ−８）は、それぞれｖ１発現３Ｔ３細胞の足場非依存的増殖を強く抑制した。ｓｉＲＮＡ−１，ｓｉＲＮＡ−３，ｓｉＲＮＡ−４，又はｓｉＲＮＡ−５を導入したｖ１発現３Ｔ３細胞の測定時（Ｄａｙ３）の細胞数はｓｉＲＮＡ導入日（Ｄａｙ０）の細胞数より低かったため増殖抑制率が１００％を超える結果となり、細胞死が誘導されていると考えられた。一方、ｓｉＲＮＡ−７及びｓｉＲＮＡ−８は実施例８（５）でＡＬＫ遺伝子の発現を抑制することが示されたが、全長ＡＬＫを発現するＵ−８７ＭＧ細胞に対して増殖抑制は示さなかった。尚、ｓｉＲＮＡ−１〜ｓｉＲＮＡ−６はＵ−８７ＭＧ細胞の増殖抑制は示さず、また、ネガティブコントロールのｓｉＲＮＡ−９はｖ１発現３Ｔ３細胞及びＵ−８７ＭＧ細胞の増殖抑制は示さなかった。

以上の結果から、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリヌクレオチドｖ１の一つである配列番号１で表されるポリヌクレオチドを発現する癌細胞に対応するｓｉＲＮＡを導入することにより、ｍＲＮＡ発現が抑制され、その結果としてＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドの低下、さらには自己リン酸化活性が抑制され癌細胞の増殖が抑制されることが明らかとなった。また、全長ＡＬＫを発現する癌細胞に対してはＡＬＫの発現を抑制しても増殖阻害は起こらなかった。以上の結果より、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリヌクレオチド陽性の癌患者に対し、配列番号１で表されるポリヌクレオチドに対するｓｉＲＮＡ、例えばｓｉＲＮＡ−１〜ｓｉＲＮＡ−８は、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリヌクレオチドを発現する腫瘍に対する治療薬として有用であることが明らかとなった。

（８）ｖ１発現３Ｔ３細胞に対するＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチド抑制剤の抗腫瘍試験
ＰＢＳに懸濁したｖ１発現３Ｔ３細胞３×１０^６個を５週齡の雄性BALB／ｃヌードマウス（日本チャールズリバー社）の背部皮下に注射して植えつけた。植付け７日後にＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチド抑制剤である（表１〜３）化合物Ｃの投与を開始した。試験は溶媒群および化合物Ｃ群各４匹で行い、１０％ １−メチル−２−ピロリドン（１−ｍｅｔｈｙｌ−２−ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｏｎｅ）（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社）／９０％ ポリエチレングリコール３００（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ ３００）（Ｆｌｕｋａ社）の組成の溶媒に化合物Ｃを溶解し、１０ｍｇ／ｋｇを経口投与した。投与は１４日間１日１回行い、体重および腫瘍径を隔日で測定した。腫瘍体積の算出には以下の式を用いた。
［腫瘍体積（ｍｍ^３）］＝［腫瘍の長径（ｍｍ）］×［腫瘍の短径（ｍｍ）］^２×０．５

化合物投与開始日および投与終了日の溶媒群の腫瘍体積をそれぞれ１００％抑制、０％抑制として化合物Ｃの抑制率を算出した。結果、化合物Ｃはｖ１発現３Ｔ３細胞（腫瘍）の増殖を１０３％抑制した。

下記以外は、同様に化合物Ｄの抗腫瘍作用を検討した。植付け６日後に化合物Ｄの投与を開始し、投与は１０日間１日１回行い、腫瘍径を測定した。化合物Ｄはｖ１発現３Ｔ３細胞（腫瘍）の増殖を１０１％抑制した。

（９）ｖ１発現３Ｔ３腫瘍に対するＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチド抑制剤反復投与によるキナーゼ抑制作用
下記以外は実施例８（８）と同様にして、化合物Ｃのキナーゼ抑制作用を観察した。ｖ１発現３Ｔ３細胞１×１０^６個を植えつけ、植付け１３日後に化合物Ｃの投与を開始した。試験は溶媒群および化合物Ｃ群各３匹で行い、投与は３日間１日１回行い、最終投与４時間後に解剖して腫瘍を摘出した。その後、組織から蛋白質抽出液を調製し、抗リン酸化ＡＬＫ抗体を用いたイムノブロッティングを行った。結果、化合物Ｃ群では溶媒群に比べ腫瘍内のＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドｖ１のチロシン自己リン酸化が有意に減少していた。この結果から上記動物モデルにおける化合物Ｃの抗腫瘍作用が腫瘍内のＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドｖ１のキナーゼ抑制作用に基づくことが確認された。

［実施例９］ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドｖ１の検出
細胞中のＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドｖ１を検出する方法を以下の通り構築した。ｖ１発現３Ｔ３細胞及びＵ−８７ＭＧ細胞を培養した。ＰＢＳにて３回洗浄後、細胞を溶解液（実施例７（１））にて溶解した。遠心後得られた上清蛋白質４ｍｇに対して抗ＥＭＬ４抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社）を添加し４℃にて一晩反応させた。その後、プロテインＧビーズ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ；ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を添加し２時間免疫沈降を行った。遠心後に沈降物を洗浄液（実施例７（１））にて３回洗浄し、ＳＤＳ溶解液にて沈殿物を懸濁した。この上清に対して抗ＡＬＫ抗体を用いたイムノブロッティングを行った。結果、ｖ１発現３Ｔ３細胞の免疫沈降物では、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドｖ１が検出されたが、Ｕ−８７ＭＧ細胞では検出されなかった。以上の結果から、抗ＥＭＬ４抗体及び抗ＡＬＫ抗体を組み合わせて用いることで、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドｖ１を発現している癌細胞や癌組織中のＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドｖ１の存在を検出することが可能となり、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリヌクレオチドｖ１陽性癌患者を判定することが可能であることが明らかとなった。

[実施例１０] ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドｖ２の解析
（１）ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドｖ２の発現ベクターの構築
実施例４の（１）で製造したＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリヌクレオチドｖ２の一つである配列番号６のポリヌクレオチドをクローニングしたｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクターを用いて、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリヌクレオチドｖ２の開始コドンの5’末端側に制限酵素ＨｉｎｄIIIの切断配列を組み込んだベクター（ＥＭＬ４−ＡＬＫｖ２／ｐＣＲ２．１）を作製した。

ＥＭＬ４−ＡＬＫｖ２／ｐＣＲ２．１を制限酵素ＨｉｎｄIIIで消化して、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリヌクレオチドｖ２を切り出して両端を平滑末端にした後、アダプター(ＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩ−ＢａｍＨＩ ａｄａｐｔｏｒ；タカラバイオ社）を両端にライゲーションさせ、レトロウィルスベクターｐＭＸＳのＥｃｏＲＩサイトに挿入した。これをＥＭＬ４−ＡＬＫｖ２／ｐＭＸＳと命名した。

また、ＥＭＬ４−ＡＬＫｖ２／ｐＣＲ２．１を制限酵素ＨｉｎｄIIIとＸｂａＩで消化して、切り出した断片を、Ｎ末端にＦＬＡＧタグを付加して発現できるように改変した発現ベクターｐｃＤＮＡ３のＨｉｎｄIII／ＸｂａＩサイトに挿入し、Ｎ末端にＦＬＡＧタグが付加されたＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドｖ２の発現プラスミド（ＦＬＡＧ−ＥＭＬ４−ＡＬＫｖ２／ｐｃＤＮＡ３）を作製した。

（２）ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドｖ２の腫瘍形成能
ＦＬＡＧ−ＥＭＬ４−ＡＬＫｖ２／ｐｃＤＮＡ３（実施例１０（１））を、トランスフェクション試薬（ＦｕＧＥＮＥ ＨＤ；Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）を用いて、添付マニュアルに従って３Ｔ３繊維芽細胞に導入した。選択薬剤ゼオシン(Ｚｅｏｃｉｎ)を８０μｇ／ｍＬにより、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドｖ２を安定に発現した３Ｔ３細胞を樹立した。ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドｖ２の発現は、抗ＡＬＫ抗体及び抗リン酸化ＡＬＫ抗体を用いたイムノブロッティングにより確認した。この細胞をｖ２発現３Ｔ３細胞と称する。ＰＢＳに懸濁したｖ２発現３Ｔ３細胞２×１０^６個を５週齡の雄性BALB／ｃヌードマウス（日本チャールズリバー社）の背部皮下に注射して植えつけた。植付け後１５日間観察したところ、図３下段に示すｖ１発現３Ｔ３細胞の結果と同様に、ｖ２発現３Ｔ３細胞でも、4例中4例全てに明らかな腫瘍形成が確認できた。

以上の結果より、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリヌクレオチドｖ２の一つである配列番号６で表されるポリヌクレオチドは、３Ｔ３細胞に対する腫瘍形成能を有するポリペプチドをコードする癌の原因遺伝子であることが確認できた。

（３）ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドｖ２の細胞内自己リン酸化活性を抑制する物質のスクリーニング
１ウェル当り１×１０^５細胞となるように１０％牛胎児血清を含むＤＭＥＭ培地で、コラーゲンＩコート２４ウェルプレート（ＩＷＡＫＩ社）に播種した２９３ＥＢＮＡ細胞（インビトロジェン社）に、トランスフェクション試薬（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ２０００；インビトロジェン社）を用いて、ＦＬＡＧ−ＥＭＬ４−ＡＬＫｖ２／ｐｃ DNA３（実施例１０（１））又はコントールとしてｐｃＤＮＡ３（空ベクター）を１００ｎｇ導入した。２０時間培養した後、化合物Ｃ，Ｄ又はDMSOをそれぞれ添加して４時間培養して細胞を回収した。抗ＡＬＫ抗体及び抗リン酸化ＡＬＫ抗体を用いたイムノブロッティングにより、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドｖ２の蛋白質発現及びチロシンリン酸化レベルを測定した。

その結果、抗ＡＬＫ抗体を用いたイムノブロッティングでは、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドｖ２として予想される約１６０ｋＤａの位置にバンドが確認でき、全てのサンプル中のＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドｖ２の蛋白発現量自体がほぼ一定であることが示された。また、抗リン酸化ＡＬＫ抗体を用いたイムノブロッティングでも同じ位置にバンドが確認できた。実施例７（２）と同様に定量化してリン酸化量を算出した。化合物によるリン酸化の抑制率は、化合物未添加（化合物の溶媒であるＤＭＳＯ添加）時の値を抑制率０％として、また、空ベクターのｐｃＤＮＡ３導入した時の値を抑制率１００％として、各化合物添加時のリン酸化量から算出した。その結果、各化合物は２９３ＥＢＮＡ細胞内のＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドｖ２のキナーゼ活性を明らかに抑制した（表６）。また、ｖ２発現３Ｔ３細胞（実施例１０(２)）に化合物Ａ〜Ｄ、又はDMSOを１０μＭ又は１０ｎＭ濃度で添加して実施例７（４−２）と同様にＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドｖ２のチロシンリン酸化量及びＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドｖ２の総蛋白質量を測定し、各化合物の細胞内キナーゼ活性抑制率を算出した。各化合物はｖ２発現３Ｔ３細胞内のＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドｖ２のキナーゼ活性を明らかに抑制した（表６）。

化合物Ａ及びＢを５０％以上ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドｖ２の活性を抑制する濃度が１０μＭ以下の物質として、化合物Ｃ及びＤを５０％以上ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドｖ２の活性を抑制する濃度が０．１μＭ以下の物質として選択することができ、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドｖ１と同様に、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドｖ２を用いても、本発明のポリペプチドの活性を抑制する物質のスクリーニング（細胞型スクリーニング）が可能であることが確認された。

（４）ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドｖ2発現細胞に対するＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチド抑制剤の足場非依存的細胞増殖抑制作用
ｖ２発現３Ｔ３細胞（実施例１０（２））を用いて、実施例８（３）と同様の方法で実施した。その結果、全ての化合物はｖ２発現３Ｔ３細胞に対して増殖抑制活性を示した。Ｄａｙ０、Ｄａｙ３の細胞数をそれぞれ１００％抑制、０％抑制として化合物の抑制率を算出した（表7）。

以上の結果から、化合物Ａ〜ＤはＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドｖ２のキナーゼ活性を抑制することにより、ｖ２発現３Ｔ３細胞の足場非依存的細胞増殖を抑制したことが示された。

[実施例１１] 本発明のポリペプチドｖ３型の解析
（１）臨床検体でのＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリヌクレオチド３の検出と遺伝子の単離
実施例３（１）の肺癌臨床検体由来75例のｃＤＮＡおよび定量的ＰＣＲキットを用い、配列番号131及び配列番号82で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーとして、ＰＣＲ（５０℃ ２分、９５℃ １５分の後、９４℃ １５秒、６０℃ ３０秒、７２℃ ９０秒を５０サイクル）を行った。その結果、2例において、EML4-ALK融合ポリヌクレオチドｖ１及びEML4-ALK融合ポリヌクレオチドｖ２とは異なる融合点を有する、ＥＭＬ４遺伝子の一部とＡＬＫ遺伝子の一部とが融合した５１５ｂｐ（配列番号86）及び５４８ｂｐ（配列番号90）の配列が増幅されたことがわかった。

上記のＰＣＲ産物陽性の患者由来ｃＤＮＡを鋳型として、配列番号94及び配列番号46で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーとして、ＤＮＡポリメラーゼ（ＰｒｉｍｅＳｔａｒ ＨＳ ＤＮＡポリメラーゼ）を用いてＰＣＲ（９８℃ １０秒、６８℃ ６分を３５サイクル）行い、増幅産物をｐＴ７Ｂｌｕｅ−２にクローニングしたところ、ＥＭＬ４遺伝子の開始コドンＡＴＧからイントロン６の一部までの７００塩基と、ＡＬＫ遺伝子エキソン２１からエキソン３０の停止コドンまでの１６９１塩基からなる新規なポリヌクレオチド（配列番号１２９）が取得できた。これによりコードされる配列を配列番号130に示す。本明細書では、配列番号130で表されるポリペプチドをＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドｖ３と称し、配列番号130で表されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリヌクレオチドｖ３と称している。配列番号１２９で表されるｃＤＮＡをクローニングしたプラスミドを、ＥＭＬ４−ＡＬＫｖ３／ｐＴ７Ｂｌｕｅ−２と命名した。

（２）ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドｖ３の腫瘍形成能の検討
ＥＭＬ４−ＡＬＫｖ３／ｐＴ７Ｂｌｕｅ−２より実施例４（１）の方法に従い、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドｖ３発現ベクター（ＥＭＬ４−ＡＬＫｖ３／ｐＭＸＳと命名）を構築した。また、実施例４の方法に従い、ＥＭＬ４−ＡＬＫｖ３／ｐＴ７Ｂｌｕｅ−２を利用して、Ｎ末端にＦＬＡＧタグが付加されたＥＭＬ４−ＡＬＫｖ３とＣＤ８の両方を発現するベクター（ＦＬＡＧ−ＥＭＬ４−ＡＬＫｖ３／ｐＭＸ−ｉｒｅｓＣＤ８と命名）を構築した。

上記のＥＭＬ４−ＡＬＫｖ３／ｐＭＸＳを導入した３Ｔ３細胞をヌードマウスの皮下に５×１０^６個ずつ接種し２０日後には腫瘍形成が確認された。ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドｖ３が腫瘍形成能を持っていたことからＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリヌクレオチドｖ３の一つである配列番号129で表されるポリヌクレオチドは癌の原因遺伝子であることが示された。以下、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドｖ３発現プラスミドを導入し、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドｖ３を発現している３Ｔ３細胞をｖ３発現３Ｔ３細胞と称する。

（３）ＥＭＬＡ−ＡＬＫ融合ポリヌクレオチドｖ３のｍＲＮＡを検出する方法
鋳型としてＥＭＬ４−ＡＬＫｖ３を発現するプラスミドを１ｎｇ用い、プライマーセットとして配列番号132と配列番号６２、配列番号133と配列番号６４、配列番号134と配列番号６６、配列番号135と配列番号６８、配列番号136と配列番号７０、配列番号137と配列番号７２、配列番号138と配列番号７４、配列番号139と配列番号７６、配列番号140と配列番号７８、及び配列番号141と配列番号８０のプライマーセットをそれぞれ用いて、ＤＮＡポリメラーゼ（ｒＴａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；タカラバイオ）によりＰＣＲ（９４℃１５秒、５５℃３０秒、７２℃１分を３０サイクル）を行った。その結果、全てのプライマーセットにおいて、それぞれ期待されるサイズの単一のＤＮＡ断片が増幅された。以上の結果から、被験者から得た試料から抽出したｍＲＮＡを鋳型としてＲＴ−ＰＣＲを本実施例に従って行うことにより、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリヌクレオチドｖ３の存在を検出することが可能であることがわかった。

（４）ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドｖ３抑制剤のスクリーニング
ＦＬＡＧ−ＥＭＬ４−ＡＬＫｖ３／ｐＭＸ−ｉｒｅｓＣＤ８を利用して、実施例１、実施例５（１）及び実施例７（１）の方法に従い、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドｖ３を取得した。

実施例７（２）の方法により、上記で精製したＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドｖ３のインビトロキナーゼ活性を検出することが可能であった。ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドｖ３のインビトロキナーゼ活性に対する化合物Ａ〜Ｄの抑制作用を実施例７（３）の方法により試験した。その結果、精製ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドｖ３の自己リン酸化活性及びペプチド基質に対するリン酸化活性を化合物Ａ〜Ｄが抑制すること見出した（表８）。これらの化合物をＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドｖ３を抑制する物質として選択することができた。

以上より、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドｖ３を取得しインビトロキナーゼ活性を指標とすることで、本発明のポリペプチドの活性を抑制する物質のスクリーニング（インビトロ型スクリーニング）が可能であることが示された。

（５）ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドｖ３の細胞内自己リン酸化活性を抑制する物質のスクリーニング
ｖ３発現３Ｔ３細胞（実施例１１(２)）にDMSO(コントロール)又は化合物Ａ〜Ｄを１０μＭ又は１０ｎＭ濃度で添加して実施例７（４−２）と同様にＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドｖ３のチロシンリン酸化量及びＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドｖ３の総蛋白質量を測定し、各化合物の細胞内キナーゼ活性抑制率を算出した。抗ＡＬＫ抗体を用いたイムノブロッティングでは、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドｖ３として予想される約９０ｋＤａの位置に全てのサンプルでほぼ一定量のバンドが確認できた。また、抗リン酸化ＡＬＫ抗体を用いたイムノブロッティングでも同じ位置にバンドが確認できた。

各化合物はｖ３発現３Ｔ３細胞内のＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドｖ３のキナーゼ活性を明らかに抑制した（表９）。ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドｖ３を用いて、本発明のポリペプチドの活性を抑制する物質のスクリーニング（細胞型スクリーニング）が可能であることがわかった。

（６）ｖ３発現３T３細胞に対するＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチド抑制剤の足場非依存的細胞増殖抑制作用
ｖ３発現３T３細胞（実施例１１(２)）を用いて、実施例８（３）と同様の方法でＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチド抑制剤（化合物Ａ〜Ｄ）の足場非依存的細胞増殖抑制作用を試験した。その結果、全ての化合物はｖ３発現３Ｔ３細胞に対して増殖抑制活性を示した（表１０）。

以上の結果から、化合物Ａ〜ＤはＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドｖ３のキナーゼ活性を抑制することにより、ｖ３発現３Ｔ３細胞の足場非依存的細胞増殖を抑制したことが示された。

（７）ＮＣＩ−Ｈ２２２８細胞での本発明のポリヌクレオチドｖ３型ｍＲＮＡの発現とクローニング
ヒト非小細胞肺癌細胞株ＮＣＩ−Ｈ２２２８細胞（アメリカンタイプカルチャーコレクション）の全ＲＮＡから逆転写反応により作製したｃDNAを鋳型として、配列番号94及び配列番号46で表されるオリゴヌクレオチドをプライマーとして、ＤＮＡポリメラーゼ（ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳＤＮＡポリメラーゼ；タカラバイオ）を用いてＰＣＲ（９８℃１０秒、６８℃４分を３５サイクル）を行った。さらに、得られたＰＣＲ産物の一部を鋳型として、ＥＭＬ４遺伝子の開始コドンＡＴＧの５’末端側に制限酵素ＨｉｎｄIIIの切断配列を付加した配列番号105で表されるオリゴヌクレオチドと、ＡＬＫ遺伝子の終始コドンＴＧＡの3’末端側に制限酵素ＸｂａＩの切断配列を付加した配列番号106で表されるオリゴヌクレオチドをプライマーとして、ＤＮＡポリメラーゼ（ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳＤＮＡポリメラーゼ；タカラバイオ）を用いてＰＣＲ（９８℃１０秒、６８℃４分を３５サイクル）を行い、約２４００ｂｐのＰＣＲ産物を得た。この産物をＴＯＰＯ ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇキット（インビトロジェン社）を用いてｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクターにＴＡクローニングして塩基配列を解析した。その結果、2種類のポリヌクレオチドを同定した。一つは、配列番号129（実施例１１（１））とは4塩基（配列番号129の第685番、903番、2000番、2115番）異なる配列からなる２３９１塩基（配列番号107）であった。配列番号107で表されるポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド（配列番号108）は、配列番号130で表されるポリペプチドとは、3アミノ酸（配列番号130の第229番、667番、705番）異なっていた。他方は、ＥＭＬ４遺伝子の開始コドンＡＴＧからエキソン６までの６６７塩基とＡＬＫ遺伝子エキソン２１からエキソン３０の停止コドンまでの１６９１塩基からなる２３５８塩基（配列番号１０９）であった。この配列は、配列番号129とは、3塩基（配列番号129の第903番、2000番、2115番）の置換があり、33塩基（配列番号129の第668番〜700番）の欠失がある点で異なっていた。配列番号109で表されるポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド（配列番号110）は、配列番号130で表されるポリペプチドとは、2アミノ酸の置換（配列番号130の第667番、705番）及び11アミノ酸（配列番号130の第223番〜233番）の欠失がある配列からなるポリペプチドであり、配列番号130で表されるポリペプチドと98.4％の同一性を示していた。これらのALK遺伝子由来の部分は、ALK遺伝子としてGenbankに登録されているNM_004304の配列（4080番〜5770番）と1塩基違いであった。この違いによるアミノ酸置換は起こらない。このことから、肺癌患者において同定したポリヌクレオチド（配列番号129）とNCI-H2228からクローニングしたポリヌクレオチド（配列番号107）のＡＬＫ遺伝子部分の違いは遺伝子配列多型である可能性が示唆された。

なお、NCI-H2228細胞には、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドｖ１又はＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドｖ２をコードするポリヌクレオチドはいずれも発現していなかった。

（８）NCI-H2228細胞での本発明のポリペプチドｖ３型の自己リン酸化活性を抑制する物質のスクリーニング
NCI-H2228細胞にDMSO(コントロール)又は化合物Ｃを最終濃度１００ｎＭとなるように添加して実施例１１（５）と同様に融合ポリペプチドのチロシンリン酸化量を測定し、化合物Cの自己リン酸化活性抑制率を算出した。化合物ＣはNCI-H2228細胞内の本発明のポリペプチドｖ３型のキナーゼ活性を81％抑制した。以上より、NCI-H2228細胞の自己リン酸化を指標とすることで本発明のポリペプチドの活性を抑制する物質のスクリーニング（細胞型スクリーニング）が可能であることが明らかとなった。

（９）NCI-H2228細胞に対するＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチド抑制剤の足場非依存的細胞増殖抑制作用
NCI-H2228細胞にDMSO(コントロール)又は化合物Ａ〜Ｄを最終濃度１０μＭ又は１０ｎＭとなるように添加して５日間培養した以外は実施例８（３）と同様の方法で実施した。その結果、化合物Ａ〜Ｄの化合物はNCI-H2228細胞に対して増殖抑制活性を示した。Ｄａｙ０、Ｄａｙ５の細胞数をそれぞれ１００％抑制、０％抑制として化合物の抑制率を算出した（表１１）。

化合物Ａ〜Ｄはヒト非小細胞肺癌細胞株NCI-H2228細胞で発現する本発明のポリペプチドｖ３型の自己リン酸化（キナーゼ）活性を抑制することにより、NCI-H2228細胞の足場非依存的細胞増殖を抑制したことが示された。以上の結果より、本発明のポリヌクレオチド陽性の肺癌患者に対し、本発明のポリペプチドの抑制剤が本発明のポリヌクレオチドを発現する肺癌に対する治療薬として有用であることが明らかとなった。

本発明のポリペプチド、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、該発現ベクターで形質転換された細胞は、本発明のポリペプチドを抑制する物質（即ち、本発明のポリヌクレオチド陽性の癌治療剤）のスクリーニングに有用である。本発明のポリヌクレオチド又は蛋白質の検出方法は、本明細書の融合遺伝子陽性の癌患者の判定に有用である。本発明の検出用キット及びプライマーセットは前記検出方法に用いることができる。本発明のポリヌクレオチドもまたそれ自体、プローブとして及びコントロールテンプレートとして検出方法に用いることができる。

ＰＣＲの結果を示す。左レーン（４６，ＸＸ）は健常人由来ゲノムＤＮＡを基質とした場合の結果を、右レーン（ＩＤ＃３３）は癌患者由来のゲノムＤＮＡを基質とした場合の結果を示す。 肺がん患者検体におけるＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリヌクレオチドのスクリーニングの結果を示す図である。レーン「４６，ＸＸ」は健常女性末梢血単核球、「ＩＤ＃２」〜「ＩＤ＃４２」は肺がん患者切除標本から得た試料を用いた結果を示す。またレーン「ＮＴＣ」は基質ｃＤＮＡを加えない状態での結果を示す。レーン「Ｍａｒｋｅｒ」は、サイズマーカーＤＮＡを泳動したレーンをを示す（上段）。ＧＡＰＤＨ ｃＤＮＡを増幅した結果を下段に示す。各症例の性別（Ｍ、男性；Ｆ、女性）、病理型（Ｓ， ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌｃａｒｃｉｎｏｍａ； Ａ， ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ； ＡＳ， ａｄｅｎｏｓｑｕａｍｏｕｓ ｃａｒｃｉｎｏｍａ； Ｂ， ｂｒｏｎｃｈｉｏｌｏ−ａｌｅｖｅｏｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、ＥＧＦＲ変異の有無および喫煙歴の有無についてそれぞれ図上部に示す。 遺伝子の腫瘍形成能を示す図である。図上段（３Ｔ３）は、空ベクター（Ｖｅｃｔｏｒ）、全長ＡＬＫ/ｐＭＸＳ（ＡＬＫ）、ＥＭＬ４−ＡＬＫｖ１／ｐＭＸＳ（ＥＭＬ４−ＡＬＫ）又はＥＭＬ４−ＡＬＫ（Ｋ５８９Ｍ）／ｐＭＸＳ発現プラスミドを導入した場合の３Ｔ３繊維芽細胞を示している。スケールバーは100μmを示す。図下段（Ｎｕｄｅ ｍｉｃｅ）は、各３Ｔ３繊維芽細胞株をヌードマウスに接種した結果を示す。 細胞内自己リン酸化に対するＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチド抑制剤（化合物Ａ）の抑制作用を示す図である。「ＫＭ」はＥＭＬ４−ＡＬＫ（Ｋ５８９Ｍ）発現細胞を用いた場合を、「ＥＡ」はｖ１発現ＢＡ／Ｆ３細胞を用いた場合を示している。「αｐ−ＡＬＫ」（上段パネル）は抗リン酸化ＡＬＫ抗体でイムノブロットしたときの結果を、「αＦＬＡＧ」（下段パネル）は抗ＦＬＡＧ抗体でイムノブロットしたときの結果を示す。 ＣＤ８蛋白のみ（ＣＤ８）、あるいはＣＤ８と共にＡＬＫ（ＡＬＫ）、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ポリペプチドｖ１（ＥＡ）又はＥＭＬ４−ＡＬＫ（Ｋ５８９Ｍ）（ＫＭ）を発現する細胞のＩＬ−３の存在下（＋ＩＬ−３）又は非存在下（−ＩＬ−３）での増殖能を示す図である。図の横軸は時間経過（Ｄａｙｓ）を、縦軸は細胞数（Ｃｅｌｌ ｎｕｍｂｅｒ）を示す。 （ａ）ＣＤ８のみ発現するＢＡ／Ｆ３細胞に各濃度の化合物Ａを添加してＩＬ−３存在下で培養した際の細胞数の経時的変化を示す。（ｂ）ＩＬ−３非存在下でｖ１発現ＢＡ／Ｆ３細胞を培養した際の各濃度の化合物Ａ添加による細胞数の経時的変化を示す。図の横軸は時間経過（Ｄａｙｓ）を、縦軸は細胞数（Ｃｅｌｌ ｎｕｍｂｅｒ）を示す。 siRNA1〜siRNA9を示す。

Claims (13)

1. 被験者から得た試料中の、下記（１）乃至（３）に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド又は該ポリペプチドの存在を検出する工程を含むことを特徴とする、エキノダームマイクロチューブルアソシエートプロテインライク４（ＥＭＬ４）遺伝子とアナプラスチックリンフォーマキナーゼ（ＡＬＫ）遺伝子との融合遺伝子又は該融合遺伝子によってコードされる融合蛋白質の検出方法。
   （１）配列番号２、配列番号７又は配列番号１３０で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、キナーゼ活性を有するポリペプチド、あるいは、配列番号２、配列番号７又は配列番号１３０で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、しかもキナーゼ活性を有するポリペプチド、
   （２）配列番号２、配列番号７又は配列番号１３０で表されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかもキナーゼ活性を有するポリペプチド、並びに、
   （３）配列番号２、配列番号７又は配列番号１３０で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
2. 被験者から得た試料中の、下記（１）乃至（３）に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド又は該ポリペプチドの存在を検出する工程を含むことを特徴とする、エキノダームマイクロチューブルアソシエートプロテインライク４（ＥＭＬ４）遺伝子とアナプラスチックリンフォーマキナーゼ（ＡＬＫ）遺伝子との融合遺伝子又は該融合遺伝子によってコードされる融合蛋白質の検出方法。
   （１）配列番号２、配列番号７又は配列番号１３０で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、キナーゼ活性を有するポリペプチド、あるいは、配列番号２又は配列番号７で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、しかもキナーゼ活性を有するポリペプチド、
   （２）配列番号２又は配列番号７で表されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかもキナーゼ活性を有するポリペプチド、並びに、
   （３）配列番号２、配列番号７又は配列番号１３０で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
3. 被験者から得た試料中の、下記（１）乃至（３）に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド又は該ポリペプチドの存在を検出する工程を含むことを特徴とする、エキノダームマイクロチューブルアソシエートプロテインライク４（ＥＭＬ４）遺伝子とアナプラスチックリンフォーマキナーゼ（ＡＬＫ）遺伝子との融合遺伝子又は該融合遺伝子によってコードされる融合蛋白質の検出方法。
   （１）配列番号２又は配列番号７で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、キナーゼ活性を有するポリペプチド、あるいは、配列番号２又は配列番号７で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、しかもキナーゼ活性を有するポリペプチド、
   （２）配列番号２又は配列番号７で表されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかもキナーゼ活性を有するポリペプチド、並びに、
   （３）配列番号２又は配列番号７で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
4. 被験者から得た試料中の、請求項１乃至３の（１）乃至（３）に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの存在を検出する工程を含むことを特徴とする、請求項１乃至３の融合遺伝子の検出方法。
5. 被験者から得た試料中の、請求項１乃至３の（１）乃至（３）に記載のポリペプチドの存在を検出する工程を含むことを特徴とする、請求項１乃至３の融合蛋白質の検出方法。
6. 請求項１乃至３の（１）乃至（３）に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを特異的に増幅できるように設計したセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを含む、ＥＭＬ４遺伝子とＡＬＫ遺伝子との融合遺伝子の検出用キット。
7. ＥＭＬ４遺伝子をコードする部分から設計されるセンスプライマー及びＡＬＫをコードする部分から設計されるアンチセンスプライマーを含む、ＥＭＬ４遺伝子とＡＬＫ遺伝子との融合遺伝子を検出するためのプライマーセットであって、下記ａ）〜ｃ)からなる群より選択されるプライマーセット；
   ａ）請求項１に記載のポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子からなるアンチセンスプライマー及び該ポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸分子からなるセンスプライマーを含むプライマーセット、
   ｂ）配列番号４で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子からなるアンチセンスプライマー及び該ポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸分子からなるセンスプライマーを含むプライマーセット、
   ｃ）配列番号５で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子からなるアンチセンスプライマー及び該ポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸分子からなるセンスプライマーを含むプライマーセット。
8. ＥＭＬ４遺伝子をコードする部分から設計されるセンスプライマー及びＡＬＫをコードする部分から設計されるアンチセンスプライマーを含む、ＥＭＬ４遺伝子とＡＬＫ遺伝子との融合遺伝子を検出するためのプライマーセットであって、下記ａ）〜ｃ)からなる群より選択されるプライマーセット；
   ａ）請求項３に記載のポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子からなるアンチセンスプライマー及び該ポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸分子からなるセンスプライマーを含むプライマーセット、
   ｂ）配列番号４で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子からなるアンチセンスプライマー及び該ポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸分子からなるセンスプライマーを含むプライマーセット、
   ｃ）配列番号５で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子からなるアンチセンスプライマー及び該ポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸分子からなるセンスプライマーを含むプライマーセット。
9. 配列番号１又は配列番号６で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子からなるアンチセンスプライマー及び該ポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸分子からなるセンスプライマーを含むプライマーセットである、請求項７又は８のプライマーセット。
10. 配列番号１の塩基番号２７１から１７５９間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号１の塩基番号１７６０から３４４７間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセットであって、センスプライマーとアンチセンスセンスプライマーにより増幅される増幅産物の大きさが１ｋｂ以下である前記プライマーセット又はその相補鎖からなるプライマーセット。
11. 配列番号６の塩基番号１から２２４２の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号６の塩基番号２２４３から３９３３の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセットであって、センスプライマーとアンチセンスセンスプライマーにより増幅される増幅産物の大きさが１ｋｂ以下である前記プライマーセット又はその相補鎖からなるプライマーセット。
12. 配列番号４の塩基番号１から３６２９間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号４の塩基番号３６３０から３９７９間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセットであって、センスプライマーとアンチセンスセンスプライマーにより増幅される増幅産物の大きさが１ｋｂ以下である前記プライマーセット又はその相補鎖からなるプライマーセット。
13. 配列番号５の塩基番号１から５７９の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号５の塩基番号５８０から８５３の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット又はその相補鎖からなるプライマーセット。

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