JPWO2015064620A1 - 新規融合体及びその検出法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、ZSCAN9の少なくとも一部を含む新規の融合タンパク質又は該融合タンパク質をコードする融合遺伝子、及びそれらの検出方法に関する。
例えば、チロシンキナーゼ阻害剤のイレッサやタルセバの登場により、分子診断とがん治療効果の関係について、臨床で示されつつあり、分子診断による適応患者の選別により、患者を層別化した上での治療薬投与というコンセプトが広がりつつある。
ZSCAN9(zinc finger and SCAN domain containing 9、ZNF193(zinc finger protein 193)ともいう。)は、krueppel C2H2-type zinc-finger タンパクファミリーに属し、5つのC2H2-type zinc fingerドメインと、1つのSCAN box domainを有する細胞内タンパクである(非特許文献5)。当該遺伝子が融合遺伝子を構成することは知られていない。
本発明者は、これらの知見から、ALK融合タンパク質又は当該タンパク質をコードする融合遺伝子の検出方法を提供し(実施例4〜7)、そのためのキット及びプライマーセットを提供し、この融合タンパク質又は当該融合タンパク質をコードする融合遺伝子を検出することにより、ALK阻害物質を用いた薬物治療の対象となるがん患者を判別することを可能とし、当該がん患者にALK阻害物質を投与する工程を含む、がんの治療方法を提供する。
本発明者は、これらの知見から、ZSCAN9融合タンパク質又は当該タンパク質をコードする融合遺伝子の検出方法を提供し(実施例4〜7)、そのためのキット及びプライマーセットを提供し、この融合タンパク質又は当該融合タンパク質をコードする融合遺伝子を検出することにより、ZSCAN9融合タンパク質阻害物質を用いた薬物治療の対象となるがん患者を判別することを可能とし、当該がん患者にZSCAN9融合タンパク質阻害物質を投与する工程を含む、がんの治療方法を提供する。
[1]ZSCAN9融合タンパク質。
[2]ZSCAN9とALKとの融合タンパク質。
[3]以下の(a)〜(d)からなる群から選択されるポリペプチドである、[1]に記載の融合タンパク質:
(a)配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(b)配列番号2で表されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、
(c)配列番号2で表されるアミノ酸配列との同一性が80%以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、及び
(d)配列番号2で表されるアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び/若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド。
[4][1]〜[3]のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
[5][4]に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
[6][5]に記載のベクターで形質転換された細胞。
[7]被験者から得た試料中の、ZSCAN9融合タンパク質又は該融合タンパク質をコードする融合遺伝子の検出方法。
[8]前記検出方法が、ZSCAN9タンパク質の切断、又は、ZSCAN9タンパク質をコードする遺伝子の切断、を検出する工程を含む、[7]に記載の検出方法。
[9]前記検出方法が、ZSCAN9タンパク質とそれ以外の他のタンパク質とから構築される融合タンパク質の存在、又は、前記融合タンパク質をコードする融合遺伝子の存在、を検出する工程を含む、[7]に記載の検出方法。
[10]前記融合タンパク質が、ZSCAN9タンパク質とALKタンパク質との融合タンパク質である、[7]〜[9]のいずれか一項に記載の検出方法。
[11]前記融合タンパク質が、以下の(a)〜(d)からなる群から選択されるポリペプチドである、[7]〜[10]のいずれか一項に記載の検出方法:
(a)配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(b)配列番号2で表されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、
(c)配列番号2で表されるアミノ酸配列との同一性が80%以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、及び
(d)配列番号2で表されるアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び/若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド。
[12]前記ZSCAN9融合遺伝子が、[3]に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである、[7]〜[11]のいずれか一項に記載の検出方法。
[13]前記融合遺伝子が、DNA又はmRNAである、[7]〜[12]のいずれか一項に記載の検出方法。
[14]前記試料が、消化器由来試料である、[7]〜[13]のいずれか一項に記載の検出方法。
[15]前記消化器が、消化管由来試料である、[14]に記載の検出方法。
[16]前記消化器が、下部消化管である、[14]に記載の検出方法。
[17]前記消化器が、大腸である、[14]に記載の検出方法。
[18]ZSCAN9遺伝子5’末端側ゲノム領域を特異的に認識できる第1のプローブと、ZSCAN9遺伝子3’末端側ゲノム領域を特異的に認識できる第2のプローブとを含む、ZSCAN9融合遺伝子の検出用キット。
[19]ZSCAN9遺伝子と共にZSCAN9融合遺伝子を構成する他の遺伝子の3’末端側ゲノム領域を特異的に認識できる第1のプローブと、ZSCAN9遺伝子5’末端側ゲノム領域を特異的に認識できる第2のプローブとを含む、ZSCAN9融合遺伝子の検出用キット。
[20]ZSCAN9タンパク質をコードするポリヌクレオチドの、5’末端側領域を特異的に増幅できるように設計したセンスプライマー及びアンチセンスプライマー、ならびに、前記ポリヌクレオチドの3’末端側領域を特異的に増幅できるように設計したセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを含む、ZSCAN9融合遺伝子の検出用キット。
[21]ZSCAN9タンパク質とALKタンパク質との融合タンパク質であるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを特異的に増幅できるように設計したセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを含む、ZSCAN9−ALK融合遺伝子の検出用キット。
[22]以下の(a)〜(d)からなる群から選択されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを特異的に増幅できるように設計したセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを含む、ZSCAN9−ALK融合遺伝子の検出用キット:
(a)配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(b)配列番号2で表されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、
(c)配列番号2で表されるアミノ酸配列との同一性が80%以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、及び
(d)配列番号2で表されるアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び/若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド。
[23]ZSCAN9タンパク質のN末端側領域を特異的に認識できる抗ZSCAN9抗体、及び、ZSCAN9タンパク質のC末端側領域を特異的に認識できる抗ZSCAN9抗体を含む、ZSCAN9融合タンパク質の検出用キット。
[24]ZSCAN9タンパク質と共にZSCAN9融合タンパク質を構成する他のタンパク質のC末端側領域のポリペプチドに特異的に結合する抗体と、ZSCAN9タンパク質のN末端側領域のポリペプチドに特異的に結合する抗体を含む、ZSCAN9融合タンパク質の検出用キット。
[25]前記他のタンパク質が、ALKタンパク質である、[24]に記載のキット。
[26]ZSCAN9タンパク質をコードするポリヌクレオチド部分から設計されるセンスプライマー及びALKタンパク質をコードするポリヌクレオチド部分から設計されるアンチセンスプライマーを含む、ZSCAN9遺伝子とALK遺伝子との融合遺伝子を検出するためのプライマーセットであって、アンチセンスプライマーは[22]に記載のポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でアニールする核酸分子からなり、センスプライマーは[22]に記載のポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件でアニールする核酸分子からなるプライマーセット。
[27]ZSCAN9遺伝子とALK遺伝子との融合遺伝子を検出するためのプライマーセットであって、配列番号1に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でアニールする核酸分子からなるアンチセンスプライマー及び該ポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件下でアニールする核酸分子からなるセンスプライマーを含むプライマーセット。
[28]配列番号1の塩基番号1から568間の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号1の塩基番号569から2259間の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマー、あるいは、配列番号12の塩基番号1から716間の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号12の塩基番号717から2857間の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーを含む、プライマーセット。
[29](1)[3]に記載のポリペプチド、又は前記ポリペプチドを発現している細胞に試験物質を接触させる工程、
(2)前記ポリペプチドの活性及び/又は発現が阻害されるか否かを分析する工程、及び
(3)前記ポリペプチドの活性及び/又は発現を阻害する物質を選択する工程
を含む、前記ポリペプチドの活性及び/又は発現を阻害する物質をスクリーニングする方法。
[30]前記ポリペプチドの活性及び/又は発現を阻害する物質が、ZSCAN9融合体陽性のがんの治療剤である、[29]に記載のスクリーニング方法。
[31]前記がんが消化器がんである、[29]又は[30]に記載のスクリーニング方法。
[32]前記がんが消化管がんである、[29]又は[30]に記載のスクリーニング方法。
[33]前記がんが下部消化管がんである、[29]又は[30]に記載のスクリーニング方法。
[34]前記がんが大腸がんである、[29]又は[30]に記載のスクリーニング方法。
[35]ZSCAN9融合タンパク質の活性及び/又は発現を阻害する物質を含有する、ZSCAN9融合体陽性のがんの治療用医薬組成物。
[36]前記ZSCAN9融合タンパク質の活性及び/又は発現を阻害する物質が、キナーゼ阻害剤である、[35]に記載の医薬組成物。
[37]前記ZSCAN9融合タンパク質が、[3]に記載のポリペプチドである、[35]又は[36]に記載の医薬組成物。
[38]前記がんが消化器がんである、[35]〜[37]のいずれか一項に記載の医薬組成物。
[39]前記がんが消化管がんである、[35]〜[37]のいずれか一項に記載の医薬組成物。
[40]前記がんが下部消化管がんである、[35]〜[37]のいずれか一項に記載の医薬組成物。
[41]前記がんが大腸がんである、[35]〜[37]のいずれか一項に記載の医薬組成物。
[42]ALK融合タンパク質。
[43]ZSCAN9とALKとの融合タンパク質。
[44]以下の(a)〜(d)からなる群から選択されるポリペプチドである、[42]に記載の融合タンパク質:
(a)配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(b)配列番号2で表されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、
(c)配列番号2で表されるアミノ酸配列との同一性が80%以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、及び
(d)配列番号2で表されるアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び/若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド。
[45][42]〜[44]のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
[46][45]に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
[47][46]に記載のベクターで形質転換された細胞。
[48]被験者から得た試料中の、ALK融合タンパク質又は該融合タンパク質をコードする融合遺伝子の検出方法。
[49]前記検出方法が、ALKタンパク質の切断、又は、ALKタンパク質をコードする遺伝子の切断、を検出する工程を含む、[48]に記載の検出方法。
[50]前記検出方法が、ALKタンパク質とそれ以外の他のタンパク質とから構築される融合タンパク質の存在、又は、前記融合タンパク質をコードする融合遺伝子の存在、を検出する工程を含む、[48]に記載の検出方法。
[51]前記融合タンパク質が、ZSCAN9タンパク質とALKタンパク質との融合タンパク質である、[48]〜[50]のいずれか一項に記載の検出方法。
[52]前記融合タンパク質が、以下の(a)〜(d)からなる群から選択されるポリペプチドである、48〜51のいずれか一項に記載の検出方法:
(a)配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(b)配列番号2で表されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、
(c)配列番号2で表されるアミノ酸配列との同一性が80%以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、及び
(d)配列番号2で表されるアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び/若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド。
[53]前記ALK融合遺伝子が、[44]に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである、[48]〜[52]のいずれか一項に記載の検出方法。
[54]前記融合遺伝子が、DNA又はmRNAである、[48]〜[53]のいずれか一項に記載の検出方法。
[55]前記試料が消化器である、[48]〜[54]のいずれか一項に記載の検出方法。
[56]前記消化器が、消化管である、[55]に記載の検出方法。
[57]前記消化器が、下部消化管である、[55]に記載の検出方法。
[58]前記消化器が、大腸である、[55]に記載の検出方法。
[59]ALK遺伝子5’末端側ゲノム領域を特異的に認識できる第1のプローブと、ALK遺伝子3’末端側ゲノム領域を特異的に認識できる第2のプローブとを含む、ALK融合遺伝子の検出用キット。
[60]ALK遺伝子と共にALK融合遺伝子を構成する他の遺伝子の5’末端側ゲノム領域を特異的に認識できる第1のプローブと、ALK遺伝子3’末端側ゲノム領域を特異的に認識できる第2のプローブとを含む、ALK融合遺伝子の検出用キット。
[61]ALKタンパク質をコードするポリヌクレオチドの、5’末端側領域を特異的に増幅できるように設計したセンスプライマー及びアンチセンスプライマー、ならびに、前記ポリヌクレオチドの3’末端側領域を特異的に増幅できるように設計したセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを含む、ALK融合遺伝子の検出用キット。
[62]ZSCAN9タンパク質とALKタンパク質との融合タンパク質であるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを特異的に増幅できるように設計したセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを含む、ZSCAN9−ALK融合遺伝子の検出用キット。
[63]以下の(a)〜(d)からなる群から選択されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを特異的に増幅できるように設計したセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを含む、ZSCAN9−ALK融合遺伝子の検出用キット:
(a)配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(b)配列番号2で表されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、
(c)配列番号2で表されるアミノ酸配列との同一性が80%以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、及び
(d)配列番号2で表されるアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び/若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド。
[64]ALKタンパク質のN末端側領域を特異的に認識できる抗ALK抗体、及び、ALKタンパク質のC末端側領域を特異的に認識できる抗ALK抗体を含む、ALK融合タンパク質の検出用キット。
[65]ALKタンパク質と共にALK融合タンパク質を構成する他のタンパク質のN末端側領域のポリペプチドに特異的に結合する抗体と、ALKタンパク質のC末端側領域のポリペプチドに特異的に結合する抗体を含む、ALK融合タンパク質の検出用キット。
[66]前記他のタンパク質が、ZSCAN9タンパク質である、[65]に記載のキット。
[67]ZSCAN9タンパク質をコードするポリヌクレオチド部分から設計されるセンスプライマー及びALKタンパク質をコードするポリヌクレオチド部分から設計されるアンチセンスプライマーを含む、ZSCAN9遺伝子とALK遺伝子との融合遺伝子を検出するためのプライマーセットであって、アンチセンスプライマーは[63]に記載のポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でアニールする核酸分子からなり、センスプライマーは[63]に記載のポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件でアニールする核酸分子からなるプライマーセット。
[68]ZSCAN9遺伝子とALK遺伝子との融合遺伝子を検出するためのプライマーセットであって、配列番号1に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でアニールする核酸分子からなるアンチセンスプライマー及び該ポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件下でアニールする核酸分子からなるセンスプライマーを含むプライマーセット。
[69]配列番号1の塩基番号1から568間の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号1の塩基番号569から2259間の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマー、あるいは、配列番号12の塩基番号1から716間の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号12の塩基番号717から2857間の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーを含む、プライマーセット。
[70](1)[44]に記載のポリペプチド、又は前記ポリペプチドを発現している細胞に試験物質を接触させる工程、
(2)前記ポリペプチドの活性及び/又は発現が阻害されるか否かを分析する工程、及び
(3)前記ポリペプチドの活性及び/又は発現を阻害する物質を選択する工程
を含む、前記ポリペプチドの活性及び/又は発現を阻害する物質をスクリーニングする方法。
[71]前記ポリペプチドの活性及び/又は発現を阻害する物質が、ALK融合体陽性のがんの治療剤である、[70]に記載のスクリーニング方法。
[72]前記がんが消化器がんである、[70]又は[71]に記載のスクリーニング方法。
[73]前記がんが消化管がんである、[70]又は[71]に記載のスクリーニング方法。
[74]前記がんが下部消化管がんである、[70]又は[71]に記載のスクリーニング方法。
[75]前記がんが大腸がんである、[70]又は[71]に記載のスクリーニング方法。
[76]ALK融合タンパク質の活性及び/又は発現を阻害する物質を含有する、ALK融合体陽性のがんの治療用医薬組成物。
[77]前記ALK融合タンパク質の活性及び/又は発現を阻害する物質が、キナーゼ阻害剤である、[76]に記載の医薬組成物。
[78]前記ALK融合タンパク質が、[44]に記載のポリペプチドである、[76]又は[77]に記載の医薬組成物。
[79]前記がんが消化器がんである、[76]〜[78]のいずれか一項に記載の医薬組成物。
[80]前記がんが消化管がんである、[76]〜[78]のいずれか一項に記載の医薬組成物。
[81]前記がんが下部消化管がんである、[76]〜[78]のいずれか一項に記載の医薬組成物。
[82]前記がんが大腸がんである、[76]〜[78]のいずれか一項に記載の医薬組成物。
[83]ZSCAN9融合タンパク質の活性及び/又は発現を阻害する物質が、キナーゼ阻害剤である、ZSCAN9融合体陽性のがんの治療方法。
[84]ZSCAN9融合タンパク質の活性及び/又は発現を阻害する物質の、ZSCAN9融合体陽性の癌の治療用医薬組成物の製造への使用。
[85]前記ポリペプチドを発現している細胞が、[6]に記載の形質転換細胞である、[29]〜[34]のいずれかに記載のスクリーニング方法。
[86]ALK融合タンパク質の活性及び/又は発現を阻害する物質が、キナーゼ阻害剤である、ALK融合体陽性のがんの治療方法。
[87]ALK融合タンパク質の活性及び/又は発現を阻害する物質の、ALK融合体陽性の癌の治療用医薬組成物の製造への使用。
[88]前記ポリペプチドを発現している細胞が、[47]に記載の形質転換細胞である、[70]〜[75]のいずれかに記載のスクリーニング方法。
本発明の検出方法は、ZSCAN9融合体陽性のがん(特に消化器がん)を検出する方法として利用できる。また、本発明の検出方法によれば、被験者におけるZSCAN9融合体陽性のがんを診断することができ、更に、ZSCAN9阻害物質の適用対象者であるか否かを判定することができる。本発明の検出用キット及びプライマーセットは、本発明の検出方法に用いることができる。更に、本発明の阻害物質スクリーニング方法によれば、当該融合体陽性のがん患者の治療に有効な薬剤をスクリーニングすることができる。前記スクリーニングにより得られた物質は、ZSCAN9融合体陽性のがんの治療用医薬組成物の有効成分として使用することができ、また、ZSCAN9融合体陽性のがんの治療に用いることができる。
<融合点>
本明細書における「ALK融合遺伝子における融合点」とは、ALK融合遺伝子におけるALK遺伝子由来のポリヌクレオチドと、ALK遺伝子と共に融合遺伝子を構築する他の遺伝子由来のポリヌクレオチドとが結合した箇所を意味する。例えば、配列番号1で表されるZSCAN9−ALK融合遺伝子の場合、塩基配列の第568番塩基と第569番の塩基の結合した箇所である。
本明細書における「ALK融合タンパク質における融合点」とは、ALK融合タンパク質における、ALK遺伝子由来のポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドと、ALK遺伝子と共に融合遺伝子を構築するもう一方の遺伝子由来のポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドとが結合した箇所を意味する。
本明細書における「ZSCAN9融合タンパク質における融合点」とは、ZSCAN9融合タンパク質における、ZSCAN9遺伝子由来のポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドと、ZSCAN9遺伝子と共に融合遺伝子を構築するもう一方の遺伝子由来のポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドとが結合した箇所を意味する。
更に、本明細書において、「ALK遺伝子の切断」又は「ALK遺伝子が切断されている」とは、遺伝子の転座又は逆位等によりALK遺伝子の連続性が失われている状態、すなわち、ALK遺伝子がALKキナーゼ領域を含むポリヌクレオチドと、それ以外のポリヌクレオチドと、の少なくとも2つのポリヌクレオチドとに分かれている状態を指す。なお、ALK遺伝子の切断点(break point)は、ALK遺伝子が切断されてできたポリヌクレオチドの少なくとも一つがコードするタンパク質がALKキナーゼ活性を保持する範囲で限定されない。
また、「ALK遺伝子以外の他の遺伝子の切断」又は「ALK遺伝子以外の他の遺伝子が切断されている」とは、遺伝子の転座又は逆位等により他の遺伝子の連続性が失われている状態、すなわち、他の遺伝子が少なくとも2つのポリヌクレオチドに分かれている状態を指す。
また、「ALKタンパク質以外の他のタンパク質の切断」又は「ALKタンパク質以外の他のタンパク質が切断されている」とは、他の遺伝子が、前述のように切断されている状態であることに基づき、他のタンパク質の連続性が失われている状態、すなわち、他のタンパク質が少なくとも2つのポリペプチドに分かれている状態を指す。
更に、本明細書において、「ZSCAN9遺伝子の切断」又は「ZSCAN9遺伝子が切断されている」とは、遺伝子の転座又は逆位等によりZSCAN9遺伝子の連続性が失われている状態、すなわち、ZSCAN9遺伝子が少なくとも2つのポリヌクレオチドに分かれている状態を指す。なお、ZSCAN9遺伝子の切断点(break point)は、ZSCAN9遺伝子と共にZSCAN9融合遺伝子を構築する他の遺伝子によってコードされるZSCAN9融合タンパク質の腫瘍形成能を保持する範囲で限定されない。
また、「ZSCAN9遺伝子以外の他の遺伝子の切断」又は「ZSCAN9遺伝子以外の他の遺伝子が切断されている」とは、遺伝子の転座又は逆位等により他の遺伝子の連続性が失われている状態、すなわち、他の遺伝子が少なくとも2つのポリヌクレオチドに分かれている状態を指す。
また、「ZSCAN9タンパク質以外の他のタンパク質の切断」又は「ZSCAN9タンパク質以外の他のタンパク質が切断されている」とは、他の遺伝子が、前述のように切断されている状態であることに基づき、他のタンパク質の連続性が失われている状態、すなわち、他のタンパク質が少なくとも2つのポリペプチドに分かれている状態を指す。
5’末端側領域とは、融合遺伝子の場合は、融合点より5’末端側のポリヌクレオチド、野生型遺伝子(融合遺伝子でない遺伝子)の場合は、当該野生型遺伝子が融合遺伝子を構築した場合の、切断点より5’末端側のポリヌクレオチドを示す。なお、5’末端側領域は、ゲノムDNA、mRNA、及びcDNAのいずれにおける領域であってもよく、例えば、ゲノムDNAの場合は、5’末端側ゲノム領域ともいう。
3’末端側領域とは、融合遺伝子の場合は、融合点より3’末端側のポリヌクレオチド、野生型遺伝子(融合遺伝子でない遺伝子)の場合は、当該野生型遺伝子が融合遺伝子を構築した場合の、切断点より3’末端側のポリヌクレオチドを示す。なお、3’末端側領域は、ゲノムDNA、mRNA、及びcDNAのいずれにおける領域であってもよく、例えば、ゲノムDNAの場合は、3’末端側ゲノム領域ともいう。
N末端側領域とは、融合タンパク質の場合は、融合点よりN末端側のポリペプチド、野生型タンパク質(融合タンパク質でないタンパク質)の場合は、当該野生型タンパク質が融合遺伝子を構築した場合の、切断点よりN末端側のポリヌクレオチドを示す。
C末端側領域とは、融合タンパク質の場合は、融合点よりC末端側のポリペプチド、野生型タンパク質(融合タンパク質でないタンパク質)の場合は、当該野生型タンパク質が融合遺伝子を構築した場合の、切断点よりC末端側のポリヌクレオチドを示す。
例えば、配列番号1で表されるZSCAN9−ALK融合遺伝子の場合、5’末端側領域は、第1番〜第568番、3’末端側領域は、第569番〜2259番の塩基配列からなるポリヌクレオチドである。ZSCAN9−ALK融合タンパク質の場合、N末端側領域は、前記5’末端側領域にコードされるポリペプチドであり、C末端側領域は、前記3’末端側領域にコードされるポリペプチドである。
また、本明細書において、各由来遺伝子のcDNAリファレンス配列として、ZSCAN9はENST 00000252207、ALKはENST 00000389048を、タンパク質のアミノ酸リファレンス配列としては、ZSCAN9はENSP00000252207、ALKはENSP00000373700、を用いた。
本明細書における「ストリンジェントな条件」とは、ハイブリダイゼーションのための条件として、「5×SSPE、5×Denhardt’s液、0.5%SDS、50%ホルムアミド、200μg/mL鮭精子DNA、42℃オーバーナイト」、洗浄のための条件として、「0.5×SSC、0.1%SDS、42℃」の条件である。「よりストリンジェントな条件」とは、ハイブリダイゼーションのための条件として、「5×SSPE、5×Denhardt’s液、0.5%SDS、50%ホルムアミド、200μg/mL鮭精子DNA、42℃オーバーナイト」、洗浄のための条件として、「0.2×SSC、0.1%SDS、65℃」の条件である。
あるポリペプチドが「腫瘍形成能を有する」ことは、後述の実施例8の方法で確認することができる。具体的には、当該ポリペプチドを発現するプラスミドを導入した宿主(3T3繊維芽細胞)をヌードマウスの皮下に接種し、腫瘍形成の有無で判断する方法で確認する。
<本発明のポリペプチド(1)>
本発明のポリペプチドは、ALKタンパク質由来のポリペプチドと、ALKタンパク質以外の他のタンパク質由来のポリペプチドと、から構築される融合ポリペプチド(「ALK融合タンパク質」ともいう)であって、前記ALKタンパク質由来のポリペプチドは、ALKタンパク質における少なくともALKキナーゼ領域のポリペプチドを含み、ALKタンパク質以外の他のタンパク質由来のポリペプチドは、他のタンパク質における少なくとも一部のポリペプチドを含む範囲で特に制限されない。
前記他のタンパク質としては、ALKキナーゼドメインを含むALKタンパク質の一部と融合することにより、ALKキナーゼ活性化が恒常的に維持され、構築されたALK融合タンパク質が腫瘍形成能を有するものであれば特に制限されない。
ALK融合タンパク質としては、前記他のタンパク質が、ZSCAN9タンパク質である融合タンパク質が特に好ましい。すなわち、少なくともALKキナーゼ領域のポリペプチドを含む、ALKタンパク質由来のポリペプチドと、ZSCAN9タンパク質の少なくとも一部のポリペプチドとを含む、ZSCAN9遺伝子由来のポリペプチドと、から構築された、ZSCAN9タンパク質とALKタンパク質との融合タンパク質(以下、ZSCAN9−ALK融合タンパク質ともいう)であることが好ましい。
本発明のポリペプチドは、ZSCAN9タンパク質由来のポリペプチドと、ZSCAN9タンパク質以外の他のタンパク質由来のポリペプチドと、から構築される融合ポリペプチド(「ZSCAN9融合タンパク質」ともいう)であって、前記ZSCAN9タンパク質由来のポリペプチドは、ZSCAN9タンパク質における少なくとも一部のポリペプチドを含み、ZSCAN9タンパク質以外の他のタンパク質由来のポリペプチドは、当該他のタンパク質における少なくとも一部のポリペプチドを含む範囲で特に制限されない。
前記他のタンパク質としては、ZSCAN9タンパク質と融合することにより、当該他のタンパク質の有する機能性ドメインの活性化が恒常的に維持され、構築されたZSCAN9融合タンパク質が腫瘍形成能を有するものであれば特に制限されない。
ZSCAN9融合タンパク質としては、前記他のタンパク質が、キナーゼドメインを有するタンパク質である融合タンパク質が好ましく、ALKタンパク質である融合タンパク質が特に好ましい。すなわち、前記他のタンパク質がALKタンパク質である場合、少なくともALKキナーゼ領域のポリペプチドを含む、ALKタンパク質由来のポリペプチドと、ZSCAN9タンパク質の少なくとも一部のポリペプチドとを含む、ZSCAN9遺伝子由来のポリペプチドと、から構築された、ZSCAN9タンパク質とALKタンパク質との融合タンパク質(以下、ZSCAN9−ALK融合タンパク質ともいう)であることが好ましい。
(a)配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(b)配列番号2で表されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、
(c)配列番号2で表されるアミノ酸配列との同一性が80%以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド(以下、相同ポリペプチドと称する)、及び
(d)配列番号2で表されるアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び/又は挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド(以下、機能的等価改変体と称する)。
Gap penalty = 10
Extend penalty = 0.5
Matrix = EBLOSUM62
本発明のポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチド(すなわち、ALK融合タンパク質)をコードするポリヌクレオチド(「ALK融合遺伝子」ともいう)である限り、特に限定されるものではない。なお、「ALK融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド」は、ALK融合遺伝子において翻訳領域のみからなるポリヌクレオチドであっても、ALK融合遺伝子のゲノムDNA全長であっても、ALK融合遺伝子のmRNAやcDNAであってもよい。
本発明のポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチド(すなわち、ZSCAN9融合タンパク質)をコードするポリヌクレオチド(「ZSCAN9融合遺伝子」ともいう)である限り、特に限定されるものではない。なお、「ZSCAN9融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド」は、ZSCAN9融合遺伝子において翻訳領域のみからなるポリヌクレオチドであっても、ZSCAN9融合遺伝子のゲノムDNA全長であっても、ZSCAN9融合遺伝子のmRNAやcDNAであってもよい。
また、本発明のベクターは、前記本発明のポリヌクレオチドを含む限り、特に限定されるものではなく、真核生物又は原核生物の宿主細胞を形質転換できる適当なベクターに当該ポリヌクレオチドを組み込むことにより調製することができる。前記ベクターは、当該ポリヌクレオチドの発現に必要な配列、例えば、プロモーター、エンハンサーを含むことができ、更に、宿主への導入確認に必要な配列、例えば、薬剤耐性遺伝子を含むことができる。
本発明の形質転換細胞は、本発明のベクターにより、適当な宿主細胞、例えば、真核生物又は原核生物の宿主細胞を形質転換することにより調製することができる。本発明の形質転換細胞は、本発明のポリペプチドを製造するのに用いることができる。
<対象臓器>
本発明に係る検出方法は、対象臓器に生じるがんの検出に好適に用いることができる。被験者の被験部位(対象臓器)としては、本発明に係る融合体が存在している範囲で限定されないが、消化器が好ましく、消化管がより好ましく、胃腸が更に好ましく、下部消化管が更に好ましく、大腸が更に好ましい。
より具体的には、本発明に係る検出方法は、消化器がんの検出に好適に、消化管がんの検出により好適に、胃腸がんの検出に更に好適に、下部消化管がんの検出に更に好適に、大腸がんの検出に更に好適に用いることができる。
本発明に係る検出方法における、被験者から得た試料としては、被験者からの採取物(生体から分離した試料)、具体的には、任意の採取された体液(好ましくは血液)、被験者患部からの摘出検体、生検試料又は擦過検体、糞便、尿、消化管洗浄液等を用いることができる。前記消化管洗浄液は、消化管全体の洗浄液であっても、あるいは、少なくとも被験部位を含む消化管の洗浄液、例えば、下部消化管の洗浄液、大腸の洗浄液であってもよい。検出感度を考慮すると、前記対象臓器における被験部位の細胞が含まれる試料が好ましく、被験者の被験部位からの摘出検体又は生検試料が更に好ましい。
本発明に係るALK融合遺伝子、又は、ALK融合タンパク質の検出方法は、被験者から得た試料の組織切片、又は、細胞懸濁液等を作成し、組織切片又は細胞懸濁液に含まれる細胞に対し、当業者に周知の技法により、ALK融合遺伝子、又は、ALK融合タンパク質を検出することにより実施できる。あるいは、前述の被験者から得た試料から、可溶化液を調製し、ここに含まれる遺伝子、又は、タンパク質を抽出し、この抽出試料において、当業者に周知の技法により、ALK融合遺伝子、又は、ALK融合タンパク質を検出してもよい。なお、ALK融合遺伝子の検出とは、ALK融合遺伝子のゲノムDNAの検出、当該ゲノムDNAの転写産物であるmRNA、又は、mRNAを鋳型として得られるcDNAの検出のいずれであってもよい。
<ALK融合体:ALK融合遺伝子とALK融合タンパク質>
本発明の検出方法には、被験者から得た試料中の、ALK融合体の検出方法、すなわち、ALKキナーゼ領域を含む融合タンパク質(ALK融合タンパク質)の検出方法、又は、前記融合タンパク質をコードする融合遺伝子(ALK融合遺伝子)の検出方法が含まれる。
<ZSCAN9融合体:ZSCAN9融合遺伝子とZSCAN9融合タンパク質>
本発明の検出方法には、被験者から得た試料中の、ZSCAN9融合体の検出方法、すなわち、ZSCAN9融合タンパク質の検出方法、又は、前記融合タンパク質をコードする融合遺伝子(ZSCAN9融合遺伝子)の検出方法が含まれる。
本発明の検出方法には、被験者から得た消化器由来試料中の、ALK遺伝子の切断、又は、ALK遺伝子にコードされるポリペプチドの切断、を検出する工程を含む検出方法と、被験者から得た消化器由来試料中の、ALK遺伝子とそれ以外の他の遺伝子とから構築される融合遺伝子の存在、又は、前記融合遺伝子によってコードされる融合タンパク質の存在、を検出する工程を含む検出方法が含まれる。
以下、ALK融合遺伝子を検出する態様について述べるが、これらに限定されるものではない。
なお、以下の各態様における遺伝子の特定の領域の検出は、その例示に関わらず、あらかじめ解析した塩基配列に基づいて設計されたプローブ又はプライマーを用いて行っても、あるいは、シーケンシングによって行ってもよい。
ここで、正常試料(がんに罹患していない組織由来試料)には、ALK融合体のみならずALK遺伝子又はALKタンパク質も存在しないので、ALK遺伝子又はALKタンパク質自体の存在を検出することによってALK融合体を検出することもできる。
〈ALK融合遺伝子を検出する態様(1−a)〉
ALK融合遺伝子を検出する一態様として、ALK融合遺伝子が構築されているとき、ALK遺伝子が2つ以上のポリヌクレオチドに切断されていることに基づき、ALK遺伝子が切断されている状態、すなわち、ALK遺伝子5’末端側領域とALK遺伝子3’末端側領域との連続性が失われていることを検出することにより、ALK融合遺伝子を検出することができる。
具体的には、例えば、ALK遺伝子5’末端側領域に特異的にハイブリダイズする第1のプローブと、ALK遺伝子3’末端側領域に特異的にハイブリダイズする第2のプローブを用い、当該2つの遺伝子領域が染色体上で離れていることを検出することにより、ALK融合遺伝子を検出することができる。あるいは、ALK遺伝子3’末端側領域のみが存在することを検出することにより、ALK融合遺伝子を検出することができる。
なお、ALK遺伝子由来のポリヌクレオチドと融合して融合遺伝子を構築している他の遺伝子が切断されている状態を前記方法で確認することにより、ALK融合遺伝子を検出してもよい。
他の一態様として、ALK遺伝子の、5’末端側領域と、3’末端側領域の発現量をそれぞれ特異的に検出し、その発現量の比を求めることにより、ALK融合遺伝子を検出することができる。具体的には、例えば、ALK遺伝子の5’末端側領域の発現量と、ALK遺伝子3’末端側領域の発現量とが異なる場合、ALK融合遺伝子を検出することができる。
あるいは、ALK遺伝子と共にALK融合遺伝子を構築しているALK遺伝子以外の他の遺伝子について、前記方法で確認することにより、ALK融合遺伝子を検出してもよい。
他の一態様として、ALK融合体の形成過程において、ALK遺伝子又はALK遺伝子以外の他の遺伝子の少なくとも一部の複製(duplication)を伴う場合、すなわち、ALK遺伝子由来の重複したポリヌクレオチド、及び、ALK遺伝子と共にALK融合遺伝子を構築しているALK遺伝子以外の他の遺伝子由来の重複したポリヌクレオチドとから、ALK融合遺伝子が構築されている場合、ALK遺伝子由来のポリヌクレオチド又は前記他の遺伝子由来のポリヌクレオチドの重複を検出することにより、ALK融合遺伝子を検出することができる。
ALK融合遺伝子を検出する一態様として、ALK融合遺伝子が、ALK遺伝子由来ポリヌクレオチドと、ALK遺伝子以外の他の遺伝子由来のポリヌクレオチドとが融合して構築されていることに基づき、ALK融合遺伝子における、ALK遺伝子由来のポリヌクレオチドの少なくとも一部と、ALK遺伝子以外の他の遺伝子由来のポリヌクレオチドの少なくとも一部とが連続して含まれる融合ポリヌクレオチドを検出することにより、ALK融合遺伝子を検出することができる。
具体的には、例えば、ALK遺伝子以外の他の遺伝子由来のポリヌクレオチドの5’末端側領域に特異的にハイブリダイズする第1のプローブと、ALK遺伝子3’末端側領域に特異的にハイブリダイズする第2のプローブを用い、当該2つの遺伝子領域が染色体上で近接していることを検出することにより、ALK融合遺伝子を検出することができる。ALK遺伝子以外の他の遺伝子が、ZSCAN9の場合、すなわちALK融合遺伝子がZSCAN9−ALK融合遺伝子である場合、第1のプローブはZSCAN9遺伝子由来のポリヌクレオチドの5’末端側領域に特異的にハイブリダイズするプローブを用いればよい。
ALK融合遺伝子を検出する一態様として、ALK融合遺伝子が、ALK遺伝子由来ポリヌクレオチドと、ALK遺伝子以外の他の遺伝子由来ポリヌクレオチドとが、融合点において融合して構築されていることに基づき、ALK融合遺伝子における、ALK遺伝子由来のポリヌクレオチドの少なくとも一部と、ALK遺伝子以外の他の遺伝子由来のポリヌクレオチドの少なくとも一部とが、融合点を含んで連続して含まれる融合ポリヌクレオチドを検出することにより、ALK融合遺伝子を検出することができる。
具体的には、例えば、ALK遺伝子以外の他の遺伝子由来のポリヌクレオチドの5’末端側領域に特異的にアニールする第1のプライマーと、ALK遺伝子由来のポリヌクレオチドの3’末端側領域に特異的にアニールする第2のプライマーとを用いてPCR反応を行い、融合点の存在を示す所定のPCR産物が得られることを確認することにより、ALK融合遺伝子を検出することができる。
以下、ALKタンパク質を検出する態様について述べるが、これらに限定されるものではない。
〈ALK融合タンパク質を検出する態様(1−a)〉
ALK融合タンパク質を検出する態様として、ALK融合遺伝子が構築されているとき、ALK遺伝子にコードされるALKタンパク質も切断されることに基づき、ALKタンパク質が切断されている状態、すなわち、ALKタンパク質のN末端側領域とC末端側領域とが連続せずに切断されていることを検出することにより、ALK融合タンパク質を検出することができる。
具体的には、例えば、ALKタンパク質のN末端側領域に特異的に結合する第1の抗体と、ALKタンパク質のC末端側領域に特異的に結合する第2の抗体を用い、当該2つの領域が、異なるタンパク質に存在することを確認することにより、ALK融合タンパク質を検出することができる。
あるいは、ALKタンパク質と共に融合タンパク質を構築しているALKタンパク質以外の他のタンパク質が切断されている状態を前記方法により確認することで、ALK融合タンパク質を検出してもよい。
他の一態様として、ALKタンパク質の、N末端側領域と、C末端側領域の発現量をそれぞれ特異的に検出し、その発現量の比を求めることにより、ALK融合タンパク質を検出することができる。具体的には、例えば、ALKタンパク質のN末端側領域の発現量と、ALKタンパク質C末端側領域の発現量とが異なることを指標として、ALK融合タンパク質を検出することができる。
あるいは、ALKタンパク質と共にALK融合タンパク質を構築しているALKタンパク質以外の他のタンパク質について、前記方法で確認することにより、ALK融合タンパク質を検出してもよい。
ALK融合タンパク質を検出する一態様では、ALK融合タンパク質が、ALKタンパク質由来ポリペプチドと、ALKタンパク質以外の他のタンパク質由来のポリペプチドとが融合して構築されていることに基づき、ALK融合タンパク質における、ALKタンパク質由来のポリペプチドの少なくとも一部と、前記他のタンパク質由来のポリペプチドの少なくとも一部が連続して含まれる融合ポリペプチドを検出することにより、ALK融合タンパク質を検出することができる。
具体的には、例えば、ALKタンパク質以外の他のタンパク質のN末端側領域に特異的に結合する第1の抗体と、ALKタンパク質のC末端側領域に特異的に結合する第2の抗体を用い、当該2つの領域が、同一のタンパク質に存在することを確認することにより、ALK融合タンパク質を検出することができる。
ALK融合タンパク質を検出する一態様では、ALK融合タンパク質が、ALKタンパク質由来ポリペプチドと、ALKタンパク質以外の他のタンパク質由来のポリペプチドとが融合点で融合して構築されていることに基づき、ALK融合タンパク質における、前記融合点を含むALKタンパク質由来のポリペプチドの少なくとも一部と、前記他のタンパク質由来のポリペプチドの少なくとも一部が連続して含まれる融合ポリペプチドを検出することにより、ALK融合タンパク質を検出することができる。
具体的には、例えば、ALK融合タンパク質の融合点を含むポリペプチドを特異的に認識する抗体を用いた免疫学的測定法により、ALK融合タンパク質を検出することができる。
ALK融合タンパク質を検出する一態様では、ALK融合タンパク質の活性を指標にALK融合タンパク質を検出することができる。
具体的には、例えば、野生型ALKタンパク質に対して阻害活性のある物質を用いて野生型ALKタンパク質の活性を阻害した上で、ALKタンパク質のキナーゼ活性を測定し、ALK融合タンパク質を含まない(野生型ALKタンパク質のみを含む)場合に比較して、活性が高いことを指標にALK融合タンパク質を検出することができる。なお、ALKタンパク質のキナーゼ活性の測定には当業者に周知の方法を適宜選択することができ、例えば、ALKによりリン酸化を受ける分子のリン酸化状態を検出してもよい。
以下、ZSCAN9融合遺伝子を検出する態様について述べるが、これらに限定されるものではない。
なお、以下の各態様における遺伝子の特定の領域の検出は、その例示に関わらず、あらかじめ解析した塩基配列に基づいて設計されたプローブ又はプライマーを用いて行っても、あるいは、シーケンシングによって行ってもよい。
〈ZSCAN9融合遺伝子を検出する態様(1−a)〉
ZSCAN9融合遺伝子を検出する一態様として、ZSCAN9融合遺伝子が構築されているとき、ZSCAN9遺伝子が2つ以上のポリヌクレオチドに切断されていることに基づき、ZSCAN9遺伝子が切断されている状態、すなわち、ZSCAN9遺伝子5’末端側領域とZSCAN9遺伝子3’末端側領域との連続性が失われていることを検出することにより、ZSCAN9融合遺伝子を検出することができる。
具体的には、例えば、ZSCAN9遺伝子5’末端側領域に特異的にハイブリダイズする第1のプローブと、ZSCAN9遺伝子3’末端側領域に特異的にハイブリダイズする第2のプローブを用い、当該2つの遺伝子領域が染色体上で離れていることを検出することにより、ZSCAN9融合遺伝子を検出することができる。あるいは、ZSCAN9遺伝子5’末端側領域のみが存在することを検出することにより、ZSCAN9融合遺伝子を検出することができる。
なお、ZSCAN9遺伝子由来のポリヌクレオチドと融合して融合遺伝子を構築している他の遺伝子が切断されている状態を前記方法で確認することにより、ZSCAN9融合遺伝子を検出してもよい。
他の一態様として、ZSCAN9遺伝子の、5’末端側領域と、3’末端側領域の発現量をそれぞれ特異的に検出し、その発現量の比を求めることにより、ZSCAN9融合遺伝子を検出することができる。具体的には、例えば、ZSCAN9遺伝子の5’末端側領域の発現量と、ZSCAN9遺伝子3’末端側領域の発現量とが異なる場合、ZSCAN9融合遺伝子を検出することができる。
あるいは、ZSCAN9遺伝子と共にZSCAN9融合遺伝子を構築しているZSCAN9遺伝子以外の他の遺伝子について、前記方法で確認することにより、ZSCAN9融合遺伝子を検出してもよい。
他の一態様として、ZSCAN9融合体の形成過程において、ZSCAN9遺伝子又はZSCAN9遺伝子以外の他の遺伝子の少なくとも一部の複製(duplication)を伴う場合、すなわち、ZSCAN9遺伝子由来の重複したポリヌクレオチド、及び、ZSCAN9遺伝子と共にZSCAN9融合遺伝子を構築しているZSCAN9遺伝子以外の他の遺伝子由来の重複したポリヌクレオチドとから、ZSCAN9融合遺伝子が構築されている場合、ZSCAN9遺伝子由来のポリヌクレオチド又は前記他の遺伝子由来のポリヌクレオチドの重複を検出することにより、ZSCAN9融合遺伝子を検出することができる。
ZSCAN9融合遺伝子を検出する一態様として、ZSCAN9融合遺伝子が、ZSCAN9遺伝子由来ポリヌクレオチドと、ZSCAN9遺伝子以外の他の遺伝子由来のポリヌクレオチドとが融合して構築されていることに基づき、ZSCAN9融合遺伝子における、ZSCAN9遺伝子由来のポリヌクレオチドの少なくとも一部と、ZSCAN9遺伝子以外の他の遺伝子由来のポリヌクレオチドの少なくとも一部とが連続して含まれる融合ポリヌクレオチドを検出することにより、ZSCAN9融合遺伝子を検出することができる。
具体的には、例えば、ZSCAN9遺伝子以外の他の遺伝子由来のポリヌクレオチドの3’末端側領域に特異的にハイブリダイズする第1のプローブと、ZSCAN9遺伝子5’末端側領域に特異的にハイブリダイズする第2のプローブを用い、当該2つの遺伝子領域が染色体上で近接していることを検出することにより、ZSCAN9融合遺伝子を検出することができる。ZSCAN9遺伝子以外の他の遺伝子が、ALKの場合、すなわちZSCAN9融合遺伝子がZSCAN9−ALK融合遺伝子である場合、第1のプローブはALK遺伝子由来のポリヌクレオチドの3’末端側領域に特異的にハイブリダイズするプローブを用いればよい。
ZSCAN9融合遺伝子を検出する一態様として、ZSCAN9融合遺伝子が、ZSCAN9遺伝子由来ポリヌクレオチドと、ZSCAN9遺伝子以外の他の遺伝子由来ポリヌクレオチドとが、融合点において融合して構築されていることに基づき、ZSCAN9融合遺伝子における、ZSCAN9遺伝子由来のポリヌクレオチドの少なくとも一部と、ZSCAN9遺伝子以外の他の遺伝子由来のポリヌクレオチドの少なくとも一部とが、融合点を含んで連続して含まれる融合ポリヌクレオチドを検出することにより、ZSCAN9融合遺伝子を検出することができる。
具体的には、例えば、ZSCAN9遺伝子以外の他の遺伝子由来のポリヌクレオチドの3’末端側領域に特異的にアニールする第1のプライマーと、ZSCAN9遺伝子由来のポリヌクレオチドの5’末端側領域に特異的にアニールする第2のプライマーとを用いてPCR反応を行い、融合点の存在を示す所定のPCR産物が得られることを確認することにより、ZSCAN9融合遺伝子を検出することができる。
以下、ZSCAN9タンパク質を検出する態様について述べるが、これらに限定されるものではない。
〈ZSCAN9融合タンパク質を検出する態様(1−a)〉
ZSCAN9融合タンパク質を検出する態様として、ZSCAN9融合遺伝子が構築されているとき、ZSCAN9遺伝子にコードされるZSCAN9タンパク質も切断されることに基づき、ZSCAN9タンパク質が切断されている状態、すなわち、ZSCAN9タンパク質のN末端側領域とC末端側領域とが連続せずに切断されていることを検出することにより、ZSCAN9融合タンパク質を検出することができる。
具体的には、例えば、ZSCAN9タンパク質のN末端側領域に特異的に結合する第1の抗体と、ZSCAN9タンパク質のC末端側領域に特異的に結合する第2の抗体を用い、当該2つの領域が、異なるタンパク質に存在することを確認することにより、ZSCAN9融合タンパク質を検出することができる。
あるいは、ZSCAN9タンパク質と共に融合タンパク質を構築しているZSCAN9タンパク質以外の他のタンパク質が切断されている状態を前記方法により確認することで、ZSCAN9融合タンパク質を検出してもよい。
他の一態様として、ZSCAN9タンパク質の、N末端側領域と、C末端側領域の発現量をそれぞれ特異的に検出し、その発現量の比を求めることにより、ZSCAN9融合タンパク質を検出することができる。具体的には、例えば、ZSCAN9タンパク質のN末端側領域の発現量と、ZSCAN9タンパク質C末端側領域の発現量とが異なることを指標として、ZSCAN9融合タンパク質を検出することができる。
あるいは、ZSCAN9タンパク質と共にZSCAN9融合タンパク質を構築しているZSCAN9タンパク質以外の他のタンパク質について、前記方法で確認することにより、ZSCAN9融合タンパク質を検出してもよい。
ZSCAN9融合タンパク質を検出する一態様では、ZSCAN9融合タンパク質が、ZSCAN9タンパク質由来ポリペプチドと、ZSCAN9タンパク質以外の他のタンパク質由来のポリペプチドとが融合して構築されていることに基づき、ZSCAN9融合タンパク質における、ZSCAN9タンパク質由来のポリペプチドの少なくとも一部と、前記他のタンパク質由来のポリペプチドの少なくとも一部が連続して含まれる融合ポリペプチドを検出することにより、ZSCAN9融合タンパク質を検出することができる。
具体的には、例えば、ZSCAN9タンパク質以外の他のタンパク質のC末端側領域に特異的に結合する第1の抗体と、ZSCAN9タンパク質のN末端側領域に特異的に結合する第2の抗体を用い、当該2つの領域が、同一のタンパク質に存在することを確認することにより、ZSCAN9融合タンパク質を検出することができる。
ZSCAN9融合タンパク質を検出する一態様では、ZSCAN9融合タンパク質が、ZSCAN9タンパク質由来ポリペプチドと、ZSCAN9タンパク質以外の他のタンパク質由来のポリペプチドとが融合点で融合して構築されていることに基づき、ZSCAN9融合タンパク質における、前記融合点を含むZSCAN9タンパク質由来のポリペプチドの少なくとも一部と、前記ZSCAN9タンパク質以外の他のタンパク質由来のポリペプチドの少なくとも一部が連続して含まれる融合ポリペプチドを検出することにより、ZSCAN9融合タンパク質を検出することができる。
具体的には、例えば、ZSCAN9融合タンパク質の融合点を含むポリペプチドを特異的に認識する抗体を用いた免疫学的測定法により、ZSCAN9融合タンパク質を検出することができる。
ZSCAN9融合タンパク質を検出する一態様では、ZSCAN9融合タンパク質の活性を指標にZSCAN9融合タンパク質を検出することができる。
具体的には、例えば、ZSCAN9タンパク質と共に融合タンパク質を構築するZSCAN9以外の他のタンパク質が酵素活性を有するタンパク質である場合、ZSCAN9融合タンパク質を含まない(野生型ZSCAN9タンパク質のみを含む)場合に比較して、当該酵素活性が高いことを指標に、ZSCAN9融合タンパク質を検出することができる。なお、酵素活性の測定には当業者に周知の方法を適宜選択することができ、例えば、前記他のタンパク質がキナーゼ活性を有するタンパク質(好ましくはALKタンパク質)である場合、ZSCAN9融合タンパク質によりリン酸化を受ける分子のリン酸化状態を検出してもよい。
以下、ALK融合遺伝子(ゲノムDNA、mRNA、又はcDNA)の検出、ZSCAN9融合遺伝子(ゲノムDNA、mRNA、又はcDNA)の検出、ALK融合タンパク質の検出、ZSCAN9融合タンパク質の検出の工程及び検出技法について、より詳細に説明するが、これらに制限されるものではない。
なお、被験者から得た試料から、遺伝子(ゲノムDNA、又は、mRNA)又は、タンパク質を抽出した場合、あるいは、組織切片、又は、細胞懸濁液等を作成した場合において、調製された試料においてALK融合遺伝子又はZSCAN9融合遺伝子、あるいは、ALK融合タンパク質又はZSCAN9融合タンパク質を検出するために好適な技法は、当業者が適宜選択することができる。
ALK融合遺伝子又はZSCAN9融合遺伝子の検出は、ALK融合遺伝子又はZSCAN9融合遺伝子のゲノムDNAの検出、当該ゲノムDNAの転写産物であるmRNAの検出、又は、mRNAを鋳型として得られるcDNAの検出のいずれであってもよい。
被験者から得た試料中の、ALK融合遺伝子(ゲノムDNA、又は、mRNA)又はZSCAN融合遺伝子(ゲノムDNA、又は、mRNA)を検出する技法としては、ALK融合遺伝子又はZSCAN9融合遺伝子の少なくとも一部にハイブリダイズするプローブ(核酸プローブ等)を使用したハイブリダイゼーション技術、あるいは、ALK融合遺伝子又はZSCAN9融合遺伝子の少なくとも一部にアニールするプライマーを用いた遺伝子増幅技術等、遺伝子の検出に用いられる当業者に周知のいかなる技法、及び、これらの技法を応用した技法を用いることができる。
すなわち、PCR、LCR(Ligase chain reaction)、SDA(Strand displacement amplification)、NASBA(Nucleic acid sequence-based amplification)、ICAN(Isothermal and chimeric primer-initiated amplification of nucleic acids)、LAMP(Loop-mediated isothermal amplification)法、TMA法(Gen-Probe’s TMA system)、インサイチュハイブリダイゼーション法、マイクロアレイ法、ノーザンハイブリダイゼーション、サザンハイブリダイゼーション、ドットブロット法、RNAプロテクション法、DNAシーケンス、RNAシーケンス等のいかなる技法を用いてもよい。
ゲノムDNAの検出には、インサイチュハイブリダイゼーション技術を好適に用いることができる。インサイチュハイブリダイゼーション技術を利用した検出は、例えば、公知のFISH法に従って実施することができる。又は、クロモジェニックインサイチュハイブリダイゼーション(CISH)法とシルバーインサイチュハイブリダイゼーション(SISH)法を組み合わせたフュージョンアッセイ(fusion assay)で実施することができる。好適には、実施例4又は5に記載のFISH法スプリットアッセイ、又は、FISH法フュージョンアッセイで検出することができる。
以下に、ゲノムDNAの検出のための代表的な方法を例示するが、これらに限定されるものではない。
ALK融合遺伝子のFISH法スプリットアッセイでは、検出用プローブとして、後述の実施例6で詳細に説明するように、ALK遺伝子の5’末端側ゲノム領域をカバーするポリヌクレオチドであって蛍光標識したものと、同遺伝子の3’末端側ゲノム領域をカバーするポリヌクレオチドであって別の蛍光色素で標識したものとの組み合わせを使用する。正常な場合(野生型ALK遺伝子の場合)には、2つの遺伝子領域(各遺伝子ごとの5’末端側領域と3’末端側領域)が近接しているため、2つのシグナルが重なった色(例えば、赤色蛍光色素と緑色蛍光色素を使用する場合には、黄色)として検出されるのに対して、転座又は逆位等により2つの遺伝子領域が切断されている場合は、2種類の蛍光色素に由来するシグナル(例えば、赤色と緑色)が孤在性に検出される。従って、FISH法スプリットアッセイでは、ALK遺伝子の5’末端側ゲノム領域とALK遺伝子3’末端側ゲノム領域とが染色体上で近接していないことを検出することにより、ALK融合遺伝子の存在を検出している。
ALK融合遺伝子のFISH法フュージョンアッセイでは、例えば、ALK融合遺伝子がZSCAN9−ALK融合遺伝子の場合、検出用プローブとして、後述の実施例5で詳細に説明するように、ZSCAN9遺伝子の5’末端側ゲノム領域をカバーするポリヌクレオチドであって蛍光標識したものと、ALK遺伝子の3’末端側ゲノム領域をカバーするポリヌクレオチドであって別の蛍光色素で標識したものとの組み合わせを使用することができる。正常な場合(野生型ALK遺伝子の場合)には、2種類の蛍光色素に由来するシグナル(例えば、赤色と緑色)が別々に離れて検出されるのに対して、転座又は逆位等により2つの遺伝子領域が近接している場合は、2つのシグナルが重なった色(例えば、黄色)として検出される。
上記、FISH法フュージョンアッセイおよびスプリットアッセイは、同一の病理切片に対して同時におこなうこともできる。
例えば、ALK融合遺伝子またはZSCAN9融合遺伝子が、ZSCAN9−ALK融合遺伝子の場合、検出用プローブとして、後述の実施例7で詳細に説明するように、ZSCAN9遺伝子の5’末端側ゲノム領域をカバーするポリヌクレオチドであって蛍光標識(例えば青色)したものと、ALK遺伝子の5’末端側ゲノム領域をカバーするポリヌクレオチドであって別の蛍光色素(例えば赤色)で標識したものと、ALK遺伝子の3’末端側ゲノム領域をカバーするポリヌクレオチドであってさらに別の蛍光色素(例えば緑色)で標識したものと、の組み合わせを使用することができる。すなわち、異なる3色の蛍光色素(例えば、青色、赤色、緑色)でそれぞれのプローブを標識して用いる。
フュージョンアッセイおよびスプリットアッセイを同一の病理切片に対して同時におこなう本FISHアッセイは、両手法の結果を一つの病理切片上で得られるため、効率性、および、判定の信頼性向上の観点から好適である。
特に、融合遺伝子を構成する遺伝子同士が染色体上の近い距離に位置する場合、フュージョンアッセイだけを行った場合では、遺伝子転座又は逆位等が起きていないにも関わらず、融合遺伝子を構成する一つの遺伝子の5’末端側領域と、融合遺伝子を構成する他の遺伝子の3’末端側領域が近い場合に、見る角度等によっては、近接したシグナル(例えば青緑色)が観察され、偽陽性の判定が生じる恐れがある。その際、融合遺伝子を構成する他の遺伝子の5’末端側のシグナル(例えば赤色)が、融合遺伝子構成部位に、近接して検出されないことを確認することにより、偽陽性の判定を回避することができるため、好ましい。
ALK融合遺伝子を検出するための、ハイブリダイゼーションに用いるプローブとしては、ALK融合遺伝子の少なくとも一部のヌクレオチド又はそれらの相補鎖にストリンジェントな条件下で(好ましくはよりストリンジェントな条件下で)ハイブリダイズするプローブが好ましい。
mRNAの検出は、ノーザンハイブリダイゼーション法等によりmRNA自体を解析することにより行っても、又は、当業者に周知の方法によりmRNAを鋳型として合成した、相補的DNA(cDNA)を解析することにより行ってもよい。
上記RNAの検出には、シーケンス技術を好適に用いることができる。シーケンシングには、解析の効率を考慮すると、次世代シーケンサーを使用することが好ましい(例えば、Metzker ML、Nat Rev Genet. 2010 Jan;11(1):31-46参照)。次世代シーケンサーとしては、Illumina社のMiSeq/HiSeq、Life Technogies社のSOLiDシステム、Roche社の454シーケンスシステム(GS FLX+/GS Junior)等が例示できる。シーケンシングにおいては、後述の遺伝子増幅反応方法、シーケンスキャプチャ技術等を用いて、融合遺伝子が存在している可能性がある領域を濃縮(enrich)することで、解析の効率を向上させることができる。シーケンスキャプチャ技術としては、Roche社のRoche NimbleGen、Agilent Technologies社のSure Select等が例示できる。
mRNAは、検出対象であるALK融合遺伝子又はASCAN9融合遺伝子の少なくとも一部のポリヌクレオチドを特異的に増幅できるように設計したプライマーを用いた、遺伝子増幅反応方法にて検出することができる。以下に、mRNAの検出のための代表的な方法を例示するが、これらに限定されるものではない。
例えば、PCR法では、PCR産物をアガロースゲル電気泳動によって分析し、エチジウムブロマイド染色等によって目的とするサイズの増幅断片が得られたか否かを確認できる。目的とするサイズの増幅断片が得られた場合は、被験者から得た試料において、ALK融合遺伝子又はZSCAN9融合遺伝子が存在していたことになる。このように、ALK融合遺伝子又はZSCAN9融合遺伝子を検出することができる。
本発明のALK融合遺伝子の検出方法としては、被験者から得た試料中の、特定のポリヌクレオチドを遺伝子増幅反応により増幅する工程に加え、更に目的とするサイズの増幅断片が得られたか否かを検出する工程を含むことが好ましい。
従って、前述の<ALK融合遺伝子を検出する態様(1−b)>に記載のように、ALK遺伝子の5’末端側領域と3’末端側領域の発現量をそれぞれ特異的に検出し、その発現量の比を求めることによってALK融合遺伝子を検出する方法に好適に用いることができる。あるいは、ALK遺伝子と共にALK融合遺伝子を構築しているALK遺伝子以外の他の遺伝子の5’末端側領域と3’末端側領域の発現量をそれぞれ特異的に検出し、その発現量の比を求めることによって、ALK融合遺伝子を検出することができる。
また、前述の<ZSCAN9融合遺伝子を検出する態様(1−b)>に記載のように、ZSCAN9遺伝子の5’末端側領域と3’末端側領域の発現量をそれぞれ特異的に検出し、その発現量の比を求めることによってZSCAN9融合遺伝子を検出する方法に好適に用いることができる。あるいは、ZSCAN9遺伝子と共にZSCAN9融合遺伝子を構築しているZSCAN9遺伝子以外の他の遺伝子の5’末端側領域と3’末端側領域の発現量をそれぞれ特異的に検出し、その発現量の比を求めることによって、ZSCAN9融合遺伝子を検出することができる。
例えば、ALK遺伝子の5’末端側領域を特異的に増幅できるように設計したセンスプライマー及びアンチセンスプライマー、ならびに、ALK遺伝子の3’末端側領域を特異的に増幅できるように設計したセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを用いることができる。
例えば、ZSCAN9遺伝子の5’末端側領域を特異的に増幅できるように設計したセンスプライマー及びアンチセンスプライマー、ならびに、ZSCAN9遺伝子の3’末端側領域を特異的に増幅できるように設計したセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを用いることができる。
更には、PCR法においては、遺伝子の増幅過程においてPCR増幅モニター(リアルタイムPCR)法(Genome Res., 6(10), 986, 1996)を用いることにより、ALK融合遺伝子又はZSCAN9融合遺伝子の検出において、より定量的な解析を行うことが可能である。PCR増幅モニター法としては、例えば、ABI PRISM7900(PEバイオシステムズ社)を用いることが出来る。リアルタイムPCRは公知の方法であり、そのための装置及びキットは市販されており、これらを利用して簡便に行える。
また、例えばZSCAN9融合遺伝子がZSCAN9−ALK融合遺伝子であって、mRNAを指標にしてZSCAN9融合遺伝子を検出する場合、センスプライマー(5’−プライマー)を、ZSCAN9遺伝子由来の任意の部分から、アンチセンスプライマー(3’−プライマー)を、ALK遺伝子由来の任意の部分から設計する。
ALK融合遺伝子を検出するためのPCR法では、ALK遺伝子と融合してALK融合遺伝子を構成する他の各遺伝子、及び、複数の融合点に対応した上記センスプライマーを混ぜることにより、1反応液により全ての融合ポリヌクレオチドを検出するマルチプレックスPCR(Multiplex PCR)を設計することもできる。
ZSCAN9融合遺伝子を検出するためのPCR法では、ZSCAN9遺伝子と融合してZSCAN9融合遺伝子を構成する他の各遺伝子、及び、複数の融合点に対応した上記センスプライマーを混ぜることにより、1反応液により全ての融合ポリヌクレオチドを検出するマルチプレックスPCR(Multiplex PCR)を設計することもできる。
上記遺伝子増幅反応方法を用いた検出方法において、増幅断片の解析のために、特開2012-100628記載の質量分析法を用いることができる。
本発明のALK融合遺伝子を検出するための検出方法に用いられるプライマーセットは、検出対象であるALK融合遺伝子の少なくとも一部を特異的に増幅でき、ALK融合遺伝子を検出できるものであれば、特には限定されず、当業者が、検出対象ポリヌクレオチドの塩基配列に基づいて設計することができる。
本発明のZSCAN9融合遺伝子を検出するための検出方法に用いられるプライマーセットは、検出対象であるZSCAN9融合遺伝子の少なくとも一部を特異的に増幅でき、ZSCAN9融合遺伝子を検出できるものであれば、特には限定されず、当業者が、検出対象ポリヌクレオチドの塩基配列に基づいて設計することができる。
PCR増幅モニター法におけるプライマー設計は、プライマー設計ソフトウェア(例えば、Primer Express; PE Biosystems)などを利用してできる。また、PCR産物のサイズが大きくなると増幅効率が悪くなるため、センスプライマーとアンチセンスプライマーは、mRNA又はcDNAを対象に増幅したときの増幅産物の大きさが1kb以下になるように設定するのが適切である。
mRNAは、検出対象であるALK融合遺伝子又はZSCAN9融合遺伝子の少なくとも一部のポリヌクレオチドにハイブリダイズするプローブを用いた、ハイブリダイゼーション法にて検出することができる。
ハイブリダイゼーション技術を利用した検出は、例えば、ノーザンハイブリダイゼーション、ドットブロット法、DNAマイクロアレイ法、RNAプロテクション法などが挙げられる。
ハイブリダイゼーションに用いるプローブとしては、ALK融合遺伝子又はZSCAN9融合遺伝の少なくとも一部又はそれらの相補鎖にストリンジェントな条件下で(好ましくはよりストリンジェントな条件下で)ハイブリダイズするプローブが好ましい。
被験者から得た試料中の、ALK融合タンパク質又はZSCAN9融合タンパク質を検出する技法としては、タンパク質を解析するために用いられる当業者に周知いかなる技法、又は、これらの技法を応用したいかなる技法を用いてもよい。
以下に、タンパク質の検出のための代表的な方法を例示するが、これらに限定されるものではない。
抗体を用いる検出方法としては、上記公知の方法によればよいが、例えば以下の方法を用いることができる。
例えば、検出対象のALK融合タンパク質又はZSCAN9融合タンパク質が、ZSCAN9−ALK融合タンパク質の場合、検出対象の融合タンパク質が存在している可能性のある組織切片に対し、ALKタンパク質のC末端側領域のポリペプチドに結合する抗ALK抗体及びZSCAN9タンパク質のN末端側領域のポリペプチドに結合する抗ZSCAN9抗体を用いた免疫染色を行い、それらの抗体が近接していることを指標に、検出対象の融合タンパク質の存在を検出することもできる。また、ALKタンパク質のN末端側領域のポリペプチドに特異的に結合する抗体と、ALKタンパク質のC末端側領域のポリペプチドに特異的に結合する抗体を用いた免疫染色を行い、それらの抗体が近接せずに局在していることを指標に、検出対象の融合タンパク質の存在を検出することもできる。また、ZSCAN9タンパク質のN末端側領域のポリペプチドに特異的に結合する抗体と、ZSCAN9タンパク質のC末端側領域のポリペプチドに特異的に結合する抗体を用いた免疫染色を行い、それらの抗体が近接せずに局在していることを指標に、検出対象の融合タンパク質の存在を検出することもできる。また、融合点を含むポリペプチドに特異的に結合する抗体を用いた免疫染色を行い、検出対象の融合タンパク質の存在を検出することもできる。
例えば、検出対象のALK融合タンパク質又はZSCAN9融合タンパク質がZSCAN9−ALK融合タンパク質の場合、検出対象の融合タンパク質が存在している可能性のある細胞抽出液を、当業者に周知の方法により電気泳動して細胞抽出液中のタンパク質を分離した後、メンブレンにブロッティングする。
そして、タンパク質がブロッティングされたメンブレンに対し、ALKタンパク質のC末端側領域のポリペプチドに結合する抗ALK抗体及びZSCAN9タンパク質のN末端側領域に結合する抗ZSCAN9抗体を用いた免疫染色を行い、メンブレン上の所望の位置に、抗ALK抗体と抗ZSCAN9抗体が結合していることを指標に、検出対象の融合タンパク質の存在を検出することもできる。
また、融合点を含むポリペプチドに特異的に結合する抗体を用い、当該抗体がメンブレン上の所望の位置に結合していることを指標に、検出対象の融合タンパク質の存在を検出することもできる。
あるいは、抗ALK抗体を用い、当該抗体が、メンブレン上のZSCAN9−ALK融合タンパク質に結合していることを指標に、検出対象の融合タンパク質の存在を検出することもできる。この際、メンブレン上で野生型ALKタンパク質が予測される位置とは異なる位置に抗ALK抗体が結合することを指標に、検出対象の融合タンパク質の存在を検出してもよい。
抗ZSCAN9抗体を用い、抗ALK抗体を用いた場合と同じ原理で、ZSCAN9−ALK融合タンパク質を検出してもよい。
例えば、検出対象のALK融合タンパク質又はZSCAN9融合タンパク質が、ZSCAN9−ALK融合タンパク質の場合、検出対象の融合タンパク質が存在している可能性のある細胞抽出液に対し、ALKタンパク質のC末端側領域のポリペプチドに結合する抗ALK抗体又はZSCAN9タンパク質のN末端側領域のポリペプチドに結合する抗ZSCAN9抗体のいずれか一方の抗体で免疫沈降を行い、その沈降物に対して残るもう一方の抗体で検出することで、検出対象の融合タンパク質の存在を検出することもできる。上記の通り、免疫沈降と検出をした後、更には、検出抗体により、検出したポリペプチドが目的の検出対象ポリペプチドの大きさであることを確認することが好ましい。
あるいは、検出対象のALK融合タンパク質が存在している可能性のある細胞抽出液に対し、ALKタンパク質のC末端側領域のポリペプチドに結合する抗ALK抗体で免疫沈降を行い、さらにその沈降物の質量分析を行うことにより、野生型ALKと異なる質量の抗ALK抗体と結合するタンパク質の存在を確認することで、検出対象の融合タンパク質の存在を検出することもできる。検出対象のZSCAN9融合タンパク質が存在している可能性のある細胞抽出液に対し、ZSCAN9タンパク質のN末端側領域のポリペプチドに結合する抗ZSCAN9抗体で免疫沈降を行い、さらにその沈降物の質量分析を行うことにより、野生型ZSCAN9と異なる質量の抗ZSCAN9抗体と結合するタンパク質の存在を確認することで、検出対象の融合タンパク質の存在を検出することもできる。
なお、本発明に係る検出方法に用いる抗体は、ALK融合タンパク質又はZSCAN9融合タンパク質の所望の部位に特異的に結合する範囲で特に制限されず、モノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよく、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体を組みあわせて用いることもできる。前記抗体としては、免疫グロブリンそれ自体であっても、抗原結合能を保持した抗体断片、例えば、Fab、Fab’、F(ab’)2、又はFvでもよい。また、抗体の結合を検出するため、当業者に周知のいかなる標識やシグナル増幅法が用いられてもよい。
上記遺伝子(ゲノムDNA、mRNA、cDNA等)及びタンパク質の検出方法において、プローブ、増幅産物、抗体等の標識は公知の技術を用いればよい。例えば、蛍光標識、放射性標識、酵素標識等を挙げることができる。
プローブを用いた検出方法において、プローブを標識する場合、その標識方法は上記のとおり、公知の方法によればよく、例えば、BACクローンから、標識された核酸プローブを作製する場合、ニックトランスレーション、ランダムプライム法等の公知手法を用いることができる。またその際、ビオチン−dUTP(例えば、Roche Applied Science社製)を用いてプローブをビオチン標識し、アビジンと結合させた、蛍光体、放射性同位体、酵素等、をさらに処理することでプローブを標識することができる。
抗体を用いた検出方法において、抗体を標識する場合、その標識方法は上記のとおり、公知の方法によればよいが、例えば、下記の標識方法が挙げられる。
検出対象となるタンパク質に結合する第一抗体と、ポリマー試薬の間に介在抗体を入れることにより、染色感度を上げることが可能である(Takeuchiら、Clin Cancer Res, 2009 May 1; 15(9):3143-3149)。
2つの抗体の近接を検出する手法として、例えば、FRET現象を利用したプローブ(FRETプローブ)を用いることができる。抗体の一つをドナー蛍光物質(CFP等)で標識し、他の抗体をアクセプター蛍光物質(YFP等)で標識した場合、両者が十分に近い距離にあると、FRET現象により、YFPが励起状態となり、基底状態に戻る際に蛍光を発する。この蛍光を検出することで、2つの抗体が近接していることを検出することができる。
本発明の検出方法における検出対象のALK融合遺伝子又は検出対象のALK融合タンパク質が、被験者から得た試料から検出された場合は、当該被験者は、ALK融合体陽性のがんを有する対象(患者)であり、ALK阻害物質による治療の適用対象となる。
本発明の検出方法における検出対象のZSCAN9融合遺伝子又は検出対象のZSCAN9融合タンパク質が、被験者から得た試料から検出された場合は、当該被験者は、ZSCAN9融合体陽性のがんを有する対象(患者)であり、ZSCAN9阻害物質による治療の適用対象となる。
本発明の検出用キットには、検出対象のALK融合遺伝子の検出用キット、又は、検出対象のALK融合タンパク質の検出用キットが含まれる。
本発明の検出用キットには、検出対象のZSCAN9融合遺伝子の検出用キット、又は、検出対象のZSCAN9融合タンパク質の検出用キットが含まれる
本発明の検出対象のALK融合遺伝子の検出用キット、又は、ZSCAN9融合遺伝子の検出用キットには、本発明の検出方法においてFISH法フュージョンアッセイ又はFISH法スプリットアッセイに用いることのできるプローブ、あるいは、本発明の検出方法における検出対象のALK融合遺伝子又はZSCAN9融合遺伝子の少なくとも一部を特異的に増幅できるように設計したセンス及びアンチセンスプライマーが含まれる。センス及びアンチセンスプライマーセットは、ALK融合遺伝子又はZSCAN9融合遺伝子の少なくとも一部のポリヌクレオチドであり、かつ、増幅対象であるポリヌクレオチドの増幅用のプライマーとして機能するポリヌクレオチドのセットである。
また、本発明の検出対象のALK融合タンパク質又はZSCAN9融合タンパク質の検出用キットには、本発明の検出方法において用いることができる抗体が含まれる。
本発明のALK融合遺伝子の検出用キットは、ALK融合遺伝子の少なくとも一部のポリヌクレオチド、又は、その相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、前記ALK融合遺伝子を検出できるプローブを1種類、あるいは、2種類以上の組み合わせで含むことができる。
本発明のZSCAN9融合遺伝子の検出用キットは、ZSCAN9融合遺伝子の少なくとも一部のポリヌクレオチド、又は、その相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、前記ZSCAN9融合遺伝子を検出できるプローブを1種類、あるいは、2種類以上の組み合わせで含むことができる。
例えば、ALK融合遺伝子又はZSCAN9融合遺伝子が、ZSCAN9−ALK融合遺伝子の場合、ALK遺伝子由来ポリヌクレオチドにハイブリダイズする1種類以上の(好ましくは2種類以上の)プローブ、又は、ZSCAN9遺伝子由来ポリヌクレオチドにハイブリダイズする1種類以上の(好ましくは2種類以上の)プローブ、のいずれかのみを含んでも、ALK遺伝子由来ポリヌクレオチドにハイブリダイズする1種類以上のプローブ、及び、ZSCAN9遺伝子由来ポリヌクレオチドにハイブリダイズする1種類以上のプローブ、の両方を含んでも、あるいは、ALK融合遺伝子の融合点を含むポリヌクレオチドにハイブリダイズする1種類以上のプローブ、又は、ZSCAN9融合遺伝子の融合点を含むポリヌクレオチドにハイブリダイズする1種類以上のプローブを含んでもよい。
本発明のALK融合遺伝子の検出用キットは、ALK融合遺伝子の少なくとも一部を特異的に増幅でき、ALK融合遺伝子を検出できるプライマーセットを1セット、あるいは、2セット以上の組み合わせで含むことができる。
本発明のZSCAN9融合遺伝子の検出用キットは、ZSCAN9融合遺伝子の少なくとも一部を特異的に増幅でき、ZSCAN9融合遺伝子を検出できるプライマーセットを1セット、あるいは、2セット以上の組み合わせで含むことができる。
プライマーセットとして、前述の≪本発明の検出方法の態様≫又は≪検出方法に用いる技法≫に記載したいずれか1種類以上のプライマーセットが例示できる。
(1)ZSCAN9をコードする部分から設計されるセンスプライマー及びALKをコードする部分から設計されるアンチセンスプライマーを含む、ZSCAN9遺伝子とALK遺伝子との融合遺伝子を検出するためのプライマーセットであって、アンチセンスプライマーは「検出対象ポリヌクレオチド」にストリンジェントな条件下(好ましくは、よりストリンジェントな条件下)でアニールする核酸分子(好ましくは、少なくとも16塩基の核酸分子)からなり、センスプライマーは「検出対象ポリヌクレオチド」の相補鎖にストリンジェントな条件(好ましくは、よりストリンジェントな条件下)でアニールする核酸分子(好ましくは、少なくとも16塩基の核酸分子)からなるプライマーセット、が含まれる。
また、本発明のプライマーは、通常、15〜40塩基、好ましくは16〜24塩基、更に好ましくは18〜24塩基、特に好ましくは20〜24塩基の鎖長を有する。
本発明のALK融合タンパク質の検出用キットには、ALK融合タンパク質の任意の部位に特異的に結合する抗体を1種類、あるいは、2種類以上の組み合わせで含むことができる。具体的には、前述の<融合タンパク質の検出>に記載した抗体が例示できる。
本発明のZSCAN9融合タンパク質の検出用キットには、ZSCAN9融合タンパク質の任意の部位に特異的に結合する抗体を1種類、あるいは、2種類以上の組み合わせで含むことができる。具体的には、前述の<融合タンパク質の検出>に記載した抗体が例示できる。
例えば、ALK融合タンパク質又はZSCAN9融合タンパク質が、ZSCAN9−ALK融合タンパク質の場合、ALKタンパク質由来ポリペプチドに結合する1種類以上の(好ましくは2種類以上の)抗体、又は、ZSCAN9タンパク質由来ポリペプチドに結合する1種類以上の(好ましくは2種類以上の)抗体、のいずれかのみを含んでも、ALKタンパク質由来ポリペプチドに結合する1種類以上の抗体、及び、ZSCAN9タンパク質由来ポリペプチドに結合する1種類以上の抗体、の両方を含んでも、あるいは、ALK融合タンパク質の融合点を含むポリペプチドに結合する1種類以上の抗体、又は、ZSCAN9融合遺伝子の融合点を含むポリヌクレオチドに結合する1種類以上の抗体を含んでもよい。
<ポリペプチドを阻害する物質をスクリーニングする工程>
本発明の、阻害物質のスクリーニング方法は、前記検出対象ポリペプチドを阻害する物質をスクリーニングすることができ、
(1)検出対象ポリペプチド、又は前記ポリペプチドを発現している細胞に試験物質を接触させる工程、
(2)前記ポリペプチドが阻害されるか否かを分析する工程、及び
(3)前記ポリペプチドを阻害する物質を選択する工程
を含む。
本発明のスクリーニング方法には、
(A)精製又は粗製のポリペプチドを用いて、インビトロでポリペプチドの活性阻害を指標とする方法、
(B)ポリペプチドを発現している細胞を用いて、ポリペプチドの活性阻害を指標とする方法、
(C)ポリペプチドを発現している細胞を用いて、ポリペプチドの発現阻害を指標とする方法
が含まれる。
前記方法(A)には、インビトロでポリペプチドに試験物質を添加して接触させる工程、前記試験物質により前記ポリペプチドの活性が阻害されたか否かを、対照(試験物質を接触させなかったポリペプチド)と比較して分析する工程、ポリペプチドの活性を阻害した物質を選択する工程を含む方法が含まれる。
インビトロにおけるポリペプチド活性の測定は、公知のキナーゼ活性測定法を用いることができ、例えば、キナーゼ反応により生成するADP量を指標としても、あるいは、ポリペプチドのチロシンリン酸化レベルを指標としてもよく、市販のキナーゼ活性測定キットを用いることもできる。
前記方法(B)には、ポリペプチドを発現している細胞に試験物質を添加して接触させる工程、前記試験物質により前記ポリペプチドの活性が阻害されたか否かを、対照(試験物質を接触させなかった細胞)と比較して分析する工程、ポリペプチドの活性を阻害した物質を選択する工程を含む方法が含まれる。
前記細胞におけるポリペプチド活性の測定は、公知のキナーゼ活性測定法を用いることができ、例えば、キナーゼ反応により生成するADP量を指標としても、あるいは、ポリペプチドのチロシンリン酸化レベルを指標としてもよく、市販のキナーゼ活性測定キットを用いることもできる。
前記方法(C)には、ポリペプチドを発現している細胞に試験物質を添加して接触させる工程、前記試験物質により前記ポリペプチドの発現が阻害されたか否かを、対照(試験物質を接触させなかった細胞)と比較して分析する工程、ポリペプチドの発現を阻害した物質を選択する工程を含む方法が含まれる。
前記細胞におけるポリペプチドの発現は、タンパク質又はmRNAの量を測定することにより分析することができる。タンパク質量の測定には、例えば、ELISA法、イムノブロット法を用いることができ、mRNA量の測定には、例えば、RT−PCR法、ノーザンブロット法を用いることができる。
また、ZSCAN9融合遺伝子は、腫瘍形成能を有する遺伝子である。従って、本発明の阻害物質スクリーニング方法で選択したポリペプチド阻害物質は、ZSCAN9融合体陽性のがんの治療薬又はその候補物質として有用であり、本発明方法は、所望により、前記阻害物質がZSCAN9融合体陽性のがんに対する治療活性を有することを確認する工程を更に含むことができる。
前記ポリペプチド発現細胞は、本発明のポリヌクレオチドを、常法にしたがって、所望の細胞に導入することで得ることもできる(例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual 4th Edition(2012)、Cold Spring Harbor Laboratory Press参照)。具体的には、例えば、本発明のALK融合遺伝子又はZSCAN9融合遺伝子であるcDNAを、組換えベクターに導入し、これをさらに細胞に導入することで、前記ポリペプチド発現細胞(形質転換細胞)を得ることができる。
本発明の、ALK融合体陽性のがん(例えば、消化器がん)の治療用医薬組成物は、ALK融合遺伝子又はその転写産物に対する阻害物質を含む。例えば、本発明の阻害物質スクリーニング方法で得られる阻害物質(例えば、低分子化合物、二重鎖核酸(siRNAを含む)、タンパク質(抗体又は抗体断片を含む)、ペプチド、又はそれ以外の化合物)を有効成分として含有し、所望により、製剤学的に許容される担体を含有することができる。
本発明のZSCAN9融合体陽性のがんの治療用医薬組成物は、ZSCAN9融合遺伝子又はその転写産物に対する阻害物質を含む。例えば、本発明の阻害物質スクリーニング方法で得られる阻害物質(例えば、低分子化合物、二重鎖核酸(siRNAを含む)、タンパク質(抗体又は抗体断片を含む)、ペプチド、又はそれ以外の化合物)を有効成分として含有し、所望により、製剤学的に許容される担体を含有することができる。
ALK融合遺伝子又はその転写産物に対する阻害物質としては、キナーゼ阻害剤、例えば、ALK阻害物質、又は、ALK遺伝子と共に融合遺伝子を構築するもう一方の遺伝子又はその転写物質に対する阻害物質を挙げることができる。
ZSCAN9融合遺伝子又はその転写産物に対する阻害物質としては、ZSCAN9遺伝子又はその転写物質、あるいは、ZSCAN9遺伝子と共に融合遺伝子を構築するもう一方の遺伝子の少なくともいずれか一方に対する阻害物質を挙げることができる。例えば、前記もう一方の遺伝子がALK遺伝子の場合、阻害物質としてキナーゼ阻害剤を例示できる。
前記阻害物質のうち、低分子化合物の具体例としては、AG879(CAS148741-30-4)、国際公開公報WO2008/045627、WO2008/073480に記載の化合物等を挙げることができる。
二重鎖核酸は、二重鎖の核酸(RNA又はDNA)部分と、好ましくはセンス鎖及びアンチセンス鎖の3’末端のオーバーハングとからなり、RNAiを誘導する。RNAiは進化的に保存された現象で、RNaseIIIエンドヌクレアーゼによって生じる21〜23塩基の二重鎖核酸を介して起こる(Genes Dev. 15, 485-490, 2001)。3’側のオーバーハングはそれぞれ1又は2塩基の任意の核酸であるが、2塩基が好ましい。なお、前記塩基数(21〜23塩基)は、オーバーハングを含むセンス鎖又はアンチセンス鎖の各々の塩基数である。また、センス鎖及びアンチセンス鎖は、同じ塩基数であることもできるし、異なる塩基数であることもできるが、同じ塩基数であることが好ましい。
本発明の医薬組成物の有効成分として用いることのできる抗体は、ALK融合遺伝子の転写産物又はZSCAN9遺伝子の転写産物、好ましくは、ZSCAN9−ALK遺伝子の転写産物を阻害するものであれば、限定されない。例えば、ALK融合タンパク質又はZSCAN9融合タンパク質の活性、好ましくはキナーゼ活性を阻害するものが挙げられる。
目的遺伝子の5’末端側領域及び3’末端側領域を異なる色素で染め、遺伝子の転座又は逆位等を観察する方法が知られている。FISH法の一種であるこの方法はスプリットアッセイ(split assay)と呼ばれている。スプリットアッセイでは、染色体転座又は逆位等を調べたい目的遺伝子の5’末端側領域及び3’末端側領域のそれぞれを異なる蛍光色素で標識したプローブで染める。例えば、テキサスレッド(TexasRed)(赤)標識及びFITC(緑)標識した2種類のプローブにて蛍光標識することにより、正常な場合(融合遺伝子が構築されていない場合)は1つの黄色のシグナル(緑色と赤色のシグナルが近傍に存在している状態)として検出され、転座又は逆位等が起きている場合は、離れた緑色と赤色のシグナルとして検出される。
FISH法解析によりALKゲノム構造異常が示唆された組織由来のRNAをテンプレートに、インバースRT−PCR法により、ALK遺伝子キナーゼ領域の5’側に存在する遺伝子を調べた。
まず、逆転写及び二本鎖cDNA合成は、臨床検体由来のRNA0.5μgと、ALK遺伝子キナーゼコード領域に設計した逆転写プライマーALKREVex22−23(配列番号3)とを用いて、cDNA Synthesis System(Roche)により行った。合成した二本鎖cDNAを High Pure PCR Product Purification Kit(Roche)により精製した後、T4DNAリガーゼ(TaKaRa)を用いて自己環状化(self-ligation)した。環状化DNAを鋳型として、第1回PCR(フォワードプライマーALKFWDex20−21(配列番号4)とリバースプライマーALKREV3(配列番号5)との組合せ)と、第2回PCR(フォワードプライマーALKFWDex21−22(配列番号6)とリバースプライマーALKREV4(配列番号7)との組合せ)とを行った後、得られたPCR産物を用いてダイレクトシークエンスを行った。本実施例及び以下の実施例で使用したプライマーの塩基配列を表1に示す。
その結果、ZSCAN9遺伝子の一部がALK遺伝子キナーゼ領域の5’側に融合していることが明らかとなった。
FISH法解析によりALKゲノム構造異常が示唆され、融合する遺伝子が同定された大腸がん臨床検体由来のcDNAを鋳型として、DNAポリメラーゼ(PrimeStar HS DNAポリメラーゼ)を用いてPCRを行い、増幅産物をpT7Blue−2にクローニングした。プライマーセットとしては、フォワードプライマーZSCAN9−HindIII(配列番号8)とリバースプライマーALK−EcoRI(配列番号9)との組合せを用いた。
得られた増幅産物の配列を確認した結果、ZSCAN9遺伝子の開始コドンATGからエクソン3までと、ALK遺伝子のエクソン20からエクソン29の停止コドンまでの塩基配列からなるポリヌクレオチド(ZSCAN9ex3−ALKex20;配列番号1)が取得できた。
なお、上記アミノ酸置換について、ALK−001の登録アミノ酸配列(Ensemble database, Protein ID: ENSP00000373700)における相当箇所のアミノ酸番号で示した場合、前記I593V、K623R、D661Eは、それぞれ、I1461V、K1491R、D1529E、と表すこともできる。これらのアミノ酸置換は、それぞれ一塩基多型(rs1670283、rs1881420、rs1881421)として報告されている。
表1に示すプライマーを用いて、融合部を含む領域を直接増幅するRT−PCRで融合遺伝子の検出を行い、融合遺伝子cDNAががん組織に存在していることを示した。具体的には、検体由来RNAテンプレートに対して、ZSCAN9遺伝子上に設計したフォワードプライマーZSCAN9−394F(配列番号10)とALK遺伝子上に設計したリバースプライマーALK3078RR(配列番号11)とを使用してPCRを行った。増幅産物を電気泳動したところ、プライマー設定位置から予想されるサイズのバンド(492bp)が観察され、臨床検体を用いた融合遺伝子の検出が、これらの遺伝子上にプライマーを設計することによって可能であることが示された。
融合遺伝子がゲノム上で融合していることを確認するため、FISH法フュージョンアッセイにて検出を行った。
具体的には、赤(TexasRed)の蛍光標識をした、ZSCAN9遺伝子5’末端側領域をカバーするBACクローン(クローン番号 CTD-2382I15)と、緑(FITC)の蛍光標識をした、ALK遺伝子3’末端側領域をカバーするBACクローン(クローン番号 RP11-984I21, RP11-62B19)との組み合わせを使用した。
蛍光観察は蛍光顕微鏡BX51(Olympus社)を使用した。実施例4において融合遺伝子が陽性であった病理切片上でのフュージョンアッセイの結果、ZSCAN9遺伝子5’末端側領域とALK遺伝子3’末端側領域との近接したシグナル(黄)が観察され、融合遺伝子が染色体転座又は逆位等により生成されたことが確かめられた。
この方法が当該融合遺伝子の存在を検出する方法として使えることがわかった。
実施例1に記載の方法にしたがい、ZSCAN9遺伝子又はALK遺伝子のFISH法スプリットアッセイを実施した。病理切片の作製は、実施例1と同様に実施した。作製した未染色の切片は、Histology FISHアクセサリーキット(Dako社)で処理した。
蛍光観察は蛍光顕微鏡BX51(Olympus社)を使用した。実施例4において融合遺伝子が陽性であった病理切片上で、5’側のシグナル(本実施例では赤)が弧在性に観察されるゲノム構造異常が示唆される切片を見出した。
蛍光観察は蛍光顕微鏡BX51(Olympus社)を使用した。実施例4において融合遺伝子が陽性であった病理切片上で、3’側のシグナル(実施例では緑)が弧在性に観察されるゲノム構造異常が示唆される切片を見出した。
この方法が当該融合遺伝子の存在を検出する方法として使えることがわかった。
FISH法フュージョンアッセイおよびスプリットアッセイを、同一の病理切片に対しておこなった。病理切片の作製は、実施例1と同様に実施した。作製した未染色の切片は、Histology FISHアクセサリーキット(Dako社)で処理した。
蛍光観察は蛍光顕微鏡BX51(Olympus社)を使用した。実施例4において融合遺伝子が陽性であった病理切片上で、ZSCAN9遺伝子5’末端側領域とALK遺伝子3’末端側領域との近接したシグナル(青緑)と、このシグナルから離れた孤在性のALK遺伝子5’末端側のシグナル(赤)が観察され、融合遺伝子の生成を伴うゲノム構造異常が示された。よって、この方法が当該融合遺伝子の存在を検出する方法として使用できる。
本実施例では、ZSCAN9−ALK融合ポリペプチドをコードするcDNA(ZSCAN9ex3−ALKex20(配列番号1))を発現ベクターpLenti6(Invitrogen(登録商標)、Life Technologies社)に挿入して得られたpLenti6−ZSCAN9−ALKを用いて、ZSCAN9−ALK融合ポリペプチドの腫瘍形成能を検討した。pLenti6−ZSCAN9−ALKをマウス繊維芽細胞株NIH3T3細胞に導入し11日間培養したところ、図1(ZSCAN9−ALK融合ポリペプチド発現)に示すように形質転換フォーカスが観察された。遺伝子導入試薬のみの処理をしたNIH3T3細胞(control(図2))及び、LacZを導入したNIH3T3細胞(図示せず)においては、形質転換フォーカスは認められなかった。すなわち、ZSCAN9−ALK融合ポリペプチドを発現するベクターを導入した場合に限り形質転換フォーカスが観察された。
マウスリンパ系細胞株Ba/F3細胞は、増殖因子であるIL−3依存性細胞株であり、その増殖にIL−3を必要とするが、がん化遺伝子(例えば、チロシンキナーゼ融合遺伝子)を導入することにより、IL−3を添加しなくても増殖できるようになることが知られている(Daley GQ and Baltimore D. Proc Natl Acad Sci USA. 1988 Dec;85(23):9312-9316.)。
本実施例では、親株Ba/F3細胞及び実施例7で作製したpLenti6−ZSCAN9−ALKを導入したBa/F3細胞について、細胞数2000の状態から、所定濃度の各ALK阻害剤(クリゾチニブ、CH5424802、TAE684、ASP3026)を添加し、72時間培養した後の細胞数をカウントすることにより、各ALK阻害剤に対する感受性を検討した。より具体的な試験方法については、例えば、Katayamaらの文献(Katayama R et al., Sci Transl Med, 2012(4):120ra17)を参照することができる。
この結果は、ALK阻害剤が、ZSCAN9−ALK融合遺伝子陽性のがん患者の治療に有効であることを示すと同時に、pLenti6−ZSCAN9−ALKを導入したBa/F3細胞を用いる本評価系が、当該融合遺伝子陽性のがん患者の治療に有効な薬剤をスクリーニングするために用いることができることを示すものである。
実施例8で確認した、各ALK阻害剤によるZSCAN9−ALK融合ポリペプチド発現細胞の増殖抑制が、ZSCAN9−ALK融合ポリペプチドのキナーゼ活性が阻害されたことによるものであることを確認するために、各ALK阻害剤で処理した各培養細胞由来抽出物のウェスタンブロッティングを行った。
結果を図7に示す。抗体としては、抗リン酸化ALK抗体(図7におけるpALK;pY1604)、抗ALK抗体(図7のALK)を使用した。ALKのポリペプチド量については、各ALK阻害剤の処理の有無(及び処理濃度)に関してほとんど差異は認められなかった。一方、ZSCAN9−ALK融合ポリペプチドのリン酸化は、各ALK阻害剤による処理により、濃度依存的に顕著に減少しており、ZSCAN9−ALK融合ポリペプチドのキナーゼ活性が阻害されることにより、ZSCAN9−ALK融合ポリペプチドの自己リン酸化が抑制されることが確認された。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。
Claims (57)
- ZSCAN9融合タンパク質。
- ZSCAN9とALKとの融合タンパク質。
- 以下の(a)〜(d)からなる群から選択されるポリペプチドである、請求項1に記載の融合タンパク質:
(a)配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(b)配列番号2で表されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、
(c)配列番号2で表されるアミノ酸配列との同一性が80%以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、及び
(d)配列番号2で表されるアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び/若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド。 - 請求項1〜3のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
- 請求項4に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
- 請求項5に記載のベクターで形質転換された細胞。
- 被験者から得た試料中の、ZSCAN9融合タンパク質又は該融合タンパク質をコードする融合遺伝子の検出方法。
- 前記検出方法が、ZSCAN9タンパク質の切断、又は、ZSCAN9タンパク質をコードする遺伝子の切断、を検出する工程を含む、請求項7に記載の検出方法。
- 前記検出方法が、ZSCAN9タンパク質とそれ以外の他のタンパク質とから構築される融合タンパク質の存在、又は、前記融合タンパク質をコードする融合遺伝子の存在、を検出する工程を含む、請求項7に記載の検出方法。
- 前記融合タンパク質が、ZSCAN9タンパク質とALKタンパク質との融合タンパク質である、請求項7〜9のいずれか一項に記載の検出方法。
- 前記融合タンパク質が、以下の(a)〜(d)からなる群から選択されるポリペプチドである、請求項7〜10のいずれか一項に記載の検出方法:
(a)配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(b)配列番号2で表されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、
(c)配列番号2で表されるアミノ酸配列との同一性が80%以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、及び
(d)配列番号2で表されるアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び/若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド。 - 前記ZSCAN9融合遺伝子が、請求項3に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである、請求項7〜11のいずれか一項に記載の検出方法。
- 前記融合遺伝子が、DNA又はmRNAである、請求項7〜12のいずれか一項に記載の検出方法。
- 前記試料が、消化器由来試料である、請求項7〜13のいずれか一項に記載の検出方法。
- 前記消化器が、消化管である、請求項14に記載の検出方法。
- 前記消化器が、下部消化管である、請求項14に記載の検出方法。
- 前記消化器が、大腸である、請求項14に記載の検出方法。
- ZSCAN9遺伝子5’末端側ゲノム領域を特異的に認識できる第1のプローブと、ZSCAN9遺伝子3’末端側ゲノム領域を特異的に認識できる第2のプローブとを含む、ZSCAN9融合遺伝子の検出用キット。
- ZSCAN9遺伝子と共にZSCAN9融合遺伝子を構成する他の遺伝子の3’末端側ゲノム領域を特異的に認識できる第1のプローブと、ZSCAN9遺伝子5’末端側ゲノム領域を特異的に認識できる第2のプローブとを含む、ZSCAN9融合遺伝子の検出用キット。
- ZSCAN9タンパク質をコードするポリヌクレオチドの、5’末端側領域を特異的に増幅できるように設計したセンスプライマー及びアンチセンスプライマー、ならびに、前記ポリヌクレオチドの3’末端側領域を特異的に増幅できるように設計したセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを含む、ZSCAN9融合遺伝子の検出用キット。
- ZSCAN9タンパク質とALKタンパク質との融合タンパク質であるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを特異的に増幅できるように設計したセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを含む、ZSCAN9融合遺伝子又はALK融合遺伝子の検出用キット。
- 以下の(a)〜(d)からなる群から選択されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを特異的に増幅できるように設計したセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを含む、ZSCAN9融合遺伝子又はALK融合遺伝子の検出用キット:
(a)配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(b)配列番号2で表されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、
(c)配列番号2で表されるアミノ酸配列との同一性が80%以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、及び
(d)配列番号2で表されるアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び/若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド。 - ZSCAN9タンパク質のN末端側領域を特異的に認識できる抗ZSCAN9抗体、及び、ZSCAN9タンパク質のC末端側領域を特異的に認識できる抗ZSCAN9抗体を含む、ZSCAN9融合タンパク質の検出用キット。
- ZSCAN9タンパク質と共にZSCAN9融合タンパク質を構成する他のタンパク質のC末端側領域のポリペプチドに特異的に結合する抗体と、ZSCAN9タンパク質のN末端側領域のポリペプチドに特異的に結合する抗体を含む、ZSCAN9融合タンパク質の検出用キット。
- 前記他のタンパク質が、ALKタンパク質である、請求項24に記載のキット。
- ZSCAN9タンパク質をコードするポリヌクレオチド部分から設計されるセンスプライマー及びALKタンパク質をコードするポリヌクレオチド部分から設計されるアンチセンスプライマーを含む、ZSCAN9遺伝子とALK遺伝子との融合遺伝子を検出するためのプライマーセットであって、アンチセンスプライマーは請求項22に記載のポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でアニールする核酸分子からなり、センスプライマーは請求項22に記載のポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件でアニールする核酸分子からなるプライマーセット。
- ZSCAN9遺伝子とALK遺伝子との融合遺伝子を検出するためのプライマーセットであって、配列番号1に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でアニールする核酸分子からなるアンチセンスプライマー及び該ポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件下でアニールする核酸分子からなるセンスプライマーを含むプライマーセット。
- 配列番号1の塩基番号1から568間の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号1の塩基番号569から2259間の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマー、あるいは、配列番号12の塩基番号1から716間の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号12の塩基番号717から2857間の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーを含む、プライマーセット。
- (1)請求項3に記載のポリペプチド、又は前記ポリペプチドを発現している細胞に試験物質を接触させる工程、
(2)前記ポリペプチドの活性及び/又は発現が阻害されるか否かを分析する工程、及び
(3)前記ポリペプチドの活性及び/又は発現を阻害する物質を選択する工程
を含む、前記ポリペプチドの活性及び/又は発現を阻害する物質をスクリーニングする方法。 - 前記ポリペプチドの活性及び/又は発現を阻害する物質が、ZSCAN9融合体陽性のがんの治療剤である、請求項29に記載のスクリーニング方法。
- ZSCAN9融合タンパク質の活性及び/又は発現を阻害する物質を含有する、ZSCAN9融合体陽性のがんの治療用医薬組成物。
- 前記ZSCAN9融合タンパク質の活性及び/又は発現を阻害する物質が、キナーゼ阻害剤である、請求項31に記載の医薬組成物。
- 前記ZSCAN9融合タンパク質が、請求項3に記載のポリペプチドである、請求項31又は32に記載の医薬組成物。
- 前記がんが消化器がんである、請求項31〜33のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- 前記がんが消化管がんである、請求項31〜33のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- 前記がんが下部消化管がんである、請求項31〜33のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- 前記がんが大腸がんである、請求項31〜33のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- 被験者から得た消化器由来試料中の、ALK融合タンパク質又は該融合タンパク質をコードする融合遺伝子の検出方法。
- 前記検出方法が、ALKタンパク質の切断、又は、ALKタンパク質をコードする遺伝子の切断、を検出する工程を含む、請求項38に記載の検出方法。
- 前記検出方法が、ALKタンパク質とそれ以外の他のタンパク質とから構築される融合タンパク質の存在、又は、前記融合タンパク質をコードする融合遺伝子の存在、を検出する工程を含む、請求項38に記載の検出方法。
- 前記融合遺伝子が、DNA又はmRNAである、請求項38〜40のいずれか一項に記載の検出方法。
- 前記消化器が、消化管である、請求項38〜41のいずれか一項に記載の検出方法。
- 前記消化器が、下部消化管である、請求項38〜41のいずれか一項に記載の検出方法。
- 前記消化器が、大腸である、請求項38〜41のいずれか一項に記載の検出方法。
- ALK遺伝子5’末端側ゲノム領域を特異的に認識できる第1のプローブと、ALK遺伝子3’末端側ゲノム領域を特異的に認識できる第2のプローブとを含む、ALK融合遺伝子の検出用キット。
- ALK遺伝子と共にALK融合遺伝子を構成する他の遺伝子の5’末端側ゲノム領域を特異的に認識できる第1のプローブと、ALK遺伝子3’末端側ゲノム領域を特異的に認識できる第2のプローブとを含む、ALK融合遺伝子の検出用キット。
- ALKタンパク質をコードするポリヌクレオチドの、5’末端側領域を特異的に増幅できるように設計したセンスプライマー及びアンチセンスプライマー、ならびに、前記ポリヌクレオチドの3’末端側領域を特異的に増幅できるように設計したセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを含む、ALK融合遺伝子の検出用キット。
- ALKタンパク質のN末端側領域を特異的に認識できる抗ALK抗体、及び、ALKタンパク質のC末端側領域を特異的に認識できる抗ALK抗体を含む、ALK融合タンパク質の検出用キット。
- ALKタンパク質と共にALK融合タンパク質を構成する他のタンパク質のN末端側領域のポリペプチドに特異的に結合する抗体と、ALKタンパク質のC末端側領域のポリペプチドに特異的に結合する抗体を含む、ALK融合タンパク質の検出用キット。
- 前記ポリペプチドの活性及び/又は発現を阻害する物質が、ALK融合体陽性のがんの治療剤である、請求項29に記載のスクリーニング方法。
- ALK融合タンパク質の活性及び/又は発現を阻害する物質を含有する、ALK融合体陽性のがんの治療用医薬組成物。
- 前記ALK融合タンパク質の活性及び/又は発現を阻害する物質が、キナーゼ阻害剤である、請求項51に記載の医薬組成物。
- 前記ALK融合タンパク質が、請求項3に記載のポリペプチドである、請求項51又は52に記載の医薬組成物。
- 前記がんが消化器がんである、請求項51〜53のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- 前記がんが消化管がんである、請求項51〜53のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- 前記がんが下部消化管がんである、請求項51〜53のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- 前記がんが大腸がんである、請求項51〜53のいずれか一項に記載の医薬組成物。
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