PT2450437T - Defeitos de genes e cinase alk mutante em tumores sólidos humanos - Google Patents

Description

DESCRIgAO

" DEFEITOS DE GENES E CIÑASE ALK MOTANTE EM TUMORES SÓLIDOS HUMANOS "

CAMPO DA INVENgÁO A invengáo está relacionada, de um modo geral, com proteínas e genes envolvidos em cancro e com o tratamento de cancro.

ANTECEDENTES DA INVENgÁO

Muitos cancros sao caracterizados por disrupgóes ñas vias de sinalizagáo celular que conduzem ao controlo aberrante dos processos celulares ou a crescimento e proliferagáo descontrolados das células. Estas disrupgóes sao frequentemente causadas por alteragóes na actividade de proteínas de sinalizagáo particulares, tais como cinases. Entre estes cancros estáo os tumores sólidos, como sejam o carcinoma das células nao pequeñas do pulmáo (NSCLC). NSCLC é a principal causa da morte por cancro nos Estados Unidos e corresponde a cerca de 87% de todos os cancros do pulmáo. Existem cerca de 151,000 novos casos de NSCLC anualmente nos Estados Unidos e estima-se que mais de 120,000 doentes morram anualmente da doenga apenas nos Estados Unidos. Ver "CancerFacts and Figures 2005," American Cáncer Society. NSCLC, que compreende tres subtipos distintos, é frequentemente apenas detectado após ter metastizado e, assim, a taxa de mortalidade é de 75% dentro de dois anos após o diagnóstico. É conhecido que as delegóes e/ou translocagóes de genes que resultam em proteínas de fusao de cinases com actividade de sinalizagao aberrante podem directamente conduzir a determinados cancros. Por exemplo, foi directamente demonstrado que a oncoproteína BCR-ABL, urna proteína de fusao de tirosina cíñase, é o agente causador de leucemia mielogénica crónica (CML) humana. A oncoproteína BCR-ABL, a qual é encontrada em pelo menos 90-95% dos casos de CML, é gerada por translocagao de sequéncias do gene da tirosina cíñase de proteínas c-ABL no cromossoma 9 para sequéncias BCR no cromossoma 22, produzindo o chamado cromossoma Philadelphia. Ver, e.g. Kurzock et al., N. Engl. J. Med. 319:990-998 (1988). A translocagao é igualmente observada em leucemia linfocítica aguda e nos casos de NSCLC. Tém sido descritas translocagóes e delegóes de genes conducentes a proteínas mutantes ou de fusao implicadas numa variedade de outros cancros. Por exemplo, Falini et al., Blood 99(2): 409-426 (2002), revé as translocagóes conhecidas nos cancros hematológicos, incluindo a fusao NPM-ALK encontrada em ALCL. Até agora, foi descrito apenas um número limitado de translocagóes, delegóes de genes e proteínas mutantes que ocorrem em cancros do pulmao, incluindo a translocagáo t(15;19) envolvendo Notch3 Ver Dang et al., J. Nati. Can. Instit. 92(16): 1355-1357 (2000). Defeitos na expressáo e/ou actividade da Proteína de Ligagáo a RNA-6 (EML-4) foram encontrados nos carcinomas das células pequeñas e células nao pequeñas do pulmao. Ver Drabkin et al., Oncogene 8(16): 2589-97 (1999). No entanto, até agora nao foram descritas quaisquer translocagóes ou delegóes no cancro NSCLC humano envolvendo cinases de proteínas.

Foram descritos defeitos na expressáo da cíñase ALK resultantes da fusao de NPM com ALK em linfoma anaplásico das células grandes. Ver Morris et al.,1994; Shiota et al., 1994. Foi descrita a fusao de ALK com moesina, cadeia pesada 9 da miosina nao muscular (Tort et al., 2001), cadeia pesada da clatrina (Touriol et al., 2000; Bridge et al., 2001), tropomiosina 3 (TPM3) (Lamant et al., 1999), gene fundido com TRK (TGF) (Hernández et al., Am. J. Path. 160(4): 1487-1493 (2002)) e outros genes. Em particular, a fusao TGF-ALK foi descrita em linfoma nao sólido, mas até agora esta fusao nao foi descrita em tumores sólidos. Foi descrito o papel geral de ALK em cancro. Ver Pulford et al., J. Cell Physiol. 199(3): 330-358 (2004). No entanto, até agora, nao foram descritos defeitos na expressáo e/ou activagao de EML-4. A identificagao de mutagóes em cancros humanos é altamente desejável devido a poder conduzir ao desenvolvimento de novos fármacos tendo como alvo tais proteínas de fusao ou mutantes e a novos reagentes de diagnóstico para identificagáo de doentes que possuam tais mutagóes dos genes. Por exemplo, BCR-ABL tornou-se um alvo para o desenvolvimento de fármacos para tratar leucemia. Mais recentemente, Gleevec® (Imatinib mesylate, STI-571), um inibidor do tipo molécula pequeña da cíñase ABL, foi aprovada para o tratamento de CML. Este fármaco é o primeiro de urna nova classe de agentes anti-proliferativos desenhados para interferirem com as vías de sinalizagáo responsáveis pelo crescimento de células tumorais. 0 desenvolvimento deste fármaco representa um avango significativo relativamente as terapias convencionais para CML e ALL, quimioterapia e radiagáo, as quais sao marcadas pelos efeitos secundários bem conhecidos e frequentemente possuem um efeito limitado, urna vez que falham o alvejamento específico das causas subjacentes das doengas malignas. Igualmente, tém sido descritos reagentes e métodos para detectar específicamente a proteína de fusao BCR-ABL em doentes, de modo a identificar doentes com maior probabilidade de responder a inibidores dirigidos como Gleevec®.

Assim, permanece a necessidade da identificagao de novas mutagóes de genes, tais como translocagóes ou delegóes, que resultem em proteínas de fusao ou mutantes implicadas na progressáo de cancros humanos, particularmente tumores sólidos, incluindo cancros do pulmáo como NSCLC e o desenvolvimento de novos reagentes e métodos para o estudo e detecgáo de tais proteínas de fusáo. A identificagáo de tais proteínas de fusáo desejavelmente permitirá, entre outras coisas, estabelecer novos métodos para a selecgáo de doentes para terapias dirigidas, assim como para o rastreio de novos fármacos que inibam tais proteínas mutantes/de fusáo.

SUMARIO DA INVENQÁO A invengáo é como reivindicada ñas reivindicagóes 1-6.

Sao aquí divulgadas novas mutagóes por delegóes de genes que ocorrem no cromossoma 2 humano, as quais resultam em proteínas de fusáo combinando parte da Cíñase de Linfoma Anaplásico (ALK) com urna proteína secundária identificada agora no tumor sólido humano carcinoma do pulmáo das células nao pequeñas (NSCLC). Proteínas secundárias envolvidas ñas fusóes ALK incluem Proteína Associada a Microtúbulos Equinoderme tipo 4 (EML-4) e o

Gene da Fusáo de TRK (TFG). Actualmente, cinases ALK mutantes/de fusáo foram observadas em amostras de doentes com carcinoma das células nao pequeñas do pulmáo. A divulgagáo proporciona assim, em parte, polinucleótidos isolados e vectores codificadores dos polipéptidos ALK mutantes/de fusáo divulgados, sondas e ensaios para a sua detecgáo, polipéptidos ALK mutantes/de fusáo isolados, polipéptidos recombinantes mutantes e reagentes para a detecgáo de polinucleótidos e polipéptidos ALK mutantes. A identificagao divulgada destas novas cinases ALK mutantes e translocagóes/delegóes permite novos métodos para determinar a presenga de polinucleótidos ou polipéptidos ALK mutantes numa amostra biológica e métodos para o rastrero de compostos que inibam a proteina cíñase mutante. Também permite métodos para inibir a progressao de um cancro caracterizado pela expressao de polipéptidos ALK mutantes, os quais sao proporcionados pela invengao. Os aspectos e realizagóes da invengao estao descritos mais detalhadamente abaixo.

BREVE DESCRIQAO DOS DESENHOS

Fig. 1A- mostra as localizagóes do gene EML-4 e do gene ALK no cromossoma 2 (painel A) e as localizagóes dos dominios das proteínas EML-4 e ALK de tamanho completo, assim como os da proteína de fusao EML4-ALK (variante pequeña) (painel B) ; a jungao da fusao ocorre nos aminoácidos 233-234 e a proteína de fusao incluí o dominio cíñase (mas nao os dominios transmembranar e extracelular) de ALK. Sao igualmente mostrados (no painel B) a sequéncia de DNA (e da proteína) da regiáo de jungao exáo 6/intráo 6 de EML4 / exao 20 de ALK (SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8, respectivamente). FIG. IB- mostra as localizagóes do gene EML-4 e do gene ALK no cromossoma 2 (painel A) e as localizagóes dos dominios das proteínas EML-4 e ALK de tamanho completo, assim como os da proteína de fusao EML4-ALK (variante pequeña) (painel B) ; a jungao da fusao ocorre nos aminoácidos 495-496 e a proteina de fusao incluí o dominio cíñase (mas nao os dominios transmembranar e extracelular) de ALK. Sao igualmente mostrados (no painel B) a sequéncia de DNA (e da proteína) da regiáo de jungao exao 13 de EML4/exao 20 de ALK (SEQ ID NO:24 e SEQ ID NO:25, respectivamente).

Fig. 1C- mostra as localizagóes do gene TFG no cromossoma 6 e do gene ALK no cromossoma 2 (painel A) e as localizagóes dos dominios das proteínas TFG e ALK de tamanho completo, assim como os da proteína de fusao TFG-ALK (painel B) ; a jungao da fusao ocorre nos aminoácidos 138-139 e a proteína de fusao incluí o dominio cíñase (mas nao os dominios transmembranar e extracelular) de ALK. Sao igualmente mostrados (no painel B) a sequéncia de DNA (e da proteína) da regiáo de jungao exao 3 de TFG/exao 20 de ALK (SEQ ID NO:26 e SEQ ID NO:27, respectivamente).

Fig. 2A- é a sequéncia de aminoácidos (código de 1 letra) da proteína de fusao humana EML4-ALK (variante curta) (SEQ ID NO:l) (painel superior) com a sequéncia de DNA codificadora também indicada (SEQ ID NO:2) (painel inferior); os residuos da fracgáo EML-4 estao em itálico, enquanto os residuos do dominio cíñase de ALK estao a negrito.

Fig. 2B- é a sequéncia de aminoácidos (código de 1 letra) da proteína de fusao humana EML4-ALK (variante longa) (SEQ ID NO:18) (painel superior) com a sequéncia de DNA codificadora também indicada (SEQ ID NO:19) (painel inferior); os residuos da fracgáo EML-4 estao em itálico, enquanto os residuos do dominio cíñase de ALK estao a negrito.

Fig. 2C- é a sequéncia de aminoácidos (código de 1 letra) da proteína de fusáo humana TFG-ALK (variante longa) (SEQ ID NO:20) (painel superior) com a sequéncia de DNA codificadora também indicada (SEQ ID NO:21) (painel inferior); os residuos da fracgao TFG estao em itálico, enquanto os residuos do dominio cíñase de ALK estao a negrito.

Fig. 3A-3B- é a sequéncia de aminoácidos (código de 1 letra) da proteína EML-4 humana (SEQ ID NO:3) (Swiss Prot N° de Acesso 061936) com a sequéncia de DNA codificadora também indicada (SEQ ID NO:4) (GeneBank N° de Acesso NM019063); os residuos mantidos no mutante de delegáo variante curta estao sublinhados, enquanto os residuos mantidos na variante longa estao em itálico.

Fig. 4A-4B- é a sequéncia de aminoácidos (código de 1 letra) da cíñase ALK (SEQ ID NO: 5) (Swiss Prot N° de Acesso Q9UM73) com a sequéncia de DNA codificadora também indicada (SEQ ID NO:6) (GeneBank N° de Acesso HSU66559); os residuos mantidos nos mutantes de delegáo estao sublinhados, enquanto os residuos no dominio cíñase estao em negrito.

Fig. 4C-4D- é a sequéncia de aminoácidos (código de 1 letra) da proteina humana TFG (SEQ ID NO:22) (Swiss Prot N° de Acesso Q92734) com a sequéncia de DNA codificadora também indicada (SEQ ID NO:23) (GeneBank N° de Acesso NM006070); os residuos mantidos no mutante de delegáo estáo sublinhados.

Fig. 5- sao géis que descrevem (A) a detecgáo de ALK através do produto 5' RACE com sequéncias iniciadoras para ALK após 2 reacgoes sucessivas de PCR; UAP significa Universal Amplification Primer, GSP significa Sequéncia Iniciadora Especifica de Gene, (B) detecgáo do gene de fusáo formado pelo mutante de delegáo EML-4 e ALK, (C) detecgáo do gene de fusáo EML4-ALK (variantes curta e longa) em amostras de tumores NSCLC humanos por 5' RACE e (D) detecgáo do gene de fusáo TFG-ALK em amostras de tumor NSCLC por 5' RACE.

Fig. 6- é urna imagem que descreve a detecgáo do gene de fusáo formado pela translocagáo EML-4 e ALK em células H2228 pelo ensaio FISH empregando sondas para separagáo por quebra, de dupla cor (laranja/verde), compreendendo sondas para locáis opostos do ponto de quebra 2p23 do gene ALK; os tamanhos e localizagóes das sondas estáo mostrados no painel superior.

DESCRigÁO DETALHADA DA INVENQÁO

De acordo com a invengáo, delegóes e translocagóes de genes anteriormente desconhecidas que resultam em proteínas de fusao de cinases mutantes, combinando parte da Cíñase de Linfoma Anaplásico (ALK) com urna porgao de urna proteína secundária, foram agora identificadas no tumor sólido humano carcinoma das células pequeñas do pulmao (NSCLC). Proteínas secundárias envolvidas na descoberta de fusóes de ALK incluem Proteína Associada a Microtúbulos Equinoderme tipo 4 (EML-4) e Gene da Fusao de TRK (TFG).

As duas delegóes divulgadas, as quais ocorrem entre os genes EML4 e ALK no cromossoma 2, produzem proteínas de fusao que combinam o extremo N de EML-4, urna proteína de ligagao a microtúbulos de 401 aminoácidos, com o dominio cíñase e o extremo C de ALK, urna tirosina cíñase de membrana de 1620 aminoácidos. Espera-se que as proteínas de fusao EML4-ALK resultantes, as quais possuem 796 aminoácidos (variante curta) e 1059 aminoácidos (variante longa), respectivamente, e mantém a actividade cíñase ALK, conduzam á proliferagáo e sobrevivencia de urna subsérie de tumores sólidos humanos, incluindo NSCLC. A translocagáo divulgada, a qual ocorre entre o gene TFG no cromossoma 6 e o gene ALK no cromossoma 2, produz urna proteína de fusao que combina o extremo N de TFG, urna proteína de 400 aminoácidos, com o dominio cíñase e o extremo C de ALK, urna tirosina cíñase de membrana de 1620 aminoácidos. A proteína de fusáo TFG-ALK resultante, que tem 701 aminoácidos, foi anteriormente observada em linfoma humano nao sólido (Hernández et al. (2002), supra.), mas nao foi anteriormente descrita em tumores sólidos. A proteína de fusáo TFG-ALK mantém a actividade cíñase de ALK e espera-se que seja responsável pela proliferagáo e sobrevivencia de urna subsérie de tumores sólidos humanos, incluindo NSCLC.

Apesar de terem sido descritas em NSCLC, sao poucas as translocagóes ou delegóes de genes que resultam em proteínas de fusao aberrantes, incluindo a translocagáo t (15;19) envolvendo Notch3 (ver Dang et al., supra), a proteína mutante de delegao e de fusáo de EML4-ALK presentemente divulgadas sao novas. De forma semelhante, a proteína mutante e de fusao da translocagáo TFG-ALK, apesar de conhecida em tumores náo sólidos, com sejam linfoma, é nova no tumor sólido NSCLC. EML-4 é urna proteína associada a microtúbulos que é expressa na maioria dos tecidos humanos. Até agora, náo foram descritos defeitos na expressáo e/ou actividade de EML-4. ALK é urna tirosina cíñase de membrana e é expressa, em seres humanos, no cérebro e tecidos do SNC, também no intestino delgado e testículos, mas náo em células linfóides normáis. Desempenha um papel importante no desenvolvimento e fungáo normal do sistema nervoso (Iwahara et al., 1997).

Defeitos na expressáo e/ou activagáo de ALK foram encontrados no linfoma anaplásico das células grandes e em neuroblastoma (ver Morris et al., 1994, Osajima-Hakomori et al., 2005) . Foram descritas a fusao de ALK com moesina, cadeia pesada da miosina nao muscular 9, cadeia pesada da clatrina, tropomiosina 3 (TPM3), gene fundido com TRK(TFG) e outros genes. Ver Tort et al.; Touriol et al., Hernández et al., supra.) . É interessante que a fusao divulgada de EML-4 com ALK (variante curta) ocorre precisamente no mesmo ponto (aminoácido 1058) como anteriormente descrito para outros mutantes ALK de fusao.

Como aínda descrito abaixo, os mutantes de delegáo EML4-ALK e as proteínas de fusao expressas foram presentemente isoladas e sequenciadas e produzidos os cDNA para expressao das proteínas de fusao. Assim, a divulgagao proporciona, em parte, polinucleótidos isolados que codificam polipéptidos de fusao EML4-ALK, sondas de ácido nucleico que hibridam com tais polinucleótidos e métodos, vectores e células hospedeiras para utilizagáo de tais polinucleótidos para produzir polipéptidos ALK recombinantes mutantes. A divulgagao também proporciona, em parte, polipéptidos isolados compreendendo sequéncias de aminoácidos codificadoras dos polipéptidos de fusao EML4-ALK, polipéptidos recombinantes mutantes e reagentes isolados que específicamente se ligam e/ou detectam polipéptidos de fusao EML4-ALK, mas que nao se ligam ou detectam EML-4 selvagem ou ALK selvagem. Estes aspectos da divulgagao, os quais sao descritos mais detalhadamente abaixo, seráo úteis, ínter alia, noutros estudos de mecanismos de cancros induzidos pela expressao/actividade da cíñase ALK muíante, para identificagao de tumores sólidos (e.g. carcinomas incluindo carcinomas do pulmáo e sarcomas) e outros cancros caracterizados pelas mutagóes de delegao e translocagao de ALK divulgadas e/ou proteína de fusao, ou expressao/actividade da cíñase ALK muíante e na realizagao de métodos da divulgagao como aínda descritos abaixo. A identificagao dos novos mutantes da cíñase ALK e mutagóes de delegao e translocagao de genes tem implicagóes importantes para o potencial diagnóstico e tratamento de tumores sólidos, tais como NSCLC, que se caracterizam por urna ou mais destas proteínas de fusao. NSCLC, por exemplo, é frequentemente apenas detectado após ter metastizado e assim a taxa de mortalidade é de 75% dentro de dois anos após o diagnóstico. Assim, a capacidade de identificar, tao cedo quanto possível, doentes com mutagóes genéticas que possam conduzir a NSCLC, é altamente desej ável.

Deste modo, a descoberta das proteínas de fusao EML4-ALK (variantes curtas e longas) resultantes da delegao de genes e a proteína de fusao TFG-ALK resultante da translocagao de genes, que se espera conduza á proliferagao e sobrevivencia de um tumor sólido, NSCLC, permite novos métodos importantes para a identificagao precisa de tumores sólidos em mamíferos, incluindo os cancros do pulmao (tais como NSCLC), assim como outros cancros, em que urna proteína de fusao de ALK (como seja EML4-ALK ou TFG-ALK) seja expressa. Estes tumores muito provavelmente responderao a inibidores da actividade cíñase da proteína ALK mutante, tais como WHI-131 ou WHI-154. A capacidade para identificar, tao cedo quanto possível, cancros que sejam originados por urna cíñase ALK mutante será de grande ajuda na determinagáo clínica de quais os fármacos ou combinagáo de fármacos mais adequados para um doente particular, ajudando assi a evitar a prescrigáo de inibidores tendo como alvo outras cinases que nao sao, de facto, a molécula de sinalizagáo principal que origina o cancro.

Assim, a divulgagáo proporciona, em parte, métodos para a detecgáo da presenga de um polinucleótido mutante e/ou polipéptido de fusao num cancro usando reagentes específicos de fusao e reagentes específicos de mutantes da divulgagáo. Tais métodos podem ser realizados, por exemplo, para identificar um tumor sólido, como seja NSCLC, que tem probabilidade de responder a um inibidor da actividade de cíñase ALK de proteína humana. A divulgagáo também proporciona, em parte, métodos para determinar se um composto inibe a progressáo de um cancro caracterizado por um polipéptido de fusao EML4-ALK. É aínda proporcionado pela invengáo um composto para usar na inibigáo da progressáo de um tumor sólido que expresse um polipéptido de fusao EM4L4-ALK através da inibigáo da expressáo e/ou actividade do polipéptido mutante. Tais métodos e compostos estáo descritos mais detalhadamente abaixo.

Outros aspectos, vantagens e realizagóes da invengáo sao descritos mais detalhadamente abaixo.

Definigóes.

Como aquí usados, os termos que se seguem possuem os significados indicados. "Anticorpo" ou "anticorpos" refere-se a todos os tipos de imunoglobulinas, incluindo IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, incluindo Fab ou seus fragmentos de reconhecimento do antigénio, incluindo anticorpos quiméricos, policlonais e monoclonais. 0 termo "anticorpo humanizado", como aquí usado, refere-se a moléculas de anticorpo em que os aminoácidos foram substituidos ñas regióes de nao ligagao ao antigénio, de modo a assemelharem-se mais a um anticorpo humano mas mantendo aínda a capacidade de ligagao original. 0 termo "activo em termos biológicos" refere-se a urna proteína com fungóes estruturais, reguladoras ou bioquímicas de urna molécula natural. Igualmente, "activo em termos imunológicos" refere-se á capacidade do polipéptido de fusao EML4-ALK ou TFG-ALK natural, recombinante ou sintético ou qualquer seu oligopéptido, induzir urna resposta imune específica em animáis ou células adequadas e ligar-se a anticorpos específicos. 0 termo "amostra biológica" é usado no seu sentido mais lato e significa qualquer amostra biológica suspeita de conter polinucleótidos ou polipéptidos de fusao ALK ou seus fragmentos (incluindo polinucleótidos e polipéptidos EML4-ALK e TFG-ALK) e pode compreender urna célula, cromossomas isolados de urna célula (e.g. urna dispersao de cromossomas na metáfase), DNA genómico (em solugáo ou ligado a um suporte sólido como seja para análise Southern), RNA (em solugáo ou ligado a um suporte sólido como seja para análise Northern), cDNA (em solugáo ou ligado a um suporte sólido), um extracto de células, sangue, urina, medula ou um tecido e similares. "Caracterizado por" no que respeita a um cancro e polinucleótido e polipéptido ALK mutante significa um cancro em que a delegáo ou translocagáo de um gene e/ou polipéptido de fusao expresso envolvendo ALK estao presentes comparativamente com um cancro em que tal delegáo de gene e/ou polipéptido de fusao nao está presente. A presenga do polipéptido mutante pode originar, na totalidade ou em parte, o crescimento e sobrevivencia de tal cancro. "Consenso" refere-se a urna sequéncia de ácido nucleico que foi sequenciada de novo pata resolver bases indistintas ou que foi prolongada usando XL-PCR™ (Perkin Elmer, Norwalk, Conn.) na direcgáo 5' e/ou 3' e novamente sequenciada ou que foi montada a partir de sequéncias sobreponiveis de mais de clone usando o GELVIEW™ Fragment Assembly System (GCG, Madison, Wis.) ou que foi prolongada e montada. "Fármaco inibidor da cíñase ALK" significa qualquer composigáo compreendendo um ou mais compostos, químicos ou biológicos, que inibe, directamente ou indirectamente, a expressao e/ou actividade de cíñase ALK selvagem ou truncada, por si só e/ou como parte de urna proteína de fusáo (como sejam as proteínas de fusáo EML4-ALK e a proteína de fusáo TFG-ALK). "Derivado" refere-se á modificagáo química de urna sequéncia de ácido nucleico codificadora de um polinucleótido de fusáo divulgado ou o próprio polipéptido codificado. Exemplos de tais modificagóes seráo a substituigáo de hidrogénio por um grupo alquilo, acilo ou amino. Um derivado de ácido nucleico codificará um polipéptido que mantém as características biológicas essenciais da molécula natural. "Marca detectável" relativamente a um polipéptido, polinucleótido ou reagente aquí divulgado significa urna modificagáo química, biológica ou outra, incluindo, mas náo lhes estando limitados, modificagóes de fluorescencia, massa, residuo, corante, isótopo radioactivo, marca ou cauda, etc., através das quais a presenga da molécula de interesse pode ser detectada. "Expressáo" ou "expresso" relativamente a um polipéptido de fusáo ALK numa amostra biológica significa expresso significativamente com a amostra controlo em que este polipéptido de fusao nao é expresso significativamente. "Péptido marcado com isótopo pesado" (usado de forma permutável com péptido AQUA) significa um péptido compreendendo pelo menos urna marca de isótopo pesado, que é adequada para a quantificagao absoluta ou detecgao de urna proteina como descrito em W0/03016861, "Quantificagao absoluta de proteínas e suas formas modificadas através da espectrometría de assa multiface" (Gygi et al.), discutido abaixo. 0 termo "detecta específicamente" relativamente a tal péptido AQUA significa que o péptido apenas detectará e quantificará polipéptidos e proteínas que possuem a sequéncia do péptido AQUA e nao detectará substancialmente polipéptidos e proteínas que nao possuam a sequéncia do péptido AQUA. "Isolado" (ou "substancialmente purificado") refere-se a sequéncias de ácido nucleico ou de aminoácidos que sao removidos, isolados ou separados do seu ambiente natural. De preferencia estao pelo menos 60% livres, mais de preferencia 75% livres e mais de preferencia 90% ou mais livre de outros componentes com os quais estao naturalmente associados. "Mimético" refere-se a urna molécula cuja estrutura é desenvolvida a partir do conhecimento da estrutura de um polipéptido de fusao ALK ou porgóes dos mesmos e, como tal, é capaz de efectuar algumas ou todas as acgóes das moléculas do tipo proteína associadas a translocagáo. "ALK mutante" ou "polinucleótido ou polipéptido de fusao" significa um polinucleótido ou polipéptido de fusao envolvendo ALK e urna proteína secundária (e.g. EML-4 ou TFG), como aquí descrito. "Polinucleótido" (ou "sequéncia nucleotídica") refere-se a um oligonucleótido, nucleótido ou polinucleótido e fragmentos ou porgóes do mesmo e a DNA ou RNA de origem genómica ou sintética, o qual pode ser de cadeia simples ou dupla e representa a cadeia codificante ou complementar. "Polipéptido" (ou "sequéncia de aminoácidos" refere-se a um oligopéptido, péptido, polipéptido ou sequéncia proteica e seus fragmentos ou porgóes, e moléculas naturais ou sintéticas. Sempre que "sequéncia de aminoácidos" é aquí mencionada refere-se a urna sequéncia de aminoácidos de urna molécula proteica natural, "sequéncia de aminoácidos" e termos similares, tais como "polipéptido" ou "proteína", nao pretendem limitar a sequéncia de aminoácidos á sequéncia de aminoácidos nativa completa associadas á molécula proteica mencionada. "Polinucleótido de fusao EML4-ALK" refere-se á sequéncia de ácido nucleico de um produto de gene mutante de delegáo EML4-ALK ou polipéptido de fusao (variante curta ou longa) como aquí descrito, obtido a partir de qualquer urna das espécies, particularmente mamífero, incluindo bovino, ovino, porcino, murino, equino e, de preferencia, humano, a partir de qualquer fonte, quer natural, sintética, semi-sintética ou recombinante. "Polipéptido de fusao EML4-ALK" refere-se á sequéncia de aminoácidos de um polipéptido de fusao EML4-ALK substancialmente puro (variante curta ou longa) aquí descrita, obtida a partir de qualquer espécie, particularmente de mamífero, incluindo bovino, ovino, porcino, murino, equino e, de preferencia, humano, a partir de qualquer fonte, quer natural, sintética, semi-sintética ou recombinante. "Polinucleótido de fusao TFG-ALK" refere-se á sequéncia de ácido nucleico de um produto do gene mutante da translocagao TFG-ALK ou polinucleótido de fusao substancialmente purificado como aquí descrito, obtido a partir de qualquer espécie, particularmente de mamífero, incluindo bovino, ovino, porcino, murino, equino e, de preferencia, humano, a partir de qualquer fonte, quer natural, sintética, semi-sintética ou recombinante. "Polipéptido de fusao TFG-ALK" refere-se á sequéncia de aminoácidos de um polipéptido de fusao TFG-ALK substancialmente purificado como aqui descrito, obtido de qualquer espécie, particularmente de mamífero, incluindo bovino, ovino, porcino, murino, equino e, de preferencia, humano, a partir de qualquer fonte, quer natural, sintética, semi-sintética ou recombinante.

Os termos "liga-se específicamente a" (ou "ligar específicamente" ou "ligagao específica" como referencia á interacgáo de um anticorpo e urna proteína ou péptido, significa que a interacgáo está dependente da presenga de urna estrutura particular (í.e. o determinante antigénico ou epitopo) na proteína; por outras palavras, o anticorpo é reconhecido e liga-se a urna estrutura proteica específica e nao a proteínas em geral. 0 termo "nao se liga" no que respeita á ligagao de anticorpos a sequéncias ou determinantes antigénicos diferentes daqueles para os quais é específico significa que nao reage substancialmente comparativamente com a ligagao do anticorpo a determinante ou sequéncia antigénica para o qual o anticorpo é específico. 0 termo "condigóes restringentes" no que respeita a condigóes de hibridagáo com sequéncia ou sonda é a "restringéncia" que ocorre dentro de urna gama de aproximadamente Tm menos 5°C (5°C abaixo da temperatura de fusáo (Tm) da sequéncia ou sonda) até cerca de 20°C a 25°C abaixo da Tm. Sao condigóes de restringéncia típicas: incubagáo durante a noite a 42°C numa solugao compreendendo: 50% formamida, 5X SSC (750 mM NaCl, citrato trissódico 75 mM), fosfato de sodio 50 mM (pH 7,6), solugao de Denhardt 5X, 10% sulfato de dextrano e 20 microgramas/ml de DNA de esperma de salmáo cortado, seguido de lavagens dos filtros em 0,1X SSC a cerca de 65°C. Como será compreendido pelos familiarizados com a arte, a restringéncia da hibridagáo pode ser alterada de forma a identificar ou detectar sequéncias de polinucleótidos idénticas ou relacionadas.

Urna "variante" de um polipéptido ALK mutante refere-se a urna sequéncia de aminoácidos que é alterada em um ou mais aminoácidos. A variante pode ter alteragóes "conservadas", em que um aminoácido substituido possui propriedades estruturais ou químicas similares, e.g. substituigao de leucina com isoleucina. Mais raramente, urna variante pode ter alteragóes "nao conservadas", e.g. substituigao de urna glicina com um triptofano. Variagóes menores semelhantes também incluem delegóes ou insergóes de aminoácidos ou ambas. Linhas orientadoras de como determinar quais os residuos de aminoácidos podem ser substituidos, inseridos ou deletados sem anular a actividade biológica ou imunológica podem ser encontradas usando programas informáticos bem conhecidos na arte, por exemplo o programa DNASTAR. A. Identificado de cinases ALK mutantes em tumores sólidos humanos

As novas delegóes de genes humanos aquí divulgadas, as quais ocorrem no cromossoma 2 e resultam na expressáo de duas variantes de proteina de fusáo que combinam o extremo N de EML-4 com o dominio cúnase e o extremo C de ALK, foram surpreendentemente identificadas durante a análise de perfis globais de péptidos fosforilados em extractos de linhas celulares de carcinoma das células nao pequeñas do pulmao (NSCLC) (incluindo H2228) e tumores sólidos dos doentes. NSCC, um tumor sólido, é um subtipo de cancro do pulmao. As proteínas envolvidas nestas fusóes por delegáo estao mostradas ñas Figuras 1A-1B, painel A. 0 perfil de fosforilagao da linha celular H2228 foi primeiro elucidado usando urna técnica recentemente descrita para o isolamento e caracterizagáo por espectrometría de massa dos péptidos modificados a partir de misturas complexas (ver Publicagao de Patente U.S. N° 20030044848, Rushet al., "Isolamento por imunoafinidade de Péptidos modificados a partir de misturas complexas" (a técnica "IAP") como aínda descrita no Exemplo 1 abaixo. A aplicagao da técnica IAP usando um anticorpo específico de fosfotirosina (CELL SIGNALING TECHNOLOGY, INC., Beverly, MA, 2003/04 Cat. #9411), identificou que a linha celular H2228 expressa a cíñase ALK, mas que a proteína estava aparentemente truncada. O rastrero identificou muitas outras cinases activadas na linha celular, incluindo algumas conhecidas por estarem activadas no cancro do pulmao. A análise da sequéncia 5' de ALK por 5' RACE identificou entáo que a cíñase estava fundida com o extremo N de EML-4 (ver Fig. 6). A análise subsequente de 154 amostras de tumores de doentes NSCLC, usando a mesma abordagem do perfil de fosforilagáo global, nao só confirmou a presenga da mutagáo EML4-ALK (variante curta) numa populagáo daqueles doentes, como também revelou a presenga de urna segunda EML4-ALK (variante longa) e a presenga da mutagáo TFG-ALK noutras populagdes de doentes (ver Exemplo IB e 1C). A confirmagao que as proteínas ALK mutantes sao responsáveis pela proliferagao celular e sobrevivencia nestes tumores NSCLC pode ser estabelecida através da inibigao directa das células usando silenciamento com siRNA (ver Exemplo 3).

Os genes de fusáo EML4-ALK (variantes curtas e longas) e o gene de fusáo TFG-ALK foram amplificados por PCR, isolados e sequenciados (ver Exemplo 3). Com se mostra no Painel B das Figuras 1A-1B, a delegao EML4-ALK combina o extremo N de EML-4 selvagem (os aminoácidos 1-233 na variante curta ou os aminoácidos 1-495 na variante longa) com o dominio cíñase e o extremo C de ALK selvagem (aminoácidos 1057-1620) (ver também SEQ ID NOs: 3 e 5). A jungáo da fusáo ocorre no extremo C relativamente ao dominio transmembranar de ALK selvagem (ver Figuras 1A-1B). Os polipéptidos de fusáo EML4-ALK mantém os 233 aminoácidos ou os 495 aminoácidos N-termináis de EML-4, respectivamente, o que incluí o dominio em espiral enrolada desta proteína. As proteínas de fusáo EML4-ALK resultantes, as quais compreendem 796 aminoácidos (variante curta) ou 1059 aminoácidos (variante longa), respectivamente (ver painel B das Figuras 1A-1B Banda e Figuras 2A-2B (SEQ ID NOs: 1 e 18)), mantém a actividade cíñase de ALK. Os exóes envolvidos e as jungóes de fusáo estáo mostrados ñas Figuras 1A-1B (painel B). A jungáo de fusáo incluí o intrao 6 de EML-4, que se segue ao exáo 6 (variante curta) ou exáo 13 de EML-4 (variante longa).

Como se mostra no painel B da Figura 1C, a translocagao TFG-ALK combina o extremo N de TFG selvagem (aminoácidos 1-138) com o dominio cíñase e o extremo C de ALK selvagem (aminoácidos 1057-1620) (ver também SEQ ID NO:22 e 5; e o painel B da Figura 1C e Figura 4C (SEQ ID NOs: 2 0 e 1) . A jungáo de fusáo ocorre no extremo C relativamente ao dominio transmembranar de ALK selvagem (ver Figura 1C) e mantem a actividade cíñase de ALK. Os exoes envolvidos e a jungáo de fusáo estáo mostrados ñas Figuras 1C (painel B). A jungáo da fusáo incluí o exáo 3 de TFG e o exáo 20 de ALK.

As sondas FISH foram usadas para detectar a presenga da proteína de fusáo EML4-ALK (variante curta) num grupo de 400 amostras de tumores NSCLC humanos embebidos em parafina (ver Exemplos 6 e 7; Figura 6). A incidencia desta mutagáo da variante curta neste tamanho de amostra foi muito baixa. No entanto, a expressáo das proteínas de fusáo EML4-ALK (variantes curtas e longas), assim como a proteína de fusáo TFG-ALK, foi detectada com maior incidencia usando a técnica IAP para examinar os perfis globais de fosforilagáo num outro grupo de 154 amostras congeladas de tumores NSCLC humanos de doentes (ver Exemplo IB). B. Polinucleótidos isolados A presente divulgagáo proporciona, em parte, polinucleótidos isolados que codificam polipéptidos de fusao EML4-ALK, sondas nucleotidicas que hibridam com tais polinucleótidos e métodos, vectores e células hospedeiras para utilizar tais polinucleótidos para produzir polipéptidos de fusao recombinantes. A menos que de outra forma se ja indicado, todas as sequéncias nucleotidicas determinadas através da sequenciagáo de urna molécula de DNA foram determinadas usando um sequenciador de DNA automático (como se ja o Modelo 373 da Applied Biosystems, Inc.) e todas as sequéncias de aminoácidos dos polipéptidos codificados pelas moléculas de DNA aquí determinadas foram determinadas usando um sequenciador de péptidos automático (ver Exemplo 2). Como é conhecido na arte para qualquer sequéncia de DNA determinada através desta abordagem automática, qualquer sequéncia nucleotidica aquí determinada pode conter alguns erros. As sequéncias nucleotidicas determinadas automáticamente sao típicamente pelo menos cerca de 90% idénticas, mais típicamente pelo menos cerca de 95% a pelo menos cerca de 99, 9% idénticas á sequéncia nucleotidica real da molécula de DNA sequenciada. A sequéncia real pode ser mais precisamente determinada por outras abordagens incluindo métodos manuais de sequenciagáo de DNA bem conhecidos na arte. Como é igualmente conhecido na arte, urna única insergao ou delegao numa determinada sequéncia nucleotidica comparada com a sequéncia real causará urna alteragáo da grelha de tradugáo da sequéncia nucleotidica, de modo a sequéncia de aminoácido prevista codificada por urna determinada sequéncia nucleotidica será completamente diferente da sequéncia de aminoácidos codificada pela molécula de DNA sequenciada, comegando no ponto de tal insergao ou delegao.

Excepto se de outra forma for indicado, cada sequéncia nucleotidica aqui descrita é apresentada como urna sequéncia de desoxirribonucleótidos (abreviados A, G, C e T). No entanto, "sequéncia nucleotidica" de urna molécula de ácido de nucleico ou polinucleótido compreende urna molécula de DNA ou polinucleótido, urna sequéncia de desoxirribonucleótidos e urna molécula de RNA ou polinucleótido, a sequéncia correspondente de ribonucleótidos (A, G, C e U), em que cada desoxirribonucleótido timidina (T) na sequéncia de desoxirribonucleótidos especificada é substituida pelo ribonucleótido uridina (U). Por exemplo, a referencia a urna molécula de RNA tendo a sequéncia de SEQ ID NO: 2 descrita usando abreviaturas de desoxirribonucleótidos destina-se a indicar urna molécula de RNA tendo urna sequéncia em que cada desoxirribonucleótido A, G ou C de SEQ ID NO:2 foi substituida pelo ribonucleótido correspondente A, G ou C e cada desoxirribonucleótido T foi substituido por um ribonucleótido U.

Numa realizagáo, a divulgagáo proporciona um polinucleótido isolado compreendendo urna sequéncia nucleotidica pelo menos 95% idéntica a urna sequéncia seleccionada do grupo consistindo em: (a) urna sequéncia nucleotidica codificadora de urna proteina de fusao da Proteina Associada a Microtúbulos Equinoderme tipo 4 (EML-4)/Cíñase de Linfoma Anaplásico (EML4-ALK) compreendendo a sequéncia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 18; (b) urna sequéncia nucleotidica codificadora de um polipéptido de fusao EML4-ALK, a referida sequéncia nucleotidica compreendendo a sequéncia de nucleótidos SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 19; (c) urna sequéncia nucleotidica codificadora de um polipéptido de fusao EML4-ALK compreendendo a sequéncia de aminoácidos N-terminal de EML-4 (residuos 1-233 de SEQ ID NO: 3 ou residuos 1-495 de SEQ ID NO: 3) e o dominio cíñase de ALK (residuos 1116-1383 de SEQ ID NO: 5) ; (d) urna sequéncia nucleotidica compreendendo a sequéncia nucleotidica N-terminal de EML-4 (nucleótidos 1-700 de SEQ ID NO: 4 ou nucleótidos 1-1486 de SEQ ID NO: 4) e a sequéncia nucleotidica do dominio cíñase de ALK (nucleótidos 3348-4149 de SEQ ID NO: 6); (e) urna sequéncia nucleotidica compreendendo pelo menos seis nucleótidos contiguos englobando a jungáo de fusao (nucleótidos 700-701 de SEQ ID NO: 2 ou nucleótidos 1486-1487 de SEQ ID NO: 19) de um polinucleótido de fusao EML4-ALK; (f) urna sequéncia nucleotidica codificadora de um polipéptido compreendendo pelo menos seis aminoácidos contiguos abrangendo a jungáo de fusao (residuos 233-234 de SEQ ID NO: 1 ou os residuos 495-496 de SEQ ID NO: 18) de um polipéptido de fusao EML4-ALK; e (g) urna sequéncia nucleotidica complementar de qualquer urna das sequéncias nucleotidicas de (a)- (f) .

Usando a informagao aquí proporcionada, como seja a sequéncia nucleotidica na Figura 2 (SEQ ID NO:2), urna molécula de ácido nucleico da presente divulgagáo codificadora de um polipéptido ALK mutante da divulgagáo pode ser obtida usando procedimentos convencionais de clonagem e rastrero, como sejam os de clonagem de cDNA usando mRNA como material de partida. O polinucleótido de fusao EML4-ALK (variante curta) ilustrativo da divulgagáo, descrito na Figura 2 (SEQ ID NO:2) foi isolado a partir de DNA genómico de urna linha celular NSCLC humana (como aínda descrito no Exemplo 2 abaixo). O gene de fusao pode também ser identificado em DNA genómico ou bibliotecas de cDNA noutros cancros, incluindo tumores sólidos, em que ocorre urna delegáo de genes EML4-ALK (cromossoma 2).

As sequéncias nucleotidicas determinadas dos genes de fusao EML4-ALK (SEQ ID NOs:2 e 19) codificam proteínas de fusao de cíñase de 796 aminoácidos (variante curta) e 1059 aminoácidos (variante longa), respectivamente (ver Figuras 2A-B (SEQ ID NOs: 1 e 18) e Figuras 1A-B) . Os polinucleótidos de fusáo EML4-ALK compreendem a porgáo da sequéncia nucleotidica de EML-4 selvagem (ver Figura 3 (SEQ ID NO:4)) que codifica o extremo N (aminoácidos 1-233 (variante curta) ou aminoácidos 1-495 (variante longa) daquela proteina com a porgáo da sequéncia nucleotidica de ALK selvagem (ver Figura 4 (SEQ ID NO: 6)) que codifica o dominio cinase e o extremo C daquela proteina. Ver Figuras 1A-B. O dominio cinase compreende os residuos 292-568 na proteina de fusáo variante curta (codificada pelos nucleótidos 874-1704 do polipéptido de fusáo variante curta) ou residuos 555-831 na proteina de fusáo variante longa (codificada pelos nucleótidos 1663-2494 do polinucleótido de fusáo variante longa). Ver Figuras 2A-2B.

Conforma indicado, a presente divulgagáo proporciona, em parte, a forma madura das proteínas de fusáo EML4-ALK. De acordo com a hipótese do sinal, as proteínas secretadas pelas células de mamífero possuem um sinal ou sequéncia líder secretora que é cortado da proteína madura urna vez iniciada a exportagáo da cadeia proteica em crescimento através do retículo endoplasmático rugoso. A maioria das células de mamífero, e mesmo as células de insecto, cortam as proteínas secretadas com a mesma especificidade. No entanto, nalguns casos, a clivagem de urna proteína secretada náo é totalmente uniforme, o que resulta em duas ou mais espécies maduras da proteína. Aínda, sabe-se há muito que a especificidade da clivagem de urna proteína secretada é em última instancia determinada pela estrutura primária da proteína completa, ou seja está inerente na sequéncia de aminoácidos do polipéptido.

Por polipéptido EML4-ALK maduro tendo a sequéncia de aminoácidos codificada, e.g. pelo clone de cDNA depositado, pretende-se significar a forma madura desta proteína de fusao produzida pela expressao numa célula de mamífero (e.g. células 3T3, como descrito abaixo) da grelha de leitura aberta completa codificada pela sequéncia de DNA humana do clone depositado ou outro cone codificador do polipéptido de fusao maduro.

Como indicado, os polinucleótidos da presente divulgagao podem ser na forma de RNA, como se ja como mRNA ou na forma de DNA incluindo, por exemplo, cDNA e DNA genómico obtido através da clonagem ou obtido por síntese química. 0 DNA pode ser de cadera dupla ou de cadeia simples. 0 DNA ou RNA de cadeia simples pode ser a cadeia codificadora, também conhecida como a cadeia com sentido, ou pode ser a cadeia nao codificadora, também referida como a cadeia anti-sentido.

Os polinucleótidos isolados da divulgagao sao moléculas de ácido nucleico, DNA ou RNA, as quais foram retiradas do seu ambiente nativo. Por exemplo, as moléculas de DNA recombinante contidas num vector sao consideradas isoladas para fins da presente divulgagao. Outros exemplos de moléculas de DNA isoladas incluem moléculas de DNA recombinante mantidas em células hospedeiras heterólogas ou moléculas de DNA purificadas (parcialmente ou substancialmente) em solugáo. As moléculas de RNA isoladas incluem transcritos de RNA, in vivo ou in vitro, das moléculas de DNA da presente divulgagáo. As moléculas de ácido nucleico isoladas de acordo com a presente divulgagao aínda incluem moléculas produzidas por síntese química.

Polinucleótidos isolados da divulgagao incluem a molécula de DNA mostrada ñas Figuras 2A-B (SEQ ID NOs: 2 e 19), moléculas de DNA compreendendo a sequéncia codificadora das proteínas de fusáo EML2-ALK maduras mostradas ñas Figuras 1A-1B (SEQ ID NOs: 1 e 18) e moléculas de DNA que compreendem urna sequéncia substancialmente diferente das descritas acima mas que, devido á degenerescencia do código genético, aínda codificam um polipéptido ALK mutante da divulgagao. 0 código genético é bem conhecido na arte, assim, será rotina para os familiarizados com aa arte gerar tais variantes degeneradas.

Numa outra realizagao, a divulgagao proporciona um polinucleótido isolado codificador do polipéptido de fusáo EML4-ALK compreendendo a sequéncia nucleotídica de fusáo EML4-ALK contida no clone de cDNA depositado acima descrito. De preferéncia, tal molécula de ácido nucleico codificará o polipéptido de fusáo maduro codificado pelo clone de cDNA depositado ou um outro clone que expresse urna proteína de fusáo EML4-ALK de tamanho completo aquí descrita. Numa outra realizagáo, a divulgagao proporciona urna sequéncia nucleotidica isolada codificadora de um polipéptido de fusao EML4-ALK compreendendo a sequéncia de aminoácidos N-terminal de EML-4 (residuos 1-233 de SEQ ID NO: 3 ou residuos 1-495 de SEQ ID NO: 3) e o dominio cinase de ALK (residuos 1116-1383 de SEQ ID N05). Numa realizagáo, o polipéptido compreendendo o dominio cinase de ALK compreende os residuos 1057-1620 de SEQ ID NO:5 (ver Figura 1, Painel B). Numa outra realizagao, a sequéncia de aminoácidos N-terminal referida de EML-4 e o dominio cinase de ALK sao codificados por sequéncias nucleotidicas compreendendo os nucleótidos 1-700 de SQ ID NO: 4 ou os nucleótidos 1-1486 de SEQ ID NO: 4 e os nucleótidos 3171-4860 de SEQ ID NO:6, respectivamente. A divulgagao aínda proporciona polinucleótidos isolados compreendendo sequéncias nucleotidicas tendo urna sequéncia complementar de um dos polinucleótidos ALK mutantes da divulgagao. Tais moléculas isoladas, particularmente moléculas de DNA, sao úteis como sondas para o mapeamento de genes, através de hibridagao in situ com cromossomas e para detectar a expressao de urna proteína de fusao EML4-ALK em tecido humano, por exemplo, através da análise de transíeréncias Northern, como descrito na Secgáo F abaixo.

A presente divulgagao é aínda dirigida a fragmentos isolados das moléculas de ácido nucleico aquí descritas. Por um fragmento de um polinucleótido EML4-ALK isolado da divulgagáo pretende-se significar fragmentos de pelo menos aproximadamente 15 nucleótidos e mais de preferencia pelo menos cerca de 20 nucleótidos, ainda mais de preferencia pelo menos cerca de 30 nucleótidos e mesmo mais de preferencia, pelo menos cerca de 40 nucleótidos de comprimento, os quais sao úteis como sondas de diagnóstico e sequéncias iniciadoras como aqui discutido. Certamente, fragmentos maiores de aproximadamente 50-1500 nucleótidos de comprimento sao igualmente úteis de acordo com a presente divulgagáo, tal como fragmentos correspondendo á maioria, senao a totalidade, das sequéncias de nucleótidos de ALK mutante dos cDNA depositados ou como se mostra na Figura 2 (SEQ ID NO:2) ou outro clone que expresse um polipéptido de fusao como se mostra ñas Figuras 2A-B (SEQ ID NOs: 2 ou 19). Um fragmento de pelo menos 20 nucleótidos de comprimento, por exemplo, pretende incluir fragmentos que possuam 20 ou mais bases contiguas das respectivas sequéncias nucleotidicas de onde os fragmentos derivam. A geragao de tais fragmentos de DNA é rotina para os familiarizados com a arte e pode ser conseguida, por exemplo, através de corte com endonucleases de restrigao ou quebra por sonicagao de DNA obtido a partir do clone de cDNA depositado ou sintetizado de acordo com a sequéncia aqui divulgada. Como alternativa, tais fragmentos podem ser directamente gerados por sintese química.

Fragmentos de ácidos nucleicos preferidos ou sondas da presente da divulgagáo incluem moléculas de ácido nucleico codificadoras da jungáo de fusao dos produtos do gene de fusao EML4-ALK (ver Figuras 1A-B, painel B) . Por exemplo, em determinadas realizagóes preferidas, m polinucleótido isolado da divulgagao compreende urna sequéncia/fragmento de nucleótidos compreendendo pelo menos seis nucleótidos contiguos abrangendo a jungao de fusao (nucleótidos 700-701 de SEQ ID NO:2 ou nucleótidos 1486-1487 de SEQ ID NO: 19) de um polinucleótido de fusao EML4-ALK (ver Figuras 1A-B, painel B (SEQ ID Ns: 8 e 25) . Numa outra realizagao preferida, um polinucleótido isolado da divulgagao compreende urna sequéncia/fragmento de nucleótidos que codifica um polipéptido compreendendo pelo menos seis aminoácidos contiguos abrangendo a jungao de fusao (residuos 233-234 de SEQ ID NO:l ou residuos 495-496 de SEQ ID NO: 18) de um polipéptido de fusao EML4-ALK (ver Figuras 1A-B, painel inferior (SEQ ID NOs:7 e 24)).

Num outro aspecto, a divulgagao proporciona um polinucleótido isolado que híbrida em condigóes de hibridagáo restringentes com urna porgáo de um polinucleótido ALK mutante da divulgagao como aquí descrito. Por "condigóes de hibridagao restringentes" pretende-se significar incubagao durante a noite a 42°C numa solugao compreendendo: 50% formamida, 5X SSC (750 mM NaCl, citrato trissódico 75 mM), fosfato de sodio 50 mM (pH 7,6), solugao de Denhardt 5X, 10% sulfato de dextrano e 20 microgramas/ml de DNA de esperma de salmáo cortado, seguido de lavagens dos filtros em 0,1X SSC a cerca de 65°C.

Por um polinucleótido que híbrida com urna "porgao" de um polinucleótido pretende significar um polinucleótido (DNA ou RNA) que híbrida com pelo menos cerca de 15 nucleótidos (nt) e mais de preferencia pelo menos cerca de 20 nt, aínda mais de preferencia pelo menos cerca de 30 nt e mesmo mais de preferencia cerca de 30-70 nt do polinucleótido de referencia. Estes sao úteis como sondas de diagnóstico e sequéncias iniciadoras como discutido acima e mais detalhadamente abaixo.

Certamente, os polinucleótidos que hibridam com urna porgao maior do polinucleótido de referencia (e.g. o polinucleótido de fusao EML4-ALK madura descrito na Figura 2 (SEQ ID NO:2)), por exemplo, urna porgao de 50-750 nt de comprimento ou mesmo com o total do comprimento do polinucleótido de referencia, sao úteis como sondas de acordo com a presente divulgagao, como os polinucleótidos correspondendo á maior parte, senao a totalidade, das sequéncias nucleotídicas dos cDNAs depositados ou sequéncias de nucleótidos mostrados ñas Figuras 2A-B (SEQ ID NOs:2 ou 19) ou Figuras 1A-B (painel B)) (SEQ ID NOs: 7 e 24) .

Por porgao de um polinucleótido de "pelo menos 20 nucleótidos de comprimento", por exemplo, pretende-se significar 20 ou mais nucleótidos contiguos da sequéncia de nucleótidos do polinucleótido de referéncia. Como indicado, tais porgóes sao úteis em diagnóstico como sonda de acordo com técnicas convencionais de hibridagao de DNA ou como sequéncias iniciadoras para amplificagao de urna sequéncia alvo pela reacgáo em cadeia da polimerase (PCR) , como descrito, por exemplo, em MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, 2nd Ed., Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T., eds., Coid Spring Harbor Laboratory Press, Coid Spring Harbor, N.Y. (1989), cuja divulgagáo da sua totalidade é aquí incluida como referencia. Certamente, um polinucleótido que híbrida apenas com urna sequéncia poli(A) (como seja o segmento poli(A) 3'terminal da sequéncia EML4-ALK mostrada na Figura 2 (SEQ ID N0:2)) ou com um segmento complementar de residuos T (ou U) , nao estará incluido num polinucleótido da divulgagáo usado para hibridar com urna porgao de um ácido nucleico da divulgagáo, urna vez que tal polinucleótido hibridará com qualquer molécula de ácido nucleico contendo um segmento poli(A) ou o seu complemento (e.g. praticamente qualquer clone de cDNA de cadeia dupla).

Como indicado, as moléculas de ácido nucleico da presente divulgagáo, que codifica um polipéptido ALK mutante da divulgagáo, pode incluir, mas nao lhes está limitado, os codificadores da sequéncia de aminoácidos do polipéptido maduro, por si só; a sequéncia codificadora do polipéptido maduro e sequéncias adicionáis, tais como codificadoras da sequéncia líder ou secretora, como seja urna sequéncia de pré- ou pro ou pre-proproteína; a sequéncia codificadora do polipéptido maduro, com ou sem as sequéncias codificadoras adicionadas mencionadas, juntamente com sequéncias náo codificadoras adicionáis, incluindo por exemplo, mas náo lhes estando limitados, intróes e sequéncias náo codificadoras 5' e 3' , tais como as sequéncias transcritas nao traduzidas que desempenham um papel na transcrigáo, processamento de mRNA, incluindo sinais de "splicing" e de poliadenilagao, por exemplo ligagáo ao ribossoma e estabilidade do mRNA; urna sequéncia codificadora adicional que codifica aminoácidos adicionáis, como sejam os que proporcionam outras funcionalidades.

Assim, a sequéncia codificadora do polipéptido pode ser fundida com urna sequéncia marcadora, como seja urna sequéncia codificadora de um péptido que facilita a purificagáo do polipéptido fundido. Em determinadas realizagoes preferidas deste aspecto da divulgagao, a sequéncia de aminoácidos marcadora é um péptido de hexa-histidina, como se ja a cauda proporcionado num vector pQE (Qiagen, Inc.), entre outros, muitos dos quais sao comercializados. Como descrito em Gentz et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86:821-824 (1989), por exemplo, a hexa-histidina proporciona purificagao conveniente da proteina de fusáo. A cauda "HA" é um outro péptido útil para a purificagao, o qual corresponde a um epitopo derivado da proteina hemaglutinina do virus da gripe, que foi descrita por Wilson et al., Cell 37: 767 (1984). Como descrito abaixo, outra dessas proteínas de fusao incluem um polipéptido de fusao EML4-ALK fundido com Fe no extremo N ou C. A presente divulgagao aínda está relacionada com variantes das moléculas de ácido nucleico da presente divulgagao, as quais codificam porgóes, análogos ou derivados de um polipéptido de fusáo EML4-ALK aquí divulgado. As variantes podem ocorrer naturalmente, como seja urna variante alélica natural. Por urna "variante alélica" pretende-se significar urna de várias formas alternativas de um gene que ocupa um determinado locus num cromossoma de um organismo. Ver, e.g. GENES II, Lewin, B., ed., John Wiley & Sons, New York (1985) . Variantes nao naturais podem ser produzidas usando técnicas de mutagénese conhecidas na arte.

Tais variantes incluem as produzidas por substituigóes, delegóes ou adigóes de nucleótidos. As substituigóes, delegóes ou adigóes podem envolver um ou mais nucleótidos. As variantes podem ser alteradas ñas regióes codificadoras, regióes nao codificadoras ou abas. As alteragóes ñas regióes codificadoras podem produzir substituigóes nao conservadas, delegóes ou adigóes de aminoácidos. Entre estas sao especialmente preferidas as substituigóes, delegóes ou adigóes silenciosas que nao alteram as propriedades e actividades (e.g. actividade de cíñase) dos polipéptidos ALK mutantes aquí divulgados. Neste contexto, igualmente sao especialmente preferidas as substituigóes conservadas.

Outras realizagóes da divulgagáo incluem polinucleótido isolados compreendendo urna sequéncia nucleotídica pelo menos 90% idéntica e mais de preferencia pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idéntica a um polinucleótido ALK mutante da divulgagáo (por exemplo, urna sequéncia nucleotídica codificadora do polipéptido de fusao EML4-ALK tendo a sequéncia de aminoácidos mostrada na Figura 2 (SEQ ID N0:1; ou urna sequéncia nucleotídica codificadora do extremo N de EML-4 e o dominio cíñase de ALK (ver Figura 1, painel B; e Figuras 3 e 4); ou um urna sequéncia de nucleótidos complementar de tais sequéncias exemplificativas).

Por polinucleótido tendo urna sequéncia de nucleótidos pelo menos, por exemplo, 95% "idéntica" a urna sequéncia de nucleótidos de referéncia codificadora de um polipéptido ALK mutante pretende-se significar que a sequéncia nucleotídica do polinucleótido é idéntica á sequéncia de referéncia excepto a sequéncia polinuleotídica poder incluir até cinco mutagóes pontuais por cada 100 nucleótidos da sequéncia nucleotídica de referéncia codificadora do polipéptido ALK mutante. Por outras palavras, para obter um polinucleótido tendo urna sequéncia de nucleótidos pelo menos 95% idéntica a urna sequéncia de nucleótidos de referéncia, até 5% dos nucleótidos na sequéncia de referéncia pode estar deletada ou substituida com um outro nucleótido ou urna série de nucleótidos até 5% dos nucleótidos totais na sequéncia de referéncia podem ser inseridos na sequéncia de referéncia. Estas mutagóes da sequéncia de referéncia podem ocorrer ñas posigóes termináis 5' ou 3' da sequéncia de nucleótidos de referéncia ou algures entre estas posigóes termináis, dispersas individualmente no seio dos nucleótidos da sequéncia de referéncia ou num ou mais grupos contiguos dentro da sequéncia de referencia.

Em termos práticos, se qualquer molécula de ácido nucleico particular for pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idéntica, por exemplo, as sequéncias nucleotidicas mostradas ñas Figuras 2A-B (SEQ ID NOs:2 e 19) ou á sequéncia nucleotidica dos clones de cDNA depositados acima descritos pode ser determinado convencionalmente usando programas informáticos conhecidos tais como (Wisconsin Sequence Analysis Package, Versión 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, Wis. 53711. Bestfit usa o algoritmo de homología local de Smith e Waterman, Advances in Applied Mathematics 2: 482-489 (1981), para encontrar o melhor segmento de homología entre duas sequéncias. Quando da utilizagáo do Bestfit ou de qualquer outro programa de alinhamento de sequéncias para determinar se urna sequéncia particular é, por exemplo, 95% idéntica a urna sequéncia polinucleotídica da fusáo EML4-ALK de referéncia ou a urna sequéncia polinucleotídica ALK truncada de acordo com a presente divulgagáo, os parámetros sao estabelecidos, certamente, de modo a que a percentagem de identidade seja calculada ao longo de todo o comprimento da sequéncia nucleotidica de referéncia e sao permitidas lacunas na homología até 5% do número total de nucleótidos na sequéncia de referéncia. A presente divulgagáo incluí no seu ámbito moléculas de ácido nucleico pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idénticas á sequéncia de ácido nucleico mostrada na Figura 2 (SEQ ID N0:2) ou as sequéncias de ácido nucleico dos cDNA depositados, independentemente de codificarem um polipéptido tendo actividade de cíñase ALK. Isto é porque mesmo quando urna molécula de ácido nucleico particular nao codifica um polipéptido de fusáo tendo actividade de cinase ALK, os familiarizados com a arte saberao como usar a molécula de ácido nucleico, por exemplo, como sonda de hibridagáo ou como urna sequéncia iniciadora na reacgáo em cadera com polimerase (PCR). Usos das moléculas de ácido nucleico da presente divulgaqáo que nao codificam um polipéptido tendo cinase incluem, ínter alia, (1) isolamento do gene com delegáo eEML4-ALK ou o gene ALK truncado ou variantes alélicas dos mesmos numa biblioteca de cDNA; (2) hibridagáo in situ (e.g. "FISH") com dispersóes de cromossomas na metáfase para proporcionar a localizagáo precisa do gene com delegáo EML4-ALK ou gene ALK truncado, como descrito em Verma et al., HUMAN CHROMOSOMES: A MANUAL OF BASIC TECHNIQUES, Pergamon Press, New York (1988); e análise de transíeréncias Northern para detecgáo da proteína de fusáo EML4-ALK ou expressáo de mRNA de cinase ALK truncada em tecidos específicos.

No entanto, sao preferidas moléculas de ácido nucleico tendo sequéncias pelo menos 95% idéntica a um polipéptido ALK mutante da divulgagáo ou á sequéncia de ácido nucleico dos cDNA depositados que, de facto, codificam um polipéptido de fusáo tendo actividade cinase ALK. Tal actividade pode ser similar, mas náo necessariamente idéntica, á actividade de urna proteína de fusao EML4-ALK aquí divulgada (proteína de tamanho completo, proteína madura ou um fragmento proteico que mantem a actividade cíñase), conforme medido num ensaio biológico particular. Por exemplo, a actividade cíñase de ALK pode ser analisada determinando a sua capacidade para fosforilar urna ou mais substratos peptídicos contendo tirosina, por exemplo, Substrato 1 ou 2 do Receptor da

Insulina (IRS1, IRS2) que sao substratos da cíñase ALK.

Devido á degenerescencia do código genético, os familiarizados com a arte reconhecerao imediatamente que um grande número das moléculas de ácido nucleico tendo urna sequéncia pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idéntica á sequéncia de ácido nucleico dos cDNA depositados ou ás sequéncias de ácido nucleico mostradas ñas Figuras 2A-B. (SEQ ID N°s: 2 e 19) codificaráo um polipéptido mutante tendo actividade ALK. De facto, urna vez que as variantes degeneradas destas sequéncias nucleotídicas todas codificam o mesmo polipéptido, isto será claro para os familiarizados com a arte mesmo sem realizar o ensaio de comparagáo acima descrito. Será aínda reconhecido na arte que, para tais moléculas de ácido nucleico que nao sao variantes degeneradas, um número razoável também codificará um polipéptido que mantem a actividade cíñase ALK. Isto é porque os familiarizados com a arte conhece quais as substituigóes de aminoácidos que tém menos probabilidade ou nao tém probabilidade de significativamente desempenharem a fungáo da proteína (e.g. substituigáo de um aminoácido alifático por um segundo aminoácido alifático).

Por exemplo, a orientagáo no que respeita a como fazer substituigoes de aminoácidos fenotipicamente silenciosas é proporcionada em Bowie et al., "Deciphering the Message in Protein Sequences: Tolerance to Amino Acid Substitutions," Science 247: 1306-1310 (1990), que descreve duas abordagens principáis para o estudo da tolerancia a urna alteragao sequéncia de aminoácidos. O primeiro método baseia-se no processo de evolugáo, em que as mutagóes sao aceites ou rejeitadas através da selecgao natural. A segunda abordagem usa engenharia genética para introduzir alteragóes de aminoácidos em posigóes especificas de um gene clonado e selecgoes ou rástrelos para identificar sequéncias que mantém a funcionalidade. Estes estudos revelaram que as proteínas sao surpreendentemente tolerantes ás substituigdes de aminoácidos. Os familiarizados com a arte de tais técnicas também apreciaráo que as alteragóes de aminoácidos sao provavelmente permissivas numa determinada posigáo da proteina. Por exemplo, os residuos de aminoácidos mais internos necessitam de cadeias laterais nao polares, enquanto algumas características das cadeias laterais da superficie sao, de um modo geral, conservadas. Outras substituigoes fenotipicamente silenciosas estao descritas e Bowie et al., supra., e ñas referencias ai citadas. Métodos de sequenciagáo de DNA que sao bem conhecidos e geralmente disponíveis na arte podem ser usados para por em prática realizagóes de quaisquer polinucleótidos da divulgagao. Os métodos podem empregar enzimas tais como o fragmento Klenow da DNA polimerase I, SEQUENASE® (US Biochemical Corp, Cleveland, Ohio), polimerase Taq (Perkin Elmer), polimerase T7 estável o calor (Amersham, Chicago, IL), ou combinagóes de polimerases recombinantes e exonucleases de revisao de provas tais como ELONGASE Amplification System comercializada pela Gibco BRL (Gaithersburg, Md.). De preferencia, o processo é automático com máquinas tais como Hamilton Micro Lab 2200 (Hamilton, Reno, Nev.), Peltier Thermal Cycler (PTC200; MJ Research, Watertown, Mass.) e o sequenciador de DNA ABI 377 (Perkin Elmer).

As sequéncias polinucleotidicas codificadoras de um polipéptido ALK mutante da divulgagáo podem ser prolongadas usando urna sequéncia nucleotidica parcial e empregando vários métodos conhecidos para detectar sequéncias a montante tais como promotores e elementos reguladores. Por exemplo, um método que pode ser empregue, "PCR com "locáis de restrigáo", usa sequéncias iniciadoras universais para recuperar sequéncias desconhecidas adjacentes a um determinado locus (Sarkar, G., PCR Methods Applic. 2:318-322 (1993)). Em particular, O DNA genómico é primeiro amplificado na presenga de urna sequéncia iniciadora com um elemento de ligagáo e urna sequéncia iniciadora especifica da regiáo conhecida. Sao exemplos de sequéncias iniciadoras as aquí descritas no Exemplo 2. As sequéncias amplificadas sao entáo sujeitas a urna segunda reacgáo de PCR com a mesma sequéncia iniciadora do elemento de ligagáo e urna outra sequéncia iniciadora especifica interna relativamente á primeira. Os produtos de cada reacgáo de PCR sao transcritos com urna RNA polimerase adequada e sequenciados usando transcriptase reversa. 0 PCR inverso também pode ser usado para amplificar ou prolongar sequéncias usando sequéncias iniciadoras divergentes baseadas numa regiao conhecida (Triglia et al., Nucleic Acids Res. 16:8186 (1988)). As sequéncias iniciadoras podem ser projectadas usando o programa informático OLIGO 4.06 Primer Analysis (National Biosciences Inc., Plymouth, Minn.) ou qualquer outro programa adequado, para terem 22-30 nucleótidos de comprimento, para terem um teor de GC de 50% ou mais e para emparelharem com a sequéncia alvo a temperaturas de cerca de 68-72°C. O método usa várias enzimas de restrigáo para gerar um fragmento adequado na regiao conhecida de um gene. O fragmento é entáo circularizado através da ligagáo intramolecular e usado como urna matriz de PCR.

Um outro método que pode ser usado é o PCR de captura que envolve a amplificagáo por PCR de fragmentos de DNA adjacentes a urna sequéncia conhecida em DNA humano e de cromossoma artificial de levedura (Lagerstrom et al., PCR Methods Applic. 1: 111-119 (1991)). Neste método, múltiplas digestóes com enzimas de restrigáo e ligagóes podem ser igualmente usadas para colocar urna sequéncia de cadeia dupla genéticamente manipulada numa porgáo desconhecida da molécula de DNA antes de se fazer o PCR. Um outro método que pode ser usado para recuperar sequéncias desconhecidas é o descrito em Parker et al., Nucleic Acids Res. 19:3055-3060 (1991)). Aínda, pode ser usado PCR, sequéncias iniciadoras "nested" e bibliotecas PROMOTERFINDER® para andar ao longo do DNA genómico (Clontech, Palo Alto, Calif.). Este processo evita a necessidade de fazer o rastreio de bibliotecas e é útil para encontrar jungóes intrao/exao.

Quando do rastreio de cDNA de tamanho completo, prefere-se usar bibliotecas que tenham sido seleccionadas pelo tamanho de forma a incluírem cDNA maiores, Igualmente as bibliotecas iniciadas aleatoriamente sao preferidas, urna vez que possuirao mais sequéncias que contém as regióes 5' dos genes. O uso de urna biblioteca iniciada aleatoriamente pode ser especialmente preferido para situagóes em que urna biblioteca de oligo d(T) nao origine um cDNA de tamanho completo. Bibliotecas genómicas podem ser úteis para a extensao de sequéncias no sentido de regióes nao transcritas 5' e 3'.

Os sistemas de electroforese capilar, os quais sao comercializados, podem ser utilizados para analisar o tamanho ou confirmar a sequéncia de nucleótidos da sequenciagao ou os produtos de PCR. Em particular, a sequenciagao capilar pode empregar polímeros de elevado escoamento para separagao electroforética, quatro corantes fluorescentes diferentes (um para cada nucleótido) os quais sao activados por láser e detecgáo dos comprimentos de onda emitidos através de urna cámara com dispositivo de carga acoplado. A intensidade da luz emitida pode ser convertida em sinal eléctrico usando um programa informático adequado (e.g. GENOTYPER™ and SEQUENCE NAVIGATOR™, Perkin Elmer) e todo o processo desde a aplicagáo das amostras até á análise informática e apresentagáo electrónica dos dados pode ser controlada informáticamente. A electrofórese capilar é especialmente preferida para a sequenciagao de pequeños fragmentos de DNA que possam estar presentes em quantidades limitadas numa amostra particular. C. Vectores e células hospedelras A presente divulgagáo também proporciona vectores recombinantes que compreendem um polinucleótido isolado da presente divulgagáo, células hospedeiras que estáo genéticamente manipuladas com os vectores recombinantes e a produgáo de polipéptidos EML4-ALK recombinantes ou fragmentos dos mesmos através de técnicas recombinantes.

As construgbes recombinantes podem ser introduzidas ñas células hospedeiras usando técnicas bem conhecidas tais como infecgáo, transdugáo, transfecgao transvecgáo, electroporagáo e transíormagáo. 0 vector pode ser, por exemplo, um fago, plasmídeo, vector viral ou retroviral. Os vectores retrovirais podem ser competentes para a replicagáo ou defectivos para a replicagáo. Neste último caso, a propagagáo viral geralmente ocorre apenas em células hospedeiras de complementagao.

Os polinucleótidos podem ser ligados a um vector contendo urna marca seleccionável para propagagao num hospedeiro. De um modo geral, um vector plasmídico é introduzido num precipitado, como seja precipitado de fosfato de cálcio, ou num complexo com um lípido carregado. Se o vector for um virus, ele pode ser encapsidado in vitro usando urna linha celular de encapsidagao adequada e depois transduzido para as células hospedeiras.

Sao preferidos vectores compreendendo regióes de controlo que actuam em cis relativamente ao polinucleótido de interesse, Factores que actuam em trans adequados podem ser fornecidos pelo hospedeiro, fornecidos por um vector de complementagao ou fornecidos pelo próprio vector quando da introdugao no hospedeiro. Em determinadas realizagóes preferidas neste contexto, os vectores proporcionados para a expressáo especifica, os quais podem ser induziveis e/ou específicos do tipo celular. Particularmente preferidos entre tais vectores estao os induziveis por factores ambientáis que sao fáceis de manipular, como sejam a temperatura e aditivos nutricionais,

Os vectores de expressáo úteis na presente divulgagao incluem vectores derivados de cromossomas, epissomas e virus, e.g. vectores derivados de plasmídeos bacterianos, bacteriófagos, epissomas de levedura, elementos cromossómicos de levedura, virus tais como baculovírus papovavírus, virus da vacina, adenovírus, poxvírus das galinhas, virus da pseudo-raiva e retrovirus e vectores derivados de combinagóes dos mesmos, tais como cosmideos e fagemideos. 0 inserto de DNA compreendendo um polinucleótido EML4-ALK ou da divulgagáo deverá ser operacionalmente ligado a um promotor adeguado como se ja o promotor PL do fago lambda, os promotores lac, trp e tac de E. coli, os promotores precoce e tardío de SV40 e promotores das LTR de retrovirus, para mencionar apenas alguns. Outros promotores adequados sao conhecidos dos familiarizados com a arte. As construgóes de expressao conterao aínda locáis para iniciagáo e terminagao da transcrigáo e, na regiao transcrita, um local de ligagáo ao ribossoma para tradugáo. A porgao codificadora dos transcritos maduros expressos pelas construgóes, de preferencia, incluirá urna iniciagáo da tradugáo no inicio e um codáo de terminagáo (UAA, UGA ou UAG) adequadamente posicionado no final do polipéptido a ser traduzido.

Como indicado, os vectores de expressáo, de preferencia, incluiráo pelo menos urna marca seleccionável. Tais marcas incluem a di-hidrofolato redutase ou a resistencia a neomicina para cultura de células eucarióticas e genes de resistencia á tetraciclina ou á ampicilina para a cultura em E. coli e noutras bactérias. Exemplos representativos de hospedeiros adequados incluem, mas nao lhes estáo limitados, células bacterianas, tais como E. coli, Streptomyces e Salmonella typhimurium; células de fungos, tais como células de levedura; células de insecto tais como as células de S2 de Drosophila e Sf9 de Spodoptera; células animáis tais como CHO, COS e células de melanoma Bowes; e células vegetáis. Meios de cultura adequados e condigóes para as células hospedeiras acima descritas sao conhecidos na arte.

Entre os vectores preferidos para usar em bactérias incluem-se pQE70, pQE60 and pQE-9, disponíveis na Qiagen; vectores pBS, vectores Phagescript, vectores Bluescript, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A, disponíveis na Stratagene; e ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 disponíveis na Pharmacia. Entre os vectores eucarióticos preferidos estao pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXTl e pSG da Stratagene; e pSVK3, pBPV, pMSG e pSVL da Pharmacia. Outros vectores adequados serao fácilmente aparentes para os familiarizados com a arte.

Entre promotores bacterianos conhecidos adequados para usar na presente divulgagao incluem-se os promotores lacl e lacZ de E. coli, os promotores T3 e T7, o promotor gpt, os promotores PR e PL de lambda e o promotor trp. Promotores eucarióticos adequados incluem o promotor precoce imediato de CMV, o promotor da timidina cíñase de HSV, os promotores precoce e tardío de SV40, os promotores das LTR de retrovírus, como sejam os do virus do sarcoma de Rous (RSV) e os promotores da metalotioneína, como se ja o promotor da metalotioneína-1 de murganho.

Na levedura, Saccharomyces cerevisiae, pode ser usada urna série de vectores contendo promotores constitutivos ou induziveis tais como o factor alfa, álcool oxidase e PGH. Para revisóes, ver Ausubel et al., (1989) CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New York, N.Y, e Grant et ai., Methods Enzymol. 153:516-544 (1997). A introdugao da construgao na célula hospedeira pode ser efectuada através de transfecgao com fosfato de cálcio, transfecgao mediada por DEAE-dextrano, transfecao mediada por lipidos catiónicos, electroporagao, transdugao, infecgao e outros métodos. Tais métodos estao descritos em muitos manuais de laboratorio convencionais, tais como Davis et al., BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY (1986). A transcrigao do DNA codificador de um polipéptido de fusao EML4-ALK da presente divulgagáo por eucariotas superiores pode ser aumentada através da insergao de urna sequéncia estimuladora no vector. Os estimuladores sao elemento de actuagao em cis, geralmente com cerca de 10 a 300 pb que actuam de modo a aumentar a actividade de transcrigao de um promotor num determinado tipo de célula hospedeira. Exemplos de estimuladores incluem o estimulador de SV40, o qual está situado no lado tardío da origem de replicagao nos pares de bases 100 a 270, o estimulador do promotor precoce de citomegalovírus, o estimulador do virus polioma no lado tardio da origem de replicagáo e os estimuladores de adenovírus.

Para a secregao da proteína traduzida para o lúmen do retículo endoplasmático, para o espago periplásmico ou para o ambiente extracelular, podem ser incorporados sinais de secregao adequados no polipéptido expresso. Os sinais podem ser endógenos relativamente ao polipéptido ou podem ser sinais heterólogos. 0 polipéptido pode ser expresso numa forma modificada, como seja como urna proteína de fusao (e.g. urna fusao com GST) e pode incluir nao só sinais de secregao, como também outras regióes funcionáis heterólogas. Por exemplo, urna regiao de aminoácidos adicionáis, particularmente aminoácidos carregados, pode ser adicionada ao extremo N do polipéptido para melhorar a estabilidade e persistencia na célula hospedeira, durante a purificagáo ou durante subsequente manipulagao e armazenamento. Igualmente, podem ser adicionadas fracgóes peptídicas ao polipéptido para facilitar a purificagáo. Tais regióes podem ser removidas antes da preparagáo final do polipéptido. A adigáo de fracgóes peptídicas aos polipéptidos para proporcionar secregao ou excregáo, para melhorar a estabilidade e para facilitar a purificagáo, entre outros, sáo técnicas familiares e de rotina na arte. Urna proteína de fusáo preferida compreende urna regiáo heteróloga de imunoglobulina que é útil para solubilizar proteínas.

Os polipéptidos de fusao EML4-ALK podem ser recuperados e purificados a partir de culturas de células recombinantes por métodos bem conhecidos incluindo precipitagao com sulfato de amonio ou com etanol, extracgao ácida, cromatografía de permuta aniónica ou catiónica, cromatografía em fosfocelulose, cromatografía de interacgao hidrofóbica, cromatografía de afinidade, cromatografía em hidroxilapatite e cromatografía com lactinas. Mais de preferencia, para a purificagao é empregue cromatografía líquida de alta resolugao ("HPLC"). Os polipéptidos a presente divulgagao incluem produtos purificados naturais, produtos de procedimentos de síntese química e produtos produzidos através de técnicas recombinantes a partir de um hospedeiro procariótico ou eucariótico, incluindo, por exemplo células de bactérias, leveduras, plantas superiores, insectos e mamíferos. Dependendo do hospedeiro empregue num processo de produgao recombinante, os polipéptidos da presente divulgagao podem ser glicosilados ou nao glicosilados. Aínda, os polipéptidos da divulgagao podem também incluir um residuo de metionina inicial modificado, nalguns casos como resultado de processos mediados pelo hospedeiro.

Assim, numa realizagao, a divulgagao proporciona um método para a produgao de um polipéptido de fusao EML4-ALK recombinante através da cultura de urna célula hospedeira recombinante (como descrito acima) em condigóes adequadas para a expressao do polipéptido de fusao e recuperagao do polipéptido. As condigóes de cultura adequadas ao crescimento das células hospedeiras e expressao dos polipéptidos recombinantes a partir de células sao bem conhecidas dos familiarizados com a arte. Ver, e.g. CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Ausubel FM et al., eds., Volume 2, Capitulo 16, Wiley Interscience. D. Polipéptidos isolados A divulgagáo também proporciona, em parte, polipéptidos de cinase ALK mutantes isolados e fragmentos dos mesmos. Numa realizagáo, a divulgagáo proporciona um polipéptido isolado compreendendo urna sequéncia de aminoácidos pelo menos 95% idéntica a urna sequéncia seleccionada do grupo consistindo em: (a) urna sequéncia de aminoácidos codificadora e um polipéptido de fusáo EML4-ALK compreendendo a sequéncia de aminoácidos de SEQ ID N0:1 ou SEQ ID NO:18; (b) urna sequéncia de aminoácidos codificadora e um polipéptido de fusáo EML4-ALK compreendendo a sequéncia de aminoácidos N-terminal de EML-4 (residuos 1-233 de SEQ ID N0:3 ou os residuos 1-495 de SEQ ID N0:3) e o dominio cinase de ALK (resíduoslll6-1383 de SEQ ID N0:5); e (c) urna sequéncia de aminoácidos codificadora de um polipéptido compreendendo pelo menos seis aminoácidos contiguos abrangendo a jungáo de fusáo (residuos 233-234 de SEQ ID N0:1 ou residuos 495-496 de SEQ ID N0:18) de um polipéptido de fusao ELM4-ALK.

Numa realizagáo preferida, sao proporcionados os polipéptidos ALK recombinantes mutantes da divulgagao, os quais podem ser produzidos usando um vector recombinante ou célula hospedeira recombinante como descrito acima.

Será reconhecido na arte que algumas sequéncias de aminoácidos de um polipéptido de fusao EML4-ALK ou polipéptido cíñase ALK truncado podem variar sem efeito significativo na estrutura ou fungao da proteína mutante. Se tais diferengas na sequéncia foram consideradas deve ser recordado que existiráo áreas críticas na proteína que determinam a actividade (e.g. o dominio cíñase de ALK). Em geral, é possível substituir residuos que formam a estrutura terciária, desde que os residuos que desempenham fungao semelhante sejam usados. Noutros casos, o tipo de residuo pode ser completamente nao importante se a alteragáo ocorrer numa regiáo nao crítica da proteína.

Assim, a divulgagao aínda incluí variagóes de um polipéptido de fusao EML4-ALK que mantém substancial actividade de cíñase ALK ou que incluem outras regióes das proteínas EML-4 ou ALK, como sejam as regibes proteicas discutidas abaixo. Tais mutantes incluem delegoes, insergóes, inversóes, repetigbes e substituigóes do mesmo tipo (por exemplo, substituigao de um residuo hidrofílico por um outro, mas nao fortemente hidrofílico por fortemente hidrofóbico como regra). Pequeñas alteragóes ou substituigóes "neutras" de aminoácidos teráo, em geral, pouco efeito na actividade.

Sao típicamente consideradas como substituicpóes conservadas as substituigóes, de uns por outros, entre aminoácidos alifáticos Ala, Val, Leu e lie; troca dos residuos hidroxilo Ser e Thr, troca dos residuos acídicos Asp e Glu, substituigao entre os residuos amida Asn e Gln, permuta dos residuos básicos Lys e Arg e substituigóes entre os residuos aromáticos Phe, Tyr. Sao exemplos de substituigóes de aminoácidos conservadas conhecidas dos familiarizados com a arte: aromáticos: fenilalanina, triptofano, tirosina; Hidrofóbicos: leucina, isoleucina, valina; Polares: glutamina, asparaginas; Básicos: arginina, lisina, histidina; Acídicos: ácido aspártico, ácido glutámico; Pequeños: alanina, serina, treonina, metionina, glicina. Como indicado detalhadamente acima, mais orientagóes respeitantes a quais as alteragóes de aminoácidos sao provavelmente silenciosas em termos fenotípicos (í.e nao tém provavelmente um efeito deletério significativo numa fungáo) podem ser encontrados em Bowie et al., Science 247, supra.

Os polipéptidos da presente divulgagáo sao, de preferencia proporcionados numa forma isolada e, de preferencia, sao substancialmente purificados. Urna versao produzida por vía recombinante de um polipéptido de fusao EML4-ALK da divulgagáo pode ser substancialmente purificada através de um método de passo único descrito em Smith and

Johnson, Gene 67:31-40 (1988).

Os polipéptidos da presente divulgagáo incluem os polipéptidos de fusao EML4-ALK das Figuras 2A-B(SEQ ID NOs: 1 e 18) (com ou sem inclusao de urna sequéncia líder), urna sequéncia de aminoácidos codificadora de um polipéptido de fusao EML4-ALK compreendendo a sequéncia de aminoácidos N-terminal de EML-4 (residuos 1-233 de SEQ ID NO:3 ou residuos 1-495 de SEQ ID NO: 3) e o dominio cíñase de ALK (residuos 1116-1383 de SEQ ID NO:5) e urna sequéncia de aminoácidos codificadora de um polipéptido compreendendo pelo menos seis aminoácidos contiguos englobando a jungáo de fusao (residuos 233-234 de SEQ UID NO:l ou residuos 495-496 de SEQ ID NO: 18) de um polipéptido de fusao EML4-ALK; e (ver também as Figuras 1A-B, painel inferior) , assim como polipéptidos que possuem pelo menos 90% de similaridade, de preferencia pelo menos 95% de similaridade e aínda mais de preferencia pelo menos 96% de similaridade, 97%, 98% ou 99% de similaridade com os descritos acima.

Por "% de similaridade" para dois polipéptidos pretende-se significar urna classificagáo de similaridade produzida por comparagáo das sequéncias de aminoácidos dos dois polipéptidos usando o programa Bestfit (Wisconsin Sequence Analysis Package, Versáo 8 para Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, Wis. 53711) e os parámetros por defeito para determinagáo da similaridade. Bestfit usa o algoritmo de homología local de Smith e Waterman (Advances in Applied

Mathematics 2: 482-489 (1981)) para encontrar o melhor segmento de similaridade entre duas sequéncias.

Por um polipéptido tendo urna sequéncia de aminoácidos pelo menos, por exemplo, 95% "idéntica" a urna sequéncia de aminoácidos de referéncia de um polipéptido de fusáo EML4-ALK da divulgagáo pretende-se significar que a sequéncia de aminoácidos do polipéptido é idéntica á sequéncia de referéncia excepto a sequéncia polipeptídica poder incluir até cinco alteragbes de aminoácidos por cada 100 aminoácidos da sequéncia de aminoácidos de referéncia do polipéptido ALK mutante. Por outras palavras, para obter um polipéptido tendo urna sequéncia de aminoácidos pelo menos 95% idéntica a urna sequéncia de aminoácidos de referéncia, até 5% dos residuos de aminoácidos na sequéncia de referéncia pode estar deletada ou substituida com um outro aminoácido ou urna série de aminoácidos até 5% dos residuos de aminoácidos totais na sequéncia de referéncia podem ser inseridos na sequéncia de referéncia. Estas alteragóes da sequéncia de referéncia podem ocorrer ñas posigóes termináis amino ou carboxilo da sequéncia de aminoácidos de referéncia ou algures entre estas posigóes termináis, dispersas individualmente no seio dos da sequéncia de referéncia ou num ou mais grupos contiguos dentro da sequéncia de referéncia.

Quando da utilizagáo do Bestfit ou de qualquer outro programa de alinhamento de sequéncias para determinar se urna sequéncia particular é, por exemplo, 95% idéntica a urna sequéncia de referencia de acordo com a presente divulgagáo, os parámetros sao estabelecidos, certamente, de modo a que a percentagem de identidade se ja calculada ao longo de todo o comprimento da sequéncia aminoácidos de referencia e sao permitidas lacunas na homología até 5% do número total de aminoácidos na sequéncia de referéncia.

Um polipéptido de fusáo EML4-ALK da presente divulgagáo pode ser usado como um marcador de massa molecular em géis de SDS-PAGE ou em colunas de filtragáo molecular em gel, por exemplo, usando métodos bem conhecidos dos familiarizados com a arte.

Como descrito mais detalhadamente abaixo, os polipéptidos da presente divulgagáo podem ser igualmente usados para gerar reagentes específicos dos polipéptidos de fusáo, tais como anticorpos policlonais e monoclonais ou reagentes específicos de polipéptidos truncados, os quais sao úteis em ensaios para detecgáo da expressáo de polipéptidos ALK mutantes como descrito abaixo ou como agonistas e antagonistas capazes de estimular ou inibir a fungáo/actividade da proteína ALK mutante. Aínda, tais polipéptidos podem ser usados no sistema de duplo híbrido de levedura para "capturar" proteínas que se liguem ao polipéptido de fusáo EML4-ALK ou a um polipéptido cíñase ALK mutante, os quais podem também ser agonistas e antagonistas candidatos de acordo com a presente divulgagáo. 0 sistema de duplo híbrido de levedura está descrito em Fields and Song, Nature 340: 245-246 (1989).

Num outro aspecto, a divulgagao proporciona um péptido ou polipéptido compreendendo urna porgáo portadora de um epitopo de um polipéptido da divulgagao, por exemplo, um epitopo compreendendo a jungao de fusao de um polipéptido de fusao EML4-ALK (ver Figuras 1A-B, painel inferior). 0 epitopo deste polipéptido é um epitopo imunogénico ou antigénico de um polipéptido da divulgagao. Um "epitopo imunogénico" é definido como urna parte de urna proteina que induz urna resposta de anticorpos quando a proteina completa é o imunogénio. Pensa-se que estes epitopos imunogénicos estejam confinados a alguns loci na molécula. Por outro lado, urna regiao de urna molécula proteica á qual um anticorpo se possa ligar é definida como um "epitopo antigénico". 0 número de epitopos imunogénicos de urna proteina geralmente é inferior ao número de epitopos antigénicos. Ver, por exemplo Geysen et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 81:3998-4002 (1983). A produgáo de anticorpos específicos do polipéptido de fusao da divulgagao está descrito mais detalhadamente abaixo.

Os anticorpos induzidos por péptidos ou polipéptidos portadores de epitopos antigénicos sao úteis para detectar urna proteína mimética e anticorpos contra diferentes péptidos podem ser usados para seguir o destino de várias regióes de um precursor proteico que sofre processamento pós-tradugáo. Os péptidos e anticorpos anti-péptidos podem ser usados numa variedade de ensaios qualitativos ou quantitativos para a proteína mimética, por exemplo em ensaios de competigáo urna vez que foi demonstrado que mesmo péptidos pequeños (e.g. cerca de 9 aminoácidos) podem ligar-se e deslocar os péptidos maiores nos ensaios de imunoprecipitagao. Ver, por exemplo, Wilson et al., Cell 37: 767- 778 (1984) at 777. Os anticorpos anti-péptidos da divulgagao também sao úteis para a purificagáo da proteina mimética, por exemplo, através de cromatografía de adsorgáo usando métodos conhecidos na arte. Os formatos de ensaios imunológicos estáo descritos mais detalhadamente abaixo.

Polipéptidos ALK mutantes recombinantes estáo também dentro do ámbito da presente divulgagao e podem sr produzidos usando polinucleótidos da divulgagao, como descrito na Secgáo B acima Por exemplo, a divulgagao proporciona, em parte, um método para a produgao de um polipéptido de fusao EML4-ALK recombinante através da cultura de urna célula hospedeira recombinante (como descrito acima) em condigóes adequadas para a expressáo do polipéptido de fusao e recuperagáo do polipéptido. Condigóes de cultura adequadas para o crescimento de células hospedeiras e expressáo dos polipéptidos recombinantes a partir de tais células sao do conhecimento dos familiarizados com a arte. E. Reagentes específicos de mutantes

Reagentes específicos do polipéptido ALK mutante úteis na realizagáo dos métodos divulgados incluem, entre outros, anticorpos específicos do polipéptido de fusáo e péptidos AQUA (péptidos marcados com isótopos pesados) correspondendo ao polipéptido de fusao EML4-ALK e adequados para a detecgáo e quantif icagáo da sua expressáo numa amostra biológica de um cancro, como seja um sarcoma sólido ou tumor carcinoma de mamífero. Sao iqualmente úteis reagentes específicos de truncagem, tais como anticorpos, péptidos AQUA ou sondas de ácido nucleico, adequadas para detectar a presenga ou ausencia de um polinucleótido ou polipéptido cíñase ALK truncada da divulgagáo. Um reagente específico do polipéptido de fusao é qualquer reagente, biológico ou químico, capaz de específicamente se ligar, detectar e/ou quantificar a presenga/nível do polipéptido de fuáo EML4-ALK numa amostra biológica. 0 termo inclui, mas nao lhes está limitado, os reagentes de anticorpos e péptidos AQUA discutidos abaixo e reagentes equivalentes estáo dentro do ámbito da presente divulgagáo.

Anticorpos

Reagentes adequados para usar na realizagao dos métodos da divulgagáo incluem um anticorpo especifico do polipéptido de fusao EML4-ALK e um anticorpo especifico do polipéptido de fusao TFG-ALK. Um anticorpo específico da fusao da divulgagáo é um anticorpo ou anticorpos isolados que se ligam específicamente a um polipéptido de fusao EML4-ALK da divulgagáo (e.g. SEQ ID N0:1) as que nao se liga substancialmente a EML-4 selvagem ou a ALK selvagem ou liga-se específicamente a um polipéptido de fusao TFG-ALK aquí descrito (e.g. SEQ ID NO:20) mas que nao se liga substancialmente a TFG selvagem ou a ALK selvagem. Outros reagentes adequados incluem anticorpos específicos de epitopos que se ligam específicamente a um epitopo no dominio extracelular da sequéncia proteica ALK selvagem (dominio que nao está presente na cíñase ALK truncada activa aquí descrita) e sao portanto capazes de detectar a presenga (ou ausencia) de ALK selvagem numa amostra.

Anticorpos específicos do polipéptido de fusáo EML4-ALK ou TFG-ALK humanos podem também ligar-se a sequéncias peptídicas epitópicas altamente homologas ou equivalentes noutras espécies de mamífero, por exemplo murinos ou coelho, e vice versa. Anticorpos úteis na realizagáo dos métodos da divulgagáo incluem (a) anticorpos monoclonais, (b) anticorpos policlonais purificados que se ligam específicamente ao polipéptido alvo (e.g. a jungao de fusáo do polipéptido de fusáo EML4-ALK (ver Figuras 1A-B, painel inferior) ou do polipéptido de fusáo TFG-ALK (Ver Figura 1C, painel inferior), (c) anticorpos como descrito em (a)- (b) acima que se ligam a epitopos equivalentes e altamente homólogos ou a locáis de fosforilagáo noutras espécies náo humanas (e.g. murganho, rato) e (d) fragmentos (a)- (c) acima que se ligam ao antigénio (ou mais de preferencia ao epitopo) ligado pelos anticorpos do exemplo aquí divulgados. 0 termo "anticorpo" ou "anticorpos" como aquí usado refere-se a todos os tipos de imunoglobulinas, incluindo IgG, IgM, IgA, IgD e IgE. Os anticorpos podem ser monoclonais ou policlonais e podem ser de qualquer espécie de origem, incluindo (por exemplo) murganho, rato, coelho, cavalo ou ser humano ou podem ser anticorpos quiméricos. Ver, e.g. M. Walker et al., Malee. Immunol. 26: 403-11 (1989); Morrision et al., Proc. Nati. Acad. Sci. 81:6851 (1984); Neuberger et al., Nature 312:604 (1984)). Os anticorpos podem ser anticorpos monoclonais recombinantes produzidos de acordo com os métodos divulgados na Pat. U.S. N° 4,474,893 (Reading) ou Pat. U.S. No. 4,816,567 (Cabilly et al.). Os anticorpos podem também ser anticorpos específicos construidos químicamente de acordo com o método divulgado na Pat. U.S. N°4,676,980 (Segel et al.). O local epitópico preferido de um anticorpo específico do polipéptido de fusao EML4-ALK da divulgagáo é um fragmento peptídico consistindo essencialmente em cerca de 11 a 17 aminoácidos de urna sequéncia do polipéptido de fusao EML4-ALK (SEQ ID NOs: 1 e 18) cujo fragmento abrange a jungáo de fusao (a qual ocorre nos residuos 233-234 na proteína de fusao variante curta e nos residuos 495-496 na proteína de fusao variante longa (ver Figuras 1A-B (painel inferior) ) . Será apreciado que os anticorpos que se ligam específicamente a péptidos/epitopos mais curtos ou mais longos abrangendo a jungao de fusao de um polipéptido de fusao EML4-ALK estáo dentro do ámbito da presente divulgagáo.

De forma semelhante, o local epitópico preferido de um anticorpo específico do polipéptido de fusao TFG-ALK, útil na realizagáo dos métodos divulgados, é um fragmento peptídico consistindo essencialmente em cerca de 11 a 17 aminoácidos da sequéncia do polipéptido de fusao TFG-ALK humano (SEQ ID NO:20), fragmento que abrange a jungáo de fusao (a qual ocorre nos residuos 137-138 (ver Figura 1C (painel inferior)). A divulgagao nao está limitada ao uso de anticorpos, mas incluí moléculas equivalentes, tais como dominios de ligagáo a proteínas ou aptámeros de ácido nucleico, os quais se ligam, numa forma específica a proteínas de fusao ou em proteínas truncadas, essencialmente ao mesmo epitopo a que se liga o anticorpo específico do polipéptido de fusao EML4-ALK ou TFG-ALK útil nos métodos da divulgagao. Ver Neuberger et al., Nature 312:604 (1984). Tais reagentes equivalentes nao anticorpos podem ser adequadamente empregues nos métodos da divulgagao descrita mais detalhadamente abaixo.

Os anticorpos policlonais úteis na realizagáo dos métodos da divulgagao podem ser produzidos de acordo com técnicas convencionais através da imunizagáo de um animal adequado (e.g. coelho, cabra, etc.) com um antigénio que abrange um epitopo pretendido específico da proteína de fusao (e.g. a jungáo da fusao de urna proteína de fusao ALK aquí descrita) , colheita do soro imune do animal e separagáo dos anticorpos policlonais do soro imune e purificagao dos anticorpos policlonais tendo a especificidade pretendida, de acordo com procedimentos conhecidos. 0 antigénio pode ser um antigénio de péptido sintético compreendendo a sequéncia epitópica pretendida, seleccionada e construida de acordo com técnicas bem conhecidas. Ver, e.g. ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Chapter 5, p. 75-76, Harlow & Lañe Eds., Coid Spring Harbor Laboratory (1988); Czernik, Methods In Enzymology, 201:264-283 (1991); Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:21-49 (1962)). Os anticorpos policlonais produzidos como aquí descrito podem ser testados e isolados como descrito mais abaixo.

Os anticorpos monoclonais podem também ser benéficamente empregues nos métodos da divulgagao e podem ser produzidos em linhas celulares de hibridoma de acordo com a técnica bem conhecida de Kohler e Milstein. Nature 265:495-97 (1975); Kohler and Milstein, Eur. J. Immunol. 6:511 (1976); ver também, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Ausubel et al. Eds. (1989). Os anticorpos monoclonais assim produzidos sao altamente específicos e melhoram a selectividade e especificidade dos métodos de ensaio proporcionados pela divulgagao. Por exemplo, urna solugao contendo o antigénio apropriado (e.g. um péptido sintético compreendendo a jungao de fusao d polipéptido de fusao EML4-ALK) pode ser injectado num murganho e, após um tempo suficiente (de acordo com a s técnicas convencionais), o murganho é sacrificado e obtidas as células do bago. As células do bago sao entao imortalizadas através da sua fusao com células de mieloma, típicamente na presenga de polietilenoglicol, para produzir células de hibridoma. Os hibridomas de fusao de coelho, por exemplo, podem ser produzidos como descrito na Patente U.S. N°5,675,063, K. Knight, Publicado em 7 de Outubro, 1997. As células de hibridoma sao entao crescidas num meio de selecgao adequado, como se ja hipoxantina-aminopterina-timidina (HAT) e o sobrenadante testado para anticorpos monoclonais tendo a especificidade pretendida, como descrito abaixo. 0 anticorpo secretado pode ser recuperado do sobrenadante da cultura de tecidos através de métodos convencionais tais como precipitagao, cromatografía de permuta iónica ou de afinidade, ou similares.

Os fragmentos Fab monoclonais podem ser igualmente produzidos em Escherichia coli através de técnicas recombinantes conhecidas dos familiarizados com a arte. Ver, e.g., W. Huse, Science 246: 1275-81 (1989); Mullinax et ai., Proc. Nati. Acad. Sci. 87:8095 (1990). Se forem preferidos anticorpos monoclonais de um isotipo para urna aplicagao particular, isotipos particulares podem ser preparados directamente, através da selecgao a partir da fusao inicial ou preparados posteriormente a partir de um hibridoma parental, que secretam um anticorpo monoclonal de isotipo diferente, ao usar a técnica de selecgao Sib para isolar variantes de mudanga de classe (Steplewski, et al., Proc. Nati. Acad. Sci.,82:8653 (1985); Spira et al., J. Immunol. Methods, 74:307 (1984)). O local de combinagao do antigénio do anticorpo monoclonal pode ser clonado por PCR e os anticorpos de cadera simples produzidos como anticorpos recombinantes de apresentagao fágica ou como anticorpos solúveis em E. coli (ver, e.g.r ANTIBODY ENGINEERING PROTOCOLS, 1995, Humana Press, Sudhir Paul editor.) Aínda, a Pat. U.S. 5,194,392, Geysen (1990) descreve um método geral de detecgao ou determinagáo da sequéncia e monómeros (aminoácidos ou outros compostos) que é um equivalente topológico do epitopo (i.e um "mimotopo") que é complementar de um paratopo particular (local de ligagao ao antigénio) de um anticorpo de interesse. Mais genéricamente, este método envolve a detecgao ou determinagáo da sequéncia de monómeros que é um equivalente topográfico de um ligando que é complementar do local de ligagao do ligando de um receptor particular de interesse. De forma semelhante, a Pat. U.S No. 5,480,971, Houghten et al. (1996) divulga oligopéptidos lineares peralquilados com alquilo Cl-C e séries e bibliotecas de tais péptidos, assim como métodos para a utilizagáo de tais séries e bibliotecas de oligopéptidos para determinar a sequéncia de um oligopéptido peralquilado que preferencialmente se liga a urna molécula aceitadora de interesse. Assim, os análogos nao peptídicos dos péptidos portadores de epitopos da divulgagáo podem também ser feitos de rotina através destes métodos.

Anticorpos úteis nos métodos da divulgagáo, policlonais ou monoclonais, podem ser testados relativamente á especificidade do epitopo e proteína de fusáo de acordo com técnicas padronizadas. Ver, e.g. Czemik et al., Methods in Enzymology, 201:264-283 (1991). Por exemplo, os anticorpos podem ser testado contra urna biblioteca de péptidos por ELISA para assegurar a especificidade do antigénio pretendido e, caso se pretenda, a reactividade apenas com, e.g. um polipéptido de fusao EML4-ALK da divulgagao e nao com EML-4 selvagem ou com ALK selvagem. Os anticorpos podem ser igualmente testados por transferencia Western contra preparagdes de células contendo a proteina alvo para confirmar a reactividade apenas com o alvo pretendido e para assegurar ausencia de ligagao apreciável a outras proteínas de fusao envolvendo ALK. A produgao, rastreio e uso dos anticorpos específicos da proteina de fusao é conhecido dos familiarizados com a arte e tem sido descrito. Ver, e.g. Publicagao de Patente U.S. No. 20050214301, Wetzel et ai., 29 de Setembro, 2005.

Os anticorpos específicos do polipéptido de fusao úteis nos métodos da divulgagao podem apresentar alguma reactividade cruzada limitada com epitopos de fusao semelhantes noutras proteínas de fusao ou com epitopos de EML-4 selvagem, TFG selvagem e ALK selvagem que formam a jungao de fusao. Isto nao é inesperado urna vez que a maioria dos anticorpos apresenta algum grau de reactividade cruzada e os anticorpos anti-péptidos frequentemente dáo reacgao cruzada com epitopos tendo elevada homología ou identidade com o péptido imunizante. Ver, e.g. Czemik, supra. A reactividade cruzada com outras proteínas de fusao é fácilmente caracterizada por transferencia Western com marcadores de massa molecular conhecida. As sequéncias de aminoácidos das proteínas que dáo reacgáo cruzada podem ser analisadas para identificar locáis altamente homólogos ou idénticos á sequéncia do polipéptido de fusáo EML4-ALK ou TFG-ALK as quais o anticorpo se liga. Reactividade cruzada indesejável pode ser removida através de selecgáo negativa usando purificagáo dos anticorpos em colunas de péptidos (e.g. selecgao por rejeigao dos anticorpos que se ligam a EML-4 selvagem e/ou ALK selvagem).

Os anticorpos específicos do polipéptido de fusáo EML4-ALK da divulgagáo (e anticorpos específicos do polipéptido de fusáo TFG-ALK) que sáo úteis na realizagáo dos métodos aquí divulgados sáo idealmente específicos para o polipéptido de fusáo humano, mas nao estáo imitados apenas á ligagáo á espécie humana, per se. A divulgagáo incluí a produgáo e uso de anticorpos que também se ligam a epitopos conservados e altamente homólogos ou idénticos noutras espécies de mamífero (e.g. murganho, rato, macaco). Sequéncias altamente homologas ou idénticas noutras espécies podem ser fácilmente identificadas através de comparagóes de sequéncias convencionais, como seja usando BLAST, com urna sequéncia do polipéptido de fusáo EL4-ALK humano aquí divulgada (SEQID NOs:1 e 18) ou urna sequéncia do polipéptido de fusáo humano TFG-ALK aquí divulgada (SEQ ID NO:20).

Anticorpos empregues nos métodos da divulgagáo podem ser aínda caracterizados e validados para usar nm formato de ensaio particular, por exemplo citometria de fluxo (FC), imuno-histoquímica (IHC) e/ou imunocitoquímica (ICC) . O uso de anticorpos específicos do polipéptido de fusáo ALK em tais métodos é aínda descrito na Secgáo F abaixo. Os anticorpos podem também ser vantajosamente conjugados com corantes fluorescentes (e.g. Alexa488, PE) ou marcas tais como pontos quánticos, para usar em análises multiparamétricas juntamente com outros anticorpos de transdugáo de sinal (fosfo-AKT, fosfo-Erk W¡ e/ou marcador celular (citoqueratina) , como descrito mais detalhadamente na Secgáo F abaixo.

Na realizagáo dos métodos da divulgagáo, a expressao e/ou actividade de EML-4 selvagem, TFG selvagem e/ou ALK selvagem numa determinada amostra biológica pode também ser vantajosamente analisada usando anticorpos (fosfo-específicos ou totais) para estas proteínas selvagens. Por exemplo, anticorpos específicos de ALK total e específicos de locáis de fosforilagao sao comercializados (ver CELL SIGNALING TECHNOLOGY, INC., Beverly MA, 2005/06 Catalogue, #'s 3341, 3342). Tais anticorpos podem também ser produzidos de acordo com métodos convencionais, como descrito acima. As sequéncias de aminoácidos de EML-4, TFG e ALK humanas estáo publicadas (ver Figuras 3A e 4A-4C e referenciadas com Nos de Acesso SwissProt) como estao as sequéncias destas proteínas de outras espécies. A detecgáo da expressao e/ou activagáo de EML-4. TFG e ALK selvagens juntamente com a expressao do polipéptidos de fusáo EML4-ALK e/ou TFG-ALK, numa amostra biológica (e.g. urna amostra de tumor) pode proporcionar informagao sobre se a proteina de fusao por si só é responsável pelo tumor ou se ALK selvagem é também activada e responsável pelo tumor. Tal informagao é clínicamente útil na avaliagao do alvejamento da proteína da fusao ou das proteínas selvagens ou ambas, ou se é provável ser mais benéfico na inibigáo da progressáo do tumor e na selecgáo de um fármaco adequado ou combinagáo destas hipóteses. Anticorpos específicos para o dominio extracelular da cíñase ALK selvagem, o qual nao está presente na cíñase ALK activa truncada aquí divulgada, podem ser particularmente úteis para determinar se a presenga/auséncia da cíñase ALK mutante.

Será entendido que mais de um anticorpo pode ser usado na realizagao dos métodos acima descritos. Por exemplo, um ou mais anticorpos específicos do polipéptido de fusao EML4-ALK juntamente com um ou mais anticorpos específicos para urna outra cíñase, receptor ou substrato de cíñase suspeito de ser, ou potencialmente ser, activado num cancro em que o polipéptido de fusao EML4-ALK seja expresso podem ser simultáneamente empregues para detectar a actividade de tais outras moléculas de sinalizagáo numa amostra biológica compreendendo células de tal cancro.

Os familiarizados com a arte apreciarao que os polipéptidos de fusao EML4-ALK da presente divulgagáo e os seus fragmentos portadores do epitopo da jungáo de fusao acima descrito podem ser combinados com partes do dominio constante de imunoglobulinas (IgG), resultando em polipéptidos quiméricos. Estas proteínas de fusao facilitam a purificagáo e mostram urna semivida aumentada in vivo. Isto foi demonstrado, e.g., para proteínas quiméricas consistindo nos primeiros dois dominios do polipéptido CD4 humano e vários dominios das regides constantes das cadeias pesada ou leve de imunoglobulinas de mamífero (EPA 394,827; Traunecker et al., Nature 331:84-86 (1988)). As proteínas de fusao que possuem urna estrutura dimérica ligada por dissulfeto devido á parte de IgG podem também ser mais eficientes na ligagao e neutralizagao de outras moléculas que o polipéptido de fusao EML4-ALK monomérico por si só (Fountoulakis et al., J Biochem 270: 3958-3964 (1995)). Péptidos marcados com isótopos pesados (Péptidos AQUA).

Reagentes específicos do polipéptido de fusao EML4-ALK ou TFG-ALK úteis na realizagáo dos métodos da divulgagáo podem também compreender péptidos marcados com isótopos pesados adequados para a quantificagao absoluta do polipéptido de fusao AK expresso ou do polipéptido cúnase ALK truncado numa amostra biológica. A produgao e uso dos péptidos AQUA para a quantificagao absoluta de proteína (AQUA) em misturas complexas tém sido descritos. Ver WO/03016861, "Absolute Quantification of Proteins and Modified Forms Thereof by Multistage Mass Spectrometry," Gygi et al. e também Gerber et al. Proc. Nati. Acad. Sci. U. S.A. 100:6940-5 (2003) (cujos ensinamentos sao aquí incluidos na sua totalidade através da referencia) A metodología AQUA emprega a introdugáo de urna quantidade conhecida de pelo menos um padrao peptídico marcado com isótopo radioactivo (o qual possui urna assinatura única detectável por cromatografía LC-SRM) numa amostra biológica digerida de modo a determinar, por comparagáo com o padrao peptídico, a quantidade de um péptido com a mesma sequéncia e modificagáo proteica na amostra biológica. Resumidamente, a metodología AQUA possui duas fases: a selecgao e validagao do padrao interno peptídico e o método de revelagao; e a implementagao usando os padróes internos peptídicos validados para detectar e quantificar urna proteína alvo na amostra. 0 método é urna técnica poderosa para a detecgao e quantificagao de um determinado péptido/proteína dentro de urna mistura biológica complexa, como seja um lisado celular, e pode ser empregue, e.g., para quantificar alteragao na fosforilagao da proteína como resultado do tratamento com um fármaco ou para quantificar diferengas no nivel de urna proteína em diferentes estados biológicos.

De um modo geral, para desenvolver um padrao interno adequado, é escolhido um péptido particular (ou péptido modificado) dentro de urna sequéncia proteica alvo com base na sua sequéncia de aminoácidos e a protease a ser usada para digerir. 0 péptido é entáo gerado através de síntese de péptidos em fase sólida de modo que um residuo seja substituido pelo mesmo residuo contendo isótopos estáveis (C3C, 15N) . O resultado é um péptido que é químicamente idéntico á sua contraparte nativa formada por proteólise, mas é fácilmente distinta por MS através de um desvio de massa de 7-Da. 0 péptido padrao interno AQUA sintetizado de novo é entao avallado por LC-MS/MS. Este processo proporciona informagáo acerca da retengao do péptido através de cromatografía de fase reversa, eficiéncia de inonizagao e fragmentagao através de dissociagao induzida por colisáo. loes informativos e de fragmentos abundantes para séries de péptidos nativos e de padróes internos sao escolhidos e depois específicamente monitorizados em sucessao rápida em fungáo de retengao cromatográfica para formar um método de monitorizagao de urna reacgáo seleccionada (LC-SRM) baseado no perfil único do padrao peptídico.

Urna segunda fase da estratégia AQUA é a sua implementagáo para medir a quantidade de urna proteína ou proteína modificada a partir de misturas complexas. Lisados celulares totais sao típicamente fraccionados por electrofórese em gel SDS-PAGE e regibes do gel consistente co, a migragáo da proteína sao excisadas Este processo é seguido de proteólise em gel na presenga dos péptidos AQUA e análise LC-SRM. (Ver Gerber et al. supra). Os péptidos AQUA sao introduzidos na mistura complexa de péptidos obtida por digestáo do lisado de células totais com urna enzima proteolítica e sujeitos a purificagáo por imunoafinidade como descrito acima. 0 tempo de retengao e o padrao de fragmentagao do péptido nativo formado pela digestao (e.g. tripsinizagáo) é idéntico ao do péptido padrao interno AQUA previamente determinado; assim a análise LC-MS/MS usando urna experiencia SRM resulta na medigáo altamente espegífica e sensivel de misturas de padrao interno e de analito directamente a partir de misturas complexas de péptidos.

Urna vez que é adicionada urna quantidade absoluta do péptido AQUA (e.g. 250 fmol) a razao das áreas sob a curva poe ser usada para determinar os níveis de expressáo precisos de urna proteína ou forma fosforilada de urna proteína no lisado celular original. Aínda, o padrao interno está presente durante a digestao em gel á medida que sao gerados os péptidos nativos, de modo que a eficiencia de extracgáo dos péptidos a partir dos fragmentos de gel, perdas absolutas durante a manipulagáo da amostra (incluindo centrifugagáo sob vácuo) e variabilidade durante a introdugáo no sistema LC-MS nao afecta, a taxa determinada das abundancias dos péptidos nativos e AQUA. O padrao de péptido AQUA é revelado para urna sequéncia conhecida previamente identificada através do método IAP-LC-MS/MS dentro de urna proteína alvo. Se o local for modificado, um péptido AQUA incorporando a forma modificada do residuo particular dentro do local pode ser desenvolvido e um segundo péptido AQUA incorporando a forma nao modificada do residuo revelada. Desta forma, os dois padróes podem ser usados para detectar e quantificar as formas modificadas e nao modificadas do local numa amostra biológica.

Padróes peptídicos internos podem também ser gerados através da análise da sequéncia de aminoácidos primária de urna proteína e determinagao das fronteiras de péptidos produzidos pelo corte com protéases. Como alternativa, urna proteína pode, de facto, ser digerida com urna protease e um fragmento peptídico particular produzido pode entao ser sequenciado. Proteases adequadas incluem, mas nao lhes estáo limitadas, proteases serina, (e.g. tripsina, hepsina), metaloproteases (e.g. PUMP1), quimotripsina, catepsina, pepsina, termolisina, carboxipeptidases, etc.

Urna sequéncia peptídica dentro de urna proteína alvo é seleccionada de acordo com um ou mais critérios para optimizar o uso do péptido como um padráo interno. De preferencia, o tamanho do péptido é seleccionado para minimizar as probabilidades da sequéncia peptídica estar repetida algures noutras proteínas nao alvo. Assim, um péptido tem, de preferencia, pelo menos cerca de 6 aminoácidos. 0 tamanho do péptido é também optimizado para maximizar a frequéncia de ionizagáo. Assim, os péptidos com mais de cerca de 20 aminoácidos nao sao preferidos. A gama preferida é cerca de 7 a 15 aminoácidos. É igualmente seleccionada urna sequéncia peptídica que nao tenha probabilidade de ser químicamente reactiva durante a espectrometría de massa, assim sao evitadas sequéncias compreendendo cisteína, triptofano ou metionina.

Urna sequéncia peptídica que nao inclua urna regiáo modificada da regiáo alvo pode ser seleccionada de modo que o padrao peptídico interno possa ser usado para determinar a quantidade de todas as formas da proteina. Como alternativa, um padrao peptidico interno abrangendo um aminoácido modificado pode ser desejável para detectar e quantificar apenas a forma modificada da proteina alvo. Os padróes peptidicos para ambas as regióes modificadas e nao modificadas podem ser usados em conjunto, para determinar o grau de urna modificagáo numa amostra particular (i.e para determinar qual a fracgáo da quantidade total de proteina está representada pela forma modificada). Por exemplo, padrdes peptidicos para a forma fosforilada e nao fosforilada de urna proteina conhecida como sendo fosforilada num local particular podem ser usados para quantificar a quantidade da forma fosforilada numa amostra. 0 péptido é marcado usando um ou mais aminoácidos marcados (i.e a marca é de facto urna parte do péptido) ou menos preferido, as marcas podem ser ligadas após a sintese de acordo com métodos convencionais. De preferencia, a marca é urna marca que altera a massa, seleccionada com base ñas seguintes consideragóes: A massa deverá ser única para alterar as massas dos fragmentos produzidos por análise MS em regióes do espectro com fundo baixo; 0 componente iónico da assinatura de massa é a porgao da fracgao de marcagáo que preferencialmente apresenta urna assinatura iónica de massa única em análise MS; a soma das massas dos átomos constituintes da marca é, de preferencia diferente de forma única dos fragmentos de todos os aminoácidos possiveis. Como resultado, os aminoácidos marcados e péptidos sao fácilmente distinguiveis dos nao marcados pelo padrao de iáo/massa no espectro de massa resultante. De preferencia, o componente iónico da assinatura de massa confere ao fragmento proteico urna massa que nao corresponde á massa dos residuos de qualquer um dos 20 aminoácidos naturais. A marca deverá ser robusta ñas condigóes de fragmentagao de MS e nao sofrer fragmentagao desfavorável. A química de marcagao deverá ser eficiente numa gama de condigóes, particularmente condigoes desnaturantes e a cauda marcada, de preferencia, permanece solúvel no sistema tampáo MS escolhido. A marca, de preferencia, nao suprime a eficiencia de ionizagáo da proteína e nao é químicamente reactiva. A marca pode conter urna mistura de duas ou mais espécies isotópicamente distintas para gerar um padrao de espectrometría de massa único em cada posigáo do fragmento marcado. Isótopos adequados, tais como 2H, 13C, 15N, 170, 180, ou 34S, estáo entre as marcas preferidas. Pares de padróes peptídicos internos que incorporam um isótopo diferente podem ser igualmente preparados. Os residuos de aminoácidos preferidos nos quais pode ser incorporado urna marca de isótopo pesado incluem leucina, prolina, valina e fenilalanina.

Os padróes de péptidos internos sao caracterizados de acordo com a sua proporgáo de massa:carga (m/z) e, de preferencia, também de acordo com o seu tempo de retengáo numa coluna de cromatografia (e.g. urna coluna de HPLC). Os padróes internos gue eluem em simultáneo com os péptidos nao marcados de seguéncia idéntica sao seleccionados como padróes internos óptimos. 0 padráo interno é entáo analisado através de fragmentagáo do péptido através de quaisquer meios adequados, por exemplo por dissociagao induzida por colisáo (CID) usando, e.g., árgon ou hélio como gás de colisáo. Os fragmentos sao entáo analisados, por exemplo através de espectrometría de massa de múltiplas fases (MSn) para obter um espectro iónico de fragmentos, para obter urna assinatura de fragmentagáo de péptidos. De preferencia, os fragmentos peptidicos possuem diferengas significativas ñas razóes m/z para permitir picos correspondendo a cada um dos fragmentos bem separados e para ser obtida urna assinatura que seja única do péptido alvo. Caso nao seja obtida um urna assinatura de fragmentos adequada na primeara fase, sáo realizadas fases adicionáis de MS até ser obtida urna assinatura única.

Os fragmentos de ióes nos espectros MS/MS e MS3 sáo típicamente altamente específicos para o péptido de interesse e, conjuntamente com os métodos LC, permitem meios altamente selectivos de detecgáo e quantificagáo de um péptido/proteina alvo numa mistura complexa de proteínas, como sejam um Usado celular, contendo muitos milhares ou dezenas de milhares de proteínas. Pode ser testada qualquer amostra biológica potencialmente contendo urna proteina/péptido alvo de interesse. Podem ser testados extractos celulares brutos ou parcialmente purificados contendo urna proteina/péptido alvo de interesse. De preferencia, sao empregues extractos celulares brutos ou parcialmente purificados. Geralmente, a amostra possui pelo menos 0,01 mg de proteina, típicamente urna concentragao de 0,1-10 mg/ml e pode ser ajustada a urna concentragao e pH de tampao pretendido.

Urna quantidade conhecida de um padrao peptídico interno marcado, de preferencia cerca de lOfentomoles, correspondendo a urna proteina alvo a ser detectada/quantificada é entao adicionada a urna amostra biológica, como seja um lisado celular. A amostra com péptido marcado adicionado é entao digerido com urna ou mais protéases durante um período de tempo adequado para permitir a digestao. Urna separagao é entao realizada (e.g. por HPLC, HPLC de fase reversa, electrofórese capilar, cromatografía de permuta iónica, etc.) para isolar o padrao interno marcado e o seu péptido alvo correspondente a partir de outros péptidos na amostra. LC microcapilar é um método preferido.

Cada péptido isolado é entao analisado para monitorizar urna reacgao seleccionada na MS. Isto envolve a utilizagáo de conhecimento anterior obtido através da caracterizagao do padrao peptídico interno e depois requere a MS para monitorizar continuamente um iao específico no espectro MS/MS ou MSn para o péptido de interesse e para o padráo interno. Após eluigáo, é calculada a área sob a curva (AUC) para os picos do padrao peptidico e péptido alvo. A razao das duas áreas proporciona a quantificagáo absoluta que pode ser normalizada para o número de células usado na análise e para o peso molecular da proteina, para proporcionar o número preciso de copias da proteina por célula. Outros detalhes da metodología AQUA estáo descritos em Gygi et al., e Gerber et al. supra.

Os padrdes de péptidos internos AQUA (péptidos marcados com isótopos pesados) podem ser desejavelmente produzidos, como descrito acima, para detectar qualquer quantidade de qualquer local único (e.g. a jungao de fusáo dentro de um polipéptido de fusáo EML4-ALK divulgado) dentro de um polipéptido ALK mutante da divulgagáo. Por exemplo, pode ser preparado um fosfopéptido AQUA que corresponda á sequéncia da jungao de fusáo de um polipéptido de fusáo EML4-ALK (ver Figuras 1A-B (painel inferior)) ou que corresponda ao ponto de truncagem de EML4, TFG ou ALK. Os padrdes peptídicos podem ser produzidos para a jungáo de fusáo EML4-ALK ou TFG-ALK e tais padrdes empregues na metodología AQUA para detectar e quantificar a jungáo de fusáo (i.e a presenga do polipéptido de fusáo EML4-ALK) numa amostra biológica.

Por exemplo, um péptido AQUA exemplificativo da divulgagáo compreende a sequéncia de aminoácidos INQVYR ver Figura 1, painel inferior) que corresponde aos tres aminoácidos que imediatamente flanqueiam cada lada da jungáo de fusáo no polipéptido de fusáo EML4-ALK (ver SEQ ID NO:7). Será apreciado que péptidos AQUA de maiores dimensoes compreendendo a sequéncia da junqáo de fusáo (e residuos adicionáis a jusante ou a montante déla) podem ser igualmente construidos. Do mesmo modo, um péptido AQUA de menores dimensoes compreendendo menos residuos que tal sequéncia (mas aínda compreendendo o ponto da própria jungáo de fusáo) pode ser construido em alternativa. Tais péptidos AQUA maiores ou menores estáo dentro do ámbito da presente divulgagáo e a selecgáo e produgáo de péptidos AQUA preferidos pode ser realizada como descrito acima (Gygi et al., Gerber et al., supra.).

Sondas de ácido nucleico

Reagentes específicos de fusáo proporcionados pela divulgagáo também incluem sondas de ácido nucleico e sequéncias iniciadoras adequadas para a detecqáo de um polinucleótido EML4-ALK ou polinucleótido cíñase ALK truncado, como descrito detalhadamente na Secgáo B acima. Tais sondas desejáveis incluem, entre outras, sondas de pontos de quebra correspondendo a ambos os lados dos pontos de quebra nos genes EML4 selvagem e/ou ALK selvagem que produzem a fusáo. 0 uso específico de tais sondas em ensaios tais como hibridagáo in situ com fluorescencia (FISH) ou amplificagáo por reacgáo em cadeia da polimerase (PCR) está descrito na Secgáo F abaixo. Sondas de pontos de quebra semelhantes podem ser preparadas para detectar a presenga do polinucleótido de fusao TDG-ALK (ver Figura 1C (SEQ ID NO:21). F. Aplicagóes de diagnóstico e formatos de ensaio

Os métodos da divulgagao podem ser realizados numa variedade de formatos de ensaio conhecidos dos familiarizados com a arte.

Imunoensaios

Imunensaios úteis na realizagao dos métodos da divulgagao podem ser imunoensaios homogéneos ou imunoensaios heterogéneos. Num ensaio homogéneo, a reaegao imunológica geralmente envolve um reagente especifico do polipéptido cinase ALK mutante (e.g. um anticorpo especifico do polipéptido de fusao EML4-ALK), um analito marcado e a amostra biológica de interesse. 0 sinal com origem na marca é modificado, directamente ou indirectamente, quando da ligagao do anticorpo ao analito marcado. Tanto a reaegao imunológica como a deteegao do seu nivel sao realizadas numa solugao homogénea. As marcas imunoquimicas que podem ser empregues incluem radicáis livres, isótopos radioactivos, corantes fluorescentes, enzimas, bacteriófagos, coenzimas, etc. marcas de nanocristais semicondutores, ou "pontos quánticos", podem ser vantaj osamente empregues e a sua preparagao e uso tem sido bem descrita. Ver, de um modo geral, K. Barovsky, Nanotech. Law & Bus. l(2):Article 14 (2004) e patentes ai citadas .

Na abordagem do ensaio heterogéneo, os reagentes sao geralmente a amostra biológica, um reagente específico do polipéptido cíñase ALK mutante (e.g. um anticorpo específico da fusáo EML4-ALK) e meios adequados para a produgáo de um sinal detectável. Podem ser usadas as amostras biológicas como descritas mais detalhadamente abaixo. 0 anticorpo é geralmente imobilizado num suporte, como seja urna esfera, placa ou lámina e colocado em contacto com a amostra suspeita de conter o antigénio numa fase líquida. 0 suporte é entáo separado da fase líquida e a fase do suporte ou a fase líquida é avallada relativamente a um sinal detectável empregando meios para a produgáo de tal sinal. 0 sinal está relacionado com a presenga do analito na amostra biológica. Meios para a produgáo de um sinal detectável incluem o uso de marcas radioactivas, marcas fluorescentes, "pontos quánticos", etc. Por exemplo, s o antigénio a ser detectado possuir um segundo local de ligagáo, um anticorpo que se ligue a esse local pode ser conjugado com um gruo detectável e adicionado á solugáo de reacgáo em fase líquida antes do passo de separagáo. A presenga do grupo detectável no suporte sólido indica a presenga do antigénio na amostra a testar. Exemplos de imunoensaios adequados sao o radioimunoensaio, métodos de imunofluorescéncia, imunoensaios ligados a enzimas e similares.

Os formatos de imunoensaio e suas variagóes, os quais podem ser úteis na realizagao dos métodos aquí descritos, sao bem conhecidos na arte. Ver, de um modo qeral, E. Maqgio, Enzyme-Immunoassay, (1980) (CRC Press, Inc., Boca Ratón, Fia.); ver também, e.g., Pat. U.S. No. 4,727,022 (Skold et ai., "Métodos para a modulagáo das interacgóes ligando-receptor e sua aplicagáo" ("Methods for Modulating Ligand-Receptor Interactions and their Application"); Pat. U.S. No. 4,659, 678 (Forrest et al., "Imunoensaio de antigénios" (Immunoassay of antigens")); Pat U.S. No. 4,376,110 (David et al., "Ensaios imunométricos usando anticorpos monoclonais" ("Immunometric Assays Using Monoclonal Antibodies")) . Condigóes adequadas para a formagao dos complexos reagente-anticorpo sao bem conhecidos dos familiarizados com a arte. Ver id. Os anticorpos monoclonais específicos do polipéptido de fusao EML4-ALK podem ser usados num ensaio de "dois locáis" ou "sanduíche", com urna única linha celular de hibridoma a servir de fonte para o anticorpo monoclonal marcado e para o anticorpo monoclonal ligado. Tais ensaios estáo descritos na Pat. U.S. 4,376,110. A concentragao de reagente detectável deverá ser suficiente de modo que a ligagáo do polipéptido de fusao EML4-ALK ou TGF-ALK se ja detectável comparativamente com o fundo.

Anticorpos úteis na realizagao dos métodos aquí divulgados podem ser conjugados com um suporte sólido adequado para um ensaio de diagnóstico (e.g., esferas, placas, láminas ou alvéolos formados a partir de materiais tais como látex ou polistireno) de acordo com técnicas conhecidas, tais como precipitagáo. Os anticorpos ou outros reagentes de ligagáo ao polipéptido de fusao ALK ou ao polipéptido cíñase ALK truncada podem igualmente ser conjugados com grupos detectáveis tais como marcas radioactivas (e.g. 35S, 125I, 131I), marcas de enzimas (e.g. peroxidade de rábano silvestre, fosfatase alcalina) e marcas fluorescentes (e.g. fluoresceína) de acordo com técnicas conhecidas.

Ensaios baseados em células, como sejam citometria de fluxo (FC), imuno-histoquímica (IHC) ou imunofluorescéncia (IF) sao particularmente desejáveis na realizagáo dos métodos da divulgagáo, urna vez que tais formatos de ensaio sao adequados em termos clínicos, permitem a detecgáo da expressáo de um polipéptido cíñase ALK mutante in vivo e evitam o risco de alteragóes artificiáis na actividade resultantes da manipulagáo das células obtidas, e.g., a partir de um tumor para se obterem extractos. Assim, nalgumas realizagóes preferidas, os métodos da divulgagáo sao implementados num formato de ensaio de citometria de fluxo (FC), imuno-histoquímica (IHC) ou imunofluorescéncia (IF) . A citometria de fluxo (FC) pode ser empregue para determinar a expressáo do polipéptido cíñase ALK mutante num tumor de mamífero antes, durante e após o tratamento com um fármaco dirigido á inibigáo da actividade da cíñase ALK. Por exemplo, células tumorais de urna amostra de medula óssea podem ser analisadas por citometria de fluxo relativamente á expressao e/ou activagáo do polipéptido de fusao EML4-ALK ou TFG-ALK, assim como a marcadores que identificam tipos de células de cancro, etc., caso se pretenda. A citometria de fluxo pode ser realizada de acordo com métodos convencionais. Ver, e.g. Chow et al., Cytometry (Communications in Clinical Cytometry) 46:72-78 (2001) . Resumidamente e a titulo de exemplo, pode ser empregue o protocolo que se segue para análise citométrica: fixagao das células com 2% de paraformaldeido durante 10 minutos a 37°C seguido de permeabilizagáo em 90% de metanol durante 30 minutos em gelo. As células podem ser coradas com o anticorpo primário especifico do polipéptido de fusao EML4-ALK ou TFG-ALK, lavadas e marcadas com um anticorpo secundário marcado com fluorescencia. As células serao entao analisadas num citómetro de fluxo (e.g. um Beckam Coulter FC500) de acordo com os protocolos específicos do instrumento usado. Tal análise identificará o nivel de polipéptido de fusao EML4-ALK ou TFG-ALK expresso no tumor. Análise semelhante após tratamento do tumor com um fármaco inibidor de ALK revelará a resposta de um tumor que expresse um polipéptido de fusao ALK ao inibidor dirigido para a cinase ALK. A coloragáo imuno-histoquimica (HC) podem ser igualmente empregue para determinar a o estado da expressao e/ou activagáo do polipéptido cinase mutante num cancro de mamífero (e.g. um tumor sólido do tipo NSCLC) antes, durante e após tratamento com um fármaco dirigido á inibigao da actividade da cinase ALK. IHC pode ser realizado de acordo com técnicas bem conhecidas. Ver, e.g., ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Capítulo 10, Harlow & Lañe Eds., Coid Spring Harbor Laboratory (1988). Resumidamente, e a título exemplificativo, o tecido embebido em parafina (e.g. tecido tumoral de urna biópsia) é preparado para coloragáo imuno-histoquímica através de desparafinizagáo de secgóes do tecido com xileno seguido de etanol; hidratagáo em água, depois PBS; exposigáo do antigénio através do aquecimento da lámina em tampáo citrato de sodio; incubagáo das secgóes em peróxido d hidrogénio; boqueio em solugáo de bloqueio; incubagáo da lámina em anticorpo primário específico do polipéptido de fusáo EML4-ALK ou TFG-ALK e anticorpo secundário; e finalmente detecgao usando o método de avidina/biotina ABC de acordo com as instrugóes do fabricante.

Os ensaios de imunofluorescéncia (IF) podem ser igualmente empregues para determinar o estado de expressáo e/ou activagáo do polipéptido cíñase ALK mutante num cancro de mamífero antes, durante e após tratamento com um fármaco dirigido á inibigáo da actividade cíñase ALK. IF pode ser realizada de acordo com técnicas bem conhecidas. Ver, e.g. J.M. Polak and S. Van Noorden (1997) INTRODUCTION TO IMMUNOCYTOCHEMISTRY, 2nd Ed.; ROYAL MICROSCOPY SOCIETY MICROSCOPY HANDBOOK 37, BioScientific/Springer-Verlag. Resumidamente, e a título de exemplo, as amostras do doente podem ser fixadas em para formaldeído seguido de metanol, bloqueadas com urna solugáo de bloqueio, como se ja soro de cavalo, incubadas com o anticorpo primário contra o polipéptido de fusao EML4-ALK ou TFG-ALK seguido de um anticorpo secundário marcado com um corante fluorescente como se ja Alexa488 e analisadas com um microscopio de epifluorescéncia.

Os anticorpos empregues nos ensaios acima descritos podem ser vantajosamente conjugados com corantes fluorescentes (e.g. Alexa488, PE) ou outras marcas, como sejam "pontos quánticos", para usar em análise multiparamétrica juntamente com outros anticorpos para transdugao de sinal (e.g. EGFR, fosfo-AKT, fosfo-Erk χλ) e/o marcador celular (e.g. citoqueratina).

Urna variedade de outros protocolos, incluindo ensaio imunossorvente ligado a enzima (ELISA), radioimunoensaio (RIA) e separagao de células activada por fluorescencia (FACS), para medigao do polipéptido cúnase ALK mutante sao conhecidos na arte e proporcionam urna base para o diagnóstico de niveis alterados ou anormais do polipéptido de fusao EML4-ALK ou TFG-ALK. Os valores normáis ou padronizados desta expressao do polipéptido de fusao foram estabelecidos através da combinagao de fluidos corporais ou de extractos celulares de individuos mamíferos normáis, de preferencia seres humanos, com o anticorpo contra o polipéptido de fusao EML4-ALK ou TFG-ALK em condigóes adequadas para a formagao de complexos. A quantidade de formagao de complexos convencionais pode ser quantificada por vários métodos, mas, de preferencia através de meios fotométricos. Quantidades do polipéptido de fusao EML4-ALK ou TFG-ALK expresso num individuo, controlo e amostras de doentes derivadas de tecidos de biópsias sao comparadas com os valores padronizados. 0 desvio entre valores padronizados e do individuo estabelece os parámetros para o diagnóstico da doenga.

Ensaios de péptidos e ácidos nucleicos

De modo semelhante, péptidos AQUA para a detecgáo/quantificagáo de polipéptido cíñase ALK imitante expresso numa amostra biológica compreendendo células de um tumor podem ser preparados e usados em ensais AQUA convencionais, como descrito detalhadamente na Secgáo E acima. Assim, nalgumas realizagóes preferidas dos métodos da divulgagáo, o reagente específico do polipéptido de fusao ALK compreende fosfopéptidos marcados com isótopos radioactivos (péptido AQUA) correspondendo a urna sequéncia peptídica compreende a jungáo de fusao de um polipéptido de fusao EML4-ALK ou polipéptido de fusao TFG-ALK, como descrito na Secgáo E.

Os reagentes específicos do polipéptido ALK mutante úteis na realizagáo dos métodos da divulgagáo podem também ser sondas de mRNA, oligonucleótido ou DNA que podem hibridar directamente e detectar transcritos da expressáo do polipéptidos de fusao ou truncado numa amostra biológica, Tais sondas estáo discutidas detalhadamente na Secgáo B acima. Resumidamente e a título de exemplo, amostras de doentes fixadas em formalina e embebidas em parafina podem ser testadas com urna sonda de RNA marcada com fluoresceína seguido de lavagens com formamida, SSC e PBS e análise com um microscopio de fluorescencia. Sao igualmente preferidas sondas FISH, incluindo sondas para pontos de quebra, as quais permitem a detecgao fluorescente de rearranjos de gene, como sejam as mutagóes de delegao EML4-ALK no cromossoma 2 (ver Exemplo 6).

Polinucleótidos codificadores do polipéptido cinase ALK mutantes podem ser igualmente usadas para fins de diagnóstico. Os polinucleótdos que podem ser usados incluem sequéncias oligonucleotidicas, moléculas de RNA e DNA anti-sentido e PNAs. Os polinucleótidos podem ser usados para detectar e quantificar a expressao de genes em biópsias de tecidos de tumores sólidos em que a expressao do polipéptido de fusao EML4-ALK ou TFG-ALK ou polipéptido cinase ALK activa truncada possam estar correlacionados com doenga. Por exemplo, o ensaio de diagnóstico pode ser usado para distinguir entre ausencia, presenga e excesso de expressao do polipéptido de fusao EML4-ALK ou TFG-ALK e para monitorizar a regulagao dos niveis de polipéptido de fusao ALK durante a intervengao terapéutica.

Numa realizagáo preferida, a hibridagao com sondas de PCR que sejam capazes de detectar sequéncias polinucleotidicas, incluindo sequéncias genómicas, codificadoras do polipéptido de fusao ALK ou polipéptido cinase AL JK truncado, ou moléculas estreitamente relacionadas, pode ser usada para identificar sequéncias de ácido nucleico que codificam polipéptido ALK mutante. A construgao e uso de tais sondas estao descritos na Secgao B acima. A especificidade da sonda, quer se ja feita de urna reqiáo altamente especifica, e.g. 10 nucleótidos únicos na jungáo de fusao ou numa regiao menos especifica, e.g. a regiao codificadora 3' e a restringéncia da hibridagáo ou amplificagao (máxima, elevada, intermédia ou baixa) determinará se a sonda identifica apenas sequéncias naturais codificadoras do polipéptido ALK mutante, alelos ou sequéncias relacionadas.

As sondas podem ser igualmente usadas para a detecgáo de sequéncias relacionadas deveráo, de preferencia, conter pelo menos 50% dos nucleótidos de qualquer urna das sequéncias mutantes codificadoras do polipéptido ALK. As sondas de hibridagáo da presente divulgagáo podem ser DNA ou RNA e derivadas das sequéncias nucleotídicas SEQ ID NOs: 2, 19 e 21, maioritariamente englobando de preferéncia a jungáo de fusao (ver Figuras 1A-C, painel inferior e SEQ ID NOs: 7, 24 e 26) ou da sequéncia genómica incluindo promotor, elementos estimuladores e intróes dos polipéptidos EML-4, TFG e ALK naturais, como aínda descrito na Secgao B acima.

Por exemplo, um polinucleótido de fusao EML4-ALK da divulgagáo pode ser usado em análise Southern ou Northern, transferéncia de pontos ou outras tecnologías baseadas em membranas; ñas tecnologías de PCR; ou em ensaio com tiras, alfinetes, ELISA ou chips usando fluidos ou tecidos de biópsias de doentes para detectar expressao alterada do polipéptido ALK. Tais métodos qualitativos ou quantitativos sao bem conhecidos na arte. Num aspecto particular as sequéncias nucleotídicas codificadoras de um polipéptido ALK mutante da divulgagao podem ser úteis em ensaios que detectam a activagao ou a indugao de vários cancros, incluindo carcinomas do pulmao. Polinucleótidos ALK mutantes podem ser marcados através de métodos convencionais e adicionados a urna amostra de fluido ou tecido de um doente em condigóes adequadas para a formagao dos complexos de hibridagao. Após um periodo de tempo de incubagao adequado, a amostra é lavada e o sinal é quantificado e comparado com um valor padrao. Se a quantidade de sinal na amostra de biópsia ou extraída for significativamente alterada relativamente á da amostra controlo comparável, as sequéncias nucleotídicas que hibridam com sequéncias nucleotídicas na amostra e a presenga de níveis alterados de sequéncias nucleotídicas codificadoras do polipéptido de fusáo EML4-ALK ou polipéptido cíñase ALK truncado na amostra indica a presenga da doenga associada. Tais ensaios podem também ser usados para avallara eficácia de um regime de tratamento terapéutico particular em estudos animáis, em ensaios clínicos ou na monitorizagáo do tratamento de um doente individual.

Para proporcionar urna base para o diagnóstico de doenga caracterizada pela expressao e um polipéptido cíñase ALK mutante, é estabelecido um perfil normal ou padronizado para a expressao. Isto pode ser conseguido através da combinagao de fluidos corporais ou de extractos celulares colhidos de individuos normáis, animáis ou seres humanos, com urna sequéncia, ou um seu fragmento, que codifica o polipéptido de fusao EML4-ALK ou TFG-ALK, em condigóes adequadas para hibridagao ou amplificagao. A hibridagao padrao pode ser quantificada por comparagao dos valores obtidos a partir de individuos normáis com os de urna experiencia em que é usada urna quantidade conhecida de um polinucleótido substancialmente purificado. Valores padronizados obtidos a partir de amostras normáis podem ser comparados com valores obtidos a partir de amostras de doentes que sejam assintomáticos para a doenga. 0 desvio entre valores padronizados e de individuos é usado para estabelecer a presenga de doenga.

Urna vez estabelecida a doenga e iniciado um protocolo de tratamento, os ensaios de hibridagao podem ser repetidos numa base regular para avaliar se o nivel de expressao no doente comega a aproximar-se do que é observado no doente normal. Os resultados obtidos a partir de ensaios sucessivos podem ser usados para mostrar a eficácia do tratamento ao longo e um periodo que varia entre vários dias e meses.

Outros usos em diagnóstico para os polinucleótidos ALK mutantes da divulgagao podem envolver o uso da reacgao em cadeia da polimerase (PCR), um formato de ensaio preferido que é padronizado pelos familiarizados com a arte. Ver, e.g., MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, 2nd. edition, Sambrook, J., Fritsch, E. F. e Maniatis, T., eds., Coid Spring Harbor Laboratory Press, Coid Spring Harbor, N.Y. (1989) . Os oligómeros de PCR podem ser obtidos por síntese química, gerados enzimaticamente ou produzidos a partir de urna fonte recombinante. Os oligómeros preferencialmente consistirao em das sequéncias nucleotídicas, urna com a mesma orientagáo (5' para 3' ) e urna outra com anti-sentido (3' para 5'), empregues em condigóes optimizadas para identificagao de um gene ou condigao específica. Os mesmos dois oligómeros, séries "nested" de oligómeros ou mesmo um conjunto de oligómeros degenerados pode ser empregue em condigóes menos restringentes para detecgao e/ou quantificagao de sequéncias de DNA ou RNA estreitamente relacionadas.

Métodos que também podem ser usados para quantificar a expressao de um polipéptido de fusao ALK ou polipéptido cíñase ALK truncado incluem nucleótidos marcados radioactivamente ou biotinilados, coamplificagao de um ácido nucleico controlo e curvas padrao ñas quais sos resultados experimentáis sao interpolados (Melby et al., J. Immunol. Methods, 159:235-244 (1993); Duplaa et al. Anal. Biochem. 229-236 (1993)). A velocidade da quantificagao de múltiplas amostras pode ser acelerada através da realizagao de um ensaio no formato de ELISA onde o oligómero de interesse é apresentado em várias diluigóes e urna resposta espectrofotométrica ou colorimétrica de dá quantificagao rápida. Numa outra realizagao, os polinucleótidos ALK mutantes da divulgagao, assim como a regiao genómica adjacente proximal e distal, podem ser usados para gerar sondas de hibridagáo que sao úteis para o mapeamento da sequéncia genómica natural. AS sequéncias podem ser mapeadas num cromossoma particular ou numa regiao especifica do cromossoma usado técnicas bem conhecidas. Tais técnicas incluem hibridagao in situ (FISH) , FAGs ou construgóes de cromossomas artificiáis, como sejam cromossomas artificiáis de levedura, cromossomas artificiáis bacterianos, construgóes P1 bacterianas ou bibliotecas de cDNA de cromossomas individuáis, como revisto em Price, C. M., Blood Rev. 7: 127-134 (1993), e Trask, B. J., Trends Genet. 7: 149-154 (1991).

Numa realizagao preferida, FISH é empregue (como descrito em Verma et al. HUMAN CHROMOSOMES: A MANUAL OF BASIC TECHNIQUES, Pergamon Press, New York, N.Y. (1988)) e pode ser correlacionado com outras técnicas de mapeamento físico de cromossomas e dados de mapas genéticos. Exemplos de dados de mapas genéticos podem ser encontrados no 1994 Genome Issue of Science (265: 1981f). A correlagao entre a localizagao do gene codificador do polipéptido de fusao EML4-ALK ou TFG-ALK ou do polipéptido cinase ALK truncado num mapa fásico e numa doenga especifica, ou predisposigáo para urna doenga especifica, pode ajudar a delimitar a regiao de DNA associada com aquela doenga genética. As sequéncias nucleotídicas da presente divulgagao podem ser usadas para detectar diferengas ñas sequéncias de genes entre individuos normáis, portadores ou afectados. Sondas FISH de pontos de quebra de dupla cor, por exemplo, podem ser empregues para detectar a presenga ou ausencia de genes EML-4, TFG e/ou ALK mutantes numa amostra.

Hibridagao in situ de preparagóes cromossómicas e técnicas de mapeamento físico, tais como análise de associagao física de genes usando marcadores cromossómicos estabelecidos, podem ser usadas para a extensao de mapas de genes. Frequentemente a colocagao de um gene no cromossoma de urna outra espécie de mamífero, como se ja murganho pode revelar marcadores associados mesmo se o número ou brago de um cromossoma humano particular nao for conhecido. Novas sequéncias podem ser atribuidas a bragos dos cromossomas, ou a partes dos mesmos, através do mapeamento físico. Isto proporciona informagao importante aos investigadores que pesquisam genes de doengas usando clonagem posicional ou outras técnicas de descoberta de genes. Urna vez a doenga ou síndrome tenha sido localizada grosseiramente através de ligagao genética a urna regiáo genómica particular, por exemplo, AT to llq22-23 (Gatti et ai., Nature 336:577-580 (1988)), quaisquer sequéncias mapeadas nessa área podem representar genes associados ou reguladores para posterior investigagao. A sequéncia nucleotídica da presente divulgagao pode também ser usada para detectar diferengas na localizagáo cromossómica devido á translocagao, inversáo, etc., entre individuos normáis, portadores ou afectados.

Outros métodos adequados para a detecgao de ácidos nucleicos, tais como sondas de oligonucleótidos conjugadas de ligagáo ao sulco menor (ver, e.g. Patente U.S. No. 6,951,930, "Detecgáo de ácidos nucleicos por fluorescencia devida a hibridagáo" ("Hybridization-Triggered Fluorescent Detection of Nucleic Acids")) sao conhecidos dos familiarizados com a área.

Amostras biológicas.

Amostras biológicas úteis na concretizagáo dos métodos da divulgagáo podem ser obtidos a partir de qualquer mamífero em que esteja presente ou em desenvolvimento um cancro caracterizado pela expressao de um polipéptido de fusáo EML4-ALK ou TFG-ALK. Numa realizagáo, o mamífero é um ser humano e o ser humano pode ser um candidato para um fármaco inibidor de ALK para o tratamento de um cancro, e.g. NSCLC. O candidato humano pode ser um doente de momento a ser tratado, ou considerado para tratamento, com um inibidor da cíñase ALK, como seja WHI-131 e/ou WHI-154. Numa outra realizagao, o mamífero é urna animal de grande porte, como seja um cavalo ou vaca, enquanto noutras realizagóes, o mamífero é um pequeño animal, como seja um cao ou gato, todos eles sao conhecidos por desenvolverem cancros, incluindo carcinomas do pulmáo.

Qualquer amostra biológica compreendendo células (ou extractos de células) de um cancro de mamífero é adequada para usar nos métodos da divulgagáo. No caso do polipéptido de fusáo EML4-ALK, qualquer cancro sólido ou nao sólido, será adequado. No caso de TFG-ALK, os tumores sólidos estáo dentro do ámbito dos métodos da divulgagao. Por exemplo, a amostra biológica pode compreender células obtidas a partir de urna efusáo, como seja urna efusáo pleural. As efusóes pleurais (liquido que se forma fora do pulmáo na cavidade torácica e que possui células cancerosas) sao conhecidas por se formarem em muitos doentes com cancro do pulmáo avangado (incluindo NSCLC) e a presenga de tal efusáo é preditiva de um prognóstico fraco e pouco tempo de sobrevivencia. Técnicas convencionais de obtengáo de amostras de efusáo pleural foram descritas e sáo bem conhecidas na arte (Ver Sahn, Clin Chest Med. 3(2): 443-52 (1982)). As células tumorais em circulagáo podem também ser obtidas a partir de soro usando marcadores tumorais, marcadores da proteina citoqueratina ou outros métodos de selecgáo negativa como descrito (ver Ma et ai., Anticancer Res. 23(1A): 49-62 (2003)). Amostras de soro e de medula óssea podem ser particularmente preferidas para doentes com leucemia. Para cancros envolvendo tumores sólidos, tais como sarcomas e carcinomas, a amostra biológica pode compreender células obtidas a partir de urna biópsia de tumor, a qual pode ser obtida de acordo com técnicas clínicas convencionais. Por exemplo, a expressáo aberrante de ALK foi observada num espectro de cancros incluindo neuroblastomas e cancro neuro-ectodérmico. Ver, e.g. Pulford et al., supra. O mutante da translocagáo TFG-ALK, no entanto, foi apenas descrito em linfoma e náo anteriormente observado em tumores sólidos.

Urna amostra biológica pode compreender células (ou extractos celulares de um cancro em que u polipéptido de fusáo ALK é expresso e/ou activado mas nao a cíñase ALK selvagem. Como alternativa, a amostra pode compreender células de um cancro em que tanto o polipéptido ALK mutante como a cíñase ALK sao expressos e/ou activados, ou em quea cíñase ALK selvagem e/ou EML-4 e/ou TFG sao expressos e/ou activos, mas nao o polipéptido ALK mutante.

Extractos celulares das amostras biológicas referidas podem ser preparados, brutos ou parcialmente (ou totalmente purificados) , de acordo com técnicas convencionais e usado nos métodos da divulgagao. Como alternativa, amostras biológicas compreendendo a totalidade das células podem ser utilizadas em formatos de ensaio preferidos tais como imuno-histoquímica (IHC) , citometria de fluxo (FC), imunofluorescéncia (IF) e hibridagao ín situ com fluorescencia (FISH) como descrito mais detalhadamente abaixo. Tais ensaios com células totais sao vantajosos por minimizarem a manipulagao da amostra de células tumorais e assim reduzir os riscos de alteragao no estado de sinalizagao/activagao in vivo das células e/ou introdugao de sinais de artefactos. Ensaios de células totais sao igualmente vantajosos devido a caracterizarem a expressáo e sinalizagao apenas ñas células tumorais, em vez de numa mistura de células tumorais e normáis.

Na concretizagao do método divulgado para determinar ser um composto inibe a progressao de um tumor caracterizado por um gene de fusao e/ou polipéptido de fusao EML4-ALK ou TFG-ALK, amostras biológicas compreendendo células de modelos de transplante de medula óssea ou xenógrafos de mamífero podem ser vantajosamente empregues. Os xenógrafos preferidos (ou recipientes de transplantes) sao pequeños mamíferos, tais como murganhos, portadores de tumores humanos que expressam um polipéptido cíñase ALK mutante. Os xenógrafos portadores de tumores humanos sao bem conhecidos na arte (ver Kal, Cáncer Treat Res. 72: 155-69 (1995)) e a produgao de xenógrafos de mamíferos portadores de tumores humanos está bem descrito (Ver Winograd et al., In vivo. 1(1): 1-13 (1987)). De forma semelhante, a geragao e uso de modelos de transplante de medula óssea está bem descrito /ver, e.g. Schwaller, et al., EMBO J. 17:5321-333 (1998); Kelly et al., Blood 99:310-318 (2002)). Por "cancro caracterizado por" um polinucleótido e/ou polipéptido de fusao EML4-ALK ou TFG-ALK pretende significar um cancro em que tal gene ALK mutante e/ou polipéptido expresso estáo presentes, comparativamente com um cancro em que o gene de fusao e/ou polipéptido de fusao nao está presente.

Na avaliagáo da presenga do polinucleótido ou expressáo do polipéptido ALK mutante numa amostra biológica compreendendo células de um tumor cancro de mamífero, urna amostra controlo representando urna célula em que tal translocagáo e/ou proteína de fusao nao ocorre pode ser desejavelmente empregue para fins comparativos. Idealmente, a amostra controlo compreende células de urna subsérie do cancro particular (e.g. NSCLC) que é representativo da subsérie em que a mutagao (e.g. mutagao de delegáo EML-ALK) nao ocorre e/ou o polipéptido de fusáo nao é expresso. Comparando o nivel na amostra controlo versus a amostra biológica a testar identifica assim se o polinucleótido e/ou polipéptido ALK mutante está ou estao presentes. Como alternativa, urna vez que o polinucleótido e/ou polipéptido de fusáo EML4-ALK e/ou TFG-ALK pode nao estar presente na maioria dos cancros, qualquer tecido que de modo semelhante nao expresse tal polipéptido mutante (ou seja portador do polinucleótido mutante) pode ser empregue como um controlo.

Os métodos descritos abaixo teráo utilidade importante em diagnóstico para cancros caracterizados por polinucleótido e/ou polipéptido ALK mutante e decisóes de tratamento relacionados com os mesmos. Por exemplo, amostras biológicas podem ser obtidas a partir de um individuo que nao tenha sido anteriormente diagnosticado como tendo um cancro caracterizado por urna mutagao de delegao EML4-ALK e/ou polipéptido de fusáo, nem sofreu aínda tratamento de tal cancro e o método é empregue para identificar para fins de diagnóstico um tumor, num individuo, pertencente a urna subsérie de tumores (e.g. NSCLC) em que polinucleótido e/ou polipéptido de fusáo EML4-ALK está presente e/ou é expresso. Os métodos da divulgagáo podem ser empregues para monitorizar a progressáo ou inibigáo de um cancro que expresse o polipéptido cíñase ALK mutante após o tratamento de um individuo com urna composigáo compreendendo um fármaco inibidor da cíñase ALK ou combinagóes de fármacos.

Tal ensaio de diagnóstico pode ser realizado após ou antes de procedimentos de avaliagáo preliminar ou vigilancia cirúrgica. 0 método de identificagáo da divulgagáo pode ser vantajosamente empregue como diagnóstico para identificar doentes com cancro, como seja NSCLC, com origem na ou ñas proteínas de fusao EML4-ALK e/ou TFG-ALK ou em cíñase ALK truncada, doentes que muito provavelmente responderáo a fármacos dirigidos para a inibigáo da actividade cíñase ALK, como sejam WHI-131 e/ou WHI-154 ou seus análogos. A capacidade para seleccionar tais doentes também será útil na avaliagáo clínica da eficácia de futuros fármacos para atingir ALK, assim como na prescrigao futura de tais fármacos a doentes.

Diagnóstico A capacidade de selectivamente identificar cancros em que um polinucleótido e/ou polipéptido de fusao EML4-ALK e/ou TFG-ALK está presente fornece novos métodos importantes para identificar com precisáo tais tumores para fins de diagnóstico, assim como obtengáo de informagáo útil na determinagao do tumor ter probabilidade de responder a urna composigao terapéutica inibidora de ALK ou de ter probabilidade parcial ou total de nao responder a um inibidor para alvejar urna cinase diferente quando administrado como um agente isolado no tratamento do cancro.

Assim, nua realizagáo, a divulgagáo proporciona um método para a detecgáo da presenga de um polinucleótido ALK mutante e/ou o seu polipétido ALK mutante codificado numa amostra biológica de um cancro de mamífero, o referido método compreendendo os passos de: (a) obtengao de urna amostra biológica a partir de um cancro de mamífero; e (b) utilizagáo de pelo menos um reagente que detecte um polinucleótido de fusáo, ou o seu polipéptido de fusáo codificado, compreendendo parte de ALK com parte de urna proteína secundária para determinar se um polinucleótido ALK mutante e/ou o seu polipéptido ALK mutante codificado está presente na referida amostra biológica.

Nalgumas realizagóes preferidas, o cancro é um tumor sólido, sarcoma ou carcinoma, enquanto numa realizagáo o carcinoma é um carcinoma do pulmáo, como se ja NSCLC. Numa outra realizagáo preferida, o polipéptido mutante ALK é um polipéptido de fusao compreendendo os residuos 1116-1383 de ALK (SEQ ID N0:5) com urna porgáo da referida proteína secundária. Numa outra realizagáo preferida, a proteína secundária é seleccionada do grupo consistindo em EML-4 (SEQ ID NO: 3) e proteína do gene fundido com TRK (TFG) (SEQ ID NO:22) . Aínda numa outra realizagáo preferida, o polipéptido de fusáo compreende os residuos 1-233 ou os residuos 1-495 de EML-4 (SEQ ID NO:3) ou os residuos 1-138 de TFG (SEQ ID NO:22).

Noutras realizagóes preferidas o polinucleótido de fusao compreende um polinucleótido de fusao EML4-ALK (SEQ ID N0:2 ou 19) ou um polinucleótido de fusao RFG-ALK (SEQ ID N0:21), enquanto aínda numa outra realizagao o polipéptido de fusao compreende um polipéptido de fusao EML4-ALK (SEQ ID NOs: 1 ou 18) ou um polipéptido de fusao TFG-ALK (SEQ ID NO:20. Aínda noutra realizagao preferida, o polinucleótido de fusao é um polinucleótido ou polipéptido de fusao como acima descrito.

Em realizagóes mais preferidas, o método emprega um reagente que compreende um polinucleótido de fusao EML4-ALK e/ou pelo menos um reagente específico do polipéptido de fusao EML4-ALK (anticorpo ou péptido AQUA) como descrito acima. Nalgumas realizagóes preferidas, o reagente compreende um reagente isolado que se liga específicamente ou detecta um polipéptido de fusao TFG-ALK (SEQ ID NO:20) ou polinucleótido de fusao TFG-ALK (SEQ ID N0:21) mas que nao se liga ou detecta TFG selvagem ou ALK selvagem. Noutras realizagóes preferidas, o reagente é urna sonda de reacgao em cadera da polimerase (PCR) ou urna sonda de hibridagao in situ fluorescente (FISH). Determinadas realizagóes preferidas empregam um péptido marcado com isótopo pesado (AQUA) que compreende a sequéncia de aminoácidos da jungao de fusao do polipéptido de fusao TFG-ALK ou o ponto de truncagem dentro de ALK selvagem.

Nalgumas realizagóes preferidas, os métodos de diagnóstico da divulgagao sao implementados num formato de ensaio de citometria de fluxo (FC), imuno-histoquimica (IHC) e/ou imunocitoquímica (ICC), como descrito acima. Numa outra realizagao preferida, é detectada a actividade do polipéptido de fusao EML4-ALK ou TFG-ALK. Noutras realizagóes preferidas, os métodos de diagnóstico da divulgagao sao implementados em formatos de ensaio de hibridagao in situ com fluorescencia (FISH) ou como reacgao em cadeia da polimerase (PCR), como acima descrito. A divulgagao ainda proporciona um método para determinar se um composto inibe a progressao de um cancro caracterizado por um polinucleótido de fusao e/ou polipéptido de fusao EML4-ALK ou TFG-ALK, o referido método compreendendo o passo de determinagao se o referido composto inibe a expressao e/ou actividade do referido polipéptido de fusao EML4-ALK ou TFG-ALK no referido cancro. Numa realizagáo preferida, a inibigáo de fusao de um polipéptido de fusao ALK (ver Figuras 1A-C (painel do fundo)). Ainda numa outra realizagao preferida, a expressao e/ou actividade do polipéptido de fusao ALK é determinada usando pelo menos um reagente que detecta um polinucleótido ou polipéptido de fusao EML4-ALK da divulgagao ou um polinucleótido ou polipéptido de fusao TFG-ALK aquí descrito. Compostos adequados para inibigáo da actividade da cíñase ALK estao discutidos mais detalhadamente na Secgáo G abaixo.

Sondas e reagentes específicos de polinucleótidos e polipéptidos ALK mutantes úteis na concretizagao dos métodos da divulgagao estao descritos mais detalhadamente ñas secgóes B e D acima. Numa realizagao preferida, o reagente específico do polipéptido de fusao ALK compreende um anticorpo específico do polipéptido de fusao. Numa outra realizagao preferida, os reagentes específico do polipéptido de fusao compreende um fosfopéptido marcado com um isótopo pesado (péptido AQUA) correspondendo á jungao de fusao de um polipéptido de fusao ALK (ver Figuras 1A-C (painel inferior)). Aínda numa outra realizagao preferida, o reagente especifico do polinucleótido de fusao compreende urna sonda FISH correspondendo á jungao de fusao de um gene de fusao de ALK e/ou pontos de quebra de genes EML4, TFG ou ALK selvagens.

Os métodos da divulgagao acima descrita também podem compreender facultativamente o passo de determinagao do nivel de expressao ou activagao de outras cinases, coo sejam ALK e EGFR selvagens, ou outras moléculas de sinalizagao a jusante na referida amostra biológica. 0 perfil de expressao/activagao do polipéptido de fusao ALK e de expressao/activagao de outras cinases e vías numa determinada amostra biológica pode proporcionar informagáo valiosa sobre as cinases e vías que estao na origem da doenga e qual o regime terapéutico com maior probabilidade de causar beneficio.

Rastreio de compostos A descoberta dos novos polipéptidos de fusao EML4-ALK aquí descritos permitem igualmente o desenvolvimento de novos compostos que inibam a actividade desta proteina ALK mutante, particularmente a sua actividade de cíñase ALK. Assim, a divulgagao também proporciona, em parte, um método para determinar se um composto inibe a progressao de um cancro caracterizado por um polinucleótido de fusao e/ou polipéptido de fusao EML4-ALK, o referido método compreendendo o passo de determinagao se o referido composto inibe a expressao e/ou actividade do referido polipéptido de fusao EML4-ALK no referido cancro. Numa realizagao preferida, a inibigao da expressao e/ou actividade do polipéptido de fusao EML4-ALK é determinado usando pelo menos um reagente que detecta um polinucleótido de fusao e/ou um polipéptido de fusao da divulgagao. Reagentes preferidos da divulgagao foram descritos acima. Compostos adequados para a inibigao da actividade de cíñase ALK estáo descritos mais detalhadamente na Secgao G abaixo. 0 composto pode ser, por exemplo, um inibidor de cinases, como seja urna molécula pequeña ou inibidor anticorpo. Pode ser um inibidor genérico de cinases com actividade contra diferentes cinases ou um inibidor específico de cinases. Os compostos inibidores de cíñase ALK sao discutidos ais detalhadamente na Secgao G abaixo. As amostras biológicas dos doentes podem ser colhidas antes e após tratamento com o inibidor e depois analisadas, usando métodos descritos acima, para o efeito biológico do inibidor na actividade cinase ALK, incluindo a fosforilagáo de proteinas substrato a jusante. Tal ensaio farmacodinámico pode ser útil na determinagáo da dose biológicamente activa do fármaco que pode ser preferivel a urna dose máxima tolerável. Tal informagáo também seria útil em submissóes para aprovagáo do fármaco através da demonstragáo do mecanismo da actuagáo do fármaco. A identificagáo de compostos com tais características inibidoras pretendidas está ainda descrita na Secgáo G abaixo. G. Inibigáo terapéutica de cancros

De acordo com a presente invengáo, foi agora demonstrado que a progressáo de um cancro tumor sólido de mamífero (NSCLC) em que a proteina de fusáo EML4-ALK é expressa pode ser inibida, in vivo, através da inibigáo da actividade da cinase ALK em tal cancro. De forma semelhante ao aqui descrito, a actividade de um cancro tumor sólido de mamífero em que a proteina de fusáo TFG-ALK é expressa pode ser inibida de forma semelhante, in vivo, através da inibigáo da actividade da cinase ALK nesse cancro. A actividade ALK em cancros caracterizados pela expressáo de um polipéptido mutante pode ser inibida através do contacto do cancro (e.g. um tumor) com um fármaco inibidor da cinase ALK, como seja urna molécula pequeña inibidora de cinases como seja WHI-131 ou WHI-154. Como ainda descrito no Exemplo 2, a inibigáo do crescimento dos tumores que expressao a proteína de fusao ALK, por exemplo, pode ser conseguida através da inibigao da cíñase de fusao usando como exemplo um siRNA como fármaco inibidor de ALK. Assim, a invengáo proporciona, em parte, um inibidor ALK para uso na inibigao da progressao e um cancro que expresse o polipéptido de fusao EML4-ALK através da inibigao da expressao e/ou actividade da cinase ALK mutante no cancro.

Um fármaco inibidor da cinase ALK pode ser qualquer composigáo compreendendo pelo menos um composto, produto biológico ou químico, que iniba, directamente ou indirectamente, a expressao e/ou actividade da cinase ALK in vivo, incluindo as classes exemplificativas de compostos descritos abaixo. Tais compostos incluem fármacos que actuam directamente na própria cinase ALK ou em proteínas ou moléculas que modificam a actividade de ALK ou que actuam indirectamente através da inibigao da expressao de ALK. Tais composigóes também incluem composigóes compreendendo apenas um composto inibidor da cinase ALK, assim como composigóes compreendendo múltiplos fármacos (incluindo os dirigidos contra outras RTKs), os quais podem também incluir um agente terapéutico nao específico, do tipo agente quimioterapéutico ou inibidor da transcrigáo em geral.

Pequeñas moléculas inibidoras

Nalgumas realizagóes preferidas, um fármaco inibidor de ALK útil na invengáo é urna pequeña molécula inibidora dirigida, como seja WHI-131 e WHI-154, ou seus análogos. WHI-131 e WHI-154 sao pequeñas moléculas inibidoras do tipo quinazolina dirigidos para ALK e as suas propriedades foram descritas. Ver Marzec et ai., Lab. Invest. 85(12): 1544-54 (2005). Demonstrou-se que estes compostos induzem apoptose e suprimem a proliferagao em células de linfoma. Outras moléculas pequeñas inibidoras dirigidas para cinases sao bem conhecidas na arte. Por exemplo, Gleevec® (STI-571, Imatinib) que se liga especifreamente e bloqueia o local de ligagáo de ATP de urna cinase de fusáo BCR-ABL (assim como outras cinases) prevenindo assim a fosforilagáo e activagáo desta enzima, é comercializada e as suas propriedades sao bem conhecidas. Ver, Dewar et ai., Blood 105(8): 3127-32 (2005). Outras moléculas pequeñas inibidoras de ALK estáo actualmente em desenvolvimento pela Novartis, Inc., e CEphalon, Inc.

Pequeñas moléculas inibidoras dirigidas sao urna classe de moléculas que típicamente inibem a actividade da sua enzima alvo ao específicamente, e frequentemente de forma irreversível, se ligarem ao local catalítico da enzima e/ou ligar a urna chave de ligagáo a ATP de outro local de ligagáo dentro da enzima que evita a enzima de adoptar urna conformagáo necessária para a sua actividade. Pequeñas moléculas inibidoras podem ser racionalmente desenhadas usando modelagáo cristalográfica de raios X ou informática da estrutura tridimensional da cinase ALK ou pode ser encontrada através de rastreio de elevado número de amostras de bibliotecas de compostos para inibigáo de ALK. Tais métodos sao bem conhecidos na arte e foram descritos. A especificidade da inibigáo de ALK pode ser confirmada, por exemplo, através da avaliagáo da capacidade de tal composto para inibir a actividade ALK, mas nao a actividade de outras cinases, num painel de cinases, e/ou através da avaliagáo da inibigáo da actividade de ALK numa amostra biológica compreendendo células do carcinoma do pulmao, como descrito acima. Tais métodos de rastreio sao aínda descritos abaixo.

Anticorpos inibidores Fármacos inibidores da cíñase ALK úteis na invengáo podem também ser anticorpos dirigidos que específicamente se ligam a locáis críticos, catalíticos ou de ligagáo, necessários para a actividade ALK e inibem a cíñase através do bloqueio do acesso de ligandos, substratos ou moléculas secundárias a ALK, e/ou prevengao da enzima adoptar urna conformagáo necessária para a sua actividade. A produgáo, rastreio e uso terapéutico de anticorpos humanizados específicos do alvo tem sido bem descrita. Ver Merluzzi et al., Adv Clin Path. 4(2): 77-85 (2000). Tecnologías e sistemas comerciáis, tais como Morphosys, Inc.'s Human Combinatorial Antibody Library (HuCAL®), para a geragáo e rastreio de elevado número de anticorpos humanizados inibidores, específicos de alvo, disponíveis. Tém sido descritos a produgáo de vários anticorpos dirigidos anti-receptores cinases e o seu uso para inibir actividade do receptor alvo. Ver, e.g. Publicagáo de Patente U.S. No. 20040202655, "Anticorpos contra o receptor IGF-1 para o tratamento de cancros" ("Antibodies to IGF-1 Receptor for the Treatment of Cancers,") 14 de Outubro, 2004, Morton et al.; Publicagao de Patente U.S. No. 20040086503, "Anticorpos de cadeia simples humanos anti-receptor do factor de crescimento epidérmico" ("Human anti-Epidermal Growth Factor Receptor Single-Chain Antibodies,") 15 de Abril, 2004, Raisch et al.; Publicagao de Patente U.S. No. 20040033543, "Tratamento de carcinoma renal usando anticorpos contra o EGFr" ("Treatment of Renal Carcinoma Using Antibodies Against the EGFr," 19 de Fevereiro, 2004, Schwab et. al. Métodos padronizados para a produgao e uso de anticorpos inibidores da actividade do receptor tirosina cíñase sao conhecidos na arte. Ver, e.g. Patente Europeia No. EP1423428, "Anticorpos que bloqueiam a activagao de receptor tirosina cíñase, métodos para o seu rastreio e utilizagao dos mesmos" ("Antibodies that Block Receptor Tyrosine Finase Activation, Methods of Screening for and Uses Thereof," 2 de Junho, 2004, Borges et al.

Abordagens de apresentagáo fágica podem ser igualmente empregues para gerar anticorpos inibidores específicos de ALK e protocolos para a construgao de bibliotecas de bacteriófagos e selecgao de anticorpos recombinantes sao proporcionados no livro de texto de referencia bem conhecido CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY,

Colligan et al. (Eds.), John Wiley & Sons, Inc. (1992 — 2000), Capítulo 17, Secgao 17.1. Ver também Patente U.S. No. 6,319,690, 20 de Novembro, 2001, Little et al.; Patente U.S. No. 6, 300,064, 9 de Outubro, 2001, Knappik et al./ Patente U.S. No. 5,840,479, 24 de Novembro, 1998, Little et al.; Publicagao de Patente U.S. No. 20030219839, 27 de Novembro, 2003, Bowdish et al.

Urna biblioteca de fragmentos de anticorpos apresentada na superficie de bacteriófagos pode ser produzida (ver, e.g. Patente U.S. 6,300,064, 9 de Outubro, 2001, Knappik et al.)) e rastreada relativamente á ligagao a urna forma dimérica solúvel de um receptor de tirosina cíñase de proteínas (como seja ALK). Um fragmento de anticorpo que se liga á forma dimérica solúvel da RTK usada no rastreio é identificado como urna molécula candidata para o bloqueio constitutivo da activagao da RTK alvo numa célula. Ver Patente Europeia No. EP1423428, Borges et al., s upra.

Os anticorpos dirigidos que se ligam a ALK identificados no rastreio de bibliotecas de anticorpos como descrito acima pode ser entao aínda testados relativamente á sua capacidade para bloquear a actividade ALK, tanto no ensaio de cíñase in vitro como in vivo, em linhas celulares e/ou tumores. A inibigao de ALK pode ser conformada, por exemplo, através da avaliagao da capacidade de tal anticorpo terapéutico para inibir a actividade de cíñase ALK, mas nao outra actividade de cíñase, num painel de cinases e/ou através da avaliagáo da inibigáo da actividade ALK numa amostra biológica compreendendo células cancerosas, como descrito acima. Métodos de rastreio de tais compostos relativamente á inibigáo da cíñase ALK estao descritos mais detalhadamente acima.

Inibidores indirectos

Os compostos inibidores de ALK úteis na realizagao dos métodos divulgados podem também ser compostos que indirectamente inibem a actividade ALK através da inibigáo da actividade de proteínas ou moléculas diferentes da própria cíñase ALK. Tais fármacos inibidores podem ser inibidores dirigidos que modulam a actividade de cinases reguladoras chave que fosforilam ou desfosforilam (e portanto activam ou desactivam) a própria ALK, ou interferem com a ligagáo de ligandos. Tal como com outros receptores tirosina cinases, ALK regula a sinalizagáo a jusante através de urna rede de proteínas adaptadoras e cinases a jusante, incluindo STAT5 e AKT. Como resultado, a indugáo do crescimento e sobrevivencia celulares através da actividade de ALK pode ser inibida através do alvejamento destas proteínas que interagem ou proteínas a jusante. Os fármacos actualmente me desenvolvimento que poderáo ser usados desta forma incluem Wartmanin.

A actividade da cíñase ALK pode também ser indirectamente inibida usando um composto que inibe a ligagáo de urna molécula activadora necessária para ALK adoptar a sua conformagáo activa. De modo semelhante, por exemplo, foram descritos a produgáo e o uso de anticorpos anti-PDGF para regular negativamente a tirosina cúnase receptor PDGF. Ver Publicagáo de Patente U.S. No. 20030219839, "Anticorpos anti-PDGF e métodos para a produgáo de anticorpos genéticamente manipulados" ("Anti-PDGF Antibodies and Methods for Producing Engineered Antibodies,") Bowdish et al.

Os inibidores indirectos da actividade ALK podem ser racionalmente projectados usando modelagao cristalográfica de raios X ou modulagáo informática da estrutura tridimensional de ALK ou pode ser encontrada através de rastreio de elevado número de amostras de bibliotecas de compostos relativamente á inibigáo de enzimas reguladoras chave a montante e/ou moléculas d e ligagáo necessárias, as qual resulta na inibigáo da actividade de cúnase ALK. Tais abordagens sao bem conhecidas na arte e foram descritos. A inibigáo de ALK por tais fármacos pode ser confirmada, por exemplo, através da avaliagáo da capacidade do composto para inibir a actividade ALK, mas náo a de outra actividade cúnase, num painel de cinases e/ou através da avaliagáo da actividade ALK numa amostra biológica compreendendo células de cancro, e.g. células NSCLC, como descrito acima. Métodos de identificagáo de compostos que inibem um cancro caracterizado por um polinucleótido de fusáo e/ou polipéptido de fusáo EML4-ALK ou TFG-ALK sáo aínda descritos abaixo.

Inibidores anti-sentido e/ou da transcrigao Fármacos inibidores de ALK podem compreender igualmente compostos anti-sentido e/ou inibidores da transcrigao que inibem a actividade de cúnase ALK através do bloqueio da transcrigao do gene codificador de ALK e/ou dos genes de fusao EML4-ALK ou TFG-ALK ou genes ALK truncados. Por exemplo, tem sido descrita a inibigao de várias cinases receptores, incluindo VEGFR, EGFR e IGFR e FGFR, através de fármacos anti-sentido opara o tratamento de cancro. Ver, e.g., Patentes U.S. Nos. 6,734,017; 6, 710, 174, 6, 617,162; 6, 340, 674; 5, 783, 683; 5, 610,288.

Os oligonucleótidos anti-sentido podem ser desenhados, construidos e empregues como fármacos contra genes alvo de acordo com técnicas conhecidas. Ver, e.g.

Cohén, J., Trends in Pharmacol. Sci. 10(11): 435-437 (1989); Marcus-Sekura, Anal. Biochem. 172: 289-295 (1988);

Weintraub, H., Sci. AM. pp. 40-46 (1990); Van Der Krol et al., BioTechniques 6(10): 958-976 (1988); Skorski et al.,

Proc. Nati. Acad. Sci. USA (1994) 91:4504-4508. A inibigao do crescimento de carcinoma humano in vivo usando inibidor RNA anti-sentido de EGFR foi recentemente descrita. Ver Publicagáo de Patente U.S. No. 20040047847, "Inibigao do crescimento in vivo de carcinoma de células escamosas humano por RNA anti-sentido para o recepto do factor de crescimento epidérmico transcrito a partir de um promotor de Pool III" ("Inhibition of Human Squamous Cell Carcinoma

Growth In vivo by Epidermal Growth Factor Receptor Antisense RNA Transcribed from a Pol III Promoter,") 11 de

Margo, 2004, He et al. De forma semelhante, um fármaco inibidor de ALK compreendendo pelo menos um oligonucleótido anti-sentido contra um gene de mamífero ALK (ver Figura 4 (SEQ ID N06)) ou polinucleótido de fusao EML4-ALK ou TFG-ALK ou polinucleótido ALK truncado (ver Figuras 2A-C (SEQ ID NOs: 2, 19 e 21)) podem ser preparados de acordo com métodos descritos acima. Composigóes farmacéuticas

compreendendo compostos anti-sentido inibidores de ALK podem ser preparados e administrados como descrito ainda abaixo.

Pequeño RNA de interferencia

Composigóes de pequeñas moléculas de RNA de interferencia (siRNA), as quais inibem a tradugao e portanto a actividade de ALK através do processo de interferencia por RNA, podem também ser desejavelmente empregues na invengáo. Tem sido igualmente descrita a

interferencia por RNA e o silenciamento selectivo da expressáo da proteína alvo através da introdugáo de pequeñas moléculas de RNA de cadeia dupla exógenas compreendendo urna sequéncia complementar do mRNA codificador da proteína alvo. Ver, e.g. Publicagao de Patente U.S. No. 20040038921, "Composigao e Método para inibigao da expressáo de um gene alvo" ("Composition and Method for Inhibiting Expression of a Target Gene,") February 26, 2004, Kreutzer et al.; Publicagao de Patente U.S. No. 20020086356, "Mediadores específicos de sequéncia de RNA de RNA de interferencia" ("RNA Sequence-Specific Mediators of RNA Interference,") 12 de Junho,2003, Tuschl et al.; Publicagao de Patente U.S. No. 20040229266, "Interferencia por RNA mediada por moléculas pequeñas de RNA" ("RNA Interference Mediating Small RNA Molecules,") 18 de Novembro, 2004, Tuschl et. al.

Por exemplo, como presentemente demonstrado (ver Exemplo 2), o silenciamento mediado por siRNA da expressao da proteína de fusao EML4-ALK numa linha celular humana NSCLC, expressando a proteína de fusao, inibiu selectivamente a progressao da doenga naquelas células, mas nao ñas células controlo que nao expressam a proteína ALK mutante.

Moléculas de RNA de cadeia dupla (dsRNA) tém revelado boquearem a expressao de genes num mecanismo regulador altamente conservado conhecido como interferencia por RNA (RNAi). Resumidamente, a RNAse III Dicer processa dsRNA em pequeños RNAs interferentes (siRNA) de aproximadamente 22 nucleótidos, os quais servem como sequéncias guia para induzir corte de mRNA específico de alvo através de um complexo de silenciamento induzido por RNA RISC (ver Hammond et al., Nature (2000) 404: 293-296). RNAi envolve urna reacgao do tipo catalítico através da qual novos siRNAs sao gerados através de cortes sucessivos de dsRNA mais longo. Assim, ao contrário do RNA anti-sentido, RNAi degrada RNA alvo numa forma nao estequiométrica.

Quando administrado a urna célula ou organismo, foi demonstrado que dsRNA exógeno dirige a degradagao especifica de sequéncia do RNA mensageiro endógeno (mRNA) através de RNAi.

Urna larga variedade de produtos de siRNA específicos de alvo, incluindo vectores e sistemas para a sua expressao e uso em células de mamífero, sao agora comercializados. Ver, e.g., Dharmacon's "RNAi Technical Reference & Application Guide"; Promega's "RNAi: A Guide to Gene Silencing.". Existem manuais técnicos detalhados sobre desenho, construgao e uso de dsRNA para RNAi. Ver, e.g. e.g. Dharmacon's "RNAi Technical Reference & Application

Guide"; Promega's "RNAi: A Guide to Gene Silencing.

Produtos de siRNA inibidores de ALK estao também comercializados e podem ser adequadamente empregues na invengao. Ver, e.g., Dharmacon, Inc., Lafayette, CO (Cat Nos. M-0 03162-03, MU-003162-03, D-003162-07 thru -10 (siGENOME™ SMARTselection e SMARTpool® siRNAs).

Foi recentemente estabelecido que dsRNA pequeño, com menos que 4 9 nucleótidos de comprimento, e de preferencia com 19-25 nucleótidos, compreendendo pelo menos urna sequéncia que é substancialmente idéntica a parte de urna sequéncia de mRNA alvo e em que dsRNA, idealmente, possui pelo menos um extremo saliente de 1-4 nucleótidos num extremo, é mais eficaz na mediagao de RNAi em mamíferos. Ver Publicagao de Patente U.S. No. 20040038921, Kreutzer et al., supra; Publicagao de Patente U.S. No. 20040229266, Tuschl et al., supra. A construgáo de tal dsRNA e o seu uso em preparagóes farmacéuticas para silenciar a expressáo de urna proteina alvo, in vivo, estáo descritos detalhadamente nessas publicagóes.

Se a sequéncia do gene a ser atingido num mamífero for conhecida, RNAs de 21-23 nt, por exemplo, podem ser produzidos e testado quanto á sua capacidade para mediar RNAi numa célula de mamífero, como se ja urna célula humana ou de outro primata. Tais moléculas de RNA de 21-23 nt que medeiam RNAi podem ser testadas, caso se pretenda, num modelo animal adequado para avaliar melhor a sua eficácia in vivo. Locáis alvo que sao conhecidos, por exemplo locáis alvo determinados como sendo locáis alvo eficazes com base em estudos com outras moléculas de ácido nucleico, por exemplo ribozimas ou anti-sentido, ou os alvos conhecidos por estarem associados a urna doenga ou condigáo, tais como os locáis contendo mutagóes ou delegóes, podem ser usados para desenhar moléculas de siRNA tendo igualmente como alvo esses locáis.

Como alternativa, as sequéncias de dsRNA eficazes podem ser racionalmente desenhadas/previstas através do rastreio do mRNA alvo de interesse relativamente a locáis alvo, por exemplo através da utilizagao de um algoritmo informático para enrolamento. A sequéncia alvo pode ser analisada in sálico numa lista de todos os fragmentos ou subsequéncias de um comprimento particular, por exemplo fragmentos de 23 nucleótidos, usando um Perl Script por encomenda ou programas comerciáis de análise de sequéncias tais como Oligo, MacVector, ou o pacote GCG Wisconsin.

Podem ser usados vários parámetros para determinar quais os locáis mais adequados dentro da sequéncia de RNA alvo. Estes parámetros incluem, mas nao lhes estáo limitados, estrutura secundária ou terciária do RNA, composigáo em bases nucleotidicas da sequéncia alvo, grau de homología entre várias regioes da sequéncia alvo ou a posigao relativa da sequéncia alvo dentro do transcrito de RNA. Com base nestas determinagdes, qualquer número de locáis alvo dentro do transcrito de RNA pode ser escolhido para o rastrero de moléculas de siRNA, por exemplo usando ensaios de corte de RNA in vitro, culturas celulares ou modelos animáis. Ver, e.g., Publicagáo de Patente U.S. No. 20030170891, 11 de Setembro, 2003, McSwiggen J. Um algoritmo para identificagáo e selecgáo de locáis alvo para RNAi foi também descrito recentemente. Ver Publicagáo de Patente U.S. No. 20040236517, "Selecgáo de locáis alvo para ataque anti-sentido de RNA" ("Selection of Target Sites for Antisense Attack of RNA,") 25 de Novembro, 2004, Drlica et al. Técnicas de transferéncia de genes frequentemente usadas incluem fosfato de cálcio, DEAE-dextrano, electroporagáo e microinjecgáo e métodos viráis (Graham et al. (1973) Viral. 52: 456; McCutchan et al., (1968), J. Nati. Cáncer Inst. 41: 351; Chu et al. (1987), Nucí. Acids Res. 15: 1311; Fraley et al. (1980), J. Bioi. Chern. 255: 10431; Capecchi (1980), Cell 22: 479). O DNA pode também ser introduzido ñas células usando lipossomas catiónicos (Feigner et al. (1987), Proc. Nati. Acad. Sci USA 84: 7413) . Formulagoes de lípidos catiónicos comercializadas incluem Tfx 50 (Promega) ou Lipofectamin 200 (Life Technologies). Como alternativa, vectores viráis podem ser empregues na entrega de dsRNA numa célula e mediar RNAi. Ver Publicagao de Patente U.S. No. 20040023390, "Silenciamento de genes mediado por siRNA com vectores viráis" ("siRNA-mediated Gene Silencing with Viral Vectors,") 4 Feb., 2004, Davidson et al. A transfecgao e vectores/sistemas de expressao para RNAi em células de mamífero estao comercializados e foram bem descritos. Ver, e.g. o sistema Dharmacon, Inc., DharmaFECT™; Promega, Inc., o sistema siSTRIKE™U6 Hairpin; ver também Gou et al. (2003) FEBS. 548, 113-118; Sui, G. et al. A DNA vector-based RNAi technology to suppress gene expression in mammalian cells (2002) Proc. Nati. Acad. Sci. 99, 5515-5520; Yu et al. (2002) Proc. Nati. Acad. Sci. 99, 6047-6052; Paul, C. et al. (2002) Nature Biotechnology 19, 505-508; McManus et al. (2002) RNA 8, 842-850. A interferencia por siRNA num mamífero usando moléculas de dsRNA preparados pode ser efectuada através da administragao de urna preparagao farmacéutica compreendendo o dsRNA ao mamífero. A composigao farmacéutica é administrada numa dosagem suficiente para inibir a expressao do gene alvo. dsRNA pode, típicamente, ser administrado numa dosagem inferior a 5 mg de dsRNA por quilograma de peso de corpo por dia e é suficiente para inibir ou suprimir completamente a expressáo do gene alvo. Em geral, urna dose adequada de dsRNA será na gama de 0,01 a 2,5 miligramas por quilograma de peso de corpo do recipiente por dia, de preferencia na gama de 0,1 a 200 microgramas por quilograma de peso do corpo por dia, mais de preferencia na gama de 0,1 a 100 microgramas por quilograma de peso de corpo por dia, aínda mais de preferencia na gama de 10 a 50 microgramas por quilograma de peso de corpo por dia e, mais de preferencia na gama de 1,0 a 25 microgramas por quilograma de peso de corpo por dia. Urna composigáo farmacéutica compreendendo o dsRNA é administrada urna vez por dia ou em múltiplas subdoses, por exemplo, usando formulagóes de libertagáo controlada bem conhecidas na arte. A preparagáo e administragáo de tais composigóes farmacéuticas podem ser realizadas de acordo com técnicas convencionais, como descrito aínda abaixo.

Tal dsRNA pode ser entáo usado para inibir a expressáo de ALK e actividade num cancro, através da preparagáo de urna preparagáo farmacéutica compreendendo urna quantidade eficaz em termos terapéuticas de tal dsRNA, como acima descrito, e administragáo da preparagáo a um individuo humano tendo um cancro que expressa a proteína de fusáo EML4-ALK ou TFG-ALK ou a cíñase ALK truncada activa por exemplo, vía injecgáo directa no tumor. A inibigáo similar de outros receptores tirosina cíñase, tais como VEFR e EGFR usando inibidores de siRNA foi recentemente descrita. Ver Publicagáo de Patente U.S. No. 20040209832, 21 de Outubro, 2004, McSwiggen et al./ Publicagáo de Patente U.S. No. 20030170891, 11 de Setembro, 2003, McSwiggen; Publicagáo de Patente U.S. No. 20040175703, 9 de Setembro, 2004, Kreutzer et al.

Composigoes terapéuticas: Administragao

Composigoes terapéuticas inibidoras da cíñase ALK úteis na invengáo podem ser administradas a um mamífero ou através de quaisquer meios conhecidos na arte, incluindo, mas nao lhes estando limitados, as vías oral ou peritoneal, incluindo administragao intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, subcutánea, transdérmica, as vías aérea (aerossol), rectal, vaginal e tópica (incluindo bucal e sublingual).

Para administragao oral, um fármaco inibidor de ALK, de um modo geral, será proporcionado na forma de comprimidos ou cápsulas, como um pó ou granulos, ou como solugáo aquosa ou suspensáo. Os comprimidos para uso oral podem incluir os ingredientes activos misturados co excipientes aceitáveis em termos farmacéuticos tais como diluentes inertes, agentes desintegrantes, agentes de ligagáo, agentes lubrificantes, agentes edulcorantes, agentes aromatizantes, corantes e preservativos. Diluentes inertes adequados incluem carbonato de sodio e de cálcio, fosfato de sodio e cálcio e lactose, enquanto aido de milho e ácido algínico sao adequados como agentes desintegrantes.

Os agentes de ligagao podem incluir amido e gelatina, enquanto o agente lubrificante, se presente, será geralmente estearato de magnésio, ácido esteárico ou talco. Caso se ja pretendido, os comprimidos podem ser revestidos com um material como se ja monostearato de glicerilo ou distearato de glicerilo, para retardar a absorgáo no tracto gastrointestinal. Cápsulas para uso oral incluem cápsulas de gelatina dura em que o ingrediente activo é misturado com um diluente sólido e cápsulas de gelatina mole em que os ingredientes activos sao misturados com água ou um óleo como se ja óleo de amendoim, parafina liquida ou azeite. Para uso intramuscular, intraperitoneal, subcutáneo e intravenoso, as composigóes farmacéuticas aqui divulgadas geralmente seráo proporcionadas em solugóes aquosas estéreis ou suspensóes, tamponado com um pH e isotonicidade adequados. Veiculos aquosos adequados incluem solugáo de Ringer e cloreto de sodio isotónico. 0 veiculo pode consistir exclusivamente num tampáo aquoso ("exclusivamente" significa que nao estao presentes agentes auxiliares ou substancias de encapsulagáo que possam afectar ou mediar a tomada do fármaco inibidor de ALK). Tais substancias incluem, por exemplo, estruturas micelares, tais como lipossomas ou cápsides, como descrito abaixo. Suspensóes aquosas podem incluir agentes de suspensáo tais como derivados de celulose, alginato de sodio, polivinilpirrolidona e goma tragacanta e um agente molhante como se ja lecitina. Preservativos adequados para suspensóes aquosas incluem p-hidroxibenzoato de etilo e n-propilo.

Composigóes terapéuticas inibidoras de cíñase ALK podem também incluir formulagóes encapsuladas para proteger o fármaco (e.g. um composto dsRNA) contra a eliminagáo rápida do corpo, como seja urna formulagáo de libertagáo controlada, incluindo implantes e sistemas de entrega microencapsuladas. Podem ser usados polímeros biodegradáveis biocompatíveis, tais como acetato de etilenovinilo, polianidridos, ácido poliglicólico, colagénio, poliortoésteres e ácido poliláctico. Métodos para a preparagáo de tais formulagóes serao aparentes para os familiarizados com a arte. Os materiais podem ser obtidos no comércio á Alza Corporation e Nova

Pharmaceuticals, Inc. Também podem ser usadas suspensóes de lipossomas (incluindo lipossomas dirigidas as células infectadas com anticorpos monoclonais contra antigénios viráis) como veículos aceitáveis em termos farmacéuticos. Estes podem ser preparados de acordo com métodos conhecidos dos familiarizados com a arte, por exemplo, como descrito na Pat. U.S. No. 4,522,811; Publicagao PCT WO 91/06309; e publicagao de patente Europeia EP-A-43075. Urna formulagao encapsulada pode compreender urna proteína da superficie viral. A proteína da superficie viral pode derivar ou estar associada a um virus, como seja virus polioma, ou pode ser parcialmente ou totalmente artificial. Por exemplo, a proteína de superficie pode ser a Proteína Viral 1 e/ou a Proteína Viral 2 do virus polioma ou um seu derivado.

Composigóes inibidoras de ALK podem igualmente compreender um veículo de entrega, incluindo lipossomas, para administragáo a um individuo, veiculos e diluentes e seus sais e/ou podem estar presentes ñas formulagóes

aceitáveis em termos farmacéuticos. Por exemplo, métodos para a entrega de moléculas de ácido nucleico estáo descritas em Akhtar et al., 1992, Trends Cell Bio., 2, 139; DELIVERY STRATEGIES FOR ANTISENSE OLIGONUCLEOTIDE THERAPEUTICS, ed. Akbtar, 1995, Maurer et al., 1999, Mol. Membr. Biol., 16, 129-140; Hofland and Huang, 1999, Handb.

Exp. Pharmacal., 137, 165-192; e Lee et al., 2000, ACS

Symp. Ser., 752, 184-192. Beigelman et al., Pat. U.S. No. 6,395,713 e Sullivan et al., PCT WO 94/02595 ainda descrevem os métodos gerais para entrega de moléculas de ácidos nucleicos. Estes protocolos podem ser utilizados para a entrega de virtualmente qualquer molécula de ácido nucleico.

Os fármacos inibidores de ALK podem ser administrados a um tumor de mamifero através de urna variedade de métodos conhecidos dos familiarizados co a arte, incluindo, mas nao lhes estando restringidos, encapsulagao em lipossomas, por iontoforese ou através da incorporagáo noutros veiculos, tais como hidrogéis, ciclodextrinas, nanocápsulas biodegradáveis e microsferas bioadesivas ou através de vectores proteicos (O'Haré and Normand, Publicagao Internacional PCT No. WO 00/53722). Como alternativa, a combinagáo fármaco/veiculo é entregue localmente através de injecgáo directa ou através do uso de urna bomba de infusáo. A injecgáo directa da composigáo, seja subcutánea, intramuscular ou intradérmica pode ocorrer usando metodologías convencionais de agulha e seringa ou tecnologías sem agulhas tais como as descritas em Conry et al., 1999, Clin. Cáncer Res., 5, 2330-2337 e Barry et al., Publicagáo Internacional PCT No. WO 99/31262.

Formulagóes aceitáveis em termos farmacéuticos de fármacos inibidores da cíñase ALK incluem sais dos compostos acima descritos, e.g. sais de adigáo de ácido, por exemplo, sais ácido clorídrico, ácido brómico, ácido acético e ácido benzenossulfónico. Urna composigáo farmacológica ou formulagáo refere-se a urna composigáo ou formulagáo numa forma adequada á administragáo, e.g. administragáo sistémica, numa célula ou doente, incluindo por exemplo um ser humano. Formas adequadas, em parte, dependem do uso ou da vía de entrada, por exemplo oral, transdérmica ou injecgáo. Tais formas nao deveráo impedir que a composigáo ou formulagáo atinja urna célula alvo. Por exemplo, as composigóes farmacológicas injectadas na corrente sanguínea deveráo ser solúveis. Outros factores sáo conhecidos na arte e incluem consideragóes tais como toxicidade e formas que impedem que a composigáo ou formulagáo exerga o seu efeito.

As vías de administragáo que conduzem a absorgáo sistémica (i.e. absorgáo ou acumulagáo sistémica de fármacos na corrente sanguínea seguido de distribuigáo por todo os corpo) sao desejáveis e incluem, se limitagóes: intravenosa, subcutánea, intraperitoneal, inalagáo, oral, intrapulmonar e intramuscular. Cada urna destas vías de administragáo expóe o fármaco inibidor de ALK a um tecido ou tumor doente acessivel. Demonstrou-se que a velocidade de entrada de um fármaco na circulagáo é urna fungáo da sua massa molecular ou do tamanho. 0 uso de um lipossoma ou outro veiculo do fármaco compreendendo os compostos para uso de acordo com a presente invengáo pode potencialmente localizar o fármaco, por exemplo, em determinados tipos de tecidos, tais como os tecidos do sistema reticular endotelial (RES). Urna formulagáo de lipossomas que pode facilitar a associagáo do fármaco com a superficie de células, tais como, linfócitos e macrófagos é também útil. Esta abordagem pode proporcionar melhor entrega do fármaco ás células alvo tirando vantagem da especificidade do reconhecimento imunológico de células anormais por macrófagos e linfócitos, tais como células de cancro.

Por "formulagáo aceitável em termos farmacéuticos" pretende-se significar urna composigáo ou formulagáo que permite a distribuigáo eficaz das moléculas de ácido nucleico para usar de acordo com a presente invengáo na localizagáo física mais adequada para a sua actividade pretendida. Exemplos nao limitantes de agentes adequados para a formulagáo com as moléculas de ácido nucleico para usar de acordo com a presente invengáo incluem: inibidores de P-glicoproteínas (como seja Pluronic P85) , os quais podem potenciar a entrada dos fármacos no CNS (Jolliet-Riant and Tillement, 1999, Fundam. Clin. Pharmacal., 13, 16-26); polímeros biodegradáveis, tais como microsferas de poli(DL-lactida-coglicolida) para entrega com libertagáo controlada após implantagáo intracerebral (Emerich et al., 1999, Cell Transplant, 8, 47-58) (Aikermes, Inc. Cambridge, Mass.); e nanopartículas carregadas, tais como as feitas de polibutilcianoacrilato, as quais podem entregar fármacos através da barreira hematocefálica e pode alterar mecanismos de internalizagao neuronal (Prog Neuro-psychopharmacol Bioi Psychiatry, 23, 941-949, 1999). Outros exemplos nao limitantes de estratégias de entrega para os compostos inibidores de ALK para usar de acordo com a invengáo incluem material descrito em Boado et al., 1998, J. Pharm. Sci., 87, 1308-1315; Tyler et al., 1999, FEBS Lett., 421, 280-284; Pardridge et al., 1995, PNAS USA., 92, 5592-5596; Boado, 1995, Adv. Drug Delivery Rev., 15, 73-107; Aldrian-Herrada et al., 1998, Nucleic Acids Res., 26, 4910-4916; and Tyler et al., 1999, PNAS USA., 96, 7053-7058.

Composigóes terapéuticas compreendendo lipossomas modificados na superficie contendo polietilenoglicol e lípidos (lipossomas modificados com PEG ou lipossomas de circulagáo prolongada ou lipossomas invisíveis) podem também ser adequadamente empregues para usar de acordo com a invengáo. Estas formulagóes oferecem um método para aumentar a acumulagao de fármacos em tecidos alvo. Esta classe de veículos de fármacos resiste á opsonizagáo e eliminagao pelo sistema fagocítico mononuclear (MPS ou RES), permitindo assim tempos de circulagao no sangue mais longos e aumento da exposigáo dos tecidos para ao fármaco encapsulado (Lasic et al. Chem. Rev. 1995, 95, 2601-2627; Ishiwata et al., Chem. Pharm. Bull. 1995,43, 1005-1011). Demonstrou-se que tais lipossomas se acumulam selectivamente em tumores, presumivelmente por extravasagao e captura nos tecidos alvo neovascularizados (Lasic et al., Science 1995, 267, 1275-1276; Oku et al.,1995, Biochim. Biophys. Acta, 1238, 86-90). Os lipossomas de circulagao prolongada estimulam a farmacocinética e a farmacodinámica de DNA e RNA, particularmente quando comparado com lipossomas catiónicos convencionais que sao conhecidos por se acumularem em tecidos do MPS (Liu et al., J. Bioi. Chern. 1995, 42, 24864-24870; Choi et al., Publicagáo Internacional PCT No. WO 96/10391; Ansell et al., Publicagáo Internacional PCT No. WO 96/10390; Holland et al., Publicagáo Internacional PCT No. WO 96/10392). Os lipossomas de circulagao prolongada com probabilidade protegem os fármacos da degradagáo por nucleases num grau superior comparativamente com os lipossomas catiónicos, baseado na sua capacidade para evitar acumulagáo em tecidos MPS metabolicamente agressivos, como sejam o figado e o bago.

As composigoes terapéuticas podem incluir urna quantidade eficaz em termos farmacéuticos dos compostos pretendidos num veiculo ou diluente aceitável em termos farmacéuticos. Os veiculos ou diluentes aceitáveis para uso terapéutico sao bem conhecidos na arte farmacéutica e estáo descritos, por exemplo, em REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, Mack Publishing Co. (A. R. Gennaro, Ed. 1985). Por exemplo, podem ser proporcionados preservativos, estabilizadores, corantes e agentes aromatizantes. Estes incluem benzoato de sodio, ácido sórbico e ásteres de ácido p-hidroxibenzóico. Ainda, podem ser usados antioxidantes e agentes de suspensáo.

Urna dose eficaz em termos farmacéuticos é urna dose necessária para prevenir, inibir a ocorréncia, ou tratar (aliviar um sintoma até certo ponto, de preferencia todos os síntomas) de um estado de doenga. A dose eficaz em termos farmacéuticos depende do tipo de doenga, da composigáo usada, da vía de administragao, do tipo de mamífero a ser tratado, das características físicas do mamífero específico em questao, medicagáo dada simultáneamente e outros factores que os familiarizados com a área médica reconhecem. De um modo geral, urna quantidade entre 0,1 mg/kg e 100 mg/kg de peso do corpo/dia dos ingredientes activos é administrado dependendo da poténcia do polímero carregado negativamente. Níveis de dosagem da ordem de aproximadamente 0,1 mg e cerca de 140 mg por quilograma de peso do corpo por día sao úteis no tratamento das condigoes acima indicadas (cerca de 0,5 mg a cerca de 7 g por doente por dia) . A quantidade de ingrediente activo que pode ser combinada com os materiais veículo para produzir urna forma de dosagem simples varia dependendo do hospedeiro tratado e do modo particular de administragáo. Formas de unidade de dosagem geralmente possuem entre cerca de 1 mg e cerca de 500 mg de um ingrediente activo. É entendido que o nivel de dose especifico para qualquer doente particular depende de urna variedade de factores incluindo a actividade do composto especifico empregue, idade, peso do corpo, saúde geral, sexo, dieta, tempo de administragáo, via de administragáo e velocidade de excregao, combinagáo de fármacos e gravidade da doenga particular sujeita a terapia.

Para administragao a animáis nao humanos, a composigáo pode também ser adicionada ao alimento ou água de beber do animal. Pode ser conveniente formular as composigoes do alimento e água de beber do animal de modo que o animal ingira urna quantidade adequada em teros terapéuticos da composigáo juntamente com a sua dieta. Pode ser igualmente conveniente apresentar a composigáo como urna pré-mistura para adigáo ao alimento ou água de beber.

Um fármaco inibidor de ALK para usar de acordo com a invengáo pode compreender um composto simples como descrito acima ou urna combinagáo de múltiplos compostos, da mesma classe de inibidor (i.e anticorpo inibidor) ou de diferentes classes (i.e anticorpos inibidores e pequeñas moléculas inibidoras). Tal combinagáo de compostos pode aumentar o efeito terapéutico global ao inibir a progressáo de um cancro expressando a proteina de fusáo. Por exemplo, a composigáo terapéutica pode ser urna molécula pequeña inibidora, como seja WHI-131 e/ou WHI-154 sozinhos, ou em combinagao com outros inibidores tendo como alvo a actividade ALK e/ou outras moléculas pequeñas inibidoras. A composigáo terapéutica pode também compreender um ou mais agentes quimioterapéuticos nao específicos para além de um ou mais inibidores dirigidos. Recentemente, demonstrou-se que tais combinagóes proporcionam um efeito sinergístico na morte do tumor em muitos cancros. A eficácia de tais combinagóes na inibigao da actividade ALK e crescimento de tumores in vivo pode ser avallado como descrito abaixo.

Identificagao de compostos inibidores de cinases ALK mutantes A divulgagao também proporciona, em parte, um método para determinar se um composto inibe a progressao de um cancro caracterizado por um polinucleótido de fusao e/ou polipéptido de fusao EML4-ALK ou TFG-ALK, através da determinagao se o composto inibe a actividade do polipéptido de fusao EML4-ALK ou TFG-ALK ou do polipéptido cíñase ALK truncada no cancro. Nalgumas realizagóes preferidas, a actividade inibidora de ALK é determinada através da análise de urna amostra biológica compreendendo células de medula óssea, sangue, efusao pleural ou um tumor.

Numa outra realizagao preferida, a inibigao da actividade de ALK é determinada usando pelo menos um reagente específico do polinucleótido ou polipéptido ALK mutante da divulgagao. O composto a testar pode ser qualquer tipo de fármaco ou composigáo como descrito acima. Métodos de avaliagao da eficácia de um composto, tanto in vitro como in vivo, estáo bem estabelecidos e conhecidos na arte. Por exemplo, urna composigao pode ser testada quanto a sua capacidade para inibir ALK in vitro usando urna célula ou extracto celular em que ALK está activada. Um painel de compostos podem ser empregue para testar a especificidade do composto relativamente a ALK (em oposigáo a outros alvos, tais como EGFR ou PDGFR).

Urna outra técnica para o rastrero de fármacos que podem ser usados proporciona rastreio de elevado número de compostos tendo afinidade de ligagáo adequada para urna proteina de interesse, como descrito no pedido de patente PCT publicado W084/03564. Neste método, conforme aplicado a polipéptidos ALK mutantes, grandes números de diferentes compostos pequeños a testar sao sintetizados num substrato sólido, como sejam alfinetes de plástico ou outra superficie. Os compostos a testar reagem com o polipéptido ALK mutante, ou fragmentos do mesmo, e lavados. 0 polipéptido mutante ligado (e.g. polipéptido de fusáo EML4-ALK) é entao detectado por métodos bem conhecidos na arte. Polipéptido ALK mutante purificado pode também ser usado para revestir directamente placas para usar ñas técnicas de rastreio de fármacos acima referidas. Como alternativa, anticorpos nao neutralizantes podem ser usados para capturar o péptido e imobilizá-lo num suporte sólido.

Um composto que se observou ser um inibidor eficaz da actividade ALK in vitro pode entáo ser examinado relativamente a sua capacidade para inibir a progressao de um cancro que expressa o polipéptido de fusao EML4-ALK ou TFG-ALK e/ou o polipéptido cíñase ALK mutante, in vivo, usando, por exemplo, xenógrafos de mamífero portadores de tumores humanos tais como NSCLC. Desta forma, os efeitos do fármaco podem ser observados num contexto biológico que mais se assemelha ao doente. A capacidade do fármaco para alterar a sinalizagáo ñas células cancerosas ou células do estroma envolvente pode ser determinada por análise com anticorpos específicos de fosforilagao. A eficácia do fármaco na indugao da morte celular ou na inibigao da proliferagáo celular pode ser igualmente observado através da análise com marcadores específicos de apoptose tais como caspase 3 cortada e PARP cortado. De forma semelhante, podem ser empregues transplantes de medula óssea de mamíferos (e.g. murganhos) portadores de leucemias humanas que sejam originadas pela proteína ALK mutante. Neste procedimento, as células de medula óssea que se sabe serem originadas por cíñase ALK mutante sao transplantadas no murganho. 0 crescimento das células cancerosas pode ser monitorizado, o murganho pode entao ser tratado com o fármaco e o efeito do tratamento com fármaco no fenotipo ou progressao do cancro pode ser externamente observado. 0 murganho é entao sacrificado e a medula óssea transplantada removida para análise por, e.g. IHC e transferencias Western. A toxicidade e eficácia terapéutica de tais compostos podem ser determinadas por procedimentos farmacéuticos convencionais em culturas celulares ou animáis experimentáis, e.g., para determinar o LD50 (a dose letal para 50% da populagáo) e o ED50 (a dose terapéuticamente eficaz em 50% da populagao). A razao de doses entre os efeitos tóxicos e terapéuticos é o índice terapéutico e pode ser expresso como a razao LD50/ED50. Os compostos que apresentem indices terapéuticos elevados sao preferidos.

Os Exemplos que se seguem sao proporcionados apenas para ilustrar melhor a invengao e divulgagoes e nao pretendem limitar o seu ámbito, excepto de acordo com s reivindicagóes apensas. A presente invengao abrange modificagóes e variagóes dos métodos aquí ensinados, os quais seráo obvios para os familiarizados com a arte. EXEMPLO 1

Identificado da actividade cinase ALK em tumores sólidos através do perfil global de fosfopéptidos A. Perfil das linhas celulares NSCLC humanas O perfil global de fosforilagao da activagáo de cinase em 22 linhas celulares NSCLC humanas, incluindo H2228, foram examinados usando urna técnica recentemente descrita e poderosa para o isolamento e caracterizagao por espectrometría de massa dos péptidos modificados a partir de misturas complexas a técnica "IAP", ver Rush et al., supra) . A técnica IAP foi realizada usando um anticorpo específico de fosfotirosina (CELL SIGNALING TECHNOLOGY, INC., Beverly, MA, 2003/04 Cat. #9411) para isolar e, subsequentemente, caracterizar os péptidos contendo fosfotirosina a partir de extractos das linhas celulares NSCLC.

Específicamente, a abordagem IAP foi empregue para facilitar a identificagao de tirosina cinases responsáveis pela fosforliagáo de proteínas em cada urna das linhas celulares NSCLC. Em particular, foi considerada actividade de cíñase atípica ou invulgar.

Cultura de células

Todos os reagentes para cultura de células foram adquiridos á Invitrogen, Inc. Um total de 41 linhas celulares NSCLC humanas foi examinado. As linhas celulares NSCLC humanas H520, H838, H1437, H1563, H1568, H1792, H1944, H2170, H2172, H2228, H2347, A549, H441, H1703, H1373 e H358, foram obtidas á American Type Culture Collection e cultivadas em meio RPMI 1640 com 10% FBS e ajustadas para conterem 2 mM L-glutamina, 1,5 g/L bicarbonato de sodio, 4,5 g/L glucose, 10 mM HEPES, 1,0 mM piruvato de sodio, penicilina/estreptomicina. Adicionalmente, seis linhas celulares NSCLC humanas HCC78, Cai-12T, HCC366, HCC15, HCC44 e L0U-NH91, foram adquiridas á DSMZ e cultivadas em RPMI 1640 contendo 10% FBS e penicilina/estreptomicina. As células foram mantidas numa incubadora com 5% CO2 a 37°C.

Para a precipitagao por imunoafinidade e experiencias de imunotransferéncia, as células foram crescidas até 80% de confluencia e depois jejuaram em meio RPMI sem FBS, durante a norte, antes de serem colhidas.

Imunoprecipitagao de fosfopéptidos 100 milhóes de células foram Usadas em tampao de lise com ureia (20 mM Hepes, pH 8,0, Ureia 9 Μ, 1 mM vanadato de sodio, 2,5 mM pirofosfato de sodio, 1 mM beta-glicerofosfato). 0 lisado foi sonicado e clarificado por centrifugagao. 0 lisado clarificado foi reduzido por DTT e alquilado com iodoacetamida como descrito anteriormente (ver Rush et al., Nat. Biotechnol. 23(1): 94-101 (2005)). As amostras foram entao diluidas 4 vezes com Hepes 20 mM para reduzir a concentragao de ureia para 2M e digeridas com tripsina durante a noite, á temperatura ambiente, com agitagao suave.

Os péptidos digeridos foram purificados grosseiramente com colunas Sep-Pak C18, como anteriormente descrito (ver Rush et al., supra) . O material eluido foi liofilizado e os péptidos secos foram dissolvidos em 1,4 mi de tampao MOPS IP (50 mM MOPS/NaOH pH 7,2, 10 mM Na2PÜ4, 50 mM NaCl) e o material insolúvel foi removido por centrifugagáo. A imunoprecipitagáo foi realizada a 4°C durante a noite com 160 yg de anticorpos Phospho-Tyrosine 100 (Cell Signaling Technology) acoplados a esferas de agarose e proteína G (Roche). As esferas foram entao lavadas 3 vezes com 1 mi de tampao MOPS IP e duas vezes com 1 mi de dPRO grau de pureza para HPLC. Os f osf opéptidos foram eluídos das esferas com 60 μΐ de 0,1% TFA seguido de urna segunda eluigáo com 40 μΐ de 0,1% TFA e as fracgóes foram reunidas. Os péptidos eluídos foram concentrados usando urna coluna Zip Tip (Millipore) e analisados com LC-MS/MS. Os espectros de massa foram colhidos com um espectrómetro de massa com armadilha de ides LTQ (ThermoFinnigan).

Análise por espectrometría de massa LC-MS/MS

Os péptidos no eluato de IP (100 μΐ) foram concentrados e separados do anticorpo eluído usando pontas de extracgáo Stop and Go (Stage Tips) (ver Rappsilber et al., Anal. Chem., 75(3): 663-70 (2003)). Os péptidos foram eluídos das microcolunas com 1 μΐ de 60% MeCN, 0,1% TFA em 7,6 1 de 0,4% ácido acético/0,005% ácido heptafluorobutírico (HFBA).

Cada amostra de fosfopéptido foi analisada por LC-MS em duplicado. Urna coluna microcapilar de sílica fundida (125 ym x 18 cm) foi carregada com resina de fase reversa C18 (Magic C18AQ, partículas de 5 ym, 200 Á e tamanho de poro, Michrom Bioresources, Auburn, CA) .

Amostras (4 μΐ) foram aplicadas nesta coluna com um aplicador automático (LC Packings Famos, San Francisco, CA) e eluídas para o espectrómetro de massa através de um gradiente linear, de 55 min, de 7 a 30% de acetonitrilo em ácido fórmico a 0,1%. O gradiente foi aplicado a aproximadamente abe nl/min usando urna bomba de HPLC binária (Agilent 1100, Palo Alto, CA) com um divisor de fluxo em linha. Os ióes dos péptidos eluidos foram analisados em termos de massa com urna armadilha linear de ióes hibrida-instrumento transformador de ressonáncia Fourier do ciclotrao de ióes Tesla 7 (LTQ-FT, Thermo Finnigan, San José, CA).

Empregou-se um método dos sete melhores, pelo que 7 varrimentos MS/MS dependentes dos dados no captor de ióes linear foram colhidos com base ñas medigóes feitas durante o varrimento de rastreio MS anterior na célula ICR, com o captor de ióes linear e o instrumento de transíormagao Fourier operando em simultáneo. Os varrimentos MS foram realizados a 375-1800 m/z com um alvo de controlo de ganho automático (AGC) de 8x106 e urna resolugao e massa de 105. Para MS/MS o AGC foi de 8x106, o tempo de exclusáo dinámico foi de 25 s e ióes com cargas simples foram rejeitados através do rastreio do estado de carga.

Análise da base de dados & classificagóes

As sequéncias peptídicas foram classificadas de acordo com os espectros MS/MS usando o programa

TurboSequest (v.27, ver.12) (ThermoFinngan) urna base de dados composta directa/reversa para proteínas humanas IPI. Os parámetros de pesquisa foram: tripsina como protease; toleráncia de massa do precursor de 1,08 Da; modificagáo estática em cisteína ( + 57,02146, carboxamidometilagáo) ; e modificagóes dinámicas em serina, treonina e tirosina (+79,96633 Da, fosforilagao), lisina (+8,01420, 13C615N2), arginina (+6,02013, 13C6) e metionina (+15,99491, oxidagao). Urna abordagem da base de dados alvo/isca foi usada para estabelecer critérios adequados de filtragáo por pontuagáo de modo que a estimativa da taxa de classificagao de falsos positiva fosse <1%. Para além de exceder os patamares XCorr dependentes de carga (z=l, XCorr >1.5, for z=2, XCorr >2.2, for z=3, XCorr >3.3), as classificagóes foram necessárias para incluírem fosfotirosina, para ter urna precisáo de massa de -5 a +25 ppm e para conter todos os residuos lisina/argina leves ou pesados.

As classificagóes que passaram estes critérios foram aínda avalladas usando um programa de quantificagao por encomenda, Vista (Balalarski et al., manuscrito em preparagáo) para calcular as áreas dos picos e finalmente urna abundancia relativa entre formas pesadas e leves de cada péptido. Os péptidos identificados com sinal versus ruido no varrimento de MS abaixo de 15 nao foram considerados para quantificagao. Para os péptidos encontrados apenas numa das condigóes usou-se no seu lugar o sinal versus ruido.

Foram feitos estudos contra a base de dados humana do NCBI libertada em 24 de Agosto de 2004 contendo 27175 proteínas permitindo metionina oxidada (M+16) e fosforilagáo (Y+80) como modificagoes dinámicas. Todos os espectros que suportaram a lista final de sequéncias atribuidas (nao apresentados aquí) foram revistos por pelo menos tres dentistas para estabelecer a sua credibilidade. A análise IAP referida identificou mais de 2000 péptidos contendo fosfotirosina nao redundantes, mais de 1500 locáis de f osf otirosina e mais de 1000 proteínas fosforiladas em tirosina, a maioria das quais sao novas, a partir das linhas celulares examinadas (dados nao apresentados). As tirosina cinases receptores conhecidas por estarem envolvidas na sinalizagáo de NSCLC foram observadas como tendo tirosina fosforilada em murtas linhas celulares, tais como EGFR, Her2, Her3, EphA2 ed Met. Níveis elevados de fosfopéptidos EGFR foram observados em várias linhas celulares incluindo HCC827 e H3255, duas linhas celulares conhecidas por expressarem niveis amplificados de formas genéticamente activadas de EGFR, confirmando que o método identifica tirosina cinases receptores conhecidos por estarem activados em linhas celulares NSCLC.

Estas linhas celulares expressavam ctirosina cinases receptores nao observados boutras linhas celulares NSCLC. Grandes quantidades de péptidos com tirosina fosforilada derivados de Ros, ALK e PDGFR foram observadas ñas linhas celulares HCC78, H2228 e H1703, respectivamente A linha celular NSCLC H2228, que expressa ALK em níveis elevados, foi seleccionada para posterior análise. B. Perfil de amostras de tumores NSCLC humanos. A técnica IAP, substancialmente como descrito na Parte A acima, foi subsequentemente aplicada na análise de perfis globais de fosforilagáo de um painel de 154 amostras de tumores humanos de doentes NSCLC. Os tecidos foram obtidos do Second Xiangya Hospital, China.

Amostras de tecido congelado foram cortadas em pequeños fragmentos, homogeneizados em tampáo de lise (20 mM HEPES pH 8,0, Ureia 9 M, vanadato de sodio 1 mM suplementado com pirofosfato de sodio 2,5 mM, b-glicerolfosfato 1 mM, 1 mi de tampáo de lise para 100 mg de tecido congelado) usando um Polytron durante 2 vezes de 20 seg. O homogenato foi entáo brevemente sonicado. O lisado clarificado foi reduzido através de DTT e alquilado com iodoacetamida, como anteriormente descrito (ver Rush et al., Nat. Biotechnol. 23(1):94-101 (2005)). As amostras foram entáo diluidas 4 vezes com 20 mM Hepes para reduzir a concentrando de ureia para 2M e digeridas com tripsina durante a noite, á temperatura ambiente, com agitando suave.

Os péptidos digeridos foram purificados grosseiramente com colunas Sep-Pak C18, como anteriormente descrito (ver Rush et al., supra) . O material eluido foi liofilizado e os péptidos secos foram dissolvidos em 1,4 mi de tampao MOPS IP (50 mM MOPS/NaOH pH 7,2, 10 mM Na2P04, 50 mM NaCl) e o material insolúvel foi removido por centrifugagáo. A imunoprecipitagáo foi realizada a 4°C durante a noite com 160 yg de anticorpos para fosfotirosina (Cell Signaling Technology) acoplados a esferas de agarose e proteina G (Roche). As esferas foram entao lavadas 3 vezes com 1 mi de tampao MOPS IP e duas vezes com 1 mi de dH20 grau de pureza para HPLC. Os f osf opéptidos foram eluidos das esferas com 60 μΐ de 0,1% TFA seguido de urna segunda eluigao com 40 μΐ de 0,1% TFA e as fracgóes foram reunidas. Os péptidos eluidos foram concentrados usando urna coluna Zip Tip (Millipore) e analisados com LC-MS/MS. Os espectros de massa foram colhidos com um espectrómetro de massa com armadilha de ides LTQ (ThermoFinnigan). A imunoprecipitagáo de fosfopéptidos, seguido de análise por espectrometría LC-MS/MS foi entao realizada como descrito na Parte A. A pesquisa de bases de dados e classificagao das sequéncias foram feitas substancialmente como descrito acima na Parte A, mas usando a base de dados humana do NCBI libertada em 24 de Agosto de 2004, contendo 27970 proteínas. A análise IAP referida identificou mais de 2000 péptidos contendo fosfotirosina nao redundantes, mais de 1500 locáis de f osf otirosina e mais de 1000 proteínas fosforiladas em tirosina, a maioria das quais sao novas, a partir das amostras de tumor humanas examinadas (dados nao apresentados). As tirosina cinases receptores, conhecidas por estarem envolvidas na sinalizagao de NSCLC, foram novamente observadas como tendo tirosina fosforilada em muitos tumores, tais como EGFR, Her2, Her3, EphA2 e Met. Niveis elevados de fosfopéptidos EGFR confirmando que o método identifica tirosina cinases receptores conhecidos por estarem activados em linhas celulares NSCLC.

Cinco amostras de doentes expressaram tirosina cinases receptores nao observados noutras linhas celulares NSCLC e tumores. Grandes quantidades de péptidos de ALK com tirosina fosforilada foram observadas em doentes CS0110/11, CS045 e CS110. Estes tres tumores, que expressam grandes quantidades de ALK, foram seleccionados para posterior análise. EXEMPLO 2

Isolamento &amp; sequenciagáo de trés genes ALK de fusáo

A. Seguenciagao urna linha celular NSCLC

Considerando o elevado nivel de fosforilagao da cíñase ALK detectado na linha celular NSCLC H2228, realizou-se amplificagao rápida 5' dos extremos de cDNA na sequéncia codificadora do dominio cíñase de ALK de modo a determinar se um transcrito ALK quimérico estava presente.

Amplificagao rápida de extremos de DNA complementares

Usou-se o kit RNeasy Mini Kit (Qiagen) para extrair RNA da linha celular H2228. 0 DNA foi extraido com o uso do kit DNeasy Tissue Kit (Qiagen) . A amplificagao rápida dos extremos de cDNA foi realizada usando o sistema 5' RACE (Invitrogen) com as sequéncias iniciadoras ALK-GSP1 para a sintese de cDNA e ALK-GSP2 e ALK-GSP3 para urna reacgao de PCR "nested".

5' RACE A Figura 5 (painel A) mostra a detecgao do gene da fusáo EML4-ALK (variante curta) através de 5' RACE e a detecgao do produto de amplificagáo por PCR após duas reacgoes. 0 produto de PCR foi purificado com o kit de purificagáo de PCR (Qiagen) e sequenciado usando ALK-GSP3 um sequenciador de DNA automático capilar ABI 3130 (Applied Biosystems). A análise da sequéncia do produto resultante revelou que o dominio cíñase e o extremo C de ALK estavam fundidos com o extremo N do gene EML-4 (ver Figura 1, painel B). O gene de fusáo EML4-ALK (variante curta) estava na mesma grelha de leitura e fundido com os 233 primeiros aminoácidos de EML-4 aos últimos 562 aminoácidos de ALK (ver Figura 1, painel B). Os genes EML-4 e ALK estáo ambos localizados no cromossoma 2, assim o gene de fusáo foi criado através de delegáo de genes entre estes dois loci.

Foram usadas as seguintes sequéncias iniciadoras: ALK-GSP1: 5'-GCAGTAGTTGGGGTTGTAGTC (SEQ ID NO: 9) ALK-GSP2: 5'-GCGGAGCTTGCTCAGCTTGT (SEQ ID NO: 10) ALK-GSP3: 5'-TGCAGCTCCTGGTGCTTCC (SEQ ID NO: 11)

Ensaio de PCR A análise por RT-PCR foi realizada para confirmar se o extremo N de EML-4 estava intacto na proteina de fusao (ver Figura 6 (painel B) ) . A primeira cadeia de cDNA foi sintetizada a partir de 2,5 mg de RNA total usando o sistema de sintese da primeira cadeia SuperScrip™III (Invitrogen) com oligo (dT) 20. Em seguida, o gene de fusao EML4-ALK foi amplificado usando os pares de sequéncias iniciadoras EML-Atg e ALK-GSP3. A fusao recíproca foi detectada usando os pares de sequéncias iniciadoras EML-4-43 e ALK-GSP3 e ELML-4-49 e ALK-GSP3 e EML4-202 e ALK-GSP3. Para PCR genómico, a amplificagao do gene de fusao foi realizada usando a DNA polimerase de alta fidelidade Taq Platinum (Invitrogen) com os pares de sequéncias iniciadoras EML-4-atg e ALK-tga.

Foram usadas as seguintes sequéncias iniciadoras: ALK-GSP3: 5'- TGCAGCTCCTGGTGCTTCC (SEQ ID NO: 12) EML4-Atg: 5'- CGCAAGATGGACGGTTTGGC (SEQ ID NO: 13) EML4-43: 5'-TGTTCAAGATCGCCTGTCAGCTCT (SEQ ID NO: 14) EML4-94: 5'- TGAAATCACTGTGCTAAAGGCGGC (SEQ ID NO: 15) EML4-202: 5'-AAGCCCTCGAGCAGTTATTCCCAT (SEQ ID NO: 16) ALK-Tga: 5'- GAATTCCGCCGAGCTCAGGGCCCAG (SEQ ID NO:17)

De notar, na fusao EML4-ALK (variante curta), a fracgáo ALK está fundida com a fracgáo EML-4 precisamente no mesmo ponto em ALK observado noutras fusóes de ALK, tais como a fusao NPM-ALK que ocorre em ALC. 0 dominio cinase de ALK na linha celular H2228 foi aínda sequenciado a partir de DNA genómico e encontrou-se ser selvagem. Assim, a mutagáo de delegáo descoberta em H2228 nao afecta o dominio cinase de ALK. Aínda, EML-4 selvagem é fosforilada em tirosina apenas num único local que nao está presente na proteína de fusao EML4-ALK (variante curta), sugerindo que o dominio espiral enrolada N terminal que é conservado na proteína de fusao (ver Figura 1A) pode funcionar para dimerizar e activar ALK, assim como para promover a interacgáo com ALK selvagem. B. Sequenciagáo na linha celular NSCLC humana

De forma semelhante, considerando o elevado nivel de fosforilagáo da cinase ALK ñas amostras de tumor NSCLC humanas dos doentes CS0110/11, CS045 e CS110, a amplificagáo rápida 5' dos extremos de cDNA na sequéncia codificadora do dominio cinase de ALK foi realizada de modo a determinar se um transcrito ALK quimérico estava presente nestes tumores. A amplificagáo rápida de extremos de DNA complementar e 5' RACE foi realizada substancialmente como descrito acima na Parte A, com sequéncias iniciadoras ALK-GSP1 para a sintese do cDNA e ALK-GSP2 e ALK-GSP3 para urna reacgáo de PCR "nested".

Figura 5 (painel C) mostra a detecgao dos genes de fusao EML4-ALK (variantes curta e longa) através de 5'RACE em duas amostras de doentes e a detecgao d gene de fusao TFG-ALK num doente e a detecgáo do produto de amplificagao por PCR após 2 reacgoes. Os produtos de PCR foram purificados e sequenciados substancialmente como descrito acima na Parte A. A análise de sequéncias dos produtos resultantes revelou que o dominio cíñase e o extremo C-terminal de ALK foram fundidos com o extremo N do gene EML-4 em duas variantes diferentes (ver Figuras 1A-1B, painel B) . Os genes de fusao EML4-ALK estavam em grelha e fundidos os primeiros 233 aminoácidos (variante curta) ou os primeiros 495 aminoácidos (variante longa) de EML-4 e com os últimos 562 aminoácidos de ALK (ver Figuras 1A-1B, painel B). Os genes EML-4 e ALK estáo ambos localizados no cromossoma 2, assim o gene de fusao foi criado através de delegao de genes entre estes dois loci. A observagáo do gene de fusao (variante curta) no doente CS045 confirmou este resultado do gene mutante na linha celular humana H2228 . 0 gene de fusao TFG-ALK estava também na mesma grelha de leitura e fundidos os primeiros 138 aminoácidos de TFG com os últimos 562 aminoácidos de ALK (ver Figuras 1C, painel B) . Os genes TFG e ALK estao situados em cromossomas diferentes (cromossoma 6 e 2, respectivamente), assim o gene de fusao foi criado por translocagáo de genes entre estes dois loci. É interessante que a fusao de TFG com ALK ocorreu exactamente no mesmo ponto em ALK, conforme observado para a fusao das duas variantes EML4-ALK, indicando que a truncagem de ALK em tumores sólidos neste ponto poe ser urna ocorréncia frequente.

As mesmas sequéncias iniciadoras foram usadas como descrito na Parte A acima. A análise por RT-PCR foi realizada substancialmente como descrito na Parte A acima, para confirmar que o extremo N de EML-4 e de TFG estao intactos ñas proteínas de fusao (ver Figura 6 (painel B) ) . Os pares de sequéncias iniciadoras para EML-4 e ALK foram como descrito na Parte A acima. 0 par de sequéncias iniciadoras que se segue foi usado para TFG: TFG-F1: 5'-TTTGTTAATGGCCAGCCAAGACCC-3 (SEQ ID NO: 28)

De notar, em ambas as variantes de fusao EML4-ALK, a fracgao ALK está fundida com a fracgao EML-4 precisamente no mesmo ponto de ALK que foi observado noutras fusóes de ALK, tais como a fusao NPM-ALK que ocorre em ALCL. Aínda, EML-4 selvagem é fosforilada na tirosina apenas num local que nao está presente ñas proteínas de fusao EML4-ALK, sugerindo que o dominio N-terminal de espiral enrolada que está conservado ñas proteínas de fusao (ver Figuras 1A-1B) pode funcionar para dimerizar e activar ALK, assim como para promover a interacgáo com ALK selvagem. De notar também que a fusao da fracgao TFG com ALK também ocorre precisamente no mesmo ponto em ALK e, de tacto, a fusao de TFG com ALK neste ponto foi descrita em linfoma humano (ver Hernández et al. (2002), supra.), mas nao foi anteriormente descrita em tumores sólidos humanos, tais como NSCLC. EXEMPLO 3

Inibigáo do crescimento de tumores sólidos de mamífero expressando a fusao ALK usando siRNA

De modo a confirmar que as formas truncadas/de fusao de ALK sao responsáveis pelo crescimento celular e sobrevivencia da linha celular H2228 de NSCLC assim como de amostras de tumores NSCLC dos doentes CS0110/11, CS045 e CS110, a capacidade de siRNA (contra ALK) para inibir o crescimento destas células e tumores pode ser avallada.

Duplas hélices de siRNA para ALK SMARTpool (dados nao apresentados sequéncias alvo proprietárias) podem ser adquiridas, por exemplo, á Dharmacon Research, Inc. (Lafayette, CO) . Um siRNA nao especifico SMARTpool foi usado como controlo. As células foram transfectadas com o siRNA por electropragao. Resumidamente, 2 x 107 células (H2228) foram pulsadas urna vez (20ms; 275V, K562 20ms; 285V) usando um electroporador de onda quadrada (BTX Genetronics, San Diego, CA), incubadas á temperatura ambiente durante 30 minutos e transferidas para frascos Τ150 com 30 mi de RPMI-1640/10% FBS. O número de células viáveis foi determinado com o ensaio de proliferagáo celular CeiiTiter 96 AOueous One (Promega). IC50 foi calculado usando o programa OriginPro 6.1 (Originlab). A percentagem de células apoptóticas ás 48 horas pode ser determinada através de análise por citometria de fluxo do corte de caspase 3 ("Cleaved-Caspase-3", Cell Signaling Technology). A análise de imunotransferéncias revelará se a expressáo de ALK está específicamente e significativamente reduzida ás 72 horas após a transfecgáo do siRNA ñas células H2228 ou ñas células tumorais dos doentes CS010/11, CS045 e CS110. Espera-se que a regulagáo negativa de ALK resulte em forte inibigáo do crescimento celular. O tratamento com siRNA ALK espera-se que também resulte num aumento de apoptose destas células de tumores sólidos. Estes resultados indicaráo mais fortemente que as cinases ALK mutantes/de fusáo na linha celular H2228 e nos tumores do doentes sao responsáveis pela proliferagáo e crescimento destas células NSCLC e que tal crescimento e proliferagáo podem ser inibidos usando siRNA para inibir a expressáo e actividade da cíñase ALK. EXEMPLO 4

Inibigáo do crescimento de tumores sólidos de mamífero que expressam ALK de fusáo usando WI-131 e/ou WI-154

Para aínda confirmar que as proteínas de fusao de ALK mutante sao responsáveis pelo crescimento e viabilidade da linha celular NSCLC H2228 e células tumorais dos doentes CS010/11, CS045 e CS110, as células podem ser tratadas com um inibidor dirigido da cíñase ALK, como seja WI-131 e/ou WI-154. WI-131 e W-154 sao pequeñas moléculas inibidoras da cíñase ALK do tipo quinazolina e a sua actividade contra a proteína de fusao NPM-ALK em linfoma das células T foi descrita. Ver Marzeca et al., supra.

Resumidamente, as células NSCLC sao cultivadas e um ensaio de inibigáo do crescimento celular é realizado com o ensaio de proliferagáo celular CellTiter 96 AQue0us One Solution Cell Proliferation Assay (Promega) de acordo com as sugestóes do fabricante. Resumidamente, 1000 a 5000 células sao semeadas em placas de 96 alvéolos de fundo plano e crescidas em meio completo com 10% FBS. Após 24 horas, o meio das células foi trocado por 100 1 de meio de crescimento completo com 10% FBS contendo várias concentragóes do fármaco e as células sao incubadas durante mais 72 horas. Cada urna das concentragóes do fármaco é aplicada em triplicados de alvéolos com células. No final da incubagáo, 20 μΐ de solugáo CellTiter 96 AQue0us One sao adicionados e a placa foi incubada durante 1-4 horas. A absorváncia foi lida a 490 nm usando um leitor de microplacas Titán Multiskan Ascent (Titertek Instrument). A inibigáo do crescimento pode ser expressa como o valor da média ± SD da percentagem da leitura de absorváncia das células tratadas versus células nao tratadas. 0 ensaio foi repetido pelo menos tres vezes.

Espera-se que tal análise confirme que as proteínas de fusao ALK (EML4-ALK (variantes curta e longa), TFG-ALK) sao responsáveis pelo crescimento e sobrevivencia de urna subsérie de tumores NSCLC humanos em que estas proteínas mutantes sao expressas e que tais células podem ser inibidas através da inibigao da actividade da cíñase ALK de fusao usando um inibidor dirigido, como seja WI-131 e/ou WI-154. EXEMPLO 5

Proteínas de fusao ALK sao responsáveis pelo crescimento e sobrevivéncia da linha celular transformada de mamífero

Para confirmar que a expressao de urna ou mais proteínas ALK de fusao podem transformar células normáis num fenotipo canceroso, células 3T# podem ser transformadas com as construgóes de cDNA acima descritas (Exemplo 2), as quais expressam as proteínas de fusao EML4-ALK (variantes curta e longa) ou proteínas de fusao TFG-ALK, respectivamente.

Resumidamente, as células sao mantidas em meio RPMI-1640 (Invitrogen) com 10% de soro fetal bovino (FBS) (Sigma) e 1,0 ng/ml de IL-3 (R&amp;D Systems) . A produgao de sobrenadante de retrovírus e transdugao é realizada como anteriormente descrito. Ver Schwaller et al., Embo J. 17(18): 5321-33 (1998). Células 3T3 sao transduzidas com sobrenadante de retrovirus contendo o vector MSCV-Neo/EML4-ALK (ou TFG-ALK) e seleccionadas relativamente a G418 (1 mg/ml). A capacidade das células transformadas crescerem em agar mole é entao avallada através da sementeira das células transduzidas após lavagem tres vezes em PBS. Caso se pretenda, para as curvas de dose/resposta, as células sao tratadas com siRNA contra ALK como descrito abaixo (ver Exemplo 3) e o número de células viáveis é determinado com o ensaio de proliferagáo CellTiter 96 AQue0us One solution (Promega) . IC50 pode ser calculado com o uso do programa OriginPro 6.1 (Originlab). A percentagem de células apoptóticas as 48 horas pode ser determinada por análise de citometria de fluxo do corte de caspase 3 usando um anticorpo especifico para este alvo (Cell Signaling Technology). Tal análise mostrarla que a expressao da proteina de fusáo EML4-ALK (variante curta e longa) ou proteina de fusáo TFG-ALK pode transformar as células 3T3 e confirmar a sobrevivencia e o crescimento em agar mole quando estas células sao originadas pela proteina ALK de fusáo e ainda que a inibigáo da expressáo de ALK ñas células transformadas conduz á redugáo da viabilidade e apoptose aumentada. EXEMPLO 6

Detecgáo da expressáo da proteína de fusáo EML4-ALK em tumores sólidos humanos usando o ensaio FISH A presenga da proteína de fusao EML4-ALK (variante curta) em tumores NSCLC humanos foi detectada usando um ensaio de hibridagao in situ com fluorescencia, como anteriormente descrito, Ver, e.g. Verma et al. HUMAN CHROMOSOMES: A MANUAL OF BASIC TECHNIQUES, Pergamon Press, New York, N.Y. (1988). Foram avalladas mais de 200 amostras de tumores NSCLC humanos embebidas em parafina.

Urna sonda de rearranjo por quebra de ALK de dupla cor foi adquirida á Vysis (Vysis, Dowers Grove, IL, USA) e usada de acordo com as instrugóes do fabricante com as seguintes modificagóes. Resumidamente, as secgóes de tecido embebidas em parafina foram reidratadas e sujeitas a recuperagáo do antigénio com micro-ondas, em tampao Citrato 0,01M (pH 6,0), durante 11 minutos. As secgóes foram digeridas com Protease (4 mg/ml de Pepsina, 2000-3000 U/mg) durante 25 minutos a 37°C, desidratado e hibridado com a série de sondas FISH a 37°C durante 18 horas. Após lavagem, 4',6.diamino-2-fenilindole (DAPI; ng/ml) em meio de montagem Vectashield (Vector Laboratories, Burlingame, CA) foi aplicado para contrastagao nuclear. A sonda de rearranjo para ALK possui duas sondas marcadas de forma diferente em lados opostos do ponto de quebra do gene ALK (no nucleótido 3171) na sequéncia selvagem (SEQ ID NO:6). Quando hibridada, a regiao de ALK nativa surgirá como um sinal de fusáo laranja/verde, enquanto o rearranjo neste locus (como ocorre nos mutantes de delegáo EML4-ALKK) resultará em sinais laranja e verde separados. Ver Figura 6. A análise FISH revelou urna incidencia relativamente baixa desta mutagáo de variante curta de EML4-ALK na populagáo de amostras estudada (urna em 229 amostras). No entanto, considerando a elevada incidencia de NSCLC a nivel mundial (anualmente cerca de 151000 novos casos só nos E.U.A.) é de esperar que haja um número significativo de doentes portadores desta ALK mutante, doentes que podem beneficiar do regime terapéutico inibidor de ALK. EXEMPLO 7

Detecgáo da expressáo da proteína ALK de fusáo em tumores sólidos humanos usando o ensalo de PCR A presenta de urna ou mais proteínas ALK de fusáo numa amostra de tumores sólidos humanos pode também ser detectada usando a reacgáo em cadeia da polimerase (PCR) genómico ou após transcriptase reversa (RT), anteriormente descritas. Ver, e.g. Cools et ai., N. Engl. J. Med. 348: 1201-1214 (2003). Resumidamente e a título de exemplo, amostras de tumores sólidos pode ser obtido a partir de um doente tendo, e.g. NSCLC, usando técnicas convencionais.

Foram construidas sondas de PCR contra cíñase ALK truncada ou proteína de fusao EML4-ALK (variante curta ou longa) ou proteína de fusao TFG-ALK. RNeasy Mini Kit (Qiagen) pode ser usado para extrair RNA das amostras de tumor. 0 DNA pode ser extraído usando o kit DNeasy Tissue kit (Qiagen). Para RT-PCR, a primeira cadera do cDNA é sintetizada, e.g., a partir de 2,5 yg de RNA total usando, por exemplo, usando o sistema de síntese da primeira cadera SuperScript™ III (Invitrogen) com oligo(dT) 20.

Em seguida, o gene de fusao ALK foi amplificado usando pares de sequéncias iniciadoras, e.g. EML4-202 e ALK-GSP3 (ver Exemplo 2 acima). Para PCR genómico, a amplificagao do gene de fusao pode ser realizada usando a DNA polimerase de alta fidelidade Taq Platinum (Invitrogen) com os pares de sequéncias iniciadoras EML4-202 e ALK-GSP3. (ver Exemplo 2, acima). Tal análise identificará um doente tendo um tumor sólido caracterizado pela expressao da cíñase ALK truncada (e/ou proteínas de fusao EML4-ALK ou proteína de fusao TFG-ALK), doente que é candidato ao tratamento usando um fármaco inibidor de ALK, como se ja WHI-131 e/ou WHI154.

Lisboa, 16 de agosto de 2017

Claims (6)

1. REIVINDICAgÓES

   1. Um inibidor de ALK para usar no tratamento de um cancro de mamífero caracterizado pela expressao de um polipéptido de fusao EML4-ALK.
2. 2. Um inibidor de ALK para usar de acordo com a reivindicagao 1, em que o referido cancro é cancro do pulmao.
3. 3. Um inibidor de ALK para usar de acordo com a reivindicagao 1 ou 2, em que o referido cancro é NSCLC.
4. 4. Um inibidor de ALK para usar de acordo com qualquer urna das reivindicagóes anteriores, em que o referido inibidor é um oligonucleótido anti-sentido ou siRNA capaz de inibir a expressao do referido polipéptido de fusao EML4-ALK.
5. 5. Um inibidor de ALK para usar de acordo com qualquer urna das reivindicagóes 1 a 3, em que o referido inibidor é um anticorpo capaz de bloquear a actividade do referido polipéptido de fusao EML4-ALK.
6. 6. Um inibidor de ALK para usar de acordo com qualquer urna das reivindicagóes 1 a 3, em que o referido inibidor é urna molécula pequeña como seja WHI-131 e/ou WHI- 154, ou seus análogos.