ES2637592T3 - Defectos de genes y quinasa ALK mutante en tumores sólidos humanos - Google Patents

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Abstract

Un inhibidor de ALK para usar en el tratamiento del cáncer de un mamífero caracterizado por la expresión de un polipéptido de fusión de EML4-ALK.

Description

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DESCRIPCION
Defectos de genes y quinasa ALK mutante en tumores solidos humanos Campo de la invencion
La invencion se refiere en general a protemas y genes implicados en el cancer, y al tratamiento del cancer. Antecedentes de la invencion
Muchos canceres se caracterizan por alteraciones en las vfas de senalizacion celular que conducen a un control aberrante de los procesos celulares, o al crecimiento y proliferacion incontrolados de las celulas. Estas alteraciones son causadas a menudo por los cambios en la actividad de protemas de senalizacion concretas, tales como las quinasas. Entre estos canceres se encuentran tumores solidos, como carcinoma de pulmon de celulas no pequenas (CPCNP). El CPCNP es la principal causa de muerte por cancer en los Estados Unidos, y representa aproximadamente 87% de todos los canceres de pulmon. Existen aproximadamente 151.000 nuevos casos de CPCNP en los Estados Unidos cada ano, y se estima que mas de 120.000 pacientes moriran anualmente a causa de esta enfermedad solo en los Estados Unidos. Vease "Cancer Facts and Figures 2005', American Cancer Society. El CPCNP, que comprende tres subtipos distintos, a menudo solo se detecta despues de que haya metastatizado, y por lo tanto la tasa de mortalidad es de 75% en los dos anos siguientes al diagnostico.
Se sabe que las deleciones y/o translocaciones genicas que dan como resultado protemas de fusion de quinasas con actividad de senalizacion aberrante pueden conducir directamente a ciertos canceres. Por ejemplo, se ha demostrado directamente que la oncoprotema BCR-ABL, una protema de fusion de tirosina quinasa, es el agente causal en la leucemia mielogena cronica humana (LMC). La oncoprotema BCR-ABL, que se encuentra en al menos 90-95% de los casos de LMC, es generada por la translocacion de secuencias genicas de la protema tirosina quinasa c-Abl en el cromosoma 9 a las secuencias de BCR en el cromosoma 22, produciendo el denominado cromosoma Filadelfia. Vease, p. ej., Kurzock et al., N. Engl. J. Med. 319: 990-998 (1988). La translocacion se observa tambien en casos de leucemia linfodtica aguda y CPCNP.
Se han descrito translocaciones y deleciones genicas que conducen a protemas mutantes o de fusion implicadas en una variedad de otros canceres. Por ejemplo, Falini et al., Blood 99(2): 409-426 (2002), revisan las translocaciones que se sabe que se producen en los canceres hematologicos, incluyendo la fusion NPM-ALK encontrada en LACG. Hasta la fecha, se han descrito solo un numero limitado de translocaciones, deleciones de genes, y protemas mutantes que aparecen en los canceres de pulmon, incluyendo la translocacion t(15;19) que implica Notch3. Vease Dang et al., J. Natl. Can. Instit. 92(16): 1355-1357 (2000). Se han encontrado defectos en la expresion y/o actividad de la Protema 6 de Union a ARN (EML-4) en carcinomas de pulmon de celulas pequenas y de celulas no pequenas. Vease. Drabkin et al., Oncogene 8(16): 2589-97 (1999). Sin embargo, hasta la fecha, no se han descrito translocaciones o deleciones en el cancer CPCNP humano que impliquen protemas quinasas.
Se han descrito defectos en la expresion de la quinasa ALK resultante de la fusion de NPM a ALK en el linfoma anaplasico de celulas. Veanse Morris et al., 1994; Shiota et al., 1994. Se han descrito la fusion de ALK a moesina, a la cadena pesada 9 de la miosina no muscular (Tort et al. 2001), a la cadena pesada de clartrina (Touriol et al., 2000; Bridge et al., 2001), a tropomiosina 3 (TPm3) (Lamant et al., 1999), al gen fusionado a TRK (TgF) (Hernandez et al., Am. J. Path. 160(4): 1487-1493 (2002)) y a otros genes. En particular, se informo sobre la fusion de TGF-ALK en el linfoma no solido, pero hasta la fecha esta fusion no se ha descrito en los tumores solidos. Se ha descrito el papel general de ALK en el cancer. Vease Pulford et al., J. Cell Physiol. 199(3): 330-358 (2004). Sin embargo, hasta la fecha, no se han descrito defectos en la expresion y/o activacion de EML-4.
La identificacion de mutaciones en canceres humanos es altamente deseable, ya que puede conducir al desarrollo de nuevos agentes terapeuticos que se dirigen a tales protemas de fusion o mutantes, y a nuevos diagnosticos para la identificacion de pacientes que tienen tales mutaciones geneticas. Por ejemplo, BCR-ABL se ha convertido en una diana para el desarrollo de agentes terapeuticos para el tratamiento de la leucemia. Mas recientemente, Gleevec® (mesilato de imatinib, STI-571), un inhibidor de molecula pequena de la quinasa ABL, ha sido aprobado para el tratamiento de la LMC. Este farmaco es el primero de una nueva clase de agentes anti-proliferativos disenados para interferir en las rutas de senalizacion que dirigen el crecimiento de celulas tumorales. El desarrollo de este farmaco representa un avance significativo sobre las terapias convencionales para la LMC y la LLA, la quimioterapia y la radiacion, que se ven afectadas por los efectos secundarios bien conocidos y tienen a menudo un efecto limitado, ya que no pueden dirigirse espedficamente a las causas subyacentes de las enfermedades malignas. Del mismo modo, se han descrito los reactivos y metodos para detectar espedficamente la protema de fusion BCR-ABL en pacientes, con el fin de identificar a los pacientes con mas probabilidades de responder a inhibidores espedficos, como Gleevec®.
Por consiguiente, sigue existiendo la necesidad de la identificacion de nuevas mutaciones de genes, tales como translocaciones o deleciones, que dan como resultado protemas de fusion o mutantes implicadas en la progresion de canceres humanos, concretamente tumores solidos, incluyendo canceres de pulmon como el CPCNP, y el desarrollo de nuevos reactivos y metodos para el estudio y la deteccion de tales protemas de fusion. La identificacion de tales protemas de fusion permitira deseablemente, entre otras cosas, nuevos metodos de seleccion
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de pacientes para terapias dirigidas, as^ como para el escrutinio de nuevos farmacos que inhiban tales protemas mutantes/de fusion.
Compendio de la invencion
La invencion se reivindica en las reivindicaciones 1-6. En esta memoria se describen mutaciones novedosas por delecion genica que se producen en el cromosoma humano 2 que dan como resultado protemas de fusion que combinan parte de la Quinasa del Linfoma Anaplasico (ALK) con una protema secundaria que se han identificado ahora en el tumor solido de carcinoma de pulmon de celulas no pequenas (CPCNP) humano. Las protemas secundarias que participan en las fusiones de ALK incluyen Protema de Tipo 4 Asociada a Microtubulos de Equinodermo (EML-4) y Gen Fusionado a TRK (TFG). Las quinasas ALK mutantes/de fusion han sido observadas en la actualidad en muestras de pacientes con carcinoma de pulmon de celulas no pequenas.
Por consiguiente, la descripcion proporciona, en parte, polinucleotidos aislados y vectores que codifican los polipeptidos de ALK mutantes/de fusion descritos, sondas y analisis para detectarlos, polipeptidos de ALK mutante/de fusion aislados, polipeptidos mutantes recombinantes, y reactivos para la deteccion de los polinucleotidos y polipeptidos de aLk mutantes. La identificacion descrita de estas nuevas quinasas ALK mutantes y de las translocaciones/deleciones permite nuevos metodos para determinar la presencia de polinucleotidos o polipeptidos de ALK mutantes en una muestra biologica, y metodos para el escrutinio de compuestos que inhiben la protema quinasa mutante. Tambien describe metodos para inhibir la progresion de un cancer caracterizado por la expresion de polipeptidos de ALK mutantes, que son proporcionados por la invencion. Los aspectos y realizaciones de la invencion se describen con mas detalle a continuacion.
Breve descripcion de los dibujos
Fig. 1A - muestra las localizaciones del gen de EML-4 y del gen de ALK sobre el cromosoma 2 (panel A), y las localizaciones de los dominios de las protemas EML-4 y ALK completas, asf como las de la protema de fusion EML4- ALK (variante corta) (panel B); la union por fusion se produce en los aminoacidos 233-234, y la protema de fusion incluye el dominio quinasa (pero no los dominios transmembrana y extracelulares) de ALK. Tambien se muestra (en el panel B) la secuencia de ADN (y de la protema) de la region de union por fusion del exon 6/intron 6 de EML4/exon 20 de ALK (SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8, respectivamente).
Fig. 1B - muestra las localizaciones del gen de EML-4 y el gen de ALK sobre el cromosoma 2 (panel A), y las localizaciones de los dominios de las protemas EML-4 y ALK completas, asf como las de la protema de fusion EML4- ALK (variante larga) (panel B); la union por fusion se produce en los aminoacidos 495-496, y la protema de fusion incluye el dominio quinasa (pero no los dominios transmembrana y extracelulares) de ALK. Tambien se muestra (en el panel B) la secuencia de ADN (y de la protema) de la region de union por fusion del exon 13 de EML4/exon 20 de ALK (SEQ ID NO: 24 y SEQ ID NO: 25, respectivamente).
Fig. 1C - muestra las localizaciones del gen de TFG sobre el cromosoma 6 y del gen ALK sobre el cromosoma 2 (panel A), y las localizaciones de los dominios de las protemas TFG y ALK completas, asf como las de la protema de fusion de TFG-ALK (panel B); la union por fusion se produce en los aminoacidos 138-139, y la protema de fusion incluye el dominio quinasa (pero no los dominios transmembrana y extracelulares) de ALK. Tambien se muestra (en el panel B) la secuencia el ADN (y de la protema) de la region de union por fusion del exon 3 de TFG/exon 20 de ALK (SEQ ID NO: 26 y SEQ ID NO: 27, respectivamente).
Fig. 2A - es la secuencia de aminoacidos (codigo de 1 letra) de la protema de fusion EML4-ALK humana (variante corta) (SEQ ID NO: 1) (panel superior) indicandose tambien la secuencia de ADN codificante (SEQ ID NO: 2) (panel inferior); los residuos del radical EML-4 estan en cursiva, mientras que los residuos del dominio quinasa ALK estan en negrita.
Fig. 2B - es la secuencia de aminoacidos (codigo de 1 letra) de la protema de fusion EML4-ALK humana (variante larga) (SEQ ID NO: 18) (panel superior) indicandose tambien la secuencia de ADN codificante (SEQ ID NO: 19) (panel inferior); los residuos del radical EML-4 estan en cursiva, mientras que los residuos del dominio quinasa ALK estan en negrita.
Fig. 2C - es la secuencia de aminoacidos (codigo de 1 letra) de la protema de fusion de TFG-ALK humana (SEQ ID NO: 20) (panel superior) indicandose tambien la secuencia de ADN codificante (SEQ ID NO: 21) (panel inferior); los residuos del radical TFG estan en cursiva, mientras que los residuos del dominio quinasa ALK estan en negrita.
Fig. 3A-3B - es la secuencia de aminoacidos (codigo de 1 letra) de la protema EML-4 humana (SEQ ID NO: 3) (Num. de Acceso SwissProt 061936) indicandose tambien la secuencia de ADN codificante (SEQ ID NO: 4) (Num. de Acceso GenBank NM019063); los residuos conservados en el mutante por delecion de la variante corta estan subrayados, mientras que los residuos conservados en la variante larga estan en cursiva.
Fig. 4A-4B - es la secuencia de aminoacidos (codigo de 1 letra) de la quinasa ALK humana (SEQ ID NO: 5) (Num. de Acceso SwissProt Q9UM73) indicandose tambien la secuencia de ADN codificante (SEQ ID NO: 6) (Num. de Acceso GenBank HSU66559); los residuos conservados en los mutantes por delecion estan subrayados, mientras
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que los residuos del dominio quinasa estan en negrita.
Fig. 4C-4D - es la secuencia de aminoacidos (codigo de 1 letra) de la protema TFG humana (SEQ ID NO: 22) (Num. de Acceso SwissProt Q92734) indicandose tambien la secuencia de ADN codificante (SEQ ID NO: 23) (Num. de Acceso GenBank NM006070); los residuos conservados en el mutante por delecion estan subrayados.
Fig. 5 - son geles que representan (A) la deteccion de ALK a traves del producto 5' RACE con cebadores ALK despues de 2 rondas de PCR; UAP significa Cebador de Amplificacion Universal, GSP significa Cebador Espedfico del Gen, (B) la deteccion del gen de fusion formado por el mutante por delecion de EML-4 y ALK mediante RT-PCR, (C) la deteccion del gen de fusion EML4-ALK (variantes corta y larga) en muestras de tumor CPCNP humano por medio de 5' RACE, y (D) la deteccion del gen de fusion de tFG-ALK en muestras de tumor CPCNP humano por medio de 5' RACE.
Fig. 6 - es una imagen que representa la deteccion del gen de fusion formado por la translocacion de EML-4 y ALK en celulas H2228 mediante el analisis FISH empleando una sonda de rotura de doble color (naranja/verde) que comprende sondas para los lados opuestos del punto de rotura 2p23 del gen ALK; los tamanos y localizaciones de las sondas se muestran en el panel superior.
Descripcion detallada de la invencion
De acuerdo con la invencion, se han identificado ahora deleciones y translocaciones de genes previamente desconocidas que dan como resultado protemas de fusion de quinasa mutantes, que combinan parte de la Quinasa del Linfoma Anaplasico (ALK) con una porcion de una protema secundaria, en el tumor solido de carcinoma de pulmon de celulas no pequenas (CPCNP) humano. Las protemas secundarias que participan en las fusiones de ALK descubierta incluyen la Protema de Tipo 4 Asociada con Microtubulos de Equinodermo (EML-4) y el Gen Fusionado a TRK (TFG).
Los dos deleciones descritas, que se produce entre los genes EML4 y ALK en el cromosoma 2, producen protemas de fusion que combinan el extremo N de EML-4, una protema de union a microtubulos de 401 aminoacidos, con el dominio quinasa y el extremo C de ALK, una tirosina quinasa de membrana de 1.620 aminoacidos. Se espera que las protemas de fusion EML4-ALK resultantes, que tienen 796 aminoacidos (variante corta) y 1059 aminoacidos (variante larga), respectivamente, y conservan la actividad de la quinasa ALK, dirijan la proliferacion y la supervivencia de un subgrupo de tumores solidos humanos, incluyendo CPCNP.
La translocacion descrita, que se produce entre el gen de TFG sobre el cromosoma 6 y el gen ALK sobre el cromosoma 2, produce una protema de fusion que combina el extremo N de TFG, una protema de 400 aminoacidos, con el dominio quinasa y el extremo C de ALK, una tirosina quinasa de membrana de 1620 aminoacidos. La protema de fusion de TFG-ALK resultante, que tiene 701 aminoacidos, ha sido observada previamente en el linfoma humano no solido (Hernandez et al. (2002), mas arriba), pero no ha sido previamente descrita en tumores solidos. La protema de fusion de TFG-ALK conserva la actividad de la quinasa ALK, y se espera que dirija la proliferacion y la supervivencia de un subgrupo de tumores solidos humanos, incluyendo CPCNP.
Aunque se han descrito unas pocas translocaciones o deleciones de genes que dan como resultado protemas de fusion aberrantes en CPCNP, incluyendo la translocacion t(15;19) que implica Notch3 (vease Dang et al., mas arriba), los mutantes por delecion y las protemas de fusion de EML4-ALK descritas en la actualidad son novedosos. Del un modo similar, el mutante por translocacion y la protema de fusion de TFG-ALK, aunque no conocidos en tumores no solidos como el linfoma, son novedosos en el tumor solido CPCNP. EML-4 es una protema asociada a los microtubulos que se expresa en la mayona de los tejidos humanos. Hasta la fecha, no se ha informado de defectos en la expresion y/o actividad de EML-4. ALK es una tirosina quinasa de membrana, y es expresada, en seres humanos, en cerebro y tejidos del SNC, tambien en intestino delgado y testmulos, pero no en celulas linfoides normales. Desempena un papel importante en el desarrollo y la funcion normales del sistema nervioso (Iwahara et al., 1997).
Se han encontrado defectos en la expresion y/o activacion de ALK en linfoma anaplasico de celulas grandes y neuroblastoma (veanse Morris et al., 1994, Osajima-Hakomori et al., 2005). Se ha descrito la fusion de ALK a moesina, a la cadena pesada 9 de miosina no muscular, a la cadena pesada de clatrina, a tropomiosina 3 (TPM3), al gen fusionado a TRK (TFG), y a otros genes. Veanse Tort et al.; Touriol et al., Hernandez et al., mas arriba). Curiosamente, la fusion descrita de EML-4 a ALK (variante corta) se produce precisamente en el mismo punto en la ALK de tipo salvaje (aminoacido 1058) que se ha descrito anteriormente para otros mutantes de fusion de ALK.
Como se describe adicionalmente mas adelante, los mutantes por delecion de EML4-ALK y las protemas de fusion expresadas se han aislado y secuenciado en la actualidad, y se han producido los ADNc para la expresion de las protemas de fusion. Por consiguiente, la descripcion proporciona, en parte, polinucleotidos aislados que codifican polipeptidos de fusion de EML4-ALK, sondas de acidos nucleicos que hibridan con tales polinucleotidos, y metodos, vectores y celulas anfitrionas para la utilizacion de tales polinucleotidos para producir polipeptidos de ALK mutantes recombinantes. La descripcion tambien proporciona, en parte, polipeptidos aislados que comprenden secuencias de aminoacidos que codifican polipeptidos de fusion de EML4-ALK, polipeptidos mutantes recombinantes, y reactivos aislados que se unen espedficamente a y/o detectan polipeptidos de fusion de EML4-ALK, pero no se unen a ni
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detectan EML-4 de tipo salvaje o ALK de tipo salvaje. Estos aspectos de la descripcion, que se describen con mas detalle a continuacion, seran utiles, entre otras cosas, en el estudio adicional de los mecanismos de los canceres dirigidos por la expresion/actividad de la quinasa ALK mutante, para la identificacion de tumores solidos (por ejemplo, carcinomas incluyendo carcinomas de pulmon y sarcomas) y otros canceres caracterizados por las mutaciones por delecion y translocacion y/o protemas de fusion de ALK descritas, o por la expresion/actividad de la quinasa ALK mutante, y en la practica de los metodos de la descripcion descritos adicionalmente a continuacion.
La identificacion de los mutantes de la quinasa ALK novedosos y las mutaciones por delecion y translocacion del gen tiene implicaciones importantes para el diagnostico y el tratamiento potenciales de tumores solidos, tales como CPCNP, que se caracterizan por una o mas de estas protemas de fusion. El CPCNP, por ejemplo, a menudo solo se detecta despues de que haya metastatizado, y de este modo la tasa de mortalidad es de 75% en los dos anos siguientes al diagnostico. En consecuencia, sena muy deseable la capacidad para identificar, tan temprano como sea posible, los pacientes que tienen mutaciones genicas que pueden conducir a CPCNP.
Por lo tanto, el descubrimiento de las protemas de fusion de EML4-ALK (variantes cortas y largas) que resultan de la delecion genica y la protema de fusion de TGF-ALK que resulta de la translocacion genica, que se espera que dirijan la proliferacion y la supervivencia de un tumor solido, CPCNP, permite importantes metodos nuevos para identificar con precision tumores solidos de mamfferos, incluyendo canceres de pulmon (tales como CPCNP), asf como otros tipos de cancer, en los que se expresa una protema de fusion de ALK (tal como EML4-ALK o TFG-ALK). Es muy probable que estos tumores respondan a inhibidores de la actividad quinasa de la protema ALK mutante, tales como WHI-131 o WHI-154. La capacidad para identificar, tan pronto como sea posible, canceres que estan dirigidos por una quinasa ALK mutante sera de gran ayuda en la determinacion clmica de que agente terapeutico o combinacion de agentes terapeuticos, sera la mas adecuada para un paciente concreto, contribuyendo de ese modo a evitar la prescripcion de inhibidores dirigidos otras quinasas que no son, de hecho, la molecula de senalizacion principal que dirige el cancer.
Por consiguiente, la descripcion proporciona, en parte, metodos para detectar la presencia de un polinucleotido mutante de ALK y/o polipeptido de fusion en un cancer utilizando reactivos espedficos para la fusion y espedficos para el mutante de la descripcion. Tales metodos pueden ponerse en practica, por ejemplo, para identificar un tumor solido, tal como CPCNP, que es probable que responda a un inhibidor de la actividad de la quinasa ALK de la protema mutante. La descripcion tambien proporciona, en parte, metodos para determinar si un compuesto inhibe la progresion de un cancer caracterizado por un polipeptido de fusion de EML4-ALK. La invencion proporciona adicionalmente un compuesto para usar en la inhibicion de la progresion de un tumor solido que expresa un polipeptido de fusion de EML4-ALK mediante la inhibicion de la expresion y/o actividad del polipeptido mutante. Tales metodos y compuestos se describen con mas detalle a continuacion.
Los aspectos, ventajas y realizaciones adicionales de la invencion se describen con mas detalle a continuacion. Definiciones.
Segun se utiliza en la presente memoria, los siguientes terminos tienen los significados indicados.
"Anticuerpo" o "anticuerpos" se refiere a todos los tipos de inmunoglobulinas, incluyendo IgG, IgM, IgA, IgD, e IgE, incluyendo Fab o fragmentos de reconocimiento del antfgeno de los mismos, incluyendo anticuerpos quimericos, policlonales, y monoclonales. El termino "anticuerpo humanizado", segun se utiliza en la presente memoria, se refiere a moleculas de anticuerpo en las que los aminoacidos han sido sustituidos en las regiones que no se unen al antfgeno con el fin de parecerse mas estrechamente a un anticuerpo humano, a la vez que todavfa conservan la capacidad de union original.
El termino "biologicamente activo" se refiere a una protema que tiene las funciones estructurales, reguladoras o bioqmmicas de una molecula de origen natural. Del mismo modo, "inmunologicamente activo" se refiere a la capacidad del polipeptido de fusion de EML4-ALK o TFG-ALK natural, recombinante, o sintetico, o cualquier oligopeptido del mismo, para inducir una respuesta inmunitaria espedfica en animales o celulas apropiados y para unirse con anticuerpos espedficos.
El termino "muestra biologica" se utiliza en su sentido mas amplio, y representa cualquier muestra biologica que se sospecha que contiene polinucleotidos o polipeptidos de fusion de aLk o fragmentos de los mismos (incluyendo polinucleotidos y polipeptidos de fusion de EML4-ALK y TFG-ALK), y puede comprender una celula, los cromosomas aislados de una celula (p. ej., una dispersion de cromosomas en metafase), ADN genomico (en disolucion o unido a un soporte solido, por ejemplo para el analisis Southern), ARN (en disolucion o unido a un soporte solido, por ejemplo para analisis northern), ADNc (en disolucion o unido a un soporte solido), un extracto de celulas, sangre, orina, medula osea, o un tejido, y similares.
"Caracterizado por" con respecto a un cancer y un polinucleotido y polipeptido de ALK mutante significa un cancer en el que estan presentes una delecion o translocacion genica y/o un polipeptido de fusion expresado que implica ALK en comparacion con un cancer en el que no estan presentes semejante delecion genica y/o polipeptido de fusion. La presencia de un polipeptido mutante puede dirigir, en su totalidad o en parte, el crecimiento y la supervivencia de tal cancer.
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"Consenso" se refiere a una secuencia de acido nucleico que ha sido re-secuenciada para resolver bases no exigidas, o que ha sido ampliada utilizando XL-PCR™ (Perkin Elmer, Norwalk, Conn.) en la direccion 5' y/o 3' y re- secuenciada, o que ha sido ensamblada a partir de secuencias solapantes de mas de un clon Incyte utilizando el sistema de ensamblaje de fragmented GELVIEW™ (GCG, Madison, Wis.), o que ha sido tanto ampliada como ensamblada.
"Agente terapeutico inhibidor de quinasa ALK" significa cualquier composicion que comprende uno o mas compuestos, qmmicos o biologicos, que inhiben, ya sea directa o indirectamente, la expresion y/o actividad de quinasa ALK tipo salvaje o truncada, ya sea sola y/o como parte de una protema de fusion (tal como, protemas de fusion de EML4-ALK y protemas de fusion de TGF-ALK).
"Derivado" se refiere a la modificacion qrnmica de una secuencia de acido nucleico que codifica un polinucleotido de fusion descrito o el propio polipeptido codificado. Sena ilustrativa de tales modificaciones la sustitucion de hidrogeno por un grupo alquilo, acilo, o amino. Un derivado de acido nucleico codificana un polipeptido que conservana las caractensticas biologicas esenciales de la molecula natural.
"Marca detectable" con respecto a un polipeptido, polinucleotido, o reactivo descrito en la presente memoria significa una modificacion qrnmica, biologica, u otra, incluyendo pero no limitada a modificaciones de fluorescencia, masa, residuo, colorante, radioisotopo, marca, o etiqueta, etc., por medio de la cual se puede detectar la presencia de la molecula de interes.
"Expresion" o "expresado" con respecto a un polipeptido de fusion de ALK en una muestra biologica significa expresado significativamente en comparacion con una muestra de control en la que este polipeptido de fusion no es expresado de manera significativa.
"Peptido marcado con isotopo pesado" (utilizado indistintamente con peptido AQUA) significa un peptido que comprende al menos una marca de isotopo pesado, que es adecuada para la cuantificacion o deteccion absolutas de una protema como se describe en el documento WO/03016861, "Absolute Quantification of Proteins and Modified Forms Thereof by Multistage Mass Spectrometry" (Gygi et al.), comentado adicionalmente mas adelante. El termino "detecta espedficamente" con respecto a un peptido AQUA significa que el peptido solamente detectara y cuantificara polipeptidos y protemas que contienen la secuencia del peptido AQUA y no detectara sustancialmente polipeptidos y protemas que no contienen la secuencia del peptido AQUA.
"Aisladas" (o "sustancialmente purificadas") se refiere a secuencias de acidos nucleicos o de aminoacidos que son retiradas de su medio natural, aisladas o separadas. Se encuentran preferiblemente libres en al menos 60%, mas preferiblemente libres en 75%, y lo mas preferiblemente libres en 90% o mas de otros componentes con los que estan asociadas de forma natural.
"Mimetico" se refiere a una molecula, cuya estructura es desarrollada a partir del conocimiento de la estructura de un polipeptido de fusion de ALK o porciones del mismo y, como tal, es capaz de efectuar algunas o todas las acciones de las moleculas de tipo protema asociadas con la translocacion.
"ALK mutante" o polinucleotido o polipeptido de "fusion" se refiere a un polinucleotido o polipeptido de fusion que implica ALK y una protema secundaria (p. ej., EML-4 o TFG), como se describe en la presente memoria.
"Polinucleotido" (o "secuencia de nucleotidos") se refiere a un oligonucleotido, nucleotido, o polinucleotido, y fragmentos o porciones de los mismos, y a ADN o ARN de origen genomico o sintetico, que puede ser de hebra sencilla o de doble hebra, y representan la hebra efectora o antisentido.
"Polipeptido" (o "secuencia de aminoacidos") se refiere a una secuencia de oligopeptido, peptido, polipeptido, o protema, y fragmentos o porciones de la misma, y a moleculas de origen natural o sintetico. Cuando en la presente memoria se cita "secuencia de aminoacidos" para referirse a una secuencia de aminoacidos de una molecula de protema de origen natural, no se pretende que "secuencia de aminoacidos" y terminos similares, tales como "polipeptido" o "protema", limiten la secuencia de aminoacidos a la secuencia de aminoacidos nativa, completa asociada con la molecula de protema citada.
"Polinucleotido de fusion de EML4-ALK" se refiere a la secuencia de acido nucleico de un producto genico mutante por delecion o un polinucleotido de fusion (variante corta o larga) de EML4-ALK sustancialmente purificado como se describe en la presente memoria, obtenido a partir de cualquier especie, particularmente de mairnfero, incluyendo bovino, ovino, porcino, murino, equino, y preferentemente humano, de cualquier origen ya sea natural, sintetico, semisintetico, o recombinante.
"Polipeptido de fusion de EML4-ALK" se refiere a la secuencia de aminoacidos de un polipeptido de fusion de EML4- ALK (variante corta o larga) sustancialmente purificado descrito en la presente memoria, obtenido a partir de cualquier especie, particularmente de mamffero, incluyendo bovino, ovino, porcino, murino, equino, y, preferiblemente, humano, de cualquier origen ya sea natural, sintetico, semisintetico, o recombinante.
"Polinucleotido de fusion de TFG-ALK" se refiere a la secuencia de acido nucleico de un producto genico mutante
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por translocacion o polinucleotido de fusion de TFG-ALK sustancialmente purificado como se describe en la presente memoria, obtenido a partir de cualquier especie, particularmente de mai^ero, incluyendo bovino, ovino, porcino, murino, equino, y, preferiblemente, humano, de cualquier origen ya sea natural, sintetico, semisintetico, o recombinante.
"Polipeptido de fusion de TFG-ALK" se refiere a la secuencia de aminoacidos de un polipeptido de fusion de TFG- ALK sustancialmente purificado descrito en la presente memoria, obtenido a partir de cualquier especie, particularmente de mairnfero, incluyendo bovino, ovino, porcino, murino, equino, y preferentemente humano, de cualquier origen ya sea natural, sintetico, semisintetico, o recombinante.
Los terminos "se une espedficamente a" (o "que se une espedficamente" o "union espedfica") en referencia a la interaccion de un anticuerpo y una protema o peptido, significan que la interaccion depende de la presencia de una estructura concreta (es decir, el determinante antigenico o epftopo) en la protema; en otras palabras, el anticuerpo esta reconociendo y se esta uniendo a una estructura de protema espedfica en lugar de a las protemas en general. El termino "no se une" con respecto a la union de un anticuerpo a secuencias o determinantes antigenicos distintos de aquel para el cual es espedfico significa que no reacciona sustancialmente en comparacion con la union del anticuerpo al determinante antigenico o secuencia para el cual es espedfico el anticuerpo.
El termino "condiciones rigurosas" con respecto a las condiciones de hibridacion de secuencias o sondas es la "rigurosidad" que existe en un intervalo de aproximadamente Tm menos 5°C (5°C por debajo de la temperatura de fusion (Tm) de la sonda o secuencia) a aproximadamente 20°C a 25°C por debajo de la Tm. Las condiciones rigurosas tfpicas son: incubacion durante la noche a 42°C en una disolucion que comprende: formamida al 50%, 5 X SSC (NaCl 750 mM, citrato trisodico 75 mM), fosfato de sodio 50 mM (pH 7,6), 5X solucion de Denhardt, sulfato de dextrano al 10%, y 20 microgramos /ml de ADN de esperma de salmon sometido a cizalla, desnaturalizado, seguido de lavado de los filtros en 0,1 X SSC a aproximadamente 65°C. Como entenderan los expertos en la tecnica, la rigurosidad de la hibridacion se puede alterar con el fin de identificar o detectar secuencias de polinucleotidos identicas o relacionadas.
Una "variante" de un polipeptido de ALK mutante, se refiere a una secuencia de aminoacidos que es alterada por uno o mas aminoacidos. La variante puede tener cambios "conservativos", en donde el aminoacido sustituido tiene propiedades estructurales o qmmicas similares, p. ej., sustitucion de leucina por isoleucina. Mas raramente, una variante puede tener cambios "no conservativos", p. ej., sustitucion de una glicina por triptofano. Las variaciones menores similares tambien pueden incluir deleciones o inserciones de aminoacidos, o ambas. Las pautas para determinar que residuos de aminoacidos pueden ser sustituidos, insertados, o suprimidos sin anular la actividad biologica o inmunologica se pueden encontrar usando programas de ordenador bien conocidos en la tecnica, por ejemplo, el soporte logico DNASTAR.
A. Identificacion de quinasas ALK mutantes en tumores solidos humanos.
Las nuevas deleciones de genes humanos descritas en la presente memoria, que se producen en el cromosoma 2 y dan como resultado la expresion de dos variantes de la protema de fusion que combinan el extremo N de EML-4 con el dominio quinasa y el extremo C de ALK, se identificaron sorprendentemente durante el examen de perfiles de peptidos fosforilados globales en extractos de lmeas celulares de carcinoma de pulmon de celulas no pequenas (CPCNP) (incluyendo H2228) y tumores solidos de pacientes. El CPCNP, un tumor solido, es un subtipo de cancer de pulmon. Las protemas implicadas en estas fusiones por delecion se muestran en las Figuras 1A-1B, panel A.
El perfil de fosforilacion de la lmea celular H2228 se dilucido primero usando una tecnica recientemente descrita para el aislamiento y caracterizacion mediante espectrometna de masas de peptidos modificados a partir de mezclas complejas (vease la Publicacion de Patente de los Estados Unidos Num. 20030044848, Rush et al.," Immunoaffinity Isolation of Modified Peptides from Complex Mixtures" (tecnica "IAP"), como se describe adicionalmente en el Ejemplo 1 de mas abajo. La aplicacion de la tecnica IAP utilizando un anticuerpo espedfico de fosfotirosina (CELL SIGNALING TECHNOLOGY, INC., Beverly, MA, 2003/04 Num. de Cat. 9411), identifico que la lmea celular H2228 expresa la quinasa ALK, pero que la protema estaba aparentemente truncada. El escrutinio identifico muchas otras quinasas activadas en la lmea celular, incluyendo algunas que se sabe que estan activadas en el cancer de pulmon. El analisis de la secuencia 5' a ALK mediante 5'RACE identifico a continuacion que la quinasa se fusionaba al extremo N de EML-4 (vease la Fig. 6).
El examen posterior de 154 muestras de tumor de pacientes de CPCNP utilizando el mismo enfoque de perfilado de la fosforilacion global no solo confirmo la presencia de la mutacion EML4-ALK (variante corta) en una poblacion de esos pacientes, sino que tambien revelo la presencia de una segunda EML4-ALK (variante larga) y la presencia de la mutacion TFG-ALK en otras poblaciones de pacientes (vease el Ejemplo 1B y 1C).
La confirmacion de que las protemas de ALK mutantes estan dirigiendo la proliferacion y la supervivencia celular en estos tumores de CPCNP se puede establecer mediante la inhibicion de las celulas utilizando el silenciamiento con ARNip (vease el Ejemplo 3).
Los genes de fusion de EML4-ALK (variantes cortas y largas) y el gen de fusion de TFG-ALK se amplificaron por PCR, se aislaron, y se secuenciaron (vease el Ejemplo 3). Como se muestra en el panel B de las Figuras 1A-1B, la
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delecion de EML4-ALK combina el extremo N de EML-4 de tipo salvaje (aminoacidos 1-233 en la variante corta, o aminoacidos 1-495 en la variante larga) con el dominio quinasa y el extremo C de ALK de tipo salvaje (aminoacidos 1057-1620) (veanse tambien los SEQ ID NO: 3 y 5). La union por fusion se produce justo en el extremo C con respecto al dominio transmembrana de ALK de tipo salvaje (veanse las Figuras 1A-1B). Los polipeptidos de fusion de EML4-ALK conservan los 233 o 495 aminoacidos N-terminales de EML-4, respectivamente, lo que incluye el dominio de bobina en espiral de esta protema. Las protemas de fusion de EML4-ALK resultantes, que comprenden 796 aminoacidos (variante corta) o 1059 aminoacidos (variante larga), respectivamente (vease el panel B de las Figuras 1A-1B y las Figuras 2A-2B (SEQ ID NO: 1 y 18)), conservan la actividad de la quinasa aLk. Los exones implicados y la union de fusion se muestran en las Figuras 1A-1B (panel B). La union por fusion incluye el intron 6 de eML-4, que sigue al exon 6 (variante corta) o al exon 13 de EML-4 (variante larga).
Como se muestra en el panel B de la Figura 1C, la translocacion de TFG-ALK combina el extremo N de TFG de tipo salvaje (aminoacidos 1-138) con el dominio quinasa y el extremo C de ALK de tipo salvaje (aminoacidos 1057-1620) (veanse tambien los SEQ iD NO: 22 y 5, y el panel B de la Figura 1C y la Figura 4C (SEQ ID NO: 20 y 1)). La union por fusion se produce justo en el extemo C con respecto al dominio transmembrana de ALK de tipo salvaje (vease la Figura 1 C) y conserva la actividad de la quinasa aLk. Los exones implicados y la union por fusion se muestran en la Figura 1C (panel B). La union de fusion incluye el exon 3 del TFG y el exon 20 de ALK.
Se utilizaron sondas FISH para detectar la presencia de la protema de fusion de EML4-ALK (variante corta) en un grupo de 400 muestras de tumores de CPCNP humanos embebidas en parafina (veanse los Ejemplos 6 y 7; Figura 6). La incidencia de esta mutacion de variante corta en este tamano de muestra fue muy baja. Sin embargo, la expresion de las protemas de fusion de EML4-ALK (variantes cortas y largas), asf como la protema de fusion de TFG-ALK, se detecto con una mayor incidencia utilizando la tecnica IAP para examinar los perfiles de fosforilacion global de otro grupo de 154 muestras congeladas de tumores de CPCNP humanos de pacientes (vease el Ejemplo 1B).
B. Polinucleotidos aislados.
La presente descripcion proporciona, en parte, polinucleotidos aislados que codifican polipeptidos de fusion de EML4-ALK, sondas de nucleotidos que hibridan con tales polinucleotidos, y metodos, vectores y celulas anfitrionas para la utilizacion de tales polinucleotidos para producir polipeptidos de fusion recombinantes.
A menos que se indique lo contrario, todas las secuencias de nucleotidos determinadas por secuenciacion de una molecula de ADN en la presente memoria se determinaron utilizando un secuenciador de ADN automatizado (tal como el Modelo 373 de Applied Biosystems, Inc.), y se determinaron todas las secuencias de aminoacidos de polipeptidos codificados por moleculas de ADN determinadas en la presente memoria utilizando un secuenciador automatizado de peptidos (vease el Ejemplo 2). Como es conocido en la tecnica para cualquier secuencia de ADN determinada mediante este enfoque automatizado, cualquier secuencia de nucleotidos determinada en la presente memoria puede contener algunos errores. Las secuencias de nucleotidos determinadas mediante automatizacion son tfpicamente identicas al menos en aproximadamente 90%, mas tfpicamente identicas en al menos aproximadamente 95% a al menos aproximadamente 99,9% a la secuencia de nucleotidos real de la molecula de ADN secuenciada. La secuencia real puede determinarse mas precisamente por otros enfoques, incluyendo metodos manuales de secuenciacion de ADN bien conocidos en la tecnica. Como tambien es conocido en la tecnica, una sola insercion o delecion en una secuencia de nucleotidos determinada en comparacion con la secuencia real causara un desplazamiento de marco en la traduccion de la secuencia de nucleotidos de manera que la secuencia de aminoacidos predicha codificada por una secuencia de nucleotidos determinada sera completamente diferente de la secuencia de aminoacidos realmente codificada por la molecula de ADN secuenciada, comenzando en el punto de semejante insercion o delecion.
A menos que se indique lo contrario, cada secuencia de nucleotidos expuesta en la presente memoria se presenta como una secuencia de desoxirribonucleotidos (abreviados A, G, C y T). Sin embargo, por "secuencia de nucleotidos" de una molecula de acido nucleico o polinucleotido se entiende, para una molecula de ADN o polinucleotido, una secuencia de desoxirribonucleotidos, y para una molecula de ARN o polinucleotido, la secuencia correspondiente de ribonucleotidos (A, G, C y U ), donde cada desoxirribonucleotido timidina (T) en la secuencia de desoxirribonucleotidos especificada es remplazado por el ribonucleotido uridina (U). Por ejemplo, se pretende que la referencia a una molecula de ARN que tiene la secuencia del SEQ ID NO: 2 mostrada utilizando abreviaturas de desoxirribonucleotidos indique una molecula de ARN que tiene una secuencia en la que cada desoxirribonucleotido A, G o C del SEQ ID NO: 2 ha sido reemplazado por el correspondiente ribonucleotido A, G o C, y cada desoxirribonucleotido T ha sido remplazado por un ribonucleotido U.
En una realizacion, la descripcion proporciona un polinucleotido aislado que comprende una secuencia de nucleotidos identica en al menos 95% a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en:
(a) una secuencia de nucleotidos que codifica un polipeptido de fusion Protema de Tipo 4 Asociada a Microtubulos de Equinodermo/Quinasa de Linfoma Anaplasico (EmL4-ALK) que comprende la secuencia de aminoacidos del SEQ ID NO: 1 o del SEQ ID NO: 18;
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(b) una secuencia de nucleotidos que codifica un polipeptido de fusion de EML4-ALK, comprendiendo dicha secuencia de nucleotidos la secuencia de nucleotidos del SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 19;
(c) una secuencia de nucleotidos que codifica un polipeptido de fusion de EML4-ALK que comprende la secuencia de aminoacidos N-terminal de EML-4 (residuos 1-233 del SEQ ID NO: 3 o residuos 1 a 495 del SEQ ID NO: 3) y el dominio quinasa ALK (residuos 1116 a 1383 del SEQ ID NO: 5);
(d) una secuencia de nucleotidos que comprende la secuencia de nucleotidos N-terminal de EML-4 (nucleotidos 1700 del SEQ ID NO: 4 o los nucleotidos 1-1486 del SEQ ID NO: 4) y la secuencia de nucleotidos de dominio quinasa ALK (nucleotidos 3348-4149 del SEQ ID NO: 6);
(e) una secuencia de nucleotidos que comprende al menos seis nucleotidos contiguos que abarcan la union por fusion (nucleotidos 700-701 del SeQ ID NO: 2 o los nucleotidos 1486-1487 del SEQ ID NO: 19) de un polinucleotido de fusion de EML4-ALK;
(f) una secuencia de nucleotidos que codifica un polipeptido que comprende al menos seis aminoacidos contiguos que abarcan la union por fusion (residuos 233-234 del SEQ ID NO: 1 o los residuos 495-496 del SEQ ID NO: 18) de un polipeptido de fusion de EML4-ALK; y
(g) una secuencia de nucleotidos complementaria a cualquiera de las secuencias de nucleotidos de (a) - (f).
Utilizando la informacion proporcionada en la presente memoria, tal como la secuencia de nucleotidos de la Figura 2 (SEQ ID NO: 2), se puede obtener una molecula de acido nucleico de la presente descripcion que codifica un polipeptido de ALK mutante de la descripcion utilizando procedimientos de clonacion y escrutinio convencionales, tales como aquellos para clonar ADNc utilizando ARNm como material de partida. El polinucleotido de fusion de EML4-ALK (variante corta), ilustrativo de la descripcion, descrito en la Figura 2 (SEQ ID NO: 2) se aislo a partir de ADN genomico de una lmea celular de CPCNP humano (como se describe adicionalmente en el Ejemplo 2 a continuacion). El gen de fusion tambien se puede identificar genotecas de ADN genomico o ADNc en otros tipos de cancer, incluyendo tumores solidos, en los que se produce una delecion descrita del gen EML4-ALK (cromosoma 2).
Las secuencias de nucleotidos determinadas de los genes de fusion de EML4-ALK (SEQ ID NO: 2 y 19) codifican protemas de fusion de quinasa de 796 aminoacidos (variante corta) y 1059 aminoacidos (variante larga), respectivamente (veanse las Figuras 2A-B (SEQ ID NO: 1 y 18) y las Figuras 1A-B). Los polinucleotidos de fusion de EML4-ALK comprenden la porcion de la secuencia de nucleotidos de EML-4 de tipo salvaje (vease la Figura 3 (SEQ ID NO: 4)) que codifica el extremo N (aminoacidos 1-233 (variante corta) o aminoacidos 1-495 (variante larga)) de esa protema con la porcion de la secuencia de nucleotidos de ALK de tipo salvaje (vease la Figura 4 (SEQ ID NO: 6)) que codifica el dominio quinasa y el extremo C de esa protema. Veanse las Figuras 1A-B. El dominio quinasa comprende los residuos 292-568 de la protema de fusion de la variante corta (codificada por los nucleotidos 8741704 del polinucleotido de fusion de la variante corta) y los residuos 555-831 de la protema de fusion de la variante larga (codificada por los nucleotidos 1663-2494 del polinucleotido de fusion de la variante larga). Veanse las Figuras 2A-2B.
Como se ha indicado, la presente descripcion proporciona, en parte, la forma madura de las protemas de fusion de EML4-ALK. De acuerdo con la hipotesis de la senal, las protemas secretadas por celulas de mairnferos tienen una secuencia senal o lfder secretora que se escinde de la protema madura una vez que se ha iniciado la exportacion de la cadena de protema en crecimiento a traves del retmulo endoplasmico rugoso. La mayona de las celulas de mamffero e incluso las celulas de insecto escinden las protemas secretadas con la misma especificidad. Sin embargo, en algunos casos, la escision de una protema secretada no es enteramente uniforme, lo que da como resultado dos o mas especies maduras sobre la protema. Adicionalmente, hace tiempo que se sabe que la especificidad de escision de una protema secretada esta determinada en ultima instancia por la estructura primaria de la protema completa, es decir, esta es inherente en la secuencia de aminoacidos del polipeptido.
Por polipeptido de EML4-ALK maduro que tiene la secuencia de aminoacidos codificada, p. ej., por el clon de ADNc depositado, se quiere significar la forma madura de esta protema de fusion producida por la expresion en una celula de mamffero (p. ej., celulas 3T3, como se describe a continuacion) del marco de lectura abierto completo codificado por la secuencia de ADN humana del clon depositado o de otro clon que codifica el polipeptido de fusion maduro.
Como se ha indicado, los polinucleotidos de la presente descripcion pueden estar en forma de ARN, tal como ARNm, o en forma de ADN, incluyendo, por ejemplo, ADNc y ADN genomico obtenidos por clonacion o producidos sinteticamente. El ADN puede ser de doble hebra o de hebra sencilla. El ADN o ARN de hebra sencilla puede ser la hebra codificante, tambien conocida como hebra efectora, o puede ser la hebra no codificante, tambien conocida como hebra antisentido.
Los polinucleotidos aislados de la descripcion son moleculas de acido nucleico, ADN o ARN, que han sido separadas de su ambiente nativo. Por ejemplo, las moleculas de ADN recombinante contenidas en un vector se consideran aisladas para los fines de la presente descripcion. Otros ejemplos de moleculas de ADN aisladas incluyen moleculas de ADN recombinante mantenidas en celulas anfitrionas heterologas o moleculas de ADN purificadas (parcial o sustancialmente) en disolucion. Las moleculas de ARN aisladas incluyen transcritos de ARN in
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vivo o in vitro de las moleculas de ADN de la presente descripcion. Las moleculas de acido nucleico aisladas de acuerdo con la presente descripcion incluyen adicionalmente tales moleculas producidas sinteticamente.
Los polinucleotidos aislados de la descripcion incluyen la molecula de ADN mostrada en las Figuras 2A-B (SEQ ID NO: 2 y 19), moleculas de ADN que comprenden la secuencia codificante para las protemas de fusion de EML4-ALK maduras mostradas en las Figuras 1A-B (SEQ ID NO: 1 y 18), y moleculas de ADN que comprenden una secuencia sustancialmente diferente de las descritas anteriormente pero que, debido a la degeneracion del codigo genetico, todavfa codifican un polipeptido de ALK mutante de la descripcion. El codigo genetico es bien conocido en la tecnica, por lo tanto, sena rutinario para un experto en la tecnica generar tales variantes degeneradas.
En otra realizacion, la descripcion proporciona un polinucleotido aislado que codifica el polipeptido de fusion de EML4-ALK que comprende la secuencia de nucleotidos de fusion de EML4-ALK contenida en el clon de ADNc depositado anteriormente descrito. Preferiblemente, tal molecula de acido nucleico codificara el polipeptido de fusion maduro codificado por el clon de ADNc depositado u otro clon que expresa una protema de fusion de EML4-ALK completa descrita en la presente memoria. En otra realizacion, la descripcion proporciona una secuencia de nucleotidos aislada que codifica un polipeptido de fusion de EML4-ALK que comprende la secuencia de aminoacidos N-terminal de EML-4 (residuos 1-233 del SEQ ID NO: 3 o residuos 1-495 del SeQ ID NO: 3) y el dominio quinasa ALK (residuos 1116-1383 del SEQ ID NO: 5). En una realizacion, el polipeptido que comprende el dominio quinasa ALK comprende los residuos 1057-1620 del SEQ ID NO: 5 (vease la Figura 1, panel B). En otra realizacion, la secuencia de aminoacidos N-terminal de EML-4 y el dominio quinasa ALK antes mencionados estan codificados por secuencias de nucleotidos que comprende los nucleotidos 1-700 del SEQ ID NO: 4 o los nucleotidos 1-1486 del SEQ ID NO: 4 y los nucleotidos 3171-4860 del SEQ ID NO: 6, respectivamente.
La descripcion proporciona adicionalmente polinucleotidos aislados que comprenden secuencias de nucleotidos que tienen una secuencia complementaria a uno de los polinucleotidos de ALK mutante de la descripcion. Tales moleculas aisladas, particularmente moleculas de ADN, son utiles como sondas para el mapeo de genes, mediante hibridacion in situ con cromosomas, y para detectar la expresion de una protema de fusion de EML4-ALK en el tejido humano, por ejemplo, mediante analisis de transferencia Northern, como se describe adicionalmente en la Seccion F a continuacion.
La presente descripcion se dirige adicionalmente a fragmentos de las moleculas de acido nucleico aisladas descritas en la presente memoria. Por fragmento de un polinucleotido de EML4-ALK aislado de la descripcion se quieren significar fragmentos de al menos aproximadamente 15 nucleotidos, y mas preferiblemente al menos aproximadamente 20 nucleotidos, aun mas preferiblemente al menos aproximadamente 30 nucleotidos, e incluso mas preferiblemente, al menos aproximadamente 40 nucleotidos de longitud, que son utiles como sondas y cebadores de diagnostico como se comenta en la presente memoria. Por supuesto, tambien son utiles fragmentos mas grandes de aproximadamente 50-1500 nucleotidos de longitud de acuerdo con la presente descripcion, como son los fragmentos correspondientes a la mayona, si no todas, de las secuencias de nucleotidos de ALK mutantes de los ADNc depositados o mostrados en la Figura 2 (SEQ ID NO: 2) o de otro clon que expresa el polinucleotido de fusion mostrado en las Figuras 2A-B (SEQ ID NO: 2 o 19). Por fragmento de al menos 20 nucleotidos de longitud, por ejemplo, se quieren significar fragmentos que incluyen 20 o mas bases contiguas de las secuencias de nucleotidos respectivas de los que derivan los fragmentos. La generacion de tales fragmentos de ADN es rutinaria para el experto en la tecnica, y se puede llevar a cabo, a modo de ejemplo, mediante escision con endonucleasas de restriccion o cizallamiento por sonicacion de ADN obtenible a partir del clon de ADNc depositado o sintetizado de acuerdo con la secuencia descrita en la presente memoria. Alternativamente, tales fragmentos se pueden generar directamente sinteticamente.
Los fragmentos de acido nucleico o sondas preferidos de la presente descripcion incluyen moleculas de acido nucleico que codifican la union por fusion de los productos genicos de fusion de EML4-ALK (veanse las Figuras 1A- B, panel B). Por ejemplo, en ciertas realizaciones preferidas, un polinucleotido aislado de la descripcion comprende una secuencia/fragmento de nucleotidos que comprende al menos seis nucleotidos contiguos que incluyen la union por fusion (nucleotidos 700-701 del SeQ ID nO: 2 o los nucleotidos 1486-1487 del SEQ ID NO: 19) de un polinucleotido de fusion de EML4-ALK (veanse las Figuras 1A-B, panel B (SEQ ID NO: 8 y 25)). En otra realizacion preferida, un polinucleotido aislado de la descripcion comprende una secuencia/fragmento de nucleotidos que codifica un polipeptido que comprende al menos seis aminoacidos contiguos que abarcan la union por fusion (residuos 233-234 del SEQ ID nO: 1 o residuos 495-496 del SEQ ID NO: 18) de un polipeptido de fusion de EML4- AlK (veanse las Figuras 1A-B, panel inferior (SEQ ID NO: 7 y 24)).
En otro aspecto, la descripcion proporciona un polinucleotido aislado que hibrida en condiciones de hibridacion rigurosas con una porcion de un polinucleotido de ALK mutante de la descripcion como se describe en la presente memoria. Por "condiciones de hibridacion rigurosas" se entiende una incubacion durante la noche a 42°C en una disolucion que comprende: formamida al 50%, 5 X SSC (NaCl 750 mM, citrato trisodico 75 mM), fosfato de sodio 50 mM (pH 7,6), 5X solucion de Denhardt , sulfato de dextrano al 10%, y 20 microgramos/ml de ADN de esperma de salmon sometido a cizalla, desnaturalizado, seguido de lavado de los filtros en 0,1 X SSC a aproximadamente 65°C.
Por polinucleotido que se hibrida con una "porcion" de un polinucleotido se quiere significar un polinucleotido (ADN o ARN) que hibrida con al menos aproximadamente 15 nucleotidos (nt), y mas preferiblemente al menos
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aproximadamente 20 nt, aun mas preferiblemente al menos aproximadamente 30 nt, e incluso mas preferiblemente aproximadamente 30-70 nt del polinucleotido de referencia. Estos son utiles como sondas y cebadores de diagnostico como se comento anteriormente y con mas detalle a continuacion.
Por supuesto, los polinucleotidos que hibridan a una porcion mayor del polinucleotido de referencia (p. ej., el polinucleotido de fusion de EML4-ALK maduro descrito en la Figura 2 (SEQ ID NO: 2)), por ejemplo, una porcion de 50-750 nt de longitud, o incluso a toda la longitud del polinucleotido de referencia, tambien son utiles como sondas, segun la presente descripcion, como lo son los polinucleotidos correspondientes a la mayona, si no todas, las secuencias de nucleotidos de los ADNc depositados o las secuencias de nucleotidos mostradas en las Figuras 2A-B (SEQ ID NO: 2 o 19), o las Figuras 1A-B (panel B)) (SEQ ID NO: 7 y 24).
Por porcion de un polinucleotido de "al menos 20 nucleotidos de longitud", por ejemplo, se quieren significar 20 o mas nucleotidos contiguos de la secuencia de nucleotidos del polinucleotido de referencia. Como se indica, tales porciones son utiles diagnosticamente o bien como una sonda segun las tecnicas de hibridacion de ADN convencionales o bien como cebadores para la amplificacion de una secuencia diana por reaccion en cadena de la polimerasa (PCR), como se describe, por ejemplo, en MOLECULAR CLONING, A Laboratory Manual, 2a ed., Sambrook, J., Fritsch, E.F. y Maniatis, T., eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York (1989), cuya descripcion completa se incorpora a esta memoria por referencia. Por supuesto, un polinucleotido que hibrida solo con una secuencia poli A (tal como la extension poli(A) 3' terminal de la secuencia de EML4-ALK mostrada en la Figura 2 (SEQ ID NO: 2)) o con un tramo complementario de residuos de T (o U), no se incluina en un polinucleotido de la descripcion utilizado para hibridar con una porcion de un acido nucleico de la descripcion, puesto que tal polinucleotido hibridana con cualquier molecula de acido nucleico que contuviera una tramo de poli (A) o el complemento del mismo (p. ej., practicamente cualquier clon de ADNc de doble hebra).
Como se ha indicado, las moleculas de acido nucleico de la presente descripcion, que codifican un polipeptido de ALK mutante de la descripcion, pueden incluir, pero no se limitan a las que codifican la secuencia de aminoacidos del polipeptido maduro, por sf mismas; la secuencia codificante para el polipeptido maduro y secuencias adicionales, tales como las que codifican la secuencia lfder o secretora, tal como una secuencia de pre-, o pro- o pre-pro- protema; la secuencia codificante del polipeptido maduro, con o sin las secuencias codificantes adicionales anteriormente mencionadas, junto con, secuencias no codificantes adicionales, incluyendo por ejemplo, pero no limitadas a intrones y secuencias 5' y 3' no codificantes, tales como las secuencias transcritas, no traducidas que juegan un papel en la transcripcion, el procesamiento del ARNm, incluyendo las senales de empalme y poliadenilacion, por ejemplo -- union al ribosoma y estabilidad de ARNm; y una secuencia codificante adicional que codifica aminoacidos adicionales, tales como las que proporcionan funcionalidades adicionales.
De este modo, la secuencia que codifica el polipeptido puede fusionarse a una secuencia marcadora, tal como una secuencia que codifica un peptido que facilita la purificacion del polipeptido fusionado. En ciertas realizaciones preferidas de este aspecto de la descripcion, la secuencia de aminoacidos marcadora es un peptido de hexa- histidina, tal como la etiqueta proporcionada en un vector pQE (Qiagen, Inc.), entre otras, muchas de las cuales estan disponibles en el mercado. Como describen Gentz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 821-824 (1989), por ejemplo, la hexa-histidina proporciona una purificacion conveniente de la protema de fusion. La etiqueta "HA" es otro peptido util para la purificacion que corresponde a un epttopo derivado de la protema hemaglutinina de la gripe, que ha sido descrita por Wilson et al, Cell 37: 767 (1984). Como se comenta mas adelante, otras de tales protemas de fusion incluyen el propio polipeptido de fusion de EML4-ALK fusionado a Fc en el extremo N o C.
La presente descripcion se refiere adicionalmente a variantes de las moleculas de acido nucleico de la presente descripcion, que codifican porciones, analogos o derivados de un polipeptido de fusion de EML4-ALK descrito en la presente memoria. Las variantes pueden aparecer de forma natural, tal como una variante alelica natural. Por "variante alelica" se quiere significar una de las varias formas alternativas de un gen que ocupa un locus dado en un cromosoma de un organismo. Vease, p. ej. Genes II, Lewin, B., ed., John Wiley & Sons, Nueva York (1985). Las variantes de origen no natural se pueden producir utilizando mecanismos de mutagenesis conocidos en la tecnica.
Tales variantes incluyen las producidas por sustituciones, deleciones o adiciones de nucleotidos. Las sustituciones, deleciones o adiciones pueden implicar uno o mas nucleotidos. Las variantes pueden estar alteradas en las regiones codificantes, las regiones no codificantes, o ambas. Las alteraciones en las regiones codificantes pueden producir sustituciones, deleciones o adiciones de aminoacidos conservativas o no conservativas. Especialmente preferidas entre estas son las sustituciones, adiciones y deleciones silenciosas, que no alteran las propiedades y actividades (p. ej., actividad quinasa) de los polipeptidos de ALK mutantes descritos en la presente memoria. Tambien se prefieren especialmente a este respecto las sustituciones conservativas.
Realizaciones adicionales de la descripcion incluyen polinucleotidos aislados que comprenden una secuencia de nucleotidos identica al menos en 90%, y mas preferiblemente identica al menos en 95%, 96%, 97%, 98% o 99%, a un polinucleotido de ALK mutante de la descripcion (por ejemplo, una secuencia de nucleotidos que codifica el polipeptido de fusion de EML4-ALK que tiene la secuencia de aminoacidos completa mostrada en la Figura 2 (SEQ ID NO: 1, o una secuencia de nucleotidos que codifica el extremo N de EML-4 y el dominio quinasa ALK (vease la Figura 1, panel B; y las Figuras 3 y 4); o un nucleotido complementario a tales secuencias ilustrativas).
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Por polinucleotido que tiene una secuencia de nucleotidos al menos, por ejemplo, "identica" en 95% a una secuencia de nucleotidos de referencia que codifica un polipeptido de ALK mutante se quiere significar que la secuencia de nucleotidos del polinucleotido es identica a la secuencia de referencia excepto que la secuencia de polinucleotidos puede incluir hasta cinco mutaciones puntuales por cada 100 nucleotidos de la secuencia de nucleotidos de referencia que codifica el polipeptido de ALK mutante. En otras palabras, para obtener un polinucleotido que tiene una secuencia de nucleotidos identica al menos en 95% a una secuencia de nucleotidos de referencia, hasta 5% de los nucleotidos en la secuencia de referencia puede ser suprimido o sustituido por otro nucleotido, o se pueden insertar en la secuencia de referencia varios nucleotidos hasta 5% de los nucleotidos totales de la secuencia de referencia. Estas mutaciones de la secuencia de referencia pueden producirse en las posiciones 5' o 3' terminales de la secuencia de nucleotidos de referencia o en cualquier lugar entre esas posiciones terminales, intercaladas individualmente entre los nucleotidos en la secuencia de referencia o en uno o mas grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia.
Como cuestion practica, que cualquier molecula de acido nucleico concreta sea identica en al menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% a, por ejemplo, las secuencias de nucleotidos mostradas en las Figuras 2A-B (SEQ ID NOS: 2 y 19) o a la secuencia de nucleotidos de los clones de ADNc depositados descritos anteriormente se puede determinar convencionalmente usando programas de ordenador conocidos tales como el programa Bestfit (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 para Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, Wis. 53711. Bestfit utiliza el algoritmo de homologfa local de Smith y Waterman, Advances in Applied Mathematics 2: 482-489 (1981), para encontrar el mejor segmento de homologfa entre dos secuencias. Cuando se usa Bestfit o cualquier otro programa de alineamiento de secuencias para determinar si una secuencia concreta es, por ejemplo, identica en 95% a una secuencia de referencia de polinucleotido de fusion de EML4-ALK o una secuencia de polinucleotidos de ALK truncado de acuerdo con la presente descripcion, los parametros se ajustan, por supuesto, de manera que el porcentaje de identidad se calcule sobre la longitud completa de la secuencia de nucleotidos de referencia y que se permitan huecos en la homologfa de hasta 5% del numero total de nucleotidos en la secuencia de referencia.
La presente descripcion incluye en su alcance moleculas de acido nucleico identica en al menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% a la secuencia de acido nucleico mostrada en la Figura 2 (SEQ ID NO: 2), o a las secuencias de acido nucleico de los ADNc depositados, con independencia de si codifican un polipeptido que tiene actividad de la quinasa ALK. Esto es porque incluso cuando una molecula de acido nucleico concreta no codifica un polipeptido de fusion que tiene actividad de la quinasa ALK, un experto en la tecnica todavfa sabna como utilizar la molecula de acido nucleico, por ejemplo, como sonda de hibridacion o cebador para la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR). Los usos de las moleculas de acido nucleico de la presente descripcion que no codifican un polipeptido que tiene quinasa incluyen, entre otros, (1) el aislamiento del gen de delecion de EML4-ALK, o el gen de ALK truncado, o variantes alelicas del mismo en una genoteca de ADNc; (2) la hibridacion in situ (p. ej., "FISH") a dispersiones cromosomicas en metafase para proporcionar una localizacion cromosomica precisa del gen de supresion de EML4- ALK o el gen de ALK truncado, como describen Verma et al., HUMAN CHROMOSOMES: A MANUAL OF BASIC TECHNIQUES, Pergamon Press, Nueva York (1988); y el analisis de transferencia Northern para detectar la protema de fusion de EML4-ALK o la expresion de ARNm de la quinasa ALK truncada en tejidos espedficos.
Se prefieren, sin embargo, moleculas de acido nucleico que tienen secuencias identicas en al menos 95% a un polipeptido de ALK mutante de la descripcion o a la secuencia de acido nucleico de los ADNc depositados que de hecho, codifican un polipeptido de fusion que tiene actividad de la quinasa ALK. Tal actividad puede ser similar, pero no necesariamente identica, a la actividad de una protema de fusion de EML4-ALK descrita en la presente memoria (ya sea la protema completa, la protema madura, o un fragmento de protema que conserva la actividad de quinasa), como se mide en un analisis biologico concreto. Por ejemplo, la actividad de la quinasa ALK se puede examinar determinando su capacidad para fosforilar uno o mas sustratos de peptidos que contienen tirosina, por ejemplo, Sustrato 1 o 2 del Receptor de Insulina (IRS1, IRS2), que son sustratos para la quinasa ALK.
Debido a la degeneracion del codigo genetico, un experto normal en la tecnica reconocera inmediatamente que un gran numero de las moleculas de acido nucleico que tienen una secuencia identica en al menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99 % a la secuencia de acido nucleico de los ADNc depositados o las secuencias de acidos nucleicos mostradas en las Figuras 2A-B (SEQ ID NO: 2 y 19) codificaran un polipeptido mutante que tenga actividad de ALK. De hecho, puesto que las variantes degeneradas de estas secuencias de nucleotidos codifican todas el mismo polipeptido, esto estara claro para el experto en la tecnica incluso sin realizar el analisis comparativo anteriormente descrito. Adicionalmente se reconocera en la tecnica que, para tales moleculas de acido nucleico que no son variantes degeneradas, un numero razonable tambien codificara un polipeptido que conserve la actividad de la quinasa ALK. Esto es porque el experto en la tecnica es plenamente consciente de las sustituciones de aminoacidos que es menos probable o no es probable que afecten significativamente a la funcion de la protema (p. ej., remplazando un aminoacido alifatico por un segundo aminoacido alifatico).
Por ejemplo, las pautas concernientes a como realizar sustituciones de aminoacidos fenotfpicamente silenciosas son proporcionadas por Bowie et al., "Deciphering the Message in Protein Sequences: Tolerance to Amino Acid Substitutions", Science 247: 1306-1310 (1990), que describen dos enfoques principales para estudiar la tolerancia de una secuencia de aminoacidos al cambio. El primer metodo se basa en el proceso de evolucion, en el que las mutaciones son aceptadas o rechazadas por la seleccion natural. El segundo enfoque utiliza ingeniena genetica
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para introducir cambios de aminoacidos en posiciones espedficas de un gen clonado y selecciones o escrutinio para identificar secuencias que mantienen la funcionalidad. Estos estudios han revelado que las protemas son sorprendentemente tolerantes a las sustituciones de aminoacidos. Los expertos en la tecnica familiarizados con tales tecnicas tambien aprecian que cambios de aminoacidos es probable que sean permisivos en una cierta posicion de la protema. Por ejemplo, los residuos de aminoacidos mas escondidos requieren cadenas laterales no polares, mientras que se conservan generalmente pocas caractensticas de las cadenas laterales de la superficie. Otras de tales sustituciones fenotfpicamente silenciosas son descritas por Bowie et al., mas arriba, y en las referencias allf citadas.
Los metodos para la secuenciacion de ADN que son bien conocidos y estan generalmente disponibles en la tecnica se pueden usar para poner en practica cualquiera de las realizaciones de polinucleotidos de la descripcion. Los metodos pueden emplear enzimas tales como el fragmento Klenow de la ADN polimerasa I, SEQUENASE® (US Biochemical Corp., Cleveland, Ohio), polimerasa Taq (Perkin Elmer), polimerasa T7 termoestable (Amersham, Chicago, IL), o combinaciones de polimerasas recombinantes y exonucleasas de correccion de pruebas, tales como el sistema de amplificacion elongasa comercializado por Gibco BRL (Gaithersburg, MD). Preferiblemente, el procedimiento se automatiza con maquinas tales como Hamilton Micro Lab 2200 (Hamilton, Reno, Nev.), Peltier Thermal Cycler (PTC200; MJ Research, Watertown, MA) y los secuenciadores de ADN ABI 377 (Perkin Elmer).
Las secuencias de polinucleotidos que codifican un polipeptido de ALK mutante de la descripcion se pueden ampliar utilizando una secuencia parcial de nucleotidos y empleando diversos metodos conocidos en la tecnica para detectar secuencias aguas arriba tales como promotores y elementos reguladores. Por ejemplo, un metodo que se puede emplear, la PCR para "sitio de restriccion", utiliza cebadores universales para recuperar la secuencia desconocida adyacente a un locus conocido (Sarkar, G., PCR Methods Applic. 2: 318-322 (1993)). En particular, el ADN genomico se amplifica primero en presencia del cebador para la secuencia conectora y un cebador espedfico para la region conocida. Los cebadores ilustrativos son los descritos en el Ejemplo 2 en la presente memoria. Las secuencias amplificadas se someten despues a una segunda ronda de PCR con el mismo cebador conector y otro cebador espedfico interno con respecto al primero. Los productos de cada ronda de PCR se transcriben con una ARN polimerasa apropiada y se secuencian utilizando transcriptasa inversa.
Tambien se puede utilizar la PCR inversa para amplificar o ampliar secuencias utilizando cebadores divergentes basados en una region conocida (Triglia et al., Nucleic Acids Res. 16:8186 (1988)). Los cebadores se pueden disenar utilizando el soporte logico OLIGO 4.06 Primer Analysis (National Biosciences Inc., Plymouth, Minn.), u otro programa apropiado, para que tengan 22-30 nucleotidos de longitud, tengan un contenido de GC de 50% o mas, e hibriden con la secuencia diana a temperaturas de aproximadamente 68-72°C. El metodo utiliza varias enzimas de restriccion para generar un fragmento adecuado en la region conocida de un gen. El fragmento es circularizado a continuacion por medio de ligacion intramolecular y utilizado como un molde para la PCR.
Otro metodo que se puede utilizar es la PCR de captura que implica la amplificacion por PCR de fragmentos de ADN adyacentes a una secuencia conocida en ADN de cromosomas artificiales humanos y de levadura (Lagerstrom et al., PCR Methods Applic. 1: 111-119 (1991)). En este metodo, tambien se pueden utilizar multiples digestiones y ligaciones con enzimas de restriccion para colocar una secuencia de doble hebra manipulada geneticamente en una porcion desconocida de la molecula de ADN antes de realizar la PCR. Otro metodo que se puede usar para recuperar secuencias desconocidas es el descrito por Parker et al., Nucleic Acids Res. 19: 3055-3060 (1991)). Adicionalmente, se pueden utilizar PCR, cebadores anidados y bibliotecas PROMOTERFINDER® para pasear por el ADN genomico (Clontech, Palo Alto, Calif.). Este procedimiento evita la necesidad de escrutar bibliotecas y es util para encontrar uniones intron/exon.
Cuando se realiza el escrutinio para determinar ADNc completos, es preferible usar bibliotecas que hayan sido seleccionadas por tamano para incluir ADNc mas grandes. Ademas, se prefieren las bibliotecas de cebado al azar, ya que contendran mas secuencias que contengan regiones 5' de genes. El uso de una biblioteca cebada aleatoriamente puede ser especialmente preferible para situaciones en las que una biblioteca de oligo d(T) no produce un ADNc completo. Las bibliotecas genomicas pueden ser utiles para la ampliacion de secuencias en las regiones reguladoras no transcritas 5' y 3'.
Los sistemas de electroforesis capilar, que estan disponibles comercialmente, se pueden utilizar para analizar el tamano o confirmar la secuencia de nucleotidos de los productos de secuenciacion o PCR. En particular, la secuenciacion capilar puede emplear polfmeros vertibles para la separacion electroforetica, cuatro colorantes fluorescentes diferentes (uno para cada nucleotido) que son activados por laser, y deteccion de las longitudes de onda emitidas por medio de una camara con una dispositivo de carga acoplada. La Intensidad de luz de salida se puede convertir en senal electrica utilizando el soporte logico apropiado (p. ej., GENOTYPER™ y SEQUENCE NAVIGATOR™, Perkin Elmer) y todo el proceso desde la carga de las muestras al analisis por ordenador y la presentacion de datos electronicos se pueden controlar por ordenador. La electroforesis capilar es especialmente preferible para la secuenciacion de pequenas porciones de ADN que podnan estar presentes en cantidades limitadas en una muestra concreta.
C. Vectores y celulas anfitrionas.
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La presente descripcion tambien proporciona vectores recombinantes que comprenden un polinucleotido aislado de la presente descripcion, celulas anfitrionas que estan manipuladas geneticamente con los vectores recombinantes, y la produccion de polipeptidos de EML4-ALK recombinantes o fragmentos de los mismos mediante tecnicas recombinantes.
Los constructos recombinantes se pueden introducir en celulas anfitrionas utilizando tecnicas bien conocidas tales como infeccion, transduccion, transfeccion, transveccion, electroporacion y transformacion. El vector puede ser, por ejemplo, un vector fagico, plasirndico, viral o retroviral. Los vectores retrovirales pueden ser de replicacion competente o de replicacion defectuosa. En este ultimo caso, la propagacion viral generalmente se producira solo en celulas anfitrionas de complementacion.
Los polinucleotidos se pueden unir a un vector que contiene un marcador seleccionable para la propagacion en un anfitrion. Generalmente, se introduce un vector plasirndico en un producto precipitado, tal como un producto precipitado con fosfato de calcio, o en un complejo con un lfpido cargado. Si el vector es un virus, este se puede empaquetar in vitro utilizando una lmea celular de empaquetamiento apropiada y transducirlo a continuacion a celulas anfitrionas.
Se prefieren los vectores que comprenden regiones de control que actuan en cis con respecto al polinucleotido de interes. Los factores que actuan en trans apropiados pueden ser suministrados por el anfitrion, suministrados por un vector de complementacion o suministrados por el propio vector tras la introduccion en el anfitrion. En ciertas realizaciones preferidas a este respecto, los vectores proporcionan una expresion espedfica, que puede ser inducible y/o espedfica del tipo celular. Son particularmente preferidos entre tales vectores aquellos inducibles por factores ambientales que son faciles de manipular, tales como la temperatura y aditivos nutrientes.
Los vectores de expresion utiles en la presente descripcion incluyen vectores cromosomicos, episomicos y derivados de virus, p. ej., vectores derivados de plasmidos bacterianos, bacteriofagos, episomas de levadura, elementos cromosomicos de levadura, virus tales como baculovirus, papovavirus, virus vaccinia, adenovirus, virus de la viruela aviar, virus de pseudorrabia y retrovirus, y vectores derivados de combinaciones de los mismos, tales como cosmidos y fagemidos.
El inserto de ADN que comprende un polinucleotido de EML4-ALK o de la descripcion debe estar conectado operativamente a un promotor apropiado, tal como el promotor PL del fago lambda, los promotores lac, trp y tac de E. coli, los promotores temprano y tardfo de SV40 y los promotores de LTR retrovirales, por nombrar unos pocos. Otros promotores adecuados son conocidos por el experto en la tecnica. Los constructos de expresion contendran adicionalmente sitios para el inicio de la transcripcion, la terminacion y, en la region transcrita, un sitio de union al ribosoma para la traduccion. La porcion codificante de los transcritos maduros expresados por los constructos incluira preferiblemente un inicio de la traduccion al principio y un codon de terminacion (UAA, UGA o UAG) situado apropiadamente al final del polipeptido que se va a traducir.
Como se ha indicado, los vectores de expresion incluiran preferiblemente al menos un marcador seleccionable. Tales marcadores incluyen los genes de la dihidrofolato reductasa o de resistencia a neomicina para el cultivo de celulas eucariotas y de resistencia a tetraciclina o ampicilina para el cultivo en E. coli y otras bacterias. Los ejemplos representativos de los anfitriones apropiados incluyen, pero no se limitan a, celulas bacterianas, tales como celulas de E. coli, Streptomyces y Salmonella typhimurium; celulas fungicas, tales como celulas de levadura; celulas de insecto tales como celulas de Drosophila S2 y de Spodoptera Sf9; celulas animales tales como celulas CHO, COS y de melanoma de Bowes; y celulas vegetales. Los medios de cultivo apropiados y las condiciones para las celulas anfitrionas descritas anteriormente son conocidos en la tecnica.
Entre los vectores preferidos para su uso en bacterias se incluyen pQE70, pQE60 y pQE-9, asequibles de Qiagen; vectores pBS, vectores Phagescript, vectores Bluescript, pNH8A, pNH16a, pNHl8A, pNH46A, asequibles de Stratagene; y ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 asequibles de Pharmacia. Entre los vectores eucarioticos preferidos se encuentran pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1 y pSG asequibles de Stratagene; y pSVK3, pBPV, pMSG y pSVL asequibles de Pharmacia. Otros vectores adecuados seran facilmente evidentes para el experto en la tecnica.
Entre los promotores bacterianos conocidos adecuados para su uso en la presente descripcion se incluyen los promotores lacl y lacZ de E. coli, los promotores T3 y T7, el promotor gpt, los promotores PR y PL de lambda y el promotor trp. Los promotores eucarioticos adecuados incluyen el promotor inmediato temprano de CMV, el promotor de la timidina quinasa de HSV, los promotores tempranos y tardfos de SV40, los promotores de LTR retrovirales, tales como los del virus del sarcoma de Rous (RSV), y los promotores de metalotionema, tales como el promotor de metalotionema 1 de raton.
En la levadura, Saccharomyces cerevisiae, se pueden utilizar varios vectores que contienen promotores constitutivos o inducibles tales como el factor alfa, la alcohol oxidasa, y PGH. Para las revisiones, veanse Ausubel et al. (1989) CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, Nueva York, NY, y Grant et al., Methods Enzymol. 153: 516-544 (1997).
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La introduccion del constructo en la celula anfitriona se puede efectuar mediante transfeccion con fosfato de calcio, transfeccion mediada por DEAE-dextrano, transfeccion mediada por lfpidos cationicos, electroporacion, transduccion, infeccion u otros metodos. Tales metodos se describen en muchos manuales de laboratorio convencionales, tales como Davis et al., BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY (1986).
La transcripcion de ADN que codifica un polipeptido de fusion de EML4-ALK de la presente descripcion por eucariotas superiores se puede incrementar insertando una secuencia potenciadora en el vector. Los potenciadores son elementos de ADN que actuan en cis, generalmente de aproximadamente 10 a 300 pb que actuan para aumentar la actividad transcripcional de un promotor en un tipo dado de celula anfitriona. Los ejemplos de los potenciadores incluyen el potenciador de SV40, que esta ubicado en el lado tardm del origen de replicacion en los pares de bases 100 a 270, el potenciador de promotor temprano de citomegalovirus, el potenciador de polioma en el lado tardm del origen de replicacion, y los intensificadores de adenovirus.
Para la secrecion de la protema traducida al lumen del retmulo endoplasmico, al espacio periplasmico o al entorno extracelular, se pueden incorporar senales de secrecion apropiadas al polipeptido expresado. Las senales pueden ser endogenas al polipeptido o pueden ser senales heterologas.
El polipeptido se puede expresar en una forma modificada, tal como una protema de fusion (p. ej., una fusion con GST), y puede incluir no solo senales de secrecion, sino tambien regiones funcionales heterologas adicionales. Por ejemplo, se puede anadir una region de aminoacidos adicionales, particularmente aminoacidos cargados, al extremo N del polipeptido para mejorar la estabilidad y persistencia en la celula anfitriona, durante la purificacion, o durante la posterior manipulacion y almacenamiento. Asimismo, se pueden anadir radicales peptfdicos al polipeptido para facilitar la purificacion. Tales regiones se pueden retirar antes de la preparacion final del polipeptido. La adicion de radicales peptfdicos a los polipeptidos para suscitar la secrecion o excrecion, para mejorar la estabilidad y para facilitar la purificacion, entre otros, son mecanismos familiares y rutinarios en la tecnica. Una protema de fusion preferida comprende una region heterologa de inmunoglobulina que es util para solubilizar protemas.
Los polipeptidos de fusion de EML4-ALK se pueden recuperar y purificar a partir de cultivos de celulas recombinantes por medio de metodos bien conocidos incluyendo la precipitacion con sulfato de amonio o etanol, la extraccion con acido, la cromatograffa de intercambio anionico o cationico, la cromatograffa en fosfocelulosa, la cromatograffa de interaccion hidrofoba, la cromatograffa de afinidad, la cromatograffa en hidroxilapatita y la cromatograffa con lectina. Lo mas preferiblemente, se emplea cromatograffa lfquida de alta resolucion ("HPLC") para la purificacion. Los polipeptidos de la presente descripcion incluyen productos purificados naturalmente, productos de procedimientos sinteticos qmmicos, y productos producidos por tecnicas recombinantes a partir de un anfitrion procariotico o eucariotico, incluyendo, por ejemplo, celulas bacterianas, de levadura, de plantas superiores, de insectos y de mairnferos. Dependiendo del anfitrion empleado en el procedimiento de produccion recombinante, los polipeptidos de la presente descripcion pueden estar glicosilados o pueden no estar glicosilados. Ademas, los polipeptidos de la descripcion tambien pueden incluir un residuo de metionina modificado inicial, en algunos casos como resultado de procesos mediados por el anfitrion.
Por consiguiente, en una realizacion, la descripcion proporciona un metodo para producir un polipeptido de fusion de EML4-ALK recombinante mediante el cultivo de una celula anfitriona recombinante (como se ha descrito anteriormente) en condiciones adecuadas para la expresion del polipeptido de fusion y recuperar el polipeptido. Las condiciones de cultivo adecuadas para el crecimiento de las celulas anfitrionas y la expresion de los polipeptidos recombinantes a partir de tales celulas son bien conocidas por los expertos en la tecnica. Vease, p. ej., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Ausubel FM et al., Eds., Volumen 2, Capttulo 16, Wiley Interscience.
D. Polipeptidos aislados.
La descripcion tambien proporciona, en parte, polipeptidos de quinasa ALK mutantes aislados y fragmentos de los mismos. En una realizacion, la descripcion proporciona un polipeptido aislado que comprende una secuencia de aminoacidos identica en al menos 95% a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en:
(a) una secuencia de aminoacidos que codifica un polipeptido de fusion de EML4-ALK que comprende la secuencia de aminoacidos del SEQ ID NO: 1 o el SEQ ID NO: 18;
(b) una secuencia de aminoacidos que codifica un polipeptido de fusion de EML4-ALK que comprende la secuencia de aminoacidos N-terminal de EML-4 (residuos 1-233 del SEQ ID NO: 3 o residuos 1-495 del SEQ ID NO: 3) y el dominio quinasa ALK (residuos 1116-1383 del SEQ ID NO: 5); y
(c) una secuencia de aminoacidos que codifica un polipeptido que comprende al menos seis aminoacidos contiguos que abarcan la union por fusion (residuos 233-234 del sEq ID NO: 1 o residuos 495-496 del SEQ ID NO: 18) de un polipeptido de fusion de EML4-ALK.
En una realizacion preferida, se proporcionan polipeptidos de ALK mutantes recombinantes de la descripcion, que pueden ser producidos utilizando un vector recombinante o celula anfitriona recombinante como se ha descrito anteriormente.
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Se reconocera en la tecnica que algunas secuencias de aminoacidos del polipeptido de fusion de EML4-ALK o del polipeptido de la quinasa ALK activo truncado se pueden variar sin efecto significativo de la estructura o la funcion de la protema mutante. Si se contemplan tales diferencias en la secuencia, debe recordarse que habra zonas cnticas en la protema que determinan la actividad (p. ej., el dominio quinasa ALK). En general, es posible remplazar los residuos que forman la estructura terciaria, siempre que se utilicen residuos que realicen una funcion similar. En otros casos, el tipo de residuo puede ser completamente insignificante si la alteracion se produce en una region no cntica de la protema.
Por lo tanto, la descripcion incluye adicionalmente variaciones de un polipeptido de fusion de EML4-ALK que conservan la actividad de la quinasa ALK sustancial o que incluyen otras regiones de las protemas EML-4 o ALK, tales como las porciones de protemas comentadas a continuacion. Tales mutantes incluyen deleciones, inserciones, inversiones, repeticiones y sustituciones tipo (p. ej., la sustitucion de un residuo hidrofilo por otro, pero no de fuertemente hidrofilos por fuertemente hidrofobos como norma). Pequenos cambios o tales sustituciones de aminoacidos "neutros" tendran generalmente poco efecto sobre la actividad.
Por lo general se consideran sustituciones conservativas los reemplazos, de uno por otro, entre los aminoacidos alifaticos Ala, Val, Leu e Ile; el intercambio de residuos hidroxilados Ser y Thr, el cambio de los residuos acidos Asp y Glu, la sustitucion entre los residuos amida Asn y Gln, el cambio de residuos alcalinos Lys y Arg y los reemplazos entre los residuos aromaticos Phe, Tyr. Los ejemplos de las sustituciones de aminoacidos conservativas conocidas por los expertos en la tecnica son: Aromaticos: fenilalanina triptofano tirosina; Hidrofibos: leucina isoleucina valina; Polares: glutamina asparragina; Alcalinos: arginina lisina histidina; Acidos: acido aspartico acido glutamico; Pequenas: alanina serina treonina metionina glicina. Como se indica con detalle mas arriba, mas directrices se pueden encontrar pautas adicionales concernientes a que cambios de aminoacidos sean fenotfpicamente silenciosos (esto es, no es probable que tengan un efecto perjudicial significativo sobre una funcion) en Bowie et al., Science 247, mas arriba.
Los polipeptidos de la presente descripcion se proporcionan preferiblemente en una forma aislada, y preferiblemente estan sustancialmente purificados. Una version producida de forma recombinante de un polipeptido de fusion de EML4-ALK de la descripcion se puede purificar sustancialmente mediante el metodo de una etapa descrito por Smith y Johnson, Gene 67: 31-40 (1988).
Los polipeptidos de la presente descripcion incluyen los polipeptidos de fusion de EML4-ALK de las Figuras 2A-B (SEQ ID NO: 1 y 18) (incluyan o no una secuencia lfder), una secuencia de aminoacidos que codifica un polipeptido de fusion de EML4-ALK que comprende la secuencia de aminoacidos N-terminal de EML-4 (residuos 1-233 del SEQ ID NO: 3 o residuos 1 a 495 del SEQ ID NO: 3) y el dominio quinasa ALK (residuos 1116 a 1383 del SEQ ID NO: 5), y una secuencia de aminoacidos que codifica un polipeptido que comprende al menos seis aminoacidos contiguos que abarcan la union por fusion (residuos 233-234 del SEQ ID NO: 1 o residuos 495-496 del SEQ ID NO: 18) de un polipeptido de fusion de EML4-ALK (veanse tambien las Figuras 1A-B, panel inferior), asf como polipeptidos que tienen una similitud de al menos 90%, preferiblemente una similitud de al menos 95%, y aun mas preferiblemente una similitud de al menos 96%, 97%, 98% o 99% con los descritos anteriormente .
Por "% de similitud" para dos polipeptidos se quiere significar una puntuacion de similitud producida por la comparacion de las secuencias de aminoacidos de los dos polipeptidos utilizando el programa Bestfit (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 para Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive , Madison, Wis. 53711) y los ajustes por defecto para determinar la similitud. Bestfit utiliza el algoritmo de homologfa local de Smith y Waterman (Advances in Applied Mathematics 2: 482-489 (1981)) para encontrar el mejor segmento de similitud entre dos secuencias.
Por polipeptido que tiene una secuencia de aminoacidos al menos, por ejemplo, "identica" en 95% a una secuencia de aminoacidos de referencia de un polipeptido de fusion de EML4-ALK de la descripcion se quiere significar que la secuencia de aminoacidos del polipeptido es identica a la secuencia de referencia excepto que la secuencia del polipeptido puede incluir hasta cinco alteraciones de aminoacidos por cada 100 aminoacidos de la secuencia de aminoacidos de referencia del polipeptido de ALK mutante. En otras palabras, para obtener un polipeptido que tiene una secuencia de aminoacidos identica en al menos 95% a una secuencia de aminoacidos de referencia, se pueden suprimir o sustituir hasta 5% de los residuos de aminoacidos en la secuencia de referencia por otro aminoacido, o pueden insertarse en la secuencia de referencia varios aminoacidos hasta 5% de los residuos de aminoacidos totales en la secuencia de referencia. Estas alteraciones de la secuencia de referencia pueden producirse en las posiciones amino o carboxi terminales de la secuencia de aminoacidos de referencia o en cualquier lugar entre esas posiciones terminales, intercaladas o bien individualmente entre residuos en la secuencia de referencia o en uno o mas grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia.
Cuando se utiliza Bestfit o cualquier otro programa de alineamiento de secuencias para determinar si una secuencia particular es, por ejemplo, identica en 95% a una secuencia de referencia de acuerdo con la presente descripcion, los parametros se ajustan, por supuesto, de tal manera que el porcentaje de identidad se calcula sobre la longitud completa de la secuencia de aminoacidos de referencia y que se permiten huecos en la homologfa de hasta 5% del numero total de residuos de aminoacidos en la secuencia de referencia.
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Un polipeptido de fusion de EML4-ALK de la presente descripcion se puede utilizar como un marcador de peso molecular en geles de SDS-PAGE o en columnas de filtracion en gel de tamiz molecular, por ejemplo, utilizando metodos bien conocidos por los expertos en la tecnica.
Como se describe adicionalmente en detalle a continuacion, los polipeptidos de la presente descripcion tambien se pueden utilizar para generar reactivos espedficos de polipeptidos de fusion, tales como anticuerpos policlonales y monoclonales, o reactivos espedficos de polipeptidos truncados, que son utiles en analisis para detectar la expresion del polipeptido de ALK mutante como se describe a continuacion, o como agonistas y antagonistas capaces de potenciar o inhibir la funcion/actividad de la protema ALK mutante. Adicionalmente, tales polipeptidos se pueden utilizar en el sistema de levadura de dos Idbridos para "capturar" el polipeptido de fusion de EML4-ALK o protemas de union al polipeptido de la quinasa ALK truncada, que son tambien agonistas y antagonistas candidato de acuerdo con la presente descripcion. El sistema de dos Idbridos de levadura es descrito por Fields y Song, Nature 340. 245-246 (1989).
En otro aspecto, la descripcion proporciona un peptido o polipeptido que comprende una porcion portadora de epftopo de un polipeptido de la descripcion, por ejemplo, un epftopo que comprende la union por fusion de un polipeptido de fusion de EML4-ALK (veanse las Figuras 1A-B, panel inferior). El epftopo de esta porcion del polipeptido es un epftopo inmunogenico o antigenico de un polipeptido de la descripcion. Un "epftopo inmunogenico" se define como una porcion de una protema que provoca una respuesta de anticuerpos cuando la protema completa es el inmunogeno. Se cree que estos epftopos inmunogenicos estan confinados a unos pocos loci en la molecula. Por otro lado, una region de una molecula de protema a la que puede unirse un anticuerpo se define como un "epftopo antigenico". El numero de epftopos inmunogenicos de una protema generalmente es menor que el numero de epftopos antigenicos. Vease, por ejemplo, Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3998-4002 (1983). La produccion de anticuerpos espedficos para el polipeptido de fusion de la descripcion se describe con mas detalle a continuacion.
Los anticuerpos generados por peptidos o polipeptidos que portan epftopos antigenicos son utiles para detectar una protema imitada, y se pueden utilizar anticuerpos para diferentes peptidos para el seguimiento del destino de diversas regiones de un precursor de protema que experimenta el procesamiento post-traduccional. Los peptidos y anticuerpos anti-peptido se pueden utilizar en una variedad de analisis cualitativos o cuantitativos para determinar la protema imitada, por ejemplo, en analisis de competicion, ya que se ha demostrado que incluso los peptidos cortos (p. ej., aproximadamente 9 aminoacidos) se pueden unir y desplazar los peptidos mas grandes en analisis de inmunoprecipitacion. Vease, por ejemplo, Wilson et al., Cell 37:767-778 (1984) en 777. Los anticuerpos anti-peptido de la descripcion tambien son utiles para la purificacion de la protema imitada, por ejemplo, mediante cromatograffa de adsorcion utilizando metodos bien conocidos en la tecnica. Los formatos de analisis inmunologicos se describen con mas detalle a continuacion.
Los polipeptidos de ALK mutantes recombinantes tambien estan dentro del alcance de la presente descripcion, y se pueden producir utilizando polinucleotidos de la descripcion, como se describe en la Seccion B anterior. Por ejemplo, la descripcion proporciona, en parte, un metodo para producir un polipeptido de fusion de EML4-ALK recombinante mediante el cultivo de una celula anfitriona recombinante (como se describe anteriormente) en condiciones adecuadas para la expresion del polipeptido de fusion y recuperar el polipeptido. Las condiciones de cultivo adecuadas para el crecimiento de las celulas anfitrionas y la expresion de los polipeptidos recombinantes a partir de tales celulas son bien conocidas por los expertos en la tecnica.
E. Reactivos espedficos de mutantes
Los reactivos espedficos del polipeptido de ALK mutante utiles en la practica de los metodos descritos incluyen, entre otros, anticuerpos espedficos de polipeptidos de fusion y peptidos AQUA (peptidos marcados con isotopos pesados) que corresponden a, y adecuados para la deteccion y cuantificacion de, la expresion del polipeptido de fusion de EML4-ALK en una muestra biologica de un cancer, tal como un tumor sarcoma o carcinoma solido de mamfero. Tambien son utiles los reactivos espedficos de truncamiento, tales como anticuerpos, peptidos AQUA, o sondas de acidos nucleicos, adecuados para la deteccion de la presencia o ausencia de un polinucleotido o polipeptido de quinasa ALK truncado de la descripcion. Un reactivo espedfico de polipeptido de fusion es cualquier reactivo, biologico o qrnmico, capaz de unirse espedficamente a, detectar y/o cuantificar la presencia/nivel de polipeptido de fusion de EML4-ALK expresado en una muestra biologica. El termino incluye, pero no se limita a, los reactivos de anticuerpos y peptidos AQUA preferidos mencionados a continuacion, y reactivos equivalentes estan dentro del alcance de la presente descripcion.
Anticuerpos.
Los reactivos adecuados para su uso en la practica de los metodos de la descripcion incluyen un anticuerpo espedfico del polipeptido de fusion de EML4-ALK y un anticuerpo espedfico del polipeptido de fusion de TFG-ALK. Un anticuerpo espedfico de una fusion de la descripcion es uno o varios anticuerpos aislado que se unen espedficamente a un polipeptido de fusion de EML4-ALK de la descripcion (p. ej., SEQ ID NO: 1) pero no se unen sustancialmente a EML-4 de tipo salvaje o a ALK de tipo salvaje, o se unen espedficamente a un polipeptido de fusion de TFG-ALK descrito en la presente memoria (p. ej., SEQ ID NO: 20), pero no se unen sustancialmente a
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TFG de tipo salvaje o ALK de tipo salvaje. Otros reactivos adecuados incluyen anticuerpos espedficos de epftopos que se unen espedficamente a un epftopo en el dominio extracelular de la secuencia de la protema ALK de tipo salvaje (cuyo dominio no esta presente en la quinasa ALK activa, truncada descrita en la presente memoria), y por lo tanto son capaces de detectar la presencia (o ausencia) de ALK de tipo salvaje en una muestra.
Los anticuerpos espedficos del polipeptido de fusion de EML4-ALK o TFG-ALK humanos tambien pueden unirse a secuencias peptfdicas epitopicas altamente homologas y equivalentes en otras especies de mairnferos, por ejemplo murinos o de conejo, y viceversa. Los anticuerpos utiles en la practica de los metodos de la descripcion incluyen (a) anticuerpos monoclonales, (b) anticuerpos policlonales purificados que se unen espedficamente al polipeptido diana (p. ej., la union por fusion del polipeptido de fusion de EML4-ALK (veanse las Figuras 1A-B, panel inferior) o el polipeptido de fusion de TFG-ALK (vease la Figura 1C, panel inferior), (c) anticuerpos como los descritos en los apartados (a) - (b) anteriores que se unen epftopos o sitios de fosforilacion equivalentes y altamente homologas en otras especies no humanas (p. ej., raton, rata), y (d) fragmentos de los apartados (a) - (c) anteriores que se unen al antigeno (o mas preferiblemente al epftopo) unido mediante los anticuerpos ilustrativos descritos en la presente memoria.
El termino "anticuerpo" o "anticuerpos", segun se utiliza en la presente memoria se refiere a todos los tipos de inmunoglobulinas, incluyendo IgG, IgM, IgA, IgD, e IgE. Los anticuerpos pueden ser monoclonales o policlonales y pueden ser de cualquier especie de origen, incluyendo (por ejemplo) raton, rata, conejo, caballo, o ser humano, o pueden ser anticuerpos quimericos. Veanse, p. ej., M. Walker et al., Molec. Immunol. 26: 403-11 (1989); Morrision et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 81: 6851 (1984); Neuberger et al., Nature 312:604 (1984)). Los anticuerpos pueden ser anticuerpos monoclonales recombinantes producidos de acuerdo con los metodos descritos en la Patente de los Estados Unidos Num. 4.474.893 (Reading) o la Patente de los Estados Unidos Num. 4.816.567 (Cabilly et al.). Los anticuerpos tambien pueden ser anticuerpos espedficos construidos qmmicamente preparados de acuerdo con el metodo descrito en la Patente de los Estados Unidos Num. 4.676.980 (Segel et al.).
El sitio epitopico preferido de un anticuerpo espedfico de un polipeptido de fusion de EML4-ALK de la descripcion es un fragmento peptfdico que consiste esencialmente en aproximadamente 11 a 17 aminoacidos de una secuencia del polipeptido de fusion de EML4-ALK humano (SEQ ID NO: 1 y 18) cuyo fragmento abarca la union por fusion (que se produce en los residuos 233-234 en la protema de fusion de variante corta y los residuos 495-496 en la protema de fusion de variante larga (veanse las Figuras 1A-B (panel inferior)). Se apreciara que los anticuerpos que se unen espedficamente peptidos/epftopos mas cortos o mas largos que abarcan la union de fusion de un polipeptido de fusion de EML4-AlK estan dentro del alcance de la presente descripcion.
Del mismo modo, el sitio epitopico preferido de un anticuerpo espedfico del polipeptido de fusion de TFG-ALK util en la practica de los metodos descritos es un fragmento peptfdico que consiste esencialmente en aproximadamente 11 a 17 aminoacidos de la secuencia del polipeptido de fusion de TFG-ALK humano (SEQ ID NO: 20), cuyo fragmento abarca la union por fusion (que se produce en los residuos 137-138 (vease la Figura 1C (panel inferior)).
La descripcion no se limita al uso de anticuerpos, sino que incluye moleculas equivalentes, tales como dominios de union a protemas o aptameros de acidos nucleicos, que se unen, de una manera espedfica de la protema de fusion o la protema truncada, esencialmente al mismo epftopo al que se une el anticuerpo espedfico del polipeptido de fusion de EML4- ALK o TFG-ALK util en los metodos de la descripcion. Vease, p. ej., Neuberger et al., Nature 312: 604 (1984). Tales reactivos distintos de anticuerpos equivalentes se pueden emplear adecuadamente en los metodos de la descripcion descritos adicionalmente mas adelante.
Los anticuerpos policlonales utiles en la practica de los metodos de la descripcion se pueden producir de acuerdo con tecnicas convencionales inmunizando un animal adecuado (p. ej., conejo, cabra, etc.) con un antfgeno que incluye un epftopo espedfico de la protema de fusion deseada (p. ej., la union por fusion de una protema de fusion de ALK descrita en la presente memoria), recogiendo el suero inmune del animal, y separando los anticuerpos policlonales del suero inmune, y purificando los anticuerpos policlonales que tienen la especificidad deseada, de acuerdo con procedimientos conocidos. El antfgeno puede ser un antfgeno peptfdico sintetico que comprende la secuencia epitopica deseada, seleccionado y construido de acuerdo con tecnicas bien conocidas. Veanse, p. ej., ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, capftulo 5, pags. 75-76, Harlow y Lane Eds., Cold Spring Harbor Laboratory (1988); Czernik, Methods in Enzymology, 201: 264-283 (1991); Merrifield, J. Am.. Chem. Soc. 85: 21-49 (1962)). Los anticuerpos policlonales producidos como se describe en la presente memoria se pueden escrutar y aislar como se describe adicionalmente mas adelante.
Los anticuerpos monoclonales tambien se pueden emplear de manera beneficiosa en los metodos de la descripcion, y se pueden producir en lmeas celulares de hibridoma de acuerdo con la tecnica bien conocida de Kohler y Milstein. Nature 265: 495-97 (1975); Kohler y Milstein, Eur. J. Immunol. 6: 511 (1976); vease tambien, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Ausubel et al. Eds. (1989). Los anticuerpos monoclonales producidos de este modo son altamente espedficos, y mejoran la selectividad y especificidad de los metodos de analisis proporcionados por la descripcion. Por ejemplo, se puede inyectar una disolucion que contiene el antfgeno apropiado (p. ej., un peptido sintetico que comprende la union por fusion de polipeptido de fusion de EML4-ALK) en un raton y, despues de un tiempo suficiente (de acuerdo con tecnicas convencionales), el raton se sacrifica y se obtienen las celulas del bazo obtenidas. A continuacion las celulas del bazo se inmortalizan fusionandolas con
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celulas de mieloma, tipicamente en presencia de polietilenglicol, para producir celulas de hibridoma. Los hibridomas de fusion de conejo, por ejemplo, se pueden producir como se describe en la Patente de los Estados Unidos Num. 5.675.063, K. Knight, Expedida el 7 de Octubre de 1997. Las celulas de hibridoma se cultivan a continuacion en un medio de seleccion adecuado, tal como hipoxantina-aminopterina-timidina (HAT), y el sobrenadante se escruta para determinar los anticuerpos monoclonales que tienen la especificidad deseada, como se describe a continuacion. El anticuerpo secretado se puede recuperar del sobrenadante de cultivo de tejidos mediante metodos convencionales tales como precipitacion, cromatograffa de intercambio ionico o de afinidad, o similares.
Los fragmentos Fab monoclonales tambien se pueden producir en Escherichia coli mediante mecanismos recombinantes conocidos por los expertos en la tecnica. Veanse, p. ej., W. Huse, Science 246: 1275-81 (1989); Mullinax et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 87: 8095 (1990). Si se prefieren anticuerpos monoclonales de un isotipo para una aplicacion concreta, se pueden preparar los isotipos concretos directamente, mediante seleccion a partir de la fusion inicial, o se pueden preparar secundariamente, a partir de un hibridoma parental que secreta un anticuerpo monoclonal de isotipo diferente mediante el uso de la tecnica de seleccion sib para aislar variantes de cambio de clase (Steplewski, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 82:. 8653 (1985); Spira et al., J. Immunol. Methods, 74: 307 (1984)). El sitio de combinacion con el antigeno del anticuerpo monoclonal se puede clonar mediante PCR y producir anticuerpos de cadena sencilla como anticuerpos recombinantes presentados en fagos o anticuerpos solubles en E. coli (vease, p. ej., ANTIBODY ENGINEERING PROTOCOLOS, 1995, Humana Press, Sudhir Paul editor.)
Mas aun, la Patente de los Estados Unidos Num. 5.194.392, Geysen (1990) describe un metodo general para detectar o determinar la secuencia de monomeros (aminoacidos u otros compuestos) que es un equivalente topologico del epftopo (es decir, un "mimotopo") que es complementaria a un paratopo concreto (sitio de union al antigeno) de un anticuerpo de interes. Mas en general, este metodo implica la deteccion o determinacion de una secuencia de monomeros que es un equivalente topografico de un ligando que es complementario al sitio de union de ligando de un receptor concreto de interes. Del mismo modo, la Patente de los Estados Unidos Num. 5.480.971, de Houghten et al. (1996) describe oligopeptidos peralquilados con alquilo C1-C lineal y conjuntos y bibliotecas de tales peptidos, asf como metodos para utilizar tales conjuntos y bibliotecas de oligopeptidos para determinar la secuencia de un oligopeptido peralquilado que se une preferentemente a una molecula aceptora de interes. De este modo, los analogos no peptfdicos de los peptidos portadores de epftopos de la descripcion tambien se pueden elaborar de forma rutinaria por medio de estos metodos.
Los anticuerpos utiles en los metodos de la descripcion, ya sean policlonales o monoclonales, se pueden escrutar para determinar la especificidad del epftopo y la protema de fusion de acuerdo con mecanismos convencionales. Vease, p. ej., Czemik et al, Methods in Enzymology, 201: 264-283 (1991). Por ejemplo, los anticuerpos se pueden escrutar frente a una biblioteca de peptidos mediante ELISA para asegurar la especificidad tanto para el antfgeno deseado como, si se desea, para la reactividad solamente con, p. ej., un polipeptido de fusion de EML4-ALK de la descripcion y no con EML-4 de tipo salvaje o ALK de tipo salvaje. Los anticuerpos tambien se pueden someter a ensayo mediante transferencia Western frente a preparaciones celulares que contienen la protema diana para confirmar la reactividad con la unica diana deseada y para asegurar que no hay union apreciable a otras protemas de fusion que implican ALK. La produccion, escrutinio, y uso de anticuerpos espedficos para la protema de fusion son conocidos por los expertos en la tecnica, y han sido descritos. Vease, p. ej., la Publicacion de Patente de los Estados Unidos Num. 20050214301, Wetzel et al., 29 de Septiembre de 2005.
Los anticuerpos espedficos para el polipeptido de fusion utiles en los metodos de la descripcion pueden exhibir alguna reactividad cruzada limitada con epftopos de fusion similares en otras protemas de fusion o con los epftopos de EML-4 de tipo salvaje, TFG de tipo salvaje, y ALK de tipo salvaje que forman la union por fusion. Esto no es inesperado ya que la mayona de los anticuerpos muestran algun grado de reactividad cruzada, y los anticuerpos anti-peptido a menudo reaccionaran de forma cruzada con epftopos que tienen alta homologfa o identidad con el peptido inmunizante. Vease, p. ej., Czemik, mas arriba. La reactividad cruzada con otras protemas de fusion se caracteriza facilmente por transferencia Western junto con marcadores de peso molecular conocido. Las secuencias de aminoacidos de las protemas de reaccion cruzada se pueden examinar para identificar los sitios altamente homologos o identicos a la secuencia de polipeptido de fusion de EML4-ALK o TFG-ALK a la que se une el anticuerpo. La reactividad cruzada no deseable se puede eliminar mediante seleccion negativa utilizando purificacion de anticuerpos en columnas peptfdicas (p. ej., seleccionando anticuerpos que se unen, a EML-4 de tipo salvaje y/o a ALK de tipo salvaje).
Los anticuerpos espedficos del polipeptido de fusion de EML4-ALK de la descripcion (y los anticuerpos espedficos del polipeptido de fusion de TFG-ALK) que son utiles en la practica de los metodos descritos en la presente memoria son idealmente espedficos para el polipeptido de fusion humano, pero no se limitan solo a la union a la especie humana, per se. La descripcion incluye la produccion y uso de anticuerpos que tambien se unen a epftopos conservados y altamente homologos o identicos en otras especies de mamferos (p. ej., raton, rata, mono). Las secuencias altamente homologas o identicas en otras especies pueden identificarse facilmente mediante comparaciones de secuencias patron, por ejemplo utilizando BLAST, con una secuencia de polipeptido de fusion de EML4-ALK humano descrita en la presente memoria (SEQ ID NO: 1 y 18) o una secuencia del polipeptido de fusion de TFG-ALK humano descrita en la presente memoria (SEQ ID NO: 20).
Los anticuerpos empleados en los metodos de la descripcion se pueden caracterizar adicionalmente, y validar, para
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su uso en un formato de analisis concreto, por ejemplo citometna de flujo (FC), inmunohistoqmmica (IHC), y/o inmunocitoqmmica (ICC). El uso de anticuerpos espedficos para el polipeptido de fusion de ALK en tales metodos se describe adicionalmente en la seccion F a continuacion. Los anticuerpos tambien pueden conjugarse ventajosamente con colorantes fluorescentes (p. ej., Alexa 488, PE), o marcas tales como puntos cuanticos, para su uso en analisis multiparametricos junto con otros anticuerpos de transduccion de senales (fosfo-AKT, fosfo-Erk 1/2) y/o marcadores celulares (citoqueratina), como se describe adicionalmente en la seccion F a continuacion.
A poner en practica los metodos de la descripcion, tambien se pueden examinar ventajosamente la expresion y/o actividad de EML-4 de tipo salvaje, TFG de tipo salvaje, y/o aLk de tipo salvaje en una muestra biologica dada utilizando anticuerpos (ya sea fosfoespedficos o totales) para estas protemas de tipo salvaje. Por ejemplo, los anticuerpos espedficos totales y del sitio de fosforilacion de ALK estan disponibles en el mercado (vease CELL SIGNALING TECHNOLOGY, INC., Beverly MA, 2005/06 Num. de Catalogo 3341, 3342). Tales anticuerpos tambien pueden producirse de acuerdo con metodos convencionales, como se ha descrito anteriormente. Las secuencias de aminoacidos de EML-4, TFG, y ALK humanos estan publicadas (veanse las Figuras 3A y 4A-4C, y los Num. de acceso SwissProt referenciados), como lo estan las secuencias de estas protemas de otras especies.
La deteccion de la expresion y/o activacion de EML-4 de tipo salvaje, TFG, ALK de tipo salvaje, junto con la expresion del polipeptido de fusion de EML4-ALK y/o TFG-ALK, en una muestra biologica (p. ej., una muestra tumoral) puede proporcionar informacion acerca de si la protema de fusion por sf sola esta dirigiendo el tumor, o si ALK de tipo salvaje tambien esta activada y dirige el tumor. Tal informacion tiene utilidad clmica para evaluar si es probable que la eleccion como diana de la protema de fusion o la protema o protemas de tipo natural, o ambas, sea lo mas beneficioso para inhibir la progresion del tumor, y para seleccionar un agente terapeutico apropiado o una de sus combinaciones. Los anticuerpos espedficos para el dominio extracelular de la quinasa ALK de tipo salvaje, que no esta presente en la quinasa ALK activa truncada descrita en la presente memoria, pueden ser particularmente utiles para determinar la presencia/ausencia de la quinasa ALK mutante.
Se entendera que se puede utilizar mas de un anticuerpo en la practica de los metodos descritos anteriormente. Por ejemplo, se pueden emplear simultaneamente uno o mas anticuerpos espedficos para el polipeptido de fusion de EML4-ALK junto con uno o mas anticuerpos espedficos para otra quinasa, receptor, o sustrato de quinasa que se sospecha que esta, o potencialmente esta, activado en un cancer en el es expresado el polipeptido de fusion de EML4-ALK para detectar la actividad de tales otras moleculas de senalizacion en una muestra biologica que comprende celulas de tal cancer.
Los expertos en la tecnica apreciaran que los polipeptidos de fusion de EML4-ALK de la presente descripcion y los fragmentos portadores de epftopos de union por fusion de los mismos descritos anteriormente pueden combinarse con porciones del dominio constante de inmunoglobulinas (IgG), dando como resultado polipeptidos quimericos. Estas protemas de fusion facilitan la purificacion y muestran un incremento de la vida media in vivo. Esto se ha demostrado, p. ej., para protemas quimericas que consisten en los dos primeros dominios del polipeptido CD4 humano y diversos dominios de las regiones constantes de las cadenas pesadas o ligeras de inmunoglobulinas de mairnferos (EPA 394.827; Traunecker et al., Nature 331: 84-86 (1988)). Las protemas de fusion que tienen una estructura dimerica unida por puentes disulfuro debido a la porcion IgG tambien pueden ser mas eficaces en la union y neutralizacion de otras moleculas que el polipeptido de fusion de EML4-ALK monomerico solo (Fountoulakis et al, J. Biochem 270. 3958-3964 (1995)).
Peptidos marcados con isotopos pesados (Peptidos AQUA)
Los reactivos espedficos para el polipeptido fusion de EML4-ALK o TFG-ALK utiles en la practica de los metodos descritos tambien pueden comprender peptidos marcados con isotopos pesados adecuados para la cuantificacion absoluta del polipeptido de fusion de AlK expresado o el polipeptido de quinasa ALK truncado en una muestra biologica. Se han descrito la produccion y el uso de peptidos AQUA para la cuantificacion absoluta de protemas (AQUA) en mezclas complejas. Veanse WO/03016861, "Absolute Cuantification of Proteins and Modified Forms Thereof by Multistage Mass Spectrometry", Gygi et al. y tambien Gerber et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100: 69405 (2003) (cuyas ensenanzas se incorporan en la presente memoria por referencia, en su totalidad).
La metodologfa AQUA emplea la introduccion de una cantidad conocida de al menos un patron peptfdico marcado con isotopo pesado (que tiene una firma unica detectable por cromatograffa LC-SRM) en una muestra biologica digerida con el fin de determinar, por comparacion con el patron de peptido, la cantidad absoluta de un peptido con la misma secuencia y modificacion de protema en la muestra biologica. En pocas palabras, la metodologfa AQUA tiene dos fases: seleccion del patron interno peptfdico y la validacion y desarrollo de metodos; y la aplicacion utilizando los patrones internos peptfdicos validados para detectar y cuantificar una protema diana en la muestra. El metodo es una tecnica poderosa para detectar y cuantificar un peptido/protema dados dentro de una mezcla biologica compleja, tal como un producto lisado celular, y se puede emplear, p. ej., para cuantificar el cambio en la fosforilacion de protemas como resultado del tratamiento con farmacos, o para cuantificar diferencias en el nivel de una protema en diferentes estados biologicos.
Generalmente, para desarrollar un patron interno adecuado, se selecciona un peptido concreto (o peptido modificado) dentro de una secuencia de protema diana basandose en su secuencia de aminoacidos y en la proteasa
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concreta que se va a utilizar para la digestion. A continuacion el peptido se genera mediante smtesis de peptidos en fase solida de manera que un residuo es remplazado por ese mismo residuo que contiene isotopos estables C 3C, 15N). El resultado es un peptido que es qmmicamente identico a su contraparte nativa formada mediante proteolisis, pero es facilmente distinguible mediante MS a traves de un desplazamiento de masas de 7 Da. El peptido patron interno AQUA recien sintetizado se evalua a continuacion mediante LC-MS/MS. Este procedimiento proporciona informacion cualitativa sobre la retencion de peptido mediante cromatograffa de fase inversa, eficacia de ionizacion, y fragmentacion por medio de disociacion inducida por colision. Los iones de los fragmentos informativos y abundantes para los conjuntos de peptidos nativos y patrones internos se seleccionan y a continuacion se verifican espedficamente en una sucesion rapida como una funcion de la retencion cromatografica para formar un metodo de verificacion de la reaccion seleccionada (LC-SRM) basandose en el perfil unico del patron peptidico.
La segunda fase de la estrategia AQUA es su implementacion para medir la cantidad de una protema o protema modificada a partir de mezclas complejas. Los productos lisados celulares completos son fraccionados tfpicamente por medio de electroforesis en gel de SDS-PAGE, y las regiones del gel coincidentes con la migracion de protema son escindidas. Este procedimiento esta seguido por la proteolisis en gel en presencia de los peptidos AQUA y analisis LC-SRM. (vease Gerber et al. mas arriba). Los peptidos AQUA se agregan a la mezcla de peptidos compleja obtenida por digestion del producto lisado celular completo con una enzima proteolftica y se someten a purificacion por inmunoafinidad como se ha descrito anteriormente. El tiempo de retencion y patron de fragmentacion del peptido nativo formado por digestion (p. ej., tripsinizacion) son identicos a los del peptido patron interno AQUA determinado previamente; de este modo, el analisis LC-MS/MS utilizando un experimento SRM da como resultado una medicion altamente espedfica y sensible tanto del patron interno como del analito directamente a partir de las mezclas de peptidos extremadamente complejas.
Puesto que se anade una cantidad absoluta del peptido AQUA (p. ej., 250 fmol), la razon de las areas bajo la curva se puede utilizar para determinar los niveles de expresion precisos de una protema o forma fosforilada de una protema en el producto lisado celular original. Ademas, el patron interno esta presente durante la digestion en el gel a medida que se forman los peptidos nativos, de manera que la eficacia de extraccion del peptido de los pedazos de gel, las perdidas absolutas durante la manipulacion de la muestra (incluyendo la centrifugacion a vado), y la variabilidad durante la introduccion en el sistema LC-MS no afectan a la razon determinada de abundancias de peptidos nativos y AQUA.
Un patron de peptido AQUA se desarrolla para una secuencia conocida previamente identificada por medio del metodo IAP-LC-MS/MS en una protema diana. Si el sitio es modificado, se puede desarrollar un peptido AQUA que incorpora la forma modificada del residuo concreto dentro del sitio, y se desarrolla un segundo peptido AQUA que incorpora la forma no modificada del residuo. De esta manera, se pueden utilizar los dos patrones para detectar y cuantificar las formas del sitio tanto modificadas como no modificadas en una muestra biologica.
Patrones internos peptfdicos tambien se pueden generar examinando la secuencia de aminoacidos primaria de una protema y determinando los lfmites de los peptidos producidos por la escision con proteasa. Alternativamente, se puede digerir realmente una protema con una proteasa y a continuacion se puede secuenciar un fragmento peptfdico concreto producido. Las proteasas adecuadas incluyen, pero no se limitan a, serina proteasas (p. ej., tripsina, hepsina), metaloproteasas (p. ej., PUMP1), quimotripsina, catepsina, pepsina, termolisina, carboxipeptidasas, etc.
Una secuencia peptfdica dentro de una protema diana se selecciona de acuerdo con uno o mas criterios para optimizar el uso del peptido como patron interno. Preferiblemente, se selecciona el tamano del peptido para reducir al mmimo las posibilidades de que la secuencia peptfdica se repita en otros lugares de otras protemas distintas de la diana. De este modo, un peptido tiene preferiblemente al menos aproximadamente 6 aminoacidos. El tamano del peptido tambien se optimiza para maximizar la frecuencia de ionizacion. Por lo tanto, no se prefieren peptidos mas largos de aproximadamente 20 aminoacidos. El intervalo preferido es de aproximadamente 7 a 15 aminoacidos. Tambien se selecciona una secuencia peptfdica que no es probable que sea qmmicamente reactiva durante la espectrometna de masas, por lo tanto se evitan secuencias que comprenden cistema, triptofano, o metionina.
Se puede seleccionar una secuencia peptfdica que no incluye una region modificada de la region diana de manera que el patron interno peptfdico se pueda utilizar para determinar la cantidad de todas las formas de la protema. Alternativamente, puede ser deseable detectar un patron interno peptfdico que abarca un aminoacido modificado y cuantificar solamente la forma modificada de la protema diana. Se pueden utilizar juntos patrones peptfdicos para regiones tanto modificadas como no modificadas, para determinar el alcance de una modificacion en una muestra particular (es decir, para determinar que fraccion de la cantidad total de protema esta representada por la forma modificada). Por ejemplo, se pueden usar patrones peptfdicos para la forma tanto fosforilada como no fosforilada de una protema que se sabe que esta fosforilada en un sitio concreto para cuantificar la cantidad de la forma fosforilada en una muestra.
El peptido se marca utilizando uno o mas aminoacidos marcados (es decir, la marca es una parte real del peptido) o menos preferiblemente, las marcas se pueden anclar despues de la smtesis de acuerdo con metodos convencionales. Preferiblemente, al marca es una marca que altera la masa seleccionada basandose en las siguientes consideraciones: La masa debe ser unica con respecto a las masas de los fragmentos desplazados
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producidos mediante analisis de MS a las regiones del espectro con fondo bajo; el componente de firma de la masa ionica es la porcion del radical de marcaje que muestra preferiblemente una firma de masa ionica unica en el analisis MS; la suma de las masas de los atomos constituyentes de la marca es preferiblemente unica y diferente de los fragmented de todos los posibles aminoacidos. Como resultado, los aminoacidos y peptidos marcados se distinguen facilmente de los no marcados por el patron de masa ionica en el espectro de masas resultante. Preferiblemente, el componente de firma de masa ionica confiere una masa a un fragmento de protema que no coincide con la masa del residuos para ninguno de los 20 aminoacidos naturales.
La marca debe ser robusta en las condiciones de fragmentacion del MS y no experimentar una fragmentacion desfavorable. La qrnmica de marcaje debe ser eficaz en un intervalo de condiciones, particularmente condiciones de desnaturalizacion, y la etiqueta marcada permanece preferiblemente soluble en el sistema de tampon de MS de eleccion. La marca no suprime preferiblemente la eficacia de ionizacion de la protema y no es qmmicamente reactiva. La marca puede contener una mezcla de dos o mas especies isotopicamente distintas para generar un patron de espectrometna de masas unico en cada posicion de fragmento marcado. Los isotopos estables, tales
* O 1 O 1 1 £T A~7 HQ o A 1 ^ 1
como H, C, N, O, O, o S, se encuentran entre las marcas preferidas. Tambien se pueden preparar pares de patrones internos peptfdicos que incorporan una marca isotopica diferente. Los residuos de aminoacidos preferidos en los que se puede incorporar una marca isotopica pesada incluyen leucina, prolina, valina, y fenilalanina.
Los patrones internos peptfdicos se caracterizan de acuerdo con su razon de masa a carga (m/z), y preferiblemente, tambien de acuerdo con su tiempo de retencion en una columna cromatografica (p. ej., una columna de HPLC). Los patrones internos que eluyen simultaneamente con peptidos no marcados de secuencia identica se seleccionan como patrones internos optimos. El patron interno se analiza a continuacion mediante la fragmentacion del peptido por cualquier medio adecuado, por ejemplo, mediante disociacion inducida por colision (CID) utilizando, p. ej., argon o helio como gas de colision. Los fragmentos se analizan a continuacion, por ejemplo, mediante espectrometna de masas de multiples etapas (MSn) para obtener un espectro de iones fragmento, para obtener una firma de fragmentacion peptfdica. Preferiblemente, los fragmentos peptfdicos tienen diferencias significativas en las razones de m/z para permitir que los picos correspondientes a cada fragmento se separen bien, y se obtenga una firma que sea unica para el peptido diana. Si no se obtiene una firma de fragmento adecuada en la primera etapa, se realizan etapas adicionales de MS hasta que se obtiene una firma unica.
Los iones fragmento en los espectros MS/MS y MS3 son tipicamente altamente espedficos para el peptido de interes, y, junto con los metodos LC, permiten un medio altamente selectivo para detectar y cuantificar un peptido/protema diana en una mezcla compleja de protemas, tal como un producto lisado celular, que contiene muchos miles o decenas de miles de protemas. Se puede analizar cualquier muestra biologica que contenga potencialmente una protema/peptido diana de interes. Se emplean preferiblemente extractos celulares brutos o parcialmente purificados. Generalmente, la muestra tiene al menos 0,01 mg de protema, tipicamente una concentracion de 0,1-10 mg/ml, y se puede ajustar a una concentracion de tampon y pH deseados.
A continuacion se anade una cantidad conocida de un patron interno del peptido marcado, preferiblemente aproximadamente 10 femtomoles, correspondiente a una protema diana que se va a detectar/cuantificar a una muestra biologica, tal como un producto lisado celular. La muestra enriquecida se digiere a continuacion con una o mas proteasas durante un pertedo de tiempo adecuado para permitir la digestion. Despues se realiza una separacion (p. ej., mediante HPLC, HPLC de fase inversa, electroforesis capilar, cromatograffa de intercambio ionico, etc.) para aislar el patron interno marcado y su peptido diana correspondiente de otros peptidos en la muestra. La LC por microcapilaridad es un metodo preferido.
Cada peptido aislado se examina a continuacion mediante el seguimiento de una reaccion seleccionada en el MS. Esto implica el uso del conocimiento previo obtenido mediante la caracterizacion del patron interno peptfdico y requiere despues el MS para controlar continuamente un ion espedfico en el espectro MS/MS o MSn tanto para el peptido de interes como para el patron interno. Despues de la elucion, se calculan el area bajo la curva (AUC) para los picos tanto del patron peptfdico como del peptido diana. La razon de las dos areas proporciona la cuantificacion absoluta que se puede normalizar para el numero de celulas utilizado en el analisis y el peso molecular de la protema, para proporcionar el numero exacto de copias de la protema por celula. Los detalles adicionales de la metodologfa aQuA son descritos por Gygi et al., y Gerber et al. mas arriba.
Los patrones peptfdicos internos AQUA (peptidos marcados con isotopos pesados) se pueden producir de manera deseable, como se ha descrito anteriormente, para detectar y cuantificar cualquier sitio unico (p. ej., la union por fusion dentro de un polipeptido de fusion de EML4-ALK descrito) en de un polipeptido de ALK mutante de la descripcion. Por ejemplo, se puede preparar un fosfopeptido AQUA que corresponde a la secuencia de union por fusion de un polipeptido de fusion de EML4-ALK (veanse las Figuras 1A-B (panel inferior)) o que corresponde al punto de truncamiento de cualquiera de EML4, TFG, o ALK. Se pueden producir patrones peptfdicos para la union por fusion de EML4-ALK o TFG-ALK y se pueden emplear tales patrones en la metodologfa AQUA para detectar y cuantificar la union por fusion (es decir, la presencia de polipeptido de fusion de EML4-ALK) en una muestra biologica.
Por ejemplo, un peptido AQUA ilustrativo de la descripcion comprende la secuencia de aminoacidos INQVYR (vease la Figura 1, panel inferior), que corresponde a los tres aminoacidos que flanquean inmediatamente cada lado de la
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union por fusion en el polipeptido de fusion de EML4-ALK (vease el SEQ ID NO: 7). Se apreciara que tambien se pueden construir peptidos AQUA mas grandes que comprenden la secuencia de union por fusion (y residuos adicionales aguas abajo o aguas arriba de la misma). Del mismo modo, se puede construir alternativamente un peptido AQUA mas pequeno que comprende menos de la totalidad de los residuos de tal secuencia (pero que todavfa comprende el punto de la propia union por fusion). Tales peptidos AQUA mas grandes o mas pequenos estan dentro del alcance de la presente descripcion, y la seleccion y produccion de peptidos AQUA preferidos se pueden llevar a cabo como se describio anteriormente (vease Gygi et al., Gerber et al., mas arriba).
Sondas de acido nucleico
Los reactivos de$fusion espedfica proporcionados por la descripcion tambien incluyen sondas y cebadores de acidos nucleicos adecuados para la deteccion de un polinucleotido de EML4-ALK o un polinucleotido de quinasa ALK truncado, como se describe con detalle en la Seccion B anterior. Tales sondas deseables incluyen, entre otras, sondas de punto de rotura que corresponden a ambos lados de los puntos de rotura de los genes de EML4 de tipo salvaje y/o ALK de tipo salvaje que producen la fusion. El uso espedfico de tales sondas en analisis tales como la hibridacion fluorescente in situ (FISH) o la amplificacion mediante reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) se describe en la seccion F de mas abajo. Se pueden preparar sondas de punto de ruptura similares para detectar la presencia del polinucleotido de fusion de TFG-ALK (vease la Figura 1C (SEQ ID NO: 21).
F. Aplicaciones de diagnostico y formatos de analisis.
Los metodos de la descripcion se pueden llevar a cabo en una variedad de formatos de analisis diferentes conocidos por los expertos en la tecnica.
Inmunoanalisis
Los inmunoanalisis utiles en la practica de los metodos de la descripcion pueden ser inmunoanalisis homogeneos o inmunoanalisis heterogeneos. En un analisis homogeneo la reaccion inmunologica normalmente implica un reactivo espedfico del polipeptido quinasa ALK mutante (p. ej., un anticuerpo espedfico del polipeptido de fusion de EML4- ALK), un analito marcado, y la muestra biologica de interes. La senal que surge de la marca se modifica, directa o indirectamente, tras la union del anticuerpo al analito marcado. Tanto la reaccion inmunologica como la deteccion del grado de la misma se llevan a cabo en una solucion homogenea. Las marcas inmunoqmmicas que se pueden emplear incluyen radicales libres, radioisotopos, colorantes fluorescentes, enzimas, bacteriofagos, coenzimas, etcetera. Tambien se pueden emplear ventajosamente marcas de nanocristales semiconductores, o "puntos cuanticos", y su preparacion y uso han sido bien descritos. Vease, en general, K. Barovsky, Nanotech. Law y Bus. 1(2): Artfculo 14 (20O4) y patentes allf citadas.
En un enfoque de analisis heterogeneo, los reactivos son por lo general la muestra biologica, un reactivo espedfico del polipeptido de quinasa ALK mutante (p. ej., un anticuerpo espedfico de la fusion de EML4-ALK), y medios adecuados para producir una senal detectable. Se pueden utilizar muestras biologicas descritas adicionalmente a continuacion. El anticuerpo generalmente se inmoviliza sobre un soporte, tal como una cuenta, placa o portaobjetos, y se pone en contacto con la muestra que se sospecha que contiene el antfgeno en una fase lfquida. El soporte se separa despues de la fase lfquida y se examina ya sea la fase de soporte o la fase lfquida para determinar una senal detectable empleando los metodos para producir tal senal. La senal esta relacionada con la presencia del analito en la muestra biologica. Los metodos para producir una senal detectable incluyen el uso de marcas radiactivas, marcas fluorescentes, marcas enzimaticas, puntos cuanticos, etcetera. Por ejemplo, si el antfgeno que se va a detectar contiene un segundo sitio de union, se puede conjugar un anticuerpo que se une a ese sitio con un grupo detectable y se puede anadir a la solucion de reaccion en fase lfquida antes de la etapa de separacion. La presencia del grupo detectable sobre el soporte solido indica la presencia del antfgeno en la muestra de ensayo. Los ejemplos de inmunoanalisis adecuados son radioinmunoanalisis, metodos de inmunofluorescencia, inmunoanalisis ligados a enzimas, y similares.
Los formatos de inmunoanalisis y variaciones de los mismos, que pueden ser utiles para llevar a cabo los metodos descritos en la presente memoria, son bien conocidos en la tecnica. Vease, en general E. Maggio, Enzyme- Immunoassay, (1980) (CRC Press, Inc., Boca Raton, Fla.); veanse tambien, p. ej., la Patente de los Estados Unidos Num. 4.727.022 (Skold et al., "Methods for Modulating Lingand-Receptor Interactions and their Application"); la Patente de los Estados Unidos Num. 4.659.678 (Forrest et al., "Immunoassay of Antigens"); la Patente de los Estados Unidos Num. 4.376.110 (David et al.,"Immunometric Assays Using Monoclonal Antibodies"). Las condiciones adecuadas para la formacion de complejos de reactivo-anticuerpo son bien conocidas por los expertos en la tecnica. Vease id. Se pueden utilizar anticuerpos monoclonales espedficos del polipeptido de fusion de EML4- ALK en un analisis "de dos sitios" o "sandwich", con una sola lmea celular de hibridoma que sirve como fuente tanto para el anticuerpo monoclonal marcado como para el anticuerpo monoclonal unido. Tales analisis se describen en la Patente de los Estados Unidos Num. 4.376.110. La concentracion de reactivo detectable debe ser suficiente de manera que la union del polipeptido de fusion de EML4-ALK o TFG-ALK sea detectable en comparacion con el fondo.
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Los anticuerpos utiles en la practica de los metodos descritos en la presente memoria se pueden conjugar con un soporte solido adecuado para un analisis de diagnostico (p. ej., cuentas, placas, portaobjetos o pocillos formados a partir de materiales tales como latex o poliestireno) de acuerdo con tecnicas conocidas, tales como la precipitacion. Los anticuerpos u otros reactivos de union al polipeptido de fusion de ALK o al polipeptido de quinasa ALK truncado se pueden conjugar del mismo modo con grupos detectables tales como radiomarcas (p. ej., 35S, 125I, 131I), marcas enzimaticos (p. ej., peroxidasa de rabano picante, fosfatasa alcalina), y marcas fluorescentes (p. ej., fluorescema) de acuerdo con tecnicas conocidas.
Los analisis basados en celulas, tales como la citometna de flujo (FC), la inmunohistoqmmica (IHC), o inmunofluorescencia (IF) son particularmente deseables en la practica de los metodos de la descripcion, ya que dichos formatos de ensayo son clmicamente adecuados, permiten la deteccion de la expresion del polipeptido de quinasa ALK mutante in vivo, y evitan el riesgo de cambios por artefactos en la actividad resultante de la manipulacion de las celulas obtenidas a partir de, p. ej., una muestra tumoral con el fin de obtener extractos. De acuerdo con ello, en alguna realizacion preferida, los metodos de la descripcion se implementan en un formato de analisis de citometna de flujo (FC), inmunohistoqmmica (IHC), o inmunofluorescencia (IF).
La citometna de flujo (FC) puede emplearse para determinar la expresion de polipeptido de quinasa ALK mutante en un tumor de mairnfero antes, durante, y despues del tratamiento con un farmaco dirigido a inhibir la actividad de la quinasa ALK. Por ejemplo, las celulas tumorales de una muestra de medula osea se pueden analizar mediante citometna de flujo para determinar la expresion y/o la activacion del polipeptido de fusion de EML4-ALK o TFG-ALK, asf como para determinar marcadores que identifican tipos de celulas cancerosas, etc., si asf se desea. La citometna de flujo se puede llevar a cabo de acuerdo con metodos convencionales. Vease, p. ej., Chow et al, Citometry (Communications in Clinical Cytometry) 46: 72-78 (2001). Brevemente y a modo de ejemplo, se puede emplear el siguiente protocolo para el analisis citometrico: fijacion de las celulas con paraformaldehndo al 2% durante 10 minutos a 37°C seguido de permeabilizacion en metanol del 90% durante 30 minutos sobre hielo. A continuacion las celulas se pueden tenir con el anticuerpo espedfico del polipeptido de fusion de EML4-ALK o TFG-ALK primario, lavar y marcar con un anticuerpo secundario marcado con fluorescencia. Las celulas se posefan analizar despues en un citometro de flujo (p. ej., Beckman Coulter FC500) de acuerdo con los protocolos espedficos del aparato utilizado. Tal analisis identificana el nivel de polipeptido de fusion de EML4-ALK o TFG-ALK expresado en el tumor. Un analisis similar despues del tratamiento del tumor con un agente terapeutico inhibidor de ALK revelana la sensibilidad de un tumor que expresa el polipeptido de fusion de ALK al inhibidor selectivo de la quinasa ALK.
La tincion inmunohistoqmmica (IHC) tambien se puede emplear para determinar la expresion y/o estado de activacion del polipeptido de quinasa ALK mutante en un cancer de marnffero (p. ej., un tumor solido tal como CPCNP) antes, durante, y despues del tratamiento con un farmaco dirigido a inhibir la actividad de la quinasa ALK. La IHC se puede llevar a cabo de acuerdo con tecnicas bien conocidas. Vease, p. ej., ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Capftulo 10, Harlow y Lane Eds., Cold Spring Harbor Laboratory (1988). En resumen, y a modo de ejemplo, se prepara tejido incluido en parafina (p. ej., tejido tumoral de una biopsia) para la tincion inmunohistoqmmica mediante desparafinado de las secciones de tejido con xileno seguido de etanol; hidratacion en agua, despues PBS; desenmascaramiento del anrtgeno mediante calentamiento del portaobjetos en tampon de citrato de sodio; incubacion de las secciones en peroxido de hidrogeno; bloqueo en disolucion de bloqueo; incubacion del portaobjetos en anticuerpo para el polipeptido de fusion anti-EML4-ALK o anti-TFG-ALK primario y anticuerpo secundario; y, finalmente, deteccion utilizando metodo de avidina/biotina ABC de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Los analisis de inmunofluorescencia (IF) tambien se pueden emplear para determinar la expresion y/o el estado de activacion del polipeptido de quinasa ALK mutante en un cancer de mamffero antes, durante, y despues del tratamiento con un farmaco dirigido a inhibir la actividad de la quinasa ALK. La IF se puede llevar a cabo de acuerdo con tecnicas bien conocidas. Vease, p. ej., J.M. Polak y S. Van Noorden (1997) INTRODUCTION TO IMMUNOCYTOCHEMISTRY, 2s ed.; ROYAL MICROSCOPY SOCIETY MICROSCOPY HANDBOOK 37, Bioscientific/Springer-Verlag. En resumen, y a modo de ejemplo, se pueden fijar muestras de pacientes en paraformaldetndo seguido de metanol, bloquear con una solucion de bloqueo tal como suero de caballo, incubar con el anticuerpo primario contra el polipeptido de fusion de EML4-ALK o TFG-ALK seguido de un anticuerpo secundario marcado con un colorante fluorescente tal como Alexa 488 y analizar con un microscopio de epifluorescencia.
Los anticuerpos empleados en los analisis descritos anteriormente se pueden conjugar ventajosamente con colorantes fluorescentes (p. ej., Alexa 488, PE), u otras marcas, tales como puntos cuanticos, para su uso en analisis multiparametricos junto con otros anticuerpos de transduccion de la senal (p. ej., EGFR, fosfo-AKT, fosfo-Erk 1/2) y/o marcadores celulares (p. ej., citoqueratina).
Una variedad de otros protocolos, incluyendo el analisis de inmunoabsorcion ligado a enzimas (ELISA), radioinmunoanalisis (RIA), y clasificacion celular activada por fluorescencia (FAGS), para medir el polipeptido de quinasa ALK mutante es conocida en la tecnica y proporciona una base para el diagnostico de niveles alterados o anormales de la expresion polipeptido de fusion de EML4-ALK o TFG-ALK. Los valores normales o patron para la expresion de estos polipeptido de fusion se establecen mediante la combinacion de fluidos corporales o extractos de celulas tomados de sujetos mai^eras normales, preferiblemente seres humanos, con un anticuerpo para el polipeptido de fusion de EML4-ALK o TFG-ALK en condiciones adecuadas para la formacion de complejos. La
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cantidad de formacion de complejo patron se puede cuantificar por medio de diversos metodos, pero preferiblemente mediante metodos fotometricos. Las cantidades de polipeptido de fusion de EML4-ALK o TFG-ALK expresadas en sujetos, de control, y en muestras de enfermedad de tejidos de biopsia se comparan con los valores patron. La desviacion entre los valores patron y del sujeto establece los parametros para diagnosticar la enfermedad.
Analisis de peptidos y acidos nucleicos
Del mismo modo, se pueden preparar peptidos AQUA para la deteccion/cuantificacion del polipeptido de quinasa ALK mutante expresado en una muestra biologica que comprende celulas de un tumor y utilizarlos en analisis AQUA convencionales, como se ha descrito en detalle en la seccion E anterior. Por consiguiente, en algunas realizaciones preferidas de los metodos de la descripcion, el reactivo espedfico del polipeptido de fusion de ALK comprende un fosfopeptido marcado con un isotopo pesado (peptido AQUA) correspondiente a una secuencia peptidica que comprende la union por fusion de un polipeptido de fusion de EML4-ALK o de un polipeptido de fusion TFG-ALK, como se ha descrito anteriormente en la Seccion E.
Los reactivos de espedficos del polipeptido de ALK mutantes utiles en la practica de los metodos de la descripcion tambien pueden ser ARNm, oligonucleotidos o sondas de ADN que pueden hibridarse directamente con, y detectar, los transcritos de expresion de los polipeptidos de fusion o truncados en una muestra biologica. Tales sondas se comentan con detalle en la Seccion B anterior. En resumen, y a modo de ejemplo, se pueden sondear muestras de pacientes, fijadas con formalina, incluidas en parafina con una sonda de aRn marcada con fluorescema seguido de lavados con formamida, SSC y PBS y analisis con un microscopio de fluorescencia. Tambien se prefieren las sondas FISH, incluyendo las sondas de punto de rotura, que permiten la deteccion fluorescente de reordenamientos de genes, tales como las mutaciones por delecion de EML4-ALK en el cromosoma 2 (vease el Ejemplo 6).
Los polinucleotidos que codifican el polipeptido de quinasa ALK mutante tambien se pueden utilizar para propositos de diagnostico. Los polinucleotidos que se pueden utilizar incluyen secuencias de oligonucleotidos, moleculas de ARN y ADN antisentido, y PNA. Los polinucleotidos se pueden utilizar para detectar y cuantificar la expresion genica en tejidos de tumores solidos sometidos a biopsia en los que la expresion del polipeptido de fusion de EML4-ALK o TFG-ALK o del polipeptido de quinasa ALK activo truncado puede ser correlacionada con la enfermedad. Por ejemplo, se puede utilizar un analisis de diagnostico para distinguir entre la ausencia, presencia, y exceso de expresion del polipeptido de fusion de EML4-ALK o TFG-ALK, y para verificar la regulacion de los niveles del polipeptido de fusion de ALK durante la intervencion terapeutica.
En una realizacion preferida, se puede utilizar la hibridacion con sondas de PCR que son capaces de detectar secuencias de polinucleotidos, incluyendo secuencias genomicas, que codifican un polipeptido de fusion de ALK o un polipeptido de quinasa ALK truncado, o moleculas estrechamente relacionadas, para identificar secuencias de acido nucleico que codifican el polipeptido de ALK mutante. La construccion y el uso de tales sondas se describen en la Seccion B anterior. La especificidad de la sonda, ya sea elaborada a partir de una region altamente espedfica, p. ej., 10 nucleotidos unicos en la union por fusion, ya sea una region menos espedfica, p. ej., la region codificante 3', y la rigurosidad de la hibridacion o amplificacion (maxima, alta, intermedia o baja) determinara si la sonda identifica solo secuencias de origen natural que codifican el polipeptido de ALK mutante, alelos, o secuencias relacionadas.
Las sondas tambien se pueden utilizar para la deteccion de secuencias relacionadas, y deben contener preferiblemente al menos 50% de los nucleotidos de cualquiera de las secuencias codificantes del polipeptido de ALK mutante. Las sondas de hibridacion objeto de la descripcion pueden ser ADN o ARN y estar derivadas de las secuencias de nucleotidos de los SEQ ID NO: 2, 19, y 21, abarcando lo mas preferiblemente la union por fusion (veanse las Figuras 1A-C, el panel inferior y los SEQ iD NO: 7, 24, y 26), o de secuencias genomicas incluyendo el promotor, elementos potenciadores, intrones y de los polipeptidos EML-4, TFG, y ALK de origen natural, como se ha descrito adicionalmente en la Seccion B anterior.
Por ejemplo, se puede utilizar el polinucleotido de fusion de EML4-ALK de la descripcion en el analisis Southern o northern, transferencia puntual, u otras tecnologfas basadas en membranas; en tecnologfas de PCR; o en analisis con tiras reactivas, puncion, ELISA o chips que utilizan fluidos o tejidos de biopsias de pacientes para detectar la expresion alterada del polipeptido de aLk. Tales metodos cualitativos o cuantitativos son bien conocidos en la tecnica. En un aspecto concreto, las secuencias de nucleotidos que codifican un polipeptido de ALK mutante de la descripcion pueden ser utiles en analisis que detectan la activacion o la induccion de diversos tipos de cancer, incluyendo carcinomas de pulmon. Los polinucleotidos de ALK mutante se pueden marcar por medio de metodos convencionales, y anadir a una muestra de fluido o tejido de un paciente en condiciones adecuadas para la formacion de complejos de hibridacion. Despues de un penodo de incubacion adecuado, la muestra se lava y la senal se cuantifica y se compara con un valor patron. Si la cantidad de senal en la muestra obtenida mediante biopsia o extrafda esta significativamente alterada con respecto a la de una muestra de control comparable, las secuencias de nucleotidos se han hibridado con secuencias de nucleotidos en la muestra, y la presencia de niveles alterados de secuencias de nucleotidos que codifican el polipeptido de fusion de EML4-ALK o el polipeptido de quinasa ALK truncado en la muestra indica la presencia de la enfermedad asociada. Tales analisis tambien se pueden utilizar para evaluar la eficacia de un regimen de tratamiento terapeutico concreto en estudios con animales, en pruebas clmicas, o en el seguimiento del tratamiento de un paciente individual.
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Con el fin de proporcionar una base para el diagnostico de enfermedades caracterizadas por la expresion del polipeptido de quinasa ALK mutante, se establece un perfil normal o patron para expresion. Esto se puede lograr mediante la combinacion de fluidos corporales o extractos celulares tornados de sujetos normales, ya sean animales o seres humanos, con una secuencia, o un fragmento de la misma, que codifica un polipeptido de fusion de EML4- ALK o TFG-ALK, en condiciones adecuadas para la hibridacion o la amplificacion. La hibridacion patron se puede cuantificar comparando los valores obtenidos de sujetos normales con los de un experimento en el que se utiliza una cantidad conocida de un polinucleotido sustancialmente purificado. Los valores patron obtenidos a partir de muestras normales se pueden comparar con los valores obtenidos a partir de muestras de pacientes que son sintomaticos para la enfermedad. La desviacion entre los valores patron y del sujeto se utiliza para establecer la presencia de la enfermedad.
Una vez que se establece la enfermedad y se inicia un protocolo de tratamiento, se pueden repetir los analisis de hibridacion sobre una base regular para evaluar si el nivel de expresion en el paciente comienza a aproximarse al que se observa en el paciente normal. Los resultados obtenidos a partir de analisis sucesivos se pueden utilizar para demostrar la eficacia del tratamiento a lo largo de un penodo que oscila de varios dfas a meses.
Los usos diagnosticos adicionales para los polinucleotidos de ALK mutante de la descripcion pueden implicar la utilizacion de la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR), un formato de analisis preferido que es convencional para los expertos en la tecnica. Vease, p. ej., MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, segunda edicion, Sambrook, J., Fritsch, E.F. y Maniatis, T., eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York (1989). Los oligomeros para la PCR se pueden sintetizar qmmicamente, generarse enzimaticamente o producirse a partir de una fuente recombinante. Los oligomeros consistiran preferiblemente en dos secuencias de nucleotidos, una con orientacion efectora (5' a 3') y otra antisentido (3' a 5'), empleadas en condiciones optimizadas para la identificacion de un gen o afeccion espedficos. Los mismos dos oligomeros, conjuntos anidados de oligomeros, o incluso una reserva degenerada de oligomeros pueden emplearse en condiciones menos rigurosas para la deteccion y/o cuantificacion de secuencias de ADN o ARN estrechamente relacionadas.
Los metodos que tambien se pueden utilizar para cuantificar la expresion de un polipeptido de fusion de ALK o polipeptido de quinasa ALK truncado incluyen el radiomarcaje o la biotinilacion de nucleotidos, la amplificacion simultanea de un acido nucleico de control, y curvas patron sobre la que se interpolan los resultados experimentales (Melby et al., J. Immunol. Methods, 159: 235-244 (1993); Duplaa et al. Anal. Biochem. 229-236 (1993)). La velocidad de cuantificacion de multiples muestras se puede acelerar mediante la ejecucion del analisis en un formato ELISA en el que el oligomero de interes se presenta en varias diluciones y una respuesta espectrofotometrica o colorimetrica proporciona una cuantificacion rapida.
En otra realizacion de la descripcion, los polinucleotidos de ALK mutante de la descripcion, asf como la region genomica adyacente proxima y distante de ellos, se pueden utilizar para generar sondas de hibridacion que son utiles para el mapeo de la secuencia genomica de origen natural. Las secuencias se pueden mapear con respecto a un cromosoma concreto o a una region espedfica del cromosoma utilizando tecnicas bien conocidas. Tales tecnicas incluyen la hibridacion fluorescente in situ (FISH), FACS, o construcciones de cromosomas artificiales, tales como cromosomas artificiales de levadura, cromosomas artificiales bacterianos, construcciones P1 bacterianas o bibliotecas de ADNc de cromosomas individuales, como fue revisado por Price, C.M., Blood Rev. 7: 127-134 (1993), y Trask, B.J., Trends Genet. 7: 149-154 (1991).
En una realizacion preferida, se emplea FISH (como describen Verma et al. HUMAN CHROMOSOMES: A MANUAL OF BASIC TECHNIQUES, Pergamon Press, Nueva York, NY (1988)) y se puede correlacionar con otras tecnicas ffsica de mapeo de cromosomas y datos de mapas geneticos. Se pueden encontrar ejemplos de datos geneticos en 1994 Genome Issue of Science (265: 1981f). La correlacion entre la ubicacion del gen que codifica el polipeptido de fusion de EML4-ALK o TFG-ALK o el polipeptido de la quinasa ALK activo truncado sobre un mapa cromosomico ffsico y una enfermedad espedfica, o la predisposicion a una enfermedad espedfica, pueden ayudar a delimitar la region de ADN asociada con esa enfermedad genetica. Las secuencias de nucleotidos de la descripcion sujeto se pueden utilizar para detectar diferencias en las secuencias genicas entre individuos normales, portadores, o afectados. Se pueden emplear sondas FISH punto de rotura de dos colores, por ejemplo, para detectar la presencia o ausencia de genes de EML-4, TFG, y/o ALK mutantes en una muestra.
La hibridacion in situ de preparaciones cromosomicas y las tecnicas ffsicas de mapeo tales como el analisis de ligamiento utilizando marcadores cromosomicos establecidos se puede utilizar para ampliar los mapas geneticos. A menudo la ubicacion de un gen sobre el cromosoma de otra especie de mairnfero, tal como raton, puede revelar marcadores asociados incluso si el numero o el brazo de un cromosoma humano concreto no es conocido. Se pueden asignar nuevas secuencias a los brazos cromosomicos, o porciones de los mismos, mediante mapeo ffsico. Esto proporciona una informacion valiosa a los investigadores en busca de genes de enfermedades utilizando clonacion posicional u otras tecnicas de descubrimiento de genes. Una vez que la enfermedad o el smdrome han sido localizados groseramente mediante ligamiento genetico a una region genomica concreta, por ejemplo, AT a 11q22-23 (Gatti et al., Nature 336: 577-580 (1988)), cualquiera de las secuencias asignada a esa zona puede representar genes asociados o reguladores para una investigacion adicional. La secuencia de nucleotidos de la descripcion sujeto tambien se puede utilizar para detectar diferencias en la localizacion cromosomica debido a translocacion, inversion, etc., entre individuos normales, portadores, o afectados.
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Otros metodos adecuados para la deteccion de acidos nucleicos, tales como sondas de oligonucleotidos conjugadas de union al surco menor (vease, p. ej., la Patente de los Estados Unidos Num. 6.951.930, "Hybridization-Triggered Fluorescent Detection of Nucleic Acids ") son conocidos por los expertos en la tecnica.
Muestras biologicas
Las muestras biologicas utiles en la practica de los metodos de la descripcion se pueden obtener de cualquier mairnfero en el que esta presente o en desarrollo un cancer caracterizado por la expresion de un polipeptido de fusion de EML4-ALK o TFG-ALK. En una realizacion, el mai^ero es un ser humano, y el ser humano puede ser un candidato para un agente terapeutico inhibidor de ALK para el tratamiento de un cancer, p. ej., CPCNP. El candidato humano puede ser un paciente que esta siendo tratado actualmente con, o esta siendo considerado para el tratamiento con, un inhibidor de la quinasa ALK, tal como WHI-131 y/o WHI-154. En otra realizacion, el marnffero es un animal grande, tal como un caballo o una vaca, mientras que en otras realizaciones, el mamffero es un animal pequeno, tal como un perro o un gato, todos los cuales son conocidos por desarrollar canceres, incluyendo carcinomas de pulmon.
Cualquier muestra biologica que comprende celulas (o extractos de celulas) de un cancer de mamffero es adecuada para su uso en los metodos de la descripcion. En el caso del polipeptido de fusion de EML-ALK, cualquier tipo de cancer, ya sea solido o no solido, sera adecuado. En el caso de TFG-ALK, los tumores solidos estan dentro del alcance de los metodos de la descripcion. Por ejemplo, la muestra biologica puede comprender celulas obtenidas de una efusion, tal como una efusion pleural. Se sabe que las efusiones pleurales (lfquido que se forma fuera del pulmon en la cavidad toracica y que contiene celulas cancerosas) se forman en muchos pacientes con cancer de pulmon avanzado (incluyendo CPCNP), y la presencia de tal efusion es predictiva de un resultado desfavorable y un corto tiempo de supervivencia. Los mecanismos convencionales para la obtencion de muestras de efusion pleural se han descrito y son bien conocidos en la tecnica (vease Sahn, Clin Chest Med. 3(2): 443-52 (1982)). Tambien se pueden obtener celulas tumorales circulantes a partir de suero utilizando marcadores tumorales, marcadores de la protema citoqueratina u otros metodos de seleccion negativa como se ha descrito (vease Ma et al., Anticancer Res. 23(1A): 49-62 (2003)). Las muestras de suero y de medula osea pueden ser particularmente preferidas para los pacientes con leucemia. Para los canceres que implican tumores solidos, tales como sarcomas y carcinomas, la muestra biologica puede comprender celulas obtenidas de una biopsia de tumor, que se puede obtener de acuerdo con tecnicas clmicas convencionales. Por ejemplo, se ha observado la expresion aberrante de ALK en un espectro de canceres, incluidos neuroblastomas y cancer neuroectodermico. Vease, p. ej., Pulford et al., mas arriba. El mutante por translocacion de TFG-ALK, sin embargo, solo se ha descrito en linfoma y no observado previamente en tumores solidos.
Una muestra biologica puede comprender celulas (o extractos de celulas) de un cancer en el se expresa y/o activa que un polipeptido de fusion de ALK, pero no la quinasa ALK de tipo salvaje. Alternativamente, la muestra puede comprender celulas de un cancer en el que se expresan y/o activan tanto el polipeptido de ALK mutante como la quinasa ALK de tipo salvaje, o en el que se expresan y/o activan la quinasa aLk y/o EML-4 y/o TFG de tipo salvaje pero no el polipeptido de ALK mutante.
Los extractos celulares de las muestras biologicas anteriores se pueden preparar, en bruto o parcialmente (o totalmente) purificados, de acuerdo con tecnicas convencionales, y se pueden utilizar en los metodos de la descripcion. Alternativamente, se pueden utilizar muestras biologicas que comprenden celulas completas en formatos de analisis preferidos tales como inmunohistoqmmica (IHC), citometna de flujo (FC), inmunofluorescencia (IF), e hibridacion fluorescente in situ (FISH) como se ha descrito adicionalmente mas arriba. Tales analisis de celulas completas son ventajosos ya que minimizan la manipulacion de la muestra de celulas tumorales y por lo tanto reducen los riesgos de alteracion del estado de senalizacion/activacion in vivo de las celulas y/o introducir senales artefacto. Los analisis de celulas completas tambien son ventajosos ya que caracterizan la expresion y la senalizacion unicamente en celulas tumorales, en lugar de una mezcla de celulas tumorales y normales.
Al poner en practica el metodo descrito para determinar si un compuesto inhibe la progresion de un tumor caracterizado por un gen de fusion y/o un polipeptido de fusion de EML4-ALK o TFG-ALK, tambien se pueden emplear ventajosamente muestras biologicas que comprenden celulas de modelos de trasplante o xenoinjertos de medula osea de mamnferos. Los xenoinjertos preferidos (o receptores de trasplante) son marnfferos pequenos, tales como ratones, que albergan tumores humanos que expresan un polipeptido de quinasa ALK mutante. Los xenoinjertos que albergan tumores humanos son bien conocidos en la tecnica (vease Kal, Cancer Treat Res. 72: 155-69 (1995)) y la produccion de xenoinjertos de mai^eras que albergan tumores humanos esta bien descrita (vease Winograd et al., In vivo. 1(1): 1-13 (1987)). De un modo similar estan bien descritos la generacion y el uso de modelos de trasplante de medula osea (veanse, p. ej., Schwaller, et al, EMBO J. 17: 5321-333 (1998); Kelly et al, Blood 99: 310-318 (2002)). Por "cancer caracterizado por" un polinucleotido de fusion y/o un polipeptido de fusion de EML4-ALK o TFG-ALK se quiere significar un cancer en el que estan presentes tal gen y/o polipeptido expresado de ALK mutante, en comparacion con un cancer en el que no estan presentes tal gen de fusion y/o polipeptido de fusion.
En la evaluacion de la presencia del polinucleotido o la expresion del polipeptido de ALK mutante en una muestra biologica que comprende celulas de un tumor de cancer de marnffero, se puede emplear de manera deseable una
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muestra de control que representa una celula en la que no se producen tales translocacion y/o protema de fusion para fines comparativos. idealmente, la muestra de control comprende celulas de un subgrupo de cancer concreto (p. ej., CPCNP) que es representativo del subgrupo en el que no se produce la mutacion (p. ej., mutacion por delecion de EML4-ALK) y/o no se expresa el polipeptido de fusion. La comparacion del nivel en la muestra de control frente a la muestra biologica de ensayo identifica de ese modo si esta/estan presentes el polinucleotido y/o el polipeptido de ALK mutante. Alternativamente, puesto que polinucleotido y/o polipeptido de fusion de EML4-ALK y/o TFG-ALK pueden no estar presentes en la mayona de los canceres, cualquier tejido que no exprese de manera similar tal polipeptido de ALK mutante (o albergue el polinucleotido mutante) se puede emplear como control.
Los metodos descritos a continuacion tendran utilidad de diagnostico valiosa para los canceres caracterizados por el polinucleotido y/o polipeptido de ALK mutante, y las decisiones de tratamiento correspondientes a la misma. Por ejemplo, las muestras biologicas se pueden obtener de un sujeto al que no se ha diagnosticado previamente que tiene un cancer caracterizado por una mutacion por delecion y/o un polipeptido de fusion de EML4-ALK, ni tampoco se ha sometido a un tratamiento para tal cancer, y el metodo se emplea para identificar diagnosticamente un tumor en tal sujeto como perteneciente a un subgrupo de tumores (p. ej., CpNM) en el que esta presente y/o se expresa un polinucleotido y/o polipeptido de fusion de EML4-ALK. Los metodos de la descripcion tambien se pueden emplear para controlar la progresion o la inhibicion de un cancer que expresa el polipeptido de quinasa ALK mutante despues del tratamiento de un sujeto con una composicion que comprende un agente terapeutico o una combinacion de agentes terapeuticos inhibidores de quinasa ALK.
Semejante analisis de diagnostico se puede llevar a cabo despues de o antes de los procedimientos de evaluacion preliminar o vigilancia quirurgica. El metodo de identificacion de la descripcion se puede emplear ventajosamente como diagnostico para identificar pacientes que tienen cancer, tales como CPCNP, dirigido por las protemas de fusion de EML4-ALK y/o TFG-ALK o por la quinasa ALK truncada, cuyos pacientes sena muy probable que respondieran a agentes terapeuticos dirigidos a inhibir la actividad de la quinasa ALK, tales como WHI-131 y/o WHI- 154 o sus analogos. La capacidad para seleccionar tales pacientes sena tambien util en la evaluacion clmica de la eficacia de futuros agentes terapeuticos dirigidos ALK asf como en la prescripcion futura de tales farmacos a los pacientes.
Diagnostico
La capacidad de identificar selectivamente canceres en los que esta/estan presentes un polinucleotido de fusion y/o polipeptido de fusion de EML4-ALK y/o TFG-ALK permite importantes nuevos metodos para identificar con precision tales tumores con fines diagnosticos, asf como obtener informacion util en la determinacion de si es probable que un tumor de este tipo responda a una composicion terapeutica inhibidora de ALK, o es probable que sea parcialmente o totalmente insensible a un inhibidor dirigido a una quinasa diferente cuando se administra como un agente unico para el tratamiento del cancer.
Por consiguiente, en una realizacion, la descripcion proporciona un metodo para detectar la presencia de un polinucleotido de ALK mutante y/o su polipeptido de ALK mutante codificado en una muestra biologica de un cancer de mairnfero, comprendiendo dicho metodo las etapas de:
(a) obtener una muestra biologica de un cancer de mai^ero; y
(b) utilizar al menos un reactivo que detecta un polinucleotido de fusion, o su polipeptido de fusion codificado, que comprende parte de ALK con parte de una protema secundaria para determinar si un polinucleotido mutante de ALK y/o su polipeptido de ALK mutante codificado estan presentes en dicha biologica muestra.
En algunas realizaciones preferidas, el cancer es un tumor solido sarcoma o carcinoma, mientras que en otra realizacion el carcinoma es un carcinoma de pulmon, tal como CPCNP. En otra realizacion preferida, el polipeptido de ALK mutante es un polipeptido de fusion que comprende los residuos 1116-1383 de ALK (SEQ ID NO: 5) con una porcion de dicha protema secundaria. En otra realizacion preferida, la protema secundaria se selecciona del grupo que consiste en EmL-4 (SEQ ID NO: 3) y la protema del Gen Fusionado a TRK (TFG) (SEQ ID NO: 22). En otra realizacion preferida adicional, el polipeptido de fusion comprende los residuos 1-233 o los residuos 1 a 495 de EML- 4 (SEQ ID NO: 3) o los residuos 1-138 de TFG (SEQ ID NO: 22).
En otras realizaciones preferidas, el polinucleotido de fusion comprende un polinucleotido de fusion de EML4-ALK (SEQ ID NO: 2 o 19) o un polinucleotido de fusion de TFG-ALK (SEQ ID nO: 21) mientras que en otra realizacion preferida adicional el polipeptido de fusion comprende un polipeptido de fusion de EML4-ALK (SEQ ID NO: 1 o 18) o un polipeptido de fusion de TFG-ALK (SEQ ID NO: 20). En otra realizacion preferida mas, el polinucleotido de fusion es un polinucleotido o polipeptido de fusion de EML4-ALK descritos anteriormente.
En mas realizaciones preferidas, el metodo emplea un reactivo que comprende un polinucleotido de fusion de EML4- ALK y/o al menos un reactivo espedfico del polipeptido de fusion de EML4-ALK (anticuerpo o peptido AQUA), como se ha descrito anteriormente. En algunas realizaciones preferidas, el reactivo comprende un reactivo aislado que se une espedficamente a, o detecta, un polipeptido de fusion de TFG-ALK (SEQ ID NO: 20) o un polinucleotido de fusion TFG-ALK (SEQ ID NO: 21), pero no se une a, ni detecta, TFG de tipo salvaje ni ALK de tipo salvaje. En otras realizaciones preferidas, el reactivo es una sonda para la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) de una sonda
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de hibridacion fluorescente in situ (FISH). Ciertas realizaciones preferidas emplean un peptido marcado con isotopo pesado (AQUA) que comprende la secuencia de aminoacidos de la union por fusion de polipeptido de fusion de TFG-ALK o un punto de truncamiento dentro de ALK de tipo salvaje.
En algunas realizaciones preferidas, los metodos de diagnostico de la descripcion se implementan en un formato de analisis de citometna de flujo (FC), inmunohistoqmmica (IHC), o inmuno-fluorescencia (IF), como se ha descrito anteriormente. En otra realizacion preferida, se detecta la actividad del polipeptido de fusion de EML4-ALK o TFG- ALK. En otras realizaciones preferidas, los metodos de diagnostico de la descripcion se implementan en un formato de analisis de hibridacion fluorescente in situ (FISH) o de reaccion en cadena de la polimerasa (PCR), como se ha descrito anteriormente.
La descripcion proporciona adicionalmente un metodo para determinar si un compuesto inhibe la progresion de un cancer caracterizado por un polinucleotido de fusion y/o polipeptido de fusion de EML4-ALK o TFG-ALK, comprendiendo dicho metodo la etapa de determinar si dicho compuesto inhibe la expresion y/o actividad de dicho polipeptido de fusion de EML4-ALK o TFG-ALK en dicho cancer. En una realizacion preferida la inhibicion de la expresion y/o actividad del polipeptido de fusion de ALK se determina utilizando al menos un reactivo que detecta un polinucleotido o polipeptido de fusion de EML4-ALK de la descripcion y/o un polinucleotido o polipeptido de fusion de TFG-ALK descrito en la presente memoria. Los compuestos adecuados para la inhibicion de la actividad de la quinasa ALK se comentan con mas detalle en la Seccion G a continuacion.
Sondas polinucleotidicas de ALK mutante y los reactivos espedficos del polipeptido utiles en la practica de los metodos de la descripcion se describen con mas detalle en las secciones B y D anteriores. En una realizacion preferida, el reactivo espedfico del polipeptido de fusion de ALK comprende un anticuerpo espedfico del polipeptido fusion. En otra realizacion preferida, el reactivo espedfico del polipeptido de fusion comprende un fosfopeptido marcado con un isotopo pesado (peptido AQUA) que corresponde a la union por fusion de un polipeptido de fusion de ALK (veanse las Figuras lA-C (panel inferior)). En otra realizacion preferida, el reactivo espedfico del polinucleotido de fusion comprende una sonda FISH que corresponde a la union por fusion de un gen de fusion de ALK y/o puntos de rotura de los genes de EML4, TFG, o ALK de tipo salvaje.
Los metodos de la descripcion descritos anteriormente tambien pueden comprender opcionalmente la etapa de determinar el nivel de expresion o activacion de otras quinasas, tales como ALK y EGFR de tipo salvaje, o de otras moleculas de senalizacion aguas abajo en dicha muestra biologica. El perfilado tanto de la expresion/activacion del polipeptido de fusion de ALK como de la expresion/activacion de otras quinasas y rutas en una muestra biologica dada puede proporcionar informacion valiosa sobre que quinasas y rutas estan dirigiendo la enfermedad, y por lo tanto que regimen terapeutico es probable que sea el de mayor beneficio.
Escrutinio de compuestos
El descubrimiento de los polipeptidos de fusion de EML4-ALK novedosos descritos en la presente memoria tambien permite el desarrollo de nuevos compuestos que inhiben la actividad de esta protema de ALK mutante, en particular su actividad de la quinasa ALK. Por consiguiente, la descripcion tambien proporciona, en parte, un metodo para determinar si un compuesto inhibe la progresion de un cancer caracterizado por un polinucleotido de fusion y/o polipeptido de fusion de EML4-ALK, comprendiendo dicho metodo la etapa de determinar si dicho compuesto inhibe la expresion y/o actividad de dicho polipeptido de fusion de EML4-ALK en dicho cancer. En una realizacion preferida, la inhibicion de la expresion y/o actividad del polipeptido de fusion de EML4-ALK se determina utilizando al menos un reactivo que detecta un polinucleotido de fusion y/o polipeptido de fusion de la descripcion. Los reactivos preferidos de la descripcion se han descrito anteriormente. Los compuestos adecuados para la inhibicion de la actividad de la quinasa ALK se describen en mas detalle en la Seccion G a continuacion.
El compuesto puede, por ejemplo, ser un inhibidor de quinasa, tal como un inhibidor de molecula pequena o anticuerpo inhibidor. Este puede ser un pan-inhibidor de quinasa con actividad contra varias quinasas diferentes, o un inhibidor espedfico de una quinasa. Los compuestos inhibidores de quinasa ALK se comentan con mas detalle en la Seccion G de mas abajo. Las muestras biologicas de los pacientes se pueden tomar antes y despues del tratamiento con el inhibidor y despues analizarse, utilizando los metodos descritos anteriormente, para determinar el efecto biologico del inhibidor sobre la actividad de la quinasa ALK, incluyendo la fosforilacion de la protema sustrato aguas abajo. Tal analisis farmacodinamico puede ser util en la determinacion de la dosis biologicamente activa del farmaco que puede ser preferible a una dosis maxima tolerable. Tal informacion tambien sena util en las presentaciones para la aprobacion de farmacos mediante la demostracion del mecanismo de accion del farmaco. La identificacion de los compuestos con tales caractensticas inhibidoras deseadas se describen adicionalmente en la Seccion G de mas abajo.
G. Inhibicion terapeutica de canceres
De acuerdo con la presente invencion, se ha demostrado ahora que la progresion de un cancer de tumor solido de mairnfero (CPCNP) en el que se expresa la protema de fusion de EML4-ALK puede ser inhibida, in vivo, mediante la inhibicion de la actividad de la quinasa ALK de tal cancer. De un modo similar al descrito en la presente memoria, la
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actividad de un cancer de tumor solido de mairnfero en el que se expresa la protema de fusion de TFG-ALK puede ser inhibida de manera similar, in vivo, mediante la inhibicion de la actividad de la quinasa ALK de tal cancer. La actividad ALK en los canceres caracterizados por la expresion de un polipeptido de aLk mutante puede ser inhibida poniendo en contacto el cancer (p. ej., un tumor) con un agente terapeutico inhibidor de la quinasa ALK, tal como un inhibidor de quinasa de molecula pequena como WHI-131 o WHI-154. Como se describe adicionalmente en el Ejemplo 2 a continuacion, la inhibicion del crecimiento de tumores que expresan la protema de fusion de ALK, por ejemplo, puede llevarse a cabo mediante la inhibicion de la quinasa de fusion utilizando un tipo ilustrativo de agente terapeutico inhibidor de ALK, ARNip. Por consiguiente, la descripcion proporciona, en parte, un inhibidor de ALK para usar en la inhibicion de la progresion de un cancer que expresa el polipeptido de fusion de EML4-ALK mediante la inhibicion de la expresion y/o actividad de la quinasa ALK mutante en el cancer.
Un agente terapeutico inhibidor de la quinasa ALK puede ser cualquier composicion que comprende al menos un compuesto, biologico o qmmico, que inhibe, directa o indirectamente, la expresion y/o actividad de la quinasa ALK in vivo, incluyendo las clases ilustrativas de compuestos descritas a continuacion. Tales compuestos incluyen agentes terapeuticos que actuan directamente sobre la propia quinasa ALK, o sobre protemas o moleculas que modifican la actividad de ALK, o que actuan indirectamente mediante la inhibicion de la expresion de ALK. Tales composiciones tambien pueden incluir composiciones que comprenden solamente un unico compuesto inhibidor de la quinasa ALK, asf como composiciones que comprenden multiples agentes terapeuticos (incluyendo aquellos contra otras RTK), que tambien pueden incluir un agente terapeutico no espedfico como agente quimioterapeutico o inhibidor general de la transcripcion.
Inhibidores de molecula pequena
Un agente terapeutico inhibidor de ALK util en la invencion es un inhibidor de pequena molecula dirigido, tal como WHI-131 y WHI-154, o sus analogos. WHI-131 y WHI-154 son inhibidores de aLk espedficos de molecula pequena de tipo quinazolina, y sus propiedades han sido descritas. Vease Marzec et al., Lab. Invest. 85(12): 1544-54 (2005). Se ha demostrado que estos compuestos inducen la apoptosis y suprimen la proliferacion en celulas de linfoma. Otros inhibidores de quinasas espedficos de molecula pequenas son bien conocidos en la tecnica. Por ejemplo, Gleevec® (STI-571, imatinib), que se une espedficamente a, y bloquea el sitio de union a ATP de la quinasa de fusion BCR-ABL (asf como otras quinasas) impidiendo de este modo la fosforilacion y la activacion de esta enzima, se encuentra disponible en el mercado y sus propiedades son bien conocidas. Vease, p. ej., Dewar et al., Blood 105(8): 3127-32 (2005). Otros inhibidores de aLk de molecula pequena estan actualmente en desarrollo por Novartis, Inc., y Cephalon, Inc.
Los inhibidores espedficos de molecula pequena son una clase de moleculas que inhiben tfpicamente la actividad de su enzima diana uniendose espedficamente, y a menudo de forma irreversible, al sitio catalttico de la enzima, y/o uniendose a una hendidura de union a ATP u otro sitio de union dentro de la enzima que impide que la enzima adopte una conformacion necesaria para su actividad. Los inhibidores de molecula pequena pueden ser disenados racionalmente utilizando el modelado cristalografico de rayos X o por ordenador de la estructura tridimensional de la quinasa ALK, o se pueden encontrar mediante escrutinio de alto rendimiento de bibliotecas de compuestos para la inhibicion de ALK. Tales metodos son bien conocidos en la tecnica, y han sido descritos. La especificidad de la inhibicion de ALK puede confirmarse, p. ej., examinando la capacidad de dicho compuesto para inhibir la actividad de ALK, pero no otra actividad quinasa, en un panel de quinasas, y/o examinando la inhibicion de la actividad de ALK en una muestra biologica que comprende celulas de carcinoma de pulmon, como se ha descrito anteriormente. Tales metodos de escrutinio se describen adicionalmente mas adelante.
Anticuerpo inhibidores
Los agentes terapeuticos inhibidores de quinasas ALK utiles en la invencion tambien pueden ser anticuerpos dirigidos que se unen espedficamente a sitios o dominios catalfticos o de union cnticos necesarios para la actividad de ALK, e inhiben la quinasa bloqueando el acceso de ligandos, sustratos o moleculas secundarias para ALK, y/o evitando que la enzima adopte una conformacion necesaria para su actividad. La produccion, escrutinio y/o uso terapeutico de anticuerpos humanizados espedficos de dianas han sido bien descritos. Vease Merluzzi et al., Adv Clin Path. 4(2): 77-85 (2000). Se encuentran disponibles tecnologfas y sistemas comerciales, tales como Morphosys, Inc.'s Human Combinatorial Antibody Library (HuCAL®), para la generacion y el escrutinio de alto rendimiento de anticuerpos humanizados inhibidores espedficos de dianas.
Se ha descrito la produccion de diversos anticuerpos dirigidos anti-quinasas receptoras y su uso para inhibir la actividad del receptor elegido como diana. Veanse, p. ej., la Publicacion de Patente de los Estados Unidos Num. 20040202655, "Antibodies to IgF-I Receptor for the Treatment of Cancers", 14 de Octubre de 2004, Morton et al.; Publicacion de Patente de los Estados Unidos Num. 20040086503, "Human anti-Epidermal Growht Factor Receptor Single-Chain Antibodies", 15 de Abril de 2004, Raisch et al.; Publicacion de Patente de los Estados Unidos Num. 20040033543, "Treatment of Renal Carcinoma Using Antibodies Using Antibodies Against EGFr," 19 de Febrero de 2004, Schwab et. al. Los metodos normalizados para la produccion y el uso de anticuerpos inhibidores de la actividad tirosina quinasa receptora son conocidos en la tecnica. Vease, p. ej., la Patente Europea Num. EP1423428, "Antibodies that Block Receptor Tyrosine Kinase Activation, Methods of Screening for and Uses Thereof', 2 de Junio de 2004 Borges et al.
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Tambien se pueden emplear los enfoques de presentacion de fagos para generar anticuerpos inhibidores espedficos de ALK, y protocolos para la construccion de la biblioteca de bacteriofagos y la seleccion de anticuerpos recombinantes se proporcionan en el texto de referencia bien conocido CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Colligan et al. (Eds.), John Wiley & Sons, Inc. (1992-2000), Capftulo 17, Seccion 17.1. Veanse tambien la Patente de los Estados Unidos Num. 6.319.690, 20 de Noviembre de 2001, Little et al.; la Patente de los Estados Unidos Num. 6.300.064, 9 de Octubre de 2001, Knappik et al.; la Patente de los Estados Unidos Num. 5.840.479, 24 de Noviembre de 1998, Little et al.; la Publicacion de Patente de los Estados Unidos Num. 20030219839, 27 de Noviembre de 2003, Bowdish et al.
Se puede producir una biblioteca de fragmentos de anticuerpos presentados en la superficie de bacteriofagos (vease, p. ej., la Patente de los Estados Unidos Num. 6.300.064, 9 de Octubre de 2001, Knappik et al.) y se puede escrutar para determinar la union a una forma dimerica soluble de una protema tirosina quinasa receptoras (como ALK). Un fragmento de anticuerpo que se une a la forma dimerica soluble de la RTK utilizado para el escrutinio se identifica como una molecula candidato para bloquear la activacion constitutiva de la RTK diana en una celula. Vease la Patente Europea Num. EP1423428, Borges et al., mas arriba.
Los anticuerpos dirigidos a la union de ALK identificados en el escrutinio de bibliotecas de anticuerpos como se ha descrito anteriormente se puede escrutar adicionalmente a continuacion para determinar su capacidad para bloquear la actividad de ALK, tanto en un analisis de quinasa in vitro como en lmeas celulares y/o tumores in vivo. La inhibicion de ALK puede confirmarse, por ejemplo, examinando de la capacidad de tal agente terapeutico de anticuerpo para inhibir la actividad de la quinasa ALK, pero no otra actividad quinasa, en un panel de quinasas, y/o examinando la inhibicion de la actividad de ALK en una muestra biologica que comprende celulas de cancer, como se ha descrito anteriormente. Los metodos para el escrutinio de tales compuestos para la inhibicion de la quinasa ALK se describen mas arriba.
Inhibidores indirectos
Los compuestos inhibidores de ALK utiles en la practica de los metodos descritos tambien pueden ser compuestos que inhiben indirectamente la actividad de ALK mediante la inhibicion de la actividad de protemas o moleculas distintas de la propia quinasa ALK. Tales agentes terapeuticos inhibidores pueden ser inhibidores dirigidos que modulan la actividad de quinasas reguladoras clave que fosforilan o desfosforilan (y por lo tanto activan o desactivan) la propia ALK, o interfieren en la union de ligandos. Al igual que con otras tirosina quinasas receptoras, ALK regula la senalizacion aguas abajo a traves de una red de protemas adaptadoras y quinasas aguas abajo, incluyendo STAT5 y AKT. Como resultado, la induccion del crecimiento y la supervivencia celulares por la actividad de ALK puede inhibirse eligiendo como diana estas protemas que interactuan o aguas abajo. Los farmacos actualmente en desarrollo que podnan usarse de esta manera incluyen la Wartmanina.
La actividad de la quinasa ALK tambien se puede inhibir indirectamente mediante el uso de un compuesto que inhibe la union de una molecula activadora necesaria para que ALK adopte su conformacion activa. Del mismo modo, por ejemplo, se han descrito la produccion y el uso de anticuerpos anti-PDGF para regular a la baja la tirosina quinasa receptora de PDGF. Vease la Publicacion de Patente de los Estados Unidos Num. 20030219839, "Anti-PDGF Antibodies and Methods for Producing Engineered Antibodies," Bowdish et al.
Los inhibidores indirectos de la actividad de ALK se pueden disenar racionalmente utilizando modelado cristalografico de rayos X o por ordenador de la estructura tridimensional de ALK, o se pueden encontrar mediante escrutinio de alto rendimiento de bibliotecas de compuestos para la inhibicion de enzimas reguladoras clave aguas arriba y/o moleculas de union necesarias, que da como resultado la inhibicion de la actividad de la quinasa ALK. Tales enfoques son bien conocidos en la tecnica, y se han descrito. La inhibicion de ALK por tales agentes terapeuticos se puede confirmar, por ejemplo, examinando la capacidad del compuesto para inhibir la actividad de ALK, pero no otra actividad quinasa, en un panel de quinasas, y/o examinando la inhibicion de la actividad de ALK en una muestra biologica que comprende celulas cancerosas, p. ej., celulas de CPCNP, como se ha descrito anteriormente. Los metodos para la identificacion de compuestos que inhiben un cancer caracterizado por un polinucleotido de fusion y/o un polipeptido de fusion de EML4-ALK o TFG-ALK se describen adicionalmente mas adelante.
Inhibidores anti-sentido y/o de la transcripcion
Los agentes terapeuticos inhibidores de ALK tambien pueden comprender compuestos inhibidores anti-sentido y/o de la transcripcion que inhiben la actividad de la quinasa ALK mediante el bloqueo de la transcripcion del gen que codifica ALK y/o los genes de fusion de EML4-ALK o TFG-ALK o genes de ALK truncados. Por ejemplo, se ha descrito la inhibicion de diversas quinasas receptoras, incluyendo VEGFR, EGFR, e IGFR, y FGFR, por agentes terapeuticos antisentido para el tratamiento del cancer. Veanse, p. ej., las Patentes de los Estados Unidos Nums. 6.734.017; 6.710.174; 6.617.162; 6.340.674; 5.783.683; 5.610.288.
Los oligonucleotidos antisentido pueden ser disenados, construidos, y empleados como agentes terapeuticos contra genes diana de acuerdo con tecnicas conocidas. Veanse, p. ej. Cohen, J., Trends in Pharmacol. Sci. 10(11): 435437 (1989); Marcus-Sekura, Anal. Biochem. 172: 289-295 (1988); Weintraub, H., Sci. AM. pags. 40-46 (1990); Van
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Der Krol et al., BioTechniques 6(10): 958-976 (1988); Skorski et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1994) 91:4504-4508. Recientemente se ha descrito la inhibicion del crecimiento de carcinoma humano in vivo utilizando un inhibidor de ARN antisentido de EGFR. Vease la Publicacion de Patente de los Estados Unidos Num. 20040047847, "Inhibition of Human Squamous Cell Carcinoma Growth in vivo by Epidermal Growth Factor Receptor Antisense RNA Transcribed from a Pol III Promoter," 11 de Marzo de 2004, He et al. Del mismo modo, se puede preparar un agente terapeutico inhibidor de ALK que comprende al menos un oligonucleotido antisentido contra un gen de ALK de mairnfero (vease la Figura 4 (SEQ ID NO: 6)) o un polinucleotido de fusion de EML4-ALK o TFG-ALK o un polinucleotido de ALK truncado (veanse las Figuras 2A-C (SEQ ID NO: 2, 19, y 21)) de acuerdo con los metodos descritos anteriormente. Las composiciones farmaceuticas que comprenden compuestos antisentido inhibidores de ALK se pueden preparar y administrar como se describe adicionalmente a continuacion.
ARN de interferencia pequeno
Las composiciones de moleculas de ARN de interferencia pequeno (ARNip), que inhiben la traduccion, y por lo tanto la actividad de ALK a traves del proceso de interferencia de ARN, tambien se pueden emplear deseablemente en la invencion. La interferencia de ARN, y el silenciamiento selectivo de la expresion de la protema diana mediante la introduccion de moleculas pequenas exogenas de ARN de doble hebra que comprenden la secuencia complementaria al ARNm que codifica la protema diana, ha sido bien descrita. Veanse, p. ej. la Publicacion de Patente de los Estados Unidos Num. 20040038921, "Composition and Method for Inhibiting Expression of a Target Gene", 26 de febrero de 2004, Kreutzer et al.; Publicacion de Patente de los Estados Unidos Num. 20020086356, "RNA Sequence-Specific Mediators of RNA Interference", 12 de Junio, 2003, Tuschl et al.; la Publicacion de Patente de los Estados Unidos Num. 20040229266, "RNA Interference Mediating Small RNA Molecules," 18 de Noviembre de 2004, Tuschl et. al.
Por ejemplo, como se muestra en la presente (vease el Ejemplo 2), silenciamiento mediado por ARNip de la expresion de la protema de fusion de EML4-ALK en una lmea celular de CPCNP humano que expresa la protema de fusion inhibio selectivamente la progresion de la enfermedad en esas celulas, pero no en celulas de control que no expresan la protema de ALK mutante.
Se ha demostrado que las moleculas de ARN de doble hebra (ARNdh) bloquean la expresion genica en un mecanismo regulador muy conservado conocido como interferencia de ARN (ARNi). Brevemente, la RNasa III Dicer procesa el ARNdh a ARN de interferencia pequenos (ARNip) de aproximadamente 22 nucleotidos, que sirven como secuencias grna para inducir la escision del ARNm espedfica de la diana por un complejo de silenciamiento inducido por ARN RISC (vease Hammond y otros, Nature (2000) 404: 293-296). El ARNi implica una reaccion de tipo catalttico por medio de la cual se generan nuevos ARNip a traves de la escision sucesiva de ARNdh mas largo. De este modo, a diferencia del antisentido, el ARNi degrada el ARN diana de una manera no estequiometrica. Cuando se administra a una celula u organismo, se ha demostrado que el ARNdh exogeno dirige la degradacion espedfica de la secuencia del ARN mensajero endogeno (ARNm) a traves del ARNi.
En la actualidad se encuentra disponible en el mercado una amplia variedad de productos de ARNip espedficos de dianas, que incluyen vectores y sistemas para su expresion y su uso en celulas de mamfferos. Vease, p. ej., Promega, Inc. (promega.com); Dharmacon, Inc. (dharmacon.com). Se encuentran disponibles manuales tecnicos detallados sobre el diseno, construccion y uso de ARNdh para ARNi. Vease, p. ej., Dharmacon's "RNAi Technical Reference & Application Guide"; Promega's "RNAi: A Guide to Gene Silencing." Los productos de ARNip inhibidores de ALK tambien se encuentran disponibles en el mercado, y pueden emplearse adecuadamente en la invencion. Vease, p. ej. Dharmacon, Inc., Lafayette, CO (Nums. de Cat. M-003162-03, MU-003162-03, D-003162-07 a -10 (ARNip siGENOME™ SMARTselection y SMARTpool®).
Se ha establecido recientemente que los ARNdh pequenos de menos de 49 nucleotidos de longitud, y preferiblemente de 19-25 nucleotidos, que comprenden al menos una secuencia que es sustancialmente identica a parte de una secuencia de ARNm diana, y cuyo ARNdh tiene de manera optima al menos un saliente de 1-4 nucleotidos en un extremo, son los mas eficaces en la mediacion de ARNi en mamnferos. Vease la Publicacion de Patente de los Estados Unidos Num. 20040038921, Kreutzer et al., mas arriba; la Publicacion de Patente de los Estados Unidos Num. 20040229266, Tuschl et al., mas arriba. La construccion de tales ARNdh, y su uso en preparaciones farmaceuticas para silenciar la expresion de una protema diana, in vivo, se describen en detalle en tales publicaciones.
Si se conoce la secuencia del gen que se va a elegir como diana en un marnffero, se puede producir ARN de 21-23 nt, por ejemplo, y se puede someter a ensayo para determinar su capacidad para mediar en ARNi en una celula de mamffero, tal como una celula humana o de otro primate. Esas moleculas de ARN de 21-23 nt que se ha demostrado que median en ARNi pueden someterse a ensayo, si se desea, en un modelo animal apropiado para evaluar adicionalmente su eficacia in vivo. Los sitios diana que se conocen, por ejemplo sitios diana que se ha determinado que son sitios diana eficaces basandose en estudios con otras moleculas de acido nucleico, por ejemplo ribozimas o antisentido, o aquellas dianas que se sabe que estan asociadas con una enfermedad o afeccion, tales como aquellos sitios que contienen mutaciones o deleciones, se pueden utilizar para disenar moleculas de ARNip que se dirigen tambien a estos sitios.
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Alternativamente, las secuencias de ARNdh eficaz se pueden disenar/predecir racionalmente escrutando el ARNm diana de interes para determinar los sitios diana, por ejemplo mediante el uso de un algoritmo de plegamiento por ordenador. La secuencia diana se puede analizar in silico en una lista de todos los fragmentos o subsecuencias de una longitud concreta, por ejemplo, fragmentos de 23 nucleotidos, utilizando un comando Perl adaptado o programas de analisis de secuencias comerciales tales como Oligo, MacVector o GCG Wisconsin Package.
Se pueden utilizar varios parametros para determinar que sitios son los sitios diana mas adecuados dentro de la secuencia de ARN diana. Estos parametros incluyen, pero no se limitan a la estructura secundaria o terciaria del ARN, la composicion de base de nucleotidos de la secuencia diana, el grado de homologfa entre diversas regiones de la secuencia diana, o la posicion relativa de la secuencia diana dentro del transcrito de ARN. Sobre la base de estas determinaciones, se puede seleccionar cualquier numero de sitios diana dentro del transcrito de ARN para escrutar las moleculas de ARNip para determinar la eficacia, por ejemplo, mediante el uso de analisis de escision del ARN in vitro, cultivo celular, o modelos animales. Vease, p. ej., la Publicacion de Patente de los Estados Unidos Num. 20030170891, 11 de Septiembre 2003, McSwiggen J. Tambien se ha descrito recientemente un algoritmo para la identificacion y la seleccion de sitios diana de ARNi. Vease la Publicacion de Patente de los Estados Unidos Num. 20040236517 "Selection of Target Sites for Antisense Attack of RNA," 25 de Noviembre de 2004, Drlica et al.
Las tecnicas de transferencia genica utilizadas comunmente incluyen metodos con fosfato de calcio, DEAE- dextrano, electroporacion y microinyeccion y virales (Graham et al. (1973) Virol. 52: 456; McCutchan et al., (1968)), J. Natl. Cancer Inst. 41: 351; Chu et al. (1987), Nucl. Acids Res. 15: 1311; Fraley et al. (1980), J. Biol. Chem. 255: 10431; Capecchi (1980), Cell 22: 479). El ADN tambien se puede introducir en las celulas usando liposomas cationicos (Felgner et al. (1987), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7413). Las formulaciones de lfpidos cationicos disponibles en el mercado incluyen Tfx 50 (Promega) o Lipofectamine 200 (Life Technologies). Alternativamente, los vectores virales se pueden emplear para liberar ARNdh en una celula y mediar en ARNi. Vease la Publicacion de Patente de los Estados Unidos Num. 20040023390, "ARNip-mediated Gene Silencing with Viral Vectors," 4 de Febrero de 2004, Davidson et al.
Los sistemas de transfeccion y de expresion con vectores para ARNi en celulas de mairnfero estan disponibles en el mercado y han sido bien descritos. Vease, p. ej., el sistema Dharmacon, Inc., DharmaFECT™; Promega, Inc., el sistema siSTRIKE™ U6 Hairpin; veanse tambien Gou et al. (2003) FEBS. 548, 113-118; Sui, G. et al. A DNA vector- based RNAi technology to suppress gene expression in mammalian cells (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. 99, 55155520; Yu et al. (2002) Proc. Natl. Acad Sci. 99, 6047-6052; Paul, C. et al. (2002) Nature Biotechnology 19, 505-508; McManus et al. (2002) RNA 8, 842-850.
La interferencia con ARNip en un marnffero utilizando moleculas de ARNdh preparadas se puede llevar a cabo a continuacion mediante la administracion de una preparacion farmaceutica que comprende el ARNdh al mamffero. La composicion farmaceutica se administra a una dosis suficiente para inhibir la expresion del gen diana. El ARNdh puede administrarse tfpicamente a una dosis de menos de 5 mg de ARNdh por kilogramo de peso corporal por dfa, y es suficiente para inhibir o suprimir la expresion del gen diana completamente. En general, una dosis adecuada de ARNdh estara en el intervalo de 0,01 a 2,5 miligramos por kilogramo de peso corporal del receptor por dfa, preferiblemente en el intervalo de 0,1 a 200 microgramos por kilogramo de peso corporal por dfa, mas preferiblemente en el intervalo de 0,1 a 100 microgramos por kilogramo de peso corporal por dfa, incluso mas preferiblemente en el intervalo de 1,0 a 50 microgramos por kilogramo de peso corporal por dfa, y lo mas preferiblemente en el intervalo de 1,0 a 25 microgramos por kilogramo de peso corporal por dfa. Una composicion farmaceutica que comprende el ARNdh se administra una vez al dfa, o en multiples subdosis, por ejemplo, utilizando formulaciones de liberacion sostenida bien conocidas en la tecnica. La preparacion y administracion de tales composiciones farmaceuticas pueden llevarse a cabo de acuerdo con tecnicas convencionales, como se describe adicionalmente a continuacion.
Tal ARNdh se puede utilizar despues para inhibir la expresion y la actividad de ALK en un cancer, preparando una preparacion farmaceutica que comprende una cantidad terapeuticamente eficaz de tal ARNdh, como se describe mas arriba, y administrando la preparacion a un sujeto humano que tiene un cancer que expresa la protema de fusion de EML4-ALK o TFG-ALK o la quinasa ALK activa truncada, por ejemplo, a traves de inyeccion directa en el tumor. Recientemente se ha descrito la inhibicion similar de otras tirosina quinasas receptoras, tales como VEGFR y EGFR utilizando inhibidores ARNip. Veanse la Publicacion de Patente de los Estados Unidos Num. 20040209832, 21 de Octubre de 2004, McSwiggen et al.; Publicacion de Patente de los Estados Unidos Num. 20030170891, 11 de Septiembre de 2003, McSwiggen; Publicacion de Patente de los Estados Unidos Num. 20040175703, 9 de Septiembre de 2004, Kreutzer et al.
Composiciones terapeuticas; Administracion.
Las composiciones terapeuticas inhibidoras de la quinasa ALK utiles en la invencion se pueden administrar a un mamffero mediante cualquier medio conocido en la tecnica incluyendo, pero no limitado a las rutas oral o peritoneal, incluyendo la administracion intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, subcutanea, transdermica, vfas respiratorias (aerosol), rectal, vaginal y topica (incluyendo bucal y sublingual).
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Para la administracion oral, se proporcionaran generalmente un agente terapeutico inhibidor de ALK en forma de comprimidos o capsulas, como polvo o granulos, o como una solucion o suspension acuosa. Los comprimidos para uso oral pueden incluir los ingredientes activos mezclados con excipientes farmaceuticamente aceptables tales como diluyentes inertes, agentes disgregantes, agentes aglutinantes, agentes lubricantes, agentes edulcorantes, agentes aromatizantes, agentes colorantes y conservantes. Los diluyentes inertes adecuados incluyen carbonato de sodio y de calcio, fosfato de sodio y de calcio, y lactosa, mientras que el almidon de mafz y el acido algmico son agentes disgregantes adecuados. Los agentes aglutinantes pueden incluir almidon y gelatina, mientras que el agente lubricante, si esta presente, sera generalmente estearato de magnesio, acido estearico o talco. Si se desea, los comprimidos pueden recubrirse con un material tal como monoestearato de glicerilo o diestearato de glicerilo, para retrasar la absorcion en el tracto gastrointestinal.
Las capsulas para uso oral incluyen capsulas de gelatina dura en las que el ingrediente activo se mezcla con un diluyente solido, y capsulas de gelatina blanda en las que los ingredientes activos se mezclan con agua o un aceite tal como aceite de cacahuete, parafina lfquida o aceite de oliva. Para uso intramuscular, intraperitoneal, subcutaneo e intravenoso, las composiciones farmaceuticas descritas en la presente memoria se proporcionaran generalmente en soluciones o suspensiones acuosas esteriles, tamponadas a un pH y una isotonicidad apropiados. Los vehmulos acuosos adecuados incluyen disolucion de Ringer y cloruro sodico isotonico. El portador puede consistir exclusivamente en un tampon acuoso ("exclusivamente" significa que no se encuentran presentes agentes auxiliares o sustancias encapsulantes que pudieran afectar o mediar la absorcion del agente terapeutico inhibidor de ALK). Tales sustancias incluyen, p. ej., estructuras micelares, tales como liposomas o capsidas, como se describe a continuacion. Las suspensiones acuosas pueden incluir agentes suspensores tales como derivados de celulosa, alginato de sodio, polivinilpirrolidona y goma de tragacanto, y un agente humectante tal como lecitina. Los conservantes adecuados para suspensiones acuosas incluyen p-hidroxibenzoato de etilo y n-propilo.
Las composiciones terapeuticas inhibidoras de quinasa ALK tambien pueden incluir formulaciones encapsuladas para proteger el agente terapeutico (p. ej. un compuesto de ARNdh) frente a la rapida eliminacion del organismo, tal como una formulacion de liberacion controlada, incluyendo implantes y sistemas de liberacion microencapsulados. Se pueden utilizar polfmeros biocompatibles, biodegradables, tales como etileno-acetato de vinilo, poliantudridos, acido poliglicolico, colageno, poliortoesteres, y poli(acido lactico). Los metodos para la preparacion de tales formulaciones seran evidentes para los expertos en la tecnica. Los materiales tambien se pueden obtener comercialmente de Alza Corporation y Nova Pharmaceuticals, Inc. Las suspensiones liposomales (incluyendo liposomas dirigidos a celulas infectadas con anticuerpos monoclonales para antfgenos virales) tambien se pueden utilizar como portadores farmaceuticamente aceptables. Estas se pueden preparar de acuerdo con metodos conocidos por los expertos en la tecnica, p. ej., como se describe en la Patente de los Estados Unidos Num. 4.522.811; La publicacion PCT WO 91/06309; y la Publicacion de Patente Europea EP-A-43075. Una formulacion encapsulada puede comprender una protema de la cubierta viral. La protema de la cubierta viral puede derivar de o asociarse con un virus, tal como un virus de polioma, o puede ser parcial o totalmente artificial. Por ejemplo, la protema de la cubierta puede ser una Protema Viral 1 y/o la Protema Viral 2 del virus del polioma, o un derivado de las mismas.
Las composiciones inhibidoras de ALK tambien pueden comprender un vehmulo de liberacion, incluyendo liposomas, para la administracion a un sujeto, portadores y diluyentes y sus sales, y/o pueden estar presentes en formulaciones farmaceuticamente aceptables. Por ejemplo, los metodos para la liberacion de moleculas de acido nucleico son descritos por Akhtar et al., 1992, Trends Cell Bio., 2, 139; DELIVERY STRATEGIES FOR ANTISENSE OLIGONUCLEOTIDE THERAPEUTICS, ed. Akbtar, 1995, Maurer et al., 1999, Mol. Membr. Biol., 16, 129-140; Hofland and Huang, 1999, Handb. Exp. Pharmacol., 137, 165-192; y Lee et al., 2000, ACS Symp. Ser., 752, 184192. Beigelman et al., Patente de los Estados Unidos Num. 6.395.713 y Sullivan et al., PCT WO 94/02595 describen adicionalmente los metodos generales para la liberacion de moleculas de acido nucleico. Estos protocolos se pueden utilizar para la liberacion de practicamente cualquier molecula de acido nucleico.
Se pueden administrar agentes terapeuticos inhibidores de ALK a un tumor de mairnfero mediante una variedad de metodos conocidos por los expertos en la tecnica, incluyendo, pero no limitados a, encapsulacion en liposomas, mediante iontoforesis, o mediante incorporacion en otros vehmulos, tales como hidrogeles, ciclodextrinas, nanocapsulas biodegradables, y microesferas bioadhesivas, o mediante vectores proteinaceos (O'Hare y Normand, Publicacion Internacional pCt Num. WO 00/53722). Alternativamente, la combinacion de agente terapeutico/vehmulo se libera localmente mediante inyeccion directa o mediante el uso de una bomba de infusion. La inyeccion directa de la composicion, ya sea subcutanea, intramuscular, o intradermica, puede tener lugar utilizando metodologfas de agujas y jeringas convencionales, o tecnologfas sin agujas tales como las descritas por Conry et al., 1999, en Clin. Cancer Res., 5, 2330-2337 y Barry et al., Publicacion PCT Internacional Num. WO 99/31262.
Las formulaciones farmaceuticamente aceptables de agentes terapeuticos inhibidores de la quinasa ALK incluyen sales de los compuestos anteriormente descritos, p. ej., sales de adicion de acido, por ejemplo, sales de acido clorhudrico, bromhudrico, acetico, y acido bencenosulfonico. Una composicion o formulacion farmacologica se refiere a una composicion o formulacion en una forma adecuada para la administracion, p. ej., administracion sistemica, en una celula o paciente, incluyendo por ejemplo un ser humano. Las formas adecuadas dependen, en parte, del uso o de la ruta de entrada, por ejemplo oral, transdermica, o mediante inyeccion. Tales formas no debenan impedir que la composicion o formulacion alcance una celula diana. Por ejemplo, las composiciones farmacologicas inyectadas en
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el torrente sangumeo deben ser solubles. Se conocen otros factores en la tecnica, e incluyen consideraciones tales como toxicidad y formas que impiden que la composicion o formulacion ejerzan su efecto.
Las rutas de administracion que conducen a la absorcion sistemica (es decir absorcion sistemica o acumulacion de farmacos en el torrente sangumeo seguido de distribucion en todo el organismo), son deseables e incluyen, sin limitacion: intravenosa, subcutanea, intraperitoneal, inhalacion, oral, intrapulmonar e intramuscular. Cada una de estas rutas de administracion expone el agente terapeutico inhibidor de ALK a un tejido enfermo o tumor accesibles. Se ha demostrado que la tasa de entrada de un farmaco en la circulacion es una funcion del peso molecular o el tamano. El uso de un liposoma u otro portador de farmaco que comprende los compuestos para usar segun la presente invencion puede localizar potencialmente el farmaco, por ejemplo, en ciertos tipos de tejidos, tales como los tejidos del sistema reticuloendotelial (RES). Una formulacion de liposomas que puede facilitar la asociacion del farmaco con la superficie de las celulas, tales como, linfocitos y macrofagos tambien es util. Este enfoque puede proporcionar una liberacion mejorada del farmaco en las celulas diana mediante el aprovechamiento de la especificidad del reconocimiento inmunitario de los macrofagos y linfocitos de celulas anormales, tales como las celulas cancerosas.
Por "formulacion farmaceuticamente aceptable" se quiere significar, una composicion o formulacion que permite la distribucion eficaz de las moleculas de acido nucleico para usar segun la presente invencion en la localizacion ffsica mas adecuada para su actividad deseada. Los ejemplos no limitantes de agentes los adecuados para la formulacion con las moleculas de acido nucleico para usar segun la presente invencion incluyen: inhibidores de P-glicoprotema (tales como Pluronic P85), que pueden mejorar la entrada de farmacos en el sNc (Jolliet-Riant y Tillement, 1999, Fundam. Clin. Pharmacol., 13, 16-26); polfmeros biodegradables, tales como microesferas poli(DL-lactida- coglicolido) para la administracion de liberacion sostenida despues de la implantacion intracerebral (Emerich et al., 1999, Cell Transplant, 8, 47-58) (Alkermes, Inc. Cambridge, Mass.); y nanopartmulas cargadas, tales como las elaboradas de poli(cianoacrilato de butilo), que pueden liberar farmacos a traves de la barrera hematoencefalica y pueden modificar mecanismos de absorcion neuronales (Prog. Neuro-Psychopharmacol Biol Psychiatry, 23, 941949, 1999). Otros ejemplos no limitantes de estrategias de liberacion de los compuestos inhibidores de ALK para usar segun la invencion incluyen el material descrito por Boado et al., 1998, en J. Pharm. Sci., 87, 1308-1315; Tyler et al., 1999, FEBS Lett., 421, 280-284; Pardridge et al., 1995, PNAS USA, 92, 5592-5596; Boado, 1995, Adv. Drug Delivery Rev., 15, 73-107; Aldrian-Herrada et al., 1998, Nucleic Acids Res., 26, 4910-4916; y Tyler et al., 1999, PNAS USA, 96, 7053-7058.
Las composiciones terapeuticas que comprenden liposomas modificados en la superficie que contienen lfpidos de poli(etilenglicol) (modificados con PEG o liposomas de circulacion prolongada o liposomas encubiertos) tambien se pueden emplear adecuadamente para usar segun la invencion. Estas formulaciones ofrecen un metodo para aumentar la acumulacion de farmacos en tejidos diana. Esta clase de portadores de farmacos resiste opsonizacion y la eliminacion por el sistema mononuclear fagodtico (MPS o RES), permitiendo de este modo tiempos de circulacion de la sangre mas largos y un aumento de la exposicion en el tejido para el farmaco encapsulado (Lasic et al. Chem. Rev. 1995, 95, 2601-2627; lshiwata et al., Chem. Pharm. Bull. 1995, 43, 1005-1011). Se ha demostrado que tales liposomas se acumulan selectivamente en los tumores, presumiblemente por la extravasacion y captura en los tejidos diana neovascularizados (Lasic et al., Science 1995, 267, 1275-1276; Oku et al., 1995, Biochim. Biophys. Acta, 1238, 86-90). Los liposomas de circulacion prolongada mejoran la farmacocinetica y la farmacodinamica del ADN y el ARN, particularmente en comparacion con los liposomas cationicos convencionales que se sabe que se acumulan en tejidos del MPS (Liu et al., J. Biol. Chem. 1995, 42, 24864-24870; Choi et al., Publicacion Internacional PCT Num. WO 96/10391; Ansell et al., Publicacion Internacional PCT Num. WO 96/10390; Holland et al., Publicacion Internacional PCT Num. WO 96/10392). Tambien es probable que los liposomas de circulacion prolongada protejan los farmacos de la degradacion por nucleasas en un mayor grado en comparacion con los liposomas cationicos, basandose en su capacidad para evitar la acumulacion en los tejidos del MPS metabolicamente agresivos tales como el hugado y el bazo.
Las composiciones terapeuticas pueden incluir una cantidad farmaceuticamente eficaz de los compuestos deseados en un portador o diluyente farmaceuticamente aceptable. Los portadores o diluyentes aceptables para uso terapeutico son bien conocidos en la tecnica farmaceutica, y se describen, por ejemplo, en REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, Mack Publishing Co. (A.R. Gennaro, ed. 1985). Por ejemplo, se pueden proporcionar conservantes, estabilizadores, colorantes y agentes aromatizantes. Estos incluyen benzoato de sodio, acido sorbico y esteres de acido p-hidroxibenzoico. Ademas, se pueden utilizar antioxidantes y agentes suspensores.
Una dosis farmaceuticamente eficaz es la dosis requerida para prevenir, inhibir la aparicion o tratar (aliviar un smtoma en cierta medida, preferentemente todos los smtomas) de un estado de enfermedad. La dosis farmaceuticamente eficaz depende del tipo de enfermedad, la composicion usada, la via de administracion, el tipo de marnffero que esta siendo tratado, las caractensticas ffsicas del mamffero espedfico bajo consideracion, la medicacion concurrente y otros factores que reconoceran los expertos en las tecnicas medicas. En general, se administra una cantidad entre 0,1 mg/kg y 100 mg/kg de peso corporal/dfa de los ingredientes activos dependiendo de la potencia del polfmero cargado negativamente.
Los niveles de dosificacion del orden de aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 140 mg por kilogramo de
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peso corporal por dfa son utiles en el tratamiento de las afecciones indicadas anteriormente (aproximadamente 0,5 mg a aproximadamente 7 g por paciente por dfa). La cantidad de ingrediente activo que se puede combinar con los materiales portadores para producir una sola forma de dosificacion vana dependiendo del anfitrion tratado y del modo concreto de administracion. Las formas de dosificacion unitarias generalmente contienen entre aproximadamente 1 mg y aproximadamente 500 mg de un ingrediente activo. Se entiende que el nivel de dosificacion espedfico para cualquier paciente concreto depende de una variedad de factores incluyendo la actividad del compuesto espedfico empleado, la edad, el peso corporal, la salud general, el sexo, la dieta, el tiempo de administracion, la ruta de administracion y la tasa de excrecion, la combinacion de farmacos y la gravedad de la enfermedad concreta que experimenta la terapia.
Para la administracion a animales no humanos, la composicion tambien se puede anadir al pienso animal o al agua de bebida. Puede ser conveniente formular las composiciones de pienso animal y de agua de bebida de modo que el animal tome una cantidad terapeuticamente apropiada de la composicion junto con su dieta. Tambien puede ser conveniente presentar la composicion como una premezcla para la adicion al pienso o al agua de bebida.
Un agente terapeutico inhibidor de ALK para usar segun la invencion puede comprender un unico compuesto como se ha descrito anteriormente, o una combinacion de multiples compuestos, ya sea en la misma clase de inhibidor (es decir, anticuerpo inhibidor), o en diferentes clases (es decir, anticuerpos inhibidores e inhibidores de molecula pequena). Tal combinacion de compuestos puede aumentar el efecto terapeutico global en la inhibicion de la progresion de un cancer que expresa la protema de fusion. Por ejemplo, la composicion terapeutica puede ser un inhibidor de molecula pequena, tal como WHI-131 y/o WHI-154 solo, o combinado con otros inhibidores dirigidos a la actividad de ALK y/u otros inhibidores de molecula pequena. La composicion terapeutica tambien puede comprender uno o mas agente quimioterapeuticos no espedficos, ademas de uno o mas inhibidores selectivos. Se ha demostrado recientemente que tales combinaciones proporcionan un efecto sinergico eliminador del tumor en muchos canceres. La eficacia de tales combinaciones en la inhibicion de la actividad de ALK y el crecimiento del tumor in vivo se puede evaluar como se describe a continuacion.
Identificacion de compuestos inhibidores de quinasa ALK mutante.
La descripcion tambien proporciona, en parte, un metodo para determinar si un compuesto inhibe la progresion de un cancer caracterizado por un polinucleotido de fusion y/o un polipeptido de fusion de EML4-ALK o TFG-ALK, mediante la determinacion de si el compuesto inhibe la actividad del polipeptido de fusion de EML4-ALK o TFG-ALK o un polipeptido de quinasa ALK truncado en el cancer. En algunas realizaciones preferidas, la inhibicion de la actividad de ALK se determina mediante el examen de una muestra biologica que comprende celulas de la medula osea, sangre, efusion pleural, o un tumor. En otra realizacion preferida, la inhibicion de la actividad de ALK se determina utilizando al menos un reactivo espedfico de un polinucleotido o polipeptido de ALK mutante de la descripcion.
El compuesto sometido a ensayo puede ser cualquier tipo de agente terapeutico o composicion como se ha descrito anteriormente. Los metodos para evaluar la eficacia de un compuesto, tanto in vitro como in vivo, estan bien establecidos y son conocidos en la tecnica. Por ejemplo, se puede someter a ensayo una composicion para determinar su capacidad para inhibir ALK in vitro utilizando una celula o extracto celular en el que se activa ALK. Se puede emplear un panel de compuestos para someter a ensayo la especificidad del compuesto para ALK (a diferencia de otras dianas, tales como EGFR o PDGFR).
Otra tecnica para el escrutinio de farmacos que se puede utilizar proporciona el escrutinio de alto rendimiento de compuestos que tienen una afinidad de union adecuada a una protema de interes, como se describe en la Solicitud PCT publicada WO84/03564. En este metodo, tal como se aplica a polipeptidos mutantes de ALK, se sintetiza un gran numero de diferentes compuestos de ensayo pequenos sobre un sustrato solido, tal como alfileres de plastico o alguna otra superficie. Los compuestos de ensayo se hacen reaccionar con el polipeptido de ALK mutante, o fragmentos del mismo, y se lavan. El polipeptido mutante unido (p. ej., polipeptido de fusion de EML4-ALK) se detecta a continuacion, mediante metodos bien conocidos en la tecnica. El polipeptido de ALK mutante purificado tambien se puede recubrir directamente sobre placas para su uso en las tecnicas de escrutinio de farmacos anteriormente mencionadas. Alternativamente, se pueden utilizar anticuerpos no neutralizadores para capturar el peptido e inmovilizarlo sobre un soporte solido.
A continuacion se puede examinar un compuesto que se ha encontrado que es un inhibidor eficaz de la actividad de ALK in vitro para determinar su capacidad para inhibir la progresion de un cancer que expresa un polipeptido de fusion de EML4-ALK o TFG-ALK y/o un polipeptido de quinasa ALK truncado, in vivo, utilizando, p. ej., xenoinjertos de mamffero que albergan tumores humanos, tales como CPCNP. De este modo, se pueden observar los efectos del farmaco en un entorno biologico que se asemeja mas estrechamente a un paciente. La capacidad del farmaco para modificar la senalizacion en las celulas cancerosas o celulas estromales circundantes se puede determinar mediante analisis con anticuerpos espedficos de fosforilacion. La eficacia del farmaco en la induccion de la muerte celular o la inhibicion de la proliferacion celular tambien se puede observar mediante analisis con marcadores espedficos de apoptosis tales como caspasa 3 escindida y PARP escindida. Del mismo modo, se pueden emplear trasplantes de medula osea de mairnferos (p. ej., ratones) que albergan leucemias humanas que estan dirigidas por la protema ALK mutante. En este procedimiento, las celulas de medula osea que se sabe que estan dirigidas por la
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quinasa ALK mutante se trasplantan al raton. Se puede controlar el crecimiento de las celulas cancerosas. El raton se puede tratar a continuacion con el farmaco, y observar externamente el efecto del tratamiento con el farmaco sobre el fenotipo o la progresion del cancer. El raton se sacrifica a continuacion, y despues se retira la medula osea trasplantada para el analisis mediante, IHC y transferencia Western, etc.
La toxicidad y la eficacia terapeutica de tales compuestos se pueden determinar mediante procedimientos farmaceuticos convencionales en cultivos celulares o animales experimentales, p. ej., para determinar la DL50 (la dosis letal para el 50% de la poblacion) y la DE50 (la dosis terapeuticamente eficaz en el 50% de la poblacion). La razon de la dosis entre los efectos toxicos y terapeuticos es el mdice terapeutico y puede expresarse como la razon DL50/DE50. Se prefieren los compuestos que muestran indices terapeuticos elevados.
Los siguientes Ejemplos se proporcionan solo para ilustrar adicionalmente la invencion y descripciones, y no se pretende que limiten su alcance, salvo lo dispuesto en las reivindicaciones adjuntas a la misma. La presente invencion abarca modificaciones y variaciones de los metodos que se ilustran en la presente memoria que resultanan obvios para un experto normal en la tecnica.
Ejemplo 1
Identificacion de actividad quinasa de ALK en tumores solidos mediante perfilado de fosfopeptidos global A. Perfilado de lmeas celulares de CPCNP humano.
Se examino el perfil de fosforilacion global de la activacion de la quinasa en 22 lmeas celulares de CPCNP humano, incluyendo H2228, utilizando una tecnica recientemente descrita y poderosa para el aislamiento y la caracterizacion mediante espectrometna de masas de peptidos modificados a partir de mezclas complejas (la tecnica "IAP", vease Rush et al., mas arriba). La tecnica IAP se llevo a cabo utilizando un anticuerpo espedfico de fosfotirosina (CELL SIGNALING TECHNOLOGY, INC, Beverly, MA, 2003/04 Num. de Cat. 9411) para aislar y posteriormente caracterizar, peptidos que contienen fosfotirosina a partir de extractos de las lmeas celulares de CPCNP.
Espedficamente, se empleo el enfoque IAP para facilitar la identificacion de tirosina quinasas responsables de la fosforilacion de protemas en cada una de las lmeas celulares de CPCNP. En particular, se considero la actividad quinasa atfpica o inusual.
Cultivo Celular.
Se adquirieron reactivos para cultivo celular de Invitrogen, Inc. Se examinaron un total de 41 lmeas celulares de CPCNP humano. Las lmeas celulares de CPCNP humano, H520, H838, H1437, H1563, H1568, H1792, H1944, H2170, H2172, H2228, H2347, A549, H441, H1703, H1373, H358 se obtuvieron de la Coleccion de Cultivos Tipo Americana, y se cultivaron en medio RPMI 1640 con FBS al 10% y se ajustaron para que contuvieran L-glutamina 2 mM, 1,5 g/l de bicarbonato de sodio, 4,5 g/l de glucosa, HEPEs 10 mM, piruvato de sodio 1,0 mM, penicilina/estreptomicina. Se adquirieron seis lmeas celulares de CPCNP humano adicionales, HCC78, Cal-12T, HCC366, HCC15, HCC44, y Lou-NH91, de DSMZ, y se cultivaron en medio RPMI 1640 que contema FBS al 10% y penicilina/estreptomicina. Las celulas se mantuvieron en una incubadora con CO2 al 5% a 37°C.
Para los experimentos de precipitacion de inmunoafinidad e inmunotransferencia, las celulas se cultivaron hasta 80% de confluencia y a continuacion mueren por inanicion en medio RPMI sin FBS durante la noche antes de la recoleccion.
Inmunoprecipitacion de fosfopeptidos.
Se lisaron 100 millones de celulas en tampon de lisis de urea (Hepes 20 mM, pH 8,0, urea 9 M, vanadato de sodio 1 mM, pirofosfato de sodio 2,5 mM, beta-glicerofosfato 1 mM). El producto lisado se sometio a sonicacion y se aclaro por centrifugacion. El producto lisado aclarado se redujo mediante DTT y se alquilo con yodoacetamida, como se ha descrito previamente (vease Rush et al., Nat. Biotechnol. 23(1): 94-101 (2005)). A continuacion las muestras se diluyeron 4 veces con Hepes 20 mM para reducir la concentracion de urea a 2 M, y se digirieron con tripsina durante toda la noche a temperatura ambiente con sacudimiento suave.
Los peptidos digeridos se purificaron groseramente con columnas Sep-Pak C18, como se ha descrito previamente (vease Rush et al., mas arriba). El eluato se liofilizo y los peptidos secos se disolvieron en 1,4 ml de tampon MOPS IP (MOPS/NaOH 50 mM pH 7,2, Na2PO4 10 mM, NaCl 50 mM) y la materia insoluble se elimino por centrifugacion. La inmunoprecipitacion se realizo a 4°C durante la noche con 160 |jg de anticuerpo Phospho-Tyirosine 100 (Cell Signaling Technology) acoplado a cuentas de protema G agarosa (Roche). Las cuentas se lavaron despues 3 veces con 1 ml de tampon MOPS IP y dos veces con 1 ml de dH2O de grado HPLC en frio. Los fosfopeptidos se hicieron eluir de las cuentas con 60 jl de TFA al 0,1% seguido de una segunda elucion con 40 jl TFA al 0,1% y las fracciones se reunieron. Los peptidos eluidos se concentraron utilizando una columna ZipTip (Millipore), y se analizaron con LC-MS/MS. Los espectros de masas se recogieron con un espectrometro de masas de trampa de iones LTQ (ThermoFinnigan).
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Analisis mediante espectrometna de masas LC-MS/MS
Los peptidos del eluato IP (100 |jl) se concentraron y se separan de anticuerpo eluido utilizando puntas de extraccion Stop and Go (StageTips) (vease Rappsilber et al., Anal. Chem., 75(3): 663-70 (2003)). Los peptidos se hicieron eluir de las microcolumnas con 1 jl de MeCN al 60%, TFA al 0,1% en 7,6 jl de acido acetico al 0,4%/acido heptafluorobutmco (HFBA) al 0,005%.
Cada muestra de fosfopeptidos se analizo mediante LC-MS por duplicado. Se cargo una columna microcapilar de sflice fundida (125 m x 18 cm) con resina de fase inversa C18 (Magic C18AQ, partmulas de 5 jm, tamano de poro 200 A, Michrom Bioresources, Auburn, CA). Las muestras (4 jl) se cargaron en esta columna con un muestreador automatico (LC Packings Famos, San Francisco, CA) y se hicieron eluier en el espectrometro de masa por medio de un gradiente lineal de 55 min de acetonitrilo de 7 a 30% en acido formico al 0,1%. El gradiente se libero a aproximadamente ABC nl/min utilizando una bomba de HPLC binaria (Agilent 1100, Palo Alto, CA) con un divisor de flujo en lmea. Se analizo la masa de los iones de los peptidos eluyentes con una trampa de iones lineal tnbrida - aparato de resonancia de ion ciclotron con transformada de Fourier 7 Tesla (LTQ-FT, Thermo Finnigan, San Jose, CA).
Se empleo un metodo con los siete-principales, por medio del cual se recogieron barridos de MS/MS dependientes de 7 datos en la trampa de iones lineal basandose en las mediciones realizadas durante el barrido de la inspeccion de MS anterior en la celula ICR, con la trampa de iones lineal y el aparato con transformada de Fourier funcionando al mismo tiempo. Los barridos de MS se realizaron a 375-1800 m/z con una diana de control automatico de ganancia (AGC) de 8x106 y una resolucion de masa de 105. Para MS/MS el AGC fue de 8x106, el tiempo de exclusion dinamica fue de 25 s, y los iones de una sola carga fueron rechazados por el escrutinio del estado de carga.
Analisis y asignaciones de la base de datos.
Las secuencias de peptidos se asignaron a espectros MS/MS utilizando soporte logico TurboSequest (v. 27, rev.12) (ThermoFinnigan) y una base de datos de protema humana IPI compuesta directa/inversas. Los parametros de busqueda fueron: tripsina como proteasa; tolerancia de masa del precursor 1,08 Da; modificacion estatica en cistema (+57,02146, carboxamidometilacion); y modificaciones dinamicas en serina, treonina y tirosina (+79,96633 Da, fosforilacion), lisina (+8,01420, 13C615N2), arginina (+6,02013, 13C6) y metionina (+15,99491, oxidacion). Se utilizo un enfoque de base de datos objetivo/senuelo para establecer criterios de filtrado de puntuacion adecuados, de manera que la tasa de asignacion de falsos positivos estimada fuera <1%. Ademas de superar los umbrales XCorr dependientes de la carga (z = 1, XCorr > 1,5, para z = 2, XCorr > 2,2, para z = 3, XCorr > 3,3), se requirio que las asignaciones contuvieran fosfotirosina, tuvieran una precision de masa de -5 a +25 ppm, y contuvieran residuos de lisina/arginina todos ligeros o todos pesados.
Las asignaciones que pasaron estos criterios se evaluaron adicionalmente utilizando un programa de cuantificacion a la medida, Vista (Bakalarski et al., manuscrito en preparacion) para calcular las areas de los picos y en ultima instancia, una abundancia relativa entre las formas pesada y ligera de cada peptido. Los peptidos identificados con senal con respecto a ruido en el barrido de MS por debajo de 15 no se tuvieron en cuenta para la cuantificacion. Para esos peptidos encontrados solamente en una de las condiciones se utilizo en lugar de eso la razon de senal con respecto a ruido.
Las busquedas se realizaron frente a la base de datos NCBI humana lanzada el 24 de agosto 2004 que contema 27.175 protemas que permitfan metionina oxidada (M+16) y fosforilacion (Y+80) como modificaciones dinamicas. Todos los espectros de apoyo a la lista final de las secuencias asignadas (no mostrados aqm) fueron revisados por al menos tres cientfficos para establecer su credibilidad.
El analisis IAP anterior identifico mas de 2.000 peptidos no redundantes que conteman fosfotirosina, mas de 1.500 sitios de fosfotirosina, y mas de 1.000 protemas con tirosina fosforilada, la mayona de las cuales son novedosas, a partir de las lmeas celulares examinadas (datos no presentados). Se observo que las tirosina quinasas receptoras que se sabe que estan implicadas en la senalizacion de CPCNP tienen tirosina fosforilada en muchas lmeas celulares, tales como EGFR, Her2, Her3, de EphA2 y Met. Se observaron altos niveles de fosfopeptidos de EGFR en varias lmeas celulares incluyendo HCC827 y H3255, dos lmeas celulares conocidas por expresar niveles amplificados de formas activadas geneticamente de EGFR, lo que confirma que el metodo identifica las tirosina quinasas receptoras que se sabe que son activas en lmeas celulares de CPCNP.
Tres lmeas de celulas expresaron tirosina quinasas receptoras no observadas en lmeas celulares distintas de CPCNP. Se observaron grandes cantidades de peptidos con tirosina fosforilada de Ros, ALK y PDGFR alfa en las lmeas celulares HCC78, H2228, y H1703, respectivamente. La lmea celular de CPCNP H2228, que expresa sumamente ALK, se selecciono para un examen adicional.
B. Perfilado de muestras tumorales de CPCNP humano.
Con posterioridad se aplico la tecnica IAP, sustancialmente como se describe en la Parte A anterior, para examinar los perfiles de fosforilacion globales de un panel de 154 muestras de tumores humanos de pacientes con CPCNP. Los tejidos se obtuvieron de la Second Xiangya Hospital, China.
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Se cortaron en trozos pequenos muestras de tejido congeladas, se homogeneizaron en tampon de lisis (HEPES 20 mM, pH 8,0, urea 9 M, vanadato de sodio 1 mN, con un suplemento de pirofosfato de sodio 2,5 mM, b-glicerol- fosfato 1 mM, 1 ml de tampon de lisis para 100 mg de tejido congelado) utilizando un Polytron durante 2 penodos de 20 seg. cada vez. El producto homogeneizado se sometio a continuacion a sonicacion brevemente. El producto lisado aclarado se redujo con DTT y se alquilo con yodoacetamida, como se ha descrito anteriormente (vease Rush et al., Nat. Biotechnol. 23(1): 94-101 (2005)). A continuacion las muestras se diluyeron 4 veces con Hepes 20 mM para reducir la concentracion de Urea a 2 M, y se digirieron por medio de tripsina durante la noche a temperatura ambiente con agitacion suave.
Los peptidos digeridos se purificaron groseramente con columnas Sep-Pak C18, como se ha descrito anteriormente (vease Rush et al., mas arriba). El eluato se liofilizo y los peptidos secos se disolvieron en 1,4 ml de tampon MOPS IP (MOPS/NaOH 50 mM pH 7,2, Na2PO4 10 mM, NaCl 50 mM) y la materia insoluble se elimino por centrifugacion. La inmunoprecipitacion se llevo a cabo a 4°C durante la noche con 160 |jg de anticuerpo Phospho-Tyrosine 100 (Cell Signaling Technology) acoplado a cuentas de protema G-agarosa (Roche). Las cuentas se lavaron 3 veces con 1 ml de tampon MOPS IP y dos veces con 1 ml de dH2O de grado HPLC en frio. Los fosfopeptidos se hicieron eluir de las cuentas con 60 jl de TFA al 0,1% seguido de una segunda elucion con 40 jl de TFA al 0,1% y las fracciones se reunieron. Los peptidos eluidos se concentraron utilizando una columna ZipTip (Millipore), y se analizaron con LC- MS/MS. Los espectros de masas se recogieron con un espectrometro de masas con trampa de iones LTQ (ThermoFinnigan).
A continuacion se llevo a cabo la inmunoprecipitacion de los fosfopeptidos, seguido de analisis de espectrometna LC-MS/MS como se ha descrito anteriormente en la Parte A. La busqueda en la base de datos y las asignaciones de secuencias se realizaron sustancialmente como se ha descrito anteriormente en la Parte A, pero utilizando la base de datos NCBI humana lanzada el 24 de agosto 2004 que contema 27.970 protemas.
El analisis IAP anterior identifico mas de 2.000 peptidos no redundantes que conteman fosfotirosina, mas de 1.500 sitios de fosfotirosina, y mas de 1.000 protemas con tirosina fosforilada de las muestras de tumores humanos examinadas (datos no mostrados). De nuevo se observo que las tirosina quinasas receptoras que se sabfa que estan implicadas en la senalizacion de CPCNP teman tirosina fosforilada en muchos tumores, tales como EGFR, Her2, Her3, de EphA2 y Met. Se observaron de nuevo altos niveles de fosfopeptidos de EGFR en varias muestras tumorales, lo que confirma que el metodo identifica las tirosina quinasas receptoras que se sabe que son activas en las lmeas celulares de CPCNP.
Cinco muestras de pacientes expresaron tirosina quinasas receptoras no observadas en lmeas celulares y tumores distintos de CPCNP. Se observaron grandes cantidades de peptidos con tirosina fosforilada de ALK en pacientes CS010/11, CS045, y CS110. Estos tres tumores, que expresaban sumamente ALK, se seleccionaron para su examen adicional.
Ejemplo 2
Aislamiento y secuenciacion de tres genes de fusion de ALK A. Secuenciacion en lmeas celulares de CPCNP humano.
Dado el alto nivel de fosforilacion de la quinasa ALK detectado en la lmea celular de CPCNP H2228, se llevo a cabo una amplificacion rapida 5' de los extremos de ADNc en la secuencia que codifica el dominio quinasa de ALK con el fin de determinar si se encontraba presente un transcrito de ALK quimerico.
Amplificacion rapida de extremos de ADN complementarios
Se utilizo el RNeasy Mini Kit (Qiagen) para extraer el ARN de la lmea celular H2228. El ADN se extrajo utilizando el DNeasy Tissue Kit (Qiagen). La amplificacion rapida de los extremos del ADNc se realizo utilizando el sistema 5' RACE (Invitrogen) con los cebadores ALK-GSP1 para la smtesis de ADNc y ALK-GSP2 y ALK-GSP3 para una reaccion de PCR anidada.
5' RACE
La Figura 5 (panel A) muestra la deteccion del gen de fusion EML4-ALK (variante corta) mediante 5'RACE y la deteccion del producto de amplificacion de PCR despues de 2 rondas. El producto de la PCR se purifico con el kit de purificacion de PCR (Qiagen) y se secuencio utilizando ALK-GSP3, un secuenciador de ADN automatico capilar ABI 3130 (Applied Biosystems). El analisis de secuencia del producto resultante revelo que el dominio quinasa y el extremo C de ALK estaban fusionados al extremo N del gen de EML-4 (vease la Figura 1, panel B). El gen de fusion de EML4-ALK (variante corta) estaba en marco y fusionaba los primeros 233 aminoacidos de EML-4 a los ultimos 562 aminoacidos de ALK (vease la Figura 1, panel B). Los genes de EML-4 y ALK estan ambos ubicados en el cromosoma 2, de modo que el gen de fusion fue creado por la delecion de genes entre estos dos loci.
Se utilizaron los siguientes cebadores:
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ALK-GSP1:
ALK-GSP2:
ALK-GSP3:
5'-GCAGTAGTTGGGGTTGTAGTC (SEQ ID NO: 9) 5'-GCGGAGCTTGCTCAGCTTGT (SEQ ID NO: 10) 5'-TGCAGCTCCTGGTGCTTCC (SEQ ID NO: 11)
Analisis mediante PCR
Se realizo un analisis de RT-PCR para confirmar que el extremo N de EML-4 estaba intacto en la protema de fusion (vease la Figura 6 (panel B)). La primera hebra de ADNc se sintetizo a partir de 2,5 mg de ARN total utilizando el sistema de smtesis de la primera hebra Superscript™ III (lnvitrogen) con oligo (dT)20. A continuacion, se amplifico el gen de fusion de EML4-ALK con el uso de los pares de cebadores EML-ATG y ALK-GSP3. La fusion redproca se detecto con el uso de los pares de cebadores EML-4-43 y ALK-GSP3 y EML-4-94 y ALK-GSP3 y EML4-202 y ALK- GSP3. Para la PCR genomica, la amplificacion del gen de fusion se realizo utilizando la ADN polimerasa Platinum Taq de alta fidelidad (Invitrogen) con los pares de cebadores EML-4-ATG y ALK-TGA.
Se utilizaron los siguientes cebadores:
ALK-GSP3:
5'
EML4-Atg:
5'
EML4-43:
5'
EML4-94:
5'
EML4-202:
5'
ALK-Tga:
5'
TGCAGCTCCTGGTGCTTCC (SEQ ID NO: 12) CGCAAGATGGACGGTTTGGC (SEQ ID NO: 13) TGTTCAAGATCGCCTGTCAGCTCT (SEQ ID NO: 14) TGAAATCACTGTGCTAAAGGCGGC (SEQ ID NO: 15) AAGCCCTCGAGCAGTTATTCCCAT (SEQ ID NO: 16) GAATTCCGCCGAGCTCAGGGCCCAG (SEQ ID NO: 17)
Es de destacar que, en la fusion de EML4-ALK (variante corta), el radical de ALK se fusiona al radical de EML-4, precisamente en el mismo punto en el se ha observado ALK en otras fusiones de ALK, tales como la fusion NPM- ALK que se producen en el LACG. El dominio quinasa de ALK en la lmea celular H2228 se secuencio adicionalmente a partir de ADN genomico y se encontro que era de tipo salvaje. Por lo tanto, la mutacion por delecion descubierta en H2228 no afecta al dominio quinasa de ALK. Adicionalmente, EML-4 de tipo salvaje esta fosforilada en tirosina solo en un sitio que no esta presente en la protema de fusion de EML4-ALK (variante corta), lo que sugiere que el dominio N-terminal de la bobina en espiral que se conserva en la protema de fusion (vease la Figura 1A ) pueden funcionar dimerizando y activando ALK, asf como promoviendo la interaccion con ALK de tipo salvaje.
B. Secuenciacion en la lmea celular de CPCNP humano.
De manera similar, dado el alto nivel de fosforilacion de la quinasa ALK detectado en las muestras de tumores de CPCNP humanos de pacientes CS010/11, CS045, y CS110, se llevo a cabo una amplificacion rapida 5' de los extremos de ADNc en la secuencia que codifica el dominio quinasa de ALK con el fin de determinar si el transcrito de ALK quimerico estaba presente en estos tumores.
La rapida amplificacion de los extremos de ADN complementarios y 5' RACE se llevaron a cabo, sustancialmente como se ha descrito anteriormente en la Parte A, con los cebadores ALK-GSP1 para la smtesis de ADNc y ALK- GSP2 y ALK-GSP3 para una reaccion de PCR anidada.
La Figura 5 (panel C) muestra la deteccion de los genes de fusion de EML4-ALK (variantes tanto corta como larga) mediante 5' RACE en dos muestras de pacientes, y la deteccion del gen de fusion TFG-ALK en un paciente, y la deteccion del producto de la amplificacion de PCR despues de 2 rondas. Los productos de la PCR se purificaron y secuenciaron sustancialmente como se ha descrito anteriormente en la Parte A. El analisis de secuencia de los productos resultantes revelo que el dominio quinasa y el extremo C de ALK se fusionaron al extremo N del gen de EML-4 en dos variantes diferentes (veanse las Figuras 1A-1B, panel B). Los genes de fusion de EML4-ALK estaban en marco y fusionaban los primeros 233 aminoacidos (variante corta) o los primeros 495 aminoacidos (variante larga) de EML-4 a los ultimos 562 aminoacidos de ALK (veanse las Figuras 1A-1B, panel B). Los genes de EML-4 y ALK estan ubicados ambos en el cromosoma 2, por lo tanto el gen de fusion fue creado mediante delecion genica entre estos dos loci. La observacion del gen de fusion (variante corta) en el paciente CS045 confirmo el hallazgo de
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este gen mutante en la lmea celular humana H2228.
El gen de fusion de TFG-ALK tambien estaba en marco y fusionaba los primeros 138 aminoacidos de TFG a los ultimos 562 aminoacidos de ALK (veanse las Figuras 1C, panel B). Los genes de TFG y ALK estan localizados en diferentes cromosomas (cromosomas 6 y 2, respectivamente), de este modo el gen de fusion se creo mediante translocacion genica entre estos dos loci. Curiosamente, la fusion de TPG a ALK se produjo exactamente en el mismo punto de ALK que se observo para la fusion de las dos variantes de EML4-ALK, lo que indica que el truncamiento de ALK en tumores solidos en este punto puede ser un evento comun.
Se usaron los mismos cebadores descritos en la Parte A anterior. Se llevo a cabo un analisis de RT-PCR, sustancialmente como se ha descrito en la Parte A anterior, para confirmar que el extremo N de EML-4 y TFG estan intactos en las protemas de fusion (vease la Figura 6 (panel B)). Los pares de cebadores para EML-4 y ALK fueron como los descritos en la Parte A anterior. Se utilizo el siguiente par de cebadores para TFG:
TFG-F1: 5'-TTTGTTAATGGCCAGCCAAGACCC-3 (SEQ ID NO: 28)
Es de destacar que, en ambas variantes de fusion de EML4-ALK, el radical de ALK se fusiona al radical de EML-4, precisamente en el mismo punto de ALK que se ha observado en otras fusiones de ALK, tales como la fusion NPM- ALK que se produce en el LACG. Adicionalmente, EML-4 de tipo salvaje esta fosforilado en tirosina solo en un sitio que no esta presente en las protemas de fusion de EML4-ALK, lo que sugiere que el dominio de bobina en espiral N- terminal que esta conservado en las protemas de fusion (veanse las Figuras 1A-1B) puede funcionar dimerizando y activando ALK, asf como para promoviendo la interaccion con ALK de tipo salvaje. Tambien es de destacar que, la fusion del radical de TG a ALK tambien se produce precisamente en el mismo punto en ALK, y de hecho la fusion de TFG de ALK en este punto se ha descrito en el linfoma humano (vease Hernandez et al.(2002), mas arriba), pero no se ha descrito previamente en tumores solidos humanos, tales como CPCNP.
Ejemplo 3
Inhibicion del crecimiento de tumores solidos de mairnferos que expresan la fusion de ALK utilizando ARNip
Con el fin de confirmar que las formas truncada/de fusion de ALK estan dirigiendo el crecimiento celular y la supervivencia celulares en la lmea celular de CPCNP H2228, asf como en muestras de tumor de CPCNP de pacientes CS010/11, CS045, y CS110, se puede examinar la capacidad de ARNip (frente a ALK) para inhibir el crecimiento de estas celulas y tumores.
Se pueden adquirir duplex ARNip de SMARTpool de ALK (secuencias diana en propiedad - datos no mostrados), p. ej., de Dharmacon Research, Inc. (Lafayette, CO). Se utiliza como control un ARNip de SMARTpool no espedfico. Las celulas se transfectan con el ARNip por medio de electroporacion. En resumen, se aplican pulsos a 2 x 107 celulas (H2228) (20 ms; 275V, 20 ms K562; 285V) utilizando un electroporador de onda cuadrada (BtX Genetronics, San Diego, CA), se incuban a temperatura ambiente durante 30 minutos y se transfirieren a matraces T150 con 30 ml de RPMI - 1640/FBS al 10%.
Se determina el numero de celulas viables con el analisis de proliferacion de celulas en disolucion CellTiter 96 AQueous One (Promega). La CI50 se calcula mediante el uso del soporte logico OriginPro 6.1 (OriginLab). El porcentaje de celulas apoptoticas a las 48 horas se puede determinar mediante el analisis de citometna de flujo Cleaved-Caspase-3 (Cell Signaling Technology).
El analisis por inmunotransferencia revelara que la expresion de ALK es reducida espedficamente y significativamente a las 72 horas de la transfeccion del ARNip a celulas H2228 o celulas tumorales de pacientes CS010/11, CS045, y CS110. Se espera que la regulacion a la baja de ALK de como resultado una fuerte inhibicion del crecimiento celular. Tambien se espera que el tratamiento con ARNip de ALK de como resultado un aumento de la apoptosis de estas celulas de tumores solidos. Estos resultados indicaran adicionalmente que las quinasas ALK mutantes/fusionadas en la lmea celular H2228 y en tumores de pacientes estan dirigiendo la proliferacion y el crecimiento de estas celulas de CPCNP, y que tal crecimiento y tal proliferacion pueden ser inhibidos utilizando ARNip para inhibir la expresion y la actividad de la quinasa ALK.
Ejemplo 4
Inhibicion del crecimiento de tumores solidos de mamnferos que expresan la fusion de ALK utilizando WI-131 y/o WI- 154
Para confirmar adicionalmente que las protemas de fusion de ALK mutantes estan dirigiendo el crecimiento y la viabilidad de la lmea celular de CPCNP H2228 y de las celulas tumorales de CPCNP de pacientes CS010/11, CS045, y CS110, las celulas se pueden tratar con un inhibidor selectivo de la quinasa ALK, tal como WI-131 y/o WI- 154. WI-131 y W-154 son inhibidores de molecula pequena de tipo quinazolina de la quinasa ALK, y se ha descrito su actividad contra la protema de fusion NPM-ALK en el linfoma de celulas T. Vease Marzec et al., mas arriba.
En resumen, se cultivan celulas de CPCNP, y se lleva a cabo un analisis de inhibicion del crecimiento celular con
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CellTiter 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay (Promega) de acuerdo con la sugerencia del fabricante. Brevemente, se siembran de 1000 a 5000 celulas sobre placas de 96 pocillos de fondo plano y se cultivan en medio completo con FBS al 10%. Despues de 24 horas, se cambia el medio celular por 100 pl de medio de crecimiento completo con FBS al 10% que contiene diversas concentraciones del farmaco, y las celulas se incuban durante 72 horas mas. Cada concentracion de farmaco se aplica a pocillos de celulas por triplicado. Al final de la incubacion, se anaden 20 pl de solucion CellTiter 96 AQueous One a cada pocillo, y la placa se incuba durante 1-4 horas. La absorbancia se lee a 490 nm utilizando un lector de microplacas Titan Multiskan Ascent (Titertek Instrument). La inhibicion del crecimiento se puede expresar como la media ± valor DT del porcentaje de la lectura de absorbancia de las celulas tratadas en comparacion con las celulas no tratadas. El analisis se repite al menos tres veces.
Se espera que tal analisis confirme que las protemas de fusion de ALK (EML4-ALK (variantes corta y larga), TFG- ALK) estan dirigiendo el crecimiento y la supervivencia de un subgrupo de tumores de CPCNP humano en las que estas protemas mutantes son expresadas, y que tales celulas se pueden inhibir mediante la inhibicion de la actividad de la quinasa ALK de fusion utilizando un inhibidor selectivo, tal como WI-131 y/o WI-154.
Ejemplo 5
Las protemas de fusion de ALK dirigen el crecimiento y la supervivencia de lmeas celulares de mairnfero transformadas.
Con el fin de confirmar que la expresion de una o mas de las protemas de fusion de ALK puede transformar las celulas normales en un fenotipo canceroso, se pueden transformar celulas 3T# con los constructos de ADNc descritos anteriormente (Ejemplo 2), que expresan las protemas de fusion de EML4-ALK (variantes corta y larga) o de TFG-ALK, respectivamente.
En resumen, las celulas se mantienen en medio RPMI-1640 (Invitrogen) con suero bovino fetal (FBS) al 10% (Sigma) y 1,0 ng/ml de IL-3 (R&D Systems). La produccion de sobrenadante retroviral y la transduccion se llevan a cabo como se ha descrito previamente. Vease Schwaller et al, EMBO J. 17(18): 5321-33 (1998). Las celulas 3T3 son transducidas con sobrenadante retroviral que contiene el vector MSCV-Neo/EML4-ALK (o TFG-ALK) y se seleccionan con G418 (1 mg/ml). A continuacion se inspecciona la capacidad de las celulas transformadas para crecer en agar blando cultivando en placa las celulas transducidas despues de haber lavado las celulas tres veces en PBS. Si se desea, para las curvas de respuesta a la dosis, las celulas se tratan con ARNip contra ALK como se ha descrito anteriormente (vease el Ejemplo 3), y se determina el numero de celulas viables con el analisis de proliferacion de celulas en disolucion CellTiter 96 AQueous One (Promega). La CI50 se puede calcular utilizando el soporte logico OriginPro 6.1 (OriginLab). Se puede determinar el porcentaje de celulas apoptoticas a las 48 horas mediante analisis de citometna de flujo Cleaved-Caspase-3 utilizando un anticuerpo espedfico para esta diana (Cell Signaling Technology). Tal analisis demostrana que la expresion de la protema de fusion de EML4-ALK (variante corta o larga) o de la protema de fusion de TFG-ALK puede transformar las celulas 3T3 y confirmar la supervivencia y el crecimiento en agar blando cuando estas celulas son dirigidas por la protema de fusion de ALK, y adicionalmente que la inhibicion de la expresion de ALK en las celulas transformadas conduce a la disminucion de la viabilidad y a un aumento de la apoptosis.
Ejemplo 6
Deteccion de la expresion de la protema de fusion de EML4-ALK en tumores solidos humanos utilizando el analisis FISH
La presencia de la protema de fusion de EML4-ALK (variante corta) en muestras de tumores de CPCNP humano se detecto utilizando el analisis de hibridacion fluorescente in situ (FISH), como se ha descrito previamente. Vease, p. ej., Verma et al. HUMAN CHROMOSOMES: A MANUAL OF BASIC TECHNIQUES, Pergamon Press, New York, N.Y. (1988). Se examinaron mas de 200 muestras de tumores de CPCNP humanos incluidas en parafina.
Se obtuvo una sonda de translocacion por rotura de dos colores para ALK, de Vysis (Vysis, Dowers Grove, IL, USA) y se utilizo de acuerdo con las instrucciones del fabricante con las siguientes modificaciones. En resumen, las secciones de tejidos incluidas en parafina se rehidrataron y se sometieron a recuperacion de antfgeno con microondas en de tampon de citrato 0,01 M (pH 6,0) durante 11 minutos. Las secciones se digirieron con proteasa (4 mg/ml de pepsina, 2000-3000 U/mg) durante 25 minutos a 37°C, se deshidrataron y se hibridaron con la sonda FISH ajustada a 37°C durante 18 horas. Despues del lavado, se aplico 4',6-diamino-2-fenilindol (DAPI; mg/ml) en un medio de montaje Vectashield (Vector Laboratories, Burlingame, CA) para la contratincion nuclear.
La sonda de translocacion para ALK contiene dos sondas marcadas de forma diferente en lados opuestos del punto de rotura del gen de ALK (en el nucleotido 3171) en la secuencia de tipo salvaje (SEQ ID NO: 6). Cuando se hibriden, la region de ALK nativa aparecera como una senal de fusion de color naranja/verde, mientras la translocacion en este locus (como ocurre en los mutantes por delecion de EML4-ALK) dara como resultado senales de color naranja y verde separadas. Vease la Figura 6.
El analisis FISH revelo una incidencia relativamente baja de esta mutacion de EML4-ALK de variante corta en la poblacion de muestras estudiada (una de cada 229 muestras). Sin embargo, dada la alta incidencia de CPCNP en
todo el mundo (mas de 151.000 casos nuevos en los Estados Unidos solo cada ano), se espera que haya un numero significativo de pacientes que alberguen esta ALK mutante, cuyos pacientes pueden beneficiarse de un regimen terapeutico inhibidor de ALK.
Ejemplo 7
5 Deteccion de la expresion de la protema de fusion de ALK en tumores solidos humanos utilizando el analisis por PCR
Tambien se puede detectar la presencia de una o mas protemas de fusion de ALK en una muestra de tumor solido humano utilizando ya sea la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) genomica o con transcriptasa inversa (RT), descrita anteriormente. Vease, p. ej., Cools et al., N. Engl. J. Med. 348. 1201-1214 (2003). Brevemente y a modo de 10 ejemplo, se pueden obtener muestras de tumores solidos de un paciente que tiene, p. ej., CPCNP, utilizando tecnicas convencionales. Se construyen sondas para PCR contra la quinasa ALK truncada o la protema de fusion de EML4-ALK (variante corta o larga) o la protema de fusion de TFG-ALK. Se puede utilizar RNeasy Mini Kit (Qiagen) para extraer el ARN de las muestras de tumor. El ADN se puede extraer utilizando DNeasy Tissue Kit (Qiagen). Para la RT-PCR, se sintetiza la primera hebra de ADNc, p. ej., a partir de 2,5 g de ARN total utilizando, p. ej., el sistema 15 de smtesis de la primera hebra Superscript™ III (Invitrogen) con oligo (dT)20.
A continuacion, se amplifica el gen de fusion de ALK mediante el uso de pares de cebadores, p. ej., EML4-202 y ALK-GSP3 (vease el Ejemplo 2 mas arriba). Para la PCR genomica, la amplificacion del gen de fusion se puede realizar utilizando ADN polimerasa Platinum Taq de alta fidelidad (Invitrogen) con pares de cebadores, p. ej., EML4- 202 y ALK-GSP3 (ver Ejemplo 2, mas arriba). Tal analisis identificara un paciente que tenga un tumor solido 20 caracterizado por la expresion de la quinasa ALK truncada (y/o una o varias protemas de fusion de EML4-ALK o una protema de fusion de TFG-ALK), cuyo paciente es un candidato para el tratamiento utilizando un agente terapeutico inhibidor de ALK, tal como WHI-131 y/o WHI154.

Claims (5)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un inhibidor de ALK para usar en el tratamiento del cancer de un mairnfero caracterizado por la expresion de un polipeptido de fusion de EML4-ALK.
    5 2. Un inhibidor de ALK para usar segun la reivindicacion 1, en donde dicho cancer es cancer de pulmon.
  2. 3. Un inhibidor de ALK para usar segun la reivindicacion 1 o 2, en donde dicho cancer es CPCNP.
  3. 4. Un inhibidor de ALK para usar segun cualquier reivindicacion anterior, en donde dicho inhibidor es un oligonucleotido antisentido o ARNip capaz de inhibir la expresion de dicho polipeptido de fusion de EML4-ALK.
  4. 5. Un inhibidor de ALK para usar segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde dicho inhibidor es 10 un anticuerpo capaz de bloquear la actividad de dicho polipeptido de fusion de EML4-ALK.
  5. 6. Un inhibidor de ALK para usar segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde dicho inhibidor es una molecula pequena tal como WHI-131 y / o WHI-154, o sus analogos.
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