ES2655842T3

ES2655842T3 - EGFR y ROS1 en el cáncer

Info

Publication number: ES2655842T3
Application number: ES13778278.5T
Authority: ES
Inventors: Katherine Eleanor Crosby; Victoria McGUINNESS RIMKUNAS; Matthew Ren Silver; Herbert Haack
Original assignee: Cell Signaling Technology Inc
Current assignee: Cell Signaling Technology Inc
Priority date: 2012-04-18
Filing date: 2013-04-18
Publication date: 2018-02-21
Anticipated expiration: 2033-04-18
Also published as: EP3336181B1; EP2838998A4; WO2013158859A1; DK2838998T3; PL2838998T3; HUE037856T2; EP2838998A1; US20220267854A1; EP3336181A1; US20150056193A1; EP2838998B1; SI2838998T1; PT2838998T; HK1206056A1; HK1256196A1

Abstract

Un método que comprende: detectar, en una muestra biológica de un paciente humano que tiene o se sospecha que tiene cáncer, la presencia de un polipéptido de fusión ROS1 que tiene actividad quinasa ROS1 o de un polinucleótido que codifique al mismo; y detectar, en la muestra biológica, la presencia de un polipéptido EGFR mutante o de un polinucleótido que codifique al mismo.

Description

EGFR y ROS1 en el cáncer

Antecedentes

La presente divulgación versa en general sobre proteínas y genes implicados en el cáncer (por ejemplo, el cáncer humano), y sobre la detección, el diagnóstico y el tratamiento del cáncer.

Muchos cánceres se caracterizan por alteraciones en los sistemas de señalización celular que llevan a un control aberrante de los procesos celulares, incluyendo el crecimiento y la proliferación. Estas alteraciones son causadas a menudo por cambios en la actividad de proteínas de señalización concretas, tales como las quinasas.

En algunos casos, la expresión o actividad aberrante de las proteínas quinasa puede ser el agente causativo del cáncer (y un motor del mismo). La expresión o actividad aberrante puede ser causada, por ejemplo, por mutaciones activadoras que aumenten la actividad quinasa de la proteína, la fusión de la proteína (o de la porción quinasa de la misma) con una proteína secundaria (o porción de la misma), la expresión de una porción truncada de la proteína, o mediante la regulación anormal de la expresión de la proteína de longitud máxima.

El papel oncogénico de los receptores de tirosina quinasa (RTK) ha sido implicado en cánceres sanguíneos tales como el linfoma y la leucemia, así como en muchos tipos de cánceres tumorales sólidos, incluyendo el cáncer de pulmón, el cáncer de colon, el cáncer hepático, el cáncer cerebral y el cáncer de mama. Desgraciadamente, el cáncer de tumores sólidos, a menudo, no es diagnosticado en una fase temprana, y, a menudo, no responde por completo a la cirugía, ni siquiera cuando es combinada con quimioterapia o radioterapia. Por ejemplo, el carcinoma no microcítico de pulmón NSCLC es la causa principal de fallecimiento por cáncer en los Estados Unidos, y representa aproximadamente el 87% de todos los cánceres de pulmón. Véase “Cancer Facts and Figures 2005”, American Cancer Society.

Por ello, sería útil descubrir nuevas formas de identificar el cáncer en una fase temprana, y nuevas maneras (y nuevos reactivos) de tratar el cáncer.

Chenguang Li et al. “Spectrum of Oncogenic Driver Mutations in Lung Adenocarcinomas from East Asian Never Smokers”, PLOS ONE, vol. 6, nº 11, 30 de noviembre de 2011, página e28204, divulga la detección, en una muestra biológica de un paciente que tiene cáncer, de la presencia de un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene actividad quinasa ROS1 y de la presencia de un EGFR mutante.

Compendio

La invención es según se reivindica en las reivindicaciones 1-13.

Esta divulgación se basa, al menos en parte, en el descubrimiento de que en los tumores pueden coexpresarse mutaciones del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) y fusiones del oncogén 1 c-ros (ROS1). Este descubrimiento puede permitir la identificación de pacientes cuyos tumores pueden beneficiarse de una terapia con uno o ambos de un producto terapéutico inhibidor de EGFR o un producto terapéutico inhibidor de ROS1.

En consecuencia, en un aspecto, la divulgación presenta métodos que incluyen detectar, en una muestra biológica de un paciente que tiene o se sospecha que tiene cáncer, la presencia de un polipéptido que tiene actividad quinasa ROS1 o de un polinucleótido que codifique al mismo, y detectar, en la muestra biológica, la presencia de un polipéptido EGFR mutante o de un polinucleótido que codifique al mismo. En algunas realizaciones, la muestra procede de un tumor. En algunas realizaciones, la muestra procede del pulmón del paciente. La muestra puede proceder de un cáncer o carcinoma; por ejemplo, un cáncer de pulmón (por ejemplo, un cáncer no microcítico de pulmón).

El polipéptido que tiene actividad quinasa ROS1 puede ser, por ejemplo, una fusión ROS1. Fusiones ROS1 ejemplares incluyen proteínas de fusión SLC34A2-ROS1, proteínas de fusión CD74-ROS1 y proteínas de fusión FIG-ROS1, proteínas de fusión TPM3-ROS1 (Takeuchi et al., 2012, Nat. Med., 18:378-381), proteínas de fusión SDC4-ROS1 (íd.), proteínas de fusión EZR-ROS1 (íd.) y proteínas de fusión LRIG3-ROS1 (íd.).

El polipéptido EGFR mutante puede incluir una mutación en el dominio quinasa del EGFR. Mutaciones ejemplares incluyen deleciones en el exón 19 y la mutación de la leucina del residuo 858 en arginina (L858R).

Una o ambas de la detección de la presencia de un polipéptido que tiene actividad quinasa ROS1 y la detección de la presencia de un polipéptido EGFR mutante pueden incluir, por ejemplo, el uso de un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo específico a una fusión ROS1 o a un EGFR mutante) y/o el uso de espectrometría de masas. Una o ambas de la detección de la presencia de un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene actividad quinasa ROS1 y la detección de la presencia de un polinucleótido que codifica un polipéptido EGFR mutante pueden incluir, por ejemplo, el uso de una o más de una hibridación in situ, una amplificación de ácidos nucleicos y una secuenciación de ácidos nucleicos.

En algunas realizaciones, los métodos incluyen, además, tratar al paciente con uno o ambos de un inhibidor de la actividad quinasa ROS1 y un inhibidor de EGFR. En algunas realizaciones, el paciente es tratado con un compuesto que inhibe la actividad quinasa ROS1 y EGFR; por ejemplo, AP26113.

En otro aspecto, la divulgación presenta métodos de tratamiento de cáncer en un paciente que incluyen determinar que una muestra biológica procedente de un tumor del paciente incluye un polipéptido que tiene actividad quinasa ROS1 o un polinucleótido que codifica al mismo y un polipéptido EGFR mutante o un polinucleótido que codifica al mismo y administrar al paciente una cantidad terapéuticamente efectiva de un inhibidor de ROS1 (por ejemplo, crizotinib, ASP3026, NVP TAE-684, CH5424802 y AP26113) y un inhibidor de EGFR (por ejemplo, gefitinib, erlotinib, cetuximab, afatinib, necitumumab, nimotuzumab, PF299804, RO5083945, ABT-806 y AP26113), tratando con ello de cáncer al paciente.

En algunas realizaciones, el tumor es un cáncer de pulmón; por ejemplo, un carcinoma o cáncer no microcítico de pulmón.

El polipéptido que tiene actividad quinasa ROS1 puede ser, por ejemplo, una fusión ROS1. Fusiones ROS1 ejemplares incluyen proteínas de fusión SLC34A2-ROS1, proteínas de fusión CD74-ROS1, y proteínas de fusión FIG-ROS1.

En otro aspecto, la divulgación proporciona métodos de tratamiento de cáncer en un paciente que incluyen: detectar la presencia, en una muestra biológica de un paciente que tiene o se sospecha que tiene cáncer, de uno o más polipéptidos seleccionados del grupo constituido por un polipéptido que tiene actividad quinasa ROS1, un polipéptido que tiene actividad quinasa de la quinasa de linfoma anaplásico (ALK) y un polipéptido EGFR mutante; y administrar al paciente una cantidad terapéuticamente efectiva de uno o más de un producto terapéutico inhibidor de ALK/ROS1 y un producto terapéutico inhibidor de EGFR, tratando con ello de cáncer al paciente. En algunas realizaciones, la etapa de detección se lleva a cabo usando un reactivo que se une específicamente a un polipéptido que tiene actividad quinasa ROS1, a un polipéptido que tiene actividad quinasa ALK o a un polipéptido EGFR mutante.

En algunas realizaciones, la etapa de detección se lleva a cabo usando un reactivo que se une específicamente a un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene actividad quinasa ROS1, a un polipéptido que tiene actividad quinasa ALK o a un polipéptido EGFR mutante.

En un aspecto adicional, la divulgación proporciona métodos para identificar a un paciente con cáncer o que se sospecha que tiene cáncer como un paciente que es probable que responda a un producto terapéutico inhibidor de ALK que incluyen: poner en contacto una muestra biológica del paciente con un primer reactivo que se une específicamente a un polipéptido que tiene actividad quinasa ROS1 y con un segundo reactivo que se une específicamente a un polipéptido que tiene actividad quinasa ALK, y detectar si el primer reactivo o el segundo reactivo se une específicamente a la muestra biológica, identificando la detección de la unión a la muestra biológica ya sea del primer reactivo o del segundo reactivo al paciente como un paciente que es probable que responda a un producto terapéutico inhibidor de ALK.

En un aspecto adicional, la divulgación proporciona métodos para identificar a un paciente con cáncer o que se sospecha que tiene cáncer como un paciente que es probable que responda a un producto terapéutico inhibidor de ALK que incluyen: poner en contacto una muestra biológica del paciente con un primer reactivo que se une específicamente a un polipéptido que tiene actividad quinasa ROS1 o que se une específicamente a un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene actividad quinasa ROS1 y con un segundo reactivo que se une específicamente a un polipéptido que tiene actividad quinasa ALK o que se une específicamente a un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene actividad quinasa ALK, y detectar si el primer reactivo o el segundo reactivo se une específicamente a la muestra biológica, identificando la detección de la unión a la muestra biológica ya sea del primer reactivo o del segundo reactivo al paciente como un paciente que es probable que responda a un producto terapéutico inhibidor de ALK.

En diversas realizaciones, el primer reactivo se une específicamente a una proteína quinasa ROS1 de longitud máxima. En diversas realizaciones, el segundo reactivo se une específicamente a una proteína quinasa ALK de longitud máxima. En diversas realizaciones, el primer reactivo se une específicamente al dominio quinasa de la proteína quinasa ROS1. En diversas realizaciones, el segundo reactivo se une específicamente al dominio quinasa de la proteína quinasa ALK. En algunas realizaciones, el primer reactivo es un anticuerpo. En algunas realizaciones, el segundo reactivo es un anticuerpo.

En diversas realizaciones de los métodos anteriores, el paciente es un paciente humano y el cáncer (o presunto cáncer) es de un ser humano. En algunas realizaciones, el producto terapéutico inhibidor de ROS1 o el producto terapéutico inhibidor de ALK es PF-02341066, NVP TAE-684 o AP26113. En algunas realizaciones, el producto terapéutico inhibidor de ROS1 o el producto terapéutico inhibidor de ALK es AP26113, CEP-14083, CEP-14513, CEP11988, CH5424802, WHI-P131 y WHI-P154.

En diversas realizaciones de los anteriores métodos, la muestra biológica es del cáncer o presunto cáncer del paciente. En algunas realizaciones, el cáncer es un cáncer tumoral sólido. En algunas realizaciones, el cáncer es leucemia. En algunas realizaciones, el cáncer es linfoma. En algunas realizaciones, el cáncer es un cáncer de pulmón (por ejemplo, un carcinoma no microcítico de pulmón o un carcinoma microcítico de pulmón). En algunas realizaciones, el cáncer es un cáncer cerebral (por ejemplo, glioblastoma). En algunas realizaciones, el cáncer es un cáncer hepático (por ejemplo, colangiocarcinoma). En algunas realizaciones, el cáncer es cáncer de colon. En algunas realizaciones, el cáncer es cáncer de mama. En algunas realizaciones, el cáncer es cáncer de ovario.

En realizaciones adicionales de los anteriores métodos, la muestra biológica se selecciona del grupo constituido por una biopsia tumoral, un lavado broncoalveolar, una célula tumoral circulante, una resección tumoral, una muestra aspirativa con aguja fina, un nodo linfático, una muestra de médula ósea y un derrame (por ejemplo, un derrame pleural).

En algunas realizaciones de los anteriores métodos, los reactivos de detección (por ejemplo, anticuerpos) están marcados de manera detectable. En otra realización, un reactivo (o primer reactivo) se une específicamente a un polipéptido ROS1 de longitud máxima. En otra realización, un reactivo (o primer reactivo) se une específicamente a un dominio quinasa ROS1. En otra realización, un reactivo (o primer reactivo) se une específicamente a un polipéptido de fusión ROS1 (por ejemplo, se une específicamente a un polipéptido de fusión CD74-ROS1, un polipéptido SLC34A2-ROS1(S), un polipéptido SLC34A2-ROS1(L), un polipéptido SLC34A2-ROS1(VS), un polipéptido FIG-ROS1(L), un polipéptido FIG-ROS1(S) o un polipéptido FIG-ROS1(VL). En diversas realizaciones, el polipéptido que tiene actividad quinasa ROS1 (al que se une específicamente un reactivo de detección) incluye la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1, la SEQ ID NO: 27, la SEQ ID NO: 24, la SEQ ID NO: 22, la SEQ ID NO: 26, la SEQ ID NO: 13, la SEQ ID NO: 7, la SEQ ID NO: 5, o la SEQ ID NO: 11. Estas fusiones ROS1 han sido descritas anteriormente (véanse las publicaciones de patentes estadounidenses nos 20100221737 y 20100143918, y la publicación de PCT nº WO2010/09392).

En algunas realizaciones de los anteriores métodos, un reactivo (o primer reactivo, por ejemplo) se une específicamente a un polipéptido ALK de longitud máxima. En algunas realizaciones, el reactivo se une específicamente a un dominio quinasa ALK. En algunas realizaciones, el reactivo (o segundo reactivo) se une específicamente a un polipéptido de fusión ALK seleccionado del grupo constituido por NPM-ALK, ALO17-ALK, TFG-ALK, MSN-ALK, TPM3-ALK, TPM4-ALK, ATIC-ALK, MYH9-ALK, CLTC-ALK, SEC31L1-ALK RANBP2-ALK CARS-ALK EML4-ALK, KIF5B-ALK y TFG-ALK.

En diversas realizaciones de los anteriores métodos, el polipéptido que tiene actividad quinasa ROS1 es un polipéptido ROS1 de longitud máxima. En otra realización, el polipéptido es un polipéptido de fusión ROS1. En otra realización, el polipéptido de fusión ROS1 se selecciona del grupo constituido por un polipéptido de fusión CD74-ROS1, un polipéptido SLC34A2-ROS1(S), un polipéptido SLC34A2-ROS1(L), un polipéptido SLC34A2-ROS1(VS), un polipéptido FIG-ROS1 (L), un polipéptido FIG-ROS1(S) y un polipéptido FIG-ROS1(VL). En diversas realizaciones, el polipéptido que tiene actividad quinasa ROS1 incluye la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1, la SEQ ID NO: 27, la SEQ ID NO: 24, la SEQ ID NO: 22, la SEQ ID NO: 26, la SEQ ID NO: 13, la SEQ ID NO: 7, laSEQ ID NO: 5 o la SEQ ID NO: 11.

En diversas realizaciones de los anteriores métodos, el polipéptido que tiene actividad quinasa ALK es un polipéptido ALK de longitud máxima. En otra realización, el polipéptido es un polipéptido de fusión ALK. En otra realización, el polipéptido de fusión ALK se selecciona del grupo constituido por NPM-ALK, ALO17-ALK, TFG-ALK, MSN-ALK, TPM3-ALK, TPM4-ALK, ATIC-ALK, MYH9-ALK, CLTC-ALK, SEC31L1-ALK, RANBP2-ALK, CARS-ALK, EML4-ALK, KIF5B-ALK y TFG-ALK.

En algunas realizaciones, los anteriores métodos son implementados en un formato seleccionado del grupo constituido por un ensayo de citometría de flujo, un ensayo de quinasa in vitro, un ensayo de inmunohistoquímica (IHC), un ensayo de inmunofluorescencia (IF), un ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) y un ensayo de análisis por transferencia de tipo Western.

En algunas realizaciones de los anteriores métodos, se detecta la actividad quinasa de un polipéptido (por ejemplo, un polipéptido que tenga actividad quinasa ALK, un polipéptido que tenga actividad quinasa ROS1 o un polipéptido EGFR mutante). En realizaciones adicionales, un reactivo de detección es un péptido marcado con isótopos pesados (AQUA). En otra realización, el péptido marcado con isótopos pesados (AQUA) incluye una secuencia de aminoácidos que incluye una unión de la fusión de un polipéptido de fusión ROS1, una unión de la fusión de un polipéptido de fusión ALK o un fragmento de un polipéptido EGFR mutante que incluya una secuencia mutante de aminoácidos. En otra realización, el método es implementado usando un análisis de espectrometría de masas.

En algunas realizaciones, cuando se detecta el polinucleótido, un reactivo de detección (o el primer reactivo y el segundo reactivo, por ejemplo) es una sonda de ácidos nucleicos. En algunas realizaciones, el reactivo está marcado de manera detectable. En otra realización, la sonda de ácidos nucleicos es una sonda de hibridación fluorescente in situ (FISH) y dicho método es implementado en un ensayo FISH. En otra realización, la sonda de ácidos nucleicos es una sonda de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y dicho método es implementado en un ensayo PCR.

En otro aspecto, la divulgación proporciona métodos para inhibir el avance de un cáncer en un mamífero o de un presunto cáncer en un mamífero que exprese uno o más de un polipéptido que tiene actividad quinasa ROS1, un polipéptido que tiene actividad quinasa ALK y un polipéptido EGFR mutante, incluyendo dichos métodos la etapa de inhibir la expresión y/o la actividad de uno o más del polipéptido que tiene actividad quinasa ROS1, el polipéptido que tiene actividad quinasa ALK y el polipéptido EGFR mutante en dicho cáncer en un mamífero o presunto cáncer en un mamífero.

En otro aspecto, la divulgación proporciona métodos para inhibir el avance de un cáncer en un mamífero o de un presunto cáncer en un mamífero que exprese uno o más polinucleótidos que codifiquen un polipéptido que tiene actividad quinasa ROS1, un polipéptido que tiene actividad quinasa ALK y un polipéptido EGFR mutante que incluyen una etapa de inhibir la expresión de uno o más de los polinucleótidos en dicho cáncer en un mamífero o presunto cáncer en un mamífero.

En aspectos adicionales, la divulgación proporciona métodos para determinar si un compuesto inhibe el avance de un cáncer de pulmón en un mamífero o presunto cáncer de pulmón en un mamífero caracterizado por la expresión de un primer polipéptido con actividad ROS1, de un segundo polipéptido con actividad ALK, y/o de un tercer polipéptido con actividad EGFR que incluyen una etapa de determinar si dicho compuesto inhibe la expresión de dicho primer, segundo o tercer polipéptido en dicho cáncer. En algunas realizaciones, el cáncer procede de un ser humano.

Breve descripción de los dibujos

Las Figuras 1A-1F son fotografías que muestran resultados de inmunohistoquímica y FISH de proteína ROS1 y ácido nucleico ROS1 en tejidos tumorales FFPE de cáncer no microcítico de pulmón (NSCLC). La variación en la localización de la proteína ROS1 es mostrada como sigue: (A) Citoplasmática difusa, indicando las flechas amarillas del recuadro (A) la translocación equilibrada del locus c-ros mediante FISH. (B) Localización punteada con intensidad de ROS1 en un adenocarcinoma, con ampliación (es decir, una imagen ampliada) en el recuadro. (C) Localización citoplasmática de la tinción de ROS1 en un carcinoma megacítico y correspondiente a la tinción con hematoxilina y eosina en el panel E. (D) Adenocarcinoma con tinción citoplasmática única y localización de la membrana, con ampliación en el recuadro que muestra la tinción de la membrana. (E) Tinción con hematoxilina y eosina correspondiente a la tinción de ROS1 en el panel C. (F) Tinción vesicular punteada con ampliación en el recuadro que muestra la tinción vesicular.

Las Figuras 2A y B son imágenes que muestran la detección específica de la fusión/translocación ROS1 (en una línea celular de NSCLC humano) mediante FISH usando una sonda bicolor de escisión. La Figura 2A muestra las localizaciones en el gen ROS1 en las que se hibridan las sondas FISH, y la Fig. 2B muestra la reordenación del gen ROS1 en una línea celular de NSCLC humano (izquierda) y en un tumor de NSCLC humano, dando como resultado señales anaranjada y verde separadas.

La Fig. 3 es un diagrama esquemático que muestra dónde se hibridan las sondas de ADN de los dos conjuntos de sondas con el gen ROS1 y el gen FIG. La sonda proximal de ambos conjuntos de sondas, concretamente la RP1179P9, dará una señal anaranjada, mientras que las tres sondas distales darán una señal verde. El conjunto 1 de sondas se derivó de c-ros, y si se produce una translocación equilibrada, el anaranjado se separará del verde; sin embargo, si se produce una translocación FIG-ROS1, la señal verde desaparecerá. El conjunto 2 de sondas se derivó de c-ros (RP1-179P9 anaranjada) y fig (RP11-213A17 verde).

Las Figuras 4A-4F son fotografías que muestran los resultados de un análisis FISH de células HCC78 (paneles A y B), células U118MG (paneles C y D) y células tumorales FFPE con ID 749 (paneles E y F). Las células HCC78 sometidas a sondeo con el conjunto 1 de sondas (A) y el conjunto 2 de sondas (B) muestran los resultados previstos de la fusión SLC34A2-ROS1 presente en estas células. Las flechas amarillas apuntan a señales de escisión indicativas de una translocación equilibrada en las células HCC78, y las flechas blancas apuntas a un cromosoma intacto. Las células U118MG sometidas a sondeo con el conjunto 1 de sondas (C) y el conjunto 2 de sondas (D) muestran los resultados previstos de la fusión FIG-ROS1 presente en estas células. El tumor 749 FFPE sometido a sondeo con el conjunto 1 de sondas (E) y el conjunto 2 de sondas (F) es idéntico a las células U118MG. Tanto en U118 MG como en el tumor ID 749 sometidos a sondeo con el conjunto 1 de sondas solo se hibrida la sonda c-ros (anaranjada), y la región eliminada (sonda verde) no está presente (paneles C y E, respectivamente). En U-118 MG y el tumor ID 749 sometidos a sondeo con el conjunto 2 de sondas (paneles E y F, respectivamente), se juntan las sondas c-ros (anaranjada) y fig (verde), indicación una fusión fig-ros.

La Figura 5 muestra los resultados de la secuenciación de ADNc de la proteína de fusión ROS1 a partir del tumor 749 (en la línea “sujeto”) y su alineamiento con la secuencia de nucleótidos FIG-ROS1(S) (como “consulta”).

La Fig. 6 es un gráfico de líneas que muestra la respuesta de crecimiento celular en presencia de 0nM, 3nM, 10 nM, 30 nM, 100 nM, 300 nM o 1000 nM de TAE-684 de BaF3 que expresan FIG-ROS1(S) (cuadrados rojos), BaF3 que expresan FIG-ROS1(L) (rombos azules), BaF3 que expresan FLT3ITD (triángulos verdes), y células Karpas 299 (equis moradas).

La Fig. 7 es un gráfico de barras que muestra que las BaF3 que expresan ya sea FIG-ROS1(S) o FIG-ROS1(L) mueren por apoptosis en presencia de TAE-684.

La Fig. 8 es una representación de un análisis por transferencia de tipo Western que muestra que TAE-684 inhibe la fosforilación tanto de FIG-ROS1(S) como de FIG-ROS1(L), así como de sus moléculas de señalización subsiguientes.

Las Figuras 9A y 9B son gráficos de líneas que muestran la respuesta de crecimiento celular en presencia de TAE684 (Fig. 9A) o crizotinib (Fig. 9B) a 0uM, 0,01uM, 0,03uM, 0,10uM, 0,3uM, 1,0uM de células BaF3 transducidas con neo-myc (control negativo; rombos azules); BaF3 que expresan FIG-ROS1(S) (equis moradas), BaF3 que expresan FIG-ROS1(L) (triángulos verdes), BaF3 que expresan FLT3ITD (cuadrados rojos), y células Karpas 299 (asteriscos azules).

La Fig. 10 es una representación de un análisis por transferencia de tipo Western que muestra que el crizotinib inhibe la fosforilación tanto de FIG-ROS1(S) como de FIG-ROS1(L), así como de ALK y de moléculas de señalización adicionales.

Las Figuras 11A-D son fotomicrografías que representan la tinción inmunohistoquímica de EGFR mutante del caso 147 de adenocarcinoma de pulmón, positivo a ROS1/L858R, tincionado con anticuerpos ROS1 D4D6 (11A), EGFR total (11B), EGFR L858R (11C) y EGFR A746-E750del (11D).

Las Figuras 11E-H son fotomicrografías que representan la tinción inmunohistoquímica de EGFR mutante del caso 702 de adenocarcinoma de pulmón, positivo a ROS1/EGFR A746-E750del, tincionado con anticuerpos ROS1 D4D6 (11E), EGFR total (11F), EGFR A746-E750 (11G) y EGFR L858R (11H).

Descripción detallada de las realizaciones preferentes

Esta se basa, al menos en parte, en el descubrimiento de que en los tumores pueden coexpresarse mutaciones de EGFR y fusiones de ROS1. Este descubrimiento puede permitir la identificación de pacientes cuyos tumores pueden beneficiarse de una terapia con uno o ambos de un producto terapéutico inhibidor de los sistemas del EGFR o un producto terapéutico inhibidor de los sistemas de ROS1.

A continuación, se describen con mayor detalle aspectos, ventajas y realizaciones adicionales. Cualquier conflicto entre una definición de una palabra o frase según se entiende en la técnica y una definición de una palabra o frase según se enseña específicamente en esta memoria será resuelta a favor de esta. Según se usan en la presente memoria, los siguientes términos tienen los significados indicados. Según se usan en esta memoria, las formas singulares, “un”, “una” y “el” y “la” también abarcan, específicamente, las formas plurales de los términos a los que se refieren, a no ser que el contexto dicte claramente algo distinto. En la presente memoria, la expresión “alrededor de” es usada con el significado de aproximadamente, en las inmediaciones de, en líneas generales o en el entorno de. Cuando se usa el término “aproximadamente” junto con un intervalo numérico, modifica ese intervalo extendiendo los límites por encima y por debajo de los valores numéricos expresados. En general, el término “aproximadamente” es usado en la presente memoria para modificar un valor numérico por encima y por debajo del valor indicado con una varianza del 20%.

Los términos técnicos y científicos usados en la presente memoria tienen el significado comúnmente entendido por un experto en la técnica a la que pertenece la presente divulgación, a no ser que se defina algo distinto. En la presente memoria se hace referencia a diversas metodologías y a diversos materiales conocidos a los expertos en la técnica. Obras estándar de referencia que presentan los principios generales de la tecnología de anticuerpos de ADN recombinante incluyen Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York (1988), Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nueva York, Nueva York (1989 y actualizaciones hasta septiembre de 2010), Samhrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York (1989); Kaufmanet al., ed., Handbook of Molecular and Cellular Methods in Biology in Medicine, CRC Press, Boca Ratón (1995); McPherson, ed., Directed Mutagenesis: A Practical Approach, IRL Press, Oxford (1991). Obras estándar de referencia que presentan los principios generales de farmacología incluyen Goodman y Gilman, The Pharmacological Basis of Therapeutics, 11ª ed., McGraw Hill Companies Inc., Nueva York (2006).

En consecuencia, en un primer aspecto, la divulgación proporciona métodos de tratamiento de cáncer en un paciente que incluyen: detectar, en una muestra biológica de un paciente que tiene o se sospecha que tiene cáncer, la presencia de uno o más de un polipéptido seleccionado del grupo constituido por un polipéptido que tiene actividad quinasa ROS1 y un polipéptido EGFR mutante; y administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de uno o ambos de un producto terapéutico inhibidor de los sistemas del EGFR o un producto terapéutico inhibidor de los sistemas de ROS1, tratando con ello el cáncer del paciente. En algunas realizaciones, la etapa de detección se lleva a cabo usando un reactivo que se une específicamente ya sea a un polipéptido que tiene actividad quinasa ROS1 o a un polipéptido EGFR mutante.

La proteína quinasa ROS1 humana (codificada por el gen ROS1) es una tirosina quinasa receptora de 2347 aminoácidos de longitud que es propensa a una expresión aberrante, que conduce al cáncer. Puede encontrarse

una descripción de la quinasa ROS1 humana de longitud máxima (con la secuencia de aminoácidos de la proteína ROS1 humana) en el nº de acceso P08922 de UniProt. Según se muestra en la Tabla 1, los dominios de péptidos señal, extracelular, transmembranoso y quinasa de ROS1 se encuentran en los siguientes residuos de aminoácidos en la SEQ ID NO: 1:

Tabla 1

Dominio: Residuos de aminoácidos en la SEQ ID NO: 1

Péptido señal: 1-27

Dominio extracelular: 28-1859

Dominio transmembranoso: 1860-1882

Dominio quinasa: 1945-2222

En la presente memoria, se proporciona la secuencia de ADN codificante de ROS1 humano como la SEQ ID NO: 2.

Además, hay múltiples variantes conocidas de ROS1 que se presentan de forma natural (véase, por ejemplo, Greenman et al., Nature 446: 153-158, 2007). Se conocen las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de ROS1 murino de longitud máxima (véase, por ejemplo, el nº de acceso Q78DX7 de UniProt). Usando experimentación rutinaria, el biólogo con un dominio normal de la técnica sería fácilmente capaz de determinar las secuencias correspondientes en homólogos ROS1 en mamíferos no humanos.

Con ROS1 en su “forma natural” se quiere decir la expresión y/o la activación de la quinasa ROS1 de longitud máxima (es decir, para el ROS1 humano, el polipéptido de 2347 aminoácidos de longitud o el polipéptido de 2320 aminoácidos de longitud tras la eliminación de la secuencia de péptidos señal) en tejido sano (o normal) (por ejemplo, tejido no canceroso) de un individuo normal (por ejemplo, un individuo normal que no padezca cáncer). No parece que la quinasa ROS1 (de longitud máxima o truncada) sea expresada en tejido pulmonar normal en seres humanos (por ejemplo, véase posteriormente en los Ejemplos). Sin embargo, usando los métodos descritos en los posteriores Ejemplos, los inventores han hecho el sorprendente descubrimiento de la expresión de la quinasa ROS1 en el cáncer de pulmón. Tal expresión en una célula atípica (en este caso, una célula cancerosa) cuando no se ve expresión alguna en una célula típica (por ejemplo, una célula no cancerosa del pulmón) es aberrante.

Se ha documentado la quinasa ROS1 expresada aberrantemente, en forma de una fusión con otra proteína, concretamente FIG, en una línea celular de glioblastoma (véanse Charest et al., Genes Chromosomes Cancer 37: 58-71, 2003; Charest et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100: 916-921, 2003) y en cáncer hepático (véase, por ejemplo, la publicación de PCT nº WO2010/093928).

Según se la usa aquí, la expresión “fusión ROS1” se refiere a una porción del polipéptido ROS1 que incluye el dominio quinasa de la proteína ROS1 (o el polinucleótido que codifica la misma) fusionada a la totalidad o a una porción de otro polipéptido (o polinucleótido que codifique el mismo), nombrándose en la fusión el nombre de ese segundo polipéptido o polinucleótido. (El término “fusión” significa simplemente la totalidad o una porción de un polipéptido o polinucleótido del primer gen fusionada a la totalidad o a una porción de un polipéptido o un polinucleótido de un segundo gen). Por ejemplo, una fusión SLC34A2-ROS1 es una fusión entre una porción del polipéptido SLC34A2 (o del polinucleótido que codifica el mismo) y una porción del polipéptido ROS1 (o del polinucleótido que codifica el mismo) que incluye el dominio quinasa ROS1. Una fusión ROS1 resulta a menudo de una translocación o inversión cromosómica. Hay numerosas fusiones ROS1 conocidas, resultando útiles en la presente memoria la totalidad de las fusiones ROS1, e incluyen, sin limitación, las proteínas de fusión SLC34A2-ROS1, cuyos miembros incluyen SLC34A2-ROS1(VS), SLC34A2-ROS1(S), SLC34A2-ROS1(L) (véase la publicación de patente estadounidense nº 20100143918), CD74-ROS1 (véase la publicación de patente estadounidense nº 20100221737), las proteínas de fusión FIG-ROS1, cuyos miembros incluyen FIG-ROS1(S), FIG-ROS1(L) y FIG-ROS1(XL) (véase la publicación de PCT nº WO2010/093928), las proteínas de fusión TPM3-ROS1 (Takeuchi et al., 2012, Nat. Med., 18:378-381), las proteínas de fusión SDC4-ROS1 (íd.), las proteínas de fusión EZR-ROS1 (íd.) y las proteínas de fusión LRIG3-ROS1 (íd.). Véase también el documento WO 2011/0162295.

Todas las proteínas de fusión ROS1 conocidas incluyen el dominio quinasa completo de ROS1 de longitud máxima. Así, según se usa la expresión en la presente memoria, con “polipéptido con actividad quinasa ROS1” (o “polipéptido que tiene actividad quinasa ROS1”) se quiere decir una proteína (o un polipéptido) que incluye el dominio quinasa completo de la proteína ROS1 de longitud máxima y que, así, retiene la actividad quinasa ROS1. Ejemplos no limitantes de proteínas con actividad quinasa ROS1 incluyen, sin limitación, la proteína ROS1 de longitud máxima, las proteínas de fusión SLC34A2-ROS1, cuyos miembros incluyen SLC34A2-ROS1(VS), SLC34A2-ROS1(S), SLC34A2-ROS1(L) (véase la publicación de patente estadounidense nº 20100143918), CD74-ROS1 (véase la publicación de patente estadounidense nº 20100221737) y las proteínas de fusión FIG-ROS1, cuyos miembros incluyen FIG-ROS1 (S), FIG-ROS1 (L) y FIG-ROS1 (XL) (véase la publicación de PCT nº WO2010/093928), y cualquier forma truncada o mutada de la quinasa ROS1 que retenga el dominio quinasa de la proteína quinasa ROS1 de longitud máxima. Dado que el dominio quinasa de ROS1 está definido en la SEQ ID NO: 27, un

“polipéptido con actividad quinasa ROS1” es aquel cuya secuencia de aminoácidos incluya la SEQ ID NO: 27 o una secuencia idéntica a la SEQ ID NO: 27 en al menos un 95%.

La ALK (quinasa de linfoma anaplásico) es una tirosina quinasa receptora de 1620 aminoácidos de longitud que es propensa a una expresión aberrante, que conduce al cáncer. Puede encontrarse una descripción de la quinasa ALK humana de longitud máxima (con la secuencia de aminoácidos de la proteína ALK humana) en el nº de acceso Q9UM73 de UniProt (véase también la patente estadounidense nº 5.770.421, titulada “Human ALK Protein Tyrosine Kinase”). Según se muestra en la Tabla 2, los dominios de péptidos señal, extracelular, transmembranoso y quinasa de ALK se encuentran en los siguientes residuos de aminoácidos en la SEQ ID NO: 35:

Tabla 2

Dominio: Residuos de aminoácidos en la SEQ ID NO: 71

Péptido señal: 1-18

Dominio extracelular: 19-1038

Dominio transmembranoso: 1039-1059

Dominio quinasa: 1116-1392

Además, hay múltiples variantes conocidas de ALK que se presentan de forma natural (véase, por ejemplo, Greenman et al., Nature 446: 153-158, 2007). Se conocen las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de ALK murino de longitud máxima (véase, por ejemplo, Iawahara et al., Oncogene 14: 439-449, 1997). Usando experimentación rutinaria, el biólogo con un dominio normal de la técnica sería fácilmente capaz de determinar las secuencias correspondientes en homólogos ALK en mamíferos no humanos.

Con ALK en su “forma natural” se quiere decir la expresión y/o la activación de la quinasa ALK de longitud máxima (es decir, el polipéptido de 1620 aminoácidos de longitud o el polipéptido de 1602 aminoácidos de longitud tras la eliminación de la secuencia de péptidos señal) en tejido sano (o normal) (por ejemplo, tejido no canceroso) de un individuo normal (por ejemplo, un individuo normal que no padezca cáncer). Pulford et al., J. Cell. Physiol., 199:330358, 2004, proporciona una reseña exhaustiva relativa a polipéptidos ALK y de fusión que incluyen porciones del polipéptido ALK de longitud máxima. En seres humanos normales, la expresión de ALK de longitud máxima ha sido detectada en el cerebro y en el sistema nervioso central, y ha sido documentada en el intestino delgado y el testículo (véase, por ejemplo, Morris et al., Oncogene 14:2175-88, 1997). Sin embargo, no parece que la quinasa ALK (de longitud máxima o truncada) sea expresada en tejido ovárico normal en seres humanos, hallazgo que los inventores han confirmado usando diversos anticuerpos específicos al ALK disponibles comercialmente (por ejemplo, los nos de catálogo 3791, 3633 y 3333 de Cell Signaling Technology, Inc., Danvers, Massachusetts). Sin embargo, usando los métodos descritos en los posteriores Ejemplos, los inventores han hecho el sorprendente descubrimiento de la expresión de la quinasa ALK en el cáncer de ovario. Tal expresión en una célula atípica (en este caso, una célula cancerosa) cuando no se ve expresión alguna en una célula típica (por ejemplo, una célula no cancerosa del ovario) es aberrante.

Se han encontrado en otros cánceres numerosos ejemplos de la quinasa ALK expresada aberrantemente. Por ejemplo, se han encontrado mutaciones puntuales dentro del dominio quinasa en el neuroblastoma, se ha encontrado sobreexpresión de ALK en numerosos cánceres (incluyendo, por ejemplo, retinoblastoma, cáncer de mama y melanoma), y se han descubierto proteínas de fusión que incluyen el dominio quinasa (pero no el dominio transmembranoso) de ALK fusionadas con la totalidad o una porción de una segunda proteína en diversos cánceres, incluyendo el cáncer no microcítico de pulmón (NSCLC) en el tumor miofibroblástico inflamatorio. Véase la reseña en Palmer et al., Biochem. J. 420: 345-361 (2009).

En consecuencia, según se la usa aquí, la expresión “fusión ALK” se refiere a una porción del polipéptido ALK que incluye el dominio quinasa de ALK (o el polinucleótido que codifica la misma) fusionada a la totalidad o a una porción de otro polipéptido (o polinucleótido que codifique el mismo), nombrándose en la fusión el nombre de ese segundo polipéptido o polinucleótido. (El término “fusión” significa simplemente la totalidad o una porción de un polipéptido o polinucleótido del primer gen fusionada a la totalidad o a una porción de un polipéptido o un polinucleótido de un segundo gen). Por ejemplo, una fusión NPM-ALK es una fusión entre una porción del polipéptido o polinucleótido NPM y una porción del polipéptido ALK (o del polinucleótido que codifica el mismo) que incluye el dominio quinasa de ALK. Una fusión ALK resulta a menudo de una translocación o inversión cromosómica. Hay numerosas fusiones ALK conocidas, resultando útiles en la presente memoria la totalidad de las fusiones ALK, e incluyen, sin limitación, NPM-ALK, AL017-ALK, TFG-ALK, MSN-ALK, TPM3-ALK, TPM4-ALK, ATIC-ALK, MYH9-ALK, CLTC-ALK, SEC31L1-ALK, RAKBP2-ALK, CARS-ALK, EML4-ALK KIF5B-ALK y TFG-ALK (véanse, por ejemplo, Palmer et al., Biochem. J. 420:345-361, 2009 (y los artículos ahí citados), la patente estadounidense nº 5.770.421; Rikova et al., Cell 131: 1190-1203, 2007; Soda et al., Nature 448: 561-566, 2007; Morri et al., Science 263: 1281-84, 1994; Du et al., J. Mol. Med 84: 863-875, 2007; Panagopoulos et al., Int. J. Cancer 118: 1181-86, 2006; Cools et al., Genes

Chromosomes Cancer 34: 354-362, 2002; Debelenko et al., Lab. Invest. 83: 1255-65, 2003; Ma et al., Genes Chromosomes Cancer 37: 98-105, 2003; Lawrence et al., Am. J. Pathol. 157: 377-384, 1995; Hernández et al., Blood

94: 3265-68, 1999; Takeuchi K., Clin Cancer Res. 15:3143-49, 2009; Tort et al., Lab. Invest. 81: 419-426, 2001; Trinei et al., Cancer Res. 60: 793-798, 2000; y Touriol et al., Blood 95: 3204-07, 2000. Algunas de estas fusiones ALK tienen múltiples variantes, la totalidad de las cuales son consideradas fusiones ALK y, así, están incluidas en la definición de fusión ALK. Por ejemplo, hay múltiples variantes de TFG-ALK (véase, por ejemplo, Hernández et al., Amer. J. Pathol. 160: 1487-94, 2002) y al menos nueve variantes conocidas de EML4-ALK (véase, por ejemplo, Horn et al., J. of Clinical Oncology 27(26): 4232-35, 2009, las patentes estadounidenses nos 7.700.339 y 7.728.120 y la patente EP nº 1914240).

Según se usa la expresión en la presente memoria, con “polipéptido con actividad quinasa ALK” se quiere decir un polipéptido que incluye el dominio quinasa completo de ALK y que, así, tiene activada la quinasa ALK. Polipéptidos no limitantes con actividad quinasa ALK incluyen ALK de longitud máxima, polipéptidos de fusión ALK (por ejemplo, la fusión NPM-ALK, diversas fusiones EML4-ALK, la fusión ATIC-ALK, la fusión CARS-ALK, la fusión ALO17-ALK, la fusión TFG-ALK, la fusión MSN-ALK, la fusión TPM3-ALK, la fusión TPM4-ALK, la fusión MYH9-ALK, la fusión CLTC-ALK, la fusión SEC31L1-ALK, la fusión RANBP2-ALK, la fusión KIF5B-ALK y la fusión TFG-ALK).

El receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR; también denominado ErbB-1 y HER1 en seres humanos) es el receptor de superficie celular para miembros de la familia del factor de crecimiento epidérmico (familia EGF) de los ligandos proteínicos extracelulares. En la presente memoria se proporciona la secuencia de aminoácidos de un EGFR humano ejemplar en su forma natural (incluyendo la secuencia de señales) como SEQ ID NO: 3; la secuencia de aminoácidos de human EGFR humano en su forma natural (menos la secuencia de señales) es proporcionada en la presente memoria como SEQ ID NO: 4. La secuencia de nucleótidos de un ARNm de EGFR humano ejemplar en su forma natural es proporcionada en la presente memoria como SEQ ID NO: 9. Se ha demostrado que los pacientes que tienen un cáncer no microcítico de pulmón (NSCLC) que porta una mutación somática del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) son hipersensibles a los inhibidores de la tirosina quinasa de EGFR Gefitinib [Lynch, T.J., et al., N Engl J Med, 2004. 350(21): p. 2129-39, y Páez, J.G., et al., Science, 2004. 304(5676):

p. 1497-500] y Erlotinib [Pao, W., et al., Proc Natl Acad Sci USA, 2004. 101(36): p. 13306-11].

Es sabido que en la molécula de EGFR surgen mutaciones. Tal como se lo usa en la presente memoria, el término “mutante” o “mutación” se refiere a una molécula (por ejemplo, un polipéptido o un polinucleótido) que tiene una estructura diferente de la de la molécula en su forma natural. Esa diferencia en estructura con respecto a la molécula en su forma natural incluye, sin limitación, una secuencia diferente (por ejemplo, una secuencia diferente de aminoácidos o de nucleótidos), secuencias adicionales, secuencias ausentes (es decir, falta una porción de la secuencia), cambios en la modificación (metilación, fosforilación, etc.), y/o fusión de la totalidad o parte de la molécula en su forma natural con otra molécula. Con “forma natural” se quiere decir aquella forma de la molécula que se presenta de manera natural en la mayoría de individuos de la especie de la que se deriva la molécula mutante, y/o la forma de la molécula que se presenta de manera natural en un individuo sano (por ejemplo, no canceroso) de una especie de la que se deriva la molécula mutante. La secuencia de la molécula en su forma natural es la normalmente proporcionada en la base de datos de GenBank. Por ejemplo, se proporciona una secuencia de aminoácidos de EGFR humano en su forma natural en la SEQ ID NO: 3 (sin la secuencia de señales de 24 aminoácidos de longitud) y en la SEQ ID NO: 4 (con la secuencia de señales).

Tal como se lo usa en la presente memoria, un “EGFR mutante” incluye cualquier tipo de mutación (es decir, cambio) en una molécula de EGFR que haga que el EGFR mutante sea diferente del EGFR en su forma natural. En algunas realizaciones, la mutación aumenta la actividad quinasa de la molécula de EGFR y/o vuelve una célula tumoral sensible a uno o más inhibidores de EGFR. En algunas realizaciones, la mutación es en el dominio quinasa del EGFR. En algunas realizaciones, la mutación es en uno de los exones 18 a 21 del gen de EGFR humano. Las mutaciones más comunes del EGFR son deleciones dentro del exón 19 (por ejemplo, una deleción dentro del marco de 15 pb de nucleótidos en el exón 19 (Del E746-A750) y una mutación puntual que sustituye la leucina con arginina en el codón 858 del exón 21 (L858R). Estas dos clases de EGFR mutantes representan el 85-90% de las mutaciones activantes del EGFR [Riely, G.J., et al, Clin Cancer Res, 2006.12:7232-41]. Las deleciones del exón 19 incluyen: Del E746_A750; Del E746_S752>V; Del E746_T751>A; Del E746_T751; Del L747_A750>P; Del L747_E749; Del L747_P753>Q; Del L747_P753>S; Del L747_S752; Del L747_T751>P; Del L747_T751 y Del S752_I759. Otras mutaciones incluyen T790M, S768I, L861Q, 2240de112, G719C (Lynch et al., supra), G791A y G719S (Páez et al., 2004, Science, 304:1497-1500), y las inserciones en el exón 19 (He et al., 2011, Clin. Cancer Res., 18:1790-97). La capacidad de detectar productos génicos mutados en células cancerosas puede identificar a pacientes con máxima probabilidad de beneficiarse de tales terapias, y hacer ensayos clínicos más eficaces e informativos.

Los EGFR mutantes pueden ser detectados por medios estándar conocidos en la técnica. Por ejemplo, pueden detectarse mutantes en el ámbito de nucleótidos mediante secuenciación, amplificación de ácidos nucleicos usando cebadores y/o sondas específicos a la secuencia de la forma natural o de la mutante, y análisis de amplificación y longitud para detectar mutantes delecionales. Se dan a conocer métodos ejemplares para determinar el estado mutacional del EGFR en Rosell et al., 2009, N. Engl. J. Med., 361:958-967 y Li et al., 2011, PLoS ONE, 6: e28204. Hay conjuntos de reactivos para análisis de ácidos nucleicos disponibles comercialmente; por ejemplo, EGFR Pyro Kit (QIAGEN), EGFR PCR Kit (QIAGEN) y EGFR RGQ PCR Kit (QIAGEN). El conjunto de reactivos EGFR RGQ

PCR es capaz de detectar 29 mutaciones en el gen del EGFR, incluyendo 19 deleciones en el exón 19, T790M, L858R, L861A, S768I y G719X (detecta la presencia de G719S, G719A o G719C, pero no distingue entre ellos).

Pueden detectarse EGFR mutantes específicos en el ámbito polipeptídico (por ejemplo, mediante transferencia de tipo Western o inmunohistoquímica) usando anticuerpos específicos al mutante; por ejemplo, el AcM XP® de conejo del receptor de EGF (específico a E746-A750del) (6B6) o el AcM de conejo del receptor de EGF (específico al mutante L858R) (43B2), ambos de Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, Massachusetts) o péptidos AQUA específicos a la mutación (Stemmann et al., 2001, Cell, 107: 715-726). Pueden prepararse anticuerpos específicos al mutante que se unan específicamente a otros polipéptidos EGFR mutantes identificados. En el documento WO 2009/126306 se dan a conocer anticuerpos ejemplares específicos a mutantes.

Tal como se usa el término en la presente memoria, “polipéptido” (o “secuencia de aminoácidos” o “proteína”) se refiere a un polímero formado a partir del enlace, en un orden definido, de, preferentemente, α-aminoácidos, D-, Laminoácidos, y combinaciones de los mismos. El enlace entre un residuo de aminoácido y el siguiente se denomina enlace amídico o enlace peptídico. Ejemplos no limitantes de polipéptidos incluyen un oligopéptido, un péptido, un polipéptido o una secuencia de proteínas y fragmentos o porciones de los mismos, y se refieren a moléculas que se presentan de forma natural o sintéticas. Los polipéptidos también incluyen moléculas derivatizadas tales como glicoproteínas y lipoproteínas, así como polipéptidos de menor peso molecular. No se pretende que “secuencia de aminoácidos” y expresiones similares, tales como “polipéptido” o “proteína”, limiten la secuencia indicada de aminoácidos a la secuencia completa nativa de aminoácidos asociada con la molécula proteínica enumerada.

Se reconoce en la técnica que puede hacerse que algunas secuencias de aminoácidos de un polipéptido indicado (por ejemplo, un polipéptido FIG-ROS1(S)) varíen sin efecto significativo en la estructura o en la función de la proteína mutante. Si se contemplan tales diferencias en secuencia, debería recordarse que habrá áreas críticas en la proteína que determinen la actividad (por ejemplo, el dominio quinasa de ROS1). En general, es posible sustituir residuos que forman la estructura terciaria, siempre y cuando se usen residuos que realicen una función similar. En otros casos, el tipo de residuo puede carecer por completo de importancia si la alteración se produce en una región no crítica de la proteína.

Así, un polipéptido con actividad ROS1 o un polipéptido con actividad ALK incluye, además, variantes de los polipéptidos descritos en la presente memoria que presentan actividad quinasa ROS1 o actividad quinasa ALK sustanciales. Algunas sustituciones conservadoras no limitantes incluyen el intercambio de uno por otro entre los aminoácidos alifáticos Ala, Val, Leu e Ile; el intercambio de los residuos de hidroxilo Ser y Thr; el intercambio de los residuos ácidos Asp y Glu; el intercambio de los residuos amídicos Asn y Gln; el intercambio de los residuos básicos Lys y Arg; y el intercambio de los residuos aromáticos Phe y Tyr. Ejemplos adicionales de sustituciones conservadoras de aminoácidos conocidos a los expertos en la técnica son: Aromáticos: fenilalanina triptófano tirosina (por ejemplo, un residuo de triptófano es sustituido con una fenilalanina); Hidrófobos: leucina isoleucina valina; Polar: glutamina asparagina; Básicos: arginina lisina histidina; Ácidos: ácido aspártico ácido glutámico; Pequeños: alanina serina treonina metionina glicina. Según se ha indicado anteriormente con detalle, en Bowie et al., Science 247, supra, puede encontrarse orientación adicional en cuanto a qué cambios en aminoácidos es probable que sean fenotípicamente silentes (es decir, no es probable que tengan un efecto perjudicial significativo sobre una función).

En algunas realizaciones, una variante puede tener cambios “no conservadores”; por ejemplo, la sustitución de una glicina con un triptófano. Variantes similares también pueden incluir deleciones o inserciones de aminoácidos, o ambas. Usando programas informáticos muy conocidos en la técnica —por ejemplo, el soporte lógico DNASTAR—, puede encontrarse orientación para determinar qué residuos de aminoácidos pueden ser sustituidos, insertados o eliminados sin abolir la actividad biológica o inmunológica.

Los polipéptidos que tienen actividad quinasa ROS1 pueden incluir la proteína ROS1 humana de longitud máxima (que tiene una secuencia de aminoácidos expresada en la SEQ ID NO: 1), y los polipéptidos de fusión ROS1 que tienen las secuencias de aminoácidos expresadas en las SEQ ID Nos. 5, 7, 11, 13, 22, 24 y 26 (incluyan o no una secuencia líder), una secuencia de aminoácidos que codifica un polipéptido que incluye al menos seis aminoácidos contiguos que abarcan la unión de la fusión (es decir, las secuencias en la unión entre la proteína socia no ROS1 y la proteína ROS1 —véase la Tabla 3—, así como polipéptidos que tienen una similitud de al menos el 90%, más preferentemente una similitud de al menos el 95%, y aún más preferentemente una similitud de al menos el 96%, el 97%, el 98% o el 99% con los descritos anteriormente.

Los polipéptidos que tienen actividad quinasa ALK incluyen la proteína ALK humana de longitud máxima (que tiene una secuencia de aminoácidos expresada en la SEQ ID NO: 35) y los diversos polipéptidos de fusión ALK descritos en la presente memoria, una secuencia de aminoácidos que codifica un polipéptido que incluye al menos seis aminoácidos contiguos que abarcan la unión de la fusión (es decir, las secuencias en la unión entre la proteína socia no ALK y la proteína ALK, así como polipéptidos que tienen una similitud de al menos el 90%, más preferentemente una similitud de al menos el 95%, y aún más preferentemente una similitud de al menos el 96%, el 97%, el 98% o el 99% con los descritos anteriormente.

Los reactivos específicos al ROS1 de longitud máxima y los reactivos específicos al polipéptido de fusión ROS1 (tales como anticuerpos policlonales y monoclonales) o los reactivos específicos a la ALK de longitud máxima y los reactivos específicos al polipéptido de fusión ALK (tales como anticuerpos policlonales y monoclonales) que son útiles en ensayos para detectar la expresión de polipéptidos ROS1 o ALK y/o actividad quinasa ROS1 o ALK según se describe posteriormente, o como productos terapéuticos inhibidores de ROS1 o productos terapéuticos inhibidores de ALK capaces de inhibir la función/actividad de la proteína ROS1 y/o la función/actividad de la proteína ALK. Además, tales polipéptidos pueden ser usados en el sistema de doble híbrido en levadura para “capturar” proteínas de unión, que son también productos terapéuticos candidatos inhibidores de ROS1 o productos terapéuticos inhibidores de ALK según la presente divulgación. Fields y Song, Nature 340: 245-246 (1989), describen el sistema de doble híbrido en levadura.

En algunas realizaciones, un reactivo de detección puede incluir, además, una marca detectable (por ejemplo, una marca fluorescente o una marca infrarroja). “Marca detectable”, con respecto a un polipéptido, un polinucleótido o un reactivo (por ejemplo, un anticuerpo o una sonda FISH) divulgados en la presente memoria significa una modificación química, biológica o de otro tipo del o al polipéptido, polinucleótido o anticuerpo, incluyendo, sin limitación, modificaciones de fluorescencia (por ejemplo, FITC o ficoeritrina), infrarrojas, de masa (por ejemplo, un marcaje isobárico), de residuo, de tinción (tinción cromófora), radioisotópica (por ejemplo, 32P), de marca o marcaje (marcaje myc o marcaje GST), etc., mediante la cual se puede detectar la presencia de la molécula de interés. Tal polipéptido, polinucleótido o reactivo es denominado, así, “marcado de manera detectable”. La marca detectable puede estar unida al polipéptido, polinucleótido o agente de unión mediante un enlace químico covalente (por ejemplo, un enlace peptídico o un enlace de fosfodiéster) o no covalente (por ejemplo, un enlace iónico).

Los reactivos útiles en los métodos dados a conocer en la presente memoria incluyen, sin limitación, reactivos tales como anticuerpos, o fracciones de unión de los mismos, que se unan específicamente a la proteína ROS1 de longitud máxima o a una de las muchas proteínas de fusión ROS1, o a una proteína ROS1 de longitud máxima o a u na de las muchas proteínas de fusión ROS1 expresadas en un cáncer, o a un polipéptido EGFR mutante. “Que se une específicamente” significa que un reactivo o agente de unión (por ejemplo, una sonda de ácidos nucleicos, un anticuerpo) interactúa con su molécula diana, dependiendo la interacción de la presencia de una estructura particular (por ejemplo, el determinante antigénico o epítopo en el polipéptido o la secuencia de nucleótidos del polinucleótido); en otras palabras, el reactivo reconoce y se une a un polipéptido específico o a una estructura de polinucleótidos, en vez de a todos los polipéptidos o polinucleótidos en general. “Fragmento de unión del mismo” significa un fragmento

o porción de un reactivo que se une específicamente a la molécula diana (por ejemplo, un fragmento Fab de un anticuerpo).

Un reactivo que se una específicamente a la molécula diana puede ser denominado reactivo específico a la diana o reactivo antidiana. Por ejemplo, un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido FIG-ROS1(L) puede ser denominado anticuerpo específico a FIG-ROS1(L) o anticuerpo anti FIG-ROS1(L). De manera similar, una sonda de ácidos nucleicos que se une específicamente a un polinucleótido FIG-ROS1(L) puede ser denominada sonda de ácidos nucleicos específica a FIG-ROS1(L) o sonda de ácidos nucleicos anti FIG-ROS1(L).

En algunas realizaciones, cuando la molécula diana es un polipéptido, un reactivo que se une específicamente a una molécula diana tiene una afinidad de unión (KD) hacia su molécula diana de 1×10-6 M o menos. En algunas realizaciones, un reactivo que se une específicamente a una molécula diana tiene hacia su molécula diana una KD de 1×10-7 M o menos, o una KD de 1×10-8 M o menos, o una KD de 1×10-9 M o menos, o una KD de 1×10-10 M o menos, o una KD de 1×10-11 M o menos, o una KD de 1×10-12 M o menos. En ciertas realizaciones, la KD de un reactivo que se une específicamente a una molécula diana es de 1 pM a 500 pM, o está entre 500 pM y 1 μM, o entre 1 μM y 100 nM, o entre 100 mM y 10 nM hacia su molécula diana. Ejemplos no limitantes de una molécula diana a la que se une específicamente un reactivo incluyen el polipéptido ROS1 de longitud máxima, el polipéptido ALK de longitud máxima, una de las muchas proteínas de fusión ALK y/o los polipéptidos de fusión ROS1 descritos en la presente memoria, o un polipéptido EGFR mutante.

En algunas realizaciones, cuando la molécula diana es un polinucleótido, un reactivo que se une específicamente a su molécula diana es un reactivo que se hibrida en condiciones estrictas con su polinucleótido diana. La expresión “condiciones estrictas” con respecto a condiciones de hibridación con secuencias de nucleótidos o sondas de nucleótidos es el “rigor” que se produce dentro de un intervalo desde aproximadamente Tm menos 5°C (es decir, 5°C por debajo de la temperatura de fusión (Tm) del reactivo o de la sonda de ácidos nucleicos) hasta aproximadamente de 20°C a 25°C por debajo de Tm. Condiciones estrictas típicas son: incubación a 42°C durante la noche en una solución que comprende: formamida al 50%, 5× SSC (750 mM NaCl, 75 mM citrato trisódico), 50 mM fosfato sódico (pH 7,6), 5× solución de Denhardt, sulfato de dextrano al 10%, y 20 microgramos/ml de ADN de esperma desnaturalizado cizallado de salmón, seguido por el lavado de los filtros en 0,1× SSC a aproximadamente 65°C. Según entenderán los expertos en la técnica, el rigor de la hibridación puede ser alterado para identificar o detectar secuencias idénticas o afines de polinucleótidos. Con “reactivo (por ejemplo, una sonda de polinucleótidos o nucleótidos) que se hibrida en condiciones estrictas con un polinucleótido diana (por ejemplo, un polinucleótido ROS1 de longitud máxima)” se pretende que el reactivo (por ejemplo, la sonda de polinucleótidos o nucleótidos (por ejemplo, ADN, ARN, o un híbrido de ADN-ARN)) se hibride en toda la longitud del polinucleótido de referencia o se hibride con una porción del polinucleótido de referencia que es de al menos aproximadamente 15 nucleótidos (nt), o con al menos aproximadamente 20 nt, o con al menos aproximadamente 30 nt, o con aproximadamente 30-70 nt del

polinucleótido de referencia. Estas sondas de nucleótidos son útiles como sondas diagnósticas (por ejemplo, para FISH) y cebadores (por ejemplo, para PCR), según se expone en la presente memoria.

Los reactivos útiles en la puesta en práctica de los métodos divulgados, incluyen, entre otros, anticuerpos específicos a ROS1 de longitud máxima y específicos al polipéptido de fusión ROS1, anticuerpos específicos a ALK de longitud máxima y específicos al polipéptido de fusión ALK, anticuerpos específicos al EGFR mutante, y péptidos AQUA (péptidos marcados con isótopos pesados) correspondientes a —y adecuados para— la detección y la cuantificación de la expresión del polipéptido indicado en una muestra biológica. Así, un “reactivo específico al polipéptido ROS1” es cualquier reactivo —biológico o químico— capaz de unirse específicamente con el polipéptido ROS1 expresado en una muestra biológica, de detectarlo y/o de cuantificar la presencia o el nivel del mismo. Asimismo, un “reactivo específico al polipéptido ALK” es cualquier reactivo —biológico o químico— capaz de unirse específicamente con el polipéptido ALK expresado en una muestra biológica, de detectarlo y/o de cuantificar la presencia o el nivel del mismo. Un “reactivo específico al polipéptido EGFR mutante” es cualquier reactivo — biológico o químico— capaz de unirse específicamente con el polipéptido EGFR mutante expresado en una muestra biológica, de detectarlo y/o de cuantificar la presencia o el nivel del mismo. Los términos incluyen, sin limitación, los anticuerpos y reactivos peptídicos AQUA presentados posteriormente, y agentes de unión equivalentes que estén dentro del alcance de la presente divulgación.

Los anticuerpos que se unen específicamente a una proteína ROS1 de longitud máxima, a uno de los polipéptidos de fusión ROS1, a una proteína ALK de longitud máxima, a uno de los polipéptidos de fusión ALK, o a un polipéptido EGFR mutante en un cáncer también se pueden unir a secuencias peptídicas epitópicas altamente homólogas y equivalentes en otras especies de mamíferos; por ejemplo, murinas o de conejo, y viceversa. Anticuerpos útiles en la puesta en práctica de los métodos divulgados en la presente memoria incluyen (a) anticuerpos monoclonales, (b) anticuerpos policlonales purificados que se unen específicamente al polipéptido diana (por ejemplo, la unión de la fusión del polipéptido de fusión, (c) anticuerpos descritos anteriormente en (a)-(b) que se unen específicamente a epítopos equivalentes y muy homólogos o a sitios de fosforilación en otras especies no humanas (por ejemplo, ratón, rata), y (d) fragmentos de los anteriores (a)-(c) que se unen específicamente al antígeno (o, más preferentemente, al epítopo) unidos por los anticuerpos ejemplares dados a conocer en la presente memoria.

El término “anticuerpo” o “anticuerpos” se refiere a todos los tipos de inmunoglobulinas, incluyendo IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, incluyendo los fragmentos de unión de las mismas (es decir, fragmentos de un anticuerpo que son capaces de unirse específicamente a la molécula diana del anticuerpo, tales como los fragmentos Fab y F(ab′)2), así como anticuerpos recombinantes, humanizados, policlonales y monoclonales y/o fragmentos de unión de los mismos. Los anticuerpos pueden derivarse de cualquier especie de animal, tal como un mamífero. Anticuerpos naturales ejemplares no limitantes incluyen anticuerpos derivados de seres humanos, pollos, cabras y roedores (por ejemplo, ratas, ratones, hámsteres y conejos), incluyendo roedores transgénicos modificados genéticamente para producir anticuerpos humanos (véanse, por ejemplo, Lonberg et al., WO93/12227; la patente estadounidense nº 5.545.806; y Kucherlapati, et al., WO91/10741; la patente estadounidense nº 6.150.584). Los anticuerpos también pueden ser anticuerpos quiméricos. Véanse, por ejemplo, M. Wroser et al., Molec. Immunol. 26: 403-11 (1989); Morrision et al., Proc. Nat’l. Acad. Sci. 81: 6851 (1984); Neuberger et al., Nature 312: G04 (1984)). Los anticuerpos pueden ser anticuerpos monoclonales recombinantes producidos según los métodos dados a conocer en la patente estadounidense nº 4.474.93 (Reading) o la patente estadounidense nº 4.16.567 (Cabilly et al.). Los anticuerpos también pueden ser anticuerpos específicos construidos químicamente creados según el método dado a conocer en la patente estadounidense nº 4.676.980 (Segel et al.).

Anticuerpos naturales son los anticuerpos producidos por un animal anfitrión; sin embargo, la divulgación también contempla anticuerpos alterados genéticamente en los que se ha hecho que la secuencia de aminoácidos varíe con respecto a la de un anticuerpo nativo. Debido a la relevancia de las técnicas de ADN recombinantes para esta solicitud, no es preciso limitarse a las secuencias de aminoácidos encontradas en anticuerpos naturales; los anticuerpos pueden ser rediseñados para obtener las características deseadas. Las posibles variaciones son muchas y oscilan entre el cambio de solo uno o algunos aminoácidos y el rediseño completo de, por ejemplo, la región variable o la constante. En general, los cambios en la región constante se realizarán para mejorar o alterar características, tales como complementar la fijación, la interacción con membranas y otras funciones efectoras. Los cambios en la región variable se realizarán para mejorar las características de unión a antígenos. La expresión “anticuerpo humanizado”, usado en la presente memoria, se refiere a moléculas de anticuerpos en las que se han sustituido aminoácidos en las regiones no de unión de antígenos para que se asemejen más estrechamente a un anticuerpo humano, mientras sigan conservando la capacidad de unión original. Otros anticuerpos específicamente contemplados son los anticuerpos oligoclonales. Según se usa en la presente memoria, la expresión “anticuerpos oligoclonales” se refiere a una mezcla predeterminada de diferentes anticuerpos monoclonales. Véanse, por ejemplo, la publicación de PCT WO 95/20401; las patentes estadounidenses nos 5.789.208 y 6.335.163. En una realización, se generan en una única célula anticuerpos oligoclonales consistentes en una mezcla predeterminada de anticuerpos contra uno o más epítopos. En otras realizaciones, los anticuerpos oligoclonales incluyen varias cadenas pesadas capaces de emparejarse con una cadena ligera común para generar anticuerpos con especificidades múltiples (por ejemplo, la publicación de PCT WO 04/009618). Los anticuerpos oligoclonales son particularmente útiles cuando se desee seleccionar como blancos múltiples epítopos en una única molécula diana. En vista de los ensayos y de los epítopos dados a conocer en la presente memoria, los expertos en la técnica

pueden generar o seleccionar anticuerpos o mezclas de anticuerpos que son aplicables para un propósito previsto y una necesidad deseada.

En la presente divulgación también se incluyen anticuerpos recombinantes. Estos anticuerpos recombinantes tienen la misma secuencia de aminoácidos que los anticuerpos naturales o tienen secuencias de aminoácidos de los anticuerpos naturales alteradas. Pueden ser creados en cualquier sistema de expresión, incluyendo sistemas de expresión tanto procariotas como eucariotas o usando métodos de expresión en fagos (véanse, por ejemplo, Dower et al., WO91/17271 y McCafferty et al., WO92/01047, patente estadounidense nº 5.969.108). Los anticuerpos pueden ser diseñados de numerosas formas. Pueden ser creados como anticuerpos monocatenarios (incluyendo inmunofármacos modulares pequeños o SMIP™), fragmentos Fab y F(ab′)2, etc. Los anticuerpos pueden ser humanizados, quimerizados, desinmunizados, o ser plenamente humanos. Numerosas publicaciones presentan los muchos tipos de anticuerpos y los métodos de diseño de tales anticuerpos. Por ejemplo, véanse las patentes estadounidenses nos 6.355.245, 6.180.370, 5.693.762, 6.407.213, 6.548.640, 5.565.332, 5.225.539, 6.103.889 y

5.260.203. Los anticuerpos alterados genéticamente pueden ser funcionalmente equivalentes de los anticuerpos naturales anteriormente mencionados. En ciertas realizaciones, anticuerpos modificados pueden proporcionar estabilidad o/y eficacia terapéutica mejoradas.

Ejemplos no limitantes de anticuerpos modificados incluyen aquellos con sustituciones conservadoras de residuos de aminoácidos, y una o más deleciones o adiciones de aminoácidos que no alteran de forma significativamente perjudicial la función de unión a antígenos. Las sustituciones pueden abarcar desde cambiar o modificar uno o más residuos de aminoácidos hasta el rediseño completo de una región, siempre y cuando se mantenga la utilidad terapéutica. Los anticuerpos pueden ser modificados después de su traducción (por ejemplo, acetilación y/o fosforilación) o pueden ser modificados sintéticamente (por ejemplo, la fijación de un grupo marcador). Los anticuerpos con regiones constantes o Fc diseñadas o variantes pueden resultar útiles en la modulación de funciones efectoras, tales como, por ejemplo, la citotoxicidad dependiente del antígeno (ADCC) y la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC). Tales anticuerpos con regiones constantes o Fc diseñadas o variantes pueden resultar útiles en casos en los que se expresa una proteína de individualización parental en tejido normal; en estos casos, los anticuerpos variantes sin función efectora pueden provocar la respuesta terapéutica deseada sin dañar el tejido normal. En consecuencia, ciertos aspectos y métodos de la presente divulgación están relacionados con anticuerpos con funciones efectoras alteradas que incluyen una o más sustituciones, inserciones y/o deleciones de aminoácidos. La expresión “biológicamente activa” se refiere a una proteína que tiene funciones estructurales, reguladoras o bioquímicas de una molécula que se da de forma natural. Asimismo, “inmunológicamente activa” se refiere a la capacidad del polipéptido natural, recombinante o sintético (por ejemplo, uno de los polipéptidos de fusión ROS1 o ALK descritos en la presente memoria), o de cualquier oligopéptido de los mimos, de inducir una respuesta inmunitaria específica en animales o células apropiados y de unirse con anticuerpos específicos.

También dentro de la presente divulgación hay moléculas de anticuerpos con menos de 4 cadenas, incluyendo anticuerpos monocatenarios, anticuerpos de camélidos y similares y componentes de un anticuerpo, que incluyan una cadena pesada o una cadena ligera. En algunas realizaciones una cadena de inmunoglobulina puede incluir, en orden de 5′ a 3′, una región variable y una región constante. La región variable puede incluir tres regiones determinantes de la complementariedad (CDR), con regiones marco (FR) intercaladas para una estructura FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4. También dentro de la divulgación hay regiones y CDR variables de cadena pesada o ligera. Un anticuerpo puede incluir una región constante de cadena pesada que incluya algunas o la totalidad de una región CH1, de bisagra, CH2 y una región CH3.

Un sitio epitópico no limitante de un anticuerpo específico al polipéptido de fusión es un fragmento peptídico que consiste esencialmente en aproximadamente de 11 a 17 aminoácidos de una secuencia de polipéptidos de fusión, fragmento que abarca la unión de la fusión entre la porción ROS1 o ALK de la molécula y la porción de la molécula del socio de fusión no ROS1 o no ALK. Se apreciará que los anticuerpos que se unen específicamente con péptidos/epítopos más cortos o más largos que abarcan la unión de la fusión de un polipéptido de fusión ROS1 o ALK están dentro del alcance de la presente divulgación.

La divulgación no está limitada al uso de anticuerpos, sino que incluye moléculas equivalentes, tales como dominios de unión a proteínas o aptámeros de ácidos nucleicos, que se unen, de forma específica a la proteína ROS1 o ALK

o específica a la proteína de fusión ROS1 o ALK o específica al EGFR mutante, con esencialmente el mismo epítopo al que se une un anticuerpo útil en los métodos divulgados. Véase, por ejemplo, Neuberger et al., Nature 312: 604 (1984). En los métodos dados a conocer en la presente memoria se pueden emplear adecuadamente tales reactivos equivalentes no anticuerpos.

Los anticuerpos policlonales útiles en la puesta en práctica de los métodos dados a conocer en la presente memoria pueden producirse según técnicas estándar inmunizando a un animal adecuado (por ejemplo, conejo, cabra, etc.) con un antígeno que abarque un epítopo específico a una proteína de fusión o a una proteína mutante deseadas (por ejemplo, la unión de la fusión entre el socio proteínico no ROS1 o no ALK y el socio proteínico ROS1 o ALK en un polipéptido de fusión ROS1 o ALK o un fragmento de un polipéptido EGFR mutante que incluya uno o más residuos mutantes), recogiendo suero inmune del animal y separando del suero inmune los anticuerpos policlonales, y purificando los anticuerpos policlonales que tengan la especificidad deseada, según procedimientos conocidos. El antígeno puede ser un antígeno peptídico sintético que incluya la secuencia epitópica deseada seleccionado y

construido según técnicas muy conocidas. Véanse, por ejemplo, ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, capítulo 5, p. 75-76, Harlow & Lane ed., Cold Spring Harbor Laboratory (1988); Czernik, Methods In Enzymology, 201: 264283 (1991); Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85: 21-49 (1962)). Los anticuerpos policlonales producidos según se describe en la presente memoria pueden ser filtrados y aislados según se describe adicionalmente más abajo.

En los métodos divulgados en la presente memoria también pueden emplearse de forma beneficiosa anticuerpos monoclonales, y pueden ser producidos en líneas celulares de hibridoma según la conocidísima técnica de Kohler y Milstein. Nature 265: 495-97 (1975); Kohler y Milstein, Eur. J. Immunol. 6: 511 (1976); véase también, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Ausubel et al. ed. (Wiley and Sons, Nueva York, Nueva York, 1989 y las actualizaciones anuales hasta 2010, inclusive). Los anticuerpos monoclonales así producidos son muy específicos, y mejoran la selectividad y la especificidad de los métodos de ensayo proporcionados por la presente divulgación. Por ejemplo, una solución que contenga el antígeno apropiado (por ejemplo, un péptido sintético que incluya la unión de la fusión del polipéptido de fusión ROS1) puede ser inyectada en un ratón y, después de un tiempo suficiente (en consonancia con las técnicas convencionales), sacrificado el ratón y obtenidas células de su bazo. A continuación, las células del bazo son inmortalizadas fusionándolas con células de mieloma, normalmente en presencia de polietilenglicol, para producir células de hibridoma. Por ejemplo, pueden producirse hibridomas de fusión de conejo según se describe en la patente estadounidense nº 5.675.063. A continuación, las células de hibridoma son cultivadas en un caldo de cultivo adecuado de selección, tal como hipoxantina-aminopterina-timidina (HAT), y el sobrenadante es filtrado para obtener anticuerpos monoclonales que tienen la especificidad deseada, según se describe posteriormente. El anticuerpo segregado puede ser recuperado del sobrenadante del cultivo tisular por métodos convencionales tales como precipitación, intercambio de iones o cromatografía de afinidad, o similares.

También se pueden producir fragmentos Fab monoclonales en Escherichia coli mediante técnicas recombinantes conocidas a los expertos en la técnica. Véanse, por ejemplo, W. Huse, Science 246: 1275-81 (1989); Mullinax et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. 87: 8095 (1990). Si se desean anticuerpos monoclonales de un isotipo para una aplicación particular, pueden prepararse directamente isotipos particulares mediante selección a partir de la fusión inicial, o ser preparados de forma secundaria, a partir de un hibridoma parental que segregue un anticuerpo monoclonal de isotipo diferente usando la técnica de selección endogámica para aislar variantes de conmutación de clase (Steplewski, et al., Proc. Nat’l. Acad. Sci., 82: 8653 (1985); Spira et al., J. Immunol. Methods, 74: 307 (1984)). El sitio de combinación con antígenos del anticuerpo monoclonal puede ser clonado por PCR y anticuerpos monocatenarios producidos como anticuerpos recombinantes de expresión en fagos o anticuerpos solubles en E. coli (véase, por ejemplo, ANTIBODY ENGINEERING PROTOCOLS, 1995, Humana Press, Sudhir Paul, editor).

Además, la patente estadounidense nº 5.194.392, Geysen (1990) describe un método general de detección o determinación de la secuencia de monómeros (aminoácidos u otros compuestos) que es un equivalente topológico del epítopo (es decir, un “mimótopo”) que es complementario de un parátopo particular (sitio de unión a antígenos) de un anticuerpo de interés. Más en general, este método implica la detección o la determinación de una secuencia de monómeros que es un equivalente topográfico de un ligando que es complementario del sitio de unión a ligandos de un receptor particular de interés. De manera similar, la patente estadounidense nº 5.480.971, Houghten et al. (1996), da a conocer oligopéptidos perrosilados lineales de rosilo C1-C y conjuntos y bibliotecas de tales péptidos, así como métodos para emplear dichos conjuntos y bibliotecas de oligopéptidos para determinar la secuencia de un oligopéptido perrosilado que se une preferentemente a una molécula aceptora de interés. Así, también pueden prepararse de forma rutinaria análogos no peptídicos de los péptidos que portan el epítopo mediante estos métodos.

Los anticuerpos útiles en los métodos dados a conocer en la presente memoria, tanto policlonales como monoclonales, pueden explorarse respecto de su especificidad de epítopo y de proteína de fusión según técnicas convencionales. Véase, por ejemplo, Czernik et al., Methods in Enzymology, 201: 264-283 (1991). Por ejemplo, los anticuerpos pueden compararse con una biblioteca de péptidos mediante ELISA para asegurar la especificidad tanto hacia el antígeno deseado como, si se desea, para la reactividad solo con la proteína ROS1 o ALK de longitud máxima, un polipéptido particular de fusión ROS1 o ALK (por ejemplo, un polipéptido SLC34A2-ROS1(S)), un polipéptido particular EGFR mutante, o fragmentos de los mismos. Los anticuerpos también pueden analizarse mediante un análisis de la transferencia de tipo Western frente a preparaciones de células que contienen la proteína diana para confirmar la reactividad solo con la diana deseada y para asegurarse de que no se produce una unión apreciable con otras proteínas. La producción, la exploración y el uso de anticuerpos específicos a proteínas de fusión es conocido por los expertos en la técnica y se han sido descritos. Véase, por ejemplo, la publicación de patente estadounidense nº 20050214301.

Los anticuerpos útiles en los métodos dados a conocer en la presente memoria pueden mostrar cierta reactividad cruzada limitada con epítopos similares en otras proteínas o polipéptidos, tales como polipéptidos de fusión similares. Esto no resulta inesperado, puesto que la mayoría de los anticuerpos muestra algún grado de reactividad cruzada, y los anticuerpos antipeptídicos a menudo tienen reactividad cruzada con epítopos que tienen una alta homología o identidad con el péptido inmunizante. Véase, por ejemplo, Czernik, supra. La reactividad cruzada con otras proteínas de fusión puede caracterizarse con facilidad mediante una transferencia de tipo Western junto con marcadores de peso molecular conocido. La reactividad cruzada no deseada puede eliminarse mediante selección negativa empleando purificación de anticuerpos sobre columnas de péptidos.

Los anticuerpos específicos a ROS1 y los anticuerpos específicos al polipéptido de fusión ROS1 que son útiles para practicar los métodos divulgados en la presente memoria son específicos, de manera ideal para el polipéptido de fusión humano, pero no se limitan solo a la unión con la variedad humana, per se. La divulgación incluye la producción y el uso de anticuerpos que también se unen a epítopos conservados y altamente homólogos o idénticos en otras especies de mamífero (por ejemplo, ratón, rata, mono). Las secuencias altamente homólogas o idénticas en otras especies pueden identificarse con facilidad mediante comparaciones de secuencias convencionales, tales como el empleo de BLAST, con la secuencia de la proteína ROS1 humana (SEQ ID NO: 1), y las secuencias del polipéptido de fusión ROS1 humano de la presente memoria (SEQ ID NO: 5, 7, 11, 13, 22, 24 y 26).

Los anticuerpos específicos a ALK y los anticuerpos específicos al polipéptido de fusión ALK que son útiles para practicar los métodos divulgados en la presente memoria son específicos, de manera ideal para el polipéptido de fusión humano, pero no se limitan solo a la unión con la variedad humana, per se. La divulgación incluye la producción y el uso de anticuerpos que también se unen a epítopos conservados y altamente homólogos o idénticos en otras especies de mamífero (por ejemplo, ratón, rata, mono). Las secuencias altamente homólogas o idénticas en otras especies pueden identificarse con facilidad mediante comparaciones de secuencias convencionales, tales como el empleo de BLAST, con la secuencia de la proteína ALK humana (SEQ ID NO: 35), y las secuencias de polipéptidos de fusión ALK humano descritas previamente.

Los anticuerpos específicos al polipéptido EGFR mutante de la divulgación que son útiles para practicar los métodos divulgados en la presente memoria son específicos, de manera ideal para el polipéptido de fusión humano, pero no se limitan solo a la unión con la variedad humana, per se. La divulgación incluye la producción y el uso de anticuerpos que también se unen a epítopos conservados y altamente homólogos o idénticos en otras especies de mamífero (por ejemplo, ratón, rata, mono). Las secuencias altamente homólogas o idénticas en otras especies pueden identificarse con facilidad mediante comparaciones de secuencias convencionales, tales como el empleo de BLAST, con la secuencia de la proteína EGFR humana (SEQ ID NO: 3), y las secuencias de polipéptidos de EGFR mutante humano descritas previamente.

Los anticuerpos empleados en los métodos dados a conocer en la presente memoria también pueden caracterizarse y validarse para su uso en un formato de ensayo concreto, por ejemplo, FC, IHC, y/o ICC. En la presente memoria, se describe más a fondo el uso de anticuerpos específicos a la proteína ROS1 de longitud máxima y/o los anticuerpos específicos al polipéptido de fusión ROS1 y/o EGFR mutante en tales métodos. Los anticuerpos descritos en la presente memoria, usados solos o en los ensayos descritos a continuación, también pueden conjugarse de modo ventajoso con tinciones fluorescentes (por ejemplo, ALEXA FLUOR 488, ficoeritrina), o con marcadores tales como puntos cuánticos, para su uso en análisis multiparamétricos junto con otros anticuerpos de transducción de señales (fosfo-AKT, fosfo-Erk 1/2) y/o marcadores celulares (citoqueratina), según se describe más a fondo posteriormente.

En la práctica de los métodos dados a conocer en la presente memoria, la expresión y/o la actividad de un polipéptido de fusión ROS1 y/o ROS1 de longitud máxima en una muestra biológica concreta también puede estudiarse de modo ventajoso empleando anticuerpos específicos (es decir, que se unen específicamente) para la proteína ROS1 de longitud máxima o anticuerpos específicos a polipéptidos de fusión ROS1. Por ejemplo, hay disponibles comercialmente anticuerpos específicos a ROS1 (es decir, anticuerpos que se unen específicamente a ROS1 de longitud máxima) (véanse Santa Cruz Biotech, Inc. (Santa Cruz, California) nº de catálogo sc-6347; Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, Massachusetts), nos de catálogo 3078, 3266, y 3287); y Abcam (Cambridge, Massachusetts), nos de catálogo ab5512 y ab108492, por ejemplo). En algunas realizaciones, los anticuerpos específicos a ROS1 utilizados en los métodos dados a conocer en la presente memoria se unen específicamente al dominio quinasa ROS1 y, así, detectarán ROS1 de longitud máxima y todos los polipéptidos de fusión ROS1 descritos en la presente memoria. En algunas realizaciones, los anticuerpos específicos a ROS1 utilizados en los métodos dados a conocer en la presente memoria se unen específicamente a una región en la proteína ROS1 que está en el extremo C del dominio quinasa de ROS1 y, así, detectarán ROS1 de longitud máxima y todos los polipéptidos de fusión ROS1 descritos en la presente memoria. Tales anticuerpos pueden producirse también según métodos estándar.

Asimismo, la expresión y/o la actividad de un polipéptido de fusión ALK y/o ALK de longitud máxima en una muestra biológica concreta también puede estudiarse de modo ventajoso empleando anticuerpos específicos (es decir, que se unen específicamente) para la proteína ALK de longitud máxima o anticuerpos específicos a polipéptidos de fusión ALK. Por ejemplo, hay disponibles comercialmente anticuerpos específicos a ALK (es decir, anticuerpos que se unen específicamente a ALK de longitud máxima) (véanse CELL SIGNALING TECHNOLOGY, INC., Danvers, Massachusetts, nos de catálogo 3333, 3633 y 3791; Abcam, catálogo de 2010, nos ab17127, ab59286, y Sigma-Aldrich, catálogo de 2010, nº HPA010694, por ejemplo). En algunas realizaciones, los anticuerpos específicos a ALK utilizados en los métodos dados a conocer en la presente memoria se unen específicamente al dominio quinasa ALK y, detectarán ALK de longitud máxima y los polipéptidos de fusión ALK descritos en la presente memoria. Además, hay disponibles comercialmente anticuerpos ALK específicos para ALK fosforilado o regiones del extremo C de ALK (por ejemplo, en proteínas de fusión ALK) (véanse CELL SIGNALING TECHNOLOGY, INC., Beverly, Massachusetts, nos de catálogo 3343S (fosfo-ALK), 3983 (fosfo-ALK), Abcam, catálogo de 2010, nº ab4061 (extremo C de ALK), y Thermo Scientific, catálogo de 2010, nº PA1-37060 (extremo C de ALK), por ejemplo). Tales anticuerpos pueden producirse también según métodos estándar, según se ha descrito anteriormente.

La detección de la expresión y/o la actividad de la expresión de ROS1 de longitud máxima y/o una expresión del polipéptido de fusión ROS1 o una expresión del polipéptido EGFR mutante, en una muestra biológica (por ejemplo, una muestra tumoral) pueden proporcionar información sobre si la proteína quinasa está dirigiendo por sí sola el tumor, o si también está presente y dirigiendo el tumor un ROS1 de longitud máxima o un EGFR mutante. Tal información es clínicamente útil para evaluar si dirigirse a la proteína de fusión o a la proteína (o proteínas) de longitud máxima, o a ambas, o si es probable que sea más beneficioso para inhibir el avance del tumor, y para seleccionar un producto terapéutico adecuado o una combinación de los mismos.

En algunas realizaciones, un reactivo que puede ser usado para detectar un ROS1 de longitud máxima o un polipéptido de fusión ROS1, un ALK de longitud máxima o un polipéptido de fusión ALK, o un polipéptido EGFR mutante es un péptido marcado con isótopos pesados (es decir, un péptido AQUA) que, por ejemplo, corresponde a una secuencia peptídica que comprende la unión de la fusión de un polipéptido de fusión de ROS1 o ALK o una secuencia específica a mutantes de un polipéptido EGFR mutante. Tal péptido AQUA puede ser adecuado para la cuantificación absoluta de un polipéptido de fusión ROS1 o ALK expresado o un polipéptido EGFR mutante en una muestra biológica. Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión “péptido marcado con isótopos pesados” se usa indistintamente con “péptido AQUA”. Se ha descrito la producción y el uso de péptidos AQUA para la cuantificación absoluta o la detección de proteínas (AQUA) en mezclas complejas. Véase el documento WO/03016861, “Absolute Quantification of Proteins and Modified Forms Thereof by Multistage Mass Spectrometry”, Gygi et al. y también Gerber et al., Pro. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100: 6940-5 (2003). La expresión “detecta específicamente” con respecto a tal péptido AQUA significa que el péptido solo detecta y cuantifica polipéptidos y proteínas que contienen la secuencia del péptido AQUA y sustancialmente no detecta polipéptidos ni proteínas que no contienen la secuencia del péptido AQUA.

La metodología AQUA emplea la introducción de una cantidad conocida de al menos un patrón peptídico marcado con un isótopo pesado (que tiene una firma exclusiva que puede detectarse mediante cromatografía LC-SRM) en una muestra biológica digerida para determinar, mediante la comparación con el patrón peptídico, la cantidad absoluta de un péptido con la misma secuencia y modificación de proteínas en la muestra biológica. Sucintamente, la metodología AQUA tiene dos etapas: la selección y la validación del patrón interno del péptido, y el desarrollo del método; y la implementación empleando patrones internos de péptidos validados para detectar y cuantificar una proteína diana en una muestra. El método es una técnica potente para detectar y cuantificar un péptido/proteína concreto dentro de una mezcla biológica compleja, tal como un lisado celular, y puede emplearse, por ejemplo, para cuantificar el cambio en la fosforilación de proteínas que resulta del tratamiento con un fármaco, o para cuantificar diferencias en el ámbito de una proteína en estados biológicos diferentes.

En general, para desarrollar un patrón interno adecuado, se elige un péptido particular (o un péptido modificado) dentro de una secuencia de proteína diana basándose en su secuencia de aminoácidos y en la proteasa concreta que se va a utilizar para la digestión. Después se genera el péptido mediante una síntesis peptídica en fase sólida de modo que un resto es reemplazado por el mismo resto que contiene isótopos estables (13C, 15N). El resultado es un péptido que es químicamente idéntico a su homólogo nativo formado por proteólisis, pero que puede distinguirse con facilidad mediante MS a través de un desplazamiento de masas de 7 Da. A continuación, el péptido de patrón interno AQUA recién sintetizado se evalúa mediante LC-MS/MS. Este proceso proporciona información cualitativa acerca de la retención del péptido mediante cromatografía de fase inversa, eficacia de ionización, y fragmentación mediante disociación inducida por colisión. Se eligen fragmentos de iones informativos y abundantes para conjuntos de péptidos de patrón interno y nativos, y después se controlan específicamente en sucesión rápida como una función de la retención cromatográfica para formar un método de monitorización de reacción seleccionado (LC-SRM) basado en el perfil exclusivo del patrón peptídico.

La segunda etapa de la estrategia AQUA es su implementación para medir la cantidad de una proteína o una proteína modificada en mezclas complejas. Los lisados de células completas generalmente se fraccionan mediante electroforesis en gel de SDS-PAGE, y las regiones del gel coherentes con la migración de las proteínas se escinden. Este proceso es seguido por una proteólisis en gel en presencia de los péptidos AQUA y un análisis LC-SRM. (Véase Gerber et al., supra). Los péptidos AQUA se siembran en la mezcla de péptidos compleja obtenida mediante la digestión del lisado de células completas con una enzima proteolítica y se someten a purificación por inmunoafinidad, tal como se describió anteriormente. El tiempo de retención y el patrón de fragmentación del péptido nativo formado mediante digestión (por ejemplo, tripsinización) son idénticos a los del péptido de patrón interno AQUA determinados previamente; así, un análisis de LC-MS/MS empleando un experimento SRM resulta en una medición muy sensible y específica del patrón interno y del analito directamente a partir de mezclas de péptidos sumamente complejas.

Puesto que se añade una cantidad absoluta del péptido AQUA (por ejemplo, 250 fmol), puede utilizarse la proporción de las áreas bajo la curva para determinar los niveles de expresión precisos de una proteína o una forma fosforilada de una proteína en el lisado de células original. Además, el patrón interno está presente durante la digestión en gel a medida que se forman los péptidos nativos, de modo que la eficacia de la extracción de los péptidos de los trozos de gel, las pérdidas absolutas durante la manipulación de la muestra (incluyendo la centrifugación al vacío), y la variabilidad durante la introducción en el sistema LC-MS no afecta a la proporción determinada de abundancias del péptido nativo y el péptido AQUA.

Se desarrolla un patrón de péptido AQUA para una secuencia conocida previamente identificada mediante el método IAP-LC-MS/MS dentro de una proteína diana. Si el sitio se modifica, puede desarrollarse un péptido AQUA que incorpore la forma modificada del resto concreto dentro del sitio, y puede desarrollarse un segundo péptido AQUA que incorpore la forma no modificada del residuo. De esta forma, los dos patrones pueden emplearse para detectar y cuantificar las formas modificadas y no modificadas del sitio en una muestra biológica.

También pueden generarse patrones internos de péptidos estudiando la secuencia de aminoácidos primaria de una proteína y determinando los límites de los péptidos producidos mediante escisión con proteasas. Como alternativa, una proteína puede digerirse realmente con una proteasa y después puede secuenciarse un fragmento peptídico concreto producido. Las proteasas adecuadas incluyen, sin limitaciones, serina proteasas (por ejemplo, tripsina, hepsina), metaloproteasas (por ejemplo, PUMP1), quimotripsina, catepsina, pepsina, termolisina, carboxipeptidasas, etc.

Se selecciona una secuencia peptídica dentro de una proteína diana según uno o más criterios para optimizar el uso del péptido como patrón interno. Preferiblemente, el tamaño del péptido se selecciona para minimizar las probabilidades de que la secuencia peptídica se repita en otro punto en otras proteínas que no son la diana. Así, un péptido tiene preferiblemente al menos aproximadamente 6 aminoácidos. El tamaño del péptido también se optimiza para maximizar la frecuencia de ionización. Por lo tanto, en algunas realizaciones, no es más largo de aproximadamente 20 aminoácidos. En algunas realizaciones, el péptido es de aproximadamente 7 a 15 aminoácidos de longitud. También se selecciona la secuencia del péptido que no es probable que sea químicamente reactiva durante la espectrometría de masas, y así se evitan secuencias que comprendan cisteína, triptófano o metionina.

Puede seleccionarse una secuencia peptídica que no incluya una región modificada de la región diana, de modo que el patrón interno de péptido puede utilizarse para determinar la cantidad de todas las formas de la proteína. Como alternativa, un patrón interno de péptido que incluya un aminoácido modificado puede ser deseable para detectar y cuantificar solo la forma modificada de la proteína diana. Los patrones de péptidos para las regiones modificadas y no modificadas pueden utilizarse juntos, para determinar el grado de modificación en una muestra concreta (es decir, para determinar qué fracción de la cantidad total de proteína está representada por la forma modificada). Por ejemplo, pueden utilizarse patrones de péptidos para las formas fosforilada y no fosforilada de una proteína que se sabe que está fosforilada en un sitio concreto, para cuantificar la cantidad de la forma fosforilada en una muestra.

El péptido se marca empleando uno o más aminoácidos marcados (o sea, el marcador es una parte real del péptido) o, menos preferiblemente, los marcadores pueden unirse después de la síntesis según métodos convencionales. Preferiblemente, el marcador es un marcador que altera la masa en función de las siguientes consideraciones: la masa debe ser exclusiva para las masas de los fragmentos de desplazamiento producidos mediante el análisis MS con regiones del espectro con bajo fondo; el componente de firma de masas iónicas es la porción del resto marcador que preferiblemente presenta una firma de masa iónica exclusiva en el análisis MS; preferiblemente, la suma de las masas de los átomos constituyentes del marcador preferiblemente es exclusivamente diferente de los fragmentos de todos los aminoácidos posibles. Como resultado, los péptidos y aminoácidos marcados pueden distinguirse con facilidad de los no marcados por el patrón de iones/masas en el espectro de masas resultante. Preferiblemente, el componente de firma de masas iónicas imparte una masa a un fragmento de proteína que no se corresponde con la masa del resto para ninguno de los 20 aminoácidos naturales.

El marcador debe ser robusto bajo las condiciones de fragmentación de MS y no sufrir una fragmentación desfavorable. La química de marcaje debe ser eficaz bajo una serie de condiciones, en particular condiciones desnaturalizantes, y la marca del marcaje preferiblemente permanece soluble en el sistema de tampón de MS elegido. El marcador preferiblemente no suprime la eficacia de ionización de la proteína y no es químicamente reactivo. El marcador puede contener una mezcla de dos o más especies isotópicamente diferenciadas para generar un patrón espectrométrico de masas exclusivo en cada posición del fragmento marcada. Los isótopos estables, tales como 2H, 13C, 15N, 17O, 18O o 34S, son algunos marcadores no limitantes. También pueden prepararse parejas de patrones internos de péptidos que incorporen un marcador de isótopo diferente. Los restos de aminoácidos no limitantes en los que pueden incorporarse un marcador de isótopo pesado incluyen leucina, prolina, valina y fenilalanina.

Los patrones internos de péptidos se caracterizan según su proporción de masa a carga (m/z), y preferiblemente, también según su tiempo de retención en una columna cromatográfica (por ejemplo, una columna de HPLC). Los patrones internos que coeluyen con péptidos no marcados de secuencia idéntica se seleccionan como los patrones internos óptimos. Después, el patrón interno se analiza mediante la fragmentación del péptido por cualquier medio adecuado; por ejemplo, mediante disociación inducida por colisión (CID) empleando, por ejemplo, argón o helio como gas de colisión. A continuación, los fragmentos se analizan; por ejemplo, mediante espectrometría de masas de múltiples etapas (MSn) para obtener un espectro iónico del fragmento, para obtener una firma de fragmentación del péptido. Preferiblemente, los fragmentos peptídicos tienen diferencias significativas en las proporciones de m/z para que los picos que se corresponden con cada fragmento estén bien separados, y se obtiene una firma que es exclusiva para el péptido diana. Si no se obtiene una firma del fragmento adecuada en la primera etapa, se realizan más etapas de la MS hasta que se obtenga una firma exclusiva.

Los iones del fragmento en los espectros de MS/MS y MS3 generalmente son muy específicos para el péptido de interés y, junto con los métodos de LC, permiten un medio muy selectivo para detectar y cuantificar un péptido/proteína diana en una mezcla de proteínas compleja, tal como un lisado de células, que contiene muchos miles o decenas de miles de proteínas. Puede ensayarse cualquier muestra biológica que contenga potencialmente una proteína/péptido diana de interés. Preferiblemente se emplean extractos de células en bruto o parcialmente purificados. En general, la muestra contiene al menos 0,01 mg de proteína, generalmente una concentración de 0,110 mg/mL, y puede ajustarse a un pH y concentración del tampón deseados.

Después se añade una cantidad conocida de un patrón interno de péptido marcado, preferiblemente aproximadamente 10 femtomoles, que se corresponde con una proteína diana que va a detectarse/cuantificarse, a una muestra biológica, tal como un lisado de células. La muestra sembrada se digiere a continuación con una o más proteasas durante un periodo de tiempo adecuado para permitir la digestión. Después se realiza una separación (por ejemplo, mediante HPLC, HPLC en fase inversa, electroforesis capilar, cromatografía de intercambio iónico, etc.) para aislar el patrón interno marcado y su correspondiente péptido diana de los otros péptidos en la muestra. La LC microcapilar es un método no limitante.

Acto seguido, cada péptido aislado se estudia monitorizando una reacción seleccionada en la MS. Esto implica emplear el conocimiento previo adquirido mediante la caracterización del patrón interno de péptido y después dejando que la MS controle continuamente un ion específico en el espectro de MS/MS o MSn para el péptido de interés y el patrón interno. Después de la elución se calcula el área bajo la curva (ABC) para los picos del patrón del péptido y del péptido diana. La proporción de las dos áreas proporciona la cuantificación absoluta que puede normalizarse para el número de células empleado en el análisis y el peso molecular de la proteína, para proporcionar el número preciso de copias de la proteína por célula. Otros detalles de la metodología AQUA se describen en Gygi et al., and Gerber et al. supra.

Idealmente, pueden producirse patrones de péptidos internos AQUA (péptidos marcados con isótopos pesados), según se ha descrito anteriormente, para detectar y cuantificar cualquier sitio único (por ejemplo, la zona de unión de la fusión dentro de un polipéptido de fusión ROS1 o ALK o una secuencia específica a mutantes dentro de un polipéptido EGFR mutante) dentro de un polipéptido dado a conocer en la presente memoria. Por ejemplo, puede prepararse un fosfopéptido AQUA que se corresponda con la secuencia de la zona de unión de la fusión de uno de los polipéptidos de fusión ROS1 o ALK. Pueden producirse patrones de péptidos para la unión de la fusión, y estos patrones pueden emplearse en la metodología AQUA para detectar y cuantificar la unión de la fusión (es decir, la presencia del polipéptido de fusión) en una muestra biológica.

Por ejemplo, un péptido AQUA no limitante incluye la secuencia de aminoácidos AGSTLP (SEQ ID NO: 32), que corresponde a los tres aminoácidos inmediatamente flanqueantes a cada lado de la unión de la fusión en la variante corta del polipéptido de fusión FIG-ROS1 (es decir, el polipéptido de fusión de FIG-ROS1(S)), donde los aminoácidos codificados por el gen FIG están en cursiva y los aminoácidos codificados por el gen ROS1 están en negrita. Se apreciará que también pueden construirse péptidos AQUA más grandes que incluyan la secuencia de la unión de la fusión (y residuos adicionales cadena abajo o arriba de ella). De modo similar, puede construirse, como alternativa, un péptido AQUA más pequeño que comprenda menos de todos los residuos de dicha secuencia (pero que comprenda el punto de la propia unión de la fusión). Dichos péptidos AQUA más grandes o más cortos están dentro del alcance de la presente invención y la selección y la producción de los péptidos AQUA preferidos puede realizarse como se ha descrito anteriormente (véanse Gygi et al., Gerber et al., supra).

Debe observarse que, debido a que la secuencia del péptido AQUA abarca la unión de fusión de una de las proteínas de fusión ROS1 descritas en la presente memoria, también puede estar (o incluirse en) el epítopo al que un anticuerpo específico de fusión de ROS1 se une específicamente. Un “epítopo” se refiere a un epítopo inmunogénico (es decir, capaz de provocar una respuesta inmunitaria) o un epítopo antigénico (es decir, la región de una molécula de proteína a la que un anticuerpo puede unirse específicamente). El número de epítopos inmunogénicos de una proteína en general es menor que el número de epítopos antigénicos. Véase, por ejemplo, Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:3998-4002 (1983).

La Tabla 3 proporciona una lista de las secuencias de todas las uniones de fusión de los polipéptidos de fusión ROS1 ejemplares, donde los aminoácidos codificados por el gen no ROS1 están en cursiva y los aminoácidos codificados por el gen ROS1 están en negrita.

Tabla 3 5

Fusión: Secuencia de unión SEQ ID NO:

SLC34A2-ROS1 (muy corta): VGVWHR 28

SLC34A2-ROS1 (corta): LVGDDF 29

SLC34A2-ROS1 (larga): LVGAGV 30

Fusión: Secuencia de unión SEQ ID NO:

CD74-ROS1: PPKDDF 31

FIG-ROS1 (corta): AGSTLP 32

FIG-ROS1 (larga): LQVWHR 33

FIG-ROS1 (extralarga): VLQAGV 34

En la SEQ ID NO: 15 se proporciona una representación de la secuencia de CD74-ROS1 que incluye la unión de la fusión.

En algunas realizaciones, el cáncer de mamífero es de un ser humano. En algunas realizaciones, la muestra biológica es del cáncer o presunto cáncer del paciente. En algunas realizaciones, el cáncer es un cáncer tumoral sólido. En algunas realizaciones, el cáncer es leucemia. En algunas realizaciones, el cáncer es linfoma. En algunas realizaciones, el cáncer es un cáncer de pulmón (por ejemplo, un carcinoma no microcítico de pulmón o un carcinoma microcítico de pulmón). En algunas realizaciones, el cáncer es un cáncer cerebral (por ejemplo, glioblastoma). En algunas realizaciones, el cáncer es un cáncer hepático (por ejemplo, colangiocarcinoma). En algunas realizaciones, el cáncer es cáncer de colon. En algunas realizaciones, el cáncer es cáncer de mama. En algunas realizaciones, el cáncer es cáncer de ovario.

En algunas realizaciones, el cáncer de pulmón de mamífero es NSCLC (carcinoma no microcítico de pulmón). En algunas realizaciones, el cáncer de pulmón de mamífero es SCLC (carcinoma microcítico de pulmón). En realizaciones adicionales de los métodos dados a conocer en la presente memoria, el mamífero es un ser humano, y el ser humano puede ser un candidato para un producto terapéutico inhibidor de ROS1, un producto terapéutico inhibidor de EGFR, o ambos, para el tratamiento de un cáncer de pulmón. El candidato humano puede ser un paciente que está siendo tratado en la actualidad, o considerado para un tratamiento con un inhibidor de la quinasa ROS1 o un inhibidor de la quinasa EGFR. En otra realización, el mamífero es un animal grande, tal como un caballo

o una vaca, mientras que en otras realizaciones el mamífero es un animal pequeño, tal como un perro o un gato, de los cuales se sabe que todos desarrollan cánceres de pulmón, tales como NSCLC y SCLC.

Tal como se utiliza a lo largo de la memoria descriptiva, la expresión "muestra biológica" se utiliza en su sentido más amplio y significa cualquier muestra biológica sospechosa de contener un polipéptido con actividad quinasa ROS1, un polipéptido con actividad quinasa ALK o un polipéptido EGFR mutante, incluyendo, sin limitaciones, un polipéptido de fusión ROS1 o ALK o una proteína ROS1 o ALK de longitud máxima (con o sin la secuencia de péptidos señal) o fragmentos de los mismos que tienen actividad quinasa ROS1 o ALK. Las muestras biológicas incluyen, sin limitación, saliva, moco, lágrimas, sangre, células tumorales circulantes, suero, tejidos, médula ósea, fluidos linfáticos/intersticiales, células bucales, células mucosas, líquido cefalorraquídeo, semen, heces, plasma, orina, una suspensión de células, o una suspensión de células y virus o extractos de la misma, y pueden comprender una célula, cromosomas aislados de una célula (por ejemplo, una dispersión de cromosomas en metafase), ADN genómico (en solución o unido a un soporte sólido, tal como para el análisis de Southern), ARN (en solución o unido a un soporte sólido tal como para el análisis de Northern), ADNc (en solución o unido a un soporte sólido). En algunas realizaciones, la muestra biológica contiene células pulmonares sospechosas de ser cancerosas.

Los métodos dados a conocer en la presente memoria pueden incluir la detección de dos o más analitos (por ejemplo, un polipéptido con actividad quinasa ROS1, un polipéptido con actividad quinasa ALK y un polipéptido EGFR mutante (y ácidos nucleicos que codifican los mismos)) en la misma muestra biológica. En estos métodos, una muestra biológica puede ser dividida en una o más fracciones (por ejemplo, porciones de una muestra líquida o secciones de una muestra tisular) antes de la detección, y cada analito ser detectado en una fracción separada. Los métodos no requieren la detección de los analitos en la misma fracción de una muestra o en la misma célula dentro de una muestra. En otras realizaciones, los métodos dados a conocer en la presente memoria pueden ser usados para detectar dos o más analitos (por ejemplo, un polipéptido con actividad quinasa ROS1, un polipéptido con actividad quinasa ALK y un polipéptido EGFR mutante (y ácidos nucleicos que codifican los mismos)) en muestras biológicas separadas procedentes del mismo sujeto. Por ejemplo, dos muestras obtenidas por separado del mismo tumor o del mismo órgano o tejido de un paciente pueden ser estudiadas independientemente para cada uno de los dos o más analitos. Las muestras obtenidas por separado pueden ser obtenidas aproximadamente al mismo tiempo

o en momentos diferentes (por ejemplo, separados entre sí por días, semanas, meses o años).

Cualquier muestra biológica que incluya células (o extractos de células) procedentes de un cáncer de mamífero es adecuada para su uso en los métodos dados a conocer en la presente memoria. En una realización, la muestra biológica incluye células obtenidas a partir de una biopsia tumoral o una resección tumoral. La biopsia o resección puede obtenerse, según las técnicas clínicas convencionales, a partir de tumores primarios que aparezcan en un órgano de un mamífero, o de tumores secundarios que han metastatizado en otros tejidos. En algunos casos, la biopsia o resección es congelada o fijada con formol y embebida en parafina. Las muestras congeladas o fijadas pueden ser seccionadas para un análisis adicional.

En otra realización, la muestra biológica comprende células obtenidas a partir de una muestra aspirativa con aguja fina extraída de un tumor, y las técnicas para obtener tales aspirados son muy conocidas en la técnica (véase Cristallini et al., Acta Cytol. 36(3): 416-22 (1992)). En ciertas realizaciones, la muestra biológica incluye un raspado bronquial.

La muestra biológica también puede comprender células obtenidas de un derrame, tal como un derrame pleural. Se sabe que se forman derrames pleurales (el líquido que se forma fuera del pulmón en la cavidad torácica y que contiene células cancerosas) en muchos pacientes con cáncer de pulmón avanzado (incluyendo el NSCLC), y la presencia de tal derrame es predictiva de un mal resultado y de un tiempo de supervivencia corto. Las técnicas convencionales para obtener muestras de derrames pleurales han sido descritas y son muy conocidas en la técnica (véase Sahn, Clin. Chest. Med., 3(2): 443-52 (1982)).

La muestra biológica puede incluir células obtenidas de un lavado broncoalveolar. El lavado broncoalveolar es un procedimiento médico estándar en el cual se hace pasar un broncoscopio a través de la boca o la nariz hasta los pulmones y se inyecta líquido en una pequeña parte del pulmón y luego se lo recolecta para su examen.

En algunas realizaciones, la muestra biológica incluye células tumorales circulantes. Las células tumorales circulantes (“CTC”) pueden purificarse, por ejemplo, utilizando los kits y reactivos vendidos bajo las marcas registradas Vita-Assays™, Vita-Cap™ y CellSearch® (comercialmente disponible de Vitatex, LLC (una sociedad anónima de Johnson and Johnson). Se describen otros métodos para aislar CTC (véanse, por ejemplo, la publicación de PCT nº WO/2002/020825, Cristofanilli et al., New Engl. J. of Med. 351 (8):781-791 (2004), y Adams et al., J. Amer. Chem. Soc. 130 (27): 8633-8641 (julio de 2008)). En una realización particular, una célula tumoral circulante (“CTC”) puede aislarse e identificarse como originada en el pulmón.

En consecuencia, la invención proporciona un método para aislar un CTC y, después, seleccionar una CTC en uno o más formatos de ensayo para identificar la presencia de un polipéptido con actividad quinasa ROS1, un polipéptido EGFR mutante o una molécula de ácido nucleico que codifica cualquiera de los dos en la CTC.

Pueden prepararse extractos celulares de las muestras biológicas descritas en la presente memoria, en bruto o parcial (o totalmente) purificadas, según técnicas convencionales, y emplearse en los métodos dados a conocer en la presente memoria. Como alternativa, pueden utilizarse muestras biológicas que incluyen células completas en formatos de ensayo preferidos, tales como ensayo de quinasa in vitro, ensayos ELISA, inmunohistoquímica (IHC), citometría de flujo (FC) e inmunofluorescencia (IF), inmunohistoquímica (IHC), hibridación fluorescente in situ (FISH) y reacción en cadena de la polimerasa (PCR), de acuerdo con métodos estándar tales como los descritos a continuación (véase, también, por ejemplo, Ausubel et al., supra). Tales ensayos de células completas son ventajosos, puesto que minimizan la manipulación de la muestra de células tumorales y, así, reducen los riesgos de alterar el estado de señalización/activación in vivo de las células y/o la introducción de señales accidentales. Los ensayos de células completas también son ventajosos porque caracterizan la expresión y la señalización solo en células tumorales, en lugar de una mezcla de células tumorales y normales.

Por tanto, las muestras biológicas útiles en la práctica de los métodos dados a conocer en la presente memoria pueden obtenerse de cualquier mamífero en el que esté presente o pudiera estar presente o desarrollándose un cáncer o presunto cáncer caracterizado por la presencia de un polipéptido que tiene actividad quinasa ROS1, un polipéptido que tiene actividad quinasa ALK o un polipéptido EGFR mutante. Como se usa en la presente memoria, la frase “caracterizado por” con respecto a un cáncer (o presunto cáncer) y la molécula indicada (por ejemplo, un polipéptido con actividad quinasa ROS1 o un polipéptido con actividad quinasa ALK), significa un cáncer (o presunto cáncer) en el que una translocación o mutación génica y/o un polipéptido expresado están presentes, en comparación con otro cáncer o un tejido normal en el que tal translocación o expresión aberrante no está presente. La presencia de tales translocación o expresión aberrante puede dar lugar (es decir, estimular o ser el agente causal de), en su totalidad o en parte, al crecimiento y la supervivencia de dicho cáncer o presunto cáncer.

Por consiguiente, cualquier muestra biológica (por ejemplo, CTC, derrame pleural, aspiración con aguja, biopsia tumoral) de un paciente que se identifica como que comprende un polipéptido con actividad quinasa ROS1, un polipéptido EGFR mutante, o un polinucleótido que codifica el mismo (por ejemplo, un polipéptido o polinucleótido ROS1 de longitud máxima o un polipéptido o polinucleótido de fusión ROS1) puede indicar que el cáncer originario del paciente (por ejemplo, un cáncer de pulmón tal como NSCLC o SCLC) está siendo dirigido por el polipéptido con actividad quinasa ROS1 y/o el polipéptido EGFR mutante y, por tanto, es probable que responda a un régimen de tratamiento que incluya uno o ambos de un producto terapéutico inhibidor de la quinasa ROS1 y un producto terapéutico inhibidor de la quinasa EGFR.

Tal como se utiliza en la presente memoria, por “probable que responda” se quiere decir que un cáncer es más probable que muestre ralentización o anulación del crecimiento en respuesta a (por ejemplo, tras el contacto o el tratamiento con) un producto terapéutico inhibidor de ROS1 y/o un producto terapéutico inhibidor de EGFR. En algunas realizaciones, un cáncer que es probable que responda a un producto terapéutico inhibidor de ROS1 y/o a un producto terapéutico inhibidor de EGFR es aquel que muere (por ejemplo, apoptosis de las células cancerosas) en respuesta al producto terapéutico inhibidor de ROS1 y/o al producto terapéutico inhibidor de EGFR.

Para evaluar la presencia de un polipéptido con actividad quinasa ROS1, un polipéptido con actividad quinasa ALK o un polipéptido EGFR mutante (o polinucleótidos que codifiquen los mismos) en una muestra biológica que comprende células procedentes de un tumor canceroso de mamífero, puede emplearse de modo deseable, con fines comparativos, una muestra de control que representa una célula en la que tal polipéptido no se presenta (por ejemplo, células pulmonares sanas). Idealmente, la muestra control comprende células de un subconjunto del cáncer concreto (por ejemplo, cáncer de pulmón) que es representativo del subconjunto en el que no se produce el polipéptido (o el polinucleótido que codifica el mismo). Así, comparar el nivel en la muestra control con la muestra biológica de ensayo identifica si el polipéptido y/o el polinucleótido mutantes están presentes. Como alternativa, puesto que un polipéptido con actividad quinasa ROS1, un polipéptido con actividad quinasa ALK o un polipéptido EGFR mutante (o polinucleótidos que codifican los mismos) pueden no estar presentes en la mayoría de los cánceres, puede emplearse como control cualquier tejido que, de forma similar, no exprese el polipéptido con actividad quinasa ROS1, un polipéptido con actividad quinasa ALK o un polipéptido EGFR mutante (o polinucleótidos que codifiquen los mismos).

Los métodos descritos en la presente memoria tienen una función diagnóstica valiosa para cánceres caracterizados por la presencia de un polipéptido con actividad quinasa ROS1, un polipéptido con actividad quinasa ALK o un polipéptido EGFR mutante, y para las decisiones de tratamiento que pertinentes a los mismos. Por ejemplo, pueden obtenerse muestras biológicas de un sujeto que no ha sido previamente diagnosticado con un cáncer que se caracteriza por la presencia de un polipéptido con actividad quinasa ROS1 y/o un polipéptido EGFR mutante, ni que se haya sometido todavía a un tratamiento para tal cáncer, y el método se emplea para determinar diagnósticamente que un tumor en tal sujeto pertenece a un subconjunto de tumores (por ejemplo, NSCLC o SCLC) en los que un polipéptido con actividad quinasa ROS1 y/o un polipéptido EGFR mutante (o un polinucleótido que codifique los mismos) estén presentes/se expresen.

Como alternativa, puede obtenerse una muestra biológica de un sujeto que ha sido diagnosticado con un cáncer caracterizado por la presencia de un tipo de quinasa, tal como EGFR, y que ha estado recibiendo terapia, tal como terapia inhibidora de EGFR (por ejemplo, erlotinib, gefitinib), para el tratamiento de tal cáncer, y emplearse un método dado a conocer en la presente memoria para identificar si el tumor del sujeto también se caracteriza por la presencia de un polipéptido con actividad quinasa ROS1 (o de un polinucleótido que codifique el mismo), tal como proteína ROS1 de longitud máxima o uno de los muchos polipéptidos de fusión de ROS1 (por ejemplo, SLC34A2-ROS1(S)), y si, por tanto, es probable que responda completamente a la terapia existente y/o si resulta deseable o se justifica una terapia alternativa o adicional inhibidora de ROS1. Los métodos dados a conocer en la presente memoria también pueden emplearse para controlar el avance o la inhibición de un cáncer que expresa un polipéptido con actividad quinasa ROS1 después del tratamiento de un sujeto con una composición que incluye un producto terapéutico o una combinación de productos terapéuticos inhibidores de ROS1.

Tal ensayo diagnóstico puede realizarse después o antes de una evaluación preliminar o de procedimientos de vigilancia quirúrgica. Los métodos de identificación dados a conocer en la presente memoria pueden emplearse de modo ventajoso como diagnóstico para identificar pacientes que tienen cáncer, tal como cáncer de pulmón (por ejemplo, cáncer de pulmón no microcítico), o cáncer de colon, caracterizado por la presencia de un polipéptido con actividad quinasa ROS1 o actividad quinasa ALK, o de un polipéptido EGFR mutante, para saber cuáles son los pacientes que es más probable que respondan a productos terapéuticos dirigidos a la inhibición de la actividad quinasa ROS1 o ALK o la actividad quinasa EGFR. La capacidad de seleccionar dichos pacientes también será útil en la evaluación clínica de la eficacia de futuros productos terapéuticos inhibidores de ROS1, ALK, y/o EGFR, así como en la futura prescripción de dichos fármacos a pacientes.

La capacidad de identificar selectivamente cánceres en los que un polipéptido con actividad quinasa ROS1 (o un polinucleótido que codifique el mismo) o un polipéptido con actividad quinasa ALK (o un polinucleótido que codifique el mismo) o un polipéptido EGFR mutante (o un polinucleótido que codifique el mismo) están presentes permite desarrollar nuevos métodos importantes para la identificación precisa de tales tumores con fines de diagnóstico, así como obtener información útil para determinar si es probable que tal tumor responda a una composición terapéutica inhibidora de ROS1, ALK, y/o EGFR, o si es probable que no responda parcial o totalmente a un inhibidor que se dirija a una quinasa diferente cuando se administra como agente único para el tratamiento del cáncer.

Tal como se usa en la presente memoria, por “cáncer” o “canceroso” se entiende una célula que presenta un crecimiento anormal en comparación con una célula normal (es decir, no cancerosa) del mismo tipo de célula. Por ejemplo, una célula cancerosa puede ser metastásica o no metastásica. Una célula cancerosa también puede presentar falta de inhibición de contacto, en la que una célula normal de ese mismo tipo de célula muestra inhibición de contacto. En algunas realizaciones, el cáncer es cáncer de pulmón (por ejemplo, cáncer no microcítico de pulmón

o cáncer microcítico de pulmón). Tal como se usa en la presente memoria, por “presunto cáncer” (como en “presunto cáncer de pulmón de mamífero”) o “tejido sospechoso de ser canceroso” se entiende una célula o un tejido que tiene algunas características aberrantes (por ejemplo, hiperplasia o falta de inhibición de contacto) en comparación con células o tejidos normales de ese mismo tipo de célula o de tejido que el posible cáncer, pero donde la célula o el tejido aún no han sido confirmados por un médico o patólogo como cancerosos.

En algunas realizaciones, los diversos métodos dados a conocer en la presente memoria pueden realizarse en una diversidad de formatos de ensayo diferentes conocidos por los expertos en la técnica. Algunos ejemplos no limitantes de métodos incluyen inmunoensayos y ensayos de péptidos y nucleótidos.

Inmunoensayos

Los inmunoensayos útiles en la práctica de los métodos dados a conocer en la presente memoria pueden ser inmunoensayos homogéneos o inmunoensayos heterogéneos. En un ensayo homogéneo, la reacción inmunológica habitualmente implica a un reactivo específico (por ejemplo, un anticuerpo específico a ROS1, un anticuerpo específico a ALK, o un anticuerpo específico al EGFR mutante), un analito marcado, y la muestra biológica de interés. La señal que surge del marcador se modifica, directa o indirectamente, después de la unión del anticuerpo al analito marcado. Tanto la reacción inmunológica como la detección del grado de la misma se realizan en una disolución homogénea. Los marcadores inmunoquímicos que pueden emplearse incluyen radicales libres, radioisótopos, tinciones fluorescentes, enzimas, bacteriófagos, coenzimas, etcétera. También pueden emplearse de modo ventajoso marcadores de nanocristales semiconductores, o “puntos cuánticos”, y su preparación y su uso han sido bien descritos. Véase, en general, K. Barovsky, Nanotech. Law & Bus. 1(2): artículo 14 (2004) y las patentes citadas en ese documento.

En la estrategia del ensayo heterogéneo, los materiales suelen ser la muestra biológica, un reactivo de unión (por ejemplo, un anticuerpo), y un medio adecuado para producir una señal detectable. Pueden emplearse las muestras biológicas tal como se describe adicionalmente a continuación. El anticuerpo en general se inmoviliza sobre un soporte, tal como una esfera, una placa o un portaobjetos, y se lo pone en contacto con la muestra sospechosa de contener el antígeno en una fase líquida. Después, el soporte se separa de la fase líquida, y la fase del soporte o la fase líquida se estudia para descubrir una señal detectable empleando medios para producir tal señal. La señal se relaciona con la presencia del analito en la muestra biológica. Los medios para producir una señal detectable incluyen el uso de marcadores radiactivos, marcadores fluorescentes, marcadores enzimáticos, puntos cuánticos, etcétera. Por ejemplo, si el antígeno que se va a detectar contiene un segundo sitio de unión, un anticuerpo que se une a ese sitio puede conjugarse con un grupo detectable y ser añadido a la disolución de reacción en fase líquida antes de la etapa de separación. La presencia del grupo detectable sobre el soporte sólido indica la presencia del antígeno en la muestra de ensayo. Ejemplos de inmunoensayos adecuados son el radioinmunoensayo, métodos de inmunofluorescencia, inmunoensayos ligados a enzimas y similares.

Los formatos de inmunoensayos y las variaciones de los mismos que pueden ser útiles para realizar los métodos dados a conocer en la presente memoria son muy conocidos en la técnica. Véase, en general, E. Maggio, Enzyme-Immunoassay (1980) (CRC Press, Inc., Boca Ratón, Florida); véanse también, por ejemplo, la patente estadounidense nº 4.727.022 (Skold et al., “Methods for Modulating Ligand-Receptor Interactions and their Application”); la patente estadounidense nº 4.659.678 (Forrest et al., “Immunoassay of Antigens”); la patente estadounidense nº 4.376.110 (David et al., “Immunometric Assays Using Monoclonal Antibodies”). Las condiciones adecuadas para la formación de complejos de reactivo-anticuerpo son muy conocidas por los expertos en la técnica. Véase íd. Los anticuerpos específicos a ROS1 pueden emplearse en un ensayo de “dos sitios” o “sándwich”, con una única línea celular de hibridoma sirviendo de fuente para el anticuerpo monoclonal marcado y el anticuerpo monoclonal unido. Tales ensayos son descritos en la patente estadounidense nº 4.376.110. La concentración del reactivo detectable debería ser suficiente para que la unión del antígeno de interés sea detectable en comparación con el fondo.

Los anticuerpos útiles en la práctica de los métodos dados a conocer en la presente memoria pueden conjugarse con un soporte sólido adecuado para un ensayo diagnóstico (por ejemplo, esferas, placas, portaobjetos o pocillos formados por materiales tales como látex o poliestireno) según técnicas conocidas, tales como precipitación. Los anticuerpos u otros reactivos de unión al polipéptido pueden asimismo conjugarse con grupos detectables, tales como radiomarcadores (por ejemplo, 35S, 125I, 131I), marcadores enzimáticos (por ejemplo, peroxidasa de rábano picante, fosfatasa de rosalina), y marcadores fluorescentes (por ejemplo, fluoresceína) según técnicas conocidas.

Los ensayos basados en células, tales como la citometría de flujo (FC), la inmunohistoquímica (IHC) o la inmunofluorescencia (IF), son particularmente deseables en la práctica de los métodos dados a conocer en la presente memoria, puesto que dichos formatos de ensayo son adecuados desde el punto de vista clínico, permiten la detección de la expresión de una proteína con actividad quinasa ROS1 o de una proteína con actividad quinasa ALK in vivo, y evitan el riesgo de cambios accidentales en la actividad resultantes de la manipulación de células obtenidas, por ejemplo, de una muestra tumoral para obtener extractos. Por consiguiente, en algunas realizaciones, los métodos dados a conocer en la presente memoria son implementados en un formato de ensayo de citometría de flujo (FC), inmunohistoquímica (IHC) o inmunofluorescencia (IF).

La citometría de flujo (FC) puede emplearse para determinar la expresión de un polipéptido con actividad quinasa ROS1 o actividad quinasa ALK o de un polipéptido EGFR mutante en un tumor de mamífero antes, durante y después del tratamiento con un fármaco dirigido a la inhibición de la actividad quinasa ROS1, ALK, y/o EGFR. Por ejemplo, pueden analizarse células tumorales procedentes de muestra aspirativa con aguja fina mediante citometría de flujo en busca de la expresión y/o la activación de un polipéptido con actividad quinasa ROS1 o actividad quinasa ALK o de un polipéptido EGFR mutante o de un polinucleótido que codifique los mismos, así como de marcadores

que identifiquen tipos de células cancerosas, etc., si así se desea. La citometría de flujo puede realizarse según métodos convencionales. Véase, por ejemplo, Chow et al., Cytometry (Communications in Clinical Cytometry) 46: 72-78 (2001). Sucintamente y a título de ejemplo, puede emplearse el siguiente protocolo para el análisis citométrico: fijación de las células con paraformaldehído al 2% durante 10 minutos a 37°C, seguido de permeabilización en metanol al 90% durante 10 minutos en hielo. Las células pueden teñirse después con el anticuerpo primario (por ejemplo, un anticuerpo específico a ROS1 de longitud máxima o específico al polipéptido de fusión ROS1 o un anticuerpo específico a EGFR mutante), lavarse y marcarse con un anticuerpo secundario marcado con fluorescencia. Las células después se analizarían en un citómetro de flujo (por ejemplo, un Beckman Coulter FC500) según los protocolos específicos del instrumento empleado. Tal análisis identificaría el nivel del ROS1 o ALK de longitud máxima o de un polipéptido de ROS1 o de fusión ALK o de un polipéptido EGFR mutante expresados en el tumor. Análisis similares después del tratamiento del tumor con uno o más productos terapéuticos inhibidores de ROS1, ALK o EGFR revelarían el grado de respuesta del tumor al inhibidor dirigido de quinasa ROS1

o ALK o de quinasa EGFR.

La tinción inmunohistoquímica (IHC) también puede emplearse para determinar el estado de expresión y/o activación de un polipéptido con actividad quinasa ROS1 o de un polipéptido EGFR mutante en un cáncer de mamífero (por ejemplo, un cáncer de pulmón) antes, durante y después del tratamiento con un producto terapéutico dirigido a la inhibición de la actividad quinasa ROS1 y/o de la actividad quinasa EGFR. La IHC puede realizarse según técnicas muy conocidas. Véase, por ejemplo, ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, capítulo 10, Harlow & Lane eds., Cold Spring Harbor Laboratory (1988). Sucintamente, y a título de ejemplo, se prepara tejido introducido en parafina (por ejemplo, un tejido tumoral procedente de una biopsia) para una tinción inmunohistoquímica desparafinando secciones de tejido con xileno, seguido de etanol; hidratando en agua y después en PBS; revelando el antígeno mediante el calentamiento del portaobjetos en tampón citrato de sodio; incubando secciones en peróxido de hidrógeno; bloqueando en disolución bloqueante; incubando el portaobjetos en un anticuerpo primario (por ejemplo, un anticuerpo específico a ROS1 o un anticuerpo específico a EGFR mutante) y un anticuerpo secundario; y, por último, detectando mediante el método de avidina/biotina.

Los ensayos de inmunofluorescencia (IF) también pueden emplearse para determinar el estado de expresión y/o activación de un polipéptido con actividad quinasa ROS1 (por ejemplo, un polipéptido ROS1 de longitud máxima o un polipéptido de fusión ROS1) o de un polipéptido EGFR mutante en un cáncer de mamífero antes, durante y después del tratamiento con un producto terapéutico dirigido a la inhibición de la actividad quinasa ROS1 y/o la actividad quinasa EGFR. La IF puede realizarse según técnicas muy conocidas. Véanse, por ejemplo, J. M. Polak y

S. Van Noorden (1997) INTRODUCTION TO IMMUNOCYTOCHEMISTRY, 2ª ed.; ROYAL MICROSCOPY SOCIETY MICROSCOPY HANDBOOK, 37, BioScientific/Springer-Verlag. Sucintamente, y a título de ejemplo, las muestras del paciente pueden fijarse en paraformaldehído, seguido de metanol, bloquearse con una solución de bloqueo, tal como suero de caballo, incubarse con un anticuerpo primario contra (es decir, que se une específicamente a) un polipéptido con actividad quinasa ROS1 (por ejemplo, un polipéptido de fusión CD74-ROS1) o un polipéptido con actividad quinasa ALK (por ejemplo, un polipéptido de fusión EML4-ALK) o un polipéptido EGFR mutante, seguido de un anticuerpo secundario marcado con una tinción fluorescente, tal como ALEXA FLUOR 488, y analizarse con un microscopio de epifluorescencia.

En la técnica se conocen diversos protocolos adicionales, que incluyen el ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA), radioinmunoensayo (RIA), análisis de transferencia de tipo Western, ensayo de quinasa in vitro, y clasificación celular activada por fluorescencia (FACS), para medir la expresión y/o la actividad de un polipéptido con actividad quinasa ROS1, y proporcionan una base para diagnosticar la presencia del polipéptido con actividad quinasa ROS1 (por ejemplo, un polipéptido ROS1 de longitud máxima, o un polipéptido de fusión ROS1, tal como un polipéptido de fusión FIG-ROS1(S)) o la presencia de un polipéptido con actividad quinasa ALK (por ejemplo, un ALK de longitud máxima o un polipéptido de fusión ALK tal como el polipéptido de fusión NPM-ALK) o la presencia de un polipéptido EGFR mutante. Se establecen unos valores normales o estándar para la expresión del polipéptido ALK o ROS1 (de longitud máxima o de fusión) combinando los fluidos corporales o extractos celulares obtenidos de sujetos mamíferos normales, preferiblemente seres humanos, con un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido con actividad quinasa ROS1 o a un polipéptido con actividad quinasa ALK en condiciones adecuadas para la formación de complejos. La cantidad de formación de complejo de patrón puede cuantificarse mediante diversos métodos, pero preferiblemente por medios fotométricos. Las cantidades del polipéptido ROS1 de longitud máxima expresado en muestras presentes de control y de la enfermedad procedentes de los tejidos de biopsia son comparados con los valores estándar. La desviación entre los valores de los patrones y presentes establece los parámetros para diagnosticar la enfermedad. Obsérvese que, en algunos tejidos (por ejemplo, cáncer de pulmón), dado que se descubrieron en el tejido canceroso proteínas con actividad quinasa ROS1 o proteínas con actividad quinasa ALK (por ejemplo, SLC34A2-ROS1(S) y EML4-ALK (variante 796aa)) o polipéptidos EGFR mutantes, no se espera que muestras biológicas de tejido pulmonar normal contengan estas proteínas con actividad quinasa ROS1 o actividad quinasa ALK (o los polinucleótidos que codifican las mismas) o estos polipéptidos EGFR mutantes.

En otro aspecto, la divulgación proporciona un método para detectar la presencia de un polinucleótido que codifica un polipéptido con actividad quinasa ROS1 o actividad quinasa ALK o un polinucleótido que codifica un polipéptido EGFR mutante en una muestra biológica procedente de un cáncer de pulmón de mamífero o presunto cáncer de pulmón de mamífero, comprendiendo dicho método las etapas de: (a) obtener una muestra biológica de un cáncer de pulmón en un mamífero o presunto cáncer de pulmón en un mamífero y (b) utilizar un reactivo que se une

específicamente a dicho polinucleótido que codifica dicho polipéptido para determinar si dicho polinucleótido está presente en dicha muestra biológica, en donde la detección de la unión específica de dicho reactivo a dicha muestra biológica indica que dicho polinucleótido que codifica dicho polipéptido con actividad quinasa ROS1 o actividad quinasa ALK o que dicho polipéptido EGFR mutante está presente en dicha muestra biológica.

La presencia de un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene actividad quinasa ROS1 o actividad quinasa ALK o un polipéptido EGFR mutante puede ser evaluada por cualquier método convencional. Además, estos métodos pueden combinarse con métodos para detectar el polipéptido que tiene actividad quinasa ROS1 o actividad quinasa ALK o un polipéptido EGFR mutante según se ha descrito anteriormente.

Ensayos de nucleótidos

Los reactivos de unión específicos al polinucleótido ROS1 de longitud máxima o al polinucleótido de fusión ROS1, los reactivos de unión específicos al polinucleótido ALK de longitud máxima o al polinucleótido de fusión ALK y reactivos de unión específicos al polinucleótido EGFR mutante útiles la puesta en práctica de los métodos dados a conocer en la presente memoria también pueden ser sondas de ARNm, oligonucleótidos o ADN que pueden hibridar directamente con, y detectar, transcritos de expresión de polipéptido de fusión o truncado en una muestra biológica. Tales sondas son estudiadas con detalle en la presente memoria. Sucintamente, y a título de ejemplo, muestras de un paciente fijadas en formol e incluidas en parafina (PPFE) pueden sondarse con una sonda de ARN marcada con fluoresceína, seguido de lavados con formamida, SSC y PBS, y un análisis con un microscopio de fluorescencia.

También pueden usarse con fines diagnóstico polinucleótidos que codifican un polipéptido con actividad quinasa ROS1 o ALK o un polipéptido EGFR mutante. Los polinucleótidos que pueden emplearse incluyen secuencias de oligonucleótidos, moléculas de ADN y ARN antisentido, y PNA. Los polinucleótidos pueden emplearse para detectar y cuantificar la expresión génica en tejidos de biopsia en los que la expresión de un polipéptido con actividad quinasa ROS1 o ALK (por ejemplo, un polipéptido de fusión ROS1 o ALK o un ROS1 o ALK de longitud máxima) o de un polipéptido EGFR mutante puede ser correlacionada con una enfermedad. El ensayo diagnóstico puede emplearse para distinguir entre la ausencia, la presencia y un exceso de expresión de un polipéptido con actividad quinasa ROS1 o ALK o de un polipéptido EGFR mutante, y para monitorizar la regulación de los niveles de un polipéptido con actividad quinasa ROS1 o ALK o de un polipéptido EGFR mutante durante una intervención terapéutica.

En una realización, la hibridación con cebadores de PCR que son capaces de detectar secuencias de polinucleótidos, que incluyen secuencias genómicas, que codifican un polipéptido con actividad quinasa ROS1 o ALK o un polipéptido EGFR mutante puede ser utilizada para identificar secuencias de ácidos nucleicos que codifican dichos polipéptidos con actividad quinasa ROS1 o ALK o dichos polipéptidos EGFR mutantes. La especificidad de la sonda, tanto si se produce a partir de una región muy específica —por ejemplo, 10 nucleótidos exclusivos en la zona de unión de la fusión— o de una región menos específica —por ejemplo, la región codificante 3′—, y el rigor de la hibridación o la amplificación (máxima, alta, intermedia o baja) determinará si la sonda identifica solo a las secuencias que se dan en la naturaleza que codifican polipéptidos quinasa ROS1 o ALK (por ejemplo, ROS1 o ALK de longitud máxima o una proteína de fusión ROS1 o ALK) o polipéptidos EGFR mutantes, alelos o secuencias relacionadas.

Las sondas también pueden emplearse para la detección de secuencias relacionadas. Las sondas de hibridación (por ejemplo, sondas FISH o sondas de transferencia de tipos Southern o Northern) de los presentes métodos pueden ser ADN o ARN y derivadas de las secuencias de nucleótidos de los polipéptidos con actividad quinasa ROS1, polipéptidos con actividad quinasa ALK, o de los polipéptidos EGFR mutantes codificantes. En algunas realizaciones, en las que el polipéptido que tiene actividad quinasa ROS1 o ALK es una proteína de fusión, las sondas de hibridación que incluyen la zona de unión de la fusión o de la secuencia genómica que incluya un promotor, elementos potenciadores e intrones del gen ROS1 o ALK que se presenta de forma natural y el gen socio de fusión (por ejemplo, para ROS1, SLC34A2, FIG, o CD74; para ALK, NPM, EML4, TFG, etc.).

Puede usarse un polinucleótido de fusión de ROS1 (es decir, un polinucleótido que codifica un polipéptido de fusión ROS1, tal como FIG-ROS1(S) o CD74-ROS1), un polinucletótido ROS1 de longitud máxima, un polinucletótido de fusión ALK (es decir, un polinucleótido que codifica un polinucletótido de fusión ALK, tal como EML4-ALK(variante 796aa), un polinucletótido ALK de longitud máxima, o un polinucleótido EGFR mutante) en análisis de tipo Southern

o Northern, transferencias por puntos, u otras tecnologías basadas en membranas; en tecnologías de PCR; o en ensayos de bastones de inmersión, espigas, ELISA o de chip empleando fluidos o tejidos procedentes de biopsias de pacientes para detectar una expresión alterada de un polipéptido con actividad quinasa ROS1 o la expresión de un polipéptido EGFR mutante. Tales métodos cualitativos o cuantitativos son muy conocidos en la técnica. En un aspecto particular, las secuencias de nucleótidos que codifican un polipéptido con actividad quinasa ROS1 o ALK o un polipéptido EGFR mutante pueden ser útiles en ensayos que detectan la activación o la inducción de diversos cánceres, incluyendo cáncer de pulmón (por ejemplo, el carcinoma no microcítico de pulmón (NSCLC) y el carcinoma microcítico de pulmón) y el cáncer de colon. Los polinucleótidos que codifican un polipéptido con actividad quinasa ROS1 o un polipéptido EGFR mutante pueden ser marcados de forma detectable mediante métodos convencionales, y ser añadidos a una muestra de fluido o tejido procedente de un paciente en condiciones adecuadas para la formación de complejos de hibridación. Después de un periodo de incubación adecuado, la

muestra se lava y la señal se cuantifica y se compara con un valor patrón. Si la cantidad de señal en la muestra procedente de biopsia o extraída está significativamente alterada con respecto a la de una muestra control comparable, las secuencias de nucleótidos han hibridado con las secuencias de nucleótidos en la muestra, y la presencia de niveles alterados de secuencias de nucleótidos que codifican un polipéptido con actividad quinasa ROS1 o ALK (por ejemplo, un polipéptido de fusión ROS1 o ALK o un polipéptido ROS1 o ALK de longitud máxima)

: o un polipéptido EGFR mutante en la muestra indica la presencia de la enfermedad asociada. Estos ensayos también pueden utilizarse para evaluar la eficacia de un régimen de tratamiento terapéutico concreto en estudios animales, en ensayos clínicos, o en la monitorización del tratamiento de un paciente individual.

En algunas realizaciones, los métodos dados a conocer en la presente memoria se llevan a cabo usando un formato de ensayo de amplificación de ácidos nucleicos (por ejemplo, PCR). La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es estándar para los expertos en la técnica. Véase, por ejemplo, MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, 2ª edición, Sambrook, J., Fritsch, E. F. y Maniatis, T., ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York (1989). Los cebadores (también denominados oligómeros) para PCR pueden ser sintetizados químicamente, generados enzimáticamente, o producidos a partir de una fuente recombinante. Los oligómeros consistirán preferentemente en dos secuencias de nucleótidos, una con la orientación sentido (5′ a 3′) y otra con la orientación antisentido (3′ a 5′), y se emplean en condiciones optimizadas para la identificación de un gen

: o una afección específicos. Los mismos dos oligómeros, conjuntos anidados de oligómeros, o incluso una agrupación degenerada de oligómeros pueden ser empleados en condiciones menos estrictas para la detección y/o la cuantificación de secuencias de ADN o ARN estrechamente relacionadas.

Métodos que también pueden emplearse para cuantificar la expresión de un nucleótido que codifica un polipéptido con actividad quinasa ROS1 o ALK (por ejemplo, un polipéptido de fusión ROS1 o ALK o un polipéptido ROS1 o ALK entero) o un polipéptido EGFR mutante incluyen el radiomarcaje o la biotinilación de nucleótidos, la coamplificación de un ácido nucleico de control, y las curvas patrón en las cuales se interpolan los resultados experimentales (Melby I., J. Immunol. Methods, 159: 235-244 (1993); Duplaa et al., Anal. Biochem., 229-236 (1993)). La velocidad de cuantificación de múltiples muestras puede acelerarse realizando el ensayo en un formato ELISA, en el que el oligómero de interés se presenta en diversas diluciones, y una respuesta espectrofotométrica o colorimétrica proporciona una cuantificación rápida.

En otra realización, los polinucléotidos que codifican un polipéptido con actividad quinasa ROS1 o ALK o un polipéptido EGFR mutante pueden ser usados para generar sondas de hibridación que son útiles para el cartografiado de la secuencia genómica natural. Las secuencias pueden cartografiarse en un cromosoma particular

o en una región específica del cromosoma empleando técnicas muy conocidas. Tales técnicas incluyen hibridación fluorescente in situ (FISH), FACS, o construcciones de cromosomas artificiales, tales como cromosomas artificiales de levadura, cromosomas artificiales bacterianos, construcciones P1 bacterianas, o bibliotecas de ADNc de cromosomas individuales, tal como se reseña en Price, C. M., Blood Rev., 7: 127-134 (1993); y Trask, B. J., Trends Genet., 7: 149-154 (1991).

En realizaciones adicionales, se usa hibridación fluorescente in situ (FISH) en los métodos dados a conocer en la presente memoria (como se describe en Verma et al. HUMAN CHROMOSOMES: A MANUAL OF BASIC TECHNIQUES, Pergamon Press, Nueva York, Nueva York (1988)). En algunas realizaciones, el ensayo FISH puede correlacionarse con otras técnicas de correlación de cromosomas físicos y datos de mapa genético. La técnica FISH es muy conocida (véanse, por ejemplo, las patentes estadounidenses nos 5.756.696, 5.447.841, 5.776.688 y 5.663.319). Pueden encontrarse ejemplos de datos de mapas genéticos en el número de 1994 dedicado al genoma en la revista Science (265: 1981s). La correlación entre la localización del gen que codifica la proteína ROS1 o ALK y/o, en el caso de los polipéptidos de fusión, el gen que codifica el socio de fusión de una proteína de fusión ROS1 o ALK (por ejemplo, para ROS1, el gen FIG, el gen SLC34A2 o el gen CD74; para ALK, el gen EML4, el gen NPM, el gen ATIC, el gen CARS, etc.) sobre un mapa cromosómico físico y una enfermedad específica, o predisposición a una enfermedad específica, puede contribuir a delimitar la región del ADN asociada con esa enfermedad genética. Las secuencias de nucleótidos pueden utilizarse para detectar diferencias en las secuencias génicas entre individuos normales, portadores o afectados.

La hibridación in situ de preparaciones cromosómicas y las técnicas de cartografiado físico, tales como el análisis de conexiones empleando marcadores cromosómicos establecidos, pueden emplearse para extender los mapas genéticos. A menudo, la colocación de un gen sobre el cromosoma de otra especie de mamífero, tal como un ratón, puede revelar marcadores asociados, aunque se desconozca el número o el brazo de un cromosoma humano particular. Pueden asignarse nuevas secuencias a brazos cromosómicos, o a partes de los mismos, mediante cartografiado físico. Esto proporciona información valiosa a los investigadores que buscan genes de enfermedades empleado clonación posicional u otras técnicas de descubrimiento de genes. Una vez que se ha localizado de forma general la enfermedad o el síndrome mediante vinculación genética con una región genómica concreta —por ejemplo, AT con 11q22-23 (Gatti et al. Nature 336: 577-580 (1988)), cualquier correlación de secuencias con esa área puede representar genes asociados o reguladores para una investigación ulterior. La secuencia de nucleótidos también puede ser usada para detectar diferencias en la localización cromosómica debidas a translocación, inversión, etc., entre individuos normales, portadores o afectados.

Los polinucleótidos que codifican un polipéptido con actividad quinasa ROS1 o ALK o un EGFR mutante pueden ser detectados mediante secuenciación de nucleótidos; por ejemplo, de ácidos nucleicos cromosómicos o expresados (por ejemplo, ARNm, ADNc). Los métodos de secuenciación de ácidos nucleicos son muy conocidos e incluyen la secuenciación de la terminación de cadenas y otras técnicas de secuenciación, tales como la secuenciación de moléculas individuales en tiempo real, la secuenciación por semiconductores iónicos, la pirosecuenciación, la secuenciación por síntesis (ofrecida, por ejemplo, por Illumina), y la secuenciación por ligadura (secuenciación SOLiD).

Se entenderá que todos los métodos (por ejemplo, secuenciación PCR y FISH) que detectan polinucleótidos que codifican un polipéptido con actividad quinasa ROS1 o ALK o un polipéptido EGFR mutante, se pueden combinar con otros métodos que detectan polipéptidos con actividad quinasa ROS1 o ALK o un polipéptido EGFR mutante o polinucleótidos que codifican un polipéptido con actividad quinasa ROS1 o ALK o un polipéptido EGFR mutante. Por ejemplo, la detección de un polinucleótido de fusión FIG-ROS1(S) en el material genético de una muestra biológica (por ejemplo, FIG-ROS1(S) en una célula tumoral circulante) puede ser seguida por un análisis de transferencia de tipo Western o análisis inmunohistoquímica (IHC) de las proteínas de la muestra para determinar si el polinucleótido FIG-ROS1(S) se expresaba realmente como un polipéptido de fusión FIG-ROS1(S) en la muestra biológica. Tales análisis de transferencia de tipo Western o IHC pueden realizarse usando un anticuerpo que se une específicamente al polipéptido codificado por el polinucleótido FIG-ROS1(S) detectado, o los análisis pueden realizarse usando anticuerpos que se unen específicamente ya sea al FIG de longitud máxima (por ejemplo, uniéndose al extremo N de la proteína) o a ROS1 de longitud máxima (por ejemplo, uniéndose a un epítopo en el dominio quinasa ROS1). Dichos ensayos son conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, la patente estadounidense 7.468.252).

En otro ejemplo, la tecnología CISH de Dako permite la hibridación cromatogénica in situ con inmunohistoquímica en la misma sección tisular. Véase Elliot et al., Br J Biomed Sci 2008; 65: 167-171, 2008 para una comparación de CISH y FISH.

Otro aspecto de la divulgación proporciona métodos para diagnosticar a un paciente cáncer o un presunto cáncer dirigido por una quinasa ROS1, una quinasa ALK o un polipéptido EGFR mutante. Los métodos incluyen la puesta en contacto de una muestra biológica de dicho cáncer o presunto cáncer (en donde la muestra biológica contiene al menos una molécula de ácido nucleico) con una sonda que hibrida en condiciones estrictas con una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido con actividad quinasa ROS1 o ALK o un polipéptido EGFR mutante, y en donde la hibridación de dicha sonda con al menos una molécula de ácido nucleico en dicha muestra biológica identifica que dicho paciente tiene un cáncer o un presunto cáncer dirigido por una quinasa ROS1 o un polipéptido EGFR mutante.

Otro aspecto adicional de la divulgación proporciona un método para diagnosticar que un paciente tiene un cáncer o un presunto cáncer dirigido por una quinasa ROS1 o una quinasa ALK o un polipéptido EGFR mutante. El método incluye la puesta en contacto de una muestra biológica de dicho cáncer o presunto cáncer (en donde dicha muestra biológica contiene al menos un polipéptido) con un reactivo que se une específicamente a un polipéptido con actividad quinasa ROS1 o ALK o a un polipéptido EGFR mutante, en donde la unión específica de dicho reactivo a al menos un polipéptido en dicha muestra biológica identifica que dicho paciente tiene un cáncer de pulmón o un presunto cáncer de pulmón dirigido por una quinasa ROS1 o una quinasa ALK o un polipéptido EGFR mutante.

En diversas realizaciones, la identificación de que un cáncer de pulmón o presunto cáncer de pulmón está dirigido por una quinasa ROS1 o un polipéptido EGFR mutante identificará que es probable que el paciente que tiene ese cáncer de pulmón o presunto cáncer de pulmón responda a un producto terapéutico inhibidor de ROS1, a un producto terapéutico inhibidor de EGFR o a ambos.

Para proporcionar una base para el diagnóstico de una enfermedad (por ejemplo, un cáncer de pulmón) caracterizada por la expresión de un polipéptido con actividad quinasa ROS1 o ALK o de un polipéptido EGFR mutante, puede establecerse un perfil normal o estándar para la expresión. Esto puede lograrse combinando fluidos corporales o extractos de células obtenidos de sujetos normales, tanto animales como humanos, con una secuencia de polinucleótidos, o un fragmento de la misma, que codifica el polipéptido con actividad quinasa ROS1 o ALK o un polipéptido EGFR mutante, en condiciones adecuadas para la hibridación o la amplificación. La hibridación convencional puede cuantificarse comparando los valores obtenidos de sujetos normales con los de un experimento en el que se emplea una cantidad conocida de un polinucleótido sustancialmente purificado. Los valores patrón obtenidos de las muestras normales pueden compararse con los valores obtenidos de muestras de pacientes que son sintomáticos para la enfermedad. Se emplea la desviación entre los valores patrón y del sujeto para establecer la presencia de enfermedad.

Una vez que se ha establecido la enfermedad y se inicia un protocolo de tratamiento, los ensayos de hibridación pueden repetirse de modo regular para evaluar si el nivel de expresión en el paciente empieza a aproximarse al observado en el paciente normal. Los resultados obtenidos de ensayos sucesivos pueden ser empleados para demostrar la eficacia del tratamiento a lo largo de un periodo de varios días a meses.

Puede establecerse un perfil normal o estándar similar para la expresión o el nivel de actividad de un polipéptido que tiene actividad quinasa ROS1 o ALK o un polipéptido EGFR mutante. Por ejemplo, para la expresión de proteínas, el

perfil puede establecerse utilizando un reactivo que se une específicamente al polipéptido; también puede establecerse utilizando, por ejemplo, un anticuerpo que se une específicamente al polipéptido (por ejemplo, uniéndose a la unión de fusión de un polipéptido de fusión ROS1) y comparando los niveles de unión en sujetos normales con niveles de unión en pacientes sintomáticos para cáncer de pulmón. De manera similar, para los niveles de actividad quinasa ROS1, ALK o EGFR, se puede realizar un ensayo estándar de quinasa in vitro (véanse Ausubel et al., supra; Sambrook et al., supra) en muestras tomadas de pacientes normales en comparación con muestras tomadas de pacientes sintomáticos para cáncer de pulmón.

En diversas realizaciones, la inhibición de la expresión o de la actividad quinasa ROS1 o ALK se determina usando un reactivo que se une específicamente a un polinucleótido de fusión ROS1 o ALK, un reactivo que se une específicamente a un polipéptido de fusión ROS1 o ALK, un reactivo que se une específicamente a un polinucleótido ROS1 o ALK de longitud máxima, o a un reactivo que se une específicamente a un polipéptido ROS1 o ALK de longitud máxima. En algunas realizaciones adicionales, la inhibición de la expresión o de la actividad quinasa ROS1

o ALK se determina usando un reactivo que se une específicamente a la proteína de longitud máxima de un socio de fusión de un polipéptido de fusión ROS1 o a una proteína de fusión ALK. Por ejemplo, para ROS1, el reactivo puede unirse específicamente al polinucleótido FIG o CD74 o SLC34A2 o se une específicamente a un polipéptido FIG o CD74 o SLC34A2 de longitud máxima. Para ROS1, el reactivo puede unirse específicamente a un polinucleótido NPM o EML4 o ATIC o CARS o TFG o KIF5B o RANBP2 o TPM3, o ALO17 o MSN o TPM4 o ATIC o MYH9 o CLTC o SEC31L1 de longitud máxima, o puede unirse específicamente a un polipéptido NPM o EML4 o ATIC o CARS o TFG o KIF5B o RANBP2 o TPM3, o ALO17 o MSN o TPM4 o ATIC o MYH9 o CLTC o SEC31L1 de longitud máxima.

En diversas realizaciones, la expresión y/o la actividad de dicho polipéptido ALK o ROS1 son inhibidas con una composición que incluye un producto terapéutico seleccionado del grupo constituido por crizotinib (también denominado PF-02341066), ASP3026, NVP TAE-684, AP26113, CEP-14083, CEP-14513, CEP11988, WHI-P131 y WHI-P154.

Tal como se utiliza en la presente memoria, “inhibidor de ROS1” o “compuesto inhibidor de ROS1” significa cualquier composición que incluya uno o más compuestos, químicos o biológicos, que inhiben, directa o indirectamente, la expresión y/o la actividad de un polipéptido con actividad quinasa ROS1. Tal inhibición puede ser in vitro o in vivo. “Producto terapéutico inhibidor de ROS1” o “producto terapéutico que inhibe a ROS1” significa un compuesto inhibidor de ROS1 utilizado como producto terapéutico para tratar a un paciente que alberga un cáncer (por ejemplo, un cáncer de pulmón, tal como NSCLC o SCLC) caracterizado por la presencia de un polipéptido con actividad quinasa ROS1, tal como una proteína ROS1 de longitud máxima expresada de forma aberrante o un polipéptido de fusión ROS1 (por ejemplo, una de las proteínas de fusión FIG-ROS1) descritas en la presente memoria.

En algunas realizaciones de la divulgación, el inhibidor de ROS1 es un reactivo que se une específicamente a un polipéptido de fusión ROS1 (por ejemplo, FIG-ROS1(S), FIG-ROS1(L), FIG-ROS1(XL), SLC34A2-ROS1(VS), SLC34A2-ROS1(S), SLC34A2-ROS1(L) o CD74-ROS1), un reactivo que se une específicamente a un polipéptido ROS1 de longitud máxima, un ARNip dirigido a un polinucleótido de fusión ROS1 (por ejemplo, un polinucleótido de fusión SLC34A2-ROS1(S)) o un ARNip dirigido a un polinucleótido ROS1 de longitud máxima. Los siguientes son ARNip no limitantes para inhibir la expresión de la proteína ROS1:

5′AAGCCCGGACGGCAACGUUTT3′ (ROS 1(6318-6340) (SEQ ID NO: 16)); o

5′AAGCCLGAAGGCCUGAACUTT3′ (ROS 1(7181-7203) (SEQ ID NO: 17)).

La capacidad de estos dos ARNip de inhibir la actividad quinasa ROS1 ha sido descrita (véase la publicación de patente estadounidense nº 20100221737).

En algunas realizaciones, un inhibidor de ROS1 se selecciona del grupo constituido por crizotinib (también denominado PF-02341066), ASP3026 (identificador de ClinicalTrials.gov: NCT01284192), NVP TAE-684 (Gu et al., 2011, PLos ONE, 6:e15640), CH5424802 (Sakamoto et al., 2011, Cancer Cell, 19:679-690) y AP26113 (identificador de ClinicalTrials.gov: NCTO 1449461; Katayama et al., 2011, Proc. Natl. Acad. Sci. LSA, 108:7535-40). Se dan a conocer inhibidores adicionales de ROS1, por ejemplo, en WO 2012/016133, ‘CS 2012/0065233 y El-Deeb et al., 2009, Bioorg. Med. Chem Lett., 19:5622-26.

Tal como se utiliza en la presente memoria, “inhibidor de ALK” o “compuesto inhibidor de ALK” significa cualquier composición que incluya uno o más compuestos, químicos o biológicos, que inhiben, directa o indirectamente, la expresión y/o la actividad de un polipéptido con actividad quinasa ALK. Tal inhibición puede ser in vitro o in vivo. “Producto terapéutico inhibidor de ALK” o “producto terapéutico que inhibe a ALK” significa un compuesto inhibidor de ALK utilizado como producto terapéutico para tratar a un paciente que alberga un cáncer (por ejemplo, un cáncer de pulmón, tal como NSCLC o SCLC) caracterizado por la presencia de un polipéptido con actividad quinasa ALK, tal como una proteína ALK de longitud máxima expresada de forma aberrante o un polipéptido de fusión ALK (por ejemplo, una de las proteínas de fusión EM4-ALK) descritas en la presente memoria.

El producto terapéutico inhibidor de ALK y/o de ROS1 puede ser, por ejemplo, un inhibidor de la quinasa, tal como un inhibidor de molécula pequeña o de anticuerpo. Puede ser un inhibidor de panquinasas con actividad contra

varias quinasas diferentes, o un inhibidor específico a una quinasa. Dado que ROS1, ALK, LTK, InsR e IGF1R pertenecen a la misma familia de tirosina quinasas, pueden compartir una estructura similar en el dominio quinasa. Así, en algunas realizaciones, un inhibidor de ALK y/o ROS1 también inhibe la actividad de una quinasa ALK, una quinasa LTK, un receptor de insulina o un receptor de IGF1. Los compuestos inhibidores de ROS1 son estudiados con más detalle a continuación. Las muestras biológicas de los pacientes pueden tomarse antes y después del tratamiento con el inhibidor y después ser analizadas, empleando los métodos descritos anteriormente, para el efecto biológico del inhibidor sobre la actividad quinasa ALK o ROS1, que incluye la fosforilación de la proteína sustrato corriente abajo. Tal ensayo farmacodinámico puede ser útil para determinar la dosis biológicamente activa del fármaco, que puede ser preferible a una dosis máxima tolerable. Tal información también sería útil en propuestas para la aprobación de fármacos demostrando el mecanismo de acción del fármaco.

En otra realización, la expresión y/o la actividad de dicho polipéptido se inhibe con una composición que incluye un producto terapéutico inhibidor de ROS1 o ALK seleccionado del grupo constituido por PF-02341066, NVP TAE-684, AP26113, CEP-14083, CEP-14513, CEP11988, WHI-P131 y WHI-P154.

Diversos inhibidores de EGFR son conocidos y pueden ser usados en los métodos dados a conocer en la presente memoria, incluyendo gefitinib, erlotinib, cetuximab, afatinib, necitumumab, nimotuzumab, PF299804 (Jänne et al., 2011, Clin. Cancer Res., 17:1131-39), RO5083945 (anticuerpo monoclonal glicodiseñado anti EGFR; Hoffinann-La Roche); Markman et al., 2010, J. Clin. Oncol., 28:15s, abstr 2522), ABT-806 (anticuerpo monoclonal humanizado anti EGFR; Abbott), NVP-TAE684 (Katayama et al., 2011, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 108:7535-40), y AP26113 (ibíd.).

Según la presente divulgación, el polipéptido con actividad quinasa ROS1 o ALK o el polipéptido EGFR mutante pueden darse en al menos un subgrupo de cáncer humano. En consecuencia, el avance un cáncer de mamífero en el que se expresa un polipéptido con actividad quinasa ROS1 o ALK o un polipéptido EGFR mutante puede inhibirse, in vivo, inhibiendo la actividad de la quinasa ROS1 o ALK o del polipéptido EGFR mutante en tal cáncer. La actividad ROS1 o ALK en los cánceres caracterizados por la expresión de un polipéptido con actividad quinasa ROS1 o ALK puede inhibirse poniendo en contacto el cáncer con una cantidad terapéuticamente eficaz de un producto terapéutico inhibidor de ROS1 y/o inhibidor de ALK. Además, la actividad EGFR mutante puede ser inhibida poniendo en contacto el cáncer con una cantidad terapéuticamente eficaz de un producto terapéutico inhibidor de EGFR. En consecuencia, la divulgación proporciona, en parte, un método para inhibir el avance de cánceres (por ejemplo, cánceres de pulmón) que expresan un polipéptido con actividad quinasa ROS1 o ALK y un polipéptido EGFR mutante inhibiendo la expresión y/o la actividad de la quinasa ROS1 o ALK y el polipéptido EGFR mutante en el cáncer poniendo en contacto el cáncer (por ejemplo, un cáncer de pulmón) con una cantidad terapéuticamente eficaz de un producto terapéutico inhibidor de ROS1 y/o un producto terapéutico inhibidor de EGFR.

Tal como se utiliza en la presente memoria, por “cantidad terapéuticamente eficaz” o “cantidad farmacéuticamente eficaz” se entiende una cantidad de un producto terapéutico inhibidor de ROS1, un producto terapéutico inhibidor de ALK, y/o un producto terapéutico inhibidor de EGFR es adecuada para inhibir el cáncer (o una célula del mismo) o presunto cáncer (o células del mismo), en comparación con un cáncer o presunto cáncer no tratados, ya sea ralentizando el crecimiento del cáncer o presunto cáncer, reduciendo la masa del cáncer o presunto de cáncer, reduciendo el número de células del cáncer o presunto cáncer, o matando el cáncer. Cuando se administran en combinación dos o más productos terapéuticos a un paciente, la cantidad eficaz de cada producto terapéutico puede ser menor que si el producto terapéutico hubiera de ser administrado solo.

Un producto terapéutico inhibidor de ROS1 y/o un producto terapéutico inhibidor de ALK pueden ser cualquier composición que incluya al menos un inhibidor de ROS1 o ALK. Tales composiciones también comprenden composiciones que incluyen solamente un único compuesto inhibidor de ROS1 o ALK, así como composiciones que incluyen múltiples productos terapéuticos (incluyendo aquellos contra otras RTK), que también pueden incluir un agente terapéutico no específico, como un agente quimioterapéutico o un inhibidor general de la transcripción.

En algunas realizaciones, un producto terapéutico inhibidor de ROS1 y/o un producto terapéutico inhibidor de ALK útiles en la práctica de los métodos dados a conocer en la presente memoria son un inhibidor de molécula pequeña dirigido. Los inhibidores dirigidos de molécula pequeña son una clase de moléculas que generalmente inhiben la actividad de su enzima diana uniéndose de forma específica, y a menudo irreversible, con el sitio catalítico de la enzima y/o uniéndose a una hendidura de unión a ATP u otro sitio de unión dentro de la enzima que evite que la enzima adopte una conformación necesaria para su actividad. Debido a la estrecha similitud en la estructura y la función entre la quinasa ROS 1 y la quinasa ALK, se prevé que cualquier inhibidor de la quinasa ALK también inhiba la quinasa ROS1.

En consecuencia, en otro aspecto, la divulgación proporciona métodos de tratamiento de cáncer de pulmón en un paciente que incluyen: detectar la presencia, en una muestra biológica de un pulmón de un paciente que tiene o se sospecha que tiene cáncer de pulmón, de uno o más polipéptidos seleccionados del grupo constituido por un polipéptido que tiene actividad quinasa ROS1, un polipéptido que tiene actividad quinasa ALK, y un polipéptido EGFR mutante (en cualquier combinación); y administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un producto terapéutico inhibidor de ALK/ROS1 y/o un producto terapéutico inhibidor de EGFR al paciente, tratando de este modo al sujeto por cáncer de pulmón.

Debería hacerse notar que, cuando un inhibidor de ROS1 o ALK y un inhibidor de EGFR son administrados a un paciente, la molécula inhibidora puede ser una molécula que inhiba tanto ROS1 o ALK como EGFR. Por ejemplo, NVP TAE-684 inhibe ROS1 (Gu et al., 2011, PLos ONE, 6:el5640), ALK (Galkin et al., 2007, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 104:270-275) y EGFR (Katayama et al., 2011, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 108:7535-40), igual que AP26113 (Katayama et al., 2011, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 108:7535-40). Se pueden identificar moléculas adicionales que inhiben tanto ROS1 y/o ALK como EGFR.

Tal como se utiliza en la presente memoria, por “proteína que tiene actividad quinasa ALK” se entiende cualquier polipéptido que retiene el dominio quinasa completo de ALK y, por lo tanto, tiene actividad quinasa ALK. Polipéptidos no limitantes con actividad quinasa ALK incluyen ALK de longitud completa (véase la patente estadounidense nº 5.770.421), NPM-ALK, ALO17-ALK, TFG-ALK, MSN-ALK, TPM3-ALK, TPM4-ALK, ATIC-ALK, MYH9-ALK, CLTC-ALK, SEC31L1-ALK, RANBP2-ALK, CARS-ALK, EML4-ALK, KIF5B-ALK y TFG-ALK (véanse, por ejemplo, Palmer et al., Biochem. J. 420:345-361, 2009 (y los artículos ahí citados), Rikova et al., Cell 131:1190-1203, 2007; Soda et al., Nature 448:561-566, 2007; Morris et al., Science 263:1281-84, 1994; Du et al., J. Mol. Med 84:863-875, 2007; Panagopoulos et al., Int. J. Cancer 118:1181-86, 2006; Cools et al., Genes Chromosomes Cancer 34:354-362, 2002; Debelenko et al., Lab. Invest. 83:1255-65, 2003; Ma et al., Genes Chromosomes Cancer 37:98-105, 2003; Lawrence et al., Am. J. Pathol. 157:377-384, 1995; Hernández et al., Blood 94:3265-68, 1999; Takeuchi K., Clin Cancer Res. 15:3143-49, 2009; Tort et al., Lab. Invest. 81:419-426, 2001; Trinei et al., Cancer Res. 60:793-798, 2000; y Touriol et al., Blood 95:3204-07, 2000. Véase también Pulford et al., J. Cell. Physiol., 199:330-358, 2004.

En diversas realizaciones, el paciente es un ser humano. En diversas realizaciones, el cáncer de pulmón es un cáncer no microcítico de pulmón o es un cáncer microcítico de pulmón.

Un inhibidor de la quinasa de molécula pequeña útil es el compuesto de Pfizer, Inc. crizotinib (también denominado PF-02341066), que inhibe la actividad quinasa de ALK, ROS1 y MET, y sus propiedades están bien descritas. Véanse You et al., Cancer Res 67: 4408 (2007) y la publicación de patente estadounidense nº 2008/0300273. Inhibidores de quinasa de molécula pequeña adicionales que pueden dirigirse a ROS1 incluyen TAE-684 (de Novartis), CH5424802 (Chugai; véase Sakamoto, H. et al., Cancer Cell 19: 679-690, 2011), AP26113 (Ariad Pharmaceuticals, Inc.), y CEP-14083, CEP-14513, y CEP-11988 (Cephalon; véase Wan et al., Blood 107: 1617-23, 2006). También se ha demostrado que TAE-684, una 5-cloro-2,4-diaminofenilpirimidina, inhibe la quinasa ALK. Galkin, et al., Proc. National Acad. Sci 104:270-275, 2007.

Inhibidores adicionales de molécula pequeña y otros inhibidores (por ejemplo, inhibidores indirectos) de la actividad quinasa ROS1 pueden diseñarse racionalmente usando modelado cristalográfico de rayos X o por ordenador de la estructura tridimensional de ROS1, o pueden hallarse mediante cribado de alto rendimiento de bibliotecas de compuestos para la inhibición de enzimas reguladoras clave aguas arriba y/o moléculas de unión necesarias, lo que da lugar a la inhibición de la actividad quinasa ROS1 o ALK. Tales estrategias son muy conocidas en la técnica y han sido descritas. La inhibición de ROS1 o ALK por tales productos terapéuticos puede confirmarse, por ejemplo, examinando la capacidad del compuesto para inhibir la actividad quinasa ROS1 o ALK, pero no otra actividad quinasa, en un panel de quinasas, y/o examinando la inhibición de la actividad de ROS1 o ALK en una muestra biológica que incluye células cancerosas (por ejemplo, células de cáncer de pulmón). A continuación, se describen adicionalmente métodos para identificar compuestos que inhiben un cáncer caracterizado por la expresión/presencia de un polipéptido con actividad quinasa ROS1 o ALK.

Productos terapéuticos inhibidores de ROS1, productos terapéuticos inhibidores de ALK, y/o productos terapéuticos inhibidores de EGFR útiles en los métodos dados a conocer en la presente memoria también pueden ser anticuerpos dirigidos que se unen específicamente a sitios o dominios catalíticos o de unión críticos requeridos para la actividad de ROS1 o ALK e inhiben la quinasa bloqueando el acceso de ligandos, sustratos o moléculas secundarias a α y/o impidiendo que la enzima adopte una conformación necesaria para su actividad. La producción, la selección y el uso terapéutico de anticuerpos específicos de dianas humanizadas han sido bien descritos. Véase, Merluzzi et al., Adv. Clin. Path. 4 (2): 77-85 (2000). Hay disponibles sistemas y tecnologías comerciales, tales como la Human Combinatorial Antibody Library (HuCAL®), de Morphosys, Inc., para la generación y selección de alta capacidad de procesamiento de anticuerpos inhibidores específicos a dianas humanizadas.

Se ha descrito la producción de diversos anticuerpos dirigidos anti receptores de quinasa y su uso para inhibir la actividad del receptor diana. Véanse, por ejemplo, la publicación de patente estadounidense nº 20040202655, la publicación de patente estadounidense nº20040086503, la publicación de patente estadounidense nº 20040033543. En la técnica se conocen métodos estandarizados para producir y usar anticuerpos inhibidores de la actividad de la tirosina quinasa receptora. Véase, por ejemplo, la patente europea nº EP1423428.

También pueden emplearse estrategias de expresión en fagos para generar inhibidores de anticuerpos específicos a ROS1, específicos a ALK, o específicos a EGFR, y se describen protocolos para la construcción de bancos de bacteriófagos y la selección de anticuerpos recombinantes en el conocidísimo texto de referencia CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Colligan et al. (ed.), John Wiley & Sons, Inc. (1992-2000), capítulo 17, sección

17.1. Véase también la patente estadounidense nº 6.319.690, la patente estadounidense nº 6.300.064, la patente estadounidense nº 5.840.479, y la publicación de patente estadounidense nº 20030219839.

Puede producirse un banco de fragmentos de anticuerpos mostrados sobre la superficie de bacteriófagos (véase, por ejemplo, la patente estadounidense 6.300.064) y se seleccionó para la unión a un polipéptido con actividad quinasa ROS1 o actividad quinasa ALK o a un polipéptido EGFR (por ejemplo, un polipéptido EGFR mutante). Véase la patente europea nº EP1423428.

Después, los anticuerpos identificados en la selección de bancos de anticuerpos, tal como se describió anteriormente, pueden ser seleccionados por su capacidad de bloquear la actividad de ROS1, ALK o EGFR (por ejemplo, un EGFR mutante), tanto en un ensayo de quinasas in vitro como en líneas celulares y/o tumores in vivo. La inhibición de ROS1, ALK o EGFR puede confirmarse, por ejemplo, examinando la capacidad de tal terapéutica de anticuerpos para inhibir la actividad quinasa ROS1, ALK o EGFR en un panel de quinasas, y/o examinando la inhibición de la actividad ROS1, ALK o EGFR en una muestra biológica que incluye células cancerosas, como se ha descrito anteriormente. En algunas realizaciones, un compuesto inhibidor de ROS1 reduce la actividad quinasa ROS1, pero reduce la actividad quinasa de otras quinasas en menor medida (o nada en absoluto). Asimismo, en algunas realizaciones, un compuesto inhibidor de ALK reduce la actividad quinasa ALK, pero reduces la actividad quinasa de otras quinasas en menor medida (o nada en absoluto). De modo similar, en algunas realizaciones, un compuesto inhibidor de EGFR reduce la actividad quinasa EGFR, pero reduces la actividad quinasa de otras quinasas en menor medida (o nada en absoluto). Los métodos para seleccionar dichos compuestos para la inhibición de la quinasa ROS1, ALK, y/o EGFR son descritos con más detalle en lo que antecede.

Los compuestos inhibidores de ROS1, inhibidores de ALK o inhibidores de EGFR que son útiles en la práctica de los métodos divulgados también pueden ser compuestos que inhiben indirectamente la actividad de ROS1, ALK o EGFR inhibiendo la actividad de proteínas o moléculas distintas de la propia quinasa ROS1, ALK o EGFR. Tales productos terapéuticos inhibidores pueden ser inhibidores dirigidos que modulan la actividad de quinasas reguladoras clave que fosforilan o desfosforilan (y, por ende, que activan o desactivan) al propio ROS1, ALK o EGFR, o que interfieren en la unión de los ligandos. Al igual que con otras tirosinas quinasa receptoras, ROS1, ALK y EGFR regulan la señalización corriente abajo a través de una red de proteínas adaptadoras y de quinasas corriente abajo. Como resultado, la inducción del crecimiento celular y la supervivencia por la actividad de ROS1, ALK o EGFR puede inhibirse dirigiendo estas proteínas interactivas o de corriente abajo.

La actividad quinasa ROS1, ALK o EGFR también puede ser inhibida indirectamente usando un compuesto que inhibe la unión de una molécula activadora necesaria para que estos polipéptidos de longitud máxima y de fusión (por ejemplo, un polipéptido de fusión CD74-ROS1 o uno EML4-ALK) adopten su conformación activa (es decir, de modo que el dominio quinasa pueda ser activado). Por ejemplo, se ha descrito la producción y el uso de anticuerpos anti PDGF. Véase la publicación de patente estadounidense nº 20030219839, “Anti-PDGF Antibodies and Methods for Producing Engineered Antibodies,” Bowdish et al. La inhibición del ligando (PDGF) que se une al receptor regula negativamente de manera directa la actividad del receptor.

Los compuestos o productos terapéuticos inhibidores de ROS1, ALK, y/o EGFR pueden también incluir compuestos antisentido o inhibidores de la transcripción que inhiben la actividad quinasa ROS1, ALK o EGFR bloqueando la transcripción del gen que codifica polipéptidos con actividad quinasa ROS1, ALK o EGFR. Se ha descrito la inhibición de diversos receptores de quinasas, que incluyen VEGFR, EGFR, e IGFR y FGFR, mediante productos terapéuticos antisentido para el tratamiento del cáncer. Véanse, por ejemplo, las patentes estadounidenses nos 6.734.017, 6.710.174, 6.617.162, 6.340.674, 5.783.683, 5.610.288.

Pueden diseñarse y construirse y emplearse oligonucleótidos antisentido como agentes terapéuticos contra genes diana según técnicas convencionales. Véanse, por ejemplo, Cohen, J., Trends in Pharmacol. Sci. 10(11): 435-437 (1989); Marcus-Sekura, Anal. Biochem. 172: 289-295 (1988); Weintraub, H., Sci. AM, pp. 40-46 (1990); Van Der Krol et al., BioTechniques 6: 958-976 (1988); Skorski et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1994) 91: 4504-4508. Recientemente se ha descrito la inhibición del crecimiento de carcinomas humanos in vivo empleando un inhibidor de ARN antisentido de EGFR. Véase la publicación de patente estadounidense nº 20040047847. De forma similar, se puede preparar según métodos estándar un producto terapéutico inhibidor de ROS1 o inhibidor de ALK que incluya al menos un oligonucleótido antisentido contra un gen ROS1 o ALK de mamífero o un polinucleótido codificante de la proteína de fusión ROS1 o ALK de mamífero. Pueden prepararse composiciones farmacéuticas que incluyan compuestos antisentido inhibidores de ROS1 y administrarse como se describe más a fondo a continuación.

Las composiciones de moléculas de ARN interferente pequeño (ARNip), que inhiben la traducción y, por tanto, la actividad, de ROS1, ALK o EGFR a través del proceso de interferencia de ARN, también pueden ser empleadas de modo deseable en los métodos dados a conocer en la presente memoria. La interferencia de ARN y el silenciamiento selectivo de la expresión de proteínas diana mediante la introducción de moléculas de ARN bicatenarias pequeñas exógenas que tienen una secuencia complementaria del ARNm que codifica la proteína diana ha sido bien descrita. Véase, por ejemplo, la publicación de patente estadounidense nº 20040038921, la publicación de patente estadounidense nº 20020086356, y la publicación de patente estadounidense nº 20040229266.

Se ha demostrado que las moléculas de ADN bicatenario (ARNbc) bloquean la expresión de genes mediante un mecanismo regulador altamente conservado conocido como interferencia de ARN (iARN). Sucintamente, la ARNasa III Dicer procesa el ARNbc en ARN interferentes pequeños (ARNip) de aproximadamente 22 nucleótidos, que actúan como secuencias guía para inducir la escisión del ARNm específico a la diana por un RISC complejo silenciador

inducido por ARN (véase Hammond et al., Nature (2000), 404: 293-296). El iARN implica una reacción de tipo catalítico por la cual se generan nuevos ARNip a través de la escisión sucesiva de ARNbc más largo. Así, a diferencia del antisentido, el iARN degrada el ARN diana de una manera no estequiométrica. Se ha demostrado que, cuando se lo administra a una célula o a un organismo, el ARNbc exógeno dirige la degradación del ARN mensajero endógeno (ARNm) específica a la secuencia mediante iARN.

Ahora hay disponible comercialmente una amplia diversidad de productos de ARNip específicos a dianas, que incluyen vectores y sistemas para su expresión y su uso en células de mamífero. Véanse, por ejemplo, Promega, Inc. (www.promega.com); Dharmacon, Inc. (www.dharmacon.com). Hay disponibles manuales técnicos detallados sobre el diseño, la construcción y el uso de ARNbc para iARN. Véanse, por ejemplo, “RNAi Technical Reference & Application Guide”, de Dharmacon; “RNAi: A Guide to Gene Silencing”, de Promega. También hay comercialmente disponibles productos de ARNip inhibidores de ROS1, y pueden emplearse de modo adecuado en los métodos dados a conocer en la presente memoria. Véase, por ejemplo, Dharmacon, Inc., Lafayette, Colorado (nos de cat. M003162-03, MU-003162-03, D-003162-07 a -10 (siGENOME™ SMARTselection y SMARTpool® siRNAs).

Recientemente se ha establecido que los ARNbc pequeños con una longitud menor de 49 nucleótidos, y preferiblemente de 19-25 nucleótidos, que incluyen al menos una secuencia que es sustancialmente idéntica a parte de una secuencia de ARNm diana, y dicho ARNbc tiene óptimamente al menos una proyección de 1-4 nucleótidos en un extremo, son los más eficaces en la mediación del iARN en mamíferos. Véanse las publicaciones de patente estadounidense nos 20040038921 y 20040229266. La construcción de tal ARNbc y su uso en preparaciones farmacéuticas para silenciar la expresión de una proteína diana in vivo se describen en detalle en tales publicaciones.

Si se conoce la secuencia del gen diana en un mamífero, pueden producirse ARN de 21-23 nt, por ejemplo, y ensayarse en cuanto a su capacidad para la mediación del iARN en una célula de mamífero, tal como una célula humana o de otro primate. Las moléculas de ARN de 21-23 nt que se ha demostrado que medien en el iARN pueden someterse a ensayo, si se desea, en un modelo animal apropiado para evaluar también su eficacia in vivo. Los sitios diana que se conocen —por ejemplo, los sitios diana que se ha determinado que son sitios diana eficaces basándose en estudios con otras moléculas de ácidos nucleicos; por ejemplo, ribozimas o antisentido—, o las dianas que se sabe que están asociadas con una enfermedad o un trastorno, tales como los sitios que contienen mutaciones o deleciones, pueden emplearse para diseñar moléculas de ARNip que se dirijan también a esos sitios.

Como alternativa, pueden predecirse/diseñarse de forma racional las secuencias de los ARNbc eficaces mediante la selección del ARNm diana de interés para sitios diana; por ejemplo, empleando un algoritmo informático de plegamiento. La secuencia diana puede analizarse por ordenador para producir una lista de todos los fragmentos o subsecuencias de una longitud particular —por ejemplo, fragmentos de 23 nucleótidos—, usando una secuencia de ejecución Perl a medida o programas comerciales de análisis de secuencias, tales como Oligo, MacVector, o el paquete GCG Wisconsin.

Pueden emplearse diversos parámetros para determinar qué sitios diana son los más adecuados dentro de la secuencia de ARN diana. Estos parámetros incluyen, sin limitación, la estructura secundaria o terciaria de ARN, la composición de bases de nucleótidos de la secuencia diana, el grado de homología entre diversas regiones de la secuencia diana, o la posición relativa de la secuencia diana dentro del transcrito de ARN. En función de estas determinaciones, puede elegirse un número cualquiera de sitios diana dentro del transcrito de ARN para seleccionar moléculas de ARNip según su eficacia; por ejemplo, empleando ensayos de escisión de ARN in vitro, cultivos celulares o modelos animales. Véase, por ejemplo, la publicación de patente estadounidense nº 20030170891. También se ha descrito recientemente un algoritmo para identificar y seleccionar sitios diana de iARN. Véase la publicación de patente estadounidense nº 20040236517.

Las técnicas de transferencia de genes que se emplean comúnmente incluyen los métodos de fosfato de calcio, DEAE-dextrano, electroporación y microinyección y virales (Graham et al. (1973) Virol. 52: 456; McCutchan et al., (1968), J. Natl. Cancer Inst. 41: 351; Chu et al. (1987), Nucl. Acids Res. 15: 1311; Fraley et al. (1980), J. Biol. Chem.

255: 10431; Capecchi (1980), Cell 22: 479). El ADN también puede introducirse en las células empleando liposomas catiónicos (Feigner et al. (1987), Proc. Natl. Acad. Sci USA 84: 7413). Las formulaciones de lípidos catiónicos comercialmente disponibles incluyen Tfx 50 (Promega Corp., Fitchburg, Wisconsin) o Lipofectamin 200 (Life Technologies, Carlsbad, California). Como alternativa, pueden emplearse vectores virales para transportar el ARNbc a una célula y mediar en el iARN. Véase la publicación de patente estadounidense nº 20040023390.

La transfección y los sistemas de vector/expresión para iARN en células de mamífero están disponibles comercialmente y han sido bien descritos. Véase, por ejemplo, Dharmacon, Inc. (Lafayette, Colorado), sistema DharmaFECT™; Promega, Inc., sistema de horquilla U6 siSTRIKE™; véanse también Gou et al. (2003), FEBS, 548, 113-118; Sui, G. et al., A DNA vector-based RNAi technology to suppress gene expression in mammalian cells (2002), Proc. Natl. Acad. Sci., 99, 5515-5520; Yu et al. (2002), Proc. Natl. Acad. Sci., 99, 6047-6052; Paul, C. et al. (2002), Nature Biotechnology, 19, 505-508; McManus et al. (2002), RNA, 8, 842-850.

Entonces, la interferencia de ARNip en un mamífero empleando moléculas de ARNbc preparadas puede realizarse administrando al mamífero una preparación farmacéutica que comprende el ARNbc. La composición farmacéutica se

administra en una dosificación suficiente para inhibir la expresión del gen diana. El ARNbc generalmente puede administrarse a una dosificación inferior a 5 mg diarios de ARNbc por kilogramo de peso corporal, y es suficiente para inhibir o suprimir completamente la expresión del gen diana. En general, una dosis adecuada de ARNbc estará en el intervalo de 0,01 a 2,5 miligramos diarios por kilogramo de peso corporal del receptor, preferiblemente en el intervalo de 0,1 a 200 microgramos diarios por kilogramo de peso corporal, más preferiblemente en el intervalo de 0,1 a 100 microgramos diarios por kilogramo de peso corporal, aún más preferiblemente en el intervalo de 1,0 a 50 microgramos por kilogramo de peso corporal diarios, y lo más preferiblemente en el intervalo de 1,0 a 25 microgramos diarios por kilogramo de peso corporal. Una composición farmacéutica que comprende el ARNbc se administra una vez al día, o en múltiples subdosis; por ejemplo, empleando formulaciones de liberación sostenida muy conocidas en la técnica. La preparación y la administración de tales formulaciones farmacéuticas puede realizarse según técnicas convencionales, tal como se describe más a fondo a continuación.

Tal ARNbc puede utilizarse para inhibir la expresión y la actividad de ROS1 en un cáncer, preparando una preparación farmacéutica que incluye una cantidad terapéuticamente eficaz de tal ARNbc, como se ha descrito anteriormente, y administrando la preparación a un sujeto humano que tiene un cáncer de pulmón o presunto cáncer de pulmón (por ejemplo, un NSCLC o SCLC) que expresa un polipéptido con actividad quinasa ROS1 o ALK (tal como, por ejemplo, la expresión aberrante de la proteína ROS1 o ALK de longitud máxima o la expresión de una proteína de fusión ROS1 o ALK); por ejemplo, mediante inyección directa en el tumor. La inhibición similar de otras tirosinas quinasa receptoras, tales como VEGFR y EGFR, empleando inhibidores de ARNip ha sido descrita recientemente. Véanse la publicación de patente estadounidense nº 20040209832, la publicación de patente estadounidense nº 20030170891, y la publicación de patente estadounidense nº 20040175703.

Los productos terapéuticos inhibidores de ROS1 y/o inhibidores de EGFR útiles en la práctica de los métodos dados a conocer en la presente memoria pueden administrarse a un mamífero por cualquier medio conocido en la técnica, incluyendo, sin limitación, vías oral o peritoneal, incluyendo la administración intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, subcutánea, transdérmica (aerosol), rectal, vaginal y tópica (incluyendo bucal y sublingual).

Para la administración oral, generalmente se proporciona un producto terapéutico inhibidor de ROS1 y/o inhibidor de EGFR en forma de comprimidos o cápsulas, como un polvo o gránulos, o como una solución o suspensión acuosa. Los comprimidos para uso oral pueden incluir ingredientes activos mezclados con vehículos y excipientes farmacéuticamente aceptables, tales como diluyentes inertes, agentes disgregantes, agentes aglutinantes, agentes lubricantes, agentes edulcorantes, agentes aromatizantes, agentes colorantes y conservantes. Diluyentes inertes adecuados incluyen carbonato de sodio y de calcio, fosfato de sodio y de calcio, y lactosa, mientras que la fécula de maíz y el ácido algínico son agentes disgregantes adecuados. Los agentes ligantes pueden incluir fécula y gelatina, mientras que el agente lubricante, si está presente, generalmente será estearato de magnesio, ácido esteárico o talco. Si se desea, los comprimidos pueden revestirse con un material, tal como monoestearato de glicerilo o diestearato de glicerilo, para retrasar la absorción en el tracto gastrointestinal.

Las cápsulas para el uso oral incluyen cápsulas de gelatina dura, en las que el ingrediente activo se mezcla con un diluyente sólido, y cápsulas de gelatina blanda, en las que los ingredientes activos se mezclan con agua o un aceite, tal como aceite de cacahuete, parafina líquida o aceite de oliva. Para un uso intramuscular, intraperitoneal, subcutáneo e intravenoso, las composiciones farmacéuticas generalmente se proporcionan en soluciones o suspensiones acuosas estériles, tamponadas hasta un pH y una isotonicidad apropiados. Los vehículos acuosos adecuados incluyen la disolución de Ringer y el cloruro de sodio isotónico. El vehículo puede consistir exclusivamente en un tampón acuoso (“exclusivamente” significa que no hay presentes agentes auxiliares o sustancias encapsulantes que pudieran afectar o arbitrar la captación del fármaco inhibidor del producto terapéutico inhibidor de ROS1 y/o de EGFR). Tales sustancias incluyen, por ejemplo, estructuras micelares, tales como liposomas o cápsides, tal como se describe a continuación. Las suspensiones acuosas pueden incluir agentes suspensores, tales como los derivados de la celulosa, el alginato de sodio, la polivinilpirrolidona y la goma de tragacanto, y un agente humectante, tal como lecitina. Los conservantes adecuados para suspensiones acuosas incluyen p-hidroxibenzoato de etilo y de n-propilo.

Las composiciones terapéuticas inhibidoras de ROS1 y/o inhibidoras de EGFR también pueden incluir formulaciones encapsuladas para proteger al producto terapéutico (por ejemplo, un compuesto de ARNbc o un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido de fusión ROS1 o a un polipéptido EGFR mutante) contra la eliminación rápida del cuerpo, tal como una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes y sistemas de administración microencapsulados. Se pueden usar polímeros biocompatibles biodegradables, tales como etileno-acetato de vinilo, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres, y ácido poliláctico. Los métodos para la preparación de tales formulaciones serán evidentes para los expertos en la técnica. Los materiales también se pueden obtener comercialmente en Alza Corporation y Nova Pharmaceuticals, Inc. También se pueden usar suspensiones liposómicas (incluyendo liposomas dirigidos a células infectadas con anticuerpos monoclonales contra antígenos virales) como vehículos farmacéuticamente aceptables. Estos se pueden preparar según métodos conocidos por los expertos en la técnica; por ejemplo, tal como se describe en la patente estadounidense nº 4.522.811; en la publicación de PCT WO 91/06309; y en la publicación de patente europea EP-A-43075. Una formulación encapsulada puede incluir una proteína de la envuelta vírica. La proteína de la envuelta vírica puede derivarse de un virus —tal como un virus de polioma— o estar asociada con él, o puede ser parcial o totalmente artificial. Por

ejemplo, la proteína de la envuelta puede ser una proteína de virus 1 y/o una proteína de virus 2 del virus del polioma, o un derivado de las mismas.

Los productos terapéuticos inhibidores de ROS1 y/o inhibidores de EGFR también pueden incluir un vehículo de administración, incluyendo liposomas, para administración a un sujeto, vehículos y diluyentes y sus sales, y/o pueden estar presentes en formulaciones farmacéuticamente aceptables. Por ejemplo, se describen métodos para la liberación de moléculas de ácido nucleico en Akhtar et al., 1992, Trends Cell Bio., 2, 139; DELIVERY STRATEGIES FOR ANTISENSE OLIGONUCLEOTIDE THERAPEUTICS, ed. Akbtar, 1995, Maurer et al., 1999, Mol. Member. Biol., 16, 129-140; Hofland y Huang, 1999, Handb. Exp. Pharmacol., 137, 165-192; y Lee et al., 2000, ACS Symp. Ser., 752, 184-192. Además, la patente estadounidense nº 6.395.713 y la publicación de PCT nº WO 94/02595 describen los métodos generales para la administración de moléculas de ácido nucleico. Estos protocolos pueden utilizarse para el transporte de casi cualquier molécula de ácido nucleico.

Los productos terapéuticos inhibidores de ROS1 y/o inhibidores de EGFR (es decir, un compuesto inhibidor de ROS1 o de EGFR que se administra como producto terapéutico) se puede administrar a un tumor de mamífero por diversos métodos conocidos por los expertos en la técnica, incluyendo, sin limitación, encapsulación en liposomas, mediante iontoforesis, o por incorporación en otros vehículos, tales como hidrogeles, ciclodextrinas, nanocápsulas biodegradables y microesferas bioadhesivas, o mediante vectores proteináceos (véase la publicación de PCT nº WO 00/53722). Como alternativa, la combinación de producto terapéutico/vehículo se administra de modo local mediante una inyección directa o mediante el uso de una bomba de infusión. La inyección directa de la composición, ya sea subcutánea, intramuscular o intradérmica, puede tener lugar utilizando metodologías estándar de aguja y jeringa, o mediante tecnologías sin aguja como las descritas en Conry et al., 1999, Clin. Cancer Res., 5, 2330-2337 y la publicación de PCT nº WO 99/3 1262.

Las formulaciones farmacéuticamente aceptables de productos terapéuticos inhibidores de ROS1 y/o inhibidores de EGFR incluyen sales de los compuestos descritos anteriormente —por ejemplo, sales de adición de ácidos; por ejemplo, sales de ácido clorhídrico, bromhídrico, acético y bencenosulfónico—. Una formulación o composición farmacológica se refiere a una formulación o composición en una forma adecuada para la administración; por ejemplo, la administración sistémica, en una célula o un paciente, incluyendo, por ejemplo, un ser humano. Las formas adecuadas, en parte, dependen del uso o la vía de entrada; por ejemplo, oral, transdérmica o mediante inyección. Tales formas no deberían impedir que la formulación o composición alcance una célula diana. Por ejemplo, las composiciones farmacológicas inyectadas en la corriente sanguínea deberían ser solubles. En la técnica se conocen otros factores, e incluyen consideraciones tales como la toxicidad y las formas que evitan que la composición o formulación ejerza su efecto.

Las vías de administración que conducen a una absorción sistémica (por ejemplo, la absorción sistémica o acumulación de fármacos en la corriente sanguínea, seguido de su distribución por todo el cuerpo) son deseables e incluyen, sin limitaciones: intravenosa, subcutánea, intraperitoneal, por inhalación, oral, intrapulmonar e intramuscular. Cada una de estas vías de administración exponen el producto terapéutico inhibidor de ROS1 a un tejido enfermo o tumor accesible. Se ha demostrado que la velocidad de entrada de un fármaco hacia la circulación es una función de su peso molecular o su tamaño. El uso de un liposoma u otro vehículo farmacológico que contenga los compuestos de la presente invención puede localizar potencialmente el fármaco, por ejemplo, en ciertos tipos de tejidos, tales como los tejidos del sistema endotelial reticular (RES). También es útil una formulación de liposomas que puede facilitar la asociación del fármaco con la superficie de las células, tales como linfocitos y macrófagos. Esta estrategia puede proporcionar un transporte potenciado del fármaco a las células diana aprovechando la especificidad del reconocimiento inmunológico de las células anómalas, tales como células del cáncer, por parte de los macrófagos y de los linfocitos.

Una “formulación farmacéuticamente aceptable” significa una composición o formulación que permite la distribución eficaz de las moléculas de ácidos nucleicos en la localización física más adecuada para su actividad deseada. Ejemplos no limitantes de agentes adecuados para la formulación con las moléculas de ácidos nucleicos incluyen: inhibidores de p-glicoproteínas (tales como Pluronic P85), que pueden potenciar la entrada de fármacos en el SNC (Jolliet-Riant y Tillement, 1999, Fundam. Clin. Pharmacol., 13, 16-26); polímeros biodegradables, tales como microesferas de poli(DL-lactida-coglicólido) para la administración de liberación sostenida después de la implantación intracerebral (Emerich et al, 1999, Cell Transplant, 8, 47-58) (Rosermes, Inc. Cambridge, Massachusetts); y nanopartículas cargadas, tales como las fabricadas con polibutilcianoacrilato, que puede transportar fármacos atravesando la barrera hematoencefálica y pueden alterar los mecanismos de captación neuronal (Prog Neuro-psychopharmacol Biol Psychiatry, 23, 941-949, 1999). Otros ejemplos no limitantes de estrategias de liberación para los compuestos inhibidores de ROS1 útiles en los métodos dados a conocer en la presente memoria incluyen los materiales descritos en Boado et al., 1998, J. Pharm. Sci., 87, 1308-1315; Tyler et al., 1999, FEBS Lett., 421, 280-284; Pardridge et al., 1995, PNAS USA, 92, 5592-5596; Boado, 1995, Adv. Drug Delivery Rev., 15, 73-107; Aldrian-Herrada et al., 1998, Nucleic Acids Res., 26, 4910-4916; y Tyler et al., 1999, PNAS USA., 96, 7053-7058.

Las composiciones terapéuticas que incluyen liposomas modificados en superficie que contienen lípidos de polietilenglicol (modificados con PEG, o liposomas de largo tiempo en circulación o liposomas sigilosos) también pueden emplearse de modo adecuado en los métodos dados a conocer en la presente memoria. Estas

formulaciones ofrecen un método para aumentar la acumulación de fármacos en tejidos diana. Esta clase de vehículos farmacológicos resiste la opsonización y la eliminación por el sistema fagocítico mononuclear (MPS o RES), permitiendo con ello tiempos en la circulación sanguínea más largos y una mayor exposición tisular para el fármaco encapsulado (Lasic et al. Chem. Rev., 1995, 95, 2601-2627; Ishiwata et al., Chem. Pharm. Bull. 1995, 43, 1005-1011). Se ha demostrado que tales liposomas se acumulan selectivamente en tumores, presumiblemente debido a la extravasación y la captura en los tejidos diana neovascularizados (Lasic et al., Science 1995, 267, 12751276; Oku et al.,1995, Biochim. Biophys. Acta, 1238, 86-90). Los liposomas de tiempo de circulación largo potencian la farmacocinética y la farmacodinámica del ADN y el ARN, en particular en comparación con los liposomas catiónicos convencionales que se sabe que se acumulan en tejidos del MPS (Liu et al., J. Biol. Chem. 1995, 42, 24864-24870; publicación de PCT nº WO 96/10391; publicación de PCT nº WO 96/10390; y publicación de PCT nº WO 96/10392). También es probable que los liposomas de largo tiempo en circulación protejan a los fármacos de la degradación por nucleasas en un grado mayor que los liposomas catiónicos, en función de su capacidad de evitar la acumulación en tejidos de MPS metabólicamente agresivos, tales como el hígado y el bazo.

Las composiciones terapéuticas pueden incluir una cantidad farmacéuticamente eficaz de los compuestos deseados en un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. Los vehículos o diluyentes aceptables para un uso terapéutico son muy conocidos en la técnica farmacéutica, y se describen, por ejemplo, en REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES, Mack Publishing Co. (A. R. Gennaro ed. 1985). Por ejemplo, pueden proporcionarse conservantes, estabilizantes, tinciones y agentes aromatizantes. Estos incluyen benzoato de sodio, ácido sórbico y ésteres del ácido p-hidroxibenzoico. Además, pueden utilizarse antioxidantes y agentes suspensores.

En algunas realizaciones, el producto terapéutico inhibidor de ROS1 y/o el producto terapéutico inhibidor de EGFR es administrado en una cantidad eficaz. Por “cantidad eficaz” o “dosis eficaz” se entiende la cantidad del producto terapéutico requerida para prevenir, inhibir la aparición o tratar (aliviar un síntoma en cierta medida, preferiblemente todos los síntomas) de un estado patológico (por ejemplo, cáncer de pulmón). La dosis eficaz depende del tipo de enfermedad, del uso terapéutico, de la vía de administración, del tipo de mamífero que se esté tratando, de las características físicas del mamífero específico considerado, de la medicación concurrente y de otros factores que los expertos en las técnicas médicas reconocerán. Generalmente, una cantidad eficaz es una cantidad entre 0,1 mg/kg y 100 mg/kg de peso corporal/día de ingredientes activos que se administra dependiendo de la potencia del polímero cargado negativamente.

Unos niveles de dosificación del orden de aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 140 mg diarios por kilogramo de peso corporal son útiles en el tratamiento de los trastornos indicados anteriormente (de aproximadamente 0,5 mg a aproximadamente 7 g diarios por paciente). La cantidad de ingrediente activo que se puede combinar con los materiales vehiculares para producir una forma posológica única varía dependiendo del anfitrión tratado y del modo particular de administración. Las formas posológicas unitarias generalmente contienen entre aproximadamente 1 mg a aproximadamente 500 mg de un ingrediente activo. Se entiende que el nivel de dosis específica para cualquier paciente concreto depende de diversos factores, que incluyen la actividad del compuesto específico empleado, la edad, el peso corporal, la salud general, el sexo, la dieta, el momento de la administración, la vía de administración y la velocidad de excreción, la combinación de fármacos y la gravedad de la enfermedad particular sometida a terapia.

Para la administración a animales no humanos, la composición también puede añadirse al pienso animal o al agua para beber. Puede resultar conveniente formular las composiciones de pienso animal y de agua para beber, de modo que el animal ingiera una cantidad terapéuticamente apropiada de la composición junto con su dieta. También puede resultar conveniente presentar la composición como una premezcla para la adición al pienso o al agua para beber.

Un producto terapéutico inhibidor de ROS1 y/o inhibidor de EGFR útil en la práctica de la divulgación puede comprender un solo compuesto según se ha descrito anteriormente, o una combinación de múltiples compuestos, ya sea en la misma clase de inhibidor (por ejemplo, inhibidor de anticuerpos), o en diferentes clases (por ejemplo, inhibidores de anticuerpos e inhibidores de molécula pequeña). Tal combinación de compuestos puede aumentar el efecto terapéutico global mediante la inhibición del avance de un cáncer que expresa la proteína de fusión. Por ejemplo, la composición terapéutica puede incluir un inhibidor de molécula pequeña, tal como Crizotinib (también denominado PF-02341066) producido por Pfizer, Inc. (véase la publicación de estadounidense nº 2008/0300273) solo o en combinación con otros análogos de Crizotinib dirigidos a la actividad ROS1 y/o inhibidores de molécula pequeña de ROS1, tales como NVP-TAE684, producido por Novartis, Inc., o el compuesto CH5424802, descrito in Sakamoto et al., Cancer Cell 19: 679-690, 2011. La composición terapéutica también puede comprender uno o más agentes quimioterapéuticos no específicos, además de uno o más inhibidores dirigidos. Recientemente se ha demostrado que estas combinaciones proporcionan un efecto sinérgico de destrucción del tumor en muchos cánceres. La eficacia de tales combinaciones para inhibir la actividad de ROS1 y/o EGFR y el desarrollo tumoral in vivo puede ser evaluada como se describe a continuación.

La divulgación también proporciona, en parte, métodos para determinar si un compuesto inhibe el avance de un cáncer (por ejemplo, un cáncer de pulmón) caracterizado por un polipéptido con actividad quinasa ROS1 o ALK, un polipéptido EGFR mutante o un polinucleótido que codifica los mismos, determinando si el compuesto inhibe la

expresión de la actividad quinasa ROS1, ALK o EGFR del polipéptido en el cáncer. En algunas realizaciones, la inhibición de la actividad de ROS1 o ALK o de un polipéptido EGFR mutante se determina examinando una muestra biológica que incluye células de médula ósea, sangre o un tumor. En otra realización, la inhibición de la actividad quinasa ROS1 o ALK o EGFR mutante se determina utilizando al menos un reactivo que se une específicamente a un polipéptido ROS1 o ALK (por ejemplo, un anticuerpo específico a ROS1 un anticuerpo específico a ALK) o a un polipéptido EGFR mutante, o un reactivo que se une específicamente a un polinucleótido que codifique un polipéptido ROS1 o ALK o un polipéptido EGFR mutante (por ejemplo, un ARNip o un antisentido).

El compuesto sometido a ensayo puede ser cualquier tipo de producto terapéutico o composición, según se ha descrito anteriormente. Los métodos para evaluar la eficacia de un compuesto, tanto in vitro como in vivo, están bien establecidos y son conocidos en la técnica. Por ejemplo, una composición puede ser sometida a ensayo para averiguar su capacidad de inhibir ROS1 o un polipéptido EGFR mutante in vitro usando una célula o un extracto celular en el que la quinasa ROS1 está activada o en el que se expresa un polipéptido EGFR mutante. Puede emplearse un panel de compuestos para ensayar la especificidad del compuesto para ROS1 o EGFR (en oposición a otras dianas, tales como PDGFR).

Otra técnica para la selección de fármacos que puede usarse proporciona una selección de alto rendimiento de compuestos que tienen afinidad de unión adecuada a una proteína de interés, como se describe en la publicación de PCT nº WO 84/03564. En este método, al igual que se aplica a los polipéptidos que tienen actividad ROS1 o ALK o a los polipéptidos EGFR mutantes, se sintetiza un gran número de compuestos de ensayo pequeños diferentes sobre un sustrato sólido, tal como varillas de plástico o alguna otra superficie. Se puede hacer que los compuestos de ensayo reaccionen con un polipéptido dado a conocer en la presente memoria, o con fragmentos del mismo, y se lavan. El polipéptido unido es detectado entonces mediante métodos muy conocidos en la técnica. Un polipéptido purificado también puede recubrir directamente placas para ser usado en las técnicas de selección de fármacos anteriormente mencionadas. Como alternativa, pueden emplearse anticuerpos no neutralizantes para capturar el péptido e inmovilizarlo sobre un soporte sólido.

Entonces, un compuesto que se haya descubierto que es un inhibidor eficaz de la actividad ROS1 o EGFR mutante in vitro puede ser estudiado para determinar su capacidad de inhibir el avance de un cáncer que expresa un polipéptido con actividad quinasa (tal como cáncer de pulmón u otro cáncer, tal como cáncer hepático, cáncer de pulmón, cáncer de colon, cáncer de riñón o cáncer de páncreas), in vivo, utilizando, por ejemplo, xenoinjertos de mamíferos que albergan tumores humanos de pulmón, hígado, páncreas, riñón, pulmón o colon que expresan un polipéptido con actividad quinasa ROS1 o ALK o un polipéptido EGFR mutante. En este procedimiento, líneas celulares que se sabe que expresan una proteína que tiene actividad quinasa ROS1 o ALK (por ejemplo, ROS1 o ALK de longitud máxima o una de las proteínas de fusión ROS1 o ALK) o un polipéptido EGFR mutante pueden ser puestas subcutáneamente en un animal (por ejemplo, en un ratón desnudo o SCID u otro animal inmunocomprometido). Después, las células se desarrollan produciendo una masa tumoral que puede ser monitorizada de forma visual. A continuación, el animal puede ser tratado con el fármaco. El efecto del tratamiento con el fármaco sobre el tamaño del tumor puede observarse externamente. A continuación, el animal es sacrificado y se extirpa el tumor para su análisis mediante IHC y transferencia de tipo Western. De forma similar, pueden prepararse trasplantes de médula ósea de mamíferos, mediante métodos estándar, para examinar la respuesta a los fármacos en tumores hematológicos que expresan una proteína con actividad quinasa ROS1 o ALK o un polipéptido EGFR mutante. De esta forma, los efectos del fármaco pueden observarse en el contexto biológico que más se parece a un paciente. La capacidad del fármaco para alterar la señalización en las células tumorales o en las células estromales circundantes puede determinarse mediante un análisis con anticuerpos específicos a la fosforilación. La eficacia del fármaco para inducir la muerte celular o la inhibición de la proliferación celular también puede observarse mediante un análisis con marcadores específicos a la apoptosis, tales como caspasa 3 escindida y PARP escindida.

La toxicidad y la eficacia terapéutica de dichos compuestos pueden ser determinadas mediante procedimientos farmacéuticos convencionales en cultivos celulares o en animales experimentales; por ejemplo, para determinar la DL50 (la dosis letal para el 50% de la población) y la DE50 (la dosis terapéuticamente eficaz en el 50% de la población). La proporción de dosis entre los efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico, y puede ser expresado como la proporción DL50/DE50. En algunas realizaciones, los compuestos presentan altos índices terapéuticos.

En la práctica del método divulgado para determinar si un compuesto inhibe el avance de un tumor caracterizado por la presencia de un polipéptido con actividad quinasa ROS1 (o de un que codifica el mismo), también pueden usarse de forma ventajosa muestras biológicas que incluyen células de xenoinjertos (o trasplantes de médula ósea) de mamíferos. Los xenoinjertos (o receptores de trasplante) no limitantes son pequeños mamíferos, tales como ratones, que albergan tumores (o leucemias) humanos que expresan un polipéptido con actividad quinasa ROS1 o ALK (por ejemplo, un polipéptido de fusión ROS1 o ALK o un ROS1 o ALK de longitud máxima) o un polipéptido EGFR mutante. Los xenoinjertos que albergan tumores humanos son muy conocidos en la técnica (véase Kal, Cancer Treat Res., 72: 155-69 (1995)), y la producción de xenoinjertos de mamífero que albergan tumores humanos ha sido bien descrita (véase, Winograd et al., In Vivo, 1 (1): 1-13 (1987)). De manera similar, la generación y el uso de modelos de trasplante de médula ósea están bien descritos (véanse, por ejemplo, Schwaller, et al., EMBO J. 17: 5321-333 (1998); Kelly et al., Blood, 99: 310-318 (2002)).

Los siguientes Ejemplos se proporcionan solo para ilustrar más a fondo la memoria descriptiva y no pretenden limitar su alcance, salvo en lo provisto en las reivindicaciones adjuntas a la misma. La presente divulgación abarca modificaciones y variaciones de los métodos indicados en la presente memoria que serían obvias para una persona con un dominio normal de la técnica. Los materiales, reactivos y similares a los que se hace referencia pueden obtenerse de fuentes comerciales, a no ser que se indique algo distinto.

Ejemplo 1

Detección de la proteína quinasa ROS1 por inmunohistoquímica (IHC)

Las proteínas de fusión ROS1 han sido descritas previamente en líneas celulares de NSCLC y en muestras tumorales humanas de NSCLC (así como en otros tejidos, tales como el cáncer de hígado y el de cerebro). Para determinar si las proteínas de fusión ROS1 descubiertas en NSCLC pudieran o no ser detectadas por inmunohistoquímica, se utilizó un anticuerpo monoclonal de conejo específico a ROS1. El anticuerpo específico a ROS1 (concretamente, el anticuerpo monoclonal de conejo ROS1 D4D6) que se utilizó en estos estudios ha sido descrito previamente (véase la publicación de PCT nº WO2010/093928), y se une específicamente a una región de la proteína quinasa ROS1 humana que está en C-terminal al dominio quinasa de la proteína ROS1. Aunque el anticuerpo D4D6 no está todavía comercialmente disponible, hay anticuerpos específicos a ROS1 similares disponibles comercialmente en diversos proveedores, incluyendo, sin limitación, el anticuerpo Ros (C-20), nº de catálogo sc-6347 de Santa Cruz Biotechnology, Inc., (Santa Cruz, California) y el anticuerpo ROS1 (69D6), nº de catálogo 3266 de Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, Massachusetts).

Para estos estudios, se preparó una cohorte de 556 muestras humanas de tumores de NSCLC como bloques de parafina. Todas las muestras tumorales fueron evaluadas por un patólogo, y se encontró que comprendían 246 casos de adenocarcinoma, 64 carcinomas broncoalveolares, 226 carcinomas escamosos y 20 megacíticos. Las identificaciones de las muestras seleccionadas, incluyendo las muestras positivas a ROS1 y a EGFR mutante, fueron confirmadas por un patólogo independiente.

Inmunohistoquímica: Se desparafinaron secciones tisulares de 4-6 μm y se rehidrataron a través de xileno y etanol graduado, respectivamente (por ejemplo, a través de tres cambios de xileno durante 5 minutos cada uno, luego se rehidrataron a través de dos cambios de etanol al 100% y 2 cambios de etanol al 95%, cada uno durante 5 minutos). Los portaobjetos se enjuagaron en diH2O, después se sometieron a la recuperación de antígeno en una Decloaking Chamber (Biocare Medical, Concord, California) usando 1,0 mM EDTA, pH 8, y reglajes del fabricante: SP1 125°C durante 30 segundos y SP2 90°C durante 10 segundos. Los portaobjetos se inactivaron en H2O2 al 3% durante 10 minutos, luego se lavaron en diH2O. Después de bloquear en solución salina tamponada con Tris al 0,5% Tween-20 (TBST) positivo/suero de cabra al 5% en una cámara humidificada, los portaobjetos fueron incubados durante la noche a 4°C con AcM XP™ de conejo ROS1 (D4D6) a 0,19 μg/ml diluido en diluyente de anticuerpos SignalStain® (nº 8112 Cell Signaling Technology, Danvers, Massachusetts). Después de lavar con TBST, la detección se realizó con ENVISION+ (Dako, Carpintería, California) o SIGNALSTAIN® Boost IHC Detection Reagent (HRP, conejo) (nº de catálogo 8114, Cell Signaling Technology, Danvers, Massachusetts) con una incubación de 30 minutos a temperatura ambiente en una cámara humidificada. Después de lavar los portaobjetos (por ejemplo, tres veces en TBST), los portaobjetos fueron expuestos a continuación a NovaRed (Vector Laboratories, Burlingame, California) preparado según las instrucciones del fabricante.

Los portaobjetos se revelaron durante 1 minuto y después se aclararon en diH2O. Los portaobjetos se sometieron a contratinción incubando en hematoxilina (lista para usar, comercialmente disponible de Invitrogen (Carlsbad, California) nº de catálogo 00-8011) durante 1 minuto, se aclararon durante 30 segundos en diH2O, se incubaron durante 20 segundos en reactivo azulado (Richard Allan Scientific, Kalamazoo, Míchigan (empresa del grupo Thermo Scientific), nº de catálogo 7301), y finalmente se lavaron durante 30 segundos en diH2O. Los portaobjetos se deshidrataron en 2 cambios de etanol al 95% durante 20 segundos cada uno y 2 cambios de etanol al 100% durante 2 minutos cada uno. Los portaobjetos se aclararon en 2 cambios de xileno durante 20 segundos cada uno, después se secaron al aire. Los cubreobjetos se montaron usando VectaMount (Vector Laboratories, Burlingame, California). Los portaobjetos se secaron al aire, luego se evaluaron bajo el microscopio. Las imágenes (20×) se adquirieron usando un microscopio Olympus CX41 equipado con una cámara Olympus DP70 y soporte lógico DP Controller.

De los 556 tumores NSCLC seleccionados por inmunohistoquímica con el Rmab ROS1 D4D6 específico a ROS1, se identificaron 9 tumores positivos a ROS1. El desglose fue el siguiente:

De los 246 adenocarcinomas, 8 (o el 3,3%) fueron positivos para la quinasa ROS1.

De los 20 carcinomas megacíticos, 1 (o el 5,0%) fueron positivos para la quinasa ROS1.

Se observaron diversos patrones de tinción ROS1 IHC que van desde el citoplasmático débil hasta los agregados perinucleares fuertes (véanse las Figuras 1A-F). En 5/9 (55%) casos ROS1 se localizó difusamente en el citoplasma (Fig. 1A). Se observó fuerte tinción citoplasmática en 1 carcinoma megacítico (Fig. 1C). Dos casos presentaban fenotipos diferenciados entre sí, siendo uno citoplasmático difuso con áreas de tinción punteada de la membrana plasmática (Fig. 1D) y la otra tinción vesicular total (Fig. 1F). También debe observarse que en casos excepcionales

las células no neoplásicas, tales como macrófagos y células epiteliales bronquiales, fueron teñidas con ROS1 D4D6. La expresión de ROS1 estaba ausente en el tejido estromal circundante.

Ejemplo 2

Detección de una fusión ROS1 en muestras de cáncer humano usando el ensayo FISH

Se detectó la presencia de la proteína de fusión de SLC34A2-ROS1 y/o de la proteína CD74-ROS1 (u otra proteína de fusión ROS1) en muestras tumorales de NSCLC humano empleando un ensayo de hibridación fluorescente in situ (FISH), según se ha descrito previamente. Véase, por ejemplo, Verma et al., HUMAN CHROMOSOMES: A MANUAL OF BASIC TECHNIQUES, Pergamon Press, Nueva York, Nueva York (1988). Se estudiaron más de 200 muestras tumorales de NSCLC humano introducidas en parafina.

Para analizar las reordenaciones que tienen que ver con ROS1, se diseñó una sonda de escisión de dos colores. Se obtuvieron una sonda proximal (clon de BAC RP1-179P9) y dos sondas distales (clon BAC RP11-323017, RP194G16) (estando todas ellas comercialmente disponibles, por ejemplo, en Invitrogen Inc., Carlsbad, California, como nos de catálogo RPCI1.C y RPCI11.C). Las localizaciones en las que estas sondas se unen al gen ROS1 se muestran esquemáticamente en la Fig. 2. Como se muestra en la Fig. 2A, la sonda proximal se marcó con Spectrum Orange dUTP, y las sondas distales se marcaron con Spectrum Green dUTP. El marcado de las sondas se realizó con el Nick Translation DNA Labeling Kit de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Enzo Life Sciences, Farmingdale, Nueva York). Se realizó FISH en secciones tisulares FFPE de 4 μm de espesor según métodos estándar. Por ejemplo, las secciones de tejido embebidas en parafina se rehidrataron y se sometieron a recuperación de antígeno con microondas en tampón citrato 0,01M (pH 6,0) durante 11 minutos. Las secciones se digirieron con proteasa (pepsina 4 mg/ml, 2000-3000 U/mg) durante 25 minutos a 37°C, se deshidrataron y se hibridaron con la sonda FISH ajustada a 37°C durante 18 horas. Después de lavar, se aplicó 4′,6-diamidino-2fenilindol (DAPI; mg/ml) en medio de montaje Vectashield (Vector Laboratories, Burlingame, California) para la contratinción nuclear.

Los casos positivos en FISH para ROS1 se definieron como señales de escisión >15% en las células tumorales. Se utilizó el microscopio Nikon C1 Confocal, objetivo de 60× X y trifiltro (dapi, TRITC, FITC) para puntuar cada case. Para la adquisición de imágenes se utilizó el microscopio de fluorescencia de campo ancho Olympus BX-51 con objetivo de 40 X y el soporte lógico Metamorph para generar imágenes tricolor.

Por lo tanto, la sonda de reordenación ROS1 contiene dos sondas marcadas de manera diferente en lados opuestos del punto de rotura del gen ROS1 en la secuencia de la forma natural (WT) (véase la Figura 15A). Cuando se hibrida, la región ROS1 nativa aparecerá como una señal de fusión anaranjada/verde, mientras que la reordenación en este locus (como ocurre en la proteína de fusión SLC34A2-ROS1) dará como resultado señales separadas anaranjada y verde.

Como se muestra en la Figura 2B, se encontró un gen ROS1 reordenado en HCC78 (Figura 2B, panel izquierdo) que, como se ha descrito anteriormente, contiene una reordenación de genes que da como resultado la fusión SLC34A2-ROS1. En una de las muestras de pulmón humano —concretamente, la del pulmón 306—, se encontró un reordenamiento del gen ROS1 similar, que puede ser SLC34A2-ROS1 o CD74-ROS1.

El análisis FISH reveló una baja incidencia de esta mutación de ROS1 en la población de muestras estudiada. De los 123 tumores iniciales examinados, dos de los 123 tumores o el 1,6 % de los tumores contenían las mutaciones de fusión ROS1. Sin embargo, dada la alta incidencia del NSCLC a lo largo del mundo (más de 151.00 casos nuevos al año solamente en EE. UU.), cabe esperar que haya un número significativo de pacientes que alberguen este ROS1 mutante, pacientes que pueden beneficiarse de un régimen terapéutico inhibidor de ROS1.

Ejemplo 3

Descubrimiento del tumor NSCLC positivo para FIG-ROS1

Del Ejemplo 1, una de las muestras tumorales, concretamente el tumor 749, mostró tinción con ROS1 que se localizó en los compartimentos vesiculares (véase la Fig. 1F). Este patrón de tinción es distinto de todos los demás tumores positivos a ROS1, lo que apunta a la posibilidad de un socio de fusión ROS1 diferente.

Para determinar cuál era el patrón FISH de este tumor 749, se obtuvo de Invitrogen una tercera sonda distal RP11213A17 para investigar más a fondo si la mutación ROS1 en este tumor podría deberse a una fusión FIG-ROS1. las fusiones entre el gen FIG y el gen ROS1 han sido descritas en glioblastoma, colangiocarcinoma y cáncer hepático (véanse Charest et al., Genes Chromosomes Cancer 37: 58-71, 2003; Charest et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100: 916-921, 2003; y la publicación de PCT nº WO2010/093928), pero esta fusión nunca antes se ha descrito en el pulmón. Dado que la fusión entre el gen FIG y el gen ROS1 no da lugar a una translocación o inversión, sino que resulta más bien de una deleción intracromosómica en el cromosoma 6 de 240 kilobases, se diseñó un nuevo conjunto de sondas FISH.

Las sondas FISH utilizadas en la prueba de confirmación IHC descrita anteriormente (véase el Ejemplo 2 anterior) identificaron aquellos tumores y células con translocaciones equilibradas de ROS1 que podrían ser debidas a la presencia de una de las proteínas de fusión SLC34A2-ROS1 o a la proteína de fusión CD74-ROS1. El patrón de FISH en el pulmón 749 sugirió que el reordenamiento no era una de estas dos fusiones, sino, potencialmente, la de FIG-ROS1. Para determinar si el pulmón ID 749 era de hecho positivo para FIG-ROS1, se diseñó otro conjunto de sondas FISH (Fig. 3). Como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 2, el conjunto 1 de sondas que contiene los BAC 179P9 y 323017 flanquea ambos lados del punto de rotura ROS1 en las proteínas de fusión ROS1 descritas en la presente memoria (por ejemplo, después del exón 34, 35 o 36 de ROS1) (véanse las Fig. 3 y Fig. 2A). En las células HCC78 positivas para SLC34A-ROS1 (véanse la Fig. 2B, panel izquierdo y la Fig. 4A), el conjunto 1 de sondas da como resultado una translocación equilibrada. En la línea celular de glioblastoma humano U118MG positiva para FIG-ROS1, BAC 323017 no hibridó, ya que esta sección del cromosoma 6 se suprime, dando como resultado solo señales anaranjadas (Fig. 4C). El conjunto 2 de sondas contenía 179P9 situado en ROS1 y 213A7 situado en el gen FIG, por lo que U118MG muestra tanto señales anaranjadas como verdes con este conjunto de sondas (véase la Fig. 4D). Las células HCC78 mostraron 1 cromosoma con una translocación equilibrada (por ejemplo, a partir de una fusión SLC34A2-ROS1; véanse las dos flechas amarillas en la Fig. 4B) y la flecha blanca en la Fig. 4B apunta a un cromosoma normal con las señales verde y anaranjada juntas, ya que el gen FIG y el gen ROS1 están, de hecho, muy juntos en el mismo cromosoma (véase la Fig. 4B). El cromosoma de la forma natural presentó una señal separada, debido a la distancia entre las sondas. El pulmón de ID 749, cuando fue sondeado con el conjunto 1 de sondas (Fig. 4E) o el conjunto 2 de sondas (véase la Fig. 4F), imitó el de las células U118MG (Figuras 4C y D). Estos datos fueron los primeros en mostrar la fusión de FIG-ROS1 como una deleción intracromosómica en el cromosoma 6 en NSCLC.

Ejemplo 4

Aislamiento y secuenciación del gen de fusión FIG-ROS1(S) del tumor pulmonar 749

Para aislar y secuenciar la fusión ROS1 del tumor 749 (que era un tumor fijado en formol, embebido en parafina), se utilizó el siguiente protocolo.

RT-PCR de muestras tumorales FFPE: Se extrajo ARN de secciones de 3 × 10 μm siguiendo protocolos estándar (RNeasy FFPE Kit, Qiagen). Se sintetizó el ADNc de la primera cadena a partir de 500 ng de ARN total con el uso del sistema de síntesis de primera cadena SuperScript III (Invitrogen) con cebadores específicos a genes. A continuación, se amplificó el ADNc de la fusión FIG-ROS1 con el uso de pares de cebadores de PCR FIG-F3 y ROS1-GSP3.1 para la isoforma corta y FIG-F7 y ROS1-GSP3.2 para las isoformas largas. Los cebadores GAPDH se adquirieron de Qiagen (Valencia, California).

Cebadores

ROS1-GSP3.1: CAGCAAGAGACGCAGAGTCAGTTT (SEQ ID NO: 18)

ROS1-GSP3.2: GCAGCTCAGCCAACTCTTTGTCTT (SEQ ID NO: 10)

FIG-F3: GCTGTTCTCCAGGCTGAAGTATATGG (SEQ ID NO: 19)

FIG-F7: GTAACCCTGGTGCTAGTTGCAAAG (SEQ ID NO: 20)

Se seleccionaron los cebadores para FIG porque, basándose en los patrones FISH observados en el tumor 749 y en la información publicada sobre la fusión FIG-ROS1, cabía esperar que el tumor 749 fuera una fusión FIG-ROS1.

Como se predijo, la proteína de fusión ROS1 en el tumor 749 era, de hecho, una fusión FIG-ROS1, específicamente la fusión FIG-ROS1 (S) descrita anteriormente (véase la publicación PCT nº WO2010/0923828). La Figura 5 muestra una alineación de la secuencia del bloque FFPE del tumor 749 (en la línea “sujeto”) con la secuencia de FIG-ROS1(S) descrita en la publicación de PCT nº WO2010/0923828 (en la línea “consulta”). Como se muestra en la Figura 5, la identidad era 100% con 0 huecos. Dado que FIG-ROS1(S) contiene todo el dominio quinasa de la quinasa ROS1, cabe esperar que esta FIG-ROS1(S) retenga la actividad quinasa y, por lo tanto, que sea una proteína con actividad quinasa ROS1 como se describe en la presente memoria.

La SEQ ID NO: 24 presenta la secuencia de aminoácidos de FIG-ROS1(S) y la SEQ ID NO: 23 presenta la secuencia de nucleótidos de FIG-ROS1(S).

Se ha descrito la FIG-ROS (L) en el cáncer hepático (véase la publicación de PCT nº WO2010/0923828). Las SEC ID Nos.: 22 y 21 presentan las secuencias de aminoácidos y nucleótidos, respectivamente, de FIG-ROS1(L). Además, a partir del análisis de la estructura génica de los genes FIG y ROS1, se ha propuesto una tercera variante de FIG-ROS1 (concretamente, FIG-ROS1(XL) (véase la publicación de PCT nº WO2010/0923828). Las SEC ID Nos.: 26 y 25 presentan las secuencias de aminoácidos y nucleótidos, respectivamente, de FIG-ROS1(XL). Dado este hallazgo de FIG-ROS1(S) en el NSCLC, también se pueden encontrar otras variantes de la proteína de fusión FIG-ROS1 en el NSCLC.

Ejemplo 5

Detección de la expresión de la quinasa ROS1 en una muestra de cáncer de pulmón humano usando un ensayo de PCR

La presencia de una proteína ROS1 de longitud máxima expresada aberrantemente o de una proteína de fusión ROS1 (por ejemplo, una de las proteínas de fusión SLC34A2-ROS1, de la proteína de fusión CD74-ROS1 o de una de las proteínas de fusión FIG-ROS1) en una muestra de cáncer de pulmón humano puede detectarse mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), ya sea genómica o de la transcriptasa inversa (RT), previamente descrita. Véase, por ejemplo, Cools et al., N. Engl. J. Med., 348: 1201-1214 (2003).

Sucintamente y a título de ejemplo, empleando técnicas convencionales pueden obtenerse muestras de tumor o de un derrame pleural de un paciente que padece NSCLC. Se construyen sondas de PCR contra la quinasa ROS1 truncada, la proteína de fusión SLC34A2-ROS1, CD74-ROS1 o FIG-ROS1. Puede utilizarse el kit RNeasy Mini Kit (Qiagen) para extraer ARN de las muestras del tumor o del derrame pleural. Puede extraerse ADN con el uso del DNeasy Tissue Kit (Qiagen). Para RT-PCR, el ADNc de primera cadena se sintetiza a partir de, por ejemplo, 2.5 mg de ARN total con el uso de, por ejemplo, del sistema de síntesis de la primera cadena SuperScript™ III (Invitrogen) con oligo (dT)20. A continuación, se amplifica el gen ROS1 o el gen de fusión ROS1 (por ejemplo, SLC34A2-ROS1, CD74-ROS1 o FIG-ROS1) con el uso de pares de cebadores, por ejemplo, SLC34A2-F1 y ROS1-P3 (véase el Ejemplo 5 anterior). Para la PCR genómica, la amplificación del gen de fusión puede realizarse con el uso del kit de alta fidelidad Taq Platinum de ADN polimerasa (Invitrogen) con pares de cebadores; por ejemplo, SLC34A2-F1 y ROS1-R1, o SLC34A2-F1 y ROS1-R2.

Tal análisis identificará a un paciente que tiene un cáncer caracterizado por la expresión de la quinasa ROS1 truncada (y/o una proteína de fusión ROS1 tal como FIG-ROS1, SLC34A2-ROS1 o CD74-ROS1), paciente que es candidato para el tratamiento usando un producto terapéutico inhibidor de ROS1.

Ejemplo 6

Sensibilidad de las fusiones quinasa ROS1 a TAE-6 4 y crizotinib

La pequeña molécula TAE-6 4, una 5-cloro-2,4-diaminofenilpirimidina, inhibe la quinasa ALK. La estructura de TAE684 se proporciona en Galkin, et al., Proc. National Acad. Sci 104(1) 270-275, 2007. Otra pequeña molécula, concretamente crizotinib, también inhibe la quinasa ALK, así como la quinasa MET. La estructura de crizotinib (también denominado PF-02341066) se proporciona en Zou HY et al., Cancer Research 67: 4408-4417, 2007 y en la publicación de patente estadounidense nº 20080300273.

Se determinó si TAE-684 y/o crizotinib también inhiben la actividad quinasa de los polipéptidos de fusión ROS1.

Se obtuvieron en DSMZZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Alemania) células BaF3 y Karpas 299. Las células BaF3, que necesitan interleucina-3 para sobrevivir, se mantuvieron a 37° C en medio RPMI-1640 (Invitrogen) con suero fetal bovino (FBS) al 10% (Sigma) y 1,0 ng/ml de IL-3 murina (R&D Systems). Se cultivaron células Karpas 299 (una línea celular de linfoma) en RPMI-1640 con FBS al 10%.

Las células BaF3 se transdujeron con retrovirus que codifican FIG-ROS1(S), FIG-ROS1(L) o FLT-3ITD (la mutación de duplicación en tándem interna en FLT3 causa leucemia LMA) y se seleccionaron para el crecimiento independiente de IL3. Se usaron células Karpas 299, que expresan NPM-ALK, como control positivo. Los retrovirus se generaron como se ha descrito anteriormente (véase la publicación de PCT nº WO 2010/093928).

Se realizó un ensayo MTS utilizando el CellTiter 96 Aqueous One Solution Reagent (Promega, nº de catálogo G3582). Sucintamente, se cultivaron 1×105 células/pocillo en placas de 24 pocillos en 1 mL de caldo de cultivo que incluía TAE-684 de 0 nM, 3 nM, 10 nM, 30 nM, 100 nM, 300 nM o 1000 nM. Después de 72 horas, se añadieron 20 μl del CellTiter 96 Aqueous One Solution Reagent a cada pocillo de una placa de ensayo de 96 pocillos (fondo plano) y, a continuación, se añadieron 100 μl de células cultivadas con o sin tratamiento. Se usaron como controles los pocillos que solo tenían caldo de cultivo. La placa de 96 pocillos se incubó durante 1-4 horas a 37°C, y luego se contaron las células viables leyendo la absorbancia a 490 nm usando un lector de placas de 96 pocillos.

Como se muestra en la Fig. 6, las células BaF3 transducidas con retrovirus que expresan uno de los polipéptidos de FIG-ROS1 dejaron de crecer en presencia de TAE-684. La FIG-ROS1(S) era menos susceptible a TAE-684 que la FIG-ROS1(L). Las células Karpas 299 también respondieron (es decir, dejaron de crecer) en presencia de TAE-684. Las células BaF3 transducidas con FLT3/ITD no fueron susceptibles a TAE-684. Los valores de CI50 de dos experimentos son como sigue en la Tabla 4, con datos de una línea celular final, concretamente, células BaF3 que expresan neomicina marcada myc, disponible solo en el segundo experimento.

Tabla 4

TAE-684: CI50 CI50

FIG-ROS1 (L): 1,78 nM 2,84 nM

FIG-ROS1 (S): 10,16 nM 15,01 nM

FLT3/ITD: 419,35 nM 316,44 nM

Neo-Myc: ND 1641,84 nM

Karpas-299: 4,85 nM 4,36 nM

A continuación, se evaluó el mecanismo de muerte de las células BaF3 y Karpas 299 midiendo, mediante ensayo de citometría de flujo, el porcentaje de células positivas de caspasa 3 escindidas usando caspasa-3 escindida como marcador para la apoptosis. Estos resultados se obtuvieron usando el protocolo públicamente disponible en Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, Massachusetts). Como se muestra en la Fig. 7, la presencia de TAE-684 hizo que las células BaF3 que expresan FIG-ROS1(S) o FIG-ROS1(L) murieran por apoptosis. Las células Karpas 299, que dejaron de crecer en presencia de TAE-684, no murieron por apoptosis; simplemente sufrieron el paro del ciclo celular. Así, el mecanismo mediante el cual el TAE-684 inhibe los polipéptidos de fusión FIG-ROS1 es diferente del mecanismo mediante el cual el TAE-684 inhibe la quinasa ALK.

Para identificar adicionalmente el mecanismo de acción de TAE-684 sobre los polipéptidos de fusión FIG-ROS1, las cuatro líneas celulares (es decir, células Karpas 299 y células BaF3 transducidas con retrovirus que codifican FIG-ROS1(S), FIG-ROS1(L), y FLT-3ITD) se sometieron a análisis de transferencia de tipo Western después del tratamiento con TAE-684 de 0, 10, 50, o 100 nM durante tres horas. Todos los anticuerpos procedieron de Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, Massachusetts).

Como se muestra en la Fig. 8, TAE-684 inhibió la fosforilación tanto de FIG-ROS1(S) como de FIG-ROS1(L) en células BaF3 que expresan FIG-ROS1(S) y FIG-ROS1(L). Además, se inhibió la fosforilación de STAT3, AKT y ERK, y Shp2 en células BaF3 que expresan FIG-ROS1(S) y FIG-ROS1(L). La fosforilación de STAT3, AKT y ERK, y Shp2 no se vio afectada en las células BaF3 transducidas con el retrovirus FLT-3ITD. TAE-684 también inhibió la fosforilación de ALK y ERK en células Karpas 299. Dado que ROS1, ALK, LTK, InsR e IGF1R pertenecen a la misma familia de tirosina quinasas, puede que compartan una estructura similar en el dominio quinasa. Los inhibidores o anticuerpos de quinasas diseñados contra ALK, LTK, InsR e IGF1R pueden tener efectos terapéuticos contra la quinasa ROS1.

A continuación, se realizó un conjunto paralelo de experimentos en las mismas células usando los mismos protocolos con la adición de otro control negativo; concretamente, células BaF3 transducidas con el marcaje neomyc, para comparar dos terapias ALK; concretamente, TAE-684 y crizotinib.

Como se muestra en la Fig. 9A (TAE-684) y la Fig. 9B (crizotinib), las células BaF3 que contenían la proteína de fusión FIG-ROS1 eran más sensibles a TAE-684 que a crizotinib a la misma concentración de cada producto terapéutico. Puede ser que el crizotinib no sea tan eficaz como una dosis similar de TAE-684, puesto que ni siquiera el control positivo —concretamente, las células Karpas 299 que expresan la proteína de fusión NPM-ALK—era sensible a crizotinib en comparación con TAE-684 a las mismas concentraciones. Ambos controles negativos (es decir, BaF3 transducidas con FLT3-ITD o BaF3 transducidas con neo-myc) eran menos sensibles a crizotinib y a TAE-684 que las células BaF3 que expresan la proteína FIG-ROS1 y las células Karpas 299 que expresan la proteína NPM-ALK.

Después de un tratamiento con 0, 0,1, 0,3 o 1,0 uM de crizotinib durante tres horas se realizó el análisis de transferencia de tipo Western utilizando anticuerpos disponibles en Cell Signaling Technology, Inc. Según se muestra en la Figura 10, el crizotinib inhibió la fosforilación tanto de FIG-ROS1(S) como de FIG-ROS1(L) en células BaF3 que expresan FIG-ROS1(S) y FIG-ROS1(L). Además, el crizotinib inhibió la fosforilación de STAT3 y ERK en células BaF3 que expresan FIG-ROS1(S) y FIG-ROS1(L). La fosforilación de STAT3 y ERK no se vio afectada en las células BaF3 transducidas con el retrovirus FLT-3ITD, tras el tratamiento con crizotinib. El crizotinib también inhibió la fosforilación de ALK, STAT3 y ERK en células Karpas 299. Dado que ROS1, ALK, LTK, InsR e IGF1R a la misma familia de tirosina quinasas, puede que compartan una estructura similar en el dominio quinasa. Los inhibidores o anticuerpos de quinasas diseñados contra ALK, LTK, InsR e IGF1R pueden tener efectos terapéuticos contra la quinasa ROS1.

Ejemplo 15

Estudio de NSCLC que expresa ALK y/o ROS1

Además de la quinasa ROS1, se han descrito también NSCLC que contienen proteínas que tienen actividad ALK (véanse, por ejemplo, las patentes estadounidenses 7.700.339, 7.605.131, 7.728.120). Usando los métodos de IHC descritos anteriormente en el Ejemplo 1, se examinaron numerosas muestras FFPE de tumores de NSCLC humano para determinar la unión específica mediante anticuerpos anti ROS1 o anti ALK. Tales anticuerpos están

5 comercialmente disponibles en numerosas fuentes.

Las mismas muestras se examinaron también con FISH para el gen ROS1 o para el gen ALK usando métodos estándar. Por ejemplo, en los Ejemplos anteriores se describe un protocolo FISH para el gen ROS1. En la patente estadounidense nº 7.700.339 se describe un protocolo FISH para ALK. Asimismo, en la publicación de patente estadounidense nº 20110110923 se describe otro ensayo FISH). Los resultados del examen se muestran a

10 continuación en las Tablas 5 (muestras positivas a ROS1) y 6 (muestras positivas para ALK) .

Tabla 5 Histopatología de muestras positivas a ROS1

Nº de paciente: ID del tumor Diagnóstico Patrón histológico (%) Puntuación IHC FISH ROS1

1: 147 Adenocarcinoma BAC (40), papilar (30), acinar (20), sólido (10) 3 + +

2: 306 Adenocarcinoma acinar (70), papilar (20) y sólido (10) 3 + +

3: 570 Adenocarcinoma acinar (90), BAC (5), micropapilar (5) 3 + +

4: 400037 Adenocarcinoma acinar 2 + +

5: 668 Adenocarcinoma sólido (80), acinar (10), BAC (10) 1 + +

6: 702 Adenocarcinoma papilar (40), acinar (30), sólido (30) 1 + +

7: 749 Adenocarcinoma sólido (80), acinar (20) 1 + +, deleción verde

8: 760 Adenocarcinoma células en forma de anillo de sellar 3 + +

9: 575 Macrocito 2 + No puntuable

Tabla 6: Histopatología de casos positivos para ALK

Nº de paciente: ID del tumor Diagnóstico Patrón histológico (%) FISH ALK

1: 187 Adenocarcinoma sólido características de células focales en forma de anillo de sellar +

2: 307 Adenocarcinoma BAC (30), acinar (10), papilar (10), sólido (50) células claras y características mucinosas +

3: 587 Adenocarcinoma acinar (85), sólido (10), papilar (5) No puntuable

4: 618 Adenocarcinoma sólido +

5: 645 Adenocarcinoma sólido (70), BAC (30) +

6: 652 Adenocarcinoma papilar (60), micropapilar (40) +

7: 663 Adenocarcinoma papilar (50), BAC (50) +

8: 664 Adenocarcinoma acinar +

9: 666 Adenocarcinoma sólido (90), papilar (10) +

10: 670 Adenocarcinoma sólido (60), papilar (40) +

11: 680 Adenocarcinoma sólido (70) y acinar (30) con características de células en forma de anillo de sellar +

12: 759 Adenocarcinoma sólido células en forma de anillo de sellar +

13: 580 Adenocarcinoma (incierto) +

14: 70 Adenocarcinoma sólido +

15: 383 Adenocarcinoma BAC (40), papilar (30), acinar (30) +

16: 395 Adenocarcinoma sólido +

17: 278 Escamoso; carcinoma megacítico (incierto) +

18: 330 Carcinoma neuroendocrino megacítico +

19: 503 Escamoso +

20: 615 Escamoso +

21: 644 Escamoso +

22: 691 Escamoso +

En función de este examen de NSCLC humano tanto por IHC como por FISH, se halló que la expresión de ALK y ROS1 en estos tumores es mutuamente excluyente. En otras palabras, si un tumor de NSCLC es conducido por ALK, no expresará ROS1. Asimismo, si un tumor de NSCLC es dirigido por ROS1, no expresará ALK. De este modo, un fármaco terapéutico —tal como crizotinib o TAE-684— que inhiba tanto la actividad de ROS1 como la actividad

5 de ALK será particularmente eficaz en el tratamiento del NSCLC.

Ejemplo 16

Análisis de mutaciones de EGFR en tumores de NSCLC positivos a ROS1 y ALK

Se examinó el estado mutacional de todos los tumores positivos a ROS1 y ALK en las cohortes de pacientes usando IHC con anticuerpos de EGFR específicos a la mutación (EGFR L858R y EGFR E746-A750del (Yu et al., 2009, Clin. 10 Cancer Res., 15:3023-28)). Los portaobjetos fueron teñidos con AcM de conejo receptor de EGF (específico al mutante L858R) (43B2) (1,2 μg/ml), AcM XP® de conejo receptor de EGF (específico a E746-A750del) (6B6) (8,5 μg/ml) o AcM XP® de conejo receptor de EGF (D38B1) (0,28 μg/ml), (nº 3197, nº 2085 y nº 4267, respectivamente, todos de Cell Signaling Technology, Danvers, Massachusetts) todos diluidos en diluyente de anticuerpos SignalStain® (nº 8112 de Cell Signaling Technology, Danvers, Massachusetts), incubados durante 1 hora a

15 temperatura ambiente, lavados, luego incubados con el reactivo de detección por IHC SignalStain® Boost (HRP, conejo) (Cell Signaling Technology, nº 8114) durante 30 minutos. Todos los portaobjetos fueron expuestos a un sustrato NOVARED (Vector Laboratories, Burlingame, California), y, a continuación, se montaron cubreobjetos. Se tomaron imágenes (20×) usando un microscopio Olympus CX41 equipado con una cámara Olympus DP70 y soporte lógico DP Controller.

20 Según se esperaba, todos los tumores positivos a ROS1 y ALK expresaron el EGFR total. Inesperadamente, fueron identificados dos tumores positivos a EGFR L858R/ALK (pacientes 3 y 8), uno positivo a EGFR L858R/ROS1 (paciente 1) y uno positivo a EGFR E746-A750de1/ROS1 (paciente 6) (véanse las Figuras 11A-H). La secuenciación confirmó la presencia de mutaciones de EGFR en los dos tumores positivos a ROS1.

Equivalentes

25 Ha de ser entendido que, aunque la divulgación ha sido descrita junto con descripción detallada de la misma, la anterior descripción está pensada para ilustrar y no limitar el alcance de la invención, que está definida por el alcance de las reivindicaciones adjuntas.

LISTA DE SECUENCIAS

<110> Cell Signaling Technology, Inc.

5: <120> Quinasa EGFR y ROS1 en cánceres <130> CST-321

10: <150> 61/635,057 <151> <150> 61/787,033 <151>

15: <160> 36 <170> PatentIn versión 3.5

20: <210> 1 <211> 2347 <212> PRT <213> Secuencia Artificial

25: <220> <223> Polipéptido Sintético <400> 1

<210> 2

<211> 7368

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Polinucleótido Sintético

<400> 2

<210> 3

<211> 1210

<212> PRT 5 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Polipéptido Sintético

10 <400> 3

Secuencia Artificial Polipétido Sintético Secuencia Artificial Polipétido Sintético

<210> 6

<211> 2175 5 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223>: Polinucleótido Sintético 10

<400> 6

<210> 7

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223>: Polipéptido Sintético 10

<400> 7

<210> 8

<211> 1866 5 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Polinucleótido Sintético 10

<400> 8 <210> 9

<211> 5616 5 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Polinucleótido Sintético 10

<400> 9

5: <210> 10 <211> 24 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

10: <220> <223> Polinucleótido Sintético <400> 10 gcagctcagc caactctttg tctt 24

15: <210> 11 <211> 703 <212> PRT <213> Secuencia Artificial

20: <220> <223> Polipéptido Sintético

<400> 11

<210> 12

<211> 2112 5 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Polinucleótido Sintético 10

<400> 12

<210> 13 5 <211> 592

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220> 10 <223> Polipéptido Sintético

<400> 13

<210> 14

<211> 1782 5 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223>: Polinucleótido Sintético 10

<400> 14

<210> 15

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223>: Polipéptido Sintético 10

<400> 15

15: <210> 16 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

20: <220> <223> Polinucleótido Sintético

<400> 16 aagcccggau ggcaacguut t: 21

25: <210> 17 <211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Polinucleótido Sintético

<400> 17 aagccugaag gccugaacut t

<210> 18

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Polinucleótido Sintético

<400> 18 cagcaagaga cgcagagtca gttt

<210> 19

<211> 26

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Polinucleótido Sintético

<400> 19 gctgttctcc aggctgaagt atatgg

<210> 20

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Polinucleótido Sintético

<400> 20 gtaaccctgg tgctagttgc aaag

<210> 21

<211> 2637

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Polinucleótido Sintético

<400> 21

<210> 22

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Polipéptido Sintético 10

<400> 22

5 <210> 23

<211> 1893

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Polinucleótido Sintético

<400> 23

<210> 24

<211> 630

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Polipéptido Sintético

<400> 24

<210> 25

<211> 3030 5 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Polinucleótido Sintético 10

<400> 25

<210> 26

<211> 1009 5 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Polipéptido Sintético 10

<400> 26

<210> 27

<211> 278 5 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Polipéptido Sintético 10

<400> 27

<210> 28

<211> 6

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Polipéptido Sintético

<210> 29

<211> 6

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Polipéptido Sintético

<210> 30

<211> 6

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Polipéptido Sintético

<210> 31

<211> 6

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Polipéptido Sintético

<210> 32

<211> 6

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Polipéptido Sintético

<210> 33

<211> 6

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Polipéptido Sintético

<210> 34

<211> 6

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Polipéptido Sintético

<210> 35

<211> 1620

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Polipéptido Sintético

<400> 35

<210> 36

<211> 6222 5 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Polinucleótido Sintético 10

<400> 36

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método que comprende:

detectar, en una muestra biológica de un paciente humano que tiene o se sospecha que tiene cáncer, la presencia de un polipéptido de fusión ROS1 que tiene actividad quinasa ROS1 o de un polinucleótido que codifique al mismo; y

detectar, en la muestra biológica, la presencia de un polipéptido EGFR mutante o de un polinucleótido que codifique al mismo.
2.

El método de la reivindicación 1 en el que la muestra procede de un cáncer de pulmón, opcionalmente un cáncer no microcítico de pulmón.
3.

El método de cualquier reivindicación precedente en el que el polipéptido EGFR mutante comprende una mutación en el dominio quinasa.
4.

El método de cualquier reivindicación precedente en el que la detección de la presencia de un polipéptido que tiene actividad quinasa ROS1 comprende el uso de un anticuerpo.
5.

El método de cualquier reivindicación precedente en el que la detección de la presencia de un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene actividad quinasa ROS1 comprende el uso de una hibridación in situ y/o una amplificación de ácidos nucleicos.
6.

El método de cualquier reivindicación precedente en el que la detección de la presencia de un polipéptido EGFR mutante comprende el uso de un anticuerpo específico al mutante.
7.

El método de cualquier reivindicación precedente en el que la detección de la presencia de un polinucleótido que codifica un polipéptido EGFR mutante comprende el uso de una secuenciación de ácidos nucleicos.
8.

El método de cualquier reivindicación precedente en el que la detección de la presencia de un polinucleótido que codifica un polipéptido EGFR mutante comprende el uso de una amplificación de ácidos nucleicos.
9.

Una cantidad terapéuticamente efectiva de un inhibidor de ROS1 y de un inhibidor de EGFR para ser usada en el tratamiento del cáncer en un paciente humano en un método que comprende:

determinar que una muestra biológica de un tumor del paciente comprende un polipéptido de fusión ROS1 que tiene actividad quinasa ROS1 o un polinucleótido que codifica al mismo y un polipéptido EGFR mutante

o un polinucleótido que codifica al mismo.
10.

El inhibidor de ROS1 y el inhibidor de EGFR de la reivindicación 9 en los que el tumor es un cáncer de pulmón, opcionalmente un cáncer no microcítico de pulmón.
11.

El inhibidor de ROS1 y el inhibidor de EGFR para el uso de la reivindicación 9 o de la reivindicación 10 en los que el polipéptido EGFR mutante comprende una mutación en el dominio quinasa.
12.

El inhibidor de ROS1 y el inhibidor de EGFR para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 9-11 en los que el inhibidor de ROS1 se selecciona del grupo constituido por crizotinib, ASP3026, NVP TAE-684, CH5424802 y AP26113.
13.

El inhibidor de ROS1 y el inhibidor de EGFR para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 9-12 en los que el inhibidor de EGFR se selecciona del grupo constituido por gefitinib, erlotinib, cetuximab, afatinib, necitumumab, nimotuzumab, PF299804, RO5083945, ABT-806 y AP26113.

121 122

124 125 126