ES2564127T5 - Mutaciones en EGFR - Google Patents

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Description

DESCRIPCIÓN
Mutaciones en EGFR
Campo de la invención
La presente invención se refiere a diagnóstico y terapias del cáncer y en particular a la detección de mutaciones que son de diagnóstico y/o pronóstico.
Antecedentes de la invención
El receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) es un miembro de la familia de la tirosina quinasa tipo 1 de receptores del factor de crecimiento, que desempeñan papeles críticos en el crecimiento, la diferenciación y la supervivencia celular. La activación de estos receptores normalmente sucede mediante unión de ligando específico, provocando hetero- u homodimerización entre miembros de la familia del receptor, con posterior autofosforilación del dominio tirosina quinasa. Esta activación desencadena una cascada de rutas de señalización intracelular implicadas tanto en la proliferación celular (la ruta de ras/raf/MAP quinasa) y supervivencia celular (la ruta de PI3 quinasa/Akt). Los miembros de esta familia, incluyendo EGFR y HER2, se han implicado directamente en la transformación celular.
Varias neoplasias humanas están asociadas a expresión aberrante o sobre-expresión de EGFR y/o sobre-expresión de sus ligandos específicos, por ejemplo, el factor de crecimiento transformante a (Gullick, Br Med Bull 1991, 47:87-98; Modijtahedi y Dean, Int J Oncol 1994, 4:277-96; Salomon et al., Crit Rev Onco1Hematol 1995; 19:183-232). La sobre-expresión de EGFR se ha asociado a un pronóstico adverso en varios cánceres humanos, incluyendo NSCLC. En algunos casos, la sobre-expresión de EGFR tumoral se ha correlacionado tanto con quimio-resistencia como a un mal pronóstico (Lei et al., Anticancer Res 1999; 19:221-8; Veale et al., Br J Cancer 1993; 68:162-5). Estas observaciones sugieren que agentes que inhiban de forma eficaz la activación del receptor EGFR y la posterior señalización corriente abajo pueden tener actividad clínica en varios cánceres humanos, incluyendo NSCLC.
Tarceva™ (también conocido como erlotinib; OSI-774), una quinazolina, es un potente inhibidor selectivo oralmente activo de tirosina quinasa EGFR. Erlotinib inhibe la tirosina quinasa de EGFR humano con una CI50 de 2 nM (0,786 mg/ml) en un ensayo enzimático in vitro. Esta inhibición es selectiva para la tirosina quinasa de EGFR, provoca detención del ciclo celular en G1, y es reversible. La administración oral de erlotinib en ratones ha demostrado una reducción de >70 % en la autofosforilación de EGFR en xenoinjertos humanos y ha demostrado inhibición marcada del crecimiento de xenoinjertos HN5 y A431 en ratones desnudos. Además de la actividad de agente individual en sistemas de ensayo in vivo, erlotinib se ha evaluado en combinación con varios agentes quimioterapéuticos para determinar posibles interacciones. Hubo una interacción aditiva entre erlotinib y paclitaxel, cisplatino, gemcitabina y doxorrubicina.
El cáncer pulmonar representa la causa principal de mortalidad relacionada con cáncer tanto para hombres como para mujeres en los Estados Unidos. En 2000, se estimó que se diagnosticarían 164.000 nuevos casos y 157.000 pacientes morirían de esta enfermedad (Greenlee et al., CA Cancer J Clin 2001, 51:15-36). Aproximadamente el 75 % de estos pacientes habría tenido histologías de células no microcíticas, presentando la mayoría enfermedad inoperable en Fase IIIB o Fase IV. Para aquellos pacientes con enfermedad más limitada en la presentación (Fases I-IIIA), la recidiva que sigue a la terapia quirúrgica convencional, con o sin quimio- y/o radioterapia adyuvante o neoadyuvante, es habitual. Estos hallazgos producen una supervivencia global de 5 años en cáncer pulmonar no microcítico (NSCLC) de ~ 12 % y sirven para enfatizar la necesidad médica insatisfecha en esta enfermedad.
El compuesto de platino cisplatino fue el primer agente quimioterapéutico en mostrar beneficio clínico en el tratamiento de NSCLC localmente avanzado o metastásico. Ensayos clínicos aleatorizados demostraron mejoras en las tasas de respuesta, calidad de vida, y supervivencia en comparación con los mejores cuidados de apoyo (Rapp et al. 1988). Sin embargo, la magnitud de esta mejora fue modesta-moderada en semanas. Posteriormente, se han evaluado varios agentes quimioterapéuticos más nuevos como agentes individuales y en combinación con las sales de platino en el escenario de primera línea. La conclusión de estos estudios es que la quimioterapia moderna "doble" parece conseguir tasas de respuesta del 15 %-20 %, un tiempo medio hasta progresión de la enfermedad de 3-4 meses, y una supervivencia media de 7-8 meses. Las mejoras moderadas en la eficacia con terapias de combinación sobre los resultados obtenidos con cisplatino han establecido estas terapias como norma asistencial para pacientes con NSCLC avanzado y un aceptable estado funcional (Non-Small Cell Lung Cancer Cooperative Group, Br Med J 1995, 311:899-909; American Society of Clinical Oncology, J Clin Oncol 1997, 15:2996-3018; Breathnach et al., J Clin Oncol 2001; 19:1734-42).
Sumario de la invención
La presente invención proporciona métodos, tal como se definen en las reivindicaciones, para determinar el pronóstico de un paciente que tiene un tumor de cáncer pulmonar no microcítico.
La presente invención también proporciona métodos, tal como se definen en las reivindicaciones, para identificar un tumor de cáncer pulmonar no microcítico que es susceptible a tratamiento con un inhibidor de EGFR.
La presente invención también proporciona un inhibidor de EGFR seleccionado entre el grupo que consiste en cetuximab, panitumumab, erlotinib o gefitinib, para uso en un método de tratamiento de tumor de cáncer pulmonar no microcítico en un paciente humano, como se define en las reivindicaciones.
La presente descripción proporciona un método para identificar un tumor en un sujeto humano que es susceptible a tratamiento, que comprende determinar la presencia de un gen EGFR mutado o una proteína EGFR mutada en una muestra de dicho tumor donde dicha mutación está localizada en los exones 18-21 de EGFR mediante lo cual la presencia de un gen EGFR mutado o proteína EGFR mutada indica que el tumor es susceptible a tratamiento. También se describe un método para tratar un tumor en un mamífero, que comprende identificar la presencia de una mutación EGFR en dicho tumor y tratar a dicho mamífero con un agente antineoplásico.
También se describe un método para identificar una mutación EGFR en una muestra, que comprende poner en contacto el ácido nucleico de dicha muestra con una sonda que es capaz de hibridar específicamente con el ácido nucleico que codifica una proteína EGFR mutada, o fragmento de la misma que incorpora una mutación, y detectar la hibridación.
También se describen sondas de ácido nucleico capaces de hibridar específicamente con un ácido nucleico que codifica una proteína EGFR mutada o fragmento de la misma que incorpora una mutación.
También se describe un método para detectar un gen EGFR mutado en una muestra, que comprende amplificar a partir de dicha muestra, el ácido nucleico correspondiente al dominio quinasa de dicho gen EGFR, o un fragmento del mismo sospechoso de contener una mutación, y comparar la movilidad electroforética del ácido nucleico amplificado con la movilidad electroforética del correspondiente gen EGFR de tipo silvestre o fragmento del mismo. También se describe un método para identificar un tumor en un sujeto humano que es susceptible a tratamiento con un inhibidor de EGFR, que comprende (i) determinar la presencia de una proteína o gen KRAS de tipo silvestre en una muestra de dicho tumor mediante lo cual la presencia de una proteína o gen KRAS de tipo silvestre indica que el tumor es susceptible a tratamiento con un inhibidor de EGFR o (ii) determinar la presencia de una proteína o gen KRAS mutado en una muestra de dicho tumor mediante lo cual la ausencia de una proteína o gen KRAS mutado indica que el tumor es susceptible a tratamiento con un inhibidor de EGFR.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 ilustra la secuencia de amino ácidos de EGFR1 de tipo silvestre (SEC ID N.° 1) en que la secuencia señal es los restos 1-24, el dominio extracelular incluye los restos 24-645, el dominio transmembrana incluye los restos 646-668, y el dominio citoplasmático incluye los restos 669-1210. La región de dominio tirosina quinasa es los restos 718-964, y el sitio de fosforilación de treonina es el resto 678.
La Figura 2a a 2d es la secuencia de ADNc (SEC ID N.° 2) de EGFR de tipo silvestre en que el exón 18 corresponde a los nucleótidos 2308-2430; el exón 19 corresponde a los nucleótidos 2431-2529; el exón 20 corresponde a los nucleótidos 2530-2715 y el exón 21 corresponde a 2716-2871.
La Figura 3 es una representación gráfica de las regiones extracelular (parte superior) e intracelular (parte inferior) de EGFR.
La Figura 4 es una curva de Kaplan-Meier que muestra el tiempo hasta la progresión de pacientes que tienen tumores NSCLC que expresan EGFR de tipo silvestre (línea continua) y EGFR mutante (línea discontinua). La Figura 5 es una curva de Kaplan-Meier que muestra la supervivencia de pacientes que tienen tumores NSCLC que expresan EGFR de tipo silvestre (línea continua) y EGFR mutante (línea discontinua).
La Figura 6 es una autorradiografía que ilustra la inhibición de la autofosforilación de EGFR de tipo silvestre, y EGFR mutante (L858R y del746-752) con concentraciones variables de erlotinib en células COS7 transfectadas de forma transitoria.
La Figura 7 es un gráfico que muestra la inhibición de la autofosforilación de EGFR de tipo silvestre y EGFR mutante L858R y del746-752) con concentraciones variables de erlotinib en células COS7 transfectadas de forma transitoria.
La Figura 8 ilustra mutaciones en los exones 18 y 19 de las secuencias génica y proteica de EGFR. Los cambios de aminoácido y nucleótido, y las inserciones, están en fuente negrita, subrayada mientras que las deleciones se muestran como guiones (-).
La Figura 9 ilustra mutaciones en los exones 20 y 21 de las secuencias génica y proteica de EGFR. Los cambios de aminoácido y nucleótido, y las inserciones, están en fuente negrita, subrayada mientras que las deleciones se muestran como guiones (-).
Descripción detallada de las realizaciones preferidas
Un descubrimiento de la presente invención es que suceden eventos mutacionales asociados a tumorigénesis en el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR). Aunque se ha sabido previamente que actividad aberrante de EGFR estaba asociada a diversos cánceres, se desconocía que existían mutaciones en la región del dominio quinasa de EGFR (KDR) que causaban actividad aberrante de señalización asociada a algunos cánceres. Sorprendentemente, pacientes que padecen tumores que tienen mutaciones en la KDR de EGFR tienen un mejor pronóstico que aquellos con EGFR de tipo silvestre. Las mutaciones en KDR del gen EGFR pueden implicar reordenamientos tales como inserciones y deleciones así como mutaciones puntuales.
Se secuenciaron muestras de aproximadamente 250 pacientes que participaron en un ensayo clínico en fase III doble ciego, aleatorizado mencionado como Tribute, para mutaciones que existen en los exones 18-21 de EGFR. Tribute estudió 1.079 pacientes en aproximadamente 150 centros en los Estados Unidos que tenían NSCLC confirmado de forma histológica que no habían recibido quimioterapia previa, comparando erlotinib quimioterapia (carboplatino/paclitaxel) con quimioterapia en solitario. Los pacientes recibieron paclitaxel (200 mg/m2en infusión i.v. de 3 horas) seguido por carboplatino (AUC = 6 mg/ml x minuto infundido en 15-30 minutos usando la fórmula de Calvert) con o sin erlotinib (100 mg/día p.o. en escala hasta 150 mg/día para pacientes tolerantes). Las muestras de tumor, los bloques integrados en parafina fijados con formalina o portaobjetos sin teñir, de aproximadamente 250 pacientes, recogidas del ensayo Tribute, se enriquecieron para células tumorales por micro-disección con captura láser seguida por extracción de ADN. Se amplificaron los exones 18-21 por PCR anidada y se obtuvieron secuencias bidireccionales de cada producto de PCR usando química con terminador de colorante fluorescente. Las mutaciones descubiertas a partir de la secuenciación se muestran en la tabla 1:
Tabla 1
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continuación
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La numeración de nucleótidos para las mutaciones se basa en la secuencia de referencia mostrada en las figuras 2a-2d.
El resultado clínico de pacientes que tienen tumores con mutaciones EGFR y EGFR de tipo silvestre se analizaron de acuerdo con el beneficio (respuesta enfermedad estable) de respuesta (completa parcial) y enfermedad progresiva. Se evaluaron las lesiones usando los criterios de evaluación de respuesta en tumores sólidos (RECIST) por los cuales "respuesta completa" (CR) se define como la desaparición de todas las lesiones diana; "respuesta parcial" (PR) se define como al menos un 30 % de disminución en la suma del diámetro más largo de las lesiones diana, tomando como referencia la suma del diámetro más largo basal; "enfermedad progresiva" (PD) se define como al menos un 20 % de aumento en la suma del diámetro más largo de las lesiones diana, tomando como referencia la suma del diámetro más largo más pequeña registrada desde que empezó el tratamiento o la aparición de una o más nuevas lesiones; y "enfermedad estable" (SD) se define como ni encogimiento suficiente para reunir los requisitos para respuesta parcial ni suficiente aumento para reunir los requisitos para enfermedad progresiva, tomando como referencia la suma del diámetro más largo más pequeña desde que empezó el tratamiento.
Los resultados del análisis se resumen en la tabla 2.
Tabla 2
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El análisis del resultado clínico reveló que pacientes con tumores que expresan una mutación en los exones 18-21 de EGFR tienen mejor pronóstico que aquellos con tumores que expresan EGFR de tipo silvestre. Los pacientes con EGFR mutante mostraron mayor tasa de respuesta, tasa de beneficio y supervivencia cuando se trataban con quimioterapia o quimioterapia más erlotinib. Estos resultados son útiles para predecir el resultado ya que pacientes cuyos tumores tienen mutaciones EGFR en cualquiera o todos los exones 18 a 21 tienen pronóstico más favorable que pacientes cuyos tumores no tienen dichas mutaciones.
Por consiguiente, la presente invención proporciona un método definido en las reivindicaciones para determinar el pronóstico de un paciente que tiene un tumor, que comprende determinar en una muestra de dicho tumor la presencia o ausencia de una o más mutaciones EGFR en los exones 18-21 (o la secuencia de aminoácidos correspondiente a los exones 18-21) mediante lo cual la presencia de dicha una o más mutaciones EGFR indica mejor pronóstico en comparación con la ausencia de dicha una o más mutaciones EGFR. Por "pronóstico" se entiende respuesta y/o beneficio y/o supervivencia. Por "mutaciones EGFR" se entiende una secuencia de aminoácidos o ácido nucleico que difiere de la proteína o ácido nucleico de EGFR de tipo silvestre respectivamente encontrada en un alelo (heterocigoto) o ambos alelos (homocigoto) y puede ser somática o de la línea germinal. La mutación es E746K o a 755V.
Se secuenciaron los exones de EGFR 18-21 de una línea de células tumorales H1975 que mostraba resistencia a tratamiento con erlotinib y se descubrió que incorporaban una mutación T790M en combinación con una mutación L858R. Por consiguiente, la presente descripción proporciona adicionalmente un método para determinar el pronóstico de un paciente que tiene un tumor, que comprende determinar en una muestra de dicho tumor la presencia o ausencia de la mutación de EGFR T790M mediante lo cual la presencia de dicha mutación de EGFR T790M indica peor pronóstico en comparación con la ausencia de dicha mutación de EGFR T790M. Además, se proporcionó un método para identificar pacientes que tienen un tumor que es menos sensible a terapia de un inhibidor de EGFR tal como erlotinib o gefitinib, sea en combinación con quimioterapia o no, que comprende determinar la presencia o ausencia de una mutación de EGFR T790M en el tumor del paciente mediante lo cual la presencia de dicha mutación indica que el paciente responderá menos a dicha terapia en comparación con un paciente que tiene un tumor que no tiene dicha mutación de EGFR T790M. Además, se proporcionó un método para identificar un tumor que es resistente a tratamiento con un inhibidor de EGFR, tal como un inhibidor de la unión del dominio quinasa (por ejemplo, erlotinib o gefitinib), sea en combinación con quimioterapia o no, que comprende determinar la presencia o ausencia de una mutación de EGFR T790M en una muestra del tumor mediante lo cual la presencia de dicha mutación indica que el tumor es resistente a dicho tratamiento. Se entiende que la determinación de la mutación es a nivel proteico o nivel de ácido nucleico (ADN genómico o ARNm) y se consiguió usando técnicas tales como las descritas en este documento. En una realización particular, dicho inhibidor de EGFR compite con ATP en el dominio quinasa de EGFR. En una realización particular, el inhibidor de EGFR es erlotinib.
En otro aspecto, se proporcionó un método para tratar a un paciente que tienen un tumor que incorpora una proteína o gen EGFr mutante T790M (o para tratar un tumor que incorpora una proteína o gen EGFR mutante T790M), que comprende co-administrar a dicho paciente (o poner contacto dicho tumor con) un primer compuesto que se une a y/o inhibe la señalización de dicho EGFR mutante T790M en combinación con un segundo compuesto que se une a y/o inhibe la señalización de EGFR de tipo silvestre o EGFR que incorpora una mutación activadora. En una realización particular, dicha mutación activadora es una o más de las descritas en la Tabla 1 (diferentes a T790M). En una realización particular, dichos primer y segundo compuestos se administran de forma secuencial o concomitante. En una realización particular, dicho segundo compuesto es erlotinib.
En otro aspecto de la descripción, se proporciona un método para seleccionar compuestos que inhiben la señalización de una proteína EGFR mutante que incorpora una mutación T790M, que comprende poner en contacto dicho EGFR mutante con un compuesto de ensayo en presencia de un sustrato de fosforilación y ATP y detectar un cambio en la cantidad de fosforilación de dicho sustrato mediante lo cual una reducción de fosforilación de dicho sustrato en comparación con un control, o en comparación con la fosforilación del sustrato en ausencia del compuesto de ensayo, indica que dicho compuesto de ensayo es un inhibidor de la señalización de EGFR mutante. En una realización, dicho método se realiza in vitro en presencia de un ligando para dicho EGFR mutante tal como EGF o TGF-alfa.
En una realización particular, la actividad inhibidora de un compuesto de ensayo puede determinarse in vitro mediante la cantidad de inhibición de la fosforilación de un sustrato exógeno (por ejemplo, copolímero aleatorio Lys3-Gastrina o poliGluTyr (4:1) (I. Posner et. al., J. Biol. Chem. 267 (29), 20638-47 (1992)) en tirosina por la quinasa del receptor del factor de crecimiento epidérmico mediante un compuesto de ensayo respecto a un control. Se pre­ incuba EGFR mutante T790M humano soluble purificado (96 ng) en un tubo de microfuga con EGF (2 pg/ml) en tampón de fosforilación vanadato (PBV: HEPES 50 mM, pH 7,4; NaCl 125 mM; MgCh 24 mM; ortovanadato sódico 100 pM), en un volumen total de 10 pl, durante 20-30 minutos a temperatura ambiente. El compuesto de ensayo, disuelto en dimetilsulfóxido (DMSO), se diluye en PBV, y se mezclan 10 pl con la mezcla EGFR mutante/EGF, y se incuba durante 10-30 minutos a 30 °C. La reacción de fosforilación se inicia mediante la adición de 20 pl de mezcla de 33P-ATP/sustrato (Lys3-Gastrina 120 pM (secuencia en código de una letra para los aminoácidos, KKKGPWLEEEEEAYGWLDF - SEC ID N.° 38), Hepes 50 mM pH 7,4, ATP 40 pM, 2 pCi y-[33P]-ATP) a la mezcla de EGFR mutante/EGF y se incubó durante 20 minutos a temperatura ambiente. La reacción se detuvo mediante la adición de 10 pl de solución de detención (EDTA 0,5 M, pH 8; ATP 2 mM) y 6 pl de HCl 2N. Los tubos se centrifugan a 14.000 RPM, 4 °C, durante 10 minutos. Se pipetean 35 pl de sobrenadante de cada tubo en un círculo de 2,5 cm de papel Whatman P81, se lava abundantemente cuatro veces en ácido acético al 5 %, 1 litro por lavado, y después se seca al aire. Esto provoca la unión del sustrato al papel con pérdida de ATP libre en el lavado. El [33P] incorporado se mide por recuento de centelleo líquido. La incorporación en ausencia de sustrato (por ejemplo, Lys3-Gastrina) se sustrae de todos los valores como fondo y se calcula el porcentaje de inhibición respecto a controles sin compuesto de ensayo presente. Dichos ensayos, realizados con un intervalo de dosis de compuestos de ensayo, permiten la determinación de un valor de CI50 aproximado para la inhibición in vitro de la actividad quinasa de EGFR mutante T790M.
En otro aspecto de la invención, se proporciona un método como se define en las reivindicaciones para identificar un tumor en un sujeto humano que es susceptible a tratamiento, que comprende determinar la presencia de un gen EGFR mutado o proteína EGFr mutada en una muestra de dicho tumor, donde dicha mutación está localizada en los exones 18-21 de EGFR, mediante lo cual la presencia de un gen EGFR mutando proteína EGFR mutada indica que el tumor es susceptible a tratamiento con un inhibidor de EGFR. El tumor es un tumor de cáncer pulmonar no microcítico. En una realización, el inhibidor de EGFR es un anticuerpo tal como Erbitutux™ (cetuximab, Imclone Systems Inc.) y ABX-EGF (panitumumab, Abgenix, Inc.). En otra realización, el inhibidor de EGFR es una molécula pequeña que compite con ATP tal como Tarceva™ (erlotinib, OSI Pharmaceuticals), Iressa™ (gefitinib, Astra-Zeneca), tirfostinas descritas por Dvir, et al., J Cell Biol., 113:857-865 (1991); compuestos tricíclicos de pirimidina descritos en la patente de Estados Unidos 5.679.683; el compuesto 6-(2,6-diclorofenil)-2-(4-(2-dietilaminoetoxi)fenilamino)-8-metil-8H-pirido(2,3-d)pirimidin-7-ona (conocido como PD166285) descrito en Panek, et al., Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics 283, 1433-1444 (1997).
En otro aspecto de la descripción. Se proporciona un método para identificar una mutación EGFR en una muestra, que comprende poner en contacto ácido nucleico de dicha muestra con una sonda de ácido nucleico que es capaz de hibridar específicamente con el ácido nucleico que codifica una proteína EGFR mutada, o fragmento de la misma que incorpora una mutación, y detectar dicha hibridación. En una realización particular, dicha sonda se marca de forma detectable tal como con un radioisótopo (3H, 32P, 33P etc.), un agente fluorescente (rodamina, fluoresceína etc.) o un agente cromogénico. En una realización particular, la sonda es un oligómero antisentido, por ejemplo PNA, morfolino-fosforamidatos, LNA o 2'-alcoxialcoxi. La sonda puede ser de aproximadamente 8 nucleótidos a aproximadamente 100 nucleótidos, o de aproximadamente 10 a aproximadamente 75, de aproximadamente 15 a aproximadamente 50, o de aproximadamente 20 a aproximadamente 30. En otro aspecto, dichas sondas de la descripción se proporcionan en un kit para identificar mutaciones EGFR en una muestra, comprendiendo dicho kit un oligonucleótido que hibrida específicamente con o adyacente a un sitio de mutación en el gen EGFR. El kit puede comprender adicionalmente instrucciones para tratar pacientes que tienen tumores que contienen mutaciones EGFR con un inhibidor de EGFR basándose en el resultado de un ensayo de hibridación usando el kit.
En otro aspecto de la descripción, se proporciona un método para detectar un gen EGFR mutando en una muestra, que comprende amplificar dicho ácido nucleico de la muestra correspondiente al dominio quinasa de dicho gen EGFR, o los exones 18-21, o un fragmento del mismo sospechoso de contener una mutación, y comparar la movilidad electroforética del ácido nucleico amplificado con la movilidad electroforética del correspondiente gen EGFR de tipo silvestre o fragmento del mismo. Una diferencia en la movilidad indica la presencia de una mutación en la secuencia de ácido nucleico amplificada. La movilidad electroforética puede determinarse en gel de poliacrilamida.
Como alternativa, el ácido nucleico del gen EGFR amplificado o fragmento puede analizarse para la detección de mutaciones usando detección de mutación enzimática (EMD) (Del Tito et al, Clinical Chemistry 44:731-739, 1998). EMD usa la endonucleasa VII resolvasa T4 de bacteriófago, que explora a lo largo de ADN bicatenario hasta que detecta y escinde distorsiones estructurales causadas por desapareamiento de pares de bases que provocan mutaciones puntuales, inserciones y deleciones. La detección de dos fragmentos cortos formados por escisión con resolvasa, por ejemplo por electroforesis en gel, indica la presencia de una mutación. Los beneficios del método EMD son un único protocolo para identificar mutaciones puntuales, deleciones, e inserciones ensayadas directamente a partir de reacciones de PCR, lo que elimina la necesidad de purificación de la muestra, acorta el tiempo de hibridación, y aumenta la relación señal a ruido. Pueden ensayarse mezclas mixtas que contienen hasta un exceso de 20 veces de ADN normal y fragmentos de hasta 4 kb de tamaño. Sin embargo, la exploración EMD no identifica cambios de bases particulares que existen en muestras positivas a mutación, lo que requiere procedimientos adicionales de secuenciación para identificar la mutación si fuera necesario. La enzima CEL I puede usarse de forma similar a la endonucleasa VII resolvasa T4 como se demuestra en el documento US5869245.
Otro kit simple para detectar las mutaciones EGFR de la descripción es una tira de ensayo de hibridación inversa similar a Haemochromatosis StripAssay™ (Viennalabs http://www.bamburghmarrsh.com/pdf/4220.pdf) para la detección de múltiples mutaciones en genes HFE, TFR2 y FPN1 que causan hemocromatosis. Dicho ensayo se basa en hibridación específica de secuencia después de amplificación por PCR. Para ensayos de una única mutación, puede aplicarse un sistema de detección basado en microplaca, mientras que para ensayos de múltiples mutaciones, pueden usarse tiras de ensayo como "macro-series". Los kits pueden incluir reactivos listos para su uso para preparación de la muestra, amplificación y detección de mutaciones. Protocolos de amplificación combinados proporcionan comodidad y permiten el ensayo de muestras con volúmenes muy limitados. Usando el formato directo StripAssay, que ensaya veinte y más mutaciones, se puede completar en menos de cinco horas sin equipo costoso. El ADN se aísla de una muestra y se amplifica el gen EGFR (o exones 18-21 o KDR o segmentos del mismo) in vitro (por ejemplo, PCR) y se marca con biotina, preferiblemente en una única reacción de amplificación ("combinada"). Los productos de pCr se hibridan de forma selectiva a sondas oligonucleotídicas (específicas de tipo silvestre y mutante) inmovilizadas en un soporte sólido tal como una tira de ensayo en que las sondas se inmovilizan como líneas o bandas paralelas. Los amplicones biotinilados unidos se detectan usando estreptavidina-fosfatasa alcalina y sustratos de color. Dicho ensayo puede detectar todos o cualquier subconjunto de las mutaciones de la tabla 1. Con respecto a una banda de sonda mutante particular, son posibles uno de tres patrones de señalización: (i) una banda solamente para la sonda de tipo silvestre que indica EGFR normal, (ii) bandas para la sonda tanto de tipo silvestre como mutante que indica genotipo heterocigótico y, (iii) bandas solamente para la sonda mutante que indica genotipo EGFR mutante homocigótico. Por consiguiente, se proporciona adicionalmente un método para detectar mutaciones EGFR de la descripción, que comprende aislar ácido nucleico de una muestra, amplificar el gen EGFR, o fragmento del mismo (por ejemplo, la KDR o exones 18-21 o más pequeño) de modo que el ácido nucleico amplificado comprende un ligando, poner en contacto el gen EGFR amplificado fragmento con una sonda que comprende un compañero de unión detectable al ligando y la soda es capaz de hibridar específicamente a una mutación EGFR, y después detectar la hibridación de dicha sonda a dicho gen EGFR o fragmento amplificado. En una realización particular, el ligando es biotina y el compañero de unión comprende avidina o estreptavidina. En una realización particular, el compañero de unión es estreptavidina-fosfatasa alcalina que es detectable con sustratos de color. En una realización particular, las sondas se inmovilizan, por ejemplo, en una tira de ensayo, donde las sondas complementarias a diferentes mutaciones se separan entre sí. Como alternativa, el ácido nucleico amplificado se marca con un radioisótopo en cuyo caso la sonda no tiene que comprender un ligando.
Las muestras de tumor también se analizaron para mutaciones en KRAS (mencionado como p21a). Las mutaciones particulares detectadas en el exón 1 son: G12C; G12A; G12D; G12R; G12S; G12V; G13C; G13D que se correlacionaban con un mal pronóstico a quimioterapia así como quimioterapia con terapia con erlotinib. Por consiguiente, la descripción proporciona adicionalmente un método para identificar pacientes no sensibles a terapia de un inhibidor de EGFr tal como erlotinib o erlotinib en combinación con quimioterapia, que comprende determinar la presencia o ausencia de una mutación KRAS mediante lo cual la presencia de dicha mutación indica que un paciente no responderá a dicha terapia. Como alternativa, se proporciona un método para identificar un tumor en un sujeto humano que es susceptible a tratamiento con un inhibidor de EGFR, que comprende (i) determinar la presencia de una proteína o gen KRAS de tipo silvestre en una muestra de dicho tumor, mediante lo cual la presencia de una proteína o gen KRAS de tipo silvestre indica que el tumor es susceptible a tratamiento con un inhibidor de EGFR o (ii) determinar la presencia de una proteína o gen KRAS mutando en una muestra de dicho tumor mediante lo cual la ausencia de una proteína o gen KRAS mutado indica que el tumor es susceptible a tratamiento con un inhibidor de EGFR. En una realización particular, la mutación es en el exón 1 de K-Ras. En otra realización, la mutación K-Ras es al menos una de G12C; G12A; G12D; G12R; G12S; G12V; G13C; G13D. Como alternativa, los individuos que tienen tumores que albergan K-Ras mutante pueden tratarse con inhibidores de EGFR cuando se proporcionan de forma concomitante con un inhibidor de K-Ras. Los métodos para determinar la presencia de mutaciones K-Ras son análogos a los usados para identificar mutaciones EGFR descritos en detalle en este documento.
De acuerdo con el método de diagnóstico y pronóstico de la presente invención, se detecta una alteración del gen EGFR de tipo silvestre como se define en las reivindicaciones. Las mutaciones somáticas son aquellas que aparecen solamente en ciertos tejidos, por ejemplo, en el tejido tumoral, y no se heredan en la línea germinal. Las mutaciones de línea germinal pueden encontrarse en cualquiera de los tejidos corporales. Si solamente un único alelo está mutado somáticamente, se indica un estado neoplásico prematuro. Sin embargo, si ambos alelos están mutados entonces se indica un estado neoplásico tardío. El hallazgo de mutaciones EGFR, por lo tanto, es un indicador diagnóstico y pronóstico como se describe en este documento.
Las mutaciones EGFR encontradas en tejidos tumorales pueden provocar actividad de señalización aumentada respecto a EGFR de tipo silvestre, que conduce a un estado canceroso. Para detectar la alteración del gen EGFR de tipo silvestre, se obtiene una muestra o biopsia del tumor por métodos bien conocidos en la técnica y apropiados para el tipo particular y localización del tumor. Por ejemplo, pueden obtenerse muestras de lesiones de cáncer pulmonar por resección, broncoscopia, aspiración con aguja fina, cepillados bronquiales, o de esputo, fluido pleural o sangre. Los medios para enriquecer una preparación tisular para células tumorales son conocidos en la técnica. Por ejemplo, el tejido puede aislarse de secciones de parafina o criostato. Las células cancerosas también pueden separarse de células normales por citometría de flujo o micro-disección con captura laser. Éstas así como otras técnicas para separar células tumorales de células normales son bien conocidas en la técnica. Si el tejido tumoral está muy contaminado con células normales, la detección de las mutaciones es más difícil.
La detección de mutaciones puntuales puede conseguirse por clonación molecular del alelo (o alelos) de EGFR y secuenciación del alelo o alelos usando técnicas bien conocidas en la técnica. Como alternativa, puede usarse reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para amplificar secuencias génicas directamente desde una preparación de ADN genómico del tejido tumoral. La secuencia de ADN de las secuencias amplificadas puede determinarse después e identificarse las mutaciones a partir de las mismas. La reacción en cadena de la polimerasa es bien conocida en la técnica y se describe en Saiki et al., Science 239:487, 1988; documento U.S. 4.683.203; y documento U.S. 4.683.195.
Los pares de cebadores específicos que pueden usarse para amplificación por PCR de los exones 18-21 de EGFR incluyen:
<5pEGFR.ex18.out> CAAATGAGCTGGCAAGTGCCGTGTC (SEC ID N.° 39)
<3pEGFR.ex18.out> GAGTTTCCCAAACACTCAGTGAAAC (SEC ID N.° 40)
<5pEGFR.ex19.out> GCAATATCAGCCTTAGGTGCGGCTC (SEC ID N.°41)
<3pEGFR.ex19.out> CATAGAAAGTGAACATTTAGGATGTG (SEC ID N.° 42)
<5pEGFR.ex20.out> CCATGAGTACGTATTTTGAAACTC (SEC ID N.° 43)
<3pEGFR.ex20.out> CATATCCCCATGGCAAACTCTTGC (SEC ID N.° 44)
<5pEGFR.ex21.out> CTAACGTTCGCCAGCCATAAGTCC (SEC ID N.° 45)
<3pEGFR.ex21.out> GCTGCGAGCTCACCCAGAATGTCTGG (SEC ID N.° 46)
<5pEGFR.ex18.in.m13f> TGTAAAACGACGGCCAGTCAAGTGCCGTGTCCTGGCACCCAAGC (SEC ID N.° 47) <3pEGFR.ex18.in.m13r> CAGGAAACAGCTATGACCCCAAACACTCAGTGAAACAAAGAG (SEC ID N.° 48) <5pEGFR.ex19.in.m13f> TGTAAAACGACGGCCAGTCCTTAGGTGCGGCTCCACAGC (SEC ID N.° 49) <3pEGFR.ex19.in.m13r> CAGGAAACAGCTATGACCCATTTAGGATGTGGAGATGAGC (SEC ID N.° 50) <5pEGFR.ex20.in.m13f> TGTAAAACGACGGCCAGTGAAACTCAAGATCGCATTCATGC (SEC ID N.° 51) <3pEGFR.ex20.in.m13r> CAGGAAACAGCTATGACCGCAAACTCTTGCTATCCCAGGAG (SEC ID N.° 52) <5pEGFR.ex21.in.m13f> TGTAAAACGACGGCCAGTCAGCCATAAGTCCTCGACGTGG (SEC ID N.° 53) <3pEGFR.ex21.in.m13r> CAGGAAACAGCTATGACCCATCCTCCCCTGCATGTGTTAAAC (SEC ID N.° 54)
Los pares de cebadores específicos que pueden usarse para amplificación de PCR del exón 1 de K-Ras incluyen: <5pKRAS-out> TACTGGTGGAGTATTTGATAGTG (SEC ID N.° 55)
<3pKRAS-out> CTGTATCAAAGAATGGTCCTG (SEC ID N.° 56)
<5pKRA8-in.m13f> TGTAAAACGACGGCCAGTTAGTGTATTAACCTTATGTG (SEC ID N.° 57)
<3pKRAS-in.m13r> CAGGAAACAGCTATGACCACCTCTATTGTTGGATCATATTCG (SEC ID N.° 58)
La reacción en cadena de la ligasa, que es conocida en la técnica, también puede usarse para amplificar secuencias de EGFR. Véase Wu et al., Genomics, Vol. 4, pág. 560-569 (1989). Además, puede usarse una técnica conocida como PCR específica de alelo. (Véase Ruano y Kidd, Nucleic Acids Research, Vol. 17, pág. 8392, 1989.) De acuerdo con esta técnica, se usan cebadores que hibridan en sus extremos 3' con una mutación EGFR particular. Si la mutación EGFR particular no está presente, no se observa un producto de amplificación. También puede usarse el sistema de mutación refractario a amplificación (ARMS) como se describe en la publicación de solicitud de patente europea n.° 0332435 y en Newton et al., Nucleic Acids Research, Vol. 17, pág. 7, 1989. También pueden detectarse inserciones y deleciones de genes por clonación, secuenciación y amplificación. Además, pueden usarse sondas de polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción (RFLP) para el gen o genes marcadores adyacentes para valorar la alteración de un alelo o una inserción en un fragmento polimórfico. También puede usarse análisis de polimorfismos conformacionales monocatenarios (SSCP) para detectar variantes de cambios de bases de un alelo. (Orita et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol. 86, pág. 2766-2770, 1989, y Genomics, Vol. 5, pág. 874-879, 1989.) Pueden usarse otras técnicas para detectar inserciones y deleciones que son conocidas en la técnica.
La alteración de genes de tipo silvestre también puede detectarse basándose en la alteración de un producto de expresión de tipo silvestre del gen. Dichos productos de expresión incluyen tanto el ARNm de EGFR así como el producto proteico EGFR. Las mutaciones puntuales pueden detectarse amplificando y secuenciando el ARNm o mediante clonación molecular del ADNc preparado a partir del ARNm. La secuencia del ADNc clonado puede determinarse usando técnicas de secuenciación de ADN que son bien conocidas en la técnica. El ADNc también puede secuenciarse mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
Los desapareamientos, de acuerdo con la presente invención, son dúplex de ácido nucleico hibridados que no son 100 % complementarios. La ausencia de complementariedad total puede deberse a deleciones, inserciones, inversiones, sustituciones o mutaciones con desplazamiento de fase. La detección de desapareamientos puede usarse para detectar mutaciones puntuales en el gen o su producto de ARNm. Aunque estas técnicas son menos sensibles que la secuenciación, son más simples de realizar en una gran cantidad de muestras de tumor. Un ejemplo de una técnica de escisión de desapareamiento es el método de protección de RNasa, que se describe en detalle en Winter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 82, pág. 7575, 1985 y Meyers et al., Science, Vol. 230, pág.
1242, 1985. En la práctica de la presente invención, el método implica el uso de una ribosonda marcada que es complementaria a la secuencia codificante del gen EGFR de tipo silvestre humano (o exones 18-21 o KDR del mismo). La ribosonda y cualquier ARNm o ADN aislado del tejido tumoral aparean (hibridan) juntos y posteriormente se digieren con la enzima RNasa A que es capaz de detectar algunos desapareamientos en una estructura de ARN dúplex. Si se detecta un desapareamiento por RNasa A, escinde en el sitio del desapareamiento. Por tanto, cuando se separa la preparación de ARN hibridado en una matriz de gel electroforético, si se ha detectado un desapareamiento y escindido por RNasa A, se observará un producto de ARN que es más pequeño que el ARN dúplex de longitud completa para la ribosonda y el ARNm o ADN. La ribosonda no tiene que ser la longitud completa del ARNm o gen de EGFR pero puede ser los exones 18 a 21 o la KDR de EGFR o segmentos de la misma. Si la ribosonda comprende solamente un segmento del ARNm o gen de EGFR será deseable usar varias de estas sondas para detectar la secuencia completa de ARNm para desapareamientos.
De un modo similar, pueden usarse sondas de ADN para detectar desapareamientos, a través de escisión enzimática o química. Véase, por ejemplo, Cotton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 85, 4397, 1988; y Shenk et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 72, pág. 989, 1975. Como alternativa, los desapareamientos pueden detectarse por desplazamientos en la movilidad electroforética de dúplex desapareados respecto a dúplex apareados. Véase, por ejemplo, Cariello, Human Genetics, Vol. 42, pág. 726, 1988. Con ribosondas o sondas de ADN, el ARNm o ADN celular que podría contener una mutación puede amplificarse usando PCR antes de la hibridación. También pueden detectarse cambios en el ADN del gen EGFR usando hibridación de Southern, especialmente si los cambios son reordenamientos grandes, tales como deleciones e inserciones.
Secuencias de ADN del gen EGFR que se han amplificado mediante el uso de reacción en cadena de la polimerasa también pueden detectarse usando sondas específicas de alelo. Estas sondas son oligómeros de ácido nucleico, cada uno de los cuales contiene una región de la secuencia génica de EGFR que alberga una mutación conocida. Por ejemplo, un oligómero puede ser de aproximadamente 30 nucleótidos de longitud, correspondiente a una parte de la secuencia génica de EGFR. Mediante el uso de una batería de dichas sondas específicas de alelo, pueden detectarse productos de amplificación de PCR para identificar la presencia de una mutación previamente identificada en el gen EGFR. La hibridación de sondas específicas de alelo con secuencias amplificadas de EGFR puede realizarse, por ejemplo, en un filtro de nylon. La hibridación a una sonda particular en condiciones rigurosas de hibridación indica la presencia de la misma mutación en el tejido tumoral que en la sonda específica de alelo.
También puede detectarse alteración de genes EGFR de tipo silvestre detectando alteración de la proteína EGFR de tipo silvestre. Por ejemplo, pueden usarse anticuerpos monoclonales inmunorreactivos con EGFR para explorar un tejido. La ausencia de antígeno afín indicaría una mutación EGFR. También podrían usarse anticuerpos específicos para productos de alelos mutantes para detectar producto génico de EGFR mutante. Los anticuerpos pueden identificarse a partir de bibliotecas de presentación en fago. Dichos ensayos inmunológicos pueden hacerse en cualquier formato conveniente conocido en la técnica. Estos incluyen transferencias de Western, ensayos inmunohistoquímicos y ensayos ELISA. Puede usarse cualquier medio para detectar una proteína EGFR alterada para detectar alteración de genes EGFR de tipo silvestre.
Los genes o productos génicos de EGFR mutantes pueden detectarse a partir de tumor o a partir de otras muestras corporales tales como orina, esputo o suero. Pueden aplicarse las mismas técnicas analizadas anteriormente para la detección de genes o productos génicos de EGFR mutante en muestras de tumor a otras muestras corporales. Las células cancerosas se desprenden de tumores y aparecen en dichas muestras corporales. Explorando dichas muestras corporales, puede conseguirse un diagnóstico prematuro simple para muchos tipos de cánceres. Además, el progreso de quimioterapia o radioterapia puede controlarse más fácilmente ensayando dichas muestras corporales para genes o productos génicos de EGFR mutante.
El método de diagnóstico de la presente invención es útil para los médicos de modo que puedan decidir sobre un curso apropiado de tratamiento. Por ejemplo, un tumor que presenta alteración de ambos alelos EGFR puede sugerir un régimen terapéutico más agresivo que un tumor que presenta alteración de solamente un alelo EGFR. Los pares de cebadores de la presente descripción son útiles para la determinación de la secuencia de nucleótidos de un alelo EGFR particular usando la reacción en cadena de la polimerasa. Los pares de cebadores de ADN monocatenario pueden hibridarse a secuencias dentro de o que rodean el gen EGFR para cebar la síntesis de ADN de amplificación del propio gen EGFR. Un conjunto de estos cebadores permite la síntesis de todos los nucleótidos de los exones 18-21 de EGFR. Pueden también usarse cebadores específicos de alelo. Dichos cebadores hibridan solamente con alelos mutantes EGFR particulares, y por tanto solamente amplificarán un producto en presencia del alelo mutante como molde. Para facilitar la posterior clonación de secuencias amplificadas, los cebadores pueden tener secuencias de sitio de enzima de restricción adjuntas a sus extremos. Por tanto, todos los nucleótidos de los cebadores se obtienen de los exones 18-21 de EGFR o secuencias adyacentes a los mismos excepto los pocos nucleótidos necesarios para formar un sitio de enzima de restricción. Dichas enzimas y sitio son bien conocidos en la técnica. Los cebadores en sí mismos pueden sintetizarse usando técnicas que son bien conocidas en la técnica. Generalmente, los cebadores pueden prepararse usando máquinas de síntesis de oligonucleótidos que están disponibles en el comercio. El diseño de cebadores particulares pertenece a las habilidades de la técnica.
Las sondas de ácido nucleico proporcionadas por la presente descripción son útiles para varios propósitos. Pueden usarse en hibridación de Southern a ADN genómico y en el método de protección de RNasa para detectar mutaciones puntuales ya analizadas anteriormente. Las sondas pueden usarse para detectar productos de amplificación por PCR. También pueden usarse para detectar desapareamientos con el gen o ARNm de EGFR usando otras técnicas. Los desapareamientos pueden detectarse usando enzimas (por ejemplo, nucleasa S1), agentes químicos (por ejemplo, hidroxilamina o tetróxido de osmio y piperidina), o cambios en la movilidad electroforética de híbridos desapareados en comparación con híbridos totalmente apareados. Estas técnicas son conocidas en la técnica. Véase Novack et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 83, pág. 586, 1986. Generalmente, las sondas son complementarias a secuencias del exón 18-21 de EGFR, aunque también se contemplan generalmente sondas para el dominio quinasa y segmentos del mismo. Puede usarse una batería completa de sondas de ácido nucleico para componer un kit para detectar alteraciones de genes EGFR de tipo silvestre. El kit permite la hibridación a la secuencia del exón 18-21 completo del gen EGFR. Las sondas pueden solapar entre sí o ser contiguas.
Si se usa una ribosonda para detectar desapareamientos con ARNm, es complementaria al ARNm del gen EGFR. La ribosonda por tanto es una sonda antisentido porque no codifica la proteína EGFR porque es complementaria a la hebra con sentido. La ribosonda generalmente se marcará con un material radiactivo, colorimétrico, o fluorométrico, que puede conseguirse por cualquier medio conocido en la técnica. Si la ribosonda se usa para detectar desapareamientos con ADN, puede ser de cualquier polaridad, con sentido o antisentido. Asimismo, también pueden usarse sonda de ADN para detectar desapareamientos.
La predisposición a cánceres puede averiguarse ensayando cualquier tejido de un ser humano para mutaciones del gen EGFR. Por ejemplo, una persona que ha heredado una mutación EGFR de línea germinal sería propensa a desarrollar cánceres. Esto puede determinarse ensayando ADN de cualquier tejido del cuerpo. Por ejemplo, puede extraerse sangre y extraerse el ADN de las células de la sangre. Además, puede conseguirse un diagnóstico prenatal ensayando células fetales, células placentarias, o fluido amniótico para mutaciones del gen EGFR. Una alteración de un alelo EGFR de tipo silvestre, sea, por ejemplo, por mutación puntual o por deleción, puede detectarse por cualquiera de los medios analizados anteriormente.
Ejemplos
Ejemplo 1 Preparación de portaobjetos - desparafinización y tinción
Se sumergieron secciones en las siguientes soluciones:
1. Xilenos frescos (para desparafinizar las secciones) - 5 min
2. Xilenos frescos - 5 min
3. Etanol al 100 %- 15 s
4. Etanol al 95 % -15 s
5. Etanol al 70 %- 15 s
6. Agua desionizada -15 s
7. Hematoxilina de Mayer - 30 s
8. Agua desionizada - aclarar (x 2) -15 s
9. Etanol al 70% -15 s
10. Eosina Y - 5 s
11. Etanol al 95 %- 15 s
12. Etanol al 95 %- 15 s
13. Etanol al 100 % -15 s
14. Etanol al 100 %- 15 s
15. Xilenos (para asegurar la deshidratación de la sección) - 60 s
16. Secado al aire durante aproximadamente 2 minutos o pistola de aire usada suavemente para retirar completamente los xilenos.
17. El tejido entonces estaba listo para LCM.
Ejemplo 2 Micro-disección de captura láser y extracción de ADN
Materiales:
Sistema PixCell II LCM
Cubiertas CapSure HS o CapSure Macro LCM
Dispositivo ExtractSure (HS solamente)
Cuchillas de afeitar (estériles de fábrica)
Tubos de 0,5 ml
Tubos de 0,2 ml
Kit de extracción de ADN PicoPure
Incubadora a 65 °C
Procedimientos:
1. Se colocó cubierta CapSure sobre el área de tejido a recoger
2. Se aplicó láser sobre el área deseada
2. Se levantó la cubierta del tejido.
3. Se distribuyeron 20 ul de tampón de digestión PicoPure con Proteinasa K en tubo de 0,5 ml.
4. Se colocó la cubierta con material diseccionado en el tubo para formar un sello hermético.
5. Se invirtió el tubo de modo que se digiriera la cubierta cubierto con tampón.
6. Se incubó a 65 °C durante 24 horas.
7. Se agitó el tubo con la cubierta para recoger el material digerido en el fondo del tubo.
8. Se transfirió la digestión a un tubo de separación de 0,2 ml.
9. Se inactivó Proteinasa K a 95 °C durante 10 minutos en un termociclador con una tapa calentada.
10. Se usaron 1-2 ul de muestra en una reacción de PCR de 50 ul. No fue necesaria limpieza.
Ejemplo 3 Amplificación por PCR
Cebadores de PCR:
Se diseñaron cebadores de PCR para cada exón a secuenciar (exones 18, 19, 20 y 21 de EGFR). Las secuencias cebadoras usadas fueron las siguientes:
<5pEGFR.ex18.out> CAAATGAGCTGGCAAGTGCCGTGTC (SEC ID N.° 39)
<3pEGFR.ex18.out> GAGTTTCCCAAACACTCAGTGAAAC (SEC ID N.° 40)
<5pEGFR.ex19.out> GCAATATCAGCCTTAGGTGCGGCTC (SEC ID N.° 41)
<3pEGFR.ex19.out> CATAGAAAGTGAACATTTAGGATGTG (SEC ID N.° 42)
<5pEGFR.ex20.out> CCATGAGTACGTATTTTGAAACTC (SEC ID N.° 43)
<3pEGFR.ex20.out> CATATCCCCATGGCAAACTCTTGC (SEC ID N.° 44)
<5pEGFR.ex21.out> CTAACGTTCGCCAGCCATAAGTCC (SEC ID N.° 45)
<3pEGFR.ex21.out> GCTGCGAGCTCACCCAGAATGTCTGG (SEC ID N.° 46)
<5pEGFR.ex18.in.m13f> TGTAAAACGACGGCCAGTCAAGTGCCGTGTCCTGGCACCCAAGC (SEC ID N.° 47) <3pEGFR.ex18.in.m13r> CAGGAAACAGCTATGACCCCAAACACTCAGTGAAACAAAGAG (SEC ID N.° 48) <5pEGFR.ex19.in.m13f> TGTAAAACGACGGCCAGTCCTTAGGTGCGGCTCCACAGC (SEC ID N.° 49) <3pEGFR.ex19.in.m13r> CAGGAAACAGCTATGACCCATTTAGGATGTGGAGATGAGC (SEC ID N.° 50) <5pEGFR.ex20.in.m13f> TGTAAAACGACGGCCAGTGAAACTCAAGATCGCATTCATGC (SEC ID N.° 51) <3pEGFR.ex20.in.m13r> CAGGAAACAGCTATGACCGCAAACTCTTGCTATCCCAGGAG (SEC ID N.° 52) <5pEGFR.ex21.in.m13f> TGTAAAACGACGGCCAGTCAGCCATAAGTCCTCGACGTGG (SEC ID N.° 53) <3pEGFR.ex21.in.m13r> CAGGAAACAGCTATGACCCATCCTCCCCTGCATGTGTTAAAC (SEC ID N.° 54) Oligos K-Ras para PCR
<5pKRAS-out> TACTGGTGGAGTATTTGATAGTG (SEC ID N.° 55)
<3pKRAS-out> CTGTATCAAAGAATGGTCCTG (SEC ID N.° 56)
<5pKRA8-in.m13f> TGTAAAACGACGGCCAGTTAGTGTATTAACCTTATGTG (SEC ID N.° 57)
<3pKRAS-in.m13r> CAGGAAACAGCTATGACCACCTCTATTGTTGGATCATATTCG (SEC ID N.° 58)
Se realizó amplificación anidada del producto de PCR principal usando pares de cebadores específicos de intrón localizados dentro del producto de PCR principal. Estos pares de cebadores anidados se marcaron con secuencias M13f y M13rev.
Primera ronda de PCR:
Reacción de PCR:
ADN 0,5 a 30 ng
Cebadores 250 nM/cada cebador externo
dNTP 0,2 mM cada uno (Roche n.° cat. 1581295)
MgCl2 1,5 mM (tampón 10 X 15 mM)
Enzima 1,5 U/rX Expand High fidelity Taq (Roche n.° cat. 1759078)
50 ul de volumen de reacción
Condiciones del termociclador:
95 °C - 3 minutos
94 °C - 30 segundos repetir 35 veces
58 °C - 30 segundos
72 °C - 1 minuto
72 °C - 8 minutos
4 °C - constantemente
Segunda ronda de PCR:
Reacción de PCR:
ADN 1 ul de primera ronda de reacción de PCR
Cebadores 250 nM/cada cebador interno
dNTP 0,2 mM cada uno (Roche n.° cat. 1581295)
MgCl2 1.5 mM (tampón 10 X 15 mM)
Enzima 1.5 U/RX Expand High fidelity Taq (Roche n.° cat. 1759078)
50 ul de volumen de reacción
Condiciones del termociclador:
95 °C - 3 minutos
94 °C - 30 segundos repetir 30 veces
58 °C - 30 segundos
72 °C -1 minuto
72 °C - 8 minutos
4 °C - constantemente
Aislamiento de productos de PCR:
Los productos de reacción de PCR se ejecutaron en geles de agarosa al 2 % E-Gel (Invitrogen, n.° cat. G6018-02) para control de calidad. Los productos de PCR se purificaron directamente usando el kit de purificación de PCR Qiaquick 96 (Qiagen, n.° cat. 28181) o se purificaron en gel según fue necesario. Para la purificación en gel, el producto de PCR se escindió del E-gel y se purificó el ADN usando el kit de purificación de PCR Qiaquick 96 con un protocolo de extracción de gel. (Qiagen, n.° cat. 28181).
Ejemplo 4 Secuenciación
Se usaron cebadores de secuenciación anidados o cebadores de secuenciación convencionales M13f y M13rev para productos de PCR marcados para secuenciar los productos de PCR purificados. Las secuencias fueron las siguientes:
<m13f> TGTAAAACGACGGCCAGT (SEC ID N.° 59)
<m13r> CAGGAAACAGCTATGACC (SEC ID N.° 60)
Se diluyeron los productos de PCR purificados y se secuenciaron de forma cíclica usando el kit BigDye Terminator (ABI, Foster City, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Mezcla de reacción:
5 ul de ADN (25-100 ng de producto de PCR)
6 ul de agua
1 ul de cebador diluido a 0,25 DO/100 ul con agua (m13f o m13r o cebador específico de secuencia)
2 ul de BigDye v3.1
6 ul de tampón de dilución (equivalente a tampón de dilución ABI 5x)
Secuenciación cíclica:
Condiciones:
96 °C - 2,5 minutos - desnaturalización inicial
96 °C - 10 segundos
50 °C - 5 segundos
30 °C - 4 minutos
Repetido durante un total de 25 a 50 ciclos
Limpieza de reacción:
Se retiraron los nucleótidos no incorporados usando:
sephadex al 8 %
500 ul en bloque de 96 pocillos Edge BioSystem
centrifugado a 750 g durante dos minutos
Análisis:
Los productos de reacción se sometieron a electroforesis en instrumentos de secuenciación ABI3700 o ABI3730. Los electroferogramas se analizaron para detectar mutaciones usando programas de análisis disponibles en el comercio tales como Sequencher (Gene Codes, Corp), y con herramientas personalizadas.
Ejemplo 5 Respuesta a dosis
Se marcaron con epítopo construcciones de tipo silvestre y mutantes de receptor de factor de crecimiento epidérmico (EGFR) humano usadas en este estudio en el extremo N-terminal con la secuencia señal del virus del herpes simple de gD, remplazando la secuencia señal de EGFR endógeno (Schaefer et al. 1999 J. Biol. Chem. 274, 859-866). Se sembraron células Cos7 en placas de 12 pocillos en medio de cultivo normal 24 horas antes de la transfección. Las células se transfectaron con 0,25 ug por pocillo con ADN plasmídicos de expresión (pRK5.gD.EGFR tipo silvestre, pRK5.gD.EGFR. L858R, o pRK5.gD.EGFR.del(E746-S752)) usando LipofectAMINE 2000 siguiendo el protocolo recomendado por el fabricante (Invitrogen). Veinticuatro horas post-transfección, las células se privaron de suero durante seis horas en DMEM sin suero. Una hora antes de la estimulación, las células transfectadas se pre-incubaron con las concentraciones indicadas de erlotinib. Las células transfectadas se estimularon con t Gf a 1 nM durante 10 minutos. Las células se lisaron directamente en los pocillos usando tampón de Laemmli reductor. Se detectó autofosforilación del receptor, un índice de activación del receptor EGFR por estimulación del factor de crecimiento, por transferencia de Western usando un anticuerpo anti-fosfotirosina conjugado a HRP (Oncogene Sciences, AB-4). Se evaluó la eficacia de transfección usando un anticuerpo específico para la marca epitópica gD (5B6). Se evaluó el nivel de activación del receptor a partir de los autorradiogramas usando el software NIH Image. Estos datos después se usaron para general un gráfico a partir del cual se calculó la CI50 usando una función de ajuste de 4 parámetros. Como se ilustra por los resultados a continuación, erlotinib tiene una afinidad mayor por EGFR que contiene mutaciones en comparación con EGFR de tipo silvestre.
construcción de EGFR inhibición (CI50)
EGFR-gD TS 50 nM
L858R EGFR-gD 20 nM
del(746-752) EGFR-gD 5 nM
Se describen los siguientes párrafos numerados (párr.)
1. Un método para identificar un tumor en un sujeto humano que es susceptible a tratamiento, que comprende determinar la presencia de un gen EGFR mutado o proteína EGFR mutada en una muestra de dicho tumor donde dicha mutación está localizada en los exones 18-21 de EGFR, mediante lo cual la presencia de un gen EGFR mutado o proteína EGFR mutada diferente a T790M indica que el tumor es susceptible a tratamiento. 2. El método del párr. 1 donde dicho tratamiento es un agente quimioterapéutico.
3. El método del párr. 2 donde dicho agente quimioterapéutico es uno o más de citarabina, fludarabina, 5-fluoro-2'- desoxiuridina, gemcitabina, hidroxiurea, metotrexato; bleomicina, clorambucilo, cisplatino, ciclofosfamida, doxorrubicina, mitoxantrona; camptotecina, topotecán; tenipósido; colcemid, colchicina, paclitaxel, vinblastina vincristina o tamoxifeno.
4. El método del párr. 2 donde dicho agente quimioterapéutico es carboplatino y/o paclitaxel.
5. El método del párr. 1 donde dicho tratamiento es un inhibidor de EGFR.
6. El método del párr. 5 donde dicho inhibidor de EGFR es uno o más de cetuximab, panitumumab, erlotinib o gefitinib.
7. El método del párr. 5 donde dicho inhibidor de EGFR es erlotinib.
8. El método del párr. 1 donde dicha mutación está localizada en el dominio quinasa de EGFR.
9. El método del párr. 8 donde dicha mutación es al menos una de G719A, G719C, G719S, E746K, L747S, E749Q, A750P, A755V, V765M, H773Y, S768I, S784F, L858R, L858P, L861Q, E746-A748 del, E746-A750 del, E746-R748 del, L747-E749 del, R748-P753 del, L747-S752 del, E746V, L747-T751 del, L747-P753 del, S752-I759 del, M766- A767 AI ins, S768-V769 SVA ins, P772-H773 NS ins y P772-H773 V ins.
10. El método del párr. 8 donde dicha mutación es al menos una de G719A, E746K, L747S, E749Q, A750P, A755V, V765M, S768I, L858P, E746-R748 del, R748-P753 del, M766-A767 AI ins, S768-V769 SVA ins y P772-H773 NS ins.
11. El método del párr. 8 donde dicha mutación es al menos una de 2402G>C; 2401G>T; 2401G>A; 2482G>A; 2486T>C; 2491G>C; 2494G>C; 2510C>T; 2539G>A; 2556C>T; 2563C>T; 2576T>A; 2819T>G; 2819T>C; 2482­ 2490 del; 2481-2495 del; 2482-2490 del; 2485-2493 del; 2494G>C; 2486-2503 del; 2485-2502 del; 2483A>T; 2486-2494del; 2499-2522 del; 2544-2545 ins GCCATA; 2554-2555 ins CCAGCGTGG; 2561-2562 ins GGT; y 2562-2563 ins AACTCC.
12. El método del párr. 8 donde dicha mutación es al menos una de 2402G>C; 2482G>A; 2486T>C; 2491G>C; 2494G>C; 2510C>T; 2539G>A; 2549G>T; 2563C>T; 2819T>C; 2482-2490 del; 2486-2503 del; 2544-2545 ins GCCATA; 2554-2555 ins CCAGCGTGG; y 2562-2563 ins AACTCC.
13. Un método para identificar una mutación EGFR en una muestra, que comprende poner en contacto el ácido nucleico de dicha muestra con una sonda de ácido nucleico que es capaz de hibridar específicamente con el ácido nucleico que codifica una proteína EGFR mutada, o fragmento de la misma que incorpora una mutación y detectar dicha hibridación.
14. El método del párr. 13 donde dicha mutación está en el dominio quinasa de EGFR.
15. El método del párr. 13 donde dicha mutación EGFR es al menos una de 2402G>C; 2401G>T; 2401G>A; 2482G>A; 2486T>C; 2491G>C; 2494G>C; 2510C>T; 2539G>A; 2556C>T; 2563C>T; 2576T>A; 2615C>T; 2819T>G; 2819T>C; 2482-2490 del ; 2481-2495 del; 2482-2490 del; 2485-2493 del; 2494G>C; 2486-2503 del; 2485-2502 del; 2483A>T; 2486-2494 del; 2499-2522 del; 2544-2545 ins GCCATA; 2554-2555 ins CCAGCGTGG; 2561-2562 ins GGT; y 2562-2563 ins AACTCC.
16. El método del párr. 13 donde dicha mutación EGFR es al menos una de 2402G>C; 2482G>A; 2486T>C; 2491G>C; 2494G>C; 2510C>T; 2539G>A; 2549G>T; 2563C>T; 2615C>T 2819T>C; 2482-2490 del; 2486-2503 del; 2544-2545 ins GCCATA; 2554-2555 ins CCAGCGTGG; y 2562-2563 ins AACTCC.
17. El método del párr. 13 donde dicha sonda está marcada de forma detectable.
18. El método del párr. 13 donde dicha sonda es un oligómero antisentido.
19. El método del párr. 13 donde el gen EGFR o fragmento del mismo en dicha muestra de ácido nucleico se amplifica y pone en contacto con dicha sonda.
20. El uso de agente antineoplásico en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un tumor que tiene una mutación EGFR, donde dicha mutación EGFR en dicho tumor es al menos una de G719A, G719c , G719S, E746K, L747S, E749Q, A750P, A755V, V765M, H773Y, S768I, S784F, L858R, L858P,L861Q, E746-A748 del, E746-A750 del, E746-R748 del, L747-E749 del , R748-P753 del, L747-S752 del , E746V, L747-T751 del, L747-P753 del, S752- I759 del, M766-A767 AI ins, S768-V769 SVA ins, P772-H773 NS ins y P772-H773 V ins.
21. El uso del párr. 20 donde dicho agente antineoplásico es un agente quimioterapéutico.
22. El uso del párr. 20 donde dicho agente antineoplásico e un inhibidor de EGFR.
23. El uso del párr. 21 donde dicho agente quimioterapéutico es uno o más de citarabina, fludarabina, 5-fluoro-2'-desoxiuridina, gemcitabina, hidroxiurea, metotrexato, bleomicina, clorambucilo, cisplatino, ciclofosfamida, doxorrubicina, mitoxantrona, camptotecina, topotecán; tenipósido; colcemid, colchicina, paclitaxel, vinblastina, vincristina, o tamoxifeno.
24. El uso del párr. 21 donde dicho agente quimioterapéutico es uno o más de metotrexato; bleomicina, cisplatino, ciclofosfamida, doxorrubicina, mitoxantrona, paclitaxel, vinblastina, vincristina o tamoxifeno.
25. El uso del párr. 22 donde dicho agente quimioterapéutico es uno o más de cetuximab, panitumumab, erlotinib o gefitinib.
26. El uso del párr. 20 donde dicha mutación EGFR es al menos una de G719A, E746K, L747S, E749Q, A750P, A755V, V765M, S768I, L858P, E746-R748 del, R748-P753 del, M766-A767 AI ins, S768-V769 SVA ins y P772-H773 NS ins.
27. Una sonda de ácido nucleico capaz de hibridar específicamente con ácido nucleico que codifica una proteína EGFR mutada o fragmento de la misma que incorpora una mutación.
28. La sonda del párr. 27 donde dicha sonda es complementaria a dicho ácido nucleico que codifica la EGFR mutada o dicho fragmento de la misma.
29. La sonda del párr. 27 que tiene una longitud de aproximadamente 10 a aproximadamente 50 nucleótidos. 30. La sonda del párr. 27 que comprende adicionalmente un marcador detectable.
31. La sonda del párr. 27 donde dicha mutación es al menos una de G719A, G719C, G719S, E746K, L747S, E749Q, A750P, A755V, S768I, L858R, L858P,L861Q, E746-A748 del, E746-A750 del, E746-R748 del, L747-E749 del, R748-P753 del, L747-S752 del, E746V, L747-T751 del, L747-P753 del, S752-I759 del, M766-A767 AI ins, S768- V769 SVA ins, y P772-H773 V ins.
32. La sonda del párr. 27 donde dicha mutación es al menos una de G719A, E746K, L747S, E749Q, A750P, A755V, V765M, S768I, H773Y, S784F, T790M, L858P, E746-R748 del, R748-P753 del, M766-A767 AI ins, P772-H773 NS ins y S768-V769 SVA ins.
33. Un método para detectar un gen EGFR mutado en una muestra, que comprende amplificar dicho ácido nucleico de la muestra correspondiente al dominio quinasa de dicho gen EGFR, o un fragmento del mismo sospechoso de contener una mutación, y comparar la movilidad electroforética del ácido nucleico amplificado con la movilidad electroforética del correspondiente gen EGFR de tipo silvestre o fragmento del mismo.
34. El método del párr. 33 donde la movilidad electroforética se determina en gel de poliacrilamida.
35. Un método para identificar un tumor en un sujeto humano que es susceptible a tratamiento con un inhibidor de EGFR, que comprende (i) determinar la presencia de una proteína o gen RAS de tipo silvestre en una muestra de dicho tumor mediante lo cual la presencia de una proteína o gen RAS de tipo silvestre indica que el tumor es susceptible a tratamiento con un inhibidor de EGFR o (ii) determinar la presencia de una proteína o gen RAS mutado en una muestra de dicho tumor mediante lo cual la ausencia de una proteína o gen RAS mutado indica que el tumores susceptible a tratamiento con un inhibidor de EGFR.
36. El método del párr. 36 donde dicha mutación RAS es al menos una de G12C; G12A; G12D; G12R; G12S;

Claims (17)

REIVINDICACIONES
1. Un método
(i) para determinar el pronóstico de un paciente que tiene un tumor de cáncer pulmonar no microcítico, que comprende determinar en una muestra de dicho tumor la presencia o la ausencia de una mutación E746K o A755v en la proteína del receptor de factor de crecimiento epidérmico (EGFR) o un gen que codifica una mutación E746k o A755V en la proteína EGFR, mediante lo cual la presencia de dicha mutación en la proteína EGFR o de dicho gen que codifica dicha mutación en la proteína EGFR indica mejor pronóstico en comparación con la ausencia de dicha mutación en la proteína EGFr o de dicho gen que codifica dicha mutación en la proteína EGFR; o
(ii) de identificación de un tumor de cáncer pulmonar no microcítico que es susceptible a tratamiento con un inhibidor de EGFR, que comprende determinar la presencia o la ausencia de una mutación E746K o A755V en la proteína EGFR o de un gen que codifica una mutación E746K o A755V en la proteína EGFR en una muestra del tumor, mediante lo cual la presencia de dicha mutación en la proteína EGFR o de dicho gen que codifica dicha mutación en la proteína EGFR indica que el tumor es susceptible a tratamiento con un inhibidor de EGFR.
2. El método de la reivindicación 1, en el que la presencia o la ausencia de un gen que codifica una mutación en la proteína EGFR se detecta amplificando la región de ácido nucleico correspondiente a dicha mutación de la proteína EGFR en un gen EGFR y comparando la movilidad electroforética del ácido nucleico amplificado con la movilidad electroforética de la región correspondiente en un gen EGFR de tipo silvestre.
3. El método de la reivindicación 1, en el que la presencia o la ausencia de un gen que codifica una mutación en la proteína EGFR se detecta amplificando la región de ácido nucleico correspondiente a dicha mutación en la proteína EGFR en un gen EGFR y secuenciando dicho ácido nucleico amplificado.
4. El método de la reivindicación 1, en el que la presencia o la ausencia de un gen que codifica una mutación en la proteína EGFR se detecta por reacción en cadena de la polimerasa específica de alelo.
5. El método de la reivindicación 1, en el que la presencia o la ausencia de un gen que codifica una mutación en la proteína EGFR se detecta amplificando por PCR los exones 18-21 del gen EGFR y secuenciando de forma bidireccional el producto de PCR.
6. El método de la reivindicación 1, que comprende determinar la presencia o la ausencia de una mutación E746K en la proteína EGFR o de un gen que codifica una mutación E746K en la proteína EGFR.
7. El método de cualquier reivindicación anterior, en el que la presencia de dicha mutación en la proteína EGFR o de dicho gen que codifica dicha mutación en la proteína EGFR indica mejor pronóstico en comparación con la expresión de la proteína EGFR de tipo silvestre.
8. El método de cualquier reivindicación anterior, en el que el inhibidor de EGFR es cetuximab, panitumumab, erlotinib o gefitinib.
9. El método de la reivindicación 8, en el que el inhibidor de EGFR es erlotinib.
10. Un inhibidor de EGFR seleccionado entre el grupo que consiste en cetuximab, panitumumab, erlotinib o gefitinib, para su uso en un método de tratamiento de tumor de cáncer pulmonar no microcítico en un paciente humano, comprendiendo el método:
(i) identificar un tumor de cáncer pulmonar no microcítico que es susceptible a tratamiento con un inhibidor de EGFR de acuerdo con el método de la reivindicación 1 (ii); y
(ii) tratar a un paciente cuyo tumor de cáncer pulmonar no microcítico se ha identificado como susceptible a tratamiento con un inhibidor de EGFR en la etapa (i) con dicho inhibidor de EGFR seleccionado entre el grupo que consiste en cetuximab, panitumumab, erlotinib o gefitinib.
11. El inhibidor de EGFR para uso de la reivindicación 10, en el que la presencia o la ausencia de un gen que codifica una mutación en la proteína EGFR se detecta amplificando la región de ácido nucleico correspondiente a dicha mutación en la proteína EGFR en un gen EGFR y comparando la movilidad electroforética del ácido nucleico amplificado con la movilidad electroforética de la región correspondiente en un gen EGFR de tipo silvestre.
12. El inhibidor de EGFR para uso de la reivindicación 10, en el que la presencia o la ausencia de un gen que codifica una mutación en la proteína EGFR se detecta amplificando la región de ácido nucleico correspondiente a dicha mutación en la proteína EGFR en un gen EGFR y secuenciando dicho ácido nucleico amplificado.
13. El inhibidor de EGFR para uso de la reivindicación 10, en el que la presencia o la ausencia de un gen que codifica una mutación en la proteína EGFR se detecta por reacción en cadena de la polimerasa específica de alelo.
14. El inhibidor de EGFR para uso de la reivindicación 10, en el que la presencia o la ausencia de un gen que codifica una mutación en la proteína EGFR se detecta amplificando por PCR los exones 18-21 del gen EGFR y secuenciando de forma bidireccional el producto de PCR.
15. El inhibidor de EGFR para uso de la reivindicación 10, en el que la etapa de identificación comprende determinar la presencia o la ausencia de una mutación E746K en la proteína EGFR o de un gen que codifica una mutación E746K en la proteína EGFR.
16. El inhibidor de EGFR para uso de una cualquiera de las reivindicaciones 10-15, en el que la presencia de dicha mutación en la proteína EGFR o de dicho gen que codifica dicha mutación en la proteína EGFR indica mejor pronóstico en comparación con la expresión de la proteína EGFR de tipo silvestre.
17. El inhibidor de EGFR para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 10-16, que es erlotinib.
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Families Citing this family (115)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2552281T3 (es) 2001-05-11 2015-11-26 Ludwig Institute For Cancer Research Ltd. Proteínas de unión específica y usos de las mismas
US20100056762A1 (en) 2001-05-11 2010-03-04 Old Lloyd J Specific binding proteins and uses thereof
KR20120104412A (ko) 2002-09-06 2012-09-20 인설트 테라페틱스, 인코퍼레이티드 공유결합된 치료제 전달을 위한 사이클로덱스트린-기초 중합체
US7767792B2 (en) * 2004-02-20 2010-08-03 Ludwig Institute For Cancer Research Ltd. Antibodies to EGF receptor epitope peptides
KR101347613B1 (ko) * 2004-03-31 2014-01-06 다나-파버 캔서 인스티튜트 인크. 암에 걸린 인간 환자의 표피성장인자 수용체 표적 치료의 유효 가능성 결정 방법, 키트, 핵산 프로브 및 프라이머쌍
EP2592155B2 (en) 2004-06-04 2019-09-11 Genentech, Inc. EGFR mutations
DE602006021142D1 (de) 2005-02-03 2011-05-19 Gen Hospital Corp Verfahren zur behandlung von gefitinib-resistentem krebs
CA2597673C (en) 2005-02-11 2014-07-08 Harold Varmus Methods and compositions for detecting a drug resistant egfr mutant
MX2007009963A (es) * 2005-02-24 2007-09-26 Amgen Inc Mutaciones del receptor del factor de crecimiento epidermico.
GB0506670D0 (en) * 2005-04-01 2005-05-11 Astrazeneca Ab Method
GB2424886A (en) 2005-04-04 2006-10-11 Dxs Ltd Polynucleotide primers against epidermal growth factor receptor and method of detecting gene mutations
CA2612183C (en) * 2005-06-28 2015-08-11 Genentech, Inc. Egfr and kras mutations
ATE520979T1 (de) * 2005-08-24 2011-09-15 Bristol Myers Squibb Co Biomarker und verfahren zur bestimmung der empfindlichkeit gegenüber modulatoren des egf(epidermal growth factor)-rezeptors
EP1931798A1 (en) * 2005-10-05 2008-06-18 AstraZeneca UK Limited Method to predict or monitor the response of a patient to an erbb receptor drug
CN103110948A (zh) 2005-11-04 2013-05-22 惠氏公司 mTOR抑制剂、赫赛汀和/或HKI-272的抗肿瘤组合
US20070207489A1 (en) * 2006-02-16 2007-09-06 Pestano Gary A Reagents and methods for cancer prognosis and pathological staging
EP1881079A1 (en) * 2006-07-20 2008-01-23 Pangaea Biotech, S.A. Method for the detection of EGFR mutations in blood samples
ES2534430T3 (es) * 2006-08-28 2015-04-22 The University Of Western Australia Método de modulación de la expresión del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) que implica miARN
WO2008089135A2 (en) * 2007-01-12 2008-07-24 University Of South Florida Identification of biomarkers predictive of dasatinib effects in cancer cells
JP2010516625A (ja) 2007-01-24 2010-05-20 インサート セラピューティクス， インコーポレイテッド 制御された薬物送達のためのテザー基を有するポリマー−薬物コンジュゲート
US9090693B2 (en) * 2007-01-25 2015-07-28 Dana-Farber Cancer Institute Use of anti-EGFR antibodies in treatment of EGFR mutant mediated disease
US9340601B2 (en) * 2007-03-01 2016-05-17 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Splice variants of the EGF receptor
DK2121989T4 (da) 2007-03-13 2022-06-20 Amgen Inc K-ras-mutationer og anti-EGFR-antistofbehandling
PT2412828E (pt) 2007-03-13 2013-08-02 Amgen Inc Mutações k-ras e b-raf e terapia com anticorpos anti-egfr
JP5926487B2 (ja) 2007-04-13 2016-05-25 デイナ ファーバー キャンサー インスティチュート，インコーポレイテッド ＥｒｂＢ療法に耐性である癌を治療するための方法
WO2009023265A1 (en) 2007-08-14 2009-02-19 Ludwig Institute For Cancer Research Monoclonal antibody 175 targeting the egf receptor and derivatives and uses thereof
US8022216B2 (en) 2007-10-17 2011-09-20 Wyeth Llc Maleate salts of (E)-N-{4-[3-chloro-4-(2-pyridinylmethoxy)anilino]-3-cyano-7-ethoxy-6-quinolinyl}-4-(dimethylamino)-2-butenamide and crystalline forms thereof
WO2009099991A2 (en) * 2008-01-31 2009-08-13 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Treatment of cancer
US20090226443A1 (en) * 2008-03-06 2009-09-10 Genentech, Inc. Combination therapy with c-met and egfr antagonists
EP2274437B1 (en) * 2008-04-10 2015-12-23 Cell Signaling Technology, Inc. Compositions and methods for detecting egfr mutations in cancer
DK2656844T3 (en) 2008-06-17 2015-03-02 Wyeth Llc ANTINEOPLASTIC COMBINATIONS CONTAINING HKI-272 AND VINORELBINE
BRPI0914682B8 (pt) 2008-06-27 2021-05-25 Avila Therapeutics Inc compostos de heteroarila e composições compreendendo os referidos compostos
US8338439B2 (en) 2008-06-27 2012-12-25 Celgene Avilomics Research, Inc. 2,4-disubstituted pyrimidines useful as kinase inhibitors
US11351168B1 (en) 2008-06-27 2022-06-07 Celgene Car Llc 2,4-disubstituted pyrimidines useful as kinase inhibitors
WO2010028288A2 (en) 2008-09-05 2010-03-11 Aueon, Inc. Methods for stratifying and annotating cancer drug treatment options
CN102482277B (zh) 2009-05-05 2017-09-19 达纳-法伯癌症研究所有限公司 表皮生长因子受体抑制剂及治疗障碍的方法
CN102859355B (zh) * 2009-08-24 2015-10-07 基因泰克公司 通过检测kras突变和rtk表达水平来测定细胞对b-raf抑制剂治疗的敏感性
US20120114658A1 (en) * 2009-09-15 2012-05-10 John Ryan Treatment of cancer
EP2477985B1 (en) * 2009-09-15 2018-11-07 BlueLink Pharmaceuticals, Inc. Crlx101 for use in the treatment of cancer
CN102021232A (zh) * 2009-09-22 2011-04-20 北京雅康博生物科技有限公司 用于定量检测egfr突变的试剂盒
WO2011087928A1 (en) 2010-01-12 2011-07-21 Siemens Healthcare Diagnostics Inc. Oligonucleotides and methods for detecting kras and pik3ca mutations
US9205086B2 (en) 2010-04-19 2015-12-08 Synta Pharmaceuticals Corp. Cancer therapy using a combination of a Hsp90 inhibitory compounds and a EGFR inhibitor
US20120064175A1 (en) * 2010-05-20 2012-03-15 Synta Pharmaceuticals Corp. HSP90 Inhibitors for Treating Non-Small Cell Lung Cancer in Wild-Type EGFR and/or KRAS Patients
KR20130099040A (ko) 2010-08-10 2013-09-05 셀진 아빌로믹스 리서치, 인코포레이티드 Ｂｔｋ 억제제의 베실레이트 염
EP3572528A1 (en) 2010-09-24 2019-11-27 The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University Direct capture, amplification and sequencing of target dna using immobilized primers
US9238812B2 (en) 2010-09-30 2016-01-19 Lsip, Llc Agent for suppressing expression of dominant mutant gene
JP5956999B2 (ja) * 2010-11-01 2016-07-27 セルジーン アヴィロミクス リサーチ， インコーポレイテッド ヘテロアリール化合物およびその使用
BR112013010564B1 (pt) 2010-11-01 2021-09-21 Celgene Car Llc Compostos heterocíclicos e composições compreendendo os mesmos
ES2665013T3 (es) 2010-11-10 2018-04-24 Celgene Car Llc Inhibidores de EGFR selectivos de mutante y usos de los mismos
WO2012065705A1 (en) 2010-11-19 2012-05-24 Roche Diagnostics Gmbh Novel complex mutation in the epidermal growth factor receptor kinase domain
US20120164641A1 (en) 2010-12-22 2012-06-28 Roche Molecular Systems, Inc. Methods and Compositions for Detecting Mutation in the Human Epidermal Growth Factor Receptor Gene
WO2012095639A2 (en) * 2011-01-14 2012-07-19 Genefirst Limited Methods, compositions, and kits for determing the presence/absence of a varian nucleic acid sequence
JP5930825B2 (ja) * 2011-05-06 2016-06-08 アークレイ株式会社 Ｅｇｆｒエクソン１９多型検出試験用試薬キット及びその用途
WO2012162613A2 (en) * 2011-05-26 2012-11-29 Brandeis University Detection of sequence variants in the human epidermal growth factor receptor (egfr) gene
US9364476B2 (en) 2011-10-28 2016-06-14 Celgene Avilomics Research, Inc. Methods of treating a Bruton's Tyrosine Kinase disease or disorder
US9439899B2 (en) 2011-11-02 2016-09-13 Synta Pharmaceuticals Corp. Cancer therapy using a combination of HSP90 inhibitors with topoisomerase I inhibitors
CA2853806C (en) 2011-11-02 2020-07-14 Synta Pharmaceuticals Corp. Combination therapy of hsp90 inhibitors with platinum-containing agents
US9738935B2 (en) 2011-11-10 2017-08-22 Roche Molecular Systems, Inc. Complex mutations in the epidermal growth factor receptor kinase domain
EP2780010A1 (en) 2011-11-14 2014-09-24 Synta Pharmaceuticals Corp. Combination therapy of hsp90 inhibitors with braf inhibitors
US9260714B2 (en) 2011-12-02 2016-02-16 Roche Molecular Systems, Inc. Suppression of non-specific amplification with high-homology oligonucleotides
BR112014022789B1 (pt) 2012-03-15 2022-04-19 Celgene Car Llc Formas sólidas de um inibidor de quinase de receptor do fator de crescimento epidérmico, composição farmacêutica e usos do mesmo
EP2825042B1 (en) 2012-03-15 2018-08-01 Celgene CAR LLC Salts of an epidermal growth factor receptor kinase inhibitor
EP2653558B1 (en) 2012-04-18 2015-10-07 Roche Diagniostics GmbH A method of detecting nucleic acid targets using a statistical classifier
DK2838998T3 (en) * 2012-04-18 2018-01-15 Cell Signaling Technology Inc EGFR AND ROS1 IN CANCER
WO2013190089A1 (en) 2012-06-21 2013-12-27 Pangaea Biotech, S.L. Molecular biomarkers for predicting outcome in lung cancer
WO2014055493A1 (en) 2012-10-02 2014-04-10 Cerulean Pharma Inc. Methods and systems for polymer precipitation and generation of particles
KR20240005211A (ko) 2012-11-21 2024-01-11 얀센 바이오테크 인코포레이티드 이중특이성 EGFR/c-Met 항체
US9695228B2 (en) 2012-11-21 2017-07-04 Janssen Biotech, Inc. EGFR and c-Met fibronectin type III domain binding molecules
US20140341884A1 (en) * 2012-12-04 2014-11-20 Roche Molecular Systems, Inc. Novel Complex Mutations in the Epidermal Growth Factor Receptor Kinase Domain
WO2014100748A1 (en) 2012-12-21 2014-06-26 Celgene Avilomics Research, Inc. Heteroaryl compounds and uses thereof
CN105264084A (zh) * 2013-01-14 2016-01-20 中央研究院 静默egfr表达的脱氧核糖核酸酶
US9145387B2 (en) 2013-02-08 2015-09-29 Celgene Avilomics Research, Inc. ERK inhibitors and uses thereof
EP2964781B1 (en) 2013-03-08 2018-01-10 Roche Diagnostics GmbH Egfr mutation blood testing
US20140287417A1 (en) 2013-03-08 2014-09-25 Roche Molecular Systems, Inc. EGFR Blood Monitoring
CN105074006A (zh) * 2013-03-14 2015-11-18 豪夫迈·罗氏有限公司 预测对egfr抑制剂的响应
US9492471B2 (en) 2013-08-27 2016-11-15 Celgene Avilomics Research, Inc. Methods of treating a disease or disorder associated with Bruton'S Tyrosine Kinase
AU2014334627B2 (en) 2013-10-14 2019-07-25 Janssen Biotech, Inc. Cysteine engineered fibronectin type III domain binding molecules
US9415049B2 (en) 2013-12-20 2016-08-16 Celgene Avilomics Research, Inc. Heteroaryl compounds and uses thereof
BR112016021383A2 (pt) 2014-03-24 2017-10-03 Genentech Inc Método para identificar um paciente com câncer que é susceptível ou menos susceptível a responder ao tratamento com um antagonista de cmet, método para identificar um paciente apresentando câncer previamente tratado, método para determinar a expressão do biomarcador hgf, antagonista anti-c-met e seu uso, kit de diagnóstico e seu método de preparo
EP3126520B1 (en) 2014-04-04 2021-06-09 Amgen, Inc. Amg-337 for use in the treatment of cancers having a met amplification
US10005760B2 (en) 2014-08-13 2018-06-26 Celgene Car Llc Forms and compositions of an ERK inhibitor
CN106795567B (zh) 2014-10-09 2021-07-30 豪夫迈·罗氏有限公司 在表皮生长因子受体激酶结构域中的突变
MX2017008421A (es) * 2014-12-24 2018-03-23 Genentech Inc Métodos terapéuticos, diagnósticos y pronósticos para el cáncer de vejiga.
KR101805977B1 (ko) * 2015-03-24 2017-12-08 연세대학교 산학협력단 폐암 환자의 생존기간 예측용 키트와 생존기간 예측을 위한 정보 제공 방법
EP3875606A1 (en) * 2015-05-06 2021-09-08 Seracare Life Sciences Inc. Liposomal preparations for non-invasive-prenatal or cancer screening
WO2017070281A1 (en) * 2015-10-21 2017-04-27 Admera Health LLC Blocker-based enrichment system and uses thereof
CN108140940B (zh) * 2015-10-22 2021-05-25 株式会社村田制作所 天线装置
CN105510603A (zh) * 2016-02-01 2016-04-20 宁夏医科大学总医院 一种检测吉非替尼耐药机理的方法
EP3471750A4 (en) 2016-06-21 2020-02-26 Janssen Biotech, Inc. CYSTEINE-MODIFIED TYPE III FIBRONECTIN BINDING MOLECULES
CA3046963A1 (en) 2016-12-14 2018-06-21 Janssen Biotech, Inc. Cd8a-binding fibronectin type iii domains
US10597438B2 (en) 2016-12-14 2020-03-24 Janssen Biotech, Inc. PD-L1 binding fibronectin type III domains
EP3554561B1 (en) 2016-12-14 2023-06-28 Janssen Biotech, Inc. Cd137 binding fibronectin type iii domains
US11395821B2 (en) 2017-01-30 2022-07-26 G1 Therapeutics, Inc. Treatment of EGFR-driven cancer with fewer side effects
US9980967B1 (en) 2017-03-16 2018-05-29 National Chiao Tung University Method for overcoming drug resistance of EGFR mutation and cancerous stemness of human non-small cell lung carcinoma
CN107389621B (zh) * 2017-06-28 2019-10-29 中南民族大学 一种基于修饰纳米金的过氧化氢及过氧化物酶检测方法
WO2019165434A1 (en) 2018-02-26 2019-08-29 Genentech, Inc. Dosing for treatment with anti-tigit and anti-pd-l1 antagonist antibodies
IT201800004082A1 (it) * 2018-03-29 2019-09-29 Berlin Chemie Ag Composizioni farmaceutiche antitumorali per terapia combinata
CN108642154A (zh) * 2018-06-01 2018-10-12 领航基因科技（杭州）有限公司 一种检测egfr突变位点的引物探针组合和试剂盒及其应用
CN108998526A (zh) * 2018-08-08 2018-12-14 中山大学达安基因股份有限公司 检测egfr基因21外显子基因突变的试剂盒及方法
EP3846836A1 (en) * 2018-09-05 2021-07-14 Inivata Limited Method of treating a cancer patient without the need for a tissue biopsy
JOP20210233A1 (ar) 2019-02-26 2023-01-30 Janssen Biotech Inc علاجات مركبة وتطابق المريض مع الأجسام ثنائية النوعية المضادة لـ EGFR/c-Met.
WO2020198469A1 (en) * 2019-03-27 2020-10-01 Ideaya Biosciences Inc. Method for treating epidermal growth factor receptor-driven cancers with protein kinase c inhibitors in combination with an egfr-tyrosine kinase inhibitor
US11850248B2 (en) 2019-05-14 2023-12-26 Yuhan Corporation Therapies with 3rd generation EGFR tyrosine kinase inhibitors
JOP20210304A1 (ar) 2019-05-14 2023-01-30 Janssen Biotech Inc علاجات مركبة باستخدام الأجسام المضادة ثنائية النوعية المضادة لمستقبل عامل نمو البشرة (EGFR)/ مستقبل عامل نمو خلايا الكبد (c-Met) ومثبطات كيناز التيروسين الخاصة بمستقبل عامل نمو البشرة (EGFR) من الجيل الثالث
CR20220127A (es) 2019-09-27 2022-05-27 Genentech Inc Administración de dosis para tratamiento con anticuerpos antagonistas anti-tigit y anti-pd-l1
WO2021076574A2 (en) 2019-10-14 2021-04-22 Aro Biotherapeutics Company Fn3 domain-sirna conjugates and uses thereof
CN114786682A (zh) 2019-10-14 2022-07-22 Aro生物疗法公司 结合cd71的纤维粘连蛋白iii型结构域
WO2021194481A1 (en) 2020-03-24 2021-09-30 Genentech, Inc. Dosing for treatment with anti-tigit and anti-pd-l1 antagonist antibodies
WO2022050954A1 (en) 2020-09-04 2022-03-10 Genentech, Inc. Dosing for treatment with anti-tigit and anti-pd-l1 antagonist antibodies
AU2021212662A1 (en) 2020-01-27 2022-08-11 F. Hoffmann-La Roche Ag Methods for treatment of cancer with an anti-TIGIT antagonist antibody
KR20230069958A (ko) 2020-09-14 2023-05-19 얀센 파마슈티카 엔.브이. Fgfr 억제제 조합 요법
BR112023018278A2 (pt) 2021-03-09 2023-10-31 Janssen Biotech Inc Tratamento de cânceres sem mutações de ativação de egfr
TW202309094A (zh) 2021-05-18 2023-03-01 美商健生生物科技公司 用於識別癌症患者以進行組合治療之方法
DE102021126650A1 (de) 2021-10-14 2023-04-20 Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn, Körperschaft des öffentlichen Rechts Verfahren zur bestimmung der ansprechwahrscheinlichkeit einer malignen erkrankung auf eine behandlung mit einem pharmazeutischen hemmwirkstoff
TW202342057A (zh) 2022-02-07 2023-11-01 美商健生生物科技公司 用於減少用ｅｇｆｒ／ｍｅｔ雙特異性抗體治療之患者的輸注相關反應之方法

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4683203A (en) 1984-04-14 1987-07-28 Redco N.V. Immobilized enzymes, processes for preparing same, and use thereof
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
IE61148B1 (en) 1988-03-10 1994-10-05 Ici Plc Method of detecting nucleotide sequences
US5981725A (en) * 1989-09-08 1999-11-09 The Johns Hopkins Univiersity Structural alterations of the EGF receptor gene in human tumors
US5654307A (en) 1994-01-25 1997-08-05 Warner-Lambert Company Bicyclic compounds capable of inhibiting tyrosine kinases of the epidermal growth factor receptor family
US5869245A (en) 1996-06-05 1999-02-09 Fox Chase Cancer Center Mismatch endonuclease and its use in identifying mutations in targeted polynucleotide strands
EP1170011A1 (en) * 2000-07-06 2002-01-09 Boehringer Ingelheim International GmbH Novel use of inhibitors of the epidermal growth factor receptor
WO2004111273A2 (en) 2003-05-30 2004-12-23 Genomic Health, Inc. Gene expression markers for response to egfr inhibitor drugs
KR101347613B1 (ko) 2004-03-31 2014-01-06 다나-파버 캔서 인스티튜트 인크. 암에 걸린 인간 환자의 표피성장인자 수용체 표적 치료의 유효 가능성 결정 방법, 키트, 핵산 프로브 및 프라이머쌍
EP2592155B2 (en) 2004-06-04 2019-09-11 Genentech, Inc. EGFR mutations
CA2612183C (en) 2005-06-28 2015-08-11 Genentech, Inc. Egfr and kras mutations
US11145566B2 (en) 2020-02-10 2021-10-12 Xilinx, Inc. Stacked silicon package assembly having thermal management

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