CN105074006A - 预测对egfr抑制剂的响应 - Google Patents

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Abstract

提供了预测癌症是否会响应EGFR抑制剂的方法。特别地，提供的方法依赖于LKB1突变的测定。

Description

预测对EGFR抑制剂的响应
发明领域
一般而言，本发明涉及与对EGFR抑制剂的响应性有关的遗传变异。
发明背景
丝氨酸/苏氨酸激酶LKB1首次是作为家族性癌症综合征波伊茨-耶格综合征(Peutz-Jegherssyndrome)中突变的基因鉴定的(Hemminkietal.,1998,Nature,391:184-187)。随后，在多种散发性癌症(包括多达30％的非小细胞肺癌(NSCLC))中找到LKB1中的体细胞突变(Sanchez-Cespedes,2007,Oncogene,26:7825-7832)。LKB1作为肿瘤阻抑物的分子功能仍然是未知的。
类似地，长期以来已经将表皮生长因子受体(EGFR)中的突变与许多类型的癌症(包括肺)联系起来(Pastorinoetal.,1993,J.Cell.Biochem.Suppl.,17F:237-248)。已经开发出许多靶向EGFR的药物，并且在临床上成功用于治疗数种类型的癌症，包括厄洛替尼(在2004年得到批准)、吉非替尼(2003年)、帕尼单抗(2006年)和西妥昔单抗(2004年)。然而，经常产生对这些治疗的继发性抗性(Weietal.,2011,AnticancerDrugs,22:963-970；BruggerandThomas,2012,LungCancer,77:2-8)。虽然认为EGFR的活化性突变(EGFR-Mut+)预测对EGFR靶向性疗法的响应性，但是它们是不充分的。此外，已经观察到在EGFR突变缺失下对EGFR靶向性疗法的响应性(PiperdiandPerez-Soler,2012,Drugs,72Suppl.1:11-19)。这些结果提示了需要能更好预测患者对EGFR靶向性疗法的响应的诊断学。
数个小组已经报告了活化性EGFR突变和功能丧失性LKB1突变是互相排他的(尽管这两者经常在肺癌和其它类型的癌症中观察到)；也就是说，若存在一种突变，则另一种发生的可能性在统计学上比突变在患者群体内随机分配要低(Reungwetwattanaetal.,2012,Clin.LungCancer,13:252-266；Chitaleetal.,2008,Oncogene,28:2773-2783；Koivunenetal.,2008,Br.J.Cancer,455:245-252；Dingetal.,2008,Nature,455:1069-1075)。这提示了它们可能牵涉相同的分子途径，并且一种或另一种的突变足以使此途径脱调节(deregulate)，并且驱动肿瘤进展。
发明概述
在一些实施方案中，提供了用于预测癌症是否会响应EGFR抑制剂的方法。在一些实施方案中，一种方法包括测定所述癌症是否包含LKB1突变，其中所述LKB1突变的存在指示所述癌症会响应所述EGFR抑制剂。
在一些实施方案中，提供了鉴定可能受益于EGFR抑制剂的癌症患者的方法。在一些实施方案中，一种方法包括测定所述患者的癌症是否包含LKB1突变，其中所述LKB1突变的存在指示所述癌症患者可能会受益于所述EGFR抑制剂。
在一些实施方案中，提供了为癌症患者选择疗法的方法。在一些实施方案中，一种方法包括(a)测定所述患者的癌症是否包含LKB1突变；并且(b)若所述患者的癌症包含LKB1突变，则为所述疗法选择EGFR抑制剂。
在一些实施方案中，提供了治疗哺乳动物中的癌症的方法。在一些实施方案中，一种方法包括(a)测定所述癌症是否包含LKB1突变；并且(b)若所述癌症包含LKB1突变，则对所述哺乳动物施用治疗有效量的EGFR抑制剂。
在一些实施方案中，提供了治疗哺乳动物中包含LKB1突变的癌症的方法。在一些实施方案中，一种方法包括对所述具有癌症的哺乳动物施用治疗有效量的EGFR抑制剂。在一些实施方案中，在施用所述EGFR抑制剂前，所述癌症测定为包含LKB1突变。
在本文中描述的任何实施方案中，所述癌症可以是实体瘤。在本文中描述的任何实施方案中，所述癌症可以选自大细胞癌、类癌癌、神经内分泌起源的癌症、头和颈鳞状细胞癌(HNSCC)、结肠直肠癌、宫颈癌、黑素瘤、皮肤癌、平滑肌瘤、胃癌、成胶质细胞瘤、卵巢癌、小细胞肺癌(SCLC)、非小细胞肺癌(NSCLC)、胰腺癌、食道癌、胃癌和甲状腺癌。在本文中描述的任何实施方案中，所述癌症可以选自肺癌、胰腺癌、结肠直肠癌、和头和颈癌。在本文中描述的任何实施方案中，所述癌症可以是选自表2中组织的组织。
在一些实施方案中，所述LKB1突变包含LKB1多核苷酸中的变异。在一些实施方案中，所述LKB1多核苷酸中的变异在LKB1多核苷酸的编码序列中。在一些实施方案中，所述LKB1多核苷酸中的变异包含至少一种选自插入、删除、倒位、和替代的变异。在一些实施方案中，所述LKB1多核苷酸中的变异导致LKB1编码序列中的移码。在一些实施方案中，所述LKB1多核苷酸中的变异是选自表1的核苷酸位置处的核苷酸变异，其导致(a)水平显著降低或缺乏的LKB1蛋白质和/或(b)活性显著降低的LKB1蛋白质的表达。在一些实施方案中，所述LKB1多核苷酸中的变异是选自表1的核苷酸变化。
在一些实施方案中，所述LKB1多核苷酸中的变异导致LKB1多肽中的变异。在一些实施方案中，所述LKB1多肽中的变异选自插入、替代、删除、和截短。在一些实施方案中，所述LKB1多肽中的至少一处变异是选自表1的氨基酸位置处的氨基酸变异，其导致(a)水平显著降低或缺乏的LKB1蛋白质和/或(b)活性显著降低的LKB1蛋白质的表达。在一些实施方案中，所述LKB1多肽中的至少一处变异是选自表1的氨基酸变化。
在本文中描述的任何实施方案中，所述哺乳动物可以是人。
在本文中描述的任何实施方案中，所述EGFR抑制剂可以是结合EGFR的抗体。在一些实施方案中，所述EGFR抑制剂选自西妥昔单抗、帕尼单抗、DL11f、和GA201。
在本文中描述的任何实施方案中，所述EGFR抑制剂可以是小分子。在一些实施方案中，所述EGFR抑制剂选自厄洛替尼或吉非替尼。
这些和其它实施方案在下面的书面描述中有描述。
附图简述
图1显示了与NMPP1、EGF、NMPP1+EGF、NMPP1+EGF+厄洛替尼或NMPP1+FGF7+厄洛替尼一起温育的Lkb1wt/wt和Lkb1MG/MG小鼠胚胎无间充质肺组织外植体的生长和分支，如实施例2中描述的。
图2显示了与NMPP1、EGF、NMPP1+EGF、或NMPP1+EGF+厄洛替尼一起温育的Lkb1wt/wt和Lkb1MG/MG小鼠胚胎整装(wholemount)肺组织外植体的生长和分支，如实施例2中描述的。
图3A-B显示了(A)在NMPP1存在或缺失下LKB1wt/wt和LKB1MG/MG肺中的EGFR水平，和(B)在NMPP1存在下在有或无与EGF一起温育10分钟的情况中LKB1wt/wt和LKB1MG/MG肺中的EGFR酪氨酸磷酸化，如实施例2中描述的。
图4显示了与NMPP1、EGF、和NMPP1+EGF一起温育的LKB1MG/MG胰腺外植体中囊肿表型的形成，如实施例2中描述的。
图5显示了与EGF或EGF和NMPPI一起温育的Lkb1wt/wt和Lkb1MG/MG胰腺外植体中囊肿表型的形成，如实施例2中描述的。
图6显示了与EGF和NMPPI，或与EGF、NMPPI、和厄洛替尼一起温育的Lkb1wt/wt和Lkb1MG/MG胰腺外植体中囊肿表型的形成，如实施例2中描述的。
发明详述
I.定义
出于解读本说明书的目的，会应用下述定义，并且只要时机合适，以单数使用的术语还会包括复数，且反之亦然。在下文列出的任何定义与通过提及收入本文中的任何文件矛盾的情况中，会以下文列出的定义为准。
除非另有定义，本文中使用的所有技术术语、符号和其它科学术语意图具有本发明所属领域的技术人员通常理解的意义。在一些情况中，为了清楚和/或为了方便提及，在本文中定义了具有通常理解意义的术语，并且本文中纳入此类定义不应必然解释为代表与本领域中的一般理解的实质性差异。本文中描述或提及的技术和规程是本领域技术人员一般充分了解并且使用常规方法，通常采用的。在适当时，一般依照制造商限定的方案和/或参数实施牵涉使用商品化试剂盒和试剂的规程，除非另有注释。
在描述本组合物和方法前，要理解本发明不限于描述的特定方法、方案、细胞系、动物种或属、构建体、和试剂，因为它们当然可以变化。还要理解本文中使用的术语仅为了描述具体的实施方案，而并不意图限制本发明的范围，其仅会以所附权利要求书限制。
必须注意，如本文中和所附权利要求书中使用的，单数形式“一个”、“一种”和“所述/该”包括复数，除非上下文另有明确叙述。
贯穿本说明书和权利要求书，词语“包含”或变型(诸如“包括”)会理解为暗示包括叙述的整数或整数组，但不排除任何其它整数或整数组。
术语“多核苷酸”在以单数或复数使用时一般指任何多聚核糖核苷酸或多聚脱氧核糖核苷酸，其可以是未修饰的RNA或DNA或经修饰的RNA或DNA。如此，例如，本文中限定的多核苷酸包括但不限于单链和双链DNA、包含单链和双链区的DNA、单链和双链RNA、和包含单链和双链区的RNA、包含DNA和RNA的杂合分子，其可以是单链或更通常双链或者包含单链和双链区。另外，如本文中使用的，术语“多核苷酸”指包含RNA或DNA或RNA和DNA两者的三链区。此类区域中的链可以来自相同分子或来自不同分子。区域可以包含全部的一个或多个分子，但是更通常仅牵涉一些分子的区域。三股螺旋区的分子之一常常是寡核苷酸。术语“多核苷酸”明确包括cDNA。该术语包括含有一种或多种经修饰的碱基的DNA(包括cDNA)和RNA。如此，具有出于稳定性或出于其它原因而修饰的主链的DNA或RNA是“多核苷酸”，就像该术语在本文中的意图一样。此外，如本文中定义的，术语“多核苷酸”内包括包含罕见碱基(诸如肌苷)或经修饰的碱基(诸如氚化碱基)的DNA或RNA。一般地，术语“多核苷酸”涵盖未修饰的多核苷酸的所有化学、酶促和/或代谢修饰形式，及病毒和细胞(包括简单和复杂细胞)特征性的DNA和RNA的化学形式。
术语“寡核苷酸”指相对较短的多核苷酸，包括但不限于单链脱氧核糖核苷酸、单链或双链核糖核苷酸、RNA:DNA杂合物和双链DNA。常常通过化学方法(例如使用商品化的自动化寡核苷酸合成仪)合成寡核苷酸(诸如单链DNA探针寡核苷酸)。然而，可以通过多种其它方法(包括体外重组DNA介导的技术和通过在细胞和生物体中表达DNA)生成寡核苷酸。
术语“引物”指能够与核酸杂交并且容许互补核酸聚合(一般通过提供游离的3’-OH基团)的单链多核苷酸。
“HER受体”是一种受体蛋白质酪氨酸激酶，其属于HER受体家族，并且包括EGFR(ErbB1，HER1)、HER2(ErbB2)、HER3(ErbB3)和HER4(ErbB4)受体。HER受体一般会包含胞外域(其可结合HER配体和/或与另一个HER受体分子二聚化)；亲脂性跨膜域；保守的胞内酪氨酸激酶域；和含有数个能磷酸化的酪氨酸残基的羧基端信号传导域。HER受体可以是天然存在的(“天然序列”)HER受体或其变体。优选地，HER受体是天然序列人HER受体。
“HER途径”指由HER受体家族介导的信号传导网络。
术语“ErbB1”、“HER1”、“表皮生长因子受体”和“EGFR”在本文中可互换使用，并且指例如如Carpenteretal.,Ann.Rev.Biochem.56:881-914(1987)中披露的EGFR，包括其天然存在的突变体形式(例如如Ullrichetal.,Nature(1984)309:418-425和Humphreyetal.,PNAS(USA)87:4207-4211(1990)中的删除突变体EGFR)，及其变体，诸如EGFRvIII。EGFR变体还包括删除、替代和插入变体，例如那些记载于Lynchetal(NewEnglandJournalofMedicine2004,350:2129)，Paezetal(Science2004,304:1497)，及Paoetal(PNAS2004,101:13306)的。
在本文中，“EGFR胞外域”或“EGFRECD”指EGFR中在细胞外部(锚定于细胞膜或在循环中)的域，包括其片段。在一些实施方案中，EGFR的胞外域可以包含四种域：“域I”(氨基酸残基约1-158)、“域II”(氨基酸残基159-336)、“域III”(氨基酸残基337-470)、和“域IV”(氨基酸残基471-645)，其中边界是大概的，并且可以相差约1-3个氨基酸。
“磷酸化”指对蛋白质(诸如EGFR受体)或其底物添加一个或多个磷酸基团。
术语“丝氨酸/苏氨酸激酶11”、“STK11”、“肝激酶B1”、和“LKB1”可互换使用，并且指来自任何脊椎动物来源(包括哺乳动物，诸如灵长类(例如人)和啮齿类(例如小鼠和大鼠))的任何天然的LKB1蛋白质、编码序列、或基因，除非另有指示。该术语涵盖“全长”未加工LKB1及源自天然加工的任何形式的LKB1。该术语还涵盖LKB1的天然存在变体，例如剪接变体或等位变体。一种例示性人LKB1蛋白质的序列以Swiss-Prot登录号No.Q15831.1显示。一种例示性人LKB1编码序列的序列以GenBank登录号No.NM_000455.4显示。例示性遗传信息(包括基因位置、序列、和内含子/外显子边界)以NCBI基因ID6794显示。SEQIDNO:1中显示了一种非限制性例示性LKB1编码序列。SEQIDNO:2中显示了一种非限制性例示性LKB1氨基酸序列。
术语“LKB1多核苷酸”或“编码LKB1的核酸”指编码LKB1的基因或编码序列(例如mRNA或cDNA编码序列)，除非另有指示。
术语“核苷酸变异”指核苷酸序列中相对于参照序列(例如野生型序列)的变化(例如一个或多个核苷酸的插入、删除、倒位、或替代，诸如单核苷酸多态性(SNP))。该术语还涵盖核苷酸序列的互补物中的相应变化，除非另有指示。核苷酸变异可以是体细胞突变或种系多态性。
术语“氨基酸变异”指氨基酸序列中相对于参照序列的变化(例如一个或多个氨基酸的插入、替代、或删除，诸如内部删除或N或C端截短)。
术语“变异”指核苷酸变异或氨基酸变异。术语“变异”和“突变”可以互换使用。
术语“选自表1的核苷酸位置处的核苷酸变异”及其语法变型指LKB1多核苷酸序列中在表1中列出的任何核苷酸位置(包括但不限于与表1的栏1中列出的氨基酸位置对应的任何核苷酸位置)处的核苷酸变异和表1的栏2中列出的特定核苷酸变化。例如且出于例示目的，参照表1的第三数据行中的栏1，与LKB1多肽的氨基酸37对应的三个核苷酸位置之任一处的核苷酸变异涵盖那三个核苷酸位置之一处的任何变化，包括但不限于特定的核苷酸变化，即栏2中指示的109C>T替代。该术语还涵盖核苷酸序列的互补物中的相应变化，除非另有指示。
术语“选自表1的核苷酸变化”及其语法变型指表1的栏2中列出的任何特定核苷酸变化。出于例示的目的，选自表1的核苷酸变化的例子是表1的第二栏和第三数据行中显示的109C>T替代。
术语“选自表1的氨基酸位置处的氨基酸变异”及其语法变型指LKB1氨基酸序列中在表1的栏1中列出的任何氨基酸位置处的氨基酸变异，包括但不限于表1的栏3中列出的特定氨基酸变化。例如且出于例示的目的，参照表1的第四数据行中的栏1，LKB1的氨基酸位置281处的氨基酸变异涵盖该氨基酸位置处的任何变化，包括但不限于特定的氨基酸变化，即栏3的第四数据行中指示的P281L替代。
术语“选自表1的氨基酸变化”及其语法变型指表1的栏3中列出的任何特定的氨基酸变化。出于例示的目的，选自表1的氨基酸变化的例子是表1的列3的第四数据行中指示的P281L替代。
如本文中使用的，术语“LKB1突变”指LKB1基因中导致(a)水平显著降低或缺乏的LKB1蛋白质和/或(b)活性显著降低的LKB1蛋白质的表达的一处或多处变异。术语“LKB1突变”包括但不限于导致整个LKB1基因的删除的核苷酸删除。如本文中使用的，“突变LKB1基因”指包含LKB1突变的LKB1基因。当细胞(例如肿瘤细胞)中的LKB1水平为相同细胞类型(例如与肿瘤细胞对应于相同组织类型的正常细胞)中LKB1蛋白质的野生型水平的50％或更低时，认为LKB1蛋白质的水平是“显著降低的或缺乏的”。当LKB1蛋白质的激酶活性是野生型LKB1蛋白质的激酶活性的<50％、<40％、<30％、<20％或<10％时，认为LKB1蛋白质具有“显著降低的活性”，如通过如例如EP1633883B1中描述的磷酸化测定法测定的。
“包含LKB1突变”的癌症或肿瘤指癌症或肿瘤的至少一部分细胞包含LKB1突变的癌症或肿瘤。
本文中的“肿瘤样品”是自患者肿瘤衍生或包含来自患者肿瘤的肿瘤细胞的样品。本文中的肿瘤样品的例子包括但不限于肿瘤活组织检查、循环肿瘤细胞、循环血浆蛋白质、腹水、原代细胞培养物或自肿瘤衍生或展现肿瘤样特性的细胞系，及保存的肿瘤样品，诸如福尔马林固定、石蜡包埋的肿瘤样品或冷冻的肿瘤样品。
“固定的”肿瘤样品是已经使用固定剂进行组织学保存的肿瘤样品。
“福尔马林固定的”肿瘤样品是已经使用甲醛作为固定剂进行保存的肿瘤样品。
“包埋的”肿瘤样品是以坚固且一般坚硬的介质(诸如石蜡、蜡、火棉胶、或树脂)包围的肿瘤样品。包埋使得可能切割薄切片以显微检查或产生组织微阵列(TMA)。
“石蜡包埋的”肿瘤样品是以自石油衍生的固体烃的纯化混合物围绕的肿瘤样品。
在本文中，“冷冻的”肿瘤样品指冷冻或已经冷冻的肿瘤样品。
术语“阵列”或“微阵列”指可杂交阵列元件，优选多核苷酸探针(例如寡核苷酸)在基片上的有序排列。基片可以是固体基片，诸如玻璃载玻片，或半固体基片，诸如硝酸纤维素膜。
术语“扩增”指生成参照核酸序列或其互补物的一个或多个拷贝的过程。扩增可以是线性或指数的(例如PCR)。“拷贝”不一定意指相对于模板序列的完全序列互补性或同一性。例如，拷贝可以包含核苷酸类似物(诸如脱氧肌苷)、有意的序列变化(诸如经由包含与模板可杂交但不完全互补的序列的引物引入的序列变化)、和/或扩增期间发生的序列错误。
如本文中使用的，“聚合酶链式反应”或“PCR”的技术一般指扩增微量的核酸、RNA和/或DNA的特定部分的规程，如记载于1987年7月28日公告的美国专利No.4,683,195。一般地，可以使用来自感兴趣区域的末端或超出的序列信息，从而可以设计寡核苷酸引物；这些引物会与要扩增的模板的相反链在序列上相同或相似。两种引物的5’端核苷酸可以与扩增材料的末端相符。可以使用PCR来扩增特定RNA序列、来自总基因组DNA的特定DNA序列、和自总细胞RNA转录的cDNA、噬菌体或质粒序列，等。一般参见Mullisetal.,ColdSpringHarborSymp.Quant.Biol.,51:263(1987)；Erlich,ed.,PCRTechnology,(StocktonPress,NY,1989)。如本文中使用的，认为PCR是用于扩增核酸测试样品的核酸聚合酶反应方法的一种但不是唯一的例子，其包括使用已知的核酸(DNA或RNA)作为引物，并且利用核酸聚合酶来扩增或生成核酸的特定部分或扩增或生成与特定核酸互补的核酸的特定部分。
“定量实时聚合酶链式反应”或“qRT-PCR”指一种PCR形式，其中在PCR反应中在每个步骤测量PCR产物的量。此技术已经记载于多份出版物中，包括Croninetal.,Am.J.Pathol.164(1):35-42(2004)；及Maetal.,CancerCell5:607-616(2004)。
术语“等位基因特异性寡核苷酸”指与靶核酸中包含核苷酸变异(一般是替代)的区域杂交的寡核苷酸。“等位基因特异性杂交”意指在等位基因特异性寡核苷酸与其靶核酸杂交时等位基因特异性寡核苷酸中的核苷酸与核苷酸变异特异性碱基配对。就特定核苷酸变异而言能够等位基因特异性杂交的等位基因特异性寡核苷酸被说成是对所述变异特异性的。
术语“等位基因特异性引物”指作为引物的等位基因特异性寡核苷酸。
术语“引物延伸测定法”指对核酸添加核苷酸，产生直接或间接检测的更长核酸或“延伸产物”的测定法。
术语“等位基因特异性核苷酸掺入测定法”指一种引物延伸测定法，其中引物(a)与在核苷酸变异3’的区域处的靶核酸杂交，并且(b)通过聚合酶延伸，由此将与核苷酸变异互补的核苷酸掺入延伸产物中。
术语“等位基因特异性引物延伸测定法”指一种引物延伸测定法，其中使等位基因特异性引物与靶核酸杂交并延伸。
术语“等位基因特异性寡核苷酸杂交测定法”指(a)等位基因特异性寡核苷酸与靶核酸杂交并且(b)直接或间接检测杂交的测定法。
术语“5’核酸酶测定法”指等位基因特异性寡核苷酸与靶核酸的杂交容许对杂交探针的核水解切割，产生可检测信号的测定法。
术语“采用分子信标(beacon)的测定法”指等位基因特异性寡核苷酸与靶核酸的杂交产生比由游离寡核苷酸发射的可检测信号水平要高的可检测信号水平的测定法。
术语“寡核苷酸连接测定法”指等位基因特异性寡核苷酸和第二寡核苷酸在靶核酸上彼此相邻杂交并连接在一起(直接或经由居间核苷酸间接)，并且直接或间接检测连接产物的测定法。
术语“靶序列”、“靶核酸”或“靶核酸序列”一般指怀疑或已知存在核苷酸变异的感兴趣多核苷酸序列，包括通过扩增生成的此类靶核酸的拷贝。
术语“检测”包括检测的任何手段，包括直接和间接检测。
术语“诊断”在本文中用于指分子或病理状态、疾病或状况的鉴定或分类。例如，“诊断”可以指癌症(例如肺癌)的特定类型的鉴定。“诊断”也可以指癌症的特定类型的分类，例如通过组织学(例如非小细胞肺癌)、通过分子特征(例如以特定基因或蛋白质中的核苷酸和/或氨基酸变异为特征的肺癌)、或者这两者进行。
术语“预测”在本文中用于指患者会有利地或不利地响应一种药物或一组药物的可能性。在一些实施方案中，预测涉及那些响应的程度。在另一个实施方案中，预测涉及患者是否会在治疗(例如用特定治疗剂和/或手术除去原发性肿瘤，和/或化学治疗进行的治疗)后在没有癌症复发的情况中存活某个时段和/或患者会在治疗(例如用特定治疗剂和/或手术除去原发性肿瘤，和/或化学治疗进行的治疗)后在没有癌症复发的情况中存活某个时段的可能性。可以在临床上使用本发明的预测方法，通过为任何特定患者选择最合适的治疗形式来做出治疗决定。本发明的预测方法在预测患者是否可能有利地响应治疗方案(诸如给定的治疗方案，包括例如施用给定的治疗剂或组合、手术干预、化学疗法、等)或治疗性方案后患者的长期存活是否可能中是有价值的工具。
如本文中使用的，“肿瘤”指所有新生性细胞生长和增殖(无论是恶性还是良性)，和所有癌前性和癌性细胞和组织。术语“癌症”、“癌性”、“细胞增殖性病症”、“增殖性病症”和“肿瘤”在本文中提及时不互相排斥。
术语“癌症”和“癌性”指或描述哺乳动物中通常以不受调节的细胞生长和增殖为特征的生理学状况。癌症的例子包括但不限于癌瘤(carcinoma)、淋巴瘤(例如何杰金氏和非何杰金氏淋巴瘤)、母细胞瘤(blastoma)、肉瘤、和白血病。癌症的更具体的例子包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞状癌、腹膜癌、肝细胞癌、肾细胞癌、胃肠癌、胃癌、食道癌、胰腺癌、胶质瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌(livercancer)、膀胱癌、肝瘤、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、肺癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、肝癌(livercancer)、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌(hepaticcarcinoma)、黑素瘤、白血病和其它淋巴增殖性病症、和各种类型的头和颈癌。
术语“肺肿瘤”和“肺癌”指肺的任何肿瘤，包括但不限于小细胞肺癌和非小细胞肺癌，后一种包括但不限于腺癌、鳞癌、和大细胞癌。
术语“新生物”或“新生性细胞”指比相应的正常组织或细胞更快速地增殖并且在除去启动生长的刺激后继续生长的异常组织或细胞。
“肺肿瘤细胞”或“肺癌细胞”指体内或体外的来自肺肿瘤的细胞，并且涵盖自原发性肺肿瘤或转移性肺肿瘤衍生的细胞，及自此类细胞衍生的细胞系。
如本文中使用的，“治疗/处理”指试图改变处理/处理的个体或细胞的天然过程的临床干预，并且可以为了预防或在临床病理学过程期间实施。治疗/处理的期望效果包括预防疾病的发生或复发、减轻症状、减少疾病的任何直接或间接病理学后果、阻止转移、降低疾病进展速率、改善或减轻疾病状态、和消退或改善的预后。
“个体”、“受试者”或“患者”是脊椎动物。在某些实施方案中，脊椎动物是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于家畜(诸如牛)、运动动物、宠物(诸如猫、犬和马)、灵长类(包括人和非人灵长类)、和啮齿类(例如小鼠和大鼠)。在某些实施方案中，哺乳动物是人。
“有效量”指在必需的剂量和时间段，对于实现期望的治疗或预防结果有效的量。
术语“治疗有效量”指有效治疗患者中的癌症的药物量。有效量的药物可以减少癌细胞的数目；降低肿瘤大小；抑制(即在某种程度上减缓且优选停止)癌细胞浸润入周围器官中；抑制(即在某种程度上减缓且优选停止)肿瘤转移；在某些程度上抑制肿瘤生长；和/或在某种程度上减轻一种或多种与癌症有关的症状。在药物可以阻止生长和/或杀死现有癌细胞的程度上，它可以是细胞抑制性的和/或细胞毒性的。有效量可以延长无进展存活(例如如通过实体瘤响应评估标准(RECIST)测量的)，导致客观响应(包括部分响应(PR)、或完全响应(CR))，改善存活(包括总体存活和无进展存活)和/或改善一种或多种癌症症状(例如如通过FOSI评估的)。最优选地，药物的治疗有效量有效改善无进展存活(PFS)和/或总体存活(OS)。
治疗剂的“固定”或“平坦”剂量在本文中指不管患者的重量(WT)或体表面积(BSA)对人患者施用的剂量。因此，固定或平坦剂量不以mg/kg剂量或mg/m2剂量，而是以治疗剂的绝对量提供。
“加载”剂量在本文中一般包含对患者施用的治疗剂的初始剂量，并且接着是一个或多个其维持剂量。一般地，施用一个加载剂量，但是本文中涵盖多个加载剂量。通常，施用的加载剂量的量超过施用的维持剂量的量和/或比维持剂量更频繁施用加载剂量，从而比用维持剂量可以实现的治疗剂的期望稳态浓度更早地实现治疗剂的期望稳态浓度。
“维持”剂量在本文中指在治疗期里对患者施用的一剂或多剂治疗剂。通常，以间隔的治疗间隔(诸如大约每周、大约每2周、大约每3周、大或约每4周)施用维持剂量。
“药物”是治疗癌症的活性药物，诸如EGFR抑制剂。
“目标听众”是如通过市场学或广告尤其在特定用途、治疗、或适应症方面接受特定药物宣传或意图接受特定药物宣传的人群或机构，诸如个体患者，患者群体，报纸、医学文献和杂志读者，电视或因特网观众，收音机或因特网听众，内科医生，药物公司，等。
“包装插页”用于指治疗性产品的商业包装中通常包含的用法说明，其含有关于适应症、用法、剂量、施用、禁忌症、要与包装产品组合的其它治疗产品、和/或关注使用此类治疗性产品的警告的信息。
术语“长期”存活在本文中用于指在治疗性处理后存活至少1年、5年、8年、或10年。
术语对特定治疗剂或治疗选项的“升高的抗性”在依照本发明使用时意指对标准剂量的药剂或对标准治疗方案的降低的响应。
术语对特定治疗剂或治疗选项的“降低的敏感性”在依照本发明使用时意指对标准剂量的药剂或对标准治疗方案的降低的响应，其中可以(至少部分)通过提高药剂的剂量或治疗的强度补偿降低的响应。
可以使用指示对患者的益处的任何终点来评估“响应”，所述对患者的益处包括但不限于(1)在某种程度上抑制肿瘤生长，包括减缓或完全生长停止；(2)肿瘤细胞数目的减少；(3)肿瘤大小的缩小；(4)抑制(即降低、减缓或完全停止)对相邻周围器官和/或组织的肿瘤细胞浸润；(5)抑制(即降低、减缓或完全停止)转移；(6)增强抗肿瘤免疫应答，这可以但不必导致肿瘤的消退或排斥；(7)在某种程度上减缓一种或多种与肿瘤有关的症状；(8)延长治疗后存活长度；和/或(9)在治疗后给定时间点时降低的死亡率。
术语“拮抗剂”以最广义使用，并且包括部分或完全抑制或中和多肽(诸如EGFR)的生物学活性，或者部分或完全抑制编码多肽的核酸转录或翻译的任何分子。例示性拮抗剂分子包括但不限于拮抗性抗体、多肽片段、寡肽、有机分子(包括小分子)、和反义核酸。
如本文中使用的，术语“细胞毒剂”指抑制或阻止细胞功能和/或引起细胞死亡或破坏的物质。该术语意图包括放射性同位素(例如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素)、化学治疗剂(例如甲氨蝶呤、阿霉素(adriamicin)、长春花生物碱类(vincaalkaloids)(长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、依托泊苷(etoposide))、多柔比星(doxorubicin)、美法仑(melphalan)、丝裂霉素(mitomycin)C、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、柔红霉素(daunorubicin)或其它插入剂、酶及其片段，诸如溶核酶、抗生素、和毒素，诸如小分子毒素或细菌、真菌、植物或动物起源的酶活性毒素，包括其片段和/或变体，和下文公开的各种抗肿瘤或抗癌剂。下文描述了其它细胞毒剂。“杀肿瘤”剂引起肿瘤细胞的破坏。
在本文中，“抗肿瘤剂”指用于治疗癌症的药物。本文中的抗肿瘤剂的非限制性例子包括化学治疗剂、HER抑制剂、HER二聚化抑制剂、HER抗体、针对肿瘤相关抗原的抗体、抗激素化合物、细胞因子、EGFR靶向性药物、抗血管生成剂、酪氨酸激酶抑制剂、生长抑制剂和抗体、细胞毒剂、诱导凋亡的抗体、COX抑制剂、法呢基转移酶抑制剂、结合癌胚蛋白CA125的抗体、HER2疫苗、Raf或ras抑制剂、脂质体多柔比星、托泊替康(topotecan)、紫杉烷(taxane)、双重酪氨酸激酶抑制剂、TLK286、EMD-7200、帕妥珠单抗(pertuzumab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、厄洛替尼(erlotinib)、和贝伐单抗(bevacizumab)。
“批准的抗肿瘤剂”是已经得到管理当局(诸如食品药品管理局(FDA)或其外国等同部门)上市批准的用于治疗癌症的药物。
“HER抑制剂”指干扰HER活化或功能的药剂。HER抑制剂的例子包括HER抗体(例如EGFR、HER2、HER3、或HER4抗体)；EGFR靶向性药物；小分子HER拮抗剂；HER酪氨酸激酶抑制剂；HER2和EGFR双重酪氨酸激酶抑制剂，诸如拉帕替尼(lapatinib)/GW572016；反义分子(见例如WO2004/87207)；和/或结合下游信号传导分子(诸如MAPK或Akt)或干扰其功能的药剂。在一些实施方案中，HER抑制剂是结合HER受体的抗体。在一些实施方案中，HER抑制剂是HER3抑制剂。在一些实施方案中，抑制剂是多特异性HER抑制剂，例如HER抑制剂，诸如抑制HER3和EGFR两者，HER3和HER2两者，或HER3和HER4两者的。在此类实施方案中，双特异性HER抑制剂是抗体。在一些实施方案中，HER抑制剂是对HER3和EGFR两者特异性的双特异性抗体。此类抑制剂的例子是US2010/0255010(通过提及明确收入本文)中描述的多特异性抗体，包括但不限于抗EGFR/HER3抗体“DL11f”。
如本文中所使用的，术语“EGFR抑制剂”指结合EGFR或以其它方式与EGFR直接相互作用，并且阻止或降低其信号传导活性的化合物，并且或者称为“EGFR拮抗剂”。此类药剂的例子包括结合EGFR的抗体和小分子。结合EGFR的抗体的例子包括单抗579(ATCCCRLHB8506)、单抗455(ATCCCRLHB8507)、单抗225(ATCCCRL8508)、单抗528(ATCCCRL8509)(见美国专利No.4,943,533,Mendelsohn等)及其变体，诸如嵌合化的225(C225或西妥昔单抗(cetuximab)；)和重构人225(H225)(见WO96/40210,ImcloneSystemsInc.)；IMC-11F8，即一种完全人的、EGFR靶向性抗体(Imclone)；结合II型突变体EGFR的抗体(美国专利No.5,212,290)；结合EGFR的人源化的和嵌合的抗体，如记载于美国专利No.5,891,996的；和结合EGFR的人抗体，诸如ABX-EGF或帕尼单抗(panitumumab)(见WO98/50433,Abgenix/Amgen)；EMD55900(Stragliottoetal.Eur.J.Cancer32A:636-640(1996))；EMD7200(马妥珠单抗(matuzumab))，即一种针对EGFR的人源化EGFR抗体，其与EGF和TGF-α两者竞争EGFR结合(EMD/Merck)；人EGFR抗体HuMax-EGFR(GenMab)；称为E1.1、E2.4、E2.5、E6.2、E6.4、E2.11、E6.3和E7.6.3并记载于US6,235,883的完全人抗体；MDX-447(MedarexInc)；单抗806或人源化单抗806(Johnsetal.,J.Biol.Chem.279(29):30375-30384(2004))；和人源化ICR62抗体，包括但不限于GA201(Gerdesetal.Clin.CancerRes.19(5):1126-1138(2013)和US7,722,867和WO2006/082515(通过提及明确收入本文)中描述的抗体。可以将抗EGFR抗体与细胞毒剂缀合，如此生成免疫缀合物(见例如EP659,439A2,MerckPatentGmbH)。EGFR拮抗剂包括小分子诸如记载于美国专利No:5,616,582,5,457,105,5,475,001,5,654,307,5,679,683,6,084,095,6,265,410,6,455,534,6,521,620,6,596,726,6,713,484,5,770,599,6,140,332,5,866,572,6,399,602,6,344,459,6,602,863,6,391,874,6,344,455,5,760,041,6,002,008和5,747,498，及下列PCT公开文本：WO98/14451,WO98/50038,WO99/09016和WO99/24037的化合物。具体的小分子EGFR拮抗剂包括OSI-774(CP-358774，厄洛替尼，Genentech/OSIPharmaceuticals)；PD183805(CI1033，2-丙烯酰胺，N-[4-[(3-氯-4-氟苯基)氨基]-7-[3-(4-吗啉基)丙氧基]-6-喹唑啉基]-，二氢氯化物，PfizerInc.)；ZD1839，吉非替尼(gefitinib)(IRESSATM，4-(3’-氯-4’-氟苯胺基)-7-甲氧基-6-(3-吗啉代丙氧基)喹唑啉，AstraZeneca)；ZM105180(6-氨基-4-(3-甲基苯基-氨基)-喹唑啉，Zeneca)；BIBX-1382(N8-(3-氯-4-氟-苯基)-N2-(1-甲基-哌啶-4-基)-嘧啶并[5,4-d]嘧啶-2,8-二胺，BoehringerIngelheim)；PKI-166((R)-4-[4-[(1-苯基乙基)氨基]-1H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基]-酚)；(R)-6-(4-羟基苯基)-4-[(1-苯基乙基)氨基]-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶；CL-387785(N-[4-[(3-溴苯基)氨基]-6-喹唑啉基]-2-丁炔酰胺)；EKB-569(N-[4-[(3-氯-4-氟苯基)氨基]-3-氰基-7-乙氧基-6-喹啉基]-4-(二甲基氨基)-2-丁烯酰胺)(Wyeth)；AG1478(Pfizer)；AG1571(SU5271；Pfizer)；双重EGFR/HER2酪氨酸激酶抑制剂诸如拉帕替尼(GSK572016或N-[3-氯-4-[(3-氟苯基)甲氧基]苯基]6[5[[[2甲基磺酰基)乙基]氨基]甲基]-2-呋喃基]-4-喹唑啉胺；Glaxo-SmithKline)。
在一些实施方案中，“EGFR抑制剂”包括抑制EGFR和一种或多种别的HER家族成员(例如HER2、HER3或HER4)的如上文描述的多特异性HER抑制剂。在此类实施方案中，EGFR抑制剂是结合EGFR和一种其它HER家族成员的双特异性HER抑制剂。在此类实施方案中，双特异性HER抑制剂是抗体。在此类实施方案中，双特异性抗体对HER3和EGFR两者是特异性的。EGFR抑制剂的例子包括US2010/0255010(通过提及明确收入本文)中描述的多特异性抗体，包括但不限于抗EGFR/HER3抗体“DL11f”。
“酪氨酸激酶抑制剂”指抑制酪氨酸激酶(诸如HER受体)的酪氨酸激酶活性的分子。此类抑制剂的例子包括前段中记录的EGFR靶向性药物；小分子HER2酪氨酸激酶抑制剂，诸如可购自Takeda的TAK165；CP-724,714，即一种口服选择性ErbB2受体酪氨酸激酶抑制剂(Pfizer和OSI)；双重HER抑制剂，诸如EKB-569(可购自Wyeth)，其优先结合EGFR，但是抑制HER2和EGFR过表达细胞两者；拉帕替尼(GSK572016；可购自Glaxo-SmithKline)，即一种口服HER2和EGFR酪氨酸激酶抑制剂；PKI-166(可购自Novartis)；泛-HER抑制剂，诸如卡奈替尼(canertinib)(CI-1033；Pharmacia)；Raf-1抑制剂，诸如可购自ISISPharmaceuticals的反义剂ISIS-5132，其抑制Raf-1信号传导；非HER靶向性TK抑制剂，诸如甲磺酸伊马替尼(imatinibmesylate)(GLEEVECTM，可购自GlaxoSmithKline)；多靶向性酪氨酸激酶抑制剂，诸如舒尼替尼(sunitinib)(可购自Pfizer)；VEGF受体酪氨酸激酶抑制剂，诸如瓦他拉尼(vatalanib)(PTK787/ZK222584，可购自Novartis/ScheringAG)；MAPK胞外调节激酶I抑制剂CI-1040(可购自Pharmacia)；喹唑啉(quinazolines)，诸如PD153035，4-(3-氯苯胺基)喹唑啉；吡啶并嘧啶(pyridopyrimidines)；嘧啶并嘧啶(pyrimidopyrimidines)；吡咯并嘧啶(pyrrolopyrimidines)，诸如CGP59326、CGP60261和CGP62706；吡唑并嘧啶(pyrazolopyrimidines)，4-(苯基氨基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶；姜黄素(二阿魏酰甲烷(diferuloylmethane)、4,5-二(4-氟苯胺基)酞酰亚胺)；含有硝基噻吩模块的tyrphostines；PD-0183805(Warner-Lamber)；反义分子(例如那些结合HER编码核酸的)；喹口恶啉(美国专利No.5,804,396)；tryphostins(美国专利No.5,804,396)；ZD6474(AstraZeneca)；PTK-787(Novartis/ScheringAG)；泛-HER抑制剂，诸如CI-1033(Pfizer)；Affinitac(ISIS3521；Isis/Lilly)；甲磺酸伊马替尼(GLEEVECTM)；PKI166(Novartis)；GW2016(GlaxoSmithKline)；CI-1033(Pfizer)；EKB-569(Wyeth)；Semaxinib(Pfizer)；ZD6474(AstraZeneca)；PTK-787(Novartis/ScheringAG)；INC-1C11(Imclone)；或如任何下述专利公开文本中描述的：美国专利No.5,804,396；WO1999/09016(AmericanCyanamid)；WO1998/43960(AmericanCyanamid)；WO1997/38983(WarnerLambert)；WO1999/06378(WarnerLambert)；WO1999/06396(WarnerLambert)；WO1996/30347(Pfizer,Inc)；WO1996/33978(Zeneca)；WO1996/3397(Zeneca)；及WO1996/33980(Zeneca)。
术语“抗体”和“免疫球蛋白”在最广义上可互换使用，并且包括单克隆抗体(例如全长或完整单克隆抗体)、多克隆抗体、单价抗体、多价抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)，只要它们展现出期望的生物学活性，并且还可以包括某些抗体片段(如在本文中更为详细描述的)。抗体可以是嵌合的、人的、人源化的和/或亲和力成熟的。
“小分子”或“小有机分子”在本文中定义为具有低于约500道尔顿的分子量的有机分子。
词语“标记物”在本文中使用时指可检测化合物或组合物。标记物可以自身可检出(例如放射性同位素标记物或荧光标记物)或在酶标记物的情况中可以催化底物化合物或组合物的化学改变，这产生可检测产物。可以充当可检测标记物的放射性核素包括例如I-131、I-123、I-125、Y-90、Re-188、Re-186、At-211、Cu-67、Bi-212、和Pd-109。
“分离的”生物学分子(诸如核酸、多肽、或抗体)是已经鉴定并且自其天然环境的至少一种组分分开和/或回收的生物学分子。
杂交反应的“严格性”可以容易的由本领域普通技术人员确定，而且通常根据探针长度、洗涤温度、和盐浓度凭经验计算。通常，较长的探针要求较高的温度以正确退火，而较短的探针需要较低的温度。杂交通常依赖于当互补链存在于低于其解链温度的环境中时变性DNA重新退火的能力。探针和可杂交序列之间的期望同源性程度越高，可使用的相对温度也越高。结果是，推断出较高相对温度会趋向于使反应条件更为严格，而较低温度也就较不严格。关于杂交反应严格性的另外细节和解释，参见Ausubeletal.，Current ProtocolsinMolecularBiology，WileyIntersciencePublishers，1995。
“严格条件”或“高严格性条件”，如本文中所定义的，可如下鉴别：(1)采用低离子强度和高温进行洗涤，例如0.015M氯化钠/0.0015M柠檬酸钠/0.1％十二烷基硫酸钠，50℃；(2)在杂交过程中采用变性剂，诸如甲酰胺，例如50％(v/v)甲酰胺及0.1％牛血清清蛋白/0.1％Ficoll/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/50mM磷酸钠缓冲液pH6.5，含750mM氯化钠,75mM柠檬酸钠，42℃；或(3)在采用50％甲酰胺,5xSSC(0.75MNaCl,0.075M柠檬酸钠),50mM磷酸钠(pH6.8),0.1％焦磷酸钠,5xDenhardt氏溶液,超声波处理的鲑鱼精DNA(50μg/ml),0.1％SDS,和10％硫酸右旋糖苷的溶液中于42℃杂交过夜，以及于42℃在0.2xSSC(氯化钠/柠檬酸钠)中洗涤10分钟，接着在含EDTA的0.1xSSC中于55℃进行10分钟高严格性洗涤。
“中等严格条件”可以如Sambrooketal.，MolecularCloning:ALaboratory Manual，NewYork，ColdSpringHarborPress，1989所述鉴别，包括使用比上文所述较不严格的洗涤溶液和杂交条件(例如温度、离子强度和％SDS)。中等严格条件的一个例子是于37℃在含：20％甲酰胺,5xSSC(150mMNaCl,15mM柠檬酸三钠),50mM磷酸钠(pH7.6),5xDenhardt氏溶液,10％硫酸右旋糖苷,和20mg/ml变性剪切的鲑鱼精DNA的溶液中温育过夜，接着在1xSSC中于约37-50℃洗涤滤膜。技术人员会认识到如何根据需要调整温度、离子强度等以适应诸如探针长度等因素。
II.某些实施方案的描述
本文中提供了LKB1中与肿瘤对EGFR抑制剂的响应性有关的核苷酸和氨基酸变异。这些变异提供了关于对EGFR抑制剂的响应性的生物标志物。
A.变异
例如，在癌症体细胞突变目录(CatalogueofSomaticMutationsInCancer)(COSMIC,cancer.sanger.ac.uk/cancergenome/projects/cosmic/)中鉴定原发性肿瘤和培养肿瘤细胞中LKB1基因中的已知变异。表1显示了COSMIC数据库中已经在原发性肿瘤和培养肿瘤细胞中鉴定的LKB1变异列表。表1中的变异以出现的递减次序，然后根据沿着LKB1蛋白质的氨基酸位置列出。表的第一栏列出LKB1蛋白质中变异的氨基酸位置，第二栏列出源自变异的LKB1编码序列变化。第三栏列出源自变异的LKB1氨基酸序列变化。第四栏列出突变ID，即给每种变异指派的标识号。第五栏列出具有变异的独特样品的数目。最后一栏列出变异的类型。
表1
LKB1氨基酸依照其在翻译的cDNA序列中的位置编号。在核苷酸替代导致终止密码子(即无义突变)的情况中，相应的氨基酸变化以“*”标示(见例如第三数据行的第37位变异，其指示“Q37*”的氨基酸变化)。在核苷酸插入或删除导致移码的情况中，相应的氨基酸变化以“fs*”和然后数字(其指示移码后终止密码子前的氨基酸数目)标示(见例如第281位的“p.P281fs*6”)。编码序列的部分的删除以删除的第一个核苷酸、下划线(_)、然后删除的最后一个核苷酸、和词“del”后删除的核苷酸的数目标示(见例如数据行10中的“c.465_597del133”)。剪接点中的突变以“+”(剪接供体)和“-”(剪接受体)标示，其中+或–后的数字指示相对于GT(供体位点，其中G是+1并且T是+2，等)或AG(受体位点，其中G是-1，A是-2，等)的位置。在一些情况中，包含剪接位点突变的LKB1基因可以不表达LKB1蛋白质(以“p.？”标示)。
表2显示了已经在COSMIC数据库中鉴定出LKB1突变的肿瘤的非限制性例示性列表。第一栏显示肿瘤起源的原发性组织。第二栏指示具有LKB1变异的该类型的独特样品的数目。第三栏指示该类型的独特样品的总数。第四栏指示已经鉴定为具有LKB1变异的该类型的肿瘤的百分比。
表2
原发性组织 独特的突变样品 总共独特样品 ％突变的
胃肠道(位点不确定) 5 21 23.81
宫颈 29 214 13.55
小肠 1 10 10
肺 236 2809 8.4
皮肤 15 306 4.9
胆管 1 39 2.56
睾丸 1 45 2.22
胃 9 475 1.89
大肠 14 1095 1.28
肝 1 81 1.23
胰腺 6 557 1.08
食道 1 111 0.9
前列腺 2 336 0.6
上呼吸消化道 1 176 0.57
泌尿道 1 176 0.57
造血和淋巴样组织 4 803 0.5
乳腺 3 615 0.49
肾 2 487 0.41
卵巢 3 827 0.36
虽然本文中描述的变异是在表2中指示的肿瘤类型中鉴定的，但是可以常规筛选其它类型的癌症以测定这些变异中的任一种是否在那些癌症中发生。本发明的方法可应用于包含LKB1中的变异的任何癌症，无论变异是否是表1中列出的一种。
根据任何上述方法，核苷酸变异可以是体细胞突变或种系多态性。
B.组合物
在一些实施方案中，提供了等位基因特异性寡核苷酸，其与LKB1多核苷酸中包含核苷酸变异(例如替代)的区域杂交。在一些实施方案中，核苷酸变异在选自表1的核苷酸位置处。在一些实施方案中，核苷酸变异是选自表1的核苷酸变化。等位基因特异性寡核苷酸在与LKB1多核苷酸的区域杂交时包含与核苷酸变异碱基配对的核苷酸。在一些实施方案中，提供了等位基因特异性寡核苷酸的互补物。在一些实施方案中，微阵列包含一种或多种等位基因特异性寡核苷酸和/或其互补物。在一些实施方案中，等位基因特异性寡核苷酸或其互补物是等位基因特异性引物。
等位基因特异性寡核苷酸可以与如下的对照寡核苷酸联合使用，所述对照寡核苷酸与等位基因特异性寡核苷酸是相同的，只是与核苷酸变异特异性碱基配对的核苷酸用与野生型LKB1多核苷酸中存在的相应核苷酸特异性碱基配对的核苷酸替换。可以在容许寡核苷酸区分包含核苷酸变异的LKB1多核苷酸与包含相应野生型核苷酸的LKB1多核苷酸的杂交条件下在竞争性结合测定法中使用此类寡核苷酸。基于例如寡核苷酸的长度和碱基组成使用常规方法，本领域技术人员可以得到合适的杂交条件，在该杂交条件下(a)相对于野生型LKB1多核苷酸，等位基因特异性寡核苷酸会优先结合包含核苷酸变异的LKB1多核苷酸，并且(b)相对于包含核苷酸变异的LKB1多核苷酸，对照寡核苷酸会优先结合野生型LKB1多核苷酸。例示性的条件包括高严格性的条件，例如5x标准盐水磷酸盐EDTA(SSPE)和0.5％NaDodSO4(SDS)于55℃的杂交条件，接着是于55℃或室温用2XSSPE和0.1％SDS清洗。
在一些实施方案中，例如用放射性同位素、荧光剂、或生色剂可检测标记本文中提供的分离的多核苷酸。在另一个实施方案中，分离的多核苷酸是引物。在另一个实施方案中，分离的多核苷酸是寡核苷酸，例如等位基因特异性寡核苷酸。在另一个实施方案中，寡核苷酸可以是例如长度为7-60个核苷酸，长度为9-45个核苷酸，长度为15-30个核苷酸，或长度为18-25个核苷酸。在另一个实施方案中，寡核苷酸可以是例如PNA、吗啉代-氨基磷酸酯、LNA、或2’-烷氧基烷氧基。本文中提供的寡核苷酸是有用的，例如作为杂交探针用于检测核苷酸变异。
在另一个方面，提供了结合剂，其相对于野生型LKB1优先结合包含氨基酸变异的LKB1。在一些实施方案中，氨基酸变异在选自图2的氨基酸位置处。在一些实施方案中，氨基酸变异是选自图2的氨基酸变化。在一些实施方案中，结合剂是抗体。
在一些实施方案中，提供了诊断试剂盒。在一些实施方案中，试剂盒包含任何前述多核苷酸。在一些实施方案中，试剂盒进一步包含酶。在一些实施方案中，酶是至少一种选自核酸酶、连接酶、和聚合酶的酶。在一些实施方案中，试剂盒包含任何前述结合剂。
C.治疗和诊断方法
已经在许多散发性癌症(包括例如非小细胞肺癌和表2中显示的癌症)中找到了LKB1中的体细胞突变。本发明人已经发现了包含失活LKB1基因的肺和胰腺组织比野生型组织在存在EGF的情况中显示实质上更多的生长。此外，通过EGFR抑制剂有效抑制包含失活LKB1基因的组织中EGF诱导的生长。
因而，在一些实施方案中，提供了用于预测癌症对EGFR抑制剂的响应性的方法，所述方法包括测定癌症中LKB1突变的存在，其中癌症中LKB1突变的存在指示癌症会响应用EGFR抑制剂的治疗。在一些实施方案中，提供了鉴定可能受益于EGFR抑制剂的癌症患者的方法，其包括测定患者的癌症是否包含LKB1突变，其中LKB1突变的存在指示癌症患者可能会受益于EGFR抑制剂。在一些实施方案中，提供了为癌症患者选择疗法的方法，其包括(a)测定患者的癌症是否包含LKB1突变；并且(b)若患者的癌症包含LKB1突变，则为疗法选择EGFR抑制剂。
在一些实施方案中，LKB1突变包含LKB1多核苷酸中的变异。例示性变异包括但不限于插入、删除、倒位、和替代，并且可以在LKB1编码序列中或在基因的非编码区中发生。在一些实施方案中，LKB1多核苷酸中的变异是选自表1的核苷酸位置处的核苷酸变异。在一些实施方案中，LKB1多核苷酸中的变异是选自表1的核苷酸变化。在一些实施方案中，LKB1突变是LKB1基因的删除。
LKB1多核苷酸中的变异可以导致LKB1多肽中的变异。此类变异包括但不限于插入、替代、删除、和截短。在一些实施方案中，LKB1多肽中的变异是选自表1的氨基酸位置处的变异。在一些实施方案中，LKB1多肽中的变异是选自表1的氨基酸变化。
在一些实施方案中，癌症选自大细胞癌、类癌肿瘤、神经内分泌起源的肿瘤、头和颈鳞状细胞癌(HNSCC)、结肠直肠癌、宫颈癌、黑素瘤、皮肤癌、平滑肌瘤、胃癌、成胶质细胞瘤、卵巢癌、小细胞肺癌(SCLC)、非小细胞肺癌(NSCLC)、胰腺癌、食道癌、胃癌和甲状腺癌。在一些实施方案中，癌症选自表2中列出的癌症。在一些实施方案中，癌症选自肺癌、胰腺癌、结肠直肠癌、和头和颈癌。
测定癌症(即自癌症采集的样品，或者通过任何手段(诸如通过活组织检查或作为循环癌细胞)自癌症分离的细胞)中LKB1突变的存在的方法是本领域中已知的。例如，使用实时PCR检测LKB1基因中的特定突变的测定法是已知的(可购自Qiagen,Valencia,CA)。
例如，核酸可以是基因组DNA、自基因组DNA转录的RNA、或自RNA生成的cDNA。核酸可以自脊椎动物(例如哺乳动物)衍生。若自特定来源直接获得核酸或者若核酸是所述来源中找到的核酸的拷贝，则它被说成自所述来源“衍生”。
可以通过对于本领域技术人员已知的某些方法检测核酸和氨基酸序列中的变异。此类方法包括但不限于DNA测序；引物延伸测定法，包括等位基因特异性核苷酸掺入测定法和等位基因特异性引物延伸测定法(例如等位基因特异性PCR、等位基因特异性连接链式反应(LCR)、和缺口-LCR)；等位基因特异性寡核苷酸杂交测定法(例如寡核苷酸连接测定法)；切割保护测定法，其中使用针对切割剂的保护检测核酸双链体中的错配碱基；MutS蛋白结合的分析；比较变体和野生型核酸分子的迁移率的电泳分析；变性梯度凝胶电泳(DGGE，如在例如Myersetal.(1985)Nature313:495中的)；错配碱基对处的RNA酶切割分析；对异源双链体DNA的化学或酶促切割的分析；质谱术(例如MALDI-TOF)；遗传位分析(geneticbitanalysis,GBA)；5’核酸酶测定法(例如)；和采用分子灯塔(beacon)的测定法。在下文更为详细讨论了这些中的某些方法。
可以使用本领域中公知的技术通过对靶核酸的分子克隆和测序来实现靶核酸中变异的检测。或者，可以使用扩增技术(诸如聚合酶链式反应(PCR))从来自肿瘤组织的基因组DNA制备物直接扩增靶核酸序列。然后，可以测定扩增序列的核酸序列，并且自其鉴定变异。扩增技术是本领域中公知的，例如，聚合酶链式反应记载于Saikietal.,Science239:487,1988；美国专利No.4,683,203和4,683,195中。
也可以使用本领域中已知的连接酶链式反应来扩增靶核酸序列。见例如Wuetal.,Genomics4:560-569(1989)。另外，也可以使用称为等位基因特异性PCR的技术来检测变异(例如替代)。见例如RuanoandKidd(1989)NucleicAcidsResearch17:8392；McClayetal.(2002)AnalyticalBiochem.301:200-206。在此技术的某些实施方案中，使用等位基因特异性引物，其中引物的3’端核苷酸与靶核酸中的特定变异互补(即能够与其特异性碱基配对)。若不存在特定变异，则没有观察到扩增产物。也可以使用扩增耐受突变系统(ARMS)来检测变异(例如替代)。ARMS记载于例如欧洲专利申请公开文本No.0332435及Newtonetal.,NucleicAcidsResearch,17:7,1989。
可用于检测变异(例如替代)的其它方法包括但不限于(1)等位基因特异性核苷酸掺入测定法，诸如单碱基延伸测定法(见例如Chenetal.(2000)GenomeRes.10:549-557；Fanetal.(2000)GenomeRes.10:853-860；Pastinenetal.(1997)GenomeRes.7:606-614；及Yeetal.(2001)Hum.Mut.17:305-316)；(2)等位基因特异性引物延伸测定法(见例如Yeetal.(2001)Hum.Mut.17:305-316；及Shenetal.GeneticEngineeringNews,vol.23,Mar.15,2003)，包括等位基因特异性PCR；(3)5’核酸酶测定法(见例如DeLaVegaetal.(2002)BioTechniques32:S48-S54(其描述了测定法)；Ranadeetal.(2001)GenomeRes.11:1262-1268；及Shi(2001)Clin.Chem.47:164-172)；(4)采用分子灯塔的测定法(见例如Tyagietal.(1998)NatureBiotech.16:49-53；及Mhlangaetal.(2001)Methods25:463-71)；和(5)寡核苷酸连接测定法(见例如Grossmanetal.(1994)Nuc.AcidsRes.22:4527-4534；专利申请公开文本No.US2003/0119004A1；PCT国际公开文本No.WO01/92579A2；及美国专利No.6,027,889)。
也可以通过错配检测方法检测变异。错配是并非100％互补的杂交核酸双链体。总体互补性的缺乏可以是由删除、插入、倒位、或替代所致。错配检测方法的一个例子是错配修复检测(MRD)测定法，其记载于例如Fahametal.,Proc.NatlAcad.Sci.USA102:14717-14722(2005)和Fahametal.,Hum.Mol.Genet.10:1657-1664(2001)。错配切割技术的另一个例子是RNA酶保护方法，其详细记载于Winteretal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82:7575,1985，及Myersetal.,Science230:1242,1985。例如，本发明的方法可以牵涉使用与人野生型靶核酸互补的经标记核糖核酸探针。将核糖核酸探针和自组织样品衍生的靶核酸退火(杂交)在一起，随后用能够检测双链体RNA结构中的一些错配的酶RNA酶A消化。若RNA酶A检测到错配，则它在错配位点处切割。如此，退火RNA制备物在电泳凝胶基质上分开时，若错配已被检出并受到RNA酶A切割，则会看到比核糖核酸探针和mRNA或DNA的全长双链体RNA要小的RNA产物。核糖核酸探针不需要是靶核酸全长，而是可以是靶核酸的一部分，只要它涵盖怀疑具有变异的位置。
以类似的方式，可以使用DNA探针来检测错配，例如经由酶促或化学切割。见例如Cottonetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85:4397,1988；及Shenketal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,72:989,1975。或者，可以通过错配双链体相对于匹配双链体的电泳迁移率迁移来检测错配。见例如Cariello,HumanGenetics,42:726,1988。凭借核糖核酸探针或DNA探针，可以在杂交前扩增怀疑包含变异的靶核酸。也可以使用Southern杂交来检测靶核酸中的变化，尤其在变化是大体(gross)重排(诸如删除和插入)时。
可以使用针对靶核酸或周围标志物基因的限制片段长度多态性(RFLP)探针来检测变异，例如插入或删除。也可以通过克隆、测序和扩增靶核酸来检测插入和删除。也可以使用单链构象多态性(SSCP)分析来检测等位基因的碱基变化变体。见例如Oritaetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:2766-2770,1989，及Genomics,5:874-879,1989。
本发明还提供了多种适合于用于实施本发明方法的组合物。例如，本发明提供了可以在此类方法中使用的阵列。在一些实施方案中，本发明的阵列包含可用于检测变异的核酸分子的个体或集合。例如，本发明的阵列可以包含一系列离散放置的等位基因特异性寡核苷酸个体或等位基因特异性寡核苷酸套组。本领域中公知用于将核酸附着于固体基片(诸如玻璃载玻片)的数种技术。一种方法是将含有能够附着于固体基片的反应性模块(诸如胺基基团、胺基基团的衍生物、或具有正电荷的另一种基团)的经修饰的碱基或类似物掺入合成的核酸分子中。然后，使合成的产物与用醛或其它反应性基团包被的固体基片(诸如玻璃载玻片)接触。醛或其它反应性基团会与扩增产物上的反应性模块形成共价连接，所述扩增产物会变得共价附着于玻璃载玻片。其它方法(诸如那些使用氨基丙基硅胶(aminoproprylsilican)表面化学的)也是本领域中已知的。
依照任何上述方法，可以使用任何合适的生物学样品(使用本领域技术人员已知的某些方法获得)测定癌症中LKB1突变的存在。可以自脊椎动物(特别是哺乳动物)获得生物学样品。常常使用组织活组织检查来获得肿瘤组织的代表性部分。或者，可以以已知或认为含有感兴趣肿瘤细胞的组织或流体形式间接获得肿瘤细胞。例如，可以通过切除术、支气管镜检查、细针抽吸、支气管刷检，或者自痰、胸膜液或血液获得肺癌损伤的样品。可以自肿瘤样品或者自其它身体样品(诸如尿、痰或血清)检测靶核酸(或编码的多肽)中的变异。癌细胞自肿瘤脱落，并且在此类身体样品中出现。通过筛选此类身体样品，可以对疾病(诸如癌症)实现简单早期诊断。另外，可以通过对此类身体样品测试靶核酸(或编码的多肽)中的变异更容易地监测疗法的进展。另外，用于对组织制备物富集肿瘤细胞的方法是本领域中已知的。例如，可以自石蜡或低温恒温器切片分离组织。也可以通过流式细胞术或激光捕捉显微解剖分开癌细胞与正常细胞。
在一些实施方案中，提供了治疗具有包含LKB1突变的癌症的哺乳动物的方法，其包括对哺乳动物施用治疗有效量的EGFR抑制剂。
在一些实施方案中，提供了治疗哺乳动物中的癌症的方法，其包括(a)测定癌症是否包含LKB1突变；并且(b)若癌症包含LKB1突变，则对哺乳动物施用治疗有效量的EGFR抑制剂。
在一些实施方案中，提供了治疗包含LKB1突变的癌症的方法，其中所述方法包括对具有癌症的哺乳动物施用治疗有效量的EGFR抑制剂，其中在施用EGFR抑制剂前，癌症测定为具有LKB1突变。
本文中的本发明的另一个方面提供了用于治疗具有展现LKB1基因中的突变的一类癌症的哺乳动物的方法，其包括对哺乳动物施用治疗有效量的EGFR抑制剂。
在任何前述实施方案中，哺乳动物可以是人。
在一些实施方案中，EGFR抑制剂是结合EGFR的抗体。在一些实施方案中，EGFR抑制剂是结合EGFR的小分子。在一些实施方案中，EGFR抑制剂选自厄洛替尼、西妥昔单抗、帕尼单抗、拉帕替尼、DL11f、和GA201。
依照已知的方法(诸如静脉内施用，例如以推注或者通过在一段时间里连续输注，通过肌肉内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、口服、表面、或吸入路径)对哺乳动物(诸如人患者)施用EGFR抑制剂。抗体的静脉内施用是优选的。
对于预防或治疗癌症，EGFR抑制剂的剂量会取决于要治疗的癌症的类型(如上文定义的)、癌症的严重性和过程、抗体是为了预防还是治疗目的施用、先前疗法、患者的临床史和对药物的响应、和主治内科医生的判断。
在一些实施方案中，施用固定剂量的抑制剂。可以一次性或在一系列治疗里对患者适当施用固定剂量。在施用固定剂量的情况中，优选地，它在约20mg至约2000mg抑制剂的范围中。例如，固定剂量可以是大约420mg、大约525mg、大约840mg、或大约1050mg抑制剂。
在施用一系列剂量的情况中，这些可以例如大约每周、大约每2周、大约每3周、或大约每4周，但是优选大约每3周施用。例如，可以继续施用固定剂量，直至疾病进展、不利事件、或由内科医生确定的其它时间。例如，可以施用自约2、3、或4直至约17或更多个固定剂量。
在一些实施方案中，施用一个或多个加载剂量的抗体，接着是一个或多个维持剂量的抗体。在另一个实施方案中，对患者施用多个相同剂量。
虽然可以作为单一抗肿瘤剂施用EGFR抑制剂，但是任选用抑制剂和一种或多种化疗剂的组合治疗患者。
可以与抑制剂和/或化疗剂组合的其它治疗剂包括下列任一种或多种：第二种不同HER抑制剂、HER二聚化抑制剂(例如生长抑制性HER2抗体，诸如曲妥珠单抗(trastuzumab)，或诱导HER2过表达细胞凋亡的HER2抗体，诸如7C2、7F3或其人源化变体)；针对不同肿瘤相关抗原(诸如EGFR、HER3、HER4)的抗体；抗激素化合物，例如抗雌激素化合物，诸如他莫昔芬，或芳香酶抑制剂；保心药(用于预防或减轻与疗法有关的任何心肌功能障碍)；细胞因子；EGFR靶向性药物(诸如或)；抗血管生成剂(尤其是在商标AVASTINTM下由Genentech出售的贝伐单抗)；酪氨酸激酶抑制剂；COX抑制剂(例如COX-1或COX-2抑制剂)；非类固醇消炎药，塞来昔布(celecoxib)法呢基转移酶抑制剂(例如可购自JohnsonandJohnson的Tipifarnib/R115777或可购自Schering-Plough的LonafarnibSCH66336)；结合癌胚蛋白CA125的抗体，诸如Oregovomab(MoAbB43.13)；HER2疫苗(诸如来自Pharmexia的HER2AutoVac疫苗，或来自Dendreon的APC8024蛋白质疫苗，或来自GSK/Corixa的HER2肽疫苗)；另一种HER靶向疗法(例如曲妥珠单抗、西妥昔单抗、ABX-EGF、EMD7200、吉非替尼、厄洛替尼、CP724714、CI1033、GW572016、IMC-11F8、TAK165、等)；Raf和/或ras抑制剂(见例如WO2003/86467)；盐酸多柔比星脂质体注射液拓扑异构酶I抑制剂，诸如托泊替康(topotecan)；紫杉烷；HER2和EGFR双重酪氨酸激酶抑制剂，诸如拉帕替尼/GW572016；TLK286EMD-7200；治疗恶心的药物，诸如血清素拮抗剂、类固醇、或苯二氮杂卓(benzodiazepine)；预防或治疗皮疹的药物或标准痤疮疗法，包括表面或口服抗生素；治疗或预防腹泻的药物；体温降低药物，诸如醋氨酚(acetaminophen)、苯海拉明(diphenhydramine)、或哌替啶(meperidine)；造血生长因子、等。
适合于任何上述共施用药剂的剂量是那些目前使用的，并且可以由于药剂和抑制剂的组合作用(协同)而降低。
在上述治疗方案外，患者可以经受癌细胞的手术除去和/或放射疗法。
在抑制剂是抗体的情况中，优选地，施用的抗体是裸抗体。然而，施用的抑制剂可以与细胞毒剂缀合。优选地，缀合的抑制剂和/或其结合的抗原被细胞内在化，导致缀合物在杀死其结合的癌细胞方面升高的治疗功效。在一个优选的实施方案中，细胞毒剂靶向或干扰癌细胞中的核酸。此类细胞毒剂的例子包括美登木素生物碱(maytansinoids)、加利车霉素(calicheamicins)、核糖核酸酶和DNA内切核酸酶。
本申请涵盖通过基因疗法施用抑制剂。见例如1996年3月14日公布的WO96/07321，其关注使用基因疗法来生成胞内抗体。
使核酸(任选地包含在载体中)进入患者的细胞中有两种主要办法，体内和离体。对于体内投递，通常在需要抗体的部位处，将核酸直接注射入患者。对于离体治疗，取出患者的细胞，将核酸导入这些分离的细胞中，并且将经修饰的细胞施用于直接患者或者例如在植入患者中的多孔膜内封装(见例如美国专利No.4,892,538和5,283,187)。有多种技术可用于将核酸导入活细胞中。技术随在体外入培养细胞中还是在体内入意图宿主的细胞中转移核酸而变化。适合于在体外将核酸转移入哺乳动物细胞中的技术包括使用脂质体、电穿孔、显微注射、细胞融合、DEAE-右旋糖苷、磷酸钙沉淀方法、等。用于离体投递基因的一种常用载体是逆转录病毒。
目前优选的体内核酸转移技术包括用病毒载体(诸如腺病毒、单纯疱疹I病毒、或腺伴随病毒)和基于脂质的系统(例如，可用于脂质介导的基因转移的脂质是DOTMA、DOPE和DC-Chol)的转染。在一些情况中，期望给核酸来源提供靶向靶细胞的药剂，诸如对细胞表面膜蛋白或靶细胞特异性的抗体、靶细胞上的受体的配体、等。在采用脂质体的情况中，可以使用结合与胞吞有关的细胞表面膜蛋白的蛋白质进行靶向和/或促进摄取，例如对特定细胞类型向性的衣壳蛋白或其片段、针对在循环中经历内在化的蛋白质的抗体、和靶向胞内定位并增强胞内半衰期的蛋白质。受体介导的胞吞的技术例如记载于Wuetal.,J.Biol.Chem.262:4429-4432(1987)；及Wagneretal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:3410-3414(1990)。关于目前已知的基因标记和基因疗法方案的综述，见Andersonetal.,Science256:808-813(1992)。还可见WO93/25673及其中引用的参考文献。
D.制品
在一些实施方案中，提供了装有可用于治疗上文描述的疾病或状况的材料的制品。制品包含容器和容器上或与容器联合的标签或包装插页。合适的容器包括例如瓶、管形瓶、注射器、等。容器可以由多种材料(诸如玻璃或塑料)形成。容器容纳或装有有效治疗选择的疾病或状况的组合物，并且可以具有无菌存取口(例如容器可以是具有皮下注射针可刺穿的塞的静脉内溶液袋或管形瓶)。组合物中的至少一种活性剂是EGFR抑制剂。
制品可以进一步包含第二容器，其装有药学可接受稀释剂缓冲液，诸如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液和右旋糖溶液。制品可以进一步包含从商业和用户立场看期望的其它材料，包括其它缓冲剂、稀释剂、滤器、针、和注射器。
本发明的试剂盒和制品还包含例如包装插页或标签形式的信息，其指示使用组合物来治疗癌症，其中患者的癌症包含LKB1突变。插页或标签可以采用任何形式，诸如纸或在电子介质(诸如磁记录介质(例如软盘)或CD-ROM)上。标签或插页还可以包含关注试剂盒或制品中的药物组合物和剂量形式的其它信息。
一般地，此类信息帮助患者和内科医生有效且安全地使用封装的药物组合物和剂量形式。例如，可以在插页中提供关于EGFR抑制剂的下述信息：药动学、药效学、临床研究、功效参数、适应症和用法、禁忌、警告、防范、不良反应、过量用药、合适的剂量和施用、如何供应、合适的贮存条件、参考文献和专利信息。
在本发明的一个具体的实施方案中，提供了制品，其包含包装在一起的在药学可接受载体中包含EGFR抑制剂的药物组合物和叙述指示抑制剂或药物组合物用于治疗具有能够响应EGFR抑制剂的癌症类型的患者的标签，其中患者的癌症包含LKB1基因中的突变，如本文中描述的。
在此方面的一个任选实施方案中，本文中的制品可以进一步包含装有第二药物的容器，其中EGFR抑制剂是第一药物，并且该制品进一步包含关于以有效量用第二药物治疗患者的包装插页上的用法说明。第二药物可以是上文列出的那些中的任一种。
包装插页在容器上或与容器联合。合适的容器包含例如瓶、管形瓶、注射器、等。容器可以由多种材料(诸如玻璃或塑料)形成。容器容纳或装有有效治疗癌症类型的组合物，可以具有无菌存取口(例如容器可以是具有皮下注射针可刺穿的塞的管形瓶或静脉内溶液袋)。组合物中的至少一种活性剂是EGFR抑制剂。标签或包装插页指示组合物用于治疗符合用特定指导治疗的受试者中的癌症，所述指导关于提供的抑制剂和任何其它药物的给药量和时间间隔。制品可以进一步包含另外的容器，其装有药学可接受稀释剂缓冲液，诸如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液、和/或右旋糖溶液。制品可以进一步包含从商业和用户立场看期望的其它材料，包括其它缓冲剂、稀释剂、滤器、针、和注射器。
通过下述非限制性实施例例示了本发明的更多详情。通过提及将说明书中的所有引文的公开内容明确收入本文。
III.实施例
A.材料和方法
Lkb1载体构建
使用重组工程(Warmingetal.,2005,Nucl.AcidsRes.33:e36)生成用于靶向C57BL/6Stk11(LKB1)基因座的构建体。在将来自C57BL/6BAC(RP23文库)的含有Lkb1的基因组片段恢复入pBlight-TK后，用GTT-GGG-GAA-TAT-TGC-GTA替换外显子3内的序列GTG-ATG-GAG-TAC-TGC-GTA以将Met129改变成甘氨酸，并且用SspI位点替换ScaI。然后，将侧翼有loxp的新霉素盒引入内含子2中。通过DNA测序确认最终载体，并将其线性化。用标准方法靶向C57BL/6C2胚胎干细胞，并且用Cre转染阳性克隆以除去新霉素盒。然后，将经修饰的胚胎干细胞注射入胚泡中，并且通过杂交嵌合物与C57BL6雌性获得种系传递。
外植体培养
从自定时妊娠设置收获的胚胎解剖出胰腺和单个的肺叶。在具有0.4μm聚酯膜插入物(Corning,Tewsbury,MA)的12mm上在含10％胎牛血清、谷氨酰胺和青霉素-链霉素的DME培养基中在空气-液体界面培养胚胎外植体。对更长期的培养(>3天)，每日更换培养基。
对于无间充质培养，解剖肺，并且将其于室温在胶原酶/分散酶(各1mg/ml)中温育10-15分钟。通过机械解剖取出上皮组织，将其转移至板，并用5-10μl1:1基质胶:DME覆盖。在固化基质胶后，添加400μl培养基(DME/10％FCS/谷氨酰胺/青霉素-链霉素+200ng/mlFGF7(LifeTechnologies,Carlsbad,CA)、FGF1(LifeTechnologies)、或EGF(LifeTechnologies))至顶部和顶部孔。如指示的那样添加厄洛替尼(1μM盐酸盐；OSIPharmaceuticals)或DMSO。
整装免疫荧光
在4％低聚甲醛中固定胚胎外植体，将其在含2％BSA、0.1％皂角苷或0.1％Triton-X100的PBS中透化。在清洗后，用抗-E-钙粘蛋白(SantaCruz)染色组织。封固外植体，并用LeicaSP5激光共焦显微镜成像。显示的图像代表用同窝外植体(littermateexplant)进行的多个独立实验(n≥5)，所述同窝外植体在基本上相同的条件和设置下培养、染色和成像。
Western印迹
使用PhosphoSafeTM提取试剂(EMDMillipore)和超声处理裂解组织。通过BCA测定法(Pierce)测定组织和细胞裂解物的蛋白质浓度。将LDS样品缓冲液+β-巯基乙醇中的样品加热至95℃达5分钟，之后使用4-12％BisTris凝胶(Invitrogen)通过电泳分开。将蛋白质转移至硝酸纤维素膜过夜，并在含0.1％Tween和5％Blotto的Tris缓冲盐水(TBS)缓冲液中封闭膜，之后于4℃在含0.1％Tween和2％BSA的TBS缓冲液中与一抗一起温育过夜。用缀合有HRP的二抗和ECL试剂(Pierce)检测一抗(EGF受体(D38B1)家兔单抗，磷酸-EGF受体(Tyr845)(D63B4)家兔单抗，磷酸-EGF受体(Tyr1173)(53A5)家兔单抗，细胞周期蛋白D1(92G2)家兔单抗，都来自CellSignalingTechnology；和抗肌动蛋白抗体)。显示的实验代表多个独立的实验(n≥3)。
B.结果
小鼠中LKB1中的纯合种系突变是早期胚胎致死的。因此，使用一种化学遗传方法学设计可以通过添加细胞通透性、不可水解的ATP类似物(NMPP1)等特异性抑制的等位基因(Bishopetal.,2000,Nature,407:393-401；Bishopatal.,2000,Ann.Rev.Biophys.Biomol.Struct.29:557-606)。将此等位基因(Lkb1MG)“敲入”内源LKB1基因座以生成遗传工程化小鼠系，其已经在别处详细描述(Loetal.,2012,J.Cell.Biol.,199:1117-1130)。解剖来自Lkb1MG/MG胚胎和野生型同窝幼仔的肺和胰腺组织，并且将它们在体外培养数天。以整装外植体和“无间充质”(其中从肺上皮剥离大部分间充质和其它组织类型，并在基质胶中培养上皮)两者培养肺培养物(Luetal.,2005,J.Biol.Chem.,280:4834-4841)。在此时间期间，评估这些组织对生长因子的响应。
与无生长因子相比，在NMPP1抑制剂存在下将EGF(100ng/ml)添加至自Lkb1wt/wt衍生的无间充质外植体导致适度的生长增加。相反，在NMPP1存在下将EGF添加至Lkb1MG/MG导致实质性生长(图1)，这指示在无间充质外植体中抑制LKB1导致升高的对EGF的响应性。在整装培养物中看到类似的结果(图2)。在此情况中，EGF的添加导致培养的Lkb1MG/MG肺的末端芽的实质性扩大和LKB1wt/wt肺中仅适度的大小增加。在整装和无间充质培养物两者中，EGF诱导的生长通过添加厄洛替尼(1μM)得到抑制。
比较而言，成纤维细胞生长因子(FGF)-1或FGF-7的添加在NMPP1存在和缺失下导致自LKB1wt/wt和LKB1MG/MG两者衍生的无间充质肺培养物的有力生长，尽管上皮组织结构在LKB1受到抑制时展现出较少的分支。
为了评估此响应性变化是否是由于EGFR表达的差异水平所致，通过Western印迹测量EGFR蛋白质水平。发现EGFR水平在NMPP1存在或缺失下在LKB1wt/wt和LKB1MG/MG肺两者中是相似的。此外，在位点Y1173、Y1068、和Y845处的EGFR磷酸化(其在添加EGF的10分钟内发生)表现为未改变(图3)。如此，培养物对EGF的响应性不是升高的EGFR表达的结果。
在胰腺中鉴定出LKB1在调控EGF信号传导中的类似作用。先前，我们已经显示了在自晚期阶段胚胎收获的胰腺外植体中抑制Lkb1激酶活性显著促进囊肿形成(Loetal.,2012,J.Cell.Biol.,199:1117-1130)。在此实验系统中，EGF(100ng/ml)的添加加速由Lkb1抑制诱导的囊肿表型的形成(图4)。然而，在EGF存在和缺失下形成的囊肿是形态学上不能区分的，并且在Lkb1抑制缺失下，EGF自身不促进囊肿(图5)。另外，胰腺囊肿形成似乎需要EGFR信号传导，因为厄洛替尼(1μM)抑制囊肿表型的形成(图6)。
我们已经显示了LKB1活性改变肺和胰腺上皮细胞对EGF的响应性。由于已知EGF信号传导是一些癌症中的至关重要途径，因此LKB1突变状态应当在评估此途径对某些靶向疗法(特别是EGFR靶向疗法)的易损性或抗性中提供信息。如通过上述实验显示的，会预测癌症中的LKB1突变提高癌症对EGF的响应性，并且因此会预测此类癌症较好响应EGFR抑制剂，诸如那些在本文中描述的。
虽然为了理解清楚的目的通过例示和实施例已经较为详细地描述了前述发明，但是描述和实施例不应解释为限制本发明的范围。通过提及明确完整收录本文中引用的所有专利和科学文献的公开内容。
IV.序列的表格

Claims (25)

1.一种用于预测癌症是否会响应EGFR抑制剂的方法，其包括测定所述癌症是否包含LKB1突变，其中所述LKB1突变的存在指示所述癌症会响应所述EGFR抑制剂。
2.一种鉴定可能受益于EGFR抑制剂的癌症患者的方法，其包括测定所述患者的癌症是否包含LKB1突变，其中所述LKB1突变的存在指示所述癌症患者可能会受益于所述EGFR抑制剂。
3.一种为癌症患者选择疗法的方法，其包括(a)测定所述患者的癌症是否包含LKB1突变；并且(b)若所述患者的癌症包含LKB1突变，则为所述疗法选择EGFR抑制剂。
4.一种治疗哺乳动物中的癌症的方法，其包括(a)测定所述癌症是否包含LKB1突变；并且(b)若所述癌症包含LKB1突变，则对所述哺乳动物施用治疗有效量的EGFR抑制剂。
5.一种治疗哺乳动物中包含LKB1突变的癌症的方法，其包括对所述具有癌症的哺乳动物施用治疗有效量的EGFR抑制剂。
6.权利要求4的方法，其中在施用所述EGFR抑制剂前，所述癌症测定为包含LKB1突变。
7.前述权利要求中任一项的方法，其中所述癌症是实体瘤。
8.权利要求7的方法，其中所述癌症选自大细胞癌、类癌癌、神经内分泌起源的癌症、头和颈鳞状细胞癌(HNSCC)、结肠直肠癌、宫颈癌、黑素瘤、皮肤癌、平滑肌瘤、胃癌、成胶质细胞瘤、卵巢癌、小细胞肺癌(SCLC)、非小细胞肺癌(NSCLC)、胰腺癌、食道癌、胃癌和甲状腺癌。
9.权利要求7的方法，其中所述癌症选自肺癌、胰腺癌、结肠直肠癌、和头和颈癌。
10.权利要求1至6中任一项的方法，其中所述癌症在选自表2中组织的组织中。
11.前述权利要求中任一项的方法，其中所述LKB1突变包含LKB1多核苷酸中的变异。
12.权利要求11的方法，其中所述LKB1多核苷酸中的变异在LKB1多核苷酸的编码序列中。
13.权利要求11或权利要求12的方法，其中所述LKB1多核苷酸中的变异包含至少一种选自插入、删除、倒位、和替代的变异。
14.权利要求11至13中任一项的方法，其中所述LKB1多核苷酸中的变异导致LKB1编码序列中的移码。
15.权利要求11至14中任一项的方法，其中所述LKB1多核苷酸中的变异导致LKB1多肽中的变异。
16.权利要求15的方法，其中所述LKB1多肽中的变异选自插入、替代、删除、和截短。
17.权利要求15或权利要求16的方法，其中所述LKB1多肽中的至少一处变异是选自表1的氨基酸位置处的氨基酸变异，其导致(a)水平显著降低或缺乏的LKB1蛋白质和/或(b)活性显著降低的LKB1蛋白质的表达。
18.权利要求17的方法，其中所述LKB1多肽中的至少一处变异是选自表1的氨基酸变化。
19.权利要求11至16中任一项的方法，其中所述LKB1多核苷酸中的变异是选自表1的核苷酸位置处的核苷酸变异，其导致(a)水平显著降低或缺乏的LKB1蛋白质和/或(b)活性显著降低的LKB1蛋白质的表达。
20.权利要求19的方法，其中所述LKB1多核苷酸中的变异是选自表1的核苷酸变化。
21.前述权利要求中任一项的方法，其中所述哺乳动物是人。
22.前述权利要求中任一项的方法，其中所述EGFR抑制剂是结合EGFR的抗体。
23.前述权利要求中任一项的方法，其中所述EGFR抑制剂是西妥昔单抗(cetuximab)或帕尼单抗(panitumumab)。
24.权利要求1至21中任一项的方法，其中所述EGFR抑制剂是小分子。
25.权利要求1至21中任一项的方法，其中所述EGFR抑制剂是厄洛替尼(erlotinib)或吉非替尼(gefitinib)。
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