ES2335368T3 - Gen de fusion eml4-alk. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para detectar un gen de fusión del gen de la proteína 4 similar a proteína asociada a microtúbulos equinodermos (EML4) y gen de cinasa de linfoma anaplásico (ALK) que comprende la etapa de detectar la presencia de un polinucleótido en una muestra obtenida de un sujeto de prueba, en el que el polinucleótido codifica un polipéptido seleccionado del grupo que está constituido por: (1) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2, 7 ó 130 y que tiene una actividad de cinasa, (2) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2 ó 7 con la deleción, sustitución y/o inserción de 1 a 10 aminoácidos y que tiene una actividad de cinasa, (3) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos con el 90% o más de identidad con la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2 ó 7 y que tiene una actividad de cinasa, y (4) un polipéptido que está constituido por la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2, 7 ó 130.
Description
Gen de fusión EML4-ALK.
La presente invención se refiere a un
polipéptido como proteína de fusión novedosa, a un procedimiento
para detectar la proteína de fusión o a un polinucleótido que
codifica el polipéptido y materiales relacionados.
Hasta ahora se conocen varios genes relacionados
con el cáncer. En particular, se ha mostrado que los genes de
tirosina cinasa, que codifican importantes enzimas que regulan
directamente el crecimiento celular, se activan incluso por
sustitución o deleción en secuencias de aminoácidos y así provocan
carcinogénesis.
Por ejemplo, NPM-ALK, los genes
de fusión que codifican NPM fusionada con la tirosina cinasa ALK, se
observan en más de la mitad de los casos de linfoma anaplásico de
células grandes (LACG) y se ha mostrado que la activación de la
cinasa ALK es importante para el crecimiento de células tumorales
por NPM-ALK (documentos de no patente 25 y 14).
Se ha informado la presencia de un nuevo tipo de
cinasa anormal que se encuentra en aproximadamente el 10% de los
casos de cáncer de pulmón y, sin embargo, este informe no ha hecho
referencia a moléculas específicas (documento de no patente 2).
En 2000 se informó EML4 (proteína 4 similar a
proteína asociada a microtúbulos equinodermos) (documento de no
patente 3). La proteína EML4 tiene una región básica en el extremo
amino, y adicionalmente tiene dominios WD en el extremo carboxilo
(documento de no patente 8). Se conocen poco las funciones
fisiológicas de EML4.
Por otra parte, la ALK (cinasa de linfoma
anaplásico) (documento de no patente 4) es tirosina cinasa
receptora (documento de no patente 5).
La expresión de ALK de longitud completa se ha
informado hasta ahora en algunas células cancerosas de origen
ectodérmico tales como neuroblastoma, glioblastoma, cáncer de mama y
melanoma (no se ha observado la expresión de ALK de longitud
completa en células cancerosas de orígenes endodérmicos y
mesodérmicos) (documento de no patente 13). La ALK de longitud
completa se expresa en muchas líneas celulares de neuroblastoma. Sin
embargo, la autofosforilación de ALK no se observa en estas líneas
celulares de neuroblastoma. Además, a partir del análisis de
cohorte de pacientes con neuroblastoma se ha informado que la
expresión de ALK está débilmente asociada al cáncer. Se ha sugerido
que la expresión de ALK en neuroblastoma puede reflejar su expresión
en diferenciación neural normal, en vez de su asociación a cáncer
(documento de no patente 10). Por otra parte, en casos informados,
ligandos tales como pleiotrofina y midcina, además de la
amplificación génica de la propia ALK, aumentan la
autofosforilación de ALK y movilizan señales intracelulares. También
se ha informado que la ALK puede contribuir al crecimiento de
células cancerosas (documento de no patente 12).
En algunos casos de linfoma maligno humano y
tumor miofibroblástico inflamatorio se ha informado que el gen ALK
está fusionado a otros genes (NPM, CLTCL, TFG, CARS, SEC31L1, etc.)
como resultado de translocalización o inversión cromosómica y así
forma un tipo de fusión de tirosina cinasa (documentos de no patente
9, 11, 14 a 19 y 26 a 28). Además, se ha informado un procedimiento
para identificar una proteína como componente de fusión para ALK
usando anticuerpos de ALK (documento de no patente 6). Por otra
parte, no se ha informado de un gen de fusión de EML4 y ALK. Debido
a que la mayoría de las moléculas tienen un dominio de formación de
complejos, no se ha pensado que la propia proteína de fusión forme
un complejo. Se ha considerado que esta formación de complejos
produce la pérdida de control de la actividad de tirosina cinasa de
ALK e induce carcinogénesis con señales intracelulares anormalmente
activadas (documento de no patente 10). De hecho, se ha informado
que el uso de ARNhc de ALK o compuesto inhibidor de cinasa ALK para
células de linfoma que expresan proteínas de fusión de ALK puede
inducir inhibición del crecimiento celular y muerte celular. Por
tanto, se ha sugerido que la proteína de fusión ALK puede servir de
diana terapéutica para linfoma y tumor miofibroblástico inflamatorio
(documentos de no patente 20 a 22). También se ha sugerido que la
ALK puede servir de diana terapéutica para otros cánceres cuyo
crecimiento implica ALK como se describe anteriormente (documentos
de no patente 21 a 22).
Marzec y col. han informado que
WHI-P131 y WHI-P154 (ambos, EMD
Biosciences), que se han utilizado como sustancias inhibidoras de
tirosina cinasa JAK3, inhiben la actividad de
NPM-ALK (documento de no patente 22). Otro grupo ha
informado que el inhibidor de ALK de bajo peso molecular induce la
muerte celular de líneas celulares de linfoma que expresan
NPM-ALK (documento de no patente 21). Además, hasta
ahora se han notificado varios compuestos de bajo peso molecular
que tienen una actividad inhibitoria contra ALK (documentos de no
patente 23 y 24 y documentos de patente 1 a 3).
\newpage
[Documento de patente 1] Panfleto de documento
WO 2004/080980
[Documento de patente 2] Panfleto de documento
WO 2005/009389
[Documento de patente 3] Panfleto de documento
WO 2005/016894
[Documento de no patente 1] "The New England
journal of medicine", (EE.UU.), 2005, vol. 353, pág.
172-187
[Documento de no patente 2] Proceedings of the
65th Annual Meeting of the Japanese Cancer Association,
O-324 (concedida el 28 de agosto de 2006)
[Documento de no patente 3] número de registro
de GenBank: NM_019063
[Documento de no patente 4] número de registro
de GenBank: AB209477
[Documento de no patente 5] Oncogene. 30 de
enero de 1997; 14 (4): 439-49
[Documento de no patente 6] PNAS 2006 103,
7402-7407
[Documento de no patente 7] "Seminars in
oncology", (EE.UU.), 1993, vol. 20, pág.
105-127
[Documento de no patente 8] "Genomics",
(EE.UU.), 2000, vol. 68, pág. 348-350
[Documento de no patente 9] Oncogene 9:
1567-1574, 1994
[Documento de no patente 10] "Cellular and
molecular life sciences", (Suiza), 2004, vol. 61, pág.
2939-2953
[Documento de no patente 11] Am J Patol 160:
1487-1494, 2002
[Documento de no patente 12] "Journal of
cellular physiology", (EE.UU.), 2004, vol. 199, pág.
330-358
[Documento de no patente 13] "International
journal of cancer", (EE.UU.), 2002, vol. 100, pág.
49-56
[Documento de no patente 14] "Science",
(EE.UU.), 1994, vol. 263, pág. 1281-1284
[Documento de no patente 15] "Blood",
(EE.UU.), 1995, vol. 86, pág. 1954-1960
[Documento de no patente 16] "Blood",
(EE.UU.), 2000, vol. 95, pág. 3204-3207
[Documento de no patente 17] "Blood",
(EE.UU.), 1999, vol. 94, pág. 3265-3268
[Documento de no patente 18] "Laboratory
investigation; a journal of technical methods and pathology",
(EE.UU.), 2003, vol. 83, pág. 1255-1265
[Documento de no patente 19] "International
journal of cancer", (EE.UU.), 2006, vol. 118, pág.
1181-1186
[Documento de no patente 20] "Blood",
(EE.UU.), 2006, vol. 107, pág. 689-697
[Documento de no patente 21] "Blood",
(EE.UU.), 2006, vol. 107, pág. 1617-1623
[Documento de no patente 22] "Laboratory
investigation; a journal of technical methods and pathology",
(EE.UU.), 2005, vol. 85, pág. 1544-1554
[Documento de no patente 23] "Journal of
medicinal chemistry", (EE.UU.), 2006, vol. 49, pág.
1006-1015
[Documento de no patente 24] J Comb Chem. 8:
401-409, 2006
[Documento de no patente 25] "Science",
(EE.UU.), 1997, vol. 278, pág. 1309-1312
[Documento de no patente 26] Am J Patol 157:
377-384, 2000
[Documento de no patente 27] Blood 90:
2901-2910, 1997
[Documento de no patente 28] Am J Patol. 2000
Mar; 156 (3): 781-9.
\newpage
Los presentes inventores aislaron
satisfactoriamente, a partir de muestras obtenidas de pacientes con
cáncer de pulmón, el ADNc y el ADN genómico de un novedoso
polinucleótido de fusión de un gen EML4 parcial fusionado con un
gen ALK parcial como cinasa (denominado en lo sucesivo un
polinucleótido de fusión de EML4-ALK v1), que se
produce por inversión cromosómica (Ejemplos 1, 2, y 4(1)).
Los presentes inventores también aislaron satisfactoriamente el
ADNc y el ADN genómico de un novedoso polinucleótido de fusión
(denominado en lo sucesivo un polinucleótido de fusión de
EML4-ALK v2, polinucleótido de fusión de
EML4-ALK v3) cuyas regiones fusionadas son
diferentes de las del polinucleótido de fusión de
EML4-ALK v1 (Ejemplos 4(1), 3(3),
11(1) y (7)). El análisis usando muestras clínicas mostró
que el polinucleótido de fusión de EML4-ALK v1, el
polinucleótido de fusión de EML4-ALK v2 o el
polinucleótido de fusión de EML4-ALK v3 está
presente en algunos pacientes con cáncer de pulmón (Ejemplo 3 y
11(1)). Por otra parte, debido a que el polinucleótido de
fusión de EML4-ALK es un oncogén que presenta
tumorigenicidad dependiendo de su actividad de cinasa (Ejemplo 6,
10(3) y 11(2)), se reveló que el polipéptido de
fusión de EML4-ALK es una herramienta para cribar un
agente terapéutico para cáncer que se muestra que es positivo para
el polinucleótido de fusión. Basándose en estos hallazgos, los
presentes inventores construyeron un procedimiento para detectar el
polinucleótido de fusión o proteína de fusión en una muestra
obtenida de un sujeto de prueba (Ejemplos 3, 4(2),
5(2), 9, y 11(3)) y, posteriormente, un procedimiento
para cribar un inhibidor del polinucleótido de fusión y/o el
polipéptido de fusión (es decir, un agente terapéutico para cáncer
que se muestra que es positivo para el polinucleótido de fusión)
causante del cáncer (Ejemplos 7, 10(2), 11(4),
11(5) y 11(8)), y se confirmó que los compuestos
obtenidos mediante cribado presentan un efecto antitumoral
(Ejemplos 8(3), 8(7), 8(8),11(6) y
11(9)). Como resultado, un sujeto de prueba en el que se ha
detectado el polinucleótido de fusión puede recibir tratamiento
contra el cáncer usando el inhibidor del polinucleótido de fusión
y/o el polipéptido codificado por el mismo. Según el procedimiento
de detección pueden seleccionarse los sujetos a los que puede
administrarse el agente terapéutico. Como resultado, el cuidado
médico hecho a medida esperado puede llevarse a cabo como
tratamiento altamente eficaz
usando el inhibidor.
usando el inhibidor.
Basándose en estos hallazgos, los presentes
inventores desvelan en este documento un polinucleótido y
polipéptido novedosos útiles como herramientas de cribado, un
procedimiento de cribado y una composición farmacéutica para el
tratamiento del cáncer que se muestra que es positivo para el gen de
fusión del gen EML4 y el gen ALK. Los presentes inventores desvelan
adicionalmente un procedimiento de detección útil en la detección
del cáncer que se muestra que es positivo para el gen de fusión del
gen EML4 y el gen ALK.
Específicamente, la presente invención se
refiere a: procedimientos, kits y conjuntos de cebadores como se
definen en las reivindicaciones.
Ninguno de los documentos anteriormente
mencionados ha informado de la formación de un gen de fusión
mediante el gen EML4 y el gen ALK, y mucho menos la expresión del
gen de fusión del gen EML4 y el gen ALK en algunos pacientes con
cáncer. La formación de un gen de fusión mediante el gen EML4 y el
gen ALK y la expresión de este gen de fusión en algunos pacientes
con cáncer fue encontrada por primera vez por los presentes
inventores. El procedimiento de cribado usando un gen de fusión del
gen EML4 y el gen ALK es una invención que se hizo por primera vez
por los presentes inventores. Además, el procedimiento para detectar
el gen de fusión útil en la detección de cáncer que se muestra que
es positivo para el gen de fusión, el conjunto de cebadores útiles
en esta detección y el kit para la detección son invenciones que se
proporcionaron por primera vez por los hallazgos de los presentes
inventores. Se ha informado de diversos inhibidores de ALK
(documentos de patente 3 a 4 y documentos de no patente 20 a 22 y
34) que incluyen
5-cloro-N^{4}-[2-(isopropilsulfonil)fenil]-N^{2}-{2-metoxi-4-[4-(4-metilpiperazin-1-il)piperidin-1-il]fenil}pirimidina-2,4-diamina
y
2-[(5-bromo-2-{[2-metoxi-4-(4-metilpiperazin-1-il)fenil]amino)pirimidin-4-il)amino]-N-metilbencenosulfonamida.
Además, se ha informado que los inhibidores de ALK inducen
inhibición del crecimiento y muerte celular en células de linfoma
que expresan proteínas de fusión de NPM-ALK
(documentos de no patente 20 a 22) e inhiben linfoma (PNAS, 2 de
enero de 2007, 104 (1), 270-275 Epub2006 Dec). Sin
embargo, se desconoce totalmente que estos inhibidores de ALK
tengan aplicaciones terapéuticas para el cáncer (particularmente,
cáncer de pulmón) que se muestra que es positivo para un gen de
fusión del gen EML4 y el gen ALK. La composición farmacéutica para
el tratamiento del cáncer (particularmente, cáncer de pulmón) que se
muestra que es positivo para un gen de fusión del gen EML4 y el gen
ALK es una divulgación que se proporcionó por primera vez por los
hallazgos de los presentes inventores.
El polipéptido, polinucleótido, vector de
expresión y célula de la presente divulgación pueden usarse en el
cribado de una sustancia que inhibe el polipéptido de la presente
divulgación (particularmente, un agente terapéutico para cáncer de
pulmón que se muestra que es positivo para un gen de fusión del gen
EML4 y el gen ALK). Los sujetos para los que un gen de fusión del
gen EML4 y el gen ALK es positivo (particularmente, pacientes con
cáncer de pulmón) pueden detectarse usando la presencia del
polipéptido y/o polinucleótido de la presente divulgación como
índice. Según el procedimiento de cribado de la presente
divulgación, puede cribarse un agente terapéutico para cáncer
(particularmente, un agente terapéutico para cáncer de pulmón) que
se muestra que es positivo para un gen de fusión del gen EML4 y el
gen ALK. El cebador y el kit para la detección de la presente
invención pueden utilizarse para detectar un cáncer que se muestra
que es positivo para un gen de fusión del gen EML4 y el gen ALK. El
procedimiento de detección de la presente invención puede utilizarse
como un procedimiento para detectar cáncer (particularmente, cáncer
de pulmón) que se muestra que es positivo para el gen de fusión del
gen EML4 y el gen ALK de la presente divulgación. Además, según el
procedimiento de detección de la presente invención, puede
determinarse si el agente terapéutico de la presente divulgación
puede o no administrarse a sujetos. La sustancia que inhibe el
polipéptido de la presente divulgación es útil como agente
terapéutico para el cáncer, particularmente cáncer de pulmón, que
se muestra que es positivo para un gen de fusión del gen EML4 y el
gen ALK.
\vskip1.000000\baselineskip
Fig. 1. Muestra los resultados de PCR. El carril
izquierdo (46, XX) muestra el resultado cuando se usó el ADN
genómico de un sujeto sano normal como sustrato, y el carril derecho
(ID #33) muestra el resultado cuando se usó el ADN genómico de un
paciente con cáncer como sustrato;
Fig. 2. Muestra los resultados del cribado para
el polinucleótido de fusión de EML4-ALK en
especímenes de pacientes con cáncer de pulmón. El carril "46,
XX" muestra el resultado de usar monocitos periféricos de un
sujeto hembra sano normal, y "ID #2" a "ID #42" muestran
el resultado de usar muestras obtenidas de especímenes extirpados de
pacientes con cáncer de pulmón. Además, el carril "NTC"
muestra el resultado sin ADNc de sustrato añadido. El carril
"marcador" es el carril en el que se sometió a electroforesis
el ADN marcador de tamaño (sección superior). Los resultados de la
amplificación de ADNc de GAPDH se muestran en la sección inferior.
El sexo (M, masculino; F, femenino), la patología (S, carcinoma de
células escamosas; A, adenocarcinoma; AS, carcinoma adenoescamoso;
B, carcinoma bronquioloalveolar) y la presencia o ausencia de
mutación de EGFR y la presencia o ausencia de historial de fumador
se muestran en la parte superior de la figura;
Fig. 3. Muestra la tumorigenicidad de los genes.
La sección superior de la figura (3T3) muestra células de
fibroblastos 3T3 cuando se introdujeron un vector blanco (Vector) y
plásmido de expresión tal como ALK/pMXS de longitud completa (ALK),
EML4-ALKV1/pMXS (EML4-ALK) o
EML4-ALK (K589M)/pMXS. La barra de escala representa
100 \mum. La sección inferior de la figura (ratones desnudos)
muestra el resultado de la inoculación de cada línea de células de
fibroblastos 3T3 a ratones desnudos;
Fig. 4. Muestra el efecto inhibitorio de un
inhibidor del polipéptido de fusión de EML4-ALK
(compuesto A) sobre la autofosforilación intracelular. "KM"
indica cuándo se usaron las células que expresan
EML4-ALK (K589M) y "EA" muestra cuándo se
usaron las células BA/F3 que expresan v1.
"\alphap-ALK" (panel superior) muestra el
resultado de la inmunotransferencia cuando se usó anticuerpo
anti-ALK fosforilada y "\alphaFLAG" (panel
inferior) muestra el resultado de la inmunotransferencia cuando se
usó anticuerpo anti-FLAG;
Fig. 5. Muestra el potencial de crecimiento de
células que expresan proteína CD8 sola (CD8) o coexpresan CD8 y ALK
(ALK), CD8 y polipéptido de fusión de EML4-ALK v1
(EA) o CD8 y EML4-ALK (K589M) (KM) en presencia
(+IL-3) o ausencia (-IL-3) de
IL-3. El eje horizontal de la figura es el
transcurso de tiempo (días) y el eje vertical es el número de
células;
Fig. 6(a). Muestra el cambio dependiente
del tiempo del número de células cuando se añadieron
concentraciones respectivas del compuesto A a células BA/F3 que sólo
expresan CD8 y se cultivaron en presencia de IL-3.
(b) Muestra el cambio dependiente del tiempo del número de células
cuando células BA/F3 que expresan v1 se cultivaron con la
concentración respectiva del compuesto A en ausencia de
IL-3. El eje horizontal de la figura es el
transcurso de tiempo (días) y el eje vertical es el número de
células; y
Fig. 7. Muestra
ARNip-1-ARNip-9.
\vskip1.000000\baselineskip
En lo sucesivo, la presente invención se
describirá en detalle. Las técnicas de manipulación de genes
descritas en este documento pueden practicarse según técnicas
conocidas en la técnica tales como "Molecular Cloning",
Sambrook, J y col., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, a
menos que se especifique lo contrario. Las técnicas de manipulación
de proteínas descritas en este documento pueden practicarse según
técnicas conocidas en la técnica tales como "Experimental
Protocol on Proteins", Shujunsha Co. Ltd. 1997, a menos que se
especifique lo contrario.
La frase "el polipéptido de la presente
divulgación se inhibe" descrita en este documento engloba tanto
las frases "la expresión del polipéptido de la presente
divulgación se inhibe" como "la actividad del polipéptido de
la presente divulgación se inhibe". Una "sustancia que inhibe
el polipéptido de la presente divulgación" engloba tanto una
"sustancia que inhibe la expresión del polipéptido de la presente
divulgación" como una "sustancia que inhibe la actividad del
polipéptido de la presente divulgación".
El polipéptido de la presente divulgación
engloba:
- (1)
- un polipéptido que está constituido por la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2, 7 ó 130;
(2)
- (a)
- un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2 y que tiene una actividad de cinasa, o un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2 con la sustitución, deleción y/o inserción de 1 a 10 aminoácidos y que tiene una actividad de cinasa (denominado en lo sucesivo un polipéptido modificado funcionalmente equivalente a v1);
- (b)
- un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 7 y que tiene una actividad de cinasa, o un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 7 con la sustitución, deleción y/o inserción de 1 a 10 aminoácidos y que tiene una actividad de cinasa (denominado en lo sucesivo un polipéptido modificado funcionalmente equivalente a v2); y
- (c)
- un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 130 y que tiene una actividad de cinasa, o un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 130 con la sustitución, deleción y/o inserción de 1 a 10 aminoácidos y que tiene una actividad de cinasa (denominado en lo sucesivo un polipéptido modificado funcionalmente equivalente a v3);
(en lo sucesivo, el polipéptido modificado
funcionalmente equivalente a v1, el polipéptido modificado
funcionalmente equivalente a v2 y el polipéptido modificado
funcionalmente equivalente a v3 se denominan en conjunto en lo
sucesivo un polipéptido modificado funcionalmente equivalente);
y
(3)
- (a)
- un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos con el 90% o más de identidad con la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2 y que tiene una actividad de cinasa (denominado en lo sucesivo un polipéptido homólogo a v1);
- (b)
- un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos con el 90% o más de identidad con la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 7 y que tiene una actividad de cinasa (denominado en lo sucesivo un polipéptido homólogo a v2); y
- (c)
- un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos con el 90% o más de identidad con la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 130 y que tiene una actividad de cinasa (denominado en lo sucesivo un polipéptido homólogo a v3);
(en lo sucesivo el polipéptido homólogo a v1, el
polipéptido homólogo a v2 y el polipéptido homólogo a v3 se
denominan en conjunto en lo sucesivo un polipéptido homólogo).
\vskip1.000000\baselineskip
El "polipéptido modificado funcionalmente
equivalente" es, preferentemente, el "polipéptido que comprende
una secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia de
aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2, 7 ó 130 con la
sustitución, deleción y/o inserción de 1 a 10, preferentemente 1 a
varios, más preferentemente 1 a 7, lo más preferentemente 1 a 5
aminoácidos y que tiene una actividad de cinasa". Más
preferentemente, el polipéptido es el "polipéptido que
comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2,
7 ó 130 y que tiene una
\hbox{actividad de
cinasa}".
El "polipéptido homólogo" es un
"polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos con el 90%
o más de identidad con la secuencia de aminoácidos representada por
SEQ ID NO: 2, 7 ó 130 y que tiene una actividad de cinasa".
Preferentemente, el polipéptido homólogo tiene una secuencia de
aminoácidos con el 95% o más, más preferentemente el 98% o más de
identidad a ella.
La "identidad" descrita en este documento
significa un valor identidad obtenido por el programa de búsqueda
NEEDLE (J Mol Biol 1970; 48: 443-453) usando
parámetros disponibles por defecto. Los parámetros son del
siguiente modo:
Penalización por hueco = 10
Penalización de extensión = 0,5
Matriz = EDNAFULL.
La frase "que tiene una actividad de
cinasa" significa que tiene una actividad como una enzima que
fosforila tirosina. Si un cierto polipéptido "tiene una actividad
de cinasa" se confirma mediante un procedimiento del Ejemplo
7(2). Más preferentemente, el polipéptido modificado
funcionalmente equivalente y el polipéptido homólogo tienen
actividad de cinasa y tumorigenicidad combinadas. Si un cierto
polipéptido "tiene una tumorigenicidad" se confirma mediante
un procedimiento del Ejemplo 6(1).
Hasta este punto se ha descrito el polipéptido
de la presente divulgación. En lo sucesivo, el polipéptido que está
constituido por la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID
NO: 2, 7 ó 130, el polipéptido modificado funcionalmente
equivalente y el polipéptido homólogo se denominan en conjunto en lo
sucesivo un "polipéptido de la presente divulgación". De los
polipéptidos de la presente divulgación, el polipéptido que está
constituido por la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID
NO: 2, el polipéptido modificado funcionalmente equivalente a v1 y
el polipéptido homólogo a v1 se denominan en conjunto en lo sucesivo
un "tipo de polipéptido v1 de la presente divulgación". El
polipéptido que está constituido por la secuencia de aminoácidos
representada por SEQ ID NO: 7, el polipéptido modificado
funcionalmente equivalente a v2 y el polipéptido homólogo a v2 se
denominan en conjunto en lo sucesivo un "tipo de polipéptido v2 de
la presente divulgación". El polipéptido que está constituido
por la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 130, el
polipéptido modificado funcionalmente equivalente a v3 y el
polipéptido homólogo a v3 se denominan en conjunto en lo sucesivo
un "tipo de polipéptido v3 de la presente divulgación". Una
proteína como el polipéptido que está constituido por la secuencia
de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2 se denomina en lo
sucesivo un "polipéptido de fusión de EML4-ALK
v1". Una proteína como el polipéptido que está constituido por la
secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 7 se denomina
en lo sucesivo un "polipéptido de fusión de
EML4-ALK v2". Una proteína como el polipéptido
que está constituido por la secuencia de aminoácidos representada
por SEQ ID NO: 130 se denomina en lo sucesivo un "polipéptido de
fusión de EML4-ALK v3". El "polipéptido de
fusión de EML4-ALK v1", el "polipéptido de
fusión de EML4-ALK v2" y el "polipéptido de
fusión de EML4-ALK v3" se denominan en conjunto
en lo sucesivo un "polipéptido de fusión de
EML4-ALK".
El polipéptido de la presente divulgación es,
preferentemente, el "polipéptido que comprende la secuencia de
aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2, 7 ó 130 y que tiene una
actividad de cinasa", más preferentemente el "polipéptido que
comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2,
7 ó 130 y que tiene una actividad de cinasa y tumorigenicidad",
lo más preferentemente el "polipéptido que está constituido por
la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2, 7 ó
130".
Un polinucleótido que codifica el polipéptido de
la presente divulgación (denominado en lo sucesivo un
"polinucleótido de la presente divulgación") es un
polinucleótido representado por una secuencia de nucleótidos que
codifica el polipéptido de fusión de EML4-ALK, el
polipéptido modificado funcionalmente equivalente o el polipéptido
homólogo. El polinucleótido de la presente divulgación es,
preferentemente, un polinucleótido que está constituido por una
secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos
representada por SEQ ID NO: 2, 7 ó 130, más preferentemente un
polinucleótido que está constituido por la secuencia de nucleótidos
representada por SEQ ID NO: 1 (particularmente preferentemente, las
posiciones 271 a 3447 en SEQ ID NO: 1), 6 ó 129.
De los polinucleótidos de la presente
divulgación, un gen que codifica el tipo de polipéptido v1 de la
presente invención se denomina en lo sucesivo un "tipo de
polinucleótido v1 de la presente divulgación". Un gen que
codifica el tipo de polipéptido v2 de la presente divulgación se
denomina en lo sucesivo un "tipo de polinucleótido v2 de la
presente divulgación". Un gen que codifica el tipo de polipéptido
v3 de la presente divulgación se denomina en lo sucesivo un "tipo
de polinucleótido v3 de la presente divulgación".
Un "gen de fusión del gen EML4 y el gen
ALK" descrito en este documento se refiere al polinucleótido de
la presente divulgación. Un gen que codifica el polipéptido de
fusión de EML4-ALK v1, que es un tipo de
polinucleótido v1 de la presente divulgación, se denomina en lo
sucesivo un "polinucleótido de fusión de EML4-ALK
v1". Un gen que codifica el polipéptido de fusión de
EML4-ALK v2, que es un tipo de polinucleótido v2 de
la presente divulgación, se denomina en lo sucesivo un
"polinucleótido de fusión de EML4-ALK v2". Un
gen que codifica el polipéptido de fusión de
EML4-ALK v3, que es un tipo de polinucleótido v3 de
la presente divulgación, se denomina en lo sucesivo un
"polinucleótido de fusión de EML4-ALK v3". El
polinucleótido de fusión de EML4-ALK v1, el
polinucleótido de fusión de EML4-ALK v2 y el
polinucleótido de fusión de EML4-ALK v3 se denominan
en conjunto en lo sucesivo un "polinucleótido de fusión de
EML4-ALK".
La frase "cáncer que se muestra que es
positivo para un gen de fusión del gen EML4 y el gen ALK"
descrita en este documento significa cáncer positivo para el
polinucleótido de la presente divulgación (es decir, el
polinucleótido de la presente divulgación está presente) y,
preferentemente significa cáncer positivo para el polinucleótido de
fusión de EML4-ALK (es decir, cáncer positivo para
el polinucleótido de fusión de EML4-ALK) (es decir,
el polinucleótido de fusión de EML4-ALK está
presente).
Los procedimientos para producir el
polinucleótido de la presente divulgación incluyen, pero no se
limitan particularmente a, (1) un procedimiento que usa la reacción
en cadena de la polimerasa (PCR), (2) un procedimiento que usa una
aproximación de ingeniería genética estándar (es decir, un
procedimiento que comprende seleccionar una cepa transformada que
comprende la secuencia de aminoácidos deseada de cepas transformadas
con una biblioteca de ADNc) y (3) un procedimiento de síntesis
química. Cada procedimiento puede practicarse de la misma forma que
en el documento WO 01/34785. Sin embargo, la "proteína novedosa de
la presente invención" descrita en este documento puede
interpretarse como una proteína que está constituida por el
polipéptido de la presente divulgación descrito en este documento,
y el "gen de la presente invención" descrito en este documento
puede interpretarse como el polinucleótido de la presente
divulgación descrito en este documento.
En el procedimiento que usa PCR, el
polinucleótido de la presente divulgación puede producirse, por
ejemplo, según procedimientos descritos en 1) Procedimiento de
producción del gen de proteína, a) Primer procedimiento de
producción en "Realizaciones de la invención" del documento de
patente. El ARNm se extrae de células o tejidos que tienen la
capacidad de producir la proteína de la presente divulgación, por
ejemplo, de tejidos de pulmón derivados de un paciente humano con
cáncer de pulmón. Posteriormente, este ARNm puede someterse a
reacción de la transcriptasa inversa en presencia de cebadores al
azar u oligo dT cebadores para sintetizar ADNc monocatenario. El
ADNc monocatenario obtenido puede someterse a PCR usando 2 cebadores
que interponen una región parcial del gen de interés para obtener
el polinucleótido de la presente divulgación o una parte del mismo.
Más específicamente, el polinucleótido de la presente divulgación
puede producirse, por ejemplo, mediante un procedimiento descrito
en el Ejemplo 4(1), 11 (1) o 11 (7).
Alternativamente, el polinucleótido de la
presente divulgación puede producirse sintetizando artificialmente
el polinucleótido de la presente divulgación como fragmentos
separados mediante transcripción inversa (RT)-PCR y
luego fusionando estos fragmentos obtenidos. Por ejemplo, (a) 1489
bases localizadas del exón 1 al exón 13 en EML4 (para el tipo de
polinucleótido v1 de la presente invención) o 2242 bases localizadas
del exón 1 al exón 20 en EML4 (para el tipo de polinucleótido v2 de
la presente invención) se amplifican por RT-PCR
usando como molde ARNm extraído de células (por ejemplo, células
HeLa) o tejidos que expresan endógenamente EML4 y usando 2
cebadores que interponen la región génica de interés. Por otra
parte, por ejemplo, (b) 1691 bases localizadas del exón 21 al exón
30 en ALK (para tanto el tipo de polinucleótido v1 de la presente
divulgación como el tipo de polinucleótido v2 de la presente
divulgación) se amplifican por RT-PCR usando como
molde ARNm extraído de células (por ejemplo, células Rh30 o
U-87MG) o tejidos que expresan endógenamente ALK y
usando 2 cebadores que interponen la región génica de interés. Los
productos de PCR amplificados de (a) y (b) pueden fusionarse para
obtener el polinucleótido de la presente divulgación. Esta fusión
puede practicarse ideando los cebadores usados en la
RT-PCR de (a) y (b). Por ejemplo, un cebador se crea
añadiendo aproximadamente 10 bases de la secuencia de nucleótidos
antisentido del extremo 5' del exón 21 en ALK al extremo 5' de un
cebador antisentido para la amplificación por RT-PCR
del fragmento de (a), y este cebador creado se usa como cebador
antisentido para amplificar el fragmento de (a). Además, un cebador
se crea añadiendo aproximadamente 10 bases de la secuencia de
nucleótidos sentido del extremo 3' del exón 13 en EML4 (para el tipo
de polinucleótido v1 de la presente divulgación) o aproximadamente
10 bases de la secuencia de nucleótidos sentido del extremo 3' del
exón 20 en EML4 (para el tipo de polinucleótido v2 de la presente
divulgación) al extremo 5' de un cebador sentido para la
amplificación por RT-PCR del fragmento de (b), y
este cebador creado se usa como cebador sentido para amplificar el
fragmento de (b). El polinucleótido de la presente divulgación puede
obtenerse por PCR usando como moldes estos 2 tipos de productos de
PCR obtenidos y usando un cebador sentido que comprende el codón de
iniciación de EML4 y un cebador antisentido que comprende el codón
de terminación de ALK. Alternativamente, el polinucleótido de la
presente divulgación también puede obtenerse mediante reacciones de
hibridación y extensión usando sólo estos 2 tipos de productos de
PCR obtenidos sin usar el cebador sentido que comprende el codón de
iniciación de EML4 y el cebador antisentido que comprende el codón
de terminación de ALK.
El vector de expresión de la presente
divulgación, la célula transformada de la presente divulgación y el
procedimiento para producir el polipéptido de la presente
divulgación puede practicarse, por ejemplo, según procedimientos
descritos en 2) Procedimientos para la producción del vector de la
invención, la célula huésped de la invención y la proteína
recombinante de la invención en "Modo para llevar a cabo la
invención" del documento WO 01/34785. El polinucleótido aislado
de la presente divulgación puede incorporarse de nuevo en el ADN de
vector apropiado para así transformar una célula huésped eucariota o
procariota con él. Alternativamente, un promotor apropiado y una
secuencia que participa en la expresión fenotípica pueden
introducirse en el vector para así hacer que cada célula huésped
transformada con él exprese el polinucleótido.
El vector de expresión de la presente
divulgación no está particularmente limitado mientras que comprenda
el polinucleótido de la presente divulgación y exprese el
polipéptido de la presente divulgación. Ejemplos de los mismos
pueden incluir un vector de expresión obtenido insertando el
polinucleótido de la presente divulgación en un vector de expresión
conocido en la técnica, que se selecciona apropiadamente según una
célula huésped usada.
Asimismo, la célula de la presente divulgación
no está particularmente limitada mientras que comprenda el
polinucleótido de la presente divulgación como resultado de la
transferencia de ácido nucleico mediante transfección o infección
con el vector de expresión de la presente divulgación. Por ejemplo,
la célula de la presente divulgación es una célula huésped que
comprende el polinucleótido de la presente divulgación incorporado
en el cromosoma o es una célula que comprende el vector de expresión
que comprende el polinucleótido de la presente divulgación. La
célula de la presente divulgación se obtiene, por ejemplo,
transfectando o infectando una célula deseada con el vector de
expresión de la presente divulgación. Más específicamente, por
ejemplo, el vector de expresión que comprende el polinucleótido de
la presente divulgación y un plásmido para encapsidar (por ejemplo,
pGP o pE-eco) pueden introducirse en una célula
BOSC23 usando un reactivo de transfección comercialmente
disponible, lipofectamina, como se describe en el Ejemplo 1, para
así producir un retrovirus de expresión. Una célula BA/F3 puede
infectarse con este retrovirus para así producir la célula
transformada de la presente divulgación.
La célula transformada deseada así obtenida
puede cultivarse según un procedimiento estándar. Una proteína que
está constituida por el polipéptido de la presente divulgación se
produce mediante este cultivo. Un medio usado en el cultivo puede
seleccionarse apropiadamente según una célula huésped usada de entre
una variedad de medios rutinarios. Por ejemplo, un medio RPMI1640
complementado con componentes de suero tales como suero bovino
fetal (SBF) se usa para la célula BA/F3.
\newpage
Por tanto, el polipéptido de la presente
divulgación producido por la célula transformada puede separarse y
purificarse mediante una variedad de técnicas de operaciones de
separación conocidas en la técnica usando las propiedades físicas o
bioquímicas del polipéptido.
El polipéptido de la presente divulgación puede
fusionarse en el marco con una secuencia marcadora y expresarse
para así conseguir la confirmación de la expresión de la proteína,
además de la purificación de la proteína.
La presente invención engloba un conjunto de
cebadores útiles en la detección de la presencia del polinucleótido
de la presente invención.
Específicamente, la presente invención
engloba:
- (1)
- un conjunto de cebadores para detectar el polinucleótido de la presente divulgación que comprende un cebador antisentido que está constituido por moléculas de ácidos nucleicos con al menos 16 bases consecutivas que se hibridan bajo condiciones restrictivas (preferentemente, condiciones más restrictivas) a i) un tipo de polinucleótido v1 de la presente divulgación (preferentemente, polinucleótido de fusión de EML4-ALK v1, más preferentemente un polinucleótido que está constituido por la secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 1), un tipo de polinucleótido v2 de la presente divulgación (preferentemente, polinucleótido de fusión de EML4-ALK v2, más preferentemente un polinucleótido que está constituido por la secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 6), un tipo de polinucleótido v3 de la presente divulgación (preferentemente, polinucleótido de fusión de EML4-ALK v3, más preferentemente un polinucleótido que está constituido por la secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 129), ii) un polinucleótido que está constituido por la secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 4 que es una secuencia genómica que comprende el punto de fusión de un polinucleótido que pertenece al polinucleótido de fusión de EML4-ALK v1, y/o iii) un polinucleótido que está constituido por la secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 5 que es una de las secuencias que comprenden el punto de fusión de un polinucleótido que pertenece al polinucleótido de fusión de EMK4-ALK v2, y un cebador sentido que está constituido por una molécula de ácido nucleico con al menos 16 bases consecutivas que se hibridan bajo condiciones restrictivas (preferentemente, condiciones más restrictivas) a cadenas complementarias a cualquiera de los anteriores i) a iii);
- (2)
- un conjunto de cebadores de un cebador sentido que comprende un oligonucleótido con al menos todas las 16 bases consecutivas localizadas en los nº de bases 1 a 1759 (preferentemente, nº de base 271 a 1759) en SEQ ID NO: 1 y un cebador antisentido que comprende un oligonucleótido complementario a un oligonucleótido con al menos todas las 16 bases consecutivas localizadas en los nº de bases 1760 a 3926 (preferentemente, nº de base 1760 a 3447) en SEQ ID NO: 1, o un conjunto de cebadores que está constituido por cadenas complementarias de los mismos, en el que la separación entre las posiciones seleccionadas de los cebadores sentido y antisentido en SEQ ID NO: 1 es 1 kb o menos, o en el que los cebadores sentido y antisentido dan productos de amplificación de 1 kb o menos de tamaño;
- (3)
- un conjunto de cebadores de un cebador sentido que comprende un oligonucleótido con al menos todas las 16 bases consecutivas localizadas en los nº de bases 1 a 2242 en SEQ ID NO: 6 y un cebador antisentido que comprende un oligonucleótido complementario a un oligonucleótido con al menos todas las 16 bases consecutivas localizadas en los nº de bases 2243 a 3933 en SEQ ID NO: 6, o un conjunto de cebadores que está constituido por cadenas complementarias de los mismos, en el que la separación entre las posiciones seleccionadas de los cebadores sentido y antisentido en SEQ ID NO: 6 es 1 kb o menos, o en el que los cebadores sentido y antisentido dan productos de amplificación de 1 kb o menos de tamaño;
- (4)
- un conjunto de cebadores de un cebador sentido que comprende un oligonucleótido con al menos todas las 16 bases consecutivas localizadas en los nº de bases 1 a 3629 en SEQ ID NO: 4 y un cebador antisentido que comprende un oligonucleótido complementario a un oligonucleótido con al menos todas las 16 bases consecutivas localizadas en los nº de bases 3630 a 3979 en SEQ ID NO: 4, o un conjunto de cebadores que está constituido por cadenas complementarias de los mismos, en el que la separación entre las posiciones seleccionadas de los cebadores sentido y antisentido en SEQ ID NO: 4 es 1 kb o menos, o en el que los cebadores sentido y antisentido dan productos de amplificación de 1 kb o menos de tamaño;
- (5)
- un conjunto de cebadores de un cebador sentido que comprende un oligonucleótido con al menos todas las 16 bases consecutivas localizadas en los nº de bases 1 a 579 en SEQ ID NO: 5 y un cebador antisentido que comprende un oligonucleótido complementario a un oligonucleótido con al menos todas las 16 bases consecutivas localizadas en los nº de bases 580 a 853 en SEQ ID NO: 5, o un conjunto de cebadores que está constituido por cadenas complementarias de los mismos; y
- (6)
- un conjunto de cebadores de un cebador sentido que comprende un oligonucleótido con al menos todas las 16 bases consecutivas localizadas en los nº de bases 1 a 700 en SEQ ID NO: 129 y un cebador antisentido que comprende un oligonucleótido complementario a un oligonucleótido con al menos todas las 16 bases consecutivas localizadas en los nº de bases 701 a 1691 en SEQ ID NO: 129, o un conjunto de cebadores que está constituido por cadenas complementarias de los mismos, en el que los cebadores sentido y antisentido dan productos de amplificación de 1 kb o menos de tamaño. Ejemplos de un conjunto de cebadores preferible incluyen:
- (7)
- el conjunto de cebadores o el conjunto de cebadores que está constituido por cadenas complementarias de los mismos según cualquiera de (3) a (6), en el que los cebadores sentido y antisentido están representados por (i) SEQ ID NO: 8 y 9, (ii) SEQ ID NO: 15 y 16, 17 y 18, 19 y 20, 21 y 22, 23 y 24, 25 y 26, 27 y 28, 29 y 30, 31 y 32, o 33 y 34, (iii) SEQ ID NO: 35 y 36, 37 y 38, 39 y 18, 41 y 20, 43 y 22, 45 y 24, 47 y 26, 49 y 28, 51 y 52, 53 y 54, o 55 y 34, (iv) SEQ ID NO: 61 y 62, 63 y 64, 65 y 66, 67 y 68, 69 y 70, 71 y 72, 73 y 74, 75 y 76, 77 y 78, o 79 y 80, (v) SEQ ID NO: 81 y 62, 83 y 84, 85 y 68, 87 y 88, 89 y 70, 91 y 92, 93 y 74, 95 y 96, 97 y 98, o 99 y 100, o (vi) SEQ ID NO: 131 y 82, 132 y 62, 133 y 64, 134 y 66, 135 y 68, 136 y 70, 137 y 72, 138 y 74, 139 y 76, 140 y 78, o 141 y 80.
\vskip1.000000\baselineskip
Los conjuntos de cebadores (7) (i) (en el
Ejemplo 3(1)), (7) (ii) (en el Ejemplo 3(2)), (7)
(iii) (en el Ejemplo 3(3)), y (7) (iv) y (v) (en el Ejemplo
4(2)), y (7) (vi) (en el Ejemplo 11(3)) se usaron para
detectar la presencia del polinucleótido de la presente
divulgación.
Punto de fusión en esta memoria descriptiva
significa un punto en el que se fusionan una parte derivada del gen
EML4 y una parte derivada del gen ALK. El punto de fusión en SEQ ID
No: 1 es el punto en el que se fusionan un nucleótido de posición
de base 1759 y un nucleótido de posición de base 1760. El punto de
fusión en SEQ ID No: 6 es el punto en el que se fusionan un
nucleótido de posición de base 2242 y un nucleótido de posición de
base 2243. El punto de fusión en SEQ ID No: 129 es el punto en el
que se fusionan un nucleótido de posición de base 700 y un
nucleótido de posición de base 701. El punto de fusión en SEQ ID No:
4 es el punto en el que se fusionan un nucleótido de posición de
base 3629 y un nucleótido de posición de base 3630. El punto de
fusión en SEQ ID No: 5 es el punto en el que se fusionan un
nucleótido de posición de base 579 y un nucleótido de posición de
base 580.
Las "condiciones restrictivas" en esta
memoria descriptiva comprenden condiciones de hibridación en el
orden de "5 x SSPE, 5 \times disolución de Denhardt, SDS al
0,5%, formamida al 50%, 200 \mug/ml de ADN de esperma de salmón,
42ºC durante la noche" y condiciones de lavado en el orden de
"0,5 \times SSC, SDS al 0,1%, 42ºC". Las "condiciones más
restrictivas" comprenden condiciones de hibridación en el orden
de "5 x SSPE, 5 \times disolución de Denhardt, SDS al 0,5%,
formamida al 50%, 200 \mug/ml de ADN de esperma de salmón, 42ºC
durante la noche" y condiciones de lavado en el orden de "0,2 x
SSC, SDS al 0,1%, 65ºC".
Los conjuntos de cebadores de la presente
invención pueden utilizarse como conjuntos de cebadores para
amplificar y detectar el polinucleótido de la presente divulgación.
Para el uso de cebadores, su longitud de cadena es normalmente de
15 a 40 bases, preferentemente de 16 a 24 bases, más preferentemente
de 18 a 24 bases, particularmente preferentemente de 20 a 24
bases.
Los procedimientos para producir cebadores de la
presente invención no están particularmente limitados. Los
cebadores de la presente invención pueden producirse mediante el
procedimiento de síntesis química usado para el procedimiento para
producir el polinucleótido de la presente divulgación.
La presente invención engloba un procedimiento
para detectar el polinucleótido de la presente divulgación y un
procedimiento para detectar una proteína de fusión que está
constituida por el polipéptido de la presente divulgación.
Específicamente, a continuación se ejemplifica un aspecto que
comprende la etapa. Específicamente, el procedimiento para detectar
el polinucleótido de la presente divulgación comprende la etapa
de
- (1)
- detectar la presencia del polinucleótido de la presente divulgación en una muestra obtenida de un sujeto de prueba.
\vskip1.000000\baselineskip
Una muestra recogida de un sujeto de prueba (una
muestra separada del cuerpo), específicamente cualquier fluido
corporal recogido (preferentemente, sangre), fluido de lavado
broncoalveolar, muestra de biopsia o muestra de esputo, se usa como
la muestra obtenida de un sujeto de prueba. Preferentemente se usa
una muestra de biopsia de la parte afectada del pulmón del sujeto
de prueba o una muestra de esputo del sujeto de prueba. Puede
usarse ADN genómico extraído de la muestra o un producto de
transcripción (producto como resultado de la transcripción y
traducción del genoma; por ejemplo ARNm, ADNc, o una proteína) del
mismo. Particularmente preferentemente, para uso se prepara ARNm o
ADNc.
En el procedimiento para detectar el
polinucleótido de la presente divulgación, la "etapa de detectar
la presencia del polinucleótido" puede practicarse detectando la
presencia del polinucleótido representado por SEQ ID NO: 4
(secuencia genómica que comprende el punto de fusión) o SEQ ID NO:5
(secuencia genómica que comprende el punto de fusión) en el genoma
de la muestra obtenida de un sujeto de prueba o detectando la
presencia de ARNm o ADN correspondiente al tipo de polinucleótido
v1 de la presente divulgación (preferentemente, el polinucleótido
de fusión de EML4-ALK v1), el tipo de polinucleótido
v2 de la presente divulgación (preferentemente, el polinucleótido
de fusión de EML4-ALK v2) o el tipo de
polinucleótido v3 de la presente divulgación (preferentemente, el
polinucleótido de fusión de EML4-ALK v3) preparando
un producto de transcripción (por ejemplo, ARNm o ADNc) de ADN
genómico extraído de la muestra obtenida de un sujeto de prueba.
La extracción de ADN genómico puede realizarse
mediante un procedimiento conocido en la técnica y puede realizarse
convenientemente con un kit de extracción de ADN comercialmente
disponible.
La etapa de detección en la etapa (1) puede
practicarse según un procedimiento de análisis de genes conocido en
la técnica (por ejemplo, PCR comúnmente usada como procedimiento de
detección de genes, LCR (reacción en cadena de la ligasa), SDA
(amplificación por desplazamiento de cadenas), NASBA (amplificación
basada en secuencias de ácidos nucleicos), ICAN (amplificación
isoterma y quimérica de ácidos nucleicos iniciada por cebadores),
LAMP (amplificación isoterma mediada por bucles), TMA (sistema TMA
de sondas de genes) y procedimientos muy conocidos tales como una
micromatriz). Por ejemplo, se utiliza una técnica de hibridación
usando como sonda un ácido nucleico que se hibrida con el
polinucleótido de la presente invención o una técnica de
amplificación de genes usando como cebadores ADN que se hibrida con
el polinucleótido de la presente invención. Específicamente, para
la medición se usa un ácido nucleico, por ejemplo, ARNm, derivado de
la muestra obtenida de un sujeto de prueba. El nivel de ARNm se
mide por un procedimiento de reacción de amplificación de genes que
usa cebadores diseñados para amplificar específicamente la
secuencia de polinucleótidos de la presente divulgación. Los
cebadores usados en el procedimiento de detección de la presente
invención o los cebadores contenidos en el kit para la detección de
la presente invención no están particularmente limitados mientras
amplifiquen específicamente la secuencia de polinucleótidos de la
presente invención. Estos cebadores se diseñan basándose de la
secuencia de nucleótidos del polinucleótido de la presente
invención. El diseño de cebadores para un procedimiento de
monitorización de la amplificación por PCR puede lograrse utilizando
el software de diseño de cebadores Primer Express (PE Biosystems).
Los productos de PCR con un tamaño grande reducen la eficiencia de
amplificación. Por tanto, es apropiado que los cebadores sentido y
antisentido puedan diseñarse para dar productos de amplificación de
1 kb o menos de tamaño en la amplificación de ARNm o ADNc. Más
específicamente, un cebador sentido (cebador de 5') y un cebador
antisentido (cebador de 3') se diseñan a partir de una parte que
codifica EML4 (por ejemplo, cualquier parte dentro de la región del
gen EML4 del polinucleótido de fusión de EML4-ALK
(particularmente, ADNc)) y de una parte que codifica ALK (por
ejemplo, cualquier parte dentro de la región del gen ALK del
polinucleótido de fusión de EML4-ALK
(particularmente, ADNc)), respectivamente. Preferentemente se usan
los cebadores contenidos en el kit para la detección de la presente
invención, más preferentemente, los cebadores más adecuados
contenidos en el kit para la detección de la presente invención.
Tanto si el gen de interés (la secuencia completa o su parte
específica) se amplifica como no, puede confirmarse mediante un
procedimiento adecuado para cada técnica de amplificación. Por
ejemplo, para PCR, los productos de PCR pueden someterse a análisis
por electroforesis en gel de agarosa y tinción con bromuro de
etidio para así confirmar si un fragmento de amplificación con el
tamaño de interés se obtiene o no. Si se obtiene el fragmento de
amplificación con el tamaño de interés, entonces el polinucleótido
de la presente invención está presente en la muestra obtenida de un
sujeto de prueba. De esta forma puede detectarse la presencia del
polinucleótido de la presente divulgación.
La detección usando la técnica de hibridación se
realiza, por ejemplo, por una hibridación de Northern,
transferencia por puntos o procedimiento de micromatrices de ADN.
Para detectar el polinucleótido en la hibridación puede usarse una
sonda que comprende una molécula de ácido nucleico con al menos 32
bases consecutivas que se hibridan bajo condiciones restrictivas
(preferentemente, condiciones más restrictivas) con un
polinucleótido de la presente divulgación; o cadenas
complementarias del mismo, y que comprenden las posiciones 1744 a
1775 de la secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 1,
las posiciones 2227 a 2258 de la secuencia de nucleótidos
representada por SEQ ID NO: 6, las posiciones 685 a 716 de la
secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 129, las
posiciones 3614 a 3645 de la secuencia de nucleótidos representada
por SEQ ID NO: 4, las posiciones 564 a 595 de la secuencia de
nucleótidos representada por SEQ ID NO: 5; o cadenas complementarias
del mismo. Además, puede utilizarse una técnica de amplificación de
genes tal como RT-PCR. En el procedimiento de
RT-PCR, la presencia del polinucleótido de la
presente divulgación puede analizarse más cuantitativamente usando
un procedimiento de monitorización de la amplificación por PCR (PCR
en tiempo real) (Genome Res. 6 (10), 986, 1996) en el procedimiento
de amplificación de genes. Por ejemplo, puede usarse ABI PRISM 7900
(PE Biosystems) como procedimiento de monitorización de
amplificación por PCR. La tiempo real.
PCR es un procedimiento conocido en la técnica y
puede realizarse convenientemente utilizando un aparato
comercialmente disponible y un kit para PCR en tiempo real.
Un procedimiento para detectar una proteína de
fusión codificada por el polinucleótido de la presente divulgación
comprende la etapa de
- (2)
- detectar la presencia del polipéptido de la presente divulgación en una muestra obtenida de un sujeto de prueba.
\vskip1.000000\baselineskip
Una etapa de detección tal puede practicarse
preparando una disolución solubilizada derivada de una muestra
obtenida de un sujeto de prueba (por ejemplo, un tejido o célula
canceroso obtenido del sujeto de prueba) y detectando el
polipéptido de la presente divulgación (particularmente, el
polipéptido de fusión de EML4-ALK v1) contenido en
la misma por una medición inmunológica o procedimiento de medición
de actividad enzimática usando anticuerpos
anti-EML4 y anti-ALK en combinación.
Preferentemente puede usarse una aproximación usando un anticuerpo
monoclonal o policlonal específico para el polipéptido de la
presente divulgación (particularmente, el polipéptido de fusión de
EML4-ALK v1) tal como inmunoensayo enzimático, ELISA
de tipo sándwich con dos anticuerpos, fluoroinmunoensayo,
radioinmunoensayo o transferencia de Western.
Más preferentemente, la presencia del
polipéptido de la presente divulgación puede detectarse, como se
muestra en el Ejemplo 9, sometiendo los extractos de células de una
célula que probablemente tiene el polipéptido de la presente
divulgación a inmunoprecipitación con un anticuerpo
anti-EML4 y realizando la detección usando un
anticuerpo anti-ALK para los precipitados. En el
procedimiento del Ejemplo 9 también puede usarse la
inmunoprecipitación con el anticuerpo anti-ALK y la
detección con el anticuerpo anti-EML4. Por tanto,
después de realizar la inmunoprecipitación y la detección, se
prefiere confirmar adicionalmente que la proteína detectada por el
anticuerpo de detección tiene el tamaño del polipéptido de la
presente divulgación de interés. Los anticuerpos usados en esta
detección pueden ser cualquier anticuerpo que pueda unirse
específicamente a una secuencia de polipéptidos del exón 1 al exón
20 (preferentemente, del exón 1 al exón 13; más preferentemente del
exón 1 al exón 6) de EML4 o una secuencia de polipéptidos del exón
21 al exón 30 de ALK, y pueden ser anticuerpos monoclonales o
policlonales.
Si el polinucleótido de la presente divulgación
o el polipéptido de la presente divulgación se detecta en la
muestra obtenida de un sujeto de prueba, el sujeto de prueba es una
diana (paciente) que tiene cáncer que se muestra que es positivo
para el polinucleótido de la presente divulgación y sirve de diana a
la que puede administrarse la composición farmacéutica de la
presente divulgación.
El kit para la detección de la presente
invención comprende al menos cebadores sentido y antisentido
diseñados para amplificar específicamente el polinucleótido de la
presente divulgación. El conjunto de cebadores sentido y
antisentido son un conjunto de polinucleótidos que actúan de
cebadores para la amplificación del polinucleótido de la presente
divulgación. Ejemplos de los mismos incluyen los conjuntos de
cebadores (1) a (7) descritos en el párrafo <Conjunto de
cebadores de la presente invención>. Los conjuntos de cebadores
preferibles son los conjuntos de cebadores (2) a (7). Los conjuntos
de cebadores más preferibles son los conjuntos de cebadores
(7).
Ejemplos de otros reactivos que pueden estar
contenidos en el kit para la detección de la presente invención
pueden incluir reactivos (por ejemplo, Taq polimerasa, sustratos
nucleotídicos y disoluciones de tampón) necesarios para la PCR.
El procedimiento de cribado de la presente
divulgación engloba [1] un procedimiento para cribar una sustancia
que inhibe el polipéptido de la presente divulgación y [2] un
procedimiento para cribar un agente terapéutico para cáncer
(preferentemente, cáncer de pulmón) que se muestra que es positivo
para el polinucleótido de la presente divulgación.
El procedimiento para cribar una sustancia que
inhibe el polipéptido de la presente divulgación no está
particularmente limitado mientras que comprenda las siguientes
etapas (i) a (iii):
- (i)
- poner sustancias de prueba en contacto con el polipéptido de la presente divulgación o una célula que expresa el polipéptido de la presente divulgación;
- (ii)
- analizar si el polipéptido se inhibe o no, y
- (iii)
- seleccionar una sustancia que inhibe el polipéptido.
Preferentemente, la sustancia que inhibe el
polipéptido de la presente divulgación puede cribarse mediante
procedimientos descritos en los Ejemplos 7(3), 7(4),
8(3), 8(5) - 8(9), 10(3), 11(4) -
(6), 11(8), y 11(9).
El procedimiento de cribado [1] de la presente
divulgación engloba los siguientes procedimientos (a), (b) o
(c):
- (a)
- procedimiento de cribado in vitro;
- un procedimiento para cribar una sustancia que inhibe la actividad del polipéptido de la presente divulgación que comprende las etapas de (1) poner sustancias de prueba en contacto con el polipéptido de la presente divulgación, (2) analizar si la actividad del polipéptido se inhibe o no y (3) seleccionar una sustancia que inhibe la actividad del polipéptido;
- (b)
- procedimiento de cribado basado en células;
- un procedimiento para cribar una sustancia que inhibe la actividad del polipéptido de la presente divulgación que comprende las etapas de (1) poner sustancias de prueba en contacto con una célula que expresa el polipéptido de la presente divulgación, (2) analizar si la actividad del polipéptido se inhibe o no, y (3) seleccionar una sustancia que inhibe la actividad del polipéptido; y
- (c)
- procedimiento de cribado basado en la inhibición de la expresión; un procedimiento para cribar una sustancia que inhibe la expresión del polipéptido de la presente divulgación que comprende las etapas de (1) poner sustancias de prueba en contacto con una célula que expresa el polipéptido de la presente divulgación, (2) analizar si la expresión del polipéptido se inhibe o no, y (3) seleccionar una sustancia que inhibe la expresión del polipéptido.
\vskip1.000000\baselineskip
Cada procedimiento de cribado (a)-(c) se
describirá más adelante. La célula que expresa el polipéptido de la
presente divulgación comprende una célula que expresa naturalmente
el polipéptido de la presente divulgación (por ejemplo
NCI-H2228) y una célula que produce la expresión del
polipéptido de la presente divulgación por su transformación con un
vector que comprende el polinucleótido de la presente divulgación.
La célula preferible es la célula que produce la expresión del
polipéptido de la presente divulgación por su transformación con un
vector que comprende el polinucleótido de la presente
divulgación.
El procedimiento de cribado in vitro
comprende: poner sustancias de prueba en contacto con el polipéptido
purificado de la presente invención mediante adición (etapa de
contacto); analizar si la actividad del polipéptido de la presente
divulgación se inhibe o no por la(s) sustancia(s) de
prueba en comparación con la actividad del polipéptido de la
presente divulgación que no se ha puesto en contacto con la
sustancia de prueba (etapa de análisis); y seleccionar una
sustancia que inhibe la actividad del polipéptido de la presente
divulgación (es decir, un agente terapéutico para cáncer,
particularmente, un agente terapéutico para cáncer de pulmón).
En el procedimiento de cribado de la presente
divulgación, cada etapa puede practicarse específicamente, por
ejemplo, como se describe más adelante. Las sustancias de prueba se
ponen en contacto con el polipéptido purificado de la presente
divulgación mediante adición. Después de la adición de ATP, la
actividad del polipéptido se mide. Los disolventes (por ejemplo,
DMSO) para la sustancia de prueba se ponen en contacto como control
con el polipéptido purificado mediante mezcla. Después de la adición
de ATP, la actividad del polipéptido se mide. Como control de ruido
puede ponerse una condición sin la adición de ATP. Se analiza si la
actividad del polipéptido de la presente divulgación se inhibe o no
por la(s) sustancia(s) de prueba. Si la actividad (es
decir, la actividad de fosforilación) del polipéptido de la presente
divulgación se inhibe o no por la(s) sustancia(s) de
prueba puede determinarse analizando un cambio inducido por la
sustancia de prueba en el nivel de fosforilación de tirosina del
polipéptido de la presente divulgación. Específicamente, cuando la
adición (es decir, el contacto) de una sustancia de prueba inhibe la
actividad (es decir, la actividad de fosforilación) del polipéptido
de la presente divulgación en comparación con la adición (es decir,
el contacto) del control de disolvente, esta sustancia de prueba se
selecciona como una sustancia que inhibe la actividad del
polipéptido de la presente divulgación, (es decir, un agente
terapéutico para cáncer, particularmente, un agente terapéutico
para cáncer de pulmón). El procedimiento de cribado in vitro
de la presente divulgación comprende un procedimiento de cribado
llevado a cabo de un modo similar al anterior, excepto que en las
etapas anteriores el sustrato peptídico se añade y se mezcla antes
de la adición de ATP, y la actividad del polipéptido de la presente
divulgación se determina analizando la actividad de fosforilación en
el sustrato peptídico por el polipéptido de la presente divulgación
(es decir, analizando un cambio en el nivel de fosforilación en el
sustrato peptídico por el polipéptido de la presente divulgación con
el fin de determinar si una sustancia de prueba inhibe la actividad
del polipéptido de la presente divulgación). De los procedimientos
de cribado de la presente divulgación, preferentemente se practica
el procedimiento de cribado in vitro en las condiciones
descritas en el Ejemplo 7(3) o 11(4). Una sustancia
que puede inhibir el 50% o más de actividad por este procedimiento
a una concentración de 10 \muM o inferior, preferentemente 1
\muM o inferior, más preferentemente 0,1 \muM o inferior, se
selecciona como una sustancia que inhibe la actividad del
polipéptido de la presente divulgación.
El procedimiento de cribado basado en células
comprende: poner sustancias de prueba en contacto con una célula
que expresa el polipéptido de la presente divulgación mediante
mezcla (es decir, adición) (etapa de contacto); analizar si la
actividad del polipéptido de la presente divulgación se inhibe o no
por la(s) sustancia(s) de prueba en comparación con
la actividad del polipéptido de la presente divulgación que no se
ha puesto en contacto con la sustancia de prueba (etapa de
análisis); y seleccionar una sustancia que inhibe la actividad del
polipéptido de la presente divulgación (es decir, un agente
terapéutico para cáncer, particularmente, un agente terapéutico
para cáncer de pulmón). Este procedimiento de cribado puede
practicarse específicamente, por ejemplo, como se describe a
continuación.
Primero, las sustancias de prueba o controles de
disolvente (por ejemplo, DMSO) se ponen en contacto con una célula
que expresa el polipéptido de la presente divulgación. Las células
se cultivan durante un tiempo dado. La actividad (es decir, la
actividad de autofosforilación) del polipéptido de la presente
divulgación se mide usando lisados de células preparados a partir
de las células cultivadas por disolución, por electroforesis en SDS
conocida en la técnica e inmunotransferencia usando un anticuerpo
anti-ALK fosforilada (por ejemplo, tecnología de
señalización de células) para así analizar si la actividad del
polipéptido de la presente divulgación se inhibe o no por
la(s) sustancia(s) de prueba. Si la actividad del
polipéptido de la presente divulgación se inhibe o no por
la(s) sustancia(s) de prueba puede determinarse
analizando un cambio inducido por la sustancia de prueba en el
nivel de fosforilación de tirosina (es decir, autofosforilación) del
polipéptido de la presente divulgación. Específicamente, cuando la
adición (es decir, el contacto) de una sustancia de prueba inhibe
la actividad del polipéptido de la presente divulgación en
comparación con la adición (es decir, el contacto) del control de
disolvente, esta sustancia de prueba se selecciona como una
sustancia que inhibe la actividad del polipéptido de la presente
divulgación (es decir, un agente terapéutico para cáncer,
particularmente, un agente terapéutico para cáncer de pulmón). De
los procedimientos de cribado de la presente divulgación,
preferentemente, el procedimiento de cribado basado en células se
practica en las condiciones descritas en el Ejemplo 7(4),
10(3), 11(5) o 11(8). Se selecciona una
sustancia que puede inhibir el 50% o más de actividad por este
procedimiento a una concentración de 10 \muM o inferior,
preferentemente 1 \muM o inferior, más preferentemente 0,1 \muM
o inferior.
El procedimiento de cribado basado en la
inhibición de la expresión comprende: poner sustancias de prueba en
contacto con una célula que expresa el polipéptido de la presente
divulgación mediante mezcla (es decir, adición) (etapa de
contacto); analizar si la expresión del polipéptido de la presente
divulgación se inhibe o no por la(s) sustancia(s) de
prueba en comparación con la expresión del polipéptido de la
presente divulgación que no se ha puesto en contacto con la
sustancia de prueba (etapa de análisis); y seleccionar una
sustancia que inhibe la expresión del polipéptido de la presente
divulgación (es decir, un agente terapéutico para cáncer,
particularmente, un agente terapéutico para cáncer de pulmón, que se
muestra que es positivo para el polinucleótido de la presente
divulgación). Este procedimiento de cribado puede practicarse
específicamente, por ejemplo, como se describe a continuación.
Las sustancias de prueba o controles de
disolvente (por ejemplo, DMSO) se ponen en contacto con cualquier
célula que expresa el polipéptido de la presente divulgación.
Después del cultivo, los extractos se preparan a partir de las
células y posteriormente se usan para analizar si la expresión del
polipéptido de la presente divulgación se inhibe o no por
la(s) sustancia(s) de prueba. Si la expresión del
polipéptido de la presente divulgación se inhibe o no puede
analizarse analizando si el ARNm o la expresión de proteínas del
polipéptido de la presente divulgación se inhibe o no. Más
específicamente, el ARNm o el nivel de proteínas del polipéptido de
la presente divulgación presente en los extractos de células se
identifica por un procedimiento de análisis del nivel de expresión
conocido en la técnica, por ejemplo, transferencia de Northern, PCR
cuantitativa, inmunotransferencia o ELISA. Más específicamente, la
inhibición del ARNm o la expresión de proteínas del polipéptido de
la presente divulgación puede analizarse mediante un procedimiento
descrito en el Ejemplo 8(5) o 8(6). Si la expresión
del polipéptido de la presente divulgación se inhibe o no por
la(s) sustancia(s) de prueba puede determinarse
analizando un cambio inducido por la sustancia de prueba en el nivel
de expresión del polipéptido de la presente divulgación.
Específicamente, cuando el contacto de una sustancia de prueba
inhibe el nivel de expresión (es decir, nivel de ARNm o de
proteínas) del polipéptido de la presente divulgación en comparación
con el contacto del control de disolvente, esta sustancia de prueba
se selecciona como una sustancia que inhibe la expresión del
polipéptido de la presente divulgación (es decir, un agente
terapéutico para cáncer, particularmente, un agente terapéutico
para cáncer de pulmón). De los procedimientos de cribado de la
presente divulgación, preferentemente, el procedimiento de cribado
basado en la inhibición de la expresión se practica en las
condiciones descritas en el Ejemplo 8(5) o 8(6). Se
selecciona una sustancia que puede inhibir el 50% o más de actividad
por este procedimiento a una concentración de 10 \muM o inferior,
preferentemente 1 \muM o inferior, más preferentemente 0,1 \muM
o inferior. Preferentemente, la sustancia de prueba seleccionada
tiene una actividad inhibitoria en todas las células usadas. Sin
embargo, también puede seleccionarse una sustancia de prueba que
tiene una actividad inhibitoria en una célula.
Se reveló que el polinucleótido de fusión de
EML4-ALK es un oncogén (Ejemplo 6 y 11 (2)) y la
presencia del polinucleótido de fusión de EML4-ALK
se detectó en algunos pacientes con cáncer de pulmón.
Adicionalmente, se reveló que el crecimiento celular independiente
del anclaje fue inhibido (es decir, se muestra un efecto
anticancerígeno) por la inhibición de la actividad y/o expresión del
polipéptido de la presente divulgación (Ejemplo 8, 11). Se mostró
que la sustancia que inhibe el polipéptido de la presente
divulgación (que inhibe la actividad y/o expresión del polipéptido
de la presente divulgación) tiene un efecto terapéutico sobre el
cáncer. Específicamente, el procedimiento para cribar una sustancia
que inhibe el polipéptido de la presente divulgación (que inhibe la
actividad y/o expresión del polipéptido de la presente divulgación)
mencionado anteriormente [1] puede utilizarse como procedimiento
para cribar un agente terapéutico para cáncer (preferentemente,
cáncer de pulmón) que se muestra que es positivo para el
polinucleótido de la presente divulgación.
El procedimiento de cribado [2] de la presente
invención comprende adicionalmente, además de analizar si el
polipéptido de la presente divulgación se inhibe o no y seleccionar
una sustancia que inhibe el polipéptido de la presente divulgación,
la etapa de confirmar que la sustancia de prueba seleccionada tiene
una actividad terapéutica contra el cáncer (particularmente, cáncer
de pulmón) que se muestra que es positivo para el polinucleótido de
la presente divulgación.
Ejemplos de la etapa de confirmar que la
sustancia seleccionada tiene una actividad terapéutica contra el
cáncer (particularmente, cáncer de pulmón) que se muestra que es
positivo para el polinucleótido de la presente divulgación incluyen
una etapa de practicar un procedimiento de evaluación conocido en la
técnica o un procedimiento modificado del mismo, por ejemplo, un
procedimiento que comprende analizar la actividad terapéutica de la
sustancia seleccionada contra el cáncer (particularmente, cáncer de
pulmón) tratando con la sustancia células cultivadas o animales de
modelo de tumor que expresan el polipéptido de la presente
divulgación (Clinical Oncology, 2ª ed., Cancer and Chemotherapy
Publishers, Inc.).
La etapa de confirmar que la sustancia de prueba
seleccionada tiene una actividad terapéutica contra el cáncer
(particularmente, cáncer de pulmón) que se muestra que es positivo
para el polinucleótido de la presente divulgación es,
preferentemente, la etapa de confirmar que la sustancia de prueba
seleccionada presenta el efecto inhibitorio del crecimiento y/o
efecto inductor de muerte celular en las células usando células
cancerosas derivadas de cáncer humano (particularmente, derivadas de
cáncer de pulmón) que expresan endógenamente el polipéptido de la
presente divulgación (por ejemplo, NCI-H2228), la
etapa de confirmar que la sustancia de prueba seleccionada tiene el
efecto inhibitorio en el crecimiento independiente del anclaje de
células transformadas por la expresión del polipéptido de la
presente divulgación y/o la etapa de confirmar que la sustancia de
prueba seleccionada tiene el efecto inhibitorio sobre el crecimiento
de tumor formado en ratón desnudo inoculado con una célula que
expresa el polinucleótido de la presente divulgación.
Puede usarse un animal de modelo portador de
cáncer que sirve de animal de modelo de tumor en el que las células
cancerosas que expresan endógenamente el polipéptido de la presente
divulgación (por ejemplo, NCI-H2228) o las células
transformadas por la expresión del polipéptido de la presente
divulgación se trasplantan subcutáneamente, intradérmicamente o
intraperitonealmente o a cada órgano (por ejemplo, un ratón desnudo
al que se trasplantan las células NIH3T3 que producen la expresión
del polipéptido de la presente invención). Además, también puede
usarse un animal que produce la expresión del polinucleótido de
fusión de EML4-ALK.
Ejemplos de sustancias de prueba usadas en el
procedimiento de cribado de la presente divulgación pueden incluir,
pero no se limitan particularmente a, compuestos comercialmente
disponibles (incluyendo péptidos), una variedad de compuestos
(incluyendo péptidos) conocidos en la técnica y registrados en
archivos químicos, grupos de compuestos obtenidos por una técnica
de química combinatoria (N. Terrett y col., Drug Discov. Today, 4
(1): 41, 1999), sobrenadantes de cultivos de microorganismos,
componentes naturales derivados de organismos vegetales o marinos,
extractos de tejidos animales, ácidos nucleicos bicatenarios,
anticuerpos o fragmentos de anticuerpos y compuestos (incluyendo
péptidos) químicamente o biológicamente modificados a partir de
compuestos (incluyendo péptidos) seleccionados por el procedimiento
de cribado de la presente divulgación.
La presente divulgación engloba una composición
farmacéutica para el tratamiento de cáncer que se muestra que es
positivo para el polinucleótido de la presente divulgación que
comprende como principio activo una sustancia obtenida por el
procedimiento de cribado de la presente divulgación. La presente
divulgación engloba el uso de una sustancia que inhibe el
polipéptido de la presente divulgación (por ejemplo, una sustancia
obtenida por el procedimiento de cribado de la presente divulgación
[por ejemplo, un ácido nucleico bicatenario (incluyendo ARNip),
proteína (incluyendo un anticuerpo o fragmento de anticuerpo),
péptido u otros compuestos]) para la preparación de una composición
farma-
céutica para el tratamiento de cáncer que se muestra que es positivo para el polinucleótido de la presente divulgación.
céutica para el tratamiento de cáncer que se muestra que es positivo para el polinucleótido de la presente divulgación.
El principio activo en la composición
farmacéutica puede seleccionarse por el procedimiento de cribado de
la presente divulgación. Ejemplos de la sustancia seleccionada por
el procedimiento de cribado de la presente divulgación pueden
incluir los compuestos A a D y un ácido nucleico bicatenario
descrito en los Ejemplos 7 y 8 más adelante, respectivamente.
Alternativamente, un compuesto seleccionado por el procedimiento de
cribado de la presente divulgación de un compuesto de bajo peso
molecular con una actividad inhibitoria contra ALK (inhibidor de
ALK) conocido en la técnica puede usarse como principio activo en la
composición farmacéutica. El inhibidor de ALK puede ejemplificarse
por inhibidores de ALK descritos en los documentos WO 2005/097765 y
WO 2005/016894 (particularmente, derivados de
2,4-pirimidinadiamina). Particularmente puede usarse
un compuesto descrito en Wan W y col., Blood 107:
1617-1623, 2006, además de WHI-P131
(4-(4'-hidroxifenil)amino-6,7-dimetoxiquinazolina)
y WHI-P154
(4-[(3'-bromo-4'-hidroxifenil)amino]-6,7-dimetoxiquinazolina);
denominado en lo sucesivo un compuesto A; Marzec M y col., Lab
Invest 85: 1544-1554, 2005) (ambos, EMD
Biosciences). Alternativamente, como inhibidor de ALK puede usarse
N-[2-(3-clorofenil)etil]-2-[({[4-(trifluorometoxi)fenoxi]acetil}amino)metil]-1,3-tiazol-4-carboxamida
(documento WO 2005/097765; denominado en lo sucesivo un compuesto
B),
5-cloro-N^{4}-[2-(isopropilsulfonil)fenil]-N^{2}-{2-metoxi-4-[4-(4-metilpiperazin-1-il)piperidin-1-il]fenil}pirimidina-2,4-diamina
(documento WO 2005/016894; denominado en lo sucesivo un compuesto
C) o
2-[(5-bromo-2-{[2-metoxi-4-(4-metilpiperazin-1-il)fenil]amino}pirimidin-4-il)amino]-N-metilbencenosulfonamida
(documento WO 2005/016894; denominado en lo sucesivo un compuesto
D).
El ácido nucleico bicatenario ejemplificado como
principio activo en la composición farmacéutica comprende una parte
de ácido nucleico bicatenario (ARN o ADN) y, preferentemente,
nucleótidos protuberantes del extremo 3' de las cadenas de
transcripción y complementaria e induce iARN. La iARN es un fenómeno
evolutivamente conservado que se produce por un ácido nucleico
bicatenario con 21 a 23 bases producido por la endonucleasa RNasa
III (Genes Dev. 15, 485-490, 2001). Los nucleótidos
protuberantes del extremo 3' son respectivamente cualquier ácido
nucleico con 1 ó 2 bases, preferentemente 2 bases. El número de
bases (21 a 23 bases) descrito anteriormente es el número de bases
de la cadena de transcripción o complementaria incluyendo su
nucleótido protuberante. Las cadenas de transcripción y
complementaria pueden tener el mismo número de bases o un número de
bases diferente y, preferentemente, tener el mismo número de
bases.
Por ejemplo, U (uridina), A (adenosina), G
(guanosina) o C (citidina) pueden usarse como ácidos ribonucleicos
que constituyen los nucleótidos protuberantes del extremo 3' del
ácido nucleico bicatenario. Por ejemplo, dT (desoxitimidina), dA
(desoxiadenosina), dG (desoxiguanosina) o dC (desoxicitidina) pueden
usarse como ácidos desoxirribonucleicos que constituyen los
nucleótidos protuberantes del extremo 3' de los mismos.
El ácido nucleico bicatenario que puede usarse
como principio activo en la composición farmacéutica comprende una
parte bicatenaria diseñada basándose en las bases en las posiciones
1743 a 1761, 1744 a 1762, 1750 a 1768, 1753 a 1771, 1756 a 1774, o
1757 a 1775 en SEQ ID NO: 1 y tiene una actividad inhibitoria sobre
la expresión del polipéptido de la presente divulgación (denominado
en lo sucesivo un ácido nucleico bicatenario de la presente
divulgación). Ejemplos de aspectos preferibles de un ácido nucleico
bicatenario tal incluyen los ARNip-1 a
ARNip-6 descritos en el ejemplo 8 (es decir, un
ácido nucleico bicatenario en el que una cadena está constituida
por la secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 111 y la
otra cadena está constituida por la secuencia de nucleótidos
representada por SEQ ID NO: 112; un ácido nucleico bicatenario en el
que una cadena está constituida por la secuencia de nucleótidos
representada por SEQ ID NO: 113 y la otra cadena está constituida
por la secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 114; un
ácido nucleico bicatenario en el que una cadena está constituida
por la secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 115 y la
otra cadena está constituida por la secuencia de nucleótidos
representada por SEQ ID NO: 116; un ácido nucleico bicatenario en
el que una cadena está constituida por la secuencia de nucleótidos
representada por SEQ ID NO: 117 y la otra cadena está constituida
por la secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 118; un
ácido nucleico bicatenario en el que una cadena está constituida por
la secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 119 y la
otra cadena está constituida por la secuencia de nucleótidos
representada por SEQ ID NO: 120; y un ácido nucleico bicatenario en
el que una cadena está constituida por la secuencia de nucleótidos
representada por SEQ ID NO: 121 y la otra cadena está constituida
por la secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 122).
El ácido nucleico bicatenario de la presente invención puede
producirse por procedimientos estándar (por ejemplo, J. Am. Chem.
Soc. 120, 11820-11821, 1998; y Methods, 23,
206-217, 2001). Alternativamente, un fabricante por
contrato de ácidos nucleicos bicatenarios (por ejemplo, RNAi Co.
Ltd.) es muy conocido por aquellos expertos en la materia y puede
utilizarse en la producción del ácido nucleico bicatenario. Se
confirmó por un sistema de diseño de secuencias de ARNip (versión
comercial siDirect (marca registrada), RNAi Co. Ltd.) que las
secuencias diana de los ARNip-1 a
ARNip-6 eran específicas para el polipéptido de la
presente divulgación.
El ácido nucleico bicatenario de la presente
invención puede diseñarse basándose en secuencias de nucleótidos de
ADN (bases en las posiciones 1743 a 1761, 1744 a 1762, 1750 a 1768,
1753 a 1771, 1756 a 1774, o 1757 a 1775 en SEQ ID NO: 1) elegidas
como diana por los ARNip-1 a
ARNip-6. Un ácido nucleico bicatenario tal inhibe
el polipéptido de la presente divulgación, como con los
ARNip-1 a ARNip-6. Por ejemplo, el
ARNip puede diseñarse teniendo un parte bicatenaria que está
constituida por una secuencia de nucleótidos de ARN directamente
convertida a partir de la secuencia de nucleótidos de ADN diana
completa. Alternativamente, el ácido nucleico bicatenario quimérico
ADN-ARN (que comprende tanto ARN como ADN en la
cadena idéntica) puede diseñarse teniendo una secuencia de ARN
convertida a partir de cualquier parte de la secuencia de
nucleótidos de ADN diana. Además, puede diseñarse un ácido nucleico
bicatenario híbrido en el que una cadena es ADN y la otra cadena es
ARN y se produce para uso. La conversión de la secuencia de
nucleótidos de ARN a partir de la secuencia de nucleótidos de ADN
descrita en este documento significa que la dT en la secuencia de
nucleótidos de ADN se convierte en U y otras bases, es decir, dA,
dG y dC se convierten en A, G y C, respectivamente.
El ácido nucleico bicatenario de la presente
divulgación presentó un efecto inhibitorio sobre el crecimiento
independiente del anclaje de una célula que expresa el polipéptido
de la presente divulgación (Ejemplo 8(7)). Por tanto, el
ácido nucleico bicatenario de la presente divulgación puede
utilizarse para preparar la composición farmacéutica para el
tratamiento de cáncer que se muestra que es positivo para el
polinucleótido de la presente divulgación.
Un efecto terapéutico sobre el cáncer que se
muestra que es positivo para el polinucleótido de la presente
divulgación puede confirmarse mediante el uso de un procedimiento
generalmente conocido por aquellos expertos en la materia o un
procedimiento modificado del mismo (véase "La etapa de confirmar
que la sustancia de prueba seleccionada tiene una actividad
terapéutica contra el cáncer").
Una preparación que comprende como principio
activo una sustancia que inhibe el polipéptido de la presente
divulgación (por ejemplo, una sustancia [por ejemplo, un ácido
nucleico bicatenario, proteína (incluyendo un anticuerpo o
fragmento de anticuerpo), péptido u otros compuestos] obtenida por
el procedimiento de cribado de la presente divulgación) puede
prepararse como una composición farmacéutica usando vehículos,
excipientes y/u otros aditivos farmacológicamente aceptables
normalmente usados en la producción de la preparación según el tipo
del principio activo.
Ejemplos de administración puede incluir:
administración por vía oral usando comprimidos, píldoras, cápsulas,
gránulos, gránulos finos, polvos o agentes líquidos orales; y
administración parenteral usando inyecciones para inyección
intravenosa (incluyendo goteo intravenoso), inyecciones
intramusculares o inyección subcutánea, supositorios, agentes de
administración percutánea o agente de administración transmucosa.
Particularmente se prefiere la administración parenteral tal como
inyección intravenosa para péptidos que son digeridos en el
estómago.
Para preparar una composición sólida para
administración por vía oral, 1 o más sustancias activas pueden
mezclarse con al menos un diluyente inactivo, por ejemplo, lactosa,
manitol, glucosa, celulosa microcristalina, hidroxipropilcelulosa,
almidón, polivinilpirrolidona o aluminometasilicato de magnesio. La
composición puede contener aditivos distintos del diluyente
inactivo, por ejemplo, lubricantes, disgregantes, estabilizadores o
disolventes o solubilizantes según un procedimiento estándar. Los
comprimidos o píldoras pueden recubrirse, si es necesario, con un
recubrimiento de azúcar o con una película tal como una sustancia
gastrosoluble o entérica.
Una composición líquida para administración por
vía oral puede comprender, por ejemplo, una emulsión, disolución,
suspensión, jarabe o elixir y puede contener un diluyente inactivo
generalmente usado, por ejemplo, agua purificada o etanol. La
composición puede contener aditivos distintos del diluyente
inactivo, por ejemplo, humectantes, suspensiones, edulcorantes,
aromas o antisépticos.
Una inyección parenteral puede comprender una
disolución, suspensión o emulsión acuosa o no acuosa aséptica. Una
disolución o suspensión soluble en agua puede contener, por ejemplo,
agua destilada o solución salina para inyección como diluyente. Una
disolución o suspensión insoluble en agua puede contener, por
ejemplo, propilenglicol, polietilenglicol, aceite vegetal (por
ejemplo, aceite de oliva), alcoholes (por ejemplo, etanol) o
polisorbato 80 como diluyente. La composición puede contener
adicionalmente humectantes, emulsionantes, dispersantes,
estabilizadores, disolventes o solubilizantes o antisépticos. La
composición puede esterilizarse, por ejemplo, mediante filtración
usando un filtro impermeable a bacterias, formulación de germicidas
en el mismo o irradiación. Alternativamente puede producirse una
composición sólida aséptica y disolverse en agua aséptica u otros
medios asépticos para inyección para uso.
Una dosis puede determinarse apropiadamente en
consideración de la intensidad de actividad del principio activo,
es decir, la sustancia obtenida por el procedimiento de cribado de
la presente divulgación, condiciones, la edad o sexo de un sujeto
que recibe la administración, etc. Preferentemente, la dosis puede
calcularse según una vía como una cantidad que proporciona una
concentración en suero alrededor del tumor o concentración
intratumoral de 3 a 30 veces, por ejemplo, 10 veces superior a una
concentración de fármaco que inhibe el 50% de la actividad o
expresión del polipéptido de la presente invención. Por ejemplo, la
dosis en la administración por vía oral en el adulto (60 kg de peso
corporal) es normalmente de aproximadamente 0,1 a 100 mg/día,
preferentemente de 0,1 a 50 mg/día. La dosis en la administración
parenteral es de 0,01 a 50 mg/día, preferentemente de 0,01 a 10
mg/día, en términos de una inyección.
Una diana terapéutica por la composición
farmacéutica es un sujeto de prueba en el que se ha detectado la
presencia del polinucleótido de la presente divulgación y/o el
polipéptido de la presente divulgación. La sustancia que inhibe el
polipéptido de la presente divulgación mata células que se han
transformado debido al polinucleótido de fusión de
EML4-ALK. Por tanto, la sustancia que inhibe el
polipéptido de la presente divulgación sirve de agente terapéutico
eficaz para cáncer (particularmente, cáncer de pulmón) que se
muestra que es positivo para el polinucleótido de la presente
invención.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención se describirá en detalle a
continuación mediante ejemplos, pero las presentes invenciones no
se limitan a estos ejemplos. Además, a menos que se indique lo
contrario, el procedimiento de la presente invención puede llevarse
a cabo según procedimientos públicamente conocidos. Por tanto, los
reactivos y kits comercialmente disponibles pueden usarse según las
instrucciones de los productos comerciales.
Un ADNc de ALK de longitud completa fue
amablemente suministrado por el Dr. Steve Morris del St. Jude
Children's Research Hospital. Además, este proyecto de investigación
fue aprobado por el comité ético para el estudio de análisis de
genes en la Universidad de Medicina de Jichi.
El anticuerpo anti-ALK
fosforilada y el anticuerpo anti-ALK usados fueron
producidos por Cell Signaling Tecnology Inc. y NEOMARKERS Inc.,
respectivamente.
Usando un kit de purificación de ARN (RNeasy
Mini Column; Qiagen Inc.), el ARN se extrajo de un espécimen
extirpado de adenocarcinoma de pulmón de un hombre de 62 años que
dio consentimiento informado y el ADNc se sintetizó usando
transcriptasa inversa (Power Script Reverse Transcriptase) y
cebadores (un oligonucleótido de SEQ ID NO: 42 y cebador CDS IIA)
(todos de Clontech Inc.). Después de amplificar selectivamente el
ADNc de longitud completa mediante la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR) (17 ciclos de 98ºC durante 10 segundos y 68ºC
durante 6 minutos) usando un cebador (5'-PCR primer
IIA; Clontech Inc.) y una polimerasa (ADN polimerasa PrimeSTAR HS,
Takara Bio Inc.), un adaptador BstX1 (Invitrogen Co.) se unió a
ambos extremos del ADNc. El ADNc así obtenido se ligó a un plásmido
de retrovirus y se construyó una biblioteca de plásmidos de
retrovirus introduciendo este plásmido en E. coli DH10B
(Invitrogen Inc.). Como resultado se ha construido
satisfactoriamente la biblioteca de plásmidos que contiene clones,
más de 1.500.000 unidades formadoras de colonias en total.
Se transfectaron 2 \mug del plásmido de la
biblioteca descrita anteriormente y 0,5 \mug de un plásmido para
encapsidación (pGP y pE-eco, que se obtuvieron ambos
de Takara Bio Inc.) con células de encapsidación BOSC23 usando un
reactivo de transfección. Dos días después de la transfección, el
sobrenadante de cultivo se recuperó como una disolución de
biblioteca de retrovirus recombinantes, se mezcló con polibreno
(Sigama Inc.) a una concentración de 4 \mug/ml y la mezcla se
añadió a células 3T3 de ratón a MOI (multiplicidad de infección) de
concentración 0,1. Dos días después, el sobrenadante de cultivo de
células 3T3 se cambió por medio DMEM-F12
(Invitrogen Inc.) complementado con suero bovino al 5% (Invitrogen
Inc.) y L-glutamina 2 mM, y las células se
cultivaron 2 semanas más para obtener 10 o más tipos de focos
transformados. Después de aislar cada clon de células 3T3, el
cultivo de los clones continuó por separado y el ADN genómico de
cada clon se extrajo. El ADNc viral integrado en cada clon de 3T3
se amplificó y se recuperó llevando a cabo PCR (30 ciclos de 98ºC
durante 10 segundos y 68ºC durante 6 minutos) usando 10 ng del ADN
genómico como molde, cebador 5'-PCR primer IIA y
ADN polimerasa (ADN polimerasa PrimeStar HS; Takara Bio Inc.) y se
clonó en el vector pT7Blue-2.
Uno de los ADNc así obtenidos tenía una longitud
de 3926 pares de bases (SEQ ID NO: 1) y tenía un único marco de
lectura abierto (de la base 271 a 3447 de SEQ ID NO: 1) que
codificaba una proteína que tenía 1059 residuos de aminoácidos (SEQ
ID NO: 2; una secuencia novedosa de longitud completa).
Aproximadamente la mitad del extremo amino de SEQ ID NO: 2
(residuos de aminoácidos 1-496 de SEQ ID NO: 2) se
apareó perfectamente con los residuos de aminoácidos
1-496 de la proteína 4 similar a proteína asociada a
microtúbulos equinodermos; EML4 (nº de registro de GenBank
NM_019063), y por otra parte, aproximadamente la mitad del extremo
carboxilo (residuos de aminoácidos 497-1059 de SEQ
ID NO: 2) se apareó perfectamente con la secuencia de aminoácidos
de cinasa de linfoma anaplásico; ALK (nº de registro de GenBank
AB209477). Por tanto, en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:
1, el 99,9% de las bases 35-1759 se aparearon con
las bases 1-1725 del ADNc de EML4 humano informado,
y las bases 1760-3677 de SEQ ID NO: 1 se aparearon
con las bases 3613-5530 de ADNc de ALK humano al
99,9%. Aunque las secuencias respectivas son un poco diferentes de
las secuencias de bases informadas, ninguna de estas diferencias
conduce a la sustitución de aminoácidos y, por tanto, puede ser
posible que sean polimorfismo de secuencias de genes. De los
resultados anteriores, se creyó que el ADNc presente era un ADNc
fusionado entre una parte de ADNc de EML4 y una parte de ADNc de
ALK. Además, el ADNc obtenido (SEQ ID NO: 1) contuvo un dominio de
tirosina cinasa ALK.
\vskip1.000000\baselineskip
El gen EML4 y el gen ALK en seres humanos están
ambos mapeados en el brazo corto del segundo cromosoma en
direcciones opuestas (dirección de cabeza a cabeza). Para producir
el polinucleótido de fusión de EML4-ALK encontrado
en el ejemplo 1 se necesita cortar los genomas respectivos en el
intrón aguas abajo del exón 13 del gen EML4 y el intrón aguas
arriba del exón 21 del gen ALK y religarlos con el gen en la
dirección inversa. Para investigar esto directamente, la PCR
(después de 94ºC durante 1 minuto, 40 ciclos de 98ºC durante 20
segundos y 68ºC durante 9 minutos) se llevó a cabo usando cebadores
que tenían las secuencias de bases de SEQ ID NO: 40 (una secuencia
diseñada en la cadena de transcripción del extremo 3' del exón 13
del gen EML4) y SEQ ID NO: 36 (una secuencia diseñada en la cadena
complementaria del exón 21 del gen ALK), moldes de ADN genómico de
un paciente (ID 33) y el ADN genómico de control (el ADN genómico de
monocitos periféricos de hembra sana normal (46, XX)) y ADN
polimerasa (LA Taq polimerasa; Takara Bio Inc.).
Como resultado, como se muestra en la Fig. 1, se
obtuvo un producto de PCR que tenía aproximadamente 4 kpb de
longitud sólo con el ADN genómico del presente paciente. Es decir,
se confirmó como se esperaba que en el nivel genómico el gen EML4 y
el gen ALK se cortaron en los intrones y se religaron en la
dirección inversa. Además, este producto de PCR de aproximadamente
4 kpb se clonó en un vector pT7Blue-2 (Novagen Inc.)
y se determinó la secuencia de bases total. Era evidente que los
cortes se localizaron aproximadamente a 3,6 kpb aguas abajo del
exón 13 del gen EML4 y 297 pb aguas arriba del exón 21 del gen ALK.
La secuencia de bases se muestra en SEQ ID NO: 4. SEQ ID NO: 4 es
una secuencia genómica que incluye el punto de fusión del gen EML4
y el gen ALK.
\vskip1.000000\baselineskip
Los ADNc se sintetizaron a partir de 33 casos de
especímenes clínicos (especímenes extirpados de cáncer de pulmón de
células no pequeñas) incluyendo el caso (ID 33) usado en el presente
Ejemplo 1 y 2 y de monocitos periféricos de un caso de un sujeto
sano normal (46, XX).
Para detectar el ADNc del polinucleótido de
fusión de EML4-ALK v1, la PCR (50 ciclos de 94ºC
durante 15 segundos, 60ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 1
minuto) se llevó a cabo usando un kit de PCR cuantitativa
(QuantiTect SYBR Green; Qiagen Inc.), los ADNc como sustratos
preparados a partir de los especímenes clínicos y el sujeto sano
normal descrito anteriormente y oligonucleótidos de SEQ ID NO: 8 y 9
como cebadores. Usando los mismos especímenes, las amplificaciones
por PCR del ADNc de
gliceraldehído-3-fosfato
deshidrogenasa (en lo sucesivo GAPDH) se probaron como control.
Para detectar el ADNc de GAPDH, los oligonucleótidos que están
constituidos por las secuencias de nucleótidos representadas por SEQ
ID NO: 10 y 11 se usaron como cebadores. Las muestras
respectivamente amplificadas se sometieron a electroforesis con un
ADN marcador de tamaño (marcador: escala de 50 pb, Invitrogen
Inc.). Como resultado, como se muestra en la parte superior de la
Fig. 2, en los 3 casos en total que incluyen ID 33 se detectó el
ADNc del polinucleótido de fusión de EML4-ALK v1.
Además, en todos los casos analizados se confirmó claramente una
amplificación del ADNc de GAPDH (parte inferior de la Fig. 2).
Además, se analizó la secuencia de bases de los productos de PCR
identificados en los casos de ID 20 y ID 39 y el resultado confirmó
que la secuencia era idéntica a la de ID 33 (los 247 pb que
incluyen el punto de fusión del gen EML4 y el gen ALK. SEQ ID NO:
14). Es decir, el resultado de los análisis de los 33 casos de
cáncer de pulmón de células no pequeñas confirmó que la fusión del
gen EML4 y el gen ALK se produce en el 9,1% de los casos (3/33
casos).
Se ha sabido que la mutación en el gen EGFR es
una de las causas de cáncer de pulmón. En los 33 especímenes de los
casos analizados como se describe anteriormente, el análisis de la
presencia de una anomalía en la secuencia de bases del gen EGFR
según el procedimiento conocido confirmó una deleción parcial del
exón 19 en 6 casos. Los casos que tienen la mutación del gen EGFR y
los casos positivos para el polinucleótido de fusión de
EML4-ALK pertenecieron a diferentes subgrupos. Es
decir, se espera que los agentes terapéuticos existentes para
cáncer de pulmón, que son los agentes terapéuticos para el cáncer de
pulmón producido por la mutación en el gen EGFR, no sean eficaces
para los pacientes con cáncer de pulmón que son positivos para el
polinucleótido de fusión de EML4-ALK.
Por tanto, los 33 cases analizados como se
describe anteriormente se sometieron a la investigación tanto si
existió como si no el gen ALK de longitud completa y se encontró que
existía en 8 casos. Los especímenes de los 7 casos entre estos 8
casos no contenían el polinucleótido de fusión de
EML4-ALK (es decir, el gen ALK de longitud completa
no existía en 2 casos entre los 3 casos en los que era positivo el
polinucleótido de fusión de EML4-ALK).
Además, los análisis de 42 casos de otros casos
de cáncer de pulmón de células no pequeñas por un procedimiento
similar como se describe anteriormente dieron productos de PCR de
aproximadamente 1 kpb en el 4,8% de los casos (2/42 casos), que son
más largos que los detectados en los casos de los casos ID 33, ID 20
y ID 39. Éstos se clonaron en el vector pT7Blue-2 y
se analizó la secuencia de bases. Los resultados indicaron que
éstos no eran el exón 13 del gen EML4, pero sí un producto de fusión
del exón 20 del gen EML4 y el exón 21 del gen ALK (SEQ ID NO: 3).
Es decir, en estos productos el fragmento del gen ALK fusionado era
el mismo, pero el punto de escisión en el EML4 era diferente. La
secuencia de ADNc del gen de fusión del exón 1-20
del gen EML4 y el exón 21-30 del gen ALK, que
contiene el punto de fusión del gen EML y el gen ALK encontrado en
SEQ ID NO: 3, se muestra en SEQ ID NO: 6, y la secuencia de
aminoácidos del polipéptido así codificado se muestra en SEQ ID NO:
7. En la presente descripción, el polinucleótido que codifica la
proteína constituida por el polipéptido representado por SEQ ID NO:
7 se llama el polinucleótido de fusión de EML4-ALK
v2. El plásmido producido aquí en el que un fragmento parcial del
polinucleótido de fusión de EML4-ALK v2 se clona se
designa EML4-ALKv2
parcial/pT7Blue-2.
Resultó que la presencia del polinucleótido de
fusión de EML4-ALK puede detectarse en muestras
obtenidas de los sujetos de prueba por PCR usando las muestras de
ADN genómico extraídas de los especímenes clínicos (especialmente
el tejido de pulmón) de los sujetos de prueba como Ejemplo 2. Por
tanto, como se muestra más adelante, la detección del
polinucleótido de fusión de EML4-ALK v1 se probó
usando diversos cebadores. Usando 1 ng del vector
pT7Blue-2 como molde, en el que se clonó el producto
de PCR de aproximadamente 4 kpb producido como se describe
anteriormente, y usando un conjunto de cebadores [SEQ ID NO: 15 y
SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 y SEQ
ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 y SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23 y SEQ ID NO:
24, SEQ ID NO: 25 y SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27 y SEQ ID NO: 28,
SEQ ID NO: 29 y SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31 y SEQ ID NO: 32, o SEQ
ID NO: 33 y SEQ ID NO: 34], la PCR (30 ciclos de 94ºC durante 15
segundos, 55ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 1 minuto) se
llevó a cabo mediante una ADN polimerasa (ADN polimerasa rTaq;
Takara Bio Inc.). Los resultados indicaron que en cada PCR se
amplificó un fragmento de ADN monocatenario que tenía un tamaño
esperado (de aproximadamente 270 a 380 pb). De los resultados
anteriores es evidente que la detección del polinucleótido de
fusión de EML4-ALK v1 es posible llevando a cabo la
PCR usando el ADN genómico extraído de los especímenes clínicos
como molde y diversos conjuntos de cebadores que se piensa que
detectan específicamente la presencia del polinucleótido de fusión
de EML4-ALK v1.
Se diseñaron un oligonucleótido que tiene la
secuencia de bases representada por SEQ ID NO: 35 en el exón 20 de
EML4 y un oligonucleótido que tiene la secuencia de bases
representada por SEQ ID NO: 36 en el lado complementario del exón
ALK 21 como cebador sentido y cebador antisentido, respectivamente.
Usando éstos y usando el ADN genómico de un paciente
(ID#KL-3121) como molde en el que se detectó el ADNc
del polinucleótido de fusión de EML4-ALK v2, la PCR
(después de 94ºC durante 1 minuto, 40 ciclos de 98ºC durante 20
segundos y 68ºC durante 6 minutos) se llevó a cabo con una ADN
polimerasa (LA Taq polimerasa; Takara Bio Inc.). Como resultado se
obtuvo un producto de PCR de aproximadamente 850 pb. El producto de
PCR se clonó en el vector pT7Blue-2, la secuencia
de bases se determinó y se obtuvo una secuencia de 853 pb mostrada
en SEQ ID NO: 5. Los análisis de la secuencia revelaron que los 35
pb localizados en el extremo 3' del exón 20 de EML4 y los 544 pb de
la secuencia de intrones aguas abajo del exón 20 de EML4 se ligaron
a los 233 pb de la secuencia de intrones aguas arriba del exón 21
de ALK y los 41 pb localizados en el extremo 5' del exón 21 de ALK.
Es decir, es evidente que la escisión del genoma se produjo en una
localización 544 pb aguas abajo del exón 20 de EML4 y en una
localización 233 pb aguas arriba del exón 21 de ALK. Usando 1 ng de
vector pT7Blue-2 como molde, en que se clonó el
producto de PCR de 853 pb preparado como se describe anteriormente,
y usando un conjunto de cebadores [SEQ ID NO: 37 y SEQ ID NO: 38,
SEQ ID NO: 39 y SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 41 y SEQ ID NO: 20, SEQ
ID NO: 43 y SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 45 y SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO:
47 y SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 49 y SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 51 y
SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53 y SEQ ID NO: 54, o SEQ ID NO: 55 y SEQ
ID NO: 34], la reacción de PCR se llevó a cabo bajo las mismas
condiciones que las del Ejemplo 3(2). Como resultado, en
cada PCR se amplificó un fragmento de ADN monocatenario que tenía el
tamaño esperado (de aproximadamente 270 a 380 pb). De los
anteriores resultados resulta que la detección de la presencia del
polinucleótido de fusión de EML4-ALK v2 es posible
llevando a cabo la PCR usando el ADN genómico extraído de los
especímenes clínicos como molde y los conjuntos de cebadores que se
piensa que detectan específicamente el polinucleótido de fusión de
EML4-ALK v2.
\vskip1.000000\baselineskip
A partir del clon en el que se clonó el
polinucleótido de fusión de EML4-ALK v1 en la
dirección positiva (designado EML4-ALK
v1/pT7Blue-2), el inserto se sacó digiriendo con
enzimas de restricción EcoRI y SalI y se subclonó en los sitios
EcoRI-SalI de pMXS (JBC 275,
24945-24952, 2000). Éste se designó
EML4-ALK v1/pMS. Por tanto, el ADNc de las bases
277-3450 de la SEQ ID NO: 1 que tiene los sitios en
ambos extremos que son reconocidos por la enzima de restricción
EcoRI se amplificó llevando a cabo la PCR (25 ciclos de 98ºC durante
10 segundos, 68ºC durante 5 minutos) usando el plásmido
EML4-ALK v1/pT7Blue-2 como molde y
oligonucleótidos que están constituidos por la secuencia de bases
representada por SEQ ID NO: 59 y SEQ ID NO: 60 como cebadores y una
ADN polimerasa (ADN polimerasa PrimeStar HS). Después de digerir con
EcoRI, éste se introdujo en el sitio EcoRI de un vector de
expresión pcDNA3, que se modifica de manera que el inserto pueda
expresarse con una marca FLAG añadida al extremo N para producir un
plásmido de expresión
(FLAG-EML4-ALKv1/pcDNA3) para el
polipéptido de fusión de EML4-ALK v1 que tiene la
marca FLAG en el extremo N (denominado en lo sucesivo
FLAG-EML4-ALKv 1). Además, el ADNc
de FLAG-EML4-ALKv 1 se sacó de este
vector digiriendo con enzimas de restricción HindIII y XbaI, y
después de convertir ambos extremos en romos, un adaptador
EcoRI-NotI-BamHI (Takara Bio Inc.)
se ligó a ambos extremos. El producto se introdujo en el sitio
EcoRI de un vector de expresión, mediante el cual el ADNc insertado
y el antígeno de superficie celular CD8 pueden expresarse al mismo
tiempo (vector bicistrónico pMX-iresCD8; J. Biol.
Chem. 2001, vol. 276, p39012-39020) para producir un
vector de expresión que expresa tanto
FLAG-EML4-ALKv1 como CD8. Éste se
designó
FLAG-EML4-ALKv1/pMX-iresCD8.
El polinucleótido de fusión de
EML4-ALK v2 se clonó del siguiente modo.
Usando un polinucleótido de longitud completa de
EML4 clonado en pT7Blue-2 según "Genomics",
(EE.UU.), 2000, vol. 68, pág. 348-350, como molde
para obtener un fragmento de polinucleótido que codifica EML4 del
polinucleótido de fusión de EML4-ALK v2, y usando un
oligonucleótido representado por SEQ ID NO: 57, en el que una
secuencia de escisión de EcoRI está unida al extremo 5' del codón de
iniciación ATG del exón 1 del gen EML4, y un oligonucleótido
representado por SEQ ID NO: 58, cuya secuencia está constituida por
10 bases del extremo 5' de la secuencia antisentido del exón 21 del
gen ALK fusionado al extremo 5' de la secuencia antisentido a las
20 bases del 3' extremo del exón 20 del gen EML4, respectivamente,
como cebadores sentido y antisentido, y usando una ADN polimerasa
(ADN polimerasa Pyrobest; Takara Bio Inc.), la PCR (25 ciclos
de 94ºC durante 20 segundos, 60ºC durante 30 segundos, 72ºC durante
1 minuto) se llevó a cabo para obtener un producto de PCR de
aproximadamente 2260 pb. Este producto se designó producto de PCR
A.
Mientras que se usa el
EML-ALKv1/pTBlue-2 producido en el
presente Ejemplo 4(1) como molde para obtener el fragmento
de polinucleótido de ALK del polinucleótido de fusión de
EML4-ALK v2, y usando un oligonucleótido
representado por SEQ ID NO: 101, la secuencia que está constituida
por las 10 bases de la secuencia sentido en el extremo 3' del exón
20 del gen EML4 fusionado al extremo 5' de las 20 bases de la
secuencia sentido en el extremo 5' del exón 21 del gen ALK y un
oligonucleótido representado por SEQ ID NO: 102, en el que la
secuencia de escisión Xba I está unida al extremo 5' del área de la
secuencia antisentido que contiene el codón de terminación presente
en el exón 30 del gen ALK como cebadores sentido y antisentido,
respectivamente, la PCR se llevó a cabo bajo la misma condición que
para obtener el producto de PCR A para obtener un producto de PCR
de aproximadamente 1700 pb. Este se designó el producto de PCR
B.
Los productos de PCR A y B descritos
anteriormente se mezclaron y se llevaron a cabo reacciones de
hibridación y extensión (3 ciclos de 94ºC durante 1 minuto, 55ºC
durante 30 segundos y 72ºC durante 2 minutos y 30 segundos) usando
una ADN polimerasa (ADN polimerasa Pyrobest; Takara Bio Inc.)
para obtener un producto de aproximadamente 4000 pb. Este producto
se clonó por TA en el vector pCR2.1-TOPO usando el
kit de clonación TOPO TA (Invitrogen Inc.) y se analizó la
secuencia de bases. Se obtuvo, como se muestra en SEQ ID NO: 6, que
estuvo constituida por 2242 bases desde el codón de iniciación ATG
del gen EML4 hasta el exón 20 y 1691 bases desde el exón 21 del gen
ALK hasta el codón de terminación del exón 30.
Usando 1 ng de
FLAG-EML4-ALKv1/pMX-iresCD8
descrito en (1) como molde de polinucleótido de fusión de
EML4-ALK v1 y 1 ng de EML4-ALKv2
parcial/pT7Blue-2 en el ejemplo 3 como molde para el
polinucleótido de fusión de EML4-ALK v2, y usando
un conjunto de cebadores [conjunto de cebadores para el
polinucleótido de fusión de EML4-ALK v1; (SEQ ID
NO: 61 y SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63 y SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65
y SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67 y SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69 y SEQ
ID NO: 70, SEQ ID NO: 71 y SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73 y SEQ ID
NO: 74, SEQ ID NO: 75 y SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77 y SEQ ID NO:
78, o SEQ ID NO: 79 y SEQ ID NO: 80) y el conjunto de cebadores
para el polinucleótido de fusión de EML4-ALK v2;
(SEQ ID NO: 81 y SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 83 y SEQ ID NO: 84, SEQ
ID NO: 85 y SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 87 y SEQ ID NO: 88, SEQ ID
NO: 89 y SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 91 y SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 93
y SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 95 y SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 97 y SEQ
ID NO: 98, o SEQ ID NO: 99 y SEQ ID NO: 100)], la PCR (30 ciclos de
94ºC durante 15 segundos, 55ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 1
minuto) se llevó a cabo por una ADN polimerasa (ADN polimerasa
rTaq; Takara Bio Inc.). Como resultado, en todo el conjunto de
cebadores se amplificó un fragmento de ADN monocatenario, teniendo
cada uno el fragmento esperado (aproximadamente de 260 a 350 pb). De
los resultados anteriores se confirmó que la detección de la
presencia del polinucleótido de fusión de EML4-ALK
v1 y/o v2 es posible llevando a cabo RT-PCR según
el presente ejemplo usando ARNm extraído de las muestras de sujetos
de prueba como molde.
Los resultados del Ejemplo 3 y 4(2)
descritos anteriormente indicaron que la presencia del
polinucleótido de fusión de EML4-ALK v1 y v2 puede
detectarse usando tanto ADNc como ADN genómico preparado a partir de
los especímenes clínicos obtenidos de sujetos de prueba. Este hecho
sugiere que los pacientes que tienen el polinucleótido de fusión de
EML4-ALK pueden seleccionarse y que puede
practicarse un tratamiento hecho a medida por lo que los pacientes
que van a tratarse mediante la administración de inhibidores del
polinucleótido de fusión de EML4-ALK y/o
polipéptido se seleccionan de antemano y luego se tratan.
\vskip1.000000\baselineskip
Se produjo un retrovirus recombinante mediante
un procedimiento similar al que se describe anteriormente usando
FLAG-EML4-ALKv1/pMX-iresCD8
y un vector blanco (pMX-iresCD8) y con él se
infectaron células BA/F3 de la línea celular linfática de ratón.
Las células que expresan CD8 en la superficie celular se purificaron
simplemente usando reactivo de perlas magnéticas para la separación
de células y una columna de purificación (perlas magnéticas unidas
a anticuerpo monoclonal anti-CD8 y columna de
purificación MiniMACS, ambas de Miltenyi Biotec Inc.).
Después de mezclar muestras de esputo de sujetos
sanos normales con las células BA/F3 que expresan polinucleótido de
fusión de EML4-ALK v1 (denominadas en lo sucesivo
células BA/F3 que expresan v1) a 0/ml, 10 células/ml, 100
células/ml, 1000 células/ml y 10.000 células/ml, el ADNc se
sintetizó por el procedimiento estándar. La presencia del
polinucleótido de fusión de EML4-ALK v1 en esputo se
examinó llevando a cabo una reacción de PCR (50ºC durante 2
minutos, 95 minutos durante 15 minutos y adicionalmente 40 ciclos de
la siguiente reacción (94ºC durante 15 segundos, 60ºC durante 30
segundos y 72ºC durante 1 minuto)) usando el ADNc descrito
anteriormente como sustrato, y los oligonucleótidos que están
constituidos por la secuencia de bases representada por SEQ ID NO:
8 y SEQ ID NO: 9 como cebadores y un kit de PCR cuantitativa
(QuantiTect SYBR Green; Qiagen Inc.), y se obtuvieron productos de
PCR. Como resultado, en cada caso, excepto a 0/ml, pudo confirmarse
la presencia del polinucleótido de fusión de
EML4-ALK v1.
Convencionalmente, el examen citopatológico
usando muestras de esputo ha sido un importante procedimiento de
diagnóstico para el diagnóstico de cáncer de pulmón. Este
diagnóstico para cáncer de pulmón se basa en la presencia de
células atípicas en esputo, pero no puede hacerse un diagnóstico
fidedigno a menos que en el esputo existan muchas células
cancerosas de pulmón. Sin embargo, la mayor parte de las veces,
tales casos ya estaban en el estado avanzado y fue casi imposible
practicar un diagnóstico precoz eficaz para cáncer de pulmón. Según
la presente invención, si el polinucleótido de fusión de
EML4-ALK está presente en esputo, es evidente que
puede detectarse por PCR incluso si hay una cantidad mínima.
\vskip1.000000\baselineskip
El EML4-ALK (K589M)/pMXS, en el
que el aminoácido 589 (sitio de unión a ATP), un residuo de lisina,
del polipéptido de fusión de EML4-ALK v1 se
sustituyó con metionina, se produjo usando
EML4-ALKv1/pMXS como sustrato y usando un kit de
introducción de mutaciones (kit de mutagénesis dirigida al sitio
QuickChange; Stratagene Inc.). En la reacción se usaron
oligonucleótidos de SEQ ID NO: 103 y SEQ ID NO: 104. El ADNc de ALK
(Morris, SW y col., Science. 4 de marzo de 1994; 263
(5151):1281-4) se clonó con un vector de retrovirus
pMXS según el procedimiento estándar (designado ALK/pMXS).
El EML4-ALKv1/pMXS descrito
anteriormente, ALK/pMXS, un plásmido que expresa
EML4-ALK
(K589M)/pMXS y un vector blanco sin ADNc insertado (pMXS) se transfectaron en células de fibroblasto 3T3 mediante el procedimiento de fosfato de calcio y se cultivaron durante 21 días. Como se muestra en la parte superior de la Fig. 3, sólo se observaron muchos focos de transformación cuando se transfectó el polipéptido de fusión de EML4-ALK v1 que expresa el vector. La barra de escala indica 100 \mum. Además, las mismas células 3T3 transfectadas se inocularon subcutáneamente a ratones desnudos a 5 x 10^{5} células/ratón y se observaron durante 20 días. También resultó que el tumor sólo se formó cuando se inoculó el polipéptido de fusión de EML4-ALK v1 que expresa células. Los números de formación de tumores (el número de sitios de inoculación de células 3T3 y el número de formación de tumores entre ellas) son del siguiente modo. El número de formación de tumores de la expresión de longitud completa de ALK fue 0 entre 8, mientras que el número de formación de tumores en el polipéptido de fusión EML.4-ALK v1 que expresa células era 8 entre 8. Además, el número de formación de tumores de EML4-ALK (K589M) que expresa células era 0 entre 8. Estos resultados demuestran que desde que la expresión del polipéptido de ALK de longitud completa no induce tumor, pero el polipéptido de fusión de EML4-ALK v1 es tumorigénico, el polinucleótido de fusión de EML4-ALK v1 es el gen causal del cáncer. Por tanto, debido a que la tumorigenicidad de EML4-ALK no se observó en EML4-ALK (K589M), parecería que la tumorigenicidad dependía de la actividad de cinasa. En lo sucesivo, las células 3T3 en las que el polipéptido de fusión de EML4-ALK v1 se expresa se designan células
3T3 que expresan v1.
(K589M)/pMXS y un vector blanco sin ADNc insertado (pMXS) se transfectaron en células de fibroblasto 3T3 mediante el procedimiento de fosfato de calcio y se cultivaron durante 21 días. Como se muestra en la parte superior de la Fig. 3, sólo se observaron muchos focos de transformación cuando se transfectó el polipéptido de fusión de EML4-ALK v1 que expresa el vector. La barra de escala indica 100 \mum. Además, las mismas células 3T3 transfectadas se inocularon subcutáneamente a ratones desnudos a 5 x 10^{5} células/ratón y se observaron durante 20 días. También resultó que el tumor sólo se formó cuando se inoculó el polipéptido de fusión de EML4-ALK v1 que expresa células. Los números de formación de tumores (el número de sitios de inoculación de células 3T3 y el número de formación de tumores entre ellas) son del siguiente modo. El número de formación de tumores de la expresión de longitud completa de ALK fue 0 entre 8, mientras que el número de formación de tumores en el polipéptido de fusión EML.4-ALK v1 que expresa células era 8 entre 8. Además, el número de formación de tumores de EML4-ALK (K589M) que expresa células era 0 entre 8. Estos resultados demuestran que desde que la expresión del polipéptido de ALK de longitud completa no induce tumor, pero el polipéptido de fusión de EML4-ALK v1 es tumorigénico, el polinucleótido de fusión de EML4-ALK v1 es el gen causal del cáncer. Por tanto, debido a que la tumorigenicidad de EML4-ALK no se observó en EML4-ALK (K589M), parecería que la tumorigenicidad dependía de la actividad de cinasa. En lo sucesivo, las células 3T3 en las que el polipéptido de fusión de EML4-ALK v1 se expresa se designan células
3T3 que expresan v1.
Los diversos mutantes de deleción (mutante de
deleción \DeltaBasic (se delecionaron los aminoácidos
31-140 del polipéptido de fusión de
EML4-ALK v1), mutante de deleción \DeltaHELP (se
delecionaron los aminoácidos 220-296 del
polipéptido de fusión de EML4-ALK v1), mutante de
deleción \DeltaWD (se delecionaron los aminoácidos
305-475 del polipéptido de fusión de
EML4-ALK v1)) de la parte de EML4 del polinucleótido
de fusión de EML4-ALK v1 se prepararon mediante
reacción de PCR usando
FLAG-EML4-ALKv
1/pMX-iresCD8 como molde y usando un kit de
clonación (mutagénesis dirigida al sitio basada en PCR ExSite;
Stratagene Inc.). Usando estos plásmidos de mutantes de deleción se
prepararon disoluciones de retrovirus usando un procedimiento
similar al del Ejemplo 1 para obtener células 3T3 infectadas. Estas
células infectadas respectivas se inocularon subcutáneamente a
ratones desnudos para investigar la tumorigenicidad y se encontró
que los tumores se formaron por células 3T3 que expresan el mutante
de deleción \DeltaHELP y el mutante de deleción \DeltaWD. El
número formador de tumores de células 3T3 respectivas que expresan
el mutante de deleción \DeltaBasic, el mutante de deleción
\DeltaHELP y el mutante de deleción \DeltaWD fue 0 entre 8, 7
entre 8 y 8 entre 8, respectivamente. Como no se observó formación
de tumores en el mutante de deleción \DeltaBasic, se demuestra que
los aminoácidos 31-140 del polipéptido de fusión de
EML4-ALK v1 son importantes en la tumorigénesis.
Como parece que el polipéptido de fusión de
EML4-ALK v2, al igual que el polipéptido de fusión
de EML4-ALK v1, contiene los aminoácidos
31-140 anteriormente mencionados y la región de
cinasa ALK, se considera que el polinucleótido de fusión de
EML4-ALK v2, al igual que el polinucleótido de
fusión de EML4-ALK, es el gen causal del cáncer que
codifica el polipéptido que tiene la transformabilidad y
tumorigenicidad para células 3T3.
\vskip1.000000\baselineskip
Las células BA/F3 que expresan v1 (Ejemplo
5(1)) se cultivaron en medio RPM1640 que contenía 10% de
suero bovino fetal para obtener 2,7 x 10^{9} células. Después de
lavar 3 veces con PBS, las células se lisaron en una disolución de
lisis (Tris-HCl 50 mM (pH 7,4), NaCl 150 mM, Triton
X100 al 1%, EDTA 5 mM, EGTA 5 mM, NaVO_{4} 1 mM, DTT 1 mM y
mezcla completa de inhibidor de proteasa). El polipéptido de fusión
de EML4-ALK v1 presente en el sobrenadante obtenido
después de una centrifugación se purificó usando gel de afinidad
ANTI-FLAG M2 (SIGMA-ALDRICH Inc.)
según el procedimiento descrito en el documento de información del
producto. Para el lavado y la elución se usaron la disolución de
lavado (Tris-HCl 50 mM (pH 7,4), NaCl 250 mM, Brij35
al 0,05%, EDTA 1 mM, EGTA 1 mM, NaVO_{4} 1 mM, DTT 1 mM,
completo) y la disolución de elución (Tris-HCl 50
mM (pH 7,4), NaCl 150 mM, Brij35 al 0,05%, DTT 1 mM, 0,5 mg/ml de
péptido FLAG), respectivamente. La inmunotransferencia usando
anticuerpo anti-ALK y anticuerpo
anti-FLAG M2 (SIGMA-ALDRICH Inc.) y
la tinción con plata se llevaron a cabo para el eluato para
detectar el polipéptido de fusión de EML4-ALK v1. Se
demostró que el polipéptido de fusión de EML4-ALK
v1 puede prepararse por este procedimiento.
El polipéptido de fusión de
EML4-ALK v1 purificado como se describe
anteriormente se diluyó en una disolución de reacción
(Tris-HCl 15 mM (pH 7,4), MgCl_{2} 0,25 mM,
Tween-20 al 0,01%, DTT 2 mM) y luego no se añadió
ATP o se añadió ATP 20 \muM. Las mezclas respectivas se hicieron
reaccionar a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de la
reacción, el polipéptido de fusión de EML4-ALK v1
autofosforilado y el polipéptido de fusión de
EML4-ALK v1 se detectaron por inmunotransferencia
usando anticuerpo anti-ALK fosforilada que reconoce
específicamente el producto fosforilado en el residuo de tirosina
1604 de ALK, y anticuerpo anti-ALK, y se
cuantificaron por un sistema de análisis de imágenes (VersaDoc
Imaging System; Bio-Rad Inc.). La cantidad de
fosforilación se calibró dividiendo el recuento del polipéptido de
fusión de EML4-ALK v1 autofosforilado entre el
recuento del polipéptido de fusión de EML4-ALK v1.
Como resultado, la banda del polipéptido de fusión de
EML4-ALK v1 autofosforilado se detectó en la
localización de aproximadamente 130 kDa bajo la condición de la
adición de ATP, y la cantidad de fosforilación aumentó
aproximadamente 205 veces en comparación con la no adición de
ATP.
Además, la actividad de fosforilación frente a
un sustrato peptídico se investigó usando un kit de detección de
actividad de cinasa (HTRF KinEASE-TK; Cisbio Inc.).
Usando TK sustrate 1, que se incluyó en el kit, como sustrato y
después de no añadir ATP o añadir ATP 100 \muM, las mezclas se
hicieron reaccionar a temperatura ambiente durante 1 hora y el
recuento de HTRF se detectó como se recomienda por el fabricante
del kit. Como resultado es evidente que el recuento de HTRF (es
decir, la fosforilación del sustrato peptídico) aumentó
aproximadamente 12 veces mediante la adición de ATP en comparación
con la no adición de ATP. Como se muestra anteriormente, la
actividad de cinasa in vitro del polipéptido de fusión de
EML4-ALK v1 puede detectarse usando anticuerpo
anti-ALK fosforilada y el kit de detección de
actividad de cinasa.
El efecto inhibitorio del compuesto
A-D contra la actividad de cinasa in vitro
del polipéptido de fusión de EML4-ALK v1 se
investigó usando anticuerpo anti-ALK fosforilada y
el kit de detección de actividad de cinasa. Los compuestos
respectivos se añadieron a la disolución de reacción que contenía el
polipéptido de fusión de EML4-ALK v1 a una
concentración final de 10 \muM o 10 nM, y luego la reacción se
llevó a cabo con o sin la adición de ATP. El resto de las
operaciones se llevaron a cabo según el procedimiento (2) descrito
anteriormente. En ausencia del compuesto se supuso que el recuento
de fosforilación sin la adición de ATP y con la adición de ATP era
el 100% de inhibición y el 0% de inhibición, respectivamente. La
inhibición (%) de la actividad de cinasa del polipéptido de fusión
de EML4-ALK v1 por un compuesto se calculó por la
siguiente fórmula.
[Inhibición de la actividad de
cinasa (%) por un compuesto = (1-[recuento de fosforilación
cuando
se añadieron el compuesto y ATP-recuento de fosforilación cuando no se añadió el compuesto y no se añadió ATP]/[recuento de fosforilación cuando no se añadió el compuesto y se añadió ATP-recuento de fosforilación cuando no se añadió el compuesto y no se añadió ATP]) x 100
se añadieron el compuesto y ATP-recuento de fosforilación cuando no se añadió el compuesto y no se añadió ATP]/[recuento de fosforilación cuando no se añadió el compuesto y se añadió ATP-recuento de fosforilación cuando no se añadió el compuesto y no se añadió ATP]) x 100
Como resultado se encontró que el compuesto
A-D inhibió la actividad de fosforilación del
polipéptido purificado de fusión EML4-ALK v1 de sí
mismo y el sustrato peptídico (Tabla 1). El compuesto A y B podrían
seleccionarse como sustancias que inhibieron la actividad del
polipéptido de fusión de EML4-ALK v1 el 50% o más a
una concentración de 10 \muM o menos, y el compuesto C y D podrían
seleccionarse como sustancias que inhibieron la actividad del
polipéptido de fusión de EML4-ALK v1 el 50% o más a
una concentración de 0,1 \muM o menos.
Los resultados anteriores indicaron que el
cribado (un cribado de tipo in vitro) de una sustancia que
inhibe la actividad del polipéptido de la presente invención podría
realizarse preparando el polipéptido de fusión de
EML4-ALK y usando la actividad de cinasa in
vitro como índice.
El compuesto A (1 \muM, 5 \muM y 10 \muM)
se añadió al medio de cultivo de células BA/F3 que expresan v1
(Ejemplo 5(1)) o no se añadió, y se cultivó durante 3 horas.
Además, las células BA/F3 que expresan
FLAG-EML4-ALKv1 (K589M) se
produjeron usando el vector pMX-iresCD8 en el que se
integró EML4-ALK (K589M) de manera que pudiera
añadirse FLAG, y se cultivaron. Después del cultivo, las células se
contaron y el nivel de fosforilación de tirosina del polipéptido de
fusión de EML4-ALK v1 se midió mediante
inmunotransferencia usando anticuerpo anti-ALK
fosforilada. Además, para la misma membrana de transferencia se
llevó a cabo el análisis de inmunotransferencia por anticuerpo
anti-marca FLAG (Eastman Kodak Inc.) y se midió la
cantidad de proteína total del polipéptido de fusión de
EML4-ALK v1 unido a FLAG. Como se muestra en la
parte superior de la Fig. 4, el nivel de fosforilación de la
tirosina del polipéptido de fusión de EML4-ALK v1 se
detectó en células BA/F3 que expresan v1, pero no se detectó la
fosforilación de tirosina cuando se expresó EML4-ALK
(K589M). Este hecho indica que la fosforilación de tirosina del
polipéptido de fusión de EML4-ALK v1 detectada en
células BA/F3 es una autofosforilación por el propio polipéptido de
fusión de EML4-ALK v1. Por tanto, se ha confirmado
que el compuesto A inhibe la autofosforilación intracelular del
polipéptido de fusión de EML4-ALK v1 en un modo
dependiente de la concentración. Además, se ha mostrado que la
cantidad de expresión de la propia proteína del polipéptido de
fusión de EML4-ALK v1 ha sido casi constante en
todas las muestras (Fig. 4, parte inferior).
El efecto inhibitorio del compuesto
B-D sobre la autofosforilación intracelular se
examinó en un modo similar como se describe anteriormente. Sin
embargo, el tiempo de cultivo después de la adición de los
compuestos fue 6 horas, y la cantidad de proteína total del
polipéptido de fusión de EML4-ALK v1 se midió usando
anticuerpo anti-ALK. Además, la cantidad de
fosforilación se calculó cuantificando como en el Ejemplo
7(2). Por tanto, para el compuesto A, la cantidad de
fosforilación se calculó cuantificando en el experimento bajo esta
condición. La velocidad de inhibición se calculó a partir de la
cantidad de fosforilación cuando el compuesto se añadió, usando
como control el valor cuando el compuesto no se añadió (se añadió el
disolvente del compuesto, DMSO) (0% de inhibición). Cada compuesto
inhibió claramente la actividad de cinasa del polipéptido de fusión
de EML4-ALK v1 en células BA/F3 (Tabla 2). El
compuesto A y B pueden seleccionarse como la sustancia que inhibe
la actividad del polipéptido de fusión de EML4-ALK
v1 el 50% o más a una concentración de 10 \muM o menos, y el
compuesto C y D pueden seleccionarse como la sustancia que inhibe la
actividad del polipéptido de fusión de EML4-ALK v1
el 50% o más a una concentración de 0,1 \muM o menos, y se ha
demostrado que las sustancias que inhiben la actividad del
polipéptido de la presente invención pueden cribarse (cribado basado
en células).
En un modo similar a en (4-1),
excepto que los compuestos A-D se añadieron a
células 3T3 que expresan v1 (Ejemplo 6(1)) a 10 \muM o 10
nM y se cultivaron durante 4 horas, se midieron la cantidad de
fosforilación de tirosina del polipéptido de fusión de
EML4-ALK v1 y la cantidad de proteína total del
polipéptido de fusión de EML4-ALK v1 y se calculó
la velocidad de inhibición de los compuestos respectivos en la
actividad de cinasa intracelular. Cada compuesto inhibió claramente
la actividad de cinasa del polipéptido de fusión de
EML4-ALK v1 en las células 3T3 que expresaban v1
(Tabla 2). Es evidente que pueden usarse diversas células tales como
células BA/F3, células 3T3 y similares como células que expresan el
polipéptido de la presente invención en el procedimiento de cribado
basado en células de la presente invención.
Los resultados anteriores indicaron que el
compuesto que inhibe la actividad de cinasa del polipéptido de
fusión de EML4-ALK v1 puede obtenerse usando como
índice la autofosforilación en las células que expresan el
polipéptido de fusión de EML4-ALK v1.
\vskip1.000000\baselineskip
Para el crecimiento de células BA/F3 que sólo
expresan la proteína CD8 (Ejemplo 5(1)), las células BA/F3
que expresan CD8, además de ALK, el polipéptido de fusión de
EML4-ALK v1 (Ejemplo 5(1)) o la
EML4-ALK (K589M) deficiente en actividad de cinasa,
se contó el cambio en el número de células empezando en 8 \times
10^{5 }células en el transcurso de tiempo en presencia o ausencia
de un factor de crecimiento IL-3. Los resultados se
muestran en la Fig. 5. Las células BA/F3 que expresan v1 pueden
crecer con o sin IL-3. Sin embargo, las células
BA/F3 que sólo expresan CD8 crecieron en presencia de
IL-3, pero murieron rápidamente cuando se eliminó
la IL-3. Este hecho indica que el polinucleótido de
fusión de EML4-ALK v1 tiene una actividad como
oncogén. Además, las células que expresan la ALK humana de longitud
completa y las células BA/F3 que expresan EML4-ALK
(K589M) que carecen de actividad de cinasa murieron similarmente en
ausencia de IL-3. Estos resultados indican que las
células obtienen el potencial de crecimiento, incluso en ausencia
del factor de crecimiento, expresando el polipéptido de fusión de
EML4-ALK v1 y que el potencial de crecimiento
depende de la actividad de cinasa del polipéptido de fusión de
EML4-ALK v1. Las células BA/F3 que expresan la ALK
de longitud completa se obtuvieron según el
Ejemplo 5 (1).
Ejemplo 5 (1).
A continuación, el compuesto A, que es una
sustancia que inhibe el polipéptido de fusión de
EML4-ALK v1, se añadió a células BA/F3 que
obtuvieron el potencial de crecimiento independiente de
IL-3 expresando el polipéptido de fusión de
EML4-ALK v1, y se investigó su efecto sobre el
crecimiento celular. Cuando el compuesto A se añadió a 1 \muM, 5
\muM o 10 \muM, o no se añadió (0 \muM) al control, se
midieron las células BA/F3 que expresan CD8, que crecen en
presencia de IL-3, y el crecimiento celular, las
células pudieron crecer aunque se observó una ligera inhibición del
crecimiento como se muestra en la Fig. 6(a). Por otra parte,
cuando el compuesto A se añadió a células BA/F3 que expresan v1 que
estaban en crecimiento en ausencia de IL-3, el
crecimiento celular se inhibió marcadamente por la dependencia de la
concentración del compuesto A y se indujo muerte celular como se
muestra en la Fig. 6(b). Es decir, se confirmó que las
células, que crecen independientemente en el polinucleótido de
fusión de EML4-ALK (oncogén), fueron destruidas por
un inhibidor del polipéptido de fusión de EML4-ALK
v1.
Se sabe que la medición del crecimiento celular
independiente del anclaje (procedimiento de colonias, etc.) es un
sistema para investigar un efecto antitumoral (efecto farmacológico)
de compuestos (Clinical Oncology, segunda edición, Cancer and
Chemotherapy Publishers Inc.). En lugar del procedimiento de
colonias, hay un siguiente procedimiento que usa placas esferoides
para medir el crecimiento de células no unidas.
Las células 3T3 que expresan v1 (Ejemplo
6(1)) y una de las células de glioma humano que expresan el
polipéptido de ALK de longitud completa y que no expresan el
polinucleótido de fusión de EML4-ALK endógenamente,
células U-87MG, se sembraron en una placa esferoide
de 96 pocillos (Sumilon Celltight Spheroid 96U, Sumitomo Bakelite
Inc.) a 3000 células por pocillo en un medio que contenía 10% de
suero bovino fetal (DMEM para células 3T3 que expresan v1 y RPMI
1640 para U-87MG). Bajo 5% de CO_{2}, las células
se cultivaron durante la noche a 37ºC y luego se añadió el
compuesto A o B a una concentración final de 10 \muM, el compuesto
C o D se añadió a una concentración final de 10 nM y como control
negativo se añadió el disolvente de los compuestos, DMSO, para dar
la misma concentración que los compuestos. Al mismo tiempo, las
células se contaron antes de la adición de los fármacos (día 0).
Entonces, las células se cultivaron bajo 5% de CO_{2}, a 37ºC
durante 3 días, se mezclaron con un reactivo para medir el número
de células (ensayo de viabilidad luminiscente
CellTiter-Glo^{TM}; Promega Inc.), se agitaron
durante 20 minutos y las mediciones (día 3) se llevaron a cabo
usando un luminómetro (luminómetro de placas de microtitulación
ML3000; Dynatech Laboratories Inc.). Los resultados muestran que
todos los compuestos tenían actividad inhibitoria del crecimiento en
células 3T3 que expresan v1, pero casi no tenían actividad
inhibitoria en células U-87MG. La velocidad de
inhibición de los compuestos se calculó suponiendo que el número de
células en el día 0 y el día 3 era el 100% de la inhibición y el 0%
de la inhibición, respectivamente
(Tabla 3).
(Tabla 3).
Los resultados anteriores indican que el
compuesto A-D inhibió el crecimiento celular
independiente del anclaje de células 3T3 que expresan v1 inhibiendo
la actividad de cinasa del polipéptido de fusión de
EML4-ALK v1. Además, es evidente que estos
compuestos no pudieron inhibir el crecimiento celular independiente
del anclaje de células U-87MG que expresan el
polipéptido de ALK de longitud completa. Estos resultados indican
que los inhibidores del polipéptido de fusión de
EML4-ALK pueden inhibir el crecimiento de células
cancerosas y tumores que expresan el polipéptido de fusión de
EML4-ALK.
Los ARNip, que estuvieron compuestos por una
cadena de transcripción que está constituida por las secuencias de
bases representadas por SEQ ID NO: 111, 113, 115, 117, 119 ó 121 y
una cadena complementaria que está constituida por las secuencias
de bases representadas por SEQ ID NO: 112, 114, 116, 118, 120 ó 122,
se prepararon como los ARNip (ARNip-1 a
ARNip-6) que tenían el 100% de homología con el área
de fusión del polipéptido de fusión de EML4-ALK v1
y se espera que tengan actividad inhibitoria sobre la expresión del
polipéptido de fusión de EML4-ALK v1. Además, los
ARNip compuestos por una cadena de transcripción que está
constituida por las secuencias de bases representadas por SEQ ID
NO: 123 ó 125 y una cadena complementaria que está constituida por
la secuencia de bases representada por SEQ ID NO: 124 ó 126 se
diseñaron y se prepararon como los ARNip (ARNip-7,
ARNip-8) que muestran el 100% de homología con el
área de ALK del polipéptido de fusión de EML4-ALK v1
y se espera que tengan un efecto inhibitorio sobre la expresión del
gen ALK, usando un sistema de diseño de secuencias de ARNip
(Commercial siDirect (marca registrada) RNAi Inc.). Se ha
confirmado por el sistema de diseño de secuencias de ARNip
(Commercial siDirect (marca registrada) RNAi Inc.) que las
secuencias de bases correspondientes a los ARNip-1 a
siRN-8 no muestran el 100% de homología con el gen
distinto del polinucleótido de fusión de EML4-ALK y
los genes ALK. Para los experimentos de control para investigar la
influencia de ARNip no específica, el ARNip compuesto por una cadena
de transcripción que está constituida por una secuencia de bases
representada por SEQ ID NO: 127 y una cadena complementaria que
está constituida por una secuencia de bases representada por SEQ ID
NO: 128 se preparó como ARNip (ARNip-9)
correspondiente a una secuencia de bases no presente en células de
mamífero. El ARNip-1 es un producto de hibridar SEQ
ID NO: 111 (cadena de transcripción) y SEQ ID NO: 112 (cadena
complementaria), y el ARNip-2 y otros son los
mismos (Fig. 7). (5) Efecto inhibitorio de ARNip sobre la expresión
de ARNm del polinucleótido de fusión de EML4-ALK y
el gen ALK en células que expresan el polinucleótido de fusión de
EML4-ALK v1 y ALK de longitud completa.
Las células 3T3 que expresan v1 y las células
U-87MG se sembraron en placas de 12 pocillos (IWAKI;
Asahi techno glass corp.) a 50.000 células y 150.000 células,
respectivamente. Cuatro horas después, usando un reactivo de
transfección (Lipofectamine RNAiMax; Invitrogen Inc.), los
ARNip-1 a ARNip-9 se prepararon a
una concentración final de 20 nM y se transfectaron en células según
la instrucción adjunta. Además, como control se prepararon muestras
de transfección sin ARNip. Después de 72 horas, el ARN total se
extrajo y se preparó ADNc.
La cantidad de ARNm expresado del polinucleótido
de fusión de EML4-ALK v1 en células 3T3 que expresan
v1 y la cantidad de ARNm del gen ALK en células
U-87MG se cuantificaron usando un reactivo de PCR
cuantitativa (Power SYBR Green PCR Master Mix; Applied Biosystems
Inc.) La reacción de PCR se llevó a cabo del siguiente modo:
después de 10 minutos de incubación a 95ºC, 45 ciclos de 95ºC
durante 15 segundos y 60ºC durante 60 segundos, y luego un ciclo de
95ºC durante 15 segundos, 60ºC durante 15 segundos y 95ºC durante 15
segundos hasta completar la reacción. Además, para calibrar la
cantidad de expresión, la cantidad de expresión del gen de
ciclofilina B de ratón y el gen GAPDH humano se cuantificó
similarmente para las células 3T3 que expresan v1 y las células
U-87MG, respectivamente. Los análisis se llevaron a
cabo usando un detector de secuencias (sistema de detección de
secuencias ABI PRISM 7900; Perkin-Elmer Applied
Biosystems Inc.).
Los oligonucleótidos que están constituidos por
las secuencias de bases representadas por SEQ ID NO: 44 y 48, SEQ
ID NO: 50 y 56, SEQ ID NO: 44 y 48 y SEQ ID NO: 12 y 13 se usaron
como conjuntos de cebadores que reconocen específicamente el
polinucleótido de fusión de EML4-ALK v1, el gen de
ciclofilina B de ratón, el gen ALK humano y el gen GAPDH humano.
Por tanto, para obtener una curva patrón para calcular la cantidad
de ARNm respectivo, la PCR se realizó usando ADN genómico humano
(Clontech) como molde para el polinucleótido de fusión de
EML4-ALK v1, el gen ALK humano y el gen GAPDH
humano, y usando ADN genómico de ratón (Clontech) como molde para
la ciclofilina B de ratón y los conjuntos de cebadores anteriormente
mencionados bajo la misma condición. Como se usó un conjunto de
cebadores correspondiente al exón 29 del polinucleótido de ALK
humano para detectar el polinucleótido de fusión de
EML4-ALK v1, la curva patrón puede obtenerse usando
ADN genómico humano. La cantidad de expresión del polinucleótido de
fusión de EML4-ALK v1 y el gen ALK humano en
muestras respectivas se calibró con la cantidad de expresión del
gen de ciclofilina B de ratón y el gen GAPDH humano para obtener la
cantidad de expresión calibrada. Además, suponiendo que la cantidad
de expresión calibrada respectiva del polinucleótido de fusión de
EML4-ALK v1 y el gen ALK humano en ausencia de ARNip
fuera del 100%, se determinó la cantidad de expresión relativa de
la cantidad de expresión calibrada del polinucleótido de fusión de
EML4-ALK v1 y el gen ALK humano y se calculó la
velocidad de inhibición para la expresión cuando se transfectaron
los ARNip respectivos (Tabla 4).
Como resultado, los ARNip-1 a
ARNip-8, que se corresponden con el polinucleótido
de fusión de EML4-ALK v1, inhibieron la expresión
del polinucleótido de fusión de EML4-ALK el 50% o
más. Para el gen ALK humano, los ARNip-7 y
ARNip-8, que se corresponden con el gen ALK humano,
inhibieron el 50% o más. El control negativo,
ARNip-9, no demostró un fuerte efecto inhibitorio de
la expresión sobre el polinucleótido de fusión de
EML4-ALK y el gen ALK humano. Estos resultados
demuestran que pueden cribarse las sustancias que inhiben la
expresión del polinucleótido de fusión de
EML4-ALK.
\vskip1.000000\baselineskip
Mediante el procedimiento similar descrito
antes, las células 3T3 que expresan v1 se sembraron en placas de 12
pocillos a 50.000 células por pocillo y 4 horas después se
transfectaron ARNip-1 a ARNip-9.
Además, las células en las que no se transfectó ARNip se prepararon
como control. Después de 72 horas de la transfección, el medio se
eliminó y la autofosforilación del polipéptido de fusión de
EML4-ALK v1 intracelular y la cantidad de proteína
del polipéptido de fusión de EML4-ALK v1 se
cuantificaron por el procedimiento similar al del Ejemplo
7(4). Por tanto, para confirmar que la cantidad de proteína
total en cada muestra era la misma para la medición, la proteína de
actina se cuantificó usando anticuerpo anti-actina
(SIGMA-ALDRICH Inc.). Los ARNip-1 a
ARNip-8 inhibieron claramente la expresión del
polipéptido de fusión de EML4-ALK v1 y la actividad
de cinasa en las células 3T3 que expresan v1.
La velocidad de inhibición del crecimiento
celular se calculó con o sin transfectar ARNip mediante el
procedimiento similar al del Ejemplo 8(3), excepto que cada
ARNip se añadió de antemano a placas esferoides de 96 pocillos y
luego se sembraron células 3T3 que expresan v1 y células
U-87MG y se cultivaron durante 3 días.
Los resultados de estos experimentos se muestran
en la Tabla 5. Cada ARNip (ARNip-1 a
ARNip-8), que había demostrado que tenía efecto
inhibitorio sobre la expresión y la actividad de cinasa del
polipéptido de fusión de EML4-ALK v1 en el Ejemplo
8(5) (6), inhibió fuertemente el crecimiento independiente
del anclaje de células 3T3 que expresan v1. Debido a que el número
de células de células 3T3 que expresan v1, en las que se
transfectaron ARNip-1, 3, 4 y 5, era inferior en el
momento de la medición (día 3) que cuando se transfectó el ARNip
(día 0) dando como resultado que la tasa de inhibición del
crecimiento fuera superior al 100%, se cree que se ha inducido
muerte celular. Por otra parte, se mostró que
ARNip-7 y ARNip-8 inhibían la
expresión del gen ALK en el Ejemplo 8(5), pero no inhibían
el crecimiento de células U-87MG que expresan la ALK
de longitud completa. ARNip-1 a
ARNip-6 no mostraron inhibición del crecimiento en
células U-87MG y el control negativo,
ARNip-9, no inhibió el crecimiento de células 3T3
que expresan v1 y células U-87MG.
De los resultados anteriores es evidente que,
transfectando ARNip que es contra el polinucleótido de fusión de
EML4-ALK v1 a células cancerosas que expresan el
polinucleótido de fusión de EML4-ALK v1, la
expresión del ARNm del polinucleótido de fusión de
EML4-ALK v1 se inhibe dando como resultado la
reducción del polipéptido de fusión de EML4-ALK y
la inhibición de la autofosforilación causando la inhibición del
crecimiento de células cancerosas. Por tanto, para células
cancerosas que expresan la ALK de longitud completa, la inhibición
del crecimiento no se produjo cuando se inhibió la expresión de
ALK. De los resultados anteriores es evidente que el ARNip contra
el polinucleótido de fusión de EML4-ALK v1, por
ejemplo, ARNip-1 a ARNip-8, es útil
como agente terapéutico contra el tumor que expresa el
polinucleótido de fusión de EML4-ALK para los
pacientes positivos para el polinucleótido de fusión de
EML4-ALK.
Se inocularon subcutáneamente 3 \times
10^{6} células de células 3T3 que expresan v1 suspendidas en PBS
mediante inyección en el lomo de ratones desnudos BALB/c macho de 5
semanas de edad (Japan Charles River Inc.). 7 días después de la
inoculación se inició la administración del compuesto C, un
inhibidor del polipéptido de fusión de EML4-ALK
(Tabla 1 a 3). La prueba se realizó en el grupo de disolvente y el
grupo de compuesto C, 4 animales por grupo. El compuesto C se
disolvió en un disolvente compuesto por 10% de
1-metil-2-pirrolidinona
(SIGMA-ALDRICH Inc.)/90% de polietilenglicol 300
(Fluka Inc.) y se administró por vía oral a la dosis de 10 mg/kg.
Las administraciones se realizaron una vez al día durante 14 días y
cada dos días se midieron el peso corporal y el tamaño de tumor. El
volumen de tumor se calculó usando la siguiente fórmula.
[Volumen de tumor (mm^{3})]= [eje
mayor del tumor (mm)] x [eje menor del tumor (mm)]^{2} x
0,5
La velocidad de inhibición del compuesto C se
calculó suponiendo que el volumen de tumor del grupo de disolvente
en el día de empezar y el día de terminar la administración era del
100% de inhibición y del 0% de inhibición, respectivamente. Los
resultados indicaron que el compuesto C inhibió el crecimiento de
células 3T3 que expresan v1 (tumor) el 103%.
El efecto antitumoral del compuesto D se
investigó por el procedimiento similar con las siguientes
excepciones. La administración del compuesto D empezó 6 días después
de la inoculación y se llevó a cabo una vez al día durante 10 días,
y luego se midió el tamaño del tumor. El compuesto D inhibió el
crecimiento de células 3T3 que expresan v1 (tumor) el 101%.
El efecto inhibitorio de cinasas del compuesto C
se observó mediante un modo similar al del Ejemplo 8(8) con
las siguientes excepciones. Se inocularon 1 \times 10^{6
}células de células 3T3 que expresan v1 y la administración del
compuesto C se inició 13 días después de la inoculación. La prueba
se realizó en el grupo de disolvente y el grupo del compuesto C, 3
animales por cada grupo. Las administraciones se llevaron a cabo
una vez al día durante 3 días. Los animales se diseccionaron 4 horas
después de la última administración y el tumor se extirpó.
Entonces, los extractos de proteína se prepararon a partir de los
tejidos y la inmunotransferencia se llevó a cabo usando anticuerpo
anti-ALK fosforilada. Los resultados indican que en
el grupo del compuesto C, la autofosforilación de tirosina del
polipéptido de fusión de EML4-ALK v1 en el tumor
disminuyó significativamente en comparación con el grupo de
disolvente. A partir de este resultado se confirmó que el efecto
antitumoral del compuesto C en el modelo animal descrito
anteriormente se basó en el efecto inhibitorio de cinasas del
polipéptido de fusión de EML4-ALK v1 en el
tumor.
\vskip1.000000\baselineskip
Se construyó un procedimiento para detectar el
polipéptido de fusión de EML4-ALK v1 en células del
siguiente modo. Se cultivaron células 3T3 que expresan v1 y células
U-87MG. Después de lavar 3 veces con PBS, las
células se lisaron con la disolución de lisis (Ejemplo 7(1)).
A 4 mg del sobrenadante obtenido después de la centrifugación se
añadió anticuerpo anti-EML4 (Cell Signaling Inc.) y
se hizo reaccionar durante la noche a 4ºC. Entonces, se añadieron
perlas de proteína G (Protein G Sepharose 4 Fast Flow; GE Healthcare
Inc.) y la inmunoprecipitación se llevó a cabo durante 2 horas.
Después de la centrifugación, los precipitados se lavaron 3 veces
con la disolución de lavado (Ejemplo 7(1)) y se suspendieron
en una disolución que disolvía SDS. El sobrenadante se sometió a
inmunotransferencia usando anticuerpo anti-ALK. Como
resultado, el polipéptido de fusión de EML4-ALK v1
se detectó en los inmunoprecipitados de células 3T3 que expresan v1,
pero no se detectó en células U-87MG. De los
resultados descritos anteriormente fue posible detectar la presencia
del polipéptido de fusión de EML4-ALK v1 en células
cancerosas y tejidos cancerosos que expresan el polipéptido de
fusión de EML4-ALK v1 usando anticuerpo
anti-EML4 y anticuerpo anti-ALK en
combinación, y es evidente que pueden determinarse los pacientes
con cáncer positivos para el polipéptido de fusión de
EML4-ALK v1.
\vskip1.000000\baselineskip
El vector en el que se integró la secuencia de
escisión de la enzima de restricción HindIII en el lado del extremo
5' del codón de iniciación del polinucleótido de fusión de
EML4-ALK v2 (EML4-ALKv2/pCR2.1) se
produjo usando el vector pCR2.1-TOPO en que se clonó
el polinucleótido de fusión de EML4-ALK v2 en el
Ejemplo 4(1).
El EML4-ALKv2/pCR2.1 se digirió
con enzima de restricción HindIII, el polinucleótido de fusión de
EML4-ALK v2 se escindió, ambos extremos se
volvieron romos, entonces un adaptador (adaptador
EcoRI-NotI-BamHI; Takara Bio Inc.)
se ligó a ambos extremos y el fragmento se introdujo en el sitio
EcoRI de un vector de retrovirus pMXS. Éste se designó
EML4-ALKv2/pMXS.
Por tanto, el EML4-ALKv2/pCR2.1
se digirió con enzima de restricción HindIII y XbaI, el
polinucleótido de fusión de EML4-ALK v2 se escindió
y se insertó en el sitio HindIII/XbaI de un vector de expresión
pcDNA3.1/Zeo (Invitrogen Inc.) que se modificó de manera que la
marca FLAG se uniera al extremo N en la expresión para producir un
plásmido de expresión para el polipéptido de fusión de
EML4-ALK v2 al que se unió la marca FLAG al extremo
N (FLAG-EML4-ALKv2/pcDNA3).
El
FLAG-EML4-ALKv2/pcDNA3 (Ejemplo
10(1)) se transfectó en células 3T3 usando un reactivo de
transfección (FuGENE HD; Roche Diagnostics Inc.) según la
instrucción adjunta. Las células 3T3 que expresan establemente el
polinucleótido de fusión de EML4-ALK v2 se
establecieron mediante resistencia a 80 \mug/ml de zeocina. La
expresión del polinucleótido de fusión de EML4-ALK
v2 en las células 3T3 se confirmó por inmunotransferencia usando
anticuerpo anti-ALK y anticuerpo
anti-ALK fosforilada. Las células 3T3 en las que se
expresa el polipéptido de fusión de EML4-ALK v2 se
designan células 3T3 que expresan v2. Las células 3T3 que expresan
v2 se inocularon subcutáneamente a ratones desnudos BALB/c macho de
5 semanas de edad (Japan Charles River Inc.) a 2 \times 10^{6}
células/ratón y se observaron durante 15 días. Como en el caso de
las células que expresan v1 (la sección inferior de la figura 3),
resultó que el tumor también se formó en células 3T3 que expresan el
polipéptido de fusión de EML4-ALK v2. El número de
formación de tumores era 4 entre 4.
De los resultados anteriores se confirmó que el
polinucleótido de fusión de EML4-ALK v2, al igual
que el polinucleótido de fusión de EML4-ALK v1,
también es un oncogén que codifica los polipéptidos que tienen
tumorigenicidad para células 3T3.
A células 293EBNA (Invitrogen Inc.) sembradas en
placas de 24 pocillos recubiertas de colágeno I (IWAKI; Asahi
techno glass corp.) a 1 \times 10^{5} células por pocillo en
medio DMEM que contenía 10% de suero bovino fetal se introdujo 100
ng de FLAG-EMLA-ALKv2/pcDNA3
(Ejemplo 10(1) o pcDNA3 (vector blanco) como control usando
un reactivo de transfección (lipofectamina 2000; Invitrogen Inc.).
Después de cultivar durante 20 horas, se añadió cada uno de los
compuestos C o D o DMSO y el cultivo se incubó durante 4 horas y
luego se recuperaron las células. La expresión del polipéptido de
fusión de EML4-ALK v2 y el nivel de fosforilación de
la tirosina se midieron por inmunotransferencia usando anticuerpo
anti-ALK y anticuerpo anti-ALK
fosforilada.
Como resultado, en la inmunotransferencia usando
anticuerpo anti-ALK se confirmó una banda en la
localización de aproximadamente 160 kDa en la que se esperaba que
estuviera presente el polinucleótido de fusión de
EML4-ALK v2, y se demostró que la cantidad de
expresión de la propia proteína del polinucleótido de fusión de
EML4-ALK v2 era casi constante en todas las
muestras. Además, se confirmó una banda en la misma localización en
la inmunotransferencia usando anticuerpo anti-ALK
fosforilada. La cantidad de fosforilación se calculó cuantificando
en un modo similar como en el Ejemplo 7(2). La velocidad de
inhibición de la fosforilación por un compuesto se calculó a partir
de la cantidad de fosforilación cuando el compuesto se añadió,
suponiendo que el valor cuando no se añadió compuesto (se añadió el
disolvente del compuesto, DMSO) era del 0% de velocidad de
inhibición, y que el valor cuando el vector blanco, pcDNA3, se
introdujo era del 100% de velocidad de inhibición. Los resultados
indican que cada compuesto inhibió claramente la actividad de cinasa
del polinucleótido de fusión de EML4-ALK v2 en
células 293EBNA (Tabla 6). En un modo similar al del Ejemplo
7(4-2), excepto que el compuesto A a D o
DMSO se añadieron a células 3T3 que expresan v2 (Ejemplo
10(2-2)) a 10 \muM o 10 nM, se midieron la
cantidad de fosforilación de tirosina del polipéptido de fusión de
EML4-ALK v2 y la cantidad de proteína total del
polipéptido de fusión de EML4-ALK v2 y se calculó la
velocidad de inhibición de compuestos respectivos en la actividad
de cinasa intracelular. Cada compuesto inhibió claramente la
actividad de cinasa del polipéptido de fusión de
EML4-ALK v2 en las células 3T3 que expresan v2
(Tabla 6).
El compuesto A y B podrían seleccionarse como
sustancias que inhibieron la actividad del polipéptido de fusión de
EML4-ALK v2 el 50% o más a una concentración de 10
\muM o menos, y el compuesto C y D podrían seleccionarse como
sustancias que inhibieron la actividad del polipéptido de fusión de
EML4-ALK v2 el 50% o más a una concentración de 0,1
\muM o menos. Se confirma que el cribado de las sustancias que
inhiben la actividad del polipéptido de la presente invención
(cribado basado en células) puede realizarse usando el polipéptido
de fusión de EML4-ALK v2, además del polipéptido de
fusión de EML4-ALK v1.
Mediante un modo similar descrito como en el
Ejemplo 8(3), el efecto inhibitorio de los inhibidores del
polipéptido de fusión de EML4-ALK sobre el
crecimiento celular independiente del anclaje se investigó usando
células 3T3 que expresan v2 (Ejemplo
10(2-2)). Los resultados mostraron que todos
los compuestos tenían actividad inhibitoria del crecimiento en
células 3T3 que expresan v2. La velocidad de inhibición de los
compuestos se calculó suponiendo que el número de células en el día
0 y el día 3 eran del 100% de inhibición y el 0% de inhibición,
respectivamente
(Tabla 7).
(Tabla 7).
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Los resultados indicaron que los compuestos
A-D inhibieron el crecimiento celular independiente
del anclaje de células 3T3 que expresan v2 inhibiendo la actividad
de cinasa del polipéptido de fusión de EML4-ALK
v2.
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La PCR (después de 50ºC durante 2 minutos y 95ºC
durante 15 minutos, 50 ciclos de 94ºC durante 15 segundos, 60ºC
durante 30 segundos y 72ºC durante 90 segundos) se llevó a cabo
usando 75 ADNc separados de los especímenes clínicos y un kit de
PCR cuantitativa como la del Ejemplo 3(1) y oligonucleótidos
de SEQ ID NO: 131 y 82 como cebadores. Como resultado, en dos casos
se confirmó una secuencia de 515 pb (SEQ ID NO:86) o 548 pb (SEQ ID
NO:90) hecha por la fusión de una parte de EML4 y una parte de ALK,
que tiene un punto de fusión diferente del polinucleótido de fusión
de EML4-ALK v1 y polinucleótido de fusión de
EML4-ALK v2, se amplificó usando el ADNc de un
paciente que se muestra que es positivo para un producto de PCR
descrito anteriormente como molde y oligonucleótidos de SEQ ID NO:
94 y 46 como cebadores, la PCR (35 ciclos de 98ºC durante 10
segundos y 68ºC durante 6 minutos) se llevó a cabo con una ADN
polimerasa (ADN polimerasa PrimeStar HS, Takara Bio Inc.). El
producto de PCR se clonó en el vector pT7Blue-2.
Como resultado se obtuvo el nuevo polinucleótido (SEQ ID NO: 129)
que estuvo constituido por 700 bases desde el codón de iniciación
ATG del gen EML4 hasta la porción de intrón 6 y 1691 bases desde el
exón 21 del gen ALK hasta el codón de terminación del exón 30. El
plásmido en el que se clonó el ADNc de SEQ ID NO: 129 se designó
EML4-ALKv3/pT7Blue-2.
Usando el
EML4-ALKv3/pT7Blue-2, el vector de
expresión del polipéptido de fusión de EML4-ALK v3
(designado EML4-ALKv3/pMXS) se construyó según un
procedimiento del Ejemplo 4(1). Por tanto, usando el
EML4-ALKv3/pT7Blue-2, un vector de
expresión (designado
FLAG-EML4-ALKv3/pMX-iresCD8)
que expresa tanto el polipéptido de fusión de
EML4-ALK v3 que tiene la marca FLAG en el extremo N
como CD8, se construyó usando un procedimiento similar del Ejemplo
4(1).
Las células 3T3 transfectadas con el
EML4-ALKv3/pMXS descrito anteriormente se inocularon
subcutáneamente a ratones desnudos a 5 \times 10^{6
}células/ratón y se observaron después de 20 días. Resultó que se
formó el tumor. Debido a que el polipéptido de fusión de
EML4-ALK v3 era tumorigénico, se indicó que el
polinucleótido de fusión de EML4-ALK v3 es el gen
causal del cáncer al igual que v1 y v2. En lo sucesivo, las células
3T3 en las que se expresa el polipéptido de fusión de
EML4-ALK v3 se designan células 3T3 que expresan
v3.
Usando 1 ng del plásmido que expresa el
EML4-ALK v3 como molde, y (SEQ ID NO: 132 y SEQ ID
NO: 62, SEQ ID NO: 133 y SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 134 y SEQ ID NO:
66, SEQ ID NO: 135 y SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 136 y SEQ ID NO: 70,
SEQ ID NO: 137 y SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 138 y SEQ ID NO: 74, SEQ
ID NO: 139 y SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 140 y SEQ ID NO: 78, y SEQ
ID NO: 141 y SEQ ID NO: 80) como conjunto de cebadores, la PCR (30
ciclos de 94ºC durante 15 segundos, 55ºC durante 30 segundos y 72ºC
durante 1 minuto) se llevó a cabo mediante una ADN polimerasa (ADN
polimerasa rTaq; Takara Bio Inc.). Como resultado, en todo el
conjunto de cebadores se amplificó un fragmento de ADN
monocatenario, teniendo cada uno el tamaño esperado. De los
resultados anteriores se probó que la detección de la presencia del
polinucleótido de fusión de EML4-ALK v3 es posible
llevando a cabo RT-PCR según el presente ejemplo
usando ARNm extraído de las muestras de sujetos de prueba como
molde.
Según el procedimiento del Ejemplo 1, Ejemplo
5(1) y Ejemplo 7(1), el polipéptido de fusión de
EML4-ALK v3 se preparó usando
FLAG-EML4-ALKv3/pMX-iresCD8.
La actividad de cinasa in vitro del
polipéptido de fusión de EML4-ALK v3 purificado como
se describe anteriormente puede detectarse usando un procedimiento
del Ejemplo 7(2). El efecto inhibitorio de los compuestos
A-D contra la actividad de cinasa in vitro
del polipéptido de fusión de EML4-ALK v3 se
investigó usando el procedimiento según procedimiento del Ejemplo
7(3). Como resultado, se encontró que los compuestos
A-D inhibieron la autofosforilación y la actividad
de fosforilación en el sustrato peptídico por el polipéptido de
fusión de EML4-ALK v3 purificado (Tabla 8). Estos
compuestos podrían seleccionarse como sustancias que inhibieron la
actividad del polipéptido de fusión de EML4-ALK
v3.
Los resultados anteriores indicaron que el
cribado (un cribado de tipo in vitro) para una sustancia que
inhibe la actividad del polipéptido de la presente invención podría
realizarse preparando el polipéptido de fusión de
EML4-ALK v3 y usando la actividad de cinasa in
vitro como índice.
Se añadió DMSO (control) o el compuesto
A-D a células 3T3 que expresan v3 (Ejemplo
11(2)) a 10 \muM o 10 nM y se midieron la cantidad de
fosforilación de tirosina del polipéptido de fusión de
EML4-ALK v3 y la cantidad de proteína total del
polipéptido de fusión de EML4-ALK v3 y la velocidad
de inhibición de compuestos respectivos en la actividad de cinasa
intracelular se calculó en un modo similar al del Ejemplo
7(4-2). Como resultado, en la
inmunotransferencia usando anticuerpo anti-ALK, las
bandas se confirmaron en la localización de aproximadamente 90 kDa
en las que se esperaba el polinucleótido de fusión de
EML4-ALK v3 en el nivel casi constante en todas las
muestras. Además, las bandas se confirmaron en la misma localización
en la inmunotransferencia usando anticuerpo
anti-ALK fosforilada.
Cada compuesto inhibió claramente la actividad
de cinasa del polipéptido de fusión de EML4-ALK v3
en las células 3T3 que expresan v3 (Tabla 9). Se confirmó que el
cribado de las sustancias que inhiben la actividad del polipéptido
de la presente invención (cribado basado en células) puede
realizarse usando el polipéptido de fusión de
EML4-ALK v3.
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Mediante un modo similar descrito como en el
Ejemplo 8(3), el efecto inhibitorio de los inhibidores
(compuesto A-D) del polipéptido de fusión de
EML4-ALK sobre el crecimiento independiente del
anclaje de células se investigó usando células 3T3 que expresan v3
(Ejemplo 11 (2)). Los resultados mostraron que todos los compuestos
tenían actividad inhibitoria del crecimiento sobre células 3T3 que
expresan v3 (Tabla 10).
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Los resultados anteriores indican que el
compuesto A-D inhibió el crecimiento celular
independiente del anclaje de células 3T3 que expresan v3 inhibiendo
la actividad de cinasa del polipéptido de fusión de
EML4-ALK v3.
Usando el ADNc que se preparó por la
transcripción inversa del ARN total de células
NCI-H2228, una línea de células de cáncer de pulmón
de células no pequeñas humano (Colección americana de cultivos tipo)
como molde, la PCR (35 ciclos de 98ºC durante 10 segundos, 68ºC
durante 4 minuto) se llevó a cabo usando oligonucleótidos
representados por la SEQ ID NO: 94 y la SEQ ID NO: 46 como cebadores
y una ADN polimerasa (ADN polimerasa primeSTAR HS, Takara Bio
Inc.). Usando una parte del producto de PCR como molde, la PCR (35
ciclos de 98ºC durante 10 segundos, 68ºC durante 4 minuto) se llevó
a cabo usando un oligonucleótido representado por la SEQ ID NO: 105
que se proporcionó con la secuencia de escisión de la enzima de
restricción HindIII en el lado del extremo 5' del codón de
iniciación ATG del gen EML4 y un oligonucleótido representado por
SEQE ID NO:106 que se proporcionó con la secuencia de escisión de
la enzima de restricción Xba I en el lado del extremo 3' del codón
de terminación TGA del gen ALK como cebadores y una ADN polimerasa
(ADN polimerasa Pyrobest; Takara Bio Inc.). Se obtuvo el
producto de PCR de aproximadamente 2400 pb. Este producto se clonó
por TA en el vector pCR2.1-TOPO usando el kit de
clonación TOPO TA (Invitrogen Inc.) y se analizó la secuencia de
ADN. Como resultado se identificaron dos tipos de polinucleótido.
Uno era una secuencia de 2391 pb (SEQ ID NO: 107) que era diferente
en 4 bases, concretamente, las bases 685, 903, 2000 y 2115 de la SEQ
ID NO: 129 (Ejemplo 11(1)). La otra era la secuencia de 2358
pb (SEQ ID NO: 109) que estuvo constituida por 667 bases desde el
codón de iniciación ATG del gen EML4 hasta el exón 6 y 1691 bases
desde el exón 21 del gen ALK hasta el codón de terminación del exón
30. La porción correspondiente a este gen ALK era diferente
aproximadamente 1 base de la secuencia (4080-5770)
de NM_004304 registrada en Genbank, sin la variación de aminoácidos.
Por tanto, se sugirió que las diferencias en la porción del gen ALK
entre el polinucleótido (SEQ ID NO: 129) identificado en pacientes
con cáncer de pulmón y el polinucleótido (SEQ ID NO: 107) clonado a
partir de NCI-H2228 eran el
polimorfismo.
polimorfismo.
\newpage
Ni el polinucleótido de fusión de
EML4-ALK v1 ni el polinucleótido de fusión de
EML4-ALK v2 se expresaron endógenamente en células
NCI-H2228.
Se añadió DMSO (control) o compuesto C a células
NCI-H2228 a 100 nM como concentración final y se
calcularon la cantidad de fosforilación de tirosina del polipéptido
de fusión de EML4-ALK y la velocidad de inhibición
de compuesto C en la actividad de autofosforilación en un modo
similar al del Ejemplo 11(5). El compuesto C inhibió la
actividad de cinasa del polipéptido de fusión de
EML4-ALK en las células NCI-H2228 al
81%. Se confirma que el cribado de las sustancias que inhiben la
actividad del polipéptido de fusión de EML4-ALK de
la presente invención (cribado de tipo células) puede realizarse
usando como índice la autofosforilación en las células NCI-
H2228.
H2228.
Se añadió DMSO (control) o compuesto
A-D a las células NCI-H2228 a 10
\muM o 10 nM y esta investigación se realizó de un modo similar
al descrito en el Ejemplo 8(3), excepto que las células se
cultivaron durante 5 días después de la adición de fármacos. Los
resultados mostraron que el compuesto A-D tenía
actividad inhibitoria del crecimiento sobre las células
NCI-H2228. La velocidad de inhibición de los
compuestos se calculó suponiendo que el número de células en el día
0 y el día 5 era el 100% de inhibición y el 0% de inhibición,
respectivamente (Tabla 11).
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Los resultados anteriores indican que el
compuesto A-D inhibió el crecimiento celular
independiente del anclaje de NCI-H2228, células de
cáncer de pulmón de células no pequeñas, inhibiendo la actividad de
cinasa del polipéptido de fusión de EML4-ALK. De
los resultados anteriores es evidente que el inhibidor contra el
polinucleótido de fusión de EML4-ALK es útil como
agente terapéutico para pacientes con cáncer de pulmón positivos
para el polinucleótido de fusión de EML4-ALK.
\vskip1.000000\baselineskip
Esta lista de referencias citadas por el
solicitante está prevista únicamente para ayudar al lector y no
forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha puesto
el máximo cuidado en su realización, no se pueden excluir errores u
omisiones y la OEP declina cualquier responsabilidad al
respecto.
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<151>
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\vskip0.400000\baselineskip
<160> 141
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.4
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
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<211> 3900
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Inventor: MANO, HIROYUKI
\hskip1cmInventor: KUROMITSU, SADAO
\hskip1cmInventor: SHINDO, NOBUAKI
\hskip1cmInventor: SOGA, TAKATOSHI
\hskip1cmInventor: FURUTANI, TAKASHI
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
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<222> (271)..(3447)
\newpage
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<400> 1
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<210> 2
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<211> 1059
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Homo sapiens
\newpage
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<400> 2
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<210>
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<211> 942
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
\newpage
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<400> 3
\hskip1cm
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<210> 4
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<211> 3979
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<400> 4
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\hskip1cm
\hskip1cm
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<210> 5
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<211> 853
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<400> 5
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\hskip1cm
\hskip1cm
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
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<211> 3933
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
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<222> (1)..(3930)
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<400> 6
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\hskip1cm
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<210>
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<211> 1310
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
\newpage
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<400> 7
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\newpage
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<210> 8
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<211> 24
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<400> 8
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\hskip-.1em\dddseqskipgtgcagtgtt tagcattctt gggg
\hfill24
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<210>9
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<211> 24
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<400>9
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\hskip-.1em\dddseqskiptcttgccagc aaagcagtag ttgg
\hfill24
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<210> 10
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<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<400> 10
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\hfill20
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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\hfill20
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<211> 18
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<213> Homo sapiens
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<213> Homo sapiens
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<211> 18
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<212> ADN
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<211> 18
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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\hfill18
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<212> ARN
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<213> Homo sapiens
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<213> Homo sapiens
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\hfill19
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<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
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<212> ADN
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\hfill19
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
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\hfill20
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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\hfill20
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
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\hfill20
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
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\vskip0.400000\baselineskip
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\hfill20
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\vskip0.400000\baselineskip
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagctacatca cacaccttga ctgg
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 36
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\vskip0.400000\baselineskip
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\hfill24
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
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\hfill16
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<210> 38
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<211> 16
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<213> Homo sapiens
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\hfill16
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<211> 16
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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\vskip1.000000\baselineskip
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\hfill16
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 224
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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\hfill24
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\vskip0.400000\baselineskip
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatgctgctct gaatggt
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 42
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaagcagtggt atcaacgcag agt
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 43
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\hskip-.1em\dddseqskipggcagggagg aatatga
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 44
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaattacggc taccagcaac ag
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 45
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgatagatggg catttatg
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 46
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccacggtctt agggatccca agg
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 47
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgggaatcagtttgtagtt
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 48
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptatcctcgta atgaccagct cca
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 49
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 49
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptacttctcct ggaggcagg
\hfill19
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una secuencia de cebador artificialmente sintetizada
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una secuencia de cebador artificialmente sintetizada
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<220>
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<223> Descripción de secuencia artificial:
una secuencia de cebador artificialmente sintetizada
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<212> ADN
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<213> Artificial
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una secuencia de cebador artificialmente sintetizada
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<213> Artificial
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<220>
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<223> Descripción de secuencia artificial:
una secuencia de cebador artificialmente sintetizada
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<211> 35
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<213> Artificial
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<220>
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<223> Descripción de secuencia artificial:
una secuencia de cebador artificialmente sintetizada
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<220>
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<223> Descripción de secuencia artificial:
una secuencia de cebador artificialmente sintetizada
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<212> ADN
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<213> Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
una secuencia de cebador artificialmente sintetizada
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\hskip1cm
\hskip1cm
\hskip1cm
\hskip1cm
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\hskip1cm
\hskip1cm
\hskip1cm
\hskip1cm
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
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\hskip1cm
\hskip1cm
\hskip1cm
\hskip1cm
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\vskip0.400000\baselineskip
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\hskip1cm
\hskip1cm
\hskip1cm
\hskip1cm
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<213> Artificial
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una cadena de transcripción artificialmente sintetizada de
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<213> Artificial
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<220>
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una cadena de complementaria artificialmente sintetizada de
ARNip-1
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<223> Descripción de secuencia artificial:
una cadena de transcripción artificialmente sintetizada de
ARNip-2
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<223> Descripción de secuencia artificial:
una cadena de complementaria artificialmente sintetizada de
ARNip-2
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una cadena de transcripción artificialmente sintetizada de
ARNip-3
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una cadena de complementaria artificialmente sintetizada de
ARNip-3
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<222> (7)..(21)
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<223> ARN
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<212> ADN/ARN
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<213> Artificial
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<220>
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<223> Descripción de secuencia artificial:
una cadena de transcripción artificialmente sintetizada de
ARNip-4
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<220>
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<221> misc_feature
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<222> (1)..(13)
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<223> ARN
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<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (14)..(21)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ADN
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 117
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccuaaagugu accgccggaa g
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 118
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN/ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
una cadena de complementaria artificialmente sintetizada de
ARNip-4
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(6)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ADN
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<222> (7)..(21)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ARN ...
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 118
\vskip1.000000\baselineskip
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\hskip-.1em\dddseqskiptccggcggua cacuuuaggu c
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<210> 119
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN/ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
una cadena de transcripción artificialmente sintetizada de
ARNip-5
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(13)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ARN
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<220>
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<221> misc_feature
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<222> (14)..(21)
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<223> ADN
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<400> 119
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\hskip-.1em\dddseqskipaaaguguacc gccggaagca c
\hfill21
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<210> 120
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN/ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
una cadena de complementaria artificialmente sintetizada de
ARNip-5
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
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<222> (1)..(6)
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<223> ADN
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<223> ADN
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<220>
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<221> misc_feature
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<222> (7)..(21)
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<223> ARN
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<210> 121
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<211> 21
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<212> ADN/ARN
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<213> Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
una cadena de transcripción artificialmente sintetizada de
ARNip-6
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(13)
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<223> ARN
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (14)..(21)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ADN
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 121
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaaguguaccg ccggaagcac c
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<211> 21
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<212> ADN/ARN
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<213> Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
una cadena de complementaria artificialmente sintetizada de
ARNip-6
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<220>
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<222> (1)..(6)
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<223> ADN
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<222> (7)..(21)
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<223> ARN
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<210> 123
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<211> 21
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<212> ADN/ARN
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<213> Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
una cadena de transcripción artificialmente sintetizada de
ARNip-7
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
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<222> (1)..(13)
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<223> ARN
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<222> (14)..(21)
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<223> ADN
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<211> 21
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<212> ADN/ARN
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<213> Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
una cadena de complementaria artificialmente sintetizada de
ARNip-7
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
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<222> (1)..(6)
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<223> ADN
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<220>
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<221> misc_feature
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<222> (7)..(21)
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<223> ARN
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 124
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipattatccggu auacaggccc a
\hfill21
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<210> 125
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<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
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<213> Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
una cadena de transcripción artificialmente sintetizada de
ARNip-8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 125
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\hfill21
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<211> 21
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<212> ARN
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<213> Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
una cadena de complementaria artificialmente sintetizada de
ARNip-8
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 126
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipauuauccggu auacaggccc a
\hfill21
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 127
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<211> 21
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<212> ADN/ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
una cadena de transcripción artificialmente sintetizada de
ARNip-9
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(13)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (14)..(21)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ADN
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 127
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcggcugcaau cgattgatag c
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 128
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN/ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
una cadena de complementaria artificialmente sintetizada de
ARNip-9
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
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<222> (1)..(6)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ADN
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (7)..(21)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ARN
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 128
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptatcaaucga uugcagccga a
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 129
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2391
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
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<222> (1)..(2388)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 129
\hskip1cm
\hskip1cm
\hskip1cm
\hskip1cm
\hskip1cm
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 130
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 796
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 130
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\hskip1cm
\hskip1cm
\hskip1cm
\hskip1cm
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 131
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 131 24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptaccagtgct gtctcaattg cagg
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 132
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 132 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcacagacaaa ctccag
\hfill16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 133
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 133
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgaccatcac cagctg
\hfill16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 134
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 134
\vskip1.000000\baselineskip
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\hskip-.1em\dddseqskipagaatgctac tcccacc
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 135
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 135
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcttcacaacc tctccaa
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 136
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 136
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaaccacaagg acagagag
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 137
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 137
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaagtccacaa attcgagc
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 138
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 138
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaatctcatt ctaatgatc
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 139
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 139
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttcgagcatc accttctcc
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 140
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 140
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaaagtcacat aattcttggg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 141
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 141
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcccaccaaaa gcataaaacg
\hfill20
Claims (17)
1. Procedimiento para detectar un gen de fusión
del gen de la proteína 4 similar a proteína asociada a microtúbulos
equinodermos (EML4) y gen de cinasa de linfoma anaplásico (ALK) que
comprende la etapa de detectar la presencia de un polinucleótido en
una muestra obtenida de un sujeto de prueba, en el que el
polinucleótido codifica un polipéptido seleccionado del grupo que
está constituido por:
- (1)
- un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2, 7 ó 130 y que tiene una actividad de cinasa,
- (2)
- un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2 ó 7 con la deleción, sustitución y/o inserción de 1 a 10 aminoácidos y que tiene una actividad de cinasa,
- (3)
- un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos con el 90% o más de identidad con la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2 ó 7 y que tiene una actividad de cinasa, y
- (4)
- un polipéptido que está constituido por la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2, 7 ó 130.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Procedimiento para detectar una proteína de
fusión codificada por un gen de fusión del gen EML4 y el gen ALK
que comprende la etapa de detectar la presencia de un polipéptido en
una muestra obtenida de un sujeto de prueba, en el que el
polipéptido se selecciona del grupo que está constituido por:
- (1)
- un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2, 7 ó 130 y que tiene una actividad de cinasa,
- (2)
- un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2 ó 7 con la deleción, sustitución y/o inserción de 1 a 10 aminoácidos y que tiene una actividad de cinasa,
- (3)
- un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos con el 90% o más de identidad con la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2 ó 7 y que tiene una actividad de cinasa, y
- (4)
- un polipéptido que está constituido por la secuencia de aminoácidos representada por SEX ID NO: 2, 7 ó 130.
\vskip1.000000\baselineskip
3. Procedimiento de la reivindicación 1 o la
reivindicación 2, en el que el polipéptido comprende la secuencia
de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2, 7 ó 130 y que tiene
una actividad de cinasa.
4. Procedimiento de la reivindicación 1 o la
reivindicación 2, en el que el polipéptido está constituido por la
secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2, 7 ó 130.
5. Procedimiento de la reivindicación 1 o la
reivindicación 2, en el que el polipéptido comprende la secuencia
de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2 ó 7 y que tiene una
actividad de cinasa.
6. Procedimiento de la reivindicación 1 o la
reivindicación 2, en el que el polipéptido está constituido por la
secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2 ó 7.
7. Kit para la detección de un gen de fusión del
gen EML4 y el gen ALK que comprende cebadores sentido y antisentido
que amplifican específicamente un polinucleótido que codifica un
polipéptido seleccionado del grupo que está constituido por:
- (1)
- un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2, 7 ó 130 y que tiene una actividad de cinasa,
- (2)
- un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2 ó 7 con la deleción, sustitución y/o inserción de 1 a 10 aminoácidos y que tiene una actividad de cinasa,
- (3)
- un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos con el 90% o más de identidad con la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2 ó 7 y que tiene una actividad de cinasa, y
- (4)
- un polipéptido que está constituido por la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2, 7 ó 130.
\vskip1.000000\baselineskip
8. Kit de la reivindicación 7, en el que el
polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos representada por
SEQ ID NO: 2, 7 ó 130 y que tiene una actividad de cinasa.
9. Kit de la reivindicación 7, en el que el
polipéptido está constituido por la secuencia de aminoácidos
representada por SEQ ID NO: 2, 7 ó 130.
10. Kit de la reivindicación 7, en el que el
polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos representada por
SEQ ID NO: 2 ó 7 y que tiene una actividad de cinasa.
11. Kit de la reivindicación 7, en el que el
polipéptido está constituido por la secuencia de aminoácidos
representada por SEQ ID NO: 2 ó 7.
12. Conjunto de cebadores para detectar un gen
de fusión del gen EML4 y el gen ALK, en el que el conjunto de
cebadores se selecciona del siguiente a) - c):
- a)
- un conjunto de cebadores que comprende un cebador antisentido que está constituido por una molécula de ácido nucleico que se hibrida bajo condiciones restrictivas a una parte que codifica ALK de un polinucleótido y un cebador sentido que está constituido por una molécula de ácido nucleico que se hibrida bajo condiciones restrictivas a la cadena complementaria de una parte que codifica EML4 del polinucleótido, en el que el polinucleótido codifica un polipéptido seleccionado del grupo que está constituido por:
- (1)
- un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2 ó 7 y que tiene una actividad de cinasa,
- (2)
- un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2 ó 7 con la deleción, sustitución y/o inserción de 1 a 10 aminoácidos y que tiene una actividad de cinasa,
- (3)
- un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos con el 90% o más de identidad con la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2 ó 7 y que tiene una actividad de cinasa, y
- (4)
- un polipéptido que está constituido por la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2 ó 7;
- b)
- un conjunto de cebadores que comprende un cebador antisentido que está constituido por una molécula de ácido nucleico que se hibrida bajo condiciones restrictivas a una parte que codifica ALK del polinucleótido que está constituido por la secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 4 y un cebador sentido que está constituido por una molécula de ácido nucleico que se hibrida bajo condiciones restrictivas a la cadena complementaria de una parte que codifica EML4 del polinucleótido; y
- c)
- un conjunto de cebadores que comprende un cebador antisentido que está constituido por una molécula de ácido nucleico que se hibrida bajo condiciones restrictivas a una parte que codifica ALK del polinucleótido que está constituido por la secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 5 y un cebador sentido que está constituido por una molécula de ácido nucleico que se hibrida bajo condiciones restrictivas a la cadena complementaria de una parte que codifica EML4 del polinucleótido.
\vskip1.000000\baselineskip
13. Conjunto de cebadores de la reivindicación
12, en el que el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos
representada por SEQ ID NO: 2 ó 7 y que tiene una actividad de
cinasa.
14. Conjunto de cebadores de la reivindicación
12, en el que el polipéptido está constituido por la secuencia de
aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2 ó 7.
15. Conjunto de cebadores de un cebador sentido
que comprende un oligonucleótido con al menos todas las 16 bases
consecutivas localizadas en los nº de bases 1 a 2242 en SEQ ID NO: 6
y un cebador antisentido que comprende un oligonucleótido
complementario a un oligonucleótido con al menos todas las 16 bases
consecutivas localizadas en los nº de bases 2243 a 3933 en SEQ ID
NO: 6, o un conjunto de cebadores que está constituido por cadenas
complementarias de los mismos, en el que los cebadores sentido y
antisentido dan productos de amplificación de 1 kb o menos de
tamaño.
16. Conjunto de cebadores de un cebador sentido
que comprende un oligonucleótido con al menos todas las 16 bases
consecutivas localizadas en los nº de bases 1 a 3629 en SEQ ID NO: 4
y un cebador antisentido que comprende un oligonucleótido
complementario a un oligonucleótido con al menos todas las 16 bases
consecutivas localizadas en los nº de bases 3630 a 3979 en SEQ ID
NO: 4, o un conjunto de cebadores que está constituido por cadenas
complementarias de los mismos, en el que los cebadores sentido y
antisentido dan productos de amplificación de 1 kb o menos de
tamaño.
17. Conjunto de cebadores de un cebador sentido
que comprende un oligonucleótido con al menos todas las 16 bases
consecutivas localizadas en los nº de bases 1 a 579 en SEQ ID NO: 5
y un cebador antisentido que comprende un oligonucleótido
complementario a un oligonucleótido con al menos todas las 16 bases
consecutivas localizadas en los nº de bases 580 a 853 en SEQ ID NO:
5, o un conjunto de cebadores que está constituido por cadenas
complementarias de los mismos.
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