CN111909987A - 用于kif5b-ret融合基因检测的试剂组合物、试剂盒及检测系统 - Google Patents

用于kif5b-ret融合基因检测的试剂组合物、试剂盒及检测系统 Download PDF

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ret fusion
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Abstract

本公开涉及一种用于KIF5B‑RET融合基因检测的试剂组合物，该试剂组合物包括crRNA、Cas12a酶和单链DNA荧光探针，其中，所述crRNA包括如SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。利用本公开提供的试剂组合物，能够对待测样本中的KIF5B‑RET融合基因进行高灵敏度的检测，检测时间较短，所需设备简单，反应条件温和，在常温下即可实现对KIF5B‑RET融合基因的量化检测和可视化检测。

Description

用于KIF5B-RET融合基因检测的试剂组合物、试剂盒及检测 系统
技术领域
本公开涉及生物技术领域，具体地，涉及一种用于KIF5B-RET融合基因检测的试剂组合物、试剂盒及检测系统。
背景技术
RET基因位于人10号染色体的长臂上，全长约60kb，含有21个原癌基因外显子。RET基因能够编码酪氨酸激酶受体RET蛋白，RET蛋白可与配体结合并刺激胞内产生磷酸化，参与调节机体细胞的生长和分化。RET基因易在其酪氨酸激酶域编码区发生断裂，断裂后的3’端和其伙伴基因的5’端发生融合，形成融合突变，会导致原癌基因的转化和激酶的活化，诱发恶性肿瘤。约2％的肺腺癌、20％的甲状腺乳头状癌等实体型肿瘤中存在RET基因的融合突变。RET基因的融合突变在肺腺癌中的融合类型主要为KIF5B-RET和CCDC6-RET。针对RET基因融合突变的靶向药物对肿瘤具有良好的治疗效果。检测融合突变后的RET融合基因，对临床治疗及指导合理用药具有较大的临床价值。
目前，RET融合基因的检测方法主要包括FISH、IHC、RT-PCR及PCR/Sanger测序。
然而，上述检测方法对KIF5B-RET融合基因的检测灵敏度较低，检测时间较长，且部分方法对检测条件要求较高。
发明内容
为了解决现有KIF5B-RET融合基因检测方法中存在的灵敏度低、所需时间长、检测条件要求高的问题，本公开提供一种试剂组合物、试剂盒及系统。
为了实现上述目的，第一方面，本公开提供一种用于KIF5B-RET融合基因检测的试剂组合物，该试剂组合物包括crRNA、Cas12a酶和单链DNA荧光探针，其中，所述crRNA包括如SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。
可选地，所述试剂组合物还包括引物对，所述引物对包括SEQIDNO.2和SEQIDNO.3所示的核苷酸序列。
可选地，所述KIF5B-RET融合基因为KIF5Bexon15-RETexon12融合基因。
可选地，所述单链DNA荧光探针包括如SEQIDNO.4所示的核苷酸序列以及荧光基团，所述荧光基团包括FAM荧光基团、HEX荧光基团和TAMRA荧光基团中的至少一种。
第二方面，本公开提供一种用于KIF5B-RET融合基因检测的试剂盒，该试剂盒中含有第一方面中任意一项所述的试剂组合物。
可选地，所述试剂盒中还含有反应体系缓冲液、RNase抑制剂、Mg2+和水。
可选地，所述试剂盒中含有以下含量的各组分：
20μL试剂中含有0.3～0.4μM的引物对、300～500nM的crRNA，14～15μL的Rehydrationbuffer、150～200nM的单链DNA荧光探针、5～10U的RNase抑制剂、2～3μL的NEBuffer2.1、0.3～0.6μL的醋酸镁、200～300nM的Cas12a酶。
第三方面，本公开提供第一方面中任意一项所述的试剂组合物在制备用于KIF5B-RET融合基因检测的试剂盒中的用途。
第四方面，本公开提供一种用于KIF5B-RET融合基因检测的系统，该系统包括第一反应管、第二反应管、检测器和计算装置；其中，
所述第一反应管中设有RPA试剂，用于对待测样本的cDNA进行RPA扩增，得到扩增产物，其中，所述RPA试剂中含有RPA引物，所述RPA引物包括SEQIDNO.2和SEQIDNO.3所示的核苷酸序列；
所述第二反应管中设有Cas12a酶、单链DNA荧光探针和crRNA，用于在存在所述扩增产物时，进行Cas12a酶切反应，得到酶切产物，其中，crRNA包括SEQIDNO.1所示的核苷酸序列，酶切反应时间为5-15分钟；
所述检测器设有紫外发光装置和荧光检测装置，所述紫外发光装置用于对所述酶切产物进行紫外光照射，所述荧光检测装置用于检测所述酶切产物在紫外光照射下的荧光值；
所述计算装置包括存储器和处理器，所述存储器中存储有计算机程序，所述处理器被配置为执行所述存储器中存储的计算机程序，以实现如下的判别：
当所述荧光检测装置检测到所述酶切产物在紫外光照射下的荧光值为500～3000时，判定所述待测样本中存在KIF5B-RET融合基因。
可选地，所述KIF5B-RET融合基因为KIF5Bexon15-RETexon12融合基因。
通过上述技术方案，利用本公开提供的试剂组合物，能够对待测样本中的KIF5B-RET融合基因进行高灵敏度的检测，检测时间较短，所需设备简单，反应条件温和，在常温下即可实现对KIF5B-RET融合基因的量化检测和可视化检测。
本公开的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
具体实施方式
以下对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公开。
本公开的第一方面提供一种用于KIF5B-RET融合基因检测的试剂组合物，该试剂组合物包括crRNA、Cas12a酶和单链DNA荧光探针，其中，所述crRNA包括如SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。
利用上述试剂组合物，当crRNA与KIF5B-RET融合基因特异性结合时，Cas12a酶的检测活性被激活，激活状态下的Cas12a酶能够剪切单链DNA荧光探针，并释放荧光探针中的荧光基团，因此，可以根据是否检测到荧光基团来判断检测系统中是否存在KIF5B-RET融合基因。利用上述试剂组合物能够对待测样本中的KIF5B-RET融合基因进行高灵敏度的检测，检测时间较短，所需设备简单，反应条件温和，在常温下即可实现对KIF5B-RET融合基因的量化检测和可视化检测。
根据本公开，所述试剂组合物还可以包括用于对KIF5B-RET融合基因区域进行RPA扩增的引物对，所述引物对可以包括SEQIDNO.2和SEQIDNO.3所示的核苷酸序列。
利用上述引物对，可以对待测样本中的KIF5B-RET融合基因区域进行扩增，提高KIF5B-RET融合基因在检测系统中的丰度，使crRNA能够更容易地匹配到KIF5B-RET融合基因，从而提升检测灵敏度，实现在复杂样本/杂合体突变样本中进行高灵敏度的检测。
可选地，所述KIF5B-RET融合基因为KIF5Bexon15-RETexon12融合基因。所述KIF5B-RET融合基因一般存在于肿瘤细胞中，例如肺癌细胞、甲状腺癌细胞、白血病细胞、乳腺癌细胞、结直肠癌细胞、食管癌细胞和黑色素瘤细胞。
根据本公开，所述单链DNA荧光探针可以在较宽的范围内选择，不与检测系统中其它成分杂交或反应的单链DNA荧光探针均可用于本公开。示例性地，所述单链DNA荧光探针可以包括如SEQIDNO.4所示的核苷酸序列以及荧光基团，所述荧光基团可以包括FAM荧光基团、HEX荧光基团和TAMRA荧光基团中的至少一种。
本公开的第二方面提供一种用于KIF5B-RET融合基因检测的试剂盒，该试剂盒中含有第一方面中任意一项所述的试剂组合物。
可选地，所述试剂盒中还含有反应体系缓冲液、RNase抑制剂、Mg2+和水。
可选地，所述试剂盒中含有以下含量的各组分：20μL试剂中含有0.3～0.4μM的引物对、300～500nM的crRNA，14～15μL的Rehydrationbuffer、150～200nM的单链DNA荧光探针、5～10U的RNase抑制剂、2～3μL的NEBuffer2.1、0.3～0.6μL的醋酸镁、200～300nM的Cas12a酶。
可选地，所述试剂盒中还可以含有空白对照品、阴性对照品和阳性对照品。
本公开的第三方面提供第一方面中任意一项所述的试剂组合物在制备用于KIF5B-RET融合基因检测的试剂盒中的用途。
本公开的第四方面提供一种用于KIF5B-RET融合基因检测的系统，该系统包括第一反应管、第二反应管、检测器和计算装置；其中，所述第一反应管中设有RPA试剂，用于对待测样本的cDNA进行RPA扩增，得到扩增产物，其中，所述RPA试剂中含有RPA引物，所述RPA引物包括SEQIDNO.2和SEQIDNO.3所示的核苷酸序列；所述第二反应管中设有Cas12a酶、单链DNA荧光探针和crRNA，用于在存在所述扩增产物时，进行Cas12a酶切反应，得到酶切产物，其中，crRNA包括SEQIDNO.1所示的核苷酸序列，酶切反应时间为5-15分钟；所述检测器设有紫外发光装置和荧光检测装置，所述紫外发光装置用于对所述酶切产物进行紫外光照射，所述荧光检测装置用于检测所述酶切产物在紫外光照射下的荧光值；所述计算装置包括存储器和处理器，所述存储器中存储有计算机程序，所述处理器被配置为执行所述存储器中存储的计算机程序，以实现如下的判别：当所述荧光检测装置检测到所述酶切产物在紫外光照射下的荧光值为500～3000时，判定所述待测样本中存在KIF5B-RET融合基因。
可选地，所述KIF5B-RET融合基因为KIF5Bexon15-RETexon12融合基因。
其中，检测器例如可以是紫外凝胶成像仪，紫外光的波长可以是420～460nm。利用上述系统，能够灵敏、快速、简便地对待测样本中的KIF5B-RET融合基因进行检测。
可选地，所述RPA试剂中含有以下含量的各组分：20μL试剂中含有0.3～0.4μM的引物对、14～15μL的Rehydrationbuffer、5～10U的RNase抑制剂、2～3μL的NEBuffer2.1、0.3～0.6μL的醋酸镁。
本公开的第五方面提供一种用于KIF5B-RET融合基因检测的方法，该方法包括：a、提取待测样本的RNA，并进行逆转录，得到待测样本的cDNA；b、将所述待测样本的cDNA与RPA试剂混合，并进行RPA扩增，得到扩增产物；其中，所述RPA试剂中含有RPA引物，所述RPA引物包括SEQIDNO.2和SEQIDNO.3所示的核苷酸序列；c、将所述扩增产物与Cas12a酶、单链DNA荧光探针和crRNA混合，反应15～20min，得到剪切产物；其中，所述crRNA包括如SEQIDNO.1所示的核苷酸序列，所述单链DNA荧光探针可以包括如SEQIDNO.3所示的核苷酸序列以及荧光基团，所述荧光基团可以包括FAM荧光基团、HEX荧光基团和TAMRA荧光基团中的至少一种；d、将所述剪切产物置于紫外光下，并检测其荧光值，当检测到荧光值为500～3000时，判定所述待测样本中存在KIF5B-RET融合基因。
其中，所述待测样本可以为人全血、细胞或组织样本。
优选地，本公开的方法不用于诊断，或者说KIF5B-RET融合基因的定性与定量结果与疾病是否发生没有一一对应的相关性，不属于诊断结果，但是KIF5B-RET融合基因的定性与定量的检测结果能够作为中间信息，供临床医生参考。
本公开的方法能够在40分钟内对存在KIF5B-RET融合基因的肿瘤实现快速、灵敏的检测。
下面通过实施例来进一步说明本公开，但是本公开并不因此而受到任何限制。
实施例1检测方法及检测结果判定
1、crRNA、单链DNA荧光探针和引物的合成
按照表1所示的crRNA序列、引物序列和单链DNA荧光探针序列，进行序列合成。
表1
序列名称 序列 SEQIDNO
KIF5B-RET-crRNA tttcccacagcaattcctatttct 1
KIF5B-RET-F aagaacttgctgtcaattatgatcagaagtctc 2
KIF5B-RET-R gcttcaggacgttgaactctgacagcaggtctc 3
单链DNA荧光探针 FAM-ttatt-BHQ1 4
2、样本处理
取待测样本，按照EasyPureRNAKit试剂盒的使用方法从待测样本中提取待测样本RNA，提取得到的RNA需满足OD260/OD280的比值在1.7～2.0之间，浓度大于50ng/μL。然后将符合要求的待测样本RNA利用TranscriptionFirstStrandcDNAsynthesiskit(Roche)进行逆转录，得到待测样本cDNA，逆转录得到的cDNA需满足OD260/OD280的比值在1.8～2.0之间，浓度大于30ng/μL。将符合要求的待测样本cDNA作为模板。
3、构建检测体系
(1)按照表2配制RPA反应体系。
表2
Figure BDA0002613071160000071
(2)取5μLPrimerFreeRehydrationbuffer，加入含Cas12a酶的吸附柱上层，形成终浓度为250nM的Cas12a酶试剂。
(3)按照表2配置RPA反应体系后，进行RPA扩增反应15min，得到扩增产物。然后于12000rpm条件下离心5min，使吸附柱中的Cas12a酶试剂与扩增产物混匀，反应5min，得到剪切产物。采用荧光酶标仪对剪切产物进行荧光检测，当检测在紫外光照射下的荧光值为500～3000时，判定所述待测样本中存在KIF5B-RET融合基因。
实施例2最低检出限验证
(1)评估用检测样本：将经二代测序验证为KIF5B-RET融合基因的cDNA进行梯度稀释到浓度为104，103，102，101，100aM的评估用模板。
按照实施例1的检测方法分别对各浓度的评估用模板进行检测，每个浓度梯度重复检测3次，采用荧光酶标仪进行荧光检测，检测得到的荧光值(数据呈现形式为均值±标准差，即“M±SD”)见表3。
表3
Figure BDA0002613071160000081
由表3可以看出，当评估用模板的浓度为101aM时，采用实施例1的方法检测得到的荧光值明显升高。说明实施例1的方法对KIF5B-RET融合基因的最低检出限为101aM。因此，本公开提供的试剂组合物用于检测KIF5B-RET融合基因的灵敏度高。
通过本实施例可以看出，本公开的方法检测KIF5B-RET融合基因的灵敏度较高。
实施例3准确度验证
选取经二代测序验证为野生型RET基因的样本5例，经二代测序验证为KIF5B-RET融合基因的样本10例，作为评估用样本。
按照实施例1的检测方法分别对上述评估用样本进行盲测，统计相应的检出例数，每个样本重复检测3次，检测结果见表4。
表4
Figure BDA0002613071160000091
由表4可以看出，实施例1的方法对KIF5B-RET融合基因的检测准确度为100％。
通过本实施例可以看出，本公开的方法检测KIF5B-RET融合基因的准确度较高。
对比例
按照表5所示的crRNA序列、引物序列和单链DNA荧光探针序列，进行序列合成。
表5
序列名称 序列 SEQIDNO
KIF5B-RET-crRNA-D tttctgcttgaaggcgattcagct 5
KIF5B-RET-F-D caggccctagaagaacttgctgtcaattatgat 6
KIF5B-RET-R-D gttgaactctgacagcaggtctcgcagctcact 7
单链DNA荧光探针-D FAM-ttatt-BHQ1 4
1、最低检出限验证
按照实施例2的方法进行最低检出限验证，结果见表6。
表6
Figure BDA0002613071160000101
由表6可以看出，本对比例中的试剂组合物和方法对KIF5B-RET融合基因的最低检出限为103aM。由此可见，本公开的试剂组合物和方法对KIF5B-RET融合基因的检测灵敏度更高，具有更强的检测能力。
2、准确度验证
按照实施例3的方法进行准确度验证，结果见表7。
表7
Figure BDA0002613071160000102
由表7可以看出，本对比例中的试剂组合物和方法对KIF5B-RET融合基因的阳性检出率为40％。由此可见，本公开的方法检测KIF5B-RET融合基因的准确度更高。
以上详细描述了本公开的优选实施方式，但是，本公开并不限于上述实施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所公开的内容。
序列表
<110> 浙江科途医学科技有限公司
<120> 用于KIF5B-RET融合基因检测的试剂组合物、试剂盒及检测系统
<130> 16287-K-BJKT
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tttcccacag caattcctat ttct 24
<210> 2
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aagaacttgc tgtcaattat gatcagaagt ctc 33
<210> 3
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gcttcaggac gttgaactct gacagcaggt ctc 33
<210> 4
<211> 5
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ttatt 5
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tttctgcttg aaggcgattc agct 24
<210> 6
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
caggccctag aagaacttgc tgtcaattat gat 33
<210> 7
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gttgaactct gacagcaggt ctcgcagctc act 33

Claims (10)

1.用于KIF5B-RET融合基因检测的试剂组合物，其特征在于，该试剂组合物包括crRNA、Cas12a酶和单链DNA荧光探针，其中，所述crRNA包括如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的试剂组合物，其特征在于，所述试剂组合物还包括引物对，所述引物对包括SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。
3.根据权利要求1所述的试剂组合物，其特征在于，所述KIF5B-RET融合基因为KIF5Bexon15-RETexon12融合基因。
4.根据权利要求1所述的试剂组合物，其特征在于，所述单链DNA荧光探针包括如SEQID NO.4所示的核苷酸序列以及荧光基团，所述荧光基团包括FAM荧光基团、HEX荧光基团和TAMRA荧光基团中的至少一种。
5.一种用于KIF5B-RET融合基因检测的试剂盒，其特征在于，该试剂盒中含有权利要求1～4中任意一项所述的试剂组合物。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还含有反应体系缓冲液、RNase抑制剂、Mg2+和水。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有以下含量的各组分：
20μL试剂中含有0.3～0.4μM的引物对、300～500nM的crRNA，14～15μL的Rehydrationbuffer、150～200nM的单链DNA荧光探针、5～10U的RNase抑制剂、2～3μL的NEBuffer2.1、0.3～0.6μL的醋酸镁、200～300nM的Cas12a酶。
8.权利要求1～4中任意一项所述的试剂组合物在制备用于KIF5B-RET融合基因检测的试剂盒中的用途。
9.一种用于KIF5B-RET融合基因检测的系统，其特征在于，该系统包括第一反应管、第二反应管、检测器和计算装置；其中，
所述第一反应管中设有RPA试剂，用于对待测样本的cDNA进行RPA扩增，得到扩增产物，其中，所述RPA试剂中含有RPA引物，所述RPA引物包括SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列；
所述第二反应管中设有Cas12a酶、单链DNA荧光探针和crRNA，用于在存在所述扩增产物时，进行Cas12a酶切反应，得到酶切产物，其中，crRNA包括SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，酶切反应时间为5-15分钟；
所述检测器设有紫外发光装置和荧光检测装置，所述紫外发光装置用于对所述酶切产物进行紫外光照射，所述荧光检测装置用于检测所述酶切产物在紫外光照射下的荧光值；
所述计算装置包括存储器和处理器，所述存储器中存储有计算机程序，所述处理器被配置为执行所述存储器中存储的计算机程序，以实现如下的判别：
当所述荧光检测装置检测到所述酶切产物在紫外光照射下的荧光值为500～3000时，判定所述待测样本中存在KIF5B-RET融合基因。
10.根据权利要求9所述的系统，其特征在于，所述KIF5B-RET融合基因为KIF5Bexon15-RETexon12融合基因。
CN202010760955.2A 2020-07-31 2020-07-31 用于kif5b-ret融合基因检测的试剂组合物、试剂盒及检测系统 Pending CN111909987A (zh)

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Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103764676A (zh) * 2011-08-04 2014-04-30 日本国立癌症研究中心 Kif5b基因和ret基因的融合基因、以及以该融合基因为目标的判断癌症治疗有效性的方法
CN103805688A (zh) * 2012-11-09 2014-05-21 益善生物技术股份有限公司 Ret融合基因检测的pcr引物、试剂盒和液相芯片
CN104975080A (zh) * 2015-05-29 2015-10-14 北京海思特临床检验所有限公司 检测肺癌kif5b-ret融合基因的引物、试剂盒及其使用方法
CN105229175A (zh) * 2013-03-15 2016-01-06 雅培分子公司 用于扩增和测定rna融合基因变体的方法、区分它们的方法以及有关的引物、探针和试剂盒
CN107488710A (zh) * 2017-07-14 2017-12-19 上海吐露港生物科技有限公司 一种Cas蛋白的用途及靶标核酸分子的检测方法和试剂盒
CN110396543A (zh) * 2019-04-30 2019-11-01 广州普世利华科技有限公司 一种肿瘤相关基因突变位点筛查方法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103764676A (zh) * 2011-08-04 2014-04-30 日本国立癌症研究中心 Kif5b基因和ret基因的融合基因、以及以该融合基因为目标的判断癌症治疗有效性的方法
CN103805688A (zh) * 2012-11-09 2014-05-21 益善生物技术股份有限公司 Ret融合基因检测的pcr引物、试剂盒和液相芯片
CN105229175A (zh) * 2013-03-15 2016-01-06 雅培分子公司 用于扩增和测定rna融合基因变体的方法、区分它们的方法以及有关的引物、探针和试剂盒
CN104975080A (zh) * 2015-05-29 2015-10-14 北京海思特临床检验所有限公司 检测肺癌kif5b-ret融合基因的引物、试剂盒及其使用方法
CN107488710A (zh) * 2017-07-14 2017-12-19 上海吐露港生物科技有限公司 一种Cas蛋白的用途及靶标核酸分子的检测方法和试剂盒
CN110396543A (zh) * 2019-04-30 2019-11-01 广州普世利华科技有限公司 一种肿瘤相关基因突变位点筛查方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HUA LIU等: "RPA-Cas12a-FS: A frontline nucleic acid rapid detection system for food safety based on CRISPR-Cas12a combined with recombinase polymerase amplification", 《FOOD CHEMISTRY》 *
YUNQING WANG等: "A One-Pot Toolbox Based on Cas12a/crRNA Enables Rapid Foodborne Pathogen Detection at Attomolar Level", 《ACS PUBLICATIONS》 *
李晓红等: "重组酶聚合酶扩增结合Cas12a 输血相关病原体核酸检测方法的可行性", 《中国输血杂志》 *

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