CN105658814A

CN105658814A - 在肺癌中检测出的新型融合基因

Info

Publication number: CN105658814A
Application number: CN201480057037.6A
Authority: CN
Inventors: 河野隆志; 茑幸治; 安田和基
Original assignee: National Center for Global Health and Medicine; National Cancer Center Japan; LSIP LLC
Current assignee: National Center for Global Health and Medicine; National Cancer Center Japan; LSIP LLC
Priority date: 2013-08-20
Filing date: 2014-08-20
Publication date: 2016-06-08
Also published as: US20150057335A1; JP6493681B2; EP3037547A1; TW201542825A; WO2015025866A1; JPWO2015025866A1

Abstract

一种作为癌的责任突变(驱动突变)的基因融合的检测方法，包括检测来自患有癌的被检测者的分离得到的试样中的EZR-ERBB4融合多核苷酸、KIAA1468-RET融合多核苷酸、TRIM24-BRAF融合多核苷酸、CD74-NRG1融合多核苷酸或者SLC3A2-NRG1融合多核苷酸中的任一种融合多核苷酸或者由其编码的多肽的工序。

Description

在肺癌中检测出的新型融合基因

技术领域

本发明涉及作为癌的责任突变的基因融合的检测方法、鉴定抑制由该基因融合产生的融合多核苷酸所编码的多肽的表达和/或活性的物质能带来治疗效果的癌患者或者存在患癌风险的被检测者的方法等。

背景技术

癌在日本是处于死因的第一位的疾病，要求改善其治疗法。特别是肺癌不仅在日本而且在全世界都是癌症死亡的首要病因，每年导致了100万人以上的死亡。肺癌大致分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌，另外，非小细胞肺癌分为肺腺癌(lungadenocarcinoma、LADC)，肺鳞癌、大细胞癌3种。这些肺癌之中，肺腺癌占非小细胞肺癌的约50％，其频率上升(非专利文献1)。

关于肺腺癌，已知绝大部分是由于癌基因的活化引起的。在癌基因的活化中，已知EGFR基因(10～40％)、KRAS基因(10～20％)的体细胞突变、ALK基因与EML4(echinodermmicrotubule-associatedprotein-like4)基因的融合、ALK基因与KIF5B基因的融合等(5％)互斥地(mutuallyexclusive)发生(非专利文献2～6)。

在晚期肺癌中，以利用药剂治疗为主，但是，各个症例对于药剂的反应性存在很大差异，因此，要求预测哪种药剂具有治疗效果的方法。因此，进行着对于如上所述的突变基因、融合基因这些能够作为其预测指标的分子的鉴定，例如，已知以EGFR、ALK蛋白质为标靶的酪氨酸激酶抑制剂对于具有EGFR突变、ALK融合的肺腺癌的治疗特别有效。另外，检测存在于4～5％的肺癌中的ALK酪氨酸激酶基因的融合的方法作为筛选对于ALK蛋白质的酪氨酸激酶的抑制剂适应例的筛选法而被开发，用于检测ALK酪氨酸激酶基因的融合的试剂在临床上被用作诊断药。

另一方面，本发明的发明人通过肺腺癌的全转录组测序鉴定了KIF5B(kinesinfamily5B)基因与编码受体型酪氨酸激酶的癌基因RET基因的框内融合转录产物(专利文献1和非专利文献7)。KIF5B-RET基因融合与EGFR突变、KRAS突变、ALK融合这些公知的癌基因活化突变互斥地发生，因此，显示为在癌化中的责任突变。据认为由该基因融合产生的融合蛋白经由KIF5B部分的卷曲螺旋结构域而无底物地二聚化，结果引起了RET激酶的异常活化。因此，在具有该基因融合的患者中，可以期待RET酪氨酸激酶抑制剂是有效的。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：国际公开第2013/018882号

非专利文献

非专利文献1：Herbst,R.S.etal.,TheNewEnglandjournalofmedicine,2008,359,1367-1380

非专利文献2：Paez,J.G.etal.,Science,2004,304,1497-1500

非专利文献3：Takeuchi,K.etal.,ClinCancerRes,2009,15,3143-3149

非专利文献4：Soda,M.etal.,Nature,2007,448,561-566

非专利文献5：Janku,F.etal.,NatRevClinOncol,2010,7,401-414

非专利文献6：Lovly,C.M.etal.,NatRevClinOncol,2011,8,68-70

非专利文献7：Kohno,T.etal.,NatMedicine,2012,18(3),375-377

发明内容

发明所要解决的课题

肺癌等癌中的突变的鉴定至今仍不能说是充分的，现状是期望进一步鉴定可以作为预测药剂的治疗有效性的指标的突变。

因此，本发明的目的在于提供鉴定在肺癌等癌中可以作为预测药剂的治疗有效性的指标的突变、检测该突变的方法，基于该突变，提供鉴定以具有该突变的基因或者由其编码的蛋白质为标靶的药剂能带来治疗效果的癌患者或者存在患癌风险的被检测者的方法等。

用于解决课题的方法

本发明的发明人为了实现上述目的重复进行了深入研究，其结果，利用全转录组测序的方法，发现了EZR-ERBB4、KIAA1468-RET、TRIM24-BRAF、CD74-NRG1和SLC3A2-NRG1基因融合分别在肺癌中独立存在。这些基因融合的阳性例中，作为公知的肺癌责任突变(驱动突变)的EGFR点突变-框内缺失突变(EGFRpointmutation，EGFRin-flamedeletionmutation)、KRAS点突变(KRASpointmutation)、BRAF点突变(BRAFpointmutation)、HER2框内插入突变(HER2in-flameinsertionmutation)、EML4-ALK基因融合(EML4-ALKfusion)、KIF5B-RET基因融合(KIF5B-RETfusion)、CCDC6-RET基因融合(CCDC6-RETfusion)、CD74-ROS1基因融合(CD74-ROS1fusion)、EZR-ROS1基因融合(EZR-ROS1fusion)和SLC34A2-ROS1基因融合(SLC34A2-ROS1fusion)为阴性，可以明确这些基因融合为癌化中的责任突变。

由EZR-ERBB4和KIAA1468-RET基因融合产生的蛋白质与公知的膜型酪氨酸激酶的融合蛋白(Kohno,T.etal.,NatMedicine,2012,18(3),375-377)同样，推定为经由卷曲螺旋结构域而无底物地二聚化，从而稳定活化。另外，由TRIM24-BRAF基因融合产生的蛋白质与已经鉴定的其它BRAF融合基因(Palanisamy,N.etal.,NatMedicine,2010,16(7),793-798)同样，推定为通过去除存在于BRAF蛋白的N末端侧的激酶抑制结构域而稳定活化。因此，对于这些基因融合阳性癌，可以考虑ERBB4激酶、RET激酶和BRAF激酶的抑制剂等分别能带来治疗效果。

另外，由CD74-NRG1和SLC3A2-NRG1基因融合产生的蛋白质，与此前所鉴定的NRG1融合蛋白(Adelaide,J.etal.,GENES,CHROMOSOMES&GANCER,2003,37,333-345和Wilson,T.R.etal.,CancerCell,2011,20,158-172)同样，推定为通过融合而高表达，通过自分泌机制而对细胞的增殖和生存有正向作用。因此，对于该基因融合阳性癌，对于细胞增殖因子NRG1的抗体药或者对于作为其受体的HER蛋白组群的抗体药或激酶抑制剂等可以带来治疗效果。

根据上述内容，本发明的发明人进一步重复进行研究，结果发现，在肺癌等癌中，基于该基因融合，能够鉴定以该基因或者由其编码的蛋白质为标靶的药剂能带来治疗效果的癌患者或者存在患癌风险的被检测者，从而完成了本发明。

即，本发明如下所述。

[1]一种作为癌的责任突变(驱动突变)的基因融合的检测方法，其包括：

检测来自患有癌的被检测者的分离得到的试样中的下述(a)～(e)中的任一种融合多核苷酸或者由其编码的多肽的工序：

(a)EZR-ERBB4融合多核苷酸，编码包括EZR的卷曲螺旋结构域的全部或者一部分和ERBB4的激酶结构域并且具有激酶活性的多肽的多核苷酸；

(b)KIAA1468-RET融合多核苷酸，编码包括KIAA1468的卷曲螺旋结构域的全部或者一部分和RET的激酶结构域并且具有激酶活性的多肽的多核苷酸；

(c)TRIM24-BRAF融合多核苷酸，编码包括BRAF的激酶结构域并且具有激酶活性的多肽的多核苷酸；

(d)CD74-NRG1融合多核苷酸，编码包括CD74的跨膜结构域和NRG1的EGF结构域并且具有增强细胞内信号转导的活性的多肽的多核苷酸；以及

(e)SLC3A2-NRG1融合多核苷酸，编码包括SLC3A2的跨膜结构域和NRG1的EGF结构域并且具有增强细胞内信号转导的活性的多肽的多核苷酸。

[2]如[1]所述的方法，其中，融合多核苷酸为下述(a)～(e)中的任一种：

(a)编码下述多肽的EZR-ERBB4融合多核苷酸：

(i)由序列编号2所示的氨基酸序列构成的多肽、

(ii)由序列编号2所示的氨基酸序列构成的多肽中缺失、取代或者添加1个或多个氨基酸的氨基酸序列所构成的、并且具有激酶活性的多肽、或者

(iii)由与序列编号2所示的氨基酸序列具有80％以上的序列同一性的氨基酸序列构成的、并且具有激酶活性的多肽；

(b)编码下述多肽的KIAA1468-RET融合多核苷酸：

(i)由序列编号4所示的氨基酸序列构成的多肽、

(ii)由序列编号4所示的氨基酸序列构成的多肽中缺失、取代或者添加1个或多个氨基酸的氨基酸序列所构成的、并且具有激酶活性的多肽、或者

(iii)由与序列编号4所示的氨基酸序列具有80％以上的序列同一性的氨基酸序列构成的、并且具有激酶活性的多肽；

(c)编码下述多肽的TRIM24-BRAF融合多核苷酸：

(i)由序列编号6所示的氨基酸序列构成的多肽、

(ii)由序列编号6所示的氨基酸序列构成的多肽中缺失、取代或者添加1个或多个氨基酸的氨基酸序列所构成的、并且具有激酶活性的多肽、或者

(iii)由与序列编号6所示的氨基酸序列具有80％以上的序列同一性的氨基酸序列构成的、并且具有激酶活性的多肽；

(d)编码下述多肽的CD74-NRG1融合多核苷酸：

(i)由序列编号8或者10所示的氨基酸序列构成的多肽、

(ii)由序列编号8或者10所示的氨基酸序列构成的多肽中缺失、取代或者添加1个或多个氨基酸的氨基酸序列构成的、具有增强细胞内信号转导的活性的多肽、或者

(iii)由与序列编号8或者10所示的氨基酸序列具有80％以上的序列同一性的氨基酸序列构成的、具有增强细胞内信号转导的活性的多肽；和

(e)编码下述多肽的SLC3A2-NRG1融合多核苷酸：

(i)由序列编号36所示的氨基酸序列构成的多肽、

(ii)由序列编号36所示的氨基酸序列构成的多肽中缺失、取代或者添加1个或多个氨基酸的氨基酸序列构成的、具有增强细胞内信号转导的活性的多肽、或者

(iii)由与序列编号36所示的氨基酸序列具有80％以上的序列同一性的氨基酸序列构成的、具有增强细胞内信号转导的活性的多肽。

[3]如[1]或[2]所述的方法，其中，融合多核苷酸为下述(a)～(e)中的任一种：

(a)

(i)由序列编号1所示的碱基序列构成的多核苷酸、

(ii)与由与序列编号1所示的碱基序列所构成的多核苷酸互补的碱基序列构成的多核苷酸在严格条件下杂交、并且编码具有激酶活性的多肽的多核苷酸、

(iii)由序列编号1所示的碱基序列构成的多核苷酸中缺失、取代或者添加1个或多个核苷酸的碱基序列所构成的、并且编码具有激酶活性的多肽的多核苷酸、或者

(iv)与由序列编号1所示的碱基序列构成的多核苷酸具有80％以上的序列同一性、并且编码具有激酶活性的多肽的多核苷酸；

(b)

(i)由序列编号3所示的碱基序列构成的多核苷酸、

(ii)与由与序列编号3所示的碱基序列所构成的多核苷酸互补的碱基序列构成的多核苷酸在严格条件下杂交、并且编码具有激酶活性的多肽的多核苷酸、

(iii)由序列编号3所示的碱基序列构成的多核苷酸中缺失、取代或者添加1个或多个核苷酸的碱基序列所构成的、并且编码具有激酶活性的多肽的多核苷酸、或者

(iv)与由序列编号3所示的碱基序列构成的多核苷酸具有80％以上的序列同一性、并且编码具有激酶活性的多肽的多核苷酸；

(c)

(i)由序列编号5所示的碱基序列构成的多核苷酸、

(ii)与由与序列编号5所示的碱基序列所构成的多核苷酸互补的碱基序列构成的多核苷酸在严格条件下杂交、并且编码具有激酶活性的多肽的多核苷酸、

(iii)由在序列编号5所示的碱基序列构成的多核苷酸中缺失、取代或者添加1个或多个核苷酸的碱基序列所构成的、并且编码具有激酶活性的多肽的多核苷酸、或者

(iv)与由序列编号5所示的碱基序列构成的多核苷酸具有80％以上的序列同一性、并且编码具有激酶活性的多肽的多核苷酸；

(d)

(i)由序列编号7或者9所示的碱基序列构成的多核苷酸、

(ii)与由与序列编号7或者9所示的碱基序列所构成的多核苷酸互补的碱基序列构成的多核苷酸在严格条件下杂交、并且编码具有增强细胞内信号转导的活性的多肽的多核苷酸、

(iii)由序列编号7或者9所示的碱基序列构成的多核苷酸中缺失、取代或者添加1个或多个核苷酸的碱基序列所构成的、并且编码具有增强细胞内信号转导的活性的多肽的多核苷酸、或者

(iv)与由序列编号7或者9所示的碱基序列构成的多核苷酸具有80％以上的序列同一性、并且编码具有增强细胞内信号转导的活性的多肽的多核苷酸；和

(e)

(i)由序列编号35所示的碱基序列构成的多核苷酸、

(ii)与由与序列编号35所示的碱基序列所构成的多核苷酸互补的碱基序列构成的多核苷酸在严格条件下杂交、并且编码具有增强细胞内信号转导的活性的多肽的多核苷酸、

(iii)由序列编号35所示的碱基序列构成的多核苷酸中缺失、取代或者添加1个或多个核苷酸的碱基序列所构成的、并且编码具有增强细胞内信号转导的活性的多肽的多核苷酸、或者

(iv)与由序列编号35所示的碱基序列构成的多核苷酸具有80％以上的序列同一性、并且编码具有增强细胞内信号转导的活性的多肽的多核苷酸。

[4]如[1]～[3]中任一项所述的方法，其中，癌为肺癌。

[5]一种鉴定癌患者或者存在患癌风险的被检测者的方法，所述癌患者或者存在患癌风险的被检测者是抑制由作为癌的责任突变(驱动突变)的基因融合产生的融合多核苷酸所编码的多肽的表达和/或活性的物质能带来治疗效果的癌患者或者存在患癌风险的被检测者，所述方法包括下述的工序：

(1)检测来自被检测者的分离得到的试样中的下述(a)～(e)中的任一种融合多核苷酸或者由其编码的多肽的工序：

(e)SLC3A2-NRG1融合多核苷酸，编码包括SLC3A2的跨膜结构域和NRG1的EGF结构域并且具有增强细胞内信号转导的活性的多肽的多核苷酸；和

(2)当检测到所述融合多核苷酸或者由其编码的多肽时，判定为抑制所述多肽的表达和/或活性的物质在所述被检测者中能带来治疗效果的工序。

[6]一种作为癌的责任突变(驱动突变)的基因融合的检测用试剂盒，其含有下述(A)～(C)中的任一种或者它们的组合：

(A)作为探针的多核苷酸，所述探针设计为特异性识别EZR-ERBB4融合多核苷酸、KIAA1468-RET融合多核苷酸、TRIM24-BRAF融合多核苷酸、CD74-NRG1融合多核苷酸或者SLC3A2-NRG1融合多核苷酸；

(B)作为一对引物的多核苷酸，所述一对引物设计为能够特异性扩增EZR-ERBB4融合多核苷酸、KIAA1468-RET融合多核苷酸、TRIM24-BRAF融合多核苷酸、CD74-NRG1融合多核苷酸或者SLC3A2-NRG1融合多核苷酸；或者

(C)特异性识别EZR-ERBB4融合多肽、KIAA1468-RET融合多肽、TRIM24-BRAF融合多肽、CD74-NRG1融合多肽或者SLC3A2-NRG1融合多肽的抗体。

[7]包括EZR蛋白的卷曲螺旋结构域的全部或者一部分和ERBB4蛋白的激酶结构域并且具有激酶活性的、分离得到的EZR-ERBB4融合多肽或其片段。

[8]包括KIAA1468蛋白的卷曲螺旋结构域的全部或者一部分和RET蛋白的激酶结构域并且具有激酶活性的、分离得到的KIAA1468-RET融合多肽或其片段。

[9]包括BRAF蛋白的激酶结构域并且具有激酶活性的、分离得到的TRIM24-BRAF融合多肽或其片段。

[10]包括CD74蛋白的跨膜结构域和NRG1蛋白的EGF结构域并且具有增强细胞内信号转导的活性的、分离得到的CD74-NRG1融合多肽或其片段。

[11]包括SLC3A2蛋白的跨膜结构域和NRG1蛋白的EGF结构域并且具有增强细胞内信号转导的活性的、分离得到的SLC3A2-NRG1融合多肽或其片段。

[12]编码[7]～[11]中任一项所述的融合多肽或其片段的多核苷酸。

[13]一种癌的治疗方法，其包括下述的工序：

对以[5]所述的方法判定为抑制由作为癌的责任突变(驱动突变)的基因融合产生的融合多核苷酸所编码的多肽的表达和/或活性的物质能带来治疗效果的被检测者，投与抑制由所述融合多核苷酸编码的多肽的表达和/或活性的物质。

[14]一种癌治疗剂的筛选方法，其包括下述的工序：

(1)使被检测物质与表达[7]～[11]中任一项所述的融合多肽的细胞接触的工序；

(2)确定是否抑制所述融合多肽的表达和/或活性的工序；以及

(3)将确定为抑制所述融合多肽的表达和/或活性的物质选择作为癌治疗剂的工序。

发明的效果

根据本发明，能够检测由本申请发明所首次明确的特定的癌的未知的责任突变，能够基于该责任突变的存在鉴定癌治疗能带来效果的癌患者或者存在患癌风险的被检测者，进而对该癌患者进行治疗。

附图说明

图1是表示EZR-ERBB4、KIAA1468-RET、TRIM24-BRAF和CD74-NRG1融合蛋白的结构域结构的一例的概略图。向下的箭头表示融合点。

图2是表示以从来自癌组织的RNA合成的cDNA为模板，通过RT-PCR检测EZR-ERBB4、KIAA1468-RET、TRIM24-BRAF和CD74-NRG1变异型2的各基因融合的结果的电泳的照片。向下的箭头表示基因融合阳性例。

图3是表示表达CD74-NRG1、EZR-ERBB4或者TRIM24-BRAFcDNAs的NIH3T3细胞的转化。(A)在瞬时转染的H1299细胞和病毒感染的NIH3T3细胞中，通过蛋白质免疫印迹分析检测的基因融合产物的表达。使用识别融合蛋白中保持的NRG1肽的抗体(目录编号：RB-276，ThermoScientific)、识别融合蛋白中保持的ERBB4肽的抗体(目录编号：2218-1，Epitomics)和识别融合蛋白中保持的BRAF肽的抗体(目录编号：sc-166，SantaCruzBiotechnology)。(B)通过CD74-NRG1(C8；N6)、EZR-ERBB4或者TRIM24-BRAFcDNAs的表达所诱导的NIH3T3细胞的非贴壁依赖性的集落增殖的显微镜照片。比例尺为100μm。

图4是在浸润性粘液性肺腺癌中导致癌化的基因融合。野生型蛋白质与新鉴定的融合蛋白的概略图。用箭头表示切断点。TM：跨膜结构域。用虚线表示NRG1多肽中的推定切断部位的位置。

图5是利用RT-PCR进行的基因融合转录产物的检测。在下侧表示甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的RT-PCR产物。将基因融合阳性的6例的IMA(T)和与其对应的非癌肺组织(N)并列表示；凝胶图像下的标签表示样品ID(参照表4)。

图6是新型融合转录产物的cDNA的桑格测序的电泳图。CD74-NRG1(2个变异型)、SLC3A2-NRG1、EZR-ERBB4、TRIM24-BRAF和KIAA1468-RET融合。将RT-PCR产物直接测序。

图7是关于NRG1、ERBB4、BRAF和RET重排的基因组构成的概略图。是表示包括CD74-NRG1(A)、SLC3A2-NRG1(B)、EZR-ERBB4(C)、TRIM24-BRAF(D)和KIAA1468-RET(F)融合相关的外显子和非翻译区域的、野生型和融合基因的基因组构成的图。数字表示从5'末端开始的外显子的编号，箭头表示转录的方向。TRIM24和BRAF基因在7号染色体上位于逆向2.2Mb的范围内；TRIM24-BRAF融合推测通过染色体的7q33-34区域中的臂内倒位而产生(B)。用野生型基因上的垂直的线表示切断点的位置。

图8是关于NRG1融合的break-apart荧光原位(insitu)杂交(FISH)。(A)NRG1基因的基因组构成和作为探针使用的BAC克隆的位置。(B)正常组织。(C)具有CD74-NRG1融合的IMA。通过FISH，在转座部位相邻的2个探针由来的绿色荧光(端粒侧)和橙色荧光(着丝粒侧)的分离变得明显。

图9是由融合阳性IMA得到的代表性的组织学图像。使用识别融合蛋白中保持的多肽的抗体实施免疫染色。(A)(上段)具有NRG1重排的IMA。肿瘤由具有精细的伊红嗜性细胞质和各种量的粘蛋白的高圆柱状细胞构成。可见伴有精细的粒状染色质的核扩大和核排列的紊乱(初始倍率，×20)。(中段)CD74-NRG1融合阳性IMA中的NRG1染色。腺癌构成要素中，可见斑状的粒状细胞质的染色(初始倍率，×20)。(下段)融合阴性IMA中的NRG1染色(初始倍率，×20)。在几乎所有(>80％)例子中，可观察到融合阳性肿瘤时的那种细胞质的粒状染色。(B)(上段)具有ERBB4重排的IMA。肿瘤由具有位于基部的小的核、位于细胞质上方部分的粘蛋白的高圆柱状细胞构成(初始倍率，×20)。(中段)EZR-ERBB4融合阳性IMA中的ERBB4染色。可见伴有细胞质染色的质膜的增强(初始倍率，×40)。(下段)融合阴性IMA中的ERBB4染色(初始倍率，×40)。在>50％的例子中观察到不伴有膜的增强的细胞质染色。(C)(上段)具有BRAF重排的IMA。肿瘤由具有凝缩的伊红嗜性粘蛋白的高圆柱状细胞构成。可见核扩大和核重叠(初始倍率，×20)。(中段)TRIM24-BRAF融合阳性IMA中的BRAF染色。腺癌构成要素中，可见弥散的强的粒状细胞质染色(初始倍率，×20)。(下段)融合阴性IMA中的BRAF染色(初始倍率，×40)。一部分的例子(<10％)显示局部弱的细胞质染色。

图10是基因融合产物的致癌特性。A、使用EFM-19细胞系证实的由CD74-NRG1融合引起的ERBB3活化。在来自外源性表达CD74-NRG1cDNA的H1299细胞的条件培养基中处理30分钟的EFM-19(报告)细胞中，研究ERBB3、ERBB2、AKT和ERK的磷酸化。通过HER-TKI抑制磷酸化。B、由EZR-ERBB4融合引起的ERBB4活化。将稳定转染的NIH3T3细胞进行24小时血清饥饿，用DMSO(空白对照)或者TKI处理2小时。ERBB4和ERK的磷酸化被ERBB4-TKI抑制。使用识别EZR-ERBB4融合蛋白中保持的ERBB4多肽的抗体检测该融合蛋白。C、由TRIM24-BRAF融合引起的BRAF活化。将稳定转染的NIH3T3细胞进行24小时血清饥饿，用DMSO或者激酶抑制剂处理2小时。ERK磷酸化(活化)被作为以BRAF为靶标的激酶抑制剂索拉非尼(Sorafenib)以及作为MEK抑制剂的U0126抑制。使用识别TRIM24-BRAF融合蛋白中保持的BRAF多肽的抗体检测该融合蛋白。D～F、表达CD74-NRG1(D)、EZR-ERBB4(E)或者TRIM24-BRAF(F)cDNA的NIH3T3细胞的非贴壁依赖性增殖和利用激酶抑制剂的抑制。将转染了Mock-、CD74-NRG1-、EZR-ERBB4-和TRIM24-BRAF-NIH3T3细胞接种于只含有DMSO或者含有激酶抑制剂的软琼脂中。14天后，对直径>100μm的集落进行计数。棒图表示集落数的平均±S.E.M.。

图11是表达ERZ-ERBB4或者TRIM24-BRAF融合cDNA的NIH3T3细胞的肿瘤形成能力。A、注入有空载体、表达EZR-ERBB4融合或者TRIM24-BRAF融合的NIH3T3细胞的裸鼠中的肿瘤增殖。将细胞在50％基质胶中重悬，注入裸鼠的右侧腹部。在5周内每周测定2次肿瘤的大小。以平均±S.E.M.表示数据。B、在第21天拍摄代表性肿瘤的照片。括号内的数值表示具有肿瘤的小鼠的数量相对于接受细胞注入的小鼠的数量的比例。

图12是表示具有所示的驱动突变的IMA的比例的圆饼图。

具体实施方式

如后述的实施例所示，本发明的发明人首次发现了在癌组织中作为癌的责任突变(驱动突变)的5种的基因融合、即EZR-ERBB4基因融合、KIAA1468-RET基因融合、TRIM24-BRAF基因融合、CD74-NRG1基因融合和SLC3A2-NRG1基因融合。本发明基于这样的认识，提供该基因融合的检测方法、基于该责任突变的存在的癌治疗能带来效果的癌患者或者存在患癌风险的被检测者的鉴定方法、癌的治疗方法和癌治疗剂、癌治疗剂的筛选方法等。

本发明中，所谓“癌的责任突变”，是与驱动突变可以互换使用的词语，是指存在于癌组织的、对细胞具有癌化能力的突变。典型而言，在发现了某种突变的癌组织中，已知的癌基因突变(至少为EGFR点突变-框内缺失突变、KRAS点突变、BRAF点突变、HER2框内插入突变、ALK-EML4基因融合、KIF5B-RET基因融合、CCDC6-RET基因融合、CD74-ROS1基因融合、EZR-ROS1基因融合和SLC34A2-ROS1基因融合)均不存在时(即，该突变与上述已知的癌基因突变互斥地存在时)，该突变能够称为癌的责任突变。

＜具体的癌的责任突变＞

以下，对各基因融合进行说明。其中，本说明书中，融合多核苷酸中的“融合点”是指5’侧的基因部分与3’侧的基因部分连接的边界，这是2个核苷酸残基之间的边界。另外，融合多肽中的“融合点”是指N末端侧的多肽与C末端侧的多肽连接的边界，这是2个氨基酸残基之间的边界，或者基因融合在1个密码子内产生时，为由该密码子编码的1个氨基酸残基自身。

(1)EZR-ERBB4基因融合

本基因融合是产生EZR蛋白和ERBB4蛋白的融合蛋白(以下，也称为EZR-ERBB4融合多肽)的表达的突变，是在人类染色体中由在6q25和2q34的区域内具有切断点的转座(t(2；6))产生的突变。

EZR蛋白在人类中为存在于6q25的基因所编码的蛋白质，典型而言，是由序列编号20所示的氨基酸序列(NCBI登录编号NP_001104547.1(09-JUN-2013)构成的蛋白质。EZR蛋白的特征在于具有卷曲螺旋(Coiled-coil)结构域(图1)，该结构域在人类中相当于序列编号20所示的氨基酸序列的300～550位的氨基酸序列。

ERBB4蛋白在人类中为存在于2q34的基因所编码的蛋白质，典型而言，为序列编号22所示的氨基酸序列(NCBI登录编号NP_001036064.1(15-JUN-2013)构成的蛋白质。ERBB4蛋白的特征在于具有激酶结构域(图1)，在人类中相当于序列编号22所示的氨基酸序列的708～964位的氨基酸序列。

另外，在ERBB4蛋白中，在激酶结构域的N末端侧存在弗林蛋白酶样重复序列(Furin-likerepeat)和跨膜结构域(例如，序列编号22所示的氨基酸序列的183～665位)。

EZR-ERBB4融合多肽为包括EZR蛋白的卷曲螺旋结构域的全部或者一部分和ERBB4蛋白的激酶结构域并且具有激酶活性的多肽。

EZR-ERBB4融合多肽中，可以包括EZR蛋白的卷曲螺旋结构域的全部，只要可以将EZR-ERBB4融合多肽二聚化即可，也可以包括卷曲螺旋结构域的一部分。EZR-ERBB4融合多肽是否二聚化能够通过凝胶渗透色谱、交联剂处理和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的组合等公知的方法来确认。

EZR-ERBB4融合多肽中，可以包括ERBB4蛋白的激酶结构域的全部，只要EZR-ERBB4融合多肽具有激酶活性即可，也可以包括激酶结构域的一部分。

EZR-ERBB4融合多肽“具有激酶活性”是指具有作为由来自ERBB4蛋白的激酶结构域引起的将酪氨酸磷酸化的酶的活性。EZR-ERBB4融合多肽的激酶活性能够通过通常方法测定，通常，在适当的条件下使底物(合成肽底物等)和ATP一起进行孵育后，检测底物的磷酸化酪氨酸。另外，也能够使用市售的测定试剂盒进行测定。

EZR-ERBB4融合多肽可以包括ERBB4蛋白的弗林蛋白酶样重复序列和跨膜结构域的全部或一部分，但优选不包括。

不希望受到任何理论的限制，据认为EZR-ERBB4融合多肽通过存在于N末端侧的卷曲螺旋结构域二聚化并自我磷酸化，从而稳定活化，由此参与癌化。

本发明中，编码EZR-ERBB4融合多肽的多核苷酸(以下，也称为EZR-ERBB4融合多核苷酸)是编码包括EZR蛋白的卷曲螺旋结构域的全部或者一部分和ERBB4蛋白的激酶结构域并且具有激酶活性的多肽的多核苷酸。EZR-ERBB4融合多核苷酸可以是mRNA、cDNA和基因组DNA的任一种。

本发明中的EZR-ERBB4融合多核苷酸例如可以为编码下述的多肽的EZR-ERBB4融合多核苷酸：

(i)由序列编号2所示的氨基酸序列构成的多肽、

(iii)由与序列编号2所示的氨基酸序列具有80％以上的序列同一性的氨基酸序列构成的、并且具有激酶活性的多肽。

序列编号2所示的氨基酸序列如后述的实施例所示，为在来自人类癌组织的样品中发现的EZR-ERBB4融合多核苷酸所编码的氨基酸序列。此外，序列编号2所示的氨基酸序列中，融合点位于448位的Arg。

上述(ii)中，“1个或多个氨基酸”通常是指1～50个、优选为1～30个、更优选为1～10个、更进一步优选为1～数个(例如，1～5个、1～4个、1～3个、1或2个、或者1个)的氨基酸。

上述(iii)中，“80％以上的序列同一性”是指优选为85％以上、更优选为90％以上、95％以上、更进一步优选为97％以上、98％以上、99％以上的序列同一性。氨基酸序列的同源性能够利用基于Karlin和Altschul的算法BLAST(Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:2264-2268,1990、ProcNatlAcadSciUSA90:5873,1993)的称为BLASTX或者BLASTP程序(AltschulSF,etal:JMolBiol215:403,1990)来确定。使用BLASTX进行氨基酸序列的解析时，参数例如设为score＝50、wordlength＝3。作为BLAST使用GappedBLAST程序时，使用各程序的默认参数。这些解析方法的具体方法是本领域技术人员所熟悉的(例如，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。

另外，本发明中的EZR-ERBB4融合多核苷酸，例如，可以为下述的任一种多核苷酸：

(i)由序列编号1所示的碱基序列构成的多核苷酸、

(iv)与由序列编号1所示的碱基序列构成的多核苷酸具有80％以上的序列同一性、并且编码具有激酶活性的多肽的多核苷酸。

序列编号1所示的碱基序列如后述的实施例所示，为在来自人类癌组织的样品中发现的EZR-ERBB4融合多核苷酸的碱基序列。序列编号1所示的碱基序列中，融合点位于1524位的鸟嘌呤和1525位的鸟嘌呤之间。

上述(ii)中，所谓“严格条件下”，除了特别记载的情况之外，是指中程度或者高程度的严格条件。

中程度的严格条件，例如，只要是本领域技术人员，就能够基于作为对象的多核苷酸的长度而容易地设计。基本的条件如Sambrook等，MolecularCloning:ALaboratoryManual，第3版，第6～7章，ColdSpringHarborLaboratoryPress,2001所示。典型而言，中程度的严格条件包括：对硝化纤维素膜，5×SSC、0.5％SDS、1.0mMEDTA(pH8.0)的前清洗条件；约40～50℃的、约50％甲酰胺、2～6×SSC(或者，约42℃的、约50％甲酰胺中的Stark'ssolution等其它同样的杂交溶液)的杂交条件；和约40℃～60℃、0.5～6×SSC、0.1％SDS的清洗条件。中程度的严格条件优选包括约50℃、6×SSC的杂交条件，也可以包括上述的清洗条件和/或清洗条件。

高程度的严格条件(高严格条件)，例如，只要是本领域技术人员，就能够基于作为对象的多核苷酸的长度而容易地设计。高严格条件包括比中程度的严格条件高的温度和/或低的盐浓度。典型而言，包括约65℃、0.2～6×SSC、优选为6×SSC、更优选为2×SSC、进一步优选为0.2×SSC的杂交条件。任一情况下优选包括约65～68℃、0.2×SSC、0.1％SDS的清洗条件。

任一情况下，作为用于杂交、前清洗和清洗的缓冲液，均能够代替SSC(1×SSC为0.15MNaCl和15mM柠檬酸钠。)而使用SSPE(1×SSPE为0.15MNaCl、10mMNaH₂PO₄和1.25mMEDTA，pH7.4。)。任一情况下，清洗能够在杂交结束后进行约15分钟。

上述(iii)中，“1个或多个核苷酸”通常是指1～50个、优选为1～30个、更优选为1～10个、更进一步优选为1～数个(例如，1～5个、1～4个、1～3个、1或2个、或者1个)的核苷酸。

上述(iv)中，“80％以上的序列同一性”是指优选为85％以上、更优选为90％以上、95％以上、更进一步优选为97％以上、98％以上、99％以上的序列同一性。碱基序列的同源性能够利用基于上述算法BLAST的称为BLASTN的程序(AltschulSF,etal:JMolBiol215:403,1990)来确定。使用BLASTN进行碱基序列的解析时，参数例如设为score＝100、wordlength＝12。

(2)KIAA1468-RET基因融合

本基因融合是产生KIAA1468蛋白和RET蛋白的融合蛋白(以下，也称为KIAA1468-RET融合多肽)的表达的突变，是在人类染色体中由18q21和10q11的区域内具有切断点的转座(t(10；18))产生的突变。

KIAA1468蛋白在人类中为由存在于18q21的基因编码的蛋白质，典型而言，是由序列编号24所示的氨基酸序列(NCBI登录编号NP_065905.2(17-APR-2013)构成的蛋白质。KIAA1468蛋白的特征在于具有卷曲螺旋结构域(图1)，该结构域在人类中相当于序列编号24所示的氨基酸序列的360～396位的氨基酸序列。

RET蛋白在人类中为由存在于10q11的基因编码的蛋白质，典型而言，为序列编号26所示的氨基酸序列(NCBI登录编号NP_066124.1(07-JULY-2013))构成的蛋白质。RET蛋白的特征在于具有激酶结构域(图1)，在人类中相当于序列编号26所示的氨基酸序列的723～1012位的氨基酸序列。

另外，RET蛋白中，在激酶结构域的N末端侧存在钙粘蛋白重复序列(Cadherinrepeat)和跨膜结构域。

KIAA1468-RET融合多肽为包括KIAA1468蛋白的卷曲螺旋结构域的全部或者一部分和RET蛋白的激酶结构域并且具有激酶活性的多肽。

KIAA1468-RET融合多肽中，可以包括KIAA1468蛋白的卷曲螺旋结构域的全部，只要可以将KIAA1468-RET融合多肽二聚化即可，也可以包括卷曲螺旋结构域的一部分。KIAA1468-RET融合多肽是否二聚化能够通过凝胶渗透色谱、交联剂处理和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的组合等公知的方法来确认。

KIAA1468-RET融合多肽中，可以包括RET蛋白的激酶结构域的全部，只要KIAA1468-RET融合多肽具有激酶活性即可，也可以包括激酶结构域的一部分。

KIAA1468-RET融合多肽“具有激酶活性”是指具有作为由来自RET蛋白的激酶结构域引起的将酪氨酸磷酸化的酶的活性。KIAA1468-RET融合多肽的激酶活性能够通过通常方法测定，通常，在适当的条件下使底物(合成肽底物等)和ATP一起进行孵育后，检测底物的磷酸化酪氨酸。另外，也能够使用市售的测定试剂盒进行测定。

KIAA1468-RET融合多肽可以包括RET蛋白的钙粘蛋白重复序列和跨膜结构域的全部或一部分，优选不包括。

不希望受到任何理论的限制，据认为KIAA1468-RET融合多核苷酸通过存在于N末端侧的卷曲螺旋结构域二聚化并自我磷酸化，从而稳定活化，由此参与癌化。

本发明中，编码KIAA1468-RET融合多肽的多核苷酸(以下，也称为KIAA1468-RET融合多核苷酸)是编码包括KIAA1468蛋白的卷曲螺旋结构域的全部或者一部分和RET蛋白的激酶结构域并且具有激酶活性的多肽的多核苷酸。KIAA1468-RET融合多核苷酸可以是mRNA、cDNA和基因组DNA的任一种。

本发明中的KIAA1468-RET融合多核苷酸例如可以为编码下述的多肽的KIAA1468-RET融合多核苷酸：

(i)由序列编号4所示的氨基酸序列构成的多肽、

(iii)由与序列编号4所示的氨基酸序列具有80％以上的序列同一性的氨基酸序列构成的、并且具有激酶活性的多肽。

序列编号4所示的氨基酸序列如后述的实施例所示，为在来自人类癌组织的样品中发现的KIAA1468-RET融合多核苷酸所编码的氨基酸序列。此外，序列编号4所示的氨基酸序列中，融合点位于540位的Glu和541位的Glu之间。

上述(ii)中的“1个或多个氨基酸”和上述(iii)中的“80％以上的序列同一性”的意思如上述“(1)EZR-ERBB4基因融合”中所述。

另外，本发明中的KIAA1468-RET融合多核苷酸例如可以为下述的任一种多核苷酸：

(i)由序列编号3所示的碱基序列构成的多核苷酸、

(iv)与由序列编号3所示的碱基序列构成的多核苷酸具有80％以上的序列同一性、并且编码具有激酶活性的多肽的多核苷酸。

序列编号3所示的碱基序列如后述的实施例所示，为在来自人类癌组织的样品中发现的KIAA1468-RET融合多核苷酸的碱基序列。序列编号3所示的碱基序列中，融合点位于1835位的鸟嘌呤和1836位的鸟嘌呤之间。

上述(ii)中的“严格条件下”、上述(iii)中的“1个或多个核苷酸”和上述(iv)中的“80％以上的序列同一性”的意思如上述“(1)EZR-ERBB4基因融合”中所述。

(3)TRIM24-BRAF基因融合

本基因融合是产生TRIM24蛋白和BRAF蛋白的融合蛋白(以下，也称为TRIM24-BRAF融合多肽)的表达的突变，是在人类染色体中由7q33和7q34的区域内具有切断点的倒位(inv7)产生的突变。

TRIM24蛋白在人类中为由存在于7q33的基因编码的蛋白质，典型而言，是由序列编号28所示的氨基酸序列(NCBI登录编号NP_003843.3(17-APR-2013)构成的蛋白质。TRIM24蛋白的特征在于具有环指结构域(RINGfingerdomain)(图1)，该结构域在人类中相当于序列编号28所示的氨基酸序列的56～82位的氨基酸序列。

BRAF蛋白在人类中为由存在于7q34的基因编码的蛋白质，典型而言，是由序列编号30所示的氨基酸序列(NCBI登录编号NP_004324.2(16-JUN-2013)构成的蛋白质。BRAF蛋白的特征在于具有激酶结构域(图1)，在人类中相当于序列编号30所示的氨基酸序列的457～717位的氨基酸序列。

另外，在BRAF蛋白中，在激酶结构域的N末端侧存在有作为激酶抑制结构域的Raf样Ras结合结构域(Raf-likeRas-bindingdomain)(序列编号22所示的氨基酸序列的155～227位)。

TRIM24-BRAF融合多肽是包括BRAF蛋白的激酶结构域并且具有激酶活性的多肽。

TRIM24-BRAF融合多肽中，可以包括TRIM24蛋白的环指结构域的全部或一部分，也可以不包括。

TRIM24-BRAF融合多肽中，可以包括BRAF蛋白的激酶结构域的全部，只要TRIM24-BRAF融合多肽具有激酶活性即可，也可以包括激酶结构域的一部分。

TRIM24-BRAF融合多肽“具有激酶活性”是指具有作为由来自BRAF蛋白的激酶结构域引起的将丝氨酸或苏氨酸磷酸化的酶的活性。TRIM24-BRAF融合多肽的激酶活性能够利用通常方法测定，通常，在适当的条件下使底物(合成肽底物等)和ATP一起进行孵育后，检测底物的磷酸化丝氨酸或苏氨酸。另外，也能够使用市售的测定试剂盒进行测定。

EZR-ERBB4融合多肽优选不包括Raf样Ras结合结构域(Raf-likeRas-bindingdomain)。

不希望受到任何理论的限制，据认为TRIM24-BRAF融合多肽通过去除存在于野生型BRAF蛋白的N末端侧的激酶抑制结构域而稳定活化，由此参与癌化。

本发明中，编码TRIM24-BRAF融合多肽的多核苷酸(以下，也称为TRIM24-BRAF融合多核苷酸)为编码包括BRAF蛋白的激酶结构域并且具有激酶活性的多肽的多核苷酸。TRIM24-BRAF融合多核苷酸可以是mRNA、cDNA和基因组DNA的任一种。

本发明中的TRIM24-BRAF融合多核苷酸例如可以为编码下述的多肽的TRIM24-BRAF融合多核苷酸：

(i)由序列编号6所示的氨基酸序列构成的多肽、

(iii)由与序列编号6所示的氨基酸序列具有80％以上的序列同一性的氨基酸序列构成的、并且具有激酶活性的多肽。

序列编号6所示的氨基酸序列如后述的实施例所示，为在来自人类癌组织的样品中发现的TRIM24-BRAF融合多核苷酸所编码的氨基酸序列。此外，序列编号6所示的氨基酸序列中，融合点位于294位的Arg。

另外，本发明中的TRIM24-BRAF融合多核苷酸例如可以为下述的任一种多核苷酸：

(i)由序列编号5所示的碱基序列构成的多核苷酸、

(iv)与由序列编号5所示的碱基序列构成的多核苷酸具有80％以上的序列同一性、并且编码具有激酶活性的多肽的多核苷酸。

序列编号5所示的碱基序列如后述的实施例所示，为在来自人类癌组织的样品中发现的TRIM24-BRAF融合多核苷酸的碱基序列。序列编号5所示的碱基序列中，融合点位于1096位的鸟嘌呤和1097位的鸟嘌呤之间。

上述(ii)中的“严格条件下”、上述(iii)中的“1个或多个核苷酸”和上述(iv)中的“80％以上的序列同一性”的的意思如上述“(1)EZR-ERBB4基因融合”中所述。

(4)CD74-NRG1基因融合

本基因融合是产生CD74蛋白和NRG1蛋白的融合蛋白(以下，也称为CD74-NRG1融合多肽)的表达的突变，是在人类染色体中由5q32和8p12的区域内具有切断点的转座(t(5；8))产生的突变。

CD74蛋白在人类中为由存在于5q32的基因编码的蛋白质，典型而言，是由序列编号32所示的氨基酸序列(NCBI登录编号NP_004346.1(29-APR-2013)构成的蛋白质。CD74蛋白的特征在于具有跨膜结构域(图1)，该结构域在人类中相当于序列编号32所示的氨基酸序列的47～72位的氨基酸序列。

NRG1蛋白在人类中为由存在于8p12的基因编码的蛋白质，典型而言，是由序列编号34所示的氨基酸序列(NCBI登录编号NP_001153477.1(07-JUL-2013))构成的蛋白质。NRG1蛋白的特征在于具有EGF结构域(图1)，在人类中相当于序列编号34所示的氨基酸序列的143～187位的氨基酸序列。

CD74-NRG1融合多肽是包括CD74蛋白的跨膜结构域和NRG1蛋白的EGF结构域并且具有增强细胞内信号转导的活性的多肽。

CD74-NRG1融合多肽中，可以包括CD74蛋白的跨膜结构域的全部，也可以包括一部分。

CD74-NRG1融合多肽中，可以包括NRG1蛋白的EGF结构域的全部，只要CD74-NRG1融合多肽具有增强细胞内信号转导的活性即可，也可以包括EGF结构域的一部分。

CD74-NRG1融合多肽“具有增强细胞内信号转导的活性”是指具有由来自NRG1蛋白的EGF结构域引起的增强细胞内信号转导的活性。该活性可以通过Wilson,T.R.etal.,CancerCell,2011,20,158-172中记载的以下方法测定。

在以除去血清的状态培养的EFM-19细胞(DSMZ,No.ACC-231)中添加被检测物质，处理30分钟之后，裂解EFM-19细胞，提取蛋白质。通过蛋白质免疫印迹分析，研究EGFR、ERBB2、ERBB3或ERBB4的磷酸化状态，当与不添加被检测物质时相比磷酸化上升时，确定为被检测物质具有增强细胞内信号转导的活性。其中，作为被检测物质，可以使用CD74-NRG1融合多肽整体，但考虑裂解性等，可以使用其缺失跨膜结构域并且包括EGF结构域的片段。

不希望受到任何理论的限制，据认为CD74-NRG1融合多核苷酸比野生型NRG1蛋白高表达，通过自分泌机制对细胞内信号转导的增强和生存有正向作用，由此参与癌化。

本发明中，编码CD74-NRG1融合多肽的多核苷酸(以下，也称为CD74-NRG1融合多核苷酸)是编码包括CD74蛋白的跨膜结构域和NRG1蛋白的EGF结构域并且具有增强细胞内信号转导的活性的多肽的多核苷酸。CD74-NRG1融合多核苷酸可以是mRNA、cDNA和基因组DNA的任一种。

本发明中的CD74-NRG1融合多核苷酸例如可以为编码下述的多肽的CD74-NRG1融合多核苷酸：

(i)由序列编号8或者10所示的氨基酸序列构成的多肽、

(iii)由与序列编号8或者10所示的氨基酸序列具有80％以上的序列同一性的氨基酸序列构成的、具有增强细胞内信号转导的活性的多肽。

序列编号8或者10所示的氨基酸序列如后述的实施例所示，为在来自人类癌组织的样品中发现的CD74-NRG1融合多核苷酸所编码的氨基酸序列。此外，序列编号8所示的氨基酸序列中，融合点位于230位的Ala。另外，序列编号10所示的氨基酸序列中，融合点位于209位的Ala。

另外，本发明中的CD74-NRG1融合多核苷酸例如可以为下述的任一种多核苷酸：

(i)由序列编号7或者9所示的碱基序列构成的多核苷酸、

(iv)与由序列编号7或者9所示的碱基序列构成的多核苷酸具有80％以上的序列同一性、并且编码具有增强细胞内信号转导的活性的多肽的多核苷酸。

序列编号7或者9所示的碱基序列如后述的实施例所示，为在来自人类癌组织的样品中发现的CD74-NRG1融合多核苷酸的碱基序列。序列编号7所示的碱基序列中，融合点位于875位的鸟嘌呤和876位的胞嘧啶之间。另外，序列编号9所示的碱基序列中，融合点位于812位的鸟嘌呤和813位的胞嘧啶之间。

(5)SLC3A2-NRG1基因融合

本基因融合是产生SLC3A2蛋白和NRG1蛋白的融合蛋白(以下，也称为SLC3A2-NRG1融合多肽)的表达的突变，是在人类染色体中由11q12.3和8p12的区域内具有切断点的转座(t(8；11))产生的突变。

SLC3A2蛋白在人类中为由存在于11q12.3的基因编码的蛋白质，典型而言，是由序列编号39所示的氨基酸序列(NCBI登录编号NP_001012680.1(27-APR-2014)构成的蛋白质。SLC3A2蛋白的特征在于具有跨膜结构域(图4)，该结构域在人类中相当于序列编号39所示的氨基酸序列的184～207位的氨基酸序列(http://www.hprd.org/sequence？hprd_id＝01148&isoform_id＝01148_3&isoform_name＝Isoform_2)或者184～206位的氨基酸序列(http://asia.ensembl.org/Homo_sapiens/Transcript/ProteinSummary？g＝ENSG00000168003；r＝11:62623583-62656332；t＝ENST00000377891#)。

NRG1蛋白如上述“(4)CD74-NRG1基因融合”中所述。

SLC3A2-NRG1融合多肽是包括SLC3A2蛋白的跨膜结构域和NRG1蛋白的EGF结构域并且具有增强细胞内信号转导的活性的多肽。

SLC3A2-NRG1融合多肽中，可以包括SLC3A2蛋白的跨膜结构域的全部，也可以包括一部分。

SLC3A2-NRG1融合多肽中，可以包括NRG1蛋白的EGF结构域的全部，只要SLC3A2-NRG1融合多肽具有增强细胞内信号转导的活性即可，也可以包括EGF结构域的一部分。

SLC3A2-NRG1融合多肽“具有增强细胞内信号转导的活性”是指具有由来自NRG1蛋白的EGF结构域引起的增强细胞内信号转导的活性。该活性可以通过Wilson,T.R.etal.,CancerCell,2011,20,158-172中记载的以下方法测定。

在以除去血清的状态培养的EFM-19细胞(DSMZ,No.ACC-231)中添加被检测物质，处理30分钟之后，裂解EFM-19细胞，提取蛋白质。通过蛋白质免疫印迹分析，研究EGFR、ERBB2、ERBB3或ERBB4的磷酸化状态，当与不添加被检测物质时相比磷酸化上升时，确定为被检测物质具有增强细胞内信号转导的活性。这里，作为被检测物质，可以使用CD74-NRG1融合多肽整体，但考虑裂解性等，可以使用其缺失跨膜结构域并且包括EGF结构域的片段。

不希望受到任何理论的限制，据认为SLC3A2-NRG1融合多核苷酸比野生型NRG1蛋白高表达，通过自分泌机制对细胞内信号转导的增强和生存有正向作用，由此参与癌化。

本发明中，编码SLC3A2-NRG1融合多肽的多核苷酸(以下，也称为SLC3A2-NRG1融合多核苷酸)是编码包括SLC3A2蛋白的跨膜结构域和NRG1蛋白的EGF结构域并且具有增强细胞内信号转导的活性的多肽的多核苷酸。SLC3A2-NRG1融合多核苷酸可以是mRNA、cDNA和基因组DNA的任一种。

本发明中的SLC3A2-NRG1融合多核苷酸例如可以为编码下述的多肽的SLC3A2-NRG1融合多核苷酸：

(i)由序列编号36所示的氨基酸序列构成的多肽、

序列编号36所示的氨基酸序列如后述的实施例所示，为在来自人类癌组织的样品中发现的SLC3A2-NRG1融合多核苷酸所编码的氨基酸序列。此外，序列编号36所示的氨基酸序列中，融合点位于302位的苏氨酸。

另外，本发明中的SLC3A2-NRG1融合多核苷酸例如可以为下述的任一种多核苷酸：

(i)由序列编号35所示的碱基序列构成的多核苷酸、

序列编号35所示的碱基序列如后述的实施例所示，为在来自人类癌组织的样品中发现的SLC3A2-NRG1融合多核苷酸的碱基序列。序列编号35所示的碱基序列中，融合点位于904位的腺嘌呤和905位的胞嘧啶之间。

＜作为癌的责任突变(驱动突变)的基因融合的检测方法＞

本发明提供上述4种的基因融合的检测方法(以下，也称为本发明的检测方法)。本发明的检测方法包括检测来自患有癌的被检测者的分离得到的试样中的上述任一种的融合多核苷酸或者由其编码的多肽的工序。

本发明的检测方法中，被检测者只要是哺乳动物即可，没有特别限定。作为哺乳动物，例如，能够列举小鼠、大鼠、仓鼠、花鼠、豚鼠等啮齿类；兔、猪、牛、山羊、马、绵羊、水貂、狗、猫、人类、猴子、食蟹猴、罗猴、狨猴、猩猩、黑猩猩等灵长类等，优选人类。

患有癌的被检测者不仅可以是罹患癌的被检测者，也可以是怀疑罹患癌的被检测者、或存在将来患癌的风险的被检测者。作为适用本发明的检测方法的对象的“癌”，只要是可以检测到上述4种的基因融合中的任一种的癌即可，没有特别限定，优选为肺癌，进一步优选为非小细胞肺癌，特别优选为肺腺癌。

来自被检测者的“分离的试样”不仅包括生物体试样(例如，细胞、组织、脏器、体液(血液、淋巴液等)、消化液、痰、肺胞-支气管清洗液、尿、便)，也包括从这些生物体试样得到的核酸提取物(基因组DNA提取物、mRNA提取物、由mRNA提取物制备的cDNA制备物或cRNA制备物等)、蛋白质提取物。基因组DNA、mRNA、cDNA或蛋白质，对于本领域技术人员来说，能够考虑上述试样的种类和状态等选择对其适用的公知的方法来制备。另外，上述试样可以施以福尔马林固定处理、醇固定处理、冻干处理或石蜡包埋处理。

另外，“分离的试样”优选来自存在或者怀疑存在上述癌的脏器，例如，可以列举来自小肠、脾脏、肾脏、肝脏、胃、肺、肾上腺、心脏、脑、胰脏、大动脉等的试样，更优选为来自肺。

本发明的检测方法中，融合多核苷酸或者由其编码的多肽的检测能够使用自身公知的方法来进行。

将来自基因组DNA的转录产物(mRNA或者由mRNA制备的cDNA)作为对象时，例如，能够利用RT-PCR法、测序、TaqMan探针法、RNA印迹法(NorthernBlotting)、点杂交法、cDNA微阵列解析等检测作为mRNA或cDNA的融合多核苷酸。

另外，将基因组DNA作为对象时，例如，能够利用原位杂交(ISH)、基因组PCR法、测序、TaqMan探针法、DNA印迹法(SouthernBlotting)、基因组微阵列解析等检测作为基因组DNA的融合多核苷酸。

这些方法能够分别单独利用，也可以组合利用。例如，由于上述4种的基因融合据认为通过表达融合多肽参与癌化，因此，在检测作为基因组DNA的融合多核苷酸时(例如利用原位杂交等)，也优选进一步确认转录产物或者蛋白质的生成(例如利用RT-PCR、免疫染色法等)。

利用杂交技术(例如，TaqMan探针法、RNA印迹法、DNA印迹法、点杂交法、微阵列解析、原位杂交(ISH)等)检测融合多核苷酸时，能够使用作为探针的多核苷酸，其设计为特异性识别上述融合多核苷酸。这里，“特异性识别融合多核苷酸”是指：在严格条件下，从包括来自从该融合多核苷酸的融合点至5’末端侧和3’末端侧的部分的野生型基因的、该融合多核苷酸以外的多核苷酸中，识别并认出该融合多核苷酸。

本发明的检测方法中，在治疗或诊断的过程中得到的生物体试样(生物体检测样品等)多用福尔马林固定，因此，作为检测对象的基因组DNA在福尔马林固定下也是稳定的，从检测灵敏度高的观点考虑，优选使用原位杂交。

在原位杂交中，对上述生物体试样能够通过使作为设计为特异性识别融合多核苷酸的探针的多核苷酸具有至少15个碱基的链长的下述(a)或者(b)所述的多核苷酸杂交，来检测编码融合多肽的基因组DNA(融合多核苷酸)。

(a)对于各融合基因，作为选自与5’侧融合的伙伴基因(EZR、KIAA1468、TRIM24、CD74或者SLC3A2基因)的碱基序列杂交的探针和与3’侧融合的伙伴基因(ERBB4、RET、BRAF或者NRG1基因)的碱基序列杂交的探针中的至少一个探针的多核苷酸

(b)对于各融合基因，作为与包括5’侧融合的伙伴基因和3’侧融合的伙伴基因的融合点的碱基序列杂交的探针的多核苷酸。

本发明中的的EZR基因只要是来自人类的即可，典型而言，是在以Genbank登录编号NC_000006.11规定的基因组的序列中从第159186773到159240456的DNA序列构成的基因。

另外，本发明中的KIAA1468基因只要是来自人类的即可，典型而言，是在以Genbank登录编号NC_000018.9规定的基因组的序列中第59854524～59974355的DNA序列构成的基因。

本发明中的TRIM24基因只要是来自人类的即可，典型而言，是在以Genbank登录编号NC_000007.13规定的基因组的序列中第138145079～138270333的DNA序列构成的基因。

另外，本发明中的CD74基因只要是来自人类的即可，典型而言，是在以Genbank登录编号NC_000005.9规定的基因组的序列中第149781200～149792499的DNA序列构成的基因。

另外，本发明中的SLC3A2基因只要是来自人类的即可，典型而言，是在以Genbank登录编号NC_000011.10规定的基因组的序列中第62856012～62888883的DNA序列构成的基因。

本发明中的ERBB4基因只要是来自人类的即可，典型而言，是在以Genbank登录编号NC_000002.11规定的基因组的序列中第212240442～213403352的DNA序列构成的基因。

另外，本发明中的RET基因只要是来自人类的即可，典型而言，是在以Genbank登录编号NC_000010.10规定的基因组的序列中第43572517～43625799的DNA序列构成的基因。

另外，本发明中的BRAF基因只要是来自人类的即可，典型而言，Genbank登录编号NC_000007.13规定的基因组的序列中第140433812至140624564的DNA序列构成的基因。

另外，本发明中的NRG1基因只要是来自人类的即可，典型而言，Genbank登录编号NC_000008.10规定的基因组的序列中第31496820～32622558的DNA序列构成的基因。

但是，基因的DNA序列由于其突变等在自然界中(即，非人工地)发生变化。因此，这样的天然的突变体也可以作为本发明的对象(以下同样)。

本发明的(a)所述的多核苷酸，只要是通过与作为该多核苷酸的靶标碱基序列的、5’侧融合的伙伴基因(EZR、KIAA1468、TRIM24、CD74或者SLC3A2基因)的碱基序列和/或3’侧融合的伙伴基因(ERBB4、RET、BRAF或者NRG1基因)的碱基序列杂交而能够检测编码上述生物体试样中的融合多肽的基因组DNA的存在的多核苷酸即可，优选为下述(a1)～(a3)中记载的多核苷酸：

(a1)与比5’侧融合的伙伴基因的切断点更靠5’侧的上游区域的碱基序列杂交的多核苷酸(以下，也称为“5’融合伙伴基因探针1”)和与比3’侧融合的伙伴基因的切断点更靠3’侧的下游区域的碱基序列杂交的多核苷酸(以下，也称为“3’融合伙伴基因探针1”)的组合；

(a2)与比5’侧融合的伙伴基因的切断点更靠5’侧的上游区域的碱基序列杂交的多核苷酸(以下，也称为“5’融合伙伴基因探针1”)和与比5’侧融合的伙伴基因的切断点更靠3’侧的下游区域的碱基序列杂交的多核苷酸(以下，也称为“5’融合伙伴基因探针2”)的组合；

(a3)与比3’侧融合的伙伴基因的切断点更靠5’侧的上游区域的碱基序列杂交的多核苷酸(以下，也称为“3’融合伙伴基因探针2”)和与比3’侧融合的伙伴基因的切断点更靠3’侧的下游区域的碱基序列杂交的多核苷酸(以下，也称为“3’融合伙伴基因探针1”)的组合。

上述(a1)～(a3)中，5’侧融合的伙伴基因为EZR基因时，在比该基因的切断点更靠5’侧的上游区域的碱基序列中，包括EZR蛋白的卷曲螺旋结构域的全部或者一部分的编码区域。

上述(a1)～(a3)中，3’侧融合的伙伴基因为ERBB4基因时，比该基因的切断点更靠3’侧的下游区域的碱基序列中，包括ERBB4的激酶结构域的全部或者一部分的编码区域。

上述(a1)～(a3)中，5’侧融合的伙伴基因为KIAA1468基因时，比该基因的切断点更靠5’侧的上游区域的碱基序列中，包括KIAA1468蛋白的卷曲螺旋结构域的全部或者一部分的编码区域。

上述(a1)～(a3)中，3’侧融合的伙伴基因为RET基因时，比该基因的切断点更靠3’侧的下游区域的碱基序列中，包括RET的激酶结构域的全部或者一部分的编码区域。

上述(a1)～(a3)中，5’侧融合的伙伴基因为TRIM24基因时，比该基因的切断点更靠5’侧的上游区域的碱基序列中，例如，可以包括TRIM24蛋白的环指结构域的全部或者一部分的编码区域。

上述(a1)～(a3)中，3’侧融合的伙伴基因为BRAF基因时，比该基因的切断点更靠3’侧的下游区域的碱基序列中，包括BRAF的激酶结构域的全部或者一部分的编码区域。另外，在比该基因的切断点更靠5’侧的上游区域的碱基序列中，包括BRAF的Raf样Ras结合结构域的编码区域。

上述(a1)～(a3)中，5’侧融合的伙伴基因为CD74基因时，比该基因的切断点更靠5’侧的上游区域的碱基序列中，包括CD74蛋白的跨膜结构域的编码区域。

上述(a1)～(a3)中，3’侧融合的伙伴基因为NRG1基因时，比该基因的切断点更靠3’侧的下游区域的碱基序列中，包括NRG1的EGF结构域的全部或者一部分的编码区域。

上述(a1)～(a3)中，5’侧融合的伙伴基因为SLC3A2基因时，比该基因的切断点更靠5’侧的上游区域的碱基序列中，包括SLC3A2蛋白的跨膜结构域的编码区域。

作为上述(a1)所述的多核苷酸，例如，可以列举以下的(a1-1)～(a1-4)的多核苷酸的组合：

(a1-1)与EZR的卷曲螺旋结构域的全部或者一部分的编码区域杂交的多核苷酸和与ERBB4的激酶结构域的全部或者一部分的编码区域杂交的多核苷酸的组合、

(a1-2)与KIAA1468的卷曲螺旋结构域的全部或者一部分的编码区域杂交的多核苷酸和与RET的激酶结构域的全部或者一部分的编码区域杂交的多核苷酸的组合、

(a1-3)与TRIM24的环指结构域的全部或者一部分的编码区域杂交的多核苷酸和与BRAF的激酶结构域的全部或者一部分的编码区域杂交的多核苷酸的组合、

(a1-4)与CD74的跨膜结构域的编码区域杂交的多核苷酸和与NRG1的EGF结构域的全部或者一部分的编码区域杂交的多核苷酸的组合、和

(a1-5)与SLC3A2的跨膜结构域的编码区域杂交的多核苷酸和与NRG1的EGF结构域的全部或者一部分的编码区域杂交的多核苷酸的组合。

本发明中，作为原位杂交中所使用的上述(a)所述的多核苷酸所杂交的区域(靶标碱基序列)，从对于靶标碱基序列的特异性和检测的灵敏度的观点考虑，优选为距5’侧融合的伙伴基因(EZR、KIAA1468、TRIM24、CD74或者SLC3A2基因)和3’侧融合的伙伴基因(ERBB4、RET、BRAF或者NRG1基因)的融合点1000000碱基以内的区域。

另外，本发明中，原位杂交中所使用的上述(b)所述的多核苷酸只要是通过与作为该多核苷酸的靶标碱基序列的、包括5’侧融合的伙伴基因和3’侧融合的伙伴基因的融合点的碱基序列杂交而能够检测编码上述生物体试样中的融合多肽的基因组DNA的存在即可，作为典型例，为与包括序列编号：1、3、5、7、9或35所述的碱基序列中的融合点的碱基序列杂交的多核苷酸。

另外，本发明中，原位杂交中所使用的上述(a)或者(b)所述的多核苷酸，从对于靶标碱基序列的特异性和检测的灵敏度的观点考虑，优选为能够覆盖上述靶标碱基序列整体的、包括多种多核苷酸的集合。此时，构成该集合的多核苷酸的长度至少为15个碱基，优选为100～1000个碱基。

原位杂交中所使用的上述(a)或者(b)所述的多核苷酸，为了检测，优选用荧光色素等标记。作为这样的荧光色素，例如，可以列举DEAC、FITC、R6G、TexRed、Cy5，但不限定于这些。另外，除了荧光色素以外，也可以利用放射性同位元素(例：¹²⁵I、¹³¹I、³H、¹⁴C、³³P、³²P等)、酶(例：β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、碱性磷酸酶、过氧化物酶、苹果酸脱氢酶等)、发光物质(例：鲁米诺、鲁米诺衍生物、萤光素、光泽精、3,3’-二氨基联苯(DAB)等)来标记上述多核苷酸。

原位杂交中，使用5’侧融合的伙伴基因探针1和3’侧融合的伙伴基因探针1时、使用5’侧融合的伙伴基因探针1和5’侧融合的伙伴基因2时、或者使用3’融合伙伴基因探针2和3’融合伙伴基因探针1时，优选这些探针以相互不同的色素标记。这样，使用以不同的色素标记的探针的组合进行原位杂交时，当观察到5’侧融合的伙伴基因探针1的标记所发出信号(例如，荧光)与3’侧融合的伙伴基因探针1的标记所发出的信号的重合时，能够判定为能够检测到编码融合多肽的基因组DNA。另一方面，当观察到5’侧融合的伙伴基因探针1的标记所发出的信号和5’侧融合的伙伴基因探针2的标记所发出的信号的分离、3’侧融合的伙伴基因探针2的标记所发出的信号和3’侧融合的伙伴基因探针1的标记所发出的信号的分离时，能够判定为检测到编码融合多肽的基因组DNA。

此外，多核苷酸的标记能够通过公知的方法进行。例如，能够通过切口平移法、随机引物法而在多核苷酸中插入通过荧光色素等标记的底物碱基，从而标记该多核苷酸。

原位杂交中，使上述(a)或者(b)所述的多核苷酸与上述生物体试样杂交时的条件根据该多核苷酸的长度等各要素而变动，作为高严格杂交的条件，例如，可以列举0.2×SSC、65℃这样的条件，作为低严格杂交的条件，例如，可以列举2.0×SSC、50℃这样的条件。此外，对于本领域技术人员而言，通过适当选择盐浓度(SSC的稀释率等)和温度以及例如表面活性剂(NP-40等)的浓度、甲酰胺的浓度、pH等各条件，能够实现与上述条件同样的严格杂交的条件。

作为使用上述(a)或者(b)所述的多核苷酸检测编码融合多肽的基因组DNA的方法，除了上述原位杂交以外，还可以列举DNA印迹法、RNA印迹法和点杂交。这些方法中，在转印有从上述生物体试样得到的核酸提取物的膜上使上述(a)或者(b)所述的多核苷酸杂交，由此检测上述融合基因。使用上述(a)的多核苷酸时，与5’侧融合的伙伴基因的碱基序列杂交的多核苷酸和与3’侧融合的伙伴基因的碱基序列杂交的多核苷酸识别在膜上展开的同一条带时，能够判定为能够识别编码融合多肽的基因组DNA。

作为使用上述(b)的多核苷酸检测编码融合多肽的基因组DNA的方法，还可以列举基因组微阵列解析、DNA微阵列解析。这些方法中，制作将上述(b)的多核苷酸固定于基板上的阵列，使上述生物体试样与该阵列上的多核苷酸接触，由此检测该基因组DNA。作为基板，只要是能够使寡核苷酸或者多核苷酸固相化即可，没有特别限定，例如，能够列举玻璃板、尼龙膜、微珠、硅片、毛细管等。

本发明的检测方法中，也优选利用PCR检测融合多核苷酸。

PCR中，能够使用作为一对引物的多核苷酸，其设计为能够以从上述生物体试样制备的DNA(基因组DNA、cDNA)、RNA为模板特异性扩增融合多核苷酸。这里，“能够特异性扩增融合多核苷酸”是指不扩增来自从该融合多核苷酸的融合点到5’末端侧和3’末端侧的部分的野生型基因，能够仅扩增该融合多核苷酸，可以扩增该融合多核苷酸的全部，也可以扩增包括融合点的该融合多核苷酸的一部分。

PCR等中所利用“作为一对引物的多核苷酸”，包括特异性扩增作为靶标的融合多核苷酸的正义引物(正向引物)和反义引物(反向引物)，正义引物由该融合多核苷酸的融合点至5’末端侧的碱基序列设计，反义引物由该融合多核苷酸的融合点至3’末端侧的碱基序列设计。另外，从利用PCR法检测的精度和灵敏度的观点考虑，这些引物通常设计为PCR产物为5kb以下。引物的设计能够通过公知的方法适当进行，例如，能够利用PrimerExpress(注册商标)软件(AppliedBiosystems)。这些多核苷酸的长度通常为15个碱基以上(优选为16、17、18、19或者20个碱基以上、更优选为21个碱基以上)、100个碱基以下(优选为90、80、70、60、50或者40碱基以下，更优选为30个碱基以下)。

作为“一对引物的多核苷酸”的优选例，可以列举对于EZR-ERBB4融合多核苷酸的、包括由序列编号11所示的碱基序列构成的多核苷酸和由序列编号12所示的碱基序列构成的多核苷酸的引物组；对于KIAA1468-RET融合多核苷酸的、包括由序列编号13所示的碱基序列构成的多核苷酸和由序列编号14所示的碱基序列构成的多核苷酸的引物组；对于TRIM24-BRAF融合多核苷酸的、包括由序列编号15所示的碱基序列构成的多核苷酸和由序列编号16所示的碱基序列构成的多核苷酸的引物组；对于CD74-NRG1融合多核苷酸的、包括由序列编号17所示的碱基序列构成的多核苷酸和由序列编号18所示的碱基序列构成的多核苷酸的引物组；以及对于SLC3A2-NRG1融合多核苷酸的、包括由序列编号37所示的碱基序列构成的多核苷酸和由序列编号18所示的碱基序列构成的多核苷酸的引物组(参照后述的表1)。

利用PCR检测融合多核苷酸时，以PCR产物为对象进行直接测序，确定包括融合点的碱基序列，由此，能够确认5’侧的基因部分与3’侧的基因部分在框内连接和/或含有融合多核苷酸中规定的结构域。测序能够通过公知的方法进行，根据操作说明书，使用测序仪(例如，ABI-PRISM310GeneticAnalyzer(AppliedBiosystemsInc.)等)能够简单地实施。

另外，利用PCR检测融合多核苷酸时，通过TaqMan探针法，能够确认5’侧的基因部分与3’侧的基因部分在框内连结和/或含有融合多核苷酸中规定的结构域。作为TaqMan探针法中使用的探针，例如，可以列举上述(a)或者(b)所述的多核苷酸。探针可以用报告色素(例如，FAM、FITC、VIC等)和淬灭基团(例如，TAMRA、Eclipse、DABCYL、MGB等)标记。

上述引物和探针可以是DNA也可以是RNA，或者也可以是DNA/RNA嵌合物，优选为DNA。另外，其一部分或全部中，也可以用PNA(polyamidenucleicacid，肽核酸)、LNA(注册商标，lockednucleicacid，BridgedNucleicAcid，交联化核酸)、ENA(注册商标，2'-O,4'-C-Ethylene-bridgednucleicacids)、GNA(Glycerolnucleicacid，甘油核酸)、TNA(Threosenucleicacid，苏糖核酸)等人工核酸代替核苷酸。另外，上述引物和探针可以为双链也可以为单链，优选为单链。

另外，上述引物和探针只要能够与靶标序列特异杂交即可，也可以包括1个或多个核苷酸的错配，相对于靶标序列的互补序列通常具有80％以上、优选具有90、91、92、93、94％以上、更优选具有95、96、97、98、99％以上的同一性，最优选具有100％的同一性。

上述引物和探针，例如，能够基于本说明书所述的碱基序列的信息使用DNA/RNA自动合成机根据常规方法合成。

本发明的检测方法中，可以通过全转录组测序(RNA测序)或者基因组测序检测融合多核苷酸。这些方法，例如，能够使用新一代的测序仪(例如，基因组分析仪IIx(Illumina公司)、HiSeq测序仪(HiSeq2000、Illumina公司)基因组测序仪FLXSystem(Roche公司)等)根据制造商的说明书来进行。RNA测序例如能够使用市售的试剂盒(例如，mRNA-Seq样品制备试剂盒(Illumina公司)等)，根据制造商的说明书从总RNA制备cDNA文库，将其供给使用新一代的测序仪的测序，由此来进行。

本发明的检测方法中，以融合多核苷酸的翻译产物(即，融合多核苷酸)为对象时，例如，能够利用免疫染色法、蛋白质免疫印迹法、RIA法、ELISA法、流式细胞法、免疫沉淀法、抗体阵列解析等检测该翻译产物。这些方法中，使用特异性识别融合多肽的抗体。这里“特异性识别融合多肽”是指不识别包括来自从该融合多肽的融合点到N末端侧和C末端侧的部分的野生型蛋白质的、该融合多肽以外的蛋白质，而仅识别该融合多肽。本发明的检测方法中所使用的“特异性识别融合多肽”的抗体可以为1个抗体，也可以为2个以上的抗体的组合。

作为“特异性识别融合多肽的抗体”，可以列举包括融合多肽的融合点的多肽的特异性抗体(以下，也称为“融合点特异性抗体”)。这里，“融合点特异性抗体”是指与包括上述融合点的多肽特异性结合，但是不与来自N末端侧和C末端侧的部分的野生型蛋白质结合的抗体。

另外，作为“特异性识别融合多肽的抗体”，可以列举与包括从融合多肽的融合点到N末端侧的区域的多肽结合的抗体和与包括从融合多肽的融合点到C末端侧的区域的多肽结合的抗体的组合。通过使用这2种抗体进行三明治ELISA、免疫染色法、免疫沉淀法、蛋白质免疫印迹法等，能够检测融合多肽。

本发明中，抗体包括多克隆抗体、单克隆抗体(mAb)等天然型抗体、使用基因重组技术制造的嵌合抗体、人源化抗体、单链抗体、和它们的结合性片段，但不限定于这些。结合性片段是指具有特异的结合活性的上述抗体的一部分区域，具体而言，例如，可以列举Fab、Fab’、F(ab')₂、Fv、和单链抗体等。抗体型(class)没有特别限定，可以为具有IgG、IgM、IgA、IgD或者IgE等的任一个同种型(isotype)的抗体，考虑精制的容易性等，更优选为IgG。

“特异性识别融合多肽的抗体”，对于本领域技术人员而言，能够选择适当公知的方法来制备。作为这样的公知的方法，可以例举将包括上述融合多肽的融合点的多肽、包括从上述融合多肽的融合点到N末端侧的区域的多肽、或者包括从上述融合多肽的融合点到C末端侧的区域的多肽对免疫动物接种，使该动物的免疫系统活化后，回收该动物的血清(多克隆抗体)的方法、杂交瘤法、重组DNA法、噬菌体展示法等单克隆抗体的制作方法。也可以利用市售的抗体。另外，如果使用结合有标记物质的抗体，能够通过检测该标记而直接检测靶标蛋白质。作为标记物质，能够与抗体结合且能够检测即可，没有特别限制，例如，可以列举过氧化物酶、β-D-半乳糖苷酶、微过氧化物酶、辣根过氧化物酶(HRP)、异硫氰酸荧光素(FITC)、异硫氰酸罗丹明(RITC)、碱性磷酸酶、生物素和放射性物质等。另外，除了使用结合有标记物质的抗体直接检测靶标蛋白质的方法以外，也能够利用使用结合有标记物质的二次抗体、蛋白G或者蛋白A等间接检测靶标蛋白质的方法。

＜作为癌的责任突变(驱动突变)的基因融合的检测用试剂盒＞

如上所述，能够使用上述引物、探针、或者抗体、或者这些的组合检测作为癌的责任突变的基因融合所产生的融合多核苷酸或者由其编码的多肽，由此能够检测该基因融合。因此，本发明提供包括下述任一种或者它们的组合的、作为癌的责任突变的基因融合的检测用试剂盒(以下，也称为本发明的试剂盒)：

本发明的试剂盒中，除了多核苷酸、抗体以外，能够适当组合包括多核苷酸、抗体中添加的标记的检测所必需的底物、阳性对照(例如，EZR-ERBB4融合多核苷酸、KIAA1468-RET融合多核苷酸、TRIM24-BRAF融合多核苷酸、CD74-NRG1融合多核苷酸或者SLC3A2-NRG1融合多核苷酸、EZR-ERBB4融合多肽、KIAA1468-RET融合多肽、TRIM24-BRAF融合多肽、CD74-NRG1融合多肽或者SLC3A2-NRG1融合多肽、或者保持这些的细胞等)、阴性对照、PCR用试剂、原位杂交等中所使用的对比染色用试剂(DAPI等)、抗体的检测中所必需的分子(例如，二次抗体、蛋白G、蛋白A)、试样的稀释、清洗中所使用的缓冲液等。本发明的试剂盒中也能够包括使用说明书。通过使用本发明的试剂盒，能够容易地实施上述本发明的检测方法。

本发明的检测方法和检测用试剂盒能够检测作为癌的责任突变新发现的基因融合，如后所述，在鉴定该基因融合的阳性例并应用个体化医疗上非常有用。

＜鉴定癌患者或者存在患癌风险的被检测者的方法＞

据认为上述5种的基因融合为癌的责任突变，分别通过ERBB4激酶活性的稳定活化、RET激酶活性的稳定活化、BRAF激酶活性的稳定活化、和NRG1的作为细胞增殖因子的功能的增强来参与癌的恶性化等。因此，在检测到这样的基因融合的癌患者中，利用抑制由因该基因融合产生的融合多核苷酸所编码的多肽的表达和/或活性的物质进行治疗，有效的可能性高。

因此，本发明提供一种鉴定癌患者或者存在患癌风险的被检测者的方法，其中，所述癌患者或者存在患癌风险的被检测者是抑制由作为癌的责任突变(驱动突变)的基因融合产生的融合多核苷酸所编码的多肽的表达和/或活性的物质能带来治疗效果的癌患者或者存在患癌风险的被检测者(以下，也称为本发明的鉴定方法)。

本发明的鉴定方法包括下述的工序：

本发明的鉴定方法中，“癌患者或者存在患癌风险的被检测者”为患有癌或者怀疑患有癌的某种哺乳动物，优选为人类。作为应用本发明的鉴定方法的对象的“癌”，只要是能够检测到上述5种的基因融合中的任一种的癌即可，没有特别限定，优选为肺癌，进一步优选为非小细胞肺癌，特别优选为肺腺癌。

本发明的鉴定方法中，“治疗效果”是指癌治疗的效果，只要是对患者有益的效果即可，没有特别限定，例如，可以列举肿瘤缩小效果、无恶化生存时间延长效果、生命延长效果等。

本发明的鉴定方法中，关于EZR-ERBB4基因融合，作为评价癌治疗的有效性的对象的“抑制由作为癌的责任突变(驱动突变)的基因融合产生的融合多核苷酸所编码的多肽的表达和/或活性的物质”(以下，也称为本发明的鉴定方法中的对象物质)，只要是直接或间接抑制EZR-ERBB4融合多肽的表达和/或其功能的物质即可，没有特别限定。

作为抑制EZR-ERBB4融合多肽的表达的物质，例如，可以列举抑制EZR-ERBB4融合多肽的表达的siRNA(smallinterferingRNA)、shRNA(shorthairpinRNA)、miRNA(microRNA)、反义核酸、可以表达这些多核苷酸的表达载体、低分子化合物等。

作为抑制EZR-ERBB4融合多肽的功能的物质，例如，可以列举抑制ERBB4激酶活性的物质(例如，低分子化合物等)、与EZR-ERBB4融合多肽结合的抗体等。

这些物质可以是特异性抑制EZR-ERBB4融合多肽的表达和/或活性的物质，也可以是也抑制野生型ERBB4蛋白的表达和/或活性的物质。作为这样的物质的具体例，可以列举阿法替尼(afatinib)、达克替尼(dacomitinib)等。

这些物质能够基于本说明书中所公开的EZR-ERBB4融合多核苷酸和/或EZR-ERBB4融合多肽的序列信息等利用自身公知的方法来制备。另外，也可以利用市售的物质。

在来自患有癌的被检测者的分离试样中检测到EZR-ERBB4融合多核苷酸或者由其编码的多肽时，这些物质对该被检测者而言作为癌治疗剂是有效的。

关于KIAA1468-RET基因融合，作为本发明的鉴定方法中的对象物质，只要是直接或者间接抑制KIAA1468-RET融合多肽的表达和/或其功能的物质即可，没有特别限定。

作为抑制KIAA1468-RET融合多肽的表达的物质，例如，可以列举抑制KIAA1468-RET融合多肽的表达的siRNA(smallinterferingRNA)、shRNA(shorthairpinRNA)、miRNA(microRNA)、反义核酸、可以表达这些多核苷酸的表达载体、低分子化合物等。

作为抑制KIAA1468-RET融合多肽的功能的物质，例如，可以列举抑制RET激酶活性的物质(例如，低分子化合物等)、与KIAA1468-RET融合多肽结合的抗体等。

这些物质可以是特异性抑制KIAA1468-RET融合多肽的表达和/或活性的物质，也可以是也抑制野生型RET蛋白的表达和/或活性的物质。作为这样的物质的具体例，可以列举凡德他尼(vandetanib)、卡博替尼(cabozantinib)、索拉非尼(sorafenib)、舒尼替尼(sunitinib)、乐伐替尼(lenvatinib)、帕纳替尼(ponatinib)等。

这些物质能够基于本说明书中所公开的KIAA1468-RET融合多核苷酸和/或KIAA1468-RET融合多肽的序列信息等利用自身公知的方法来制备。另外，也可以利用市售的物质。

在来自患有癌的被检测者的分离试样中检测到KIAA1468-RET融合多核苷酸或者由其编码的多肽时，这些物质对该被检测者而言作为癌治疗剂是有效的。

关于TRIM24-BRAF基因融合，作为本发明的鉴定方法中的对象物质，只要是直接或者间接抑制TRIM24-BRAF融合多肽的表达和/或其功能的物质即可，没有特别限定。

作为抑制TRIM24-BRAF融合多肽的表达的物质，例如，可以列举抑制TRIM24-BRAF融合多肽的表达的siRNA(smallinterferingRNA)、shRNA(shorthairpinRNA)、miRNA(microRNA)、反义核酸、可以表达这些多核苷酸的表达载体、低分子化合物等。

作为抑制TRIM24-BRAF融合多肽的功能的物质，例如，可以列举抑制BRAF激酶活性的物质(例如，低分子化合物等)、与TRIM24-BRAF融合多肽结合的抗体等。

这些物质可以是特异性抑制TRIM24-BRAF融合多肽的表达和/或活性的物质，也可以是也抑制野生型BRAF蛋白的表达和/或活性的物质。作为这样的物质的具体例，可以列举维罗非尼(vemurafenib)、达拉非尼(dabrafenib)等。

这些物质能够基于本说明书中所公开的TRIM24-BRAF融合多核苷酸和/或TRIM24-BRAF融合多肽的序列信息等利用自身公知的方法来制备。另外，也可以利用市售的物质。

在来自患有癌的被检测者的分离试样中检测到TRIM24-BRAF融合多核苷酸或者由其编码的多肽时，这些物质对该被检测者而言作为癌治疗剂是有效的。

CD74-NRG1基因融合，作为本发明的鉴定方法中的对象物质，只要是直接或者间接抑制CD74-NRG1融合多肽的表达和/或其功能的物质即可，没有特别限定。

作为抑制CD74-NRG1融合多肽的表达的物质，例如，可以列举抑制CD74-NRG1融合多肽的表达的siRNA(smallinterferingRNA)、shRNA(shorthairpinRNA)、miRNA(microRNA)、反义核酸、可以表达这些多核苷酸的表达载体、低分子化合物等。

作为抑制CD74-NRG1融合多肽的功能的物质，例如，可以列举抑制使NRG1的细胞内信号转导的活性的物质(例如，低分子化合物等)、与CD74-NRG1融合多肽结合的抗体等。

这些物质可以是特异性抑制CD74-NRG1融合多肽的表达和/或活性的物质，也可以是也抑制野生型NRG1蛋白的表达和/或活性的物质。作为这样的物质的具体例，可以列举参与NRG1蛋白的切断的BACE蛋白的抑制剂MK-8931、E2609等。

这些物质能够基于本说明书中所公开的CD74-NRG1融合多核苷酸和/或CD74-NRG1融合多肽的序列信息等利用自身公知的方法来制备。另外，也可以利用市售的物质。

另外，据认为野生型NRG1蛋白通过作为其受体的属于HER蛋白群的蛋白质而增强细胞内信号转导，因此，作为本发明的鉴定方法中的对象物质，也可以列举直接或间接抑制HER蛋白的表达和/或其功能的物质。其中，HER蛋白群是酪氨酸激酶型受体的一组，包括HER1(ErbB1)、HER2(ErbB2)、HER3(ErbB3)、和HER4(ErbB4)这4种蛋白质。

作为抑制HER蛋白的表达的物质，例如，可以列举抑制HER蛋白的表达的siRNA(smallinterferingRNA)、shRNA(shorthairpinRNA)、miRNA(microRNA)、反义核酸、可以表达这些多核苷酸的表达载体、低分子化合物等。

作为抑制HER蛋白的功能的物质，例如，可以列举抑制HER蛋白的激酶活性的物质(例如，低分子化合物等)、与HER蛋白结合的抗体等。作为这样的物质的具体例，可以列举阿帕替尼(rapatinib)、阿法替尼(afatinib)、达克替尼(dacomitinib)、曲妥单抗(trastuzumab)等。

这些物质能够基于公知的序列信息等利用自身公知的方法来制备。另外，也可以利用市售的物质。

在来自患有癌的被检测者的分离试样中检测到CD74-NRG1融合多核苷酸或者由其编码的多肽时，这些物质对该被检测者而言作为癌治疗剂是有效的。

关于SLC3A2-NRG1基因融合，作为本发明的鉴定方法中的对象物质，只要是直接或者间接抑制SLC3A2-NRG1融合多肽的表达和/或其功能的物质即可，没有特别限定。

作为抑制SLC3A2-NRG1融合多肽的表达的物质，例如，可以列举抑制SLC3A2-NRG1融合多肽的表达的siRNA(smallinterferingRNA)、shRNA(shorthairpinRNA)、miRNA(microRNA)、反义核酸、可以表达这些多核苷酸的表达载体、低分子化合物等。

作为抑制SLC3A2-NRG1融合多肽的功能的物质，例如，可以列举抑制NRG1的增强细胞内信号转导的活性的物质(例如，低分子化合物等)、与SLC3A2-NRG1融合多肽结合的抗体等。

这些物质可以是特异性抑制SLC3A2-NRG1融合多肽的表达和/或活性的物质，也可以是也抑制野生型NRG1蛋白的表达和/或活性的物质。作为这样的物质的具体例，可以列举参与NRG1蛋白的切断的BACE蛋白的抑制剂MK-8931、E2609等。

这些物质能够基于本说明书中所公开的SLC3A2-NRG1融合多核苷酸和/或SLC3A2-NRG1融合多肽的序列信息等利用自身公知的方法来制备。另外，也可以利用市售的物质。

另外，据认为野生型NRG1蛋白通过作为其受体的属于HER蛋白群的蛋白质增强细胞内信号转导，因此，作为本发明的鉴定方法中的对象物质，也可以列举直接或间接抑制HER蛋白的表达和/或其功能的物质。作为这些物质的例子，可以列举上述关于CD74-NRG1基因融合所列举的物质。

在来自患有癌的被检测者的分离试样中检测到SLC3A2-NRG1融合多核苷酸或者由其编码的多肽时，这些物质对该被检测者而言作为癌治疗剂是有效的。

本发明的鉴定方法中的工序(1)能够与上述本发明的检测方法中所包括的工序同样地实施。

本发明的鉴定方法中的工序(2)中，在以工序(1)在来自患有癌的被检测者(即，癌患者或者存在患癌风险的被检测者)的分离试样中检测到融合多核苷酸或者由其编码的多肽时，判定为本发明的鉴定方法中的对象物质对上述被检测者能带来治疗效果，另一方面，在没有检测到融合多核苷酸或者由其编码的多肽时，判定为本发明的鉴定方法中的对象物质对上述被检测者带来治疗效果的可能性低。

根据本发明的鉴定方法，从癌患者或者存在患癌风险的被检测者中检测到作为癌的责任突变的新发现的基因融合的阳性例，能够鉴定出抑制由因该基因融合产生的融合多核苷酸所编码的多肽的表达和/或活性的物质能带来治疗效果的癌患者或者存在患癌风险的被检测者，本发明在能够进行适于这样的对象的治疗这一点上是有用的。

＜癌的治疗方法和癌治疗剂＞

如上所述，通过本发明的鉴定方法，鉴定抑制由因上述5种的基因融合的任一种产生的融合多核苷酸所编码的多肽的表达和/或活性的物质能带来治疗效果的癌患者。因此，通过对癌患者中保持该融合基因的患者选择性投与该物质，能够高效地进行癌的治疗。因此，本发明提供一种癌的治疗方法，包括对通过上述本发明的鉴定方法判定为该物质能带来治疗效果的被检测者投与该物质的工序(以下，也称为本发明的治疗方法)。

另外，由于本发明的治疗方法中投与的物质作为癌治疗剂发挥作用，本发明还提供以抑制由因上述5种的基因融合的任一种产生的融合多核苷酸所编码的多肽的表达和/或活性的物质作为有效成分的癌治疗剂(以下，也称为本发明的癌治疗剂)。

作为本发明的癌治疗剂，可以列举上述关于本发明的鉴定方法中，作为抑制由因上述5种的基因融合的任一种产生的融合多核苷酸所编码的多肽的表达和/或活性的物质而记载的物质。

本发明的癌治疗剂能够使用这些在制剂化中通常使用的药理学上能接受的载体、赋型剂和/或其它的添加剂，作为医药组合物制备。

本发明的癌治疗剂的给药方法可以根据该抑制剂的种类和癌的种类等适当选择，例如，能够采用口服、静脉内、腹腔内、经皮、肌肉内、气管内(气溶胶)、直肠内、阴道内等的给药方式。

本发明的癌治疗剂的给药量能够考虑有效成分的活性和种类、给药方式(例如口服、非口服)、患病的严重程度、作为给药对象的动物种类、给药对象的药物感受性、体重、年龄等适当决定。

本发明的治疗方法和癌治疗剂使具有以往未知的由本申请发明发现的特定的癌的责任突变的患者的治疗成为可能，因此是有用的。

＜癌治疗剂的筛选方法＞

本发明提供对具有上述4种基因融合的任一种的癌患者能够带来治疗效果的癌治疗剂的筛选方法(以下，也称为本发明的筛选方法)。根据本发明的筛选方法，能够将抑制上述5种的融合多肽(即、EZR-ERBB4融合多肽、KIAA1468-RET融合多肽、TRIM24-BRAF融合多肽、CD74-NRG1融合多肽和SLC3A2-NRG1融合多肽)中任一种的表达和/或活性的物质作为癌治疗剂。

提供给本发明的筛选方法的被检测物质可以是任何化合物或组合物，例如，可以列举核酸(例如，核苷、寡核苷酸、多核苷酸)、糖质(例如，单糖、二糖、寡糖、多糖)、脂质(例如，饱和或不饱和的包括直链、支链和/或环的脂肪酸)、氨基酸、蛋白质(例如，寡肽、多肽)、低分子化合物、化合物文库、无规肽文库、天然成分(例如，来自微生物、动植物、海洋生物等的成分)、或者食品等。

本发明的筛选方法只要能够评价被检测物质是否抑制上述4种融合多肽中任一种的表达和/或活性即可，可以是任意形态。典型而言，本发明的筛选方法包括下述的工序：

(1)使被检测物质与表达EZR-ERBB4融合多肽、KIAA1468-RET融合多肽、TRIM24-BRAF融合多肽、CD74-NRG1融合多肽或者SLC3A2-NRG1融合多肽的细胞接触的工序；

(2)确定是否抑制上述融合多肽的表达和/或活性的工序；以及

(3)将确定为抑制上述融合多肽的表达和/或活性的物质选择作为癌治疗剂的工序。

工序(1)中，使表达上述5种融合多肽中的任一种的细胞与被检测物质接触。作为对照，能够使用不含被检测物质的溶剂(例如，DMSO等)。该接触能够在培养基中进行。培养基根据所使用的细胞的种类等适当选择，例如，为含有约5～20％的胎牛血清的最低必需培养基(MEM)、Dulbecco改良最低必需培养基(DMEM)、RPMI1640培养基、199培养基等。另外，培养条件也可以根据所使用的细胞的种类等适当选择，例如，培养基的pH为约6～约8，培养温度为约30～约40℃，培养时间为约12～约72小时。

作为表达上述5种融合多肽中任一种的细胞，例如，可以列举内在表达该融合多肽的来自癌组织的细胞、从该细胞诱导的细胞株、通过基因工程制作的细胞株等，但不限定于这些。某个细胞是否表达上述5种融合多肽中任一种，能够利用上述本发明的检测方法来确认。另外，细胞通常为哺乳动物的细胞，优选为人类的细胞。

工序(2)中，确定是否抑制上述融合多肽的表达和/或活性。融合多肽的表达能够通过用公知的分析方法、例如，RNA印迹法、定量PCR法、免疫印迹法、ELISA法等来确定细胞中的mRNA水平或者蛋白质水平来测定。另外，融合多肽的活性也能够通过公知的分析方法(例如，激酶活性测定等)来测定。将所得到的测定值与不接触被检测物质的对照细胞中的测定值进行比较。测定值比较优选基于有无显著差异来进行。与被检测物质接触的细胞中的测定值与对照相比显著降低时，能够确定为该被检测物质抑制融合多肽的表达和/或活性。

或者，表达这些融合多肽的细胞的增殖亢进，因此，能够将该细胞的增殖作为本工序中用于确定的指标。此时，首先，测定与被检测物质接触的该细胞的增殖。细胞增殖的测定能够通过细胞计数、³H胸腺嘧啶脱氧核苷的摄入、BRDU法等自身公知的方法来进行。接着，将与被检测物质接触的该细胞的增殖与不接触被检测物质的对照细胞的增殖进行比较。增殖水平的比较优选基于有无显著差异来进行。不接触被检测物质的对照细胞的增殖相对于与被检测物质接触的细胞的增殖的测定，可以为事先测定的值，也可以为同时测定的值，从实验的精度、再现性的观点考虑，优选为同时测定的值。比较的结果为与被检测物质接触的该细胞的增殖得到抑制时，能够确定该被检测物质抑制融合多肽的表达和/或活性。

工序(3)中，将工序(2)中确定为抑制融合多肽的表达和/或活性的被检测物质选择作为癌治疗剂。

如上所述，根据本发明的筛选方法，能够得到能够适用于具有以往未知的癌的责任突变的患者的治疗的癌治疗剂。

＜分离的融合多肽或其片段、以及编码它们的多核苷酸＞

本发明提供以下的分离的融合多肽(以下，也称为本发明的融合多肽)或其片段：

(1)包括EZR蛋白的卷曲螺旋结构域的全部或者一部分和ERBB4蛋白的激酶结构域并且具有激酶活性的、分离的EZR-ERBB4融合多肽、

(2)包括KIAA1468蛋白的卷曲螺旋结构域的全部或者一部分和RET蛋白的激酶结构域并且具有激酶活性的、分离的KIAA1468-RET融合多肽、

(3)包括BRAF蛋白的激酶结构域并且具有激酶活性的、分离的TRIM24-BRAF融合多肽、

(4)包括CD74蛋白的跨膜结构域和NRG1蛋白的EGF结构域并且具有增强细胞内信号转导的活性的、分离的CD74-NRG1融合多肽、以及

(5)包括SLC3A2蛋白的跨膜结构域和NRG1蛋白的EGF结构域并且具有增强细胞内信号转导的活性的、分离的SLC3A2-NRG1融合多肽。

本说明书中，“分离的”物质是指某种物质从天然存在的环境(例如，生物体的细胞内)的其它物质(优选为生物学因子)(例如，在核酸的情况下，为核酸以外的因子和包括目标核酸以外的核酸序列的核酸；在蛋白质的情况下，为蛋白质以外的因子和包括目标蛋白质以外的氨基酸序列的蛋白质等)中实质分离或者精制得到的物质。本说明书中，“分离”是指具有优选为75重量％以上、更优选为85重量％以上、更进一步优选为95重量％以上、最优选为96重量％以上、97重量％以上、98重量％以上、99重量％以上、或100％的纯度。在“分离的”多核苷酸和多肽中，包括通过标准的精制方法精制得到的多核苷酸和多肽，另外也包括化学合成得到的多核苷酸和多肽。

上述(1)～(5)中的其它的各词语的含义如上述＜具体的癌的责任突变＞中所记载的各词语的含义。

“片段”是指本发明的融合多肽的片段，由包括融合点的上游和下游的序列的连续的部分序列构成。该部分序列中所包括的融合点的上游的序列包括距融合点1个氨基酸残基以上(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100个氨基酸残基以上)，也可以包括直至本发明的融合多肽的N末端。该部分序列中所包括的融合点的下游的序列包括距融合点1个氨基酸残基以上(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100个氨基酸残基以上)，也可以包括直至本发明的融合多肽的C末端。片段的长度没有特别限定，通常为8个氨基酸残基以上(例如，9、10、11、12、13、14、15、20、25、50、100个氨基酸残基以上)。

另外，本发明的融合多肽例如可以为下述的分离的融合多肽。

(1)关于EZR-ERBB4融合多肽：

(i)由序列编号2所示的氨基酸序列构成的多肽、

(2)关于KIAA1468-RET融合多肽：

(i)由序列编号4所示的氨基酸序列构成的多肽、

(3)关于TRIM24-BRAF融合多肽：

(i)由序列编号6所示的氨基酸序列构成的多肽、

(4)关于CD74-NRG1融合多肽：

(i)由序列编号8或者10所示的氨基酸序列构成的多肽、

(5)关于SLC3A2-NRG1融合多肽：

(i)由序列编号36所示的氨基酸序列构成的多肽、

上述(i)～(iii)中的各词语的含义与上述＜具体的癌的责任突变＞中所记载的各词语的含义相同。

另外，本发明提供编码上述本发明的融合多肽或其片段的分离的多核苷酸(以下，也称为本发明的多核苷酸)。本发明的多核苷酸可以是mRNA、cDNA和基因组DNA的任一种。另外，可以是双链也可以是单链。

编码EZR-ERBB4融合多肽的cDNA的典型例为由序列编号1所示的碱基序列构成的多核苷酸。

编码KIAA1468-RET融合多肽的cDNA的典型例为由序列编号3所示的碱基序列构成的多核苷酸。

编码TRIM24-BRAF融合多肽的cDNA的典型例为由序列编号5所示的碱基序列构成的多核苷酸。

编码CD74-NRG1融合多肽的cDNA的典型例为由序列编号7或者9所示的碱基序列构成的多核苷酸。

编码SLC3A2-NRG1融合多肽的cDNA的典型例为由序列编号35所示的碱基序列构成的多核苷酸。

本发明的多核苷酸能够通过自身公知的方法制得。例如，能够由从保持EZR-ERBB4融合多核苷酸、KIAA1468-RET融合多核苷酸、TRIM24-BRAF融合多核苷酸、CD74-NRG1融合多核苷酸或者SLC3A2-NRG1融合多核苷酸的癌组织等制备的cDNA文库或者基因组文库利用公知的杂交技术来提取。另外，也能够以从上述癌组织等制备的mRNA、cDNA或者基因组DNA为模板，利用公知的基因扩增技术(PCR)进行扩增来制备。另外，也能够以来自各融合多核苷酸的5’末端侧和3’末端侧的部分的野生型基因的cDNA为材料，利用PCR、限制性内切酶处理、定点突变诱导(site-directedmutagenesis)法(Kramer,W.&Fritz,HJ.,MethodsEnzymol,1987,154,350.)等公知的基因扩增技术、重组技术来制备。

本发明的融合多肽或其片段也能够通过自身公知的方法来制得。例如，将如上所述制得的多核苷酸插入适当的表达载体，将该载体导入无细胞蛋白质合成体系(例如，网织红细胞提取液、小麦胚芽提取液)进行孵育，或者将该载体导入适当的细胞(例如，大肠杆菌、酵母、昆虫细胞、动物细胞)，将由此得到的转化体进行培养，由此，能够制备本发明的融合多肽。

本发明的融合多肽或其片段能够作为本发明的检测方法等中的标记物使用，另外，也能够用于制作针对本发明的融合多肽的抗体等。

实施例

以下，基于实施例更具体地说明本发明，但是本发明不限定于以下的实施例。

＜样品＞

由从癌患者收集的肺组织制备总RNA。

总RNA从大致切分并冷冻的组织样品根据制造者的说明使用TRIzol试剂来提取，使用Model2100生物分析仪(model2100bioanalyzer，AgilentTechnologies公司制)进行质量鉴定。其结果，全部样品显示超过6的RIN(RNAintegritynumber)值。另外，使用QIAampDNAMinikit(注册商标，QIAGEN公司制)从组织样品提取基因组DNA。此外，该研究是得到了本研究相关组织的伦理审查委员会的承认而进行的。

＜RNA测序＞

用于RNA测序的cDNA文库根据制造者的标准操作说明使用mRNA-Seq样品制备试剂盒(Illumina公司制)进行制备。简单地进行说明，从2μg的总RNA中精制poly-A(+)RNA，使用片段化缓冲液在94℃加热5分钟，由此进行片段化之后，用于双链cDNA合成。将所得到的双链cDNA与PE接头DNA连接之后，用PCR进行扩增。将这样制得的文库供给使用基因组分析仪IIx测序仪(GAIIx，Illumina公司制)或HiSeq测序仪(HiSeq2000，Illumina公司制)的50-bp或75-bp的双末端测序。

＜融合转录产物的检测＞

融合转录产物的检测使用McPherson,A.etalPLoSComputBiol.2011May；7(5):e1001138中记载的deFuse程序来进行。具体而言，与使用剪切的基因序列和未剪切的基因序列所构成的参照序列以序列比对(Align)进Paired-endRead。接着，对于与参照序列不一致的比对序列(ambiguousdiscordantalignments)，假定可能的2个基因的基因融合，进行序列比对。接着，以在核苷酸水平支持基因融合的方式对2个基因检测SplitRead，考虑SplitRead和分别在2个基因定位的双Paired-endRead(SpanningRead)所得到的确切性、SpanningRead间的核苷酸长度的整合性，作为基因融合的候选。接着，根据该候选，提取有可能编码的氨基酸结构为作为蛋白激酶、激酶的带来细胞内信号转导通路活化的基因融合。

＜RT-PCR、基因组PCR、桑格测序＞

将总RNA(500ng)使用SuperScriptIII逆转录酶(注册商标，Invitrogen公司制)进行逆转录。将所得到的cDNA(相当于10ng的总RNA)或者10ng的基因组DNA供给使用KAPATaqDNA聚合酶(KAPABiosystem公司制)的PCR扩增。反应以如下条件在热循环仪内进行：以95℃30秒、60℃30秒、72℃2分钟进行40个循环，此后在72℃进行10分钟最终延长反应。另外，将编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的基因用于评价cDNA合成的效率的评价，进行扩增。另外，PCR产物使用BigDyeTerminatorkit和ABI3130xlDNA测序仪(AppliedBiosystem公司制)在两方向直接确定碱基序列。其中，本研究中所使用的引物示于表1。

[表1]

(实施例1)

本实施例记载关于肺癌组织中的新型融合转录产物的鉴定。

为了鉴定能够作为治疗靶标的新型融合转录产物，进行114例的肺腺癌和3例的非癌肺组织的全转录组测序(RNA测序，Meyerson,M.etal.,NatRevGenet,2010,11,685-696)。

分析RNA测序所得到的Paired-endRead，进行逆转录(RT)-PCR产物的桑格测序。其结果如表2和图1所示，鉴定了4个新型融合基因产物。

[表2]

EZR-ERBB4通过染色体转座t(2；6)产生，是存在于染色体6q25的EZR基因与存在于染色体2q34的ERBB4基因的融合基因。

KIAA1468-RET通过染色体转座t(10；18)产生，是存在于染色体18q21的KIAA1468基因与存在于染色体10q11的RET基因的融合基因。

TRIM24-BRAF通过染色体倒位inv7产生，是存在于染色体7q33的TRIM24基因与存在于染色体7q34的BRAF基因的融合基因。

CD74-NRG1通过染色体转座t(5；8)产生，是存在于染色体5q32的CD74基因与存在于染色体8p12的NRG1基因的融合基因。

这些之中，EZR-ERBB4、KIAA1468-RET和TRIM24-BRAF分别从1例的肺癌样品检测到。另一方面，CD74-NRG1从不同的2例的肺癌样品检测到切断点的不同的变异型(variant1和2)。

(实施例2)

本实施例记载关于实施例1中发现的基因融合的RT-PCR检测。

对于各融合基因，制作来自5’侧和3’侧基因部分的cDNA序列的PCR引物(分别为正向引物和反向引物)(表1)。使用这些引物，以由来自癌组织的RNA合成的cDNA为模板进行PCR扩增。

在图2表示PCR产物的电泳图。在一部分的试样中确认到特异性条带的扩增，进一步确定PCR产物的碱基序列，结果确认到融合基因的一部分被扩增。

根据以上的结果，根据RT-PCR有无得到特异性条带的扩增的检查和PCR产物的碱基序列确定，显示了能够检测到实施例1中发现的基因融合。

(实施例3)

本实施例显示实施例1中发现的基因融合为肺癌的责任突变的可能性高。

研究实施例1中发现新型基因融合的5例的肺癌中有无作为其它公知的癌的责任突变的EGFR点突变-框内缺失突变(EGFRpointmutation,EGFRin-flamedeletionmutation)、KRAS点突变(KRASpointmutation)、BRAF点突变(BRAFpointmutation)、HER2框内插入突变(HER2in-flameinsertionmutation)、EML4-ALK基因融合(EML4-ALKfusion)、KIF5B-RET基因融合(KIF5B-RETfusion)、CCDC6-RET基因融合(CCDC6-RETfusion)、CD74-ROS1基因融合(CD74-ROS1fusion)、EZR-ROS1基因融合(EZR-ROS1fusion)和SLC34A2-ROS1基因融合(SLC34A2-ROS1fusion)。

其结果，上述5例肺癌中的所有例关于其它公知的突变均为阴性，4种新型基因融合与其它公知的癌的责任突变为互斥的关系。

根据该结果，显示4种新型基因融合为癌的责任突变。

(实施例4)

本实施例和实施例5中，表示对实施例1中解析的114例中所包括的90例进一步进行解析的结果。

材料和方法

＜样品＞

90例的IMA从1998年至2013年在国立癌研究中心中央病院(东京，日本)接受了外科手术的具有原发性肺腺癌的连续患者中鉴定。组织学诊断基于关于LADC的最新的世界保健机构的分类和theInternationalAssociationfortheStudyofLungCancer/AmericanThoracicSociety/EuropeanRespiratorySociety(IASLC/ATS/ERS)的基准(TravisWD,etal.JThoracOncol.2011,6,244-85；TravisWD,Brambilla,E.,Muller-Hermelink,H.K.andHarris,C.C.,editor.WorldHealthOrganizationClassificationofTumors；PathologyandGenetics,TumoursofLung,Pleura,ThymusandHeart.Lyon:IARCPress；2004)进行。总RNA从大致切分并急速冷冻的(snap-frozen)组织样品使用TRIzol(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)提取。研究得到了参与机构的疗效审查委员会的承认。

＜RNA测序＞

RNA测序文库从1或者2μg的总RNA使用mRNA-SeqSamplePrepKit或者TruSeqRNASamplePrepKit(Illumina，SanDiego，CA，USA)制备。将所得到的文库供给利用GenomeAnalyzerIIx(GAIIx)或者HiSeq2000(Illumina)的50或者75bpRead的双末端测序。使用TopHat-Fusion算法(KimD,SalzbergSL.TopHat-Fusion:analgorithmfordiscoveryofnovelfusiontranscripts.GenomeBiol.2011,12,R72)，检测融合转录产物。

＜融合产物的致癌特性的试验＞

为了构建CD74-NRG1、EZR-ERBB4和TRIM24-BRAF融合蛋白的表达用的慢病毒载体，通过PCR从肿瘤的cDNA扩增全长cDNA，插入pLenti-6/V5-DEST质粒(Invitrogen)。通过桑格测序确认各插入cDNA的完整性。通过瞬时转染的细胞和病毒感染的细胞的蛋白质免疫印迹分析确认预测大小的融合产物的表达(图3)。

＜样品＞

IMA患者构成从1998年至2013年在国立癌研究中心中央病院(东京，日本)接受了外科手术的全部的LADC病例的大约2％。切除的组织用10％福尔马林固定，在石蜡中包埋。将4μm的连续切片使用阿欣蓝－过碘酸雪夫氏法用苏木精和伊红染色，使细胞质的粘蛋白产生可视化。总RNA从大致切分并急速冷冻(snap-frozen)组织样品使用TRIzol(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)提取，使用2100Bioanalyzer(AgilentTechnologies，SantaClara，CA，USA)研究其品质。全部样品均具有>6.0的RNA完整值(RNAIntegrityNumbers(RINs))。基因组DNA也从组织样品使用QIAampDNAMinikit(Qiagen，Valencia，CA，USA)提取。通过高分辨率熔解(HRM)法研究EGFR、KRAS、BRAF和HER2基因中的热点突变，通过RT-PCR研究EML4-或者KIF5B-ALK、KIF5B-或者CCDC6-RET、和CD74-、EZR-、或者SLC34A2-ROS1融合。详细的方法如前所述(KohnoT,etal.NatMed.2012,18,375-7；YoshidaA,etal.AmJSurgPathol.2013,37,554-62；KinnoT,etal.AnnOncol.2014,25,138-42)。

＜RT-PCR和桑格测序＞

将总RNA(500ng)使用SuperscriptIIIReverseTranscriptase(Invitrogen)逆转录为cDNA。将cDNA(相当于10ng的总RNA)或者10ng的基因组DNA供给使用KAPATaqDNAPolymerase(KAPABiosystems，Woburn，MA，USA)的PCR扩增。以如下条件在热循环仪内进行：以95℃30秒、60℃30秒、72℃2分钟进行40个循环，此后在72℃进行10分钟最终延长。扩增编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的基因，推定cDNA合成的效率。将PCR产物使用BigDyeTerminatorkit在ABI3130xlDNASequencer(AppliedBiosystems，FosterCity，CA，USA)上在两方向直接确定序列。这里所使用的引物如表1所示。

＜细胞株和试剂＞

NIH3T3细胞由冲绳科学技术大学院大学(冲绳，日本)的山本雅博士提供。NCI-H1299细胞由UTSouthwesternMedicalCenter的Dr.J.D.Minna提供。EFM19和293FT细胞分别从DSMZ(Braunschweig，Germany)和Invitrogen购入。H1299和EFM-19在含有10％FBS的RPMI培养基中培养，NIH3T3和293FT在含有10％FBS的DMEM培养基中培养。

拉帕替尼(Lapatinib)、阿法替尼(Afatinib)和索拉菲尼(Sorafenib)从Selleck(Houston，TX，USA)购入。U0126从Calbiochem(SanDiego，CA，USA)购入。

针对ERBB4的一次抗体(目录编号2218-1)和针对ERBB2的一次抗体(目录编号2064-1)从Epitomics(Burlingame，CA，USA)购入。针对BRAF的抗体(目录编号sc-166)和针对ERBB3的抗体(目录编号sc-285)从SantaCruzBiotechnology(Dallas，TX，USA)购入。针对NRG1的EGF样结构域(WilsonTR,etal.CancerCell.2011,20,158-72)的抗体(目录编号RB-276)从ThermoScientific(Fremont，CA，USA)购入。针对phospho-ERBB4pTyr1284的抗体(目录编号4757)、针对phospho-ERBB3pTyr1289的抗体(目录编号4791)、针对phospho-ERBB2pTyr1248的抗体(目录编号2247)、针对AKT的抗体(目录编号4691)、针对phospho-AKTpSer473的抗体(目录编号4060)、针对总ERK1/2的抗体(目录编号4695)、针对phospho-ERK1/2pThr202/Tyr204的抗体(目录编号4370)和针对β-actin的抗体(目录编号3700)从CellSignalingTechnology(Danvers，MA，USA)购入。

＜免疫组织化学＞

对组织微阵列切片实施免疫组织化学。将4μm厚的切片脱石蜡，对BRAF和NRG使用靶标活化溶液9(Dako，Carpinteria，CA，USA)，对ERBB4使用柠檬酸缓冲液，实施热诱导表位活化(heat-inducedepitoperetrieval)。将切片用3％过氧化氢处理20分钟，抑制内源性的过氧化物酶活性，此后，用去离子水清洗2～3分钟。接着将切片与针对BRAF的一次抗体(1:800，多克隆，Sigma，St.Louis，Mo，USA)、针对NRG1的一次抗体(1:500，多克隆，ThermoScientific)或者针对ERBB4的一次抗体(1:100，cloneE200；Abcam，Cambridge，UK)在室温孵育1小时。使用EnVision-FLEX和LINKER(Dako)系统检测免疫反应。用3,3'-二氨基联苯将反应可视化，此后，用苏木精进行对比染色。将肿瘤细胞细胞>10％的细胞质的染色记为BRAF和NRG1阳性，将膜染色记为ERBB4阳性。

＜荧光原位杂交＞

为了鉴定NRG1重排，使用NRG1用的break-apart探针(ChromosomeScienceLabo，札幌，日本；作为3'着丝粒侧探针，用SpectrumOrange标记，RP11-1002K11+RP11-35D16，并且，作为5'端粒侧探针，用SpectrumGreen标记，RP11-23A12+RP11-715M18)，对于用福尔马林固定、包埋于石蜡中的肿瘤，实施荧光原位杂交(FISH)。

＜CD74-NRG1、EZR-ERBB4和TRIM24-BRAF融合蛋白的表达用慢病毒载体的构建＞

使用KOD-PLUSTaq聚合酶(Toyobo，大阪，日本)，通过PCR扩增来自各Index肿瘤样品的cDNA，得到全长的CD74-NRG1、EZR-ERBB4和TRIM24-BRAFcDNA。将PCR产物用限制性内切酶消化，与pLenti-6/V5-DEST质粒(Invitrogen)连接。通过桑格测序确认各插入cDNA的完整性。使用ViraPowerpackagingmix(Invitrogen)和Lipofectamine2000试剂(Invitrogen)将各表达质粒转染到293FT细胞中，由此制作表达CD74-NRG1、EZR-ERBB4或者TRIM24-BRAF的慢病毒。

为了瞬时表达，使用Lipofectamine2000试剂，对80％融合的NCI-H1299肺癌细胞转染空质粒或者表达CD74-NRG1、TRIM24-BRAF或EZR-ERBB4cDNA的质粒。在补充的RPMI培养基中孵育24小时之后，在检测中使用细胞。

为了稳定表达，用空的慢病毒或者表达CD74-NRG1、EZR-ERBB4、或者TRIM24-BRAF的慢病毒感染60～70％融合的NIH3T3成纤维细胞，接着，用杀稻瘟菌素(4μg/ml)处理2周。在检测中使用大量培养的杀稻瘟菌素耐性细胞。

＜由CD74-NRG1引起的HER2:HER3信号转导活化＞

为了确定表达CD74-NRG1cDNA的细胞是否分泌活化HER2:HER3细胞内信号转导的NRG1配体，如前所述(WilsonTR,etal.CancerCell.2011,20,158-72)，将表达ERRB2/HER2和ERBB3/HER3蛋白两者的EFM-19乳腺癌细胞作为报告细胞使用。将用CD74-NRG1表达质粒或者空的(对照)质粒瞬时转染的NCI-H1299细胞用PBS清洗2次，在无血清培养基中孵育，由此进行血清饥饿过夜。回收培养基，在4℃离心5分钟，去除细胞碎片。将亚融合(subconfluent)的EMF-19细胞在补充了DMSO(空白对照)或者HER-TKI的条件培养基中孵育30分钟。接着，将全细胞裂解液供给SDS-PAGE和免疫印迹。

＜ERBB4和BRAF激酶的结构的活化和由酪氨酸激酶抑制剂得到的抑制＞

将用表达EZR-ERBB4或者TRIM24-BRAFcDNAs的质粒或者空的质粒稳定转染的NIH3T3细胞在无血清培养基中维持过夜，接着，用DMSO(Sigma)或者显示的抑制剂(溶解于DMSO)处理2小时。将全细胞裂解液供给免疫印迹解析。

＜免疫印迹＞

在含有CompleteProteaseandPhosSTOPPhosphataseInhibitorCocktail(Roche，Mannheim，Germany)的RIPA缓冲液中裂解细胞。将蛋白质供给SDS-PAGE，此后，在聚偏二氟乙烯膜上进行免疫印迹。将膜用含有0.1％Tween20和1.0％BSA的TBS封闭1小时，接着用一次抗体进行研究。用含有0.1％Tween20的TBS清洗后，将膜用辣根过氧化物酶结合抗小鼠或者抗兔二次抗体孵育，接着，用增强化学发光试剂(PerkinElmer，Waltham，MA，USA)可视化。使用LAS3000成像系统(QuansysBiosciences，WestLogan，UT，USA)算出信号强度。

＜软琼脂试验＞

将用空的慢病毒、或者CD74-NRG1、EZR-ERBB4或TRIM24-BRAF慢病毒感染的NIH3T3细胞在0.6％琼脂糖的基层上的0.3％SeaPlaque琼脂糖(Lonza，Rockland，ME，USA)的上层，在24孔板中以4,000细胞/孔三次接种。在顶层琼脂中添加含有DMSO或者酪氨酸激酶抑制剂的培养基，并且在0.3％琼脂糖层之上也添加。表层(cover)培养基每周更换2次。14天后，对直径大于100μm的集落进行计数。

＜裸鼠中的肿瘤形成能力试验＞

将具有空载体或者表达EZR-ERBB4或TRIM24-BRAF融合蛋白的载体的稳定的NIH3T3细胞(5×10⁶)在含有50％基质胶(BDBiosciences，Bedford，MA，USA)的PBS中再悬浮。将细胞皮下注入6周龄的雌的nu/nu小鼠的右侧腹部。每周测定2次肿瘤的大小，直至肿瘤的大小达到大致2cm×2cm。在第21天拍摄照片。关于小鼠的全部研究得到了国立癌研究中心关于动物试验的伦理委员会的承认。

结果和考察

准备包括具有KRAS突变的56例(62％)和不具有KRAS突变的34例(38％)的90例的浸润性粘液性腺癌(invasivemucinousadenocaricinoma(IMA))群组(cohort)。KRAS阴性的34例中包括2例的BRAF突变、1例的EGFR突变和1例EML4-ALK融合。剩余的30例中LADC中的代表性驱动突变为全阴性(pan-negative)。

将包括27例的全阴性例和5例的KRAS突变阳性例的32例的IMA供给RNA测序(表3)。分析通过RNA测序得到的>2×10⁷Paired-endRead，接着，通过RT-PCR产物的桑格测序进行确认的结果，发现除了上述4种新型基因融合转录产物(CD74-NRG1、EZR-ERBB4、TRIM24-BRAF和KIAA1468-RET)以外，还有一种新型基因融合转录产物(SLC3A2-NRG1)。这些仅在全阴性的IMA中检测到(图1、和4～6、以及表1和4)。

[表3]

[表4]

对不供给RNA测序的剩余的58例的IMA，进行这些基因融合的RT-PCR筛选，可知还有1例的全阴性例具有CD74-NRG1融合。即，CD74-NRG1融合在KRAS突变阴性IMA的34例中检测到5例(14.7％)，频度最高。NRG1与CD74或者SLC3A2的融合在34例中存在6例(17.6％)。5个新型基因融合互斥，且在KRAS突变阳性例中不存在(表5)。

[表5]

(实施例5)

CD74-NRG1、SLC3A2-NRG1、EZR-ERBB4和TRIM24-BRAF的4个新型融合基因是包括编码蛋白激酶或者受体蛋白激酶的配体(NRG1/神经调节蛋白/神经生长因子)的基因的重排，关于该基因，至今没有报道其在肺癌中是导致癌化的重排(图7)。剩余的融合基因是RET癌基因相关的新类型；RET的融合在LADC的1～2％中发现(DrilonA,etal.CancerDiscov.2013,3,630-5；TakeuchiK,etal.NatMed.2012,18,378-81；LipsonD,etal.NatMed.2012,18,382-4；KohnoT,etal.NatMed.2012,18,375-7；KohnoT,etal.CancerSci.2013,104,1396-400)。从日本人患者的不具有IMA的特征的315例的LADC和从美国人患者的144例的连续LADC的筛选中，全部肿瘤关于NRG1、BRAF和ERBB4融合、以及新型RET融合的全部为阴性。因此，这些融合可以认为是对具有IMA的特征的LADC特异性的驱动突变。CD74-NRG1、SLC3A2-NRG1、EZR-ERBB4和KIAA1468-RET的4个基因融合由染色体间转座引起的可能性高，TRIM24-BRAF基因融合由不夹着着丝粒的(paracentric：臂内)倒位引起的可能性高(表4和图7)。与其一致，通过CD74-NRG1融合阳性肿瘤的荧光原位杂交(FISH)解析，观察到融合阳性肿瘤中的与NRG1的转座部位相邻的2个探针所生成的信号的分离(图8)。另外，通过使用识别融合蛋白中保持的多肽的抗体的免疫组织化学解析，在具有NRG1、ERBB4和BRAF融合的肿瘤细胞中，也确认了对应的蛋白质的过量表达；NRG1、ERBB4和BRAF蛋白的表达也在几个融合阴性例中观察到(图9)。具有基因融合的IMA从男性患者和女性患者的双方都得到，NRG1融合阳性例从女性的非吸烟者优先得到(表4)。

CD74-NRG1和SLC3A2-NRG1融合蛋白(其序列从RNA测序数据推测)包括CD74或者SLC3A2的跨膜结构域并且保持有NRG1蛋白(NRG1III-β3型)的上皮增殖因子(EGF)样结构域(图1和4)。NRG1III-β3蛋白具有细胞质侧的N末端区域和插入膜的EGF样结构域，介导经由HER2:HER3受体所转导的近泌分泌信号(FallsDL.ExpCellRes.2003,284,14-30)。CD74或者SLC3A2的一部分取代野生型NRG1III-β3的跨膜结构域，因此，推测跨膜的EGF样结构域活化经由HER2:HER3受体转导的近泌分泌信号。另外，关于NRG1型III蛋白，如最近所提示的那样(FleckD,etal.JNeurosci.2013,33,7856-69；DislichBandLichtenthalerSF.FrontPhysiol.2012,3,8)，这些融合蛋白的表达通过在来自NRG1的部位(位于EGF结构域的N末端侧)中的切断，也有可能带来可溶性NRG1蛋白的产生。在来自表达外源性CD74-NRG1融合蛋白的H1299人类肺癌细胞的条件培养基中，加入EFM-19细胞，由此引起内源性ERBB2/HER2和ERBB3/HER3蛋白质的磷酸化，这暗示通过由CD74-NRG1多肽生成分泌的NRG1配体而使得自分泌HER2:HER3信号转导活化(图10A)。HER2:HER3的下游的中介物(mediator)ERK和AKT的磷酸化也增加。HER2、HER3和ERK的磷酸化被以HER激酶为靶标的、被FDA承认的TKI的拉帕替尼(Lapatinib)和阿法替尼(Afatinib)(MajemMandPallaresC.ClinTranslOncol.2013,15,343-57；PerezEAandSpanoJP.Cancer.2012,118,3014-25；NelsonV,etal.OncoTargetsTher.2013,6,135-43)所抑制。综上所述，这些观察结果表示，NRG1融合通过近泌分泌和/或自分泌的机制而活化HER2:HER3信号转导。

EZR-ERBB4融合蛋白包括在蛋白质二聚化中发挥作用的EZR卷曲螺旋结构域，并且也保持了全长的ERBB4激酶结构域(图1)。这些特征与EZR-ROS1融合(TakeuchiK,etal.NatMed.2012,18,378-81)的情况同样，EZR-ERBB4蛋白经由EZR的卷曲螺旋结构域形成同源二聚体，显示引起ERBB4的激酶功能的异常活化的可能性高。实际上，使EZR-ERBB4cDNA在NIH3T3成纤维细胞中外源表达时，位于ERBB4激酶部位的活化loop的酪氨酸1258通过无血清刺激而磷酸化，这表示与EZR的融合异常激活ERBB4激酶(图10B)。与其一致地，作为下游的中介物(mediator)的ERK的磷酸化也增加。ERBB4和ERK的磷酸化被抑制ERBB4蛋白的拉帕替尼(Lapatinib)和阿法替尼(Afatinib)(MajemMandPallaresC.ClinTranslOncol.2013,15,343-57；PerezEAandSpanoJP.Cancer.2012,118,3014-25；NelsonV,etal.OncoTargetsTher.2013,6,135-43)所抑制。

TRIM24-BRAF融合蛋白保持有BRAF激酶结构域，但是缺失了发挥BRAF激酶的负调控的N末端的RAS结合结构域。这些特征暗示与其它的癌中的ESRP1-BRAF和AGTRAP-BRAF融合的情况(PalanisamyN,etal.NatMed.2010,16,793-8)同样，该融合蛋白在结构上活化。使TRIM24-BRAFcDNA在NIH3T3细胞中外源性表达时，作为BRAF的下游的中介物(mediator)的ERK通过无血清刺激而磷酸化，这显示与TRIM24的融合使得BRAF激酶异常活化(图10C)。ERK的磷酸化由作为RAF激酶抑制剂通常认定的被FDA承认的药物索拉非尼(Sorafenib)(WilhelmSM,etal.MolCancerTher.2008,7,3129-40)和MEK抑制剂U0126所抑制(图10C)。

融合基因的cDNA的外源性表达诱导NIH3T3成纤维细胞的非贴壁依赖性的增殖，这显示该融合基因的转化活性(图10D－F)。该增殖通过抑制上述的由融合诱导的信号转导的活化的激酶抑制剂而被抑制。表达EZR-ERBB4或者TRIM24-BRAF融合的cDNANIH3T3细胞在裸鼠中形成肿瘤(图11)。因此，得出了这3个融合基因在IMA发病中作为驱动突变发挥功能的结论。筛选了200种通常使用的人类肺癌细胞株，但是这3个融合基因均为阴性(数据不显示)。

这里所示的结果暗示了NRG1、ERBB4和BRAF融合是参与肺中的IMA的发病的新型的驱动突变(图12)，存在成为现有的TKI的靶标的可能性。NRG1以前是作为在人类支气管上皮细胞的原代培养中杯状细胞形成的调控基因而鉴定的(KettleR,etal.AmJRespirCellMolBiol.2010,42,472-81)，因此应该特别关注NRG1融合；因此，由NRG1介导的信号转导通路有可能通过参与细胞转化和杯状细胞形态的获得双方而在IMA发病中发挥作用。除了与新药的开发相关的很少一部分的公知的异常(ALK融合和EGFR突变)以外，超过10％的IMA(11/90；12.2％)具有可被现有的激酶抑制剂所靶标的、与新药的开发相关的其它异常：这些异常以NRG1、ERBB4、BRAF或者RET相关的融合、或者BRAF突变为代表(表5和图12)。因此，这里所鉴定的基因融合在IMA的治疗中有望成为靶标，并且作为IMA的诊断中的标记物也是有用的。

产业上的可利用性

根据本发明，能够检测作为癌的责任突变的新发现的基因融合，能够鉴定抑制由因该基因融合产生的融合多核苷酸编码的多肽的表达和/或活性的物质能带来治疗效果的癌患者或者存在患癌风险的被检测者，进而能够进行适于这样的癌患者的治疗。

序列表自由文本

序列编号1：EZR-ERBB4融合多核苷酸

序列编号2：EZR-ERBB4融合多肽

序列编号3：KIAA1468-RET融合多核苷酸

序列编号4：KIAA1468-RET融合多肽

序列编号5：TRIM24-BRAF融合多核苷酸

序列编号6：TRIM24-BRAF融合多肽

序列编号7：CD74-NRG1融合多核苷酸(变异型1)

序列编号8：CD74-NRG1融合多肽(变异型1)

序列编号9：CD74-NRG1融合多核苷酸(变异型2)

序列编号10：CD74-NRG1融合多肽(变异型2)

序列编号11～18：引物序列

序列编号19：EZRcDNA

序列编号20：EZR多肽

序列编号21：ERBB4cDNA

序列编号22：ERBB4多肽

序列编号23：KIAA1468cDNA

序列编号24：KIAA1468多肽

序列编号25：RETcDNA

序列编号26：RET多肽

序列编号27：TRIM24cDNA

序列编号28：TRIM24多肽

序列编号29：BRAFcDNA

序列编号30：BRAF多肽

序列编号31：CD74cDNA

序列编号32：CD74多肽

序列编号33：NRG1cDNA

序列编号34：NRG1多肽

序列编号35：SLC3A2-NRG1融合多核苷酸

序列编号36：SLC3A2-NRG1融合多肽

序列编号37：引物序列

序列编号38：SLC3A2cDNA

序列编号39：SLC3A2多肽

Claims

1.一种作为癌的责任突变(驱动突变)的基因融合的检测方法，其特征在于，包括：

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，融合多核苷酸为下述(a)～(e)中的任一种：

(a)编码下述多肽的EZR-ERBB4融合多核苷酸：

(i)由序列编号2所示的氨基酸序列构成的多肽、

(b)编码下述多肽的KIAA1468-RET融合多核苷酸：

(i)由序列编号4所示的氨基酸序列构成的多肽、

(c)编码下述多肽的TRIM24-BRAF融合多核苷酸：

(i)由序列编号6所示的氨基酸序列构成的多肽、

(d)编码下述多肽的CD74-NRG1融合多核苷酸：

(i)由序列编号8或者10所示的氨基酸序列构成的多肽、

(e)编码下述多肽的SLC3A2-NRG1融合多核苷酸：

(i)由序列编号36所示的氨基酸序列构成的多肽、

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，融合多核苷酸为下述(a)～(e)中的任一种：

(a)

(i)由序列编号1所示的碱基序列构成的多核苷酸、

(b)

(i)由序列编号3所示的碱基序列构成的多核苷酸、

(c)

(i)由序列编号5所示的碱基序列构成的多核苷酸、

(d)

(i)由序列编号7或者9所示的碱基序列构成的多核苷酸、

(e)

(i)由序列编号35所示的碱基序列构成的多核苷酸、

4.如权利要求1～3中任一项所述的方法，其特征在于：

癌为肺癌。

5.一种鉴定癌患者或者存在患癌风险的被检测者的方法，所述癌患者或者存在患癌风险的被检测者是抑制由作为癌的责任突变(驱动突变)的基因融合产生的融合多核苷酸所编码的多肽的表达和/或活性的物质能带来治疗效果的癌患者或者存在患癌风险的被检测者，所述方法的特征在于，包括下述的工序：

6.一种作为癌的责任突变(驱动突变)的基因融合的检测用试剂盒，其特征在于，含有下述(A)～(C)中的任一种或者它们的组合：

7.包括EZR蛋白的卷曲螺旋结构域的全部或者一部分和ERBB4蛋白的激酶结构域并且具有激酶活性的、分离得到的EZR-ERBB4融合多肽或其片段。

8.包括KIAA1468蛋白的卷曲螺旋结构域的全部或者一部分和RET蛋白的激酶结构域并且具有激酶活性的、分离得到的KIAA1468-RET融合多肽或其片段。

9.包括BRAF蛋白的激酶结构域并且具有激酶活性的、分离得到的TRIM24-BRAF融合多肽或其片段。

10.包括CD74蛋白的跨膜结构域和NRG1蛋白的EGF结构域并且具有增强细胞内信号转导的活性的、分离得到的CD74-NRG1融合多肽或其片段。

11.包括SLC3A2蛋白的跨膜结构域和NRG1蛋白的EGF结构域并且具有增强细胞内信号转导的活性的、分离得到的SLC3A2-NRG1融合多肽或其片段。

12.编码权利要求7～11中任一项所述的融合多肽或其片段的多核苷酸。

13.一种癌的治疗方法，其特征在于，包括下述的工序：

对以权利要求5所述的方法判定为抑制由作为癌的责任突变(驱动突变)的基因融合产生的融合多核苷酸所编码的多肽的表达和/或活性的物质能带来治疗效果的被检测者，投与抑制由所述融合多核苷酸编码的多肽的表达和/或活性的物质。

14.一种癌治疗剂的筛选方法，其特征在于，包括下述的工序：

(1)使被检测物质与表达权利要求7～11中任一项所述的融合多肽的细胞接触的工序；

(2)确定是否抑制所述融合多肽的表达和/或活性的工序；以及