CN105765065A

CN105765065A - 急性成淋巴细胞性白血病的新型嵌合基因atf7ip-pdgfrb

Info

Publication number: CN105765065A
Application number: CN201480063918.9A
Authority: CN
Inventors: 清河信敬; 松本健治; 小林健郎; 小林健一郎; 市川仁
Original assignee: NATIONAL CANCER CENTER; National Center for Child Health and Development; LSIP LLC
Current assignee: National Center for Child Health and Development
Priority date: 2013-11-22
Filing date: 2014-11-17
Publication date: 2016-07-13
Also published as: EP3072964A1; JPWO2015076213A1; WO2015076213A1; US20160289663A1

Abstract

本发明提供鉴定在白血病等癌中可作为预测药剂的治疗有效性的指标的突变、检测该突变的方法，基于该突变，提供鉴定以具有该突变的基因或由其编码的蛋白质为标靶的药剂能带来治疗效果的癌患者或存在患癌风险的被检测者的方法等。一种作为癌的责任突变(驱动突变)的基因融合的检测方法，其包括：检测来自被检测者的分离得到的试样中的ATF7IP?PDGFRB融合多核苷酸或由其所编码的多肽的工序。

Description

急性成淋巴细胞性白血病的新型嵌合基因ATF7IP-PDGFRB

技术领域

本发明涉及作为癌的责任突变的基因融合的检测方法、鉴定抑制由该基因融合产生的融合多核苷酸所编码的多肽的表达和/或活性的物质能带来治疗效果的癌患者或存在患癌风险的被检测者的方法等。

背景技术

癌在日本是占据死亡原因的第一位的疾病。已知癌细胞通过遗传变化而恶化。期待确定癌的类型中特征性的遗传变化，不仅对致癌机制的阐明有贡献，而且对癌的诊断及预后预测、癌的治疗法的开发及选择等也有贡献。

嵌合基因(本说明书中，也称为融合基因)是通过编码本来完全作为独立分子起作用的蛋白质的2个基因伴随染色体转座等异常进行融合而形成的，其结果，产生具有异常的功能的融合蛋白。已知有嵌合基因成为白血病或其它癌的产生的原因，作为诊断中的指标和药物研发的标靶被利用。特别是近年来，对具有与参与癌化的信号传导通路的构成因子(例如激酶)关联的嵌合基因的癌，分子标靶疗法的成功例增加。例如显示，将ALK蛋白作为标靶的酪氨酸激酶抑制剂(例如克唑替尼(Crizotinib))对具有EML4-ALK融合基因的肺癌患者的治疗是有效的，将由BCR-ABL融合基因所编码的蛋白质作为标靶的酪氨酸激酶抑制剂(例如伊马替尼(Imatinib))对具有该融合基因的白血病患者的治疗是有效的等。

急性成淋巴细胞性白血病(ALL)为成淋巴细胞在幼小的阶段恶化而异常增加的癌的一种。ALL在从婴幼儿至成人的任何年龄层都会发生，在婴幼儿中作为最通常的癌所知。关于ALL，也作为遗传变化报道有许多嵌合基因。例如，在非专利文献1中记载有：为了确定具有IKZF1突变且为BCR-ABL1阴性、作为预后不良的ALL(Ph-likeALL)中的遗传变化，对被确定为Ph-like ALL的B祖细胞性ALL(B-ALL)的病例进行RNA测序及全基因组测序，确定了NUP214-ABL1、EBF1-PDGFRB、BCR-JAK2、STRN3-JAK2、PAX5-JAK2、ETV6-ABL1、RANBP2-ABL1和RCSD1-ABL1的框内(in-frame)融合。另外，EBF1-PDGFRB、BCR-JAK2和NUP214-ABL1也显示有可能成为利用酪氨酸激酶抑制剂的治疗中的标靶。

现有技术文献

非专利文献

非专利文献1：Roberts KG et al.,Cancer Cell,2012,22(2),153-66.

发明内容

发明所要解决的课题

包括ALL的白血病等癌中的突变的鉴定还不能说是充分的，现状是期望进一步鉴定可作为预测药剂的治疗有效性的指标的突变。

因此，本发明的目的在于，提供鉴定在包括ALL的白血病等癌中可作为预测药剂的治疗有效性的指标的突变、检测该突变的方法，基于该突变，提供鉴定以具有该突变的基因或由其编码的蛋白质为标靶的药剂能带来治疗效果的癌患者或存在患癌风险的被检测者的方法等。

用于解决课题的技术方案

本发明的发明人为了达到上述目的，反复进行了深入研究，其结果，作为在急性成淋巴细胞性白血病(ALL)中表达的新型融合基因，鉴定了ATF7IP-PDGFRB基因。关于PDGFRB基因，虽然在上述非专利文献1中报道有与EBF1基因的融合基因，但是，关于与ATF7IP基因的融合基因的存在，即使考虑包括该文献在内的任意现有技术文献，也完全在预料之外。

可以认为，ATF7IP-PDGFRB基因产生SETDB1结合蛋白(ATF7IP)与酪氨酸激酶(PDGFRB)的融合蛋白，将本来不存在的增殖刺激传递至细胞内，结果，成为ALL产生的原因。因此，对于该基因融合阳性癌，酪氨酸激酶的抑制药等能带来治疗效果的可能性高。实际确认了：对于ATF7IP-PDGFRB基因融合阳性的ALL患者，作为酪氨酸激酶抑制剂的达沙替尼(Dasatinib)是有效的。

本发明的发明人基于上述内容进一步反复研究，从而完成了本发明。

即，本发明如下所述。

[1]一种基因融合的检测方法，其包括：

检测来自被检测者的分离得到的试样中的包括ATF7IP的SETDB1结合结构域以及PDGFRB的跨膜结构域和激酶结构域并且具有激酶活性的ATF7IP-PDGFRB融合多肽、或编码其的融合多核苷酸的工序。

[2]如[1]所述的方法，其中，融合多肽为下述(i)～(iii)中的任一种：

(i)由序列号2或4所示的氨基酸序列构成的多肽，

(ii)由序列号2或4所示的氨基酸序列构成的多肽中缺失、取代或添加1个或多个氨基酸的氨基酸序列所构成的、并且具有激酶活性的多肽，或者

(iii)由与序列号2或4所示的氨基酸序列具有80％以上的序列同一性的氨基酸序列构成的、并且具有激酶活性的多肽。

[3]如[1]或[2]所述的方法，其中，融合多核苷酸为下述(i)～(iii)中的任一种：

(i)由序列号1或3所示的碱基序列构成的多核苷酸，

(ii)与由与序列号1或3所示的碱基序列构成的多核苷酸互补的碱基序列构成的多核苷酸在严格条件下杂交、并且编码具有激酶活性的多肽的多核苷酸，

(iii)由序列号1或3所示的碱基序列构成的多核苷酸中缺失、取代或添加1个或多个核苷酸的碱基序列所构成的、并且编码具有激酶活性的多肽的多核苷酸，或者

(iv)与由序列号1或3所示的碱基序列构成的多核苷酸具有80％以上的序列同一性、并且编码具有激酶活性的多肽的多核苷酸。

[4]如[1]～[3]任一项所述的方法，其中，基因融合为癌的责任突变(驱动突变)。

[5]如[4]所述的方法，其中，癌为急性成淋巴细胞性白血病。

[6]一种鉴定抑制多肽的表达和/或活性的物质能带来治疗效果的癌患者或存在患癌风险的被检测者的方法，上述多肽由作为癌的责任突变(驱动突变)的基因融合产生的融合多核苷酸所编码，该方法包括下述的工序：

(1)检测来自被检测者的分离得到的试样中的包括ATF7IP的SETDB1结合结构域以及PDGFRB的跨膜结构域和激酶结构域并且具有激酶活性的ATF7IP-PDGFRB融合多肽、或编码其的融合多核苷酸的工序；以及

(2)在检测到上述融合多肽或编码其的融合多核苷酸的情况下，判定为抑制上述多肽的表达和/或活性的物质在上述被检测者中能带来治疗效果的工序。

[7]一种基因融合的检测用试剂盒，其含有下述(A)～(C)中的任一种多核苷酸或抗体或者它们的组合：

(A)作为探针的多核苷酸，上述探针设计为特异性地识别ATF7IP-PDGFRB融合多核苷酸；

(B)作为一对引物的多核苷酸，上述一对引物设计为能够特异性扩增ATF7IP-PDGFRB融合多核苷酸；或者

(C)特异性地识别ATF7IP-PDGFRB融合多肽的抗体。

[8]如[7]所述的试剂盒，其中，基因融合为癌的责任突变(驱动突变)。

[9]包括ATF7IP的SETDB1结合结构域以及PDGFRB的跨膜结构域和激酶结构域并且具有激酶活性的、分离得到的ATF7IP-PDGFRB融合多肽或其片段。

[10]编码[9]所述的融合多肽或其片段的多核苷酸。

[11]一种ATF7IP-PDGFRB基因融合阳性癌的治疗剂。

[12]如[11]所述的治疗剂，其包含抑制ATF7IP-PDGFRB融合多肽的表达和/或活性的物质作为有效成分，上述ATF7IP-PDGFRB融合多肽包括ATF7IP的SETDB1结合结构域以及PDGFRB的跨膜结构域和激酶结构域并且具有激酶活性。

[13]如[11]或[12]所述的治疗剂，其中，癌为急性成淋巴细胞性白血病。

[14]如[11]～[13]任一项所述的治疗剂，其中，抑制包括ATF7IP的SETDB1结合结构域以及PDGFRB的跨膜结构域和激酶结构域并且具有激酶活性的ATF7IP-PDGFRB融合多肽的表达和/或活性的物质为抑制PDGFRB激酶活性的物质。

[15]如[14]所述的治疗剂，其中，抑制PDGFRB激酶活性的物质为甲磺酸伊马替尼(Imatinib mesylate)、达沙替尼(Dasatinib)、尼洛替尼(Nilotinib)、帕纳替尼(Ponatinib)、乐伐替尼(Rebastinib)或巴氟替尼(Bafetinib)。

[16]如[14]所述的治疗剂，其中，抑制PDGFRB激酶活性的物质为达沙替尼。

[17]一种用于癌治疗的药剂，其包含抑制包括ATF7IP的SETDB1结合结构域以及PDGFRB的跨膜结构域和激酶结构域并且具有激酶活性的ATF7IP-PDGFRB融合多肽的表达和/或活性的物质。

[18]如[17]所述的药剂，其中，癌为ATF7IP-PDGFRB基因融合阳性癌。

[19]如[17]或[18]所述的药剂，其中，癌为急性成淋巴细胞性白血病。

[20]如[17]～[19]任一项所述的药剂，其中，抑制包括ATF7IP的SETDB1结合结构域以及PDGFRB的跨膜结构域和激酶结构域并且具有激酶活性的ATF7IP-PDGFRB融合多肽的表达和/或活性的物质为抑制PDGFRB激酶活性的物质，优选为甲磺酸伊马替尼、达沙替尼、尼洛替尼、帕纳替尼、乐伐替尼或巴氟替尼，更优选为达沙替尼。

[21]一种癌的治疗方法，其包括：对被检测者，投与抑制包括ATF7IP的SETDB1结合结构域以及PDGFRB的跨膜结构域和激酶结构域并且具有激酶活性的ATF7IP-PDGFRB融合多肽的表达和/或活性的物质的治疗上的有效量的工序。

[22]如[21]所述的方法，其中，被检测者为ATF7IP-PDGFRB基因融合阳性癌患者。

[23]如[21]所述的方法，其中，被检测者为急性成淋巴细胞性白血病患者。

[24]如[21]所述的方法，其中，抑制包括ATF7IP的SETDB1结合结构域以及PDGFRB的跨膜结构域和激酶结构域并且具有激酶活性的ATF7IP-PDGFRB融合多肽的表达和/或活性的物质为抑制PDGFRB激酶活性的物质。

[25]如[24]所述的方法，其中，抑制PDGFRB激酶活性的物质为甲磺酸伊马替尼、达沙替尼、尼洛替尼、帕纳替尼、乐伐替尼或巴氟替尼。

[26]如[24]所述的方法，其中，抑制PDGFRB激酶活性的物质为达沙替尼。

[27]一种癌治疗剂的筛选方法，其包括下述的工序：

(1)使被检测物质与表达包括ATF7IP的SETDB1结合结构域以及PDGFRB的跨膜结构域和激酶结构域并且具有激酶活性的ATF7IP-PDGFRB融合多肽的细胞接触的工序；

(2)确定是否抑制上述融合多肽的表达和/或活性的工序；以及

(3)将确定为抑制上述融合多肽的表达和/或活性的物质选择作为癌治疗剂的工序。

发明效果

根据本发明，能够检测由本申请发明所首次明确的特定的癌的未知的责任突变，能够基于该责任突变的存在鉴定癌治疗能带来效果的癌患者或者存在患癌风险的被检测者，进而对该癌患者进行治疗。

附图说明

图1是表示ATF7IP-PDGFRB融合蛋白的结构域结构的一例的概略图。向下的箭头表示ATF7IP蛋白和PDGFRB蛋白中的切断点、以及ATF7IP-PDGFRB融合蛋白中的融合点。SETDB1：SETDB1结合结构域；MBD1：MBD1结合结构域；Ig：Ig样结构域；TM：跨膜结构域；PTK：激酶结构域。

图2是表示以从来自白血病细胞的RNA合成的cDNA为模板，通过RT-PCR检测ATF7IP-PDGFRB基因融合的结果的电泳的照片。箭头表示显示基因融合的基因片段的扩增。

图3表示确定扩增的基因片段的碱基序列的结果。

图4表示ATF7IP/PDGFRB阳性ALL患者的临床经过。(A)通过荧光原位杂交(FISH)、RT-PCR(Kobayashi K,et al.,Br J Haematol,2014,165,836-841)和基因组PCR评价治疗反应。化疗法方案如下所述：模块1：在最初诊断的16个月后开始标准风险ALL型疗法(東京小児がん研究グループ(Tokyo Children's Cancer Study Group)研究L99-15)、维持疗法；模块2：ALL型再导入疗法；模块3：AML型方案(TsukimotoI,et al.,J Clin Oncol,2009,27,4007-4013)。缩写：CBSCT、脐带血干细胞移植；TKI、酪氨酸激酶抑制剂；FISH、荧光原位杂交。(B)在17个样品中通过RT-PCR和基因组PCR检测到的MRD的结果。将通过基因组PCR和RT-PCR得到的检测水平分别示于x轴和y轴。在2个样品中，使用任一种方法都没有检测到MRD；在4个样品中，仅通过基因组PCR检测到MRD；在11个样品中，使用任一种PCR法都在定量的范围内检测到MRD。对结果不一致的4个样品，通过克隆序列确认基因组PCR产物，排除了偶发的假阳性的结果的可能性。虚线表示MRD检测的能够定量化的范围的阈值。

图5-1表示由ATF7IP-和EBF1-PDGFRB诱导IL-3非依赖性的细胞增殖，但没有通过野生型(WT-)PDGFRB诱导。(A)使用四环素诱导性系统，用表达ATF7IP-PDGFRB的逆转录病毒载体或空载体(Mock)转染Ba/F3细胞。暴露于逆转录病毒10小时，接着使用或不使用多西环素(Dox)，处理24小时后，清洗细胞，除去条件培养基。孵育60小时后，通过水溶性四唑盐(WST)检测推定活细胞数。对各处理，利用柱状图表示三次连续的平均±SEM。

图5-2(B)将用ATF7IP-PDGFRB、EBF1-PDGFRB或野生型PDGFRB(WT-PDGFRB)转染并克隆化的Ba/F3细胞在所示的期间、在WEHI-3-条件培养基(CM)的非存在下进行培养，供于WST检测。WT-PDGFRB转染子的情况下，对2个条件、即，使用和不使用100ng/mL的PDGFBB的条件进行试验。作为对照，对用使用或不使用WEHI-3条件培养基进行培养的、空载体转染的Ba/F3细胞同时进行研究。将OD值作为三次连续的平均±SEM表示。所示的数据为三次独立的实验的代表例。(C)将使用或不使用(B)所示的PDGFBB的WT-PDGFRB和不使用条件培养基的Mock的结果提取出来，示于将Y轴进行了放大的坐标图上。

图5-3(D)对与(B)相同的WT-PDGFRB转染子的样品制备物通过膜联蛋白V结合检测进行研究。作为对照，如所表示那样，使用或不使用PDGFBB或条件培养基而进行了处理的Mock细胞也同样地进行试验。实验连续进行三次，表示典型的细胞所见和阳性率(％)的平均±SEM。X轴：荧光强度；Y轴：相对细胞数。

图6表示转染子中的PDGFRB关联嵌合分子和野生型(WT-)PDGFRB的表达。(A)从用ATF7IP-PDGFRB(A)、EBF1-PDGFRB(E)、WT-PDGFRB(W)或空载体(Mock、M)转染的Ba/F3细胞1×10⁷个中提取总RNA，对各基因的表达和作为内部标准的β-肌动蛋白的表达通过PCR进行研究。(B)对各类型的PDGFRB的表达通过免疫印迹分析进行研究。ATF7IP-PDGFRB的情况下，使用抗ATF7IP抗体或抗PDGFRB抗体中的任一种都检测到了融合蛋白。灰色的箭头表示WT-PDGFRB的情况下检测到的、与预想大小相比分子量低的几个出乎意料的带。(C)利用免疫细胞化学法检测Ba/F3细胞中的ATF7IP-PDGFRB的表达。

图7表示通过PDGFRB的表达而介导的酪氨酸磷酸化的增加。(A)由Ba/F3转染子制备细胞裂解液(lysate)，通过使用抗磷酸化酪氨酸抗体4G10的免疫印迹检测蛋白质酪氨酸磷酸化。(B)对与(A)相同的样品制备物，使用关于图中所表示的酪氨酸残基的磷酸化特异性抗PDGFRB抗体同样地进行研究。ATF7IP-PDGFRB、A；EBF1-PDGFRB、E；WT-PDGFRB、W；有配体刺激(100ng/mL的PDGFBB)，L；Mock/空载体、M。

图8表示位于PDGFRB的下游的信号转导分子的磷酸化的增强。对与图7相同的样品制备物，使用图中所表示的抗体同样地进行研究。ATF7IP-PDGFRB、A；EBF1-PDGFRB、E；WT-PDGFRB、W；有配体刺激(100ng/mL的PDGFBB中5分钟)、+；没有配体刺激、－；Mock/空载体、M。

图9表示对Ba/F3转染子中的c-Cbl的磷酸化和c-Cbl与PDGFRB的结合。(A)对所表示的细胞裂解液，使用抗PDGFRB抗体进行免疫沉淀。在SDS-PAGE上进行分离之后，使用抗c-Cbl或抗PDGFRB抗体中的任一种进行免疫印迹。(B)使用相同的样品制备物，分别使用抗c-Cbl抗体和抗磷酸化酪氨酸抗体进行免疫沉淀和免疫印迹分析。ATF7IP-PDGFRB、A；EBF1-PDGFRB、E；有PDGFBB(100ng/mL中5分钟)的WT-PDGFRB、W+；没有PDGFBB的WT-PDGFRB、W-；Mock/空载体、M。

图10表示PI3激酶以及对MEK的抑制剂对于具有PDGFRB的Ba/F3转染子的增殖的效果。(A)使用或不使用所表示的浓度的PI3激酶抑制剂LY294002或MEK抑制剂PD98059对表达ATF7IP-PDGFRB的Ba/F3细胞在WEHI-3-条件培养基(CM)的非存在下处理24小时，另外对Mock Ba/F3细胞在CM的存在下处理24小时。之后，与图5B同样地，通过WST检测推定活细胞数。算出由用抑制剂进行了处理的细胞得到的OD值相对于由没有用抑制剂进行处理的细胞得到的OD值之比，将结果作为三次连续的平均±SEM表示。(B)将表达ATF7IP-PDGFRB的Ba/F3细胞在CM的存在下或非存在下用PD98059进行处理，与(A)同样地进行研究。

图11表示PI3激酶以及MEK的抑制剂对于AKT和MAP激酶的磷酸化的效果。由与图10相同的样品制备物制备细胞裂解液。与图8同样地进行免疫印迹分析。没有抑制剂、None；有LY294002、LY；有PD98059、PD。

图12表示PDGFBB和IL-3对AKT和MAP激酶的磷酸化的效果。在(CM(+))或非存在下(CM(-))将表达WT-PDGFRB的细胞在WEHI-3条件培养基的存在下维持12小时。所表示的期间通过PDGFBB刺激之后，制备细胞裂解液。与图8同样地，进行免疫印迹分析。

图13-1表示酪氨酸激酶抑制剂对具有PDGFRB的Ba/F3转染子的增殖的效果。(A)使用或不使用所表示的浓度的酪氨酸激酶抑制剂，将在条件培养基的存在下维持的(CM(+))表达ATF7IP-或EBF1-PDGFRB的细胞和Mock Ba/F3细胞处理24小时。之后，与图5B同样地，通过WST检测推定活细胞数。算出由用抑制剂进行了处理的细胞得到的OD值相对于由没有用抑制剂进行处理的细胞得到的OD值之比，将结果作为三次连续的平均±SEM表示。

图13-2(B)尼洛替尼、巴氟替尼(Bafetinib)、乐伐替尼(Rebastinib)和帕纳替尼对具有PDGFRB的Ba/F3转染子的增殖的效果。

图14表示酪氨酸激酶抑制剂对AKT和MAP激酶的磷酸化的效果。与图13同样地，由用100nM的伊马替尼处理12小时的样品制备物制备细胞裂解液。与图8同样地，进行免疫印迹分析。

具体实施方式

如后述的实施例中所示，本发明的发明人首次发现了在癌组织中作为癌的责任突变(驱动突变)的ATF7IP-PDGFRB基因融合。本发明基于这样的认识，提供该基因融合的检测方法、基于该责任突变的存在的癌治疗能带来效果的癌患者或存在患癌风险的被检测者的鉴定方法、癌的治疗方法和癌治疗剂、癌治疗剂的筛选方法等。

本发明中，所谓“癌的责任突变”，是与驱动突变可以互换使用的词语，是指存在于癌组织的、对细胞具有癌化能力的突变。典型而言，在发现了某种突变的癌组织中，已知的癌基因突变均不存在的情况(即，该突变与上述已知的癌基因突变相互排斥地存在的情况)下，该突变能够称为癌的责任突变。

＜具体的癌的责任突变＞

以下，对具体的基因融合进行说明。其中，本说明书中，融合多核苷酸中的“融合点”是指5’侧的基因部分与3’侧的基因部分连接的边界，其为2个核苷酸残基之间的边界。另外，融合多肽中的“融合点”是指N末端侧的多肽与C末端侧的多肽连接的边界，其为2个氨基酸残基之间的边界，或在1个密码子内产生基因融合的情况下，为由该密码子所编码的1个氨基酸残基自身。

ATF7IP-PDGFRB基因融合为产生ATF7IP蛋白和PDGFRB蛋白的融合蛋白(以下，也称为ATF7IP-PDGFRB融合多肽)的表达的突变，是在人染色体中由在12p13.1和5q33.1的区域内具有切断点的转座(t(5；12))产生的突变。

ATF7IP(activating transcription factor 7interacting protein 1，激活转录因子7相互作用蛋白1)蛋白是也作为MCAF1等已知的、在人体内由存在于12p13.1的基因所编码的蛋白质，典型而言，是由序列号6或8所示的氨基酸序列(NCBI登录编号NP_060649.3(26-Oct-2013)、或NP_851997.1(08-Nov-2013))构成的蛋白质。关于ATF7IP蛋白的功能，还没有充分地阐明，但认为是与转录因子结合而调节其转录活性。ATF7IP蛋白的特征在于具有SETDB1结合结构域和MBD1结合结构域(图1)。SETDB1结合结构域例如在人类时相当于序列号6所示的氨基酸序列的562～817位的氨基酸序列。MBD1结合结构域例如在人类时相当于序列号6所示的氨基酸序列的1154～1270位的氨基酸序列。

PDGFRB蛋白是在人体内由存在于5q33.1的基因所编码的蛋白质，典型而言，是由序列号10所示的氨基酸序列(NCBI登录编号NP_002600.1(27-Oct-2013))构成的蛋白质。PDGFRB蛋白的特征在于具有Ig样结构域、跨膜结构域和激酶结构域(图1)。Ig样结构域例如在人类时相当于序列号10所示的氨基酸序列的228～415位的氨基酸序列。跨膜结构域例如在人类时相当于序列号10所示的氨基酸序列的533～553位的氨基酸序列。激酶结构域例如在人类时相当于序列号10所示的氨基酸序列的562～953位的氨基酸序列。

ATF7IP-PDGFRB融合多肽是包括ATF7IP蛋白的SETDB1结合结构域以及PDGFRB蛋白的跨膜结构域和激酶结构域并且具有激酶活性的多肽。

在ATF7IP-PDGFRB融合多肽中，可以包括ATF7IP蛋白的SETDB1结合结构域的全部，只要能够与SETDB1结合，也可以包括SETDB1结合结构域的一部分。该SETDB1结合结构域的一部分是否与SETDB1结合，可以通过利用J Biol Chem,2005,280(14),13928-35中所记载的GST拉下实验(GST Pull-down assay)进行测定而确认。

ATF7IP-PDGFRB融合多肽既可以包括ATF7IP蛋白的MBD1结合结构域的全部或一部分，也可以不包括。

在ATF7IP-PDGFRB融合多肽中，可以包括PDGFRB蛋白的激酶结构域的全部，只要ATF7IP-PDGFRB融合多肽具有激酶活性，也可以包括激酶结构域的一部分。

ATF7IP-PDGFRB融合多肽“具有激酶活性”是指具有由来自PDGFRB蛋白的激酶结构域引起的作为将酪氨酸磷酸化的酶的活性。ATF7IP-PDGFRB融合多肽的激酶活性通过常规方法测定，通常，在适当的条件下与底物(合成肽底物等)和ATP同时孵育之后，检测底物的磷酸化酪氨酸。另外，也可以使用市售的测定试剂盒进行测定。

ATF7IP-PDGFRB融合多肽可以包括PDGFRB蛋白的跨膜结构域的全部或一部分，优选包括跨膜结构域的全部。

在本发明中，编码ATF7IP-PDGFRB融合多肽的多核苷酸(以下，也称为ATF7IP-PDGFRB融合多核苷酸)是编码包括ATF7IP蛋白的SETDB1结合结构域以及PDGFRB蛋白的跨膜结构域和激酶结构域并且具有激酶活性的多肽的多核苷酸。ATF7IP-PDGFRB融合多核苷酸可以为mRNA、cDNA和基因组DNA的任一种。

本发明中的ATF7IP-PDGFRB融合多核苷酸例如可以为编码下述的多肽的ATF7IP-PDGFRB融合多核苷酸：

(i)由序列号2或4所示的氨基酸序列构成的多肽，

序列号2或4所示的氨基酸序列如后述的实施例中所示，为由含有在来自人癌组织的样品中所发现的部分序列的ATF7IP-PDGFRB融合多核苷酸所编码的氨基酸序列。

上述(ii)中，“1个或多个氨基酸”通常是指1～50个、优选1～30个、更优选1～10个、更进一步优选1～数个(例如1～5个、1～4个、1～3个、1或2个、或1个)氨基酸。

在上述(iii)中，“80％以上的序列同一性”是指优选为85％以上、更优选为90％以上、95％以上、更进一步优选为97％以上、98％以上、99％以上的序列同一性。氨基酸序列的同源性能够利用基于Karlin和Altschul的算法BLAST(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2264-2268,1990、Proc Natl Acad Sci USA 90:5873,1993)的称为BLASTX或BLASTP的程序(Altschul SF,et al:J Mol Biol 215:403,1990)来确定。使用BLASTX分析氨基酸序列的情况下，参数例如设为score＝50、wordlength＝3。使用BLAST和Gapped BLAST程序的情况下，使用各程序的默认参数。这些分析方法的具体方法为本领域技术人员所熟悉的(例如http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。

另外，本发明中的ATF7IP-PDGFRB融合多核苷酸例如可以为下述的任一种多核苷酸：

(i)由序列号1或3所示的碱基序列构成的多核苷酸，

序列号1或3所示的碱基序列如后述的实施例所示，为含有在来自人癌组织的样品中所发现的部分序列的ATF7IP-PDGFRB融合多核苷酸的碱基序列。

上述(ii)中，“严格条件下”除特别记载的情况之外，是指中程度或高程度的严格条件。

中程度的严格条件，例如，只要是本领域技术人员，就能够基于作为对象的多核苷酸的长度而容易地设计。基本的条件在Sambrook等，Molecular Cloning:A Laboratory Manual、第3版、第6～7章、Cold SpringHarbor Laboratory Press,2001所示。典型而言，中程度的严格条件包括：对硝化纤维素膜，5×SSC、0.5％SDS、1.0mM EDTA(pH8.0)的前清洗条件；约40～50℃的、约50％甲酰胺、2～6×SSC(或、约42℃的、约50％甲酰胺中的Stark’s solution等其它同样的杂交溶液)的杂交条件；和约40℃～60℃、0.5～6×SSC、0.1％SDS的清洗条件。中程度的严格条件优选包括约50℃、6×SSC的杂交条件，也可以包括上述的清洗条件和/或清洗条件。

高程度的严格条件(高严格条件)，例如，只要是本领域技术人员，就能够基于作为对象的多核苷酸的长度而容易地设计。高严格条件包括比中程度的严格条件高的温度和/或低的盐浓度。典型而言，包括约65℃、0.2～6×SSC、优选为6×SSC、更优选为2×SSC、进一步优选为0.2×SSC的杂交条件。任一种情况均优选包括约65～68℃、0.2×SSC、0.1％SDS的清洗条件。

任一种情况下，作为用于杂交、前清洗和清洗的缓冲液，均能够代替SSC(1×SSC为0.15M NaCl和15mM柠檬酸钠。)而使用SSPE(1×SSPE为0.15M NaCl、10mM NaH₂PO₄和1.25mM EDTA、pH7.4。)。任一种情况下，均可以在杂交结束后进行清洗约15分钟。

在上述(iii)中，“1个或多个核苷酸”通常是指1～50个、优选为1～30个、更优选为1～10个、更进一步优选为1～数个(例如1～5个、1～4个、1～3个、1或2个、或1个)核苷酸。

在上述(iv)中，“80％以上的序列同一性”是指优选为85％以上、更优选为90％以上、95％以上、更进一步优选为97％以上、98％以上、99％以上的序列同一性。碱基序列的同源性能够利用基于上述算法BLAST的称为BLASTN的程序(Altschul SF,et al:J Mol Biol 215:403,1990)来确定。使用BLASTN分析碱基序列的情况下，参数例如设为score＝100、wordlength＝12。

＜基因融合的检测方法＞

本发明提供ATF7IP-PDGFRB基因融合的检测方法(以下，也称为本发明的检测方法)。该基因融合优选产生癌的责任突变(驱动突变)。本发明的检测方法包括检测来自被检测者的分离得到的试样中的ATF7IP-PDGFRB融合多核苷酸或由其所编码的多肽的工序。

在本发明的检测方法中，被检测者只要是哺乳动物即可，没有特别限定。作为哺乳动物，例如能够列举小鼠、大鼠、仓鼠、花鼠、豚鼠等啮齿类；兔、猪、牛、山羊、马、绵羊、水貂、狗、猫、人类、猴子、食蟹猴、罗猴、绒猴、猩猩、黑猩猩等灵长类等，优选人类。

被检测者不仅可以为患有癌的被检测者，也可以为怀疑患有癌的被检测者、或存在将来患癌的风险的被检测者。作为适用本发明的检测方法的对象的“癌”，只要是可检测到ATF7IP-PDGFRB基因融合的癌，就没有特别限定，优选为白血病，进一步优选为急性成淋巴细胞性白血病(ALL)，特别优选为B祖细胞性急性成淋巴细胞性白血病(B-ALL)。

来自被检测者的“分离得到的试样”不仅包括生物体试样(例如细胞、组织、脏器(例如小肠、脾脏、肾脏、肝脏、胃、肺、肾上腺、心脏、脑、胰腺、大动脉等)、体液(例如血液、淋巴液、骨髓液等)、消化液、痰、肺胞-支气管清洗液、尿、便)，也包括从这些生物体试样得到的核酸提取物(由基因组DNA提取物、mRNA提取物、由mRNA提取物制备的cDNA制备物或cRNA制备物等)、蛋白质提取物。基因组DNA、mRNA、cDNA或蛋白质，对于本领域技术人员来说，能够考虑上述试样的种类和状态等选择对其适用的公知的方法来制备。另外，对上述试样可以实施福尔马林固定处理、醇固定处理、冷冻处理或石蜡包埋处理。

另外，“分离得到的试样”优选为来自存在或怀疑存在上述癌的组织、脏器或体液，更优选为来自存在或怀疑存在上述癌的血液或骨髓液。作为这种“分离得到的试样”，可列举例如：来自白血病(优选ALL、更优选B-ALL)患者或怀疑患有白血病的被检测者的血液或骨髓液的细胞、由该细胞提取的总RNA等。

在本发明的检测方法中，融合多核苷酸或由其所编码的多肽的检测能够使用自身公知的方法来进行。

将来自基因组DNA的转录产物(mRNA或由mRNA制备的cDNA)作为对象的情况下，例如，能够利用RT-PCR法、测序、TaqMan探针法、RNA印迹法(Northern Blotting)、点杂交法、cDNA微阵列分析等检测作为mRNA或cDNA的融合多核苷酸。

另外，将基因组DNA作为对象的情况下，例如，能够利用原位杂交(ISH)、基因组PCR法、测序、TaqMan探针法、DNA印迹法(SouthernBlotting)、基因组微阵列分析等检测作为基因组DNA的融合多核苷酸。

这些方法能够分别单独利用，也可以组合利用。例如，ATF7IP-PDGFRB基因融合据认为是通过表达融合多肽来参与癌化，因此，在检测作为基因组DNA的融合多核苷酸的情况(例如利用原位杂交等)下，也优选进一步确认转录产物或蛋白质生成(例如利用RT-PCR、免疫染色法等)。

在利用杂交技术(例如TaqMan探针法、RNA印迹法、DNA印迹法、点杂交法、微阵列分析、原位杂交(ISH)等)检测融合多核苷酸的情况下，能够使用作为探针的多核苷酸，其设计为特异性识别上述融合多核苷酸。在此，“特异性识别融合多核苷酸”是指：在严格条件下，从包括来自从该融合多核苷酸的融合点至5’末端侧和3’末端侧的部分的野生型基因的、该融合多核苷酸以外的多核苷酸中，识别并认出该融合多核苷酸。

在本发明的检测方法中，在治疗或诊断的过程中得到的生物体试样(生物体检测样品等)大多进行福尔马林固定，因此，作为检测对象的基因组DNA在福尔马林固定下也稳定，从检测灵敏度高的观点考虑，优选使用原位杂交。

在原位杂交中，对上述生物体试样能够通过使作为设计为特异性识别融合多核苷酸的探针的多核苷酸具有至少15个碱基的链长的下述(a)或(b)所述的多核苷酸杂交，来检测编码融合多肽的基因组DNA(融合多核苷酸)。

(a)作为选自与5’侧融合伙伴基因(ATF7IP基因)的碱基序列杂交的探针和与3’侧融合伙伴基因(PDGFRB基因)的碱基序列杂交的探针中的至少一个探针的多核苷酸

(b)作为与包括5’侧融合伙伴基因和3’侧融合伙伴基因的融合点的碱基序列杂交的探针的多核苷酸。

本发明的ATF7IP基因只要是来自人类的即可，典型而言是在以Genbank登录编号NC_000012.11规定的基因组的序列中从第14518566到第14655864的DNA序列构成的基因。

本发明的PDGFRB基因只要是来自人类的即可，典型而言是在以Genbank登录编号NC_000005.9规定的基因组的序列中第149493402～149535447的DNA序列(由互补链所编码)构成的基因。

但是，基因的DNA序列由于其突变等在自然界中(即非人工地)会发生变化。因此，这种天然的突变体也可以作为本发明的对象(以下，同样)。

本发明的(a)中记载的多核苷酸只要是通过与作为该多核苷酸的标靶碱基序列的、5’侧融合的伙伴基因(ATF7IP基因)的碱基序列和/或3’侧融合的伙伴基因(PDGFRB基因)的碱基序列杂交而能够检测编码上述生物体试样中的融合多肽的基因组DNA的存在的多核苷酸即可，优选为下述(a1)～(a3)中记载的多核苷酸：

(a1)与比5’侧融合的伙伴基因的切断点更靠5’侧的上游区域的碱基序列杂交的多核苷酸(以下，也称为“5’融合伙伴基因探针1”)和与比3’侧的融合伙伴基因的切断点更靠3’侧的下游区域的碱基序列杂交的多核苷酸(以下，也称为“3’融合伙伴基因探针1”)的组合；

(a2)与比5’侧融合的伙伴基因的切断点更靠5’侧的上游区域的碱基序列杂交的多核苷酸(以下，也称为“5’融合伙伴基因探针1”)和与比5’侧融合的伙伴基因的切断点更靠3’侧的下游区域的碱基序列杂交的多核苷酸(以下，也称为“5’融合伙伴基因探针2”)的组合；

(a3)与比3’侧融合的伙伴基因的切断点更靠5’侧的上游区域的碱基序列杂交的多核苷酸(以下，也称为“3’融合伙伴基因探针2”)和与比3’侧融合的伙伴基因的切断点更靠3’侧的下游区域的碱基序列杂交的多核苷酸(以下，也称为“3’融合伙伴基因探针1”)的组合。

在上述(a1)～(a3)中，在比5’侧融合的伙伴基因的切断点更靠5’侧的上游区域的碱基序列中，典型而言包括ATF7IP蛋白的SETDB1结合结构域的全部或一部分的编码区域。

在上述(a1)～(a3)中，在比3’侧融合的伙伴基因的切断点更靠3’侧的下游区域的碱基序列中，典型而言包括PDGFRB的跨膜结构域的全部或一部分的编码区域以及激酶结构域的全部或一部分的编码区域。

作为上述(a1)中记载的多核苷酸，可列举例如以下的(a1-1)的多核苷酸的组合：

(a1-1)与ATF7IP的SETDB1结合结构域的全部或一部分的编码区域杂交的多核苷酸和与PDGFRB的激酶结构域的全部或一部分的编码区域杂交的多核苷酸的组合。

在本发明中，作为原位杂交中所使用的上述(a)中记载的多核苷酸所杂交的区域(标靶碱基序列)，从对于标靶碱基序列的特异性和检测的灵敏度的观点考虑，优选为距5’侧融合的伙伴基因(ATF7IP基因)和3’侧融合的伙伴基因(PDGFRB基因)的融合点1000000碱基以内的区域。

另外，在本发明中，原位杂交中所使用的上述(b)中记载的多核苷酸只要是通过与作为该多核苷酸的标靶碱基序列的、包括5’侧融合的伙伴基因和3’侧融合的伙伴基因的融合点的碱基序列杂交而能够检测编码上述生物体试样中的融合多肽的基因组DNA的存在即可，作为典型例，为与包括序列号1或3中记载的碱基序列中的融合点的碱基序列杂交的多核苷酸。

另外，在本发明中，从对于标靶碱基序列的特异性和检测的灵敏度的观点考虑，原位杂交中所使用的上述(a)或(b)中记载的多核苷酸优选为能够覆盖上述标靶碱基序列整体的、包括多种多核苷酸的集合。这种情况下，构成该集合的多核苷酸的长度至少为15个碱基，优选为100～1000个碱基。

原位杂交中所使用的上述(a)或(b)中记载的多核苷酸，为了检测，优选用荧光色素等标记。作为这样的荧光色素，可列举例如：DEAC、FITC、R6G、TexRed、Cy5，但并不限于这些。另外，除荧光色素以外，也可以利用放射性同位元素(例如：¹²⁵I、¹³¹I、³H、¹⁴C、³³P、³²P等)、酶(例如：β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、碱性磷酸酶、过氧化物酶、苹果酸脱氢酶等)、发光物质(例如：鲁米诺、鲁米诺衍生物、萤光素、光泽精、3,3’-二氨基联苯胺(DAB)等)来标记上述多核苷酸。

在原位杂交中，在使用5’侧融合伙伴基因探针1和3’侧融合伙伴基因探针1的情况、使用5’侧融合伙伴基因探针1和5’侧融合伙伴基因2的情况、或使用3’融合伙伴基因探针2和3’融合伙伴基因探针1的情况下，这些探针优选以相互不同的色素标记。而且，这样使用以不同的色素标记的探针的组合进行原位杂交时，在观察到5’侧融合伙伴基因探针1的标记所发出的信号(例如荧光)与3’侧融合伙伴基因探针1的标记所发出的信号的重合时，能够判定为检测到编码融合多肽的基因组DNA。另一方面，在观察到5’侧融合伙伴基因探针1的标记所发出的信号和5’侧融合伙伴基因探针2的标记所发出的信号的分离、3’侧融合伙伴基因探针2的标记所发出的信号和3’侧融合伙伴基因探针1的标记所发出的信号的分离时，能够判定为检测到编码融合多肽的基因组DNA。

此外，多核苷酸的标记能够利用公知的方法进行。例如，能够通过切口平移法、随机引物法在多核苷酸中插入由荧光色素等所标记的底物碱基，从而标记该多核苷酸。

在原位杂交中，使上述(a)或(b)中记载的多核苷酸与上述生物体试样杂交时的条件可根据该多核苷酸的长度等各要素而变动，作为高严格杂交的条件，可列举例如0.2×SSC、65℃这样的条件，作为低严格杂交的条件，可列举例如2.0×SSC、50℃这样的条件。此外，对于本领域技术人员而言，通过适当选择盐浓度(SSC的稀释率等)和温度以及例如表面活性剂(NP-40等)的浓度、甲酰胺的浓度、pH等各种条件，能够实现与上述条件同样的严格杂交的条件。

作为使用上述(a)或(b)中记载的多核苷酸检测编码融合多肽的基因组DNA的方法，除上述原位杂交以外，还可列举DNA印迹法、RNA印迹法和点杂交。在这些方法中，在转印有从上述生物体试样得到的核酸提取物的膜上使上述(a)或(b)中记载的多核苷酸杂交，由此检测上述融合基因。使用上述(a)的多核苷酸的情况下，与5’侧融合的伙伴基因的碱基序列杂交的多核苷酸和与3’侧融合的伙伴基因的碱基序列杂交的多核苷酸识别在膜上展开的同一条带时，能够判定为能够识别编码融合多肽的基因组DNA。

作为使用上述(b)的多核苷酸检测编码融合多肽的基因组DNA的方法，还可列举基因组微阵列分析、DNA微阵列分析。在这些方法中，制作将上述(b)的多核苷酸固定于基板的阵列，使上述生物体试样与该阵列上的多核苷酸接触，由此检测该基因组DNA。作为基板，只要是能够使寡核苷酸或多核苷酸固相化即可，没有特别限定，可以列举例如玻璃板、尼龙膜、微珠、硅片、毛细管等。

在本发明的检测方法中，也优选利用PCR检测融合多核苷酸。

在PCR中，能够使用作为一对引物的多核苷酸，其设计为能够以从上述生物体试样制备的DNA(基因组DNA、cDNA)、RNA为模板特异性扩增融合多核苷酸。在此，“能够特异性扩增融合多核苷酸”是指不扩增来自从该融合多核苷酸的融合点至5’末端侧和3’末端侧的部分的野生型基因，能够仅扩增该融合多核苷酸，既可以扩增该融合多核苷酸的全部，也可以扩增包括融合点的该融合多核苷酸的一部分。

PCR等中利用的“作为一对引物的多核苷酸”包括特异性扩增作为标靶的融合多核苷酸的正义引物(正向引物)和反义引物(反向引物)，正义引物由从该融合多核苷酸的融合点至5’末端侧的碱基序列设计，反义引物由从该融合多核苷酸的融合点至3’末端侧的碱基序列设计。另外，从利用PCR法的检测的精度和灵敏度的观点考虑，这些引物通常设计为PCR产物为5kb以下。引物的设计能够利用公知的方法适当进行，例如，能够利用Primer Express(注册商标)软件(AppliedBiosystems)。这些多核苷酸的长度通常为15个碱基以上(优选为16、17、18、19或20个碱基以上、更优选为21个碱基以上)，为100个碱基以下(优选为90、80、70、60、50或40个碱基以下、更优选为30个碱基以下)。

作为“作为一对引物的多核苷酸”的优选例，可列举：包括由序列号11所示的碱基序列构成的多核苷酸和由序列号12所示的碱基序列构成的多核苷酸的引物组、以及包括由序列号21所示的碱基序列构成的多核苷酸和由序列号22所示的碱基序列构成的多核苷酸的引物组。

利用PCR检测融合多核苷酸的情况下，通过将PCR产物作为对象进行测序，确定包括融合点的碱基序列，由此能够确认5’侧的基因部分和3’侧的基因部分在框内连接和/或含有融合多核苷酸中规定的结构域。测序能够利用公知的方法进行，通过按照操作说明书(protocol)使用测序仪(例如ABI-PRISM 310Genetic Analyzer(Applied BiosystemsInc.)等)，能够简单地实施。

另外，利用PCR检测融合多核苷酸的情况下，可以利用TaqMan探针法确认5’侧的基因部分和3’侧的基因部分在框内连接和/或含有融合多核苷酸中规定的结构域。作为在TaqMan探针法中使用的探针，可列举例如上述(a)或(b)中记载的多核苷酸。探针用报告色素(例如FAM、FITC、VIC等)和猝灭基团(例如TAMRA、Eclipse、DABCYL、MGB等)标记。

上述引物和探针可以为DNA，也可以为RNA，或者也可以为DNA/RNA嵌合物，优选为DNA。另外，可以在其一部分或全部中利用PNA(polyamide nucleic acid、肽核酸)、LNA(注册商标、locked nucleicacid(锁定核酸)、Bridged Nucleic Acid、交联化核酸)、ENA(注册商标、2’-O,4’-C-Ethylene-bridged nucleic acids)、GNA(Glycerol nucleic acid、甘油核酸)、TNA(Threose nucleic acid、苏糖核酸)等人工核酸代替核苷酸。另外，上述引物和探针可以为双链，也可以为单链，优选为单链。

另外，上述引物和探针只要能够与标靶序列特异性地杂交即可，也可以包括1个或多个核苷酸的错配，相对于标靶序列的互补序列，通常具有80％以上、优选90、91、92、93、94％以上、更优选95、96、97、98、99％以上的同一性，最优选具有100％的同一性。

上述引物和探针例如能够基于本说明书中所记载的碱基序列的信息，使用DNA/RNA自动合成机，按照常规方法进行合成。

在本发明的检测方法中，可以通过全转录组测序(RNA测序)或基因组测序检测融合多核苷酸。这些方法例如能够使用新一代测序仪(例如基因组分析仪IIx(Illumina公司)、HiSeq测序仪(HiSeq2000、Illumina公司)基因组测序仪FLX System(Roche公司)等)按照制造商的说明书来进行。RNA测序例如能够通过使用市售的试剂盒(例如mRNA-Seq样品制备试剂盒(Illumina公司)等)，按照制造商的说明书由总RNA制备cDNA文库、将其供于使用新一代测序仪的测序，由此来进行。

在本发明的检测方法中，将融合多核苷酸的翻译产物(即融合多肽)作为对象的情况下，例如能够利用免疫染色法、蛋白质免疫印迹法、RIA法、ELISA法、流式细胞法、免疫沉淀法、抗体阵列分析等检测该翻译产物。在这些方法中，使用特异性地识别融合多肽的抗体。在此，“特异性地识别融合多肽”是指：不识别包括来自从该融合多肽的融合点至N末端侧和C末端侧的部分的野生型蛋白质的、该融合多肽以外的蛋白质，而仅识别该融合多肽。本发明的检测方法中所使用的“特异性地识别融合多肽”的抗体既可以为1个抗体，也可以为2个以上的抗体的组合。

作为“特异性地识别融合多肽的抗体”，可列举包括融合多肽的融合点的多肽的特异性抗体(以下，也称为“融合点特异性抗体”)。在此，“融合点特异性抗体”是指：与上述包括融合点的多肽特异性地结合、但不与来自N末端侧和C末端侧的部分的野生型蛋白质结合的抗体。

另外，作为“特异性地识别融合多肽的抗体”，也可列举与包括从融合多肽的融合点至N末端侧的区域的多肽结合的抗体和与包括从融合多肽的融合点至C末端侧的区域的多肽结合的抗体的组合。通过使用这2种抗体进行三明治ELISA、免疫染色法、免疫沉淀法、蛋白质免疫印迹法等，能够检测融合多肽。

在本发明中，抗体包括多克隆抗体、单克隆抗体(mAb)等天然型抗体、使用基因重组技术制造的嵌合抗体、人源化抗体、单链抗体和它们的结合性片段，但并不限定于这些。结合性片段是指具有特异的结合活性的上述抗体的一部分区域，具体而言，可列举例如Fab、Fab’、F(ab’)₂、Fv和单链抗体等。抗体型(class)没有特别限定，可以为具有IgG、IgM、IgA、IgD或IgE等任一个同种型(isotype)的抗体，考虑精制的容易性等，更优选为IgG。

就“特异性地识别融合多肽的抗体”而言，只要是本领域技术人员，就能够选择适当公知的方法来制备。作为这样的公知的方法，可列举：将包括上述融合多肽的融合点的多肽、包括从上述融合多肽的融合点至N末端侧的区域的多肽、或包括从上述融合多肽的融合点至C末端侧的区域的多肽接种于免疫动物，使该动物的免疫系统活化之后，回收该动物的血清(多克隆抗体)的方法、杂交瘤法、重组DNA法、噬菌体展示法等单克隆抗体的制作方法。也可以利用市售的抗体。另外，如果使用结合有标记物质的抗体，则通过检测该标记，能够直接检测标靶蛋白质。作为标记物质，只要能够与抗体结合并能够检测，就没有特别限制，可列举例如：过氧化物酶、β-D-半乳糖苷酶、微过氧化物酶、辣根过氧化物酶(HRP)、异硫氰酸荧光素(FITC)、异硫氰酸罗丹明(RITC)、碱性磷酸酶、生物素和放射性物质等。另外，除使用结合有标记物质的抗体直接检测标靶蛋白质的方法以外，也能够利用使用结合有标记物质的二次抗体、蛋白G或蛋白A等间接地检测标靶蛋白质的方法。

＜基因融合的检测用试剂盒＞

如上所述，能够使用上述引物、探针或抗体、或者它们的组合检测由ATF7IP-PDGFRB基因融合产生的融合多核苷酸或由其所编码的多肽，由此能够检测该基因融合。因此，本发明提供包括下述任一种多核苷酸或抗体或者它们的组合的基因融合(优选作为癌的责任突变(驱动突变)的基因融合)的检测用试剂盒(以下，也称为本发明的试剂盒)：

(A)作为探针的多核苷酸，该探针设计为特异性地识别ATF7IP-PDGFRB融合多核苷酸；

(B)作为一对引物的多核苷酸，该一对引物设计为能够特异性扩增ATF7IP-PDGFRB融合多核苷酸；或者

(C)特异性地识别ATF7IP-PDGFRB融合多肽的抗体。

在本发明的试剂盒中，除多核苷酸、抗体之外，能够适当组合包括检测多核苷酸、抗体中添加的标记所必需的底物、阳性对照(例如ATF7IP-PDGFRB融合多核苷酸、ATF7IP-PDGFRB融合多肽、或保持它们的细胞等)、阴性对照、PCR用试剂、原位杂交等中所使用的对比染色用试剂(DAPI等)、抗体的检测所必需的分子(例如二次抗体、蛋白G、蛋白A)、用于试样的稀释、清洗的缓冲液等。在本发明的试剂盒中，也能够包括使用说明书。通过使用本发明的试剂盒，能够容易地实施上述本发明的检测方法。

本发明的检测方法和检测用试剂盒能够检测作为癌的责任突变新发现的基因融合，如后所述，在鉴定该基因融合的阳性例并应用个体化医疗方面是非常有用的。

＜鉴定癌患者或存在患癌风险的被检测者的方法＞

据认为ATF7IP-PDGFRB基因融合为癌的责任突变，通过PDGFRB激酶活性的稳定活化，参与癌的恶化等。因此，在检测到这种基因融合的癌患者中，利用抑制由通过该基因融合而产生的融合多核苷酸所编码的多肽的表达和/或活性的物质进行治疗，有效的可能性高。

因此，本发明提供一种鉴定癌患者或存在患癌风险的被检测者的方法，其中，该癌患者或存在患癌风险的被检测者是抑制由通过作为癌的责任突变(驱动突变)的基因融合产生的融合多核苷酸所编码的多肽的表达和/或活性的物质能带来治疗效果的该癌患者或存在患癌风险的被检测者(以下，也称为本发明的鉴定方法)。

本发明的鉴定方法包括下述的工序：

(1)检测来自被检测者的分离得到的试样中包括ATF7IP的SETDB1结合结构域以及PDGFRB的跨膜结构域和激酶结构域并且具有激酶活性的ATF7IP-PDGFRB融合多肽或者由其所编码的多肽的工序；以及

(2)在检测到上述融合多核苷酸或者由其所编码的多肽的情况下，判定为抑制上述多肽的表达和/或活性的物质在上述被检测者中能带来治疗效果的工序。

在本发明的鉴定方法中，“癌患者或存在患癌风险的被检测者”为患有癌的、或怀疑患有癌的某种哺乳动物，优选为人类。作为应用本发明的鉴定方法的对象的“癌”，只要是能够检测到ATF7IP-PDGFRB基因融合的癌，就没有特别限定，优选为白血病，进一步优选为急性成淋巴细胞性白血病(ALL)，特别优选为B祖细胞性急性成淋巴细胞性白血病(B-ALL)。

在本发明的鉴定方法中，“治疗效果”是指癌治疗的效果，只要是对患者有益的效果，就没有特别限定，可列举例如：肿瘤缩小效果、无增恶生存时间延长效果、生命延长效果等。

在本发明的鉴定方法中，关于ATF7IP-PDGFRB基因融合，作为评价癌治疗的有效性的对象的“抑制由作为癌的责任突变(驱动突变)的基因融合产生的融合多核苷酸所编码的多肽的表达和/或活性的物质”(以下，也称为本发明的鉴定方法中的对象物质)，只要是直接或间接地抑制ATF7IP-PDGFRB融合多肽的表达和/或其功能的物质，就没有特别限定。

作为抑制ATF7IP-PDGFRB融合多肽的表达的物质，可列举例如抑制ATF7IP-PDGFRB融合多肽的表达的siRNA(small interferingRNA，小干扰RNA)、shRNA(short hairpin RNA，小发夹RNA)、miRNA(micro RNA，微小RNA)、反义核酸、可表达这些多核苷酸的表达载体、低分子化合物等。

作为抑制ATF7IP-PDGFRB融合多肽的功能的物质，可列举例如：抑制PDGFRB激酶活性的物质(例如低分子化合物等)、与ATF7IP-PDGFRB融合多肽结合的抗体等。

这些物质既可以是特异性地抑制ATF7IP-PDGFRB融合多肽的表达和/或活性的物质，也可以是也抑制野生型PDGFRB蛋白的表达和/或活性的物质。作为这种物质的具体例，可列举作为抑制PDGFRB激酶活性的物质(即酪氨酸激酶抑制剂)的甲磺酸伊马替尼(imatinibmesylate)(GLEEVEC(注册商标))、达沙替尼、尼洛替尼、帕纳替尼、乐伐替尼(Rebastinib)、巴氟替尼(Bafetinib)等，优选达沙替尼。

这些物质能够基于本说明书中所公开的ATF7IP-PDGFRB融合多核苷酸和/或ATF7IP-PDGFRB融合多肽的序列信息等、利用自身公知的方法制备。另外，也可以利用市售的物质。

在来自被检测者的分离得到的试样中检测到ATF7IP-PDGFRB融合多核苷酸或由其所编码的多肽的情况下，这些物质对该被检测者而言作为癌治疗剂是有效的。

本发明的鉴定方法中的工序(1)能够与上述本发明的检测方法中所包括的工序同样地实施。

在本发明的鉴定方法中的工序(2)中，在工序(1)中来自被检测者(即癌患者或存在患癌风险的被检测者)的分离得到的试样中检测到融合多核苷酸或由其所编码的多肽的情况下，判定为本发明的鉴定方法中的对象物质对上述被检测者能带来治疗效果，另一方面，在没有检测到融合多核苷酸或由其所编码的多肽的情况下，判定为本发明的鉴定方法中的对象物质对上述被检测者带来治疗效果的可能性低。

根据本发明的鉴定方法，从癌患者或存在患癌风险的被检测者中检测作为癌的责任突变新发现的基因融合的阳性例，能够鉴定出抑制由通过该基因融合而产生的融合多核苷酸所编码的多肽的表达和/或活性的物质能带来治疗效果的癌患者或存在患癌风险的被检测者，本发明在能够进行适于这样的对象的治疗方面是有用的。

＜癌的治疗方法和癌治疗剂＞

如上所述，通过本发明的鉴定方法，鉴定抑制由通过ATF7IP-PDGFRB基因融合而产生的融合多核苷酸所编码的多肽的表达和/或活性的物质能带来治疗效果的癌患者。因此，通过对癌患者中的保持该融合基因的患者选择性地投与该物质，能够有效地进行癌的治疗。因此，本发明提供一种癌的治疗方法，包括对通过上述本发明的鉴定方法判定为该物质能带来治疗效果的被检测者投与该物质的工序(以下，也称为本发明的治疗方法)。

另外，由于在本发明的治疗方法中投与的物质作为癌治疗剂起作用，因此，本发明还提供将抑制由通过ATF7IP-PDGFRB基因融合而产生的融合多核苷酸所编码的多肽的表达和/或活性的物质作为有效成分的癌治疗剂(以下，也称为本发明的癌治疗剂)。

在本发明的治疗方法和癌治疗剂中，癌只要是ATF7IP-PDGFRB基因融合阳性癌，就没有特别限定，优选为白血病，进一步优选为急性成淋巴细胞性白血病(ALL)，特别优选为B祖细胞性急性成淋巴细胞性白血病(B-ALL)。在此，ATF7IP-PDGFRB基因融合阳性癌是指利用本发明的检测方法检测到ATF7IP-PDGFRB融合多核苷酸或由其所编码的多肽的癌。

作为本发明的癌治疗剂，可列举上述关于本发明的鉴定方法中，作为抑制由通过ATF7IP-PDGFRB基因融合而产生的融合多核苷酸所编码的多肽的表达和/或活性的物质而记载的物质。

本发明的癌治疗剂能够使用这些在制剂化通常使用的药理学上能接受的载体、赋形剂和/或其它添加剂，作为医药组合物制备。

本发明的癌治疗剂的给药方法可以按照该抑制剂的种类和癌的种类等适当选择，例如能够采用口服、静脉内、腹腔内、经皮、肌肉内、气管内(气溶胶)、直肠内、阴道内等的给药方式。

本发明的癌治疗剂的给药量能够考虑有效成分的活性和种类、给药方式(例如口服、非口服)、患病的严重程度、作为给药对象的动物种类、给药对象的药物感受性、体重、年龄等适当确定。

本发明的治疗方法和癌治疗剂使具有以往未知的由本申请发明发现的特定的癌的责任突变的患者的治疗成为可能，因此是有用的。

＜癌治疗剂的筛选方法＞

本发明提供对具有ATF7IP-PDGFRB基因融合的癌患者能带来治疗效果的癌治疗剂的筛选方法(以下，也称为本发明的筛选方法)。通过本发明的筛选方法，能够得到抑制ATF7IP-PDGFRB融合多肽的表达和/或活性的物质作为癌治疗剂。

供于本发明的筛选方法的被检测物质可以为任何化合物或组合物，可列举例如：核酸(例如核苷、寡核苷酸、多核苷酸)、糖质(例如单糖、二糖、寡糖、多糖)、脂质(例如饱和或不饱和的包括直链、支链和/或环的脂肪酸)、氨基酸、蛋白质(例如寡肽、多肽)、低分子化合物、化合物文库、随机肽文库、天然成分(例如来自微生物、动植物、海洋生物等的成分)、或食品等。

本发明的筛选方法只要能够评价被检测物质是否抑制ATF7IP-PDGFRB融合多肽的表达和/或活性，则可以为任意形态。典型而言，本发明的筛选方法包括下述的工序：

(2)确定是否抑制上述融合多肽的表达和/或活性的工序；以及

在工序(1)中，使被检测物质与表达ATF7IP-PDGFRB融合多肽的细胞接触。作为对照，可以使用不含被检测物质的溶剂(例如DMSO等)。该接触可以在培养基中进行。培养基根据所使用的细胞的种类等适当选择，例如为含有约5～20％的胎牛血清的最低必需培养基(MEM)、Dulbecco改良最低必需培养基(DMEM)、RPMI1640培养基、199培养基等。另外，培养条件也可以根据所使用的细胞的种类等适当确定，例如，培养基的pH为约6～约8，培养温度为约30～约40℃，培养时间为约12～约72小时。

作为表达ATF7IP-PDGFRB融合多肽的细胞，可列举例如内在表达该融合多肽的来自癌组织的细胞、由该细胞所诱导的细胞株、通过基因工程制作的细胞株等，但并不限定于这些。某种细胞是否表达ATF7IP-PDGFRB融合多肽也能够利用上述本发明的检测方法来确认。另外，细胞通常为哺乳动物的细胞，优选为人类的细胞。

在工序(2)中，确定是否抑制上述融合多肽的表达和/或活性。融合多肽的表达可以通过使用公知的分析方法、例如，RNA印迹法、定量PCR法、免疫印迹法、ELISA法等来确定细胞中的mRNA水平或蛋白质水平来进行测定。另外，融合多肽的活性也能够利用公知的分析方法(例如激酶活性测定等)进行测定。将得到的测定值与不接触被检测物质的对照细胞中的测定值进行比较。测定值的比较优选基于有无显著差异来进行。与被检测物质接触的细胞中的测定值与对照比较显著降低的情况下，能够确定为该被检测物质抑制融合多肽的表达和/或活性。

或者，表达这些融合多肽的细胞由于增殖亢进，因此，能够将该细胞的增殖作为本工序中用于确定的指标。该情况下，首先，测定与被检测物质接触的该细胞的增殖。细胞增殖的测定能够利用细胞计数、³H胸腺嘧啶脱氧核苷的摄入、BRDU法等自身公知的方法进行。其次，将与被检测物质接触的该细胞的增殖与不接触被检测物质的对照细胞的增殖进行比较。增殖水平的比较优选基于有无显著差异来进行。不接触被检测物质的对照细胞的增殖相对于与被检测物质接触的细胞的增殖的测定，可以为预先测定所得的值，也可以为同时测定所得的值，但从实验的精度、再现性的观点考虑，优选为同时测定所得的值。比较的结果，在与被检测物质接触的该细胞的增殖得到抑制的情况下，能够确定该被检测物质抑制融合多肽的表达和/或活性。

在工序(3)中，将在工序(2)中确定为抑制融合多肽的表达和/或活性的被检测物质选择作为癌治疗剂。

如上所述，根据本发明的筛选方法，能够获得能够适用于治疗具有以往未知的癌的责任突变的患者的癌治疗剂。

＜分离得到的融合多肽或其片段、以及编码它们的多核苷酸＞

本发明提供包括ATF7IP的SETDB1结合结构域以及PDGFRB的跨膜结构域和激酶结构域并且具有激酶活性的、分离得到的ATF7IP-PDGFRB融合多肽(以下，也称为本发明的融合多肽)或其片段。

本说明书中，“分离得到的”物质是指：在某种物质从天然存在的环境(例如生物体的细胞内)的其它物质(优选生物学因子)(例如其为核酸的情况下，为核酸以外的因子和包括目标核酸以外的核酸序列的核酸；其为蛋白质的情况下，为蛋白质以外的因子和包括作为目标蛋白质以外的氨基酸序列的蛋白质等)中实质分离或精制得到的物质。本说明书中“分离得到的”是指具有优选75重量％以上、更优选85重量％以上、更进一步优选95重量％以上、最优选96重量％以上、97重量％以上、98重量％以上、99重量％以上、或100％的纯度。在“分离得到的”多核苷酸及多肽中，包括通过标准的精制方法精制得到的多核苷酸和多肽，另外，也包括化学合成的多核苷酸和多肽。

“片段”是指本发明的融合多肽的片段，由包括融合点的上游和下游的序列的连续的部分序列构成。该部分序列中所包括的融合点的上游的序列包括距融合点1个氨基酸残基以上(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100个氨基酸残基以上)，也可以包括直至本发明的融合多肽的N末端。该部分序列中所包括的融合点的下游的序列包括距融合点1个氨基酸残基以上(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100个氨基酸残基以上)，也可以包括直至本发明的融合多肽的C末端。片段的长度没有特别限定，通常为8个氨基酸残基以上(例如9、10、11、12、13、14、15、20、25、50、100个氨基酸残基以上)。

另外，本发明的融合多肽例如可以为下述的分离得到的融合多肽。

(i)由序列号2或4所示的氨基酸序列构成的多肽，

对本发明的融合多肽有关的各词语的含义与上述＜具体的癌的责任突变＞中所记载的各词语的含义相同。

另外，本发明提供编码上述本发明的融合多肽或其片段的分离得到的多核苷酸(以下，也称为本发明的多核苷酸)。本发明的多核苷酸可以为mRNA、cDNA和基因组DNA的任一种。另外，可以为双链，也可以为单链。

编码ATF7IP-PDGFRB融合多肽的cDNA的典型例为由序列号1或3所示的碱基序列构成的多核苷酸。

本发明的多核苷酸能够利用自身公知的方法来制得。例如，能够由从保持ATF7IP-PDGFRB融合多核苷酸的癌组织等制备的cDNA文库或基因组文库中利用公知的杂交技术来提取。另外，也能够通过将从上述癌组织等制备的mRNA、cDNA或基因组DNA作为模板，使用公知的基因扩增技术(PCR)进行扩增来制备。另外，也能够将来自ATF7IP-PDGFRB融合多核苷酸的5’末端侧和3’末端侧的部分的野生型基因的cDNA作为材料，利用PCR、限制性内切酶处理、定点突变诱导(site-directed mutagenesis)法(Kramer,W.&Fritz,HJ.,MethodsEnzymol,1987,154,350.)等公知的基因扩增技术、重组技术来制备。

本发明的融合多肽或其片段也能够利用自身公知的方法来制得。例如，通过将如上述那样制备的多核苷酸插入适当的表达载体，将该载体导入于无细胞蛋白质合成体系(例如网织红细胞提取液、小麦胚芽提取液)进行孵育，或者通过将该载体导入适当的细胞(例如大肠杆菌、酵母、昆虫细胞、动物细胞)，将由此得到的转化体进行培养，能够制备本发明的融合多肽。

本发明的融合多肽或其片段能够作为本发明的检测方法等中的标记使用，另外，也能够用于制作针对本发明的融合多肽的抗体等。

实施例

以下，基于实施例，更具体地说明本发明，但本发明并不限定于以下的实施例。

实施例1

＜样品＞

从由300例的儿童白血病(急性成淋巴细胞性白血病)的患儿得到的白血病细胞中使用miRNeasy mini kit(QIAGEN公司制)提取总RNA。此外，该研究是得到本研究相关组织的伦理审查委员会的承认而进行的。

＜RNA测序＞

用于RNA测序的cDNA文库按照制造者的操作说明书，使用TruSeq RNA sample preparation kit v2Set B(Illumina公司制)进行制备。总RNA序列的分析利用新一代测序仪(HiSeq1000Illumina)用双末端法进行。

＜融合转录产物的检测＞

融合转录产物的检测使用作为癌细胞中的融合基因检测专用的算法的DeFuse(http://sourceforge.net/apps/mediawiki/defuse/index.php？title＝DeFuse)来进行。

＜RT-PCR、桑格测序＞

从由被检测者的白血病细胞中提取的总RNA、使用ReverTra Ace(注册商标)qPCR RT Master Mix(东洋纺株式会社制)合成cDNA。将得到的cDNA供于使用rTaq DNA Polymerase(东洋纺株式会社制)的PCR扩增。通过琼脂糖凝胶电泳确认目标尺寸的基因片段的扩增。将所扩增的基因片段在pGEM-T easy载体(PROMEGA公司制)上进行TA克隆。将该载体上的多克隆位点的5’侧的T7序列和3’侧的SP6序列用作引物，使用BigDye(R)Terminator v3.1Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystems公司制)和ABI 3130xl Genetic Analyzer(AppliedBiosystems公司制)确定碱基序列。

本实施例记载关于白血病细胞中的新型融合转录产物的鉴定。

为了鉴定能够作为治疗标靶的新型融合转录产物，进行从300例的儿童白血病(急性成淋巴细胞性白血病)的患儿得到的白血病细胞的转录组分析。

分析由RNA测序得到的Paired-end Read，结果在1个例子中，如图1所示，鉴定了被认为是由染色体转座(t(5；12))产生的新型融合基因ATF7IP-PDGFRB。

进而，对检测出ATF7IP-PDGFRB基因的检体，使用下述引物进行RT-PCR，将得到的PCR产物进行序列分析，由此确认该新型融合基因的表达(图2和图3)。

正向引物：CAAGTGGACCATCTCAGACCAC(序列号11)

反向引物：ATTTAAGCATCTTGACGGCCAC(序列号12)

ATF7IP-PDGFRB基因是存在于染色体12p13.1的ATF7IP基因与存在于染色体5q33.1的PDGFRB基因的融合基因。

由以上的结果显示：通过利用RT-PCR的特异性条带的扩增的有无的检查或PCR产物的碱基序列确定，能够检测在实施例1中所发现的基因融合。

另外ATF7IP-PDGFRB基因阳性例中的基因表达图谱虽然显示类似于Ph-like phenotype、即作为儿童白血病的预后不良亚群的BCR-ABL融合基因阳性白血病(Ph1-ALL)的基因表达方式，但是，显示检测不出BCR-ABL融合基因的特性，因此，ATF7IP-PDGFRB基因阳性例被认为是作为急性成淋巴细胞性白血病的预后不良的特别的亚群。因此，通过检测ATF7IP-PDGFRB基因，显示能够鉴定以往未知的ALL的预后不良亚群的可能性。

实施例2

本实施例记载关于对具有ATF7IP/PDGFRB转座的复发性Ph-like急性成淋巴细胞性白血病(ALL)的患者的酪氨酸激酶抑制剂(TKI)达沙替尼单剂疗法。

病例报道

在2011年2月，8岁的男童出现标准风险ALL的症状。该男童成功地结束了导入疗法和巩固化疗，但是虽然在诊断的26个月后接受了维持化疗法，仍旧复发。通过荧光原位杂交(FISH)和RT-PCR分析这两者证明具有ATF7IP/PDGFRB，确认了原始的克隆复活(图4A)。复发的8个月前的RT-PCR的结果，关于微小残留病变(minimumresidual disease(MRD))显示否定的结果(Kobayashi K,et al.,Br JHaematol,2014,165,836-841)，因此，认识到利用RT-PCR的分子监测用于预测早期复发的灵敏度不充分。因此，决定确立其它MRD监测途径，进行基因组定位，寻找ATF7IP/PDGFRB的转座内的融合序列。确定ATF7IP的内含子13与PDGFRB的外显子10之间的基因组上的切断点，确立将白血病特异性DNA指纹作为标靶的引物对。特别值得关注的是，即使为来自在诊断的18个月后得到的缓解样品，也容易检测到了白血病特异性DNA序列(图4A)。该情况暗示：基于基因组PCR的MRD监测即使在以非常低的水平检测到的情况下，也成为早期复发的强有力的预测手段。

复发性的母细胞对使用地塞米松、长春新碱、阿糖胞苷、甲氨蝶呤和L-天门冬酰胺酶的ALL型操作程序显示完全的无感受性。接着，进行了使用依托泊苷、阿糖胞苷和米托葸醌的缓解再诱导(re-induction)AML型方案(Tsukimoto I,et al.,J Clin Oncol,2009,27,4007-4013)。3个疗程的治疗后，实现了细胞遗传学上的缓解，但MRD依然在定量的范围内被检出。该男童在全身照射(12Gy)同时连续地接受紧接着使用依托泊苷(-第四天为50mg/kg/日)和马法兰(Melphalan)(-第三天和-第二天为70mg/m²/日)的清髓性预处理方案的脐带血干细胞移植(CBSCT)。之后的临床经过如果基于RT-PCR分析，则伴随大的分子的相应而平稳无事，但融合特异性白血病DNA序列在最初诊断的34个月后还在基因组PCR中检测到。用于预测复发的MRD的截止值几乎为未知；但是，如在以前的临床分析中所证明的那样，由于在分子学上的缓解样品中还存在白血病DNA，所以暗示该患者存在引起复发的高风险。因此，为了根除MRD，决定开始作为第二代TKI的达沙替尼的给药(66mg/m²/日)。治疗反应迅速，根据白血病特异性基因组PCR分析，则MRD在3个月以内消失(图4A)。该男童维持了分子学上的完全缓解至少12个月。

为了确认TKI单剂疗法对Ph-like ALL的临床效果，需要进行具备耐久性的灵敏度和特异性的纵向疾病监测。实际上为了TKI的治疗监测一般使用疾病特征的融合转录产物、即BCR/ABL、的RT-PCR分析(Hughes T,et al.,Blood,2006,108,28-37)，但为RT-PCR阴性，也显示与CML中的临床效果不直接相关(Chu S,et al,Blood,2011,118,5565-5572)。为了开发对血液恶性肿瘤的个体化治疗，MRD的详细的分析不仅对诊断，而且对TKI疗法的正当化也很重要。关于该点，留意暗示以融合部的DNA序列为标靶的基因组PCR在成人的CML患者中与以往的RT-PCR相比灵敏度更高的证据最近增加是特别重要的(Mattarucchi E,et al.,J Mol Diagn,2009,11,482-487；Bartley PA,et al.,Int J Lab Hematol,2010,32,e222-228)，但BCP-ALL中其临床的意义几乎为未知。因此，使用在各时刻由该患者得到的17个样品，进行了RT-PCR和基因组PCR之间的MRD检测灵敏度的成对比较(图4B)。在MRD水平能够以PCR检测的定量的范围检测到的11个样品中，在2个方法之间在结果中看到明确的相关。另一方面，在4个样品中看到结果的不一致；即，即使为来自RT-PCR的结果为阴性的分子学上的缓解样品，也检测到白血病DNA。对照而言，没有发现MRD在RT-PCR中为阳性但在基因组PCR中为阴性的样品。因此，可以认为有如下的可能性：RT-PCR与基因组PCR分析之间的结果不一致与其说是由样品的变异造成的，不如说大部分是由检测灵敏度的差异造成的。另外，从转录沉默(特别是伴随静止细胞状态的转录沉默)或参与mRNA分解的可能性等理由出发，可以推测为通过RT-PCR研究的融合转录产物水平与残存白血病细胞数的关联性低(Shibata Y,et al.,Genomemedicine,2010,2,70-)。对照而言，各白血病细胞含有一个拷贝的融合DNA序列，因此，基因组PCR与白血病细胞数的测定值直接关联。DNA比RNA稳定，另外，不需要逆转录工序，因此，基于DNA的MRD分析如在本案中所示那样，也能够促进追溯调查。另外，Pagani等报道了在长期TKI治疗中，以RT-PCR为阴性的CML患者的30％以上中能够检测出融合特异性DNA(Pagani IS,et al.,Oncoscience,2014,1,510-521)。在该报道中，强调了将BCR/ABL基因组切断点作为标靶的基因组PCR在TKI疗法中可与用于CML患者的长期监测的现有技术并用。因此，综合包括本实施例在内的这些认识，表明将融合序列作为标靶的基因组PCR可被用作用于接受TKI疗法的Ph-like ALL患者的MRD监测的可靠性高的技术之一。

考察

TKI的出现不仅对CML患者、而且对Ph-like ALL等其它稀少种类的儿童血液恶性肿瘤的患者，也提高了显著的治疗效果(Roberts KG,et al.,N Engl J Med,2014,371,1005-1015；Weston BW,et al.,J ClinOncol,2013,31,e413-416；Lengline E,et al.,Haematologica,2013,98,e146-148)。另外，具有PDGFRB融合基因的骨髓恶性肿瘤的患者对作为TKI的甲磺酸伊马替尼应答而显示优异的治疗效果，不产生二次耐受性，10年总生存率为90％，特别值得关注(Cheah CY,et al.,Blood,2014,123,3574-3577)。因此，可以认为聚焦于PDGFRB融合基因等分子标靶的伴随诊断能够促进用于儿童的将来的个体化癌治疗。

实施例3

本实施例记载关于ATF7IP-PDGFRB融合激酶诱导细胞的转化。

材料和方法

试剂

使用作为TKI的伊马替尼、达沙替尼、尼洛替尼(LC Laboratories、Woburn、MA、USA)、帕纳替尼、乐伐替尼(Rebastinib)和巴氟替尼(Bafetinib)(Selleck、Houston、TX、USA)。有丝分裂原活化蛋白激酶(MEK)抑制剂PD98059和磷脂酰肌醇3-激酶(PI3激酶)抑制剂LY294002从Merck Millipore(Darmstadt、Germany)购入。

质粒构建

野生型(WT-)PDGFRB的cDNA从Promega Corporation(Madison、WI、USA)作为Flexi(注册商标)ORF克隆pF1KB7023(Kazusa Clonecp01083)购入。使用Sfg I和Pme I进行消化之后，使用T4DNA聚合酶进行平滑末端化，由此将编码区域进行分离。利用rTaq聚合酶(Toyobo Co.、Ltd.、大阪、日本)在3’末端添加突出dATP之后，将WT-PDGFRB cDNA在pGEM-T easy或pGEM-T(Promega)中的任一种上在反向(从SP6位点至T7位点)进行亚克隆。

用于研究的临床材料的使用由组织的伦理审查委员会承认，从双亲或监护人获得知情同意。将ATF7IP-PDGFRB嵌合基因中所包括的ATF7IP cDNA的5’部分由保持融合基因的患者的临床试样，使用以下的引物分成3个部分ATF7IP-1、ATF7IP-2及ATF7IP-3，通过使用KODplus ver.2(Toyobo)的PCR进行扩增：

ATF7IP-1正向(Fwd)

5’-TTCAGAATGGACAGTTTAGAAGAACCTCAG-3’(序列号13)、

ATF7IP-1反向(Rev)

5’-TCTGCTGGAGAGCACGTTTC-3’(序列号14)、

ATF7IP-2Fwd

5’-AAGCTTGCACCTTCTGAGGATGA-3’(序列号15)、

ATF7IP-2Rev

5’-ATCGGATCTCGTAACGTGGC-3’(序列号16)、

ATF7IP-PDGFRB-3Fwd

5’-TGGTCCTCTCTGATGAAGAGGATATTTC-3’(序列号17)、和

ATF7IP-PDGFRB-3Rev

5’-TCATCGTGGCCTGAGAATGG-3’(序列号18)。

如上所述，将在3’末端添加有突出dATP的各PCR产物如以前所报道的那样(Tomita et al.,2014,Leukemia Research,38,361-370)，在pGEM-T easy(Promega)上在正向(从T7位点至SP6位点)进行亚克隆。为了得到全长ORF的ATF7IP-PDGFRB cDNA，通过将分别使用Not I/Pmi I、Not I/Afi I和Not I/Cla I的组合进行了消化的ATF7IP-3、ATF7IP-2和ATF7IP-1的cDNA片段连续地连接而亚克隆在pGEM-T-WT-PDGFRB上。

同样地，将EBF1cDNA的5’部分使用引物EBF1-PDGFRB Fwd5’-ATGTTTGGGATTCAGGAAAGCATCC-3’(序列号19)和EBF1-PDGFRB Rev 5’-ATGCGGTAACCCCGTTTGAT-3’(序列号20)进行扩增，在pGEM-T easy上进行亚克隆。全长ORF的EBF1-PDGFRBcDNA通过EBF1cDNA的Sph I(平滑化)和Bam HI片段与pGEM-T-WT-PDGFRB的NdeI(平滑化)和Bam HI片段的连接而得到。

为了得到逆转录病毒表达载体，将嵌合基因的各cDNA的全长插入片段使用Sph I(平滑化)和Not I进行消化，亚克隆到pRetroX Tight(Clontech Laboratories、Inc.、Madison、WI、USA)的Nru I和Not I部位。WT-PDGFRB的情况下，将cDNA的全长插入片段通过Eco RI消化进行分离，亚克隆到pRetroX Tight的Eco RI部位。

ATF7IP-PDGFRB、EBF1-PDGFRB和WT-PDGFRB基因的表达如以前所报道的那样(Iijima et al.,2012,Eur J Immunol,42,3405-3415)，通过使用rTaq聚合酶(Toyobo)的PCR，从由用各基因转染的Ba/F3细胞制备的cDNA使其扩增。使用以下的引物：

ATF7IP-PDGFRB detection Fwd-1

5’-CGTGAATGTAACACATCGTCCA-3’(序列号21)、

ATF7IP-PDGFRB detection Rev-1

5’-AGCTCCCACGTGGAGTCATAG-3’(序列号22)、

EBF1-PDGFRBdetection Fwd-1

5’-GGGCGTGAATTCGTTCAGTG-3’(序列号23)、

EBF1-PDGFRB detection Rev-1

5’-ATCGGATCTCGTAACGTGGC-3’(序列号24)、

WT-PDGFRB detection Fwd-1

5’-TCCAGCACCTTCGTTCTGAC-3’(序列号25)、和

WT-PDGFRB detection Rev-1

5’-CCAGAAAAGCCACGTTGGTG-3’(序列号26)。

作为内部标准，也使用小鼠β-肌动蛋白(Agilent Technologies、SantaClara、CA、USA)的检测用引物组。

细胞、细胞培养和转染

Ba/F3细胞和WEHI-3细胞(理化学研究所资源中心(RIKENBioresource Center)、筑波郡、茨城、日本)如以前所报道的那样(Tomitaet al.,2014,Leukemia Research,38,361-370)进行维持。Ba/F3细胞的情况下，如以前所报道的那样(Tomita et al.,2014,Leukemia Research,38,361-370)，为了进行维持而添加来自具有IL-3的WEHI-3细胞株的10％(vol/vol)条件培养基。

能够诱导嵌合基因的细胞株基本而言如以前所报道的那样(Iijimaet al.,2012,Eur J Immunol,42,3405-3415)，通过利用使用Retro-X^TMTet-On(注册商标)Advanced Inducible Expression System和Retro-X^TMUniversal Packaging System(Clontech)的逆转录病毒转染来制备。在该系统中，使用保持新霉素耐性基因的Tet-on Advanced载体和保持嘌呤霉素耐性基因的pRetroX Tight表达载体。使导入有Tet-onAdvanced载体的6×10⁵个Ba/F3细胞在合计3mL的培养基中被含有ATF7IP-PDGFRB或EBF1-PDGFRB的任一种的pRetroX Tight的逆转录病毒进一步感染，暴露10小时。接着，将细胞清洗并分成两份，与用于药剂选择的新霉素和嘌呤霉素同时，使用或不使用1μg/mL的脱氧土霉素(DOX)进行处理，诱导目标蛋白的表达。孵育24小时之后，将细胞再次清洗，除去WEHI-3条件培养基。将进行了各处理的细胞的一半为了进行细胞增殖检测而连续涂三个平板，将剩余的一半依次供于药物选择。接着，通过重复3次有限稀释，将稳定的耐性细胞进行克隆化，在以下的实验中使用。由于不能IL-3非依赖性地增殖，因此，除一直存在WEHI-3条件培养基以外，同样地进行，制作具有WT-PDGFRB或作为Mock的空载体的转染子。

细胞增殖检测

将嵌合基因-转染子和Mock Ba/F3细胞用RPMI-1640培养基清洗2次，在含有或不含各种试剂的96孔板(每1孔2.5×10⁴个细胞/0.1mL)上各连续分注三次，在附图所示的期间，在37℃进行培养。细胞增殖如以前所报道的那样(Yamada et al.,2013,Int J Hematol,97,73-82)，使用水溶性四唑盐(WST)检测(Cell Counting Kit-8、Dojindo、熊本、日本)进行分析。在数据分析中使用F检验。将低于0.05的P值设为显著。全部的实验至少进行3次，算出平均值和SEM。

流式细胞仪分析和免疫细胞化学

凋亡细胞的出现率使用MEBCYTO(注册商标)Apoptosis Kit(Medical and Biological Laboratories、名古屋、日本)进行定量，接着，如以前所报道的那样(Tomita et al.,2014,Leukemia Research,38,361-370)，按照制造者的操作说明书进行分析。

关于免疫细胞化学，使用PerFix-nc Kit(Beckman Coulter,Inc.、Indianapolis IN、USA)按照制造者的操作说明书来处理细胞，使用兔单克隆抗PDGFRB抗体(Ab)(Cell Signaling Technology,Inc.、Danvers、MA、USA)和Alexa Fluor(注册商标)546山羊抗兔IgG(LifeTechnologies、Waltham、MA、USA)的组合进行染色。将细胞载置于载玻片上，使用Fluoroshield Mounting Medium with DAPI(Immunobioscience Corp.、Mukilteo、WA、USA)进行4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)对比染色，通过DeltaVision Elite(GE Healthcare LifeSciences、Buckinghamshire、UK)进行可视化。

免疫印迹和免疫沉淀

免疫印迹分析如以前所报道的那样(Kiyokawa et al.,1997,J BiolChem,272,18656-18665；Tomita et al.,2014,Leukemia Research,38,361-370)，使用以下的抗体而进行：抗磷酸化酪氨酸(4G10；MerckMillipore)、抗PDGF受体β(28E1)、抗磷酸化-PDGF受体βTyr751(C63G6)、抗磷酸化-PDGF受体βTyr 771(76D6)、抗磷酸化-PDGF受体βTyr1009(42F9)、抗磷酸化-PDGF受体βTyr1021(6F10)、抗磷酸化-p44/42MAPK(ERK1/2、Tyr202/Tyr204)、抗磷酸化-p38MAPK(Thr180/Tyr182)、抗磷酸化-JNK(Thr183/Tyr185、81E11)、抗磷酸化-AKT(Ser473)、抗磷酸化-PLCγ1(Tyr783)、抗Casitas B-lineagelymphoma binding(Cbl)、抗p38MAPK抗体、和抗JNK抗体(CellSignaling Technology)；抗ATF7IP(MCAF1)(Abcam、Cambridge、UK)；抗ERK、抗PLCγ(BD Biosciences、San Jose、CA、USA)；抗β肌动蛋白(Sigma-Aldrich、St.Louis、MO)；辣根过氧化物酶(HRP)结合二次抗体(Dako、Glostrup、Denmark)。如以前所报道的那样(Kiyokawa et al.,1997,J Biol Chem,272,18656-18665)，将各细胞裂解液的50-μg样品在SDS聚丙烯酰胺凝胶上通过电泳进行分离，转印到硝化纤维素膜(Amersham Hybond-ECL；GE Healthcare)上。使用一次抗体和二次抗体的适当的组合对膜进行孵育，并清洗，然后使用enhanced chemiluminescence reagent system(ECL)和Western BlottingDetection Reagents(GE)进行检测(Kiyokawa et al.,1997,J Biol Chem,272,18656-18665)。

PDGFRB和嵌合蛋白如以前所报道的那样(Kiyokawa et al.,1997,JBiol Chem,272,18656-18665)，从由各Ba/F3转染子制备的1mg的细胞裂解液中，使用适当的抗体和蛋白G-琼脂糖(F.Hoffmann-La RocheLtd.、Basel、Schweiz)的组合进行免疫沉淀。将免疫沉淀物在SDS聚丙烯酰胺凝胶上进行分离，接着，使用附图所示的适当的组合，如上所述进行免疫印迹分析。

结果

PDGFRB关联嵌合分子的导入诱导Ba/F3细胞的IL-3非依赖性的增殖，但WT-PDGFRB分子的导入不诱导Ba/F3细胞的IL-3非依赖性的增殖

首先，利用四环素诱导性基因表达系统，研究了嵌合分子的表达是否在Ba/F3细胞中引起IL-3非依赖性的增殖。使用ATF7IP-PDGFRB-表达载体的转染之后，将Ba/F3细胞以有DOX或无DOX进行处理，接着，除去含有IL-3的WEHI-3条件培养基。如图5A所示，用DOX进行了处理的Ba/F3转染子的一部分在不存在条件培养基时生存并增殖，另一方面，没有用DOX进行处理的Ba/F3转染子不存在条件培养基则不能生存；因此，能够迅速地选择出ATF7IP-PDGFRB-转染子。对照而言，进行了空载体(Mock)转染的Ba/F3细胞与DOX处理无关，没有条件培养基则不能生存。同样地，将EBF1-PDGFRB进行了转染的Ba/F3细胞也在DOX处理后显示IL-3非依赖性的增殖，与此相对，在WT-PDGFRB中看不到DOX处理后的IL-3非依赖性的增殖(未显示数据)。进一步确认了将转染子进行克隆化之后，ATF7IP-PDGFRB和EBF1-PDGFRB转染子在含有IL-3的条件培养基的非存在下显示细胞增殖，与此相对，进行了空载体转染的Ba/F3细胞仅在条件培养基的存在下能够增殖(图5B)。PDGFRB关联嵌合的转染子的增殖速度与在条件培养基的存在下增殖的亲代Ba/F3细胞同等(未显示数据)。WT-PDGFRB的情况下，转染子即使存在作为配体的PDGFBB，也是没有条件培养基则不能生存(图5B)。有趣的是，就PDGFBB的添加而言，通过WST和膜联蛋白V检测进行评价的情况下，可以部分地延长条件培养基的非存在下的WT-PDGFRB转染子的生存(图5C和图5D)。

接着，确认了上述效果实际上由导入的PDGFRB关联嵌合分子介导。如图6A和图6B所示，在各转染子中，分别利用RT-PCR和免疫印迹分析观察适当的mRNA和蛋白质表达。如图6C所示，免疫细胞化学解明了ATF7IP-PDGFRB嵌合蛋白的细胞质定位。

在Ba/F3细胞中由PDGFRB关联嵌合分子所介导的细胞内信号转导

接着，评价由PDGFRB关联嵌合分子的表达引起的IL-3非依赖性的细胞增殖的分子基础。由于PDGFRB为受体酪氨酸激酶，因此，研究了细胞蛋白和PDGFRB关联嵌合分子自身的酪氨酸磷酸化状态。如图7A所示，与Mock细胞比较，在表达ATF7IP-PDGFRB或EBF1-PDGFRB的Ba/F3细胞中，细胞内蛋白质被酪氨酸磷酸化。WT-PDGFRB的情况下，PDGFBB的刺激诱导WT-PDGFRB蛋白的酪氨酸磷酸化。也研究了位于PDGFRB上的特定的残基的酪氨酸磷酸化。如图7B所示，ATF7IP-PDGFRB和EBF1-PDGFRB的两者的Tyr751、Tyr771、Tyr1009和Tyr1021残基被磷酸化。另外，WT-PDGFRB上的相同的酪氨酸残基在PDGFBB刺激之后被磷酸化(图7B)。

接着，研究了位于PDGFRB的下游的分子的磷酸化。进行磷酸化时，PDGFRB上的Tyr751残基能够进行PI3激酶和Nckβ的结合和活化(Kazlauskas et al.,1992,Mol Cell Biol,12,2534-2544；Panayotou et al.,1992,EMBO J,11,4261-4272；Nishimura et al.,1993,Mol Cell Biol,13,6889-6896)。与PDGFRB上的Tyr751磷酸化一致，作为PI3激酶的下游分子的AKT的Ser473、以及作为Nckβ的下游分子的c-Jun N末端激酶(JNK)和p38MAPK的各个Thr183/Tyr185和Thr180/Tyr182在通过免疫印迹分析进行评价的情况下，与Mock细胞比较，在导入有ATF7IP-PDGFRB或EBF1-PDGFRB的Ba/F3细胞中被磷酸化(图8)。在导入有WT-PDGFRB的Ba/F3细胞中，AKT的相同的丝氨酸残基在用PDGFBB刺激之后被磷酸化(图8)。同样地，PDGFRB上的Tyr771残基的磷酸化能够进行RasGap的结合和活化(Kashishian et al.,1992,EMBO J,11,1373-1382；Kazlauskas et al.,1992,Mol Cell Biol,12,2534-2544)。与PDGFRB上的Tyr771残基的磷酸化一致，作为Ras信号传导通路的下游分子的p44/42MAP激酶(Erk1/2)的Ser217/Ser221残基的磷酸化水平与受到了PDGFBB刺激的WT-PDGFRB同样地，在具有2种类型的PDGFRB关联嵌合激酶中的任一种的Ba/F3细胞中，都看到磷酸化水平的增加(图8)。与使PLC-γ活化的PDGFRB上的Tyr1009和1021磷酸化(Reddi et al、2007)一致，PLC-γ上的Tyr783残基在具有PDGFRB关联嵌合的Ba/F3转染子中被磷酸化。有趣的是，表达WT-PDGFRB的细胞中的PLC-γ上的相同的残基的磷酸化即使在用PDGFBB刺激之后也不显著(图8)。

Ba/F3细胞中的c-CBL的磷酸化和c-CBL对PDGFRB的结合

如图6B所示，WT-PDGFRB的免疫印迹分析解明了，与PDGFBB刺激无关地，出现WT-PDGFRB蛋白的预料尺寸以外的、更低分子量的几个出乎意料的条带，另一方面，关于ATF7IP-或EBF1-PDGFRB的任一种的相同实验对各嵌合激酶显示特有的条带。报道有包括PDGFRB的生长因子受体被认为是受到配体结合介导多聚遍在蛋白化，在有丝分裂原信号转导中起到负的调节作用(Mori et al.,1993,JBiol Chem,268,577-583；Waterman et al.,1999,J Biol Chem,274,22151-22154)，由此，上述观察结果显示Ba/F3细胞中的WT-PDGFRB的多聚遍在蛋白化。另外，c-Cbl在PDGFRB的遍在蛋白化中有责任(Miyake et al.,1999,J Biol Chem,274,16619-16628)，另一方面，报道有作为在骨髓增殖性肿瘤(MPN)中被检测出的PDGFRB关联融合蛋白的ETV6-PDGFRB能够避免c-Cbl诱导性遍在蛋白化和分解(ToffaliniF et al.,2009,Haematologica,94,1085-1093)。因此，研究了嵌合PDGFRB蛋白和c-Cbl之间的关联。如图9所示，得知：免疫沉淀和免疫印迹分析在ATF7IP-和EBF1-PDGFRB的两者、以及用PDGFBB刺激的WT-PDGFRB中，c-Cbl的酪氨酸残基被磷酸化。另一方面，看到c-Cbl蛋白对PDGFBB刺激后的WT-PDGFRB的显著的结合，与此相对，ATF7IP-和EBF1-PDGFRB仅显示c-Cbl蛋白的限定的结合(图9)。该数据显示：受到配体刺激时，WT-PDGFRB将c-Cbl活化，接着受到多聚遍在蛋白化，与此相对，ATF7IP-和EBF1-PDGFRB由c-Cbl构成性地磷酸化，但不与c-Cbl结合。

由ATF7IP-PDGFRB所介导的Ba/F3细胞IL-3非依赖性的增殖中的MAP激酶和AKT的作用

由于显示ATF7IP-PDGFRB将MAP激酶和AKT进行磷酸化，因此，研究了MEK和PI3激酶的抑制剂对表达ATF7IP-PDGFRB的Ba/F3细胞的IL-3非依赖性的增殖的效果。如图10A所示，AKT抑制剂LY294002在表达ATF7IP-PDGFRB的Ba/F3细胞和Mock表达Ba/F3细胞的两者中诱导细胞死亡。有趣的是，MEK抑制剂PD98059仅在表达ATF7IP-PDGFRB的Ba/F3细胞中诱导细胞死亡，在Mock表达Ba/F3细胞中不诱导。进一步确认了：通过同时添加含有IL3的条件培养基，部分地避免表达ATF7IP-PDGFRB的Ba/F3细胞中的MEK抑制剂诱导性细胞死亡(图10B)。另外，进一步确认了：通过免疫印迹进行评价的情况下，利用MEK抑制剂PD98059的处理使MAP激酶的磷酸化显著减少(图11)。同样地，利用PI3激酶抑制剂LY294002的处理使AKT的磷酸化明显减少(图11)。

也研究了由WT-PDGFRB所介导的MAP激酶和AKT的磷酸化的动力学。如图12所示，使IL-3枯竭的表达WT-PDGFRB的Ba/F3细胞的PDGFBB引起的刺激诱导MAP激酶和AKT的两者的短暂性但显著的磷酸化，虽然使PDGFBB持续地存在，但是，该磷酸化仍以时间依赖性的方式减少。在含有IL-3的条件培养基的存在下，条件培养基自身诱导MAP激酶和AKT的磷酸化，因此，两蛋白的磷酸化在PDGFBB刺激后，某种程度上被延长(图12)。

TKI对表达PDGFRB关联嵌合分子的Ba/F3细胞的生存的效果

接着，研究了TKI对表达ATF7IP-PDGFRB的Ba/F3细胞的IL-3非依赖性的增殖的效果。将表达ATF7IP-PDGFRB的Ba/F3细胞暴露于伊马替尼或达沙替尼的情况下，细胞增殖以浓度依赖性的方式显著地被抑制，能够存活的细胞数在与25nM的浓度的伊马替尼或2.5nM的浓度的达沙替尼的48小时的孵育之后，减少至低于10％(图13)。在24小时的孵育中，相对于表达ATF7IP-PDGFRB的Ba/F3细胞的伊马替尼的IC50的计算值为45.6nM，关于表达BCR-ABL的Ba/F3细胞，与在以前的文献(Tomita et al.,2014,Leukemia Research,38,361-370)中所推定的600nM相比，大幅度降低。另外，也研究了含有尼洛替尼、巴氟替尼(Bafetinib)、乐伐替尼(Rebastinib)和帕纳替尼的其它新一代TKI的效果。如图13所示，各TKI有效地使表达ATF7IP–PDGFRB的Ba/F3细胞的能够存活的细胞数减少。同样地，表达EBF1-PDGFRB的Ba/F3细胞也对TKI显示显著的感受性(图13)。进而确认了：在通过免疫印迹分析进行评价的情况下，在用TKI处理后的表达ATF7IP-或EBF1-PDGFRB的Ba/F3细胞中，MAP激酶和AKT、以及PDGFRB的磷酸化实际上减少(图14)。

考察

在本实施例中，得知ATF7IP-PDGFRB的表达诱导Ba/F3细胞中的IL-3非依赖性的增殖，该情况与在MPN中检测到的EBF1-PDGFRB和其它PDGFRB关联融合激酶(Carroll M et al.,1996,Proc Natl Acad SciU S A,93,14845-14850；Wilbanks AM et al.,2000,ExperimentalHematology,28,584-593；Toffalini F et al.,2010,J Biol Chem,285,12268-12278；Roberts KG et al.,2012,Cancer Cell,22,153-166)的情况同样地，显示ATF7IP-PDGFRB的转化能力。本实施例的数据显示：ATF7IP-PDGFRB在酪氨酸残基中构成性地被磷酸化，将含有AKT、PLC-γ、MAP激酶、p38MAP激酶和JNK的下游的分子活化。进而得知：AKT和MAP激酶的活化为Ba/F3细胞的IL-3非依赖性生存所必需的。另一方面，本实施例的数据也解明了：被导入Ba/F3细胞的WT-PDGFRB对IL-3非依赖性的生存不充分，而利用PDGFBB的刺激使Ba/F3细胞部分地摆脱了因通过除去IL-3而诱导的凋亡导致的细胞死亡。

作为ATF7IP-PDGFRB的构成性的活化机制，据认为是c-Cbl介导遍在蛋白化的调节解除(Toffalini F et al.,2009,Haematologica,94,1085-1093)参与了其活化。通过与配体的结合而被活化的PDGFRB和其它受体酪氨酸激酶将c-Cbl迅速地磷酸化而活化，导致受体酪氨酸激酶的c-Cbl介导多聚遍在蛋白化，充分地证实其为用于被活化的生长因子受体的自我下调的必需的过程(Miyake S et al.,1999,J Biol Chem,274,16619-16628；Yokouchi M et al.,1999,J Biol Chem,274,31707-31712)。与以前的报道一致，在Ba/F3转染子中，看到WT-PDGFRB的显著的片段化，但不能看到ATF7IP-PDGFRB或EBF1-PDGFRB的片段化。另外，在Ba/F3转染子中，利用PDGFBB的刺激之后，看到c-Cbl对WT-PDGFRB的结合的增加，另一方面，没有看到c-Cbl对ATF7IP-PDGFRB或EBF1-PDGFRB的显著的结合。该数据暗示：利用配体的WT-PDGFRB的活化通过诱导c-Cbl介导遍在蛋白化而被自我限定，因此，不能完全支持IL-3非依赖性的细胞生存。另一方面，构成性地被活化的ATF7IP-和EBF1-PDGFRB将c-Cbl蛋白磷酸化，但不与c-Cbl结合，因此，可以避免遍在蛋白化(ToffaliniF et al.,2009,Haematologica,94,1085-1093)。由ATF7IP-和EBF1-PDGFRB所介导的下游的分子的持续的活化有可能对于Ba/F3细胞的IL-3非依赖型的生存是重要的。

对ATF7IP-PDGFRB中产生的c-Cbl介导遍在蛋白化的调节解除的机制，考虑了几种解释。例如，Toffalini和共同研究者报道了融合蛋白TEL-PDGFRB和FIP1L1-PDGFRA如野生型受体那样不插入质膜而存在于细胞质中，因此，它们的遍在蛋白化的缺乏与它们的定位的变化有关(Toffalini F et al.,2009,Haematologica,94,1085-1093)。另一方面，在本实施例中，在导入有ATF7IP-或EBF1-PDGFRB的Ba/F3细胞中看到了PLC-γ的显著的磷酸化，但在导入有WT-PDGFRB的细胞中，即使通过PDGFBB刺激，也没有看到磷酸化。报道有c-Cbl和PLC-γ对作为对接(docking)部位的Tyr1021残基进行竞争，相互排斥地被PDGFRB活化(Reddi AL et al.,2007,J Biol Chem,282,29336-29347)，因此，ATF7IP-PDGFRB优先将PLC-γ活化，因此，有可能利用相互排斥的效果而避开与c-Cbl的结合，避免c-Cbl介导遍在蛋白化。

如本实施例中所示，PI3激酶抑制剂在导入有ATF7IP-PDGFRB的细胞和利用含有IL-3的WEHI-3条件培养基维持的Mock细胞的两者中导致细胞死亡，该情况显示：在两者的情况下，由AKT所介导的信号为细胞生存所必需的。对照而言，MEK抑制剂在导入有ATF7IP-PDGFRB的细胞中导致细胞死亡，但在Mock细胞中不导致细胞死亡，该情况显示由ATF7IP-PDGFRB所诱导的细胞生存信号与生长因子引起的细胞生存信号的差异，另外暗示在ATF7IP-PDGFRB介导细胞转化中MAP激酶介导信号更为重要。一种可能的解释是，IL-3受体能够将用于MAP激酶级联以外的细胞生存的代替通路同时活化，但PDGFRB不能。或者，PDGFRB不仅诱导MAP激酶，而且也诱导介导凋亡信号的p38MAP激酶和JNK的两者，因此，MAP激酶介导抗凋亡信号有可能对于克服在生长因子非依赖性的细胞增殖中由p38MAP激酶和JNK所介导的凋亡信号是必需的，另一方面，IL-3受体有可能将调节由p38MAP激酶和JNK所介导的上述凋亡信号的其它通路活化。为什么生长因子受体将由MAP激酶所介导的生存信号和由p38MAP激酶和JNK所介导的凋亡信号的两者同时活化并不清楚(Yu J etal.,2000,J Biol Chem,275,19076-19082)，有可能为生长因子受体活化的其它自我调节机制。

重要的是，本实施例的数据也实证：表达ATF7IP-PDGFRB的Ba/F3细胞对于包括伊马替尼、达沙替尼和其它新一代TKI的TKI显示高的感受性。伊马替尼的IC50的推定值与BCR-ABL1的推定值相比大幅度降低。该结果与报道了伊马替尼对于PDGFRB重组的白血病患者的有效性的、其他人的临床发现一致(Weston BW et al.,2013,J Clin Oncol,31,e413-416；Lengline E et al.,2013,Haematologica,98,e146-48；CheahCY et al.,2014,Blood,123,3574-3577)。TKI能够有效地抑制PDGFRB的激酶活性，使细胞生存所必需的AKT和MAP激酶的活化降低。重组的PDGFRB激酶对于TKI的高的感受性，在治疗上考虑在PDGFRB重组的ALL的患者中使用TKI的方面是重要的。

如上所述，ATF7IP-PDGFRB和EBF1-PDGFRB迄今为止仅在ALL患者中发现，但其它PDGFRB融合基因仅在骨髓性肿瘤中发现，该情况的准确的机制还不清楚，但暗示了PDGFRB的嵌合伴侣与产生中的肿瘤的系统之间的选择性。有趣的是，Tomasson和共同研究者报道了在小鼠BMT模型中TEL-PDGFRB在骨髓整体中的导入引起了迅速导致死亡的骨髓增殖性疾病，而该融合基因的酪氨酸残基579/581的苯丙氨酸突变使T细胞淋巴瘤发病(Tomasson MH et al.,2000,J Clin Invest,105,423-432)。嵌合伴侣的差异能够产生对产生中的肿瘤的分化系列确定有影响的PDGFRB激酶结构域的构象的差异。期待ATF7IP-PDGFRB选择性对ALL产生的机制的阐明。

作为结论，ATF7IP-PDGFRB具有转化能力，与BCR-ABL1相比，显示对TKI的显著的感受性。本实施例的结果与临床所见一致，显示TKI对具有PDGFRB关联嵌合激酶的BCP-ALL的亚群(subset)的治疗上的有用性。另外，嵌合PDGFRB激酶介导细胞转化的分子基础的进一步阐明将会提供对由PDGFRB转座所引起的血液恶性肿瘤的治疗上的新的战略。

产业上的可利用性

根据本发明，能够检测作为癌的责任突变的新发现的基因融合，能够鉴定抑制由通过该基因融合而产生的融合多核苷酸所编码的多肽的表达和/或活性的物质能带来治疗效果的癌患者或存在患癌风险的被检测者，进而能够进行适于这样的癌患者的治疗(个体化医疗)。

序列表自由文本

序列号1和序列号3：ATF7IP-PDGFRB融合多核苷酸

序列号2和序列号4：ATF7IP-PDGFRB融合多肽

序列号5和序列号7：ATF7IP cDNA

序列号6和序列号8：ATF7IP多肽

序列号9：PDGFRB cDNA

序列号10：PDGFRB多肽

序列号11：正向引物

序列号12：反向引物

序列号13：ATF7IP-1Fwd

序列号14：ATF7IP-1Rev

序列号15：ATF7IP-2Fwd

序列号16：ATF7IP-2Rev

序列号17：ATF7IP-PDGFRB-3Fwd

序列号18：ATF7IP-PDGFRB-3Rev

序列号19：EBF1-PDGFRB Fwd

序列号20：EBF1-PDGFRB Rev

序列号21：ATF7IP-PDGFRB detection Fwd-1

序列号22：ATF7IP-PDGFRB detection Rev-1

序列号23：EBF1-PDGFRB detection Fwd-1

序列号24：EBF1-PDGFRB detection Rev-1

序列号25：WT-PDGFRB detection Fwd-1

序列号26：WT-PDGFRB detection Rev-1

Claims

1.一种基因融合的检测方法，其特征在于，包括：

检测来自被检测者的分离得到的试样中的具有激酶活性的ATF7IP-PDGFRB融合多肽或编码其的融合多核苷酸的工序，所述ATF7IP-PDGFRB融合多肽包括ATF7IP的SETDB1结合结构域以及PDGFRB的跨膜结构域和激酶结构域。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，融合多肽为下述(i)～(iii)中的任一种：

(i)由序列号2或4所示的氨基酸序列构成的多肽，

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，融合多核苷酸为下述(i)～(iv)中的任一种：

(i)由序列号1或3所示的碱基序列构成的多核苷酸，

(ii)与由与序列号1或3所示的碱基序列所构成的多核苷酸互补的碱基序列构成的多核苷酸在严格条件下杂交、并且编码具有激酶活性的多肽的多核苷酸，

4.如权利要求1～3中任一项所述的方法，其特征在于：

基因融合为癌的责任突变(驱动突变)。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于：

癌为急性成淋巴细胞性白血病。

6.一种鉴定抑制多肽的表达和/或活性的物质能带来治疗效果的癌患者或存在患癌风险的被检测者的方法，所述多肽由作为癌的责任突变(驱动突变)的基因融合产生的融合多核苷酸所编码，该方法的特征在于，包括下述的工序：

(1)检测来自被检测者的分离得到的试样中的包括ATF7IP的SETDB1结合结构域以及PDGFRB的跨膜结构域和激酶结构域并且具有激酶活性的ATF7IP-PDGFRB融合多肽、或编码其的融合多核苷酸的工序；和

(2)在检测到所述融合多肽、或编码其的融合多核苷酸的情况下，判定为抑制所述多肽的表达和/或活性的物质在所述被检测者中能带来治疗效果的工序。

7.一种基因融合的检测用试剂盒，其特征在于，含有下述(A)～(C)中的任一种多核苷酸或抗体或者它们的组合：

(A)作为探针的多核苷酸，所述探针设计为特异性地识别ATF7IP-PDGFRB融合多核苷酸；

(B)作为一对引物的多核苷酸，所述一对引物设计为能够特异性扩增ATF7IP-PDGFRB融合多核苷酸；或者

(C)特异性地识别ATF7IP-PDGFRB融合多肽的抗体。

8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于：

基因融合为癌的责任突变(驱动突变)。

9.包括ATF7IP的SETDB1结合结构域以及PDGFRB的跨膜结构域和激酶结构域并且具有激酶活性的、分离得到的ATF7IP-PDGFRB融合多肽或其片段。

10.编码权利要求9所述的融合多肽或其片段的多核苷酸。

11.一种ATF7IP-PDGFRB基因融合阳性癌的治疗剂。

12.如权利要求11所述的治疗剂，其特征在于：

包含抑制ATF7IP-PDGFRB融合多肽的表达和/或活性的物质作为有效成分，所述ATF7IP-PDGFRB融合多肽包括ATF7IP的SETDB1结合结构域以及PDGFRB的跨膜结构域和激酶结构域并且具有激酶活性。

13.如权利要求11或12所述的治疗剂，其特征在于：

癌为急性成淋巴细胞性白血病。

14.如权利要求11～13中任一项所述的治疗剂，其特征在于：

抑制包括ATF7IP的SETDB1结合结构域以及PDGFRB的跨膜结构域和激酶结构域并且具有激酶活性的ATF7IP-PDGFRB融合多肽的表达和/或活性的物质为抑制PDGFRB激酶活性的物质。

15.如权利要求14所述的治疗剂，其特征在于：

抑制PDGFRB激酶活性的物质为甲磺酸伊马替尼、达沙替尼、尼洛替尼、帕纳替尼、乐伐替尼或巴氟替尼。

16.如权利要求14所述的治疗剂，其特征在于：

抑制PDGFRB激酶活性的物质为达沙替尼。

17.一种癌治疗剂的筛选方法，其特征在于，包括下述的工序：

(2)确定是否抑制所述融合多肽的表达和/或活性的工序；以及

(3)将确定为抑制所述融合多肽的表达和/或活性的物质选择作为癌治疗剂的工序。