JP2011515088A - 増殖因子シグナル伝達経路レギュレーション状態を評価するための方法及び遺伝子発現サイン - Google Patents
増殖因子シグナル伝達経路レギュレーション状態を評価するための方法及び遺伝子発現サイン Download PDFInfo
- Publication number
- JP2011515088A JP2011515088A JP2011500943A JP2011500943A JP2011515088A JP 2011515088 A JP2011515088 A JP 2011515088A JP 2011500943 A JP2011500943 A JP 2011500943A JP 2011500943 A JP2011500943 A JP 2011500943A JP 2011515088 A JP2011515088 A JP 2011515088A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- genes
- growth factor
- signaling pathway
- factor signaling
- subject
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
- C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
-
- G—PHYSICS
- G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
- G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
- G16B25/00—ICT specially adapted for hybridisation; ICT specially adapted for gene or protein expression
- G16B25/10—Gene or protein expression profiling; Expression-ratio estimation or normalisation
-
- G—PHYSICS
- G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
- G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
- G16B40/00—ICT specially adapted for biostatistics; ICT specially adapted for bioinformatics-related machine learning or data mining, e.g. knowledge discovery or pattern finding
-
- G—PHYSICS
- G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
- G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
- G16B40/00—ICT specially adapted for biostatistics; ICT specially adapted for bioinformatics-related machine learning or data mining, e.g. knowledge discovery or pattern finding
- G16B40/20—Supervised data analysis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/106—Pharmacogenomics, i.e. genetic variability in individual responses to drugs and drug metabolism
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/112—Disease subtyping, staging or classification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/158—Expression markers
-
- G—PHYSICS
- G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
- G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
- G16B25/00—ICT specially adapted for hybridisation; ICT specially adapted for gene or protein expression
Abstract
細胞サンプルまたは被験者中の増殖因子経路シグナル伝達のレギュレーション状態を評価するための方法、バイオマーカー及び発現サインが開示されている。より具体的には、本発明の幾つかの態様は、サンプル中の増殖因子経路デレギュレーション状態を評価するために;細胞サンプルをデレギュレートまたはレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路を有しているとして分類するために;物質がサンプル中の増殖因子シグナル伝達経路をモジュレートするかを調べるために;被験者の増殖因子シグナル伝達経路をモジュレートする物質に対する応答を予測するために;被験者に対して治療を割り当てるためにに;及び増殖因子経路シグナル伝達をレギュレートするように設計された癌治療の薬力学的効果を予測し、評価するためにバイオマーカー及び遺伝子サインとして使用され得る遺伝子の集合を提供する。
Description
本明細書は、全文参照により本明細書に組み入れる配列表を含む。
治療に最も応答しそうな患者部分集団を同定することは現代分子医学の主要な目的である。この概念は、承認されている及び実験的治療が多数あるために(Rothenbergら,2003,Nat.Rev.Cancer,3:303−309)、多くの現在の治療に対する応答率が低いために、第1治療サイクルにおいて最適治療を使用することが臨床上重要であるために(Dracopoli,2005,Curr.Mol.Med.,5:103−110)癌にとって特に重要である。加えて、現在市販されている細胞傷害剤は狭い治療指数及び重大な毒性プロファイルが伴っている結果、正確に応答を予測することが緊急に必要とされている。最近の研究により細胞傷害性化学療法に対する応答に関連する遺伝子発現サインが同定されたが(Folgueriaら,2005,Clin.Cancer Res.,11:7434−7443;Ayersら,2004,22:2284−2293;Changら,2003,Lancet,362:362−369;Rouzierら,2005,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,102:8315−8320)、これらの例(及び文献からの他の遺伝子発現サイン)は未確認のままであり、まだ臨床実地に対して大きな効果を有していない。標準の技術的プラットフォームがなく、臨床サンプルの採取を取り巻く困難のような技術的問題に加えて、細胞傷害性化学療法により影響される無数の細胞プロセスがこれらの物質に対する応答の実際的でロバストな遺伝子発現予測子の同定を妨害する恐れがある。1つの例外は、微小管結合タンパク質TauのmRNA発現が低いとパクリタキセルに対する向上した応答が予測されるというマイクロアレイによる最近の所見である(上記のRouzierら)。
細胞傷害性化学療法に対する限界を改良するために、腫瘍学における薬物設計に対する現在のアプローチは腫瘍増殖及び生存のために重要な特殊な細胞シグナル伝達経路をモジュレートすることを目指している(Hahn and Weinberg,2002,Nat.Rev.Cancer,2:331−341;Hanahan and Weinberg,2000,Cell,100:57−70;Troskoら,2004,Ann.N.Y.Acad.Sci.,1028:192−201)。癌細胞において、これらの経路はデレギュレートされるようになり、その結果異常なシグナル伝達、アポトーシスの抑制、より多い転移及びより多い細胞増殖が生ずる(Adjei and Hildalgo,2005,J.Clin.Oncol.,23:5386−5403において精査されている)。正常細胞は制御された成長及び増殖のために複数のシグナル伝達経路を統合しているが、腫瘍は1つまたは2つの経路の活性化に頼り切っているようである(“癌遺伝子活性化”)。慢性骨髄性白血病のBCR−ABLに対する公知の依存に加えて、上皮増殖因子受容体及びMYC経路の研究から1つの重要な癌遺伝子の不活化が細胞死または正常表現型を有する細胞への分化が誘導され得ることが判明した(Lynchら,2004,N.Engl.J.Med.,350:2129−2139;Paezら,2004,Science,304:1497−1500;Weinstein,2002,Science,297:63−64;Jainら,2002,Science,297:102−104;Gorreら,2001,Science,293:876−880;Drukerら,2001,N.Engl.J.Med.,344:1031−1037)。異常なシグナル伝達経路の成分は新しい抗癌治療に対する魅力的で選択的な標的に相当する。加えて、標的治療に対する応答者の同定は、特定の経路により“推進される”腫瘍を有している患者は前記経路の成分を標的とする治療に応答することが論理的と思われるので、細胞傷害剤についての同定よりもより達成され得るであろう。従って、我々はいずれの経路がいずれの腫瘍において活性であるかを同定するための方法を開発し、この情報を用いて治療決定を導くことが極めて重大である。これを可能にする1つの方法は経路活性化状態を示す遺伝子発現プロファイルを同定することである。
腫瘍中の経路活性化を評価するための現在の方法は薬物標的、公知の癌遺伝子または公知の腫瘍サプレッサーの測定を含む。しかしながら、1つの経路は複数のポイントで活性化され得、公知の癌関連遺伝子を評価することにより経路活性化を評価することは常に実行可能でない(Downard,2006,Nature,439:274−275)。この状況を説明するために、ホスファチジルイノシトール3−キナーゼ(PI3K;図1)を介するシグナル伝達を考えたい。この経路は受容体チロシンキナーゼを介して複数の増殖因子により活性化され、細胞増殖及び生存、転移コンピテンス及び治療耐性を含めた複数のプロセスに影響を与える。PI3Kシグナル伝達はしばしばヒト癌において活性化され、多くの製薬会社が1つ以上の経路成分のインヒビターを開発している(Hennessyら,2005,Nat.Rev.Drug Discov.,4:988−1004)。従って、PI3K経路活性化を正確に決定することはこうした開発中の新規治療薬に対する潜在的応答者を同定するために重要であろう。
しかしながら、PI3K経路は複数のポイントで異常により活性化され得、経路活性を評価することは簡単ではない恐れがある(Cullyら,2006,Nat.Rev.Cancer,6:184−192)。例えば、PI3Kそれ自体が癌においてしばしば変異を受けている。PI3K体細胞ミスセンス変異はHER2増幅ホルモン受容体陽性乳癌で一般的であり、PI3K変異/増幅は卵巣癌、胃癌、肺癌、脳腫瘍等で見られる(Bachmanら,2004,Cancer Biol.Ther.,3:772−775;Samuelsら,2004,Science,304:554;Campbellら,2004,Cancer Res.,64:7678−7681;Mizoguchiら,2004,Brain Pathol.,14:372−377;Shayestehら,1999,Nat.Genet.,21:99−102;Woenckhausら,2002,J.Pathol.,198:335−342)。加えて、RASにおける活性化変異は膵臓癌及び肺癌で起こり(Johnson and Heymach,2004,Clin.Cancer Res.,10:4254−4257)、結腸直腸癌における最近の大規模な配列決定プロジェクトによりPDK1中の新規な珍しい変異が最近同定された(Parsonsら,2005,Nature,436:792)。最後に、AKT(活性化、増幅)及びPTEN(変異、欠失、後成的不活性化)も多くのヒト癌においてデレギュレートされている(Altomareら,2003,J.Cell Biochem.,88:470−476;Ruggeriら,1998,Mol.Carcinog.,21:81−86;Chengら,1996,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,93:3636−3641;Staalら,1987,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84:5034−5037;Liら,2005,World J.Gastroenterol.,11:285−288;Liら,1997,Science,275:1943−1947;Goelら,2004,64:3014−3021)。PI3K経路活性化は臨床サンプル中のPTENまたはリン酸化AKTレベルを免疫組織化学的に分析することにより評価され得るが(Slipicevicら,2005,Am.J.Clin.Pathol.,124:528−536)、これは経路活性化を調べるための最適方法ではない場合がある。これらのアッセイには免疫組織化学の技術的限界があり、定量的でない。加えて、発癌経路は複雑であり(例えば、RASシグナル伝達はPI3K活性化の一因となる)、よって重要な経路メディエータが少数の十分に特徴づけられている成分のみを試験するだけでは見逃される恐れがある。こうした手段によりPI3K経路活性化を調べる難しさは、個々の経路成分をばらばらに分析したときに文献に報告されている整合していない結果により反映されている(Saalら,2005,Cancer Res.,65:2554−2559;Panigrahiら,2004,J.Pathol.,204:93−100)。
Rothenbergら,2003,Nat.Rev.Cancer,3:303−309
Dracopoli,2005,Curr.Mol.Med.,5:103−110
Folgueriaら,2005,Clin.Cancer Res.,11:7434−7443
Ayersら,2004,22:2284−2293
Changら,2003,Lancet,362:362−369
Rouzierら,2005,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,102:8315−8320
Hahn and Weinberg,2002,Nat.Rev.Cancer,2:331−341
Hanahan and Weinberg,2000,Cell,100:57−70
Troskoら,2004,Ann.N.Y.Acad.Sci.,1028:192−201
Adjei and Hildalgo,2005,J.Clin.Oncol.,23:5386−5403
Lynchら,2004,N.Engl.J.Med.,350:2129−2139
Paezら,2004,Science,304:1497−1500
Weinstein,2002,Science,297:63−64
Jainら,2002,Science,297:102−104
Gorreら,2001,Science,293:876−880
Drukerら,2001,N.Engl.J.Med.,344:1031−1037
Downard,2006,Nature,439:274−275
Hennessyら,2005,Nat.Rev.Drug Discov.,4:988−1004
Cullyら,2006,Nat.Rev.Cancer,6:184−192
Bachmanら,2004,Cancer Biol.Ther.,3:772−775
Samuelsら,2004,Science,304:554
Campbellら,2004,Cancer Res.,64:7678−7681
Mizoguchiら,2004,Brain Pathol.,14:372−377
Shayestehら,1999,Nat.Genet.,21:99−102
Woenckhausら,2002,J.Pathol.,198:335−342
Johnson and Heymach,2004,Clin.Cancer Res.,10:4254−4257
Parsonsら,2005,Nature,436:792
Altomareら,2003,J.Cell Biochem.,88:470−476
Ruggeriら,1998,Mol.Carcinog.,21:81−86
Chengら,1996,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,93:3636−3641
Staalら,1987,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84:5034−5037
Liら,2005,World J.Gastroenterol.,11:285−288
Liら,1997,Science,275:1943−1947;Goelら,2004,64:3014−3021
Goelら,2004,64:3014−3021
Slipicevicら,2005,Am.J.Clin.Pathol.,124:528−536
Saalら,2005,Cancer Res.,65:2554−2559
Panigrahiら,2004,J.Pathol.,204:93−100
このような例から、遺伝子発現の同じサインが経路の複数の成分の活性化により引き出され得るので、経路活性化の遺伝子発現サインに基づく読出し情報は経路活性の1つの指標に頼るよりもより適正であり得ることが示唆される。加えて、複数の遺伝子からの発現データを統合することにより経路活性を定量的に評価することが可能であり得る。経路活性化状態を評価することにより腫瘍を分類するために遺伝子発現サインを使用することに加えて、経路活性化についての遺伝子発現サインは薬力学的バイオマーカーとして、すなわち治療後患者腫瘍または末梢組織において経路抑制をモニターする際に;応答予測バイオマーカーとして、すなわち特定経路を標的化するインヒビターで患者を治療する前にその経路活性レベルが高い腫瘍を有している患者を先を見越して同定する際に;及び早期有効性バイオマーカーとして、すなわち有効性を早期に読出す際にも使用され得る。
本セクションは、本明細書中に開示されている本発明の代表的な多くの各種態様及び実施形態を詳細に記載する。この記載は詳細及び具体性を変えた幾つかの例示的説明にすぎない。これらの実施形態の他の特徴及び作用効果はいろいろな実施例を含めた本明細書中に与えられている追加の記載から明白である。提示されている例は本発明の各種実施形態を実施する際に有用な各種成分及び手法を説明している。これらの例は特許請求されている発明を限定すると、意図されない。本明細書の開示内容に基づいて、当業者は本発明を実施するために有用な他の成分及び手法を同定し、使用することができる。
3.1 序論
本発明の各種実施形態は、その発現パターンが癌細胞の重要な特徴、すなわち増殖因子(PI3K)シグナル伝達経路のデレギュレーションに相関している遺伝子バイオマーカーの集合に関する。幾つかの実施形態では、これらのバイオマーカーの集合は2つの対立する“腕”(表5a及び5b、表9、表11を参照されたい)、すなわち増殖因子(PI3K)経路を介するシグナル伝達が増加するにつれてアップレギュレートされる遺伝子である“アップ”腕及びダウンレギュレートされる遺伝子である“ダウン”腕に分けられ得る。より具体的には、本発明の幾つかの態様は、その発現が患者の腫瘍細胞サンプルの増殖因子シグナル伝達経路のレギュレーション状態に相関し、デレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路を有する腫瘍を、レギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路を有する腫瘍から分類するために使用され得る、遺伝子バイオマーカーの集合を提供する。増殖因子シグナル伝達経路レギュレーション状態は、患者が増殖因子シグナル伝達経路のインヒビターのようなある治療薬に応答する可能性の有用な指標である。治療薬には、PI3KインヒビターのLY249002、ワートマニン及びPX−866;AKTインヒビターの17−AAG、PX316、ミルテホシン及びペリホシン;mTORインヒビターのラパマイシン、CCI1779、デフォロリムスGaud Rad001(Henson and Gibson,2006,Cellular Signalling,18:2089−2097;Hennessyら,2005,Nat.Rev.Drug Disc.,4:988−1004において精査されている)、並びにIGF1Rモノクローナル抗体MK−0646(U.S.特許7,241,444)が含まれるが、これらに限定されない。また、デレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路を有している腫瘍は有糸分裂抑制剤タイプの治療薬(例えば、タキソール、KSPインヒビター、チューブリンインヒビター、キネシンインヒビター、キナーゼ阻害剤)に対して非常に低い応答を示す。本発明の1つの態様で、増殖因子シグナル伝達経路のインヒビターに応答するであろう患者群(予測される応答者)と増殖因子シグナル伝達経路のインヒビターに応答しないであろう患者群(予測される非応答者)を区別し、治療の一般的な方針を決定するための上記バイオマーカーの使用方法を提供する。本発明の別の態様は、その発現が癌を有している被験者中の増殖因子シグナル伝達経路に対する治療薬の薬力学的効果に相関しているバイオマーカーに関する。本発明の更に他の態様では、癌を有している被験者中の増殖因子シグナル伝達経路に対する治療薬の薬力学的効果を調べるための上記バイオマーカーの使用方法及び増殖因子シグナル伝達経路をモジュレートするために治療薬の有効性を順位付けるための上記バイオマーカーの使用方法を提供する。これらのバイオマーカーを含むマイクロアレイ及び前記マイクロアレイの構築方法も提供する。バイオマーカーの各々はヒトゲノム中の遺伝子に対応し、すなわち前記バイオマーカーは遺伝子の全部または一部として同定され得る。最後に、上記バイオマーカーの各々が癌関連状態に相関しているために、バイオマーカーまたは該バイオマーカーがコードするタンパク質は癌に対する薬物の標的になるであろう。
本発明の各種実施形態は、その発現パターンが癌細胞の重要な特徴、すなわち増殖因子(PI3K)シグナル伝達経路のデレギュレーションに相関している遺伝子バイオマーカーの集合に関する。幾つかの実施形態では、これらのバイオマーカーの集合は2つの対立する“腕”(表5a及び5b、表9、表11を参照されたい)、すなわち増殖因子(PI3K)経路を介するシグナル伝達が増加するにつれてアップレギュレートされる遺伝子である“アップ”腕及びダウンレギュレートされる遺伝子である“ダウン”腕に分けられ得る。より具体的には、本発明の幾つかの態様は、その発現が患者の腫瘍細胞サンプルの増殖因子シグナル伝達経路のレギュレーション状態に相関し、デレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路を有する腫瘍を、レギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路を有する腫瘍から分類するために使用され得る、遺伝子バイオマーカーの集合を提供する。増殖因子シグナル伝達経路レギュレーション状態は、患者が増殖因子シグナル伝達経路のインヒビターのようなある治療薬に応答する可能性の有用な指標である。治療薬には、PI3KインヒビターのLY249002、ワートマニン及びPX−866;AKTインヒビターの17−AAG、PX316、ミルテホシン及びペリホシン;mTORインヒビターのラパマイシン、CCI1779、デフォロリムスGaud Rad001(Henson and Gibson,2006,Cellular Signalling,18:2089−2097;Hennessyら,2005,Nat.Rev.Drug Disc.,4:988−1004において精査されている)、並びにIGF1Rモノクローナル抗体MK−0646(U.S.特許7,241,444)が含まれるが、これらに限定されない。また、デレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路を有している腫瘍は有糸分裂抑制剤タイプの治療薬(例えば、タキソール、KSPインヒビター、チューブリンインヒビター、キネシンインヒビター、キナーゼ阻害剤)に対して非常に低い応答を示す。本発明の1つの態様で、増殖因子シグナル伝達経路のインヒビターに応答するであろう患者群(予測される応答者)と増殖因子シグナル伝達経路のインヒビターに応答しないであろう患者群(予測される非応答者)を区別し、治療の一般的な方針を決定するための上記バイオマーカーの使用方法を提供する。本発明の別の態様は、その発現が癌を有している被験者中の増殖因子シグナル伝達経路に対する治療薬の薬力学的効果に相関しているバイオマーカーに関する。本発明の更に他の態様では、癌を有している被験者中の増殖因子シグナル伝達経路に対する治療薬の薬力学的効果を調べるための上記バイオマーカーの使用方法及び増殖因子シグナル伝達経路をモジュレートするために治療薬の有効性を順位付けるための上記バイオマーカーの使用方法を提供する。これらのバイオマーカーを含むマイクロアレイ及び前記マイクロアレイの構築方法も提供する。バイオマーカーの各々はヒトゲノム中の遺伝子に対応し、すなわち前記バイオマーカーは遺伝子の全部または一部として同定され得る。最後に、上記バイオマーカーの各々が癌関連状態に相関しているために、バイオマーカーまたは該バイオマーカーがコードするタンパク質は癌に対する薬物の標的になるであろう。
本発明の他の実施形態では、その発現パターンが癌細胞の別の重要な特徴、すなわちより多くの解糖に相関している遺伝子バイオマーカーの集合(表13)に関する。より具体的には、本発明の幾つかの態様は、その発現が解糖経路活性に相関し且つ高い解糖経路活性を有する腫瘍を高い解糖経路活性を有していない腫瘍または正常細胞サンプルから分類するために使用され得る遺伝子バイオマーカーの集合に関する。高い解糖経路活性は原発性及び転移性癌のほぼ一般的な特性であり、腫瘍を正常細胞サンプルから分類するために使用され得、患者が解糖経路のインヒビターのようなある治療薬に対して応答するであろう可能性の有用な指標であり得る。治療薬にはヘキソキナーゼ阻害剤ロニダミン、3−ブロモピルベート;グルコースアナログ2−デオキシグルコース;イマチニブ;ホスホフルクトキナーゼ阻害剤;ピルベートキナーゼ阻害剤;ピルベートデヒドロゲナーゼキナーゼ阻害剤;オキシチアミン;ゲニステイン;5−チオグルコース;マンノヘプツロース;α−クロロヒドリン;オルニダゾール;グルフォスファミド;ヒ素化合物;オキサメート;ヨードアセテート;ビスホスホネート;ツベルシジン;並びにNa+/K+−ATPアーゼポンプインヒビター(Lopez−Lazaro,2008,Anti−Cancer Agents in Medicinal Chemistry,8:305−312において精査されている)が含まれるが、これらに限定されない。解糖経路バイオマーカーは、患者が増殖因子シグナル伝達経路のインヒビターに応答するであろう可能性の有用な指標でもあり得る。本発明の1つの態様で、解糖経路のインヒビターに応答するであろう患者群(予測される応答者)と解糖経路のインヒビターに応答しないであろう患者群(予測される非応答者)を区別し、治療の一般的方針を決定するための上記バイオマーカーの使用方法を提供する。本発明の別の態様は、その発現が癌を有している被験者中の解糖経路に対する治療薬の薬力学的効果に相関しているバイオマーカーに関する。本発明の更に他の態様で、癌を有している被験者中の解糖経路に対する治療薬の薬力学的効果を調べるための上記バイオマーカーの使用方法及び解糖経路をモジュレートするために治療薬の有効性を順位付けるための上記バイオマーカーの使用方法を提供する。これらのバイオマーカーを含むマイクロアレイ及び前記マイクロアレイの構築方法も提供する。バイオマーカーの各々はヒトゲノム中の遺伝子に対応し、すなわち前記バイオマーカーは遺伝子の全部または一部として同定され得る。最後に、上記バイオマーカーの各々が癌関連状態に相関しているために、バイオマーカーまたは該バイオマーカーがコードするタンパク質は癌に対する薬物の標的になるであろう。
3.2 定義
他の方法で定義されていない限り、本明細書中で使用されている技術用語及び科学用語のすべては本発明が属する業界の当業者が通常理解しているのと同じ意味を有している。
他の方法で定義されていない限り、本明細書中で使用されている技術用語及び科学用語のすべては本発明が属する業界の当業者が通常理解しているのと同じ意味を有している。
本明細書中で使用されている場合、本明細書中に記載されている1個以上の遺伝子に相補的なオリゴヌクレオチド配列は、ストリンジェントな条件下で遺伝子のヌクレオチド配列の少なくとも一部にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドを指す。ハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドは典型的にはヌクレオチドレベルで遺伝子に対して少なくとも約75%の配列同一性、好ましくは約80%または85%の配列同一性、より好ましくは約90%または95%、或いはそれ以上の配列同一性を示す。
「実質的に結合する」は、プローブ核酸と標的核酸間の相補的ハイブリダイゼーションを指し、標的ポリヌクレオチド配列の所望する検出を達成するためにハイブリダイゼーション媒体のストリンジェンシーを低下させることにより調節され得るマイナーミスマッチも包含する。
フレーズ「に対して特異的にハイブリダイズする」は、配列が複合混合物(例えば、全細胞)DNAまたはRNA中に存在するとき分子がストリンジェントな条件下で1つ以上の特定のヌクレオチド配列に対して実質的または部分的に結合、二重鎖形成またはハイブリダイズすることを指す。
「バイオマーカー」は、その発現または発現レベルがある条件下で変化する遺伝子、タンパク質、または前記遺伝子由来のESTを意味する。遺伝子の発現がある条件に相関している場合、その遺伝子は当該条件に対するバイオマーカーである。
「バイオマーカー誘導ポリヌクレオチド」は、バイオマーカー遺伝子から転写されたRNA、そこから産生されるcDNAまたはcRNA、並びにそこから誘導される核酸(例えば、バイオマーカー遺伝子に対応する遺伝子に由来する配列を有する合成核酸)を意味する。
遺伝子マーカーは、遺伝子マーカーの発現が偶然予想される以上に状態、表現型、遺伝子型または臨床的特徴に相関または反相関しているならば、前記した状態、表現型、遺伝子型または臨床的特徴についての「情報」を与える。
本明細書中で使用されている用語「遺伝子」は当業界で理解されている意味を有している。しかしながら、用語「遺伝子」が遺伝子調節配列(例えば、プロモーター、エンハンサー等)及び/またはイントロン配列を含み得ることは当業者に自明であろう。更に、遺伝子の定義がタンパク質をコードせず、むしろtRNAのような機能性RNA分子をコードする核酸への言及を含むことも明白である。明瞭とするために、用語「遺伝子」は一般的にはタンパク質をコードする核酸の一部を指す。この用語は場合により調節配列を包含し得る。この定義は、用語「遺伝子」の非タンパク質コード化発現単位への適用を排除することを意図せず、むしろ多くの場合本明細書中で使用されているこの用語はタンパク質コード化核酸を指すことを明瞭とすることを意図する。幾つかの場合には、遺伝子は転写、またはメッセージ作成または組成に関与する調節配列を含む。他の実施形態では、遺伝子はタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドをコードする転写配列を含む。本明細書中に記載されている学術用語と合わせると、「単離遺伝子」は、他の天然に存在する遺伝子、調節配列、ポリペプチドまたはペプチドコード配列等のような他の配列から実質的に単離された転写核酸、調節配列、コード配列等を含み得る。この点で、用語「遺伝子」はわかりやすくするために転写されたヌクレオチド配列からなる核酸及びその相補体を指すために使用されている。特定実施形態では、転写されたヌクレオチド配列は少なくとも1つの機能性タンパク質、ポリペプチド及び/またはペプチドコード単位を含む。当業者が理解しているように、この機能的用語「遺伝子」はゲノム配列、RNAまたはcDNA配列、或いは遺伝子の非転写部分の核酸セグメントを含めたより小さな工学処理した核酸セグメントを含む。前記した遺伝子の非転写部分には遺伝子の非転写プロモーターまたはエンハンサー領域を含むが、これらに限定されない。より小さな工学処理した遺伝子核酸セグメントは核酸操作技術、タンパク質、ポリペプチド、ドメイン、ペプチド、融合タンパク質、変異体及び/またはその他を用いて発現し得、または発現するように改変され得る。コード領域の5’に位置し、mRNA上に存在する配列は5’非翻訳配列(“5’UTR”)と称される。コード領域の3’または下流に位置し、mRNA上に存在する配列は3’非翻訳配列または(“3’UTR”)と称される。
「有糸分裂インヒビター」は、有糸分裂を抑制する薬物または物質を指す。有糸分裂インヒビターは2つのクラスに分けられ得る。1つのクラスには微小管動態をモジュレートする物質が含まれる。これらの物質はチューブリンに可逆的に結合し、微小管組立及び分解を防止し得る。第2のクラスには、有糸分裂キネシン、キナーゼ、セパラーゼ等のような特定の細胞内標的と相互作用することにより有糸分裂事象を代理で調節する非チューブリン結合物質が含まれる。有糸分裂インヒビターの例は当業界で公知であり、その中にはチューブリンインヒビター(例えば、タキサン、エポチロン、ビンカアルカロイド、コンブレタスタチン、エレウテロビン);キネシンインヒビター(例えば、モナストロール、エナストロン、エナストロール、VS−83、スルホキノボシルアシルグリセロ−ル、イスピネシブ、アドシアスルファート−2);有糸分裂キナーゼ阻害剤(例えば、PLK1インヒビターのワートマニン、スキトネミン、スタウロスポリン、ON−019010、BI−2536);オーロラキナーゼ阻害剤(VX−680、MLN−8054、PHA−680632、PHA−739358、AZD−1152、VX−528、MP−235、ヘスペラジン、ZM−447439);及びセパラーゼ阻害剤(Ivachtchenkoら,2007,Current Cancer Drug Targets,7:766−784において精査されている)が含まれるが、これらに限定されない。
「サイン」は差次的発現パターンを指す。cRNA産物をマイクロアレイ分析において使用するときその発現が検出される個々のユニークなプローブの数として表示され得る。サインはバイオマーカーの特定集合により例示され得る。
「類似値」は比較する2つの事柄の類似度を表す値である。例えば、類似値は、特定の表現型関連バイオマーカーを用いる細胞サンプル発現プロファイルとそのテンプレートに特異的な対照間の全体的類似性(例えば、表現型がデレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路状態のときには“デレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路テンプレート”に対する類似性)を示す数であり得る。類似値は相関係数のような類似性メトリックとして表示され得、或いは単に細胞サンプル発現プロファイルとベースラインテンプレート間の発現レベルの差または表現レベルの差の総計として表示され得る。
本明細書中で使用されている用語「発現レベルを測定する」、「発現レベルを得る」及び「発現レベルを検出する」等は、例えば遺伝子の転写物または遺伝子によりコードされるタンパク質の遺伝子発現レベルを定量する方法、並びに当該遺伝子が少しでも発現するかを判定する方法を含む。よって、必ずしも定量することなく発現の量の「イエス」または「ノー」の結果を与えるアッセイはその用語が本明細書中で使用されているとき「発現を判定する」アッセイである。或いは、測定または得られた発現レベルは、定量値、例えば対照遺伝子または別のサンプル中の同一遺伝子と比較したアップまたはダウン発現の数倍の変化、または発現のlog比、或いはその視覚表示、例えばカラー強度が検出された遺伝子発現の量を表す「ヒートマップ」として表示され得る。増殖因子シグナル伝達経路デレギュレーションを有する腫瘍細胞中で差次的に発現されるとして同定された遺伝子は、所与のサンプル中の遺伝子または複数の遺伝子の発現レベルを検出または定量するための各種の核酸またはタンパク質検出アッセイにおいて使用され得る。遺伝子の発現レベルを検出するための方法の例にはノーザンブロッティング法、ドットまたはスロットドット法、レポーター遺伝子マトリックス(例えば、US5,569,588号を参照されたい)ヌクレアーゼ保護、RT−PCR、マイクロアレイプロファイリング、ディファレンシャルディスプレイ、2Dゲル電気泳動、SELDI−TOF、ICAT、酵素アッセイ、抗体アッセイ等が含まれるが、これらに限定されない。
「患者」はヒトまたは非ヒト動物、好ましくは哺乳動物を意味し得る。
本明細書中で使用されている「被験者」は生物;或いはそこに由来する細胞サンプル、組織サンプルまたは臓器サンプルを指し、その中には例えば培養細胞株、生検、血液サンプルまたは細胞を含有する流体サンプルが含まれる。多くの場合、被験者または被験者に由来するサンプルは複数の細胞型を含む。1つの実施形態では、サンプルは例えば腫瘍及び正常細胞の混合物を含む。1つの実施形態では、サンプルは少なくとも10%、15%、20%、…、90%または95%の腫瘍細胞を含む。生物は動物であり得、その動物には非限定的にウシ、ブタ、マウス、ラット、家兎、ネコ、イヌ等の動物が含まれ、通常ヒトのような哺乳動物である。
本明細書中で使用されている用語「経路」は、産物または活性を生ずる2つ以上の連続的分子相互作用に関与するシステム成分の集合を意味すると意図される。経路は各種の産物または活性を生じ得、その中には例えば分子間相互作用、核酸またはポリペプチドの発現の変化、2つ以上の分子間の複合体の形成または解離、代謝性産物の蓄積または分解、酵素または結合活性の活性化または不活性化が含まれ得る。よって、用語「経路」は各種経路タイプ、例えば生化学的経路、遺伝子発現経路、調節経路を含む。また、経路はこれらの例示的経路タイプの組合せを含み得る。
「増殖因子シグナル伝達経路」は、増殖因子(非限定的に、ヘレグリン、インスリン、IGF、FGF、EGFを含む)が受容体チロシンキナーゼ(非限定的に、受容体のERBBファミリーを含む)に結合することにより開始する。増殖因子がその対応する受容体に結合すると、受容体のダイマー化、主要チロシン残基のリン酸化、及び受容体の細胞内部分での幾つかのタンパク質の補充が生ずる。その後、これらのタンパク質はPI3K/AKT、RAS/ERKやJAK/STATシグナル伝達経路のような幾つかの経路を介する細胞内シグナル伝達を開始し、それにより抗アポトーシスタンパク質の活性化及びプロアポトーシスタンパク質の不活化が生ずる(Henson and Gibson、2006、Cellular Signaling,18:2089−2097において精査されている)。他の方法で特定されていない限り、本明細書中で「増殖因子シグナル伝達経路」は外部増殖因子が膜チロシンキナーゼ受容体に結合することにより開始するPI3K/AKTシグナル伝達経路を介するシグナル伝達を指すと理解される。
「PI3K/AKTシグナル伝達経路」または「AKTシグナル伝達経路」としても公知の「PI3Kシグナル伝達経路」は、増殖因子が受容体チロシンキナーゼに結合することにより活性化される細胞内シグナル伝達経路の1つを指す。活性化すると、PI3Kはホスファチジルイノシトール−4,5−ビスホスホネート(PIP2)をホスファチジルイノシトール−3,4、5−トリホスホネート(PIP3)にリン酸化し、このプロセスはPTENにより逆転する。PIP3シグナルはキナーゼPDK1を活性化し、後者はキナーゼAKTを活性化する。PI3Kシグナル伝達経路の説明のために図1も参照されたい(PI3K/AKTシグナル伝達カスケードを精査するためにHennessyら,2005,Nat.Rev.Drug Discov.,4:988−1004も参照されたい)。加えて、PI3Kシグナル伝達経路はRAS経路のような他の細胞内シグナル伝達経路によってもモジュレートされ得、その結果増殖因子がその受容体に結合することにより活性化された細胞内シグナル伝達経路内で混線が生ずる。PI3Kシグナル伝達経路には表1にリストされている遺伝子及びこれによりコードされるタンパク質が含まれるが、これらに限定されない。
「増殖因子経路物質」はPI3K/AKTシグナル伝達腕を介して増殖因子経路シグナル伝達をモジュレートする物質を指す。増殖因子経路インヒビターはPI3K/AKTシグナル伝達腕を介して増殖因子経路シグナル伝達を抑制する。前記インヒビターの分子標的にはPDK、AKT、mTOR、PDK1、MYC、cMET、FGFR2、増殖因子(EGF、b−FGF、IGF1、インスリンまたはヘレグリン)及びその対応する受容体、並びに表1にリストされている遺伝子が含まれ得る。前記物質は当業界で公知であり、その中にはホスファチジルイノシトールエーテルリピドアナログ、アルキルホスホリピドアナログ、アロステリックAKTインヒビター、HSP90インヒビター、アルキルホスホリピドペリホシン、ラパマイシン、RAD001、FTY720、PDK1インヒビター(BX−795、BX−912及びBX−320(Feldmanら,2005,J.Biol.Chem.,280:19867−19874);7−ヒドロキシスタウロスポリン(Satoら,2002,Oncogene,21:1727−1738));PI3Kインヒビター(ワートマニン(Wymannら,1996,Mol.Cell.Biol.,16:1722−1733);LY294002(Vlahosら,1994,J.Biol.Chem.,269:5241−5248;Wetzker and Rommel,2004,Curr.Pharm.Des.,10:1915−1922);IC87114(Finan and Thomas,2004,Biochem.Soc.Trans.,32:378−382;WO0181346、WO01372557、US6403588、WO0143266);AKT抗体(Shinら,2005,Cancer Res.,65:2815−2824)(AKT経路のインヒビターを精査するためにChengら,Oncogene,2005,24:7482−7492を参照されたい)、及びIGF1Rインヒビター(例えば、モノクローナル抗体MK−0646m;U.S.特許7,241,444)が含まれるが、これらに限定されない。増殖因子シグナル伝達経路バイオマーカーを同定し、細分するために使用した実施例セクションにリストされているインヒビター及び物質も増殖因子経路物質の例(すなわち、AKT1/2インヒビターL−001154547(’547;3−フェニル−2−(4−{[4−(5−ピリジン−2−イル−1H−1,2,4−トリアゾル−1−イル)ピペリジン−1−イル]メチル}フェニル)−1,6−ナフチリジン−5(6H)−オン;WO2006065601に開示されている)、L−01173931(’931;6−メチル−3−フェニル−2−(4−{[4−(5−ピリジン−2−イル−1H−1,2,4−トリアゾル−3−イル)ピペリジン−1−イル]−メチル}フェニル)−1,6−ナフチリジン−5(6H)−オン;WO2006065601に開示されている);γ−セクレターゼ阻害剤421B(US7,138,400及びWO02/36555);cMETインヒビターL−001501404(4−(6−フェニル−[1,2,4]トリアゾロ[4,3−b][1,2,4]トリアジン−3−イルメチル)−フェノール;US7,122,548も参照されたい)、MK−2461(N−[(2R)−1,4−ジオキサン−2−イルメチル]−N−メチル−N’−[3−(1−メチル−1H−ピラゾル−4−イル)−5−オキソ−5H−ベンゾ[4,5]シクロヘプタ[1,2−b]ピリジン−7−イル]スルファミド)、及びL−001793225(1−[3−(1−メチル−1H−ピラゾル−4−イル)−5−オキソ−5H−ベンゾ[4,5]シクロヘプタ[1,2−b]ピリジン−7−イル]−N−(ピリジン−2−イルメチル)メタンスルホンアミドである。
用語「デレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路」は、本明細書中で増殖因子シグナル伝達経路が過剰活性化または過小活性化されていることを意味すべく使用されている。増殖因子シグナル伝達経路は、正常(レギュレートされている)サンプル中の増殖因子シグナル伝達経路よりも少なくとも10%、20%、50%、75%、100%、200%、500%、1000%高い活性/シグナル伝達を有しているならばサンプル(例えば、腫瘍サンプル)中で過剰活性化されている。増殖因子シグナル伝達経路は、サンプル(例えば、腫瘍サンプル)中の活性/シグナル伝達が正常(レギュレートされている)サンプル中の増殖因子シグナル伝達経路よりも少なくとも10%、20%、50%、75%、100%低いならば過小活性化されている。レギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路を有する正常サンプルは隣接する正常組織由来であったり、またはデレギュレートされている増殖因子シグナル伝達を有していない他の腫瘍サンプルであり得る。或いは、サンプル増殖因子シグナル伝達経路状態の比較は薬物または物質対ビヒクルで治療した同一サンプルを用いてなされ得る。活性化状態の変化は増殖因子シグナル伝達経路中の1つ以上の遺伝子の変異(例えば、点変異、欠失または増幅)、転写調節の変化(例えば、メチル化、リン酸化またはアセチル化の変化)、またはタンパク質レギュレーションの変化(例えば、翻訳または翻訳後コントロールメカニズム)に起因し得る。
用語「解糖(glycolysis)経路」または「解糖(glycolytic)経路」は、1つのグルコース分子を2つのピルベート分子に分解して2つのATPを生成する酸素非依存性細胞エネルギー生成経路を指す。その後、ピルベートは解糖経路においてラクテートに還元される。酸素の存在下で、ピルベートはHCO3に酸化されると、1グルコースあたり36個の追加ATPが生ずる(酸化的リン酸化経路)。酸素の存在下でのグルコースの乳酸への変換は所謂「好気的解糖」または「ワーブルグ効果」とも呼ばれている。酸素の存在下での高い解糖(好気的解糖)は原発性及び転移性癌の特徴である(Gatenby and Gillies,2004,Nature Reviews Cancer,4:891−899;Lopez−Lazaro,2008,Anti−Cancer Agents in Med.Chem.,8:305−312;Kondoh,2008,Exp.Cell Res.,314:1923−1928において精査されている)。
「解糖経路物質」は解糖経路をモジュレートする物質を指す。解糖インヒビターは解糖経路を抑制する。前記インヒビターの分子標的にはヘキソキナーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、ピルベートキナーゼ、グルコーストランスポーターが含まれる。そのような物質は当業界で公知であり、この中にはロニダミン、3−ブロモピルベート、2−デオキシグルコース、イマチニブ、ATPクエン酸リアーゼ阻害剤SB−204990、オキシチアミン、ゲニステイン、5−チオグルコース、マンノヘプツロース、α−クロロヒドリン、オルニダゾール、グルホスファミド、ヒ素化合物、オキサメート、ヨードアセテート、ビスホスホネート、ツベルシジン、及びNa+/K+−ATPアーゼポンプインヒビター、GLUTインヒビター、3−(3−ピリジニル)−1−(4−ピリジニル)−2−プロペン−1−オン、ジクロロアセテート(Lopez−Lazaro,2008,Anti−Cancer Agents in Medicinal Chemistry,8:305−312;Clemら,2008,Mol.Cancer Ther.,7:110−120;Bonnetら,2007,Cancer Cell,11:37−51において精査されている)が含まれるが、これらに限定されない。
用語「発癌経路」は、本明細書中で過剰活性化または過小活性化されたとき癌の発生または進行の原因となる経路を意味すべく使用されている。1つの実施形態では、発癌経路は癌遺伝子または癌サプレッサー遺伝子を含むものである。
本発明に関連していろいろな文法形の用語「治療する」は、病的状態、病気の進行、病気の原因物質(例えば、細菌またはウイルス)または他の異常な状態の有害な影響を予防する(すなわち、化学防御)、治癒させる、逆転させる、弱める、緩和する、最小限にする、抑制する、または停止させることを指す。例えば、治療は病気の症状(すなわち、必ずしもすべての症状でない)の緩和または病気の進行の減衰を含み得る。
本明細書中で使用されている「癌の治療」は、哺乳動物、例えばヒトにおける癌転移を含めた癌の進行を部分的にまたは完全に抑制、遅延または防止すること;癌転移を含めた癌の再発を抑制、遅延または防止すること;または癌の発生または発症を防止すること(化学防御)を指す。加えて、本発明の方法は癌を有しているヒト患者を治療するために実施され得る。しかしながら、本発明の方法は他の哺乳動物の癌の治療にも有効であろう。
本明細書中で使用されている用語「治療有効量」は、癌を治療するために必要な治療レジメンにおける治療薬の量を特定するために意図されている。これは、所望の生物学的応答を与える第1及び第2治療の合計量のような複数の治療薬の使用を含めた併用治療を含む。所望の生物学的応答は哺乳動物、例えばヒトにおける癌転移を含めた癌の進行を部分的にまたは完全に抑制、遅延または防止すること;癌転移を含めた癌の再発を抑制、遅延または防止すること;または癌の発生または発症を防止すること(化学防御)である。
「分類結果、予測結果または有効性結果を表示または出力させる」は、遺伝子発現に基づくサンプルの分類または予測の結果をメディア、例えば口頭で、文字で、画像表示等、コンピューター読み取り可能媒体またはコンピューターシステムを用いてユーザーに伝達することを意味する。結果を出力することがユーザーまたはリンクされているエクスターナル コンポーネント(例えば、コンピューターシステムまたはコンピューターメモリー)に出力させることに限定されず、代替または追加的にインターナル コンポーネント(例えば、コンピューター読み取り可能媒体)に出力させてもよいことは当業者に明白である。コンピューター読み取り可能媒体にはハードドライブ、フロッピー(登録商標)ディスク、CD−ROM、DVD、DATが含まれ得るが、これらに限定されない。コンピューター読み取り可能メディアはデータ搬送波または転送のための他の波の形態を含まない。本明細書中に開示、特許請求されている各種のサンプル分類方法はコンピューターにより実行され得るが、必須ではないこと及び例えば表示または出力ステップは例えばヒトに対して口頭または文字で(例えば、手書きで)行われることは当業者に明白である。
3.3 腫瘍を分類し、治療薬に対する応答を予測する際に有用なバイオマーカー
3.3.1バイオマーカー集合
本発明の1つの態様は、その発現がクラスタリング分析により増殖因子シグナル伝達経路デレギュレーションと相関している101個のバイオマーカーの集合を提供する。増殖因子シグナル伝達経路のレギュレーション状態に従って腫瘍を分類するために、増殖因子シグナル伝達経路をモジュレートする化合物に対する癌患者の応答を予測するために、または治療薬の増殖因子シグナル伝達経路に対する薬力学的効果を判定するために有用であるとして同定されたこれらのバイオマーカーは配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、72、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、149、151、153、155、157、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、97、99、101、103、105、107、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193及び195としてリストされている(表5a及び5bも参照されたい)。本発明の別の態様は、診断時に腫瘍型を区別するためまたは治療薬に対する応答を予測するための上記バイオマーカーの使用方法を提供する。本発明の1つの実施形態では、101個のバイオマーカー集合は2つの対立する“腕”、すなわち増殖因子経路を介するシグナル伝達が増加するにつれてアップレギュレートされる遺伝子である“アップ”腕(表5a及び5bを参照されたい)及びダウンレギュレートされる遺伝子である“ダウン”腕に分けられ得る。
3.3.1バイオマーカー集合
本発明の1つの態様は、その発現がクラスタリング分析により増殖因子シグナル伝達経路デレギュレーションと相関している101個のバイオマーカーの集合を提供する。増殖因子シグナル伝達経路のレギュレーション状態に従って腫瘍を分類するために、増殖因子シグナル伝達経路をモジュレートする化合物に対する癌患者の応答を予測するために、または治療薬の増殖因子シグナル伝達経路に対する薬力学的効果を判定するために有用であるとして同定されたこれらのバイオマーカーは配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、72、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、149、151、153、155、157、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、97、99、101、103、105、107、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193及び195としてリストされている(表5a及び5bも参照されたい)。本発明の別の態様は、診断時に腫瘍型を区別するためまたは治療薬に対する応答を予測するための上記バイオマーカーの使用方法を提供する。本発明の1つの実施形態では、101個のバイオマーカー集合は2つの対立する“腕”、すなわち増殖因子経路を介するシグナル伝達が増加するにつれてアップレギュレートされる遺伝子である“アップ”腕(表5a及び5bを参照されたい)及びダウンレギュレートされる遺伝子である“ダウン”腕に分けられ得る。
1つの実施形態では、本発明は、増殖因子シグナル伝達経路レギュレーション状態により腫瘍を分類し得る、すなわちレギュレート及びデレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路を有している腫瘍を区別し得る101個のバイオマーカーの集合を提供する。これらのバイオマーカーは表5a及び5bにリストされている。本発明はまた、デレギュレート及びレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路を有する腫瘍を区別し得る101個の集合から選抜した少なくとも少なくとも5、10、20、30、40、50、75または100個のバイオマーカーの部分集合を提供する。代替実施形態では、101個の集合から選抜した20個のバイオマーカーの部分集合は表10にリストされている。或いは、デレギュレート及びレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路を有する腫瘍を区別し得る“アップ”腕(表5aを参照されたい)から選抜した少なくとも3、5、10、15、20、25個のバイオマーカーの部分集合及び“ダウン”腕(表5bを参照されたい)から選抜した少なくとも3、5、10、15、20、25個のバイオマーカーの部分集合を提供する。1つの実施形態では、“アップ”腕バイオマーカー及び“ダウン”腕バイオマーカーの部分集合は表10にリストされている。本発明はまた、デレギュレートまたはレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路を有する腫瘍を区別するための上記バイオマーカーの使用方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、被験者の増殖因子シグナル伝達経路物質に対する応答を予測するために使用され得る101個の遺伝子バイオマーカーの集合を提供する。より具体的な実施形態では、本発明は、被験者の増殖因子シグナル伝達経路をモジュレートする物質に対する応答を予測するために使用され得る101個の集合から選抜した少なくとも5、10、20、30、40、50、75または100個のバイオマーカーの部分集合を提供する。別の実施形態では、本発明は、癌を有している被験者を治療するための増殖因子経路物質を選択するために使用され得る101個のバイオマーカーの集合を提供する。より具体的な実施形態では、本発明は、癌を有している被験者を治療するための増殖因子経路物質を選択するために使用され得る101個の集合から選抜した少なくとも5、10、20、30、40、50、75または100個のバイオマーカーの部分集合を提供する。或いは、“アップ”腕(表5aを参照されたい)から選抜した少なくとも3、5、10、15、20、25個のバイオマーカーの部分集合及び“ダウン”腕(表5bを参照されたい)から選抜した少なくとも3、5、10、15、20、25個のバイオマーカーの部分集合は被験者の増殖因子シグナル伝達経路物質に対する応答を予測するために、または癌を有している被験者を治療するための増殖因子シグナル伝達経路物質を選択するために使用され得る。特定実施形態では、バイオマーカーの部分集合は表10にリストされている。
別の実施形態では、本発明は、物質が増殖因子シグナル伝達経路に対して薬力学的効果を有するかを判定するために使用され得る101個の遺伝子バイオマーカーの集合を提供する。提供されるバイオマーカーは、物質での治療からのいろいろな時点で増殖因子シグナル伝達経路の抑制をモニターするために使用され得る。より具体的な実施形態では、本発明は、物質の増殖因子シグナル伝達経路に対する薬力学的活性をモニターするために使用され得る101個の集合から選抜した少なくとも5、10、20、30、40、50、75または100個のバイオマーカーの部分集合を提供する。或いは、“アップ”腕(表5aを参照されたい)から選抜した少なくとも3、5、10、15、20、25個のバイオマーカーの部分集合及び“ダウン”腕(表5bを参照されたい)からの少なくとも3、5、10、15、20、25個のバイオマーカーの部分集合は物質が増殖因子シグナル伝達経路に対して薬力学的効果を有するかを判定するため、または物質の増殖因子シグナル伝達経路に対する薬力学的活性をモニターするために使用され得る。特定実施形態では、バイオマーカーの部分集合は表10にリストされている。
本発明は、その発現がクラスタリング分析により増殖因子シグナル伝達経路デレギュレーションと相関している86個の遺伝子バイオマーカーの代替集合をも提供する。増殖因子シグナル伝達経路のレギュレーション状態に従って腫瘍を分類するために、被験者の増殖因子シグナル伝達経路をモジュレートする化合物に対する応答を予測するために、または治療薬の増殖因子シグナル伝達経路に対する薬力学的効果を判定するために有用であると同定されたこれらのバイオマーカーは配列番号201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255、257、259、261、263、265、267、269、271、273、275、277、279、281、283、285、287、289、291、293、295、297、299、301、303、305、307、309、311、313、315、317、319、321、323、325、327、329、331、333、335、337、339、341、343、345、347、349、351、353、355、357、359、361、363、365、367、369及び371としてリストされている(表11も参照されたい)。本発明の別の態様は、診断する際に腫瘍型を区別するため、または治療薬に対する応答を予測するための上記バイオマーカーの使用方法を提供する。本発明の1つの実施形態では、86個のバイオマーカー集合は2つの対立する“腕”、すなわち増殖因子経路を介するシグナル伝達が増加するにつれてアップレギュレートされる遺伝子である44個の遺伝子を含む“アップ”腕(表11を参照されたい)及びダウンレギュレートされる遺伝子である42個の遺伝子を含む“ダウン”腕(表11を参照されたい)に分けられ得る。本発明はまた、各種実施形態で使用され得る86個の集合から選抜した少なくとも5、10、20、30、40、50または75個のバイオマーカーの部分集合を提供する。或いは、“アップ”腕(表11を参照されたい)から選抜した少なくとも3、5、10、15、20、25、30または35個のバイオマーカーの部分集合及び“ダウン”腕(表11を参照されたい)から選抜した少なくとも3、5、10、15、20、25、30または35個のバイオマーカーの部分集合を提供する。
更には、本発明は、その発現がクラスタリング分析により解糖経路活性に相関している39個のバイオマーカーの集合を提供する。解糖経路の活性に従って腫瘍を分類するために、癌患者の解糖経路をモジュレートする化合物に対する応答を予測するために、または治療薬の解糖経路に対する薬力学的効果を判定するために有用であると同定されたこれらのバイオマーカーは配列番号373、375、377、379、381、383、385、387、389、391、221、393、395、397、399、401、403、405、407、409、411、413、253、415、417、419、421、423、425、427、429、431、433、435、437、439、441、443、445としてリストされている(表13も参照されたい)。本発明の別の態様は、診断する際に腫瘍型を区別するため、または治療薬に対する応答を予測するための上記バイオマーカーの使用方法を提供する。本発明はまた、各種実施形態で使用され得る39個の集合から選抜した少なくとも5、10、20、30または35個のバイオマーカーの部分集合を提供する。
上で提供されたバイオマーカーの集合は、特に単独でまたは当該集合の範囲外のバイオマーカーと組み合わせて使用され得る。例えば、増殖因子シグナル伝達経路レギュレーション状態を区別するバイオマーカーは、p53機能状態を区別するバイオマーカー(Andrey Lobodaらにより2008年3月22日に出願されたU.S.仮出願61/070,259,“Gene Expression Signature for Assessing p53 Pathway Functional Status”を参照されたい)と一緒に使用され得る。上で提供されたバイオマーカー集合は癌、或いは他の臨床または生理学的状態のための他のバイオマーカーと一緒に使用され得る。
3.3.2 バイオマーカーの同定
本発明は、癌に関連する状態または兆候を同定するためのバイオマーカーの集合を提供する。通常、バイオマーカー集合は〜44,000個のヒトバイオマーカーのいずれかが状態または兆候に相関する発現パターンを有しているかを調べることにより同定した。
本発明は、癌に関連する状態または兆候を同定するためのバイオマーカーの集合を提供する。通常、バイオマーカー集合は〜44,000個のヒトバイオマーカーのいずれかが状態または兆候に相関する発現パターンを有しているかを調べることにより同定した。
1つの実施形態では、バイオマーカー集合を同定するための方法は以下の通りである。標的ポリヌクレオチドを抽出し、標識した後、サンプルX中のすべてのバイオマーカー(遺伝子)の発現を標準または対照中のすべてのバイオマーカーの発現と比較する。1つの実施形態では、標準または対照は正常個体(すなわち、増殖因子経路デレギュレーションを有していない個体)からのサンプルに由来する標的ポリヌクレオチドを含む。或いは、標準または対照は腫瘍に隣接する正常組織または増殖因子経路デレギュレーションを有していない腫瘍由来のポリヌクレオチドを含む。好ましい実施形態では、標準または対照は標的ポリヌクレオチド分子のプールである。前記プールは多数の正常個体からの採取サンプルに由来し得る。別の実施形態では、前記プールは増殖因子経路デレギュレーションを有していない腫瘍を有する多数の個体から採取したサンプルからなる。別の好ましい実施形態では、前記プールは腫瘍サンプルからのバイオマーカー由来核酸のプール中に存在する各バイオマーカーに由来する核酸のレベルに近づくように設計された核酸の人工的に作成した集団からなる。更に別の実施形態では、前記プールは正常または癌細胞株または細胞株サンプルに由来する。
比較は当業界で公知の手段により実施され得る。例えば、各種バイオマーカーの発現レベルは、アガロースまたはポリアクリルアミドゲルを用いてバイオマーカー由来の標的ポリヌクレオチド分子(例えば、RNAまたはcDNA)を分離した後、バイオマーカー特異的オリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズすることにより評価され得る。或いは、比較は標的ポリヌクレオチド分子を標識した後配列決定ゲルを用いて分離することにより実施され得る。患者及び対照または標準ポリヌクレオチドが隣接レーンにあるようにポリヌクレオチドサンプルをゲル上に配置する。発現レベルは肉眼でまたはデンシトメーターを用いて比較される。好ましい実施形態では、すべてのバイオマーカーの発現がマイクロアレイへのハイブリダイゼーションにより同時に評価される。各アプローチで、特定基準に適合するバイオマーカーを増殖因子シグナル伝達経路デレギュレーションを有する腫瘍に関連するとして同定する。
バイオマーカーは、標準または対照状態と比較したサンプル中の発現の有意な差に基づいて選択される。選択は、患者サンプル中のバイオマーカーが有意にアップまたはダウンレギュレーションされているかに基づいてなされ得る。選択は、バイオマーカーと状態または兆候の発現間の相関の統計上の有意差(すなわち、p値)を計算することによってもなされ得る。好ましくは、両方の選択基準を使用する。よって、本発明の1つの実施形態では、標準と比較して発現の2倍以上の変化(上昇または低下)を示し、増殖因子シグナル伝達経路デレギュレーションの存在とバイオマーカー発現の変化の相関についてのp値が0.01以下である(すなわち、統計上有意である)腫瘍中のデレギュレーション増殖因子シグナル伝達経路に関連するバイオマーカーを選抜する。
複数のN個の癌腫瘍サンプル中の複数の異なる遺伝子からなる発現プロファイルは、異なる臨床カテゴリーに相関し、従って異なる臨床カテゴリーを判別するために有用であるマーカーを同定するために使用され得る。具体的実施形態では、N個の腫瘍サンプル中の臨床カテゴリーまたは臨床パラメーター(例えば、レギュレートまたはデレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路)を表すベクトル
とN個の腫瘍サンプル中の遺伝子の測定した発現レベルを表すベクトル
の相関係数ρを遺伝子の発現レベルと増殖因子シグナル伝達経路状態間の相関度として使用する。発現レベルは遺伝子の転写物の測定したアバンタンスレベルまたは測定したアバンダンスの変換、例えば対数、すなわちlog比であり得る。具体的には、相関係数は
として計算される。
相関係数がカットオフを超えるバイオマーカーは、所与の患者部分集合内の特定の臨床カテゴリー(例えば、デレギュレートされている増殖因子経路シグナル伝達状態)に特異的な増殖因子経路シグナル伝達状態の情報を与えるバイオマーカーとして同定される。前記カットオフまたは閾値は得られた判別遺伝子の集合のある有意性に対応し得る。閾値は使用するサンプル数に基づいても選択され得る。例えば、閾値は
(式中、
は分布幅であり、nはサンプル数である)
として計算される。具体的実施形態では、相関係数が約0.3以上または約−0.3未満ならばマーカーを選択する。
として計算される。具体的実施形態では、相関係数が約0.3以上または約−0.3未満ならばマーカーを選択する。
次に、バイオマーカー遺伝子の集合の有意性が評価され得る。有意性は適当な統計方法により計算され得る。具体例では、複数の患者の発現プロファイルと臨床カテゴリー間の関係をランダム化して、ランダム化したデータセットを作成するためにモンテカルロ法を使用する。バイオマーカー集合を選択するために使用したのと同一のバイオマーカー選択手順をランダム化データに適用して、対照バイオマーカー集合を得る。複数の前記ランを実施して、対照バイオマーカー集合中の遺伝子の数の確率分布を作成する。好ましい実施形態では、前記ランを10,000回実施する。確率分布から、発現レベルと表現型間の相関(すなわち、ランダム化データに基づいて)が予想されないときには所与の数のバイオマーカーから構成されるバイオマーカー集合を見つける確率が決定され得る。実際のデータから得たバイオマーカー集合の有意性は、ランダム化データを用いて同一数のバイオマーカーから構成される対照バイオマーカー集合を得る確率を比較することによりバイオマーカー集合中のバイオマーカーの数に基づいて評価され得る。1つの実施形態では、ランダム化データを用いて同一数のバイオマーカーから構成される対照バイオマーカーを得る確率が所与の確率閾値を下回るならば、バイオマーカー集合は有意であると言える。
バイオマーカー集合が同定されたら、バイオマーカーは判別の相関または有意性の順に順位付けされ得る。1つの順位付け手段はバイオマーカーの遺伝子発現の変化と判別しようとする具体的状態の相関の大きさによる。別の好ましい手段は統計メトリックを使用することである。具体的実施形態では、メトリックはt検定様統計量である。
上記数式中、<x1>は第1臨床群(例えば、デレギュレートされている増殖因子経路シグナル伝達)内の転写物発現測定値のlog比の誤差加重平均であり、<x2>は第2の関連する臨床群(例えば、レギュレートされている増殖因子経路シグナル伝達)内のlog比の誤差加重平均であり、σ1は第1臨床群(例えば、デレギュレートされている増殖因子経路シグナル伝達)内のlog比の分散であり、n1はlog比の正当な測定値が有効なサンプル数であり、σ2は第2臨床群(例えば、レギュレートされている増殖因子経路シグナル伝達)内のlog比の分散であり、n2はlog比の正当な測定値が有効なサンプル数である。t値は2つの平均間の分散補償差を表す。順位付けしたバイオマーカー集合は判別のために使用される集合中のバイオマーカーの数を最適とするために使用され得る。
増殖因子経路シグナル伝達状態に対する遺伝子の集合は反復アプローチを用いても同定され得る。これは、通常以下の“1個抜き(leave one out)”方法を用いて実施される。第1ランで、順位付けしたリストのトップからのバイオマーカーの部分集合(例えば、5個)をテンプレートを作成するために使用する。ここでは、N個のサンプルからテンプレートを作成するためにN−1個を使用し、残りのサンプルの状態を予測する。このプロセスをN個のサンプルが1個ずつ1回予測されるまでサンプル毎に繰り返す。第2ランでは、テンプレートが10個のバイオマーカーから作成されるように1つ以上の追加のバイオマーカー(例えば、5個の追加バイオマーカー)を添加し、残りのサンプルの出力を予測する。このプロセスを、バイオマーカーのすべての集合がテンプレートを作成するために使用されるまで繰り返す。各ラン毎に、タイプ1エラー(偽陰性)及びタイプ2エラー(偽陽性)をカウントする。最低のタイプ1エラー率またはタイプ2エラー率、好ましくはタイプ1エラー率及びタイプ2エラー率の合計に相当するトップに順位付けされたバイオマーカーの集合を選択する。
増殖因子経路シグナル伝達状態バイオマーカーについて、マーカー集合の確認は追加の統計量、生存モデルにより実施され得る。この統計量から最初の診断以降の時間の関数としての腫瘍の遠隔転移の確率が得られる。ワイブル、正規、対数正規、対数ロジスティック、対数指数またはlog−Rayleigh(Chapter 12“Life Testing”,S−PLUS 2000 GUIDE TO STATISTICS,Vol.2,p.368(2000))を含めた多数のモデルが使用され得る。「正常」モデルの場合、時間tでの遠隔転移Pの確率は
(式中、αは一定で1に等しく、τは適合されるパラメーターであり、「予測寿命」を判定する)
として計算される。
として計算される。
バイオマーカー選択または順位付けから(すなわち、相関の計算から)1つ以上のサンプルを除外することにより上記バイオマーカー同定プロセスを2回以上反復することが好ましい。除外されるサンプルは以前の反復から正しく予想され得ないものである。好ましくは、この反復プロセスにおいてバイオマーカー選択から除外されたサンプルを性能を誇張して述べるのを避けるために分類子性能評価に含める。
増殖因子経路シグナル伝達状態についての遺伝子の集合が同定されたら、バイオマーカーを2つの対立する“腕”、すなわち増殖因子経路を介するシグナル伝達が増加するにつれてアップレギュレートされる遺伝子である“アップ”腕(表5aまたは表11を参照されたい)及びダウンレギュレートされる遺伝子である“ダウン”腕(表5bまたは表11を参照されたい)に分けられ得る。
先に記載した上記方法、特に統計的方法が増殖因子シグナル伝達経路レギュレーション状態に関連するバイオマーカーの同定に限らず、表現型に関連するバイオマーカー遺伝子の集合を同定するために使用され得ることは当業者に自明である。表現型は癌のような疾患の存在または不在、或いは癌に関連する同定する臨床状態の存在または不在であり得る。例えば、先に記載した方法は解糖経路活性に関連するバイオマーカーを同定するために使用され得る。病気の関連で、表現型は生存期間、病的状態の遠隔転移の見込み、或いは治療または予防レジメンに対する具体的応答の可能性のような予後であり得る。表現型は癌または疾患である必要はない。表現型は健康な個人に関連する名目上の特徴であり得る。
3.3.3 サンプル採取
本発明において、標的ポリヌクレオチド分子を典型的にはそれぞれ癌または腫瘍細胞株に侵されている個体及び対応する正常/対照組織または細胞株から採取したサンプルから抽出する。サンプルは臨床的に許容され得る方法で採取され得るが、バイオマーカー由来ポリヌクレオチド(すなわち、RNA)が保存されるように採取されなければならない。mRNAまたはこれに由来する核酸(すなわち、cDNAまたは増幅DNA)を標準または対照ポリヌクレオチド分子から区別できるように標識することが好ましく、両方をバイオマーカーの一部または全部、或いは上記したバイオマーカー集合または部分集合を含むマイクロアレイに同時にまたは独立してハイブリダイズする。或いは、mRNAまたは底に由来する核酸を標準または対照ポリヌクレオチド分子と同一の標識で標識してもよく、この場合特定のプローブでの各々のハイブリダイゼーションの強度を比較する。サンプルは臨床的に関連する組織サンプル(例えば、腫瘍生検または細針吸引物)または体液(例えば、血液、血漿、血清、リンパ、腹水、嚢胞液、尿)のサンプルからなり得る。サンプルはヒトから、或いは獣医学的関係では非ヒト動物(例えば、反芻動物、ウマ、ブタまたはヒツジ)または家庭愛玩動物(例えば、ネコ及びイヌ)から採取され得る。加えて、サンプルは凍結または保管されているホルマリン固定またはパラフィン包埋(FFPE)組織サンプルに由来してもよい。
本発明において、標的ポリヌクレオチド分子を典型的にはそれぞれ癌または腫瘍細胞株に侵されている個体及び対応する正常/対照組織または細胞株から採取したサンプルから抽出する。サンプルは臨床的に許容され得る方法で採取され得るが、バイオマーカー由来ポリヌクレオチド(すなわち、RNA)が保存されるように採取されなければならない。mRNAまたはこれに由来する核酸(すなわち、cDNAまたは増幅DNA)を標準または対照ポリヌクレオチド分子から区別できるように標識することが好ましく、両方をバイオマーカーの一部または全部、或いは上記したバイオマーカー集合または部分集合を含むマイクロアレイに同時にまたは独立してハイブリダイズする。或いは、mRNAまたは底に由来する核酸を標準または対照ポリヌクレオチド分子と同一の標識で標識してもよく、この場合特定のプローブでの各々のハイブリダイゼーションの強度を比較する。サンプルは臨床的に関連する組織サンプル(例えば、腫瘍生検または細針吸引物)または体液(例えば、血液、血漿、血清、リンパ、腹水、嚢胞液、尿)のサンプルからなり得る。サンプルはヒトから、或いは獣医学的関係では非ヒト動物(例えば、反芻動物、ウマ、ブタまたはヒツジ)または家庭愛玩動物(例えば、ネコ及びイヌ)から採取され得る。加えて、サンプルは凍結または保管されているホルマリン固定またはパラフィン包埋(FFPE)組織サンプルに由来してもよい。
全及びポリ(A)+RNAの作成方法は公知であり、一般的にSambrookら,MOLECULAR CLONING−A LABORATORY MANUAL(2ND ED.),Vols.1−3,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989))及びAusubelら,CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,Vol.2,Current Protocols Publishing,New York(1994))に記載されている。
RNAは真核細胞を溶解し、そこに含まれているタンパク質を変性することを含む手順により真核細胞から単離され得る。当該細胞には野生型細胞(すなわち、非癌性)、薬物暴露野生型細胞、腫瘍または腫瘍由来細胞、修飾細胞、正常または腫瘍細胞株細胞及び薬物暴露修飾細胞が含まれる。
DNAを除去するために追加ステップが使用され得る。非イオン性洗剤を用いて細胞溶解した後、微量遠心して、核、よって大量の細胞DNAも除去し得る。1つの実施形態では、RNAを問題の各種型の細胞からチオシアン酸グアニジン溶解を用いて抽出した後、CsCl遠心して、RNAをDNAから分離する(Chirgwinら,Biochemistry,18:5294−5299(1979))。ポリ(A)+RNAはオリゴ−dTセルロースを用いる選択により選択される(Sambrookら,MOLECULAR CLONING−A LABORATORY MANUAL(2ND ED.),Vols.1−3,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)を参照されたい)。或いは、RNAは有機抽出、例えば熱フェノールまたはフェノール/クロロホルム/イソアミルアルコールを用いる有機抽出によりDNAから分離され得る。
所望により、RNアーゼインヒビターを溶解バッファーに添加してもよい。また、特定の細胞型の場合、プロトコルにタンパク質変性/消化ステップを加えることが望ましいことがある。
多くの用途の場合、他の細胞RNA(例えば、転移RNA(tRNA)及びリボソームRNA(rRNA))に対してmRNAを優先的に濃縮させることが望ましい。多くのmRNAはその3’末端にポリ(A)テールを含んでいる。これにより、mRNAは例えば固体支持体(例えば、セルロースまたはセファデックス(登録商標))にカップリングさせたオリゴ(dT)またはポリ(U)を用いるアフィニティークロマトグラフィーにより濃縮され得る(Ausubelら,CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,Vol.2,Current Protocols Publishing,New York(1994)を参照されたい)。結合させたら、ポリ(A)+mRNAをアフィニティーカラムから2mM EDTA/0.1% SDSを用いて溶離させる。
RNAのサンプルは、各々の異なるmRNA分子が異なるヌクレオチド配列を有している複数の異なるmRNA分子を含み得る。具体的実施形態では、RNAサンプル中のmRNA分子は少なくとも100個の異なるヌクレオチド配列を含む。より好ましくは、RNAサンプル中のmRNA分子はバイオマーカー遺伝子の各々に対応するmRNA分子からなる。別の具体的実施形態では、RNAサンプルは哺乳動物RNAサンプルである。
具体的実施形態では、細胞由来の全RNAまたはmRNAを本発明の方法において使用する。RNAの起源は植物または動物、ヒト、哺乳動物、霊長類、非ヒト動物、イヌ、ネコ、マウス、ラット、鳥、酵母、真核、原核等の細胞であり得る。具体的実施形態では、本発明の方法は1×106個以下の細胞の全mRNAまたは全RNAを含むサンプルを用いて使用される。別の実施形態では、タンパク質はタンパク質レベルでの発現分析において使用するために当業界で公知の方法を用いて前記源から単離され得る。
非ヒト核酸をアッセイする場合には本明細書に開示されているバイオマーカー配列のホモログに対するプローブが好ましく使用され得る。
3.4 増殖因子シグナル伝達経路デレギュレーションバイオマーカー集合の使用方法
3.4.1 診断/腫瘍分類方法
本発明は、腫瘍がデレギュレートまたはレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路を有しているかを個体の腫瘍型を分子レベルで決定または分類すべく個体からのサンプルを分析するためのバイオマーカー集合の使用方法を提供する。個体が実際に癌に侵されている必要はない。本質的に、個体または個体から採取したサンプル中の特定のバイオマーカー遺伝子の発現を標準または対照と比較する。例えば、2つの癌関連状態X及びYを仮定する。個体中の状態Xについて増殖因子シグナル伝達経路バイオマーカーの発現レベルを対照中のバイオマーカー由来ポリヌクレオチドのレベルと比較することができ、前記レベルは状態Xを有するサンプルが表す発現レベルに相当する。この場合、個体サンプル中のマーカーの発現が対照の発現とは実質的に(すなわち、統計上)異なるならば、個体は状態Xを有していない。選択がバイモデル(すなわち、サンプルはXまたはYのいずれかである)ならば、個体は追加的に状態Yを有していると言うことができる。勿論、状態Yに相当する対照と比較することもできる。好ましくは、各対照がポジティブ及びネガティブ対照の両方として働くように両方を同時に実施する。よって、鑑別結果は対照が表す発現レベル(すなわち、マーカー由来RNAまたはそこに由来するポリヌクレオチドの量)との明白な差であるか、または有意差なしであり得る。
3.4.1 診断/腫瘍分類方法
本発明は、腫瘍がデレギュレートまたはレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路を有しているかを個体の腫瘍型を分子レベルで決定または分類すべく個体からのサンプルを分析するためのバイオマーカー集合の使用方法を提供する。個体が実際に癌に侵されている必要はない。本質的に、個体または個体から採取したサンプル中の特定のバイオマーカー遺伝子の発現を標準または対照と比較する。例えば、2つの癌関連状態X及びYを仮定する。個体中の状態Xについて増殖因子シグナル伝達経路バイオマーカーの発現レベルを対照中のバイオマーカー由来ポリヌクレオチドのレベルと比較することができ、前記レベルは状態Xを有するサンプルが表す発現レベルに相当する。この場合、個体サンプル中のマーカーの発現が対照の発現とは実質的に(すなわち、統計上)異なるならば、個体は状態Xを有していない。選択がバイモデル(すなわち、サンプルはXまたはYのいずれかである)ならば、個体は追加的に状態Yを有していると言うことができる。勿論、状態Yに相当する対照と比較することもできる。好ましくは、各対照がポジティブ及びネガティブ対照の両方として働くように両方を同時に実施する。よって、鑑別結果は対照が表す発現レベル(すなわち、マーカー由来RNAまたはそこに由来するポリヌクレオチドの量)との明白な差であるか、または有意差なしであり得る。
従って、1つの実施形態では、個体の特定の腫瘍関連状態の確認方法は、(1)個体由来の標識標的ポリヌクレオチドを上記バイオマーカー集合またはバイオマーカーの部分集合を含むマイクロアレイにハイブリダイズするステップ;(2)標的分子由来の差次的に標識されている標準または対照ポリヌクレオチド分子をマイクロアレイにハイブリダイズするステップ;及び(3)標的及び標準または対照間の転写物レベルの差またはその差のないことを調べて、差の有無から個体の腫瘍関連状態を確認するステップを含む。より具体的実施形態では、標準または対照分子は正常個体からのサンプルのプール、正常隣接組織からのサンプルのプール、または癌を有している個体からの腫瘍サンプルのプールに由来するバイオマーカー由来ポリヌクレオチドを含む。好ましい実施形態では、標準または対照は、特定の臨床兆候(すなわち癌性または非癌性;レギュレートされているまたはデレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路)を有している正常または癌腫瘍組織の臨床サンプルが表すバイオマーカー発現のレベルに似せるように設計されている人工的に作成したバイオマーカー由来ポリヌクレオチドのプールである。別の具体的実施形態では、対照分子は正常または癌細胞株由来のプールからなる。
本発明は、デレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路腫瘍型をレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路腫瘍型から区別するために有用なバイオマーカーの集合を提供する。よって、上記方法の1つの実施形態では、個体由来のサンプル中の、表5a及び5b中に挙げられているバイオマーカーから発現されたポリヌクレオチド(すなわち、mRNAまたはそこに由来するポリヌクレオチド)のレベルを対照由来の同一バイオマーカーの発現のレベルと比較し、前記対照はデレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路腫瘍サンプル及び/またはレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路腫瘍サンプル由来のバイオマーカー関連ポリヌクレオチドを含む。比較はデレギュレート及びレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路腫瘍サンプルの両方に対してなされ得、比較はそれぞれ多数のデレギュレート及びレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路腫瘍サンプル由来のポリヌクレオチドプールに対してなされ得る。個体のバイオマーカー発現がデレギュレートされている対照に最も密接に類似または相関しており、レギュレートされている対照に類似または相関していないならば、個体はデレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路を有していると分類される。プールが純粋なデレギュレートまたはレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路型腫瘍サンプルでない場合、例えば散在性プールを使用した場合、公知の増殖因子シグナル伝達経路状態を有する個体を用いる実験の組をプールに対してハイブリダイズして、デレギュレート及びレギュレートされている群の発現テンプレートを規定する。未知の増殖因子シグナル伝達経路状態を有する各個体を同一プールに対してハイブリダイズし、発現プロファイルをテンプレートと比較して、個体の増殖因子シグナル伝達経路状態を確認する。
別の具体的実施形態では、上記方法は、
(i)第1発現プロファイルとデレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路テンプレート間の類似度を計算し、或いは第1発現プロファイルとデレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路テンプレート間の第1の類似度及び第1発現プロファイルとレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路テンプレート間の第2の類似度を計算し、前記した第1発現プロファイルは腫瘍細胞サンプル中の第1の複数の遺伝子の発現レベルからなり、前記したデレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路テンプレートは異常活性を有する増殖因子シグナル伝達経路の成分を少なくとも1つ以上有する複数の腫瘍細胞サンプル中のそれぞれの遺伝子の平均発現レベルである第1の複数の遺伝子の発現レベルからなり、前記したレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路テンプレートは異常活性を有する増殖因子シグナル伝達経路の成分を少なくとも1つ以上有していない複数の腫瘍細胞サンプル中のそれぞれの遺伝子の平均発現レベルである第1の複数の遺伝子の発現レベルからなり、第1の複数の遺伝子はそのバイオマーカーが表5a及びbにリストされている少なくとも5個の遺伝子から構成されており;
(ii)第1発現プロファイルがデレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路テンプレートに対して高い類似性を有しているかまたはレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路テンプレートよりもデレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路テンプレートに対してより高い類似性を有しているならば腫瘍細胞サンプルをデレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路を有しているとして分類し、或いは第1発現プロファイルがデレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路テンプレートに対して低い類似性を有しているかまたはデレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路テンプレートよりもレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路テンプレートに対してより高い類似性を有しているならば腫瘍細胞サンプルをレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路を有しているとして分類し、デレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路テンプレートに対する類似性が所定閾値を超えているならば前記した第1発現プロファイルはデレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路テンプレートに対して高い類似性を有し、デレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路テンプレートに対する類似性が所定閾値を下回るならば前記した第1発現プロファイルはデレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路テンプレートに対して低い類似性を有しており;
(iii)分類ステップ(ii)により得た分類をユーザーインターフェースデバイス、コンピューター読み取り可能記憶媒体、或いはローカルまたはリモートコンピューターシステムに表示または出力させることを含む。
(i)第1発現プロファイルとデレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路テンプレート間の類似度を計算し、或いは第1発現プロファイルとデレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路テンプレート間の第1の類似度及び第1発現プロファイルとレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路テンプレート間の第2の類似度を計算し、前記した第1発現プロファイルは腫瘍細胞サンプル中の第1の複数の遺伝子の発現レベルからなり、前記したデレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路テンプレートは異常活性を有する増殖因子シグナル伝達経路の成分を少なくとも1つ以上有する複数の腫瘍細胞サンプル中のそれぞれの遺伝子の平均発現レベルである第1の複数の遺伝子の発現レベルからなり、前記したレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路テンプレートは異常活性を有する増殖因子シグナル伝達経路の成分を少なくとも1つ以上有していない複数の腫瘍細胞サンプル中のそれぞれの遺伝子の平均発現レベルである第1の複数の遺伝子の発現レベルからなり、第1の複数の遺伝子はそのバイオマーカーが表5a及びbにリストされている少なくとも5個の遺伝子から構成されており;
(ii)第1発現プロファイルがデレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路テンプレートに対して高い類似性を有しているかまたはレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路テンプレートよりもデレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路テンプレートに対してより高い類似性を有しているならば腫瘍細胞サンプルをデレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路を有しているとして分類し、或いは第1発現プロファイルがデレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路テンプレートに対して低い類似性を有しているかまたはデレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路テンプレートよりもレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路テンプレートに対してより高い類似性を有しているならば腫瘍細胞サンプルをレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路を有しているとして分類し、デレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路テンプレートに対する類似性が所定閾値を超えているならば前記した第1発現プロファイルはデレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路テンプレートに対して高い類似性を有し、デレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路テンプレートに対する類似性が所定閾値を下回るならば前記した第1発現プロファイルはデレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路テンプレートに対して低い類似性を有しており;
(iii)分類ステップ(ii)により得た分類をユーザーインターフェースデバイス、コンピューター読み取り可能記憶媒体、或いはローカルまたはリモートコンピューターシステムに表示または出力させることを含む。
上記した実施形態では、バイオマーカーの全体集合(すなわち、表5a及び5bのバイオマーカーの完全な集合)を使用し得る。他の実施形態では、101個のバイオマーカーの部分集合を使用し得、或いはバイオマーカーの“アップ”(表5a)及び“ダウン”腕(表5b)の部分集合を使用し得る。或いは、表11からのバイオマーカーの全体集合を使用し得、或いは86個のバイオマーカーの部分集合を使用し得、またはバイオマーカーの“アップ”及び“ダウン”腕(表11)の部分集合を使用し得る。
別の実施形態では、発現プロファイルは対照サンプル中の複数の遺伝子の測定値に対する患者由来のサンプル中の前記した複数の遺伝子の差次的測定値を含む差次的発現プロファイルである。差次的測定値はxdev、log(比)、誤差加重log(比)または平均減法したlog(強度)(例えば、各々全文参照により本明細書に組み入れる2000年7月6日に公開されたPCT公開WO00/39339及び2004年8月5日に公開されたPCT公開WO2004/065545を参照されたい)であり得る。
サンプルまたは個体のバイオマーカー発現プロファイルと対照のバイオマーカー発現プロファイル間の類似性は当業界で公知の任意の方法を用いていろいろな方法で評価され得る。例えば、Daiらは乳癌患者を分類する際に有用な遺伝子発現テンプレート及び対応するバイオマーカー遺伝子集合を計算する多数の各種方法を記載している(US7,171,311、WO2002/103320、WO2005/086891、WO2006015312、WO2006/084272)。また、Linsleyら(US2003/0104426)及びRadishら(US20070154931)は慢性骨髄性白血病患者を分類する際に有用な遺伝子バイオマーカー遺伝子集合及び遺伝子発現テンプレートの計算方法を開示している。最も単純な場合、プロファイルを発現差データのプリントアウトを用いて肉眼で比較することができる。或いは、類似性は数学的に計算することができる。
1つの実施形態では、2人の患者(またはサンプル)x及びy間、或いは患者(またはサンプル)xとテンプレートy間の類似度は以下の方程式を用いて計算することができる:
この方程式中、x及びyはlog比xi及びyi、i=1、2,…、N=4,986のコンポーネントを有する2人の患者である。すべてのxiが誤差σxiを伴っている。値σxiが小さいほど、測定値xiはより高い信頼性である。
は誤差加重算術平均である。
1つの実施形態では、類似性は患者またはサンプルプロファイルとテンプレート間の相関係数により表される。1つの実施形態では、相関閾値を超える相関係数は高い類似性を示し、閾値を下回る相関係数は低い類似性を示す。幾つかの実施形態では、相関閾値は0.3、0.4、0.5または0.6として設定されている。別の実施形態では、サンプルまたは患者プロファイルとテンプレート間の類似性はサンプルプロファイルとテンプレート間の距離で表される。1つの実施形態では、所与の値を下回る距離は高い類似性を示し、所与の値以上の距離は低い類似性を示す。
好ましい実施形態では、テンプレートをサンプル比較のために開発する。テンプレートは、バイオマーカー遺伝子の群が特定の増殖因子シグナル伝達経路レギュレーション状態を区別することができるように発現差の誤差加重log比平均として定義され得る。例えば、テンプレートはデレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路サンプル及びレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路サンプルに対して定義される。次いで、分類子パラメーターを計算する。このパラメーターはサンプルとテンプレート間の発現レベル差を用いて、または相関係数を計算することにより計算され得る。前記係数Piは以下の方程式を用いて計算され得る:
ここで、i=1及び2である。
説明として、1つの実施形態では、1つの表現型エンドポイント、例えば増殖因子シグナル伝達経路デレギュレート状態に基づいてサンプルを分類するためのテンプレートは
(例として、例えば増殖因子シグナル伝達経路レギュレーション状態に関連する相関値C1からなるプロファイル)として定義され、及び/または第2の表現型エンドポイント、すなわち増殖因子シグナル伝達経路レギュレート状態のためのテンプレートは
(例として、例えば増殖因子シグナル伝達経路レギュレーション状態に関連する相関値C2からなるプロファイル)として定義される。その後、2つの分類子パラメーター(P1及びP2)の1つまたは両方がサンプルのプロファイルとテンプレート間の類似度を調べるために使用され得る。P1はサンプルのプロファイル
と第1発現テンプレート
間の類似性を判定し、P2は
と第2発現テンプレート
間の類似性を判定する。
よって、1つの実施形態では、P1が選択した相関閾値よりも大きいかまたはP2が選択した相関閾値以下であるならば、
は例えばデレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路プロファイルとして分類される。別の実施形態では、P1が選択した相関閾値未満であるかまたはP2が選択した相関閾値を上回るならば、
は例えばレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路プロファイルとして分類される。更に別の実施形態では、P1が第1の選択した相関閾値よりも大きいならば
は例えばデレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路プロファイルとして分類され、P2が第2の選択した相関閾値よりも大きいならば
は例えばレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路プロファイルとして分類される。
よって、より具体的実施形態では、個体の特定の腫瘍関連状態を確認する上記方法は、(1)個体由来の標識標的ポリヌクレオチドを上記マーカー集合の1つを含むマイクロアレイにハイブリダイズするステップ;(2)標的分子由来の差次的に標識されている標準または対照ポリヌクレオチド分子をマイクロアレイにハイブリダイズするステップ;(3)2つのチャネル(個体及び対照)間の転写物レベルの比(または、差)、または単に個体の転写物レベルを測定するステップ;及び(4)(3)からの結果を予め定義したテンプレートと比較するステップを含み、この測定は当業界で公知の手段(セクション3.4,6の発現プロファイルの分類方法を参照されたい)により実施され、差の有無により個体の腫瘍関連状態を確認する。
方法は表5a及び5bにリストされているバイオマーカーの完全集合を使用し得る。しかしながら、101個のバイオマーカーの部分集合、またはバイオマーカーの“アップ”(表5a)または“ダウン”(表5b)腕を使用してもよい。或いは、表11からのバイオマーカーの全体集合を使用しても、86個のバイオマーカーの部分集合を使用しても、またはバイオマーカーの“アップ”及び“ダウン”腕(表11)の部分集合を使用し得る。
別の実施形態では、個体の増殖因子経路レギュレーション状態を確認する上記方法は101個のバイオマーカーの2つの“腕”を使用する。“アップ”腕はその発現が増殖因子経路活性化に伴ってアップする63個の遺伝子(表5aを参照されたい)を含み、“ダウン”腕はその発現が増殖因子経路活性化に伴ってダウンする38個の遺伝子(表5bを参照されたい)を含む。或いは、増殖因子経路レギュレーション状態を確認する上記方法は表11にリストされている86個のバイオマーカーの2つの“腕”、すなわち44個の遺伝子(表11を参照されたい)を含む“アップ”腕及び42個の遺伝子(表11を参照されたい)を含む“ダウン”腕を使用する。個体サンプルを標準または対照と比較する場合、サンプル中の遺伝子Xの発現値を標準または対照中の遺伝子Xの発現値と比較する。バイオマーカーの集合中の各遺伝子毎に、標準または対照に対する個体サンプル中の発現値(差次的発現値)のlog(10)比を求める。サイン“スコア”は、“アップ”中の遺伝子の平均log(10)比を測定した後、“ダウン”腕中の遺伝子の平均log(10)比を減ずることにより計算する。このサインスコアが有意であるかを確認するために、2つの対立する腕中の遺伝子の発現値を相互に比較するANOVA計算(例えば、両側t検定、ウィルコクソン順位和検定、コルモゴルフ−スミルノフ検定等)を実施する。例えば、“アップ”腕中の遺伝子の平均log(10)比が“ダウン”腕中の遺伝子の平均log(10)比と明らかに異なるかを確認するために両側t検定を使用する場合、<0.05のp値は個体サンプル中のサインが標準または対照とは明らかに異なることを示している。サンプルのサインスコアが所定閾値を超えているならば、サンプルは増殖因子シグナル伝達経路のデレギュレーションを有していると見なされる。所定閾値は0であり得、またはサンプルの集合、または標準または対照として使用されるプールしたサンプルのサインスコアの平均、メジアンまたはパーセント点であり得る。代替実施形態では、表5aからの63個の“アップ”遺伝子の少なくとも3、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55及び60個の部分集合及び表5bからの38個の“ダウン”遺伝子の少なくとも3、5、10、15、20、25、30及び35個の部分集合をこのサインスコアを計算するために使用してもよい。或いは、表11からの44個の“アップ”遺伝子の部分集合及び42個の“ダウン”遺伝子の部分集合をサインスコアを計算するために使用してもよい。更に別の実施形態では、表8bからの遺伝子をサインスコアを計算するために使用してもよい。値がバイオマーカーの遺伝子の転写物アバンダンスの客観的測定値を表す限り、log(10)比以外の他の差次的発現値をサインスコアを計算するために使用し得ることを当業者は認識しているであろう。その例にはxdev、誤差加重log(比)及び平均減法log(強度)が含まれるが、これらに限定されない。
バイオマーカー集合を使用する上記方法は、表13にリストされているバイオマーカーの集合を用いてサンプルが活性化解糖経路を有しているかサンプルを分子レベルで決定または分類すべく個体由来のサンプルを分析するためにも使用され得る。表13中の39個のバイオマーカーの全体集合または部分集合を使用してもよい。解糖サインの場合、すべての遺伝子が同一方向でレギュレートされており、相関している。従って、このサインは1つの分枝のみから構成される。
バイオマーカー集合を使用する上記方法は、個体由来のサンプルを分析した後、その増殖因子経路デレギュレーション状態に従ってサンプルを順位付けするためにも使用され得る。サンプルを順位を決定するために基準サンプルと比較してもよい。順位を決めるために、サンプルを所定閾値、例えば基準サンプルに対するバイオマーカー集合または部分集合の平均発現値と比較する。基準サンプルは“デレギュレートされている”または“レギュレートされている”増殖因子シグナル伝達経路サンプルであり得る。サンプルをサンプルのプールと比較し、このサンプルのプールの所定閾値、例えばバイオマーカー集合または部分集合の平均、メジアンまたはパーセント点発現値と比較することにより順位付けてもよい。サンプルをそのサインスコアに従って順位付けてもよい。
3.4.2 治療に対する応答を予測し、治療を割り当てる方法
本発明は、増殖因子シグナル伝達経路をモジュレートする物質での治療に応答すると予測される患者からのサンプルを増殖因子シグナル伝達経路をモジュレートする物質での治療に応答すると予測されない患者から区別するために有用なバイオマーカーの集合を提供する。よって、本発明は、更に癌を有している個人が増殖因子シグナル伝達経路をモジュレートする物質での治療に対して予測される応答者であるかを判定するために上記バイオマーカーを使用するための方法を提供する。1つの実施形態では、本発明は、癌患者の増殖因子シグナル伝達経路をモジュレートする物質に対する応答を予測する方法を提供し、その方法は、(1)個体から採取したサンプル中の表5a及び5bにリストされているバイオマーカーの発現のレベルをサンプル中でデレギュレートされている増殖因子シグナル伝達を有することが分かっているレベルに相当する標準または対照中の同一バイオマーカーの発現のレベルと比較し;(2)個体からのサンプル中のバイオマーカー関連ポリヌクレオチドのレベルが対照のレベルと有意に異なっているかを調べることを含み、実質的な差が見られないならば患者は増殖因子シグナル伝達経路をモジュレートする物質での治療に対して応答すると予想され、実質的な差が見られたならば患者は増殖因子シグナル伝達経路をモジュレートする物質での治療に応答しないと予想される。当業者は、標準または対照レベルがレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路を有する腫瘍サンプルに由来し得ることが容易に分かるであろう。より具体的実施形態では、両方の対照を流す。プールが純粋な“レギュレートされている増殖因子”または“デレギュレートされている増殖因子”でない場合、公知の応答者状態を有する個体の実験の組を前記プールに対してハイブリダイズして、予測される応答者及び予測される非応答者群に対する発現テンプレートを規定しなければならない。未知の出力を有する各個体を同一のプールにハイブリダイズし、生じた発現プロファイルをテンプレートと比較してその出力を予測する。
本発明は、増殖因子シグナル伝達経路をモジュレートする物質での治療に応答すると予測される患者からのサンプルを増殖因子シグナル伝達経路をモジュレートする物質での治療に応答すると予測されない患者から区別するために有用なバイオマーカーの集合を提供する。よって、本発明は、更に癌を有している個人が増殖因子シグナル伝達経路をモジュレートする物質での治療に対して予測される応答者であるかを判定するために上記バイオマーカーを使用するための方法を提供する。1つの実施形態では、本発明は、癌患者の増殖因子シグナル伝達経路をモジュレートする物質に対する応答を予測する方法を提供し、その方法は、(1)個体から採取したサンプル中の表5a及び5bにリストされているバイオマーカーの発現のレベルをサンプル中でデレギュレートされている増殖因子シグナル伝達を有することが分かっているレベルに相当する標準または対照中の同一バイオマーカーの発現のレベルと比較し;(2)個体からのサンプル中のバイオマーカー関連ポリヌクレオチドのレベルが対照のレベルと有意に異なっているかを調べることを含み、実質的な差が見られないならば患者は増殖因子シグナル伝達経路をモジュレートする物質での治療に対して応答すると予想され、実質的な差が見られたならば患者は増殖因子シグナル伝達経路をモジュレートする物質での治療に応答しないと予想される。当業者は、標準または対照レベルがレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路を有する腫瘍サンプルに由来し得ることが容易に分かるであろう。より具体的実施形態では、両方の対照を流す。プールが純粋な“レギュレートされている増殖因子”または“デレギュレートされている増殖因子”でない場合、公知の応答者状態を有する個体の実験の組を前記プールに対してハイブリダイズして、予測される応答者及び予測される非応答者群に対する発現テンプレートを規定しなければならない。未知の出力を有する各個体を同一のプールにハイブリダイズし、生じた発現プロファイルをテンプレートと比較してその出力を予測する。
腫瘍の増殖因子シグナル伝達経路デレギュレーション状態は、増殖因子シグナル伝達経路をモジュレートする物質での治療に応答するが、有糸分裂抑制剤に応答しない被験者を示し得る。従って、本発明は、表5a及び5bの101個のバイオマーカーまたはその部分集合の発現のレベルがデレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路状態またはレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路状態に相当するサンプル中の前記バイオマーカーのレベルと相関しているかを調べ;治療方針を決定または割り当てることを含む癌患者の治療方針を決定または割り当てる方法を提供し、発現がデレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路状態パターンに相関しているならば腫瘍は増殖因子シグナル伝達経路をモジュレートする物質で治療され、有糸分裂抑制剤タイプの癌物質で治療されない。
診断バイオマーカーの場合のように、上記方法は表5a及び5bにリストされているバイオマーカーの完全集合を使用し得る。しかしながら、101個のバイオマーカーの部分集合を使用してもよい。別の実施形態では、被験者の増殖因子シグナル伝達経路をモジュレートする物質に対する応答を予測したり、被験者に治療を割り当てるために101個の集合から選抜した少なくとも5、10、20、30、40、50、75または100個のバイオマーカーの部分集合を使用してもよい。或いは、表11からのバイオマーカーの全体集合を使用しても、86個のバイオマーカーの少なくとも5、10、20、30、40、50、60、70または75個の部分集合を使用しても、またはバイオマーカーの“アップ”及び“ダウン”腕(表11)の部分集合を使用してもよい。
サンプルを“予測される応答者”または“予測される非応答者”として分類することは上記した診断バイオマーカーと実質的に同様に実施し、テンプレートはサンプル中のいずれかのバイオマーカー発現レベルを比較するために作成する。
別の実施形態では、個体の治療応答を予測したり、治療を割り当てるために増殖因子経路レギュレーション状態を使用する上記方法は101個のバイオマーカーの2つの“腕”を使用する。“アップ”腕はその発現が増殖因子経路活性化に伴ってアップする遺伝子(表5aを参照されたい)を含み、“ダウン”腕はその発現が増殖因子経路活性化に伴ってダウンする遺伝子(表5bを参照されたい)を含む。或いは、増殖因子経路レギュレーション状態を確認する上記方法は表11にリストされている86個のバイオマーカーの2つの“腕”、すなわち44個の遺伝子(表11を参照されたい)を含む“アップ”腕及び42個の遺伝子(表11を参照されたい)を含む“ダウン”腕を使用する。個体サンプルを標準または対照と比較する場合、サンプル中の遺伝子Xの発現値を標準または対照中の遺伝子Xの発現値と比較する。バイオマーカーの集合中の各遺伝子毎に、標準または対照と比較した個体サンプル中の発現値についてlog(10)比を得る。サイン“スコア”は、“アップ”中の遺伝子の平均log(10)比を求めた後、“ダウン”腕中の遺伝子の平均log(10)比を減ずることにより計算する。サインスコアが所定閾値を超えているならば、サンプルは増殖因子シグナル伝達経路のデレギュレーションを有していると見なされる。所定閾値は0であり得、または標準または対照として使用したサンプルの集合またはプールしたサンプルのサインスコアの平均、メジアンまたはパーセント点であり得る。サインスコアが有意であるかを調べるために、2つの対立する腕中の遺伝子の発現値を相互に比較するANOVA計算(例えば、両側t検定、ウィルコクソン順位和検定、コルモゴルフ−スミルノフ検定等)を実施する。例えば、“アップ”腕中の遺伝子の平均log(10)比が“ダウン”腕中の遺伝子の平均log(10)比と有意に異なるかを調べるために両側t検定を使用するならば、<0.05のp値は個体サンプル中のサインが標準または対照と有意に異なることを示す。代替実施形態では、表5aからの63個の“アップ”遺伝子の少なくとも3、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55及び60個の部分集合及び表5bからの38個の“ダウン”遺伝子の少なくとも3、5、10、15、20、25、30及び35個の部分集合をこのサインスコアを計算するために使用し得る。更に別の実施形態では、表11からの44個の“アップ”遺伝子の少なくとも3、5、10、15、20、25、30、35及び40個の部分集合及び表11からの42個の“ダウン”遺伝子の少なくとも3、5、10、15、20、25、30、35及び40個の部分集合をこのサインスコアを計算するために使用し得る。値がバイオマーカーの遺伝子の転写物アバンダンスの客観的測定値を表す限り、log(10)比以外の他の差次的発現値がサインスコアを計算するために使用され得ることを当業者は認識している。その例にはxdev、誤差加重log(比)及び平均減法log(強度)が含まれるが、これらに限定されない。
バイオマーカー集合を使用する上記方法は、表13にリストされているバイオマーカーの集合を用いて解糖経路をモジュレートする物質に対する応答を予測すべく個体由来のサンプルを分析するためにも使用され得る。表13中の39個のバイオマーカーの全体集合または部分集合を使用してもよい。
バイオマーカーの使用は、癌関連状態についての増殖因子シグナル伝達経路をモジュレートする物質に対する応答の予測に限定されず、遺伝子発現が役割を果たす各種の表現型、或いは臨床的または実験的状態において適用され得る。2つ以上の表現型に対応するバイオマーカーの集合が同定されたら、そのバイオマーカー集合を表現型を区別するために使用し得る。例えば、表現型は癌及び他の病的状態、または他の生理学的状態に関連する臨床状態の診断及び/または予後、増殖因子シグナル伝達経路以外の経路をモジュレートする物質に対する応答の予測であり得、発現レベルデータは特定の生理学的または病的状態に相関する遺伝子の集合から誘導される。
3.4.3 物質が増殖因子シグナル伝達経路をモジュレートするかを調べる方法
本発明は、被験者において増殖因子シグナル伝達経路を修飾またはモジュレートすると予測される物質を同定または評価するために有用なパイオマーカーの集合及び前記バイオマーカーの使用方法を提供する。「増殖因子シグナル伝達経路」はまず増殖因子(非限定的に、ヘレグリン、インスリン、IGF、FGF、EGFが含まれる)が受容体チロシンキナーゼ(非限定的に、受容体のERBBファミリーが含まれる)に結合することにより開始する。増殖因子がその対応する受容体に結合すると、受容体ダイマー化、主要チロシン残基のリン酸化、及び受容体の細胞内部分での幾つかのタンパク質の補充が生ずる。次いで、これらのタンパク質はPI3K/AKT、RAS/ERKやJAK/STATシグナル伝達経路のような幾つかの経路を介する細胞内シグナル伝達を開始し、これにより抗アポトーシスタンパク質の活性化及びプロアポトーシスタンパク質の不活性化が生ずる(Henson and Gibson,2006,Cellular Signaling,18:2089−2097において精査されている)。本明細書中、他の方法で特定されていない限り、「増殖因子シグナル伝達経路」は、外部増殖因子の膜チロシンキナーゼ受容体への結合により開始するPI3K/AKTシグナル伝達経路を介するシグナル伝達を指す。
本発明は、被験者において増殖因子シグナル伝達経路を修飾またはモジュレートすると予測される物質を同定または評価するために有用なパイオマーカーの集合及び前記バイオマーカーの使用方法を提供する。「増殖因子シグナル伝達経路」はまず増殖因子(非限定的に、ヘレグリン、インスリン、IGF、FGF、EGFが含まれる)が受容体チロシンキナーゼ(非限定的に、受容体のERBBファミリーが含まれる)に結合することにより開始する。増殖因子がその対応する受容体に結合すると、受容体ダイマー化、主要チロシン残基のリン酸化、及び受容体の細胞内部分での幾つかのタンパク質の補充が生ずる。次いで、これらのタンパク質はPI3K/AKT、RAS/ERKやJAK/STATシグナル伝達経路のような幾つかの経路を介する細胞内シグナル伝達を開始し、これにより抗アポトーシスタンパク質の活性化及びプロアポトーシスタンパク質の不活性化が生ずる(Henson and Gibson,2006,Cellular Signaling,18:2089−2097において精査されている)。本明細書中、他の方法で特定されていない限り、「増殖因子シグナル伝達経路」は、外部増殖因子の膜チロシンキナーゼ受容体への結合により開始するPI3K/AKTシグナル伝達経路を介するシグナル伝達を指す。
「PI3K/AKTシグナル伝達経路」または「AKTシグナル伝達経路」としても公知の「PI3Kシグナル伝達経路」は、増殖因子が受容体チロシンキナーゼに結合することにより活性化される細胞内シグナル伝達経路の1つを指す。活性化すると、PI3Kはホスファチジルイノシトール−4,5−ビスホスホネート(PIP2)をホスファチジルイノシトール−3,4,5−トリホスフェート(PIP3)にリン酸化し、このプロセスはPTENにより逆転する。PIP3シグナルはキナーゼPDK1を活性化し、後者はキナーゼAKTを活性化する。PI3Kシグナル伝達経路の説明のために図1も参照されたい(PI3K/AKTシグナル伝達カスケードを精査するためにHennessyら,2005,Nat.Rev.Drug Discov.,4:988−1004も参照されたい)。加えて、PI3Kシグナル伝達経路はRAS経路のような他の細胞内シグナル伝達経路によってもモジュレートされ得、その結果増殖因子がその受容体に結合することにより活性化される細胞内シグナル伝達経路内で混線が生ずる。PI3Kシグナル伝達経路には表1にリストされている遺伝子及びそれによりコードされるタンパク質が含まれるが、これらに限定されない。
増殖因子シグナル伝達経路に影響を及ぼす物質には小分子化合物;タンパク質またはペプチド(抗体を含む);siRNA、shRNAまたはミクロRNA分子;或いは増殖因子シグナル伝達経路または増殖因子シグナル伝達経路と相互作用する他のシグナル伝達経路(例えば、RAS経路)内で機能する1つ以上の遺伝子またはタンパク質をモジュレートする他の物質が含まれる。
「増殖因子経路物質」は、PI3K/AKTシグナル伝達腕を介して増殖因子経路シグナル伝達をモジュレートする物質を指す。増殖因子経路インヒビターはPI3K/AKTシグナル伝達腕を介する増殖因子経路シグナル伝達を抑制する。前記インヒビターの分子標的にはPI3K、AKT、mTOR、PDK1、MYC、cMET、FGFR2、及び表1にリストされている遺伝子が含まれ得る。前記物質は当業界で公知であり、その中にはホスファチジルイノシトールエーテルリピドアナログ、アルキルホスホリピドアナログ、アロステリックAKTインヒビター、HSP90インヒビター、アルキルホスホリピドペリホシン、ラパマイシン、RAD001、FTY720、PDK1インヒビター(BX−795、BX−912及びBX−320(Feldmanら,2005,J.Biol.Chem.,280:19867−19874)、7−ヒドロキシスタウロスポリン(Satoら,2002,Oncogene,21:1727−1738)、PI3Kインヒビター(ワートマニン(Wymannら,1996,Mol.Cell.Biol.,16:1722−1733)、LY294002(Wetzker and Rommel,2004,Curr.Pharm.Des.,10:1915−1922)、IC87114(Finan and Thomas,2004,Biochem.Soc.Trans.,32:378−382;WO0181346、WO01372557、US6403588、WO0143266)、及びAKT抗体(Shinら,2005,Cancer Res.,65:2815−2824を参照されたい)が含まれるが、これらに限定されない(AKT経路のインヒビターを精査するためにChengら,Oncogene,2005,24:7482−7492も参照されたい)。増殖因子シグナル伝達経路バイオマーカーを同定し、細分するために使用した実施例セクションにリストされているインヒビター(すなわち、AKT1/2インヒビターL−001154547(’547;3−フェニル−2−(4−{[4−(5−ピリジン−2−イル−1H−1,2,4−トリアゾル−3−イル)ピペリジン−1−イル]メチル}フェニル)−1,6−ナフチリジン−5(6H)−オン;WO2006065601に開示されている)、L−01173931(’931;6−メチル−3−フェニル−2−(4−{[4−(5−ピリジン−2−イル−1H−1,2,4−トリアゾル−3−イル)ピペリジン−1−イル]−メチル}フェニル)−1,6−ナフチリジン−5(6H)−オン;WO2006065601に開示されている)、γ−セクレターゼインヒビター421B(US7,138,400及びWO02/36555)、cMETインヒビターL−0015014(4−(6−フェニル−[1,2,4]トリアゾロ[4,3−b][1,2,4]トリアジン−3−イルメチル)−フェノール;US7,122,548も参照されたい)、MK−2461(N−[(2R)−1,4−ジオキサン−2−イルメチル]−N−メチル−N’−[3−(1−メチル−1H−ピラゾル−4−イル)−5−オキソ−5H−ベンゾ[4,5]シクロヘプタ[1,2−6]ピリジン−7−イル]スルファミド)及びL−001793225(1−[3−(1−メチル−1H−ピラゾル−4−イル)−5−オキソ−5H−ベンゾ[4,5]シクロヘプタ[1,2−b]ピリジン−7−イル]−N−(ピリジン−2−イルメチル)メタンスルホンアミドも増殖因子経路物質の例である。
1つの実施形態では、効果を測定したり、物質が増殖因子シグナル伝達経路をモジュレートするかを調べるための方法は、(1)物質で処理したサンプル中の表5a及び5bにリストされているバイオマーカーの発現のレベルをビヒクル処理サンプル中で観察される発現のレベルに相当する標準または対照中の同一バイオマーカーの発現のレベルと比較し;(2)処理したサンプル中のバイオマーカー関連ポリヌクレオチドのレベルがビヒクル処理した対照のレベルに比して有意な差があるかを確認することを含み、実質的な差がなければこの物質は増殖因子シグナル伝達経路のモジュレートしないと予測され、実質的な差があるならばこの物質は増殖因子シグナル伝達経路のモジュレートすると予測される。より具体的実施形態では、本発明は、物質の増殖因子シグナル伝達経路に対する効果を確認または調べるために使用され得る101個の集合から選抜した少なくとも5、10、20、30、40、50、75または100個のバイオマーカーの部分集合を提供する。或いは、表11からの86個のバイオマーカーの全体集合を使用しても、86個のバイオマーカーの少なくとも5、10、20、30、40、50、60、70または75個の部分集合を使用してもよい。
別の実施形態では、物質の増殖因子シグナル伝達経路に対する効果を判定する上記方法は101個のバイオマーカーの2つの“腕”を使用する。“アップ”腕はその発現が増殖因子経路活性化に伴ってアップする遺伝子(表5aを参照されたい)を含み、“ダウン”腕はその発現が増殖因子経路活性化に伴ってダウンする遺伝子(表5bを参照されたい)を含む。或いは、“アップ”腕はその発現が増殖因子経路活性化に伴ってアップする表11からの遺伝子を含み、“ダウン”腕はその発現が増殖因子経路活性化に伴ってダウンする表11からの遺伝子を含む。個体サンプルを標準または対照と比較する場合、サンプル中の遺伝子Xの発現値を標準または対照中の遺伝子Xの発現値と比較する。バイオマーカーの集合中の各遺伝子毎に、標準または対照と比較した個体サンプル中の発現値のlog(10)比を求める。サイン“スコア”は“アップ”腕中の遺伝子の平均log(10)比を求め、“ダウン”腕中の遺伝子の平均log(10)比を減ずることにより計算する。サインスコアが所定閾値を超えているならば、サンプルは増殖因子シグナル伝達経路のデレギュレーションを有している(すなわち、物質は増殖因子シグナル伝達経路をモジュレートする)と見なされる。所定閾値は0であり得、或いは標準または対照として使用されるサンプルの集合またはプールしたサンプルのサインスコアの平均、メジアンまたはパーセント点であり得る。サインスコアが有意であるかを判定するために、2つの対立する腕中の遺伝子の発現値を相互に比較するANOVA計算(例えば、両側t検定、ウィルコクソン順位和検定、コルモゴルフ−スミルノフ検定等)を実施する。例えば、“アップ”腕中の遺伝子の平均log(10)比が“ダウン”腕中の遺伝子の平均log(10)比に比して有意な差があるかを判定するために両側t検定を使用するならば、<0.05のp値は個体サンプル中のサインが標準または対照とは有意に異なることを示す。或いは、“アップ”腕(表5aを参照されたい)から選抜した少なくとも3、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55または60個のバイオマーカーの部分集合及び“ダウン”腕(表5bを参照されたい)から選抜した少なくとも3、5、10、15、20、25、30または35個のバイオマーカーの部分集合をこのサインスコアを計算するために使用してもよい。更に別の実施形態では、“アップ”腕から選抜した少なくとも3、5、10、15、20、25、30、35または40個のバイオマーカーの部分集合(表11を参照されたい)及び“ダウン”腕から選抜した少なくとも3、5、10、15、20、25、30、35または40個のバイオマーカーの部分集合(表11を参照されたい)をこのサインスコアを計算するために使用してもよい。値がバイオマーカーの遺伝子の転写物アバンダンスの客観的測定値を表す限り、log(10)比以外の他の差次的発現値がサインスコアを計算するために使用され得ることを当業者は認識している。その例にはxdev、誤差加重log(比)及び平均減法log(強度)が含まれるが、これらに限定されない。
バイオマーカー集合を使用する上記方法は、表13にリストされているバイオマーカーの集合を用いて物質が解糖経路をモジュレートするかを確認するために個体からのサンプルを分析するためにも使用され得る。表13中の39個のバイオマーカーの全体集合または少なくとも5、10、15、20、25、30または35個の部分集合が使用され得る。
用語「解糖経路(glycolysis pathway)」または「解糖経路(glycolytic pathway)」は、1つのグルコース分子を2つのピルベート分子に分解して2つのATPを生成する酸素非依存性細胞エネルギー生成経路を指す。その後、ピルベートは解糖経路においてラクテートに還元される。酸素の存在下でピルベートはHCO3に酸化されると、グルコース1個あたり36個の追加ATPが生ずる(酸化的リン酸化経路)。酸素の存在下でのグルコースの乳酸への変換は「好気的解糖」または「ワーブルグ効果」とも称されている。酸素の存在下での高い解糖は原発性及び転移性癌の特徴である(Gatenby and Gillies,2004,Nature Reviews Cancer,4:891−899;Lopez−Lazaro,2008,Anti−Cancer Agents in Med.Chem.,8:305−312;Kondoh,2008,Exp.Cell Res.,314:1923−1928において精査されている)。
解糖経路に影響を及ぼす物質には小分子化合物;タンパク質またはペプチド(抗体を含む);siRNA、shRNAまたはミクロRNA分子;或いは解糖経路または解糖経路と相互作用する他の経路内で機能する1つ以上の遺伝子またはタンパク質をモジュレートする他の物質が含まれる。
「解糖経路物質」は解糖経路をモジュレートする物質を指す。解糖インヒビターは解糖経路を抑制する。前記インヒビターの分子標的にはヘキソキナーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、ピルベートキナーゼ、グルコーストランスポーターが含まれるが、これらに限定されない。前記物質は当業界で公知であり、この中にはロニダミン、3−ブロモピルベート、2−デオキシグルコース、イマチニブ、ATPクエン酸リアーゼ阻害剤SB−204990、オキシチアミン、ゲニステイン、5−チオグルコース、マンノヘプツロース、α−クロロヒドリン、オルニダゾール、グルフォスファミド、ヒ素化合物、オキサマート、ヨードアセテート、ビスホスホネート、ツベルシジン、並びにNa+/K+−ATPアーゼポンプインヒビター、GLUTインヒビター、3−(3−ピリジニル)−1−(4−ピリジニル)−2−プロペン−1−オン、ジクロロアセテート(Lopez−Lazaro,2008,Anti−Cancer Agents in Medicinal Chemistry,8:305−312;Clemら,2008,Mol.Cancer Ther.,7:110−120;Bonnetら,2007,Cancer Cell,11:37−51において精査されている)が含まれるが、これらに限定されない。
バイオマーカー集合を使用する上記方法は物質のバイオマーカー集合または部分集合に対する効果に従って前記物質を順位付けるためにも使用され得る。例えば、物質はバイオマーカー集合または部分集合中の差次的発現値(例えば、バイオマーカーの集合または部分集合の平均発現値、またはサインスコア)において誘導される変化に従って順位付けられ得る。候補物質は問題の特定経路を修飾することが公知の物質と比較することによっても順位付けられ得る。
3.4.4 物質の薬力学的効果の測定方法
本発明は、増殖因子シグナル伝達経路に対する物質の薬力学的効果を判定するために有用なバイオマーカーの集合を提供する。提供されるバイオマーカーは患者またはサンプルにおいて物質で治療してからのいろいろな時点での増殖因子シグナル伝達経路のモジュレーションをモニターするために使用され得る。よって、本発明は、更に増殖因子シグナル伝達経路をモジュレートする物質の有効性の早期評価として上記バイオマーカーを使用する方法を提供する。1つの実施形態では、本発明は、(1)物質で処理したサンプル中の表5a及び5bにリストされているバイオマーカーの発現のレベルをビヒクル処理サンプルにおいて観察される発現のレベルに相当する標準または対照中の同一バイオマーカーの発現のレベルと比較し;(2)処理サンプル中のバイオマーカー関連ポリヌクレオチドのレベルがビヒクル処理対照中のレベルに比して有意な差があるかを調べることを含む患者またはサンプル中の増殖因子シグナル伝達経路をモジュレートする物質の薬力学的効果を判定するための方法を提供し、実質的な差が見られないならば当該物質は増殖因子シグナル伝達経路に対して薬力学的効果を有していないと予測され、実質的な差が見られたなら当該物質は増殖因子シグナル伝達経路に対して薬力学的効果を有していると予想される。より具体的実施形態では、本発明は、増殖因子シグナル伝達経路に対する物質の薬力学的活性をモニターするために使用され得る101個の集合から選抜した少なくとも5、10、20、30、40、50、75または100個のバイオマーカーの部分集合を提供する。更に別の実施形態では、増殖因子シグナル伝達経路に対する物質の薬力学的活性をモニターするために表11にリストされている86個のバイオマーカーの集合を使用しても、また86個の集合から選抜した少なくとも5、10、20、30、40、50、60、70または80個のバイオマーカーの部分集合を使用してもよい。
本発明は、増殖因子シグナル伝達経路に対する物質の薬力学的効果を判定するために有用なバイオマーカーの集合を提供する。提供されるバイオマーカーは患者またはサンプルにおいて物質で治療してからのいろいろな時点での増殖因子シグナル伝達経路のモジュレーションをモニターするために使用され得る。よって、本発明は、更に増殖因子シグナル伝達経路をモジュレートする物質の有効性の早期評価として上記バイオマーカーを使用する方法を提供する。1つの実施形態では、本発明は、(1)物質で処理したサンプル中の表5a及び5bにリストされているバイオマーカーの発現のレベルをビヒクル処理サンプルにおいて観察される発現のレベルに相当する標準または対照中の同一バイオマーカーの発現のレベルと比較し;(2)処理サンプル中のバイオマーカー関連ポリヌクレオチドのレベルがビヒクル処理対照中のレベルに比して有意な差があるかを調べることを含む患者またはサンプル中の増殖因子シグナル伝達経路をモジュレートする物質の薬力学的効果を判定するための方法を提供し、実質的な差が見られないならば当該物質は増殖因子シグナル伝達経路に対して薬力学的効果を有していないと予測され、実質的な差が見られたなら当該物質は増殖因子シグナル伝達経路に対して薬力学的効果を有していると予想される。より具体的実施形態では、本発明は、増殖因子シグナル伝達経路に対する物質の薬力学的活性をモニターするために使用され得る101個の集合から選抜した少なくとも5、10、20、30、40、50、75または100個のバイオマーカーの部分集合を提供する。更に別の実施形態では、増殖因子シグナル伝達経路に対する物質の薬力学的活性をモニターするために表11にリストされている86個のバイオマーカーの集合を使用しても、また86個の集合から選抜した少なくとも5、10、20、30、40、50、60、70または80個のバイオマーカーの部分集合を使用してもよい。
別の実施形態では、増殖因子シグナル伝達経路に対する物質の薬力学的活性を測定する上記方法は101個のバイオマーカーの2つの“腕”を使用する。“アップ”腕はその発現が増殖因子経路活性化に伴ってアップする遺伝子(表5aを参照されたい)を含み、“ダウン”腕はその発現が増殖因子経路活性化に伴ってダウンする遺伝子(表5bを参照されたい)を含む。或いは、薬力学的活性を測定する上記方法は表11にリストされている86個のバイオマーカーの2つの“腕”、すなわち44個の遺伝子(表11を参照されたい)を含む“アップ”腕及び42個の遺伝子を含む“ダウン”腕(表11を参照されたい)を使用する。個体サンプルを標準または対照と比較する場合、サンプル中の遺伝子Xの発現値を標準または対照中の遺伝子Xの発現値と比較する。バイオマーカーの集合中の各遺伝子毎に、標準または対照に対する個体サンプル中の発現値についてのlog(10)比を求める。サイン“スコア”は、“アップ”腕中の遺伝子の平均log(10)比を求め、“ダウン”腕中の遺伝子の平均log(10)比を減ずることにより計算する。サインスコアが所定閾値を超えているならば、サンプルは増殖因子シグナル伝達経路のデレギュレーションを有していると見なされる。所定閾値は0であり得、或いは標準または対照として使用したサンプルの集合またはプールしたサンプルのサインスコアの平均、メジアンまたはパーセント点であり得る。サインスコアが有意であるかを確認するために、2つの対立する腕中の遺伝子の発現値を相互に比較するANOVA計算(例えば、両側t検定、ウィルコクソン順位和検定、コルモゴルフ−スミルノフ検定等)を実施する。例えば、“アップ”腕中の遺伝子の平均log(10)比が“ダウン”腕中の遺伝子の平均log(10)比と有意に異なるかを調べるために両側t検定を使用するならば、<0.05のp値は個体サンプル中のサインが標準または対照と有意に異なることを示す。或いは、“アップ”腕(表5aを参照されたい)から選抜した少なくとも3、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55または60個のバイオマーカーの部分集合及び“ダウン”腕(表5bを参照されたい)から選抜した少なくとも3、5、10、15、20、25、30または35個のバイオマーカーの部分集合をこのサインスコアを計算するために使用してもよい。更に別の実施形態では、“アップ”腕(表11を参照されたい)から選抜した少なくとも3、5、10、15、20、25、30、35または40個のバイオマーカーの部分集合及び“ダウン”腕(表11を参照されたい)から選抜した少なくとも3、5、10、15、20、25、30、35または40個のバイオマーカーの部分集合をこのサインスコアを計算するために使用してもよい。値がバイオマーカーの遺伝子の転写物アバンダンスの客観的測定値を表す限り、log(10)比以外の他の差次的発現値をサインスコアを計算するために使用し得ることを当業者は認識している。その例にはxdev、誤差加重log(比)及び平均減法log(強度)が含まれるが、これらに限定されない。
バイオマーカー集合を使用する上記方法は、表13にリストされているバイオマーカーの集合を用いて解糖経路に対する物質の薬力学的効果を判定すべく個体からのサンプルを分析するために使用され得る。表13中の39個のバイオマーカーの全体集合または部分集合が使用され得る。
バイオマーカーの使用は癌関連状態についての増殖因子シグナル伝達経路に対する物質の薬力学的効果を判定することに限定されず、遺伝子発現が役割を発揮する各種の表現型、或いは臨床的または実験的状態においても適用され得る。2つ以上の表現型に対応するバイオマーカーの集合が同定されたら、これらの表現型を区別するためにバイオマーカー集合が使用され得る。例えば、癌及び他の病的状態、或いは他の生理的状態に関連する臨床状態、または表現型の診断及び/または予後、増殖因子シグナル伝達経路以外の経路をモジュレートする物質に対する応答の予測であり得、発現レベルデータは特定の生理的状態または病的状態に相関している遺伝子の集合から誘導される。
3.4.5 発現レベル差に対する感度の向上
本明細書中に開示されているバイオマーカーを使用すると、実際1つの表現型を有する個体または被験者を第2の表現型を有する別の個体または被験者と区別するためにバイオマーカーの集合を使用すると、サンプル中の各バイオマーカーの絶対発現を対照と比較することができる。例えば、対照はそれぞれ個体または被験者のプール中の各バイオマーカーの発現の平均レベルであり得る。しかしながら、比較の感度を向上させるために、発現レベル値を多数の方法で変換することが好ましい。
本明細書中に開示されているバイオマーカーを使用すると、実際1つの表現型を有する個体または被験者を第2の表現型を有する別の個体または被験者と区別するためにバイオマーカーの集合を使用すると、サンプル中の各バイオマーカーの絶対発現を対照と比較することができる。例えば、対照はそれぞれ個体または被験者のプール中の各バイオマーカーの発現の平均レベルであり得る。しかしながら、比較の感度を向上させるために、発現レベル値を多数の方法で変換することが好ましい。
例えば、バイオマーカーの各々の発現レベルはその発現レベルを測定するすべてのマーカーの平均発現レベルにより、または対照遺伝子の集合の平均発現レベルにより正規化され得る。よって、1つの実施形態では、バイオマーカーをマイクロアレイ上のプローブにより表され、バイオマーカーの各々の発現レベルは非バイオマーカー遺伝子を含めてマイクロアレイ上に表される遺伝子のすべてで平均またはメジアン発現レベルにより正規化される。具体的実施形態では、正規化はマイクロアレイ上のすべての遺伝子の発現のメジアンまたは平均レベルを分割することにより実施される。別の実施形態では、バイオマーカーの発現レベルは対照バイオマーカーの集合の発現の平均またはメジアンレベルにより正規化される。具体的実施形態では、対照バイオマーカーはハウスキーピング遺伝子の集合を含む。別の具体的実施形態では、正規化は対照遺伝子のメジアンまたは平均発現レベルにより分割することにより実施される。
バイオマーカーをベースとするアッセイの感度は、個々のバイオマーカーの発現レベルをサンプルのプール中の同一バイオマーカーの発現と比較するならば向上させ得る。好ましくは、比較はサンプルのプール中の各バイオマーカー遺伝子の各々の平均またはメジアン発現レベルに対してなされる。前記比較は、例えばサンプル中の各バイオマーカーの発現レベルからバイオマーカーの各々についてのプールの平均またはメジアン発現レベルで割ることによりなされ得る。これは、サンプル中のバイオマーカーとプール中のマーカー間の発現の相対差を全体的に強調して、絶対発現レベルのみを使用するよりも比較をより高感度とし、有意義な結果を与える可能性が増える効果を有している。発現レベルデータは便利な方法で変換され得る。好ましくは、すべてについての発現レベルデータを平均またはメジアンをとる前にlog変換する。
プールに対する比較を実施する場合2つのアプローチを使用し得る。第1は、サンプル中のマーカーの発現レベルをプール中の前記マーカーの発現レベルと比較し得、1つの実験中にサンプル由来の核酸及びプール由来の核酸をハイブリダイズする。このアプローチは、各比較または限定数の比較のために新しいプール核酸を生成する必要があり、従って利用可能な核酸の量により制限される。或いは、正規化及び/または変換されているか否かにかかわらず、プール中の発現レベルをサンプルからの個々の発現レベルデータ(すなわち、単チャネルデータ)と比較する際に使用しようとするコンピューターまたはコンピューター読み取り可能媒体に記憶させる。これが好ましい。
よって、本発明は、第1の細胞または生物を少なくとも2つの第1表現型及び第2表現型からなる異なる表現型の1つを有するとして分類する以下の方法を提供する。第1細胞または生物由来の第1サンプル中の複数の遺伝子の各々の発現レベルをそれぞれ複数の細胞または生物由来のプールしたサンプル中の前記遺伝子の各々の発現レベルと比較して第1の比較値を得る。前記した複数の細胞または生物は少なくとも2つの異なる表現型を示すいろいろな細胞または生物からなる。次いで第1の比較値を、第1表現型を有すると特徴づけられた細胞または生物由来のサンプル中の遺伝子の各々の発現レベルをそれぞれプールしたサンプル中の前記遺伝子の各々の発現レベルと比較することを含む方法の結果である第2の比較値と比較する。次いで、第1比較値を、第2表現型を有すると特徴づけられた細胞または生物由来のサンプル中の遺伝子の各々の発現レベルをそれぞれプールしたサンプル中の前記遺伝子の各々の発現レベルと比較することを含む方法の結果である第3比較値と比較する。場合により、第1比較値をそれぞれ、第1及び第2表現型と異なるが、少なくとも2つの異なる表現型の中に含まれる表現型を有すると特徴づけられた細胞または生物由来のサンプル中の遺伝子の各々の発現レベルをそれぞれプールしたサンプル中の前記遺伝子の各々の発現レベルと比較することを含む方法の結果である追加の比較値と比較してもよい。最後に、第2、第3及び存在するならば1つ以上の追加の比較値のいずれかが第1比較値に最も類似しているかを判定し、第1細胞または生物が第1比較値に最も類似している比較値を得るために使用される細胞または生物の表現型を有していると確認される。
この方法の具体的実施形態では、比較値は前記遺伝子の各々の発現レベルの各比である。別の具体的実施形態では、比較ステップの前にプールしたサンプル中の各遺伝子の発現レベルの各々を正規化する。より具体的実施形態では、発現レベルの正規化は、遺伝子の各々の発現の平均またはメジアンレベルで割ることにより、または細胞または生物由来のプールしたサンプル中の1つ以上のハウスキーピング遺伝子の発現の平均またはメジアンレベルで割ることにより実施される。別の具体的実施形態では、発現の正規化レベルをlog変換にかけ、比較ステップはサンプル中の各遺伝子の発現レベルのlogからlog変換を減ずることを含む。別の具体的実施形態では、2つ以上の異なる表現型は増殖因子シグナル伝達経路の異なるレギュレーション状態である。更に別の具体的実施形態では、2つ以上の異なる表現型は増殖因子シグナル伝達経路をモジュレートする物質での治療に対する異なる予想される応答である。更に別の具体的実施形態では、それぞれプールしたサンプル中の各遺伝子の発現レベル、または第1表現型、第2表現型、或いは第1及び第2表現型とは異なる表現型を有するとして特徴づけられた細胞または生物由来のサンプル中の各遺伝子の発現レベルをコンピューターまたはコンピーター−読み取り可能媒体に記憶させる。
別の具体的実施形態では、2つの表現型はデレギュレートまたはレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路状態である。別の具体的実施形態では、2つの表現型は予想される増殖因子シグナル伝達経路物質応答者状態である。更に別の具体的実施形態では、2つの表現型は増殖因子シグナル伝達経路に対する物質の薬力学的効果の有無である。
別の具体的実施形態では、2つの表現型は活性化または非活性化解糖経路状態である。別の具体的実施形態では、2つの表現型は予測される解糖経路物質応答者状態である。更に別の具体的実施形態では、2つの表現型は解糖経路に対する物質の薬力学的効果の有無である。
別の具体的実施形態では、比較はサンプル中の各遺伝子の発現と2つ以上の表現型の1つのみを表すプール中の同一遺伝子の発現間でなされる。増殖因子シグナル伝達経路状態相関遺伝子の関係で、例えばサンプル中の増殖因子シグナル伝達経路レギュレーション状態関連遺伝子の発現レベルをサンプルの“デレギュレートされている”プール(レギュレート及びデレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路状態を有する患者からのサンプルを含むサンプルのプールとは対照的)中の同一遺伝子の発現の平均レベルと比較することができる。よって、この方法では、予後相関遺伝子の発現レベルが平均“デレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路”発現プロファイル(すなわち、“デレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路状態”を有する患者からのサンプルのプール中の増殖因子シグナル伝達経路状態相関遺伝子の発現レベル)に対する選択した相関係数を超えているならば、サンプルはデレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路状態を有するとして分類される。その発現レベルが“デレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路”発現プロファイルと余り相関していない(すなわち、その相関係数が選択した係数を超えていない)患者または被験者はレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路状態を有するとして分類される。
勿論、1チャネルデータを算術サンプルプールと具体的に比較することなく使用してもよい。例えば、第1及び第2表現型が関連している場合、(a)サンプル由来の核酸を蛍光基で標識して蛍光基標識核酸のプールを得;(b)蛍光基標識核酸をハイブリダイゼーションが起こり得る条件下でマイクロアレイと接触させ、マイクロアレイ上の複数の不連続位置の各々で前記条件下でマイクロアレイに結合している蛍光基標識核酸からの蛍光発光シグナルを検出し;(c)個々のサンプル中のマーカー遺伝子発現の第1及び第2テンプレートに対する類似性を調べて、前記発現が第1テンプレートにより類似しているならばサンプルを第1表現型を有しているとして分類し、前記表現が第2テンプレートにより類似しているならばサンプルは第2表現型を有しているとして分類することにより、サンプル中の第1または第2表現型と相関している少なくとも5個のマーカーの発現と第1表現型テンプレート及び第2表現テンプレート中の同一マーカーの発現間の類似性を計算することにより、サンプルを第1または第2表現型を有するとして分類し得る。
3.4.6 発現プロファイルの分類方法
好ましい実施形態では、本発明の方法は、サンプルの増殖因子シグナル伝達経路レギュレーション状態を予測するために、増殖因子シグナル伝達経路をモジュレートする物質に対する応答を予測するために、被験者に治療を割り当てるために及び/または前記物質の薬力学的効果を調べるために分類子を使用する。分類子はバイオマーカープロファイルを含む入力を受け取り、いずれの患者部分集合が患者に属するかを示すデータを含む出力を与える適切なパターン認識方法に基づき得る。分類子は被験者の訓練集団からの訓練データを用いて訓練され得る。典型的には、訓練データは訓練集団中の各被験者毎に患者から採取した適当なサンプル中の複数の遺伝子のそれぞれの遺伝子産物の測定値を含む訓練マーカープロファイル及び出力情報、すなわちデレギュレートまたはレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路状態を含む。
好ましい実施形態では、本発明の方法は、サンプルの増殖因子シグナル伝達経路レギュレーション状態を予測するために、増殖因子シグナル伝達経路をモジュレートする物質に対する応答を予測するために、被験者に治療を割り当てるために及び/または前記物質の薬力学的効果を調べるために分類子を使用する。分類子はバイオマーカープロファイルを含む入力を受け取り、いずれの患者部分集合が患者に属するかを示すデータを含む出力を与える適切なパターン認識方法に基づき得る。分類子は被験者の訓練集団からの訓練データを用いて訓練され得る。典型的には、訓練データは訓練集団中の各被験者毎に患者から採取した適当なサンプル中の複数の遺伝子のそれぞれの遺伝子産物の測定値を含む訓練マーカープロファイル及び出力情報、すなわちデレギュレートまたはレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路状態を含む。
好ましい実施形態では、分類子は下記する分類(パターン認識)方法、例えばプロファイル類似性、人工ニューラルネットワーク、サポートベクトルマシン(SVM)、ロジック回帰、線形及び二次判別分析、決定木、クラスタリング、主成分分析、最近傍分類子分析(上記)に基づき得る。前記分類子は上の関連セクションに記載した方法を用いて訓練集団で訓練され得る。
バイオマーカープロファイルは、上記した方法のような当業界で公知の方法を用いて被験者からの細胞サンプル中の複数の遺伝子産物を測定することにより得られ得る。
各種公知の統計パターン認識方法が本発明と一緒に使用され得る。上記方法に基づく分類子はバイオマーカープロファイル及び訓練患者の増殖因子経路シグナル伝達状態データを用いて構築され得る。次いで、前記分類子は患者のバイオマーカープロファイルに基づいて患者の増殖因子経路シグナル伝達状態を評価するために使用され得る。前記方法は、バイオマーカープロファイル及び訓練患者の増殖因子シグナル伝達経路レギュレーションデータを用いて異なる増殖因子シグナル伝達経路レギュレーション状態を判別するバイオマーカーを同定するためにも使用され得る。
A.プロファイルマッチング
被験者は、被験者からの適当なサンプル中で得たバイオマーカープロファイルを特定の表現型状態を表すバイオマーカープロファイルと比較することにより分類され得る。前記マーカープロファイルは「テンプレートプロファイル」または「テンプレート」とも称される。テンプレートプロファイルに対する類似度により被験者の表現型が評価される。被験者マーカープロファイルとテンプレートプロファイルの類似度が所定閾値を超えているならば、被験者はテンプレートで表される分類に割り当てられる。例えば、被験者の出力予測を被験者のバイオマーカープロファイルを所与の表現型または出力に対応する所定テンプレートプロファイル(例えば、デレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路状態の腫瘍を有する複数の被験者中のバイオマーカーのレベルを代表する複数のバイオマーカーの測定値を含む増殖因子シグナル伝達経路テンプレート)と比較することにより評価され得る。
被験者は、被験者からの適当なサンプル中で得たバイオマーカープロファイルを特定の表現型状態を表すバイオマーカープロファイルと比較することにより分類され得る。前記マーカープロファイルは「テンプレートプロファイル」または「テンプレート」とも称される。テンプレートプロファイルに対する類似度により被験者の表現型が評価される。被験者マーカープロファイルとテンプレートプロファイルの類似度が所定閾値を超えているならば、被験者はテンプレートで表される分類に割り当てられる。例えば、被験者の出力予測を被験者のバイオマーカープロファイルを所与の表現型または出力に対応する所定テンプレートプロファイル(例えば、デレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路状態の腫瘍を有する複数の被験者中のバイオマーカーのレベルを代表する複数のバイオマーカーの測定値を含む増殖因子シグナル伝達経路テンプレート)と比較することにより評価され得る。
1つの実施形態では、類似性は被験者のプロファイルとテンプレート間の相関係数により表される。1つの実施形態では、相関閾値を超える相関係数は高い類似性を示し、閾値を下回る相関係数は低い類似性を示す。
具体的実施形態では、Piは被験者のプロファイル
と特定の出力または表現型(例えば、デレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路状態
またはレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路状態
)を有する被験者中のマーカー遺伝子産物の測定値を代表するマーカー遺伝子産物の測定値を含むテンプレートプロファイル間の類似性を調べる。前記係数P1は以下の方程式:
(ここで、iは第iテンプレートを指す)
を用いて計算され得る。よって、1つの実施形態では、P1が選択した相関閾値を超えているならば
はデレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路プロファイルとして分類される。別の実施形態では、P1が選択した相関閾値を超えているならば
はレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路プロファイルして分類される。好ましい実施形態では、相関閾値は0.3、0.4、0.5または0.6として設定される。別の実施形態では、P1がP2を超えているならば
はデレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路プロファイルとして分類され、P1がP2未満ならば
はレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路プロファイルとして分類される。
を用いて計算され得る。よって、1つの実施形態では、P1が選択した相関閾値を超えているならば
別の実施形態では、患者のプロファイルとテンプレート間の類似性は患者のプロファイルとテンプレート間の距離により表される。1つの実施形態では、所与の値以下の距離は高い類似性を示し、所与の値以上の距離は低い類似性を示す。
1つの実施形態では、式
[ここで、Diは被験者のプロファイル
と特定の増殖因子シグナル伝達経路レギュレーション状態を有する被験者中のマーカー遺伝子産物の測定値を代表するマーカー遺伝子産物の測定値(例えば、デレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路
またはレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路テンプレート
)を含むテンプレートプロファイル間の距離を測定する]
に従うユークリッド距離を使用する。他の実施形態では、ユークリッド距離は更に離れている細胞成分上に漸増する重みを置くために平方する。代替実施形態では、距離測定値Diは
(ここで、y(n)及びzi(n)はそれぞれ被験者のプロファイル
及びテンプレートプロファイル中の第n遺伝子産物の測定値である)
により与えられるマンハッタン距離である。
に従うユークリッド距離を使用する。他の実施形態では、ユークリッド距離は更に離れている細胞成分上に漸増する重みを置くために平方する。代替実施形態では、距離測定値Diは
により与えられるマンハッタン距離である。
別の実施形態では、距離はDi=1−Pi(ここで、Piは上記した相関係数または正規化された内積である)として定義される。
更に他の実施形態では、距離測定値は、いずれも当業界で公知のチェビシェフ距離、パワー距離及びパーセント不一致であり得る。
B.人工ニユーラルネットワーク
幾つかの実施形態では、ニューラルネットワークを使用する。ニューラルネットワークは本発明の分子マーカーの選択した集合に対して構築される。ニューラルネットワークは2段階回帰または分類モデルである。ニューラルネットワークは出力ユニットの層に対して重みの層により結合させた入力ユニットの層(及びバイアス)を含む層状構造を有する。回帰のために、出力ユニットの層は典型的にはたった1つの出力ユニットを含む。しかしながら、ニューラルネットワークはシームレス様式で複数の定量応答を扱うことができる。
幾つかの実施形態では、ニューラルネットワークを使用する。ニューラルネットワークは本発明の分子マーカーの選択した集合に対して構築される。ニューラルネットワークは2段階回帰または分類モデルである。ニューラルネットワークは出力ユニットの層に対して重みの層により結合させた入力ユニットの層(及びバイアス)を含む層状構造を有する。回帰のために、出力ユニットの層は典型的にはたった1つの出力ユニットを含む。しかしながら、ニューラルネットワークはシームレス様式で複数の定量応答を扱うことができる。
多層ニューラルネットワークには、入力ユニット(入力層)、隠れユニット(隠れ層)及び出力ユニット(出力層)がある。更に、入力ユニット以外の各ユニットに結合されている1つのバイアスユニットがある。ニューラルネットワークはDudaら,2001,Pattern Classification,Second Edition,John Wiley & Sons,Inc.,New York;及びHastieら,2001,The Elements of Statistical Learning,Springer−Verlag,New Yorkに記載されている。
ニューラルネットワークを使用するための基本的アプローチは訓練されていないネットワークから始め、訓練パターン(例えば、訓練患者由来のバイオマーカープロファイル)を入力層に対して存在させ、ネットを介してシグナルを通し、出力(例えば、訓練患者における増殖因子シグナル伝達経路レギュレーション状態)を出力層で確認することである。次いで、これらの出力を標的値と比較する。違いは誤差に相当する。この誤差または判定関数は重みの幾つかのスカラー関数であり、ネットワーク出力が所望出力に匹敵するときに最小化される。よって、重みは誤差を減らすように調節される。回帰の場合、この誤差は二乗和誤差であり得る。分類の場合、この誤差は二乗誤差またはクロスエントロピー(偏差)であり得る。例えば、Hastieら,2001,The Elements of Statistical Learning,Springer−Verlag,New Yorkを参照されたい。
3つの一般的に使用されている訓練プロトコルは確率的、バッチ及びオンラインである。確率的訓練では、パターンは訓練集合からランダムに選択され、ネットワーク重みを各パターンプレゼンテーション毎に更新する。確率的逆伝播法のような勾配降下方法により訓練された多層非線形ネットワークはネットワークトポロジーにより規定されるモデルにおいて重み値の最尤法を実施する。バッチ訓練では、学習を実施する前にすべてのパターンをネットワークに提示する。典型的には、バッチ訓練では、幾つかのパスを訓練データにより作成する。オンライン訓練では、各パターンを1度、たった1度ネットに提示する。
幾つかの実施形態では、重みに対する出発値を考慮する。重みがほぼゼロならば、ニューラルネットワークの隠れ層において通常使用されているシグモイドの操作部分(例えば,Hastieら,2001,The Elements of Statistical Learning,Springer−Verlag,New Yorkを参照されたい)は大体線形であり、よってニューラルネットワークはほぼ線形モデルに壊れる。幾つかの実施形態では、重みに対する出発値はゼロに近いランダム値であるように選択される。モデルはほぼ線形から出発し、重みが増えるにつれて非線形となる。必要ならば、個々のユニットを方向に局在させ、非線形性を導入する。正確にゼロの重みを使用すると、ゼロ微分及び完全対称となり、アルゴリズムは動かない。或いは、より大きな重みで出発すると、しばしば解は乏しい。
入力のスケーリングは底層において重みの効果的スケーリングを決定するので、最終解の質に対して大きな影響を有し得る。よって、幾つかの実施形態では、手始めに、平均ゼロ及び標準偏差1を有するようにすべての発現値を標準化する。こうすると、すべての入力が正則化プロセスにおいて等しく処理され、ランダムな出発重みに対する有意義な範囲を選択することができる。標準化入力で、典型的には範囲[−0.7,+0.7]でランダムな均一の重みを取る。
隠れ層を有するネットワークの使用における再発する問題はネットワーク中に使用するための隠れユニットの最適数である。ネットワークの入力及び出力の数は解決すべき問題により決定される。本発明では、所与のニューラルネットワークに対する入力の数は本発明の分子マーカーの選択した集合中の分子マーカーの数であり得る。ニューラルネットワークに対する出力の数は典型的にはちょうど1である。しかしながら、幾つかの実施形態では、ちょうど2つ以上が状態がネットワークにより規定され得るように2つ以上の出力を使用する。ニューラルネットワークにおいてあまり多い隠れユニットを使用すると、ネットワークは多すぎる自由度を有し、余りに長く訓練され、ネットワークがデータを過剰適合する危険がある。隠れユニットが余りに少ないと、訓練集合は学習され得ない。しかしながら、概して、余りに少ないよりもかなり多い隠れユニットを有することがベターである。隠れユニットが余りに少ないと、モデルはデータ中の非線形を捕らえるのに十分な融通性を有していない。隠れユニットが余りに多いと、下記する適切な正則化または剪定を使用するならば過剰の重みはゼロに向かって収縮され得る。典型的な実施形態では、隠れユニットの数は5〜100の範囲にあり、数は入力の数及び訓練ケースの数と共に増加する。
使用しようとする隠れユニットの数を決定する1つの一般的アプローチは正則化アプローチを適用することである。正則化アプローチでは、古典的訓練誤差だけでなく、分類子の複雑さにも依存する新しい評価関数を構築する。具体的には、新しい評価関数が非常に複雑なモデルにペナルティーを課す。この評価における最小についての検索は訓練集合の誤差を訓練集合+正則化期間の誤差のバランスを取り、解決の制約または所望特性を表すことである。
J=Jpat+λJreg
パラメーターλは正則化をより強くまたはより弱く付与するように調節される。換言すると、λの値が大きいと、重みはゼロに向かって収縮する傾向にある。典型的には、確認集合との交差検定がλを推定するために使用される。この検定は、訓練集団のランダム部分集合を除外して設定することにより得られ得る。ペナルティーの他の形、例えば重み除去ペナルティー(例えば、Hastieら,2001,The Elements of Statistical Learning,Springer−Verlag,New Yorkを参照されたい)も使用され得る。
J=Jpat+λJreg
パラメーターλは正則化をより強くまたはより弱く付与するように調節される。換言すると、λの値が大きいと、重みはゼロに向かって収縮する傾向にある。典型的には、確認集合との交差検定がλを推定するために使用される。この検定は、訓練集団のランダム部分集合を除外して設定することにより得られ得る。ペナルティーの他の形、例えば重み除去ペナルティー(例えば、Hastieら,2001,The Elements of Statistical Learning,Springer−Verlag,New Yorkを参照されたい)も使用され得る。
使用しようとする隠れユニットの数を決定するための別のアプローチは最小必要な重みを除外する、すなわち剪定することである。1つのアプローチで、最小のマグニチュードを有する重みを除外する(ゼロに設定する)。このマグニチュードに基づく剪定を実施し得るが、最適ではない。時には、小さいマグニチュードを有する重みが学習及び訓練データのために重要である。幾つかの実施形態では、マグニチュードに基づく剪定アプローチよりもむしろWald統計量を計算する。Wald統計量における基本的考えは、モデル中の隠れユニット(重み)の重要性を推定するために使用され得ることである。次いで、最小の重要性しか有さない隠れユニットを(入力及び出力重みをゼロに設定することにより)排除する。これに関する2つのアルゴリズムは、どの程度の訓練誤差が重みに依存するかを予測し、訓練誤差において最小の増加をもたらす重みを排除するために二次近似を用いるOptimal Brain Damage(OBD)及びOptimal Brain Surgeon(OBS)アルゴリズムである。
Optimal Brain Damage及びOptimal Brain Surgeonは、重みwでネットワークを局所最小誤差に訓練した後、訓練誤差において最小の増加しかもたらさない重みを剪定する同一の基本的アプローチを共有している。全重みベクターδwにおける変化に対する誤差の予想される関数増加は
(ここで、
はヘッセ行列である)
である。我々は誤差が極小であるので第1項は存在しなくなり、第3項及びそれ以上の項は無視される。1つの重みを削除する制約を与えられたこの関数を最小限とするための一般的な解決は
である。ここで、uqは重み空間における第q方向に沿ったユニットベクターであり、Lqは重みqの顕著性に対する近似であり、重みqが剪定され、他の重みがδwに更新されれば、訓練誤差は増加する。これらの方程式はHの逆を必要とする。この逆行列を計算するための1つの方法は小さい値H0 −1=α−1I(ここで、αは小さいパラメーターである)から始め、効果的に重みを一定とする。次いで、行列を
に従って各パータンで更新する。ここで、下付き文字は提示されるパターンに相当し、αmはmと共に減少する。全体訓練集合を提示したら、逆ヘッセ行列はH−1=Hn −1により与えられる。アルゴニズムフォームでは、Optimal Brain Surgeon方法は、
まずnH、w、θを初期化する、
かなり大きいネットワークを最小誤差まで訓練する;
J(w)>θまで、方程式1
によりH−1を計算する;
wを戻す;
終了する。
である。我々は誤差が極小であるので第1項は存在しなくなり、第3項及びそれ以上の項は無視される。1つの重みを削除する制約を与えられたこの関数を最小限とするための一般的な解決は
まずnH、w、θを初期化する、
かなり大きいネットワークを最小誤差まで訓練する;
J(w)>θまで、方程式1
wを戻す;
終了する。
Optimal Brain Damage方法は、行3における逆ヘッセ行列は対角行列の場合特に簡単であるのでコンピュータでより簡単であるる。誤差がθに初期化した基準を超えたときに上記アルゴリズムを中止する。別のアプローチは、重みの除外のためにJ(w)の変化が幾つかの基準値を超えたときには中止するために行6を変化させることである。
幾つかの実施形態では、EasyNN−Plusバージョン4.0gソフトウェアパッケージ(Neural Planner Software Inc.)中に見られる10個のニューロン(10個の隠れユニット)の1つの隠れ層を含む逆伝播ニューラルネットワーク(例えば、Abdi,1994,“A neural network primer”,J.Biol.System.,2,247−283を参照されたい)を使用する。具体例では、EasyNN−Plusプログラム内のパラメーター値は、学習速度0.05、モメンタム0.2に設定する。EasyNN−Plusバージョン4.0gソフトウェアパッケージを使用する幾つかの実施形態では、“外れ値”サンプルを各々20,000学習サイクルを含む20回の独立してシードしたトライアルを実施することにより同定する。
C.サポートベクターマシン
本発明の幾つかの実施形態では、サポートベクターマシン(SVM)は本発明において記載されているマーカー遺伝子の発現プロファイルを用いて被験者を分類するために使用される。SVMの一般的記載は、例えばCristianini and Shawe−Taylor,2000,An Introduction to Support Vector Machines,Cambridge University Press,Cambridge,Boserら,1992,“A training algorithm for optimal margin classifiers”,Proceedings of the 5th Annual ACM Workshop on Computational Learning Theory,ACM Press,Pittsburgh,PA,p.142−152;Vapnik,1998,Statistical Learning Theory,Wiley,New York;Duda,Pattern Classification,Second Edition,2001,John Wiley & Sons,Inc.;Hastie,2001,The Elements of Statistical Learning,Springer,New York;及びFureyら,2000,Bioinformatics,16:906−914中に見つけることができる。生物学的用途におけるSVMの適用はJaakkolaら,Proceedings of the 7th International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology、AAAI Press,Menlo Park,CA(1999);Brownら,Proc.Natl.Acad.Sci.,97(l):262−67(2000);Zienら,Bioinformatics,16(9):799−807(2000);Fureyら,Bioinformatics,16(10):906−914(2000)に記載されている。
本発明の幾つかの実施形態では、サポートベクターマシン(SVM)は本発明において記載されているマーカー遺伝子の発現プロファイルを用いて被験者を分類するために使用される。SVMの一般的記載は、例えばCristianini and Shawe−Taylor,2000,An Introduction to Support Vector Machines,Cambridge University Press,Cambridge,Boserら,1992,“A training algorithm for optimal margin classifiers”,Proceedings of the 5th Annual ACM Workshop on Computational Learning Theory,ACM Press,Pittsburgh,PA,p.142−152;Vapnik,1998,Statistical Learning Theory,Wiley,New York;Duda,Pattern Classification,Second Edition,2001,John Wiley & Sons,Inc.;Hastie,2001,The Elements of Statistical Learning,Springer,New York;及びFureyら,2000,Bioinformatics,16:906−914中に見つけることができる。生物学的用途におけるSVMの適用はJaakkolaら,Proceedings of the 7th International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology、AAAI Press,Menlo Park,CA(1999);Brownら,Proc.Natl.Acad.Sci.,97(l):262−67(2000);Zienら,Bioinformatics,16(9):799−807(2000);Fureyら,Bioinformatics,16(10):906−914(2000)に記載されている。
1つのアプローチで、SVMを使用する場合、遺伝子発現データを平均ゼロ及び単位分散を有するように標準化し、訓練母集団のメンバーを訓練集合及び試験集合にランダムに分ける。例えば、1つの実施形態では、訓練母集団のメンバーの2/3を訓練集合に配置し、訓練母集団のメンバーの1/3を試験集合に配置する。本発明の遺伝子の選択した集合についての発現値をSVMを訓練するために使用する。次いで、訓練したSVMが試験集合中のメンバーを正しく分類することができるかを調べる。幾つかの実施形態では、この計算を分子マーカーの所与の選択した集合に対して数回実施する。前記計算の各反復で、訓練母集団のメンバーは訓練集合及び試験集合にランダムに割り当てられる。次いで、分子マーカーの組合せの質をSVM計算の各反復の平均として取る。
サポートベクターマシンはバイナリー標識した訓練データの所与の集合を高次元特徴空間にマッピングし、最大境界超平面で2つのデータのクラスを分離する。一般的に、この超平面は入力空間中の非線形決定境界に相当する。X∈R0∈Rnを入力ベクターとし、y∈{−1,+1}を標識とし、φ:R0→Fを入力空間から特徴空間へのマッピングとする。次いで、SVM学習アルゴリズムは、量
(ここで、ベクターwはFと同じ次元を有し、bは実数であり、γは境界と呼ばれる)
が最大であるような超平面(w,b)を見つける。この場合、対応する決定関数は
である。
が最大であるような超平面(w,b)を見つける。この場合、対応する決定関数は
この方程式から、訓練ポイントXiに関連するαiはそのポイントが最終決定関数に埋め込まれる強度を表すと考えられ得る。この代替表示の顕著な性質は、ポイントの部分集合のみが非ゼロαiに関連していることである。これらのポイントはサポートベクターと呼ばれ、離れている超空間の最も近くにあるポイントである。αベクターのまばらさは幾つかの計算及び学習理論結果である。学習アルゴリズムも決定関数もイメージ<φ(Xi),φ(Xj)>間の内積のみを使用しているので、いずれもが特徴空間φ(Xi)中のポイントのイメージを明示するために必要でないことに注目することは重要である。関数K(X,Y)=<φ(X),φ(X)>を仮定したら、マッピングを明確に実施しなくとも特徴空間中の最大境界超空間を学習し、使用することができる。各々の連続する正の一定関数K(X,Y)毎に、すべてのX,Y∈R0についてK(X,Y)=<φ(X),φ(X)>であるようなマッピングφが存在する(マーセルの定理)。関数K(X,Y)はカーネル関数と呼ばれる。カーネル関数を使用すると、空間の次元により悪影響を受けることなくサポートベンターマシンを非線形高次元特徴空間で効果的に操作することができる。事実、無限次元の特徴空間で作業することができる。更に、マーセルの定理により、φ及びFを知らなくても特徴空間において学習することができる。行列Kij=<φ(Xi),φ(Xj)>はカーネル行列と呼ばれる。最後に、学習アルゴリズムは大域最適のみを有する2次最適化問題であることに留意されたい。極小の不在がニューラルネットワークのような標準パターン認識技術との有意な違いである。中程度のサンプルサイズの場合、最適化問題は単純勾配降下技術で解決され得る。雑音が存在する場合、上記した標準最大境界アルゴリズムを過剰適合にかけることができ、より洗練された技術を使用しなければならない。最大境界アルゴリズムは常に完全に一致する仮定を見つけ、学習誤差を許容しないので、この問題は生ずる。しかしながら、時には、より良い予測パワーのために幾つかの訓練精度を交換しなければならない。訓練誤差を許容する必要から、ソフト境界及び境界分布分類子が開発された。決定フェーズにおいて標準カーネル関数をなお使用しながら、訓練フェーズにおいてこれらの技術の1つをカーネル行列で代える:
K←K+λI
λに代えると、訓練誤差をコントロールすることができ、見られないポインの誤分類のリスクをλを適当に選択することにより減らすことができることを立証することができる。
K←K+λI
λに代えると、訓練誤差をコントロールすることができ、見られないポインの誤分類のリスクをλを適当に選択することにより減らすことができることを立証することができる。
全訓練誤差をコントロールする代わりに偽陽性及び偽陰性間のトレードオフをコントロールしたいならば、Kをポジティブ及びネガティブ例に相当する位置で次のように修正することができる:
K←K+λD
(ここで、Dはその入力がd+またはd−のいずれかである対角行列である)
この技術はクラスのサイズに依存するようにαiのサイズをコントロールして、より小さいdを有するクラス中により大きいαiに対するバイアスを導入することと均等であることを立証することができる。また、これは非対象境界に相当する。すなわち、より小さいdを有するクラスは決定境界から更に離れて維持される。幾つかの場合、雑音の存在と共に2つのクラスの極端なアンバランスにより、少数クラスからのポイントが誤標識されたポイントと容易に間違えられ得る状況が作られる。少数クラス中の訓練誤差に対して強いバイアスを加えると、前記誤差から保護し、SVMによりポジティブ例をサポートベクターとすることができる。よって、
及び
を選択すると、それぞれの基数に基づいて2つのクラスの相対的重要性を自動的に調節するための発見的方法が提供される。この技術は感受性及び特異性間のトレードオフを効果的にコントロールする。
K←K+λD
(ここで、Dはその入力がd+またはd−のいずれかである対角行列である)
この技術はクラスのサイズに依存するようにαiのサイズをコントロールして、より小さいdを有するクラス中により大きいαiに対するバイアスを導入することと均等であることを立証することができる。また、これは非対象境界に相当する。すなわち、より小さいdを有するクラスは決定境界から更に離れて維持される。幾つかの場合、雑音の存在と共に2つのクラスの極端なアンバランスにより、少数クラスからのポイントが誤標識されたポイントと容易に間違えられ得る状況が作られる。少数クラス中の訓練誤差に対して強いバイアスを加えると、前記誤差から保護し、SVMによりポジティブ例をサポートベクターとすることができる。よって、
本発明では、線形ケーネルを使用し得る。2つのマーカープロファイルX及びY間の類似性は内積X・Yであり得る。1つの実施形態では、ケーネルは
K(X,Y)=X・Y+1
である。
K(X,Y)=X・Y+1
である。
別の実施形態では、次数dのカーネル
K(X,Y)=(X・Y)d
(ここで、dは2,3,…であり得る)
を使用する。
K(X,Y)=(X・Y)d
(ここで、dは2,3,…であり得る)
を使用する。
D.ロジスティック回帰
幾つかの実施形態では、分類子は回帰モデル、好ましくはロジスティック回帰モデルに基づいている。ロジスティックモデルは本発明の分子バイオマーカーの選択した集合中の各分子マーカー毎の係数を含む。前記実施形態では、回帰モデルに対する係数を例えば最尤アプローチを用いて計算する。特定実施形態では、2つの異なる分類または表現型群からの分子バイオマーカーデータ、例えばデレギュレートまたはレギュレートされた増殖因子シグナル伝達経路、増殖因子シグナル伝達経路をモジュレートする物質に対する応答または非応答を使用し、従属変数は分子マーカー特徴データを導き出す患者の表現型状態である。
幾つかの実施形態では、分類子は回帰モデル、好ましくはロジスティック回帰モデルに基づいている。ロジスティックモデルは本発明の分子バイオマーカーの選択した集合中の各分子マーカー毎の係数を含む。前記実施形態では、回帰モデルに対する係数を例えば最尤アプローチを用いて計算する。特定実施形態では、2つの異なる分類または表現型群からの分子バイオマーカーデータ、例えばデレギュレートまたはレギュレートされた増殖因子シグナル伝達経路、増殖因子シグナル伝達経路をモジュレートする物質に対する応答または非応答を使用し、従属変数は分子マーカー特徴データを導き出す患者の表現型状態である。
本発明の幾つかの実施形態は、マルチカテゴリー(多項)応答を扱うロジスティック回帰モデルの一般化を提供する。前記実施形態は生物を1または3つ以上の分類群に、例えば増殖因子シグナル伝達経路物質での治療に対する良好、適度及び悪い治療応答に判別するために使用され得る。前記回帰モデルはカテゴリーのすべての対を言及すると同時に別のカテゴリーの代わりに1つのカテゴリーにおける応答の見込みを記載するマルチカテゴリーロジットモデルを使用している。モデルがカテゴリーの特定(J−1)対に対するロジットを特定したら、残りは余分である。例えば、参照により明細書中に組み入れるAgresti,An Introduction to Categorical Data Analysis,John Wiley & Sons、Inc.,1996,New York,Chapter 8を参照されたい。
E.判別分析
線形判別分析(LDA)はあるオブジェクト特性に基づいて被験者を2つのカテゴリーの1つに分類しようと試みる。換言すると、LDAは実験において調べるオブジェクト属性がそのオブジェクトのカテゴリー分類を予測するかを試験する。LDAは典型的には連続する独立変数及び二分的カテゴリー従属変数を必要とする。本発明において、訓練母集団の部分集合で本発明の分子マーカーの選択した集合についての発現値は必要な連続独立変数として役立つ。訓練母集団の各メンバーの臨床群分類は二分的カテゴリー従属変数として役立つ。
線形判別分析(LDA)はあるオブジェクト特性に基づいて被験者を2つのカテゴリーの1つに分類しようと試みる。換言すると、LDAは実験において調べるオブジェクト属性がそのオブジェクトのカテゴリー分類を予測するかを試験する。LDAは典型的には連続する独立変数及び二分的カテゴリー従属変数を必要とする。本発明において、訓練母集団の部分集合で本発明の分子マーカーの選択した集合についての発現値は必要な連続独立変数として役立つ。訓練母集団の各メンバーの臨床群分類は二分的カテゴリー従属変数として役立つ。
LDAは、グループ化情報を用いることにより群間分散と群内分散間の比を最大にする変数の線形組合せを探す。暗示的に、LDAにより使用される線形重みは、訓練集合で分子マーカーの発現がどのように2つの群(例えば、デレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路を有する群とレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路状態を有する群)に分けるか、この遺伝子発現がどのように他の遺伝子の発現と相関しているかに依存する。幾つかの実施形態では、LDAを、K個の遺伝子を本発明で記載されている遺伝子と組み合わせることにより訓練サンプル中のN個のメンバーのデータ行列に適用する。次いで、訓練母集団の各メンバーの線形判別をプロットする。理想的には、第1の部分群に相当する訓練母集団のメンバー(例えば、デレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路状態を有する被験者)を線形判別値(例えば、ネガティブ)の1つの範囲にクラスター化し、第2の部分群に相当する訓練母集団のメンバー(例えば、レギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路状態を有する被験者)を線形判別値(例えば、ポジティブ)の第2の範囲にクラスター化する。LDAは、判別値のクラスター間の分離がより大きいときにはより成功したと見なされる。線形判別分析に関するより多くの情報については、Duda,Pattern Classification,Second Edition,2001,John Wiley & Sons,Inc;及びHastie,2001,The Elements of Statistical Learning,Springer,New York;Venables & Ripley,1997,Modern Applied Statistics with s−plus,Springer、New Yorkを参照されたい。
二次判別分析(QDA)は同じ入力パラメーターを利用し、LDAと同じ結果を得る。QDAは結果を得るために線形方程式ではなく二次方程式を使用する。LDA及びQDAは交換可能であり、いずれを使用するかは好みの問題及び/または分析をサポートするためのソフトウェアの利用可能性である。ロジスティック回帰はLDA及びQDAと同じ入力パラメーターを使用し、同じ結果を得る。
F.決定木
本発明の幾つかの実施形態では、本発明の分子バイオマーカーの選択した集合に関する発現データを用いて被験者を分類するために決定木を用いる。決定木アルゴリズムは教師あり学習アルゴリズムのクラスに属する。決定木の目的は現実世界の例のデータから分類子(木)を誘導することである。この木は決定木を誘導するために使用されたことのない未知の例を分類するために使用され得る。
本発明の幾つかの実施形態では、本発明の分子バイオマーカーの選択した集合に関する発現データを用いて被験者を分類するために決定木を用いる。決定木アルゴリズムは教師あり学習アルゴリズムのクラスに属する。決定木の目的は現実世界の例のデータから分類子(木)を誘導することである。この木は決定木を誘導するために使用されたことのない未知の例を分類するために使用され得る。
決定木は訓練データから誘導される。例は、異なる属性についての値及びその例が属するクラスを含む。1つの実施形態では、訓練データは訓練母集団で本発明で記載されている遺伝子の組合せについての発現データである。
次のアルゴリズムは決定木誘導を記載する:
木(例、クラス、属性);
ルートノードを作成する;
すべての例が同一のクラス値を有しているならば、このラベルにルートを与える;
或いは、属性が空ならば、最も一般的な値に従ってルートに標識をつける;
或いは、開始する;
各属性毎に情報利得を計算する;
最高の情報利得を有する属性Aを選択し、これをルート属性とする。
この属性の各々の取り得る値vの場合、
ルートの下に、A=vに相当する新しい分枝を加える;
例(v)をA=vの例とする;
例(v)が空ならば、新しい分枝を例の中で最も一般的な値で標識した葉ノードとする;
或いは、新しい分枝を
木(例(v)、クラス、属性−{A}}
により作成した木とする;
終了する。
木(例、クラス、属性);
ルートノードを作成する;
すべての例が同一のクラス値を有しているならば、このラベルにルートを与える;
或いは、属性が空ならば、最も一般的な値に従ってルートに標識をつける;
或いは、開始する;
各属性毎に情報利得を計算する;
最高の情報利得を有する属性Aを選択し、これをルート属性とする。
この属性の各々の取り得る値vの場合、
ルートの下に、A=vに相当する新しい分枝を加える;
例(v)をA=vの例とする;
例(v)が空ならば、新しい分枝を例の中で最も一般的な値で標識した葉ノードとする;
或いは、新しい分枝を
木(例(v)、クラス、属性−{A}}
により作成した木とする;
終了する。
情報利得の計算のより詳細な情報を以下に示す。例の可能なクラスviが確率P(vi)を有しているならば、実際の回答の情報量Iは
により与えられる。
I値は、使用する具体的データセットについての分類の出力を記載することを可能とするために我々が必要とする情報がどれだけか多いかを示す。データセットがp個のポジティブ及びn個のネガティブ(例として、例えば個体)を含んでいると仮定すると、正解中に含まれている情報は
(ここで、Log2は奇数2を用いた対数である)
である。1つの属性を試験することにより、正しく分類するために必要な情報の量を減らすことができる。具体的属性A(例えば、遺伝子バイオマーカー)についての余りは必要とする多くの情報をどれだけ減らすことができるかを示している:
(ここで、“v”はあるデータセットにおける属性Aについての独自の属性値の数であり、“i”はある属性値であり、“pi”は分類がポジティブの場合の属性Aに対する例の数であり、“ni”は分類がネガティブの場合の属性Aに対する例の数である)。
I値は、使用する具体的データセットについての分類の出力を記載することを可能とするために我々が必要とする情報がどれだけか多いかを示す。データセットがp個のポジティブ及びn個のネガティブ(例として、例えば個体)を含んでいると仮定すると、正解中に含まれている情報は
である。1つの属性を試験することにより、正しく分類するために必要な情報の量を減らすことができる。具体的属性A(例えば、遺伝子バイオマーカー)についての余りは必要とする多くの情報をどれだけ減らすことができるかを示している:
具体的属性Aの情報利得はクラスについての情報利得と属性Aの余りの間の差として計算される:
情報利得は各種属性が分類のためにどれだけ重要であるか(どれだけうまく例を分けられるか)、最高の情報を有する属性を評価するために使用される。
一般的に、多数のいろいろな決定木アルゴリズムがあり、そのうちの多くはDuda,Pattern Classification,Second Edition,2001,John Wiley & Sons,Inc.に記載されている。決定木はしばしば特徴処理、不純物測度、阻止基準及び剪定の考慮を必要とする。具体的な決定木アルゴリズムには分類及び回帰木(CART)、多変数決定木、ID3及びC4.5が含まれるが、これらに限定されない。
1つのアプローチで、決定木の例示的実施形態を使用する場合、訓練母集団で本発明の分子マーカーの選択した集合についての遺伝子発現データを平均ゼロ及び単位分散を有するように標準化する。訓練母集団のメンバーを訓練集合及び試験集合にランダムに分ける。例えば、1つの実施形態では、訓練母集団のメンバーの2/3を訓練集合に配置し、訓練母集団のメンバーの1/3を試験集合に配置する。本発明に記載されている遺伝子の選択した組合せについての発現値を決定木を構築するために使用する。次いで、この決定木の試験集合中のメンバーを正しく分類する能力を判定する。幾つかの実施形態では、この計算を分子マーカーの所与の組合せに対して数回実施する。計算の各反復において、訓練母集団のメンバーを訓練集合及び試験集合にランダムに割り当てる。次いで、分子マーカーの組合せの質を決定木計算の各反復の平均として取る。
G.クラスタリング
幾つかの実施形態では、本発明の分子マーカーの選択した集合の発現値を訓練集合をクラスター化するために使用する。例えば、本発明の遺伝子集合の1つに記載されている10個の遺伝子バイオマーカーを使用する場合を考える。訓練母集団中の各メンバーmは10個のバイオマーカーの各々毎に発現値を有している。訓練母集団中のメンバーmからの前記値がベクトルを規定する:
幾つかの実施形態では、本発明の分子マーカーの選択した集合の発現値を訓練集合をクラスター化するために使用する。例えば、本発明の遺伝子集合の1つに記載されている10個の遺伝子バイオマーカーを使用する場合を考える。訓練母集団中の各メンバーmは10個のバイオマーカーの各々毎に発現値を有している。訓練母集団中のメンバーmからの前記値がベクトルを規定する:
訓練群で類似の発現パターンを示す訓練母集団のメンバーは一緒にクラスター化する傾向にある。本発明の遺伝子の特定組合せは、ベクトルを訓練母集団中に見られる特徴群にクラスター化するとき本発明のこのアスペクト中の良好な分類子であると見なされる。例えば、訓練母集団が良好なまたは良くない予後を有している患者を含んでいるならば、クラスタリング分類子は母集団を2つの群にクラスター化し、各群は独自にデレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路状態またはレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路状態のいずれかに相当する。
クラスタリングはDuda and Hart,Pattern Classification and Scene Analysis,1973,John Wiley & Sons,Inc.,New Yorkのp.211−256に記載されている。Dudaのセクション6.7に記載されているように、クラスタリング問題はデータセット中のファインディング自然グループ化の1つとして記載されている。自然グループ化を同定するためには2つの問題が検討される。第1は、2つのサンプル間の類似性(または、非類似性)を判定する方法を決定する。このメトリック(類似度)は、1つのクラスター中のサンプルが他のクラスター中のサンプルに対するよりも相互により似ていることを確認するために使用される。第2に、データを類似度を用いてクラスターに分割するためのメカニズムを決定する。
類似度はDudaのセクション6.7において検討されており、クラスタリング研究を始める1つの方法が距離関数を規定し、データセット中のサンプルのすべての対間の距離の行列を計算するためであると言及されている。距離が類似性の良好な尺度であるならば、同一クラスター中のサンプル間の距離は異なるクラスター中のサンプル間の距離よりも有意に短い。しかしながら、Dudaのp.215において言及されているように、クラスタリングは距離メトリックスの使用を必要としない。例えば、非メトリック類似性関数s(x,x’)が2つのベクトルx及びx’を比較するために使用され得る。一般的に、s(x,x’)は、x及びx’がやや“類似”しているときにはその値が大きい対称関数である。非メトリック類似性関数s(x,x’)の例はDudaのp.216に記載されている。
データセットのポイント間の“類似性”または“非類似性”を判定する方法を選択したら、クラスタリングはデータの任意の分割のクラスタリング品質を調べる基準関数を必要とする。基準関数を極値にするデータセットの団且つがデータをクラスター化するために使用される。基準関数はDudaのセクション6.8で検討されている。
より最近、Dudaら,Pattern Classification,2nd edition,John Wiley & Sons,Inc.,New Yorkが発行された。p.537−563はクラスタリングを詳細に記載している。クラスタリング技術に関するより多くの情報はKaufman and Rousseeuw,1990,Finding Groups in Data:An Introduction to Cluster Analysis,Wiley,New York,NY;Everitt,1993,Cluster Analysis(3d ed.),Wiley,New York,NY;及びBacker,1995,Computer−Assisted Reasoning in Cluster Analysis,Prentice Hall,Upper Saddle River,New Jerseyに見られる。本発明において使用され得るクラスタリング技術の具体例には階層的クラスタリング(最短距離アルゴリズム、最長距離アルゴリズム、群平均アルゴリズム、重心アルゴリズムまたは平方和アルゴリズムを用いる凝集型クラスタリング)、k−平均クラスタリング、ファジイーk−平均クラスタリングアルゴリズム及びJarvis−Patrickクラスタリングが含まれるが、これらに限定されない。
H.主成分分析
主成分分析(PCA)が遺伝子発現データを分析するために提案されている。主成分分析は、データをそのデータの特徴を要約している変数(主成分)の新しい集合に変換することによりデータセットの次元を減らすための古典的技術である。例えば、Jolliffe,1986,Principal Component Analysis,Springer,New Yorkを参照されたい。主成分(PC)は未相関であり、kthPCがPCの中で第kの最大分散を有するように順序付けられる。kthPCは、第1のk−1 PCに直交するようにデータポイントの射影の変動を最大にする方向として解釈され得る。第1の少数のPCはデータセット中の変動の多くを捕らえる。対照的に、最後の少数のPCはしばしばデータ中の残留“雑音”のみを捕らえると考えられる。
主成分分析(PCA)が遺伝子発現データを分析するために提案されている。主成分分析は、データをそのデータの特徴を要約している変数(主成分)の新しい集合に変換することによりデータセットの次元を減らすための古典的技術である。例えば、Jolliffe,1986,Principal Component Analysis,Springer,New Yorkを参照されたい。主成分(PC)は未相関であり、kthPCがPCの中で第kの最大分散を有するように順序付けられる。kthPCは、第1のk−1 PCに直交するようにデータポイントの射影の変動を最大にする方向として解釈され得る。第1の少数のPCはデータセット中の変動の多くを捕らえる。対照的に、最後の少数のPCはしばしばデータ中の残留“雑音”のみを捕らえると考えられる。
PCAは、本発明に従って分類子を作成するためにも使用され得る。このアプローチでは、本発明の分子バイオマーカーの選択された集合のためのベクトルが上記クラスタリングについて記載したのと同一方法で構築され得る。実際、各ベクトルが訓練母集団の特定メンバー由来の選択した遺伝子についての発現値を表すベクターの集合が行列と見なされ得る。幾つかの実施形態では、この行列はモノマーの定性バイナリー記述のフリー−ウィルソン方法において表されており(Kubinyi,1990,3D QSAR in drug design theory methods and applications,Pergamon Press,Oxford,p.589−638)、行列中のすべての分散情報が説明されるまで第1の主成分(PC)が分散情報の最大量をできるだけ捕らえる、第2の主成分(PC)がすべての分散情報の第2の最大量を捕らえる、等々ようにPCAを用いて最大限に圧縮された空間に分布される。
次いで、ベクトルの各々(各ベクトルは訓練母集団のメンバーを表す)をプロットする。多くのいろいろなタイプのプロットが可能である。幾つかの実施形態では、一次元プロットを作成する。この一次元プロットでは、訓練母集団のメンバーの各々に由来する第1主成分の値をプロットする。この形のプロットでは、第1群のメンバーが第1主成分値の1つの範囲でクラスター化し、第2群のメンバーは第1主成分値の第2範囲でクラスター化すると予想される。
1つの例で、訓練母集団は2つの分類群を含む。第1主成分を、分類出力が公知である全訓練母集団データセットで本発明の選択した遺伝子についての分子バイオマーカー発現値を用いて計算する。次いで、訓練集合の各メンバーを第1主成分についての値の関数としてプロットする。この例では、第1主成分がポジティブである訓練母集団のメンバーは1つの分類出力に相当し、第1主成分がネガティブである訓練母集団のメンバーは他の分類出力に相当する。
幾つかの実施形態では、訓練母集団のメンバーを1つ以上の主成分に対してプロットする。例えば、幾つかの実施形態では、訓練母集団のメンバーを、一次元が第1主成分であり、二次元が第2主成分である二次元プロット上にプロットする。この二次元プロットでは、訓練母集団中で表される各部分群のメンバーがばらばらの群にクラスター化されると予想される。例えば、二次元プロット中のメンバーの第1クラスターは第1分類群中の被験者に相当し、二次元プロット中のルンバーの第2クラスターは第2分類群中の被験者に相当する、等々。
幾つかの実施形態では、訓練母集団のメンバーを2つ以上の主成分に対してプロットし、訓練母集団のメンバーが各々が訓練母集団中に見られる部分群に独自に相当する群にクラスター化されるかを調べる。幾つかの実施形態では、主成分分析はRmvaパッケージ(Anderson,1973,Cluster Analysis for applications,Academic Press,New York 1973;Gordon,Classification,Second Edition,Chapman and Hall,CRC,1999)を用いることにより実施される。主成分分析は更にDuda,Pattern Classification,Second Edition,2001,John Wiley & Sons,Inc.に記載されている。
I.最近傍分類子分析
最近傍分類子はメモリに基づき、モデルを適合させる必要がない。クエリーポイントx0、k訓練ポイントx(r),r,…を仮定すると、x0に最短距離のkを同定した後、ポイントx0をk最近傍を用いて分類する。タイをランダムに壊す。幾つかの実施形態では、特徴空間におけるユークリッド距離が
として距離を測定するために使用される。
最近傍分類子はメモリに基づき、モデルを適合させる必要がない。クエリーポイントx0、k訓練ポイントx(r),r,…を仮定すると、x0に最短距離のkを同定した後、ポイントx0をk最近傍を用いて分類する。タイをランダムに壊す。幾つかの実施形態では、特徴空間におけるユークリッド距離が
典型的には、最近傍アルゴリズムを使用する場合、線形判別を計算するために使用される発現データを平均ゼロ及び分散1を有するように標準化する。本発明では、訓練母集団のメンバーを訓練集合及び試験集合にランダムに分ける。例えば、1つの実施形態では、訓練母集団のメンバーの2/3を訓練集合に配置し、訓練母集団のメンバーの1/3を試験集合に配置する。本発明の分子バイオマーカーの選択した集合のプロフィールは試験集合のメンバーがプロットされている特徴空間を表す。次いで、訓練集合の試験集合のメンバーを正確に特徴付ける能力を計算する。幾つかの実施形態では、最近傍計算を本発明の遺伝子の所与の組合せに対して数回実施する。計算の各反復において、訓練母集団のメンバーを訓練集合及び試験集合にランダムに割り当てる。その後、遺伝子の組合せの質を最近傍計算の各々の前記反復の平均として取る。
最近傍規則は不公平なクラス想定、差次的誤分類コスト及び属性選択の問題を取り扱うために細分され得る。これらの細分の多くは近傍に対する幾つかの形の重み付き投票を含む。最近傍分析についてのより多くの情報については、Duda,Pattern Classification,Second Edition,2001,John Wiley & Sons,Inc.;及びHastie,2001,The Elements of Statistical Learning,Springer,New Yorkを参照されたい。
J.進化的方法
生物学的進化のプロセスにより動機付けられて、分類子設計の進化的方法は最適分類子の確率検索を用いる。広い概説で、この方法により、本発明の遺伝子産物の測定値から幾つかの分類子、すなわち母集団が作成される。各分類子は他とやや異なる。次に、分類子を訓練母集団で発現データでスコアをつける。生物学的進化との類似を保って、得られた(スカラー)スコアは時々適合と呼ばれている。分類子はそのスコアに従って順位付けられ、最良の分類子(分類子の全母集団の一部)が保持される。再び、生物学的学術用語と合わせて、これは適者生存と呼ばれている。分類子は次世代、すなわち子供または子孫において確率的に変化する。幾つかの子孫分類子はその前の世代の親よりも高いスコアを有し、幾つかは低いスコアを有するであろう。次いで、全プロセスをその後の世代に対して繰り返す。分類子にスコアをつけ、最良のものを保持し、ランダムに変更して更に別の世代を得る、等々。一部、順位付けるために、各世代は平均して前の世代よりも僅かに高いスコアを有する。世代中で1つの最良の分類子が所望の基準値を超えるスコアを有しているときに上記プロセスを停止する。進化的方法に関するより多くの情報は、例えばDuda,Pattern Classification,Second Edition,2001,John Wiley & Sons,Inc.に見られる。
生物学的進化のプロセスにより動機付けられて、分類子設計の進化的方法は最適分類子の確率検索を用いる。広い概説で、この方法により、本発明の遺伝子産物の測定値から幾つかの分類子、すなわち母集団が作成される。各分類子は他とやや異なる。次に、分類子を訓練母集団で発現データでスコアをつける。生物学的進化との類似を保って、得られた(スカラー)スコアは時々適合と呼ばれている。分類子はそのスコアに従って順位付けられ、最良の分類子(分類子の全母集団の一部)が保持される。再び、生物学的学術用語と合わせて、これは適者生存と呼ばれている。分類子は次世代、すなわち子供または子孫において確率的に変化する。幾つかの子孫分類子はその前の世代の親よりも高いスコアを有し、幾つかは低いスコアを有するであろう。次いで、全プロセスをその後の世代に対して繰り返す。分類子にスコアをつけ、最良のものを保持し、ランダムに変更して更に別の世代を得る、等々。一部、順位付けるために、各世代は平均して前の世代よりも僅かに高いスコアを有する。世代中で1つの最良の分類子が所望の基準値を超えるスコアを有しているときに上記プロセスを停止する。進化的方法に関するより多くの情報は、例えばDuda,Pattern Classification,Second Edition,2001,John Wiley & Sons,Inc.に見られる。
K.バギング、ブースティング及びランダム部分空間方法
バギング、ブースティング及びランダム部分空間方法は、弱い分類子を改良するために使用され得る連結技術である。これらの技術は決定木のために設計され、通常決定木に対して使用される。加えて、Skurichina and Duinは前記技術の線形判別分析においても有用であり得ることを示唆するための証拠を与えている。
バギング、ブースティング及びランダム部分空間方法は、弱い分類子を改良するために使用され得る連結技術である。これらの技術は決定木のために設計され、通常決定木に対して使用される。加えて、Skurichina and Duinは前記技術の線形判別分析においても有用であり得ることを示唆するための証拠を与えている。
バギングでは、ランダム独立ブーツストラップ反復を生ずる訓練集合をサンプリングし、これらの各々で分類子を構築し、最終決定規則で単純多数決により集める。例えば、Breiman,1996,Machine Learning,24,123−140;及びEfron & Tibshirani,An Introduction to Bootstrap,Chapman & Hall,New York,1993を参照されたい。
ブースティングでは、分類子を従来の分類結果に依存する訓練集合の重み付きバージョンで構築する。最初に、すべてのオブジェクトは等しい重みを有し、第1分類子はこのデータセットで構築される。次いで、分類子の性能に従って重みを変化させる。誤って分類されたオブジェクト(データセット中の分子バイオマーカー)はより大きな重みを得、次の分類子は再重み付き訓練集合でブースティングされる。このようにして、一連の訓練集合及び分類子が得られ、次いで最終決断において単純多数決によりまたは重み付き多数決により合わされる。例えば、Freund & Schapire,“Experiments with a new boosting algorithm”,Proeedings 13th International Conference on Machine Learning,1996,148−156を参照されたい。
ブースティングを説明するために、研究中の母集団が示す2つの表現型群、すなわち表現型1及び表現型2がある場合を考慮する。分子マーカーXのベクトルを前提として、分類子G(X)は2つの値集団{表現型1、表現型2}中のタイプ値の1つをとる予測を生ずる。訓練サンプルの誤差率は
(ここで、Nは訓練集合中の被験者の数(表現型1または表現型2のいずれかを有する被験者の合計)である)
である。
である。
弱い分類子は誤差率が当て推量よりも僅かに良いものである。ブースティングアルゴリズムにおいて、弱い分類アルゴリズムをデータの修正バージョンに反復適用して、一連の弱い分類子Gm(x),m,=1,2,…,Mを得る。次いで、この一連の分類子のすべてからの予測を重み付き多数決により組み合わせて、最終予測を得る。
ここで、α1,α2,…,αMはブースティングアルゴリズムにより計算され、その目的はそれぞれのGm(x)の寄与に重みを付けることである。この効果は、シーケンス中のより正確な分類子により大きな影響を与えることである。
各ブースティングステップでのデータ修正は訓練観測(xi,yi),i=1,2,…,Nの各々に重みw1,w2,…,wnを加えることからなる。最初に、第1ステップは単に通常の方法でデータで分類子を訓練するようにすべての重みをwi=1/Nに設定する。各連続する反復m=2,3,…,M毎に、観測重みを個々に修正し、分類アルゴリズムを重み付き観測に対して再適用する。幹mで、前ステップで誘導された分類子Gm−1(x)により誤分類された観測は増えた重みを有するのに対して、正しく分類された場合には重みが減少する。よって、反復を進めるにつれて、正しく分類し難い観測は増え続ける影響を受ける。これにより、各々の連続する分類子はシーケンス中の以前のものにより脱落する訓練観測に集中する。
ブースティングアルゴリズムの例を以下に要約する:
1.観測重みwi=1/N,i=1,2,…,Nを初期化する;
2.m=l〜Mの場合、
(a)分類子Gm(x)を重みwiを用いて訓練集合に適合させる;
(b)計算する;
(c)αm=log(1−errm)/errm)を計算する;
(d)wi←wi・exp[αm・I(yi≠Cm(xi))],i=1,2,…,Nを設定する;
3.
1.観測重みwi=1/N,i=1,2,…,Nを初期化する;
2.m=l〜Mの場合、
(a)分類子Gm(x)を重みwiを用いて訓練集合に適合させる;
(b)計算する;
(d)wi←wi・exp[αm・I(yi≠Cm(xi))],i=1,2,…,Nを設定する;
3.
アルゴリズムにおいて、現在の分類子Gm(x)が行2aでの重み観測で誘導される。生じた重み付き誤差を行2bで計算する。行2aは最終分類子G(x)(行3)を得る際にGm(x)に与えた重みαmを計算する。観測の各々の個々の重みは行2dでの次の反復のために更新される。Gm(x)により誤分類された観測は因子exp(αm)により評価される重みを有し、シーケンス中の次の分類子Gm+1(x)を誘導するための相対影響が高められる。幾つかの実施形態では、Freund and Schapire,1997,Journal of Computer and System Sciences,55,p.119−139,boosting methodの修正を使用する。例えば、Hastiら,The Elements of Statistical Learning,2001,Springer,New York,Chapter 10を参照されたい。幾つかの実施形態では、ブースティングまたは適応型ブースティング方法を使用する。
幾つかの実施形態では、Freund and Schapire,1997,Journal of Computer and System Sciences,55,p.119−139の修正が使用される。例えば、幾つかの実施形態では、特徴予備選択をParkら,2002,Pac.Symp.Biocomput.,6,52−63のノンパラメトリックスコアリング方法のような技術を用いて実施する。特徴予備選択は、分類間で最良を判別する遺伝子を分類子において使用するために選択する次元圧縮方法の形である。次いで、Freund and Schapireのブースティング手順よりもFriedmanら,2000,Ann.Stat.,28,337−407が導入したLogitBoost手順を使用する。幾つかの実施形態では、Ben−Dorら,2000,Journal of Computational Biology,7,559−583のブースティング及び他の分類方法を本発明において使用する。幾つかの実施形態では、Freund and Schapire,1997,Journal of Computer and System Sciences,55,119−139のブースティング及び他の分類方法を使用する。
ランダム部分空間方法では、分類子をデータ特徴空間のランダム部分空間において構築する。これらの分類子は通常最終決定規則において単純多数決により組み合わされる。例えば、Ho,“The Random subspace method for constructing decision forests”,IEEE Trans Pattern Analysis and Machine Intelligence,1998;20(8):832−844を参照されたい。
L.他のアルゴリズム
上記したパターン分類及び統計技術は分類のためのモデルを構築するために使用され得るモデルのタイプの単なる例である。更に、上記した技術の組合せが使用され得る。このような組合せ、例えば決定木とブースティングの組合せが記載されている。しかしながら、多くの他の組合せが可能である。加えて、射影追跡や重み付き投票のような当業界での他の技術を分類子を構築するために使用され得る。
上記したパターン分類及び統計技術は分類のためのモデルを構築するために使用され得るモデルのタイプの単なる例である。更に、上記した技術の組合せが使用され得る。このような組合せ、例えば決定木とブースティングの組合せが記載されている。しかしながら、多くの他の組合せが可能である。加えて、射影追跡や重み付き投票のような当業界での他の技術を分類子を構築するために使用され得る。
3.5 バイオマーカー遺伝子発現レベルの測定
3.5.1 方法
サンプル中のバイオマーカー遺伝子の発現レベルは当業界で公知の手段により測定され得る。発現レベルは各バイオマーカー遺伝子から転写された核酸を単離し、そのレベル(すなわち、量)を測定することにより調べられ得る。代替的または追加的に、バイオマーカー遺伝子から転写されたmRNAから翻訳された特定のタンパク質のレベルを測定してもよい。
3.5.1 方法
サンプル中のバイオマーカー遺伝子の発現レベルは当業界で公知の手段により測定され得る。発現レベルは各バイオマーカー遺伝子から転写された核酸を単離し、そのレベル(すなわち、量)を測定することにより調べられ得る。代替的または追加的に、バイオマーカー遺伝子から転写されたmRNAから翻訳された特定のタンパク質のレベルを測定してもよい。
特定のバイオマーカー遺伝子の発現のレベルはサンプル中に存在するmRNAまたはそこに由来するポリヌクレオチドの量を測定することにより調べられ得る。任意のRNAレベルの測定方法が使用され得る。例えば、RNAをサンプルから単離し、アガロースゲルを用いて分離する。次いで、分離したRNAを固体支持体(例えば、フィルター)に移す。次いで、1つ以上のバイオマーカーに相当する核酸プローブをノーザンハイブリダイゼーションによりフィルターにハイブリダイズし、バイオマーカー由来RNAの量を測定する。前記測定は肉眼で、または機器を用いて、例えばデンシトメーターを用いてなされ得る。RNAレベルを測定するための別の方法はドットプロットまたはスロットブロットの使用による。この方法では、サンプルからのRNAまたはそこに由来する核酸を標識する。次いで、RNAまたはそこに由来する核酸を1つ以上のバイオマーカー遺伝子由来のオリゴヌクレオチドを含有しているフィルターにハイブリダイズし、前記オリゴヌクレオチドはフィルター上に離れた容易に同定し得る位置に配置されている。標識RNAのフィルター結合オリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションまたはその欠乏は目視でまたはデンシトメーターを用いて調べられ得る。ポリヌクレオチドは放射標識または蛍光(すなわち、目視可能な)標識を用いて標識され得る。
上記した例は限定的と意図されない。RNAアバンダンスの測定方法は当業界で公知であり、この中には定量的PCR方法(例えば、TAQMAN(登録商標))及びNanostring’s NCOUNTER(商標)Digital Gene Expression System(ワシントン州シアトルに所在)(WO2007076128、WO2007076129も参照されたい)が含まれるが、これらに限定されない。
特定バイオマーカー遺伝子の発現レベルは、バイオマーカー遺伝子から発現させた特定のタンパク質のレベルを測定することによっても評価され得る。これは、例えばサンプルからタンパク質をポリアクリルアミドゲルを用いて分離した後、特定のバイオマーカー由来タンパク質をウェスタンブロットで抗体を用いて同定することによりなされ得る。或いは、タンパク質を二次元ゲル電気泳動システムにより分離してもよい。二次元ゲル電気泳動は当業界で公知であり、典型的には一次元に沿った等電点電気泳動の後二次元に沿ったSDS−PAGE電気泳動を含む。例えば、Hamesら,1990,GEL ELECTROPHORESIS OF PROTEINS:A PRACTICAL APPROACH,IRL Press,New York;Shevchenkoら,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA,93:1440−1445(1996);Saglioccoら,Yeast,12:1519−1533(1996);Lander,Science,274:536−539(1996)を参照されたい。得られた電気泳動図は質量分析技術、ウェスタンブロッティング、並びにポリクローナル及びモノクローナル抗体を用いる免疫ブロット分析を含めた複数の技術により分析され得る。
或いは、バイオマーカー由来タンパク質レベルは、結合部位が細胞ゲノムによりコードされる複数のタンパク質種に特異的な固定化されている抗体、好ましくはモノクローナル抗体を含む抗体マイクロアレイを構築することにより測定され得る。好ましくは、抗体は当該バイオマーカー由来タンパク質の大部分に対して存在している。モノクローナル抗体の作成方法は公知である(例えば、すべての目的のために全文参照により組み入れるHarlow and Lane,1988,ANTIBODIES:A LABORATORY MANUAL,Cold Spring Harbor,N.Y.を参照されたい)。1つの実施形態では、モノクローナル抗体は細胞のゲノム配列に基づいて設計された合成ペプチド断片に対して作成する。前記抗体アレイを用いて、細胞由来のタンパク質をこのアレイに接触させ、その結合を当業界で公知のアッセイを用いてアッセイする。通常、診断または予防用タンパク質の発現及び発現のレベルは組織スライスまたは切片を免疫組織化学的に染色することにより検出され得る。
最後に、多数の組織標本中のバイオマーカー遺伝子の発現は“組織アレイ”を用いて特性づけられ得る(Kononenら,Nat.Med.,4(7):844−7(1998))。組織アレイにおいて、複数の組織サンプルを同一マイクロアレイを用いて評価する。このアレイにより、RNA及びタンパク質レベルをその場で検出することができる。連続した切片により複数のサンプルを同時に分析することができる。
3.5.2 マイクロアレイ
好ましい実施形態では、上記バイオマーカーの各々の発現状態が同時に評価されるようにポリヌクレオチドマイクロアレイを使用して発現を調べる。具体的実施形態では、本発明は、上記したバイオマーカー集合(すなわち、腫瘍の分子タイプまたはサブタイプを決定するためのバイオマーカー;腫瘍の増殖因子経路シグナル伝達状態を分類するためのバイオマーカー;被験者の増殖因子シグナル伝達経路をモジュレートする化合物に対する応答を予測するためのバイオマーカー;治療薬の増殖因子シグナル伝達経路に対する薬力学的効果を調べるためのバイオマーカー)の各々に対応する遺伝子にハイブリダイズし得るプローブを含むオリゴヌクレオチドまたはcDNAアレイを提供する。
好ましい実施形態では、上記バイオマーカーの各々の発現状態が同時に評価されるようにポリヌクレオチドマイクロアレイを使用して発現を調べる。具体的実施形態では、本発明は、上記したバイオマーカー集合(すなわち、腫瘍の分子タイプまたはサブタイプを決定するためのバイオマーカー;腫瘍の増殖因子経路シグナル伝達状態を分類するためのバイオマーカー;被験者の増殖因子シグナル伝達経路をモジュレートする化合物に対する応答を予測するためのバイオマーカー;治療薬の増殖因子シグナル伝達経路に対する薬力学的効果を調べるためのバイオマーカー)の各々に対応する遺伝子にハイブリダイズし得るプローブを含むオリゴヌクレオチドまたはcDNAアレイを提供する。
本発明により提供されるマイクロアレイは、先に挙げた臨床状態の1つ、2つまたは3つすべての状態を区別することができるようにバイオマーカーに対応する遺伝子のハイブリダイズし得るプローブを含み得る。特に、本発明は、増殖因子シグナル伝達経路がデレギュレートおよびレギュレートされている患者または腫瘍を区別する表5a及び5bの101個のバイオマーカーの少なくとも5、10、20、30、40、50、100個の遺伝子バイオマーカーの1つ以上の部分集合〜全体集合に対するプローブを含むポリヌクレオチドアレイを提供する。別の特定実施形態では、本発明は、増殖因子シグナル伝達経路がデレギュレート及びレギュレートされている患者または腫瘍を区別する表11の86個のバイオマーカーの少なくとも5、10、20、30、40、50、60、70個の遺伝子バイオマーカーの1つ以上の部分集合〜全体集合に対するプローブを含むポリヌクレオチドアレイを提供する。更に別の実施形態では、本発明は、高い解糖経路活性を有する患者またはサンプルを区別する表13の39個のバイオマーカーの少なくとも5、10、20、30個の遺伝子バイオマーカーの1つ以上の部分集合〜全体集合に対するプローブを含むアレイを提供する。
更に別の具体的実施形態では、本明細書に開示されている方法において使用されるマイクロアレイは場合により表5にリストされているバイオマーカーの少なくとも一部に対して追加のバイオマーカーを含む。例えば、具体的実施形態では、マイクロアレイはAltschulerらの2002年3月7日に国際公開されたWO02/18646及びSchererらの2002年2月28日に国際公開されたWO02/16650に記載されているスクリーニングまたはスキャンニングアレイである。スクリーニング及びスキャンニングアレイは発現及び発現されていないゲノム核酸配列由来の規則的に間隔をあけた位置的にアドレス可能なプローブを含む。前記アレイは表5にリストされているバイオマーカーの部分集合または全部、或いは上記したその部分集合に対応するプローブを含み得、表5にリストされているバイオマーカーのみを含有しているマイクロアレイと同様にしてバイオマーカー発現をモニターするために使用され得る。
更に別の具体的実施形態では、マイクロアレイは表5にリストされているバイオマーカーの少なくとも5個を含む市販のcDNAマイクロアレイである。市販されているcDNAマイクロアレイが表5にリストされているバイオマーカーの全部を含んでいることが好ましい。しかしながら、マイクロアレイは表5中の5、10、15、25、50、100個またはそれ以上のバイオマーカー〜表5中のバイオマーカーの最大数を含み得、表5の1つの部分集合及び表5の別の部分集合、或いは上記した各々の部分集合中のバイオマーカーのすべてを含み得る。本明細書中に開示されている方法において使用されるマイクロアレイの具体的実施形態では、表5のすべてまたは一部であるバイオマーカーがマイクロアレイ上のプローブの少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%または98%を占めている。
先のバイオマーカー集合及び/または部分集合を含むマイクロアレイの構築に関する一般的方法を以下のセクションにおいて記載する。
3.5.2.1 マイクロアレイの構築
マイクロアレイは、ポリヌクレオチド配列を含むプローブを選択し、前記プローブを固体支持体または表面に固定化することにより作成される。例えば、プローブはDNA配列、RNA配列、またはDNA及びRNAのコポリマー配列を含み得る。プローブのポリヌクレオチド配列はDNA及び/またはRNAアナログ、またはその組合せをも含み得る。例えば、プローブのポリヌクレオチド配列はゲノムDNAの完全または部分断片であり得る。プローブのポリヌクレオチド配列は合成したヌクレオチド配列、例えば合成オリゴヌクレオチド配列であってもよい。プローブ配列はインビボで酵素を用いて、インビトロで酵素を用いて(例えば、PCRにより)、またはインビトロで酵素を用いずに合成され得る。
マイクロアレイは、ポリヌクレオチド配列を含むプローブを選択し、前記プローブを固体支持体または表面に固定化することにより作成される。例えば、プローブはDNA配列、RNA配列、またはDNA及びRNAのコポリマー配列を含み得る。プローブのポリヌクレオチド配列はDNA及び/またはRNAアナログ、またはその組合せをも含み得る。例えば、プローブのポリヌクレオチド配列はゲノムDNAの完全または部分断片であり得る。プローブのポリヌクレオチド配列は合成したヌクレオチド配列、例えば合成オリゴヌクレオチド配列であってもよい。プローブ配列はインビボで酵素を用いて、インビトロで酵素を用いて(例えば、PCRにより)、またはインビトロで酵素を用いずに合成され得る。
本発明の方法で使用されるプローブが多孔質または非多孔質であり得る固体支持体に固定化されていることが好ましい。例えば、本発明のプローブは、ポリヌクレオチドの3’または5’末端でニトロセルロースまたはナイロン膜またはフィルターに共有結合されているポリヌクレオチド配列であり得る。前記ハイブリダイゼーションプローブは当業界で公知である(例えば、Sambrookら,MOLECULAR CLONlNG−A LABORATORY MANUAL(2ND ED.),Vols.1−3,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)を参照されたい)。或いは、固体支持体または表面はガラスまたはプラスチック表面であり得る。特に好ましい実施形態では、ハイブリダイゼーションレベルは、その表面にポリヌクレオチドの集団(例えば、DNAまたはDNAミミックの集団、或いはRNAまたはRNAミミックの集団)が固定されている固相から構成されているプローブのマイクロアレイに対して測定される。固相は非多孔質でも、場合によりゲルのような多孔質材料であり得る。
好ましい実施形態では、マイクロアレイは、各々が本明細書中に記載されているバイオマーカーの1つに相当する結合(例えば、ハイブリダイゼーション)部位または“プローブ”の規則アレイを有する支持体または表面からなる。好ましくは、マイクロアレイはアドレス可能なアレイ、より好ましくは位置的にアドレス可能なアレイである。より具体的には、アレイの各プローブを各プローブの身元(すなわち、配列)がアレイ中のその位置から決定され得るように固体支持体上の公知の所定位置に配置することが好ましい。好ましい実施形態では、各プローブは固体支持体に単一サイトで共有結合している。
マイクロアレイは多数の方法で作成され得、その方法の幾つかを以下に記載する。しかしながら、作成されたら、マイクロアレイはある特徴を共有している。アレイは再生可能であり、所与のアレイの複数コピーを作成することができ、相互に容易に比較することができる。マイクロアレイが結合(例えば、核酸ハイブリダイゼーション)条件下で安定である材料から作成されることが好ましい。マイクロアレイは小さい、例えば1〜25cm2、12〜13cm2、または3cm2であることが好ましい。しかしながら、大きなアレイも考えられ、例えばスクリーニングアレイで使用するためには好ましいことがある。マイクロアレイ中の所与の結合サイトまたは結合サイトの独自の組が細胞中の1つの遺伝子の産物に対して(例えば、特定のmRNA、またはそこに由来する特定のcDNAに対して)特異的に結合させる(例えば、ハイブリダイズする)ことが好ましい。しかしながら、一般的には、他の関連するまたは類似の配列を所与の結合部位に対して交差ハイブリダイズさせる。
本発明のマイクロアレイは1つ以上の試験プローブを含み、その各々は検出しようとするRNAまたはDNAのサブ配列に相補的なポリヌクレオチド配列を有している。好ましくは、固体表面上の各プローブの位置は公知である。実際、マイクロアレイは好ましくは位置的にアドレス可能なアレイである。具体的には、アレイの各プローブを各プローブの身元(すなわち、配列)がアレイ上(すなわち、支持体または表面上)のその位置から決定され得るように固体支持体上の公知の所定位置に配置することが好ましい。
本発明によれば、マイクロアレイは、各位置が本明細書中に記載されているバイオマーカーの1つに相当するアレイ(すなわち、行列)である。例えば、各位置は遺伝子バイオマーカーから転写された特定のRNAまたはcDNAが特異的にハイブリダイズできるゲノムDNAに基づいてDNAまたはDNAアナログを含み得る。DNAまたはDNAアナログは、例えば合成オリゴマーまたは遺伝子断片であり得る。1つの実施形態では、バイオマーカーの各々に相当するプローブはアレイ上に存在している。
3.5.2.2 マイクロアレイのためのプローブの作成
上述したように、特定のポリヌクレオチド分子が本発明に従って特異的にハイブリダイズする“プローブ”は相補的ゲノムポリヌクレオチド配列を含む。マイクロアレイのプローブは好ましくは1000個以下のヌクレオチドを有するヌクレオチド配列から構成されている。幾つかの実施形態では、アレイのプローブは10〜1,000個のヌクレオチドを有するヌクレオチド配列から構成されている。好ましい実施形態では、プローブのヌクレオチド配列は10〜200ヌクレオチド長の範囲であり、相補的配列を有し、よって生物の種のゲノムにハイブリダイズすることができ、前記ゲノムの全部または一部にわたって順次タイル張りされている複数の異なるプローブが存在するような生物の種のゲノム配列である。他の具体的実施形態では、プローブは10〜30ヌクレオチド長の範囲、10〜40ヌクレオチド長、20〜50ヌクレオチド長の範囲、40〜80ヌクレオチド長の範囲、50〜150ヌクレオチド長の範囲、80〜120ヌクレオチド長の範囲であり、最も好ましくは60ヌクレオチド長である。
上述したように、特定のポリヌクレオチド分子が本発明に従って特異的にハイブリダイズする“プローブ”は相補的ゲノムポリヌクレオチド配列を含む。マイクロアレイのプローブは好ましくは1000個以下のヌクレオチドを有するヌクレオチド配列から構成されている。幾つかの実施形態では、アレイのプローブは10〜1,000個のヌクレオチドを有するヌクレオチド配列から構成されている。好ましい実施形態では、プローブのヌクレオチド配列は10〜200ヌクレオチド長の範囲であり、相補的配列を有し、よって生物の種のゲノムにハイブリダイズすることができ、前記ゲノムの全部または一部にわたって順次タイル張りされている複数の異なるプローブが存在するような生物の種のゲノム配列である。他の具体的実施形態では、プローブは10〜30ヌクレオチド長の範囲、10〜40ヌクレオチド長、20〜50ヌクレオチド長の範囲、40〜80ヌクレオチド長の範囲、50〜150ヌクレオチド長の範囲、80〜120ヌクレオチド長の範囲であり、最も好ましくは60ヌクレオチド長である。
プローブは生物のゲノムの一部に対応するDNAまたはDNA“ミミック”(例えば、誘導体及びアナログ)からなり得る。別の実施形態では、マイクロアレイのプローブは相補的RNAまたはRNAミミックからなり得る。DNAミミックはDNAと特異的ワトソン・クリック様ハイブリダイゼーションし得る、またはRNAと特異的ハイブリダイゼーションし得るサブユニットを含むポリマーである。核酸が塩基部分、糖部分またはホスホネート骨格で修飾されていてもよい。DNAミミックの例には、例えばホスホロチオエートが含まれる。
DNAは、例えばゲノムDNAまたはクローン化配列のポリメラーゼ連鎖反応(PCR)増幅により得られ得る。PCRプライマーは、好ましくはゲノムDNAの特定断片を増幅させるゲノムの公知の配列に基づいて選択される。当業界で公知のコンピュータープログラム、例えばOligoバージョン5.0(National Biosciences)が所要の特異性及び最適の増幅特性を有するプライマーを設計する際に有用である。マイクロアレイ上の各プローブは典型的には10〜50,000塩基長、通常300〜1,000塩基長の範囲である。PCR方法は当業界で公知であり、例えばInnisら編,PCR PROTOCOLS:A GUIDE TO METHODS AND APPLICATIONS,Academic Press Inc.,San Diego,Calif.(1990)に記載されている。制御ロボットシステムが核酸を単離し、増幅するために有用であることは当業者に自明である。
マイクロアレイのポリヌクレオチドプローブを作成するための代替の好ましい手段は、合成ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを例えばN−ホスホネートまたはホスホルアミデート化学を用いて合成することによる(Froehlerら,Nucleic Acid Res.,14:5399−5407(1986);McBrideら,Tetrahedron Lett.,24:246−248(1983))。合成配列は典型的には約10〜約500塩基長、より典型的には約20〜約100塩基長、最も好ましくは約40〜約70塩基長の範囲である。幾つかの実施形態では、合成核酸には非天然塩基が含まれ、その例はイノシンであるが、決してこれに限定されない。先に述べたように、核酸アナログはハイブリダイゼーションのための結合部位として使用され得る。適当な核酸アナログの例はペプチド核酸である(例えば、Egholmら,Nature,363:566−568(1993);U.S.Pat.No.5,539,083を参照されたい)。結合エネルギー、塩基組成、配列複雑さ、クロスハイブリダイゼーション結合エネルギー及び二次構造を考慮するアルゴリズムを用いてプローブを選択することが好ましい(Friendらの2001年1月25日に公開された国際特許公開WO01/05935;Hughesら,Nat.Biotech.,19:342−7(2001)を参照されたい)。
当業者は、ポジティブ対照プローブ(例えば、標的ポリヌクレオチド分子中の配列に相補的であり且つハイブリダイズし得ることが公知のプローブ)及びネガティブ対照プローブ(例えば、標的ポリヌクレオチド分子中の配列に相補的でなく且つハイブリダイズし得ないことが公知のプローブ)をアレイ上に含めなければならないことも認識している。1つの実施形態では、ポジティブ対照はアレイの周囲に沿って合成される。別の実施形態では、ポジティブ対照はアレイを横切る対角縞中で合成される。更に別の実施形態では、各プローブの逆補体はネガティブ対照として役立つためにプローブの位置の隣で合成される。更に別の実施形態では、生物の他の種由来の配列はネガティブ対照または“スパイク−イン”対照として使用される。
3.5.2.3 プローブの固体表面への結合
プローブは、例えばガラス、プラスチック(例えば、ポリプロピレン、ナイロン)、ポリアクリルアミド、ナイロンセルロース、ゲル、或いは他の多孔質または非多孔質材料から作成され得る固体支持体または表面に結合される。核酸を表面に結合させるための好ましい方法は、Schenaら,Science,270:467−470(1995)に概略的に記載されているようにガラスプレートに印刷することによる。この方法はcDNAのマイクロアレイを作成するために特に有用である(DeRisiら,Nature Genetics,14:457−460(1996);Shalonら,Genome Res.,6:639−645(1996);及びSchenaら,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,93:10539−11286(1995)を参照されたい)。
プローブは、例えばガラス、プラスチック(例えば、ポリプロピレン、ナイロン)、ポリアクリルアミド、ナイロンセルロース、ゲル、或いは他の多孔質または非多孔質材料から作成され得る固体支持体または表面に結合される。核酸を表面に結合させるための好ましい方法は、Schenaら,Science,270:467−470(1995)に概略的に記載されているようにガラスプレートに印刷することによる。この方法はcDNAのマイクロアレイを作成するために特に有用である(DeRisiら,Nature Genetics,14:457−460(1996);Shalonら,Genome Res.,6:639−645(1996);及びSchenaら,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,93:10539−11286(1995)を参照されたい)。
マイクロアレイを作成するための第2の好ましい方法は高密度オリゴヌクレオチドアレイを作成することによる。現場合成のためにフォトリソグラフィー技術を用いて表面上の規定の位置に規定の配列に対して相補的なオリゴヌクレオチドを数千含むアレイを作成するための技術(Fodorら,1991,Science,251:767−773;Peaseら,1994,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,91:5022−5026;Lockhartら,1996,Nature Biotechnology,14:1675;U.S.Pat.Nos.5,578,832、5、556,752及び5,510,270を参照されたい)、または規定のオリゴヌクレオチドの急速合成及び付着のための他の方法(Blanchardら,Biosensors & Bioelectronics,11:687−690)は公知である。これらの方法を使用すると、公知の配列を有するオリゴヌクレオチド(例えば、60マー)が表面(例えば、誘導体化したガラススライド)上で直接合成される。通常、作成されたアレイは余分であり、RNAあたり数個のオリゴヌクレオチド分子を含んでいる。
マイクロアレイを例えばマスキング(Maskos and Southern,1992,Nuc.Acids.Res.,20:1679−1684)により作成する他の方法も使用され得る。原則として、上述したように、任意のタイプのアレイ、例えばナイロンハイブリダイゼーション膜上のドットブロット(Sambrookら,MOLECULAR CLONING−A LABORATORY MANUAL(2ND ED.),Vols.1−3,Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)を参照されたい)を使用することができる。しかしながら、当業者は認識しているように、ハイブリダイゼーション容量がより少ないので非常に小さいアレイが多くの場合好ましい。
1つの実施形態では、本発明のアレイは支持体上でポリヌクレオチドプローブを合成することにより製造される。このような実施形態では、ポリヌクレオチドプローブをポリヌクレオチドの3’または5’末端で支持体上に共有結合される。
特に好ましい実施形態では、本発明のマイクロアレイはオリゴヌクレオチド合成のためのインクジェット印刷デバイスを用いて、例えばBlanchardのU.S.Pat.No.6,028,189;Blanchardら,1996,Biosensors and Bioelectronics,11:687−690;Blanchard,1998,SYNTHETIC DNA ARRAYS IN GENETIC ENGINEERING,Vol.20,J.K.Setlow編,Plenum Press,New York,p.111−123に記載されている方法及びシステムを用いて製造される。具体的には、前記マイクロアレイ中のオリゴヌクレオチドプローブをアレイにおいて(好ましくは、ガラススライド上で)高表面張力の溶媒(例えば、プロピレンカーボネート)の“微小滴”中に個々のヌクレオチド塩基を連続的に沈着させることにより合成することが好ましい。微小滴は容量が小さく(例えば、100pL以下、より好ましくは50pL以下)、マイクロアレイ上に(例えば、疎水性ドメインにより)相互に分離されていて、アレイエレメント(すなわち、異なるプローブ)の位置を規定する円形表面張力壁を形成している。インクジェット法により製造したマイクロアレイは典型的には高密度を有しており、好ましくは少なくとも約2,500個の異なるプローブ/1cm2の密度を有している。ポリヌクレオチドプローブはポリヌクレオチドの3’または5’末端で支持体に共有結合されている。
3.5.2.4 標的ポリヌクレオチド分子
本発明により分析され得るポリヌクレオチド分子(“標的ポリヌクレオチド分子”)は任意の臨床的に関連する源由来であり得るが、天然に存在する核酸分子を含めた発現RNAまたはそこに由来する核酸(例えば、cDNA、またはRNAポレメラーゼプロモーターを含むcDNAに由来する増幅RNA)、並びに合成核酸分子である。1つの実施形態では、標的ポリヌクレオチド分子はRNAからなり、これには全細胞RNA、ポリ(A)+メッセンジャーRNA(mRNA)またはその画分、細胞質mRNA、またはcDNAから転写されたRNA(すなわち、cRNA;例えばLinsley & Schelterの1999年10月4日に出願されたU.S.特許出願番号09/411,074;またはU.S.Pat.Nos.5,545,522、5,891,636または5,716,785)が含まれるが、これらに決した限定されない。全及びポリ(A)+RNAを製造する方法は当業界で公知であり、例えばSambrookら,MOLECULAR CLONING−A LABORATORY MANUAL(2ND ED.),Vols.1−3,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)に概略的に記載されている。1つの実施形態では、RNAを本発明において興味深い各種型の細胞からグアニジニウムチオシアナート溶解を用いて抽出した後、CsCl遠心にかける(Chirgwinら,1979,Biochemistry,18:5294−5299)。別の実施形態では、全RNAはシリカゲルカラムを用いて抽出される。前記シリカゲルの市販例にはRNeasy(カリフォルニア州バレンシアに所在のQiagen)及びStrataPrep(カリフォルニア州ラ・ホイヤに所在のStratagene)が含まれる。サッカロマイセス・セレビシエ(S.cerevisiae)のために好ましい代替実施形態では、RNAは、Ausubelら編,1989,CURRENT PROTOCOLS,MOLECULAR BIOLOGY,Vol.III,Green Publishing Associates.Inc.,John Wiley & Sons.Inc.,New York,p.13.12.1−13.12.5に記載されているように細胞からフェノール及びクロロホルムを用いて抽出される。ポリ(A)+RNAは、例えばオリゴ−dTセルロースを用いて選択することにより、或いは全細胞RNAのオリゴ−dTプライマー逆転写により選択され得る。1つの実施形態では、RNAは当業界で公知の方法により、例えばZnCl2とインキュベートすることによりRNA断片を生成することにより断片化され得る。別の実施形態では、本発明により分析されるポリヌクレオチド分子はcDNA、或いは増幅RNAまたはcDNAのPCR産物からなる。
本発明により分析され得るポリヌクレオチド分子(“標的ポリヌクレオチド分子”)は任意の臨床的に関連する源由来であり得るが、天然に存在する核酸分子を含めた発現RNAまたはそこに由来する核酸(例えば、cDNA、またはRNAポレメラーゼプロモーターを含むcDNAに由来する増幅RNA)、並びに合成核酸分子である。1つの実施形態では、標的ポリヌクレオチド分子はRNAからなり、これには全細胞RNA、ポリ(A)+メッセンジャーRNA(mRNA)またはその画分、細胞質mRNA、またはcDNAから転写されたRNA(すなわち、cRNA;例えばLinsley & Schelterの1999年10月4日に出願されたU.S.特許出願番号09/411,074;またはU.S.Pat.Nos.5,545,522、5,891,636または5,716,785)が含まれるが、これらに決した限定されない。全及びポリ(A)+RNAを製造する方法は当業界で公知であり、例えばSambrookら,MOLECULAR CLONING−A LABORATORY MANUAL(2ND ED.),Vols.1−3,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)に概略的に記載されている。1つの実施形態では、RNAを本発明において興味深い各種型の細胞からグアニジニウムチオシアナート溶解を用いて抽出した後、CsCl遠心にかける(Chirgwinら,1979,Biochemistry,18:5294−5299)。別の実施形態では、全RNAはシリカゲルカラムを用いて抽出される。前記シリカゲルの市販例にはRNeasy(カリフォルニア州バレンシアに所在のQiagen)及びStrataPrep(カリフォルニア州ラ・ホイヤに所在のStratagene)が含まれる。サッカロマイセス・セレビシエ(S.cerevisiae)のために好ましい代替実施形態では、RNAは、Ausubelら編,1989,CURRENT PROTOCOLS,MOLECULAR BIOLOGY,Vol.III,Green Publishing Associates.Inc.,John Wiley & Sons.Inc.,New York,p.13.12.1−13.12.5に記載されているように細胞からフェノール及びクロロホルムを用いて抽出される。ポリ(A)+RNAは、例えばオリゴ−dTセルロースを用いて選択することにより、或いは全細胞RNAのオリゴ−dTプライマー逆転写により選択され得る。1つの実施形態では、RNAは当業界で公知の方法により、例えばZnCl2とインキュベートすることによりRNA断片を生成することにより断片化され得る。別の実施形態では、本発明により分析されるポリヌクレオチド分子はcDNA、或いは増幅RNAまたはcDNAのPCR産物からなる。
1つの実施形態では、全RNA、mRNA、またはそれに由来する核酸を乳癌を患っているヒトから採取したサンプルから単離する。特定細胞において十分に発現しない標的ポリヌクレオチド分子は正規化技術(Bonaldoら,1996,Genome Res.,6:791−806)を用いて濃縮される。
先に述べたように、標的ポリヌクレオチドは1つ以上のヌクレオチドで検出可能に標識される。標的ポリヌクレオチドを検出可能に標識するためには当業界で公知の任意の方法が使用され得る。標識化によりRNAの長さに沿って均一に標識を取り込むことが好ましく、より好ましくは標識化を高い効率で実施する。この標識化のための1つの実施形態では、標識を取り込むためにオリゴ−dTプライマー逆転写を利用する。しかしながら、この方法の慣用方法は3’末端断片の生成に偏っている。よって、好ましい実施形態では、標的ポリヌクレオチドの全長にわたって標識ヌクレオチドを均一に取り込むための逆転写においてランダムプライマー(例えば、9マー)を使用する。或いは、ランダムプライマーを標的ポリヌクレオチドを増幅するためにPCR方法またはT7プロモーターに基づくインビトロ転写方法と一緒に使用し得る。
好ましい実施形態では、検出可能な標識はルミネセンス標識である。例えば蛍光標識、バイオルミネセンス標識、化学ルミネセンス標識及び比色標識が本発明において使用され得る。非常に好ましい実施形態では、標識は蛍光標識、例えばフルオレセイン、りん光体、ローダミンまたはポリメチン染料誘導体である。市販されている蛍光標識の例には、例えば蛍光ホスホルアミデート、例えばFluorePrime(ニュージャージー州ピスカタウェイに所在のAmersham Pharmacia)、Fluoredite(マサチューセッツ州ベッドフォードに所在のMillipore)、FAM(カリフォルニア州フォスターシティーに所在のABI)、及びCy3またはCy5(ニュージャージー州ピスカタウェイに所在のAmersham Pharmacia)が含まれる。別の実施形態では、検出可能な標識は放射標識ヌクレオチドである。
更に好ましい実施形態では、患者サンプル由来の標的ポリヌクレオチド分子を標準の標的ポリヌクレオチド分子とは差次的に標識する。標準は正常個体(すなわち、癌に侵されていない個体)由来の標的ポリヌクレオチド分子を含み得る。非常に好ましい実施形態では、標準は正常個体由来のサンプルまたは癌を有している個体由来の腫瘍サンプルからプールした標的ポリヌクレオチド分子を含む。別の実施形態では、標的ポリヌクレオチド分子は同一個体から誘導されるが、異なる時点で採取され、よって治療(すなわち,増殖因子経路治療薬)中及びその後のバイオマーカーの発現の変化またはその欠乏により治療の有効性を示し、増殖因子経路デレギュレーションパターンから増殖因子経路レギュレーションパターンへのバイオマーカーの発現の変化は治療が有効であることを示す。この実施形態では、異なる時点が差次的に標識される。
3.5.2.5 マイクロアレイへのハイブリダイゼーション
核酸ハイブリダイゼーション及び洗浄条件は、標的ポリヌクレオチド分子がアレイの相補的ポリヌクレオチド配列、好ましくは相補的DNAが存在している特定のアレイ部位に対して特異的に結合または特異的にハイブリダイズするように選択される。
核酸ハイブリダイゼーション及び洗浄条件は、標的ポリヌクレオチド分子がアレイの相補的ポリヌクレオチド配列、好ましくは相補的DNAが存在している特定のアレイ部位に対して特異的に結合または特異的にハイブリダイズするように選択される。
好ましくは、その上に配置されている二本鎖プローブDNAを含むアレイは標的ポリヌクレオチド分子と接触させる前にDNAを一本鎖とすべく変性条件にかけられる。一本鎖プローブDNA(例えば、合成オリゴデオキシリボ核酸)を含むアレイは、例えば自己相補性配列のために形成するヘアピンまたはダイマーを除去するために標的ポリヌクレオチド分子と接触させる前に変性させる必要があることがある。
最適なハイブリダイゼーション条件はプローブの長さ(例えば、オリゴマー対200塩基以上のポリヌクレオチド)及びタイプ(例えば、RNAまたはDNA)、及び標的核酸に依存している。オリゴヌクレオチドが短くなると、満足なハイブリダイゼーション結果のために比較的均一な融点を得るべく長さを調節する必要が生ずることは当業者には自明である。核酸のための特異的(すなわち、ストリンジェントな)ハイブリダイゼーション条件の一般的なパラメーターはSambrookら,MOLECULAR CLONING−A LABORATORY MANUAL(2ND ED.),Vols.1−3,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)及びAusubelら,CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,Vol.2,Current Protocols Publishing,New York(1994)に記載されている。SchenaらのcDNAマイクロアレイに対する典型的なハイブリダイゼーション条件は5×SSC+0.2% SDS中、65℃で4時間ハイブリダイゼーションし、次いで低ストリンジェントな洗浄バッファー(1×SSC+0.2% SDS)中25℃で洗浄した後、高ストリンジェントな洗浄バッファー(0.1×SSC+0.2% SDS)中25℃で10分間洗浄する(Schenaら,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,93:10614(1993))。有用なハイブリダイゼーション条件は、例えばTijessen,1993,HYBRIDIZATION WITH NUCLEIC ACID PROBES,Elsevier Science Publishers B.V.;及びKricka,1992,NONISOTOPIC DNA PROBESTECHNIQUES,Academic Press,San Diego,Calif.にも記載されている。
特に好ましいハイブリダイゼーション条件は、1M NaCl、50mM MESバッファー(pH6.5)、0.5% ナトリウムサルコシン及び30% ホルムアミド中、プローブの平均融点またはそれに近い(例えば、5℃以内、より好ましくは2℃以内)温度でのハイブリダイゼーションを含む。
3.5.2.6 シグナル検出及びデータ分析
蛍光標識したプローブを使用する場合、マイクロアレイの各部位での蛍光発光は好ましくは走査型共焦点レーザー顕微鏡により検出され得る。1つの実施形態では、適当な励起線を用いる別々のスキャンを使用した2つの蛍光体の各々に対して実施する。或いは、2つの蛍光体に対して特異的な波長で標本を同時照射できるレーザーを使用し得、2つの蛍光体からの発光を同時に分析し得る(すべての目的のために全文参照により組み入れるShalomら,1996,“A DNA microarray system for analyzing complex DNA samples using two−color fluorescent probe hybridization”,Genome Research,6:639−645を参照されたい)。好ましい実施形態では、アレイをコンピューター制御X−Yステージ及び顕微鏡対物レンズを備えたレーザー蛍光スキャナーを用いて走査する。2つの蛍光体の連続励起はマルチライン混合ガスレーザーを用いてなされ、発光された光は波長により分割され、2つの光電子増幅管を用いて検出される。蛍光レーザースキャニングデバイスはSchenaら,Genome Res.,6:639−645(1996)及びここに引用されている他の文献中に記載されている。或いは、多数の部位でのmRNAアバンダンスレベルを同時にモニターするためにFergusonら,Nature Biotech.,14:1681−1684(1996)に記載されている光ファイバーバンドルを使用し得る。
蛍光標識したプローブを使用する場合、マイクロアレイの各部位での蛍光発光は好ましくは走査型共焦点レーザー顕微鏡により検出され得る。1つの実施形態では、適当な励起線を用いる別々のスキャンを使用した2つの蛍光体の各々に対して実施する。或いは、2つの蛍光体に対して特異的な波長で標本を同時照射できるレーザーを使用し得、2つの蛍光体からの発光を同時に分析し得る(すべての目的のために全文参照により組み入れるShalomら,1996,“A DNA microarray system for analyzing complex DNA samples using two−color fluorescent probe hybridization”,Genome Research,6:639−645を参照されたい)。好ましい実施形態では、アレイをコンピューター制御X−Yステージ及び顕微鏡対物レンズを備えたレーザー蛍光スキャナーを用いて走査する。2つの蛍光体の連続励起はマルチライン混合ガスレーザーを用いてなされ、発光された光は波長により分割され、2つの光電子増幅管を用いて検出される。蛍光レーザースキャニングデバイスはSchenaら,Genome Res.,6:639−645(1996)及びここに引用されている他の文献中に記載されている。或いは、多数の部位でのmRNAアバンダンスレベルを同時にモニターするためにFergusonら,Nature Biotech.,14:1681−1684(1996)に記載されている光ファイバーバンドルを使用し得る。
シグナルを記録し、好ましい実施形態では、例えば12または16ビットアナログ−デジタルボードを用いてコンピューターにより分析する。1つの実施形態では、スキャンした像をグラフィックプログラム(例えば、Hijaak Graphics Suite)を用いてスペックル除去した後、各部位の各波長での平均ハイブリダイゼーションのスプレッドシートを作成するイメージグリッデイングプログラムを用いて分析する。必要ならば、2つの蛍光体のチャネル間の“混線”(または、オーバーラップ)に対して実験的に調べた補正を作成してもよい。転写アレイでの特定ハイブリダイゼーション部位毎に2つの蛍光体の発光の比を計算し得る。この比は同族遺伝子の絶対発現レベルに依存しないが、その発現がいろいろな乳癌関連状態に関連して有意にモジュレートされる遺伝子に対して有用である。
3.6 コンピューター補助分析
本発明は更に、上記したバイオマーカー集合を含むキットを提供する。好ましい実施形態では、キットは標的ポリヌクレオチド分子へのハイブリダイゼーションの準備ができているマイクロアレイに加えて上記したデータ分析のためのソフトウェアを含んでいる。
本発明は更に、上記したバイオマーカー集合を含むキットを提供する。好ましい実施形態では、キットは標的ポリヌクレオチド分子へのハイブリダイゼーションの準備ができているマイクロアレイに加えて上記したデータ分析のためのソフトウェアを含んでいる。
前セクションに記載されている分析方法は以下のコンピューターシステムを用いて、以下のプログラム及び方法に従って実行され得る。コンピューターシステムはエクスターナル コンポーネントに接続するインターナル コンポーネントを含む。典型的なコンピューターシステムのインターナル コンポーネントはメインメモリーと相互接続させたプロセッサ素子を含む。例えば、コンピューターシステムはIntel 8086−、80386−、80486−、Pentium(登録商標)、または好ましくは32MB以上のメインメモリーを有するPentium(登録商標)プロセッサであり得る。
エクスターナル コンポーネントは大容量記憶装置を含み得る。この大容量記憶装置は1つ以上のハードディスク(典型的には、プロセッサ及びメモリと一緒にパッケージされている)であり得る。ハードディスクは好ましくは1GB以上の記憶容量を有している。他のエクスターナル コンポーネントは、入力デバイス(“マウス”または他のグラフィック入力デバイス及び/またはキーボードであり得る)と一緒にユーザーインターフェースデバイス(モニターであり得る)を含む。印刷デバイスもコンピューターに接続され得る。
典型的には、コンピューターシステムは、他のローカルコンピューターシステム、リモートコンピューターシステムまたは広域通信ネットワーク(例えば、インターネット)へのEthernet(登録商標)リンクの一部であり得るネットワークリンクにもリンクされている。このネットワークリンクにより、コンピューターシステムはデータ及びプロセッシングタスクを他のコンピューターシステムと共有し得る。
このシステムのオペレーション中メモリに当業界で標準であり、本発明に特有の幾つかのソフトウェアコンポーネントをロードする。ソフトウェアコンポーネントは全体でコンピューターシステムを本発明の方法に従って機能させる。これらのソフトウェアコンポーネントは典型的には大容量記憶装置に保存されている。ソフトウェアコンポーネントはコンピューターシステム及びそのネットワーク相互接続を管理するのに関与するオペレーティングシステムを含む。このオペレーティングシステムは、例えばWindows3.1、Windows95、Windows98、Windows2000またはWindowsNTのようなMicrosoft・Windows(登録商標)Familyのものであり得る。ソフトウェアコンポーネントは、本発明に特有の方法を実行するプログラムをアシストするためのこのシステム上に存在する共通の言語及び機能に相当する。多くの高または低レベルのコンピューター言語が本発明の分析方法をプログラムするために使用され得る。ランタイム中指示が解釈され、編集され得る。好ましい言語はC/C++、FORTRAN及びJAVA(登録商標)を含む。最も好ましくは、本発明の方法は、使用しようとするアルゴリズムの一部または全部を含めた方程式の記号エントリー及びプロセッシングの高レベル仕様を可能にする数学ソフトウェアパッケージでプログラム化され、これによりユーザーが個々の方程式またはアルゴリズムを手続き上プログラムする必要が免除される。前記パッケージにはMathworks(マサチューセッツ州ネーティックに所在)製Mathlab、Wolfram Research(イリノイ州シャンペーンに所在)製Mathematica(登録商標)、またはMath Soft(マサチューセッツ州ケンブリッジに所在)製S−Plus(登録商標)Dが含まれる。具体的には、ソフトウェアコンポーネントには手続き型言語または記号パッケージにおいてプログラム化される本発明の分析方法が含まれる。
キットに含まれるソフトウェアは本明細書中に開示されている本発明のデータ分析方法を含む。特に、ソフトウェアは、臨床カテゴリー(すなわち,増殖因子シグナル伝達経路レギュレーション状態)とバイオマーカー発現の相関係数の計算を含めたバイオマーカー発見のための数学的ルーチンを含み得る。ソフトウェアは、サンプルの臨床的分類を決定するためにアレイ生成蛍光データを用いてサンプルバイオマーカー発現と対照バイオマーカー発現間の相関を計算するための数学的ルーチンをも含み得る。
例示的実行において、本発明の方法を実施するために、ユーザーはまずコンピューターシステムに実験データをロードする。これらのデータはユーザーによりモニター、キーボードから、ネットワーク通信によりリンクされている他のコンピューターシステムから、CD−ROM、フロッピー(登録商標)ディスク(説明せず)、テープドライブ(説明せず)、ZIP(登録商標)ドライブ(説明せず)のようなリムーバル記憶媒体に、またはネットワークを介して直接入力され得る。次に、ユーザーは本発明の方法を実施する発現プロファイル分析ソフトウェアを実行する。
別の例示的実行において、ユーザーはまず実験データ及び/またはデータベースをコンピューターシステムにロードする。このデータは記憶媒体またはリモートコンピューターから、好ましくは動的遺伝子集合データベースシステムからネットワークを介してメモリにロードする。次いで、ユーザーは本発明のステップを実施するソフトウェアを実行する。
本発明の分析方法を実行するための別のコンピューターシステム及びソフトウェアは当業者に自明であり、添付されている特許請求の範囲内に包含されると意図される。特に、添付の特許請求の範囲は当業者が容易に認識する本発明の方法を実施するための代替プログラム構造を含むと意図される。
大腸癌細胞株においてAKT阻害によりレギュレートされる遺伝子の同定
ヒト腫瘍における増殖因子シグナル伝達経路デレギュレーションの遺伝子発現サインを同定するために、6つの大腸癌細胞株HCT−8(ATCC番号CCL−244)、LoVo(ATCC番号CCL−229)、COLO205(ATCC番号CLL−222)、DLD−1(ATCC番号CCL−221)、HCT−116(ATCC番号CCL−247)及びHCT−15(ATCC番号CCL−225)をまずAKT1/2小分子阻害に応答する遺伝子を同定するためにマイクロアレイにより発現プロファイルさせた。6つの大腸癌細胞株を4μMのAKT1/2阻害剤L−001154547(’547;3−フェニル−2−(4−{[4−(5−ピリジン−2−イル−1H−1,2,4−トリアゾル−3−イル)ピペリジン−1−イル]メチル}フェニル)−1,6−ナフチリジン−5(6H)−オン;WO2006065601に開示されている)または4μMのAKT1/2阻害剤L−01173931(’931;6−メチル−3−フェニル−2−(4−{[4−(5−ピリジン−2−イル−1H−1,2,4−トリアゾル−3−イル)ピペリジン−1−イル]−メチル}フェニル)−1,6−ナフチリジン−5(6H)−オン;WO2006065601に開示されている)で6または24時間処理した。1つの化合物のオフターゲット効果を相殺するための方法としてのプロファイリング実験のために2つのAKT1/2阻害剤を使用した。これらの6つの細胞株は、大腸癌細胞株の3つ(HCT−8、LoVo、COLO205)がインビトロで’547化合物によるAKT阻害に対して比較的感受性であり、他の3つの細胞株(DLD−1、HCT−116及びHCT−15)が’547化合物によるAKT阻害に対して比較的耐性であったことを示した19個の大腸癌細胞株に関する従来のデータに基づいて選択した(図2を参照されたい)。
ヒト腫瘍における増殖因子シグナル伝達経路デレギュレーションの遺伝子発現サインを同定するために、6つの大腸癌細胞株HCT−8(ATCC番号CCL−244)、LoVo(ATCC番号CCL−229)、COLO205(ATCC番号CLL−222)、DLD−1(ATCC番号CCL−221)、HCT−116(ATCC番号CCL−247)及びHCT−15(ATCC番号CCL−225)をまずAKT1/2小分子阻害に応答する遺伝子を同定するためにマイクロアレイにより発現プロファイルさせた。6つの大腸癌細胞株を4μMのAKT1/2阻害剤L−001154547(’547;3−フェニル−2−(4−{[4−(5−ピリジン−2−イル−1H−1,2,4−トリアゾル−3−イル)ピペリジン−1−イル]メチル}フェニル)−1,6−ナフチリジン−5(6H)−オン;WO2006065601に開示されている)または4μMのAKT1/2阻害剤L−01173931(’931;6−メチル−3−フェニル−2−(4−{[4−(5−ピリジン−2−イル−1H−1,2,4−トリアゾル−3−イル)ピペリジン−1−イル]−メチル}フェニル)−1,6−ナフチリジン−5(6H)−オン;WO2006065601に開示されている)で6または24時間処理した。1つの化合物のオフターゲット効果を相殺するための方法としてのプロファイリング実験のために2つのAKT1/2阻害剤を使用した。これらの6つの細胞株は、大腸癌細胞株の3つ(HCT−8、LoVo、COLO205)がインビトロで’547化合物によるAKT阻害に対して比較的感受性であり、他の3つの細胞株(DLD−1、HCT−116及びHCT−15)が’547化合物によるAKT阻害に対して比較的耐性であったことを示した19個の大腸癌細胞株に関する従来のデータに基づいて選択した(図2を参照されたい)。
遺伝子発現プロファイリングのために、全RNAを細胞サンプルから抽出し、標準プロトコル(Hughesら,2001,Nat.Biotechnol.,19:342−47;Van’t Veerら,2002,Nature,415:530−36)を用いて増幅させた。約44,000個のヒト遺伝子の発現をStratagene Universal Human Reference RNA(カリフォルニア州ラ・ホヤに所在のStratagene Corporation)を用いて60マーオリゴヌクレオチドアレイ(カリフォルニア州サンタクララに所在のAgilent Technologies,Inc.)にハイブリダイズさせることにより確認した。遺伝子発現を先に記載した(上掲したHughesら,2001;上掲したVan’t Veerら,2002)標準方法を用いて調べ、正規化した。データをビヒクルのみで処理した細胞における平均発現に正規化させた。
処理後変化のANOVA分析から、AKT化合物治療及びAKT化合物治療に対する処理応答に関連する有意な差次的発現が明らかとなった。3,500個の遺伝子は処理後差次的にレギュレートされており(p値<0.01)、1,600個の遺伝子は比較的感受性な細胞株(HCT−8、LoVo、COLO205)と比較的耐性の細胞株(DLD−1、HCT−116及びHCT−15)間で差次的にレギュレートされた(図3A;p値<0.01)。遺伝子発現の投与後変化を用いる応答者及び非応答者の判別分析は1つ抜き交差確認法で90%正確であった(データ示さず)。これら1,600個の遺伝子の中で、我々はこのデータセットでIRS2の発現の変化とぴったり相関(r>0.7)していた399個の遺伝子を増殖因子経路シグナル伝達の主要メディエータ(図3B)(Hennessyら,2005,Nat.Rev.Drug Discov.,4:988−1004)として着目した。図1に示した感受性及び耐性表現型が絶対ではないが相対的であることに留意されたい。アッセイした19個の細胞株の全部がAKT1/2の阻害に応答して若干程度の細胞死滅を示した。従って、予想されたように、すべての細胞株がこれら399個の遺伝子に対して処理後同様の方向のレギュレーションを示し、より感受性の細胞株はよりロバストなレギュレーションを示した。
AKTサイン遺伝子集合のフィルタリング
399個の遺伝子からのAKT遺伝子発現サインをより管理しやすいサイズに縮小するために、2つのアプローチを採用した。まず、我々は“フィードバックレギュレーション”に関与する遺伝子を除外した。我々は、フィードバックレギュレーション遺伝子をAKTシグナル伝達を活性化することが公知であるが、インビトロでAKT阻害剤によりアップレギュレートされたものとして定義した。例えば、ERBB3、IRS1、ERBB2、INSR、IRS2、FGFR1及びEGFR(AKTを活性化することが公知の増殖因子経路成分)はより感受性の細胞株(COLO205、HCT−8、LoVo)においてAKT阻害によりアップレギュレートされた(少なくとも1つの実験でp<0.5)(図4A)。これらの遺伝子の各々はAKTの上流にあり、各々は増殖因子により活性化されるとPI3K/AKTシグナル伝達の活性化がもたらされることが公知である。AKT活性化剤がAKT阻害によりアップレギュレートされるであろうことは反直観的と見られるが、このアップレギュレーションは阻害剤を添加した後AKTシグナル伝達活性を取り戻す細胞の試みに相当しているようである。
399個の遺伝子からのAKT遺伝子発現サインをより管理しやすいサイズに縮小するために、2つのアプローチを採用した。まず、我々は“フィードバックレギュレーション”に関与する遺伝子を除外した。我々は、フィードバックレギュレーション遺伝子をAKTシグナル伝達を活性化することが公知であるが、インビトロでAKT阻害剤によりアップレギュレートされたものとして定義した。例えば、ERBB3、IRS1、ERBB2、INSR、IRS2、FGFR1及びEGFR(AKTを活性化することが公知の増殖因子経路成分)はより感受性の細胞株(COLO205、HCT−8、LoVo)においてAKT阻害によりアップレギュレートされた(少なくとも1つの実験でp<0.5)(図4A)。これらの遺伝子の各々はAKTの上流にあり、各々は増殖因子により活性化されるとPI3K/AKTシグナル伝達の活性化がもたらされることが公知である。AKT活性化剤がAKT阻害によりアップレギュレートされるであろうことは反直観的と見られるが、このアップレギュレーションは阻害剤を添加した後AKTシグナル伝達活性を取り戻す細胞の試みに相当しているようである。
このフィードバックレギュレーションはインビトロでのAKTの短期間の急激な阻害の結果であり得(図4B)、インビボで正常組織に比してAKTの長期間の慢性活性化を有しているヒト腫瘍では観察されそうもない。例えば、ERBB3、IRS1、ERBB2、INSR、IRS2、FGFR1及びEGFRはインビトロでAKT阻害剤によりアップレギュレートされた(すなわち、AKT阻害状態ではより高い)のに対して、多くの腫瘍ではアップレギュレートされる(すなわち、高いAKTシグナル伝達を有する組織ではより高い)ことは公知である(Hennessyら,2005,Nat.Rev.Drug Discov.,4:988−1004)。我々はヒト腫瘍中の増殖因子経路活性を評価するためにこのサインを使用したいので、我々は正確なインビトロ環境及びインビボ腫瘍環境でAKT経路モジュレーションに応答して同一方向のレギュレーションを示す遺伝子に着目した。我々のアプローチは、インビトロでAKT阻害剤によりダウンレギュレートされ、大腸腫瘍発現アトラスにおいて隣接する正常組織に比して大腸癌では平均してアップレギュレートされる(及びその逆)遺伝子を同定することであった。大腸腫瘍発現アトラスは大腸癌に関する遺伝子発現情報を含むデータベースである。大腸腫瘍発現アトラスの場合、同一患者からの照合させた大腸腫瘍及び正常(すなわち、隣接する非癌性)サンプルの最高75対を正常サンプルの部分集合のプールに対してプロファイリングした。前記遺伝子を同定するために、我々は照合させた隣接正常組織に対して各腫瘍を再び比率で示すことにより大腸腫瘍発現アトラス中の各腫瘍サンプル毎に1つのプロファイルを作成した。上記した399個の遺伝子発現サインから始めて、我々は次のオペレーションを実施した。インビトロでAKT阻害剤によりアップレギュレートされた遺伝子の場合、正常組織に比して大腸腫瘍においてより低いもののみを保持する(腫瘍集合で平均log比<−0.2);インビトロでAKT阻害剤によりダウンレギュレートされた遺伝子の場合、正常組織に比して大腸腫瘍においてより高いもののみを保持する(腫瘍集合で平均log比>0.2;図4C参照)。
第2に、我々は上記したより感受性の大腸癌細胞株(HCT−8、LoVo、COLO205)において6つの時点プロファイルのすべてにおいてレギュレートされた遺伝子(FC>1.2,p<0.05)のみを維持した。これは、増殖のより非特異的な阻害を反映する可能性があるより遠隔変化よりもAKT阻害に対して近位の変化に着目すべく実施した。
これらのフィルタリングアプローチを採用した後、我々はAKTシグナル伝達活性に対する48個の遺伝子発現サインを残した。このAKTサインは大腸癌細胞及び大腸腫瘍において生じたので、我々は次に乳癌に対する適用可能性を評価した。我々は次の式;
平均log比(インビトロでAKT阻害によりダウンレギュレートされた遺伝子)−平均log比(インビトロでAKT阻害によりアップレギュレートされた遺伝子)
を用いて乳房腫瘍発現アトラス中の1つのサイン“スコア”を計算した。乳房腫瘍発現アトラスは乳癌に関する遺伝子発現情報を含むデータベースである。乳房腫瘍発現アトラスの場合、同一患者からの照合させた乳房腫瘍及び正常(すなわち、隣接する非癌性)サンプルの最高75対を正常サンプルの部分集合のプールに対してプロファイリングした。AKTサインスコアは隣接正常組織に比して乳房腫瘍においてより高い(図5A)。このことは、他の方法により固体腫瘍においてより高いAKTシグナル伝達を示す証拠(Altomareら,2003,Cell Biochem.,88:470−476;Chengら,1996,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,93:3636−3641;Goelら,2004,Cancer Res.,64:3014−3021;Liら,1997,Science,275:1943−1947;Liら,2005,World J.Gastroenterol.,11:285−288;Ruggeriら,1998,Mol.Carcinog.,21:81−86;Staalら,1987,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84:5034−5037)、及びリン酸化したAKTレベルは乳癌における負の予後指標であることを示すデータ(Vesteyら,2005,Eur.J.Cancer,41:1017−1025)と一致している。このことから、AKTシグナル伝達の我々のサインがヒト腫瘍におけるAKT経路活性化状態を正確に反映していることが示唆される。臨床的アッセイを開発するための遺伝子に着目するために、我々は生非得的機能を持たない非注釈遺伝子を排除し、37個の遺伝子サイン、すなわち24個のAKTシグナル伝達活性の増加に伴いアップする遺伝子(“AKT UP”;表1を参照されたい)及び13個のAKTシグナル伝達活性の増加に伴いダウンする遺伝子(“AKT DOWN”;表2を参照されたい)を残した。
平均log比(インビトロでAKT阻害によりダウンレギュレートされた遺伝子)−平均log比(インビトロでAKT阻害によりアップレギュレートされた遺伝子)
を用いて乳房腫瘍発現アトラス中の1つのサイン“スコア”を計算した。乳房腫瘍発現アトラスは乳癌に関する遺伝子発現情報を含むデータベースである。乳房腫瘍発現アトラスの場合、同一患者からの照合させた乳房腫瘍及び正常(すなわち、隣接する非癌性)サンプルの最高75対を正常サンプルの部分集合のプールに対してプロファイリングした。AKTサインスコアは隣接正常組織に比して乳房腫瘍においてより高い(図5A)。このことは、他の方法により固体腫瘍においてより高いAKTシグナル伝達を示す証拠(Altomareら,2003,Cell Biochem.,88:470−476;Chengら,1996,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,93:3636−3641;Goelら,2004,Cancer Res.,64:3014−3021;Liら,1997,Science,275:1943−1947;Liら,2005,World J.Gastroenterol.,11:285−288;Ruggeriら,1998,Mol.Carcinog.,21:81−86;Staalら,1987,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84:5034−5037)、及びリン酸化したAKTレベルは乳癌における負の予後指標であることを示すデータ(Vesteyら,2005,Eur.J.Cancer,41:1017−1025)と一致している。このことから、AKTシグナル伝達の我々のサインがヒト腫瘍におけるAKT経路活性化状態を正確に反映していることが示唆される。臨床的アッセイを開発するための遺伝子に着目するために、我々は生非得的機能を持たない非注釈遺伝子を排除し、37個の遺伝子サイン、すなわち24個のAKTシグナル伝達活性の増加に伴いアップする遺伝子(“AKT UP”;表1を参照されたい)及び13個のAKTシグナル伝達活性の増加に伴いダウンする遺伝子(“AKT DOWN”;表2を参照されたい)を残した。
MYCシグナル伝達サインの統合及び新規MYCサインの開発
Bildらは、原発性ヒト乳房上皮細胞においてcMYC(MYCとしても公知)過剰発現に応答してレギュレートされた遺伝子発現サインを発表した(2006,Nature,439:353−357)。このMYCサインを腫瘍発現アトラスデータの状況において分析した。腫瘍発現アトラスは乳房、大腸、胃、腎臓及び肺腫瘍を含めた幾つかの異なる型のヒト腫瘍において調べた遺伝子発現データのコレクションである。この腫瘍発現アトラスの場合、同一患者からの各型の腫瘍及び正常(すなわち、隣接する非癌性)サンプルの最高75対を正常サンプルの部分集合のプールに対してプロファイルした。1個の遺伝子CCNG2(転写物ID BC032518)のみがAKTサインとBildのMYCサイン間で共有された。我々は、MYCサインが大腸及び乳房腫瘍発現アトラスデータセットにおいてAKTサインと高度に相関していたことも知見した(図6A、B)。従って、我々は、AKT及び他の腫瘍標的の抑制に応答したMYCサインのレギュレーションを評価した。図6Cに示すように、Bildらが開発したMYCサインはAKT、cMET及びFGFR2を標的化する小分子インヒビターによりロバスト且つ常に抑制されたが、タキソールまたはKSP小分子インヒビターによっては抑制されなかった。cMET、FGFR2及びAKT阻害により引き出されるサインは非常に似ており(データ示さず)、類似のメカニズムを反映している。従って、MYCサインは細胞死の一般的なサインでない。むしろ、増殖因子経路シグナル伝達(増殖因子受容体チロシンキナーゼまたはシグナル伝達中間体の標的化)が生じるとレギュレートされるが、有糸分裂抑制剤によりレギュレヘートされない。
Bildらは、原発性ヒト乳房上皮細胞においてcMYC(MYCとしても公知)過剰発現に応答してレギュレートされた遺伝子発現サインを発表した(2006,Nature,439:353−357)。このMYCサインを腫瘍発現アトラスデータの状況において分析した。腫瘍発現アトラスは乳房、大腸、胃、腎臓及び肺腫瘍を含めた幾つかの異なる型のヒト腫瘍において調べた遺伝子発現データのコレクションである。この腫瘍発現アトラスの場合、同一患者からの各型の腫瘍及び正常(すなわち、隣接する非癌性)サンプルの最高75対を正常サンプルの部分集合のプールに対してプロファイルした。1個の遺伝子CCNG2(転写物ID BC032518)のみがAKTサインとBildのMYCサイン間で共有された。我々は、MYCサインが大腸及び乳房腫瘍発現アトラスデータセットにおいてAKTサインと高度に相関していたことも知見した(図6A、B)。従って、我々は、AKT及び他の腫瘍標的の抑制に応答したMYCサインのレギュレーションを評価した。図6Cに示すように、Bildらが開発したMYCサインはAKT、cMET及びFGFR2を標的化する小分子インヒビターによりロバスト且つ常に抑制されたが、タキソールまたはKSP小分子インヒビターによっては抑制されなかった。cMET、FGFR2及びAKT阻害により引き出されるサインは非常に似ており(データ示さず)、類似のメカニズムを反映している。従って、MYCサインは細胞死の一般的なサインでない。むしろ、増殖因子経路シグナル伝達(増殖因子受容体チロシンキナーゼまたはシグナル伝達中間体の標的化)が生じるとレギュレートされるが、有糸分裂抑制剤によりレギュレヘートされない。
cMYCがT−ALL細胞におけるNotchシグナル伝達の直接の標的であり、cMYCの過剰発現がγ−セクレターゼ阻害剤誘導細胞死由来のT細胞急性リンパ球芽性白血病/リンパ腫(T−ALL)細胞を保護し得ることは既に立証されている(Wengら,2006,Genes Dev.,20:2096−2109)。次には、我々はT−ALL細胞株(DND−41、MOLT−4(ATCC番号CRL−1582)、HPB−ALL、KARPAS−45、RPMI−8402、TALL−1、LOUCY(ATCC番号CRL−2629))におけるγ−セクレターゼ阻害に応答したBildらが開発したMYCサインを評価した。T−ALL細胞株を100nMまたは1μMのγ−セクレターゼ阻害剤421Bで3または7日間処理した。421Bは(US7,138,400及びWO02/36555の実施例75に開示されている)スルファミド化合物である。図7に示すように、γ−セクレターゼが阻害されると、MYCを発現しないLoucy細胞を除くT−ALL細胞株においてMYCサインは抑制された。従って、古典的な増殖因子経路インヒビターに加えて、MYCサインはγ−セクレターゼ阻害剤に対する標的阻害剤の読出し情報であり得る。
複数の腫瘍学化合物によるMYCサインの明らかに一定のレギュレーションのために、我々は新規MYCサインを開発するための代替アプローチを採用した。GTL−16胃癌(Giordano,1989,Nature,339:155−156)及びEBC−1肺癌細胞株(RIKEN RCB1965)をIC10、IC50及びIC90用量(cMETリン酸化のインビトロ抑制のために)のcMETインヒビターL−001501404(4−(6−フェニル−[1,2,4]トリアゾロ[4,3−b][1,2,4]トリアジン−3−イルメチル)−フェノール;US7,122,548も参照されたい)、MK−2461(N−[(2R)−1,4−ジオキサン−2−イルメチル]−N−メチル−N’−[3−(1−メチル−1H−ピラゾル−4−イル)−5−オキソ−5H−ベンゾ[4,5]シクロヘプタ[1,2−b]ピリジン−7−イル]スルファミド;PCT出願に開示されている)及びL−001793225(1−[3−(1−メチル−1H−ピラゾル−4−イル)−5−オキソ−5H−ベンゾ[4,5]シクロヘプタ[1,2−b]ピリジン−7−イル]−N−(ピリジン−2−イルメチル)メタンスルホンアミド;まだ出願されていないPCTに開示されている)で12または24時間処理した。遺伝子発現プロファイルを得るために、全RNAを細胞サンプルから抽出し、標準プロトコル(Hughesら,2001,Nat.Biotechnol.,19:342−47;Van’t Veerら,2002,Nature,415:530−36)を用いて増幅させた。約44,000個のヒト遺伝子の発現は、60マーオリゴヌクレオチドアレイ(カリフォルニア州サンタクララに所在のAgilent Technologies,Inc.)にStratagene Universal Human Reference RNA(カリフォルニア州ラ・ホイヤに所在のStratagene Corporation)を用いてハイブリダイズすることにより確認した。遺伝子発現を先に記載した(上掲のHughesら,2001;上掲のVan’t Veerら,2002)標準方法を用いて調べ、正規化した。データをビヒクルのみで処理した細胞における平均発現に対して正規化した。
すべてのIC90サンプルにおいて少なくとも2倍の変化を示した遺伝子をIngenuityソフトウェア(カリフォルニア州レッドウッドシティーに所在のIngenuity Systems)を用いてパスウェイ分析したところ、MYCが最も有意な相互作用ネットワークの中心ハブであることが判明した(図8A;p<1×10−64)。加えて、遺伝子集合アノテーターを用いる分析から、MYCプロモーターエレメントを含む遺伝子(Broad Instituteプロモーターモチーフデータベース(Xieら,2005,Nature,434:338−345も参照されたい)、E値=2.29×10−13)がすべてのIC90サンプルにおいて少なくとも2倍のダウンレギュレーションを示す遺伝子の中で最も有意に濃縮された群であったことが判明した(データ示さず)。作成し、図8Aに示したIngenuity相互作用を用いて、我々は新規なMYCサインを得るためにMYC及びMYCと相互作用することが科学文献から公知の18個の遺伝子に着目した。18個の遺伝子は倍発現変化、及びタンパク質−タンパク質相互作用よりもMYCとの相互作用がIngenuityにより定義して転写レベルで公知であったという事実に基づいて選択された。MYCサイン遺伝子のうちの13個はMYCシグナル伝達の増加に伴ってアップし(“MYC UP”)、前記遺伝子のうちの6個はMYCシグナル伝達の増加に伴ってダウンした(“MYC DOWN”;表3)。この新規なMYCシグナル伝達サインは大腸腫瘍及び乳房腫瘍アトラスデータセットにおいてAKT経路サインとも相関し(データ示さず)、有糸分裂抑制剤(タキソール、KSPインヒビター)ではなく、増殖因子経路インヒビター及びγ−セクレターゼ阻害剤によりレギュレートされる(図8B)。
“増殖因子シグナル伝達経路”サインの拡張
上記したように、AKT及びMYCシグナル伝達サインは有糸分裂抑制剤ではなく、複数の増殖因子経路インヒビターによりレギュレートされる。この結果から、AKT及びMYCシグナル伝達サインは多分増殖因子経路活性の大きな発現サインの一部であり、AKT及びMYCシグナル伝達サインにより表される遺伝子は増殖因子シグナル伝達軸に沿ったいろいろなポイントを表わし得ることが示唆される。増殖因子経路シグナル伝達の抑制に対して複数の可能性ある標的があるため、また〜100個の遺伝子がバイオマーカーとしてのサイン遺伝子を測定するための臨床的アッセイを商業化及び作成するために選択され得る可能性があるために、我々は有糸分裂抑制剤ではなく増殖因子経路インヒビターによりロバストにレギュレートされる他の遺伝子を同定することにより我々の増殖因子シグナル伝達経路サインを拡張させた。
上記したように、AKT及びMYCシグナル伝達サインは有糸分裂抑制剤ではなく、複数の増殖因子経路インヒビターによりレギュレートされる。この結果から、AKT及びMYCシグナル伝達サインは多分増殖因子経路活性の大きな発現サインの一部であり、AKT及びMYCシグナル伝達サインにより表される遺伝子は増殖因子シグナル伝達軸に沿ったいろいろなポイントを表わし得ることが示唆される。増殖因子経路シグナル伝達の抑制に対して複数の可能性ある標的があるため、また〜100個の遺伝子がバイオマーカーとしてのサイン遺伝子を測定するための臨床的アッセイを商業化及び作成するために選択され得る可能性があるために、我々は有糸分裂抑制剤ではなく増殖因子経路インヒビターによりロバストにレギュレートされる他の遺伝子を同定することにより我々の増殖因子シグナル伝達経路サインを拡張させた。
増殖因子シグナル伝達経路サインに対する追加遺伝子を同定するために、以下の基準を使用した:1)GTL−16胃癌細胞においてIC90用量のMK2461(cMETインヒビターN−[(2R)−1,4−ジオキサン−2−イルメチル]−N−メチル−N’−[3−(1−メチル−1H−ピラゾル−4−イル)−5−オキソ−5H−ベンゾ[4,5]シクロヘプタ[1,2−b]ピリジン−7−イル]スルファミド)により少なくとも2倍(p<0.01)レギュレートされる;2)タキソールまたはKSPの抑制によりレギュレートされない(p>0.05);3)上記したAKTまたMYCサインの一部でない。更に、増殖因子シグナル伝達活性の増加に伴ってアップする26個の遺伝子(“GF UP”;表4a)及び増殖因子シグナル伝達活性の増加に伴ってダウンする19個の遺伝子(“GF DOWN”;表4b)を同定するために、これらの基準を用いて同定された遺伝子を倍発現変化並びにAKT及びFGFR2の抑制に対する応答性に基づいて順位付けした。
上記分析の最終結果は、腫瘍において増殖因子シグナル伝達経路の活性を反映している101個の遺伝子サインである(表5)。この遺伝子サインは2つの対立する腕、すなわち増殖因子経路を介するシグナル伝達の増加に伴ってアップレギュレートされる遺伝子からなる“アップ”腕(表5a)及びダウンレギュレートされる遺伝子からなる“ダウン”腕(表5b)に分けられる。
増殖因子シグナル伝達経路サインの小分子インヒビター及び増殖因子による逆レギュレーション
我々は増殖因子経路シグナル伝達のインヒビターによるレギュレーションに基づいて上記の新規な増殖因子シグナル伝達経路サインを開発したので、我々は、我々の新規サイン遺伝子が増殖因子シグナル伝達を活性化させる治療によりインビトロで逆レギュレートされるであろうと仮定した。複数の細胞株(SKMC(骨格筋)、MCF7(乳癌)、HT29(大腸癌)及びHMEC(乳房上皮細胞)を5つの増殖因子(ヘレグリン、インスリン、IGF、FGF、EGF)で0.5、2、6、18または24時間処理した後プロファイルした。図9に示すように、増殖因子経路サインは増殖因子経路シグナル伝達のインヒビターと比較して増殖因子により逆レギュレートされる。増殖因子インヒビターによりアップレギュレートされる遺伝子は増殖因子によりダウンレギュレートされ、またはその逆であり、レギュレーションは増殖因子で処理してから2時間くらいの早期に観察された。加えて、サイン遺伝子は有糸分裂抑制剤により一定のレギュレーションを示さなかった。これらの結果から、このサインが増殖または細胞死の一般的サインでなく、むしろサインは増殖因子経路シグナルの活性に対してより近似で特異的な事象を明らかに反映していることが立証される。
我々は増殖因子経路シグナル伝達のインヒビターによるレギュレーションに基づいて上記の新規な増殖因子シグナル伝達経路サインを開発したので、我々は、我々の新規サイン遺伝子が増殖因子シグナル伝達を活性化させる治療によりインビトロで逆レギュレートされるであろうと仮定した。複数の細胞株(SKMC(骨格筋)、MCF7(乳癌)、HT29(大腸癌)及びHMEC(乳房上皮細胞)を5つの増殖因子(ヘレグリン、インスリン、IGF、FGF、EGF)で0.5、2、6、18または24時間処理した後プロファイルした。図9に示すように、増殖因子経路サインは増殖因子経路シグナル伝達のインヒビターと比較して増殖因子により逆レギュレートされる。増殖因子インヒビターによりアップレギュレートされる遺伝子は増殖因子によりダウンレギュレートされ、またはその逆であり、レギュレーションは増殖因子で処理してから2時間くらいの早期に観察された。加えて、サイン遺伝子は有糸分裂抑制剤により一定のレギュレーションを示さなかった。これらの結果から、このサインが増殖または細胞死の一般的サインでなく、むしろサインは増殖因子経路シグナルの活性に対してより近似で特異的な事象を明らかに反映していることが立証される。
増殖因子シグナル伝達経路サインまたはcMET mRNA発現によるcMETインヒビターに対する応答の予測
14個の腫瘍株のcMETインヒビターMK−2461に対する感受性について試験した。腫瘍を軟寒天に接種した腫瘍のコロニーを形成する能力を試験するコロニー形成アッセイで試験した。サンプルを異なる用量のMK−2461で処理し、MK−2461のコロニー形成に対する抑制効果を評価した。コロニー形成をビヒクル処理に比して50%低下させるMK−2461のIC50用量を確認した。各腫瘍株で遺伝子発現プロファイリングも実施した。
14個の腫瘍株のcMETインヒビターMK−2461に対する感受性について試験した。腫瘍を軟寒天に接種した腫瘍のコロニーを形成する能力を試験するコロニー形成アッセイで試験した。サンプルを異なる用量のMK−2461で処理し、MK−2461のコロニー形成に対する抑制効果を評価した。コロニー形成をビヒクル処理に比して50%低下させるMK−2461のIC50用量を確認した。各腫瘍株で遺伝子発現プロファイリングも実施した。
MK−2461応答を予測するためにcMETのmRNA発現の能力を評価した。図11Aに示すように、MK−2461処理に対して最も感受性であった腫瘍は低いcMET発現を有していた。しかしながら、図11Bに示すように、最も感受性の腫瘍は最高のベースライン増殖因子シグナル伝達経路サインスコアを有していた。ビヒクル処理した腫瘍株及び化合物処理した腫瘍株からRNAを採取したら、MK−2461処理細胞の遺伝子発現プロファイルをビヒクル処理細胞と比較することによりMK−2461による増殖因子シグナル伝達経路のレギュレーションを評価した。マイクロアレイ上の各プローブ毎に、照合させたビヒクル処理した細胞に対するMK−2461処理した細胞における発現のlog(10)比を計算した。増殖因子シグナル伝達経路サインスコアは、サインの“アップ”腕中の遺伝子(表5aを参照されたい)の平均log(10)比−サインの“ダウン”腕中の遺伝子(表5bを参照されたい)の平均log(10)比として計算した。これらのデータから、増殖因子シグナル伝達経路サインはcMETのmRNA発現よりも良好なMK−2461感受性の予測子であること及びこのサインはMK−2461での治療に対する応答を予測するために使用され得ることが示唆される。
細胞株における化合物有効性の早期読出し情報としての増殖因子シグナル伝達経路サイン
cMETが増殖している2つの細胞株(EBC−1及びGTL−16)を含めてPI3K/MAPK経路成分が変化している10個の細胞株を同定した(表6を参照されたい)。従来の研究で、表6にリストされている10個の細胞株の中でEBC−1及びGTL−16のみがcMETインヒビターMK−2461での処理に応答して細胞死に対して感受性であった(データ示さず)。これらの細胞における増殖因子シグナル伝達経路サインのレギュレーションを評価するために、これらの細胞株をビヒクルまたは1μMのMK−2461で処理した。処理してから6及び12時間目に細胞株をプロファイルした。各処理群につき6つのウェルプレートに2つの培養物を接種した。細胞は採取した時点で〜70%コンフルエンスであった。実験は2回実施した。
cMETが増殖している2つの細胞株(EBC−1及びGTL−16)を含めてPI3K/MAPK経路成分が変化している10個の細胞株を同定した(表6を参照されたい)。従来の研究で、表6にリストされている10個の細胞株の中でEBC−1及びGTL−16のみがcMETインヒビターMK−2461での処理に応答して細胞死に対して感受性であった(データ示さず)。これらの細胞における増殖因子シグナル伝達経路サインのレギュレーションを評価するために、これらの細胞株をビヒクルまたは1μMのMK−2461で処理した。処理してから6及び12時間目に細胞株をプロファイルした。各処理群につき6つのウェルプレートに2つの培養物を接種した。細胞は採取した時点で〜70%コンフルエンスであった。実験は2回実施した。
RNAをビヒクル処理した細胞及び化合物処理した細胞から収集し、ビヒクル処理した細胞に対してMK−2461処理した細胞の遺伝子発現プロファイルを比較することによりMK−2461による増殖因子シグナル伝達経路のレギュレーションを評価した。マイクロアレイ上の各プローブ毎に、細胞株照合させたビヒクル処理したサンプルに対するMK−2461処理したサンプルにおける発現のlog(10)比を計算した。増殖因子シグナル伝達経路サインスコアをサインの“アップ”腕中の遺伝子(表5aを参照されたい)の平均log(10)比−サインの“ダウン”腕中の遺伝子(表5bを参照されたい)の平均log(10)比として計算した。図12に示すように、EBC−1及びGTL−16の2個の細胞株でのみ増殖因子シグナル伝達経路の抑制が観察された。これらがMK−2461に対して感受性のたった2つだけの細胞株であるので、これらのデータから増殖因子シグナル伝達経路サインが有効性の早期読出し情報として使用され得ることが示唆される。
異種移植片における化合物有効性の早期読出し情報としての増殖因子シグナル伝達経路サイン
HRLN雌nu/nuマウスに5×106個のEBC−1腫瘍細胞を皮下移植した。治療薬を投与する前に腫瘍を450−500mgの平均サイズまで増殖させた。異種移植片をビヒクル、或いは11、34または112mpkのMK−2461で処理した(各治療群につきn=4)。従来のデータから、112mpkの用量のみが腫瘍増殖に対して効果を有していたことが立証された(データ示さず)。112mpkのMK−2461で処理すると、ビヒクル処理に比べて腫瘍増殖が約30%抑制された。11mpk及び34mpkのMK−2461での処理は腫瘍増殖に対して効果を有していなかった。治療薬は1日2回、7日間経口投与した。最後に投与してから2時間後がCmaxに達する推定時間であったので、この時点で腫瘍を収集した。
HRLN雌nu/nuマウスに5×106個のEBC−1腫瘍細胞を皮下移植した。治療薬を投与する前に腫瘍を450−500mgの平均サイズまで増殖させた。異種移植片をビヒクル、或いは11、34または112mpkのMK−2461で処理した(各治療群につきn=4)。従来のデータから、112mpkの用量のみが腫瘍増殖に対して効果を有していたことが立証された(データ示さず)。112mpkのMK−2461で処理すると、ビヒクル処理に比べて腫瘍増殖が約30%抑制された。11mpk及び34mpkのMK−2461での処理は腫瘍増殖に対して効果を有していなかった。治療薬は1日2回、7日間経口投与した。最後に投与してから2時間後がCmaxに達する推定時間であったので、この時点で腫瘍を収集した。
ビヒクル処理したサンプル及び化合物処理したサンプルからRNAを収集した。4つのビヒクル処理したサンプルの平均遺伝子発現プロファイルに対してMK−2461処理したサンプルの遺伝子発現プロファイルを比較することによりMK−2461による増殖因子シグナル伝達経路サインのレギュレーションを評価した。マイクロアレイ上の各プローブ毎にビヒクル処理したサンプルの平均に対するMK−2461処理したサンプルの発現のlog(10)比を計算した。増殖因子シグナル伝達経路サインスコアは、サインの“アップ”腕中の遺伝子(表5aを参照されたい)の平均log(10)比−サインの“ダウン”腕中の遺伝子(表5bを参照されたい)の平均log(10)比として計算した。
図13に示すように、112mpkの用量でのみ増殖因子シグナル伝達経路サインの抑制が観察された。これは有効性が得られた唯一の用量であるので、これらのデータから増殖因子シグナル伝達経路サインが有効性の早期読出し情報として使用され得ることが示唆される。
増殖因子経路シグナル伝達遺伝子サインの確認及び細分
増殖因子シグナル伝達経路に対する遺伝子サインは2つの対立する腕、すなわち増殖因子経路を介するシグナル伝達の増加に伴ってアップレギュレートされる“アップ”腕(表5a)及びダウンレギュレートされる“ダウン”腕(表5b)に分けられる。コヒーレンス分析の目的は、新しいデータセットにおけるサインの“アップ”及び“ダウン”腕間の統計的有意性を示すことである。表5a及び5bの“アップ”及び“ダウン”腕中のすべての遺伝子について2つの相関係数を計算した。まず、“アップ”腕中の各遺伝子と“アップ”腕中のすべての遺伝子の平均間の相関を計算する。第2に、“アップ”腕中の各遺伝子と“ダウン”腕中のすべての遺伝子の平均の反相関を計算する。このプロセスを“ダウン”腕中の遺伝子に対しても繰り返す。
増殖因子シグナル伝達経路に対する遺伝子サインは2つの対立する腕、すなわち増殖因子経路を介するシグナル伝達の増加に伴ってアップレギュレートされる“アップ”腕(表5a)及びダウンレギュレートされる“ダウン”腕(表5b)に分けられる。コヒーレンス分析の目的は、新しいデータセットにおけるサインの“アップ”及び“ダウン”腕間の統計的有意性を示すことである。表5a及び5bの“アップ”及び“ダウン”腕中のすべての遺伝子について2つの相関係数を計算した。まず、“アップ”腕中の各遺伝子と“アップ”腕中のすべての遺伝子の平均間の相関を計算する。第2に、“アップ”腕中の各遺伝子と“ダウン”腕中のすべての遺伝子の平均の反相関を計算する。このプロセスを“ダウン”腕中の遺伝子に対しても繰り返す。
サインがコヒーレントならば、各腕からの遺伝子の多くは対応する腕平均と相関し、対立する腕中のすべての遺伝子の平均と反相関しなければならない。新しいデータセット中のサインのコヒーレンスの有意性を評価するためにフィッシャーの正確確率検定を遺伝子サインの腕内及び腕間の相関について計算した。
サインを正確な関−反相関挙動を示さなかった遺伝子をフィルタリングにより除くことにより細分する。このフィルタリングプロセスにより、増殖因子経路シグナル伝達活性に関するコア情報を保持するサイン遺伝子の部分集合を同定し、新しいデータセットを分析するときに他の活性に関して報告する遺伝子を除外することができる。
サインスコアは、“アップ”遺伝子(表5aを参照されたい)の平均発現−“ダウン”遺伝子(表5bを参照されたい)の平均発現として計算した。
初期サインコヒーレンスは3つのプラットフォーム、すなわち細胞株(細胞株アトラスのCMTI部分)(乳房、大腸、肺))、新しい腫瘍(乳房、大腸、肺についての腫瘍アトラス)及びホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)サンプル(乳房、大腸、肺のMayo FFPEデータセット)で実施した。オランダ癌研究所(NKI)大腸及び乳房データセットについて確認検定を実施した。
FFPE乳房腫瘍サンプルのコヒーレンス分析は、101個の遺伝子サインの“アップ”及び“ダウン”腕はフィッシャーの正確確率検定により10−9未満のp値でかなりコヒーレントであることを示している(図14aを参照されたい)。増殖因子経路サインの101個すべての遺伝子のヒートマップは、サインの“アップ”及び“ダウン”腕はこのデータセットにおいて離れてクラスター化していることを示している(図14bを参照されたい)。101個の遺伝子サインの“アップ”及び“ダウン”腕の散布図は各分枝が相互に有意に反相関していることを示している(図14c)。“アップ”及び“ダウン”腕間の反相関のp値はピアソン、スピアマンまたはケンドール相関検定に基づいて有意である(それぞれ、R=−0.72、p=3e−24;R=−0.71、p=0e+000;R=−0.53、p=2e−20)。
次いで、同一の分析を、先に記載したように他の訓練データセットのアップ及びダウン腕に対して繰り返した。図14aに既に示したようにすべてのデータセットで実施したフィッシャー検定の結果を表7に要約する。この表は、殆どすべてのデータセットで増殖因子経路シグナル伝達について101個の遺伝子サインの常に非常に有意な挙動を示している。
101個の遺伝子サインを更に、その腕中の他の遺伝子と相関せず、他の腕中の遺伝子と反相関しない遺伝子を選別することにより細分し得る。フィルタリング後の改善はフィルタリング前及びその後のヒートマップ及び散布図で見られ得る(図14a、b及びcを図15a、b及びcと比較されたい)。
細分プロセスは、表8に示すように増殖因子経路遺伝子サインの両腕中の高%の遺伝子を保持した。元の101個の遺伝子サインの60%以上が試験した3つの腫瘍型のすべてにおいてFFPEサンプルで正しいコレギュレーションパターンを示している。元の101個のバイオマーカー集合から始めて、元の遺伝子集合からの81、73及び63個の遺伝子はそれぞれMayo FFPE乳房、肺及び卵巣データセットにおけるコヒーレンス検定に合格している。すべてのデータセットでコヒーレントであったコアFFPE由来サイン(“アップ”腕からの40個の遺伝子及び“ダウン”腕からの17個の遺伝子)をMayo FFPEサンプルから得た。コアFFPEサインを表8bに示す。腫瘍アトラスからの新鮮腫瘍サンプルでは、結果は乳房、大腸及び肺データセットで非常に類似しており(元の101個の遺伝子サインの>70%が正しいコギュレーションパターンを示す)、胃及び腎臓腫瘍データセットでは統計上余り有意でない(>50%)。元の101個の遺伝子サインの少なくとも70%以上が乳房、大腸及び肺細胞株において正しいコレギュレーションパターンを示している。各種腫瘍型の中で調べた各種プラットフォームでコヒーレンスフィルターに合格したグルーバルなコアバイオマーカー遺伝子集合を表8cに示す。
サインスコアの振幅を評価することに加えて、サインの“アップ”及び“ダウン”腕間の差の有意性を評価した。試験した各プラットフォームでサンプル毎のp値をコルモゴルフ−スミルノフ検定を用いて計算した。図16に示すように、複数のサンプルタイプ及びプラットフォームで、サンプルの大部分はα=0.05レベルで有意性を示し、このことからサンプルの大部分で各サンプルのサインスコアが標準/対照サンプルとは有意に異なることが分かる。コルモゴルフ−スミルノフ検定が“アップ”及び“ダウン”腕間の差を調べるために十分に保存的であったという確認検定も実施した。t検定及びウィルコクソン順位和検定もMayo FFPEデータセット中のサインスコアに対して実施した(図17)。3つの検定の各々で得たp値はサンプルの殆どで非常にうまく一致しており、このことから我々はサインの“アップ”及び“ダウン”分枝間の真の差を捕らえることが示唆される。
マイクロアレイに基づく遺伝子発現サインのqPCRアッセイへの変換
マイクロアレイの代替として、定量的PCRを用いる遺伝子発現分析を実施することが望ましいことがある。定量的PCRは短いターンアランドタイム、低いサンプル入力要件及びFFPE組織におけるロバストな測定値を有している。しかしながら、定量的PCRプラットフォームに使用するための遺伝子発現サインの変換はサインダウン選択及びサインスコアリングのための代替方法を必要とする。更に、定量的PCRからのデータは腫瘍遺伝子発現プロファイルの既存のデータセットと直接比較することができない。
マイクロアレイの代替として、定量的PCRを用いる遺伝子発現分析を実施することが望ましいことがある。定量的PCRは短いターンアランドタイム、低いサンプル入力要件及びFFPE組織におけるロバストな測定値を有している。しかしながら、定量的PCRプラットフォームに使用するための遺伝子発現サインの変換はサインダウン選択及びサインスコアリングのための代替方法を必要とする。更に、定量的PCRからのデータは腫瘍遺伝子発現プロファイルの既存のデータセットと直接比較することができない。
qPCRへのサイン翻訳のための戦略を設計するために、我々はまず最終産物の所望特性を同定した:1)アッセイはFFPEサンプル中で行わなければならない;2)qPCRを用いて容易に測定できるようにアッセイは数百の遺伝子から数十の遺伝子にダウン選択されなければならない;3)アッセイが複数の腫瘍型を含む腫瘍学臨床トライアルに適用し得るように、ダウン選択した遺伝子は複数の腫瘍型においてシグナルを与えなければならない;4)ダウン選択した遺伝子はマイクロアレイを用いて測定される全サインと比較してできるだけ多くのシグナルを有していなければならない;5)マイクロアレイを用いて得られる結果と類似している結果を与えるスコアリングアルゴリズムを作成しなければならない;6)アッセイは1つの患者サンプル由来のスコアを与えることができなければならない。これらの所望の期待を満たすために、我々は図18に示すような戦略を設計した。
フェーズ1:遺伝子の優先順位付け
マイクロアレイに基づくサイン(101個の遺伝子)は合理的または費用効率良くqPCRアッセイに変換され得るより多くの遺伝子を含んでいる。我々はまずその後qPCRアッセイ開発に持ち込まれるサイン遺伝子をダウン選択するための戦略を必要とした。遺伝子発現サインのパワーは大きな遺伝子集合を調べることにより与えられる感受性及び信頼性にある。ダウン選択する場合、我々は最小のパワーしか失われないことを確認しなければならない。臨床的実施はアッセイが複数の腫瘍型由来のFFPE組織で適格であることを要求しているので、遺伝子のダウン選択に対する最も重要な優先は遺伝子をFFPE腫瘍で測定するときのコヒーレンスの維持であった。複数の腫瘍データセットからの前臨床サンプル(細胞株、異種移植片)及び新鮮凍結腫瘍サンプルで研究したときマイクロアレイに基づくサイン中のすべての遺伝子が高度に相関している。しかしながら、遺伝子がシグナルを運ぶためには、FFPE材料でアッセイしたとき他のサイン遺伝子とのコレギュレーションのこのパターンを維持しなければならない。
マイクロアレイに基づくサイン(101個の遺伝子)は合理的または費用効率良くqPCRアッセイに変換され得るより多くの遺伝子を含んでいる。我々はまずその後qPCRアッセイ開発に持ち込まれるサイン遺伝子をダウン選択するための戦略を必要とした。遺伝子発現サインのパワーは大きな遺伝子集合を調べることにより与えられる感受性及び信頼性にある。ダウン選択する場合、我々は最小のパワーしか失われないことを確認しなければならない。臨床的実施はアッセイが複数の腫瘍型由来のFFPE組織で適格であることを要求しているので、遺伝子のダウン選択に対する最も重要な優先は遺伝子をFFPE腫瘍で測定するときのコヒーレンスの維持であった。複数の腫瘍データセットからの前臨床サンプル(細胞株、異種移植片)及び新鮮凍結腫瘍サンプルで研究したときマイクロアレイに基づくサイン中のすべての遺伝子が高度に相関している。しかしながら、遺伝子がシグナルを運ぶためには、FFPE材料でアッセイしたとき他のサイン遺伝子とのコレギュレーションのこのパターンを維持しなければならない。
サイン遺伝子に優先順位付けるために、我々は実施例9に先に記載したコヒーレンス分析アプローチを使用した。増殖因子シグナル伝達経路サインは2つの対立する“腕”、すなわち経路を介するシグナル伝達が増加するとアップレギュレートされる遺伝子である“アップ”腕及びダウンレギュレートされる遺伝子である“ダウン”腕に分けられた。コヒーレンス分析の目的は、新しいデータセット中のサインの“アップ”と“ダウン”腕間の差の統計上有意差を示すことである。“アップ”及び“ダウン”腕中のすべての遺伝子について2つの相関係数を計算した。第1に、“アップ”腕中の各遺伝子と“アップ”腕中のすべての遺伝子の平均間の相関を計算する。第2に、“アップ”腕中の各遺伝子と“ダウン”腕中のすべての遺伝子の平均間の反相関を計算する。これを“ダウン”腕中の遺伝子に対して繰り返す。サインがコヒーレントならば、“アップ”腕からの遺伝子の多くはすべての“アップ”遺伝子の平均と相関し、“ダウン”腕中のすべての遺伝子の平均と反相関していなければならない。新しいデータセット中のサインコヒーレンスの有意性を評価するためにサインの腕内及びサインの腕間の相関についてフィッシャー正確確率検定を計算する。正確に相関−反相関挙動を示さない遺伝子をフィルタリングにより除くことによりサインを細分する。このフィルタリングプロセスにより、新しいデータセットを分析するときシグナル伝達活性に関するコア情報を保持するサイン遺伝子の部分集合を同定し、他の活性について報告する遺伝子を排除することができる。この手順を実施することにより、我々は増殖因子シグナル伝達経路サインについて40個の遺伝子に優先順位を付けた。
フェーズ2:各ダウン選択したサイン遺伝子に対するqPCRアッセイ開発
優先順位を付けた遺伝子の各々に対する分析で確認されたqPCRアッセイを得るために、複数の考えられるアッセイを設計し、試験して、1つの遺伝子あたり複数の設計及び幾つかの遺伝子におけるスプライスバリアントを可能とした。各遺伝子標的毎にプラスミDNAまたは合成DNA鎖、並びに対応するIVT作成RNA標準を作成した。これらの標準をDNA中の線形性を評価するために3logsで、線形性、感受性及び特異性を評価するために5logsで滴定した(データ示さず)。アッセイをFFPEサンプル単離物からの早期性能データ及び分析特性に基づいて3つの“集合”の1つに分類した。各遺伝子毎に、アッセイをAgilentマイクロアレイプローブからの距離、PCR有効性(IVT RNA標準)、及び2ngのFFPERNA入力に対する平均Ct値のような基準を用いて選択した。図19は開発した各アッセイについて得たPCR有効性の柱状グラフを示す。アッセイのかなりの大部分は1.0に非常に近いPCR有効性を示し、このことは計算を実施するときPCR有効性の補正は必要なかったことを示している。その結果、各ダウン選択した遺伝子毎に1つのqPCRアッセイをフェーズ3に前進させた。
優先順位を付けた遺伝子の各々に対する分析で確認されたqPCRアッセイを得るために、複数の考えられるアッセイを設計し、試験して、1つの遺伝子あたり複数の設計及び幾つかの遺伝子におけるスプライスバリアントを可能とした。各遺伝子標的毎にプラスミDNAまたは合成DNA鎖、並びに対応するIVT作成RNA標準を作成した。これらの標準をDNA中の線形性を評価するために3logsで、線形性、感受性及び特異性を評価するために5logsで滴定した(データ示さず)。アッセイをFFPEサンプル単離物からの早期性能データ及び分析特性に基づいて3つの“集合”の1つに分類した。各遺伝子毎に、アッセイをAgilentマイクロアレイプローブからの距離、PCR有効性(IVT RNA標準)、及び2ngのFFPERNA入力に対する平均Ct値のような基準を用いて選択した。図19は開発した各アッセイについて得たPCR有効性の柱状グラフを示す。アッセイのかなりの大部分は1.0に非常に近いPCR有効性を示し、このことは計算を実施するときPCR有効性の補正は必要なかったことを示している。その結果、各ダウン選択した遺伝子毎に1つのqPCRアッセイをフェーズ3に前進させた。
フェーズ3:コア遺伝子リストへのサインの更なるダウン選択
目的は、増殖因子シグナル伝達経路サインの最終サイズを約20個のバイオマーカー遺伝子及び3〜5個のノーマライザー遺伝子に減らすことであった。好ましくは、qPCRアッセイはサインの臨床的実施のために複数の腫瘍型由来のFFPE組織で適格でなければならない。従って、更なるダウン選択は乳癌、大腸癌、肺癌及び胃癌の30個のFFPE腫瘍ブロックのパネルでの各qPCRアッセイの発現特徴に基づいていた。FFPE腫瘍ブロックは>50%腫瘍及び3才未満であった。
目的は、増殖因子シグナル伝達経路サインの最終サイズを約20個のバイオマーカー遺伝子及び3〜5個のノーマライザー遺伝子に減らすことであった。好ましくは、qPCRアッセイはサインの臨床的実施のために複数の腫瘍型由来のFFPE組織で適格でなければならない。従って、更なるダウン選択は乳癌、大腸癌、肺癌及び胃癌の30個のFFPE腫瘍ブロックのパネルでの各qPCRアッセイの発現特徴に基づいていた。FFPE腫瘍ブロックは>50%腫瘍及び3才未満であった。
次いで、各々の分析で確認されたqPCRアッセイを各FFPE腫瘍サンプルにおいて実施した。図20は、120個のFFPE腫瘍サンプルでの10個のランダムに選択したアッセイについての代表的データを示している。以下の戦略を用いて、サインを20個のバイオマーカー遺伝子にダウン選択した。第1に、約10個の“アップ”腕遺伝子及び10個の“ダウン”腕遺伝子を最終サイン中に保持する。この“バランスのとれた”設計は、新しいデータセット中のサインの“アップ”及び“ダウン”腕間の違いの統計上有意性を示すためのコヒーレンス分析のために役立つ。この“バランスのとれた”設計はサインを定量する際にも有利であり得る(フェーズ4を参照されたい)。第2に、“アップ”腕中の遺伝子はすべての“アップ”遺伝子の平均発現レベルと相関し、“ダウン”腕中のすべての遺伝子の平均発現レベルと反相関していなければならず、“ダウン”腕中の遺伝子についてはその逆である。第3に、試験した4つのすべての腫瘍型でコヒーレンスを示す遺伝子に優先順位を付ける。最後に、入力RNA量を少なくできるように、n=120腫瘍サンプルで平均Ct値<30を有する遺伝子に優先順位を付ける。これらの基準を用いて、増殖因子シグナル伝達経路について20個の遺伝子サインを選択した(10個の“アップ”腕遺伝子及び10個の“ダウン”腕遺伝子)(表9を参照されたい)。ダウン選択したqPCR増殖因子シグナル伝達サインに対して使用されるqPCRプライマー及びプローブ配列をそれぞれ表9及び10に示す。図21は、FFPE腫瘍で増殖因子シグナル伝達経路に対するダウン選択した20個の遺伝子サインについての相関行列を示している。この相関行列は120個のFFPE腫瘍サンプルでアップ”腕内及び“ダウン”腕内の相関及び“アップ”及び“ダウン”腕間の反相関を示している。
バイオマーカー遺伝子に加えて、更なるサイン定量化のためにノーマライザー遺伝子も選択され得る。ノーマライザー遺伝子は、当該サンプルで安定的に発現されなければならず、バイオマーカー遺伝子に対して類似の発現レベルを有していなければならず、ロバスト的に検出されなければならない。可能性あるノーマライザー遺伝子を同定するために、複数の候補を120個の腫瘍サンプルで調べた。ノーマライザー遺伝子の群を以前の経験及びFFPEプロファイルでのレギュレーションの欠乏に基づいて正規化した。図22は試験した5個の候補ノーマライザー遺伝子の発現変動を示している。平均Ct値(技術的三重組の平均)を120個すべてのサンプルでプロットした。図22に示すように、候補ノーマライザーの2つ(RPLP1及びRPS29)は高い変動係数を有し、かなり低いCt値を有していた。或いは、残りの3つの候補ノーマライザー遺伝子、すなわちNUP214、SAFB及びPRPF8は低い変動係数(最大3.22%)を有し、バイオマーカーの遺伝子の範囲のCt値を有していた。よって、これら3つの遺伝子を我々の最終ノーマライザー遺伝子として選択した。
qPCR条件
すべての容量及びプレートレイアウトは96ウェルピペッティングフォーマットでの液体ハンドリングロボットを用いた組立てに基づいた。PCR反応物は、384ウェルプレートにおいて5μlのRNAサンプルを10μlの合わせたプライマー及びPCRマスター混合物に添加することにより組み立てる。
すべての容量及びプレートレイアウトは96ウェルピペッティングフォーマットでの液体ハンドリングロボットを用いた組立てに基づいた。PCR反応物は、384ウェルプレートにおいて5μlのRNAサンプルを10μlの合わせたプライマー及びPCRマスター混合物に添加することにより組み立てる。
PCR試薬
1.CRA Biomarker 7900 Partial Master Mix(CRA Biomarker 7900 PMMx)
各成分の密度を測定し、以下にリストする5つの成分の比率に基づいて重量基準でCRA Biomarker 7900 PMMxを組み立てる。
1.CRA Biomarker 7900 Partial Master Mix(CRA Biomarker 7900 PMMx)
各成分の密度を測定し、以下にリストする5つの成分の比率に基づいて重量基準でCRA Biomarker 7900 PMMxを組み立てる。
3.15μM エンハンサー(Celera、−20℃で保存)、
4.2単位/μlのウラシルN−グリコシラーゼ(UNG)(Applied Biosystems,−20℃で保存)、
5.2.5単位/μlのrTth DNAポリメラーゼ(Applied Biosystems,−20℃で保存)、
6.プライマー(−20℃で保存)−100μMの各プライマー、
7.TEバッファー(10mM Tris−HCl,0.1 mM EDTA,pH8.0)、
8.RNA希釈剤(0.06 EDTA,pH8.0、0.03% Naアジド,24μg/mlのpoly rA(Amersham))(4℃で保存)。
RNAサンプル
臨床標本由来のRNAサンプルを−70℃で保存した。FFPEサンプルを100pg/μlに希釈した。ポジティブ対照のStratagene 2×200μg Universal Human Reference RNAはRNA希釈剤で3ng/μlに希釈した。希釈したRNAサンプルは短期間保存のためには−20℃で、長期間保存のためには−70℃で保存した。
臨床標本由来のRNAサンプルを−70℃で保存した。FFPEサンプルを100pg/μlに希釈した。ポジティブ対照のStratagene 2×200μg Universal Human Reference RNAはRNA希釈剤で3ng/μlに希釈した。希釈したRNAサンプルは短期間保存のためには−20℃で、長期間保存のためには−70℃で保存した。
プライマー組の作成
個々のプライマーは100μMストックで保存した。プライマーを室温で解凍し、100μMストックから20μM作業濃度に希釈した。PCR反応物を組み立てる前に順方向及び逆方向プライマーを各アッセイ毎に対とした。
個々のプライマーは100μMストックで保存した。プライマーを室温で解凍し、100μMストックから20μM作業濃度に希釈した。PCR反応物を組み立てる前に順方向及び逆方向プライマーを各アッセイ毎に対とした。
150μlのRNアーゼフリーTEバッファーを各1.5mlチューブに分取した。各チューブから9.0μlのTEを除去した。4.5μlの各20μM 順方向及び逆方向プライマーをそれぞれの反応チューブに移した。各チューブを十分に混合し、遠心沈殿させた。
完全マスターミックス(完全MMx)の作成
CRA Biomarker 7900 PMMxを室温、暗所で完全に解凍し、十分に混合した。15μM エンハンサー(Celera)、2単位/μlのUNG(ウラシルN−グリコシレート,Applied Biosystems)及び2.5単位/μlのrTth DNAポリメラーゼ(Applied Biosystems)を室温で解凍し、十分に混合した。2896μlのCRA Biomarker 7900 PMMxを5mlチューブにピペットで移した。800反応物(液体ハンドリングロボットが必要とする無用でむだな容積を含む)のための完全マスターミックスを調製した。エンハンサー、Mn(OAc)2、UNG及びrTth DNAポリメラーゼを下表に従って添加した。完全マスターミックスを優しく十分に混合し、回転し、フォイルを被せた。
CRA Biomarker 7900 PMMxを室温、暗所で完全に解凍し、十分に混合した。15μM エンハンサー(Celera)、2単位/μlのUNG(ウラシルN−グリコシレート,Applied Biosystems)及び2.5単位/μlのrTth DNAポリメラーゼ(Applied Biosystems)を室温で解凍し、十分に混合した。2896μlのCRA Biomarker 7900 PMMxを5mlチューブにピペットで移した。800反応物(液体ハンドリングロボットが必要とする無用でむだな容積を含む)のための完全マスターミックスを調製した。エンハンサー、Mn(OAc)2、UNG及びrTth DNAポリメラーゼを下表に従って添加した。完全マスターミックスを優しく十分に混合し、回転し、フォイルを被せた。
プライマー組及びマスターミックス(PS+MMx)ソースプレートの作成
150μlの完全MMxをプライマー組の各々に添加した。成分を優しく混合し、回転させた。30μlの各PS+MMxを96ウェルプレートに分取し、非光学的シールを被せ、1分間遠心沈殿させた。
150μlの完全MMxをプライマー組の各々に添加した。成分を優しく混合し、回転させた。30μlの各PS+MMxを96ウェルプレートに分取し、非光学的シールを被せ、1分間遠心沈殿させた。
RNAソースプレートの産生(FFPEサンプル由来のRNAのため)
臨床RNAサンプルを100pg/μlに希釈した。30μlの各臨床RNAサンプル(100pg/μl)、対照及びTEを96ウェルプレート中の12ウェルの各々に分取した。プレートに非光学シールを被せ、1分間遠心沈殿させた。
臨床RNAサンプルを100pg/μlに希釈した。30μlの各臨床RNAサンプル(100pg/μl)、対照及びTEを96ウェルプレート中の12ウェルの各々に分取した。プレートに非光学シールを被せ、1分間遠心沈殿させた。
384ウェル増幅プレートの作成
液体ハンドリングロボットステーションを用いて、PS+MMx及びRNAサンプルを96ウェルプレートから1つの384ウェルプレートに分配した。プレPCRロボット(DNA/RNAに対して使用したことはない)を用いて、10μlを96ウェル“PS+MMxソースプレート”から384ウェル増幅プレートに分配した。別のロボットを用いて、5μlを96ウェル“RNAソースプレート”から384ウェル増幅プレートに分配した。プレートに光学シールを被せ、1分間遠心させた。
液体ハンドリングロボットステーションを用いて、PS+MMx及びRNAサンプルを96ウェルプレートから1つの384ウェルプレートに分配した。プレPCRロボット(DNA/RNAに対して使用したことはない)を用いて、10μlを96ウェル“PS+MMxソースプレート”から384ウェル増幅プレートに分配した。別のロボットを用いて、5μlを96ウェル“RNAソースプレート”から384ウェル増幅プレートに分配した。プレートに光学シールを被せ、1分間遠心させた。
プロファイリングラン
サンプルをSDSソフトウェアを用いて以下のサイクル条件でAB7900HTに流した:
ステージ1:50℃ 2分間、
ステージ2:95℃ 1分間、
ステージ3:60℃ 30分間、
ステージ4:95℃ 15秒間、
60℃ 30秒間−データ収集
42サイクル、
ステージ5:95℃ 1分間、
ステージ6:60℃ 1分間、
ステージ7:95℃ 1分間−データ収集(2% ランプ率)。
サンプルをSDSソフトウェアを用いて以下のサイクル条件でAB7900HTに流した:
ステージ1:50℃ 2分間、
ステージ2:95℃ 1分間、
ステージ3:60℃ 30分間、
ステージ4:95℃ 15秒間、
60℃ 30秒間−データ収集
42サイクル、
ステージ5:95℃ 1分間、
ステージ6:60℃ 1分間、
ステージ7:95℃ 1分間−データ収集(2% ランプ率)。
フェーズ4:qPCRプラットフォームを用いてサインスコアを得るためのスコアリングアルゴリズムの適応
マイクロアレイからのサインをqPCRプラットフォームに翻訳するときに経験する別の問題はデータ出力が異なることである。マイクロアレイデータを強度値またはlog比によって表示し、qPCRデータは閾値サイクル(Ct)によって表示する。従って、スコアリングアルゴリズムはqPCRプラットフォームで使用するために適応させなければならないマイクロアレイプラットフォームに対して作成した。加えて、マイクロアレイプラットフォームに由来する新しいサンプルのサインスコアを腫瘍サンプル発現プロファイリングデータの既存のデータベースと比較することができるが、各サンプルを基準に対して正規化するためには前記データセットはqPCRのために存在しない。従って、基準集合と比較する必要がなく1つのqPCRサンプルで実施し得るスコアリングアルゴリズムを作成した。
マイクロアレイからのサインをqPCRプラットフォームに翻訳するときに経験する別の問題はデータ出力が異なることである。マイクロアレイデータを強度値またはlog比によって表示し、qPCRデータは閾値サイクル(Ct)によって表示する。従って、スコアリングアルゴリズムはqPCRプラットフォームで使用するために適応させなければならないマイクロアレイプラットフォームに対して作成した。加えて、マイクロアレイプラットフォームに由来する新しいサンプルのサインスコアを腫瘍サンプル発現プロファイリングデータの既存のデータベースと比較することができるが、各サンプルを基準に対して正規化するためには前記データセットはqPCRのために存在しない。従って、基準集合と比較する必要がなく1つのqPCRサンプルで実施し得るスコアリングアルゴリズムを作成した。
基準データベースと比較する必要がないqPCRプラットフォームで経路活性を反映しているサインスコアを得るために、“アップ”及び“ダウン”腕の相対発現を比較する順位付けスキームを使用した。このスキームは以下のように要約され得る:1)Ct値をlog10(2Λ−Ct)に変換(この変換によりCt値をアバンダンス測定値に変換する);2)各遺伝子をlog10(2Λ−Ct)変換の値に基づいて順位付ける;3)サインの各腕毎に平均ランクスコア(MRS)を作成する;4)“アップ”腕の平均ランク−“ダウン”腕の平均ランクに基づいてサインスコアを計算する。
所与のサンプルのすべてのサイン遺伝子を同一PCRプレートに流し、所与サンプル内の値のみ用いてサイン遺伝子に対する計算した相対アバンダンスを用いて順位付けを実施した。サインスコアの閾値値をこの具体例ではゼロに設定した。ポジティブサインスコアは高いまたはデレギュレートされている増殖因子経路シグナル伝達活性を示す。ネガティブサインスコアは低いまたはレギュレートされている増殖因子経路シグナル伝達活性を示している。このサインスコアの有意性は“アップ”及び“ダウン”腕中のサイン遺伝子の発現値または順位を比較することによっても評価され得る。実施例9で既に記載したように、個々のサンプル中の“アップ”及び“ダウン”腕における遺伝子発現の差の有意性を評価するためにコルモゴルフ−スミルノフ、t検定またはウィルコクソン検定のような統計検定が使用され得る。サインスコアがポジティブであり、t検定p値が<0.05ならば、サインスコアは有意に高いと見なされる。p値>0.05でポジティブなサインスコアは不確定と見なされる。このqPCRプラットフォームでサインスコアを計算する方法はハウスキーピング遺伝子に対して正規化する必要がないことに着目すべきである。このことは、サインが“アップ”及び“ダウン”腕のために内面的にバランスがとれており、よって各サイン遺伝子の発現をノーマライザー遺伝子に正規化させる必要がないためである。しかしながら、上記した同じ計算は、各サイン遺伝子のCt値からノーマライザー遺伝子の平均Ct値を減ずることにより実施され得る。
フェーズ5:盲検試験サンプルでのサインの評価
元の101個の遺伝子サインを20個にダウン選択し、qPCRプラットフォームに対してスコアリングアルゴリズムを作成したら、検定をqPCRサイン翻訳の“成功”を確認するために開発した。Mayoクリニックからの約40個のFFPEサンプルは既にマイクロアレイプロファイリングデータを用いて増殖因子経路シグナル伝達についてスコアリングされている。最極端なサイン分布を示した肺癌、卵巣癌、乳癌サンプルを選択した。マイクロアレイプロファイリングデータに基づいて、極めて低いサインスコアを有する20個のサンプル及びかなり高いサインスコアを有する20個のサンプルを盲検的にqPCRにより試験した。qPCRデータから得たサインスコアをマイクロアレイデータから作成したスコアと比較した。図23は、卵巣FFPEサンプルについてのqPCRサインスコア(左側の棒グラフ)のマイクロアレイで作成したサインスコア(右側の棒グラフ)に対する比較を示している。qPCR及びマイクロアレイにより得たサインスコアのサインは各卵巣サンプル毎に一致していた。
元の101個の遺伝子サインを20個にダウン選択し、qPCRプラットフォームに対してスコアリングアルゴリズムを作成したら、検定をqPCRサイン翻訳の“成功”を確認するために開発した。Mayoクリニックからの約40個のFFPEサンプルは既にマイクロアレイプロファイリングデータを用いて増殖因子経路シグナル伝達についてスコアリングされている。最極端なサイン分布を示した肺癌、卵巣癌、乳癌サンプルを選択した。マイクロアレイプロファイリングデータに基づいて、極めて低いサインスコアを有する20個のサンプル及びかなり高いサインスコアを有する20個のサンプルを盲検的にqPCRにより試験した。qPCRデータから得たサインスコアをマイクロアレイデータから作成したスコアと比較した。図23は、卵巣FFPEサンプルについてのqPCRサインスコア(左側の棒グラフ)のマイクロアレイで作成したサインスコア(右側の棒グラフ)に対する比較を示している。qPCR及びマイクロアレイにより得たサインスコアのサインは各卵巣サンプル毎に一致していた。
代替増殖因子シグナル伝達経路サインの同定
材料及び方法
細胞培養及び細胞株の増殖因子での処理
MCF−7及びHT−29細胞株を6ウェルプレートに増殖因子添加時点で40〜50%コンフルエンスになるように接種した。細胞を0.2% チャコール処理血清中で24時間血清欠乏させ、増殖因子を100ng/ml(EGF、IGF、インスリン、b−FGF)または30ng/ml(ヘレグリン)で添加した。増殖因子の濃度は、受容体自己リン酸化により判断して増殖因子受容体が最大に活性化されるように選択した。増殖因子添加後の増殖因子受容体経路の活性化は細胞の別々のプレートにおいてリン酸化MAPK及びリン酸化AKTのウェスタン分析により確認した(データ示さず)。増殖因子を添加してから30分、2時間、6時間、18時間及び24時間後に細胞を収集した。DMSO(ビヒクル)処理した細胞も各時点で収集した。RLT溶解試薬Qiagenスピンカセムを製造業者の説明に従って使用してRNAを作成した。
材料及び方法
細胞培養及び細胞株の増殖因子での処理
MCF−7及びHT−29細胞株を6ウェルプレートに増殖因子添加時点で40〜50%コンフルエンスになるように接種した。細胞を0.2% チャコール処理血清中で24時間血清欠乏させ、増殖因子を100ng/ml(EGF、IGF、インスリン、b−FGF)または30ng/ml(ヘレグリン)で添加した。増殖因子の濃度は、受容体自己リン酸化により判断して増殖因子受容体が最大に活性化されるように選択した。増殖因子添加後の増殖因子受容体経路の活性化は細胞の別々のプレートにおいてリン酸化MAPK及びリン酸化AKTのウェスタン分析により確認した(データ示さず)。増殖因子を添加してから30分、2時間、6時間、18時間及び24時間後に細胞を収集した。DMSO(ビヒクル)処理した細胞も各時点で収集した。RLT溶解試薬Qiagenスピンカセムを製造業者の説明に従って使用してRNAを作成した。
細胞培養及びAKT阻害剤処理
LoVo結腸直腸癌細胞の2つの培養物を60mmプレートに1×106細胞/プレートの接種密度で接種した。細胞を一晩接着させた。AKT1アイソザイムを優先的に抑制するAKTの小分子インヒビターを細胞に対して5μMの濃度で4または24時間添加した。この濃度により、ウェスタンブロットによるとAKTリン酸化が>90%抑制された(データ示さず)。このインヒビター(従来は“Akti−1”と呼ばれていた)の構造及びAKTアイソザイム活性は公開されている(DeFeo−Jonesら,2005,Mol.Cancer Ther.,4:271−279)。DMSO(ビヒクル)処理した細胞も各時点で収集した。薬物とインキュベートした後、RNAをRLT溶解試薬及びQiagenスピンカラムを製造業者の説明に従って用いて細胞から作成した。すべての処理を2回実施した。
LoVo結腸直腸癌細胞の2つの培養物を60mmプレートに1×106細胞/プレートの接種密度で接種した。細胞を一晩接着させた。AKT1アイソザイムを優先的に抑制するAKTの小分子インヒビターを細胞に対して5μMの濃度で4または24時間添加した。この濃度により、ウェスタンブロットによるとAKTリン酸化が>90%抑制された(データ示さず)。このインヒビター(従来は“Akti−1”と呼ばれていた)の構造及びAKTアイソザイム活性は公開されている(DeFeo−Jonesら,2005,Mol.Cancer Ther.,4:271−279)。DMSO(ビヒクル)処理した細胞も各時点で収集した。薬物とインキュベートした後、RNAをRLT溶解試薬及びQiagenスピンカラムを製造業者の説明に従って用いて細胞から作成した。すべての処理を2回実施した。
遺伝子発現プロファイリング
増殖因子及びAKT阻害剤処理した細胞の場合、全RNAを細胞株から単離し、先に記載したように(Hughesら,2001,Nat.Biotechnol,,19:342−347;Martonら,1998,Nat.Med.,4:1293−1301)DNAオリゴヌクレオチドマイクロアレイにハイブリダイズした蛍光標識cRNAに変換させた。簡単に説明すると、各処理サンプルからの4μgの全RNAを使用して、逆転写によりdsDNAを合成した。cRNAをインビトロ転写により産生させ、合成後Cy3またはCy5で標識した。増殖因子またはAKT阻害剤処理した細胞(実験サンプル)由来のcRNAをビヒクル処理したサンプル(基準サンプル)由来のcRNAに対してハイブリダイズした。2つのハイブリダイゼーションを蛍光染料逆戦略を用いて各cRNAサンプル対で実施した。増殖因子処理した細胞の場合、マイクロアレイは遺伝子または発現配列タグに相当する23,880個のプローブを含んでいた(GEOプラットフォームGPL2029)。AKT阻害剤処理した細胞の場合、マイクロアレイは遺伝子または発現配列タグに相当するプローブを含んでいた(GEOプラットフォームGPL3991)。プローブ配列を遺伝子特異性を最大とし且つmRNAの逆転写に固有の3’−複製バイアスを最小とするように選択した。加えて、すべてのマイクロアレイに品質コントロールの目的で約2,000個の対照を含んでいた。マイクロアレイ上のすべてのプローブを現場でインクジェット技術を用いて合成した(カリフォルニア州パロアルトに所在のAgilent Technologies;Hughesら,2001,Nat.Biotechnol.,19:342−347)。ハイブリダイゼーション後、アレイをスキャンし、各プローブの蛍光強度を記録した。アレイ強度データを正規化し、補正した後転写アバンダンスの比(実験対対照)を得た。遺伝子発現データをRosetta Resolver遺伝子発現分析ソフトウェア(バージョン7.0,ワシントン州シアトルに所在のRosetta Biosoftware)及びMATLAB(マサチューセッツ州ナティックに所在のThe Math Works)を用いて分析した。
増殖因子及びAKT阻害剤処理した細胞の場合、全RNAを細胞株から単離し、先に記載したように(Hughesら,2001,Nat.Biotechnol,,19:342−347;Martonら,1998,Nat.Med.,4:1293−1301)DNAオリゴヌクレオチドマイクロアレイにハイブリダイズした蛍光標識cRNAに変換させた。簡単に説明すると、各処理サンプルからの4μgの全RNAを使用して、逆転写によりdsDNAを合成した。cRNAをインビトロ転写により産生させ、合成後Cy3またはCy5で標識した。増殖因子またはAKT阻害剤処理した細胞(実験サンプル)由来のcRNAをビヒクル処理したサンプル(基準サンプル)由来のcRNAに対してハイブリダイズした。2つのハイブリダイゼーションを蛍光染料逆戦略を用いて各cRNAサンプル対で実施した。増殖因子処理した細胞の場合、マイクロアレイは遺伝子または発現配列タグに相当する23,880個のプローブを含んでいた(GEOプラットフォームGPL2029)。AKT阻害剤処理した細胞の場合、マイクロアレイは遺伝子または発現配列タグに相当するプローブを含んでいた(GEOプラットフォームGPL3991)。プローブ配列を遺伝子特異性を最大とし且つmRNAの逆転写に固有の3’−複製バイアスを最小とするように選択した。加えて、すべてのマイクロアレイに品質コントロールの目的で約2,000個の対照を含んでいた。マイクロアレイ上のすべてのプローブを現場でインクジェット技術を用いて合成した(カリフォルニア州パロアルトに所在のAgilent Technologies;Hughesら,2001,Nat.Biotechnol.,19:342−347)。ハイブリダイゼーション後、アレイをスキャンし、各プローブの蛍光強度を記録した。アレイ強度データを正規化し、補正した後転写アバンダンスの比(実験対対照)を得た。遺伝子発現データをRosetta Resolver遺伝子発現分析ソフトウェア(バージョン7.0,ワシントン州シアトルに所在のRosetta Biosoftware)及びMATLAB(マサチューセッツ州ナティックに所在のThe Math Works)を用いて分析した。
遺伝子機能及び経路分析
遺伝子機能及び経路分析はIngenuity Pathway分析(Ingenuity(登録商標)Systems,www.ingenuity.com)を用いて実施した。古典的経路分析で、データセットに対して最も有意であった古典的経路のIngenuity Pathways Analysisライブラリーから経路を同定した。増殖因子サインの一部であると同定され、Ingenuity Pathways Analysis Knowledge Base中の古典的経路に関連していたデータセットからの遺伝子を分析のために考慮した。データセットと古典的経路間の関連の有意性を2つの方法で、すなわち1)経路にマッピングするデータセットからの遺伝子の数を古典的経路にマッピングされる遺伝子の総数で割った比を表示する;2)フィッシャー正確確率検定を使用して、データセット中の遺伝子と古典的経路間の関係が偶然のみで説明される確率を決定するp値を計算した。
遺伝子機能及び経路分析はIngenuity Pathway分析(Ingenuity(登録商標)Systems,www.ingenuity.com)を用いて実施した。古典的経路分析で、データセットに対して最も有意であった古典的経路のIngenuity Pathways Analysisライブラリーから経路を同定した。増殖因子サインの一部であると同定され、Ingenuity Pathways Analysis Knowledge Base中の古典的経路に関連していたデータセットからの遺伝子を分析のために考慮した。データセットと古典的経路間の関連の有意性を2つの方法で、すなわち1)経路にマッピングするデータセットからの遺伝子の数を古典的経路にマッピングされる遺伝子の総数で割った比を表示する;2)フィッシャー正確確率検定を使用して、データセット中の遺伝子と古典的経路間の関係が偶然のみで説明される確率を決定するp値を計算した。
サインスコアの計算
細胞株研究のために、遺伝子発現を時間整合させたビヒクル処理細胞に対するlog(10)比として表示する。腫瘍サンプルの場合、遺伝子発現をすべてのサンプルの平均に対するlog(10)比として表示する。増殖因子及びc−MYCサインは、増殖因子またはMYC添加によりアップレギュレートされる遺伝子(“アップ”腕)及び増殖因子またはMYC添加によりダウンレギュレートされる遺伝子(“ダウン”腕)を含んでいる。これらの場合、サインスコアはアップ”腕中の遺伝子の平均発現−“ダウン”腕中の遺伝子の平均発現を計算することにより求めた。増殖及び解糖サインの場合、すべての遺伝子は同一方向にレギュレートされ、相関している。従って、これらのサインは1つの腕のみから構成され、スコアをすべてのサイン遺伝子の平均発現として計算した。異常PTEN活性の既に公表されているサイン(Saalら,2007,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,104:7564−7569)は2つの腕を含んでおり、サインスコアはPTENを含んでいない腕の平均−PTENを含んでいる腕の平均として計算した。
細胞株研究のために、遺伝子発現を時間整合させたビヒクル処理細胞に対するlog(10)比として表示する。腫瘍サンプルの場合、遺伝子発現をすべてのサンプルの平均に対するlog(10)比として表示する。増殖因子及びc−MYCサインは、増殖因子またはMYC添加によりアップレギュレートされる遺伝子(“アップ”腕)及び増殖因子またはMYC添加によりダウンレギュレートされる遺伝子(“ダウン”腕)を含んでいる。これらの場合、サインスコアはアップ”腕中の遺伝子の平均発現−“ダウン”腕中の遺伝子の平均発現を計算することにより求めた。増殖及び解糖サインの場合、すべての遺伝子は同一方向にレギュレートされ、相関している。従って、これらのサインは1つの腕のみから構成され、スコアをすべてのサイン遺伝子の平均発現として計算した。異常PTEN活性の既に公表されているサイン(Saalら,2007,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,104:7564−7569)は2つの腕を含んでおり、サインスコアはPTENを含んでいない腕の平均−PTENを含んでいる腕の平均として計算した。
結果
HT−20またはMCF−7細胞のEGF、IGF、インスリン、b−FGFまたはヘレグリン処理により誘導される遺伝発現変化のゲノムワイド解析をまず実施した。これらの増殖因子の各々は両細胞株でロバストな応答を引き出した。ANOVA分析は、4,500個以上の遺伝子が増殖因子処理したサンプル及びビヒクル処理したサンプル間でp<0.001で差次的に発現されることを示した(図24を参照されたい)。図24ヒートマップに示すように、いろいろな増殖因子により引き出される遺伝子発現サインは著しく類似している。この類似性を定量するために、我々は1つの増殖因子によりレギュレートされる遺伝子が別の増殖因子により刺激したときどのように挙動するかを評価した(図25A、B)。各増殖因子毎に、我々はそのサインと他の増殖因子により引き出されるサイン間の相関を計算した。相関係数の分布は圧倒的にポジティブであり、平均相関係数は0.6を超えている。
HT−20またはMCF−7細胞のEGF、IGF、インスリン、b−FGFまたはヘレグリン処理により誘導される遺伝発現変化のゲノムワイド解析をまず実施した。これらの増殖因子の各々は両細胞株でロバストな応答を引き出した。ANOVA分析は、4,500個以上の遺伝子が増殖因子処理したサンプル及びビヒクル処理したサンプル間でp<0.001で差次的に発現されることを示した(図24を参照されたい)。図24ヒートマップに示すように、いろいろな増殖因子により引き出される遺伝子発現サインは著しく類似している。この類似性を定量するために、我々は1つの増殖因子によりレギュレートされる遺伝子が別の増殖因子により刺激したときどのように挙動するかを評価した(図25A、B)。各増殖因子毎に、我々はそのサインと他の増殖因子により引き出されるサイン間の相関を計算した。相関係数の分布は圧倒的にポジティブであり、平均相関係数は0.6を超えている。
最もロバストであり、潜在的に最も関連するサイン遺伝子に着目するために、我々はレギュレーションに関して有意なp値を有しているだけでなく、早い時点(2時間目)で数倍(>2倍)の変化を有し、24時間を通してレギュレートされ続けた遺伝子の“コア”集合を選択した。この時間的パターンは、増殖因子により誘導される事象の連続における早期ステップに相当し、増殖因子刺激に応答した一時的変化よりもむしろ構成的である遺伝子にとって必要である。この手順を実施することにより、我々は86個の遺伝子コア“増殖因子”サインを同定した。44個の遺伝子は増殖因子によりアップレギュレートされ(“アップ”腕)、42個の遺伝子はダウンレギュレートされた(“ダウン”腕)(図27、表11A、B)。
増殖因子サインにおける遺伝子の生物学的分析
生物学的プロセス及び増殖因子に関与する公知のシグナル伝達経路の見識を得るために、我々は増殖因子サインにおける遺伝子中での関係性を明らかにするために生物学的経路分析を実施した。我々は、増殖因子サイン遺伝子の中で統計的に濃縮されている古典的シグナル伝達経路を同定するためにIngenuity Pathway Analysis(IPA;http://www.ingenuity.com)ソフトウェアツールを使用した。他のグループは以前、炎症、グルココルチコイド受容体シグナル伝達及び癌を含めて複雑なプロセスに関与している生物学的経路を同定するためにIPAツールを使用した(Calvanoら,2005,Nature,437:1032−1037;Kasamatsuら,2005,Int.J.Biochem.Cell.Biol.,37:1869−1880;Phucら,2005,PLoS Genet.,1:e16)。増殖因子によりアップレギュレートされる遺伝子の中には、濃縮経路はユビキチン化、ニューレグリンシグナル伝達、酸化窒素シグナル伝達及び解糖/糖新生を含んでいた(図26)。増殖因子によりダウンレギュレートされる遺伝子の中には、PTENシグナル伝達が最も有意に濃縮されていた。ニューレグリンはErbBファミリーの受容体チロシンキナーゼに対するリガンドであり(Falls,2003,Exp.Cell.Res.,284:14−30)、従来の研究でAKTがグルコース輸送及び代謝を刺激することが立証されているので(Elstromら,2004,Cancer Res.,64:3892−3899;Lumら,2007,Genes Dev.,21:1037−1049;Plas and Thompson,2005,Oncogene,24:7435−7442)、これらの経路のアップレギュレーションは増殖因子シグナル伝達の公知の生物学と一致している。PTENシグナル伝達に関与する遺伝子のダウンレギュレーションはPI3K活性のネガティブレギュレーターとしてのPTENの役割とも一致しており(Cantleyら,1999,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,96:4240−4245)、増殖因子及びPTENが遺伝子の重複集合に対して逆の効果を有していることが示唆される。これらの結果は、増殖因子サインが増殖因子受容体を介するシグナル伝達の増加を反映する細胞生物学を読出すという仮説を裏付けている。
生物学的プロセス及び増殖因子に関与する公知のシグナル伝達経路の見識を得るために、我々は増殖因子サインにおける遺伝子中での関係性を明らかにするために生物学的経路分析を実施した。我々は、増殖因子サイン遺伝子の中で統計的に濃縮されている古典的シグナル伝達経路を同定するためにIngenuity Pathway Analysis(IPA;http://www.ingenuity.com)ソフトウェアツールを使用した。他のグループは以前、炎症、グルココルチコイド受容体シグナル伝達及び癌を含めて複雑なプロセスに関与している生物学的経路を同定するためにIPAツールを使用した(Calvanoら,2005,Nature,437:1032−1037;Kasamatsuら,2005,Int.J.Biochem.Cell.Biol.,37:1869−1880;Phucら,2005,PLoS Genet.,1:e16)。増殖因子によりアップレギュレートされる遺伝子の中には、濃縮経路はユビキチン化、ニューレグリンシグナル伝達、酸化窒素シグナル伝達及び解糖/糖新生を含んでいた(図26)。増殖因子によりダウンレギュレートされる遺伝子の中には、PTENシグナル伝達が最も有意に濃縮されていた。ニューレグリンはErbBファミリーの受容体チロシンキナーゼに対するリガンドであり(Falls,2003,Exp.Cell.Res.,284:14−30)、従来の研究でAKTがグルコース輸送及び代謝を刺激することが立証されているので(Elstromら,2004,Cancer Res.,64:3892−3899;Lumら,2007,Genes Dev.,21:1037−1049;Plas and Thompson,2005,Oncogene,24:7435−7442)、これらの経路のアップレギュレーションは増殖因子シグナル伝達の公知の生物学と一致している。PTENシグナル伝達に関与する遺伝子のダウンレギュレーションはPI3K活性のネガティブレギュレーターとしてのPTENの役割とも一致しており(Cantleyら,1999,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,96:4240−4245)、増殖因子及びPTENが遺伝子の重複集合に対して逆の効果を有していることが示唆される。これらの結果は、増殖因子サインが増殖因子受容体を介するシグナル伝達の増加を反映する細胞生物学を読出すという仮説を裏付けている。
増殖因子サインの他の経路サインに対する比較
c−MYCの活性化及び高い増殖は増殖因子シグナル伝達の公知の下流効果であり(Bouchardら,2004,EMBO J.,23:2830−2840;Bernard and Eilers,2006,Results Probl.Cell.Differ.,42:329−342)、最近の研究はc−MYCのレベル(Bildら,2006,Nature,439:353−357)及び増殖(Daiら,2005,Cancer Res.,65:4059−4066)をモニターする遺伝子発現サインを作成した。従って、我々は既に公表されているc−MYC及び増殖サインと比較した増殖因子の増殖因子誘導レギュレーションのタイミング及びカイネティックを評価した。細胞株及び増殖因子で平均化したc−MYCの活性化、増殖及び増殖因子サインの時間的パターンを図28に示す。増殖因子サインは2時間目に誘導され、24時間を通して有意に誘導されたままであるが、c−MYCサインは少ないロバストで誘導され、一時的にレギュレートされ、6時間目に最大誘導された。加えて、増殖サインは後の時点でのみ誘導され、12時間目から有意な誘導が観察された。これらのデータから、増殖因子サインは増殖因子受容体の刺激に対してより近位の事象を捕捉すること及びこれらの事象は増殖因子受容体が活性化されたままである限り維持されることが示唆される。
c−MYCの活性化及び高い増殖は増殖因子シグナル伝達の公知の下流効果であり(Bouchardら,2004,EMBO J.,23:2830−2840;Bernard and Eilers,2006,Results Probl.Cell.Differ.,42:329−342)、最近の研究はc−MYCのレベル(Bildら,2006,Nature,439:353−357)及び増殖(Daiら,2005,Cancer Res.,65:4059−4066)をモニターする遺伝子発現サインを作成した。従って、我々は既に公表されているc−MYC及び増殖サインと比較した増殖因子の増殖因子誘導レギュレーションのタイミング及びカイネティックを評価した。細胞株及び増殖因子で平均化したc−MYCの活性化、増殖及び増殖因子サインの時間的パターンを図28に示す。増殖因子サインは2時間目に誘導され、24時間を通して有意に誘導されたままであるが、c−MYCサインは少ないロバストで誘導され、一時的にレギュレートされ、6時間目に最大誘導された。加えて、増殖サインは後の時点でのみ誘導され、12時間目から有意な誘導が観察された。これらのデータから、増殖因子サインは増殖因子受容体の刺激に対してより近位の事象を捕捉すること及びこれらの事象は増殖因子受容体が活性化されたままである限り維持されることが示唆される。
増殖因子により誘導されるネガティブフィードバック
増殖因子受容体を通常異常シグナル伝達(Sweeney and Carraway,2004,90:289−293)を防止するように働くネガティブ調節メカニズムにかけ、タンパク質リン酸化及び遺伝子発現のプロファイリングを含む最近の研究で増殖因子シグナル伝達の早期事象を抑制するように働く遺伝子の動態的に規定される群の存在が立証された(Amitら,2007,Nat.Genet.,39:503−512)。増殖因子により常にダウンレギュレートされた遺伝子を評価して、我々は上皮増殖因子受容体ファミリーメンバーERBB3が両方の細胞株においてすべての増殖因子により有意にダウンレギュレートされたことに注目した(表11)。最近の研究でリガンド結合はユビキチン化後リゾソーム分解することによりERBB3をダウンレギュレートし得ることが立証されているので(Caoら,2007,Mol.Cell.Biol.,27:2180−2188)、我々はEGF、IGF、インスリン、b−FGFまたはヘレグリンでどのように刺激すると増殖因子受容体のmRNA発現に影響を与えるかを評価した(図29)。細胞をEGFまたは他の増殖因子で処理しても、EGFR発現のダウンレギュレーションは生じなかった(図29A)。対照的に、細胞をEGF、IGF、インスリン、b−FGFまたはヘレグリンで処理すると、ERBB3及びINSRが有意にダウンレギュレートした(図29B、29C)。これらのデータから、ERBB3及びINSRはフィードバック抑制に対してかなり感受性であり、これらのシグナルが他の増殖因子受容体を介して伝播されてもERBB3及びINSRは増殖因子シグナル伝達に応答して迅速にダウンレギュレートされることが示唆される。よって、ERBB3またはINSRのmRNAレベルを上記受容体を介するシグナル伝達の活性の代理として使用するときには注意を払わなければならない。
増殖因子受容体を通常異常シグナル伝達(Sweeney and Carraway,2004,90:289−293)を防止するように働くネガティブ調節メカニズムにかけ、タンパク質リン酸化及び遺伝子発現のプロファイリングを含む最近の研究で増殖因子シグナル伝達の早期事象を抑制するように働く遺伝子の動態的に規定される群の存在が立証された(Amitら,2007,Nat.Genet.,39:503−512)。増殖因子により常にダウンレギュレートされた遺伝子を評価して、我々は上皮増殖因子受容体ファミリーメンバーERBB3が両方の細胞株においてすべての増殖因子により有意にダウンレギュレートされたことに注目した(表11)。最近の研究でリガンド結合はユビキチン化後リゾソーム分解することによりERBB3をダウンレギュレートし得ることが立証されているので(Caoら,2007,Mol.Cell.Biol.,27:2180−2188)、我々はEGF、IGF、インスリン、b−FGFまたはヘレグリンでどのように刺激すると増殖因子受容体のmRNA発現に影響を与えるかを評価した(図29)。細胞をEGFまたは他の増殖因子で処理しても、EGFR発現のダウンレギュレーションは生じなかった(図29A)。対照的に、細胞をEGF、IGF、インスリン、b−FGFまたはヘレグリンで処理すると、ERBB3及びINSRが有意にダウンレギュレートした(図29B、29C)。これらのデータから、ERBB3及びINSRはフィードバック抑制に対してかなり感受性であり、これらのシグナルが他の増殖因子受容体を介して伝播されてもERBB3及びINSRは増殖因子シグナル伝達に応答して迅速にダウンレギュレートされることが示唆される。よって、ERBB3またはINSRのmRNAレベルを上記受容体を介するシグナル伝達の活性の代理として使用するときには注意を払わなければならない。
PTEN経路シグナル伝達が増殖因子によりダウンレギュレートされる遺伝子内で有意に濃縮されるので(図26)、我々は異常PTEN活性の最近公表されたサイン(Saalら,2007,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,104:7564−7569)の発現に対する増殖因子の影響を評価した。図29Dに示すように、細胞を増殖因子で処理すると異常PTENサインは常にアップレギュレートした。この結果は、増殖因子はPTEN損失によっても活性化される遺伝子を活性化することが立証し、増殖因子サインの重要な成分がPTEN活性に関連するシグナルの拮抗を反映しているという見解を裏付ける。
増殖因子サインのPI3K経路インヒビターによる抑制
増殖因子サインを更に確認するために、我々は連結性マップデータセットからの薬物応答のサインにてこ入れした(Lambら,2006,Science,313:1929−1935)。このデータセットは、453個の個々の化合物処理実験に相当する164個の異なる小分子についてのmRNA発現データを含む。これらの小分子インヒビターにはPI3Kインヒビターのワートマニン及びLY−294002、並びにmTORインヒビターのシロリムスが含まれる。我々は、増殖因子サインが本当にPI3K経路の活性化を表しているならば、上記化合物はサインに対して抑制効果を有していなければならないと推量した。図30に示すように、これらの化合物の各々は増殖因子サインの非常に重要なインヒビターである。表12に示すように、シロリムス、ワートマニン及びLY−294002はこのデータセット中のすべての化合物のサイン抑制の有意性によって1、2及び3の順位が付けられる化合物であつた。対照的に、連結性マップデータセット中の他の摂動要因(perturbagens)は増殖因子シグナル伝達サインに対して効果もなく、余り重要な抑制効果もなく、更には活性化効果を有している。既に記載されている増殖及びMYCサインもシロリムス、ワートマニン及びLY−294002により抑制されたが、分布の抑制目的においてこれら3つの化合物の順位は余り極端でなかった。例えば、LY−294002は増殖サイン抑制の有意性によってトップに順位づけられた化合物であったが、シロリムスは5位に順位づけられ、ワートマニンは23位に順位づけられた(表12)。増殖サインのワートマニンによる抑制は統計上有意でなかった。この結果から、増殖因子シグナル伝達サインはPI3K経路インヒビターにより最も有意に抑制されること及びこの抑制が1つのPDK経路成分に特異的でないことが示唆される。加えて、この結果から、抑制パターンが化合物の中で異なるので増殖因子サイン及び増殖サイン受容体が異なる生物学的態様で報告されることが示唆される。
増殖因子サインを更に確認するために、我々は連結性マップデータセットからの薬物応答のサインにてこ入れした(Lambら,2006,Science,313:1929−1935)。このデータセットは、453個の個々の化合物処理実験に相当する164個の異なる小分子についてのmRNA発現データを含む。これらの小分子インヒビターにはPI3Kインヒビターのワートマニン及びLY−294002、並びにmTORインヒビターのシロリムスが含まれる。我々は、増殖因子サインが本当にPI3K経路の活性化を表しているならば、上記化合物はサインに対して抑制効果を有していなければならないと推量した。図30に示すように、これらの化合物の各々は増殖因子サインの非常に重要なインヒビターである。表12に示すように、シロリムス、ワートマニン及びLY−294002はこのデータセット中のすべての化合物のサイン抑制の有意性によって1、2及び3の順位が付けられる化合物であつた。対照的に、連結性マップデータセット中の他の摂動要因(perturbagens)は増殖因子シグナル伝達サインに対して効果もなく、余り重要な抑制効果もなく、更には活性化効果を有している。既に記載されている増殖及びMYCサインもシロリムス、ワートマニン及びLY−294002により抑制されたが、分布の抑制目的においてこれら3つの化合物の順位は余り極端でなかった。例えば、LY−294002は増殖サイン抑制の有意性によってトップに順位づけられた化合物であったが、シロリムスは5位に順位づけられ、ワートマニンは23位に順位づけられた(表12)。増殖サインのワートマニンによる抑制は統計上有意でなかった。この結果から、増殖因子シグナル伝達サインはPI3K経路インヒビターにより最も有意に抑制されること及びこの抑制が1つのPDK経路成分に特異的でないことが示唆される。加えて、この結果から、抑制パターンが化合物の中で異なるので増殖因子サイン及び増殖サイン受容体が異なる生物学的態様で報告されることが示唆される。
増殖因子サインのAKT1の抑制による抑制
PI3K及びmTORインヒビターに加えて、我々は増殖因子サインに対するAKT阻害の影響を評価しようとした。この目的で、我々はAKT1の内部開発したアロステリックでイソ型特異性のインヒビターにてこ入れした(DeFeo−Jonesら,2005,Mol.Cancer Ther.,4:271−279)。我々は結腸直腸癌細胞株LoVoをビヒクルまたは5μMのAKT1インヒビターで4または24時間処理し、生じた遺伝子発現プロファイルを評価した。図31に示すように、AKT1の抑制により、両方の時点でビヒクル処理に比して増殖因子シグナル伝達サインを抑制させた。増殖因子シグナル伝達サインの抑制が4時間目にc−MYC及び増殖の抑制を超え、24時間でcMYCサインにほぼ均等であった。これらのデータは、増殖因子サインがPI3K経路シグナル伝達を抑制する治療に対して早期に応答することを示している。
PI3K及びmTORインヒビターに加えて、我々は増殖因子サインに対するAKT阻害の影響を評価しようとした。この目的で、我々はAKT1の内部開発したアロステリックでイソ型特異性のインヒビターにてこ入れした(DeFeo−Jonesら,2005,Mol.Cancer Ther.,4:271−279)。我々は結腸直腸癌細胞株LoVoをビヒクルまたは5μMのAKT1インヒビターで4または24時間処理し、生じた遺伝子発現プロファイルを評価した。図31に示すように、AKT1の抑制により、両方の時点でビヒクル処理に比して増殖因子シグナル伝達サインを抑制させた。増殖因子シグナル伝達サインの抑制が4時間目にc−MYC及び増殖の抑制を超え、24時間でcMYCサインにほぼ均等であった。これらのデータは、増殖因子サインがPI3K経路シグナル伝達を抑制する治療に対して早期に応答することを示している。
連結性データセットからの結果と合わせて考慮して、これらのデータは増殖因子サインのレギュレーションがRTK−PI3K−AKT−mTORシグナル伝達軸の1つの成分に特異的でないことを立証している。むしろ、このサインはシグナル伝達軸に沿った複数のポイントでこの経路の活性化または抑制により常にレギュレートされる。これは増殖因子シグナル伝達がタンパク質リン酸化カスケードを引き出し、シグナルが核に達すると最終的に各種遺伝子の発現に影響を及ぼすので予測され得る。従って、この軸に沿った近位または遠位のポイントでリン酸化カスケードを抑制すると核中のmRNA発現に対して類似の影響が生じることは論理的のようである。
ヒト腫瘍における増殖因子サインの評価
増殖因子サインは増殖因子により活性化され、PI3K経路インヒビターにより抑制されるので、我々は腫瘍サンプルにおける増殖因子シグナル伝達サインのレベルがPI3K経路活性の予測レベルに従って腫瘍を階層化するために使用され得ることを推論した。PI3Kシグナル伝達の予測レベルが高い腫瘍の部分集合を同定するために、我々はvan de Vijverら(2002,N.Engl.J.Med.,347:1999−2009)からの原発性乳癌遺伝子発現プロファイルにおける増殖因子サインを評価した。エストロゲン受容体状態を先に記載されているように(Van de Vijverら,2002,N.Engl.J.Med.,347:1999−2009)測定した。図32Aに示すように、最高レベルの増殖因子サインを有する乳癌の部分集合はERBB2低でERネガティブ部分集合である。前記腫瘍はプロゲステロン受容体(PR;データ示さず)の低発現も示し、よって乳癌の“トリプル・ネガティブ”部分集合に相当する。この部分集合はERBB2高、次いで増殖因子サインの基線レベルの低下順でERポジティブ腫瘍である。このデータから、ERBB2は乳房腫瘍におけるPI3K経路シグナル伝達の最大ドライバーでなく、むしろトリプル・ネガティブ腫瘍の幾つかのアスペクトが増殖因子シグナル伝達サインを最高レベルに動かすことが示唆される。驚くことに、トリプル・ネガティブ乳房腫瘍は最悪の出力に関連しており、これからPI3Kシグナル伝達が乳癌の短い生存の原因となり得ることが示唆される(Harrisら,2006,Breast Cancer Res.,8:R66)。
増殖因子サインは増殖因子により活性化され、PI3K経路インヒビターにより抑制されるので、我々は腫瘍サンプルにおける増殖因子シグナル伝達サインのレベルがPI3K経路活性の予測レベルに従って腫瘍を階層化するために使用され得ることを推論した。PI3Kシグナル伝達の予測レベルが高い腫瘍の部分集合を同定するために、我々はvan de Vijverら(2002,N.Engl.J.Med.,347:1999−2009)からの原発性乳癌遺伝子発現プロファイルにおける増殖因子サインを評価した。エストロゲン受容体状態を先に記載されているように(Van de Vijverら,2002,N.Engl.J.Med.,347:1999−2009)測定した。図32Aに示すように、最高レベルの増殖因子サインを有する乳癌の部分集合はERBB2低でERネガティブ部分集合である。前記腫瘍はプロゲステロン受容体(PR;データ示さず)の低発現も示し、よって乳癌の“トリプル・ネガティブ”部分集合に相当する。この部分集合はERBB2高、次いで増殖因子サインの基線レベルの低下順でERポジティブ腫瘍である。このデータから、ERBB2は乳房腫瘍におけるPI3K経路シグナル伝達の最大ドライバーでなく、むしろトリプル・ネガティブ腫瘍の幾つかのアスペクトが増殖因子シグナル伝達サインを最高レベルに動かすことが示唆される。驚くことに、トリプル・ネガティブ乳房腫瘍は最悪の出力に関連しており、これからPI3Kシグナル伝達が乳癌の短い生存の原因となり得ることが示唆される(Harrisら,2006,Breast Cancer Res.,8:R66)。
先に立証したように、増殖因子及びPTENは遺伝子の重複集合に対してアンタゴニスト効果を有している。従って、我々はPTENの損失がトリプル・ネガティブ乳房腫瘍における増殖因子サインの中心ドライバーであり得ると仮定した。このことを調べるために、我々は乳房腫瘍でのPTENのmRNAレベル及び異常PTEN活性の先に記載したサインのレベル(Saalら,2007,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,104:7564−7569)を評価した。我々の仮定と一致して、トリプル・ネガティブ乳房腫瘍は低レベルのPTEN mRNA及び最高レベルの異常PTENサインを示した(図32B、C)。このことはPTEN損失は主にER/PRネガティブ乳房腫瘍で生ずるという従来のレポート(Saalら,2005,Cancer Res.,65:2554−2559)と一致している。これらのデータから、ERBB2増幅によりERポジティブ部分集合に比してPI3K経路シグナル伝達が高められるが、トリプル・ネガティブ腫瘍におけるPTENの損失はこの部分集合が最高レベルの増殖因子シグナル伝達サインを示すという所見のもととなることが示唆される。
我々はERBB3 mRNA発現がインビトロで増殖因子刺激により引き起こされるフィードバック抑制に対してかなり感受性であるという所見を既に得ているので、我々は乳房腫瘍でのERBB3発現も評価した。インビトロでの所見と一致して、ERBB3 mRNAは増殖因子サインが最高である同じ部分集団のトリプル・ネガティブ乳房腫瘍において最低レベルで発現している(図32D)。この結果から、インビトロで観察された高い増殖因子シグナル伝達サインと低いERBB3発現間の逆関係がインビボ環境でも持続されていることが立証される。インビトロで増殖因子を添加するとERBB3 mRNAがダウンレギュレートされたが、このデータセットでのPTENとERBB3 mRNA発現の相関からトリプル・ネガティブ乳癌においてPTEN損失がPI3K経路活性化及びその後のERBB3 mRNAダウンレギュレーションに大きく寄与することが示唆される。従って、PI3Kシグナル伝達の上流活性化剤(すなわち、ERBB3)はインビトロでのフィードバック抑制に対して感受性であり得、インビボでの経路活性化読出し情報と類似の関係を示すので、インビボでの全経路活性に対する代用としてmRNAレベルの単一経路活性化剤を使用するときには注意を払わなければならない。
乳房腫瘍部分集合における解糖及び増殖
PTEN活性のダウンレギュレーションに加えて、我々は次にERBB2ポジティブ腫瘍と比較してトリプル・ネガティブ乳房腫瘍では増殖因子シグナル伝達が増加するという所見の基礎となり得る他の生物学的アスペクトを評価した。複数の乳癌プロファイリング研究は増殖が乳房腫瘍のERネガティブ部分集合において高いことが示唆され(Sotiriouら,2007,Nat.Rev.Cancer,7:545−553において精査されている)、PI3K経路活性化の1つの出力は増えた増殖であるので(Vivanco and Sawyers,2002,Nat.Rev.Cancer,2:489−501)、1つの考えられる説明は増殖がトリプル・ネガティブ乳房腫瘍における高い増殖因子シグナル伝達サインレベルの主ドライバーであることである。しかしながら、多くの最近の研究で、AKT活性化により細胞は酸化的リン酸化から好気性解糖への代謝変換を受けることが立証されており(Elstromら,2004,Cancer Res.,64:3892−3899;Plas and Thompson,2005,Oncogene,24:7435−7442)、解糖/糖新生経路遺伝子は細胞株の増殖因子処理によりアップレギュレートされる増殖因子シグナル伝達サイン遺伝子の中で有意に濃縮された(図26)。よって、我々は高い解糖がERBB2ポジティブ集団に比してトリプル・ネガティブ乳房腫瘍で観察された増殖因子サインレベルの増加に対する寄与因子であったと仮定した。
PTEN活性のダウンレギュレーションに加えて、我々は次にERBB2ポジティブ腫瘍と比較してトリプル・ネガティブ乳房腫瘍では増殖因子シグナル伝達が増加するという所見の基礎となり得る他の生物学的アスペクトを評価した。複数の乳癌プロファイリング研究は増殖が乳房腫瘍のERネガティブ部分集合において高いことが示唆され(Sotiriouら,2007,Nat.Rev.Cancer,7:545−553において精査されている)、PI3K経路活性化の1つの出力は増えた増殖であるので(Vivanco and Sawyers,2002,Nat.Rev.Cancer,2:489−501)、1つの考えられる説明は増殖がトリプル・ネガティブ乳房腫瘍における高い増殖因子シグナル伝達サインレベルの主ドライバーであることである。しかしながら、多くの最近の研究で、AKT活性化により細胞は酸化的リン酸化から好気性解糖への代謝変換を受けることが立証されており(Elstromら,2004,Cancer Res.,64:3892−3899;Plas and Thompson,2005,Oncogene,24:7435−7442)、解糖/糖新生経路遺伝子は細胞株の増殖因子処理によりアップレギュレートされる増殖因子シグナル伝達サイン遺伝子の中で有意に濃縮された(図26)。よって、我々は高い解糖がERBB2ポジティブ集団に比してトリプル・ネガティブ乳房腫瘍で観察された増殖因子サインレベルの増加に対する寄与因子であったと仮定した。
このことを調べるために、我々はまず解糖“サイン”を同定した(表13)。解糖サインをNKI乳房腫瘍データセットにおいて相関分析を実施することにより同定した(Van de Vijverら,2002,N.Engl.J.Med.,347:1999−2009)。この分析は、増殖因子シグナル伝達サイン中の遺伝子を種子遺伝子として採用し、この種子と最も強く相関している(相関p値<0.0001)遺伝子のクラスターを見つけることにより実施した。増殖因子シグナル伝達サイン由来の幾つかの遺伝子(例えば、PFKP、CORO1C、TUBB3及びTUBB4)を用いた相関分析により39個の強く相関している遺伝子の集合を同定した。この相関から誘導されたコア遺伝子は解糖に関与する幾つかの他の公知遺伝子(例えば、LDHA)を含んでいた。解糖サインのIngenuity分析は、この遺伝子集合が解糖関連遺伝子に関してかなり濃縮されていることを示した(データ示さず)。
図33に示すように、ERBB2ポジティブ及びトリプル・ネガティブ乳房腫瘍のいずれもが等しく高レベルの増殖サインを示したのに対して、トリプル・ネガティブ腫瘍はERBB2ポジティブ腫瘍に比して解糖サインの高い発現を有している。加えて、図34はHT−29及びMCF−7細胞を増殖因子で処理すると解糖サインが全体的にアップレギュレートされたことを示している。これらのデータから、増殖因子によるPI3K経路活性化により解糖が増加すること及びERBB2ポジティブ乳房腫瘍に比してトリプル・ネガティブ乳房腫瘍における増殖因子サインレベルの上昇が単に増加した増殖よりもむしろ高い解糖を反映していることが示唆された。AKT活性化により解糖が増えるので、トリプル・ネガティブ腫瘍で観察されたPTENシグナル伝達のデレギュレーションと合わせて、このデータからトリプル・ネガティブ乳房腫瘍は他の乳癌部分集合に比して高レベルのPI3K経路シグナル伝達を有していることが示唆される。
異種移植片におけるIGF1R化合物有効性の早期読出し情報としての増殖因子シグナル伝達経路サイン
NMRI雌nu/nuマウスに患者由来腫瘍異種移植片を皮下移植した:肺腺癌LXFA 526、LXFA 629、LXFA 677、LXFA 749及びLXFA 1012;扁平上皮細胞肺癌LXFE 211、LXFE 397、LXFE 409及びLXFE 1422;小細胞肺癌LXFS 538、LXFS 573及びLXFS 615;結腸直腸癌CXF 94LX、CXF 158、CXF 280、CXF 975、CXF 1103及びCXF 1729;腎細胞癌RXF 393、RXF 423、RXF 631及びRXF 1220;胃癌GXF 97、GXF 251及びGXF 281;卵巣癌OVXF 550、OVXF 899、OVXF 1023、OVXF 1353及びOVXF 1544(独国フライブルクに所在のOncotest GmbH)。腫瘍異種移植片はすべてヒト患者からの外科標本に由来し、増殖させるためにヌードマウスに直接移植した。腫瘍異種移植片を安定な増殖パターンが確立されるまでヌードマウスにおいて継代させた。早期継代異種移植片のマスターストックを液体窒素中で凍結させた。特定のマスターストックバッチは典型的に約20の追加継代のためにのみ使用する。腫瘍断片をヌードマウスでの連続継代の異種移植片から得た。ドナーマウスから腫瘍を取り除いた後、断片(直径1〜2mm)に切断し、皮下移植するまでRPMI 1640培地に置いた。イソフランの吸入によりレシピエントマウスに麻酔をかけた。腫瘍断片(1〜2個/マウス)をレシピエントマウスの背中に皮下移植した。少なくとも1つの適当なサイズ(平均腫瘍直径6〜8mm、最小の許容される腫瘍直径5mm)を有する腫瘍を有する動物が治療群及びビヒクル対照群にランダム化するために考慮された。
NMRI雌nu/nuマウスに患者由来腫瘍異種移植片を皮下移植した:肺腺癌LXFA 526、LXFA 629、LXFA 677、LXFA 749及びLXFA 1012;扁平上皮細胞肺癌LXFE 211、LXFE 397、LXFE 409及びLXFE 1422;小細胞肺癌LXFS 538、LXFS 573及びLXFS 615;結腸直腸癌CXF 94LX、CXF 158、CXF 280、CXF 975、CXF 1103及びCXF 1729;腎細胞癌RXF 393、RXF 423、RXF 631及びRXF 1220;胃癌GXF 97、GXF 251及びGXF 281;卵巣癌OVXF 550、OVXF 899、OVXF 1023、OVXF 1353及びOVXF 1544(独国フライブルクに所在のOncotest GmbH)。腫瘍異種移植片はすべてヒト患者からの外科標本に由来し、増殖させるためにヌードマウスに直接移植した。腫瘍異種移植片を安定な増殖パターンが確立されるまでヌードマウスにおいて継代させた。早期継代異種移植片のマスターストックを液体窒素中で凍結させた。特定のマスターストックバッチは典型的に約20の追加継代のためにのみ使用する。腫瘍断片をヌードマウスでの連続継代の異種移植片から得た。ドナーマウスから腫瘍を取り除いた後、断片(直径1〜2mm)に切断し、皮下移植するまでRPMI 1640培地に置いた。イソフランの吸入によりレシピエントマウスに麻酔をかけた。腫瘍断片(1〜2個/マウス)をレシピエントマウスの背中に皮下移植した。少なくとも1つの適当なサイズ(平均腫瘍直径6〜8mm、最小の許容される腫瘍直径5mm)を有する腫瘍を有する動物が治療群及びビヒクル対照群にランダム化するために考慮された。
MK−0646 IGF1Rモノクローナル抗体(U.S.特許7,241,444)を20mM L−ヒスチジン、150mM NaCl、0.5% PS−80w/w(pH6.5)を用いて1:5.65の比で2mg/mLの最終投与濃度に希釈した。希釈した治療溶液を500μg/マウスの投与レベルに対して250μl/マウスの投与容量で投与した。対照ビヒクルは20mM L−ヒスチジン、150mM NaCl、0.5% PS−80w/w(pH6.5)であった。ビヒクルは250μl/マウスで投与した。IGF1Rモノクローナル抗体及び対照ビヒクルを腹腔内注射した。試験及び対照マウスに1週間に1回同じ日に注射した。注射回数は実験期間に応じて2〜7回の範囲であった。独国の動物規制が設定した限界の1つが満たされたとき実験を終了した。
各実験は、20mM L−ヒスチジン、150mM NaCl、0.5% PS−80 w/w(pH6.5)を250μL/マウスで1週間に1回腹腔内で与えたビヒクル対照群(群1)、IGF−1Rを用いて500μg/マウスで1週間に1回腹腔内で治療した1つの群(群2)から構成した。サンプル採集の目的で、各実験には、ビヒクルまたはIGF−1Rを同じ用量レベルで1回与える2つの群(群3及び4)も含めた。研究プロトコルに従って、有効性群(1及び2群)の群サイズは7匹のマウスであり、サンプル採取群(3及び4群)には各々3匹のヌードマウスを含めた。CXF 1103及びRXF 631を持っているマウスを用いた実験では、有効性群に8匹のマウスを含め、LXFE 211を持っているヌードマウスを用いた実験の有効性群の群サイズは9であった。RXF 393を持っているヌードマウスを用いた実験のビヒクル対照群は6匹のマウスから構成した。LXFS 538を用いた実験のサンプル採取群はいずれも4匹のマウスを含め、CXF 975を持っているヌードマウスを用いたサンプル採取ビヒクル対照群には4匹のマウスも含めた。
x日目の個々の腫瘍の相対容積(RTV)を、x日目の個々の腫瘍容積(Tx)を0日目の同一腫瘍の個々の容積(T0)で割り、100%を掛けることにより計算した。
群腫瘍容積は、群中のすべての腫瘍のメジアンRTV(群メジアンRTV)として表示した。計算のためには、x日目に生存しているマウス中の腫瘍の容積のみを考慮した。増殖曲線を描くため及び治療評価のために群メジアンRTV値を計算した。
1及び2群の動物は実験マウスを殺すためのガイドラインを満足した時に応じて14日目〜45日目までの終了期間の範囲を有していた。群3及び4の動物は、腫瘍が400〜600mm3の容積を有したとき及び対照ビヒクル(群3)またはIGF1R(群4)で1回治療してから24時間後にサンプル採取のために殺した。腫瘍を2つの部分に切断し、液体窒素中でスナップ凍結し、−80℃で保存した。RNAをDNAオリゴヌクレオチドアレイへのハイブリダイゼーションのために先に記載したようにビヒクル治療したサンプル及びMK0646治療したサンプルの両方から収集した。
MK−0646による増殖因子シグナル伝達経路サインのレギュレーションを、各異種移植片毎にMK0646治療したサンプルの平均遺伝子発現プロファイルをビヒクル治療したサンプルの平均遺伝子発現プロファイルと比較することにより評価した。ビヒクル治療したサンプルに対するMK−0646治療したサンプルにおける発現のlog(10)比をマイクロアレイ上のプローブ毎に計算した。増殖因子シグナル伝達経路サインスコアをサインの“アップ”腕中の遺伝子(表5aを参照されたい)の平均log(10)比−サインの“ダウン”腕中の遺伝子(表5bを参照されたい)の平均log(10)比として計算した。次いで、各異種移植片毎に増殖因子シグナル伝達経路サインスコアの投与後/投与前比を計算し、腫瘍抑制T/C比と比較した(図35を参照されたい)。GFSスコアの投与後/投与前比がより低いことはこの経路のシグナル伝達がMK−0646治療によりより多く抑制されることを立証する。T/C比がより低いことはMK−0646治療による増殖抑制がより大きいことを示している。図35に示すように、ライトグレーで示した異種移植片(LXFA−629、MAXF−713、OVXF−899及びCSF−94LX)はMK−0646治療後強い腫瘍抑制を有していた。ミディアムグレーで示した異種移植片(SXF−1186、CSF−280、CSF−1729)はMK−0646治療後中程度の応答を有しており、ダークグレーで示した異種移植片はMK−0646治療に対して最小または全く応答しなかった。図35に示すように、最も高い腫瘍抑制(T/C比)を示した2つの異種移植片(MAXF−713及びLXFA−629)は低い増殖因子シグナル伝達スコア投与後/投与前比をも有しており、MK−0646治療後のこの経路のシグナル伝達がより大きい抑制されたことを示している。これらのデータから、増殖因子シグナル伝達経路サインスコアは化合物有効性の早期読出し情報として使用され得ることが示唆される。
Claims (81)
- (i)腫瘍細胞サンプル中の第1の複数の遺伝子の発現レベルからなる第1発現プロファイルと異常活性を有する増殖因子シグナル伝達経路の成分を少なくとも1つ以上有していない複数の対照細胞サンプル中のそれぞれの遺伝子の平均発現レベルである第1の複数の遺伝子の発現レベルからなるレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路テンプレート間の類似度を計算し、前記した第1の複数の遺伝子はそのバイオマーカーが表5a及び5bにリストされている少なくとも5個の遺伝子から構成されており;
(ii)第1発現プロファイルがレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路テンプレートに対して高い類似性を有しているならば腫瘍細胞サンプルをレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路を有しているとして分類し、また第1発現プロファイルがレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路テンプレートに対して低い類似性を有しているならば腫瘍細胞サンプルをデレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路を有しているとして分類し、レギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路テンプレートに対する類似性が所定閾値を超えているならば第1発現プロファイルはレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路テンプレートに対して高い類似性を有しており、またレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路テンプレートに対する類似性が所定閾値を下回るならば第1発現プロファイルはレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路テンプレートに対して低い類似性を有しており:
(iii)分類ステップ(ii)で得た分類をユーザーインターフェースデバイス、コンピューター読み取り可能記憶媒体、或いはローカルまたはリモートコンピューターシステムに表示または出力させる;
ことからなる単離した細胞サンプルをデレギュレートまたはレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路を有しているとして分類するための方法。 - (i)a)対照細胞サンプル中の第1の複数の遺伝子の各々及び第2の複数の遺伝子の各々の第2発現レベルに対する細胞サンプル中の第1の複数の遺伝子の各々及び第2の複数の遺伝子の各々の第1発現レベルの差次的発現値を計算し、前記した第1の複数の遺伝子はそのバイオマーカーが表5aにリストされている少なくとも3個以上の遺伝子から構成されており、第2の複数の遺伝子はそのバイオマーカーが表5bにリストされている少なくとも3個以上の遺伝子から構成されており、b)第1の複数の遺伝子及び第2の複数の遺伝子の発現レベルの平均差次的発現値を計算し、c)第1の複数の遺伝子の平均差次的発現値から第2の複数の遺伝子の平均差次的発現値を減じてサインスコアを得ることからなる方法によりサインスコアを計算し;
(ii)a)得られたサインスコアが所定閾値を超えているならば、b)サインスコアが統計上有意であるならば、細胞サンプルはデレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路を有しているとして分類し;
(iii)分類ステップ(ii)で得た分類をユーザーインターフェースデバイス、コンピューター読み取り可能記憶媒体、或いはローカルまたはリモートコンピューターシステムに表示または出力させる;
ことを含む単離した細胞サンプルをデレギュレートまたはレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路を有しているとして分類するための方法。 - 第1の複数の遺伝子はそのバイオマーカーが表9aにリストされている少なくとも3個以上の遺伝子から構成されており、第2の複数の遺伝子はそのバイオマーカーが表9bにリストされている少なくとも3個以上の遺伝子から構成されている請求項2に記載の方法。
- 差次的発現値はlog(10)比である請求項2に記載の方法。
- 差次的発現値は1og10(2Λ−Ct)である請求項2に記載の方法。
- 閾値は0である請求項2に記載の方法。
- 0.05未満のp値を有しているならばサインスコアは統計上有意である請求項2に記載の方法。
- 単離した細胞サンプルはヒト被験者由来である請求項1または2に記載の方法。
- 第1の複数はそのバイオマーカーが表5a及び5bにリストされている少なくとも10個の遺伝子から構成されている請求項1に記載の方法。
- 第1の複数はそのバイオマーカーが表5a及び5bにリストされている少なくとも20個の遺伝子から構成されている請求項1に記載の方法。
- 第1の複数はそのバイオマーカーが表5a及び5bにリストされている少なくとも50個の遺伝子から構成されている請求項1に記載の方法。
- 第1の複数はそのバイオマーカーが表5aにリストされている少なくとも5個の遺伝子から構成されており、第2の複数はそのバイオマーカーが表5bにリストされている少なくとも5個の遺伝子から構成されている請求項2に記載の方法。
- (a)(i)被験者由来の単離した細胞サンプル中の第1の複数の遺伝子の発現レベルからなる第1発現プロファイルと異常活性を有する増殖因子シグナル伝達経路の成分を少なくとも1つ以上有していない複数の対照細胞サンプル中のそれぞれの遺伝子の平均発現レベルである第1の複数の遺伝子の発現レベルからなるレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路テンプレート間の類似度を計算し、前記した第1の複数の遺伝子はそのバイオマーカーが表5a及び5bにリストされている少なくとも5個の遺伝子から構成されており;
(ii)第1発現プロファイルがレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路テンプレートに対して高い類似性を有しているならば細胞サンプルをレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路を有しているとして分類し、また第1発現プロファイルがレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路テンプレートに対して低い類似性を有しているならば細胞サンプルをデレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路を有しているとして分類し、レギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路テンプレートに対する類似性が所定閾値を超えているならば第1発現プロファイルはレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路テンプレートに対して高い類似性を有しており、レギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路テンプレートに対する類似性が所定閾値を下回るならば第1発現プロファイルはレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路テンプレートに対して低い類似性を有しており;
(iii)分類ステップ(ii)により得た分類をユーザーインターフェースデバイス、コンピューター読み取り可能記憶媒体、或いはローカルまたはリモートコンピューターシステムに表示または出力させる;
ことにより被験者をデレギュレートまたはレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路を有しているとして分類することを含み、デレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路を有しているとして分類された被験者は増殖因子シグナル伝達経路をモジュレートする物質に対して応答すると予測される被験者を示す前記物質に対する被験者の応答の予測方法。 - (i)a)対照細胞サンプル中の第1の複数の遺伝子の各々及び第2の複数の遺伝子の各々の第2発現レベルに対する被験者由来の単離した細胞サンプル中の第1の複数の遺伝子の各々及び第2の複数の遺伝子の各々の第1発現レベルの差次的発現値を計算し、前記した第1の複数の遺伝子はそのバイオマーカーが表5aにリストされている少なくとも3個以上の遺伝子から構成されており、第2の複数の遺伝子はそのバイオマーカーが表5bにリストされている少なくとも3個以上の遺伝子から構成されており、b)第1の複数の遺伝子及び第2の複数の遺伝子の発現レベルの平均差次的発現値を計算し、c)第1の複数の遺伝子の平均差次的発現値から第2の複数の遺伝子の平均差次的発現値を減じてサインスコアを得:
(ii)a)得られたサインスコアが所定閾値を超えているならば、b)サインスコアが統計上有意ならば、被験者をデレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路を有しているとして分類し;
(iii)分類ステップ(ii)で得た分類をユーザーインターフェースデバイス、コンピューター読み取り可能記憶媒体、或いはローカルまたはリモートコンピューターシステムに表示または出力させる;
ことにより被験者をデレギュレートまたはレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路を有しているとして分類し、デレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路を有しているとして分類された被験者は増殖因子シグナル伝達経路をモジュレートする物質に応答すると予測される被験者を示す被験者の前記物質に対する応答の予測方法。 - 第1の複数の遺伝子はそのバイオマーカーが表9aにリストされている少なくとも3個以上の遺伝子から構成されており、第2の複数の遺伝子はそのバイオマーカーが表9bにリストされている少なくとも3個以上の遺伝子から構成されている請求項12に記載の方法。
- 差次的発現値はlog(10)比である請求項12に記載の方法。
- 差次的発現値はlog10(2Λ−Ct)である請求項12に記載の方法。
- 閾値は0である請求項12に記載の方法。
- 0.05未満のp値を有しているならばサインスコアは統計上有意である請求項12に記載の方法。
- (i)a)対照細胞サンプル中の第1の複数の遺伝子の各々及び第2の複数の遺伝子の各々の第2発現レベルに対する被験者由来の単離した細胞サンプル中の第1の複数の遺伝子の各々及び第2の複数の遺伝子の各々の第1発現レベルの差次的発現値を計算し、前記した第1の複数の遺伝子はそのバイオマーカーが表5aにリストされている少なくとも3個以上の遺伝子から構成されており、第2の複数の遺伝子はそのバイオマーカーが表5bにリストされている少なくとも3個以上の遺伝子から構成されており、b)第1の複数の遺伝子及び第2の複数の遺伝子の発現レベルの平均差次的発現値を計算し、c)第1の複数の遺伝子の平均差次的発現値から第2の複数の遺伝子の平均差次的発現値を減じてサインスコアを得ることを含む方法によりサインスコアを計算し;
(ii)a)得られたサインスコアが所定閾値を超えているならば、b)サインスコアが統計上有意であるならば、被験者をデレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路を有しているとして分類し;
(iii)分類ステップ(ii)により得た分類をユーザーインターフェースデバイス、コンピューター読み取り可能記憶媒体、或いはローカルまたはリモートコンピューターシステムに表示または出力させる;
ことにより被験者をデレギュレートまたはレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路を有しているとして分類し;
(b)被験者がデレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路を有しているとして分類されるならば、該被験者に増殖因子シグナル伝達経路をモジュレートする物質を割り当て、前記癌患者に有糸分裂抑制剤タイプの物質を割り当てない;
ことを含む被験者への治療の割り当て方法。 - 第1の複数の遺伝子はそのバイオマーカーが表9aにリストされている少なくとも3個以上の遺伝子から構成されており、第2の複数の遺伝子はそのバイオマーカーが表9bにリストされている少なくとも3個以上の遺伝子から構成されている請求項20に記載の方法。
- 差次的発現値はlog(10)比である請求項20に記載の方法。
- 差次的発現値はlog10(2Λ−Ct)である請求項20に記載の方法。
- 閾値は0である請求項20に記載の方法。
- 0.05未満のp値ならばサインスコアは統計上有意である請求項20に記載の方法。
- (a)被験者を増殖因子シグナル伝達経路の1つ以上の成分をモジュレートする物質と接触させ;
(b)被験者をデレギュレートまたはレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路を有しているとして分類する;
ことを含む被験者中の増殖因子シグナル伝達経路に対する物質の薬力学的活性の測定方法であって、前記分類は
(i)a)対照細胞サンプル中の第1の複数の遺伝子の各々及び第2の複数の遺伝子の各々の第2発現レベルに対する被験者由来の単離した細胞サンプル中の第1の複数の遺伝子の各々及び第2の複数の遺伝子の各々の第1発現レベルの差次的発現値を計算し、前記第1の複数の遺伝子はそのバイオマーカーが表5aにリストされている少なくとも3個以上の遺伝子から構成されており、第2の複数の遺伝子はそのびバイオマーカーが表5bにリストされている少なくとも3個以上の遺伝子から構成されており、b)第1の複数の遺伝子及び第2の複数の遺伝子の発現レベルの平均差次的発現値を計算し、c)第1の複数の遺伝子の平均差次的発現値から第2の複数の遺伝子の平均差次的発現値を減じてサインスコアを得ることを含む方法によりサインスコアを計算し;
(ii)a)得られたサインスコアが所定閾値を下回るならば、b)サインスコアが統計上有意であるならば、被験者はレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路を有しているとして分類し;
(iii)分類ステップ(ii)により得た分類をユーザーインターフェースデバイス、コンピューター読み取り可能記憶媒体、或いはローカルまたはリモートコンピューターシステムに表示または出力させる;
ことを含み、前記物質での治療を受け且つレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路を有しているとして分類された被験者は増殖因子シグナル伝達経路に対して薬力学的活性を有する物質を示す前記方法。 - 第1の複数の遺伝子はそのバイオマーカーが表9aにリストされている少なくとも3個以上の遺伝子から構成されており、第2の複数の遺伝子はそのバイオマーカーが表9bにリストされている少なくとも3個以上の遺伝子から構成されている請求項26に記載の方法。
- 差次的発現値はlog(10)比である請求項26に記載の方法。
- 差次的発現値はlog10(2Λ−Ct)である請求項26に記載の方法。
- 閾値は0である請求項26に記載の方法。
- 0.05未満のp値を有しているならばサインスコアは統計上有意である請求項26に記載の方法。
- (a)被験者を物質と接触させ、
(b)被験者をデレギュレートまたはレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路を有しているとして分類することを含む前記物質が被験者中の増殖因子シグナル伝達経路をモジュレートするかを調べる方法であって、前記分類は
(i)a)物質と接触していない対照細胞サンプル中の第1の複数の遺伝子の各々及び第2の複数の遺伝子の各々の第2発現レベルに対する被験者由来の単離した細胞サンプル中の第1の複数の遺伝子の各々及び第2の複数の遺伝子の各々の第1発現レベルの差次的発現値を計算し、前記した第1の複数の遺伝子はそのバイオマーカーが表5aにリストされている少なくとも3個以上の遺伝子から構成されており、第2の複数の遺伝子はそのバイオマーカーが表5bにリストされている少なくとも3個以上の遺伝子から構成されており、b)第1の複数の遺伝子及び第2の複数の遺伝子の発現レベルの平均差次的発現値を計算し、c)第1の複数の遺伝子の平均差次的発現値から第2の複数の遺伝子の平均差次的発現値を減ずることによりサインスコアを得ることを含む方法によりサインスコアを計算し;
(ii)a)得られたサインスコアが所定閾値を下回るならば、b)サインスコアが統計上有意ならば、被験者をレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路を有しているとして分類し;
(iii)分類ステップ(ii)で得た分類をユーザーインターフェースデバイス、コンピューター読み取り可能記憶媒体、或いはローカルまたはリモートコンピューターシステムに表示または出力させる;
ことを含み、物質での治療を受け且つレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路を有しているとして分類された被験者は増殖因子シグナル伝達経路に対する効果を有する物質を示す前記方法。 - 第1の複数の遺伝子はそのバイオマーカーが表9aにリストされている少なくとも3個以上の遺伝子から構成されており、第2の複数の遺伝子はそのバイオマーカーが表9bにリストされている少なくとも3個以上の遺伝子から構成されている請求項32に記載の方法。
- 差次的発現値はlog(10)比である請求項32に記載の方法。
- 差次的発現値はlog10(2Λ−Ct)である請求項32に記載の方法。
- 閾値は0である請求項32に記載の方法。
- 0.05未満のp値を有しているならばサインスコアは統計上有意である請求項32に記載の方法。
- (i)腫瘍細胞サンプル中の第1の複数の遺伝子の発現レベルからなる第1発現プロファイルと異常活性を有する増殖因子シグナル伝達経路の成分を少なくとも1つ以上有していない複数の対照細胞サンプル中のそれぞれの遺伝子の平均発現レベルである第1の複数の遺伝子の発現レベルからなるレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路テンプレート間の類似度を計算し、前記した第1の複数の遺伝子はそのバイオマーカーが表11a及び11bにリストされている少なくとも5個の遺伝子から構成されており;
(ii)第1発現プロファイルがレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路テンプレートに対して高い類似性を有しているならば腫瘍細胞サンプルをレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路を有しているとして分類し、また第1発現プロファイルがレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路テンプレートに対して低い類似性を有しているならば腫瘍細胞サンプルをデレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路を有しているとして分類し、レギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路テンプレートに対する類似性が所定閾値を超えているならば第1発現プロファイルはレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路テンプレートに対して高い類似性を有しており、またレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路テンプレートに対する類似性が所定閾値を下回るならば第1発現プロファイルはレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路テンプレートに対して低い類似性を有しており;
(iii)分類ステップ(ii)で得た分類をユーザーインターフェースデバイス、コンピューター読み取り可能記憶媒体、或いはローカルまたはリモートコンピューターシステムに表示または出力させる;
ことを含む単離した細胞サンプルをデレギュレートまたはレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路を有しているとして分類するための方法。 - (i)a)対照細胞サンプル中の第1の複数の遺伝子の各々及び第2の複数の遺伝子の各々の第2発現レベルに対する細胞サンプル中の第1の複数の遺伝子の各々及び第2の複数の遺伝子の各々の第1発現レベルの差次的発現値を計算し、前記した第1の複数の遺伝子はそのバイオマーカーが表11aにリストされている少なくとも3個以上の遺伝子から構成されており、第2の複数の遺伝子はそのバイオマーカーが表11bにリストされている少なくとも3個以上の遺伝子から構成されており、b)第1の複数の遺伝子及び第2の複数の遺伝子の発現レベルの平均差次的発現値を計算し、c)第1の複数の遺伝子の平均差次的発現値から第2の複数の遺伝子の平均差次的発現値を減じてサインスコアを得ることを含む方法によりサインスコアを計算し;
(ii)a)得られたサインスコアが所定閾値を超えているならば、b)サインスコアが統計上有意であるならば、細胞サンプルをデレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路を有しているとして分類し;
(iii)分類ステップ(ii)で得た分類をユーザーインターフェースデバイス、コンピューター読み取り可能記憶媒体、或いはローカルまたはリモートコンピューターシステムに表示または出力させる;
ことを含む単離した細胞サンプルをデレギュレートまたはレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路を有しているとして分類するための方法。 - 差次的発現値はlog(10)比である請求項39に記載の方法。
- 差次的発現値は1og10(2Λ−Ct)である請求項39に記載の方法。
- 閾値は0である請求項39に記載の方法。
- 0.05未満のp値を有しているならばサインスコアは統計上有意である請求項39に記載の方法。
- 単離した細胞サンプルはヒト被験者由来である請求項38または39に記載の方法。
- 第1の複数はそのバイオマーカーが表11a及び11bにリストされている少なくとも10個の遺伝子から構成されている請求項38に記載の方法。
- 第1の複数はそのバイオマーカーが表11a及び11bにリストされている少なくとも20個の遺伝子から構成されている請求項1に記載の方法。
- 第1の複数はそのバイオマーカーが表11a及び11bにリストされている少なくとも50個の遺伝子から構成されている請求項38に記載の方法。
- 第1の複数はそのバイオマーカーが表11aにリストされている少なくとも5個の遺伝子から構成されており、第2の複数はそのバイオマーカーが表11bにリストされている少なくとも5個の遺伝子から構成されている請求項39に記載の方法。
- (a)(i)被験者由来の単離した細胞サンプル中の第1の複数の遺伝子の発現レベルからなる第1発現プロファイルと異常活性を有する増殖因子シグナル伝達経路の成分を少なくとも1つ以上有していない複数の対照細胞サンプル中のそれぞれの遺伝子の平均発現レベルである第1の複数の遺伝子の発現レベルからなるレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路テンプレート間の類似度を計算し、前記した第1の複数の遺伝子はそのバイオマーカーが表11a及び11bにリストされている少なくとも5個の遺伝子から構成されており;
(ii)第1発現プロファイルがレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路テンプレートに対して高い類似性を有しているならば細胞サンプルをレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路を有しているとして分類し、また第1発現プロファイルがレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路テンプレートに対して低い類似性を有しているならば細胞サンプルをデレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路を有しているとして分類し、レギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路テンプレートに対する類似性が所定閾値を超えているならば第1発現プロファイルはレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路テンプレートに対して高い類似性を有し、またレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路テンプレートに対する類似性が所定閾値を下回るならば第1発現プロファイルはレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路テンプレートに対して低い類似性を有しており;
(iii)分類ステップ(ii)により得た分類をユーザーインターフェースデバイス、コンピューター読み取り可能記憶媒体、或いはローカルまたはリモートコンピューターシステムに表示または出力させる;
ことにより被験者をデレギュレートまたはレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路を有しているとして分類し、デレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路を有しているとして分類された被験者は増殖因子シグナル伝達経路をモジュレートする物質に対して応答すると予測される被験者を示す被験者の前記物質に対する応答を予測するための方法。 - (a)(i)a)対照細胞サンプル中の第1の複数の遺伝子の各々及び第2の複数の遺伝子の各々の第2発現レベルに対する被験者由来の単離した細胞サンプル中の第1の複数の遺伝子の各々及び第2の複数の遺伝子の各々の第1発現レベルの差次的発現値を計算し、前記した第1の複数の遺伝子はそのバイオマーカーが表11aにリストされている少なくとも3個以上の遺伝子から構成されており、第2の複数はそのバイオマーカーが表11bにリストされている少なくとも3個以上の遺伝子から構成されており、b)第1の複数の遺伝子及び第2の複数の遺伝子の発現レベルの平均差次的発現値を計算し、c)第1の複数の遺伝子の平均差次的発現値から第2の複数の遺伝子の平均差次的発現値を減じてサインスコアを得ることを含む方法によりサインスコアを計算し;
(ii)a)得られたサインスコアが所定閾値を超えているならば、b)サインスコアが統計上有意であるならば、被験者をデレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路を有しているとして分類し;
(iii)分類ステップ(ii)で得た分類をユーザーインターフェースデバイス、コンピューター読み取り可能記憶媒体、或いはローカルまたはリモートコンピューターシステムに表示または出力させる;
ことにより被験者をデレギュレートまたはレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路を有しているとして分類することを含み、デレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路を有しているとして分類された被験者は増殖因子シグナル伝達経路をモジュレートする物質に対して応答すると予測される被験者を示す被験者の前記物質に対する応答を予測するための方法。 - 差次的発現値はlog(10)比である請求項50に記載の方法。
- 差次的発現値はlog10(2Λ−Ct)である請求項50に記載の方法。
- 閾値は0である請求項50に記載の方法。
- 0.05未満のp値を有しているならばサインスコアは統計上有意である請求項50に記載の方法。
- (a)(i)a)対照細胞サンプル中の第1の複数の遺伝子の各々及び第2の複数の遺伝子の各々の第2発現レベルに対する被験者由来の単離した細胞サンプル中の第1の複数の遺伝子の各々及び第2の複数の遺伝子の各々の第1発現レベルの差次的発現値を計算し、前記した第1の複数の遺伝子はそのバイオマーカーが表11aにリストされている少なくとも3個以上の遺伝子から構成されており、第2の複数の遺伝子はそのバイオマーカーが表11bにリストされている少なくとも3個以上の遺伝子から構成されており、b)第1の複数の遺伝子及び第2の複数の遺伝子の発現レベルの平均差次的発現値を計算し、c)第1の複数の遺伝子の平均差次的発現値から第2の複数の遺伝子の平均差次的発現値を減じてサインスコアを得る方法によりサインスコアを計算し;
(ii)a)得られたサインスコアが所定閾値を超えているならば、b)サインスコアが統計上有意であるならば、被験者をデレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路を有しているとして分類し;
(iii)分類ステップ(ii)で得た分類をユーザーインターフェースデバイス、コンピューター読み取り可能記憶媒体、或いはローカルまたはリモートコンピューターシステムに表示または出力させる;
ことにより被験者をデレギュレートまたはレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路を有しているとして分類し;
(b)被験者がデレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路を有しているとして分類されたならば、被験者に増殖因子シグナル伝達経路をモジュレートする物質を割り当て、前記癌患者に有糸分裂抑制剤タイプの物質を割り当てない;
ことを含む被験者に対する治療の割り当て方法。 - 差次的発現値はlog(10)比である請求項55に記載の方法。
- 差次的発現値はlog10(2Λ−Ct)である請求項55に記載の方法。
- 閾値は0である請求項55に記載の方法。
- 0.05未満のp値を有しているならばサインスコアは統計上有意である請求項55に記載の方法。
- (a)被験者を増殖因子シグナル伝達経路の1つ以上の成分をモジュレートする物質と接触させ、
(b)被験者をデレギュレートまたはレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路を有しているとして分類することを含む被験者における前記物質の増殖因子シグナル伝達経路に対する薬力学的活性の測定方法であって、前記分類は
(i)a)対照細胞サンプル中の第1の複数の遺伝子の各々及び第2の複数の遺伝子の各々の第2発現レベルに対する被験者由来の単離した細胞サンプル中の第1の複数の遺伝子の各々及び第2の複数の遺伝子の各々の第1発現レベルの差次的発現値を計算し、前記した第1の複数の遺伝子はそのバイオマーカーが表11aにリストされている少なくとも3個以上の遺伝子から構成されており、第2の複数の遺伝子はそのバイオマーカーが表11bにリストされている少なくとも3個以上の遺伝子から構成されており、b)第1の複数の遺伝子及び第2の複数の遺伝子の発現レベルの平均差次的発現値を計算し、c)第1の複数の遺伝子の平均差次的発現値から第2の複数の遺伝子の平均差次的発現値を減じてサインスコアを得ることを含む方法によりサインスコアを計算し;
(ii)a)得られたサインスコアが所定閾値を下回るならば、b)サインスコアが統計上有意であるならば、被験者をレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路を有しているとして分類し;
(iii)分類ステップ(ii)で得た分類をユーザーインターフェースデバイス、コンピューター読み取り可能記憶媒体、或いはローカルまたはリモートコンピューターシステムに表示または出力させる;
ことを含み、前記物質の治療を受け且つレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路を有しているとして分類された被験者は増殖因子シグナル伝達経路に対する薬力学的活性を有する物質を示す前記方法。 - 差次的発現値はlog(10)比である請求項60に記載の方法。
- 差次的発現値はlog10(2Λ−Ct)である請求項60に記載の方法。
- 閾値は0である請求項60に記載の方法。
- 0.05未満のp値を有しているならばサインスコアは統計上有意である請求項60に記載の方法。
- (a)被験者を増殖因子シグナル伝達経路をモジュレートする物質と接触させ、
(b)被験者をデレギュレートまたはレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路を有しているとして分類することを含む前記物質が被験者中の増殖因子シグナル伝達経路をモジュレートするかを調べる方法であって、前記分類は
(i)a)前記物質と接触していない対照細胞サンプル中の第1の複数の遺伝子の各々及び第2の複数の遺伝子の各々の第2発現レベルに対する被験者由来の単離した細胞サンプル中の第1の複数の遺伝子の各々及び第2の複数の遺伝子の各々の第1発現レベルの差次的発現値を計算し、前記した第1の複数の遺伝子はそのバイオマーカーが表11aにリストされている少なくとも3個以上の遺伝子から構成されており、第2の複数の遺伝子はそのバイオマーカーが表11bにリストされている少なくとも3個以上の遺伝子から構成されており、b)第1の複数の遺伝子及び第2の複数の遺伝子の発現レベルの平均差次的発現値を計算し、c)第1の複数の遺伝子の平均差次的発現値から第2の複数の遺伝子の平均差次的発現値を減じてサインスコアを得ることを含む方法によりサインスコアを計算し;
(ii)a)得られたサインスコアが所定閾値を下回るならば、b)サインスコアが統計上有意であるならば、被験者をレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路を有しているとして分類し;
(iii)分類ステップ(ii)により得た分類をユーザーインターフェースデバイス、コンピューター読み取り可能記憶媒体、或いはローカルまたはリモートコンピューターシステムに表示または出力させる;
ことを含み、前記物質の治療を受け且つレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路を有しているとして分類された被験者は増殖因子シグナル伝達経路に対する効果を有する物質を示す前記方法。 - 差次的発現値はlog(10)比である請求項65に記載の方法。
- 差次的発現値はlog10(2Λ−Ct)である請求項65に記載の方法。
- 閾値は0である請求項65に記載の方法。
- 0.05未満のp値を有しているならばサインスコアは統計上有意である請求項65に記載の方法。
- (i)腫瘍細胞サンプル中の第1の複数の遺伝子の発現レベルからなる第1発現プロファイルと酸素の存在下で有意な解糖活性を有していない複数の対照細胞サンプル中のそれぞれの遺伝子の平均発現レベルである第1の複数の遺伝子の発現レベルからなる非活性化解糖経路テンプレート間の類似度を計算し、前記した第1の複数の遺伝子はそのバイオマーカーが表13にリストされている少なくとも5個の遺伝子から構成されており;
(ii)第1発現プロファイルが非活性化解糖経路テンプレートに対して高い類似性を有しているならば腫瘍細胞サンプルを非活性化解糖経路を有しているとして分類し、また第1発現プロファイルが非活性化解糖経路テンプレートに対して低い類似性を有しているならば腫瘍細胞サンプルを活性化解糖経路を有しているとして分類し、非活性化解糖経路テンプレートに対する類似性が所定閾値を超えているならば第1発現プロファイルは非活性化解糖経路テンプレートに対して高い類似性を有し、非活性化解糖経路テンプレートに対する類似性が所定閾値を下回るならば第1発現プロファイルは非活性化解糖経路テンプレートに対して低い類似性を有しており;
(iii)分類ステップ(ii)により得た分類をユーザーインターフェースデバイス、コンピューター読み取り可能記憶媒体、或いはローカルまたはリモートコンピューターシステムに表示または出力させる;
ことを含む単離した細胞サンプルを活性化または非活性化解糖経路を有しているとして分類するための方法。 - 単離した細胞サンプルはヒト被験者由来である請求項70に記載の方法。
- 第1の複数はそのバイオマーカーが表13にリストされている少なくとも10個の遺伝子から構成されている請求項70に記載の方法。
- 第1の複数はそのバイオマーカーが表13にリストされている少なくとも20個の遺伝子から構成されている請求項70に記載の方法。
- (a)(i)被験者由来の単離した細胞サンプル中の第1の複数の遺伝子の発現レベルからなる第1発現プロファイルと酸素の存在下で有意な解糖活性を有していない複数の対照細胞サンプル中のそれぞれの遺伝子の平均発現レベルである第1の複数の遺伝子の発現レベルからなる非活性化解糖経路テンプレート間の類似度を計算し、前記した第1の複数の遺伝子はそのバイオマーカーが表13にリストされている少なくとも5個の遺伝子から構成されており;
(ii)第1発現プロファイルが非活性化解糖経路テンプレートに対して高い類似性を有しているならば細胞サンプルを非活性化解糖経路を有しているとして分類し、また第1発現プロファイルが非活性化解糖経路テンプレートに対して低い類似性を有しているならば細胞サンプルを活性化解糖経路を有しているとして分類し、非活性化解糖経路テンプレートに対する類似性が所定閾値を超えているならば第1発現プロファイルは非活性化解糖経路テンプレートに対して高い類似性を有しており、非活性化解糖経路テンプレートに対する類似性が所定閾値を下回るならば第1発現プロファイルは非活性化解糖経路テンプレートに対して低い類似性を有しており;
(iii)分類ステップ(ii)により得た分類をユーザーインターフェースデバイス、コンピューター読み取り可能記憶媒体、或いはローカルまたはリモートコンピューターシステムに表示または出力させる;
ことを含むことにより被験者を活性化または非活性化解糖経路を有しているとして分類し、活性化解糖経路を有しているとして分類された被験者は解糖経路をモジュレートする物質に応答すると予測される被験者を示す被験者の前記物質に対する応答を予測するための方法。 - 単離した細胞サンプルはヒト被験者由来である請求項74に記載の方法。
- 第1の複数はそのバイオマーカーが表13にリストされている少なくとも10個の遺伝子から構成されている請求項74に記載の方法。
- 第1の複数はそのバイオマーカーは表13にリストされている少なくとも20個の遺伝子から構成されている請求項74に記載の方法。
- (a)被験者を解糖経路をモジュレートする物質と接触させ、
(b)被験者を非活性化または活性化解糖経路を有しているとして分類することを含む前記物質が被験者中の解糖経路をモジュレートするかを調べる方法であって、前記分類は
(i)被験者由来の単離した細胞サンプル中の第1の複数の遺伝子の発現レベルからなる第1発現プロファイルと酸素の存在下で有意な解糖活性を有していない複数の対照細胞サンプル中のそれぞれの遺伝子の平均発現レベルである第1の複数の遺伝子の発現レベルからなる非活性化解糖経路テンプレート間の類似度を計算し、前記した第1の複数の遺伝子はそのバイオマーカーが表13にリストされている少なくとも5個の遺伝子から構成されており;
(ii)第1発現プロファイルが非活性化解糖経路テンプレートに対して高い類似性を有しているならば細胞サンプルを非活性化解糖経路を有しているとして分類し、また第1発現プロファイルが非活性化解糖経路テンプレートに対して低い類似性を有しているならば細胞サンプルを活性化解糖経路を有しているとして分類し、非活性化解糖経路テンプレートに対する類似性が所定閾値を超えているならば第1発現プロファイルは非活性化解糖経路テンプレートに対して高い類似性を有し、非活性化解糖経路テンプレートに対する類似性が所定閾値を下回るならば第1発現プロファイルは非活性化解糖経路テンプレートに対して低い類似性を有しており;
(iii)分類ステップ(ii)により得た分類をユーザーインターフェースデバイス、コンピューター読み取り可能記憶媒体、或いはローカルまたはリモートコンピューターシステムに表示または出力させる;
ことを含み、前記物質の治療を受け且つ非活性化解糖経路を有するとして分類された被験者は解糖経路に対する効果を有する物質を示す前記方法。 - 単離した細胞サンプルはヒト被験者由来である請求項78に記載の方法。
- 第1の複数はそのバイオマーカーが表13にリストされている少なくとも10個の遺伝子から構成されている請求項78に記載の方法。
- 第1の複数はそのバイオマーカーが表13にリストされている少なくとも20個の遺伝子から構成されている請求項78に記載の方法。
Applications Claiming Priority (7)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US7036808P | 2008-03-22 | 2008-03-22 | |
US61/070,368 | 2008-03-22 | ||
US12800108P | 2008-05-16 | 2008-05-16 | |
US61/128,001 | 2008-05-16 | ||
US13264908P | 2008-06-20 | 2008-06-20 | |
US61/132,649 | 2008-06-20 | ||
PCT/US2009/037598 WO2009120561A2 (en) | 2008-03-22 | 2009-03-19 | Methods and gene expression signature for assessing growth factor signaling pathway regulation status |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2011515088A true JP2011515088A (ja) | 2011-05-19 |
Family
ID=41114592
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2011500943A Withdrawn JP2011515088A (ja) | 2008-03-22 | 2009-03-19 | 増殖因子シグナル伝達経路レギュレーション状態を評価するための方法及び遺伝子発現サイン |
Country Status (4)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US8392127B2 (ja) |
EP (1) | EP2265943A4 (ja) |
JP (1) | JP2011515088A (ja) |
WO (1) | WO2009120561A2 (ja) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2015076213A1 (ja) * | 2013-11-22 | 2015-05-28 | 独立行政法人国立成育医療研究センター | 急性リンパ芽球性白血病の新規キメラ遺伝子atf7ip-pdgfrb |
JP2018500010A (ja) * | 2014-11-12 | 2018-01-11 | 日立化成株式会社 | 臓器障害を診断するための方法および装置 |
Families Citing this family (18)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2013508835A (ja) * | 2009-10-21 | 2013-03-07 | ビーエーエスエフ プラント サイエンス カンパニー ゲーエムベーハー | バイオマーカー参照パターンを作成する方法 |
WO2011073901A1 (en) * | 2009-12-14 | 2011-06-23 | Koninklijke Philips Electronics N.V. | Novel tumor markers |
EP3450979A3 (en) * | 2010-03-17 | 2019-04-24 | The Regents of The University of Michigan | Using phage epitopes to profile the immune response |
EP2439282A1 (en) * | 2010-10-06 | 2012-04-11 | bioMérieux | Method for determining a biological pathway activity |
MX2013010977A (es) | 2011-03-31 | 2013-10-30 | Procter & Gamble | Sistema, modelos y metodos para identificar y evaluar agentes dermoactivos eficaces para tratar la caspa/dermatitis seborreica. |
CN102789550B (zh) * | 2011-05-17 | 2015-11-25 | 中国科学院上海生命科学研究院 | 一种利用跨物种相似性的元分析方法 |
EP2773191A2 (en) * | 2011-10-31 | 2014-09-10 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Alzheimer's disease signature markers and methods of use |
EP2859486A2 (en) | 2012-06-06 | 2015-04-15 | The Procter & Gamble Company | Systems and methods for identifying cosmetic agents for hair/scalp care compositions |
US9336302B1 (en) | 2012-07-20 | 2016-05-10 | Zuci Realty Llc | Insight and algorithmic clustering for automated synthesis |
WO2014182330A1 (en) | 2013-05-06 | 2014-11-13 | Hitachi Chemical Company Ltd | Devices and methods for capturing target molecules |
US10378059B2 (en) * | 2013-08-02 | 2019-08-13 | Tactical Therapeutics, Inc. | Methods and molecular pharmacodynamic biomarkers for multiple signaling pathways in response to carboxyamidotriazole orotate |
WO2015157970A1 (zh) * | 2014-04-17 | 2015-10-22 | 深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司 | 一种流式细胞分析仪及其多维数据分类方法、装置 |
JP6624704B2 (ja) | 2015-08-31 | 2019-12-25 | 日立化成株式会社 | 尿路上皮疾患の評価のための分子法 |
EP3364966A1 (en) | 2015-10-23 | 2018-08-29 | Daiichi Sankyo Company, Limited | Pharmaceutical composition for use in treating aml and method of treating aml in a subject in need thereof |
US11205103B2 (en) | 2016-12-09 | 2021-12-21 | The Research Foundation for the State University | Semisupervised autoencoder for sentiment analysis |
CN114173783A (zh) * | 2019-08-30 | 2022-03-11 | 新加坡科技研究局 | 促进运动神经元的存活和/或功能的方法及相关试剂、用途和方法 |
CN112899351B (zh) * | 2021-02-03 | 2022-08-26 | 东华大学 | 一种双重荧光定量pcr检测pdx模型小鼠细胞浸润状态试剂盒 |
CN115688028B (zh) * | 2023-01-05 | 2023-08-01 | 杭州华得森生物技术有限公司 | 肿瘤细胞生长状态检测设备 |
Family Cites Families (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2002095000A2 (en) * | 2001-05-22 | 2002-11-28 | Gene Logic, Inc. | Molecular toxicology modeling |
WO2002101357A2 (en) | 2001-06-10 | 2002-12-19 | Irm Llc | Molecular signatures of commonly fatal carcinomas |
US20050084872A1 (en) | 2003-01-24 | 2005-04-21 | Lum Pek Y. | Methods for determining whether an agent possesses a defined biological activity |
JP2007516693A (ja) | 2003-06-09 | 2007-06-28 | ザ・リージェンツ・オブ・ザ・ユニバーシティ・オブ・ミシガン | 癌の治療および診断のための組成物および方法 |
WO2006124836A1 (en) * | 2005-05-13 | 2006-11-23 | Duke University | Gene expression signatures for oncogenic pathway deregulation |
US20070172844A1 (en) * | 2005-09-28 | 2007-07-26 | University Of South Florida | Individualized cancer treatments |
US7955848B2 (en) | 2006-04-03 | 2011-06-07 | Trustees Of Dartmouth College | MicroRNA biomarkers for human breast and lung cancer |
-
2009
- 2009-03-19 JP JP2011500943A patent/JP2011515088A/ja not_active Withdrawn
- 2009-03-19 US US12/933,936 patent/US8392127B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2009-03-19 EP EP09725938A patent/EP2265943A4/en not_active Withdrawn
- 2009-03-19 WO PCT/US2009/037598 patent/WO2009120561A2/en active Application Filing
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2015076213A1 (ja) * | 2013-11-22 | 2015-05-28 | 独立行政法人国立成育医療研究センター | 急性リンパ芽球性白血病の新規キメラ遺伝子atf7ip-pdgfrb |
JP2018500010A (ja) * | 2014-11-12 | 2018-01-11 | 日立化成株式会社 | 臓器障害を診断するための方法および装置 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US20110015869A1 (en) | 2011-01-20 |
WO2009120561A2 (en) | 2009-10-01 |
WO2009120561A3 (en) | 2010-08-12 |
EP2265943A2 (en) | 2010-12-29 |
EP2265943A4 (en) | 2011-09-14 |
US8392127B2 (en) | 2013-03-05 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP2011515088A (ja) | 増殖因子シグナル伝達経路レギュレーション状態を評価するための方法及び遺伝子発現サイン | |
Cavalli et al. | Intertumoral heterogeneity within medulloblastoma subgroups | |
JP7186700B2 (ja) | 腫瘍抑制foxo活性を酸化ストレスから区別する方法 | |
Cooper et al. | The proneural molecular signature is enriched in oligodendrogliomas and predicts improved survival among diffuse gliomas | |
EP2419540B1 (en) | Methods and gene expression signature for assessing ras pathway activity | |
US10181009B2 (en) | Methods and systems for predicting cancer outcome | |
JP6404304B2 (ja) | メラノーマ癌の予後予測 | |
US20240110249A1 (en) | Method of diagnosis, staging and monitoring of melanoma using microrna gene expression | |
Wan et al. | Hybrid models identified a 12-gene signature for lung cancer prognosis and chemoresponse prediction | |
Chen et al. | Identifying methylation pattern and genes associated with breast cancer subtypes | |
US20130332083A1 (en) | Gene Marker Sets And Methods For Classification Of Cancer Patients | |
US8030060B2 (en) | Gene signature for diagnosis and prognosis of breast cancer and ovarian cancer | |
JP2008536094A (ja) | 乳癌患者における化学療法反応性を予測する方法 | |
Chen | Key aspects of analyzing microarray gene-expression data | |
EP2406729B1 (en) | A method, system and computer program product for the systematic evaluation of the prognostic properties of gene pairs for medical conditions. | |
US20120077687A1 (en) | Prognostic and predictive gene signature for non-small cell lung cancer and adjuvant chemotherapy | |
Luu et al. | Intertumoral Heterogeneity within Medulloblastoma Subgroups | |
Yeatman et al. | Methods and systems for predicting cancer outcome | |
Sarmah | Microarray gene expression: towards integration and between-platform association of affymetrix and cDNA arrays | |
Paquet | Towards individualized assessment of patient benefit from treatment and prognosis in breast cancer |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A300 | Application deemed to be withdrawn because no request for examination was validly filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A300 Effective date: 20120605 |