CN114173783A - 促进运动神经元的存活和/或功能的方法及相关试剂、用途和方法 - Google Patents

Abstract

提供了一种促进肌萎缩侧索硬化(ALS)或ALS样运动神经元存活和/或功能的方法，该方法包括将运动神经元与能够减少线粒体蛋白质乙酰化的试剂，特别是选自脱乙酰酶激活剂例如烟酰胺(NAM)和7‑羟基‑3‑(4'‑甲氧基苯基)香豆素(C12)，或乙酰转移酶抑制剂例如SEQ ID NO:1的GCN5L1 siRNA的试剂接触。还提供了相关试剂、寡核苷酸、用途和鉴定试剂的方法。

Description

促进运动神经元的存活和/或功能的方法及相关试剂、用途和 方法

发明领域

本公开广泛涉及促进运动神经元(例如肌萎缩侧索硬化(ALS)或ALS样运动神经元)的存活和/或功能的方法，以及相关试剂、用途和方法。

发明背景

运动神经元疾病是一组影响运动神经元的神经退行性疾病。其中，肌萎缩侧索硬化症(ALS)是一种年龄发病的、进行性神经退行性病症，影响上下运动神经元(MN)。

在ALS中，MN的丧失导致骨骼肌失神经支配，导致肌肉僵硬和肌肉萎缩，并影响患者的言语、吞咽、行走和呼吸。疾病进展迅速且持续，最终导致死亡。利鲁唑(Riluzole)和依达拉奉(Edaravone)是FDA批准的用于治疗ALS的仅有的两种药物，疗效轻微。发现利鲁唑在延髓发病性ALS患者中有效，而在肢体发病性ALS受试者中无效，而肢体发病性ALS受试者占ALS患者的大多数。平均而言，利鲁唑可延长3个月的寿命，而依达拉奉仅对一小部分ALS患者有效。尽管进行了广泛的研究，但尚未找到有效的治疗方法，至少部分原因是对ALS的发病机制缺乏了解。

大多数ALS病例(高达90％)为散发性，其病因基本未知。其余ALS患者为该疾病的家族性形式，其中例如SOD1、C9ORF72和TDP43的基因中的突变最为常见。尽管存在遗传差异，但散发性ALS患者和家族性ALS患者的临床表现不能辨别，提示可能存在一种汇聚性致病机制。然而，在散发性和家族性ALS中两者中的共同致病性节点可能为两种ALS类型的新型ALS治疗奠定基础，目前尚不清楚。

因此，需要提供促进诸如肌萎缩侧索硬化(ALS)等运动神经元疾病中运动神经元的存活和/或功能的替代方法，以及相关药剂、用途和方法。

发明概述

在一个方面，提供了一种促进肌萎缩侧索硬化(ALS)或ALS样运动神经元的存活和/或功能的方法，该方法包括将运动神经元与能够减少线粒体蛋白质乙酰化的试剂接触。

在一个实施方案中，所述试剂选自由以下组成的组：脱乙酰酶激活剂、乙酰转移酶抑制剂及其组合。

在一个实施方案中，脱乙酰酶激活剂包括SIRT3(Sirtuin 3)激活剂。

在一个实施方案中，SIRT3激活剂选自由以下组成的组：小分子、NAD(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)或其前体、及其组合。

在一个实施方案中，小分子选自由以下组成的组：7-羟基-3-(4'-甲氧基苯基)香豆素(C12)、和厚朴酚、二氢杨梅酮(DHM)及其衍生物、类似物和组合。

在一个实施方案中，NAD前体选自由以下组成的组：色氨酸、喹啉酸、烟酸(NA)、烟酰胺(Nam)、烟酰胺单核苷酸(NMN)烟酰胺核糖核苷(NR)、烟酸及其衍生物、类似物和组合。

在一个实施方案中，乙酰转移酶抑制剂包括GCN5L1(GCN5(氨基酸合成之一般控制5)-样1)抑制剂。

在一个实施方案中，GCN5L1抑制剂包括寡核苷酸。

在一个实施方案中，寡核苷酸选自由以下组成的组：反义寡核苷酸(ASO)、gapmer、短干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、微小RNA(miRNA)、向导RNA(gRNA)、单向导RNA(sgRNA)及其组合。

在一个实施方案中，寡核苷酸包含：a)与BLOC1S1基因的编码序列(CDS)或其部分，或者SEQ ID NO:3或其部分，或者SEQ ID NO:4或其部分互补的序列；或者b)与a)中的序列共享至少约75％序列同一性的序列。

在一个实施方案中，寡核苷酸包含与SEQ ID NO:1共享至少约75％序列同一性的序列，或者与SEQ ID NO:1相差约一个核苷酸、约两个核苷酸、约三个核苷酸、约四个核苷酸或约五个核苷酸的序列。

在一个方面，提供了一种能够减少线粒体蛋白质乙酰化的试剂/药剂，用于治疗ALS或ALS样疾病。

在一个实施方案中，该试剂选自由以下组成的组：脱乙酰酶激活剂、乙酰转移酶抑制剂及其组合。

在一个实施方案中，脱乙酰酶激活剂包括SIRT3激活剂，任选地其中SIRT3激活剂自由以下组成的组：小分子、NAD或其前体、及其组合，任选地其中小分子选自：C12、和厚朴酚、二氢杨梅酮(DHM)及其衍生物、类似物和组合，任选地其中NAD前体选自色氨酸、喹啉酸、烟酸(NA)、烟酰胺(Nam)、烟酰胺单核苷酸(NMN)烟酰胺核糖核苷(NR)、烟酸及其衍生物、类似物和组合。

在一个实施方案中，乙酰转移酶抑制剂包括GCN5L1抑制剂，任选地其中GCN5L1抑制剂包括寡核苷酸，任选地其中寡核苷酸选自由以下组成的组：反义寡核苷酸(ASO)、gapmer、短干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、微小RNA(miRNA)、向导RNA(gRNA)、单向导RNA(sgRNA)及其组合，任选地其中所述寡核苷酸包含：a)与BLOC1S1基因的CDS或其部分，或者SEQ ID NO:3或其部分，或者SEQ ID NO:4或其部分互补的序列；或者与a)中的序列共享至少约75％序列同一性的序列，任选地其中寡核苷酸包含与SEQ ID NO:1共享至少约75％序列同一性的序列，或者与SEQ ID NO:1相差约一个核苷酸、约两个核苷酸、约三个核苷酸，约四个核苷酸或约五个核苷酸的序列。

在一个方面，提供了该试剂在制备用于治疗ALS或ALS样疾病的药物中的用途。

在一个方面，提供了一种治疗受试者中的ALS或ALS样疾病的方法，该方法包括向受试者施用所述试剂。

在一个方面，提供与SEQ ID NO:1共享至少约75％序列同一性的寡核苷酸，或者与SEQ ID NO:1相差约一个核苷酸、约两个核苷酸、约三个核苷酸、约四个核苷酸或约五个核苷酸的序列。

在一个方面，提供了用于治疗的寡核苷酸。

在一个方面，提供了一种鉴定用于治疗ALS或ALS样疾病的试剂/药剂的方法，该方法包括：将ALS或ALS样运动神经元与候选试剂接触；和确定运动神经元中的线粒体蛋白乙酰化在接触后是否减少；并且其中当运动神经元中的线粒体蛋白质乙酰化在接触后减少，则得出结论该候选试剂是用于治疗ALS或ALS样疾病的试剂，其中当运动神经元中的线粒体蛋白质乙酰化在接触后未减少，则得出结论该候选试剂不是用于治疗ALS或ALS样疾病的试剂，任选地其中如此鉴定的用于治疗ALS或ALS样疾病的试剂包括如本文所述的试剂或寡核苷酸。

定义

本文使用的术语“处理”、“治疗”和“疗法”及其同义词指治疗性处理和预防性或防护性措施，其中目的是预防、减缓(减轻)或逆转包括但不限于疾病的医疗状况(如退行性疾病和/或运动神经元疾病)、症状和病症。医疗状况还包括身体对疾病或病症的应答，例如炎症。需要此类处理的对象包括已经患有医疗状况的，以及容易患上医疗状况的或需要预防医疗状况的对象。

如本文所用，术语“治疗有效量”将是能够预防、逆转或至少减缓(减轻)医学状况(例如运动神经元疾病、自身免疫疾病、炎症和癌症)的活性剂的量。本公开的试剂、化合物、组合物和制剂的剂量和施用可由临床药理学或药代动力学领域的普通技术人员确定。例如，参见Mordenti和Rescigno,(1992)Pharmaceutical Research.9:17-25；Morenti等人,(1991)Pharmaceutical Research.8:1351-1359；以及Mordenti和Chappell,"The use ofinterspecies scaling in toxicokinetics"于Toxicokinetics and New DrugDevelopment,Yacobi等人(eds)(Pergamon Press:NY,1989),pp.42-96。将治疗性应用的本公开的活性剂的有效量将取决于例如治疗目的、施用途径和受试者的状况。因此，可能需要治疗师根据需要滴定剂量并修改施用途径，以获得最佳治疗效果。

本文使用的术语“受试者”包括患者和非患者。术语“患者”指患有或可能患有医疗状况例如运动神经元疾病的个体，而“非患者”指未患有或可能不会患有医疗状况的个体。“非患者”包括健康个体、非患病个体和/或无医疗状况的个体。“受试者”一词包括人和动物。动物包括鼠类等等。“鼠”指鼠科的任何哺乳动物，如小鼠、大鼠等。

本文中使用的术语“微(micro)”将被广义地解释为包括从约1微米到约1000微米的维度。

本文中使用的术语“纳(nano)”将被广义地解释为包括小于约1000nm的维度。

本文中使用的术语“颗粒”广泛地指离散实体或离散体。本文所述颗粒可包括有机、无机或生物颗粒。本文所述的颗粒也可以是由多个子颗粒或小物体的碎片的聚集体形成的宏观颗粒。本公开的颗粒可以是球形、基本球形或非球形，例如不规则形状的颗粒或椭球形状的颗粒。当术语“尺寸”用于指颗粒时，广义上指颗粒的最大尺寸。例如，当颗粒基本上是球形时，术语“尺寸”可指颗粒的直径；或者，当颗粒基本上为非球形时，术语“尺寸”可指颗粒的最大长度。

除非另有说明，否则本说明书中使用的术语“偶联”或“连接”旨在涵盖直接连接或通过一个或多个中间手段连接。

本文在提及两个要素时使用的术语“关联”指两个要素之间的广泛关系。这种关系包括但不限于物理、化学或生物关系。例如，当要素A与要素B关联时，要素A和B可以直接或间接地彼此附接，或者要素A可以包含要素B，反之亦然。

当提及两个要素时，本文中使用的术语“相邻”指的是一个要素与另一个要素非常接近，并且可以是但不限于彼此接触的要素，或者可以进一步包括由布置在它们之间的一个或多个其他要素分隔的要素。

术语“和/或”，例如“X和/或Y”被理解为是指“X和Y”或“X或Y”，并且应被视为对两种含义或其中任一种含义提供明确支持。

此外，在本文的描述中，无论何时使用“基本上”一词都被理解为包括但不限于“完全地”或“彻底地”等。此外，无论何时使用诸如“包括”、“包含”等术语旨在作为非限制性描述语言，因为它们广泛地包括在这些术语之后引述的要素/组分，以及未明确引述的其他组分。例如，当使用“包括”时，对“一个”特征的引用也意图是对该特征的“至少一个”的引用。在适当的上下文中，诸如“组成”、“构成”等术语可被视为诸如“包括”、“包含”等术语的子集。因此，在使用诸如“包括”、“包含”等术语的本文所公开的实施方案中，应理解这些实施方案提供了使用诸如“组成”、“构成”等术语的相应实施方案的教导。此外，无论何时使用诸如“约”、“大约”等术语通常意味着合理的变化，例如所公开值的+/-5％的变化，或所公开值的4％的变化，或公开值的3％的变化，公开值的2％的变化或公开值的1％的变化。

此外，在本文的说明书中，某些值可以公开为一定范围内。显示范围端点的值旨在说明优选的范围。每当描述范围，该范围意图涵盖并教导所有可能的子范围以及该范围内的单个数值。也就是说，范围的终点不应被解释为不灵活的限制。例如，对1％到5％范围的描述旨在具体地公开子范围1％到2％、1％到3％、1％到4％、2％到3％等，以及单独公开该范围内的值，例如1％、2％、3％、4％和5％。应了解，范围内的单独数值还包括整数、分数和小数。此外，每当描述范围时，该范围也意图涵盖并教导从所示数字端点开始多至2个额外的小数位或有效数字(如适用)的值。例如，对1％到5％范围的描述旨在具体地公开范围1.00％到5.00％以及1.0％到5.0％及跨越范围的所有其中间值(例如1.01％、1.02％…4.98％、4.99％、5.00％和1.1％、1.2％…4.8％、4.9％、5.0％等)。上述具体公开内容的意图适用于范围的任何深度/广度。

另外，当描述一些实施方案时，本公开可能已经公开了作为特定步骤序列的方法和/或过程。然而，除非另有要求，否则将理解，方法或过程不应限于所公开的特定步骤序列。其他步骤序列也是可能的。本文公开的步骤的特定顺序不应被解释为不适当的限制。除非另有要求，否则本文公开的方法和/或过程不应限于以书面顺序执行的步骤。步骤的序列可以改变，并且仍然在本发明的范围内。

此外，应当理解虽然本公开提供了具有本文讨论的一个或多个特征/特点的实施方案，这些特征/特点中的一个或多个也可以在其他替代实施方案中被排除，并且本公开提供了对这些排除和这些相关的替代实施方案的支持。

实施方案的描述

下文公开了促进运动神经元的存活和/或功能的方法，以及相关方法、用途、试剂和组合物的示例性、非限制性实施方案。

在各种实施方案中，提供了一种促进运动神经元的存活和/或功能的方法，该方法包括调控/调节运动神经元中线粒体产物的乙酰化。在一些实施方案中，该方法是促进运动神经元的存活的方法。该方法的实施方案可增加细胞/运动神经元的活力，和/或减少细胞损失/运动神经元损失。在一些实施方案中，该方法是促进/改善运动神经元的功能(任选代谢功能)的方法。该方法的实施方案可至少在一定程度上恢复运动神经元中的适当功能，任选代谢功能和/或线粒体功能。例如，该方法的实施方案可恢复运动神经元中的适当功能，任选代谢和/或线粒体功能，使得该功能类似于或更接近于健康/正常运动神经元中的功能。在一些实施方案中，调控/调节线粒体产物的乙酰化包括减少/抑制线粒体产物的乙酰化。在一些实施方案中，线粒体产物包含线粒体蛋白质。在不受理论的约束，认为运动神经元中线粒体产物(例如线粒体蛋白)的增加的乙酰化或超乙酰化导致运动神经元中代谢缺陷或线粒体呼吸缺陷，从而导致其死亡。在某些运动神经元疾病，如肌萎缩侧索硬化症中，可观察到线粒体产物(例如线粒体蛋白)的超乙酰化。

因此，在各种实施方案中，提供了一种促进运动神经元疾病中运动神经元的存活和/或功能的方法，该方法包括减少/抑制运动神经元中线粒体蛋白质的乙酰化。运动神经元疾病的实例包括肌萎缩侧索硬化症、原发性侧索硬化症、进行性延髓麻痹症、假性延髓麻痹症、进行性肌萎缩症、脊髓性肌萎缩症、肯尼迪病和脊髓灰质炎后综合征。在一个实施方案中，运动神经元疾病包括肌萎缩侧索硬化症(ALS)或ALS样疾病。ALS样疾病可能是一种具有或以运动神经元中线粒体蛋白质乙酰化的增加/过度或超乙酰化为特征的疾病，导致代谢缺陷和运动神经元死亡。例如，通过测量患病运动神经元中线粒体蛋白乙酰化的水平/相对水平并将乙酰化的水平与对照运动神经元(例如，非患病运动神经元或健康运动神经元)的水平进行比较，可以识别ALS样疾病，其中，如果与对照运动神经元的水平相比，患病运动神经元表现出乙酰化的增加/升高的水平/相对水平，则该疾病可归类为或被视为ALS样疾病。因此，在一些实施方案中，该方法可进一步包括测量/确定运动神经元中线粒体蛋白质乙酰化的步骤。在测量/确定与对照运动神经元的水平相比，运动神经元具有乙酰化的增加/升高的水平/相对水平的情况下，该运动神经元中线粒体蛋白质乙酰化可随后得到减少或抑制，以促进运动神经元的存活和/或功能。

在各种实施方案中，减少运动神经元中线粒体蛋白质乙酰化包括减少运动神经元中乙酰化的线粒体蛋白质的量/分数/百分比和/或减少运动神经元中线粒体蛋白质内的乙酰化程度(例如，乙酰化位点的数量)。在一些实施方案中，乙酰化包括赖氨酸乙酰化。在各种实施方案中，可以减少/降低至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％，至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约99％或至少约100％。在一些实施方案中，减少至少约25％。在各种实例中，通过诸如烟酰胺(Nam)、7-羟基-3-(4'-甲氧基苯基)香豆素(C12)和GCN5L1 siRNA的试剂所实现的线粒体蛋白质乙酰化的降低程度为至少约为25％。

在各种实施方案中，运动神经元中线粒体蛋白质乙酰化可通过将运动神经元与试剂接触而减少。该试剂可减少运动神经元中乙酰化的线粒体蛋白质的量/分数/百分比和/或可减少运动神经元中线粒体蛋白质内的乙酰化程度。“试剂”可以是运动神经元可能暴露到的任何物质(物理、化学、生物等)，例如为了减少运动神经元中的线粒体蛋白质乙酰化。“试剂”的非限制性实例包括化学品、化合物、组合物分子、小分子、核酸序列、核酸类似物、蛋白质、肽、适配体、抗体或其片段。“试剂”一词绝不排除使用两种或更多种此类试剂。因此，术语“试剂”还包括混合物、融合、组合、组合物和缀合物，例如，任何化学品、化合物、组合物、分子、小分子、核酸序列、核酸类似物、蛋白质、肽、适配体、抗体或其片段等的混合物、融合、组合、组合物和缀合物。

核酸序列可以是RNA和/或DNA，并且可以是单链或双链。在一个实例中，核酸序列包含寡核苷酸。核酸序列可由天然碱基、化学修饰的碱基、人工碱基、核苷酸类似物及其组合组成。核酸序列还可包括对其核糖或糖部分的修饰(一种或多种)和/或对其磷酸键部分或磷酸二酯键的修饰(一种或多种)。核糖或糖修饰的实例包括对核糖环的2'位置，例如2'-氨基、2'-氟、2'-O-甲基和2'-O-甲氧基乙基的修饰。修饰的磷酸键部分或磷酸二酯键的非限制性示例包括硫代磷酸酯键、硼磷酸酯键(boranophosphate)、甲基膦酸酯、硫代磷酸酯类似物、三唑键的替换等。在一个实例中，核酸序列包含磷酰胺核苷酸。

核酸类似物的非限制性实例包括肽核酸(PNA)、伪互补PNA(pc-PNA)、锁核酸(LNA)、吗啉核苷酸、苏糖核酸(TNA)、二醇核酸(GNA)、阿拉伯糖核酸(ANA)、2'-脱氧-2'-氟-β-D-阿拉伯糖核酸(2'F-ANA)，2'-氟阿拉伯糖核酸(FANA)，2'-脱氧-2'-氟核糖核酸(2'-FRNA或FRNA)环己烯核酸(CeNA)、脱水己醇核酸(HNA)、解锁核酸(UNA)、乙烯桥联核酸(ENA)，(4'→6')连接的低聚2'，3’-二脱氧-β-D-吡喃葡萄糖核酸(homo-DNA或hDNA)、木糖核酸(XyNA)、脱氧木糖核酸(dXyNA)、氨基烯丙基尿苷(aa UTP)、N3'→P5'-磷酸酰胺(NP)、三环DNA(tcDNA)、磷酸二酰胺吗啉(PMO)及其衍生物等。

蛋白质的非限制性实例包括突变蛋白质、基因工程蛋白质、肽、合成肽、重组蛋白质、嵌合蛋白质、抗体、人源化蛋白质、修饰蛋白质及其片段(例如抗原结合片段)。如本文所用，术语“抗体”指免疫球蛋白或其片段，并涵盖包含抗原结合片段或抗原结合域的任何多肽。该术语包括但不限于多克隆、单克隆、单特异性、多特异性(例如双特异性)、人源化、人、单链、嵌合、合成、重组、杂交、突变、移植和体外产生的抗体。术语“抗体”可包括抗体片段，例如Fab、F(ab')2、Fv、scFv、Fd、dAb和保留抗原结合功能的其他抗体片段。抗体不一定来自任何特定来源，也不是通过任何特定方法产生的。

在各种实施方案中，运动神经元可为天然存在或非天然存在/工程化(例如，iPSC衍生的运动神经元)。通常，运动神经元包括上运动神经元和下运动神经元。

因此，在各种实施方案中，提供了一种促进ALS或ALS样运动神经元的存活和/或功能的方法，该方法包括将运动神经元与能够减少线粒体蛋白质乙酰化的试剂接触。

在各种实施方案中，ALS或ALS样运动神经元具有或以线粒体蛋白质的增加/过度乙酰化或超乙酰化为特征。在各种实例中，ALS或ALS样运动神经元中线粒体蛋白质的乙酰化水平或乙酰化的线粒体蛋白质(例如，乙酰赖氨酸蛋白质或锰超氧化物歧化酶上的乙酰赖氨酸68(MnSOD K68ac))的表达/信号是对照/健康运动神经元(例如，非ALS运动神经元或非ALS样运动神经元)的超过约1倍、例如至少约1.05倍、至少约1.1倍、至少约1.15倍、至少约1.2倍、至少约1.25倍、至少约1.3倍、至少约1.35倍、至少约1.4倍、至少约1.45倍、至少约1.5倍、至少约1.55倍、至少约1.6倍、至少约1.65倍、至少约1.7倍、至少约1.75倍、至少约1.8倍、至少约1.85倍、至少约1.9倍、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约3.5倍、至少约4倍、至少约4.5倍、至少约5倍、至少约5.5倍、至少约6倍、至少约6.5倍、至少约7倍、至少约7.5倍、至少约8倍、至少约8.5倍、至少约9倍、至少约9.5倍或至少约10倍。在各种实施方案中，ALS或ALS样运动神经元包括以下一个或多个特性：选自SOD1(例如G93A、A4V、L144F等)、TDP43(例如G298S)、C9ORF72(例如扩展的GGCC重复)以及其他如FUS、HNRNPA1、VAPB等的一个或多个基因中突变，线粒体功能障碍、代谢呼吸缺陷、相比于对照/健康运动神经元的形态学改变、相比于对照/健康运动神经元的线粒体异常的线粒体形态学、相对于对照/健康运动神经元加速的死亡表型，相比于对照/健康运动神经元降低的基础存活，相对于对照/健康运动神经元升高的内质网(ER)应激，相对于对照/健康运动神经元CHOP基因的上调/增加表达，相对于对照/健康运动神经元剪接的XBP1(sXBP1)的上调/增加表达，相对于对照/健康运动神经元减少的基础呼吸，相对于对照/健康运动神经元降低的ATP相联氧消耗率(OCR)，相对于对照/健康运动神经元减少的ATP产生，相对于对照/健康运动神经元减少的备用呼吸能力，相对于对照/健康运动神经元增加的细胞外酸化率(ECAR)，相对于对照/健康运动神经元增加的糖酵解，相对于对照/健康运动神经元增加的糖酵解能力，相对于对照/健康运动神经元减少/受损的氧化磷酸化，相对于对照/健康运动神经元减少的脱乙酰酶表达和/或活性(sirtuin如SIRT3)，相对于对照/健康运动神经元降低的复合物I活性，相对于对照/健康运动神经元降低的线粒体NAD⁺水平(例如，至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％或至少约80％)，相对于对照/健康运动神经元升高/增加的线粒体自噬，相对于对照/健康运动神经元减少的胞体尺寸；相对于对照/健康运动神经元减少的初级/初始神经突以及相对于对照/健康运动神经元的超兴奋性。在一些实施方案中，相对于对照/健康运动神经元，ALS或ALS样运动神经元中的上述一个或多个特性(例如，基因的表达、基础存活、ATP产生、备用呼吸能力等)的变化(例如增加或减少)为至少约5％、至少约10％、至少约15％，至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％，至少约99％或至少约100％。在一些实施方案中，变化是至少约0.1倍、至少约0.2倍、至少约0.3倍、至少约0.4倍、至少约0.5倍、至少约0.6倍、至少约0.7倍、至少约0.8倍或至少约0.9倍。在一些实施方案中，变化是超过约1倍，例如至少约1.05倍、至少约1.1倍、至少约1.15倍、至少约1.2倍、至少约1.25倍、至少约1.3倍、至少约1.35倍、至少约1.4倍、至少约1.45倍、至少约1.5倍，至少约1.55倍、至少约1.6倍、至少约1.65倍、至少约1.7倍、至少约1.75倍、至少约1.8倍、至少约1.85倍、至少约1.9倍、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约3.5倍、至少约4倍，至少约4.5倍、至少约5倍、至少约5.5倍、至少约6倍、至少约6.5倍、至少约7倍、至少约7.5倍、至少约8倍、至少约8.5倍、至少约9倍、至少约9.5倍或至少约10倍。在一个实施方案中，与对照/健康运动神经元相比，ALS或ALS样运动神经元未显示SIRT3的差异表达、实质性升高的表达或实质性降低的表达。在一个实施方案中，ALS或ALS样运动神经元中的SIRT3表达与对照/健康运动神经元中的SIRT3表达基本相似或可比。

在各种实施方案中，ALS可以是散发性ALS和/或家族性ALS。

在各种实施方案中，线粒体蛋白质包含能够定位至运动神经元线粒体的蛋白质或其亚基。在一些实施方案中，线粒体蛋白质包含在线粒体中从线粒体DNA(或线粒体编码)合成的蛋白质或其亚基。在一些实施方案中，线粒体蛋白质包含导入线粒体的在线粒体外部合成的蛋白质或其亚基。术语“蛋白质”包括任何氨基酸链，例如蛋白质、肽、多肽和缀合蛋白质，例如糖蛋白、脂蛋白、磷蛋白、金属蛋白、细胞色素等。在一些实施方案中，线粒体蛋白质包含酶。在一些实施方案中，线粒体蛋白质包含代谢酶。在一些实施方案中，线粒体蛋白质包含抗氧化酶。在一些实施方案中，线粒体蛋白参与以下一个或多个途径：细胞死亡、氧化磷酸化、能量生成、脂肪酸代谢、糖代谢和氨基酸代谢。在一些实施方案中，线粒体蛋白与脱乙酰酶(任选sirtuin，任选SIRT3)相互作用或是所述脱乙酰酶的靶标(例如，直接或间接下游靶标)。在一些实施方案中，线粒体蛋白与乙酰转移酶(任选GCN5L1(GCN5(氨基酸合成之一般控制5)-样1)相互作用或是所述乙酰转移酶的靶标(例如，直接或间接下游靶标)。在一些实施方案中，线粒体蛋白质包含锰超氧化物歧化酶(MnSOD)。在一些实施方案中，线粒体蛋白质乙酰化包括赖氨酸乙酰化。在一些实施方案中，线粒体蛋白质乙酰化包括在锰超氧化物歧化酶上的赖氨酸68的乙酰化(MnSOD K68ac)。在各种实例中，对健康和散发性ALSiPSC衍生运动神经元进行的微阵列/基因表达分析显示上述一条或多条途径的过表达。计算机结合预测可能表明缺陷线粒体导致散发性ALS发病机制。

在各种实施方案中，减少/抑制线粒体蛋白质乙酰化包括增加脱乙酰酶的表达和/或活性。在一些实施方案中，减少/抑制线粒体蛋白质乙酰化不包括增加脱乙酰酶的表达或仅增加脱乙酰酶的表达，例如，没有脱乙酰酶活性的增加或伴随增加。在各种实施方案中，减少/抑制线粒体产物乙酰化包括减少/抑制乙酰转移酶的表达和/或活性。因此，在各种实施方案中，该试剂选自由以下组成的组：脱乙酰酶激活剂或激动剂、乙酰转移酶抑制剂或拮抗剂及其组合。

在一些实施方案中，脱乙酰酶包含线粒体富集的脱乙酰酶。在一些实施方案中，脱乙酰酶包含主要线粒体脱乙酰酶。在一些实施方案中，诱导或增加ALS或ALS样运动神经元中的脱乙酰酶活性拯救疾病表型和/或代谢缺陷。在一些实施方案中，脱乙酰酶包含NAD⁺依赖性脱乙酰酶。在一些实施方案中，脱乙酰酶包含来自sirtuin家族的蛋白质。sirtuin家族可包括SIRT1、SIRT2、SIRT3、SIRT4、SIRT5、SIRT6和SIRT7，其可被分配到五个子类(I、II、III、IV和U)。在一些实施方案中，脱乙酰酶包含线粒体sirtuin。在一些实施方案中，线粒体sirtuin选自由以下组成的组：SIRT3、SIRT4、SIRT5及其组合。在一个实施方案中，脱乙酰酶包含SIRT3。在各种实例中，将ALS小鼠中的SIRT3水平与健康小鼠中的SIRT3水平进行比较，并将人类健康脊髓中的SIRT3水平与ALS死后脊髓中的SIRT3水平进行比较。在这些实例中，在人类中发现ALS脊髓中SIRT3 mRNA和蛋白质增加。由于SIRT3是一种酶，其活性可能比单独仅其表达水平更具信息性。在各种实例中，在ALS iPSC衍生的运动神经元中发现相似的SIRT3蛋白水平，即使SIRT3活性大大降低。在各种实例中，SIRT3功能丧失导致ALS表型。

因此，在各种实施方案中，脱乙酰酶激活剂包含SIRT3激活剂。SIRT3激活剂可促进SIRT3下游靶标的脱乙酰化。在一些实施方案中，SIRT3激活剂可促进线粒体蛋白质的脱乙酰化。在一些实施方案中，SIRT3激活剂可促进锰超氧化物歧化酶(MnSOD)的脱乙酰化。在一些实施方案中，SIRT3激活剂可促进锰超氧化物歧化酶上的赖氨素68(MnSOD K68ac)的脱乙酰化。在各种实施方案中，SIRT3激活剂可降低线粒体蛋白质MnSOD和/或MnSOD K68ac的乙酰化水平。在各种实施方案中，降低/减少为至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约99％或至少约100％。

在一些实施方案中，SIRT3激活剂包括SIRT3的辅因子和/或共底物。在一些实施方案中，SIRT3激活剂包括NAD⁺和/或NAD⁺前体，或其类似物、衍生物和组合。在各种实施方案中，NAD⁺前体选自由色氨酸、喹啉酸、烟酸(NA)、烟酰胺(Nam)、烟酰胺单核苷酸(NMN)烟酰胺核糖核苷(NR)、烟酸及其衍生物、类似物和组合组成的组。在一些实施方案中，NAD⁺前体包含维生素B3或烟酸，或其类似物、衍生物和组合。在一些实施方案中，维生素B3或烟酸选自由NA、Nam、NR及其组合组成的组。在一些实施方案中，方法包括将运动神经元与能够减少线粒体蛋白质乙酰化的食物(例如用于医疗目的的食物)接触。食物的实例包括保健食物、食物添加剂、食物补充剂、膳食补充剂、营养补充剂、营养素、维生素和/或营养制剂。在各种实例中，在星形胶质细胞和运动神经元的共培养模型中，增加ALS星形胶质细胞中的NAD+水平降低星形胶质细胞介导的毒性。

在各种实施方案中，SIRT3激活剂、NAD⁺或NAD⁺前体能够将运动神经元线粒体中的NAD⁺水平增加至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约99％或至少约100％。在各种实施方案中，SIRT3激活剂、NAD⁺或NAD⁺前体能够将运动神经元线粒体中的NAD⁺水平增加到超过约1倍，例如至少约1.05倍、至少约1.1倍、至少约1.15倍、至少约1.2倍、至少约1.25倍、至少约1.3倍，至少约1.35倍、至少约1.4倍、至少约1.45倍、至少约1.5倍、至少约1.55倍、至少约1.6倍、至少约1.65倍、至少约1.7倍、至少约1.75倍、至少约1.8倍、至少约1.85倍、至少约1.9倍、至少约2倍，至少约2.5倍、至少约3倍、至少约3.5倍、至少约4倍、至少约4.5倍、至少约5倍、至少约5.5倍、至少约6倍、至少约6.5倍、至少约7倍、至少约7.5倍、至少约8倍、至少约8.5倍，至少约9倍至少约9.5倍或至少约10倍。

在各种实施方案中，SIRT3激活剂、NAD⁺或NAD⁺前体的浓度为约0.01mM至约10mM、约0.05mM至约5mM、约0.07mM至约3mM、约0.08mM至约2mM、约0.1mM至约1mM、约0.2mM至约0.8mM，约0.3mM至约0.7mM或约0.4mM至约0.6mM。在各种实施方案中，SIRT3激活剂、NAD⁺或NAD⁺前体的浓度不超过约10mM、不超过约9mM、不超过约8mM、不超过约7mM、不超过约6mM、不超过约5mM、不超过约4mM、不超过约3mM、不超过约2mM、不超过约1mM，不超过约0.9mM、不超过约0.8mM、不超过约0.7mM、不超过约0.6mM或不超过约0.5mM。在各种实施方案中，SIRT3激活剂、NAD⁺或NAD⁺前体的浓度为至少约0.01mM、至少约0.05mM、至少约0.1mM、至少约0.15mM、至少约0.2mM、至少约0.25mM、至少约0.3mM、至少约0.35mM、至少约0.4mM，至少约0.45mM或至少约0.5mM。在一个实施方案中，SIRT3激活剂或NAD⁺前体的浓度约为0.5mM。SIRT3激活剂、NAD⁺或NAD⁺前体的浓度/剂量/量可进一步变化，以实现特定运动神经元、患者、组合物和施用模式的期望应答，而对细胞或患者没有毒性或毒性最小。在各种实施方案中，SIRT3激活剂、NAD⁺或NAD⁺前体的浓度小于引起毒性的浓度，例如细胞或肝脏毒性。在各种实施方案中，SIRT3激活剂、NAD⁺或NAD⁺前体的浓度基本上不会引起毒性或引起最小毒性，例如细胞或肝脏毒性。在各种实施方案中，当将线粒体蛋白质的乙酰化水平降低期望的量所需的SIRT3激活剂、NAD⁺或NAD⁺前体的浓度/剂量/量可能导致毒性，例如细胞或肝脏毒性时，SIRT3激活剂或NAD⁺前体可在更低浓度/剂量/量下与第二/另一种试剂(例如不同的SIRT3激活剂和/或GCN5L1抑制剂)组合使用以实现乙酰化水平降低期望的量。在各种实施方案中，第二/另一种试剂基本上不影响运动神经元线粒体中的NAD⁺水平。在各种实施方案中，第二/另一种试剂不包含色氨酸、喹啉酸、烟酸(NA)、烟酰胺(Nam)、烟酰胺单核苷酸(NMN)烟酰胺核糖核苷(NR)、烟酸或其衍生物或类似物。在一些实施方案中，第二/另一种试剂包含GCN5L1抑制剂。在一些实施方案中，试剂或SIRT3激活剂不包含如下/由如下组成：维生素B3或烟酸或食物，例如作为激活SIRT3或减少线粒体蛋白质乙酰化的唯一/仅有的试剂。

在各种实施方案中，SIRT3激活剂能够结合SIRT3，例如SIRT3的活性位点。在各种实施方案中，SIRT3激活剂具有对SIRT3的结合亲和力，例如高结合亲和力。在各种实施方案中，SIRT3激活剂能够改变SIRT3上活性位点的构象。在各种实施方案中，SIRT3激活剂对SIRT3具有特异性。例如，SIRT3激活剂的实施方案不能激活和/或结合另一sirtuin，例如SIRT1、SIRT2、SIRT4、SIRT5、SIRT6和/或SIRT7。在一些实施方案中，SIRT3激活剂具有低分子量。在一些实施方案中，SIRT3激活剂不超过约1500道尔顿(Da)、不超过约1400Da、不超过约1300Da、不超过约1200Da、不超过约1100Da、不超过约1000Da、不超过约900Da、不超过约800Da、不超过约700Da、不超过约600Da、不超过约500Da、不超过约400Da、不超过约300Da、不超过约200Da、不超过约100Da或不超过约50Da。在一些实施方案中，SIRT3激活剂包含小分子。小分子可包含有机化合物。小分子可以是天然化合物(例如植物基化合物)和/或化学合成/人工化合物。小分子可为类黄酮，任选为黄烷酮醇。在一些实施方案中，小分子包含小分子多酚。在一些实施方案中，小分子选自由以下组成的组：7-羟基-3-(4'-甲氧基苯基)香豆素(C12)、和厚朴酚、二氢杨梅酮(DHM)及其衍生物、类似物和组合。在一些实施方案中，小分子包含以下化学结构：

或其衍生物、类似物或组合。

如本文所用，母体分子的术语“衍生物”、“类似物”或“功能性类似物”指在结构上与母体分子相关的分子。例如，母体分子的衍生物、类似物或功能性类似物可以与母体分子共享共同的结构特征、基本结构和/或潜在化学基础。衍生物不限于从母体分子产生或获得的衍生物，尽管它可以是从母体分子产生或获得的衍生物。在一些实施方案中，衍生物至少在理论上可通过对母体分子的修饰从母体分子进行衍生。术语“衍生物”还包括母体分子的缀合物、盐、代谢物和前药(例如，在生理条件下可转化为初始化合物的修饰衍生物)。另一方面，在一些实施方案中，不必使用母体分子作为起始材料来生产或获得类似物或功能性类似物。在各种实施方案中，母体分子的衍生物、类似物或功能性类似物在一定程度上共享或至少保留与母体分子相关联的功能、化学性质、生物性质、化学活性和/或生物活性。技术人员将能够根据具体情况并在阅读本公开后识别分子的共同结构特征、基本结构和/或潜在化学基础，这些必须保持在衍生物、类似物或功能类似物中以保持功能、化学性质、生物性质、化学活性和/或生物活性。技术人员还将能够鉴定能够证明对功能、化学性质、生物性质、化学活性和/或生物活性的保留的测定法。例如，可以进行测定法例如细胞热迁移测定法(CETSA)、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析、western印迹分析、代谢通量分析MitoStress测定法、运动神经元存活测定法、酶联免疫吸附测定法(ELISA)、电泳移动迁移测定法(EMSA)、表面等离子体共振(SPR)、生物层干涉术(BLI)等以确定分子的功能、化学性质、生物性质、化学活性和/或生物活性。

在各种实施方案中，SIRT3激活剂或小分子或衍生物或类似物的浓度为约0.1μM至约100μM、约0.5μM至约50μM、约1μM至约30μM、约5μM至约15μM、约1μM至约10μM，约2μM至约8μM或约3μM至约7μM。在各种实施方案中，SIRT3激活剂或小分子或衍生物或类似物的浓度不超过约100μM、不超过约50μM、不超过约30μM、不超过约15μM、不超过约10μM、不超过约9μM，不超过约8μM、不超过约7μM、不超过约6μM或不超过约5μM。在各种实施方案中，SIRT3激活剂或小分子或衍生物或类似物的浓度为至少约0.1μM、至少约0.5μM、至少约1μM、至少约1.5μM、至少约2μM、至少约2.5μM、至少约3μM、至少约3.5μM、至少约4μM、至少约4.5μM，至少约5μM、至少约5.5μM、至少约6μM、至少约6.5μM、至少约7μM、至少约7.5μM、至少约8μM、至少约8.5μM、至少约9μM、至少约9.5μM或至少约10μM。在一个实施方案中，SIRT3激活剂或小分子或衍生物或类似物的浓度约为5μM。在一个实施方案中，SIRT3激活剂或小分子或衍生物或类似物的浓度小于约10μM。可进一步改变SIRT3激活剂或小分子或衍生物或类似物的浓度/剂量/量，以实现针对特定运动神经元、患者、组合物、SIRT3激活剂、小分子和施用方式的期望应答，且对细胞或患者无毒性或最小毒性。在各种实施方案中，SIRT3激活剂或小分子或衍生物或类似物的浓度小于对细胞或患者引起毒性的浓度。

在一些实施方案中，脱乙酰酶激活剂增加/能够增加脱乙酰酶的活性。在一些实施方案中，脱乙酰酶激活剂不增加/不能增加脱乙酰酶的表达或表达水平。

在一些实施方案中，乙酰转移酶包含线粒体富集的乙酰转移酶。在一些实施方案中，乙酰转移酶对抗脱乙酰酶(例如SIRT3)的乙酰化和/或呼吸作用。在一些实施方案中，ALS或ALS样运动神经元中乙酰转移酶的敲低或消耗拯救疾病表型和/或代谢缺陷。在一些实施方案中，乙酰转移酶包含与核乙酰转移酶氨基酸合成之一般控制5(GCN5)具有序列同源性和/或松散序列对齐的蛋白质。在一些实施方案中，乙酰转移酶包含氨基酸合成之一般控制5-样1(GCN5L1)，也称为溶酶体相关细胞器复合体1亚基1的生物发生(BLOC1S1)。

因此，在各种实施方案中，乙酰转移酶抑制剂包含GCN5L1抑制剂。在一些实施方案中，GCN5L1抑制剂可减少/抑制线粒体蛋白质的乙酰化。在一些实施方案中，GCN5L1抑制剂可减少/抑制锰超氧化物歧化酶(MnSOD)的乙酰化。在一些实施方案中，GCN5L1抑制剂可减少/抑制在锰超氧化物歧化酶上的赖氨酸68的乙酰化(MnSOD K68ac)。在各种实施方案中，GCN5L1抑制剂可减少线粒体蛋白质、MnSOD和/或MnSOD K68ac的乙酰化水平。在各种实施方案中，减少为至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％，至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约99％或至少约100％。

在一些实施方案中，乙酰转移酶抑制剂包括化学品，即化学抑制剂。化学化合物可包括有机或无机化合物。在一些实施方案中，化学抑制剂包括小分子。在一些实施方案中，乙酰转移酶抑制剂包括核酸序列。在一些实施方案中，乙酰转移酶抑制剂包括不超过约200个核苷酸/碱基，不超过约190个核苷酸/碱基，不超过约180个核苷酸/碱基，不超过约170个核苷酸/碱基，不超过约160个核苷酸/碱基，不超过约150个核苷酸/碱基，不超过约140个核苷酸/碱基，不超过约130个核苷酸/碱基，不超过约120个核苷酸/碱基，不超过约110个核苷酸/碱基，不超过约100个核苷酸/碱基，不超过约90个核苷酸/碱基，不超过约80个核苷酸/碱基，不超过约70个核苷酸/碱基，不超过约60个核苷酸/碱基，不超过约50个核苷酸/碱基，不超过约40个核苷酸/碱基，不超过约30个核苷酸/碱基，不超过约20个核苷酸/碱基或不超过约10个核苷酸/碱基。在一些实施方案中，乙酰转移酶包含约10至约200个核苷酸/碱基，约10至约150个核苷酸/碱基，约10至约100个核苷酸/碱基，约10至约50个核苷酸/碱基，约10至约40个核苷酸/碱基，约10至约30个核苷酸/碱基，约10至约20个核苷酸/碱基，约15至约40个核苷酸/碱基，约15至约30个核苷酸/碱基或约15至约20个核苷酸/碱基。在各种实施方案中，乙酰转移酶抑制剂包括寡核苷酸。在各种实施方案中，乙酰转移酶抑制剂包含RNA。在各种实施方案中，乙酰转移酶抑制剂包含抑制性RNA。在各种实施方案中，乙酰转移酶抑制剂选自由以下组成的组：反义寡核苷酸(ASO)、gapmer、短干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、微小RNA(miRNA)、向导RNA(gRNA)、单向导RNA(sgRNA)及其组合。在一些实施方案中，乙酰转移酶抑制剂包含CRISPR(成簇的规则间隔短回文重复序列)-Cas(CRISPR相关蛋白)复合物，例如CRISPR-Cas9复合物或其部分。反义寡核苷酸(ASO)可通过外显子跳跃和随后的mRNA衰减或翻译抑制来敲低基因，例如GCN5L1或BLOC1S1。SiRNA可通过内切核糖核酸酶DICER诱导基因敲低，例如GCN5L1或BLOC1S1敲低。

在各种实施方案中，寡核苷酸包括：a)序列，任选地线性序列，其与BLOC1S1基因或SEQ ID NO:2，任选地BLOC1S1基因的编码序列(CDS)或SEQ ID NO:3和/或SEQ ID NO:4或其部分互补；或者b)与a)中的序列共享至少约70％，至少约71％、至少约72％、至少约73％、至少约74％、至少约75％、至少约76％、至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％，至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％序列同一性的序列或与a)中的序列相差约一个核苷酸/碱基、约两个核苷酸/碱基、约三个核苷酸/碱基、约四个核苷酸/碱基、约五个核苷酸/碱基、约六个核苷酸/碱基、约七个核苷酸/碱基、约八个核苷酸/碱基、约九个核苷酸/碱基或约十个核苷酸/碱基的序列。在各种实施方案中，寡核苷酸包括：a)与BLOC1S1基因的编码序列(CDS)、SEQ ID NO:3和/或SEQ ID NO:4或其部分互补的序列；或者b)与a)中的序列共享至少约75％序列同一性的序列。在各种实施方案中，寡核苷酸包含SEQID NO:1(或AGAGGAGGCGAGAGGCUAU)或者b)与a)中的序列共享至少约70％、至少约71％、至少约72％、至少约73％、至少约74％、至少约75％、至少约76％、至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％序列同一性的序列，或与a)中的序列相差约一个核苷酸/碱基、约两个核苷酸/碱基、约三个核苷酸/碱基、约四个核苷酸/碱基、约五个核苷酸/碱基、约六个核苷酸/碱基、约七个核苷酸/碱基，约八个核苷酸/碱基，约九个核苷酸/碱基或约十个核苷酸/碱基的序列。在各种实施方案中，寡核苷酸包含与SEQ ID NO:1共享至少约75％序列同一性的序列，或与SEQ ID NO:1相差约一个核苷酸、约两个核苷酸、约三个核苷酸、约四个核苷酸或约五个核苷酸的序列。在各种实施方案中，乙酰转移酶抑制剂减少/抑制GCN5L1的表达。

在各种实施方案中，包含与BLOC1S1基因的部分、BLOC1S1基因的编码序列(CDS)的部分或SEQ ID No.2至4中任一种的一部分互补的序列的寡核苷酸包含与BLOC1S1基因、BLOC1S1基因的编码序列(CDS)或SEQ ID No.2至4中的序列/核酸残基的区段互补的序列，从而可以实现寡核苷酸与该基因或序列的至少一部分的杂交。在各种实施方案中，序列/核酸残基的区段包含BLOC1S1基因、BLOC1S1基因的编码序列(CDS)或SEQ ID No.2至4的任何一个中的至少约5、至少约6、至少约7、至少约8、至少约9、至少约10、至少约11、至少约12、至少约13、至少约14、至少约15、至少约16、至少约17、至少约18，至少约19、至少约20、至少约21、至少约22、至少约23、至少约24、至少约25、至少约26、至少约27、至少约28、至少约29或至少约30个连续核酸残基。在一些实施方案中，寡核苷酸可包含与BLOC1S1基因、BLOC1S1基因的编码序列(CDS)或SEQ ID No.2至4中的序列/核酸残基的超过一个区段(例如，约两个、约三个区段等)互补的序列。

在各种实施方案中，乙酰转移酶抑制剂能够将乙酰转移酶的表达(例如，基因或蛋白质表达)降低/减少至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％，至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约99％或至少约100％。在一个实施方案中，乙酰转移酶抑制剂能够将乙酰转移酶的表达降低/减少约50％至70％。

在各种实施方案中，试剂能够改善ALS或ALS样运动神经元中的以下一个或多个特性：线粒体功能障碍、代谢呼吸缺陷、形态改变、异常线粒体形态、存活/基础存活、胞体大小、初级神经突的量、内质网(ER)应激、基础呼吸、ATP相联的耗氧率(OCR)、ATP产生、备用呼吸能力、氧化磷酸化、脱乙酰酶表达和/或活性(如SIRT3等sirtuin)、复合物I活性、线粒体NAD⁺水平、CHOP基因表达、剪接XBP1(sXBP1)量/水平、细胞外酸化率(ECAR)和线粒体自噬，例如与健康/正常运动神经元中的相似或更相似。在一些实施方案中，试剂能够改变/调控(例如，增加/促进或降低/减少)上述一个或多个特性至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约99％或至少约100％，使得一个或多个特性类似于或更接近于健康/正常运动神经元中的特性。在一些实施方案中，改变是至少约0.1倍、至少约0.2倍、至少约0.3倍、至少约0.4倍、至少约0.5倍、至少约0.6倍、至少约0.7倍、至少约0.8倍或至少约0.9倍。在一些实施方案中，改变大于约1倍，例如至少约1.05倍、至少约1.1倍、至少约1.15倍、至少约1.2倍、至少约1.25倍、至少约1.3倍、至少约1.35倍、至少约1.4倍、至少约1.45倍、至少约1.5倍，至少约1.55倍、至少约1.6倍、至少约1.65倍、至少约1.7倍、至少约1.75倍、至少约1.8倍、至少约1.85倍、至少约1.9倍、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约3.5倍、至少约4倍、至少约4.5倍、至少约5倍、至少约5.5倍、至少约6倍、至少约6.5倍、至少约7倍、至少约7.5倍、至少约8倍、至少约8.5倍、至少约9倍、至少约9.5倍或至少约10倍。

在各种实施方案中，方法包括体外或离体方法。

在各种实施方案中，提供了一种能够调控/调节运动神经元中线粒体产物的乙酰化的试剂或组合物。在各种实施方案中，试剂或组合物能够减少/抑制运动神经元中线粒体产物(例如线粒体蛋白质)的乙酰化。试剂或组合物可用在疗法中。试剂或组合物可以是药物组合物。试剂或组合物可包含一种或多种合适的载体、添加剂、佐剂、稀释剂和赋形剂。在各种实施方案中，提供了用于疗法中的试剂或组合物。在各种实施方案中，提供了用于治疗运动神经元疾病的试剂或组合物。在各种实施方案中，提供了用于治疗ALS或ALS样疾病的试剂或组合物。在一些实施方案中，提供治疗有效量的试剂或组合物用于治疗ALS或ALS样疾病，例如，能够将运动神经元中的线粒体蛋白质乙酰化减少所需量的试剂或组合物的量。因此，在各种实施方案中，提供了能够减少线粒体蛋白质乙酰化的试剂或组合物，用于治疗ALS或ALS样疾病。

在各种实施方案中，试剂或组合物选自由以下组成的组：脱乙酰酶激活剂或激动剂、乙酰转移酶抑制剂或拮抗剂及其组合。在各种实施方案中，脱乙酰酶激活剂包括SIRT3激活剂。在各种实施方案中，SIRT3激活剂选自由以下组成的组：小分子、NAD或其前体及其组合。在各种实施方案中，小分子选自由以下组成的组：7-羟基-3-(4'-甲氧基苯基)香豆素(C12)、和厚朴酚、二氢杨梅酮(DHM)及其衍生物、类似物和组合。在各种实施方案中，NAD前体选自由色氨酸、喹啉酸、烟酸(NA)、烟酰胺(Nam)、烟酰胺单核苷酸(NMN)烟酰胺核糖核苷(NR)、烟酸及其衍生物、类似物和组合组成的组。在各种实施方案中，乙酰转移酶抑制剂包括GCN5L1抑制剂。在各种实施方案中，GCN5L1抑制剂包括寡核苷酸和/或化学物。在各种实施方案中，寡核苷酸选自由以下组成的组：反义寡核苷酸(ASO)、gapmer、短干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、微小RNA(miRNA)、向导RNA(gRNA)、单向导RNA(sgRNA)及其组合。在各种实施方案中，寡核苷酸包括：a)与BLOC1S1基因的CDS或其部分，或者SEQ ID NO:3或其部分，或者SEQ ID NO:4或其部分互补的序列；或者与a)中的序列共享至少约75％序列同一性的序列。在各种实施方案中，寡核苷酸包含与SEQ ID NO:1共享至少约75％序列同一性的序列，或者与SEQ ID NO:1相差约一个核苷酸、约两个核苷酸、约三个核苷酸、约四个核苷酸或约五个核苷酸的序列。

在一些实施方案中，试剂或组合物可增加SIRT3(或包含SIRT3的任何复合物)的表达水平(例如，基因和/或蛋白质表达)。在一些实施方案中，试剂或组合物可增加编码SIRT3的RNA的水平。在一些实施方案中，试剂或组合物可增加编码SIRT3的核酸的转录。在一些实施方案中，试剂或组合物可促进编码SIRT3的RNA的适当转录后加工(例如剪接、翻译、翻译后加工)。在一些实施方案中，试剂或组合物可增加SIRT3蛋白质(或包含SIRT3的任何蛋白质复合物)的水平。在一些实施方案中，试剂或组合物可减少SIRT3(或包含SIRT3的任何蛋白质复合物)的降解。在一些实施方案中，试剂或组合物可促进SIRT3(或包含SIRT3的任何蛋白质复合物)与SIRT3的相互作用伴侣(或包含SIRT3的任何蛋白质复合物的相互作用伴侣)之间的相互作用。在一些实施方案中，试剂或组合物可增加/增强SIRT3(或包含SIRT3的任何复合物)的功能水平。在一些实施方案中，试剂或组合物可激活SIRT3(或包含SIRT3的任何复合物)。在一些实施方案中，试剂或组合物可通过SIRT3(和/或包含SIRT3的任何复合物)增加脱乙酰酶活性的水平。在一些实施方案中，试剂或组合物可减少/抑制因SIRT3活性降低而导致的线粒体蛋白质的超乙酰化。在一些实施方案中，试剂或组合物可促进SIRT3下游靶标的脱乙酰化。

在一些实施方案中，试剂或组合物可降低GCN5L1(或包含GCN5L1的任何复合物)的表达水平(例如，基因和/或蛋白质表达)。在一些实施方案中，试剂或组合物可降低编码GCN5L1的RNA的水平。在一些实施方案中，试剂或组合物可减少/抑制编码GCN5L1的核酸的转录。在一些实施方案中，试剂或组合物可减少/抑制编码GCN5L1的RNA的转录后加工(例如剪接、翻译、翻译后加工)。在一些实施方案中，试剂或组合物可减少/抑制GCN5L1蛋白(或包含GCN5L1的任何蛋白质复合物)的水平。在一些实施方案中，试剂或组合物可增加/促进GCN5L1(或包含GCN5L1的任何蛋白质复合物)的降解。在一些实施方案中，试剂或组合物可减少/抑制/破坏GCN5L1(或包含GCN5L1的任何蛋白质复合物)与GCN5L1的相互作用伴侣(或包含GCN5L1的任何蛋白质复合物的相互作用伴侣)之间的相互作用。在一些实施方案中，试剂或组合物可降低GCN5L1(或包含GCN5L1的任何复合物)的功能水平。在一些实施方案中，试剂或组合物可抑制GCN5L1(或包含GCN5L1的任何复合物)的乙酰转移酶活性。在一些实施方案中，试剂或组合物可通过GCN5L1(或包含GCN5L1的任何复合物)降低乙酰转移酶活性水平。在一些实施方案中，试剂或组合物可减少/抑制因GCN5L1活性增加而导致的线粒体蛋白质的超乙酰化。在一些实施方案中，试剂或组合物可减少/抑制GCN5L1下游靶标的乙酰化。

在一些实施方案中，试剂或组合物可减少运动神经元中线粒体蛋白质的乙酰化。在一些实施方案中，试剂或组合物可减少运动神经元中锰超氧化物歧化酶(MnSOD)的乙酰化，例如锰超氧化物歧化酶上的赖氨酸68的乙酰化(MnSOD K68ac)。

可使用合适的测定法对试剂或组合物评估前述段落中记载的性质。测定法可以是例如体外测定法，任选地基于细胞的测定法或无细胞测定法。

基因表达可以通过技术人员熟知的手段进行分析。编码给定基因的RNA的水平可通过诸如RT-qPCR的技术来确定。蛋白质表达也可以通过本领域技术人员熟知的手段来确定。例如，可通过基于抗体的方法(包括western印迹、免疫组织化学/免疫组织(细胞)化学/细胞化学、流式细胞术、ELISA等)确定给定蛋白质/其同等型的水平。

给定基因的基因或蛋白质表达水平的增加可以是增加到在未诱导状态下(即在不存在SIRT3表达/活性诱导剂的情况下)观察到的表达水平的超过1倍，例如，以下的一种：≥1.01倍、≥1.05倍、≥1.1倍、≥1.15倍、≥1.2倍、≥1.25倍、≥1.3倍、≥1.35倍、≥1.4倍、≥1.45倍、≥1.5倍、≥1.55倍、≥1.6倍、≥1.65倍、≥1.7倍、≥1.75倍、≥1.8倍、≥1.85倍、≥1.9倍、≥2倍、≥3倍、≥4倍、≥5倍、≥6倍、≥7倍、≥8倍、≥9倍、≥10倍、≥20倍、≥30倍、≥40倍、≥50倍、≥60倍、≥70倍、≥80倍、≥90倍或≥100倍。在一些实施方案中，能够增加基因或蛋白质表达的试剂或组合物将基因表达增加了在未诱导状态下观察到的表达的大于5％，例如，以下一种：≥10％、≥15％、≥20％、≥25％、≥30％、≥35％、≥40％、≥45％、≥50％、≥55％、≥60％、≥65％、≥70％、≥75％、≥80％、≥85％、≥90％、≥91％、≥92％、≥93％、≥94％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％、≥100％、≥200％、≥300％、≥400％、≥500％、≥600％、≥700％、≥800％、≥900％或≥1000％。

给定基因的基因或蛋白质表达的降低可以是降低到在非抑制状态下(即在没有GCN5L1抑制剂的情况下)观察到的表达水平的小于1倍，例如，以下一种：≤0.99倍、≤0.95倍、≤0.9倍、≤0.85倍、≤0.8倍、≤0.75倍、≤0.7倍、≤0.65倍、≤0.6倍、≤0.55倍、≤0.5倍、≤0.45倍、≤0.4倍、≤0.35倍、≤0.3倍、≤0.25倍、≤0.2倍、≤0.15倍、≤0.1倍、≤0.05倍、或≤0.01倍。在一些实施方案中，能够减少/抑制基因或蛋白质表达的试剂抑制了在非抑制状态下观察到的表达的大于5％，例如，以下一种：≥10％、≥15％、≥20％、≥25％、≥30％、≥35％、≥40％、≥45％、≥50％、≥55％、≥60％、≥65％、≥70％、≥75％、≥80％、≥85％、≥90％、≥91％、≥92％、≥93％、≥94％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％或100％。

能够增加SIRT3基因的表达(例如，增加编码SIRT3的RNA的水平、增加编码SIRT3的核酸的转录和/或减少编码SIRT3的RNA的降解)或能够减少/抑制GCN5L1的基因表达(例如，降低编码GCN5L1的RNA的水平、减少/抑制编码GCN5L1的核酸的转录和/或增加/促进编码GCN5L1的RNA的降解)的试剂或组合物可通过使用包括检测编码SIRT3或GCN5L1的RNA水平的测定法(例如，通过RT-qPCR)来鉴定。此类测定法可包括使用试剂或组合物处理细胞/组织，例如运动神经元，然后将此类细胞/组织中编码SIRT3或GCN5L1的RNA水平与适当对照条件的细胞/组织(例如未经处理/用媒介物处理的细胞/组织)中编码SIRT3或GCN5L1的RNA水平进行比较。

能够增加SIRT3的蛋白质表达(例如，增加SIRT3蛋白质或包含SIRT3的任何蛋白质复合物的水平，或减少SIRT3蛋白质或包含SIRT3的任何蛋白质复合物的降解)或减少/抑制GCN5L1的蛋白质表达(例如，降低GCN5L1蛋白质或包含GCN5L1的任何蛋白质复合物的水平，或增加/促进GCN5L1蛋白质或包含GCN5L1的任何蛋白质复合物的降解)的试剂或组合物可使用包括检测SIRT3蛋白质、GCN5L1蛋白质、或其任何复合物的水平的测定法，例如使用基于抗体/报告物的方法(western印迹、ELISA、免疫组织/细胞化学等)来鉴定。此类测定法可包括使用试剂或组合物处理细胞/组织，例如运动神经元，然后将此类细胞/组织中的蛋白质/蛋白质复合物水平与适当对照条件的细胞/组织(例如，未经处理/用媒介物处理的细胞/组织)中的水平进行比较。

能够促进SIRT3(或包含SIRT3的任何复合物)和SIRT3的相互作用伴侣(或包含SIRT3的任何复合物的相互作用伴侣)之间的相互作用或减少/抑制/破坏GCN5L1(或包含GCN5L1的任何复合物)和GCN5L1的相互作用伴侣(或包含GCN5L1的复合物的相互作用伴侣)之间的相互作用的试剂或组合物可使用包括检测相互作用水平的测定法，例如使用基于抗体/报告物的方法来鉴定。SIRT3(或包含SIRT3的任何复合物)与SIRT3的相互作用伴侣(或包含SIRT3的任何复合物的相互作用伴侣)之间的相互作用水平，或者GCN5L1(或包含GCN5L1的任何复合物)与GCN5L1的相互作用伴侣(或包含GCN5L1的任何复合物的相互作用伴侣)之间的相互作用水平可例如使用共振能量转移技术(如FRET、BRET)或分析相互作用相关性的方法进行分析。测定法可包括用所述试剂或组合物处理细胞/组织，例如运动神经元，并随后将在此类细胞/组织中SIRT3(或包含SIRT3的任何复合物)与SIRT3的相互作用伴侣(或包含SIRT3的任何复合物的相互作用伴侣)之间的相互作用水平，或者GCN5L1(或包含GCN5L1的任何复合物)与GCN5L1的相互作用伴侣(或包含GCN5L1的复合物的相互作用伴侣)之间的相互作用水平与在适当对照条件的细胞/组织(例如，未处理/用媒介物处理的细胞/组织)中观察到的相互作用水平进行比较。可使用ELISA、表面等离子体共振或生物层干涉分析等技术分析相互作用水平。测定法可包括将存在试剂或组合物时的相互作用水平与适当对照条件(例如，不存在试剂或组合物)下的相互作用水平进行比较。

SIRT3(或包含SIRT3的任何复合物)与SIRT3的相互作用伴侣(或包含SIRT3的任何复合物的相互作用伴侣)之间的相互作用的促进/增加可以是增加到在未诱导状态下(即，在没有促进/增加SIRT3(或任何包含SIRT3的复合物)与SIRT3的相互作用伴侣(或包含SIRT3的复合物的相互作用伴侣)之间相互作用的试剂或组合物的情况下)观察到的相互作用水平的超过1倍，例如，以下一种：≥1.01倍、≥1.05倍、≥1.1倍、≥1.15倍、≥1.2倍、≥1.25倍、≥1.3倍、≥1.35倍、≥1.4倍、≥1.45倍、≥1.5倍、≥1.55倍、≥1.6倍、≥1.65倍、≥1.7倍、≥1.75倍、≥1.8倍、≥1.85倍、≥1.9倍、≥2倍、≥3倍、≥4倍、≥5倍、≥6倍、≥7倍、≥8倍、≥9倍、≥10倍、≥20倍、≥30倍、≥40倍、≥50倍、≥60倍、≥70倍、≥80倍、≥90倍或≥100倍。在一些实施方案中，能够促进/增加(SIRT3或包含SIRT3的任何复合物)与SIRT3的相互作用伴侣(或包含SIRT3的复合物的相互作用伴侣)之间的相互作用的试剂将相互作用增加了在未诱导状态下观察到的相互作用的大于5％，例如，以下一种：≥10％、≥15％、≥20％、≥25％、≥30％、≥35％、≥40％、≥45％、≥50％、≥55％、≥60％、≥65％、≥70％、≥75％、≥80％、≥85％、≥90％、≥91％、≥92％、≥93％、≥94％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％、≥100％、≥200％、≥300％、≥400％、≥500％、≥600％、≥700％、≥800％、≥900％或≥1000％。

GCN5L1(或包含GCN5L1的任何复合物)和GCN5L1的相互作用伴侣(或包含GCN5L1的任何复合物的相互作用伴侣)相互作用的减少/降低/破坏可以是至在非抑制状态下(即，在没有减少/降低/破坏GCN5L1(或包含GCN5L1的任何复合物)和GCN5L1的相互作用伴侣(或包含GCN5L1的任何复合物的相互作用伴侣)之间相互作用的试剂或组合物的情况下)观察到的相互作用水平的小于1倍，例如，以下一种：≤0.99倍、≤0.95倍、≤0.9倍、≤0.85倍、≤0.8倍、≤0.75倍、≤0.7倍、≤0.65倍、≤0.6倍、≤0.55倍、≤0.5倍、≤0.45倍、≤0.4倍、≤0.35倍、≤0.3倍、≤0.25倍、≤0.2倍、≤0.15倍、≤0.1倍、≤0.05倍，或≤0.01倍。在一些实施方案中，能够减少/抑制/破坏GCN5L1(或包含GCN5L1的任何复合物)与GCN5L1的相互作用伴侣(或包含GCN5L1的复合物的相互作用伴侣)之间的相互作用的试剂或组合物抑制了在非抑制状态下观察到的相互作用的大于5％，例如，以下一种：≥10％、≥15％、≥20％、≥25％、≥30％、≥35％、≥40％、≥45％、≥50％、≥55％、≥60％、≥65％、≥70％、≥75％、≥80％、≥85％、≥90％、≥91％、≥92％、≥93％、≥94％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％或100％。

可使用针对相关功能的测定法来鉴定能够调控SIRT3或GCN5L1(或其任何复合物)的功能的试剂或组合物。此类测定法可包括用试剂或组合物处理细胞/组织，例如表达SIRT3或GCN5L1(或其任何复合物)的运动神经元，并然后将相关功能水平与在适当对照条件下(例如未处理/用媒介物处理的细胞/组织)观察到的水平进行比较。还可使用包括检测SIRT3或GCN5L1(或其任何复合物)的功能相关物(例如，其表达因SIRT3/GCN5L1(或其任何复合物)的功能而直接/间接上调或下调的一种或多种蛋白质的基因和/或蛋白质表达和/或活性)水平的测定法来鉴定试剂或组合物。此类测定法可包括用试剂处理细胞/组织，例如表达SIRT3或GCN5L1(或其任何复合物)的功能的运动神经元，并随后将此类细胞/组织中SIRT3或GCN5L1(或其任何复合物)功能的相关物水平与适当对照条件下(例如，未处理/用媒介物处理的细胞/组织)相关功能的相关物水平进行比较。SIRT3(和/或包含SIRT3的任何复合物)的功能例如可以是脱乙酰酶活性。SIRT3(和/或包含SIRT3的任何复合物)功能的相关物可以例如是脱乙酰酶活性的产物。GCN5L1(和/或包含GCN5L1的任何复合物)的功能例如可以是乙酰转移酶活性。GCN5L1(和/或包含GCN5L1的任何复合物)的功能的相关物可以是例如乙酰转移酶活性的产物。

能够通过SIRT3(或任何包含SIRT3的复合物)增加脱乙酰酶活性或通过GCN5L1(或任何包含GCN5L1的复合物)减少/抑制乙酰转移酶活性的试剂或组合物可以使用包括检测脱乙酰酶或乙酰转移酶活性水平的测定法，例如，使用基于抗体/报告物的方法来鉴定。测定法可包括用试剂或组合物处理细胞/组织，例如表达SIRT3、GCN5L1(或其任何复合物)的运动神经元，并随后将乙酰化水平(例如，在线粒体蛋白质或代表性线粒体蛋白质中)与在适当对照条件下(例如，未经处理/用媒介物处理的细胞/组织)观察到的乙酰化水平进行比较。测定法还可包括将存在试剂或组合物时SIRT3、GCN5L1(或其任何复合物)显示的相关活性水平与不存在试剂或组合物时观察到的水平进行比较。实施例中描述了可执行的测定法的实例。

SIRT3(或包含SIRT3的任何复合物)的功能(例如脱乙酰酶活性)的增强/增加可以是增加到在未诱导状态下观察到的活性水平的超过1倍，例如，以下一种：≥1.01倍、≥1.05倍、≥1.1倍、≥1.15倍、≥1.2倍、≥1.25倍、≥1.3倍、≥1.35倍、≥1.4倍、≥1.45倍、≥1.5倍、≥1.55倍、≥1.6倍、≥1.65倍、≥1.7倍、≥1.75倍、≥1.8倍、≥1.85倍、≥1.9倍、≥2倍、≥3倍、≥4倍、≥5倍、≥6倍、≥7倍、≥8倍、≥9倍、≥10倍、≥20倍、≥30倍、≥40倍、≥50倍、≥60倍、≥70倍、≥80倍、≥90倍或≥100倍。在一些实施方案中，能够增强/增加SIRT3(或包含SIRT3的任何复合物)的功能(例如脱乙酰酶活性)的试剂或组合物增强/增加了在未诱导状态下观察到的相关活性的大于5％，例如，以下一种：≥10％、≥15％、≥20％、≥25％、≥30％、≥35％、≥40％、≥45％、≥50％、≥55％、≥60％、≥65％、≥70％、≥75％、≥80％、≥85％、≥90％、≥91％、≥92％、≥93％、≥94％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％、≥100％、≥200％、≥300％、≥400％、≥500％、≥600％、≥700％、≥800％、≥900％或≥1000％。

GCN5L1(或包含GCN5L1的任何复合物)的功能(例如乙酰转移酶活性)的减少/抑制可以是在非抑制状态下观察到的活性水平的小于1倍，例如，以下一种：≤0.99倍、≤0.95倍、≤0.9倍、≤0.85倍、≤0.8倍、≤0.75倍、≤0.7倍、≤0.65倍、≤0.6倍、≤0.55倍、≤0.5倍、≤0.45倍、≤0.4倍、≤0.35倍、≤0.3倍、≤0.25倍、≤0.2倍、≤0.15倍、≤0.1倍、≤0.05倍，或≤0.01倍。在一些实施方案中，能够减少/抑制GCN5L1(和/或包含GCN5L1的任何复合物)的功能(例如乙酰转移酶活性)的试剂或组合物抑制了在非抑制状态下观察到的相关活性的大于5％，例如，以下一种：≥10％、≥15％、≥20％、≥25％、≥30％、≥35％、≥40％、≥45％、≥50％、≥55％、≥60％、≥65％、≥70％、≥75％、≥80％、≥85％、≥90％、≥91％、≥92％、≥93％、≥94％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％或100％。

在一些实施方案中，试剂包括SIRT3结合分子、SIRT3复合物结合分子、能够增加SIRT3水平的分子、能够增加SIRT3复合物水平的分子、GCN5L1结合分子、GCN5L1复合物结合分子，能够降低GCN5L1水平的分子或能够降低GCN5L1复合物水平的分子。如本文所用，“SIRT3结合分子”指能够结合SIRT3的分子。“SIRT3复合物结合分子”是指能够结合包含SIRT3的复合物的分子。“GCN5L1结合分子”是指能够结合GCN5L1的分子。“GCN5L1复合物结合分子”是指能够结合包含GCN5L1的复合物的分子。SIRT3结合分子或GCN5L1结合分子可使用检测分子与相关因子(即SIRT3、GCN5L1或包含SIRT3和/或GCN5L1的任何复合物)结合的任何合适测定法来鉴定。此类测定法可包括检测相关因子与分子之间复合物的形成。

可以在适当的测定法中分析SIRT3结合分子、GCN5L1结合分子(或包含SIRT3或GCN5L1的任何复合物的结合分子)以鉴定SIRT3的激动剂或GCN5L1的拮抗剂。例如，可以对特异性结合SIRT3(和/或包含SIRT3的任何复合物)的分子评估它们激活脱乙酰酶的能力或它们激活脱乙酰酶活性的能力。例如，可以对特异性结合GCN5L1(和/或包含GCN5L1的任何复合物)的分子评估它们抑制乙酰转移酶的能力，或它们抑制乙酰转移酶活性的能力。

在一些实施方案中，SIRT3结合分子(或包含SIRT3的任何复合物的结合分子)可促进其靶标(即SIRT3或包含SIRT3的任何复合物)与相互作用伴侣相互作用的能力。在一些实施方案中，SIRT3结合分子(或包含SIRT3的任何复合物的结合分子)可改变SIRT3上活性位点的构象。在一些实施方案中，GCN5L1结合分子(或任何包含GCN5L1的复合物的结合分子)可以抑制其靶标(即GCN5L1或任何包含GCN5L1的复合物)与相互作用伴侣相互作用的能力。在一些实施方案中，GCN5L1结合分子(或包含GCN5L1的任何复合物的结合分子)作用为其靶标与其靶标的相互作用伴侣之间相互作用的竞争性抑制剂。结合分子可以占据其靶标的与其靶标的相互作用伴侣结合所需的区域或以其他方式减少对该区域的接近。可以评估SIRT3结合分子或GCN5L1结合分子(或包含SIRT3或GCN5L1的任何复合物的结合分子)促进或抑制其靶标与其靶标的相互作用伴侣之间相互作用的能力，例如，通过存在相关结合分子或在一种或两种相互作用伴侣与相关结合分子孵育后对相互作用进行分析。确定给定结合剂是否能够促进或抑制其靶标与其靶标的相互作用伴侣之间相互作用的合适测定法的实例包括ELISA和竞争ELISA。

在各种实施方案中，SIRT3结合分子、GCN5L1结合分子(或包含SIRT3或GCN5L1的任何复合物的结合分子)包括化学品，即化学抑制剂。在一些实施方案中，化学品包括小分子。化学化合物或小分子可以是有机或无机化合物。在一些实施方案中，化学品或小分子包括有机化合物。可通过筛选化学化合物库或小分子库来鉴定化学化合物或小分子。化学化合物库或小分子库可以是已经从任何多个来源组装的多种化学化合物或小分子，包括化学合成的化合物或分子和天然产物，或通过组合化学技术生成的化学化合物或小分子。

小分子可具有不超过约1500Da，不超过约1400Da，不超过约1300Da，不超过约1200Da，不超过约1100Da，不超过约1000Da，不超过约900Da，不超过约800Da，不超过约700Da，不超过约600Da，不超过约500Da，不超过约400Da，不超过约300Da，不超过约200Da，不超过约100Da或不超过约50Da的低分子量。在一些实施方案中，小分子具有约50Da至约1500Da，约100Da至约1000Da或约300Da至约700Da的分子量。

在各种实施方案中，SIRT3结合分子、GCN5L1结合分子(或包含SIRT3或GCN5L1的任何复合物的结合分子)包括适配体。例如在Zhou和Rossi Nat Rev Drug Discov.2017 16(3):181-202中综述了核酸适配体，并且可通过指数富集法的配体系统进化(SELEX)的方法，或通过开发SOMAmers(慢减速率修饰适配体)(Gold L等人(2010)PLoS ONE 5(12)：e15004)来鉴定和/或产生。适配体和SELEX在Tuerk和Gold，Science(1990)249(4968)：505-10和WO 91/19813中进行了描述。核酸适配体可包含DNA和/或RNA，且可为单链或双链。它们可包含化学修饰的核酸，例如其中糖和/或磷酸和/或碱基经化学修饰。此类修饰可提高适配体的稳定性或使适配体更耐降解，并可包括在核糖的2'位置处的修饰。核酸适配体可以化学合成，例如在固体支持物上。固相合成可使用磷酰胺化学。简单地说，固体支持的核苷酸被去三苯甲基化(detritylated)，然后与适当激活的核苷磷酰胺偶联以形成亚磷酸三酯键。然后可以进行封端，接着用氧化剂(通常是碘)进行亚磷酸三酯的氧化。然后可重复该循环以组装适配体(例如，见Sinha，N.D.；Biernat，J.；McManus，J.；

H.Nucleic AcidsRes.1984，12，4539；和Beaucage，S.L.；Lyer，R.P.(1992).Tetrahedron 48(12)：2223)。肽适配体及其产生和鉴定方法在Reverdatto等人Curr Top Med Chem.(2015)15(12)：1082-101中进行了综述，通过引用将其全部内容并入本文。

能够增加SIRT3(或包含SIRT3的复合物)的水平的分子包括能够增加SIRT3(或包含SIRT3的复合物)的基因和/或蛋白质表达的分子。在一些实施方案中，能够增加SIRT3(或包含SIRT3的复合物)的水平的分子诱导或增加由SIRT3基因编码的多肽的表达。给定靶基因(例如SIRT3基因)的基因或蛋白质表达的增加可包括例如增加/促进基因的转录，促进从基因转录的RNA的适当转录后加工(例如剪接)，增加从基因转录的RNA的稳定性，减少/防止从基因转录的RNA的降解，增加/促进从基因转录的RNA翻译成蛋白质，促进由基因编码的多肽的适当翻译后加工，增加由基因编码的多肽的稳定性，或减少/防止由基因编码的多肽的降解。

能够降低GCN5L1(或包含GCN5L1的复合物)的水平的分子包括能够降低GCN5L1(或包含GCN5L1的复合物)的基因和/或蛋白质表达的分子。在一些实施方案中，能够降低GCN5L1(或包含GCN5L1的复合物)的水平的分子降低或阻止由BLOC1S1基因编码的多肽的表达。给定靶基因(例如BLOC1S1基因)的基因或蛋白质表达的抑制可以包括例如抑制基因转录，抑制从基因转录的RNA的转录后加工(例如剪接)，降低从基因转录的RNA的稳定性，促进从基因转录的RNA的降解，抑制从基因转录的RNA翻译成蛋白质，抑制基因编码的多肽的翻译后加工，降低基因编码的多肽的稳定性，或促进基因编码的多肽的降解。

例如通过改变/破坏基因的核苷酸序列，或改变/破坏基因表达所需的核苷酸序列(例如控制基因表达的调控序列)，可以实现基因或蛋白质表达的抑制或诱导/激活/促进/上调。在一些实施方案中，抑制或诱导/激活/促进/上调基因或蛋白质表达可以包括例如通过一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入来改变核苷酸序列。例如，在特定方面和实施方案中，本公开包括通过删除相关基因的全部或部分核苷酸序列来抑制基因或蛋白质表达。例如，在特定方面和实施方案中，本公开包括通过引入激活突变，引入增强基因表达的调控序列和/或通过扩增相关基因的全部或部分核苷酸序列来诱导/激活/促进/上调基因或蛋白质表达。

改变/破坏核苷酸序列以抑制/阻止基因或从基因的蛋白质表达可称为基因“敲除”。基因“敲入”可改变(例如增加)基因或蛋白质表达，例如通过引入靶基因的一个或多个拷贝，或通过可操作地插入增强靶基因表达的调控序列。

核苷酸序列可能被破坏，例如通过同源重组，或通过使用位点特异性核酸酶(SSN)的靶核酸修饰。

通过同源重组的修饰可能涉及通过同源序列引导的交叉事件交换核酸序列，例如，在Mortensen Curr Protoc Neurosci(2007)Chapter 4:Unit 4.29和Vasquez等人,PNAS(2001)98(15):8403-8410中进行了综述，这两篇文章皆通过引用全部并入本文。

使用SSN的基因编辑在Eid和Mahfouz、Exp Mol Med(2016)48(10):e265中进行了综述，其全部内容通过引用并入本文。可以工程化改造能够产生位点特异性双链断裂(DSB)的酶以将DSB引入目标靶核酸序列。DSB可以通过易错的非同源末端连接(NHEJ)进行修复，其中断裂的两末端重新连接，通常具有核苷酸的插入或缺失。可替代地，DSB可以通过高度同源性定向修复(HDR)进行修复，其中提供末端与断裂位点同源的DNA模板并将其引入DSB的位点。能够工程化经改造以产生靶核酸序列特异性DSB的SSN包括锌指核酸酶(ZFN)、转录激活物样效应器核酸酶(TALEN)和成簇的规则间隔回文重复序列/CRISPR-相关-9(CRISPR/Cas9)系统。

在例如Umov等人，Nat Rev Genet.(2010)11(9):636-46中对ZFN系统进行了综述，该文献全部内容通过引用并入本文。ZFN包含可编程的锌指DNA结合结构域和DNA切割结构域(例如FokI内切核酸酶结构域)。可以通过筛选能够与靶核酸序列结合的锌指阵列来鉴定DNA结合结构域。TALEN系统在例如Mahfouz等人,Plant Biotechnol J.(2014)12(8):1006-14中综述，其全部内容通过引用并入本文。TALEN包含可编程的DNA结合TALE结构域和DNA切割结构域(例如FokI内切核酸酶结构域)。TALE包括由33-39个氨基酸的重复序列组成的重复结构域，除了每个重复序列的位置12和13处的两个残基(其是重复可变二残基(RVD))之外重复序列是相同的。每个RVD可以根据以下关系决定重复序列与靶DNA序列中的核苷酸的结合：“HD”结合C，“NI”结合A，“NG”结合T，“NN”或“NK”结合G(Moscou和Bogdanove，Science(2009)326(5959):1501)。CRISPR/Cas9和相关系统例如CRISPR/Cpf1、CRISPR/C2c1、CRISPR/C2c2和CRISPR/C2c3在例如Nakade等人，Bioengineered(2017)8(3):265-273中综述，其全部内容通过引用并入本文。这些系统包含内切核酸酶(例如Cas9、Cpf1等)和单引导RNA(sgRNA)分子。可以工程化改造sgRNA以将内切核酸酶活性靶向至感兴趣的核酸序列。

可以在动物中实现使用SSN的对核苷酸序列的破坏，其通过例如向动物施用编码相关SSN系统的组分的核酸。例如，可以对动物施用一种或多种载体，该载体包含编码SSN系统的组分的核酸，用于靶向相关基因。

也可以实现对基因或蛋白质表达的抑制，其通过例如用能够减少基因或蛋白质表达的试剂处理。例如，可以使用抑制性核酸(例如反义核酸)实现基因或蛋白质表达的抑制。反义核酸可通过互补碱基配对与靶核酸结合。当靶核酸是RNA(例如，从相关基因转录的RNA)时，反义核酸与靶RNA的结合可以促进RNA的降解和/或抑制RNA的翻译。抑制性核酸可以是反义寡核苷酸(ASO)。

在O’Keefe,Mater Methods(2013)3:197中综述了用于基因沉默的抑制性核酸的使用，该文献全部内容通过引用并入本文。抑制性核酸可以通过RNA干扰(RNAi)抑制基因或蛋白质表达。RNAi涉及通过对mRNA分子的靶向中和来抑制基因表达和翻译。在一些实施方案中，抑制性核酸是小干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(ShRNA)或微小RNA(miRNA)。

如本文所用，术语“小干扰RNA”或“siRNA”、“短发夹RNA”或“shRNA”、“微小RNA”或“miRNA”包括天然存在的序列和合成产生的序列两者。

在John等人，PLoS Biology,11(2),1862-1879,2004中讨论了miRNA的设计。可以设计用于靶向给定基因的合适的siRNA、shRNA和miRNA序列，例如使用siRNA Wizard(invivoGEN)或BLOCK-IT RNAi Designer(Invitrogen)。

作为背景，siRNA可以通过加工长双链RNA来衍生得到，并且当在自然界中发现时通常是外源性起源。微干扰RNA(miRNA)包括内源编码的小非编码RNA。siRNA和miRNA均可抑制具有部分互补靶序列的mRNA的翻译而无需RNA切割，和降解具有完全互补序列的mRNA。siRNA通常是双链。为了优化RNA介导的对靶基因功能的抑制的有效性，可以优化siRNA分子的长度以使RISC复合物正确识别siRNA，RISC复合物介导siRNA对mRNA靶标的识别。编码miRNA的DNA序列包含miRNA序列和近似反向互补体。当该DNA序列转录成单链RNA分子时，miRNA序列及其反向互补体可以碱基配对以形成部分双链RNA区段。

ShRNA通常比合成siRNA更稳定。shRNA可以包括由小环序列分开的短倒置重复序列。一个倒置重复序列可以与基因靶标互补。在细胞中，shRNA通常由DICER加工成siRNA，其降解靶基因mRNA并抑制靶基因表达。ShRNA可以在细胞内产生，例如，通过从载体转录。在各种实施方案中，提供了试剂或组合物在制备用于治疗运动神经元疾病的药物中的用途。在各种实施方案中，提供了试剂或组合物在制备用于治疗ALS或ALS样疾病的药物中的用途。

在各种实施方案中，提供了一种在受试者中治疗ALS或ALS样疾病的方法，该方法包括给受试者施用所述试剂或组合物，任选地治疗有效量的所述试剂或组合物。在各种实施方案中，该方法还包括确定受试者的治疗适合性。在各种实施方案中，确定受试者的治疗适合性包括确定/测量受试者的运动神经元(或源自受试者的运动神经元)中的线粒体蛋白乙酰化水平；并将其与健康/对照运动神经元中的线粒体蛋白乙酰化水平进行比较，其中与健康/对照运动神经元中的水平相比，受试者的运动神经元中的线粒体蛋白乙酰化水平升高表示该受试者适合进行该治疗。在各种实施方案中，该方法包括确定/测量受试者的运动神经元中的线粒体蛋白乙酰化水平，并将该水平与施用所述试剂或组合物后的线粒体蛋白乙酰化水平进行比较。在各种实施方案中，在施用所述试剂或组合物后受试者的运动神经元中的线粒体蛋白乙酰化水平的降低可能表明治疗是有效的和/或可能表明该受试者中疾病的改善。在各种实施方案中，在施用所述试剂或组合物后受试者的运动神经元中的线粒体蛋白乙酰化水平的增加可能表明治疗是无效的和/或可能表明该受试者中疾病的恶化。因此，在各种实施方案中，该方法可以是确定治疗的功效的方法或预后方法。应当理解，通过将不同的时间点的受试者样品中的线粒体蛋白乙酰化水平进行比较，该方法也可以有助于确定/监测受试者中的疾病进展，其中与在前时间点相比在后时间点的线粒体蛋白乙酰化水平降低表明该疾病在改善，而与在前时间点相比在后时间点的线粒体蛋白乙酰化水平升高则表明该疾病在恶化。

在各种实施方案中，提供了一种鉴定/诊断受试者中ALS或ALS样疾病的方法，该方法包括：测定/测量受试者的运动神经元中的线粒体蛋白乙酰化水平；并将其与健康/对照运动神经元中的乙酰化水平进行比较，其中与健康/对照运动神经元中的水平相比，受试者的运动神经元中的线粒体蛋白乙酰化水平升高指示该受试者患有或易患有ALS或ALS样疾病。

在各种实施方案中，受试者包含哺乳动物受试者。在各种实施方案中，受试者包括人受试者。在各种实施方案中，运动神经元包括哺乳动物运动神经元。在各种实施方案中，运动神经元包括人运动神经元。

在各种实施方案中，提供了一种鉴定以下的方法：

(a)能够与线粒体蛋白脱乙酰酶(例如SIRT3)和/或线粒体蛋白乙酰转移酶(例如GCN5L1)结合的分子，该方法包括使脱乙酰酶和/或乙酰转移酶与候选分子接触并确定候选分子是否结合所述脱乙酰酶和/或乙酰转移酶；

(b)线粒体蛋白脱乙酰酶(例如SIRT3)和/或线粒体蛋白乙酰转移酶(例如GCN5L1)的调控物，该方法包括使细胞(例如运动神经元)与候选分子接触并检测细胞中或细胞的脱乙酰酶和/或乙酰转移酶的升高或降低的表达、量或活性；

(c)适用于治疗、预防或减轻ALS或ALS样疾病的分子，该方法包括确定候选分子是否是线粒体蛋白脱乙酰酶(例如SIRT3)和/或线粒体蛋白乙酰转移酶(例如GCN5L1)的激动剂或拮抗剂，优选通过将候选分子暴露于脱乙酰酶和/或乙酰转移酶或表达脱乙酰酶和/或乙酰转移酶的细胞(例如运动神经元)，以确定候选分子是否是其激动剂或拮抗剂；或者

(d)线粒体蛋白脱乙酰酶(例如SIRT3)和/或线粒体蛋白乙酰转移酶(例如GCN5L1)的激动剂或拮抗剂，该方法包括向动物施用候选分子并确定动物是否表现出脱乙酰酶和/或乙酰转移酶的增加或降低的表达、量或活性；和

任选地分离或合成所述分子、调控物、激动剂或拮抗剂。

在一些实施方案中，如此鉴定的分子、调控物、激动剂或拮抗剂包括脱乙酰酶活化剂例如SIRT3活化剂，和/或乙酰转移酶抑制剂例如GCN5L1抑制剂。在一些实施方案中，如此鉴定的分子、调控物、激动剂或拮抗剂包含与SEQ ID NO：1共有至少约70％，至少约71％，至少约72％，至少约73％，至少约74％，至少约75％，至少约76％，至少约77％，至少约78％，至少约79％，至少约80％，至少约81％，至少约82％，至少约83％，至少约84％，至少约85％，至少约86％，至少约87％，至少约88％，至少约89％，至少约90％，至少约91％，至少约92％，至少约93％，至少约94％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约98％或至少约99％的序列同一性的寡核苷酸，或与SEQ ID NO:1相差约1个核苷酸/碱基，约2个核苷酸/碱基，约3个核苷酸/碱基，约4个核苷酸/碱基，约5个核苷酸/碱基，约6个核苷酸/碱基，约7个核苷酸/碱基，约8个核苷酸/碱基，约9个核苷酸/碱基或约10个核苷酸/碱基的序列。在一些实施方案中，如此鉴定的分子、调控物、激动剂或拮抗剂包含与SEQ ID NO:1共有至少约75％序列同一性的寡核苷酸，或者与SEQ ID NO：1相差约1个核苷酸，约2个核苷酸，约3个核苷酸，约4个核苷酸或约5个核苷酸的序列。在一些实施方案中，提供用于疗法的寡核苷酸。

在各种实施方案中，提供一种筛选/鉴定用于治疗ALS或ALS样疾病的试剂或组合物的方法，所述方法包括：使细胞(例如ALS或ALS样运动神经元)与候选试剂或组合物接触；并确定接触后细胞(例如运动神经元)中线粒体蛋白乙酰化是否降低；并且其中当接触后细胞(例如运动神经元)中线粒体蛋白乙酰化降低时，结论是该候选试剂或组合物是用于治疗ALS或ALS样疾病的试剂或组合物，其中当接触后细胞(例如运动神经元)中线粒体蛋白乙酰化未降低时，结论是该候选试剂或组合物不是用于治疗ALS或ALS样疾病的试剂或组合物。蛋白质乙酰化可以通过本领域技术人员已知的方法测量。例如，可以通过使用特异于乙酰赖氨酸残基的抗体检测赖氨酸乙酰化来测量蛋白质乙酰化。测量/测定可以是定性的、定量或半定量的。用于检测赖氨酸乙酰化状态的合适方法包括Western印迹分析、免疫沉淀、酶联免疫吸附测定(ELISA)质谱和这些方法的组合。在一个实施方案中，确定接触之后运动神经元中的线粒体蛋白乙酰化是否降低包括检测赖氨酸-68处的乙酰化。

在各种实施方案中，筛选/鉴定方法可以包括或进一步包括确定在接触后：SIRT3(或包含SIRT3的任何复合物)的表达(例如，基因和/或蛋白质表达)水平是否增加，编码SIRT3的RNA水平是否增加，编码SIRT3的核酸的转录是否增加，编码SIRT3的RNA的适当转录后加工(例如剪接，翻译，翻译后加工)是否被促进，SIRT3蛋白(或包含SIRT3的任何蛋白质复合物)的水平是否增加，SIRT3(或包含SIRT3的任何蛋白质复合物)的降解是否降低，SIRT3(或包含SIRT3的任何蛋白质复合物)与SIRT3的相互作用伴侣(或包含SIRT3的任何蛋白质复合物的相互作用伴侣)之间的相互作用是否被促进，SIRT3(或包含SIRT3的任何复合物)的功能水平是否增加/增强，SIRT3(或包含SIRT3的任何复合物)是否被激活，SIRT3(和/或包含SIRT3的任何复合物)的脱乙酰酶活性的水平是否增加，由降低的SIRT3活性引起的线粒体蛋白质超乙酰化是否减少/抑制，和/或SIRT3下游的靶标的脱乙酰化是否被促进，和/或候选试剂是否与SIRT3(或者其复合物)结合，并且其中在接触后实现了上述一种或多种，则结论是候选试剂是用于治疗ALS或ALS样疾病的试剂，其中上述一种或多种在接触后未实现，则结论是候选试剂不是用于治疗ALS或ALS样疾病的试剂。

在各种实施方案中，筛选/鉴定方法可以包括或进一步包括在接触后确定：GCN5L1(或包含GCN5L1的任何复合物)的表达(例如，基因和/或蛋白质表达)水平是否降低，编码GCN5L1的RNA水平是否降低，编码GCN5L1的核酸的转录是否降低/抑制，编码GCN5L1的RNA的转录后加工(例如剪接，翻译，翻译后加工)是否被降低/抑制，GCN5L1蛋白(或包含GCN5L1的任何蛋白质复合物)的水平是否降低/抑制，GCN5L1(或包含GCN5L1的任何蛋白质复合物)的降解是否增加/促进，GCN5L1(或包含GCN5L1的任何蛋白质复合物)与GCN5L1的相互作用伴侣(或包含GCN5L1的任何蛋白质复合物的相互作用伴侣)之间的相互作用是否被降低/抑制/破坏，GCN5L1(或包含GCN5L1的任何复合物)的功能水平是否降低，GCN5L1(或包含GCN5L1的任何复合物)的乙酰转移酶活性是否被抑制，GCN5L1(或包含GCN5L1的任何复合物)的乙酰转移酶活性的水平是否降低，由增加的GCN5L1活性引起的线粒体蛋白质的超乙酰化是否减少/抑制，和/或GCN5L1下游的靶标的乙酰化是否被降低/抑制，和/或候选试剂是否与GCN5L1(或者其复合物)结合，并且其中在接触后实现了上述一种或多种，则结论是候选试剂是用于治疗ALS或ALS样疾病的试剂，其中上述一种或多种在接触后未实现，则结论是候选试剂不是用于治疗ALS或ALS样疾病的试剂。

在各种实施方案中，筛选/鉴定方法可以包括或进一步包括确定候选试剂在接触后是否能够改善细胞(例如ALS或ALS样运动神经元)中的以下性质中的一种或多种：线粒体功能障碍，代谢呼吸缺陷，改变的形态，异常线粒体形态，存活/基础存活，胞体尺寸，初级神经突的量，内质网(ER)应激，基础呼吸，ATP相联的氧消耗率(OCR)，ATP生产，备用呼吸能力，氧化磷酸化，脱乙酰酶表达和/或活性(例如sirtuin如SIRT3)，复合物I活性，线粒体NAD⁺水平，CHOP基因表达，剪接的XBP1(sXBP1)量/水平，细胞外酸化率(ECAR)和线粒体自噬，例如与健康/正常运动神经元中的性质相似或更类似，以及当其中所述候选试剂能够改善上述性质中的一种或多种时，得出的结论是候选试剂是用于治疗ALS或ALS样疾病的试剂，其中当候选试剂不能改善上述性质中的一种或多种时，则结论是候选试剂不是用于治疗ALS或ALS样疾病的试剂。

上述性质的确定可以通过本领域技术人员已知的方法或本文所述的方法进行。此外，确定是定性的、定量的或半定量的。例如，在一些实施方案中，确定是否改变/调节(例如，减少/增加/促进/改善等)性质可以包括确定该性质是否在一定程度上被改变/调节，例如改变/调节了至少约5％，至少约10％，至少约15％，至少约20％，至少约25％，至少约30％，至少约35％，至少约40％，至少约45％，至少约50％，至少约55％，至少约60％，至少约65％，至少约70％，至少约75％，至少约80％，至少约85％，至少约90％，至少约95％，至少约99％或至少约100％或至少约0.1倍，至少约0.2倍，至少约0.3倍，至少约0.4倍，至少约0.5倍，至少约0.6倍，至少约0.7倍，至少约0.8倍或至少约0.9倍或超过约1倍，例如至少约1.05倍，至少约1.1倍，至少约1.15倍，至少约1.2倍，至少约1.25倍，至少约1.3倍，至少约1.35倍，至少约1.4倍，至少约1.45倍，至少约1.5倍，至少约1.55倍，至少约1.6倍，至少约1.65倍，至少约1.7倍，至少约1.75倍，至少约1.8倍，至少约1.85时间，至少约1.9倍，至少约2倍，至少约2.5倍，至少约3倍，至少约3.5倍，至少约4倍，至少约4.5倍，至少约5倍，至少约5.5倍，至少约6倍，至少约6.5倍，至少约7倍，至少约7.5倍，至少约8倍，至少约8.5倍，至少约9倍，至少约9.5倍或至少约10倍。

在各种实施方案中，提供与SEQ ID NO：1共享至少约70％，至少约71％，至少约72％，至少约73％，至少约74％，至少约75％，至少约76％，至少约77％，至少约78％，至少约79％，至少约80％，至少约81％，至少约82％，至少约83％，至少约84％，至少约85％，至少约86％，至少约87％，至少约88％，至少约89％，至少约90％，至少约91％，至少约92％，至少约93％，至少约94％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约98％，至少约99％序列同一性的寡核苷酸，或与SEQ ID NO：1相差约一个核苷酸/碱基，约两个核苷酸/碱基，约三个核苷酸/碱基，约四个核苷酸/碱基，约五个核苷酸/碱基，约六个核苷酸/碱基，约七个核苷酸/碱基基，约八个核苷酸/碱基，约九个核苷酸/碱基或约十个核苷酸/碱基的序列。在一些实施方案中，提供了与SEQ ID NO：1共享至少约75％序列同一性的寡核苷酸，或者与SEQ IDNO：1相差约一个核苷酸，约两个核苷酸，约三个核苷酸，约四个核苷酸，或约五个核苷酸的序列。在一些实施方案中，提供了用于疗法的寡核苷酸。

在各种实施方案中，提供了一种在健康的人iPSC细胞系的SOD1基因中产生杂合L144F突变，从而产生一对同基因iPSC的方法。在各种实施方案中，提供了一种在健康人iPSC细胞系的TDP43基因中产生杂合G298S突变，从而产生一对同基因iPSC的方法。在各种实施方案中，提供了生成SIRT3单倍体不足的人/小鼠iPSC模型的方法。在各种实施方案中，提供了一种运动神经元疾病模型，例如ALS或ALS样疾病模型，该疾病模型包括耗竭的SIRT3表达和/或单倍体不足的SIRT3。在各种实施方案中，提供了一种用于代谢通量测量的运动神经元富集的方法。在各种实施方案中，提供了一种用于体外表征iPSC衍生的神经元的方法，其中过低氧化和过高糖酵解代谢谱是ALS运动神经元的标志。在各种实施方案中，提供了一种用于在人运动神经元中激活SIRT3的方法，从而促进ALS运动神经元的健康线粒体呼吸和降低过高糖酵解表型。在各种实施方案中，提供了一种用于在人运动神经元中耗竭GCN5L1表达的方法，从而促进ALS运动神经元的健康线粒体呼吸和降低过高糖酵解表型。

在各种实施方案中，提供了如本文所述的方法、产品或用途。

附图说明

图1：ALS iPSC衍生的MN表现出患病表型。(A)MN分化方案的示意图。(B)野生型(BJ-iPS，18a和GM23720)、家族性ALS(29d、47a和19f)和散发性ALS(sALS1、sALS2、sALS3)iPSC衍生的培养物在第28天的免疫染色，表明ISL1⁺SMI32⁺MN的衍生。细胞核用DAPI复染色。比例尺，50μm。(C)从第25天至第35天的ISL1⁺MN的定量，展示野生型MN(BJ-iPS，18a和GM23720)保持存活，而家族性和散发性ALS MN随着时间推移显示显著降低的存活。(D)第28天在MN培养物中ER应激转录物CHOP和剪接XBP1(sXBP1)的qPCR定量。倍数变化相对于BJ-iPS中相应mRNA的表达水平标准化。(E)在第28天的同基因ALS(BJ-SOD1^L144F和BJ-TDP43^G298S)iPSC衍生培养物的免疫染色，表明ISL1⁺SMI32⁺MN的形成。细胞核用DAPI复染色。比例尺，50μm。(F)从第25至第35天的BJ-SOD1^L144F和BJ-TDP43^G298S衍生的ISL1⁺MN的定量揭示了类似于其他ALS细胞系的加速死亡表型。(G)从BJ-SOD1^L144F和BJ-TDP43^G298S衍生的MN培养物显示与其同基因对照细胞系BJ-iPS相比，CHOP和sXBP1的上调。在(D)和(G)中，基因表达相对于ACTINB和HPRT标准化。***P<0.001，n.s.不显著；双尾t检验。

图2：散发性和家族性ALS MN显示出过低氧化和过高糖酵解代谢谱。(A)健康和ALS患者衍生的分选神经元的代谢通量图，其中氧消耗率(OCR)作为时间的函数测量。通过加入复合物V抑制剂寡霉素、线粒体解耦联剂FCCP和复合物I和III抑制剂鱼藤酮和抗霉素A(AA)，使用MitoStress测定法来测量生物能学参数。(B)对于来自每种细胞系的分选神经元计算基础呼吸、ATP生产和备用呼吸，并在ALS MN中显示出降低的线粒体呼吸。(C)健康和ALS患者衍生的分选神经元的代谢通量图，其中细胞外酸化率(ECAR)作为时间的函数测量。通过添加葡萄糖、复合物V抑制剂寡霉素和己糖激酶抑制剂2-DG，使用糖酵解应激测定法来测量生物能学参数。(D)对于来自每种细胞系的分选神经元计算基础酸化、糖酵解和糖酵解能力，并在ALS MN中展示升高的糖酵解。(E)在第28天针对从健康、ALS和患病同基因iPSC衍生的皮质神经元进行使用MitoStress测定法的OCR测量和计算。(F)使用MitoStress测定法进行代谢通量分析。对BJ-iPS、BJ-SOD1^L144F和BJ-TDP43^G298S皮质神经元计算的基础呼吸、ATP生产和备用呼吸揭示了基础呼吸和ATP生产没有显著变化。同样，健康和ALS患者iPSC衍生的皮质神经元揭示了基础呼吸和ATP生产没有显著变化。(G)在第28天针对从健康、ALS和患病同基因iPSC衍生的心肌细胞进行使用MitoStress测定法的OCR测量和计算。(H)使用Mitostress测定法进行代谢通量分析。对BJ-iPS、BJ-SOD1^L144F和BJ-TDP43^G298S心肌细胞计算的基础呼吸、ATP生产和备用呼吸揭示了基础呼吸和ATP生产没有显著变化。同样，健康和ALS患者iPSC衍生的心肌细胞揭示了基础呼吸和ATP生产没有显著变化。***P<0.001，n.s.不显著；双尾t检验。

图3：家族性和散发性ALS MN中线粒体蛋白的超乙酰化。(A)第28天的iPSC衍生MN的Western印迹分析，在全细胞裂解物上针对SIRT3、总MnSOD、在赖氨酸-68处具有特定乙酰化的MnSOD(MnSOD K68ac)的探测，以及在纯化的线粒体提取物中针对乙酰赖氨酸蛋白的探测。(B)Western印迹带的密度测定分析显示ALS相对于健康MN中SIRT3蛋白水平没有显著变化。(C)相对于总MnSOD标准化的MnSOD(K68ac)的密度测量分析显示，在所有ALS iPSC衍生的MN中大约5倍上调的MnSOD(K68ac)。这表明ALS MN中的SIRT3活性降低。(D)对照和散发性ALS患者(SALS)腰部切片的免疫组织化学显示SALS患者腰部运动神经元中的MnSOD(K68ac)信号增加(箭头)。脂褐质在大的健康的运动神经元中可见，脂褐质是正常细胞衰老的功能表现且与疾病无关(*)。比例尺，2.5mm(左小图)和100μm(右小图)。(E)对照(n＝380)和SALS(n＝216)腰部运动神经元中的MnSOD(K68ac)信号的定量表明SALS患者中的MnSOD(K68ac)信号增加。(F)相对于TOMM20标准化的乙酰赖氨酸信号的密度测量分析显示，在所有ALSiPSC衍生的MN中线粒体蛋白的乙酰化增加了约3倍。(G)测量健康和ALS MN中的复合物I活性，其显示出在ALS MN中显著下降30％至80％。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，n.s.不显著；双尾t检验。

图4：MN中的SIRT3缺乏导致ALS样表型。(A)衍生自BJ-iPS和两种同基因SIRT3^+/-(#6和#17)克隆的第28天MN的Western印迹分析确认了SIRT3蛋白的减少，以及增加的MnSOD(K68ac)和线粒体蛋白的乙酰化增加。(B)Western印迹带的密度测量分析显示SIRT3^+/-#6和#17两者相对于健康MN中的SIRT3蛋白水平降低50％和MnSOD(K68ac)增加。(C)CHOP和sXBP1的qPCR测量显示SIRT3^+/-#6和#17中的两种ER应激转录物相对于同基因BJ-iPS对照显著上调。(D)使用MitoStress测定法对从BJ-iPS、SIRT3^+/-#6和#17分化的第28天MN的OCR测量。(E)从BJ-iPS、SIRT3^+/-#6和#17分化的第28天MN的基础呼吸、ATP生产和备用呼吸的测量。(F)使用糖酵解应激测定法对从BJ-iPS、SIRT3^+/-#6和#17分化的第28天MN的ECAR测量。(G)从BJ-iPS、SIRT3^+/-#6和#17分化的第28天MN的基础酸化、糖酵解和糖酵解能力的测量。(H)从第25天至第35天的BJ-SIRT3^+/-克隆衍生的ISL1⁺MN的定量揭示了与其健康对照(BJ-iPS)相比的进展性死亡表型。(I)从BJ-iPS、BJ-SIRT3^+/-#6和#17iPSC衍生的ISL1⁺SMI32⁺MN的代表性图像，显示在第28天以及第31天的MN的胞体尺寸(白色点线划界)。比例尺，50μm。(J)两种BJ-SIRT3^+/-克隆的平均细胞体尺寸和初级神经突的定量显示从第28天至第31天神经元健康状况的恶化。**p<0.01，***p<0.001，n.s.不显著；双尾t检验。

图5：NAM补充逆转线粒体呼吸缺陷并改善ALS MN中的神经元形态。(A)NAM补充后健康和ALS MN中线粒体NAD⁺水平的测量显示，ALS MN中的线粒体NAD⁺可用性增加。(B)将WT和ALS iPSC衍生的MN从第28天至第35天用H₂O或NAM进行处理。量化ISL1⁺MN的数量并相对于各细胞系中第28天的ISL1⁺MN的数量标准化。NAM补充防止了ALS MN中的MN死亡。(C-E)用水(作为对照)或0.5mM NAM处理的健康和ALS MN中的基础呼吸、ATP生产和备用呼吸的分别测量。(F)BJ-SOD1^L144F和BJ-TDP43^G298S的ISL1⁺SMI32⁺MN的代表性图像，说明NAM补充促进了更健康的神经元形态。MN细胞体尺寸由白色点线划界。比例尺，50μm。(G)胞体尺寸和初级神经突的测量显示NAM补充的ALS MN中神经元形态的总体改善。***p<0.001，n.s.不显著；双尾t检验。

图6：SIRT3的小分子活化剂，而非利鲁唑或依达拉奉，改善了ALS MN中的神经元形态。(A)使用C12(20μM)的针对SIRT3靶标的完整细胞中的代表性Western印迹和CETSA熔解曲线。(B)第31天的Western印迹分析显示在C12处理后ALS MN中的线粒体Ac-K信号降低。(C)从第28天至第35天将WT和ALS iPSC衍生的MN用DMSO/H₂O或C12/利鲁唑/依达拉奉处理。将ISL1⁺MN的数量定量并相对于相应细胞系中第28天ISL1⁺MN的数量标准化。C12、利鲁唑和依达拉奉处理阻止了ALS MN中的MN死亡。(D-F)用对照或C12/利鲁唑/依达拉奉处理的第31天MN培养物中ER应激转录物CHOP和剪接的XBP1(sXBP1)的qPCR定量。倍数变化相对于用DMSO或水处理的BJ-iPS MN中的相应mRNA的表达水平标准化。基因表达相对于ACTINB和HPRT标准化。***p<0.001，n.s.不显著；双尾t检验。图7：SIRT3的小分子活化剂，而非利鲁唑或依达拉奉，逆转ALS MN中的代谢缺陷。(A-C)用DMSO和C12处理的健康和ALS MN中分别测量基础呼吸、ATP生产和备用呼吸。值得注意的是，C12处理拯救了ATP生产恢复健康水平。(D-F)用DMSO和利鲁唑处理的健康和ALS MN中分别测量基础呼吸、ATP生产和备用呼吸。值得注意的是，利鲁唑处理不能逆转ALS MN线粒体生物能学缺陷。(G-I)用水和依达拉奉处理的健康和ALS MN中分别测量基础呼吸、ATP生产和备用呼吸。值得注意的是，依达拉奉处理不能逆转ALS MN线粒体生物能量学缺陷。(J)BJ-iPS、BJ-SOD1^L144F和BJ-TDP43^G298S的ISL1⁺SMI32⁺MN的代表性图像说明，仅C12处理促进更健康的神经元形态，显示在第28天和第31天的MN的细胞体尺寸(白色点线划界)。比例尺，50μm。***p<0.001，n.s.不显著；双尾t检验。

图8：GCN5L1敲低拯救的ATP生产逆转ALS MN中的代谢缺陷。用非靶向siRNA和GCN5L1 siRNA处理的健康和ALS MN中分别测量基础呼吸、ATP生产和备用呼吸，显示GCN5L1敲低拯救了ATP生产恢复至健康水平。

图9：GCN5L1敲低降低了ALS MN中的过高糖酵解表型。用非靶向siRNA和GCN5L1siRNA处理的健康和ALS MN中分别测量基础酸化、基础糖酵解和糖酵解能力。总之，GCN5L1敲低降低了ALS MN中的过高糖酵解表型。

图10：GCN5L1敲低促进ALS MN中的MN存活。从第28天到第35天将WT和ALS iPSC衍生的MN用非靶向siRNA或GCN5L1 siRNA处理。将ISL1⁺MN数量定量并相对于各细胞系中第28天的ISL1⁺MN的数量标准化。GCN5L1敲低阻止ALS MN中的MN死亡。

图11：GCN5L1敲低促进更健康的神经元形态。BJ-SOD1^L144F和BJ-TDP43^G298S的ISL1⁺SMI32⁺MN的代表性图像说明，GCN5L1敲低在第31天促进了更健康的神经元形态。比例尺，50μm。

图12：通过siRNA的GCN5L1敲低的确认。用针对人GCN5L1的siRNA转染MN显示出GCN5L1降低60％，这足以促进更健康的形态并改正与ALS MN相关的代谢表型。

图13：使用CRISPR/Cas9技术生成同基因细胞系(与图1和5相关)。汇总用于生成BJ-iPS背景中SOD1^L144F和TDP43^G298S突变的同基因敲入和SIRT3的同基因敲除的策略的示意图。引导RNA序列加下划线，用灰色突出显示PAM序列。(A)携带突变的单链寡核苷酸用作修复模板，以促进外显子5内的G至C转变，其产生亮氨酸(L)至苯丙氨酸(F)突变。(B)携带突变的单链寡核苷酸用作修复模板，以促进外显子5内的G至A转变，其产生甘氨酸(G)至丝氨酸(S)突变。(C)DNA测序分别在BJ-SIRT3^+/-#6和#17外显子1中确认6bp和9bp缺失。(D)两种同基因SIRT3单倍体不足克隆较好地分化成ISL1⁺SMI32⁺MN，效率类似于BJ-iPS。细胞核用DAPI复染色。比例尺，50μm。n.s.不显著。

图14：第10天的NPC中代谢通量测量显示ALS和健康细胞之间的不显著变化(涉及图2)。(A)对第10天的野生型和ALS NPC进行使用MitoStress测定法的OCR测量和计算。(B)对于来自每种细胞系的NPC计算基础呼吸、ATP生产和备用呼吸，显示ATP生产没有显著差异，但在ALS NPC中显著减少了备用呼吸。(C)对第10天的野生型和同基因ALS NPC进行使用MitoStress测定法的OCR测量和计算。(D)对于来自每种细胞系的NPC计算基础呼吸、ATP生产和备用呼吸，显示在ATP生产中没有显著差异，但在同基因ALS NPC中备用呼吸显著降低。(E)对第10天的野生型和ALS NPC进行使用糖酵解应激测定法的ECAR测量和计算。(F)对于来自每种细胞系的NPC计算基础酸化、糖酵解和糖酵解能力，显示出糖酵解没有显著差异。(G)对第10天的野生型和同基因ALS NPC进行使用糖酵解应激测定法的ECAR测量和计算。(H)对于来自每种细胞系的NPC计算基础酸化、糖酵解和糖酵解能力，显示糖酵解中没有显著差异。***p<0.001，n.s.不显著。

图15：其他代谢活性细胞类型中的代谢通量测量显示ALS和健康细胞之间的不显著变化(涉及图3)。(A)在皮质神经元分化的不同时间点对iPSC衍生培养物的免疫染色。细胞核用DAPI复染色。比例尺，50μm。(B)对第28天的衍生自健康、ALS和患病同基因iPSC的皮质神经元进行使用MitoStress测定法的OCR测量和计算。(C)对第28天的衍生自健康、ALS和患病同基因iPSC的心肌细胞实施使用MitoStress测定法的OCR测量和计算。***p<0.001，n.s.不显著。

图16：SIRT3激活或GCN5L1抑制逆转ALS MN中的疾病表型(涉及图5)。(A)在第28天的Western印迹分析确认si-SIRT3条件下的SIRT3敲低和增加的MnSOD(K68ac)水平。(B)Western印迹条带的密度测量分析显示si-SIRT3条件下的MnSOD(K68ac)水平显著增加。(C)在si-NT(深灰色)和si-SIRT3(浅灰色)条件下神经元的基础呼吸、ATP生产和备用呼吸的测量。(D)在健康和ALS MN中细胞内NAD⁺:NADH比的测量显示ALS MN中的NAD⁺可用性降低。(E)胞体尺寸和初级神经突的测量显示NAM补充的ALS MN中神经元形态的总体改善。(F)在第31天的Western印迹分析确认在ALS MN中的SIRT3过表达没有减少MnSOD(K68ac)水平，进一步证明SIRT3活性在ALS MN中受到影响。(G-I)对照(黑色)和SIRT3过表达(灰色)条件中的神经元的基础呼吸、ATP生产和备用呼吸的测量。(J)在31天GCN5L1敲低MN培养物中GCN5L1转录物的qPCR定量。倍数变化相对于非靶向MN培养物标准化。(K)胞体尺寸和初级神经突的测量显示GCN5L1敲低ALS MN中神经元形态的总体改善。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，n.s.不显著。

图17：C12激活SIRT3并减轻ALS患病表型(与图6和7相关)。(a)在第31天的Western印迹分析显示MnSOD(K68ac)水平的剂量依赖性降低，并且当C12浓度增加时SIRT3蛋白表达没有显著变化。(B)Western印迹带的密度测量分析显示在C12处理的MN中，SIRT3水平没有显著变化和MnSOD(K68ac)水平的剂量依赖性方式的显著降低。(c)用C12处理的ALS MN显示出在5μM时的运动神经元存活的改善。(D)ISL1⁺SMI32⁺ALS MN的代表性图像说明C12处理在5μM改善了运动神经元存活。(E-F)用DMSO或C12处理的第31天MN培养物中ER应激转录物CHOP和剪接XBP1(sXBP1)的qPCR定量。倍数变化相对于用DMSO或水处理的BJ-iPS MN中的相应mRNA的表达水平标准化。(G-I)用DMSO作为对照(浅灰色)或5μM C12(深灰色)处理的健康和ALS MN中分别测量糖酵解和糖酵解能力。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，n.s.不显著。

图18：C12处理而非利鲁唑或依达拉奉处理，改善了ALS MN中的神经元形态(与图7相关)。(A-B)胞体尺寸和初级神经突的测量显示C12处理过的ALS MN中神经元形态的总体改善。(C)衍生自健康和ALS iPSC的ISL1⁺SMI32⁺MN的代表性图像，显示在第28天和C12处理后第31天的MN的细胞体尺寸(在白色虚线中划界)。比例尺，50μm。(D)衍生自健康和ALSiPSC的ISL1⁺SMI32⁺MN的代表性图像，显示在第28天和用利鲁唑或依达拉奉处理后第31天的MN的细胞体尺寸(在白色虚线中划界)。比例尺，50μm。(E-H)用利鲁唑或依达拉奉处理ALSMN并未改善神经元形态。经处理的神经元的胞体尺寸和初级神经突数量的测量显示与其各自对照相比没有显著变化。***p<0.001，n.s.不显著。

图19：C12靶向/激活SIRT3并在SIRT3缺陷克隆中不显示效果。(A-C)用C12处理SIRT3^+/-克隆#6和#17未改善MN存活、MN形态或线粒体呼吸。

图20：SIRT3激活逆转对于ALS MN特异性的线粒体呼吸缺陷。(与图7相关)。(A)对第28天的健康(BJ-iPS)和SMA I型(1-38G)MN实施使用MitoStress测定法的OCR测量和计算。(B)计算基础呼吸、ATP生产和备用呼吸，并揭示SMA I型中的线粒体生物能学降低。(C)在用DMSO(浅灰色)或5μM C12(深灰色)处理的BJ-iPS和SMA I型MN中使用MitoStress测定法进行OCR测量。(D)分别测量用DMSO作为对照(浅灰色)或5μM C12(深灰色)处理的健康(BJ-iPS)和SMA型I(1-38G)MN中的基础呼吸、ATP生产和备用呼吸，显示SMA MN中没有线粒体生物能学的改善，表明SIRT3激活在拯救ALS MN中的特异性。***p<0.001，n.s.不显著。

实施例

从以下论述且如果适用的话连同附图，将更好理解本公开的示例实施方案且对于本领域普通技术人员更容易明显。应当理解，可以在不偏离本发明的范围的情况下可进行一些修改。示例实施方案不一定彼此互斥，因为一些可以与一个或多个实施方案组合以形成新的示例性实施方案。

结果

从ALS患者iPSC和同基因ALS敲入iPSC产生的MN表现出降低的线粒体呼吸和ATP生产

使用确立的方案从三种健康的iPSC细胞系BJ-iPS、18a和GM23720，3种散发性ALS细胞系sALS1、sALS2和sALS3，以及家族性ALS iPSC(携带以下突变)：29d(SOD1^L144F)、49a(TDP43^G298S)和19f(C9ORF72扩展的GGGGCC重复)分化成MN(图1A)。使用该化学限定的方案，在第28天从所有这些iPSC细胞系有效衍生ISL1⁺SMI32⁺MN(图1B)。为了确认先前报道的这些细胞系中的ALS表型，从第25天到第35天测量ISL1⁺MN的基础存活，发现加速的死亡表型与ALS MN有关(图1C)。由于升高的ER应激也是ALS MN的分子签名，因此也测量了ER应激途径中的关键基因的mRNA水平，并且发现了CHOP和剪接XBP1(sXBP1)的显著上调(图1D)。

为了确保ALS特异性表型和分子谱不是由于细胞系之间的固有可变性造成的，产生了同基因对照，其中使用CRISPR/Cas9技术将SOD1^L144F和TDP43^G298S突变引入健康BJ-iPS细胞系中(图1E；图13A，13B)。然后通过DNA测序证实突变(图13A，13B)。类似于用患者iPSC细胞系观察到的，从同基因SOD1^L144F(BJ-SOD1^L144F)和TDP43^G298S(BJ-TDP43^G298S)敲入细胞系衍生的MN也显示出降低的MN存活和升高的ER应激基因CHOP和sXBP1的表达(图1F，1G)。

虽然已经显示ALS神经元具有异常线粒体，但尚未确立这些形态异常是否对ALSMN中的线粒体功能有任何影响。由于氧化磷酸化对于维持神经元代谢和存活至关重要，因此研究了ALS MN中的线粒体呼吸是否可能会受到损害。为了在iPSC衍生的培养物中富集MN，使用PSA-NCAM和CD171抗体的混合物进行磁性分选。使用该分选策略，将ISL1⁺MN富集至约60％(图14A，14B)，其中没有使用AraC，AraC有时用于在培养物中耗竭神经祖细胞(NPC)但是也通过氧化应激诱导神经元死亡。为了研究ALS MN是否表现出代谢呼吸缺陷，使用细胞外通量分析仪测量这些分选神经元的氧消耗率(OCR)作为时间的函数。发现与健康MN相比，家族性和散发性ALS细胞系均展现出显著降低的基础呼吸，降低的ATP相联的OCR以及备用呼吸能力(图2A，2B)。同样，从BJ-SOD1L^144F和BJ-TDP43^G298S同基因iPSC衍生的MN在基础呼吸(P<0.0001)，ATP生产(P<0.0001)和备用呼吸能力(P<0.01)中表现出类似的降低，类似于29d和47a MN，29d和47a MN也分别具有SOD1中的杂合L144F突变和TDP43中的G298S突变(图2A，2B)。

由于患病MN的ATP生产在各种ALS细胞系中减少了至少25％，因此推断这些神经元必须转向其他能量来源以促进其代谢需求。要了解这些神经元是否切换到糖酵解以满足其能量需求，测量细胞外酸化率(ECAR)，并且发现与健康MN相比，ALS MN表现出糖酵解和糖酵解能力增加(图2C，2D)，展示出细胞代谢的转变。类似地，这种从氧化磷酸化到糖酵解的代谢机制的转变在BJ-SOD1^L144F和BJ-TDP43^G298S MN(相比于BJ-iPS MN)中重演，揭示这是ALS特异性代谢特征，而不是由于细胞系之间的变化(图2C，2D)。为了评估MN中这些代谢变化的特异性，测量了第10天NPC的OCR，发现ALS NPC对基础呼吸和ATP相联的OCR没有显著变化。然而，ALS NPC中的备用呼吸能力降低了约一半(图14C，14D)。此外，第10天NPC的糖酵解概况未显示在健康和ALS细胞之间的显著变化(图14E，14F)。

从ALS iPSC衍生的其他代谢活性细胞类型未显示线粒体呼吸的明显降低

接下来，想知道导致ALS的突变是否影响所有主动呼吸的细胞类型或特定地MN。为此，使用28天的方案将所有iPSC朝向BRN2⁺SATB2⁺皮质神经元分化(图15A-15B)。然后将这些神经元在96孔板上重铺板以进行代谢通量分析。OCR测量显示，BJ-SOD1^L144F和BJ-TDP43^G298S皮质神经元之间相对于其同基因BJ-iPS皮质神经元在基础呼吸和ATP产生方面没有显著差异(图2E，2F)。同样地，从家族性和散发性ALS iPSC衍生的皮质神经元与3个健康对照相比没有显示出在基础呼吸和ATP生产方面的显著差异(图2E，2F)。然而，注意到在所有ALS皮质神经元中备用呼吸能力降低超过一半，表明这些细胞可能更容易受到代谢应激的影响。

为了研究非神经细胞类型，从所有iPSC也衍生出cTnT⁺心肌细胞(图15C)，并进行代谢通量分析。BJ-SOD1^L144F和BJ-TDP43^G298S心肌细胞与其同基因健康对照在基础呼吸和ATP生产方面没有显著不同，尽管总呼吸能力也降低了(图2G，2H)。同样地，对于家族性和散发性ALS患者衍生的心肌细胞也获得类似的结果(图2G，2H)。总之，结果表明降低的线粒体呼吸和糖酵解的伴随升高是ALS MN的一种代谢标志。

与线粒体蛋白的超乙酰化相关的ALS MN代谢缺陷

已经确定线粒体呼吸缺陷是常见的并且对于家族性和散发性ALS是独特的，寻求理解这些缺陷背后的机制。已知线粒体呼吸通过线粒体蛋白的乙酰化进行精细调节，并且该过程受到线粒体脱乙酰酶SIRT3以及GCN5L1的调控，GCN5L1是提出的催化逆反应的乙酰转移酶。由于已经显示SIRT3耗竭导致肌肉、心脏和肝组织中的线粒体蛋白质超乙酰化，因此研究SIRT3的损失是否导致观察到的ALS特异性代谢缺陷。然而，Western印迹分析并未揭示健康和ALS MN或来自同基因iPSC细胞系组的MN之间的SIRT3水平的显著变化(图3A，3B)。假定SIRT3即使表达水平未改变，但活性可能受到影响。因此，为了确定SIRT3活性，测量表征最多的SIRT3靶标之一MnSOD上的赖氨酸68的相对乙酰化(MnSOD K68ac)。实际上，Western印迹分析揭示了在所有ALS MN培养物(包括散发性MN和同基因MN)中与健康对照相比高得多的MnSOD K68ac，表明SIRT3活性降低(图3A，3C)。还通过免疫组织化学分析人死后的腰部脊髓切片，确认了散发性ALS患者与非ALS对照相比在腰部脊髓的alpha MN中更高的MnSOD K68ac信号(图3D，3E)。由于SIRT3在线粒体中具有多种靶标，因此预计SIRT3活性的损失会影响全局线粒体乙酰化。为了确认这一点，从所有iPSC衍生的MN收获线粒体提取物，使用针对乙酰赖氨酸的特异性抗体进行乙酰化蛋白的免疫印迹。Western印迹分析显示所有ALS细胞系与健康对照相比显著更高的乙酰化蛋白的强度，与MnSOD K68ac测定一致(图3A，3F)。SIRT3相互作用组研究已经揭示了其下游靶标中的几种复合物I亚基。在这些研究中扩展，发现在所有ALS MN中观察到降低的复合物I活性(图3G)，这解释了在这些ALS MN中观察到的更低的基础线粒体呼吸(图2)。

SIRT3功能的损失模拟ALS表型

为了评估SIRT3在调节线粒体生物能学中的功能，创建了SIRT3消耗的遗传模型并进行RNA干扰以研究SIRT3消耗对MN存活和功能的影响。使用CRISPR/Cas9方法，产生多种同基因SIRT3单倍体不足(SIRT3^+/-)iPSC细胞系(图13C)。在总共筛选的66个克隆中有31个是杂合的敲除(47％)，而其中没有一个是完全敲除，表明SIRT3缺陷的iPSC是不可存活的。随机选择SIRT3^+/-克隆#6和#17，并显示两种克隆分化为MN的效率与同基因对照BJ-iPS大致相同(图3D)。BJ-SIRT3^+/-#6和#17都通过Western印迹验证，显示SIRT3蛋白降低50％。在BJ-SIRT3^+/-#6和#17中，MnSOD K68ac水平也显著更高，表明SIRT3在调节线粒体蛋白的乙酰化状态方面是重要的(图4A，4B)。此外，纯化的线粒体提取物也显示克隆#6和#17具有更多的乙酰基赖氨酸残基(图4A)，与在ALS iPSC衍生的MN中看到的超乙酰化线粒体谱一致(图3A)。已经示出了体外ALS表型的情况，其包括加速的MN死亡、升高的ER应激信号传导、更小的细胞体和过低氧化/过高糖酵解代谢谱(图2)。因此，寻求确定SIRT3的损失是否能在体外诱导ALS表型。来自两种SIRT3^+/-克隆的第28天MN中的ER应激转录物的测量显示出CHOP和sXBP1 mRNA的显著上调(图4C)，类似于在测试的所有ALS MN中看到的(图1D)。代谢通量测量证实，从两种SIRT3^+/-克隆衍生的MN表现出降低的线粒体呼吸(图4D，4E)和同时升高的糖酵解(图4F，4G)。在表型上，衍生自两种SIRT3^+/-克隆的运动神经元在第31天具有降低的存活(图4H)以及显著减少的胞体尺寸和初级神经突(图4I，4J)。鉴于SIRT3^+/-MN显示ALS样表型，这表明SIRT3活性的部分损失促进了ALS发病机制。

接下来，为了确认使用SIRT3^+/-MN的前述结果，在第25天进行小干扰RNA(siRNA)介导的敲低以瞬时耗竭健康的BJ-iPS MN中的SIRT3水平。在第28天，确认了mRNA和蛋白质水平两者上70％的敲低，以及增加的MnSOD K68ac，指示SIRT3活性降低(图16A，16B)。分析第28天的这些神经元也揭示了OCR参数的降低(图16C)。总之，这些结果表明SIRT3在维持MN中的线粒体生物能学方面是重要的，且SIRT3的消耗导致ALS样表型。

SIRT3激活或GCN5L1抑制改善了ALS MN中的代谢缺陷

由于SIRT3是NAD⁺依赖性脱乙酰化酶，因此SIRT3活性降低的一种可能是由于ALSMN中的线粒体NAD⁺的水平不足。为了研究这一点，在从iPSC衍生的MN提取的分离的线粒体中测量NAD⁺水平，发现与健康对照相比，在散发性、家族性和同基因ALS MN的线粒体中NAD⁺水平降低了60-80％(图5A)。使用0.5mM烟酰胺(NAM)即NAD⁺的前体，显示在ALS MN中线粒体NAD⁺水平显著升高(图5A)并促进了ALS MN存活(图5B)。NAM补充增加了ALS MN中线粒体NAD⁺水平(图5A)，导致显著改善的基础线粒体呼吸、ATP生产以及备用呼吸能力(图5C-E)。值得指出的是，NAM补充没有提升线粒体NAD⁺水平，对健康MN的线粒体呼吸没有显著影响，表明是对ALS MN的靶向性拯救。此外，添加外源NAM至细胞培养基能够促进与野生型MN相似的更健康的神经元形态(图5F，5G)。

接下来，想知道SIRT3的过表达是否能改善ALS MN代谢缺陷。使用诱导型SIRT3表达性慢病毒或对照GFP病毒，所有iPSC衍生的MN在第28天感染并在第31天收获进行分析。通过免疫印迹，验证了SIRT3在健康和ALS iPSC衍生的MN中均可靠地过表达，但是MnSODK68ac信号在过表达SIRT3的ALS MN中没有减少(图16D)。值得注意的是，SIRT3过表达显著改善了健康MN中的基础呼吸、ATP生产和备用呼吸能力，但在ALS MN中没有显著影响(图16E-G)，证明SIRT3活性而非表达在ALS MN中受限的先前结果。因此，在不添加NAM或其他NAD⁺前体的情况下仅仅过表达SIRT3对ALS MN中的线粒体呼吸没有显著影响并不令人惊讶。

由于GCN5L1涉及到促进线粒体中的乙酰化，因此接下来研究沉默GCN5L1是否能改善ALS MN中的代谢缺陷和其他相关表型。为此，用靶向GCN5L1的siRNA转染iPSC衍生的MN，并达到60％敲低(图16J)。使用MitoStress试剂盒的代谢通量分析显示了GCN5L1敲低ALSMN中的基础呼吸、ATP生产和备用呼吸能力的显著改善(图8)。此外，ECAR测量显示基础酸化和糖酵解速率降低，表明GCN5L1敲低改正ALS MN中的标志性代谢缺陷(图9)。GCN5L1的敲低还促进了ISL1⁺MN的存活和更健康的神经元形态(图10；图16K)。

SIRT3的小分子激活剂而非利鲁唑或依达拉奉，改善了ALS MN中的线粒体生物能学

虽然迄今没有已知的特异性GCN5L1抑制剂得到描述，但已经鉴定了少量的SIRT3激活剂，包括先前鉴定为7-羟基-3-(4'-甲氧基苯基)香豆素或C12的特异性SIRT3激动剂，其以高亲和力改变SIRT3活性位点的构象，并促进下游靶标的脱乙酰化。为了评估C12与SIRT3结合的特异性，使用细胞热迁移测定法(CETSA)，证实C12促进SIRT3而非另一种大量表达的sirtuin即SIRT1的热稳定性(图6A)。接下来通过用增加剂量的C12处理衍生自ALS细胞系之一(BJ-SOD1^L144F)的MN来进行C12的剂量应答测定。Western印迹分析显示MnSODK68ac信号以剂量依赖性方式降低，而SIRT3和总MnSOD蛋白水平保持不变(图17A，17B)。还注意到，用10μM C12处理是细胞毒性的(图17C，17D)，并决定使用5μM C12进行后续实验。通过用5μM C12处理ALS MN组，进一步显示所有ALS培养物中的线粒体乙酰基赖氨酸信号显著降低(图6B)，证明C12促进了线粒体脱乙酰化。

接着将C12的效果与ALS的FAD批准治疗物利鲁唑和依达拉奉进行比较。利鲁唑通过阻断钠通道发挥功能，依达拉奉充当ROS清除剂。然而，目前尚不清楚利鲁唑和依达拉奉是否会调节线粒体呼吸。为此，第28至31天将iPSC衍生的MN用利鲁唑、依达拉奉或DMSO和水对照处理。第28至31天将iPSC衍生的MN的储库用C12、利鲁唑、依达拉奉或DMSO和水对照处理。首先，发现所有三种化合物都促进了ALS MN存活(图6C)。同样地，所有三种化合物在所有ALS MN中均显著减少了ER应激转录物CHOP和sXBP1的表达(图6D-F)。

第31天的代谢通量分析显示C12促进了ALS MN中的线粒体呼吸(图7A-C)，降低了糖酵解(图17E-G)，并增加了线粒体复合物I活性(图17H)。代谢通量分析表明，利鲁唑和依达拉奉处理没有显示出ALS MN的代谢谱中的任何显著变化(图7D-I)，表明用利鲁唑或依达拉奉处理没有改善线粒体生物能学。C12处理还改善了神经元形态，导致更大的胞体尺寸和增加数量的初级神经突，类似于健康MN(图7J，图18A-C)。然而，用利鲁唑或依达拉奉处理没有改善神经元形态(图7J，图18D-H)。总的来说，这些数据表明SIRT3活化在促进运动神经元存活和维持ALS MN中的线粒体生物能学方面是有效的。

值得注意的是，用C12处理BJ-SIRT3^+/-#6和#17未促进存活或改善神经元形态(图19A，19B)。C12处理SIRT3缺陷性克隆也没有改善线粒体呼吸(图19C)，提供了额外的证据，即C12通过促进SIRT3活性而不是通过非特异性的脱靶效应来发挥作用。

最后，想知道SIRT3激活是否具有一般的神经保护作用还是特异于对ALS MN的拯救。为了调查这一点，决定分析C12处理对脊髓肌萎缩(SMA)患者来源的MN的影响。SMA是一种常染色体隐性运动神经元病症，由SMN1基因的两个拷贝中的突变引起，导致大幅减少的全长功能性SMN蛋白。将来自严重I型SMA患者(1-38G)的iPSC朝向MN分化，并在第28天进行MitoStress测定，测量到与健康的BJ MN相比，SMA MN中的基础呼吸和ATP生产中的显著下降(图20A，20B)。随后用C12处理这些SMA MN没有改善代谢缺陷(图20C，20D)，表明SIRT3活化是特异于对ALS MN的拯救的。

讨论

ALS是一种异质性运动神经元疾病，但所有患者都有类似的临床表现，表明独立于已知导致ALS的各种遗传突变而存在会聚的发病途径的可能性。在本公开中，鉴定了散发性和家族性ALS MN的代谢标志，其特征在于过低氧化和过高糖酵解。乳酸(糖酵解途径的终产物)的生产和释放的增加将解释在SOD1^G93A小鼠中看到的中枢神经系统酸中毒。在散发性ALS患者的死后脊髓中也观察到细胞呼吸的降低。很可能过高糖酵解代谢是一种补偿机制以克服ALS MN中通过氧化磷酸化产生的ATP的缺乏，因为通过NAM补充和SIRT3激活恢复ATP产生也纠正了过高糖酵解代谢谱。

虽然在ALS发病机制中其它线粒体sirtuin的功能相关性仍待阐明，但本公开证明了SIRT3在调节MN中线粒体功能的重要性。已经在许多神经退行性疾病以及代谢病症中看到SIRT3缺陷。SIRT3丧失导致SOD1^G93A小鼠的脊髓运动神经元中的线粒体片段化，引起神经元死亡。一个关键的发现是，降低的线粒体呼吸和超乙酰化的线粒体蛋白质是ALS MN的分子标志。从家族性和散发性iPSC患者以及具有SOD1^L144F和TDP43^G298S突变的同基因iPSC细胞系衍生的MN显示乙酰化的线粒体蛋白质(包括MnSOD K68ac)的一致增加，MnSOD K68ac是详细表征的SIRT3的一种靶标。ALS脊髓的死后分析进一步证实了这一发现。该分子缺陷伴随着线粒体呼吸中的所得缺陷，其被SIRT3激活逆转。

除了使用患者衍生的iPSC之外，还制备了同基因细胞系以确认以下发现，即SIRT3活性的丧失导致线粒体代谢缺陷以及ALS样表型的情况。注意到SIRT3^-/-iPSC在这项研究中，然而具有完全Sirt3敲除的小鼠正常发育而不是胚胎致死的，尽管神经元存活和功能似乎受到影响。据信这些可能是由于物种特异性的差异。然而，结果证实，SIRT3的部分丧失足以导致iPSC衍生的MN中的ALS表型。

已显示GCN5L1促进线粒体中的乙酰化，并与SIRT3共享一部分线粒体靶标。尽管GCN5L1在启动乙酰化中的机制仍然很大程度上是未知的，但已经显示敲低GCN5L1导致线粒体蛋白乙酰化的降低和线粒体OCR的改善。类似地，ALS MN中GCN5L1的敲低改善了线粒体呼吸并降低了糖酵解能力，证明了GCN5L1在调节线粒体呼吸中的作用。在用靶向GCN5L1的siRNA处理的ALS MN中，也观察到改善的MN存活和神经元形态，表明GCN5L1是逆转ALS MN中的代谢缺陷和减缓疾病病理学的潜在靶标。

除了逆转ALS MN中的代谢缺陷外，SIRT3活化和/或GCN5L1抑制还拯救其他体外ALS表型。这表明早期的ALS神经元缺陷是可逆的和可治疗的，并且SIRT3-GCN5L1轴是调节MN功能和完整性的关键的上游途径。支持数据还显示出Sirt3^-/-小鼠皮质神经元特别容易受到兴奋性、氧化和代谢应激的影响。数据支持与健康人群相比，ALS患者中的NAD⁺水平降低，并证实NAM(NAD⁺的前体)的补充逆转ALS表型。另外，在成年小鼠投射神经元中的细胞内烟酰胺磷酸核糖转移酶(iNAMPT)敲除导致模拟ALS的MN变性表型。iNAMPT充当哺乳动物NAD⁺生物合成挽救途径的限速酶。已经注意到，运动神经元中iNAMPT的耗竭导致线粒体蛋白质超乙酰化，其最有可能是由于低NAD⁺水平带来的SIRT3活性降低所致。总之，这些发现表明NAD⁺在调节线粒体功能和代谢过程中是重要的，可能通过SIRT3活化进行。

该领域感兴趣的是，还发现两种FDA批准用于ALS治疗的药物利鲁唑和依达拉奉在逆转作为ALS MN签名的线粒体代谢缺陷方面是无效的。这可以解释药物的最小益处–发现利鲁唑在延髓发作性ALS患者中而非患有肢体发作性ALS的受试者中是有效的，患有肢体发作性ALS的受试者构成了ALS患者的大多数。平均而言，利鲁唑将生命期延伸了3个月，而依达拉奉仅在小部分ALS患者中表现出功效。

总之，使用患者衍生的iPSC和同基因iPSC的本公开揭示了降低的线粒体呼吸和升高的糖酵解是ALS MN的代谢标志。还建立了线粒体SIRT3的激活对于散发性和家族性ALS而言是逆转疾病表型的靶标。最后，数据证实NAM补充以及小分子SIRT3激动剂逆转几种体外ALS表型，并具有开发成有效治疗的治疗潜力。

方法

关键资源表

*该表旨在是例示性的，而非限制可以使用的材料。

hiPSC在iPS-Brew hPSC培养基中的培养

所有hiPSC细胞系在具有iPS-Brew XF的Matrigel涂覆的培养皿上根据产品的说明书进行无饲养层培养。每6-7天使用ReLeSR(Stem Cell Technologies)进行一次常规传代。本研究中使用的iPSC细胞系及其突变列于下面的表S1中。

表S1：使用的细胞系列表

朝向运动神经元的定向分化

按照先前描述的已建立的方案(4)，将多能干细胞朝向脊柱运动神经元分化。简言之，将人iPSC首先神经化，其通过用CHIR99021处理(4.25μM)激活Wnt途径，同时通过LDN-193189处理(0.5μM)阻断骨形态发生蛋白(BMP)信号传导。在第3天，使用视黄酸(1μM)和2,6,9-三取代嘌呤(1μM)分别尾部化和腹部化处理(caudalize and ventralize)培养物。在第17天将神经营养因子BDNF(10ng/ml)和GDNF(10ng/ml)加入神经元培养物中，以促进神经元熟化成运动神经元。在整个运动神经元分化中使用N2B27培养基(50％DMEM/F12，50％Neuro培养基，1％L-Glutamax，1％MEM非必需氨基酸，补充有1％N2补充剂和2％B27补充剂)。

朝向皮质神经元的定向分化

按照先前描述的已建立的方案(5)并进行稍微改动，将多能干细胞朝向皮质神经元分化。将人iPSC首先神经化，其使用SB431542处理(8μM)以抑制TGF-β途径，同时用LDN-193189处理(0.5μM)阻断骨形态发生蛋白(BMP)信号传导。在第14天，通过添加DAPT(2.5μM)再进行7天进一步分化皮质神经祖细胞。在第21天将神经营养因子BDNF(10ng/ml)和GDNF(10ng/ml)加入神经元培养物中，以促进神经元成熟为皮质神经元。在整个皮质神经元分化中使用缺少维生素A的N2B27培养基(50％DMEM/F12，50％Neuro培养基，1％L-Glutamax，1％MEM非必需氨基酸，补充有1％N2补充剂和2％B27补充剂，没有维生素A)。

朝向心肌细胞的定向分化

按照先前描述的已建立的方案(6)，将多能干细胞朝向心肌细胞分化。简而之，首先将人iPSC定向为中内胚层，其通过在缺乏胰岛素的RPMI/B27中用CHIR99021处理(12μM)一天来激活Wnt途径。为了将这些中内胚层祖细胞定向为心脏命运，在第3天将IWP2(5μM)加入到培养物中在缺乏胰岛素的RPMI/B27中达两天。在第7天，在具有胰岛素的RPMI/B27中培养心脏中胚层细胞以发育成功能性收缩的心肌细胞。

BJ-IPS细胞系中Cas9介导的敲除/敲入

使用在crispr.mit.edu上(关闭前)张峰实验室的指导设计工具来设计向导RNA(gRNA)：将gRNA克隆到含Cas9的质粒PX458或PX459中，并使用Lipofectamine 2000转染试剂转染到293T细胞中进行surveyor核酸酶测定。使用Lipofectamine Stem转染试剂将已验证的gRNA和ssODN(表S2)转染到BJ-IPS hiPSC中。转染后2天，将培养物分选用于GFP+细胞或用1μM嘌呤霉素选择。然后将单细胞铺板并允许在筛选前扩增。收集集落的gDNA并在Sanger测序(Applied Biosystems 3730xl)之前进行PCR扩增。

表S2：用于CRISPR/Cas9研究的寡核苷酸列表

运动神经元存活测定

在第23天用AraC处理运动神经元培养物，并在第24天以96孔板每孔75,000个细胞接种。然后分别在第25、28、31和35天用4％PFA固定培养物，用于定量运动神经元存活。将固定的培养物用运动神经元标记物ISL1染色，并且用DAPI复染色细胞核，然后在高容量显微镜Phenix(Perkin Elmer)上成像。将ISL1+细胞的百分比相对于总细胞核数标准化。为了计算标准化的存活指标，将第25天ISL1+/DAPI的百分比任意设定为1.0，并且继而将在后续日的运动神经元存活相对于第25天培养物标准化。进行一式三份生物重复，每种最少有5份技术重复。

神经元的磁性微珠分选

与用Accutase解离后，用含有磷酸盐缓冲盐水、0.5％牛血清白蛋白(BSA)和2mMEDTA的溶液封闭细胞。然后将细胞与CD171-APC抗体(Miltenyi Biotec)和PSA-NCAM-APC抗体(Miltenyi Biotec)在4℃一起孵育10分钟。洗涤后，将细胞与抗APC微珠一起在4℃孵育15分钟。然后将细胞洗涤两次并过滤，接着加载到附接于磁力架的分离柱(LS柱)(均来自Miltenyi Biotec)。在三轮洗涤后，从磁力架移出柱，并在培养基中洗脱标记的细胞以进行重铺板。

使用Seahorse XFe96分析仪进行代谢通量分析

使用XFe96 Seahorse Bioscience细胞外通量分析仪(Agilent Technologies)测量线粒体氧消耗率(OCR)和细胞外酸化率(ECAR)。在测定之前24小时，将纯化的运动神经元或神经祖细胞以每孔125,000个神经元铺板到Matrigel预涂覆的Seahorse 96孔板上。在测定前45分钟，将培养基改变为175ul新鲜的Seahorse DMEM基础培养基。Seahorse分析仪注射端口填充1μM寡霉素、1μM FCCP或0.5μM分别的鱼藤酮和抗霉素A，用于OCR。对于ECAR，按照制造商的说明使用10mM葡萄糖、1μM寡霉素和50mM 2-DG。根据制造商的说明记录、标准化和量化OCR和ECAR的水平。进行一式三份生物重复，每种最少有5份技术重复。

MN培养物中的小分子处理

在DMSO中重构利鲁唑并基于先前的工作(7)以5μM的终浓度使用，而将依达拉奉溶解在水中并以100μM的终浓度使用(8)。在水和DMSO中分别重构NAM和C12，并在培养基中稀释至分别为0.5mM(9)和5μM的所需浓度。第27天将运动神经元在96孔板以每孔75,000个细胞中接种。用相应的小分子的处理在第28天开始，共3天。进行一式三份生物重复，每种最少有5份技术重复。

MN培养物中的RNA干扰

将第27天的运动神经元培养物用Accutase解离并在6孔板中以每孔200万个细胞接种。在第28天，按照制造商的说明将非靶向siRNA或siRNAs各自与LipofectamineRNAiMAX复合，并添加到运动神经元培养物中。对于每个孔，使用10pmol siRNA和8μlLipofectamine RNAiMAX。收获细胞用于RNA和蛋白质分析，固定用于免疫染色或者在siRNA转染后3天进行代谢通量分析。

RNA提取和RT-qPCR

按照制造商的说明在Trizol试剂中收获细胞用于RNA提取。使用高容量cDNA逆转录试剂盒将纯化的RNA转化为cDNA，并且使用PowerUp^TMSYBR^TM Green Master Mix在QuantStudio 5实时PCR系统(均来自Applied Biosystems)上进行定量PCR(qPCR)。除非另有说明，否则基因表达相对于HPRT和ACTB表达标准化。使用的引物列于表S3中。

表S3：qPCR研究中使用的人引物列表

SDS-PAGE和Western印迹

将蛋白质裂解物在Tris-甘氨酸-SDS缓冲液中的12％SDS-PAGE凝胶或4-20％预制凝胶中解析。然后将蛋白质转移到硝化纤维膜并用TBST缓冲液中5％奶粉封闭。将一抗在5％乳中稀释，并在4℃与膜温育过夜。使用的一抗列于表S4中。膜在TBST缓冲液中洗涤三次。然后将相应的辣根过氧化物酶二抗(Life Technologies)在5％乳中1：5000稀释，并在室温温育90分钟。将印迹洗涤三次，然后暴露于ECL以进行成像。

表S4：Western印迹和免疫染色研究中使用的抗体列表

细胞热迁移测定(CETSA)

如先前描述(3)的进行CETSA，且将HEK293T细胞用于进行实验。简言之，在低附接板上将3000万个细胞暴露于终浓度为20μM的C12或DMSO达1小时。孵育后，收获细胞，洗涤，沉淀并重悬于1mL的PBS中。将等量的细胞悬浮液等分到Eppendorf管中。然后加热细胞悬浮液(48-68℃)并使用2个冻融循环裂解。如上所述，通过Western印迹分析分离和分析可溶性级分。

线粒体分离

使用MACS技术分离来自运动神经元培养物的线粒体。在重悬于冰冷的裂解缓冲液之前，首先将运动神经元培养物用Accutase处理并用PBS洗涤两次。然后用dounce匀浆仪(Pestle B)以15个冲程将细胞匀浆化。基于制造商的说明用1x分离缓冲液稀释匀浆物。加入抗TOM22以磁性标记线粒体，接着在4℃温育1小时。然后将细胞洗涤两次并在加载到附接于磁力架的分离柱(LS柱)之前过滤(均来自Miltenyi Biotec)。三轮洗涤后，从磁力架移出柱，并在储存缓冲液中洗脱标记的线粒体，用于下游应用。

复合物I活性的测量

按照制造商的说明使用复合物I酶活性微孔板测定试剂盒(Abcam)制备细胞裂解物。基于制造商的说明记录、标准化和量化复合物I的活性。进行一式三份生物重复，每种最少有3份技术重复。

NAD+/NADH量化

在测定前24小时，将纯化的运动神经元以每孔50,000个神经元铺板到Matrigel预涂覆的96孔板上。然后使用NAD/NADH-Glo^TM Assay(Promega)根据制造商的说明制备培养物用于NAD+/NADH测量。根据制造商的说明记录、标准化和量化NAD+/NADH水平。进行一式三份生物重复，每种最少有3份技术重复。

线粒体NAD⁺量化

使用MACS技术分离来自运动神经元培养物(1000万个细胞)的线粒体(如上所述)。使用NAD/NADH-Glo^TM Assay(Promega)根据制造商的说明制备、量化线粒体NAD+。简而言之，将分离的线粒体首先在2：1：1比例的PBS、碳酸氢盐基碱性缓冲液和1％DTAB中稀释。将0.4N的HCl加入到线粒体悬浮液中，接着在60℃加热15分钟。加热后，向悬浮液中加入0.5M的Trizma碱，并基于制造商的说明(Promega)记录线粒体NAD⁺的水平，相对于NAD⁺标准曲线标准化并定量。进行一式三份生物重复，每种最少有3份技术重复。

培养细胞的免疫染色

将细胞在4％多聚甲醛中固定15分钟，在0.1％Triton X-100中透化15分钟，并在室温在含有5％FBS和1％BSA的缓冲液中封闭1小时。在封闭缓冲液中稀释一抗(表S4)并在4℃孵育过夜。将细胞在PBS中洗涤三次。将相应的二抗在封闭缓冲液中以1：1500稀释，并在室温在黑暗中孵育90分钟。以0.1μg/ml使用DAPI用于可视化细胞核。

使用ALS患者组织的免疫组织化学

从获自UCSD CNS生物储藏室的石蜡包埋的ALS组织(n＝4)和对照组织(n＝4)的块切割腰部脊髓组织切片。用组织学级CitriSolv将六微米厚度的组织切片进行脱石蜡化(每次15分钟两次)，接着是梯度醇系列(100、90、70和50％乙醇(Vol/Vol)，每次3分钟)，然后在水中洗涤(两次3分钟)。然后将内源过氧化物酶活性在甲醇中的0.6％过氧化氢(Vol/Vol)中淬灭15分钟。在1X PBS、0.2％TritonX100中20分钟的透化步骤后，在120℃高压锅中在高pH溶液(1％Tris碱)中达20分钟进行抗原恢复。将切片用2％胎牛血清(vol/vol)封闭，并在4℃与MnSOD(K68ac)抗体(1：100)孵育过夜。

第二天在平衡到室温后，在1×PBS中洗涤切片3次，然后在室温与150μl二抗孵育60分钟。通过显色反应检测信号，其使用NovaRed每切片1-3分钟，直至达到所需染色。用苏木精进行复染色10秒。在加上盖玻片之前将切片脱水。

图像采集和图像分析

使用高容量显微镜Phenix(Perkin Elmer)，使用20x空气物镜来获取图像。使用Columbus(Perkin Elmer)进行包括细胞计数和强度测量在内的图像分析。

对于初级神经突分析，基于SMI-32染色来确定从胞体尺寸的神经元突起。对于胞体尺寸分析，通过DAPI鉴定细胞核，并基于SMI-32染色测定细胞核周围的细胞质区域。基于细胞核周围的细胞质区域不包括神经元突起，通过图像分析软件(ImageJ，NIH)来测量胞体尺寸区域。

对于患者组织，将所有载玻片用Hamamatsu Nanozoomer 2.0HT滑动扫描仪在UCSD显微镜核心扫描。使用NDP.View 2查看软件，在1x和20x放大倍数下评估扫描的载玻片。在每位患者的总共四个非连续的组织切片中，在两个前角切片中评估所有神经元，以确保在神经元中没有重叠。对于所有神经元使用Fiji测定K68Ac表达模式和强度。使用“H DAB”作为定义向量进行颜色去卷积。使用代表VectorRed信号且没有来自复染色的背景的“Colour_2”(Colour_1是苏木精)进行神经元的测量和定量。针对每个神经元测定感兴趣区域，并使用“Mean gray value”来量化强度。为了将强度转换为光密度(OD)所使用的公式是：OD＝对于8位图像的log(最大强度/平均强度)。所得OD量化了由于DAB信号(因此代表MnSOD-K68ac染色)所致的图像的平均暗度。

统计分析

对每个实验进行至少三份生物重复。从不同的样品中测量以进行分析。通过双尾未配对学生t检验进行比较两组的统计分析。P值低于0.05被认为是显著的。除非另有说明，否则所有结果均显示为均值±标准差。

人类伦理声明

所有组织均按HIPAA(1996年的健康保险携带和责任法案)符合IRB(机构审查委员会)监督的知情同意过程收集。向患者提供了选择死后将其CNS组织捐献给ALS生物储藏室的选项，并在生命期间提供知情同意。所有知情同意表格和其他法律文件由临床研究支持人员处理，并针对基础研究团队去除个人信息。每个患者都有分配给他们的分别的临床、CNS和成纤维细胞标识符，以保持患者的自主性和匿名性。

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应用

运动神经元是高度活力的细胞。它们主要依赖于氧化磷酸化以促进其高代谢要求，并且与该规范的任何偏差都可能导致神经系统病症。通过使用来自健康对照、家族性ALS和散发性ALS患者(包括同基因对)的诱导多能干细胞(iPSC)朝向脊柱MN、皮质神经元和心肌细胞分化，发明人证明了改变的能量代谢先于运动神经元损失，并鉴定了将改变的代谢与ALS(一种运动神经元疾病)中的运动神经元死亡相关联的清晰的机制洞察。缺陷性线粒体呼吸被证明是牵涉到散发性和家族性ALS两者中的共同途径。

开发了用于富集上述MN的方法以用于代谢通量测量。在各种实例中，通过在代谢测定中排除难以分化的神经祖细胞(NPC)和其他非神经元细胞，本发明人鉴定了降低的线粒体呼吸/过低氧化和升高的糖酵解/超糖酵解为ALS MN的代谢标志，这在NPC中没有观察到。在各种实例中，代谢通量分析揭示了ALS中线粒体呼吸的运动神经元特异性缺陷。在各种实例中，测试的所有形式的家族性和散发性ALS MN展现出类似的缺陷代谢谱/线粒体呼吸，其归因于线粒体蛋白的超乙酰化。

在线粒体中，SIRT3用作线粒体脱乙酰酶以保持线粒体功能和完整性，而GCN5L1是线粒体富集的乙酰转移酶，其催化对SIRT3拮抗性的反应或对抗SIRT3的乙酰化和呼吸作用。在各种实例中，显示线粒体超乙酰化由脱乙酰酶SIRT3和GCN5L1调节，GCN5L1促进线粒体蛋白乙酰化。在各种实例中，SIRT3单倍体不足运动神经元重演了ALS样表型。在各种实例中，激活SIRT3(例如使用烟酰胺或小分子活化剂)或抑制GCN5L1能够在所有ALS运动神经元中逆转缺陷代谢谱，以及改正ALS相关的表型/形态的情况。在一些实例中，SIRT3活化通过恢复健康的线粒体呼吸而促进ALS MN存活和神经突的长出，但不拯救SMA。相应地，在各种实例中，ALS运动神经元中GCN5L1的敲低/耗尽也通过促进线粒体呼吸的健康水平拯救了ALS相关的表型/形态，促进运动神经元存活和神经突长出。

发明人已经证明，超乙酰化的线粒体蛋白是散发性和家族性ALS两者的标志，并且已经将SIRT3-GCN5L1轴鉴定为家族性和散发族ALS两者的共同发病节点。有利地，本公开揭示了靶向SIRT3-GCN5L1轴以调节线粒体蛋白乙酰化(例如，通过升高SIRT3活性和/或抑制GCN5L1)是ALS的有前景的治疗策略。

本领域技术人员将理解，在不脱离本公开的精神或广泛描述的范围的情况下，可以对本文公开的实施方案进行其他变化和/或修改。例如，在本文的描述中，不同示例性实施方案的特征可以跨不同示例性实施方案混合、组合、互换、并入、采用、修改、包括等等。因此，实施方案是在所有方面被认为是说明性的而不是限制性的。

序列表

<110> Agency for Science, Technology and Research

<120> 促进运动神经元的存活和/或功能的方法及相关试剂、用途和方法

<130> 2000873

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 1

agaggaggcg agaggcuau 19

<210> 2

<211> 4776

<212> DNA

<213> 人

<400> 2

gcttctgcta acactgaaat gggttcgcat tcctgaccac aaaaggacag agatgaaatt 60

ctacattcac acagcccgcc aagttagcca agctccctag gaggctgtct gaagtgccta 120

aaatgcttct ctacaatgat cacccagagc tgagagactt cagtggggta gtgagaagaa 180

agagggttgg gagagacagg aaagcatcct ctccttgagg gaaggaactg ggaatcaact 240

gagaaccagc tagcactgcc aggaggtgag gagagggaag gagaataatt taaatgaggc 300

cagggagctt ctgctccctc aattaaacgg tgatagacgg cctgacacca ccagccctcg 360

aagcctgaga tccacaggaa atgttaaaaa ctggcttggc aatataagta ttagaaaata 420

cttcttccaa cactcaccaa aaactaagct cccaataaag aacacttcac ctgccctccg 480

caaccctcta cctctcttcc ccgccaagat cttcacccaa ggtctcaaga gggcggttcc 540

caacctcacg tgacacagcg gtcacgtgac atggccccgg ggagccgagg tgagcgttcc 600

agcttccgga gccggagggg gcccggcgta cccagccccc agcccgacgt gaccatgctg 660

tcccgcctcc taaaagaaca ccaggccaag cagaatgaac gcaaggagct gcagggtgag 720

ccaaatatcc tgtcggccgt tttctcttcg gccgcggcct agcttcagcc cggagcctgg 780

atctcgagta actaaccata tccagggaaa gacgccagct agcgggcaac gggcatgggg 840

gagagggaat ttcagagagg ctttttttga aactcctttc ccttgccaac tggctccggt 900

cccttgggca atactccggt cccctcggca acgcccccaa tccccgacct gccgcacctt 960

agccccgccc ctgccccgga gcgccctgcc tattggccct gggagcctct cgtcctggcg 1020

gcgggaagga gcgactctgg agggaggagg gtgtggggaa ccccccagag atgggcttct 1080

tggaggcctg aaaccaccgg aacggaggtg gggcacttgt ttcctgagtc cgggctggaa 1140

atctcggagt taccgattct gcggccgagt agtggagaaa gagtgcctgg gagtcaggag 1200

tcctgggcgc tgccgctgac ttcctggcgt ccctgagtga gtccatttcc ctcccagggt 1260

accagtttcc tcatctctaa aatgaaagag gttgcgctat gttttgcaag gtccttttca 1320

gctccggcat tcagagatta gttaagaaat ttcggcaact agcagaatag taatggatgg 1380

gtagggaacc tttaacacta cccctcaaaa aaccaagtct cccctccaat tccttttccc 1440

cctctcccca gaaaagagga ggcgagaggc tatcactgca gcgacctgcc tgacagaagc 1500

tttggtggat cacctcaatg tggggtatgg acctcttatc aacatcagtt tcctccttcc 1560

ccaccccgcc caagtttagg cactggccag tctggccctc aaatagctgt tgaaggggtg 1620

ggatgttcca ctaattcccc tatcctaccc cgcccctccc agctctttgt agagcaactt 1680

gagtcaactc tgagtcctag cactgggcaa gggaggaaca gctgccgtgg ttagagaagc 1740

agccagattt ccccttcccc acgttaactt ccctggcatt tacaacttga tgccatctgc 1800

ccacctccct tcacccttcc aagtccagct gtcacttcag caggagggag agcaccctcc 1860

ttcattacag cttaccaccc tctcctctgc ctcccaccct ctggcaagcc tggggagcag 1920

ctggcaggaa agagatggca gagctggtgg tggtgagagt agaacctgtt ccgggagcta 1980

tggcagagcc aggctgtctc ttaccttcct attgggtctc tagggaccac accctgcccc 2040

agccctaaat gagaatgcaa gtaacagcca aagacttggg aaaaagcaaa gaacattgtc 2100

tcttgaccct aagtgaccca gaagcgtgca gagatgatga tttgctagtc tgcctattgg 2160

aagaaaggca gtatggtacc ttccacccca ggtcaagtag aacagctcgg tgtgaatcca 2220

gagactgagt catccaagtg agccatgcag gggctggggt catctttgtt actcatcttg 2280

ggggaaggtt gagagaaaga aagttgtggc tggggcctct gatctccctt ctctccaggc 2340

agctctcttt actcagtgtg aatatagaag caggtggtca atggggaaaa ccagaagttc 2400

aggaattctc aggggagtct gtttcagttc ctacccgacc cttgacagtg acccagctgt 2460

ctcccaaaaa gaaggaacag ggtctgccct cccatttcct ccctcccaca ttggcacctc 2520

ctgggctctg ctgtgcccat catttgtgag attggcccag gcctttccct cttcttttcc 2580

tttgctagat gccaccccac tttcagctta gagggcagct aagccaaagc cagattagaa 2640

agggttttgt gttgctgccc acgcctcctc tcattccccg gaaaggaaaa caaaggctca 2700

gtctatcttg gcccctgtca ggtgtcctgc ccactccctc agcccccacc aaccccttcc 2760

ccgctccagc ccccacacat tccagtgggt gggggcaccg gatgtggaat ctcctggctg 2820

agtagagctc tggggtggga agtgaaaaat tcaacagcca ataaaggaga acaattattg 2880

caggggttgg ggagggcaaa aaacactggc agaaggttgg ggacaccaac cccatggtag 2940

taatggtaac cacagcccat accttgattg aaaagaaaaa ctagtgccta aggcagaagg 3000

gagggagagc atgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtttgt gtgtgttcct tgatctgtgt 3060

gggcaaaagc gaaggcttgg gagagcaact gagagccgag aagaaacccc tgggataccc 3120

tcttttgacc cagggttcct ggggaggggg tttgtactcc catcctaacc cggcttcagg 3180

gaggggccca atttccctct ccaacttctt gcatagatcc ctaggcttcc aatcactgcc 3240

agatgtgttc ctcctgctgg attttcccag tttttccatg cccctttttc cctcccagct 3300

ttttcctcag ggatatcacc ccaggttttc cctcccttcc cccactcagc tgcaggaact 3360

cctttttggg gtttggagct ggtatgtttc tagtcagctc cgagcttggc tctcctggga 3420

atcctgggag tgaaaggaag gagctgggtt tatttgcatg tactggtagt catttgcatc 3480

acatccaaaa atggccaaaa ttatgagccc tgattcttgg ctgaactccc actgctgcaa 3540

tggaatatta gtcccggaga ccacccccaa ctagctggag ctgatctcct ccctcctcca 3600

accccccagt gtggcccagg cctacatgaa ccagagaaag ctggaccatg aggtgaagac 3660

cctacaggtc caggctgccc aatttgccaa gcagacaggc cagtggatcg gaatggtgga 3720

gaacttcaac caggcactca aggtgggcca tactccctac ctcaccaccc caatcctggg 3780

cccccattgg ctgcctccag tcaggttacc tcaggtttag gttaaggagg aagtagggtg 3840

gtcccagaaa ccccatctat agccccagtg tcagaaaagg tagagaaaga aagaaaagca 3900

gttggtgggt ccaagtaaag ccttttccag gagatgaata aaacgtattc cccagactgg 3960

aagccatact ctacccattc tgattcctgg gctcccacct cctctccccc ttcccaggaa 4020

attggggatg tggagaactg ggctcggagc atcgagctgg acatgcgcac cattgccact 4080

gcactggaat atgtctacaa agggcagctg cagtctgccc cttcctagcc cctgttccct 4140

cccccaaccc tatccctcct acctcacccg cagggggaag gagggaggct gacaagcctt 4200

gaataaaaca caagcctccg tttctctgtg gtgtgtttca gagagctact agctccagtg 4260

tcgggggtgg gagtggaagg ttcaaaggtg gtttccctga gggacaggta ccttttgggg 4320

agagggtgga actagcttcc tcttactatc ccaactctct tctcctccat ggcccttgtg 4380

caggtgtctg ttaggcaagc agagggtggg agttcccatc cctcctgaga gaaggtccta 4440

gtagccctgc cccaagcttc ctaattcagg acttgtttcc tacagaagag aaacaaggca 4500

aggtacaggc ctggtcccca gctctggctt tctgcctctc cacgtgctca tggcctctcc 4560

caggctaact ctaagcagtg tcatgagtct gagccaggtg ggagattaat tcctgggggc 4620

acttcagggc tgagaagggg gaggaatgac aggtccagta accgttacca acagagcagt 4680

gcagctgcca tccttgacag ctccctcctc cttggagacc atgacataga tggtcaggaa 4740

cccaggctga gaaagacagc caaggggtgg ggggag 4776

<210> 3

<211> 462

<212> DNA

<213> 人

<400> 3

atggccccgg ggagccgagg tgagcgttcc agcttccgga gccggagggg gcccggcgta 60

cccagccccc agcccgacgt gaccatgctg tcccgcctcc taaaagaaca ccaggccaag 120

cagaatgaac gcaaggagct gcaggaaaag aggaggcgag aggctatcac tgcagcgacc 180

tgcctgacag aagctttggt ggatcacctc aatgtgggtg tggcccaggc ctacatgaac 240

cagagaaagc tggaccatga ggtgaagacc ctacaggtcc aggctgccca atttgccaag 300

cagacaggcc agtggatcgg aatggtggag aacttcaacc aggcactcaa ggaaattggg 360

gatgtggaga actgggctcg gagcatcgag ctggacatgc gcaccattgc cactgcactg 420

gaatatgtct acaaagggca gctgcagtct gccccttcct ag 462

<210> 4

<211> 378

<212> DNA

<213> 人

<400> 4

atgctgtccc gcctcctaaa agaacaccag gccaagcaga atgaacgcaa ggagctgcag 60

gaaaagagga ggcgagaggc tatcactgca gcgacctgcc tgacagaagc tttggtggat 120

cacctcaatg tgggtgtggc ccaggcctac atgaaccaga gaaagctgga ccatgaggtg 180

aagaccctac aggtccaggc tgcccaattt gccaagcaga caggccagtg gatcggaatg 240

gtggagaact tcaaccaggc actcaaggaa attggggatg tggagaactg ggctcggagc 300

atcgagctgg acatgcgcac cattgccact gcactggaat atgtctacaa agggcagctg 360

cagtctgccc cttcctag 378

Claims (20)

1.一种促进肌萎缩侧索硬化(ALS)或ALS样运动神经元的存活和/或功能的方法，该方法包括将运动神经元与能够减少线粒体蛋白质乙酰化的试剂接触。

2.权利要求1的方法，其中所述试剂选自由以下组成的组：脱乙酰酶激活剂、乙酰转移酶抑制剂及其组合。

3.权利要求2的方法，其中所述脱乙酰酶激活剂包括SIRT3(Sirtuin 3)激活剂。

4.权利要求3的方法，其中所述SIRT3激活剂选自由以下组成的组：小分子、NAD(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)或其前体及其组合。

5.权利要求4的方法，其中所述小分子选自由以下组成的组：7-羟基-3-(4'-甲氧基苯基)香豆素(C12)、和厚朴酚、二氢杨梅酮(DHM)及其衍生物、类似物和组合。

6.权利要求4的方法，其中所述NAD前体选自由以下组成的组：色氨酸、喹啉酸、烟酸(NA)、烟酰胺(Nam)、烟酰胺单核苷酸(NMN)烟酰胺核糖核苷(NR)、烟酸及其衍生物、类似物和组合。

7.权利要求2的方法，其中所述乙酰转移酶抑制剂包括GCN5L1(GCN5(氨基酸合成之一般控制5)-样1)抑制剂。

8.权利要求7的方法，其中所述GCN5L1抑制剂包括寡核苷酸。

9.权利要求8的方法，其中所述寡核苷酸选自由以下组成的组：反义寡核苷酸(ASO)、gapmer、短干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、微小RNA(miRNA)、向导RNA(gRNA)、单向导RNA(sgRNA)及其组合。

10.权利要求8或9的方法，其中所述寡核苷酸包含：

a)与BLOC1S1基因的编码序列(CDS)或其部分，或者与SEQ ID NO:3或其部分，或者与SEQ ID NO:4或其部分互补的序列；或者

b)与a)中的序列共享至少约75％序列同一性的序列。

11.权利要求8至10中任一项的方法，其中所述寡核苷酸包含与SEQ ID NO:1共享至少约75％序列同一性的序列，或者与SEQ ID NO:1相差约一个核苷酸、约两个核苷酸、约三个核苷酸、约四个核苷酸或约五个核苷酸的序列。

12.一种能够减少线粒体蛋白质乙酰化的试剂，用于治疗ALS或ALS样疾病。

13.权利要求12的试剂，其中所述试剂选自由以下组成的组：脱乙酰酶激活剂、乙酰转移酶抑制剂及其组合。

14.权利要求13的试剂，其中所述脱乙酰酶激活剂包括SIRT3激活剂，任选地其中所述SIRT3激活剂选自由以下组成的组：小分子、NAD或其前体、及其组合，任选地其中所述小分子选自以下组成的组：C12、和厚朴酚，二氢杨梅酮(DHM)及其衍生物、类似物和组合，任选地其中所述NAD前体选自以下组成的组：色氨酸、喹啉酸、烟酸(NA)、烟酰胺(Nam)、烟酰胺单核苷酸(NMN)烟酰胺核糖核苷(NR)、烟酸及其衍生物、类似物和组合。

15.权利要求13的试剂，其中所述乙酰转移酶抑制剂包括GCN5L1抑制剂，任选地其中所述GCN5L1抑制剂包括寡核苷酸，任选地其中所述寡核苷酸选自由以下组成的组：反义寡核苷酸(ASO)、gapmer、短干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、微小RNA(miRNA)、向导RNA(gRNA)、单向导RNA(sgRNA)及其组合，任选地其中所述寡核苷酸包含：a)与BLOC1S1基因的CDS或其部分，或者与SEQ ID NO:3或其部分，或者与SEQ ID NO:4或其部分互补的序列；或者与a)中的序列共享至少约75％序列同一性的序列，任选地其中所述寡核苷酸包含与SEQID NO:1共享至少约75％序列同一性的序列，或者与SEQ ID NO:1相差约一个核苷酸、约两个核苷酸、约三个核苷酸、约四个核苷酸或约五个核苷酸的序列。

16.权利要求12至15中任一项的试剂在制备用于治疗ALS或ALS样疾病的药物中的用途。

17.一种治疗受试者中的ALS或ALS样疾病的方法，该方法包括向受试者施用权利要求12至15中任一项的试剂。

18.与SEQ ID NO:1共享至少约75％序列同一性的寡核苷酸，或者与SEQ ID NO:1相差约一个核苷酸、约两个核苷酸、约三个核苷酸、约四个核苷酸或约五个核苷酸的序列。

19.权利要求18的寡核苷酸，用于疗法中。

20.一种鉴定用于治疗ALS或ALS样疾病的试剂的方法，该方法包括：

将ALS或ALS样运动神经元与候选试剂接触；和

确定所述运动神经元中的线粒体蛋白质乙酰化在接触后是否减少；和

其中当所述运动神经元中的线粒体蛋白质乙酰化在接触后减少时，则得出结论所述候选试剂是用于治疗ALS或ALS样疾病的试剂，

其中当所述运动神经元中的线粒体蛋白质乙酰化在接触后未减少时，则得出结论所述候选试剂不是用于治疗ALS或ALS样疾病的试剂，

任选地，其中如此鉴定的用于治疗ALS或ALS样疾病的试剂包括根据权利要求12至15的试剂或根据权利要求18或19的寡核苷酸。

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