WO2015076213A1 - 急性リンパ芽球性白血病の新規キメラ遺伝子ａｔｆ７ｉｐ－ｐｄｇｆｒｂ - Google Patents

急性リンパ芽球性白血病の新規キメラ遺伝子ａｔｆ７ｉｐ－ｐｄｇｆｒｂ Download PDF

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信敬 清河
松本　健治
小林　健一郎
仁 市川
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独立行政法人国立がん研究センター
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    • G01N2500/10—Screening for compounds of potential therapeutic value involving cells

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting a gene fusion that is a responsible mutation of cancer, and a cancer patient in which a substance that suppresses the expression and / or activity of a polypeptide encoded by a fusion polynucleotide generated by the gene fusion has a therapeutic effect.
  • the present invention relates to a method for identifying a subject having a cancer risk.
  • Cancer is the leading cause of death in Japan. Cancer cells are known to become malignant due to genetic changes. Identification of genetic changes characteristic of cancer type is expected to contribute not only to the elucidation of carcinogenic mechanisms, but also to the diagnosis and prognosis of cancer, the development and selection of cancer treatments, etc. Has been.
  • a chimeric gene (also referred to as a fusion gene in the present specification) is formed by fusing two genes encoding proteins originally functioning as completely separate molecules with abnormalities such as chromosomal translocation, As a result, a fusion protein having an abnormal function is produced.
  • Chimeric genes are known to cause leukemia and other cancers, and are used as indicators in diagnosis and targets for drug discovery. In particular, in recent years, successful cases of molecular targeted therapy have increased for cancers having chimeric genes related to components (for example, kinases) of signal transduction pathways involved in canceration.
  • tyrosine kinase inhibitors that target ALK protein are effective in treating lung cancer patients with EML4-ALK fusion gene, and tyrosine that targets protein encoded by BCR-ABL fusion gene It has been shown that a kinase inhibitor (for example, imatinib) is effective in treating leukemia patients having the fusion gene.
  • ALL Acute lymphoblastic leukemia
  • ALL is a type of cancer in which lymphocytes become malignant at an early stage and increase abnormally. ALL occurs in any age group, from children to adults, but is known as the most common cancer in children. Many chimeric genes have been reported as genetic changes for ALL.
  • Non-Patent Document 1 in order to identify a genetic change in ALL (Ph-like ALL) having IKZF1 mutation, BCR-ABL1 negative and poor prognosis, B identified as Ph-like ALL NUP214-ABL1, EBF1-PDGFRB, BCR-JAK2, STRN3-JAK2, PAX5-JAK2, ETV6-ABL1, RANBP2-ABL1 for progenitor ALL (B-ALL) And the identification of RCSD1-ABL1 in-frame fusion. EBF1-PDGFRB, BCR-JAK2, and NUP214-ABL1 have also been shown to be potential targets for treatment with tyrosine kinase inhibitors.
  • the present invention identifies a mutation that can be an index for predicting the effectiveness of treatment with a drug in cancers such as leukemia including ALL, provides a means for detecting the mutation, and based on the mutation, the mutation
  • An object of the present invention is to provide a means for identifying a cancer patient or a subject who is at risk for cancer, for which a drug targeting a gene having or a protein encoded by the agent has a therapeutic effect.
  • the present inventors have identified the ATF7IP-PDGFRB gene as a novel fusion gene expressed in acute lymphoblastic leukemia (ALL).
  • ALL acute lymphoblastic leukemia
  • a fusion gene with the EBF1 gene was reported in Non-Patent Document 1, but the existence of the fusion gene with the ATF7IP gene is totally expected even if any prior art document including the document is considered. It was outside.
  • the ATF7IP-PDGFRB gene produces a fusion protein of SETDB1-binding protein (ATF7IP) and tyrosine kinase (PDGFRB), which transmits growth stimuli that do not exist in the cell, resulting in the generation of ALL. It is conceivable that. Therefore, a tyrosine kinase inhibitor or the like is likely to have a therapeutic effect on this gene fusion positive cancer. In fact, it was confirmed that dasatinib, a tyrosine kinase inhibitor, is effective for ATF7IP-PDGFRB gene fusion-positive ALL patients.
  • a method for detecting gene fusion comprising an ATF7IP-PDGFRB fusion polypeptide comprising a SETDB1-binding domain of ATF7IP and a transmembrane region and a kinase domain of PDGFRB and having kinase activity in an isolated sample derived from a subject, Or detecting a fusion polynucleotide encoding it.
  • the fusion polypeptide is any one of the following (i) to (iii): (I) a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 4, (Ii) a polypeptide comprising an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 4, wherein the polypeptide comprises an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added, and has kinase activity, or (iii) A polypeptide comprising an amino acid sequence having 80% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 4, and having kinase activity.
  • the fusion polynucleotide is any of the following (i) to (iii): (I) a polynucleotide comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 3, (Ii) a polypeptide that hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide comprising a nucleotide sequence complementary to a polynucleotide comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 3, and encodes a polypeptide having kinase activity nucleotide, (Iii) a polynucleotide comprising a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 3, comprising a nucleotide sequence in which one or more nucleotides are deleted, substituted or added, and encoding a polypeptide having kinase activity A nucleotide or (iv) a polynucleotide
  • a kit for detecting gene fusion comprising a polynucleotide or antibody of any of the following (A) to (C) or a combination thereof: (A) a polynucleotide that is a probe designed to specifically recognize an ATF7IP-PDGFRB fusion polynucleotide; (B) a polynucleotide that is a pair of primers designed to specifically amplify the ATF7IP-PDGFRB fusion polynucleotide; or (C) an antibody that specifically recognizes the ATF7IP-PDGFRB fusion polypeptide.
  • the kit according to [7] wherein the gene fusion is a responsible cancer mutation (driver mutation).
  • ATF7IP-PDGFRB fusion polypeptide or fragment thereof comprising the SETDB1-binding domain of ATF7IP and the transmembrane region and kinase domain of PDGFRB and having kinase activity.
  • a substance that inhibits the expression and / or activity of an ATF7IP-PDGFRB fusion polypeptide containing the SETDB1-binding domain of ATF7IP and the transmembrane region and kinase domain of PDGFRB and having kinase activity is a substance that inhibits PDGFRB kinase activity.
  • the therapeutic agent according to any one of [11] to [13].
  • [15] The therapeutic agent according to [14], wherein the substance that inhibits PDGFRB kinase activity is imatinib mesylate, dasatinib, nilotinib, ponatinib, levastinib, or bafetinib.
  • An agent for use in cancer treatment comprising the expression and / or activity of an ATF7IP-PDGFRB fusion polypeptide comprising the SETDB1-binding domain of ATF7IP and the transmembrane region and kinase domain of PDGFRB and having kinase activity A drug that contains a suppressive substance.
  • the drug according to [17], wherein the cancer is ATF7IP-PDGFRB gene fusion positive cancer.
  • the drug according to [17] or [18], wherein the cancer is acute lymphoblastic leukemia.
  • a method for treating cancer comprising a substance that suppresses the expression and / or activity of an ATF7IP-PDGFRB fusion polypeptide comprising the SETDB1-binding domain of ATF7IP and the transmembrane region and kinase domain of PDGFRB and having kinase activity Administering a therapeutically effective amount to the subject.
  • the subject is an ATF7IP-PDGFRB gene fusion positive cancer patient.
  • the method according to [21] wherein the subject is a patient with acute lymphoblastic leukemia.
  • a substance that inhibits the expression and / or activity of an ATF7IP-PDGFRB fusion polypeptide containing the SETDB1-binding domain of ATF7IP and the transmembrane region and kinase domain of PDGFRB and having kinase activity is a substance that inhibits PDGFRB kinase activity.
  • a method for screening a cancer therapeutic agent comprising the following steps: (1) A step of bringing a test substance into contact with a cell expressing an ATF7IP-PDGFRB fusion polypeptide having a SETDB1-binding domain of ATF7IP and a transmembrane region of PDGFRB and a kinase domain and having kinase activity; (2) determining whether the expression and / or activity of the fusion polypeptide is suppressed; and (3) treating the substance determined to suppress the expression and / or activity of the fusion polypeptide with cancer treatment. The process of selecting as an agent.
  • the present invention it becomes possible to detect an unknown responsible mutation of a specific cancer that has been clarified for the first time by the present invention, and a cancer patient in which cancer treatment based on the presence of the responsible mutation is effective or It becomes possible to identify a subject who has a risk of cancer and to treat the cancer patient.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing an example of the domain structure of the ATF7IP-PDGFRB fusion protein.
  • the down arrow indicates the breakpoint in the ATF7IP and PDGFRB proteins and the fusion point in the ATF7IP-PDGFRB fusion protein.
  • SETDB1 SETDB1 binding domain
  • MBD1 MBD1 binding domain
  • Ig Ig-like domain
  • TM transmembrane region
  • PTK kinase domain.
  • FIG. 2 is an electrophoresis photograph showing the result of detecting ATF7IP-PDGFRB gene fusion by RT-PCR using cDNA synthesized from leukemia cell-derived RNA as a template. Arrows indicate amplification of gene fragments indicating gene fusion.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing an example of the domain structure of the ATF7IP-PDGFRB fusion protein.
  • the down arrow indicates the breakpoint in the ATF7IP and PDGFRB proteins and the fusion point in the
  • FIG. 3 shows the results of nucleotide sequence determination of the amplified gene fragment.
  • FIG. 4 shows the clinical course of ATF7IP / PDGFRB positive ALL patients.
  • A The therapeutic response was evaluated by fluorescence in situ hybridization (FISH), RT-PCR (Kobayashi K, et al., Br J Haematol, 2014, 165, 836-841), and genomic PCR.
  • Chemotherapy regimens were as follows: Block 1: Standard risk ALL-type therapy (Tokyo Childhood Cancer Research Group Study L99-15), maintenance therapy started 16 months after initial diagnosis; Block 2: ALL-type reintroduction therapy; Block 3: AML-type regimen (Tsukimoto I, et al., J Clin Oncol, 2009, 27, 4007-4013).
  • MRD results detected by RT-PCR and genomic PCR in 17 samples Detection levels by genomic PCR and RT-PCR are shown on the x-axis and y-axis, respectively. MRD was not detected with either method in 2 samples; MRD was detected only by genomic PCR in 4 samples; MRD was within the quantitative range with any PCR method in 11 samples Was detected. For four samples with inconsistent results, genomic PCR products were verified by clonal sequencing, eliminating the possibility of accidental false positive results. The dotted line represents the threshold of the quantifiable range of MRD detection.
  • FIG. 5 shows that IL-3 independent cell proliferation is induced by ATF7IP- and EBF1-PDGFRB but not by wild type (WT-) PDGFRB.
  • A Ba / F3 cells were transfected with a retroviral vector expressing ATF7IP-PDGFRB or an empty vector (Mock) using a tetracycline inducible system. After exposure to retrovirus for 10 hours and then treatment for 24 hours with or without doxycycline (Dox), the cells were washed and the conditioned medium was removed. After incubation for 60 hours, the number of viable cells was estimated by a water-soluble tetrazolium salt (WST) assay. Triplicate mean ⁇ SEM for each treatment is shown as a bar graph.
  • WST water-soluble tetrazolium salt
  • B Ba / F3 cells transfected and cloned with ATF7IP-PDGFRB, EBF1-PDGFRB, or wild type PDGFRB (WT-PDGFRB) for the indicated period in the absence of WEHI-3-conditioned medium (CM) Cultivated under and subjected to WST assay.
  • CM WEHI-3-conditioned medium
  • WT-PDGFRB transfectants two conditions were tested: one with 100 ng / mL PDGFBB and one without.
  • CM WEHI-3-conditioned medium
  • Ba / F3 cells transfected with an empty vector cultured with or without WEHI-3 conditioned medium were examined simultaneously. OD values are shown as triplicate mean ⁇ SEM. The data shown is representative of three independent experiments.
  • FIG. 6 shows the expression of PDGFRB-related chimeric molecule and wild type (WT-) PDGFRB in transfectants.
  • B The expression of each type of PDGFRB was examined by immunoblot analysis. In the case of ATF7IP-PDGFRB, the fusion protein was detected using either anti-ATF7IP antibody or anti-PDGFRB antibody. Gray arrows indicate some unexpected bands with lower molecular weight than expected, detected in the case of WT-PDGFRB.
  • FIG. 7 shows an increase in tyrosine phosphorylation mediated by PDGFRB expression.
  • A Cell lysates were prepared from Ba / F3 transfectants and protein tyrosine phosphorylation was detected by immunoblotting using anti-phosphotyrosine antibody 4G10.
  • B The same sample preparation as (A) was similarly examined using a phospho-specific anti-PDGFRB antibody for the tyrosine residues indicated in the figure.
  • FIG. 8 shows enhanced phosphorylation of signaling molecules located downstream of PDGFRB. The same sample preparation as in FIG. 7 was similarly examined using the antibodies indicated in the figure.
  • FIG. 9 shows phosphorylation of c-Cbl and binding of c-Cbl to PDGFRB in Ba / F3 transfectants.
  • A The indicated cell lysate was immunoprecipitated using an anti-PDGFRB antibody. After separation on SDS-PAGE, immunoblots were performed using either anti-c-Cbl or anti-PDGFRB antibodies.
  • B Using the same sample preparation, immunoprecipitation and immunoblot analysis were performed with anti-c-Cbl and anti-phosphotyrosine antibodies, respectively.
  • FIG. 10 shows the effect of inhibitors against PI3 kinase and MEK on the growth of Ba / F3 transfectants with PDGFRB.
  • FIG. 11 shows the effect of inhibitors on PI3 kinase and MEK on the phosphorylation of AKT and MAP kinase.
  • Cell lysates were prepared from the same sample preparation as in FIG. Immunoblot analysis was performed as in FIG. No inhibitor, None; LY294002, LY; PD98059, PD.
  • FIG. 12 shows the effect of PDGFBB and IL-3 on phosphorylation of AKT and MAP kinase.
  • FIG. 13 shows the effect of tyrosine kinase inhibitors on the growth of Ba / F3 transfectants with PDGFRB.
  • CM (+) ATF7IP- or EBF1-PDGFRB and mock Ba / F3 cells maintained in the presence of conditioned medium, using the indicated concentrations of tyrosine kinase inhibitors or Treated for 24 hours without using. Thereafter, as in FIG.
  • FIG. 14 shows the effect of tyrosine kinase inhibitors on AKT and MAP kinase phosphorylation.
  • the present inventors have found ATF7IP-PDGFRB gene fusion for the first time as a responsible cancer mutation (driver mutation) in cancer tissues. Based on such findings, the present invention provides a method for detecting the gene fusion, a method for identifying a cancer patient or a subject having a cancer risk that is effective for cancer treatment based on the presence of the responsible mutation, and a method for treating cancer. Also provided are cancer therapeutic agents, screening methods for cancer therapeutic agents, and the like.
  • “responsible mutation of cancer” is a term used interchangeably with driver mutation, and refers to a mutation that exists in cancer tissue and has a cancer-causing ability for cells.
  • driver mutation refers to a mutation that exists in cancer tissue and has a cancer-causing ability for cells.
  • the mutation is responsible for cancer.
  • the “fusion point” in the fusion polynucleotide means a boundary where the 5 ′ gene portion and the 3 ′ gene portion are connected, and this is a boundary between two nucleotide residues. It is a boundary.
  • the “fusion point” in the fusion polypeptide means a boundary where the N-terminal polypeptide and the C-terminal polypeptide are connected, and is this a boundary between two amino acid residues, Or, if the gene fusion occurs within one codon, it is the single amino acid residue itself encoded by that codon.
  • ATF7IP-PDGFRB gene fusion is a mutation that causes the expression of a fusion protein of ATF7IP protein and PDGFRB protein (hereinafter also referred to as ATF7IP-PDGFRB fusion polypeptide), and within the region of 12p13.1 and 5q33.1 in the human chromosome Mutation caused by a translocation with a breakpoint (t (5; 12)).
  • ATF7IP (activating transcription factor 7 interacting protein 1) protein also known as MCAF1, etc., is a protein encoded by the gene present in 12p13.1 in humans. It is a protein consisting of the amino acid sequence represented (NCBI accession number NP_060649.3 (26-Oct-2013) or NP_851997.1 (08-Nov-2013)). Although the function of the ATF7IP protein has not yet been fully elucidated, it is thought to bind to a transcription factor and regulate its transcriptional activity.
  • the ATF7IP protein is characterized by having a SETDB1 binding domain and an MBD1 binding domain (FIG. 1).
  • the SETDB1-binding domain corresponds to the amino acid sequence at positions 562 to 817 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6, for example, in the case of humans.
  • the MBD1 binding domain corresponds to, for example, the amino acid sequence at positions 1154 to 1270 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 for humans.
  • PDGFRB protein is a protein encoded by a gene present in 5q33.1 in humans, and typically an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 (NCBI accession number NP_002600.1 (27-Oct-2013) ) Protein.
  • PDGFRB protein is characterized by having an Ig-like domain, a transmembrane region, and a kinase domain (FIG. 1).
  • the Ig-like domain corresponds to, for example, the amino acid sequence at positions 228 to 415 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 in humans.
  • the transmembrane region corresponds to, for example, the amino acid sequence at positions 533 to 553 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 for humans.
  • the kinase domain corresponds to the amino acid sequence at positions 562 to 953 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10.
  • the ATF7IP-PDGFRB fusion polypeptide is a polypeptide that includes the SETDB1-binding domain of the ATF7IP protein and the transmembrane region and kinase domain of the PDGFRB protein and has kinase activity.
  • the ATF7IP-PDGFRB fusion polypeptide may contain the entire SETDB1 binding domain of the ATF7IP protein, or may contain a part of the SETDB1 binding domain as long as it can bind to SETDB1. Whether or not a part of the SETDB1 binding domain binds to SETDB1 can be confirmed by measurement by a GST pull-down assay described in J Biol Chem, 2005, 280 (14), 13928-35.
  • the ATF7IP-PDGFRB fusion polypeptide may or may not contain all or part of the MBD1 binding domain of the ATF7IP protein.
  • the ATF7IP-PDGFRB fusion polypeptide may include the entire kinase domain of the PDGFRB protein, or may include a portion of the kinase domain as long as the ATF7IP-PDGFRB fusion polypeptide has kinase activity.
  • the ATF7IP-PDGFRB fusion polypeptide has“ kinase activity ”means that it has an activity as an enzyme that phosphorylates tyrosine due to the kinase domain derived from the PDGFRB protein.
  • the kinase activity of the ATF7IP-PDGFRB fusion polypeptide is measured by a conventional method, and usually, after incubation with a substrate (such as a synthetic peptide substrate) and ATP under appropriate conditions, the phosphorylated tyrosine of the substrate is detected. Moreover, it can also measure using a commercially available measurement kit.
  • the ATF7IP-PDGFRB fusion polypeptide may contain all or part of the transmembrane region of the PDGFRB protein, but preferably contains all of the transmembrane region.
  • the polynucleotide encoding the ATF7IP-PDGFRB fusion polypeptide contains the SETDB1-binding domain of ATF7IP protein and the transmembrane region and kinase domain of PDGFRB protein and has kinase activity.
  • a polynucleotide encoding a polypeptide having The ATF7IP-PDGFRB fusion polynucleotide may be any of mRNA, cDNA and genomic DNA.
  • the ATF7IP-PDGFRB fusion polynucleotide in the present invention can be, for example, an ATF7IP-PDGFRB fusion polynucleotide encoding the following polypeptide: (I) a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 4, (Ii) a polypeptide comprising an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 4, wherein the polypeptide comprises an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added, and has kinase activity, or (iii) A polypeptide comprising an amino acid sequence having 80% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 4, and having kinase activity.
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 4 is an amino acid encoded by an ATF7IP-PDGFRB fusion polynucleotide containing a partial sequence found in a sample derived from human cancer tissue, as shown in Examples below. Is an array.
  • the “one or more amino acids” is usually 1 to 50, preferably 1 to 30, more preferably 1 to 10, even more preferably 1 to several (for example, 1 ⁇ 5, 1-4, 1-3, 1 or 2, or 1) amino acids.
  • sequence identity is preferably 85% or more, more preferably 90% or more, 95% or more, even more preferably 97% or more, 98% or more, 99% or more.
  • Amino acid sequence identity is called BLASTX or BLASTP based on the algorithm BLAST (Proc. ⁇ ⁇ ⁇ Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264-2268, 1990, Proc Natl Acad Sci USA 90: 5873, 1993) by Carlin and Arthur It can be determined using the program (Altschul SF, et al: J Mol Biol 215: 403, 1990).
  • the ATF7IP-PDGFRB fusion polynucleotide in the present invention can be, for example, any of the following polynucleotides: (I) a polynucleotide comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 3, (Ii) a polypeptide that hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide comprising a nucleotide sequence complementary to a polynucleotide comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 3, and encodes a polypeptide having kinase activity nucleotide, (Iii) a polynucleotide comprising a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 3, comprising a nucleotide sequence in which one or more nucleotides are deleted, substituted or added, and encoding a polypeptide having kinase activity A nucleotide or (iv) a polynucleotides:
  • the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 3 is a base sequence of an ATF7IP-PDGFRB fusion polynucleotide containing a partial sequence found in a sample derived from human cancer tissue, as shown in Examples described later. .
  • stringent conditions refers to moderately or highly stringent conditions unless otherwise specified.
  • the moderately stringent conditions can be easily designed by those skilled in the art based on, for example, the length of the target polynucleotide.
  • the basic conditions are shown in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Edition, Chapters 6-7, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001.
  • moderately stringent conditions for nitrocellulose filters are 5 ⁇ SSC, 0.5% SDS, 1.0 mM EDTA (pH 8.0) prewash conditions; about 50-50 ° C. at about 50-50 ° C.
  • the moderately stringent conditions preferably include hybridization conditions of about 50 ° C. and 6 ⁇ SSC, and may include the aforementioned washing conditions and / or washing conditions.
  • High stringent conditions can also be easily designed by those skilled in the art based on, for example, the length of the target polynucleotide.
  • High stringency conditions include higher temperatures and / or lower salt concentrations than moderately stringent conditions.
  • hybridization conditions of about 65 ° C., 0.2-6 ⁇ SSC, preferably 6 ⁇ SSC, more preferably 2 ⁇ SSC, and even more preferably 0.2 ⁇ SSC are included.
  • cleaning conditions of about 65 to 68 ° C., 0.2 ⁇ SSC, and 0.1% SDS.
  • SSPE (1 ⁇ SSPE is 0.15 in place of SSC (1 ⁇ SSC is 0.15 ⁇ M NaCl and 15 ⁇ mM sodium citrate)) as a buffer for hybridization, pre-washing and washing.
  • washing can be performed for about 15 minutes after hybridization is complete.
  • the “one or more nucleotides” usually means 1 to 50, preferably 1 to 30, more preferably 1 to 10, even more preferably 1 to several (for example, 1 ⁇ 5, 1-4, 1-3, 1 or 2, or 1) nucleotides.
  • sequence identity is preferably 85% or more, more preferably 90% or more, 95% or more, even more preferably 97% or more, 98% or more, 99% or more.
  • the present invention provides a method for detecting ATF7IP-PDGFRB gene fusion (hereinafter also referred to as the detection method of the present invention).
  • the gene fusion preferably causes a responsible cancer mutation (driver mutation).
  • the detection method of the present invention comprises a step of detecting an ATF7IP-PDGFRB fusion polynucleotide or a polypeptide encoded thereby in an isolated sample derived from a subject.
  • the subject is not particularly limited as long as the subject is a mammal.
  • mammals include rodents such as mice, rats, hamsters, chipmunk, guinea pigs, rabbits, pigs, cows, goats, horses, sheep, minks, dogs, cats, humans, monkeys, cynomolgus monkeys, rhesus monkeys, marmosets, Primates such as orangutans and chimpanzees can be mentioned, and humans are preferred.
  • the subject may be not only a subject suffering from cancer, but also a subject suspected of suffering from cancer, or a subject having a risk of developing cancer in the future.
  • the “cancer” to which the detection method of the present invention is applied is not particularly limited as long as it can detect ATF7IP-PDGFRB gene fusion, but is preferably leukemia, more preferably acute lymphoblastic.
  • An “isolated sample” derived from a subject is a biological sample (eg, cell, tissue, organ (eg, small intestine, spleen, kidney, liver, stomach, lung, adrenal gland, heart, brain, pancreas, aorta, etc.), body fluid) (For example, blood, lymph, bone marrow, etc.), digestive juice, sputum, alveolar / bronchial lavage fluid, urine, stool) as well as nucleic acid extracts (genomic DNA extract, mRNA extract) obtained from these biological samples , CDNA preparations prepared from mRNA extracts, cRNA preparations, etc.) and protein extracts.
  • a biological sample eg, cell, tissue, organ (eg, small intestine, spleen, kidney, liver, stomach, lung, adrenal gland, heart, brain, pancreas, aorta, etc.), body fluid) (For example, blood, lymph, bone marrow, etc.), digestive juice, sputum, al
  • genomic DNA mRNA, cDNA or protein by selecting a known method suitable for the sample in consideration of the type and condition of the sample.
  • the sample may be subjected to formalin fixing treatment, alcohol fixing treatment, freezing treatment, or paraffin embedding treatment.
  • the “isolated sample” is preferably derived from a tissue, organ, or body fluid in which the cancer is present or suspected of being present, and more preferably the cancer is present or suspected to be present. It is derived from blood or bone marrow fluid.
  • Such an “isolated sample” includes, for example, cells derived from blood or bone marrow fluid of a leukemia (preferably ALL, more preferably B-ALL) patient or a subject suspected of suffering from leukemia, Examples include total RNA extracted from cells.
  • the detection of the fusion polynucleotide or the polypeptide encoded thereby can be performed using a technique known per se.
  • transcripts from genomic DNA for example, using RT-PCR, sequencing, TaqMan probe, Northern blotting, dot blotting, cDNA microarray analysis, etc. Fusion polynucleotides that are mRNA or cDNA can be detected.
  • genomic DNA is targeted, for example, detection of fusion polynucleotides that are genomic DNA using in situ hybridization (ISH), genomic PCR, sequencing, TaqMan probe, Southern blotting, genomic microarray analysis, etc. can do.
  • ISH in situ hybridization
  • ATF7IP-PDGFRB gene fusion is thought to contribute to canceration by expressing the fusion polypeptide, so when detecting a fusion polynucleotide that is genomic DNA (for example, by in situ hybridization) It is also preferable to further confirm that a transcript or protein is produced (for example, by RT-PCR, immunostaining, etc.).
  • the fusion polynucleotide is specific.
  • Polynucleotides that are probes designed to recognize can be used.
  • “specifically recognize a fusion polynucleotide” includes a wild-type gene derived from the fusion point of the fusion polynucleotide from the 5 ′ terminal side and the 3 ′ terminal part under stringent conditions. This refers to identifying and recognizing the fusion polynucleotide from a polynucleotide other than the fusion polynucleotide.
  • the genomic DNA to be detected is stable even under formalin fixation. From the viewpoint of high detection sensitivity, it is preferable to use in situ hybridization.
  • the biological sample described in the following (a) or (b) having a chain length of at least 15 bases as a polynucleotide that is a probe designed to specifically recognize a fusion polynucleotide By hybridizing these polynucleotides, genomic DNA (fusion polynucleotide) encoding the fusion polypeptide can be detected.
  • A At least one selected from the group consisting of a probe that hybridizes to the base sequence of the 5 ′ side fusion partner gene (ATF7IP gene) and a probe that hybridizes to the base sequence of the 3 ′ side fusion partner gene (PDGFRB gene) Polynucleotide which is a probe (b) A polynucleotide which is a probe that hybridizes to a base sequence including a fusion point between a 5 ′ fusion partner gene and a 3 ′ fusion partner gene.
  • the ATF7IP gene according to the present invention is typically a gene consisting of the DNA sequence from 1451566 to 14658864 from the genome sequence specified by Genbank accession number NC — 00001.12.
  • the PDGFRB gene according to the present invention is derived from a human, typically, the DNA sequence from the 149493402 to 149535447 of the genome sequence specified by Genbank accession number NC_000005.9 (encoded by the complementary strand) ).
  • DNA sequence of a gene can change in nature (ie, non-artificially) due to its mutation or the like. Therefore, such natural mutants can also be the subject of the present invention (hereinafter the same).
  • the polynucleotide described in (a) of the present invention is the nucleotide sequence of the 5 ′ fusion partner gene (ATF7IP gene) and / or the 3 ′ fusion partner gene (PDGFRB gene), which is the target nucleotide sequence of the polynucleotide.
  • ATF7IP gene 5 ′ fusion partner gene
  • PDGFRB gene 3 ′ fusion partner gene
  • Any polynucleotide can be used as long as it can detect the presence of genomic DNA encoding the fusion polypeptide in the biological sample by hybridizing to the base sequence.
  • the polynucleotide described in (a1) to (a3) below is used.
  • the base sequence in the upstream region 5 ′ from the breakpoint of the 5 ′ fusion partner gene typically contains the entire or part of the SETDB1-binding domain of the ATF7IP protein. An area is included.
  • the base sequence in the downstream region 3 ′ from the cleavage point of the 3 ′ fusion partner gene typically contains all or part of the transmembrane region of PDGFRB. And the coding region of all or part of the kinase domain.
  • Examples of the polynucleotide described in (a1) include the following combinations of polynucleotides (a1-1): (a1-1) A combination of a polynucleotide that hybridizes to all or part of the coding region of the SETDB1-binding domain of ATF7IP and a polynucleotide that hybridizes to all or part of the coding region of the kinase domain of PDGFRB.
  • the region (target base sequence) to which the polynucleotide described in (a) used for in situ hybridization hybridizes is the 5 ′ side from the viewpoint of specificity to the target base sequence and sensitivity of detection.
  • the region is preferably within 1 million bases from the fusion point of the fusion partner gene (ATF7IP gene) and the 3 ′ fusion partner gene (PDGFRB gene).
  • the polynucleotide described in (b) used in in situ hybridization is a fusion of a 5 ′ fusion partner gene and a 3 ′ fusion partner gene, which is a target base sequence of the polynucleotide.
  • Any base can be used as long as it can detect the presence of genomic DNA encoding the fusion polypeptide in the biological sample by hybridizing to a base sequence containing a point.
  • the base described in SEQ ID NO: 1 or 3 is used.
  • the polynucleotide described in (a) or (b) used for in-situ hybridization covers the entire target base sequence from the viewpoint of specificity to the target base sequence and sensitivity of detection.
  • a group consisting of a plurality of types of polynucleotides is preferable.
  • the length of the polynucleotide constituting the population is at least 15 bases, preferably 100 to 1000 bases.
  • the polynucleotide described in (a) or (b) used for in situ hybridization is preferably labeled with a fluorescent dye or the like for detection.
  • fluorescent dyes include, but are not limited to, DEAC, FITC, R6G, TexRed, and Cy5.
  • radioisotopes eg, 125 I, 131 I, 3 H, 14 C, 33 P, 32 P, etc.
  • enzymes eg, ⁇ -galactosidase, ⁇ -glucosidase, alkaline phosphatase, peroxidase
  • the polynucleotide may be labeled with a malate dehydrogenase, etc.
  • a luminescent substance eg, luminol, luminol derivative, luciferin, lucigenin, 3,3′-diaminobenzidine (DAB), etc.
  • in situ hybridization when 5 ′ fusion partner gene probe 1 and 3 ′ fusion partner gene probe 1 are used, 5 ′ fusion partner gene probe 1 and 5 ′ fusion partner gene 2 are used, or When 3 ′ fusion partner gene probe 2 and 3 ′ fusion partner gene probe 1 are used, these probes are preferably labeled with different dyes.
  • the signal for example, fluorescence
  • the genomic DNA encoding the fusion polypeptide has been detected when an overlap with the signal emitted by the label of the gene probe 1 is observed.
  • the signal emitted from the label of the 5 ′ fusion partner gene probe 1 is separated from the signal emitted from the label of the 5 ′ fusion partner gene probe 2, the signal emitted from the label of the 3 ′ fusion partner gene probe 2 and the signal 3 ′ from the signal emitted from the label of the 3 ′ fusion partner gene probe 2.
  • separation from the signal emitted by the label of the fusion partner gene probe 1 is observed, it can be determined that the genomic DNA encoding the fusion polypeptide has been detected.
  • labeling of the polynucleotide can be performed by a known technique.
  • the polynucleotide can be labeled by incorporating a substrate base labeled with a fluorescent dye or the like into the polynucleotide by a nick translation method or a random prime method.
  • conditions for hybridizing the polynucleotide according to (a) or (b) and the biological sample may vary depending on various factors such as the length of the polynucleotide.
  • conditions for stringency hybridization include 0.2 ⁇ SSC and 65 ° C.
  • conditions for low stringency hybridization include 2.0 ⁇ SSC and 50 ° C.
  • a person skilled in the art appropriately selects various conditions such as the concentration of surfactant (NP-40, etc.), the concentration of formamide, pH, etc. in addition to the salt concentration (SSC dilution ratio, etc.) and temperature.
  • SSC dilution ratio etc.
  • Examples of the method for detecting genomic DNA encoding a fusion polypeptide using the polynucleotide described in (a) or (b) include Southern blotting, Northern blotting, and dot blotting in addition to the in-situ hybridization. It is done.
  • the fusion gene is detected by hybridizing the polynucleotide described in (a) or (b) to a membrane to which a nucleic acid extract obtained from the biological sample is transferred.
  • the polynucleotide (a) When the polynucleotide (a) is used, the polynucleotide that hybridizes to the base sequence of the 5 ′ fusion partner gene and the polynucleotide that hybridizes to the base sequence of the 3 ′ fusion partner gene are developed on the membrane. When the same band is recognized, it can be determined that the genomic DNA encoding the fusion polypeptide has been detected.
  • Examples of the method for detecting genomic DNA encoding a fusion polypeptide using the polynucleotide (b) include genomic microarray analysis and DNA microarray analysis.
  • an array in which the polynucleotide (b) is immobilized on a substrate is prepared, and the genomic DNA is detected by bringing the biological sample into contact with the polynucleotide on the array.
  • the substrate is not particularly limited as long as it can immobilize oligo or polynucleotide, and examples thereof include glass plates, nylon membranes, micro beads, silicon chips, capillaries and the like.
  • the detection method of the present invention it is also preferable to detect the fusion polynucleotide using PCR.
  • a polynucleotide that is a pair of primers designed to specifically amplify a fusion polynucleotide using DNA (genomic DNA, cDNA) or RNA prepared from the biological sample as a template can be used.
  • the fusion polynucleotide can be specifically amplified means that the fusion polynucleotide is not amplified without amplifying the wild-type gene from which the 5′-end and 3′-end portions are derived from the fusion point of the fusion polynucleotide. It means that only nucleotides can be amplified, and all of the fusion polynucleotide may be amplified, or a part of the fusion polynucleotide including the fusion point may be amplified.
  • Polynucleotide which is a pair of primers” used in PCR, etc. consists of a sense primer (forward primer) and an antisense primer (reverse primer) that specifically amplify the target fusion polynucleotide.
  • the base sequence on the 5 ′ end side from the fusion point of the fusion polynucleotide is designed, and the antisense primer is designed from the base sequence on the 3 ′ end side from the fusion point of the fusion polynucleotide.
  • These primers are usually designed so that the PCR product is 5 kb or less from the viewpoint of accuracy and sensitivity of detection by PCR.
  • the design of the primer can be appropriately performed by a known method, and for example, Primer Express (registered trademark) software (Applied Biosystems) can be used.
  • the length of these polynucleotides is usually 15 bases or more (preferably 16, 17, 18, 19 or 20 bases or more, more preferably 21 bases or more), and 100 bases or less (preferably 90, 80, 70, 60, 50 or 40 bases or less, more preferably 30 bases or less).
  • Preferred examples of the “polynucleotide as a pair of primers” include a primer set comprising a polynucleotide comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 11 and a polynucleotide comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 12, and A primer set comprising a polynucleotide comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 21 and a polynucleotide comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 22 is exemplified.
  • sequencing is performed on the PCR product, and the base sequence including the fusion point is determined. It can be confirmed that they are linked in-frame and / or contain a predetermined domain in the fusion polynucleotide. Sequencing can be performed by a known method, and can be easily performed by using a sequencer (for example, ABI-PRISM 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems Inc.)) according to the instruction manual.
  • a sequencer for example, ABI-PRISM 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems Inc.)
  • the TaqMan probe method When detecting a fusion polynucleotide using PCR, the TaqMan probe method is used to connect the 5 ′ gene portion and the 3 ′ gene portion in-frame and / or in the fusion polynucleotide. Can be confirmed to contain a predetermined domain.
  • Examples of the probe used in the TaqMan probe method include the polynucleotides described in the above (a) or (b).
  • the probe is labeled with a reporter dye (eg, FAM, FITC, VIC, etc.) and a quencher (eg, TAMRA, Eclipse, DABCYL, MGB, etc.).
  • the primer and probe may be DNA, RNA, or DNA / RNA chimera, but is preferably DNA.
  • PNA polyamide nucleic acid, peptide nucleic acid
  • LNA registered trademark, locked nucleic acid, Bridged Nucleic acid, cross-linked nucleic acid
  • ENA registered trademark, 2'-O, 4'-C Nucleotides
  • the primers and probes may be double-stranded or single-stranded, but are preferably single-stranded.
  • the primers and probes may contain one or a plurality of nucleotide mismatches as long as they can specifically hybridize to the target sequence, and are usually 80% or more, preferably 90, relative to the complementary sequence of the target sequence. 91, 92, 93, 94% or more, more preferably 95, 96, 97, 98, 99% or more identity, most preferably 100% identity.
  • primers and probes can be synthesized according to a conventional method using a DNA / RNA automatic synthesizer based on, for example, information on the base sequence described in the present specification.
  • the fusion polynucleotide may be detected by whole transcriptome sequencing (RNA sequencing) or genome sequencing. These methods are performed according to the manufacturer's instructions using, for example, a next-generation sequencer (eg, Genome Analyzer IIx (Illumina), HiSeq Sequencer (HiSeq2000, Illumina) Genome Sequencer FLX System (Roche), etc.) Can be done.
  • a next-generation sequencer eg, Genome Analyzer IIx (Illumina), HiSeq Sequencer (HiSeq2000, Illumina) Genome Sequencer FLX System (Roche), etc.
  • a cDNA library is prepared from total RNA using a commercially available kit (eg, mRNA-Seq sample preparation kit (Illumina) etc.) according to the manufacturer's instructions, and this is used as a next-generation sequencer. This can be done by subjecting it to the sequencing used.
  • a translation product ie, fusion polypeptide
  • a fusion polypeptide a translation product of a fusion polynucleotide
  • an antibody that specifically recognizes the fusion polypeptide is used.
  • “specifically recognize a fusion polypeptide” means a protein other than the fusion polypeptide, including wild-type proteins derived from the N-terminal side and the C-terminal side from the fusion point of the fusion polypeptide. Recognizing only the fusion polypeptide without recognizing.
  • the antibody “specifically recognizes the fusion polypeptide” used in the detection method of the present invention may be one antibody or a combination of two or more antibodies.
  • the “antibody specifically recognizing the fusion polypeptide” examples include an antibody specific to the polypeptide containing the fusion point of the fusion polypeptide (hereinafter also referred to as “fusion point-specific antibody”).
  • fusion point-specific antibody means an antibody that specifically binds to a polypeptide containing the fusion point but does not bind to a wild-type protein from which the N-terminal and C-terminal portions are derived. To do.
  • the “antibody specifically recognizing the fusion polypeptide” refers to an antibody that binds to a polypeptide consisting of the N-terminal region from the fusion point of the fusion polypeptide and a C-terminal region from the fusion point of the fusion polypeptide. Also included are combinations of antibodies that bind to the polypeptide.
  • the fusion polypeptide can be detected by performing sandwich ELISA, immunostaining, immunoprecipitation, Western blotting, etc. using these two antibodies.
  • antibodies include natural antibodies such as polyclonal antibodies and monoclonal antibodies (mAbs), chimeric antibodies that can be produced using gene recombination techniques, humanized antibodies, single chain antibodies, and binding fragments thereof. Is included, but is not limited thereto.
  • the binding fragment means a partial region of the antibody having specific binding activity, and specific examples include Fab, Fab ′, F (ab ′) 2 , Fv, and a single chain antibody.
  • the class of the antibody is not particularly limited, and may be an antibody having any isotype such as IgG, IgM, IgA, IgD, or IgE, but IgG is more preferable in consideration of ease of purification.
  • “An antibody that specifically recognizes the fusion polypeptide” can be prepared by a person skilled in the art by appropriately selecting a known method.
  • a known technique includes a polypeptide comprising a fusion point of the fusion polypeptide, a polypeptide comprising a region N-terminal from the fusion point of the fusion polypeptide, or a C-terminal side of the fusion polypeptide.
  • the animal's serum (polyclonal antibody) is recovered, the hybridoma method, the recombinant DNA method, the phage display method, etc. And a method for producing a monoclonal antibody.
  • the target protein can be directly detected by detecting the label.
  • the labeling substance is not particularly limited as long as it can bind to an antibody and can be detected.
  • peroxidase ⁇ -D-galactosidase, microperoxidase, horseradish peroxidase (HRP), fluorescein isotope
  • HRP horseradish peroxidase
  • fluorescein isotope examples include thiocyanate (FITC), rhodamine isothiocyanate (RITC), alkaline phosphatase, biotin, and radioactive substances.
  • a method for indirectly detecting the target protein using a secondary antibody, protein G or protein A to which a labeling substance is bound can also be used.
  • a fusion polynucleotide generated by ATF7IP-PDGFRB gene fusion or a polypeptide encoded thereby can be detected using the primer, probe, antibody, or a combination thereof, and thereby the gene Fusion can be detected. Therefore, the present invention provides a kit for detecting a gene fusion (preferably a gene fusion that is a responsible mutation (driver mutation) for cancer) comprising any of the following polynucleotides or antibodies or combinations thereof (hereinafter referred to as this book).
  • invention kit (A) a polynucleotide that is a probe designed to specifically recognize an ATF7IP-PDGFRB fusion polynucleotide; (B) a polynucleotide that is a pair of primers designed to specifically amplify the ATF7IP-PDGFRB fusion polynucleotide; or (C) an antibody that specifically recognizes the ATF7IP-PDGFRB fusion polypeptide.
  • the kit of the present invention includes a substrate necessary for detection of a label added to the polynucleotide or antibody, a positive control (for example, ATF7IP-PDGFRB fusion polynucleotide, ATF7IP-PDGFRB fusion polypeptide, or Cells that hold these), negative controls, PCR reagents, counterstaining reagents used in in situ hybridization (DAPI, etc.), and molecules necessary for antibody detection (eg, secondary antibodies, protein G, protein A), buffer solutions used for sample dilution and washing, and the like can be included in appropriate combinations. Instructions for use can also be included in the kit of the present invention. By using the kit of the present invention, the detection method of the present invention can be easily carried out.
  • a positive control for example, ATF7IP-PDGFRB fusion polynucleotide, ATF7IP-PDGFRB fusion polypeptide, or Cells that hold these
  • negative controls for example, ATF7IP-PDGFRB fusion polynu
  • the detection method and detection kit of the present invention enable detection of a newly discovered gene fusion as a responsible mutation of cancer, and identify a positive example of the gene fusion as described later to enable individualized medicine. It is extremely useful in application.
  • ATF7IP-PDGFRB gene fusion is a responsible mutation of cancer, and is thought to contribute to malignant transformation of cancer by constitutive activation of PDGFRB kinase activity. Therefore, in cancer patients in which such gene fusion is detected, there is a high probability that treatment with a substance that suppresses the expression and / or activity of the polypeptide encoded by the fusion polynucleotide generated by the gene fusion is effective. .
  • the present invention relates to a cancer patient in which a substance that suppresses the expression and / or activity of a polypeptide encoded by a fusion polynucleotide generated by gene fusion that is a responsible mutation (driver mutation) of cancer has a therapeutic effect or Provided is a method for identifying a subject at risk of cancer (hereinafter also referred to as the identification method of the present invention).
  • the identification method of the present invention includes the following steps: (1) In an isolated sample derived from a subject, an ATF7IP-PDGFRB fusion polypeptide containing the SETDB1-binding domain of ATF7IP and the transmembrane region and kinase domain of PDGFRB and having kinase activity, or a polypeptide encoded thereby And (2) when the fusion polynucleotide or the polypeptide encoded thereby is detected, the substance that suppresses the expression and / or activity of the polypeptide is determined to have a therapeutic effect in the subject. Process.
  • a cancer patient or a subject at risk for cancer is a mammal, preferably a human, who is suffering from cancer or suspected of having cancer.
  • the “cancer” to which the identification method of the present invention is applied is not particularly limited as long as the ATF7IP-PDGFRB gene fusion can be detected, but is preferably leukemia, more preferably acute lymphoblastic.
  • the “therapeutic effect” is not particularly limited as long as it is an effect of cancer treatment and is beneficial to the patient.
  • the tumor reduction effect, the progression-free survival extension effect, the life extension The effect etc. are mentioned.
  • a polypeptide encoded by a fusion polynucleotide produced by gene fusion that is a responsible mutation (driver mutation) of cancer which is a target for evaluating the effectiveness of cancer treatment with respect to ATF7IP-PDGFRB gene fusion
  • a substance that suppresses the expression and / or activity (hereinafter also referred to as a target substance in the identification method of the present invention) is a substance that directly or indirectly inhibits the expression and / or function of an ATF7IP-PDGFRB fusion polypeptide. If it is, it will not specifically limit.
  • substances that inhibit the expression of ATF7IP-PDGFRB fusion polypeptide include siRNA (smallRNAinterfering RNA), shRNA (short hairpin RNA), miRNA (micro RNA), and antisense that suppress the expression of ATF7IP-PDGFRB fusion polypeptide.
  • siRNA smallRNAinterfering RNA
  • shRNA short hairpin RNA
  • miRNA miRNA
  • antisense that suppress the expression of ATF7IP-PDGFRB fusion polypeptide.
  • examples thereof include nucleic acids, expression vectors capable of expressing these polynucleotides, and low molecular weight compounds.
  • substances that inhibit the function of ATF7IP-PDGFRB fusion polypeptide include substances that inhibit PDGFRB kinase activity (for example, low molecular weight compounds), antibodies that bind to ATF7IP-PDGFRB fusion polypeptide, and the like.
  • These substances may be substances that specifically suppress the expression and / or activity of ATF7IP-PDGFRB fusion polypeptide, or substances that also suppress the expression and / or activity of wild-type PDGFRB protein.
  • Specific examples of such substances include substances that inhibit PDGFRB kinase activity (ie, tyrosine kinase inhibitors) imatinib mesylate (GLEEVEC®), dasatinib, nilotinib, ponatinib, levastinib ( Rebastinib), bafetinib and the like, and dasatinib is preferred.
  • These substances can be prepared by a method known per se based on the sequence information of the ATF7IP-PDGFRB fusion polynucleotide and / or ATF7IP-PDGFRB fusion polypeptide disclosed in the present specification. Commercially available materials may also be used.
  • These substances are effective as a cancer therapeutic agent for a subject when an ATF7IP-PDGFRB fusion polynucleotide or a polypeptide encoded thereby is detected in an isolated sample derived from the subject.
  • Step (1) in the identification method of the present invention can be carried out in the same manner as the step included in the detection method of the present invention.
  • step (2) of the identification method of the present invention in step (1), the fusion polynucleotide or encoded thereby in the isolated sample derived from the subject (ie, cancer patient or subject at risk of cancer)
  • the target substance in the identification method of the present invention has a therapeutic effect in the subject, whereas when the fusion polynucleotide or the polypeptide encoded thereby is not detected It is determined that the target substance in the identification method of the present invention is unlikely to have a therapeutic effect in the subject.
  • a positive example of gene fusion newly found as a responsible mutation for cancer is detected from cancer patients or subjects at risk of cancer, and the fusion poly- gram generated by the gene fusion is detected.
  • a substance that suppresses the expression and / or activity of a polypeptide encoded by a nucleotide is capable of identifying a cancer patient or a subject having a risk of cancer, and the present invention provides such a subject. It is useful in that it is possible to perform treatment suitable for the above.
  • the identification method of the present invention identifies a cancer patient in which a substance that suppresses the expression and / or activity of a polypeptide encoded by a fusion polynucleotide generated by ATF7IP-PDGFRB gene fusion has a therapeutic effect. Therefore, cancer can be efficiently treated by selectively administering the substance to cancer patients who have the fusion gene. Therefore, the present invention is a method for treating cancer, which comprises a step of administering the substance to a subject determined to have a therapeutic effect by the identification method of the present invention (hereinafter, the present invention). Also referred to as a method of treatment).
  • the present invention further includes the expression and / or activity of the polypeptide encoded by the fusion polynucleotide generated by the ATF7IP-PDGFRB gene fusion.
  • the present invention provides a cancer therapeutic agent (hereinafter also referred to as the cancer therapeutic agent of the present invention) containing a substance that suppresses the above as an active ingredient.
  • the cancer is not particularly limited as long as it is an ATF7IP-PDGFRB gene fusion positive cancer, but is preferably leukemia, more preferably acute lymphoblastic leukemia (ALL). Particularly preferred is B precursor cell acute lymphoblastic leukemia (B-ALL).
  • ALL acute lymphoblastic leukemia
  • B-ALL B precursor cell acute lymphoblastic leukemia
  • the ATF7IP-PDGFRB gene fusion positive cancer means a cancer in which the ATF7IP-PDGFRB fusion polynucleotide or the polypeptide encoded thereby is detected by the detection method of the present invention.
  • the cancer therapeutic agent of the present invention has been described as a substance that suppresses the expression and / or activity of the polypeptide encoded by the fusion polynucleotide generated by the ATF7IP-PDGFRB gene fusion in connection with the identification method of the present invention. Substances.
  • the cancer therapeutic agent of the present invention can be prepared as a pharmaceutical composition using pharmacologically acceptable carriers, excipients, and / or other additives that are usually used for their formulation.
  • the method for administering the cancer therapeutic agent of the present invention is appropriately selected according to the type of the inhibitor, the type of cancer, etc.
  • oral, intravenous, intraperitoneal, transdermal, intramuscular, intratracheal (Aerosol), rectal, intravaginal and other dosage forms can be employed.
  • the dose of the cancer therapeutic agent of the present invention is determined depending on the activity and type of the active ingredient, the mode of administration (eg, oral or parenteral), the severity of the disease, the animal species to be administered, the drug acceptability of the subject to be administered, It can be appropriately determined in consideration of weight, age and the like.
  • the therapeutic method and cancer therapeutic agent of the present invention are useful for enabling the treatment of patients having a specific cancer responsible mutation that has not been known so far and has been clarified by the present invention.
  • the present invention provides a screening method for a cancer therapeutic agent (hereinafter also referred to as the screening method of the present invention) that provides a therapeutic effect for cancer patients having an ATF7IP-PDGFRB gene fusion.
  • a cancer therapeutic agent hereinafter also referred to as the screening method of the present invention
  • a substance that suppresses the expression and / or activity of the ATF7IP-PDGFRB fusion polypeptide can be obtained as a cancer therapeutic agent.
  • the test substance to be used in the screening method of the present invention may be any compound or composition, such as a nucleic acid (eg, nucleoside, oligonucleotide, polynucleotide), carbohydrate (eg, monosaccharide, disaccharide, Oligosaccharides, polysaccharides), lipids (eg, saturated or unsaturated linear, branched and / or cyclic fatty acids), amino acids, proteins (eg, oligopeptides, polypeptides), low molecular compounds, compound libraries, Examples include random peptide libraries, natural components (eg, components derived from microorganisms, animals and plants, marine organisms, etc.), foods, and the like.
  • a nucleic acid eg, nucleoside, oligonucleotide, polynucleotide
  • carbohydrate eg, monosaccharide, disaccharide, Oligosaccharides, polysaccharides
  • lipids
  • the screening method of the present invention may be in any form as long as it can be evaluated whether the test substance suppresses the expression and / or activity of the ATF7IP-PDGFRB fusion polypeptide.
  • the screening method of the present invention comprises the following steps: (1) A step of bringing a test substance into contact with a cell expressing an ATF7IP-PDGFRB fusion polypeptide having a SETDB1-binding domain of ATF7IP and a transmembrane region of PDGFRB and a kinase domain and having kinase activity; (2) determining whether the expression and / or activity of the fusion polypeptide is suppressed; and (3) treating the substance determined to suppress the expression and / or activity of the fusion polypeptide with cancer treatment.
  • a test substance is brought into contact with cells expressing the ATF7IP-PDGFRB fusion polypeptide.
  • a solvent not containing a test substance for example, DMSO
  • the contact can be performed in a culture medium.
  • the medium is appropriately selected depending on the type of cells used, for example, a minimum essential medium (MEM) containing about 5 to 20% fetal calf serum, Dulbecco's modified minimum essential medium (DMEM), RPMI1640 medium, 199 medium.
  • MEM minimum essential medium
  • DMEM Dulbecco's modified minimum essential medium
  • RPMI1640 RPMI1640 medium
  • the culture conditions are also appropriately determined according to the type of cells to be used. For example, the pH of the medium is about 6 to about 8, the culture temperature is about 30 to about 40 ° C., and the culture time is about 12 to about 72 hours.
  • Examples of cells expressing the ATF7IP-PDGFRB fusion polypeptide include cells derived from cancer tissues that endogenously express the fusion polypeptide, cell lines derived from the cells, and genetic engineering. Cell lines and the like, which are not limited thereto. Whether or not a certain cell expresses an ATF7IP-PDGFRB fusion polypeptide can also be confirmed using the detection method of the present invention.
  • the cells are usually mammalian cells, preferably human cells.
  • step (2) it is determined whether the expression and / or activity of the fusion polypeptide is suppressed.
  • the expression of the fusion polypeptide can be measured by determining the mRNA level or protein level in the cell using a known analysis method such as Northern blotting, quantitative PCR, immunoblotting, ELISA, etc. .
  • the activity of the fusion polypeptide can also be measured by a known analysis method (for example, kinase activity measurement).
  • the obtained measured value is compared with the measured value in a control cell not contacted with the test substance. The comparison of measured values is preferably performed based on the presence or absence of a significant difference. If the measured value in the cell contacted with the test substance is significantly lower than that of the control, it can be determined that the test substance suppresses the expression and / or activity of the fusion polypeptide.
  • the proliferation of the cells can be used as an indicator for determination in this step.
  • the proliferation of the cells in contact with the test substance is measured.
  • the cell proliferation can be measured by a method known per se such as cell count, 3 H thymidine incorporation, BRDU method and the like.
  • the growth of the cells in contact with the test substance is compared with the growth of control cells not in contact with the test substance.
  • the comparison of the proliferation level is preferably performed based on the presence or absence of a significant difference.
  • the growth of the control cells not contacted with the test substance may be a value measured in advance or a value measured simultaneously with respect to the measurement of the growth of the cells contacted with the test substance.
  • a value measured simultaneously from the viewpoint of reproducibility is preferable. As a result of the comparison, when the growth of the cell contacted with the test substance is suppressed, it can be determined that the test substance suppresses the expression and / or activity of the fusion polypeptide.
  • step (3) the test substance determined to suppress the expression and / or activity of the fusion polypeptide in step (2) is selected as a cancer therapeutic agent.
  • the present invention relates to an isolated ATF7IP-PDGFRB fusion polypeptide (hereinafter also referred to as the fusion polypeptide of the present invention) comprising the SETDB1-binding domain of ATF7IP and the transmembrane region and kinase domain of PDGFRB and having kinase activity, or the like Provide a fragment.
  • an “isolated” substance refers to another substance (preferably a biological agent) (eg, a nucleic acid) in the environment in which the substance exists in nature (eg, within the organism's cells).
  • a nucleic acid containing a non-nucleic acid factor and a nucleic acid sequence other than the target nucleic acid in the case of a protein, such as a protein containing a non-protein factor and an amino acid sequence other than the target protein). It means what was done.
  • isolated preferably refers to 75% or more, more preferably 85% or more, even more preferably 95% or more, and most preferably 96% or more, 97% or more.
  • isolated polynucleotides and polypeptides include polynucleotides and polypeptides purified by standard purification methods, as well as chemically synthesized polynucleotides and polypeptides.
  • “Fragment” refers to a fragment of the fusion polypeptide of the present invention, comprising a continuous partial sequence including sequences upstream and downstream of the fusion point.
  • the sequence upstream of the fusion point contained in the partial sequence is one or more amino acid residues from the fusion point (for example, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 , 100 amino acid residues or more) and may include up to the N-terminus of the fusion polypeptide of the present invention.
  • the sequence downstream of the fusion point contained in the partial sequence is one or more amino acid residues from the fusion point (for example, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 , 100 amino acid residues or more) and may include up to the C-terminus of the fusion polypeptide of the present invention.
  • the length of the fragment is not particularly limited, but is usually 8 amino acid residues or more (for example, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 50, 100 amino acid residues or more).
  • the fusion polypeptide of the present invention can be, for example, the following isolated fusion polypeptide.
  • a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 4 (Ii) a polypeptide comprising an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 4, wherein the polypeptide comprises an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added, and has kinase activity; or (iii) A polypeptide comprising an amino acid sequence having 80% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 4, and having kinase activity.
  • the present invention provides an isolated polynucleotide encoding the above-mentioned fusion polypeptide of the present invention or a fragment thereof (hereinafter also referred to as the polynucleotide of the present invention).
  • the polynucleotide of the present invention may be any of mRNA, cDNA and genomic DNA. It may be double-stranded or single-stranded.
  • a typical example of a cDNA encoding the ATF7IP-PDGFRB fusion polypeptide is a polynucleotide comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 3.
  • the polynucleotide of the present invention can be produced by a method known per se. For example, it can be extracted from a cDNA library or a genomic library prepared from a cancer tissue or the like holding an ATF7IP-PDGFRB fusion polynucleotide using a known hybridization technique. Moreover, it can also prepare by amplifying using mRNA, cDNA, or genomic DNA prepared from the said cancer tissue etc. using a well-known gene amplification technique (PCR) as a template.
  • PCR gene amplification technique
  • PCR restriction enzyme treatment
  • site-directed mutagenesis site-directed mutagenesis method using wild-type gene cDNA derived from the 5 'end and 3' end of ATF7IP-PDGFRB fusion polynucleotide (Kramer, W. & Fritz, HJ., Methods Enzymol, 1987, 154, 350.) and the like can also be used for the preparation.
  • the fusion polypeptide of the present invention or a fragment thereof can also be produced by a method known per se. For example, by inserting the polynucleotide prepared as described above into an appropriate expression vector, introducing the vector into a cell-free protein synthesis system (for example, reticulocyte extract, wheat germ extract), and incubation, Further, the fusion polypeptide of the present invention can be prepared by introducing the vector into an appropriate cell (for example, E. coli, yeast, insect cell, animal cell) and culturing the obtained transformant.
  • a cell-free protein synthesis system for example, reticulocyte extract, wheat germ extract
  • the fusion polypeptide of the present invention can be prepared by introducing the vector into an appropriate cell (for example, E. coli, yeast, insect cell, animal cell) and culturing the obtained transformant.
  • the fusion polypeptide of the present invention or a fragment thereof can be used as a marker in the detection method of the present invention, and can also be used for production of an antibody against the fusion polypeptide of the present invention.
  • Example 1 Total RNA was extracted from leukemia cells obtained from 300 children with leukemia (acute lymphoblastic leukemia) using miRNeasy mini kit (QIAGEN). This study was carried out with the approval of the ethical review board of the organization involved in this study.
  • RNA sequencing> A cDNA library for RNA sequencing was prepared using TruSeq RNA sample preparation kit v2 Set B (Illumina) according to the manufacturer's standard protocol. The analysis of the total RNA sequence was performed by a paired end method using a next-generation sequencer (HiSeq1000 Illumina).
  • CDNA was synthesized from total RNA extracted from leukemia cells of a subject using ReverTra Ace (registered trademark) qPCR RT Master Mix (Toyobo). The obtained cDNA was subjected to PCR amplification using rTaq DNA Polymerase (Toyobo). Amplification of the desired size gene fragment was confirmed by agarose gel electrophoresis. The amplified gene fragment was TA cloned into a pGEM-T easy vector (PROMEGA).
  • This example describes the identification of novel fusion transcripts in leukemia cells.
  • transcriptome analysis of leukemia cells from 300 children with childhood leukemia was performed.
  • RT-PCR was performed on the specimen in which the ATF7IP-PDGFRB gene was detected using the following primers, and the resulting PCR product was subjected to sequence analysis to confirm the expression of the novel fusion gene (FIGS. 2 and 3).
  • Forward primer CAAGTGGACCATCTCAGACCAC (SEQ ID NO: 11)
  • Reverse primer ATTTAAGCATCTTGACGGCCAC (SEQ ID NO: 12)
  • the ATF7IP-PDGFRB gene is a fusion gene of the ATF7IP gene present on chromosome 12p13.1 and the PDGFRB gene present on chromosome 5q33.1.
  • Example 1 the gene fusion found in Example 1 can be detected by examining the presence or absence of specific band amplification by RT-PCR and determining the base sequence of the PCR product.
  • ATF7IP-PDGFRB gene-positive cases The gene expression pattern in ATF7IP-PDGFRB gene-positive cases is similar to that of Ph-likeophenotype, that is, BCR-ABL fusion gene-positive leukemia (Ph1-ALL), which is a poor prognosis subgroup of childhood leukemia.
  • Ph-likeophenotype that is, BCR-ABL fusion gene-positive leukemia (Ph1-ALL)
  • -ABL fusion gene was not detected, so ATF7IP-PDGFRB gene positive cases were considered to be a special subgroup with a poor prognosis of acute lymphoblastic leukemia. Therefore, by detecting the ATF7IP-PDGFRB gene, the possibility of identifying a subgroup with a poor prognosis of ALL, which had not been known so far, was shown.
  • Example 2 This example describes tyrosine kinase inhibitor (TKI) dasatinib monotherapy for patients with recurrent Ph-like acute lymphoblastic leukemia (ALL) with ATF7IP / PDGFRB translocation.
  • TKI tyrosine kinase inhibitor
  • Recurrent blast cells were completely refractory to the ALL-type protocol using dexamethasone, vincristine, cytarabine, methotrexate, and L-asparaginase.
  • a re-induction AML type regimen was then performed using etoposide, cytarabine, and mitoxantrone (Tsukimoto I, et al., J Clin Oncol, 2009, 27, 4007-4013). After 3 courses of treatment, cytogenetic remission was achieved, but MRD was still detected within the quantitative range.
  • CBSCT Umbilical cord blood stem cell transplantation
  • genomic PCR is directly related to the leukemia cell count measurement. Since DNA is more stable than RNA and does not require a reverse transcription step, DNA-based MRD analysis may also facilitate retrospective investigation, as demonstrated in this case. Furthermore, Pagani et al. Have reported that fusion-specific DNA can be detected in more than 30% of CML patients who are negative for RT-PCR in long-term TKI treatment (Pagani IS, et al., Oncoscience, 2014, 1, 510-521).
  • genomic PCR targeting BCR / ABL genomic breakpoints can be combined with conventional techniques for long-term monitoring of CML patients in TKI therapy. Therefore, when these findings including this example are combined, genomic PCR targeting fusion sequences is one of the highly reliable techniques for MRD monitoring in Ph-like ALL patients undergoing TKI therapy. It can be used as
  • TKI has shown significant therapeutic effects not only in patients with CML but also in other rare types of pediatric hematological malignancies such as Ph-like ALL (Roberts KG, et al., N Engl J Med, 2014, 371, 1005-1015; Weston BW, et al., J Clin Oncol, 2013, 31, e413-416; Lengline E, et al., Haematologica, 2013, 98, e146-148).
  • Example 3 This example describes that ATF7IP-PDGFRB fusion kinase induces cell transformation.
  • TKIs imatinib, dasatinib, nilotinib (LC Laboratories, Woburn, MA, USA), ponatinib, Rebastinib, and buffetinib (Selleck, Houston, TX, USA) were used.
  • Mitogen-activated protein kinase kinase (MEK) inhibitor PD98059 and phosphatidylinositol 3-kinase (PI3 kinase) inhibitor LY294002 were purchased from Merck Millipore (Darmstadt, Germany).
  • Plasmid Construction Wild type (WT-) PDGFRB cDNA was purchased from Promega Corporation (Madison, WI, USA) as Flexi® ORF clone pF1KB7023 (Kazusa clone cp01083). The coding region was isolated by digestion with Sfg I and Pme I followed by blunting with T4 DNA polymerase. After adding overhanging dATP to the 3 'end with rTaq polymerase (Toyobo Co., Ltd., Osaka, Japan), the WT-PDGFRB cDNA is reversed to either pGEM-T easy or pGEM-T (Promega). Subcloning was performed at (SP6 site to T7 site).
  • each PCR product with an overhanging dATP added to the 3 ′ end as previously reported (Tomita et al., 2014, Leukemia Research, 38, 361-370), pGEM-T easy ( Promega) in the forward direction (from T7 site to SP6 site).
  • ATF7IP-PDGFRB DNA Fragments were subcloned into pGEM-T-WT-PDGFRB by sequential ligation.
  • the full length ORF EBF1-PDGFRB cDNA was obtained by ligation of SphFI (blunted) and Bam HI fragments of EBF1 cDNA with NdeI (blunted) and Bam HI fragments of pGEM-T-WT-PDGFRB.
  • each cDNA of the chimeric gene was digested with Sph I (smoothed) and Not I and from pRetroX Tight (Clontech Laboratories, Inc., Madison, WI, USA). Subcloned into NruI and NotI sites.
  • the full-length cDNA insert was isolated by Eco RI digestion and subcloned into the Eco RI site of pRetroX Tight.
  • rTaq polymerase (Toyobo) Amplification was performed from cDNA prepared from Ba / F3 cells transfected with each gene by PCR used.
  • a primer set for detection of mouse ⁇ -actin (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) was also used.
  • Cell lines capable of inducing chimeric genes are basically retro-X TM Tet-On (registered) as previously reported (Iijima et al., 2012, Eur J Immunol, 42, 3405-3415). produced by using retroviral transfection using TM) Advanced Inducible Expression System and retro-X TM Universal Packaging System ( Clontech). In this system, a Tet-on Advanced vector carrying a neomycin resistance gene and a pRetroX Tight expression vector carrying a puromycin resistance gene were used.
  • the stable resistant cells were then cloned by repeating the limiting dilution three times and used for the following experiments.
  • Transfectants with WT-PDGFRB or an empty vector as a mock were similarly used, except that WEHI-3 conditioned medium was always present because it could not grow independently of IL-3. Produced.
  • DAPI 6-diamidino-2-phenylindole
  • HRP horseradish peroxidase
  • Membranes were incubated with the appropriate combination of primary and secondary antibodies, washed and detected using enhanced chemiluminescence reagent system (ECL) and Western Blotting Detection Reagents (GE) (Kiyokawa et al., 1997, J Biol Chem, 272, 18656-18665).
  • ECL enhanced chemiluminescence reagent system
  • GE Western Blotting Detection Reagents
  • PDGFRB and chimeric proteins were obtained from 1 mg of cell lysate prepared from each Ba / F3 transfectant as previously reported (Kiyokawa et al., 1997, J Biol Chem, 272, 18656-18665). Immunoprecipitation was performed using a combination of the appropriate antibody and protein G-agarose (F. Hoffmann-La Roche Ltd., Basel, Sau). Immunoprecipitates were separated on SDS polyacrylamide gels and then immunoblot analysis was performed as described above using the appropriate combinations shown in the figure.
  • the growth rate of PDGFRB-related chimeric transfectants was comparable to parental Ba / F3 cells growing in the presence of conditioned medium (data not shown).
  • the transfectant could not survive without the conditioned medium even in the presence of the ligand PDGFBB (FIG. 5B).
  • the addition of PDGFBB was able to partially extend the survival of WT-PDGFRB transfectants in the absence of conditioned medium as assessed by WST and Annexin V assays (FIGS. 5C and D). ).
  • FIGS. 6A and B appropriate mRNA and protein expression in each transfectant was observed by RT-PCR and immunoblot analysis, respectively.
  • FIG. 6C immunocytochemistry revealed cytoplasmic localization of the ATF7IP-PDGFRB chimeric protein.
  • Intracellular signaling mediated by PDGFRB-related chimeric molecules in Ba / F3 cells was evaluated. Since PDGFRB is a receptor tyrosine kinase, we examined the tyrosine phosphorylation status of cellular proteins and PDGFRB-related chimeric molecules themselves. As shown in FIG. 7A, intracellular proteins were tyrosine phosphorylated in Ba / F3 cells expressing ATF7IP-PDGFRB or EBF1-PDGFRB as compared to mock cells.
  • WT-PDGFRB stimulation with PDGFBB induces tyrosine phosphorylation of the WT-PDGFRB protein.
  • Tyrosine phosphorylation of specific residues located on PDGFRB was also examined. As shown in FIG. 7B, the Tyr751, Tyr771, Tyr1009, and Tyr1021 residues of both ATF7IP-PDGFRB and EBF1-PDGFRB were phosphorylated. Also, the same tyrosine residue on WT-PDGFRB was phosphorylated after PDGFBB stimulation (FIG. 7B).
  • phosphorylation of the Tyr771 residue on PDGFRB allows binding and activation of RasGap (Kashishian et al., 1992, EMBO J, 11, 1373-1382; Kazlauskas et al., 1992, Mol Cell Biol, 12, 2534-2544). Consistent with phosphorylation of the Tyr771 residue on PDGFRB, the phosphorylation level of Ser217 / Ser221 residues of p44 / 42 MAP kinase (Erk1 / 2), a molecule downstream of the Ras signaling pathway, was stimulated by PDGFBB.
  • C-Cbl is also responsible for PDGFRB ubiquitination (Miyake et al., 1999, J Biol Chem, 274, 16619-16628), whereas PDGFRB-related fusion protein detected in myeloproliferative tumors (MPN) It has been reported that ETV6-PDGFRB, can be spared from c-Cbl-induced ubiquitination and degradation (Toffalini F et al., 2009, Haematologica, 94, 1085-1093). Therefore, the association between the chimeric PDGFRB protein and c-Cbl was examined. As shown in FIG.
  • ATF7IP-PDGFRB has been shown to phosphorylate MAP kinase and AKT, ATF7IP-PDGFRB
  • MEK and PI3 kinase inhibitors were investigated.
  • FIG. 10A the AKT inhibitor LY294002 induced cell death in both Ba / F3 cells expressing ATF7IP-PDGFRB and mock-expressing Ba / F3 cells.
  • the MEK inhibitor PD98059 induced cell death only in Ba / F3 cells expressing ATF7IP-PDGFRB and not in mock-expressing Ba / F3 cells. It was further confirmed that MEK inhibitor-induced cell death in Ba / F3 cells expressing ATF7IP-PDGFRB was partially avoided by simultaneously adding conditioned medium containing IL3 (FIG. 10B). Furthermore, it was further confirmed that treatment with the MEK inhibitor PD98059 significantly reduced MAP kinase phosphorylation when assessed by immunoblotting (FIG. 11). Similarly, treatment with the PI3 kinase inhibitor LY294002 clearly reduced AKT phosphorylation (FIG. 11).
  • the calculated IC50 for imatinib for Ba / F3 cells expressing ATF7IP-PDGFRB is 45.6 nM, and the previous literature (Tomita et al.) For Ba / F3 cells expressing BCR-ABL al., 2014, Leukemia Research, 38, 361-370, significantly lower than 600 nM, and other next generation TKIs, including nilotinib, buffetinib, rebastinib, and ponatinib As shown in Fig. 13, each TKI efficiently reduced the number of viable cells of Ba / F3 cells expressing ATF7IP-PDGFRB, and also expressed EBF1-PDGFRB.
  • Ba / F3 cells also showed significant susceptibility to TKI (Fig. 13) and further expressed ATF7IP- or EBF1-PDGFRB after treatment with TKI as assessed by immunoblot analysis.
  • MAP kinase and AKT it was confirmed that phosphorylation of PDGFRB is actually decreased in beauty ( Figure 14).
  • ATF7IP-PDGFRB is constitutively phosphorylated at tyrosine residues and activates downstream molecules including AKT, PLC- ⁇ , MAP kinase, p38 MAP kinase, and JNK. Show. Furthermore, we demonstrated that activation of AKT and MAP kinase is essential for IL-3 independent survival of Ba / F3 cells. On the other hand, the data of this example show that WT-PDGFRB introduced into Ba / F3 cells is not sufficient for IL-3 independent survival, whereas stimulation by PDGFBB is induced by removing IL-3. It was also revealed that Ba / F3 cells were partially released from cell death caused by apoptosis.
  • PDGFRB and other receptor tyrosine kinases activated by binding to the ligand rapidly phosphorylate and activate c-Cbl, resulting in c-Cbl-mediated polyubiquitination of the receptor tyrosine kinase, which is activated It has been well documented that it is an essential process for self-downregulation of selected growth factor receptors (Miyake S et al., 1999, J Biol Chem, 274, 16619-16628; Yokouchi M et al. 1999, J Biol Chem, 274, 31707-31712).
  • Ba / F3 transfectants showed significant WT-PDGFRB fragmentation but no ATF7IP-PDGFRB or EBF1-PDGFRB fragmentation.
  • c-Cbl binding to WT-PDGFRB was increased after stimulation with PDGFBB, while c-Cbl to ATF7IP-PDGFRB or EBF1-PDGFRB was marked. There was no binding.
  • WT-PDGFRB activation by ligand is self-limited by inducing c-Cbl-mediated ubiquitination and therefore cannot fully support IL-3 independent cell survival is doing.
  • constitutively activated ATF7IP- and EBF1-PDGFRB phosphorylate c-Cbl protein but do not bind to c-Cbl and can thus be spared from ubiquitination (Toffalini F et al., 2009, Haematologica, 94, 1085-1093).
  • Sustained activation of downstream molecules mediated by ATF7IP- and EBF1-PDGFRB may be important for IL-3 independent survival of Ba / F3 cells.
  • Toffalini and co-workers have shown that their lack of ubiquitination is due to their lack of ubiquitination, because the fusion proteins TEL-PDGFRB and FIP1L1-PDGFRA are present in the cytoplasm without being inserted into the plasma membrane like the wild-type receptor. It has been reported to be related to changes in living (Toffalini F et al., 2009, Haematologica, 94, 1085-1093).
  • the PI3 kinase inhibitor resulted in cell death in both cells transfected with ATF7IP-PDGFRB and mock cells maintained with WEHI-3 conditioned medium containing IL-3.
  • AKT-mediated signals have been shown to be essential for cell survival.
  • MEK inhibitors cause cell death in cells transfected with ATF7IP-PDGFRB, but not in mock cells, which is related to cell survival signals and growth induced by ATF7IP-PDGFRB. This indicates a difference from that due to factors, and suggests that MAP kinase-mediated signals are more important in ATF7IP-PDGFRB-mediated cell transformation.
  • the IL-3 receptor can simultaneously activate alternative pathways for cell survival other than the MAP kinase cascade, but not PDGFRB.
  • PDGFRB induces not only MAP kinase but also both p38 MAP kinase and JNK that mediate apoptotic signals, so MAP kinase-mediated anti-apoptotic signals can be expressed in p38 MAP kinase and growth factor-independent cell proliferation.
  • the IL-3 receptor activates p38-MAP kinase and another pathway that regulates the apoptotic signal mediated by JNK there's a possibility that.
  • the data in this example demonstrate that Ba / F3 cells expressing ATF7IP-PDGFRB are highly sensitive to TKIs including imatinib, dasatinib, and other new generation TKIs. ing.
  • the IC50 estimate for imatinib is significantly lower than that for BCR-ABL1. This result is consistent with the clinical findings of others who reported the efficacy of imatinib in leukemia patients with PDGFRB rearranged (Weston BW et al., 2013, J Clin Oncol, 31, e413- 416; Lengline E et al., 2013, Haematologica, 98, e146-48; Cheah CY et al., 2014, Blood, 123, 3574-3577).
  • TKI can effectively inhibit the kinase activity of PDGFRB and reduce the activation of AKT and MAP kinases necessary for cell survival.
  • the high sensitivity of the rearranged PDGFRB kinase to TKI is important in the therapeutic consideration of using TKI in patients with ALL in which PDGFRB has been rearranged.
  • ATF7IP-PDGFRB has a transforming ability and shows a marked sensitivity to TKI compared to BCR-ABL1.
  • the results of this example are consistent with clinical findings and indicate the therapeutic utility of TKI against a subset of BCP-ALL with PDGFRB-related chimeric kinase. Further elucidation of the molecular basis of chimeric PDGFRB kinase-mediated cell transformation should also provide a new therapeutic strategy for hematological malignancies caused by PDGFRB translocation.
  • a substance that suppresses the expression and / or activity of a polypeptide encoded by a fusion polynucleotide produced by detecting a gene fusion newly found as a responsible mutation for cancer and the gene fusion results in a therapeutic effect. It is possible to identify a cancer patient or a subject who is at risk for cancer, and to perform treatment (personalized medicine) suitable for such a cancer patient.
  • SEQ ID NO: 1 and 3 ATF7IP-PDGFRB fusion polynucleotide SEQ ID NO: 2 and 4: ATF7IP-PDGFRB fusion polypeptide SEQ ID NO: 5 and 7: ATF7IP cDNA SEQ ID NOs: 6 and 8: ATF7IP polypeptide SEQ ID NO: 9: PDGFRB cDNA SEQ ID NO: 10: PDGFRB polypeptide SEQ ID NO: 11: Forward primer SEQ ID NO: 12: Reverse primer SEQ ID NO: 13: ATF7IP-1 Fwd SEQ ID NO: 14: ATF7IP-1 Rev Sequence number 15: ATF7IP-2 Fwd Sequence number 16: ATF7IP-2 Rev Sequence number 17: ATF7IP-PDGFRB-3 Fwd Sequence number 18: ATF7IP-PDGFRB-3 Rev Sequence number 19: EBF1-PDGFRB Fwd SEQ ID NO: 20: EBF1-PDGFRB Rev Sequence number 21: ATF7IP-PDGFRB

Abstract

　白血病などのがんにおいて薬剤による治療の有効性を予測する指標となりうる変異を同定すること、当該変異を検出する手段を提供すること、当該変異に基づき、当該変異を有する遺伝子またはそれにコードされるタンパク質を標的とする薬剤が治療効果をもたらすがんの患者またはがんのリスクを有する被験者を同定する手段を提供することなど。　がんの責任変異（ドライバー変異）である遺伝子融合の検出方法であって、被験者由来の単離された試料におけるATF7IP-PDGFRB融合ポリヌクレオチドまたはそれによりコードされるポリペプチドを検出する工程を含む、方法。

Description

急性リンパ芽球性白血病の新規キメラ遺伝子ＡＴＦ７ＩＰ－ＰＤＧＦＲＢ
　本発明は、がんの責任変異である遺伝子融合の検出方法、該遺伝子融合により生じる融合ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの発現および／または活性を抑制する物質が治療効果をもたらすがんの患者またはがんのリスクを有する被験者を同定する方法などに関する。
　がんは日本における死因の第一位を占める疾病である。がん細胞は、遺伝的変化により悪性化することが知られている。がんのタイプに特徴的な遺伝的変化を特定することは、発がん機構の解明のみならず、がんの診断および予後予測、がんの治療法の開発および選択などにも貢献することが期待されている。
　キメラ遺伝子（本明細書中、融合遺伝子とも称する）は、本来は全く別個の分子として機能しているタンパク質をコードする２つの遺伝子が染色体転座等の異常にともなって融合することにより形成され、その結果として異常な機能を有する融合タンパク質を産生する。キメラ遺伝子は、白血病やその他のがんの発生の原因となることが知られており、診断における指標および創薬の標的として利用されている。特に近年、がん化に関与するシグナル伝達経路の構成因子（例えば、キナーゼ）に関連するキメラ遺伝子を有するがんに対して、分子標的療法の成功例が増加している。例えば、ALKタンパク質を標的とするチロシンキナーゼ阻害剤（例えば、クリゾチニブ）がEML4-ALK融合遺伝子を有する肺がん患者の治療に有効であること、BCR-ABL融合遺伝子によってコードされるタンパク質を標的とするチロシンキナーゼ阻害剤（例えば、イマチニブ）が当該融合遺伝子を有する白血病患者の治療に有効であることなどが示されている。
　急性リンパ芽球性白血病（ALL）は、リンパ球が幼若な段階で悪性化して、異常に増加するがんの一種である。ALLは、小児から成人までのどの年齢層にも発生するが、小児においては最も一般的ながんとして知られている。ALLについても遺伝的変化として多数のキメラ遺伝子が報告されている。例えば、非特許文献１には、IKZF1変異を有しBCR-ABL1陰性であり予後不良であるALL（Ph-like ALL）における遺伝的変化を特定するために、Ph-like ALLとして特定されたB前駆細胞性ALL（B-ALL）の症例についてRNAシーケンシングおよび全ゲノムシーケンシングを行い、NUP214-ABL1、EBF1-PDGFRB、BCR-JAK2、STRN3-JAK2、PAX5-JAK2、ETV6-ABL1、RANBP2-ABL1、およびRCSD1-ABL1のインフレーム融合を特定したことが記載されている。またEBF1-PDGFRB、BCR-JAK2、およびNUP214-ABL1が、チロシンキナーゼ阻害剤による治療における標的となる可能性があることも示されている。
Roberts KG et al., Cancer Cell, 2012, 22(2), 153-66.
　ALLを含む白血病などのがんにおける変異の同定はいまだ十分になされているとはいえず、薬剤による治療の有効性を予測する指標となりうる変異のさらなる同定が望まれているのが現状である。
　したがって本発明は、ALLを含む白血病などのがんにおいて薬剤による治療の有効性を予測する指標となりうる変異を同定すること、当該変異を検出する手段を提供すること、当該変異に基づき、当該変異を有する遺伝子またはそれにコードされるタンパク質を標的とする薬剤が治療効果をもたらすがんの患者またはがんのリスクを有する被験者を同定する手段を提供することなどを目的とする。
　本発明者らは、前記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、急性リンパ芽球性白血病（ALL）において発現している新規融合遺伝子としてATF7IP-PDGFRB遺伝子を同定した。PDGFRB遺伝子に関しては、前記非特許文献１においてEBF1遺伝子との融合遺伝子が報告されていたものの、ATF7IP遺伝子との融合遺伝子の存在については当該文献を含むいずれの先行技術文献を考慮しても全く予想外であった。
　ATF7IP-PDGFRB遺伝子は、SETDB1結合タンパク質（ATF7IP）とチロシンキナーゼ（PDGFRB）との融合タンパク質を産生して、本来は存在しない増殖刺激を細胞内に伝達する結果、ALLの発生の原因になっていると考えられる。したがって、この遺伝子融合陽性がんに対しては、チロシンキナーゼの阻害薬などが治療効果をもたらす可能性が高い。実際、ATF7IP-PDGFRB遺伝子融合陽性のALL患者に対して、チロシンキナーゼ阻害剤であるダサチニブが有効であることを確認した。
　本発明者らは、これら知見に基づきさらに研究を重ね、本発明を完成するに至った。
　即ち、本発明は以下の通りである。
［１］遺伝子融合の検出方法であって、被験者由来の単離された試料において、ATF7IPのSETDB1結合ドメインならびにPDGFRBの膜貫通領域およびキナーゼドメインを含みかつキナーゼ活性を有するATF7IP-PDGFRB融合ポリペプチド、またはそれをコードする融合ポリヌクレオチドを検出する工程を含む、方法。
［２］融合ポリペプチドが、下記（i）～（iii）のいずれかである、［１］に記載の方法：
（i）配列番号2または4で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ii）配列番号2または4で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドにおいて、1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつキナーゼ活性を有するポリペプチド、または
（iii）配列番号2または4で表されるアミノ酸配列と80％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつキナーゼ活性を有するポリペプチド。
［３］融合ポリヌクレオチドが下記（i）～（iii）のいずれかである、［１］または［２］に記載の方法：
（i）配列番号１または3で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（ii）配列番号１または3で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（iii）配列番号１または3で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて、1若しくは複数のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または
（iv）配列番号１または3で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと80％以上の配列同一性を有し、かつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
［４］遺伝子融合が、がんの責任変異（ドライバー変異）である、［１］～［３］のいずれかに記載の方法。
［５］がんが急性リンパ芽球性白血病である、［４］に記載の方法。
［６］がんの責任変異（ドライバー変異）である遺伝子融合により生じる融合ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの発現および／または活性を抑制する物質が治療効果をもたらすがんの患者またはがんのリスクを有する被験者を同定する方法であって、下記の工程を含む、方法：
（1）被験者由来の単離された試料において、ATF7IPのSETDB1結合ドメインならびにPDGFRBの膜貫通領域およびキナーゼドメインを含みかつキナーゼ活性を有するATF7IP-PDGFRB融合ポリペプチド、またはそれをコードする融合ポリヌクレオチドを検出する工程；ならびに
（2）前記融合ポリペプチド、またはそれをコードする融合ポリヌクレオチドが検出された場合に、前記ポリペプチドの発現および／または活性を抑制する物質が前記被験者において治療効果をもたらすと判定する工程。
［７］遺伝子融合の検出用キットであって、下記（A）～（C）のいずれかのポリヌクレオチドまたは抗体あるいはそれらの組合せを含む、キット：
（A）ATF7IP-PDGFRB融合ポリヌクレオチドを特異的に認識するように設計されたプローブであるポリヌクレオチド；
（B）ATF7IP-PDGFRB融合ポリヌクレオチドを特異的に増幅できるように設計された一対のプライマーであるポリヌクレオチド；あるいは
（C）ATF7IP-PDGFRB融合ポリペプチドを特異的に認識する抗体。
［８］遺伝子融合が、がんの責任変異（ドライバー変異）である、［７］に記載のキット。
［９］ATF7IPのSETDB1結合ドメインならびにPDGFRBの膜貫通領域およびキナーゼドメインを含みかつキナーゼ活性を有する、単離されたATF7IP-PDGFRB融合ポリペプチドまたはその断片。
［１０］［９］に記載の融合ポリペプチドまたはその断片をコードするポリヌクレオチド。
［１１］ATF7IP-PDGFRB遺伝子融合陽性がんの治療剤。
［１２］ATF7IPのSETDB1結合ドメインならびにPDGFRBの膜貫通領域およびキナーゼドメインを含みかつキナーゼ活性を有するATF7IP-PDGFRB融合ポリペプチドの発現および／または活性を抑制する物質を有効成分として含む、［１１］に記載の治療剤。
［１３］がんが急性リンパ芽球性白血病である、［１１］または［１２］に記載の治療剤。
［１４］ATF7IPのSETDB1結合ドメインならびにPDGFRBの膜貫通領域およびキナーゼドメインを含みかつキナーゼ活性を有するATF7IP-PDGFRB融合ポリペプチドの発現および／または活性を抑制する物質が、PDGFRBキナーゼ活性を阻害する物質である、［１１］～［１３］のいずれかに記載の治療剤。
［１５］PDGFRBキナーゼ活性を阻害する物質が、メシル酸イマチニブ、ダサチニブ、ニロチニブ、ポナチニブ、レバスチニブ、またはバフェチニブである、［１４］に記載の治療剤。
［１６］PDGFRBキナーゼ活性を阻害する物質が、ダサチニブである、［１４］に記載の治療剤。
［１７］がん治療における使用のための薬剤であって、ATF7IPのSETDB1結合ドメインならびにPDGFRBの膜貫通領域およびキナーゼドメインを含みかつキナーゼ活性を有するATF7IP-PDGFRB融合ポリペプチドの発現および／または活性を抑制する物質を含む薬剤。
［１８］がんがATF7IP-PDGFRB遺伝子融合陽性がんである、［１７］に記載の薬剤。
［１９］がんが急性リンパ芽球性白血病である、［１７］または［１８］に記載の薬剤。
［２０］ATF7IPのSETDB1結合ドメインならびにPDGFRBの膜貫通領域およびキナーゼドメインを含みかつキナーゼ活性を有するATF7IP-PDGFRB融合ポリペプチドの発現および／または活性を抑制する物質が、PDGFRBキナーゼ活性を阻害する物質、好ましくはメシル酸イマチニブ、ダサチニブ、ニロチニブ、ポナチニブ、レバスチニブ、またはバフェチニブ、より好ましくはダサチニブである、［１７］～［１９］のいずれかに記載の薬剤。
［２１］がんの治療方法であって、ATF7IPのSETDB1結合ドメインならびにPDGFRBの膜貫通領域およびキナーゼドメインを含みかつキナーゼ活性を有するATF7IP-PDGFRB融合ポリペプチドの発現および／または活性を抑制する物質の治療上有効量を被験者に投与する工程を含む、方法。
［２２］被験者がATF7IP-PDGFRB遺伝子融合陽性がん患者である、［２１］に記載の方法。
［２３］被験者が急性リンパ芽球性白血病患者である、［２１］に記載の方法。
［２４］ATF7IPのSETDB1結合ドメインならびにPDGFRBの膜貫通領域およびキナーゼドメインを含みかつキナーゼ活性を有するATF7IP-PDGFRB融合ポリペプチドの発現および／または活性を抑制する物質が、PDGFRBキナーゼ活性を阻害する物質である、［２１］に記載の方法。
［２５］PDGFRBキナーゼ活性を阻害する物質が、メシル酸イマチニブ、ダサチニブ、ニロチニブ、ポナチニブ、レバスチニブ、またはバフェチニブである、［２４］に記載の方法。
［２６］PDGFRBキナーゼ活性を阻害する物質が、ダサチニブである、［２４］に記載の方法。
［２７］がん治療剤のスクリーニング方法であって、下記の工程を含む、方法：
（1）ATF7IPのSETDB1結合ドメインならびにPDGFRBの膜貫通領域およびキナーゼドメインを含みかつキナーゼ活性を有するATF7IP-PDGFRB融合ポリペプチドを発現している細胞に被験物質を接触させる工程；
（2）前記融合ポリペプチドの発現および／または活性が抑制されるか否かを決定する工程；ならびに
（3）前記融合ポリペプチドの発現および／または活性を抑制すると決定された物質をがん治療剤として選択する工程。
　本発明によれば、本願発明によりはじめて明らかとなった特定のがんの未知の責任変異を検出することが可能となり、当該責任変異の存在に基づくがん治療が効果をもたらすがんの患者またはがんのリスクを有する被験者を同定すること、さらには当該がん患者を治療することが可能となる。
図１は、ATF7IP-PDGFRB融合タンパク質のドメイン構造の一例を示す概略図である。下向き矢印はATF7IPタンパク質およびPDGFRBタンパク質における切断点、ならびにATF7IP-PDGFRB融合タンパク質における融合点を示す。SETDB1：SETDB1結合ドメイン；MBD1：MBD1結合ドメイン；Ig：Ig様ドメイン；TM：膜貫通領域；PTK：キナーゼドメイン。 図２は、白血病細胞由来RNAから合成したcDNAを鋳型として、ATF7IP-PDGFRB遺伝子融合をRT-PCRにより検出した結果を示す電気泳動の写真である。矢印は遺伝子融合を示す遺伝子断片の増幅を示す。 図３は、増幅した遺伝子断片の塩基配列決定の結果を示す。 図４は、ATF7IP/PDGFRB陽性ALL患者の臨床経過を示す。（Ａ）蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）、RT-PCR（Kobayashi K, et al., Br J Haematol, 2014, 165, 836-841)、およびゲノムPCRにより治療反応を評価した。化学療法レジメンは以下の通りであった：ブロック1：標準リスクALL型療法（東京小児がん研究グループ研究L99-15）、維持療法を、最初の診断の16か月後に開始した；ブロック2：ALL型再導入療法；ブロック3：AML型レジメン（Tsukimoto I, et al., J Clin Oncol, 2009, 27, 4007-4013）。略号：CBSCT、臍帯血幹細胞移植；TKI、チロシンキナーゼ阻害剤；FISH、蛍光in situハイブリダイゼーション。（Ｂ）17サンプルにおいてRT-PCRおよびゲノムPCRによって検出したMRDの結果。ゲノムPCRおよびRT-PCRによる検出レベルを、それぞれx軸およびy軸に示す。2サンプルにおいて、いずれの方法を用いてもMRDは検出されなかった；4サンプルにおいて、ゲノムPCRによってのみMRDが検出された；11サンプルにおいて、いずれのPCR法を用いても定量的範囲内でMRDが検出された。結果が一致しなかった4サンプルについて、ゲノムPCR産物をクローナルシークエンスにより確かめ、偶発的な偽陽性の結果の可能性を排除した。点線は、MRD検出の定量化能な範囲の閾値を表す。 図５は、IL-3非依存的細胞増殖がATF7IP-およびEBF1-PDGFRBによって誘導されるが、野生型（WT-）PDGFRBによって誘導されないことを示す。（Ａ）テトラサイクリン誘導性システムを使用して、ATF7IP-PDGFRBを発現するレトロウイルスベクターまたは空ベクター（Mock）でBa/F3細胞をトランスフェクトした。レトロウイルスに10時間曝露し、次いでドキシサイクリン（Dox）を用いるかまたは用いないで24時間処理した後、細胞を洗浄し、馴化培地を除去した。60時間インキュベーションした後、水溶性テトラゾリウム塩（WST）アッセイにより生細胞数を推定した。各処理について三連の平均 ± SEMを棒グラフにより示した。 （Ｂ）ATF7IP-PDGFRB、EBF1-PDGFRB、または野生型PDGFRB（WT-PDGFRB）でトランスフェクトし、クローン化したBa/F3細胞を、表示した期間、WEHI-3-馴化培地（CM）の非存在下で培養し、WSTアッセイに供した。WT-PDGFRBトランスフェクタントの場合、２つの条件、すなわち100 ng/mLのPDGFBBを用いる条件と用いない条件、について試験した。対照として、WEHI-3馴化培地を用いるかまたは用いないで培養した、空ベクターでトランスフェクトしたBa/F3細胞を同時に調べた。OD値を、三連の平均 ± SEMとして示す。示したデータは、三回の独立した実験の代表例である。（Ｃ）（Ｂ）に示したPDGFBBを用いるかまたは用いないWT-PDGFRBおよび馴化培地を用いないモックの結果を抽出し、Y軸を拡大したグラフ上に示した。 （Ｄ）（Ｂ）と同じWT-PDGFRBトランスフェクタントのサンプル調製物を、アネキシンV結合アッセイにより調べた。対照として、表示したようにPDGFBBまたは馴化培地を用いるかまたは用いないで処理したモック細胞も同様に試験した。実験は三連で行い、典型的な細胞所見および陽性率（%）の平均 ± SEMを示す。X軸、蛍光強度；Y軸、相対細胞数。 図６は、トランスフェクタントにおけるPDGFRB関連キメラ分子および野生型（WT-）PDGFRBの発現を示す。（Ａ）ATF7IP-PDGFRB（A）、EBF1-PDGFRB（E）、WT-PDGFRB（W）、または空ベクター（Mock、M）でトランスフェクトしたBa/F3細胞1x107個からトータルRNAを抽出し、各遺伝子の発現および内部標準としてのβ-アクチンの発現をPCRにより調べた。（Ｂ）各タイプのPDGFRBの発現を、免疫ブロット解析により調べた。ATF7IP-PDGFRBの場合、融合タンパク質は、抗ATF7IP抗体または抗PDGFRB抗体のいずれを用いても検出された。灰色の矢印は、WT-PDGFRBの場合に検出された、予想サイズよりも低分子量のいくつかの予期せぬバンドを示す。（Ｃ）Ba/F3細胞におけるATF7IP-PDGFRBの発現を、免疫細胞化学により検出した。 図７は、PDGFRBの発現により媒介されるチロシンリン酸化の増加を示す。（Ａ）細胞ライセートをBa/F3トランスフェクタントから調製し、抗ホスホチロシン抗体4G10を使用する免疫ブロッティングによりタンパク質チロシンリン酸化を検出した。（Ｂ）（Ａ）と同じサンプル調製物を、図中に表示されたチロシン残基についてのホスホ特異的抗PDGFRB抗体を使用して同様に調べた。ATF7IP-PDGFRB、A；EBF1-PDGFRB、E；WT-PDGFRB、W；リガンド刺激（100 ng/mLのPDGFBB）あり、L；モック/空ベクター、M。 図８は、PDGFRBの下流に位置するシグナル伝達分子のリン酸化の亢進を示す。図７と同じサンプル調製物を、図中に表示された抗体を使用して同様に調べた。ATF7IP-PDGFRB、A；EBF1-PDGFRB、E；WT-PDGFRB、W；リガンド刺激（100 ng/mLのPDGFBBで5分間）あり、+；リガンド刺激なし、-；モック/空ベクター、M。 図９は、Ba/F3トランスフェクタントにおけるc-Cblのリン酸化およびc-CblのPDGFRBへの結合を示す。（Ａ）表示された細胞ライセートについて抗PDGFRB抗体を用いて免疫沈降を行った。SDS-PAGE上で分離した後、抗c-Cblまたは抗PDGFRB抗体のいずれかを用いて免疫ブロットを行った。（Ｂ）同じサンプル調製物を使用して、免疫沈降および免疫ブロット解析を、それぞれ抗c-Cbl抗体および抗ホスホチロシン抗体を用いて行った。ATF7IP-PDGFRB、A；EBF1-PDGFRB、E；PDGFBB（100 ng/mLで5分間）ありのWT-PDGFRB、W+；PDGFBBなしのWT-PDGFRB、W-；モック/空ベクター、M。 図１０は、PDGFRBを有するBa/F3トランスフェクタントの増殖に対するPI3キナーゼおよびMEKに対する阻害剤の効果を示す。（Ａ）ATF7IP-PDGFRBを発現しているBa/F3細胞をWEHI-3-馴化培地（CM）の非存在下で、またモックBa/F3細胞をCMの存在下で、表示された濃度のPI3キナーゼ阻害剤LY294002またはMEK阻害剤PD98059を用いるかまたは用いないで24時間処理した。その後、図５Ｂと同様に、WSTアッセイにより生細胞数を推定した。阻害剤で処理しなかった細胞から得たOD値に対する阻害剤で処理した細胞から得たOD値の比を算出し、結果を三連の平均 ± SEMとして表した。（Ｂ）ATF7IP-PDGFRBを発現しているBa/F3細胞を、CMの存在下または非存在下でPD98059で処理し、（Ａ）と同様に調べた。 図１１は、AKTおよびMAPキナーゼのリン酸化に対するPI3キナーゼおよびMEKに対する阻害剤の効果を示す。図１０と同じサンプル調製物から細胞ライセートを調製した。図８と同様に免疫ブロット解析を行った。阻害剤なし、None；LY294002あり、LY； PD98059あり、PD。 図１２は、AKTおよびMAPキナーゼのリン酸化に対するPDGFBBおよびIL-3の効果を示す。WT-PDGFRBを発現している細胞を、WEHI-3馴化培地の存在下で（CM(+))または非存在下で（CM(-））、12時間維持した。表示された期間PDGFBBにより刺激した後、細胞ライセートを調製した。図８と同様に免疫ブロット解析を行った。 図１３は、PDGFRBを有するBa/F3トランスフェクタントの増殖に対するチロシンキナーゼ阻害剤の効果を示す。（Ａ）馴化培地の存在下で維持した（CM(+））ATF7IP-またはEBF1-PDGFRBを発現している細胞およびモックBa/F3細胞を、表示された濃度のチロシンキナーゼ阻害剤を用いるかまたは用いないで24時間処理した。その後、図５Ｂと同様に、WSTアッセイにより生細胞数を推定した。阻害剤で処理しなかった細胞から得たOD値に対する阻害剤で処理した細胞から得たOD値の比を算出し、結果を三連の平均 ±SEMとして表した。 （Ｂ）PDGFRBを有するBa/F3トランスフェクタントの増殖に対するニロチニブ、バフェチニブ（Bafetinib）、レバスチニブ（Rebastinib）、およびポナチニブの効果。 図１４は、AKTおよびMAPキナーゼのリン酸化に対するチロシンキナーゼ阻害剤の効果を示す。図１３と同様に100 nMのイマチニブで12時間処理したサンプル調製物から細胞ライセートを調製した。図８と同様に、免疫ブロット解析を行った。
　後述の実施例において示す通り、本発明者らは、がん組織において、がんの責任変異（ドライバー変異）としてATF7IP-PDGFRB遺伝子融合を初めて見出した。本発明はかかる知見に基づき、当該遺伝子融合の検出方法、当該責任変異の存在に基づくがん治療が効果をもたらすがんの患者またはがんのリスクを有する被験者の同定方法、がんの治療方法およびがん治療剤、がん治療剤のスクリーニング方法等を提供する。
　本発明において「がんの責任変異」とは、ドライバー変異と互換的に使用される用語であるが、がん組織に存在する変異であって、細胞に対するがん化能を有する変異をいう。典型的には、ある変異が見出されたがん組織において、既知のがん遺伝子変異がいずれも存在しない場合（すなわち、当該変異が前記既知のがん遺伝子変異と相互排他的に存在する場合）、当該変異はがんの責任変異であるということができる。
＜具体的ながんの責任変異＞
　以下、具体的な遺伝子融合について説明する。なお本明細書中、融合ポリヌクレオチドにおける「融合点」とは、5’側の遺伝子部分と3’側の遺伝子部分とが接続される境界を意味し、これは2つのヌクレオチド残基の間の境界である。また融合ポリペプチドにおける「融合点」とは、N末端側のポリペプチドとC末端側のポリペプチドとが接続される境界を意味し、これは2つのアミノ酸残基の間の境界であるか、または遺伝子融合が1つのコドン内で生じた場合には当該コドンによりコードされる1つのアミノ酸残基自体である。
　ATF7IP-PDGFRB遺伝子融合は、ATF7IPタンパク質とPDGFRBタンパク質の融合タンパク質（以下、ATF7IP-PDGFRB融合ポリペプチドとも称する）の発現を生じる変異であり、ヒト染色体においては12p13.1および5q33.1の領域内に切断点を有する転座（t(5;12)）により生じる変異である。
　ATF7IP（activating transcription factor 7 interacting protein 1）タンパク質は、MCAF1などとしても知られている、ヒトにおいては12p13.1に存在する遺伝子にコードされるタンパク質であり、典型的には配列番号6または8で表されるアミノ酸配列（NCBIアクセッション番号NP_060649.3（26-Oct-2013）、またはNP_851997.1（08-Nov-2013））からなるタンパク質である。ATF7IPタンパク質の機能については未だ十分に解明されていないが、転写因子と結合してその転写活性を調節すると考えられている。ATF7IPタンパク質は、SETDB1結合ドメインおよびMBD1結合ドメインを有することを特徴としている（図１）。SETDB1結合ドメインは、例えば、ヒトであれば配列番号6で表されるアミノ酸配列の562～817位のアミノ酸配列に該当する。MBD1結合ドメインは、例えば、ヒトであれば配列番号6で表されるアミノ酸配列の1154～1270位のアミノ酸配列に該当する。
　PDGFRBタンパク質は、ヒトにおいては5q33.1に存在する遺伝子にコードされるタンパク質であり、典型的には配列番号10で表されるアミノ酸配列（NCBIアクセッション番号NP_002600.1（27-Oct-2013））からなるタンパク質である。PDGFRBタンパク質は、Ig様ドメイン、膜貫通領域、およびキナーゼドメインを有することを特徴としている（図１）。Ig様ドメインは、例えば、ヒトであれば配列番号10で表されるアミノ酸配列の228～415位のアミノ酸配列に該当する。膜貫通領域は、例えば、ヒトであれば配列番号10で表されるアミノ酸配列の533～553位のアミノ酸配列に該当する。キナーゼドメインは、例えば、ヒトであれば配列番号10で表されるアミノ酸配列の562～953位のアミノ酸配列に該当する。
　ATF7IP-PDGFRB融合ポリペプチドは、ATF7IPタンパク質のSETDB1結合ドメインならびにPDGFRBタンパク質の膜貫通領域およびキナーゼドメインを含みかつキナーゼ活性を有するポリペプチドである。
　ATF7IP-PDGFRB融合ポリペプチドには、ATF7IPタンパク質のSETDB1結合ドメインの全部が含まれてもよいし、SETDB1と結合し得る限り、SETDB1結合ドメインの一部が含まれてもよい。当該SETDB1結合ドメインの一部がSETDB1と結合するか否かは、J Biol Chem, 2005, 280(14), 13928-35に記載されたGSTプルダウンアッセイにより測定することにより確認することができる。
　ATF7IP-PDGFRB融合ポリペプチドは、ATF7IPタンパク質のMBD1結合ドメインの全部または一部を含んでもよいし、含まなくてもよい。
　ATF7IP-PDGFRB融合ポリペプチドには、PDGFRBタンパク質のキナーゼドメインの全部が含まれてもよいし、ATF7IP-PDGFRB融合ポリペプチドがキナーゼ活性を有する限り、キナーゼドメインの一部が含まれてもよい。
　ATF7IP-PDGFRB融合ポリペプチドが「キナーゼ活性を有する」とは、PDGFRBタンパク質由来のキナーゼドメインに起因してチロシンをリン酸化する酵素としての活性を有することを意味する。ATF7IP-PDGFRB融合ポリペプチドのキナーゼ活性は、定法により測定され、通常、適切な条件下で基質（合成ペプチド基質など）及びATPと共にインキュベーションした後、基質のリン酸化チロシンを検出する。また市販の測定キットを用いて測定することもできる。
　ATF7IP-PDGFRB融合ポリペプチドは、PDGFRBタンパク質の膜貫通領域の全部又は一部を含んでもよいが、膜貫通領域の全部を含むことが好ましい。
　本発明において、ATF7IP-PDGFRB融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（以下、ATF7IP-PDGFRB融合ポリヌクレオチドとも称する）は、ATF7IPタンパク質のSETDB1結合ドメインならびにPDGFRBタンパク質の膜貫通領域およびキナーゼドメインを含みかつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。ATF7IP-PDGFRB融合ポリヌクレオチドは、mRNA、cDNAおよびゲノムDNAのいずれであってもよい。
　本発明におけるATF7IP-PDGFRB融合ポリヌクレオチドは、例えば、下記のポリペプチドをコードするATF7IP-PDGFRB融合ポリヌクレオチドであり得る：
（i）配列番号2または4で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ii）配列番号2または4で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドにおいて、1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつキナーゼ活性を有するポリペプチド、または
（iii）配列番号2または4で表されるアミノ酸配列と80％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつキナーゼ活性を有するポリペプチド。
　配列番号2または4で表されるアミノ酸配列は、後述の実施例において示すように、ヒトがん組織由来のサンプル中に見出された部分配列を含むATF7IP-PDGFRB融合ポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列である。
　上記(ii)において、「1若しくは複数のアミノ酸」とは、通常、1～50個、好ましくは1～30個、より好ましくは1～10個、さらにより好ましくは1～数個（例えば、1～5個、1～4個、1～3個、1若しくは2個、または1個）のアミノ酸を意味する。
　上記(iii)において、「80％以上の配列同一性」とは、好ましくは８５%以上、より好ましくは９０％以上、９５％以上、さらにより好ましくは９７%以上、９８％以上、９９%以上の配列同一性を意味する。アミノ酸配列の同一性は、カーリンおよびアルチュールによるアルゴリズムBLAST（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268, 1990、Proc Natl Acad Sci USA 90: 5873, 1993）に基づくBLASTXまたはBLASTPと呼ばれるプログラム（Altschul SF, et al: J Mol Biol 215: 403, 1990）を利用して決定することができる。BLASTXを用いてアミノ酸配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばscore＝50、wordlength＝3とする。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は当業者にはよく知られている（例えば、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）。
　また本発明におけるATF7IP-PDGFRB融合ポリヌクレオチドは、例えば、下記のいずれかのポリヌクレオチドであり得る：
（i）配列番号１または3で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（ii）配列番号１または3で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（iii）配列番号１または3で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて、1若しくは複数のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または
（iv）配列番号１または3で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと80％以上の配列同一性を有し、かつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
　配列番号１または3で表される塩基配列は、後述の実施例において示すように、ヒトがん組織由来のサンプル中に見出された部分配列を含むATF7IP-PDGFRB融合ポリヌクレオチドの塩基配列である。
　上記(ii)において、「ストリンジェントな条件下」とは、特に記載した場合を除き、中程度または高程度にストリンジェントな条件をいう。
　中程度にストリンジェントな条件は、例えば、対象となるポリヌクレオチドの長さに基づき、当業者であれば容易に設計することができる。基本的な条件は、Sambrookら，Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第3版、第6～7章、Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001に示されている。典型的には、中程度にストリンジェントな条件は、ニトロセルロースフィルターに関し、5×SSC、0.5％SDS、1.0 mM EDTA（pH8.0）の前洗浄条件；約40～50℃での、約50％ホルムアミド、2～6×SSC（または、約42℃での、約50％ホルムアミド中のStark's solutionなどの他の同様のハイブリダイゼーション溶液）のハイブリダイゼーション条件；および約40℃～60℃、0.5～6×SSC、0.1％ SDSの洗浄条件を含む。中程度にストリンジェントな条件は、好ましくは、約50℃、6×SSCのハイブリダイゼーション条件を含み、前述の洗浄条件および／または洗浄条件を含んでいてもよい。
　高程度にストリンジェントな条件（高ストリンジェントな条件）もまた、例えば、対象となるポリヌクレオチドの長さに基づき、当業者であれば容易に設計することができる。高ストリンジェントな条件は、中程度にストリンジェントな条件よりも高い温度および／または低い塩濃度が含まれる。典型的には、約65℃、0.2～6×SSC、好ましくは6×SSC、より好ましくは2×SSC、さらに好ましくは0.2×SSCのハイブリダイゼーション条件を含む。いずれの場合も、約65～68℃、0.2×SSC、0.1％ SDSの洗浄条件を含むことが好ましい。
　いずれの場合も、ハイブリダイゼーション、前洗浄および洗浄のための緩衝液として、SSC（1×SSCは、0.15 M NaClおよび15 mM クエン酸ナトリウムである。）の代わりにSSPE（1×SSPEは、0.15 M NaCl、10 mM NaH2PO4、および1.25 mM EDTA、pH7.4である。）を代用することができる。いずれの場合も、洗浄は、ハイブリダイゼーションが完了した後、約15分間行うことができる。
　上記(iii)において、「1若しくは複数のヌクレオチド」とは、通常、1～50個、好ましくは1～30個、より好ましくは1～10個、さらにより好ましくは1～数個（例えば、1～5個、1～4個、1～3個、1若しくは2個、または1個）のヌクレオチドを意味する。
　上記(iv)において、「80％以上の配列同一性」とは、好ましくは８５%以上、より好ましくは９０％以上、９５％以上、さらにより好ましくは９７%以上、９８％以上、９９%以上の配列同一性を意味する。塩基配列の同一性は、前記アルゴリズムBLASTに基づくBLASTNと呼ばれるプログラム（Altschul SF, et al: J Mol Biol 215: 403, 1990）を利用して決定することができる。BLASTNを用いて塩基配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばscore＝100、wordlength＝12とする。
＜遺伝子融合の検出方法＞
　本発明は、ATF7IP-PDGFRB遺伝子融合の検出方法（以下、本発明の検出方法とも称する）を提供する。当該遺伝子融合は、好ましくはがんの責任変異（ドライバー変異）を生じる。本発明の検出方法は、被験者由来の単離された試料におけるATF7IP-PDGFRB融合ポリヌクレオチドまたはそれによりコードされるポリペプチドを検出する工程を含む。
　本発明の検出方法において、被験者は、哺乳動物であれば特に限定されない。哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、シマリス、モルモット等のげっ歯類、ウサギ、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ、ミンク、イヌ、ネコ、ヒト、サル、カニクイザル、アカゲザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類等を挙げることができるが、ヒトが好ましい。
　被験者は、がんに罹患している被験者のみならず、がんに罹患している疑いのある被験者、又は将来がんになるリスクを有する被験者であってもよい。本発明の検出方法を適用する対象となる「がん」としては、ATF7IP-PDGFRB遺伝子融合が検出され得るがんであれば特に限定されないが、好ましくは白血病であり、さらに好ましくは急性リンパ芽球性白血病（ALL）であり、特に好ましくはB前駆細胞性急性リンパ芽球性白血病（B-ALL）である。
　被験者由来の「単離された試料」は、生体試料（例えば、細胞、組織、臓器（例えば、小腸、脾臓、腎臓、肝臓、胃、肺、副腎、心臓、脳、膵臓、大動脈等）、体液（例えば、血液、リンパ液、骨髄液等）、消化液、喀痰、肺胞・気管支洗浄液、尿、便）のみならず、これらの生体試料から得られる核酸抽出物（ゲノムDNA抽出物、mRNA抽出物、mRNA抽出物から調製されたcDNA調製物やcRNA調製物等）やタンパク質抽出物も含む。ゲノムDNA、mRNA、cDNA又はタンパク質は、当業者であれば、前記試料の種類及び状態等を考慮し、それに適した公知の手法を選択して調製することが可能である。また、前記試料は、ホルマリン固定処理、アルコール固定処理、凍結処理又はパラフィン包埋処理が施してあるものでもよい。
　また「単離された試料」は、前記がんが存在するか又は存在すると疑われる組織、臓器、または体液由来であることが好ましく、より好ましくは前記がんが存在するかまたは存在すると疑われる血液または骨髄液由来である。そのような「単離された試料」としては、例えば、白血病（好ましくはALL、より好ましくはB-ALL）患者または白血病に罹患している疑いのある被験者の血液または骨髄液由来の細胞、当該細胞から抽出した全RNAなどが挙げられる。
　本発明の検出方法において、融合ポリヌクレオチドまたはそれによりコードされるポリペプチドの検出は、自体公知の手法を用いて行なうことができる。
　ゲノムDNAからの転写産物（mRNAまたはmRNAから調製したcDNA）を対象とする場合、例えば、RT-PCR法、シークエンシング、TaqManプローブ法、ノーザンブロッティング、ドットブロット法、cDNAマイクロアレイ解析等を利用してmRNA又はcDNAである融合ポリヌクレオチドを検出することができる。
　またゲノムDNAを対象とする場合、例えば、in situハイブリダイゼーション（ISH）、ゲノムPCR法、シークエンシング、TaqManプローブ法、サザンブロッティング、ゲノムマイクロアレイ解析等を利用してゲノムDNAである融合ポリヌクレオチドを検出することができる。
　これらの手法はそれぞれ単独で利用することができるが、組み合わせて利用してもよい。例えば、ATF7IP-PDGFRB遺伝子融合は、融合ポリペプチドを発現することによりがん化に寄与すると考えられることから、ゲノムDNAである融合ポリヌクレオチドを検出する場合（例えばin situハイブリダイゼーション等による）には、転写産物またはタンパク質が生成することをさらに確認すること（例えばRT-PCR、免疫染色法等による）も好ましい。
　ハイブリダイゼーション技術（例えば、TaqManプローブ法、ノーザンブロッティング、サザンブロッティング、ドットブロット法、マイクロアレイ解析、in situハイブリダイゼーション（ISH）など）により融合ポリヌクレオチドを検出する場合には、前記融合ポリヌクレオチドを特異的に認識するように設計されたプローブであるポリヌクレオチドを使用することができる。ここで「融合ポリヌクレオチドを特異的に認識する」とは、ストリンジェントな条件で、当該融合ポリヌクレオチドの融合点から5’末端側及び3’末端側の部分が由来する野生型遺伝子を含めて当該融合ポリヌクレオチド以外のポリヌクレオチドから、当該融合ポリヌクレオチドを識別して認識することをいう。
　本発明の検出方法においては、治療又は診断の過程で得られる生体試料（生検サンプル等）は、ホルマリン固定されていることが多いため、検出対象であるゲノムＤＮＡがホルマリン固定下においても安定しており、検出感度が高いという観点から、in situハイブリダイゼーションを用いることが好適である。
　in situハイブリダイゼーションにおいては、前記生体試料に、融合ポリヌクレオチドを特異的に認識するように設計されたプローブであるポリヌクレオチドとして少なくとも１５塩基の鎖長を有する下記（ａ）または（ｂ）に記載のポリヌクレオチドをハイブリダイズさせることにより、融合ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡ（融合ポリヌクレオチド）を検出することができる。
（ａ）5’側融合パートナー遺伝子（ATF7IP遺伝子）の塩基配列にハイブリダイズするプローブ及び3’側融合パートナー遺伝子（PDGFRB遺伝子）の塩基配列にハイブリダイズするプローブからなる群から選択される少なくとも一つのプローブであるポリヌクレオチド
（ｂ）5’側融合パートナー遺伝子と3’側融合パートナー遺伝子との融合点を含む塩基配列にハイブリダイズするプローブであるポリヌクレオチド。
　本発明にかかるATF7IP遺伝子は、ヒト由来のものであれば、典型的にはＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号　NC_000012.11で特定されるゲノムの配列のうち14518566から14655864番目のＤＮＡ配列からなる遺伝子である。
　本発明にかかるPDGFRB遺伝子は、ヒト由来のものであれば、典型的にはＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号　NC_000005.9で特定されるゲノムの配列のうち149493402～149535447番目のＤＮＡ配列（相補鎖にコードされる）からなる遺伝子である。
　しかしながら、遺伝子のＤＮＡ配列は、その変異等により、自然界において（すなわち、非人工的に）変化しうる。従って、このような天然の変異体も本発明の対象になりうる（以下、同様）。
　本発明の（ａ）に記載のポリヌクレオチドは、該ポリヌクレオチドの標的塩基配列である、5’側融合パートナー遺伝子（ATF7IP遺伝子）の塩基配列および／または3’側融合パートナー遺伝子（PDGFRB遺伝子）の塩基配列にハイブリダイズすることにより、前記生体試料における融合ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡの存在を検出できるものであればよいが、好ましくは、下記（ａ１）～（ａ３）に記載のポリヌクレオチドである：
（ａ１）　5’側融合パートナー遺伝子の切断点よりも5’側の上流領域の塩基配列にハイブリダイズするポリヌクレオチド（以下、「5’融合パートナー遺伝子プローブ１」とも称する）と、3’側融合パートナー遺伝子の切断点よりも3’側の下流領域の塩基配列にハイブリダイズするポリヌクレオチド（以下、「3’融合パートナー遺伝子プローブ１」とも称する）との組み合わせ；
（ａ２）　5’側融合パートナー遺伝子の切断点よりも5’側の上流領域の塩基配列にハイブリダイズするポリヌクレオチド（以下、「5’融合パートナー遺伝子プローブ１」とも称する）と、5’側融合パートナー遺伝子の切断点よりも3’側の下流領域の塩基配列にハイブリダイズするポリヌクレオチド（以下、「5’融合パートナー遺伝子プローブ２」とも称する）との組み合わせ；
（ａ３）　3’側融合パートナー遺伝子の切断点よりも5’側の上流領域の塩基配列にハイブリダイズするポリヌクレオチド（以下、「3’融合パートナー遺伝子プローブ２」とも称する）と、3’側融合パートナー遺伝子の切断点よりも3’側の下流領域の塩基配列にハイブリダイズするポリヌクレオチド（以下、「3’融合パートナー遺伝子プローブ１」とも称する）との組み合わせ。
　上記（ａ１）～（ａ３）において、5’側融合パートナー遺伝子の切断点よりも5’側の上流領域の塩基配列には、典型的にはATF7IPタンパク質のSETDB1結合ドメインの全部または一部のコード領域が含まれる。
　上記（ａ１）～（ａ３）において、3’側融合パートナー遺伝子の切断点よりも3’側の下流領域の塩基配列には、典型的にはPDGFRBの膜貫通領域の全部または一部のコード領域およびキナーゼドメインの全部または一部のコード領域が含まれる。
　前記（ａ１）に記載のポリヌクレオチドとしては、例えば、以下の(a1-1)のポリヌクレオチドの組み合わせが挙げられる：
(a1-1)ATF7IPのSETDB1結合ドメインの全部または一部のコード領域にハイブリダイズするポリヌクレオチドと、PDGFRBのキナーゼドメインの全部または一部のコード領域にハイブリダイズするポリヌクレオチドの組み合わせ。
　本発明において、in situハイブリダイゼーションに用いられる前記（ａ）に記載のポリヌクレオチドがハイブリダイズする領域（標的塩基配列）としては、標的塩基配列に対する特異性及び検出の感度の観点から、5’側融合パートナー遺伝子（ATF7IP遺伝子）と3’側融合パートナー遺伝子（PDGFRB遺伝子）との融合点から１００００００塩基以内の領域であることが好ましい。
　また、本発明において、in situハイブリダイゼーションに用いられる前記（ｂ）に記載のポリヌクレオチドは、該ポリヌクレオチドの標的塩基配列である、5’側融合パートナー遺伝子と3’側融合パートナー遺伝子との融合点を含む塩基配列にハイブリダイズすることにより、前記生体試料における融合ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡの存在を検出できるものであればよいが、典型例としては、配列番号1または3に記載の塩基配列中の融合点を含む塩基配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドである。
　また、本発明において、in situハイブリダイゼーションに用いられる前記（ａ）または（ｂ）に記載のポリヌクレオチドは、標的塩基配列に対する特異性及び検出の感度の観点から、前記標的塩基配列全体をカバーすることのできる、複数種のポリヌクレオチドからなる集団であることが好ましい。かかる場合、該集団を構成するポリヌクレオチドの長さは少なくとも１５塩基であるが、１００～１０００塩基であることが好ましい。
　in situハイブリダイゼーションに用いられる前記（ａ）または（ｂ）に記載のポリヌクレオチドは、検出のため、蛍光色素等によって標識されていることが好ましい。かかる蛍光色素としては、例えば、ＤＥＡＣ、ＦＩＴＣ、Ｒ６Ｇ、ＴｅｘＲｅｄ、Ｃｙ５が挙げられるが、これらに制限されない。また、蛍光色素以外に放射性同位元素（例：125Ｉ、131Ｉ、3Ｈ、14Ｃ、33Ｐ、32Ｐ等）、酵素（例：β－ガラクトシダーゼ、β－グルコシダーゼ、アルカリホスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素等）、発光物質（例：ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニン、3,3'-ジアミノベンジジン（DAB）等）、によって、前記ポリヌクレオチドを標識してもよい。
　in situハイブリダイゼーションにおいて、5’側融合パートナー遺伝子プローブ１と3’側融合パートナー遺伝子プローブ１とを用いる場合、5’側融合パートナー遺伝子プローブ１と5’側融合パートナー遺伝子２とを用いる場合、または3’融合パートナー遺伝子プローブ２と3’融合パートナー遺伝子プローブ１とを用いる場合、これらプローブは互いに異なる色素にて標識されていることが好ましい。そして、このように異なる色素にて標識したプローブの組み合わせを用いてin situハイブリダイゼーションを行った場合、5’側融合パートナー遺伝子プローブ１の標識が発するシグナル（例えば、蛍光）と3’側融合パートナー遺伝子プローブ１の標識が発するシグナルとの重なりが観察された際に融合ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡを検出できたと判定することができる。一方、5’側融合パートナー遺伝子プローブ１の標識が発するシグナルと5’側融合パートナー遺伝子プローブ２の標識が発するシグナルとの分離、3’側融合パートナー遺伝子プローブ２の標識が発するシグナルと3’側融合パートナー遺伝子プローブ１の標識が発するシグナルとの分離が観察された際に融合ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡを検出できたと判定することができる。
　なお、ポリヌクレオチドの標識は、公知の手法により行うことができる。例えば、ニックトランスレーション法やランダムプライム法により、蛍光色素等によって標識された基質塩基をポリヌクレオチドに取り込ませ、該ポリヌクレオチドを標識することができる。
　in situハイブリダイゼーションにおいて、前記（ａ）または（ｂ）に記載のポリヌクレオチドと前記生体試料とをハイブリダイズさせる際の条件は、当該ポリヌクレオチドの長さ等の諸要因により変動し得るが、高ストリンジェンシーなハイブリダイズの条件として、例えば、０．２ｘＳＳＣ、６５℃という条件が挙げられ、低ストリンジェンシーなハイブリダイズの条件として、例えば、２．０ｘＳＳＣ、５０℃という条件が挙げられる。なお、当業者であれば、塩濃度（ＳＳＣの希釈率等）と温度の他、例えば、界面活性剤（ＮＰ－４０等）の濃度、ホルムアミドの濃度、ｐＨ等の諸条件を適宜選択することで、前記条件と同様のストリンジェントなハイブリダイゼーションの条件を実現することができる。
　前記（ａ）または（ｂ）に記載のポリヌクレオチドを用いて、融合ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡを検出する方法としては、前記in situハイブリダイゼーション以外に、サザンブロッティング、ノーザンブロッティング及びドットブロッティングが挙げられる。これら方法においては、前記生体試料から得られる核酸抽出物を転写したメンブレンに、前記（ａ）または（ｂ）に記載のポリヌクレオチドをハイブリダイズさせることにより、前記融合遺伝子を検出する。前記（ａ）のポリヌクレオチドを用いた場合、5’側融合パートナー遺伝子の塩基配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドと3’側融合パートナー遺伝子の塩基配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドとが、メンブレンにおいて展開された同一のバンドを認識した場合に、融合ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡを検出することができたと判定することができる。
　前記（ｂ）のポリヌクレオチドを用いて融合ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡを検出する方法としては、さらに、ゲノムマイクロアレイ解析やＤＮＡマイクロアレイ解析が挙げられる。これら方法においては、前記（ｂ）のポリヌクレオチドを基板に固定したアレイを作製し、当該アレイ上のポリヌクレオチドに前記生体試料を接触させることにより、当該ゲノムＤＮＡを検出する。基板としては、オリゴまたはポリヌクレオチドを固相化できるものであれば特に限定されず、例えばガラス板、ナイロンメンブレン、マイクロビーズ、シリコンチップ、キャピラリーなどを挙げることができる。
　本発明の検出方法においては、PCRを利用して融合ポリヌクレオチドを検出することも好ましい。
　PCRにおいては、前記生体試料から調製したDNA（ゲノムDNA、cDNA）やRNAを鋳型として融合ポリヌクレオチドを特異的に増幅できるように設計された一対のプライマーであるポリヌクレオチドを使用することができる。ここで「融合ポリヌクレオチドを特異的に増幅できる」とは、当該融合ポリヌクレオチドの融合点から5’末端側及び3’末端側の部分が由来する野生型遺伝子を増幅することなく、当該融合ポリヌクレオチドのみを増幅できることをいい、当該融合ポリヌクレオチドの全部が増幅されてもよいし、融合点を含む当該融合ポリヌクレオチドの一部が増幅されてもよい。
　PCR等で利用する「一対のプライマーであるポリヌクレオチド」は、標的となる融合ポリヌクレオチドを特異的に増幅するセンスプライマー（フォワードプライマー）とアンチセンスプライマー（リバースプライマー）とからなり、センスプライマーは当該融合ポリヌクレオチドの融合点から5’末端側の塩基配列から設計し、アンチセンスプライマーは当該融合ポリヌクレオチドの融合点から3’末端側の塩基配列から設計する。またこれらのプライマーは、PCR法による検出の精度や感度の観点から、通常PCR産物が5 kb以下になるよう設計される。プライマーの設計は、公知の手法により適宜行なうことができ、例えば、Primer Express（登録商標）ソフトウェア（Applied Biosystems）を利用することができる。これらのポリヌクレオチドの長さは、通常15塩基以上（好ましくは16、17、18、19または20塩基以上、より好ましくは21塩基以上）であり、100塩基以下（好ましくは90、80、70、60、50または40塩基以下、より好ましくは30塩基以下）である。
　「一対のプライマーであるポリヌクレオチド」の好適な例としては、配列番号11で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと配列番号12で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとからなるプライマーセット、および配列番号21で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと配列番号22で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとからなるプライマーセットが挙げられる。
　PCRを利用して融合ポリヌクレオチドを検出する場合、PCR産物を対象としてシークエンシングを行い、融合点を含む塩基配列を決定することで、5’側の遺伝子部分と3’側の遺伝子部分とがインフレームで連結されていることおよび／または融合ポリヌクレオチド中に所定のドメインが含まれていることを確認することができる。シークエンシングは公知の手法により行うことができ、シークエンサー（例えば、ABI-PRISM 310 Genetic Analyzer（Applied Biosystems Inc.）などを）を取扱説明書に従って使用することにより、簡単に実施することができる。
　またPCRを利用して融合ポリヌクレオチドを検出する場合、TaqManプローブ法をにより、5’側の遺伝子部分と3’側の遺伝子部分とがインフレームで連結されていることおよび／または融合ポリヌクレオチド中に所定のドメインが含まれていることを確認することができる。TaqManプローブ法において使用するプローブとしては、例えば前記（ａ）または（ｂ）に記載のポリヌクレオチドが挙げられる。プローブは、レポーター色素（例えば、FAM、FITC、VIC等）とクエンチャー（例えば、TAMRA、Eclipse、DABCYL、MGBなど）で標識される。
　上記プライマー及びプローブは、DNAであってもRNAであってもよく、あるいはDNA/RNAキメラであってもよいが、好ましくはDNAである。またその一部又は全部において、PNA（polyamide nucleic acid、ペプチド核酸）、LNA（登録商標、locked nucleic acid、Bridged Nucleic Acid、架橋化核酸）、ENA（登録商標、2'-O,4'-C-Ethylene-bridged nucleic acids）、GNA（Glycerol nucleic acid、グリセロール核酸）、TNA（Threose nucleic acid、トレオース核酸）等の人工核酸によって、ヌクレオチドが置換されているものであってもよい。また上記プライマー及びプローブは、二本鎖であっても一本鎖であってもよいが、好ましくは一本鎖である。
　また上記プライマーおよびプローブは、標的配列に特異的にハイブリダイズし得る限り、1又は複数のヌクレオチドのミスマッチを含んでいてもよく、標的配列の相補配列に対して通常80％以上、好ましくは90、91、92、93、94％以上、より好ましくは95、96、97、98、99％以上の同一性を有し、最も好ましくは100％の同一性を有する。
　上記プライマー及びプローブは、例えば、本明細書に記載された塩基配列の情報に基づいて、DNA/RNA自動合成機を用いて常法に従って合成することができる。
　本発明の検出方法においては、全トランスクリプトームシークエンシング（RNAシークエンシング）またはゲノムシークエンシングにより融合ポリヌクレオチドを検出してもよい。これらの手法は、例えば、次世代シークエンサー（例えば、ゲノムアナライザーIIx（Illumina社）、ハイセックシークエンサー(HiSeq2000、イルミナ社）ゲノムシークエンサー FLX System（Roche社）など）を使用して製造者の説明書に従って行なうことができる。RNAシークエンシングは、例えば、市販のキット（例えば、mRNA-Seqサンプル調製キット（Illumina社）など）を用いて製造者の説明書に従ってトータルRNAからcDNAライブラリーを調製し、これを次世代シークエンサーを使用するシークエンシングに供することにより行なうことができる。
　本発明の検出方法において、融合ポリヌクレオチドの翻訳産物（すなわち、融合ポリペプチド）を対象とする場合、例えば、免疫染色法、ウェスタンブロッティング法、RIA法、ELISA法、フローサイトメトリー法、免疫沈降法、抗体アレイ解析などを利用して当該翻訳産物を検出することができる。これらの方法においては、融合ポリペプチドを特異的に認識する抗体が用いられる。ここで「融合ポリペプチドを特異的に認識する」とは、当該融合ポリペプチドの融合点からN末端側及びC末端側の部分が由来する野生型タンパク質を含めて当該融合ポリペプチド以外のタンパク質を認識することなく、当該融合ポリペプチドのみを認識することをいう。本発明の検出方法において使用される「融合ポリペプチドを特異的に認識する」抗体は、1つの抗体であってもよいし、2つ以上の抗体の組み合わせであってもよい。
　「融合ポリペプチドを特異的に認識する抗体」としては、融合ポリペプチドの融合点を含むポリペプチドに特異的な抗体（以下、「融合点特異的抗体」とも称する）が挙げられる。ここで、「融合点特異的抗体」とは、前記融合点を含むポリペプチドに特異的に結合するが、N末端側及びC末端側の部分が由来する野生型タンパク質には結合しない抗体を意味する。
　また「融合ポリペプチドを特異的に認識する抗体」としては、融合ポリペプチドの融合点からN末端側の領域からなるポリペプチドに結合する抗体と融合ポリペプチドの融合点からC末端側の領域からなるポリペプチドに結合する抗体の組み合わせも挙げられる。これら2つの抗体を用いてサンドイッチELISA、免疫染色法、免疫沈降法、ウェスタンブロッティング法などを行なうことにより、融合ポリペプチドを検出することができる。
　本発明において、抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（mAb）等の天然型抗体、遺伝子組換え技術を用いて製造され得るキメラ抗体、ヒト化抗体、一本鎖抗体、およびこれらの結合性断片が含まれるが、これらに限定されない。結合性断片とは、特異的結合活性を有する前記抗体の一部分の領域を意味し、具体的には例えばFab、Fab’、F(ab')2、Fv、及び単鎖抗体などが挙げられる。抗体のクラスは、特に限定されず、IgG、IgM、IgA、IgDまたはIgEなどのいずれのアイソタイプを有する抗体であってもよいが、精製の容易性等を考慮するとより好ましくはIgGである。
　「融合ポリペプチドを特異的に認識する抗体」は、当業者であれば適宜公知の手法を選択して調製することができる。かかる公知の手法としては、前記融合ポリペプチドの融合点を含むポリペプチド、前記融合ポリペプチドの融合点からN末端側の領域からなるポリペプチド、または前記融合ポリペプチドの融合点からC末端側の領域からなるポリペプチドを免疫動物に接種し、該動物の免疫系を活性化させた後、該動物の血清（ポリクローナル抗体）を回収する方法や、ハイブリドーマ法、組換えDNA法、ファージディスプレイ法等のモノクローナル抗体の作製方法が挙げられる。市販の抗体を利用してもよい。また標識物質を結合させた抗体を用いれば、当該標識を検出することにより、標的蛋白質を直接検出することが可能である。標識物質としては、抗体に結合することができ、検出可能なものであれば特に制限されることはなく、例えば、ペルオキシダーゼ、β-D-ガラクトシダーゼ、マイクロペルオキシダーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP）、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）、ローダミンイソチオシアネート（RITC）、アルカリホスファターゼ、ビオチン、及び放射性物質などが挙げられる。さらに、標識物質を結合させた抗体を用いて標的タンパク質を直接検出する方法以外に、標識物質を結合させた二次抗体、プロテインGまたはプロテインA等を用いて標的タンパク質を間接的に検出する方法を利用することもできる。
＜遺伝子融合の検出用キット＞
　以上のように、ATF7IP-PDGFRB遺伝子融合により生じる融合ポリヌクレオチドまたはそれによりコードされるポリペプチドを、前記プライマー、プローブ、または抗体、あるいはそれらの組み合わせを用いて検出することができ、それにより当該遺伝子融合を検出することができる。したがって、本発明は、下記のいずれかのポリヌクレオチドまたは抗体あるいはそれらの組み合わせを含む、遺伝子融合（好ましくは、がんの責任変異（ドライバー変異）である遺伝子融合）の検出用キット（以下、本発明のキットとも称する）を提供する：
（A）ATF7IP-PDGFRB融合ポリヌクレオチドを特異的に認識するように設計されたプローブであるポリヌクレオチド；
（B）ATF7IP-PDGFRB融合ポリヌクレオチドを特異的に増幅できるように設計された一対のプライマーであるポリヌクレオチド；あるいは
（C）ATF7IP-PDGFRB融合ポリペプチドを特異的に認識する抗体。
　本発明のキットには、ポリヌクレオチドや抗体に加えて、ポリヌクレオチドや抗体に付加した標識の検出に必要な基質、陽性対照（例えば、ATF7IP-PDGFRB融合ポリヌクレオチド、ATF7IP-PDGFRB融合ポリペプチド、またはこれらを保持する細胞等）や陰性対照、PCR用試薬、in situハイブリダイゼーション等において用いられる対比染色用試薬（DAPI等）、抗体の検出に必要な分子（例えば、二次抗体、プロテインG、プロテインA）、試料の希釈や洗浄に用いる緩衝液等を適宜組み合わせて含めることができる。本発明のキットには、使用説明書を含めることもできる。本発明のキットを使用することにより、上記本発明の検出方法を容易に実施することが可能である。
　本発明の検出方法及び検出用キットは、がんの責任変異として新たに見出した遺伝子融合の検出を可能にするものであり、後述のように当該遺伝子融合の陽性例を同定し個別化医療を適用する上で極めて有用である。
＜がんの患者またはがんのリスクを有する被験者を同定する方法＞
　ATF7IP-PDGFRB遺伝子融合は、がんの責任変異であり、PDGFRBキナーゼ活性の恒常活性化により、がんの悪性化等に寄与していると考えられる。そのため、このような遺伝子融合が検出されるがん患者においては、当該遺伝子融合により生じる融合ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの発現および／または活性を抑制する物質による治療が有効である蓋然性が高い。
　したがって、本発明は、がんの責任変異（ドライバー変異）である遺伝子融合により生じる融合ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの発現および／または活性を抑制する物質が治療効果をもたらすがんの患者またはがんのリスクを有する被験者を同定する方法（以下、本発明の同定方法とも称する）を提供する。
　本発明の同定方法は、下記の工程を含む：
（1）被験者由来の単離された試料において、ATF7IPのSETDB1結合ドメインならびにPDGFRBの膜貫通領域およびキナーゼドメインを含みかつキナーゼ活性を有するATF7IP-PDGFRB融合ポリペプチド、またはそれによりコードされるポリペプチドを検出する工程ならびに
（2）前記融合ポリヌクレオチドまたはそれによりコードされるポリペプチドが検出された場合に、前記ポリペプチドの発現および／または活性を抑制する物質が前記被験者において治療効果をもたらすと判定する工程。
　本発明の同定方法において、「がんの患者またはがんのリスクを有する被験者」は、がんに罹患しているか、またはがんに罹患している疑いのある哺乳動物、好ましくはヒトである。本発明の同定方法を適用する対象となる「がん」としては、ATF7IP-PDGFRB遺伝子融合が検出され得るがんであれば特に限定されないが、好ましくは白血病であり、さらに好ましくは急性リンパ芽球性白血病（ALL）であり、特に好ましくはB前駆細胞性急性リンパ芽球性白血病（B-ALL）である。
　本発明の同定方法において、「治療効果」とは、がん治療の効果であって、患者に対する有益な効果であれば特に限定されず、例えば、腫瘍縮小効果、無増悪生存期間延長効果、延命効果などが挙げられる。
　本発明の同定方法において、ATF7IP-PDGFRB遺伝子融合に関してがん治療の有効性を評価する対象となる「がんの責任変異（ドライバー変異）である遺伝子融合により生じる融合ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの発現および／または活性を抑制する物質」（以下、本発明の同定方法における対象物質とも称する）としては、ATF7IP-PDGFRB融合ポリペプチドの発現および／またはその機能を直接または間接的に阻害する物質であれば特に限定されない。
　ATF7IP-PDGFRB融合ポリペプチドの発現を阻害する物質としては、例えば、ATF7IP-PDGFRB融合ポリペプチドの発現を抑制するsiRNA（small interfering RNA）、shRNA（short hairpin RNA）、miRNA（micro RNA)、アンチセンス核酸、これらのポリヌクレオチドを発現し得る発現ベクター、低分子化合物などが挙げられる。
　ATF7IP-PDGFRB融合ポリペプチドの機能を阻害する物質としては、例えば、PDGFRBキナーゼ活性を阻害する物質（例えば、低分子化合物等）、ATF7IP-PDGFRB融合ポリペプチドに結合する抗体等が挙げられる。
　これらの物質は、ATF7IP-PDGFRB融合ポリペプチドの発現および／または活性を特異的に抑制する物質であってもよいし、野生型PDGFRBタンパク質の発現および／または活性をも抑制する物質であってもよい。このような物質の具体例としては、PDGFRBキナーゼ活性を阻害する物質（すなわち、チロシンキナーゼ阻害剤）であるメシル酸イマチニブ（imatinib mesylate）（GLEEVEC(登録商標)）、ダサチニブ、ニロチニブ、ポナチニブ、レバスチニブ（Rebastinib）、バフェチニブ（Bafetinib）等が挙げられ、ダサチニブが好ましい。
　これらの物質は、本明細書中に開示されたATF7IP-PDGFRB融合ポリヌクレオチドおよび／またはATF7IP-PDGFRB融合ポリペプチドの配列情報等に基づいて、自体公知の方法により調製することができる。また市販の物質を利用してもよい。
　これらの物質は、被験者由来の単離された試料においてATF7IP-PDGFRB融合ポリヌクレオチドまたはそれによりコードされるポリペプチドが検出された場合に、当該被験者に対してがん治療剤として有効である。
　本発明の同定方法における工程(1)は、前記本発明の検出方法に含まれる工程と同様に実施することができる。
　本発明の同定方法における工程(2)では、工程(1)で被験者（すなわちがんの患者またはがんのリスクを有する被験者）由来の単離された試料において融合ポリヌクレオチドまたはそれによりコードされるポリペプチドが検出された場合に、本発明の同定方法における対象物質が前記被験者において治療効果をもたらすと判定され、一方、融合ポリヌクレオチドまたはそれによりコードされるポリペプチドが検出されなかった場合には、本発明の同定方法における対象物質が前記被験者において治療効果をもたらす可能性が低いと判定される。
　本発明の同定方法によれば、がんの患者またはがんのリスクを有する被験者の中からがんの責任変異として新たに見出した遺伝子融合の陽性例を検出し、当該遺伝子融合により生じる融合ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの発現および／または活性を抑制する物質が治療効果をもたらすがんの患者またはがんのリスクを有する被験者を同定することが可能であり、本発明はそのような対象に適した治療を行うことが可能になる点で有用である。
＜がんの治療方法およびがん治療剤＞
　上記の通り、本発明の同定方法により、ATF7IP-PDGFRB遺伝子融合により生じる融合ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの発現および／または活性を抑制する物質が治療効果をもたらすがん患者が同定される。そのため、がん患者のうち、当該融合遺伝子を保持する患者に選択的に当該物質を投与することにより、効率的にがんの治療を行うことが可能である。従って、本発明は、がんの治療方法であって、上記本発明の同定方法により当該物質が治療効果をもたらすと判定された被験者に、当該物質を投与する工程を含む方法（以下、本発明の治療方法とも称する）を提供する。
　また、本発明の治療方法において投与される物質はがん治療剤として機能することから、本発明はさらに、ATF7IP-PDGFRB遺伝子融合により生じる融合ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの発現および／または活性を抑制する物質を有効成分とするがん治療剤（以下、本発明のがん治療剤とも称する）を提供する。
　本発明の治療方法およびがん治療剤において、がんはATF7IP-PDGFRB遺伝子融合陽性がんであれば特に限定されないが、好ましくは白血病であり、さらに好ましくは急性リンパ芽球性白血病（ALL）であり、特に好ましくはB前駆細胞性急性リンパ芽球性白血病（B-ALL）である。ここで、ATF7IP-PDGFRB遺伝子融合陽性がんとは、本発明の検出方法によってATF7IP-PDGFRB融合ポリヌクレオチドまたはそれによりコードされるポリペプチドが検出されるがんを意味する。
　本発明のがん治療剤としては、上記本発明の同定方法に関連して、ATF7IP-PDGFRB遺伝子融合により生じる融合ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの発現および／または活性を抑制する物質として記載した物質が挙げられる。
　本発明のがん治療剤は、それらの製剤化に通常用いられる薬理学上許容される担体、賦形剤、および／またはその他の添加剤を用いて、医薬組成物として調製することができる。
　本発明のがん治療剤の投与方法は、当該阻害剤の種類やがんの種類などに応じて適宜選択されるが、例えば、経口、静脈内、腹腔内、経皮、筋肉内、気管内（エアゾール）、直腸内、膣内等の投与形態を採用することができる。
　本発明のがん治療剤の投与量は、有効成分の活性や種類、投与様式（例、経口、非経口）、病気の重篤度、投与対象となる動物種、投与対象の薬物受容性、体重、年齢等を考慮して、適宜決定することができる。
　本発明の治療方法およびがん治療剤は、従来知られておらず本願発明により明らかとなった特定のがんの責任変異を有する患者の治療を可能にするため有用である。
＜がん治療剤のスクリーニング方法＞
　本発明は、ATF7IP-PDGFRB遺伝子融合を有するがん患者に対して治療効果をもたらすがん治療剤のスクリーニング方法（以下、本発明のスクリーニング方法とも称する）を提供する。本発明のスクリーニング方法により、ATF7IP-PDGFRB融合ポリペプチドの発現および／または活性を抑制する物質を、がん治療剤として得ることができる。
　本発明のスクリーニング方法に供される被験物質は、いかなる化合物又は組成物であってもよく、例えば、核酸（例、ヌクレオシド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド）、糖質（例、単糖、二糖、オリゴ糖、多糖）、脂質（例、飽和又は不飽和の直鎖、分岐鎖及び／又は環を含む脂肪酸）、アミノ酸、タンパク質（例、オリゴペプチド、ポリペプチド）、低分子化合物、化合物ライブラリー、ランダムペプチドライブラリー、天然成分（例、微生物、動植物、海洋生物等由来の成分）、あるいは食品等が挙げられる。
　本発明のスクリーニング方法は、被験物質がATF7IP-PDGFRB融合ポリペプチドの発現および／または活性を抑制するか否かを評価可能である限り、いかなる形態であってもよい。典型的には、本発明のスクリーニング方法は、下記の工程を含む：
（1）ATF7IPのSETDB1結合ドメインならびにPDGFRBの膜貫通領域およびキナーゼドメインを含みかつキナーゼ活性を有するATF7IP-PDGFRB融合ポリペプチドを発現している細胞に被験物質を接触させる工程；
（2）前記融合ポリペプチドの発現および／または活性が抑制されるか否かを決定する工程；ならびに
（3）前記融合ポリペプチドの発現および／または活性を抑制すると決定された物質をがん治療剤として選択する工程。
　工程（1）では、ATF7IP-PDGFRB融合ポリペプチドを発現している細胞と被験物質を接触させる。対照として、被験物質を含まない溶媒（例えば、DMSOなど）を用いることができる。当該接触は、培地中で行うことができる。培地は、用いられる細胞の種類などに応じて適宜選択されるが、例えば、約5～20％のウシ胎仔血清を含む最少必須培地（MEM）、ダルベッコ改変最少必須培地（DMEM）、RPMI1640培地、199培地などである。培養条件もまた、用いられる細胞の種類などに応じて適宜決定されるが、例えば、培地のpHは約6～約8であり、培養温度は約30～約40℃であり、培養時間は約12～約72時間である。
　ATF7IP-PDGFRB融合ポリペプチドを発現している細胞としては、例えば、内在的に当該融合ポリペプチドを発現しているがん組織由来の細胞、当該細胞から誘導された細胞株、遺伝子工学的に作製された細胞株などが挙げられるが、これらに限定されない。ある細胞がATF7IP-PDGFRB融合ポリペプチドを発現しているか否かは、上記本発明の検出方法を利用して確認することもできる。また細胞は、通常哺乳動物の細胞であり、好ましくはヒトの細胞である。
　工程（2）では、前記融合ポリペプチドの発現および／または活性が抑制されるか否かが決定される。融合ポリペプチドの発現は、細胞におけるmRNAレベルまたはタンパク質レベルを公知の分析方法、例えば、ノーザンブロット法、定量的PCR法、イムノブロット法、ELISA法等を用いて決定することにより測定することができる。また融合ポリペプチドの活性も、公知の分析方法（例えば、キナーゼ活性測定など）により測定することができる。得られた測定値を被験物質と接触させない対照細胞における測定値と比較する。測定値の比較は、好ましくは有意差の有無に基づいて行われる。被験物質と接触させた細胞における測定値が対照と比較して有意に低い場合、当該被験物質が融合ポリペプチドの発現および／または活性を抑制すると決定することができる。
　あるいは、これらの融合ポリペプチドを発現している細胞は、増殖が亢進していることから、当該細胞の増殖を本工程における決定のための指標とすることができる。この場合、まず、被験物質と接触させた当該細胞の増殖を測定する。細胞増殖の測定は、セルカウント、3Hチミジンの取り込み、BRDU法等の自体公知の方法により行うことができる。次に、被験物質と接触させた当該細胞の増殖を、被験物質と接触させない対照細胞の増殖と比較する。増殖レベルの比較は、好ましくは、有意差の有無に基づいて行なわれる。被験物質と接触させない対照細胞の増殖は、被験物質と接触させた細胞の増殖の測定に対し、事前に測定した値であっても、同時に測定した値であってもよいが、実験の精度、再現性の観点から同時に測定した値であることが好ましい。比較の結果、被験物質と接触させた当該細胞の増殖が抑制された場合に、当該被験物質が融合ポリペプチドの発現および／または活性を抑制すると決定することができる。
　工程（3）では、工程（2）において融合ポリペプチドの発現および／または活性を抑制すると決定された被験物質をがん治療剤として選択する。
　以上のように、本発明のスクリーニング方法によれば、従来知られていなかったがんの責任変異を有する患者の治療に適用可能ながん治療剤を取得することが可能となる。
＜単離された融合ポリペプチドまたはその断片、およびそれらをコードするポリヌクレオチド＞
　本発明は、ATF7IPのSETDB1結合ドメインならびにPDGFRBの膜貫通領域およびキナーゼドメインを含みかつキナーゼ活性を有する、単離されたATF7IP-PDGFRB融合ポリペプチド（以下、本発明の融合ポリペプチドとも称する）またはその断片を提供する。
　本明細書中、「単離された」物質とは、ある物質が天然に存在する環境（例えば、生物体の細胞内）の他の物質（好ましくは、生物学的因子）（例えば、核酸である場合、核酸以外の因子および目的とする核酸以外の核酸配列を含む核酸；タンパク質である場合、タンパク質以外の因子および目的とするタンパク質以外のアミノ酸配列を含むタンパク質など）から実質的に分離または精製されたものをいう。本明細書において「単離された」とは、好ましくは７５重量％以上、より好ましくは８５重量％以上、よりさらに好ましくは９５重量％以上、そして最も好ましくは９６重量％以上、９７重量％以上、９８重量％以上、９９重量％以上、又は１００％の純度を有することを意味する。「単離された」ポリヌクレオチドおよびポリペプチドには、標準的な精製方法によって精製されたポリヌクレオチドおよびポリペプチドが含まれ、また化学的に合成したポリヌクレオチドおよびポリペプチドも含まれる。
　「断片」とは、本発明の融合ポリペプチドの断片であって、融合点の上流および下流の配列を含む連続した部分配列からなるものをいう。当該部分配列に含まれる融合点の上流の配列は、融合点から1アミノ酸残基以上（例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100アミノ酸残基以上）を含み、本発明の融合ポリペプチドのN末端までを含みうる。当該部分配列に含まれる融合点の下流の配列は、融合点から1アミノ酸残基以上（例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100アミノ酸残基以上）を含み、本発明の融合ポリペプチドのC末端までを含みうる。断片の長さは、特に限定されないが、通常8アミノ酸残基以上（例えば、9、10、11、12、13、14、15、20、25、50、100アミノ酸残基以上）である。
　また本発明の融合ポリペプチドは、例えば下記の単離された融合ポリペプチドであり得る。
（i）配列番号2または4で表わされるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ii）配列番号2または4で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドにおいて、1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつキナーゼ活性を有するポリペプチド、あるいは
（iii）配列番号2または4で表されるアミノ酸配列と80％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつキナーゼ活性を有するポリペプチド。
　本発明の融合ポリペプチドに関する各用語の意味については、上記＜具体的ながんの責任変異＞において記載した通りである。
　さらに本発明は、上記本発明の融合ポリペプチドまたはその断片をコードする単離されたポリヌクレオチド（以下、本発明のポリヌクレオチドとも称する）を提供する。本発明のポリヌクレオチドは、mRNA、cDNAおよびゲノムDNAのいずれであってもよい。また二本鎖であっても一本鎖であってもよい。
　ATF7IP-PDGFRB融合ポリペプチドをコードするcDNAの典型例は、配列番号1または3で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドである。
　本発明のポリヌクレオチドは、自体公知の方法により作製することができる。例えば、ATF7IP-PDGFRB融合ポリヌクレオチドを保持するがん組織等から調製したcDNAライブラリーまたはゲノムライブラリーから公知のハイブリダイゼーション技術を利用して抽出することができる。また、前記がん組織等から調製したmRNA、cDNAまたはゲノムDNAを鋳型として公知の遺伝子増幅技術（PCR）を用いて増幅することにより調製することもできる。さらに、ATF7IP-PDGFRB融合ポリヌクレオチドの5’末端側及び3’末端側の部分が由来する野生型遺伝子のcDNAを材料とし、PCR、制限酵素処理、部位特異的変異誘発（site-directed mutagenesis）法（Kramer, W. & Fritz, HJ., Methods Enzymol, 1987, 154, 350．）等の公知の遺伝子増幅技術や組換え技術を利用して調製することもできる。
　本発明の融合ポリペプチドまたはその断片も、自体公知の方法により作製することができる。例えば、上記のようにして調製したポリヌクレオチドを適当な発現ベクターに挿入し、該ベクターを無細胞タンパク質合成系（例えば、網状赤血球抽出液、小麦胚芽抽出液）に導入してインキュベーションすることにより、また該ベクターを適当な細胞（例えば、大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞）に導入し、得られた形質転換体を培養することにより、本発明の融合ポリペプチドを調製することができる。
　本発明の融合ポリペプチドまたはその断片は、本発明の検出方法等におけるマーカーとして使用することができ、また本発明の融合ポリペプチドに対する抗体の作製等にも使用することができる。
　以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
　実施例１
　＜サンプル＞
　300例の小児白血病（急性リンパ芽球性白血病）の患児より得た白血病細胞から、miRNeasy mini kit（QIAGEN社）を使用して全RNAを抽出した。なお、この研究は、本研究に係る組織の倫理審査員会の承認を得て進められた。
　＜RNAシークエンシング＞
　RNAシークエンシングのためのcDNAライブラリーは、製造者の標準プロトコールに従い、TruSeq RNA sample preparation kit v2 Set B（Illumina社）を使用して作製した。全RNA配列の解析は、次世代シーケンサー（HiSeq1000 Illumina）によりペアエンド法で行なった。
　＜融合転写産物の検出＞
　融合転写産物の検出は、がん細胞における融合遺伝子検出専用のアルゴリズムであるDeFuse （http://sourceforge.net/apps/mediawiki/defuse/index.php?title=DeFuse）を用いて行った。
　＜RT-PCR、サンガーシークエンシング＞
　被験者の白血病細胞から抽出した全RNAから、ReverTra Ace(登録商標) qPCR RT Master Mix（東洋紡社）を使用してcDNAを合成した。得られたcDNAをrTaq DNA Polymerase（東洋紡社）を用いたPCR増幅に供した。目的とするサイズの遺伝子断片の増幅をアガロースゲル電気泳動で確認した。増幅された遺伝子断片をpGEM-T easyベクター（PROMEGA社）にTAクローニングした。このベクター上のマルチクローニングサイトの5’側のT7配列および3’側のSP6配列をプライマーとして用いて、BigDye(R) Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit（Applied Biosystems社）とABI 3130xl Genetic Analyzer（Applied Biosystems社）を用いて塩基配列を決定した。
　本実施例は、白血病細胞における新規融合転写産物の同定について記載する。
　治療標的となりうる新規融合転写産物を同定するため、300例の小児白血病（急性リンパ芽球性白血病）の患児より得た白血病細胞のトランスクリプトーム解析を行った。
　RNAシークエンシングで得られたペアエンドリードを解析した結果、1例において、図１に示すように、染色体転座（t(5;12)）により生じたと考えられる新規融合遺伝子ATF7IP-PDGFRBが同定された。
　さらに、ATF7IP-PDGFRB遺伝子が検出された検体について、下記プライマーを用いてRT-PCRを行い、得られたPCR産物をシークエンス解析することにより、この新規融合遺伝子の発現を確認した（図２および３）。
フォワードプライマー：CAAGTGGACCATCTCAGACCAC（配列番号11）
リバースプライマー：ATTTAAGCATCTTGACGGCCAC（配列番号12）
　ATF7IP-PDGFRB遺伝子は、染色体12p13.1に存在するATF7IP遺伝子と染色体5q33.1に存在するPDGFRB遺伝子との融合遺伝子である。
　以上の結果から、RT-PCRによる特異的なバンドの増幅の有無の検査やPCR産物の塩基配列決定により、実施例１で見出された遺伝子融合を検出することができることが示された。
　またATF7IP-PDGFRB遺伝子陽性例における遺伝子発現パターンは、Ph-like phenotype、すなわち小児白血病の予後不良亜群であるBCR-ABL融合遺伝子陽性白血病（Ph1-ALL）に類似した遺伝子発現様式を示すもののBCR-ABL融合遺伝子が検出されない形質、を示したことから、ATF7IP-PDGFRB遺伝子陽性例は、急性リンパ芽球性白血病の予後不良である特別な亜群であると考えられた。したがって、ATF7IP-PDGFRB遺伝子を検出することにより、これまでに知られていなかったALLの予後不良亜群を特定できる可能性が示された。
　実施例２
　本実施例は、ATF7IP/PDGFRB転座を有する再発性Ph-like急性リンパ芽球性白血病（ALL）の患者に対するチロシンキナーゼ阻害剤（TKI）ダサチニブ単剤療法について記載する。
　症例報告
　2011年2月に、8歳の男児が標準リスクALLを発症した。当該男児は、導入療法および地固め療法を成功裏に完了したが、診断の26カ月後に維持化学療法を受けたにもかかわらず、再発した。蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）およびRT-PCR解析の両方によりATF7IP/PDGFRBを有することが証明され、元のクローンが復活したことが確認された（図４Ａ）。再発の8か月前のRT-PCRの結果は、微小残存病変（minimum residual disease（MRD)）について否定的な結果を示した（Kobayashi K, et al., Br J Haematol, 2014, 165, 836-841)ことから、RT-PCRでの分子モニタリングは早期の再発を予測するためには感度が十分ではないことが認識された。したがって、別のMRDモニタリングアプローチを確立することを決め、ゲノムマッピングを行い、ATF7IP/PDGFRBの転座内の融合配列を探索した。ATF7IPのイントロン13とPDGFRBのエクソン10との間のゲノム上の切断点を特定し、白血病特異的DNAフィンガープリントを標的とするプライマー対を確立した。特に、診断の18か月後に得た寛解サンプルからであっても白血病特異的DNA配列が容易に検出されたことは注目に値する（図４Ａ）。このことは、ゲノムPCRに基づくMRDモニタリングが、非常に低いレベルで検出された場合であっても早期の再発の強力な予測手段となることを示唆している。
　再発性の芽球細胞は、デキサメタゾン、ビンクリスチン、シタラビン、メトトレキサート、およびL-アスパラギナーゼを用いたALL型プロトコールに対して完全な不応性を示した。次いで、エトポシド、シタラビン、およびミトキサントロンを用いた再寛解導入（re-induction）AML型レジメンを行った（Tsukimoto I, et al., J Clin Oncol, 2009, 27, 4007-4013）。3クールの治療の後、細胞遺伝学的寛解が達成されたが、MRDは定量的範囲内で依然として検出された。当該男児は、全身照射（12 Gy）とともに、エトポシド（-4日目に50 mg/kg/日）およびメルファラン（-3日目および-2日目に70 mg/m2/日）を用いた骨髄破壊的な前処置レジメンに続く臍帯血幹細胞移植（CBSCT）を連続的に受けた。その後の臨床経過は、RT-PCR解析に基づけば大きな分子的応答を伴って平穏無事であったが、融合特異的白血病DNA配列は、最初の診断の34か月後においてもまだゲノムPCRで検出された。再発を予測するためのMRDのカットオフ値はほとんど知られていない；しかしながら、以前の臨床分析において証明されているように、分子的寛解サンプルにさえ白血病DNAが存在したことから、当該患者は再発を起こす高いリスクを有することが示唆された。したがって、MRDを根絶するために、第二世代TKIであるダサチニブの投与（66 mg/m2/日）を開始することを決めた。治療反応は迅速であり、白血病特異的ゲノムPCR解析に基づけばMRDは3か月以内に消失した（図４Ａ）。当該男児は少なくとも12か月間、分子的完全寛解を維持した。
　Ph-like ALLに対するTKI単剤療法の臨床成績を確認するためには、耐久性の感度と特異性とを備えた縦断疾患モニタリングを行う必要がある。実際、疾病特徴的融合転写産物、すなわちBCR/ABL、のRT-PCR解析は、TKIの治療モニタリングのために一般に使用されているが（Hughes T, et al., Blood, 2006, 108, 28-37）、RT-PCR陰性であることは、CMLにおける臨床成績と直接的には相関しないことも示されている（Chu S, et al, Blood, 2011, 118, 5565-5572）。血液悪性腫瘍に対する個別化治療の開発のためには、MRDの詳細な解析が、診断のためだけでなくTKI療法の正当化のためにも重要である。この点について、融合部のDNA配列を標的とするゲノムPCRは成人のCML患者において従来のRT-PCRよりも感度が高いことを示唆する証拠が最近増加していることに留意することは特に重要であるが（Mattarucchi E, et al., J Mol Diagn, 2009, 11, 482-487; Bartley PA, et al., Int J Lab Hematol, 2010, 32, e222-228）、BCP-ALLにおけるその臨床的意義はほとんど知られていない。そこで、様々な時点で当該患者から得た17サンプルを用いて、RT-PCRとゲノムPCRとの間のMRD検出感度の一対比較を行った（図４Ｂ）。MRDレベルがPCRアッセイの定量的範囲で検出可能であった11サンプルにおいて、2つの方法の間で結果に明確な相関がみられた。一方、4サンプルにおいては結果の不一致が見られた；すなわち、RT-PCRの結果が陰性の分子的寛解サンプルからであっても白血病DNAが検出された。対照的に、MRDがRT-PCRでは陽性であるがゲノムPCRでは陰性のサンプルは見つからなかった。したがって、RT-PCRとゲノムPCR解析との間の結果の不一致のほとんどは、サンプルのバリエーションよりもむしろ検出感度の違いに起因する可能性が考えられる。さらに、転写サイレンシング（特に静止細胞状態に伴うもの）や、mRNA分解が関与する可能性などの理由から、RT-PCRで調べた融合転写産物レベルの方が残存白血病細胞数との関連性が低い、と推測することが可能である（Shibata Y, et al., Genome medicine, 2010, 2, 70-）。対照的に、各白血病細胞は一コピーの融合DNA配列を含有することから、ゲノムPCRは、白血病細胞数の測定値と直接的に関連する。DNAは、RNAよりも安定であり、また逆転写工程を必要としないため、DNAに基づくMRD解析は、本件において示されたように、遡及的な調査も促進しうる。さらに、Paganiらは、長期TKI治療において、RT-PCRで陰性のCML患者の30%以上で融合特異的DNAが検出されうることを報告している（Pagani IS, et al., Oncoscience, 2014, 1, 510-521）。その報告では、BCR/ABLゲノム切断点を標的とするゲノムPCRは、TKI療法において、CML患者の長期モニタリングのための従来の技術と併用されうることが強調されている。したがって、本実施例を含むこれらの知見を総合すると、融合配列を標的とするゲノムPCRは、TKI療法を受けているPh-like ALL患者におけるMRDモニタリングのための、信頼性の高い技術の一つとして利用されうることを示唆している。
　考察
　TKIの登場は、CML患者についてのみならず、Ph-like ALLなどの他の稀な種類の小児血液悪性腫瘍の患者についても、顕著な治療効果を上げている（Roberts KG, et al., N Engl J Med, 2014, 371, 1005-1015; Weston BW, et al., J Clin Oncol, 2013, 31, e413-416; Lengline E, et al., Haematologica, 2013, 98, e146-148）。さらに、PDGFRB融合遺伝子を有する骨髄悪性腫瘍の患者が、TKIであるメシル酸イマチニブに応答して優れた治療成績を示し、二次耐性を生じることなく10年全生存率が90%であったことは、特に注目に値する（Cheah CY, et al., Blood, 2014, 123, 3574-3577）。したがって、PDGFRB融合遺伝子などの分子標的に焦点を合わせるコンパニオン診断は、小児のための将来の個別化がん治療を促進しうると考えられる。
　実施例３
　本実施例は、ATF7IP-PDGFRB融合キナーゼが細胞の形質転換を誘導することについて記載する。
　材料と方法
　試薬
　TKIであるイマチニブ、ダサチニブ、ニロチニブ（LC Laboratories、Woburn、MA、USA）、ポナチニブ、レバスチニブ（Rebastinib）、およびバフェチニブ（Bafetinib）（Selleck、Houston、TX、USA）を使用した。マイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼ（MEK）阻害剤PD98059およびホスファチジルイノシトール3-キナーゼ（PI3キナーゼ）阻害剤LY294002は、Merck Millipore（Darmstadt、Germany）から購入した。
　プラスミド構築
　野生型（WT-）PDGFRBのcDNAは、Promega Corporation（Madison、WI、USA）からFlexi（登録商標）ORFクローンpF1KB7023（かずさクローンcp01083）として購入した。Sfg IおよびPme Iを用いて消化した後、T4 DNAポリメラーゼを用いて平滑末端化することにより、コード領域を単離した。rTaqポリメラーゼ（Toyobo Co.、Ltd.、大阪、日本）により3'末端に突出dATPを付加した後、WT-PDGFRB cDNAを、pGEM-T easyまたはpGEM-T（Promega）のいずれかに、逆方向（SP6サイトからT7サイト）でサブクローニングした。
　研究のための臨床材料の使用は、組織の倫理審査委員会によって承認され、インフォームドコンセントを親または保護者から得た。ATF7IP-PDGFRBキメラ遺伝子に含まれるATF7IP cDNAの5'部分を、融合遺伝子を保持する患者の臨床試料から、以下のプライマーを使用して3つの部分ATF7IP-1、-2、および-3に分けて、KOD plus ver.2（Toyobo）を使用するPCRにより増幅した：
ATF7IP-1フォワード（Fwd） 5’-TTCAGAATGGACAGTTTAGAAGAACCTCAG-3’（配列番号13）、
ATF7IP-1リバース（Rev） 5’-TCTGCTGGAGAGCACGTTTC-3’（配列番号14）、
ATF7IP-2 Fwd 5’-AAGCTTGCACCTTCTGAGGATGA-3’（配列番号15）、
ATF7IP-2 Rev 5’-ATCGGATCTCGTAACGTGGC-3’（配列番号16）、
ATF7IP-PDGFRB-3 Fwd 5’-TGGTCCTCTCTGATGAAGAGGATATTTC-3’（配列番号17）、および
ATF7IP-PDGFRB-3 Rev 5’-TCATCGTGGCCTGAGAATGG-3’（配列番号18）。
　上記のように、3'末端に突出dATPを付加した各PCR産物を、以前に報告されているように（Tomita et al., 2014, Leukemia Research, 38, 361-370）、pGEM-T easy（Promega）にフォワード方向（T7サイトからSP6サイト）でサブクローニングした。全長ORFのATF7IP-PDGFRB cDNAを得るために、それぞれNot I/Pmi I、Not I/Afi I、およびNot I/Cla Iの組み合わせを用いて消化したATF7IP-3、-2、および-1のcDNA断片を、連続的にライゲーションすることによりpGEM-T-WT-PDGFRBにサブクローニングした。
　同様に、EBF1 cDNAの5'部分を、プライマーEBF1-PDGFRB Fwd 5’-ATGTTTGGGATTCAGGAAAGCATCC-3’（配列番号19）およびEBF1-PDGFRB Rev 5’-ATGCGGTAACCCCGTTTGAT-3’（配列番号20）を使用して増幅し、pGEM-T easyにサブクローニングした。全長ORFのEBF1-PDGFRB cDNAは、EBF1 cDNAのSph I（平滑化）およびBam HI断片とpGEM-T-WT-PDGFRBのNdeI（平滑化）およびBam HI断片とのライゲーションにより得た。
　レトロウイルス発現ベクターを得るために、キメラ遺伝子の各cDNAの全長インサートを、Sph I（平滑化）およびNot Iを用いて消化し、pRetroX Tight（Clontech Laboratories、Inc.、Madison、WI、USA）のNru IおよびNot I部位にサブクローニングした。WT-PDGFRBの場合、cDNAの全長インサートをEco RI消化により単離し、pRetroX TightのEco RI部位にサブクローニングした。
　ATF7IP-PDGFRB、EBF1-PDGFRB、およびWT-PDGFRB遺伝子の発現は、以前に報告されているように（Iijima et al., 2012, Eur J Immunol, 42, 3405-3415）、rTaqポリメラーゼ（Toyobo）を使用するPCRにより、各遺伝子でトランスフェクトしたBa/F3細胞から調製したcDNAから増幅させた。以下のプライマーを使用した：
ATF7IP-PDGFRB detection Fwd-1 5’-CGTGAATGTAACACATCGTCCA-3’（配列番号21）、
ATF7IP-PDGFRB detection Rev-1 5’-AGCTCCCACGTGGAGTCATAG-3’（配列番号22）、
EBF1-PDGFRBdetection Fwd-1 5’-GGGCGTGAATTCGTTCAGTG-3’（配列番号23）、
EBF1-PDGFRB detection Rev-1 5’-ATCGGATCTCGTAACGTGGC-3’（配列番号24）、
WT-PDGFRB detection Fwd-1 5’-TCCAGCACCTTCGTTCTGAC-3’（配列番号25）、および
WT-PDGFRB detection Rev-1 5’-CCAGAAAAGCCACGTTGGTG-3’（配列番号26）。
　内部標準として、マウスβ-アクチン（Agilent Technologies、Santa Clara、CA、USA）の検出用プライマーセットも使用した。
　細胞、細胞培養、およびトランスフェクション
　Ba/F3細胞およびWEHI-3細胞（理研バイオリソースセンター、つくば、茨城、日本）は、以前に報告されているように（Tomita et al., 2014, Leukemia Research, 38, 361-370）維持した。Ba/F3細胞の場合、以前に報告されているように（Tomita et al., 2014, Leukemia Research, 38, 361-370）、IL-3を有するWEHI-3細胞株からの10%（vol/vol）馴化培地を維持のために添加した。
　キメラ遺伝子を誘導可能な細胞株は、基本的には以前に報告されているように（Iijima et al., 2012, Eur J Immunol, 42, 3405-3415）、Retro-XTM Tet-On（登録商標）Advanced Inducible Expression SystemおよびRetro-XTMUniversal Packaging System（Clontech）を使用するレトロウイルストランスフェクションを利用することにより作り出した。このシステムでは、ネオマイシン耐性遺伝子を保持するTet-on Advancedベクターおよびピューロマイシン耐性遺伝子を保持するpRetroX Tight発現ベクターを使用した。Tet-on Advancedベクターが導入された6 x105個のBa/F3細胞を、合計3 mLの培地中で、ATF7IP-PDGFRBまたはEBF1-PDGFRBのいずれかを含むpRetroX Tightのレトロウイルスにさらに感染させ、10時間曝露した。次いで、細胞を洗浄し、二つに分け、薬剤選択のためのネオマイシンおよびピューロマイシンと共に1 μg/mLのドキシサイクリン（DOX）を用いるかまたは用いないで処理し、目的のタンパク質の発現を誘導した。24時間のインキュベーションの後、細胞を再び洗浄し、WEHI-3馴化培地を除いた。各処理を行った細胞の半分を、細胞増殖アッセイのために三連でプレーティングし、残りの半分を、順次、薬物選択に供した。次いで、限界希釈を3回繰り返すことにより、安定な耐性細胞をクローン化し、以下の実験に使用した。IL-3非依存的に増殖することができないことからWEHI-3馴化培地を常に存在させたこと以外は同様にして、WT-PDGFRBまたはモック（Mock）としての空ベクターを有するトランスフェクタントを作製した。
　細胞増殖アッセイ
　キメラ遺伝子-トランスフェクタントおよびMock Ba/F3細胞をRPMI-1640培地で2回洗浄し、各種試薬を含むかまたは含まない96ウェルプレート（1ウェル当り2.5 x 104個の細胞/0.1 mL）に各三連で分注し、図に示した期間、37℃にて培養した。細胞増殖は、以前に報告されているように（Yamada et al., 2013, Int J Hematol, 97, 73-82）、水溶性テトラゾリウム塩（WST）アッセイ（Cell Counting Kit-8、Dojindo、熊本、日本）を使用して解析した。データ解析にはF検定を使用した。0.05未満のP値を有意とした。全ての実験を少なくとも3回行い、平均およびSEMを算出した。
　フローサイトメトリー解析および免疫細胞化学
　アポトーシス細胞の出現率は、MEBCYTO（登録商標）Apoptosis Kit（Medical and Biological Laboratories、名古屋、日本）を使用して定量し、次いで、以前に報告されているように（Tomita et al., 2014, Leukemia Research, 38, 361-370）、製造者のプロトコールに従って解析した。
　免疫細胞化学については、細胞を、PerFix-nc Kit（Beckman Coulter, Inc.、Indianapolis IN、USA）を用いて製造者のプロトコールに従って処理し、ウサギモノクローナル抗PDGFRB抗体（Ab）（Cell Signaling Technology, Inc.、Danvers、MA、USA）およびAlexa Fluor（登録商標）546ヤギ抗ウサギIgG（Life Technologies、Waltham、MA、USA）の組み合わせを用いて染色した。細胞をスライドガラス上に載せ、Fluoroshield Mounting Medium with DAPI（Immunobioscience Corp.、Mukilteo、WA、USA）を使用して4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）対比染色を行い、DeltaVision Elite（GE Healthcare Life Sciences、Buckinghamshire、UK）により可視化した。
　免疫ブロッティングおよび免疫沈降
　免疫ブロット解析は、以前に報告されているように（Kiyokawa et al., 1997, J Biol Chem, 272, 18656-18665; Tomita et al., 2014, Leukemia Research, 38, 361-370）、以下の抗体を使用して行った：抗ホスホチロシン（4G10; Merck Millipore）、抗PDGF受容体β（28E1）、抗ホスホ-PDGF受容体β Tyr751（C63G6）、抗ホスホ-PDGF受容体β Tyr 771（76D6）、抗ホスホ-PDGF受容体β Tyr1009（42F9）、抗ホスホ-PDGF受容体β Tyr1021（6F10）、抗ホスホ-p44/42 MAPK（ERK1/2、Tyr202/Tyr204）、抗ホスホ-p38 MAPK（Thr180/Tyr182）、抗ホスホ-JNK（Thr183/Tyr185、81E11）、抗ホスホ-AKT（Ser473）、抗ホスホ-PLCγ1(Tyr783）、抗Casitas B-lineage lymphoma binding（Cbl）、抗p38 MAPK抗体、および抗JNK抗体（Cell Signaling Technology）；抗ATF7IP（MCAF1）（Abcam、Cambridge、UK）；抗ERK、抗PLCγ(BD Biosciences、San Jose、CA、USA）；抗βアクチン（Sigma-Aldrich、St. Louis、MO）；西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）結合二次抗体（Dako、Glostrup、Denmark）。以前に報告されているように（Kiyokawa et al., 1997, J Biol Chem, 272, 18656-18665）、各細胞ライセートの50-μgサンプルを、SDSポリアクリルアミドゲル上で電気泳動により分離し、ニトロセルロースメンブレン（Amersham Hybond-ECL; GE Healthcare）へと転写した。一次および二次抗体の適切な組み合わせを用いてメンブレンをインキュベートし、洗浄し、そしてenhanced chemiluminescence reagent system（ECL）およびWestern Blotting Detection Reagents（GE）を用いて検出した（Kiyokawa et al., 1997, J Biol Chem, 272, 18656-18665）。
　PDGFRBおよびキメラタンパク質は、以前に報告されているように（Kiyokawa et al., 1997, J Biol Chem, 272, 18656-18665）、各Ba/F3トランスフェクタントから調製した1 mgの細胞ライセートから、適切な抗体およびプロテインG-アガロース（F. Hoffmann-La Roche Ltd.、Basel、Schweiz）の組み合わせを使用して免疫沈降させた。免疫沈降物をSDSポリアクリルアミドゲル上で分離し、次いで、図に示した適切な組み合わせを使用して、上記のように免疫ブロット解析を行った。
　結果
　PDGFRB関連キメラ分子の導入はBa/F3細胞のIL-3非依存的増殖を誘導するがWT-PDGFRB分子の導入はそれを誘導しない
　まず、テトラサイクリン誘導性遺伝子発現システムを利用して、キメラ分子の発現がBa/F3細胞においてIL-3非依存的増殖を引き起こすか否かを調べた。ATF7IP-PDGFRB-発現ベクターを用いたトランスフェクションの後、Ba/F3細胞をDOX有りまたは無しで処理し、次いでIL-3を含有するWEHI-3馴化培地を除いた。図５Ａに示すように、DOXで処理したBa/F3トランスフェクタントの一部は、馴化培地の非存在下で生存し増殖した一方、DOXで処理しなかったBa/F3トランスフェクタントは馴化培地無しで生存することはできなかった；したがって、ATF7IP-PDGFRB-トランスフェクタントを速やかに選択することができた。対照的に、モックトランスフェクトしたBa/F3細胞は、DOX処理とは無関係に、馴化培地無しでは生存できなかった。同様に、EBF1-PDGFRBをトランスフェクトしたBa/F3細胞も、DOX処理後にIL-3非依存的増殖を示したのに対して、WT-PDGFRBではDOX処理後のIL-3非依存的増殖はみられなかった（データは示さない）。トランスフェクタントをクローン化した後、ATF7IP-PDGFRBおよびEBF1-PDGFRBトランスフェクタントがIL-3を含有する馴化培地の非存在下で細胞増殖を示すのに対して、モックトランスフェクトしたBa/F3細胞は馴化培地の存在下でのみ増殖することができることをさらに確認した（図５Ｂ）。PDGFRB関連キメラのトランスフェクタントの増殖速度は、馴化培地の存在下で増殖している親のBa/F3細胞と同等であった（データは示さない）。WT-PDGFRBの場合、トランスフェクタントは、リガンドであるPDGFBBが存在していても、馴化培地無しでは生存できなかった（図５Ｂ）。興味深いことに、PDGFBBの添加は、WSTおよびアネキシンVアッセイで評価した場合、馴化培地の非存在下におけるWT-PDGFRBトランスフェクタントの生存を部分的に延長することができた（図５ＣおよびＤ）。
　次いで、上記効果が導入したPDGFRB関連キメラ分子によって実際に媒介されていることを確認した。図６ＡおよびＢに示すように、各トランスフェクタントにおいて、適切なmRNAおよびタンパク質発現を、それぞれRT-PCRおよび免疫ブロット解析により観察した。図６Ｃに示すように、免疫細胞化学は、ATF7IP-PDGFRBキメラタンパク質の細胞質局在を明らかにした。
　Ba/F3細胞においてPDGFRB関連キメラ分子によって媒介される細胞内シグナル伝達
　次に、PDGFRB関連キメラ分子の発現に起因するIL-3非依存的細胞増殖の分子基盤を評価した。PDGFRBは受容体チロシンキナーゼであることから、細胞タンパク質およびPDGFRB関連キメラ分子自体のチロシンリン酸化状態を調べた。図７Ａに示すように、細胞内タンパク質は、モック細胞と比較して、ATF7IP-PDGFRBまたはEBF1-PDGFRBを発現するBa/F3細胞においてチロシンリン酸化されていた。WT-PDGFRBの場合、PDGFBBによる刺激は、WT-PDGFRBタンパク質のチロシンリン酸化を誘導する。PDGFRB上に位置する特定の残基のチロシンリン酸化も調べた。図７Ｂに示すように、ATF7IP-PDGFRBおよびEBF1-PDGFRBの両方のTyr751、Tyr771、Tyr1009、およびTyr1021残基がリン酸化されていた。また、WT-PDGFRB上の同じチロシン残基は、PDGFBB刺激の後にリン酸化された（図７Ｂ）。
　次に、PDGFRBの下流に位置する分子のリン酸化を調べた。リン酸化されると、PDGFRB上のTyr751残基は、PI3キナーゼおよびNckβの結合および活性化を可能にする（Kazlauskas et al., 1992, Mol Cell Biol, 12, 2534-2544; Panayotou et al., 1992, EMBO J, 11, 4261-4272; Nishimura et al., 1993, Mol Cell Biol, 13, 6889-6896）。PDGFRB上のTyr751リン酸化と一致して、PI3キナーゼの下流の分子であるAKTのSer473、ならびにNckβの下流の分子であるc-Jun N末端キナーゼ（JNK）およびp38 MAPKのそれぞれThr183/Tyr185およびThr180/Tyr182は、免疫ブロット解析により評価した場合、モック細胞と比較して、ATF7IP-PDGFRBまたはEBF1-PDGFRBを導入したBa/F3細胞においてリン酸化されていた（図８）。WT-PDGFRBを導入したBa/F3細胞においては、AKTの同じセリン残基は、PDGFBBで刺激した後にリン酸化された（図８）。同様に、PDGFRB上のTyr771残基のリン酸化は、RasGapの結合および活性化を可能にする（Kashishian et al., 1992, EMBO J, 11, 1373-1382; Kazlauskas et al., 1992, Mol Cell Biol, 12, 2534-2544）。PDGFRB上のTyr771残基のリン酸化と一致して、Rasシグナル伝達経路の下流の分子であるp44/42 MAPキナーゼ（Erk1/2）のSer217/Ser221残基のリン酸化レベルは、PDGFBB刺激を受けたWT-PDGFRBと同様に、2つのタイプのPDGFRB関連キメラキナーゼのいずれを有するBa/F3細胞においても、リン酸化レベルの増加がみられた（図８）。PLC-γを活性化させるPDGFRB上のTyr1009および1021リン酸化（Reddi et al、2007）と一致して、PLC-γ上のTyr783残基は、PDGFRB関連キメラを有するBa/F3トランスフェクタントにおいてリン酸化された。興味深いことに、WT-PDGFRBを発現している細胞におけるPLC-γ上の同じ残基のリン酸化は、PDGFBBで刺激した後であっても、顕著ではなかった（図８）。
　Ba/F3細胞におけるc-CBLのリン酸化およびc-CBLのPDGFRBへの結合
　図６Ｂに示すように、WT-PDGFRBの免疫ブロット解析は、PDGFBB刺激とは無関係に、WT-PDGFRBタンパク質の予想サイズ以外の、より低分子量のいくつかの予期せぬバンドを明らかにした一方、ATF7IP-またはEBF1-PDGFRBのいずれかについての同じ実験は、各キメラキナーゼについて特有のバンドを示した。PDGFRBを含む成長因子受容体は、リガンド結合媒介ポリユビキチン化を受け、マイトジェンシグナル伝達において負の調節的役割を果たしていると考えられることが報告されている（Mori et al., 1993, J Biol Chem, 268, 577-583; Waterman et al., 1999, J Biol Chem, 274, 22151-22154）ことから、上記観察結果は、Ba/F3細胞におけるWT-PDGFRBのポリユビキチン化を示している。また、c-Cblは、PDGFRBのユビキチン化に責任がある（Miyake et al., 1999, J Biol Chem, 274, 16619-16628）一方、骨髄増殖性腫瘍（MPN）において検出されるPDGFRB関連融合タンパク質であるETV6-PDGFRBは、c-Cbl誘導性ユビキチン化および分解から免れ得る（Toffalini F et al., 2009, Haematologica, 94, 1085-1093）ことが報告されている。したがって、キメラPDGFRBタンパク質とc-Cblとの間の関連を調べた。図９に示すように、免疫沈降および免疫ブロット解析は、ATF7IP-およびEBF1-PDGFRBの両方、ならびにPDGFBBで刺激したWT-PDGFRBにおいて、c-Cblのチロシン残基がリン酸化されることを明らかにした。一方、PDGFBB刺激後のWT-PDGFRBへのc-Cblタンパク質の顕著な結合がみられたのに対して、ATF7IP-およびEBF1-PDGFRBは、c-Cblタンパク質の限定的な結合のみを示した（図９）。このデータは、リガンド刺激を受けると、WT-PDGFRBはc-Cblを活性化し、次いでポリユビキチン化を受けるのに対して、ATF7IP-およびEBF1-PDGFRBはc-Cblによって構成的にリン酸化されているがc-Cblと結合しないことを示している。
　ATF7IP-PDGFRBによって媒介されるBa/F3細胞IL-3非依存的増殖におけるMAPキナーゼおよびAKTの役割
　ATF7IP-PDGFRBはMAPキナーゼおよびAKTをリン酸化することが示されていることから、ATF7IP-PDGFRBを発現しているBa/F3細胞のIL-3非依存的増殖に対するMEKおよびPI3キナーゼの阻害剤の効果を調べた。図１０Ａに示すように、AKT阻害剤LY294002は、ATF7IP-PDGFRBを発現しているBa/F3細胞およびモック発現Ba/F3細胞の両方において細胞死を誘導した。興味深いことに、MEK阻害剤PD98059は、ATF7IP-PDGFRBを発現しているBa/F3細胞においてのみ細胞死を誘導し、モック発現Ba/F3細胞においては誘導しなかった。IL3を含む馴化培地を同時に添加することによって、ATF7IP-PDGFRBを発現しているBa/F3細胞におけるMEK阻害剤誘導性細胞死が部分的に回避されることをさらに確認した（図１０Ｂ）。また、免疫ブロッティングによって評価した場合、MEK阻害剤PD98059による処理が、MAPキナーゼのリン酸化を顕著に減少させることをさらに確認した（図１１）。同様に、PI3キナーゼ阻害剤LY294002による処理は、AKTのリン酸化を明らかに減少させた（図１１）。
　WT-PDGFRBによって媒介されるMAPキナーゼおよびAKTのリン酸化のキネティクスも調べた。図１２に示すように、IL-3を枯渇させたWT-PDGFRBを発現しているBa/F3細胞のPDGFBBによる刺激は、MAPキナーゼおよびAKTの両方の一過性だが顕著なリン酸化を誘導したが、PDGFBBを持続的に存在させたにもかかわらず、当該リン酸化は時間依存的様式で減少した。IL-3を含有する馴化培地の存在下では、馴化培地自体がMAPキナーゼおよびAKTのリン酸化を誘導し、したがって両タンパク質のリン酸化は、PDGFBB刺激後、ある程度延長された（図１２）。
　PDGFRB関連キメラ分子を発現しているBa/F3細胞の生存に対するTKIの効果
　次に、ATF7IP-PDGFRBを発現しているBa/F3細胞のIL-3非依存的増殖に対するTKIの効果を調べた。ATF7IP-PDGFRBを発現しているBa/F3細胞をイマチニブまたはダサチニブに曝露した場合、細胞増殖は、濃度依存的様式で顕著に阻害され、生存可能な細胞数は、25 nMの濃度のイマチニブまたは2.5 nMの濃度のダサチニブとの48時間のインキュベーションの後に、10%未満に減少した（図１３）。24時間のインキュベーションにおいて、ATF7IP-PDGFRBを発現しているBa/F3細胞に対するイマチニブのIC50の計算値は45.6 nMであり、BCR-ABLを発現しているBa/F3細胞について以前の文献（Tomita et al., 2014, Leukemia Research, 38, 361-370において推定された600 nMよりも大幅に低かった。また、ニロチニブ、バフェチニブ（Bafetinib）、レバスチニブ（Rebastinib）、およびポナチニブを含む他の次世代TKIの効果も調べた。図１３に示すように、各TKIは、ATF7IP -PDGFRBを発現しているBa/F3細胞の生存可能な細胞数を効率よく減少させた。同様に、EBF1-PDGFRBを発現しているBa/F3細胞も、TKIに対して顕著な感受性を示した（図１３）。さらに、免疫ブロット解析によって評価した場合、TKIで処理した後のATF7IP-またはEBF1-PDGFRBを発現しているBa/F3細胞において、MAPキナーゼおよびAKT、ならびにPDGFRBのリン酸化が実際に減少していることを確認した（図１４）。
　考察
　本実施例において、ATF7IP-PDGFRBの発現が、Ba/F3細胞におけるIL-3非依存的増殖を誘導することを明らかにしたが、このことは、MPNにおいて検出されたEBF1-PDGFRBおよび他のPDGFRB関連融合キナーゼ（Carroll M et al., 1996, Proc Natl Acad Sci U S A, 93, 14845-14850; Wilbanks AM et al., 2000, Experimental Hematology, 28, 584-593; Toffalini F et al., 2010, J Biol Chem, 285, 12268-12278; Roberts KG et al., 2012, Cancer Cell, 22, 153-166）の場合と同様に、ATF7IP-PDGFRBの形質転換能を示している。本実施例のデータは、ATF7IP-PDGFRBがチロシン残基において構成的にリン酸化されており、AKT、PLC-γ、MAPキナーゼ、p38 MAPキナーゼ、およびJNKを含む下流の分子を活性化することを示している。さらに、AKTおよびMAPキナーゼの活性化が、Ba/F3細胞のIL-3非依存的生存に必須であることを明らかにした。一方、本実施例のデータは、Ba/F3細胞に導入されたWT-PDGFRBが、IL-3非依存的生存に十分ではない一方で、PDGFBBによる刺激は、IL-3を除くことにより誘導されるアポトーシスによる細胞死からBa/F3細胞を部分的に解放することも明らかにした。
　ATF7IP-PDGFRBの構成的活性化のメカニズムとしては、c-Cbl媒介ユビキチン化の調節解除（Toffalini F et al., 2009, Haematologica, 94, 1085-1093）が関与していることが考えられる。リガンドとの結合により活性化されるPDGFRBおよび他の受容体チロシンキナーゼが、c-Cblを速やかにリン酸化して活性化し、受容体チロシンキナーゼのc-Cbl媒介ポリユビキチン化をもたらし、これが活性化された成長因子受容体の自己下方調節のための必須のプロセスであることが十分に立証されている（Miyake S et al., 1999, J Biol Chem, 274, 16619-16628; Yokouchi M et al., 1999, J Biol Chem, 274, 31707-31712）。以前の報告と一致して、Ba/F3 トランスフェクタントにおいて、WT-PDGFRBの顕著な断片化がみられたが、ATF7IP-PDGFRBまたはEBF1-PDGFRBの断片化はみられなかった。また、Ba/F3トランスフェクタントにおいて、PDGFBBによる刺激の後、WT-PDGFRBへのc-Cblの結合の増加がみられた一方、ATF7IP-PDGFRBまたはEBF1-PDGFRBへのc-Cblの顕著な結合はみられなかった。このデータは、リガンドによるWT-PDGFRBの活性化は、c-Cbl媒介ユビキチン化を誘導することにより自己限定され、したがってIL-3非依存的細胞生存を完全には支持することができないことを示唆している。一方、構成的に活性化されたATF7IP-およびEBF1-PDGFRBは、c-Cblタンパク質をリン酸化するが、c-Cblと結合せず、したがってユビキチン化から免れうる（Toffalini F et al., 2009, Haematologica, 94, 1085-1093）。ATF7IP-およびEBF1-PDGFRBによって媒介される下流の分子の持続的な活性化は、Ba/F3細胞のIL-3非依存的生存のために重要である可能性がある。
　ATF7IP-PDGFRBにおいて生じたc-Cbl媒介ユビキチン化の調節解除のメカニズムについて、いくつかの説明が考えられる。例えば、Toffaliniおよび共同研究者は、融合タンパク質TEL-PDGFRBおよびFIP1L1-PDGFRAが野生型受容体のように形質膜に挿入されずに細胞質に存在することから、それらのユビキチン化の欠如がそれらの局在の変化に関連していることを報告している（Toffalini F et al., 2009, Haematologica, 94, 1085-1093）。一方、本実施例においては、ATF7IP-またはEBF1-PDGFRBを導入したBa/F3細胞においてPLC-γの顕著なリン酸化が見られたが、WT-PDGFRBを導入した細胞では、PDGFBBにより刺激してもリン酸化は見られなかった。c-CblおよびPLC-γは、ドッキング部位としてのTyr1021残基について競合しており、相互排他的にPDGFRBによって活性化されることが報告されている（Reddi AL et al., 2007, J Biol Chem, 282, 29336-29347）ことから、ATF7IP-PDGFRBは、PLC-γを優先的に活性化し、したがって相互排他的効果によりc-Cblとの結合を免れ、c-Cbl媒介ユビキチン化を回避している可能性がある。
　本実施例において示したように、PI3キナーゼ阻害剤は、ATF7IP-PDGFRBを導入した細胞およびIL-3を含有するWEHI-3馴化培地により維持したモック細胞の両方において細胞死をもたらし、このことは、両方の場合において、AKTによって媒介されるシグナルが細胞生存に必須であることを示している。対照的に、MEK阻害剤は、ATF7IP-PDGFRBを導入した細胞においては細胞死をもたらすが、モック細胞においては細胞死をもたらさず、このことは、ATF7IP-PDGFRBによって誘導される細胞生存シグナルと成長因子によるものとの違いを示しており、またATF7IP-PDGFRB媒介細胞形質転換においてはMAPキナーゼ媒介シグナルがより重要であることを示唆している。一つの可能な説明は、IL-3受容体がMAPキナーゼカスケード以外の細胞生存のための代替経路を同時に活性化することができるが、PDGFRBはできない、というものである。あるいは、PDGFRBは、MAPキナーゼのみならず、アポトーシスシグナルを媒介するp38 MAPキナーゼおよびJNKの両方をも誘導することから、MAPキナーゼ媒介抗アポトーシスシグナルは、成長因子非依存的細胞増殖においてp38 MAPキナーゼおよびJNKによって媒介されるアポトーシスシグナルを克服するために必須である可能性がある一方で、IL-3受容体は、p38 MAPキナーゼおよびJNKによって媒介される上記アポトーシスシグナルを調節する別の経路を活性化する可能性がある。なぜ成長因子受容体が、MAPキナーゼによって媒介される生存シグナルとp38 MAPキナーゼおよびJNKによって媒介されるアポトーシスシグナルの両方を同時に活性化するのかは明らかになっていないが（Yu J et al., 2000, J Biol Chem, 275, 19076-19082）、成長因子受容体活性化の別の自己調節メカニズムである可能性がある。
　重要なことに、本実施例のデータは、ATF7IP-PDGFRBを発現しているBa/F3細胞が、イマチニブ、ダサチニブ、および他の新世代TKIを含むTKIに対して高い感受性を示すことも実証している。イマチニブのIC50の推定値は、BCR-ABL1のそれよりも大幅に低い。この結果は、PDGFRBが再編成されている白血病の患者に対するイマチニブの有効性を報告した他者の臨床的知見と一致している（Weston BW et al., 2013, J Clin Oncol, 31, e413-416; Lengline E et al., 2013, Haematologica, 98, e146-48; Cheah CY et al., 2014, Blood, 123, 3574-3577）。TKIは、PDGFRBのキナーゼ活性を効果的に阻害し、細胞生存に必要なAKTおよびMAPキナーゼの活性化を低下させることができる。再編成されたPDGFRBキナーゼのTKIに対する高い感受性は、PDGFRBが再編成されているALLの患者においてTKIを使用することを治療上考慮する上で重要である。
　上述の通り、ATF7IP-PDGFRBおよびEBF1-PDGFRBはこれまでにALL患者においてのみ見つかっているが、他のPDGFRB融合遺伝子は骨髄性腫瘍においてのみ見つかっており、このことは、正確なメカニズムはいまだ明らかではないが、PDGFRBのキメラパートナーと発生中の腫瘍の系統との間の選択性を示唆している。興味深いことに、Tomassonおよび共同研究者は、マウスBMTモデルにおいて、骨髄全体へのTEL-PDGFRBの導入が速やかに死に至る骨髄増殖性疾患を引き起こした一方、当該融合遺伝子のチロシン残基579/581のフェニルアラニン変異はT細胞リンパ腫を発症させたことを報告した（Tomasson MH et al., 2000, J Clin Invest, 105, 423-432）。キメラパートナーの違いは、発生中の腫瘍の分化系列決定に影響するPDGFRBキナーゼドメインのコンホメーションの違いを生じさせ得る。ALL発生へのATF7IP-PDGFRB選択性のメカニズムの解明が待たれる。
　結論として、ATF7IP-PDGFRBは形質転換能を有し、BCR-ABL1と比較してTKIに対する顕著な感受性を示す。本実施例の結果は、臨床所見と一致しており、PDGFRB関連キメラキナーゼを有するBCP-ALLのサブセットに対するTKIの治療上の有用性を示している。また、キメラPDGFRBキナーゼ媒介細胞形質転換の分子基盤のさらなる解明は、PDGFRB転座によって引き起こされる血液悪性腫瘍に対する新たな治療上の戦略を提供するはずである。
　本発明によれば、がんの責任変異として新たに見出した遺伝子融合を検出すること、当該遺伝子融合により生じる融合ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの発現および／または活性を抑制する物質が治療効果をもたらすがんの患者またはがんのリスクを有する被験者を同定すること、さらにはそのようながんの患者に適した治療（個別化医療）を行うことが可能となる。
配列番号１および3：ATF7IP-PDGFRB融合ポリヌクレオチド
配列番号2および4：ATF7IP-PDGFRB融合ポリペプチド
配列番号5および7：ATF7IP cDNA
配列番号6および8：ATF7IPポリペプチド
配列番号9：PDGFRB cDNA
配列番号10：PDGFRBポリペプチド
配列番号11：フォワードプライマー
配列番号12：リバースプライマー
配列番号13：ATF7IP-1 Fwd
配列番号14：ATF7IP-1 Rev
配列番号15：ATF7IP-2 Fwd
配列番号16：ATF7IP-2 Rev
配列番号17：ATF7IP-PDGFRB-3 Fwd
配列番号18：ATF7IP-PDGFRB-3 Rev
配列番号19：EBF1-PDGFRB Fwd
配列番号20：EBF1-PDGFRB Rev
配列番号21：ATF7IP-PDGFRB detection Fwd-1
配列番号22：ATF7IP-PDGFRB detection Rev-1
配列番号23：EBF1-PDGFRBdetection Fwd-1
配列番号24：EBF1-PDGFRB detection Rev-1
配列番号25：WT-PDGFRB detection Fwd-1
配列番号26：WT-PDGFRB detection Rev-1

Claims (17)

  1. 　遺伝子融合の検出方法であって、被験者由来の単離された試料において、ATF7IPのSETDB1結合ドメインならびにPDGFRBの膜貫通領域およびキナーゼドメインを含みかつキナーゼ活性を有するATF7IP-PDGFRB融合ポリペプチド、またはそれをコードする融合ポリヌクレオチドを検出する工程を含む、方法。
  2. 　融合ポリペプチドが、下記（i）～（iii）のいずれかである、請求項１に記載の方法：
    （i）配列番号2または4で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
    （ii）配列番号2または4で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドにおいて、1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつキナーゼ活性を有するポリペプチド、または
    （iii）配列番号2または4で表されるアミノ酸配列と80％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつキナーゼ活性を有するポリペプチド。
  3. 　融合ポリヌクレオチドが下記（i）～（iv）のいずれかである、請求項１または２に記載の方法：
    （i）配列番号１または3で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、
    （ii）配列番号１または3で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
    （iii）配列番号１または3で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて、1若しくは複数のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または
    （iv）配列番号１または3で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと80％以上の配列同一性を有し、かつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
  4. 　遺伝子融合が、がんの責任変異（ドライバー変異）である、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 　がんが急性リンパ芽球性白血病である、請求項４に記載の方法。
  6. 　がんの責任変異（ドライバー変異）である遺伝子融合により生じる融合ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの発現および／または活性を抑制する物質が治療効果をもたらすがんの患者またはがんのリスクを有する被験者を同定する方法であって、下記の工程を含む、方法：
    （1）被験者由来の単離された試料において、ATF7IPのSETDB1結合ドメインならびにPDGFRBの膜貫通領域およびキナーゼドメインを含みかつキナーゼ活性を有するATF7IP-PDGFRB融合ポリペプチド、またはそれをコードする融合ポリヌクレオチドを検出する工程；ならびに
    （2）前記融合ポリペプチド、またはそれをコードする融合ポリヌクレオチドが検出された場合に、前記ポリペプチドの発現および／または活性を抑制する物質が前記被験者において治療効果をもたらすと判定する工程。
  7. 　遺伝子融合の検出用キットであって、下記（A）～（C）のいずれかのポリヌクレオチドまたは抗体あるいはそれらの組合せを含む、キット：
    （A）ATF7IP-PDGFRB融合ポリヌクレオチドを特異的に認識するように設計されたプローブであるポリヌクレオチド；
    （B）ATF7IP-PDGFRB融合ポリヌクレオチドを特異的に増幅できるように設計された一対のプライマーであるポリヌクレオチド；あるいは
    （C）ATF7IP-PDGFRB融合ポリペプチドを特異的に認識する抗体。
  8. 　遺伝子融合が、がんの責任変異（ドライバー変異）である、請求項７に記載のキット。
  9. 　ATF7IPのSETDB1結合ドメインならびにPDGFRBの膜貫通領域およびキナーゼドメインを含みかつキナーゼ活性を有する、単離されたATF7IP-PDGFRB融合ポリペプチドまたはその断片。
  10. 　請求項９に記載の融合ポリペプチドまたはその断片をコードするポリヌクレオチド。
  11. 　ATF7IP-PDGFRB遺伝子融合陽性がんの治療剤。
  12. 　ATF7IPのSETDB1結合ドメインならびにPDGFRBの膜貫通領域およびキナーゼドメインを含みかつキナーゼ活性を有するATF7IP-PDGFRB融合ポリペプチドの発現および／または活性を抑制する物質を有効成分として含む、請求項１１に記載の治療剤。
  13. 　がんが急性リンパ芽球性白血病である、請求項１１または１２に記載の治療剤。
  14. 　ATF7IPのSETDB1結合ドメインならびにPDGFRBの膜貫通領域およびキナーゼドメインを含みかつキナーゼ活性を有するATF7IP-PDGFRB融合ポリペプチドの発現および／または活性を抑制する物質が、PDGFRBキナーゼ活性を阻害する物質である、請求項１１～１３のいずれか一項に記載の治療剤。
  15. 　PDGFRBキナーゼ活性を阻害する物質が、メシル酸イマチニブ、ダサチニブ、ニロチニブ、ポナチニブ、レバスチニブ、またはバフェチニブである、請求項１４に記載の治療剤。
  16. 　PDGFRBキナーゼ活性を阻害する物質が、ダサチニブである、請求項１４に記載の治療剤。
  17. 　がん治療剤のスクリーニング方法であって、下記の工程を含む、方法：
    （1）ATF7IPのSETDB1結合ドメインならびにPDGFRBの膜貫通領域およびキナーゼドメインを含みかつキナーゼ活性を有するATF7IP-PDGFRB融合ポリペプチドを発現している細胞に被験物質を接触させる工程；
    （2）前記融合ポリペプチドの発現および／または活性が抑制されるか否かを決定する工程；ならびに
    （3）前記融合ポリペプチドの発現および／または活性を抑制すると決定された物質をがん治療剤として選択する工程。
     
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