JP2020515267A - 多重アイソタイプ特異的抗体の検出 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、国立衛生研究所により授与された契約DK108781およびAR067145下で政府支援を受けてなされたものである。政府は本発明に一定の権利を有する。
したがって、感度が高く、特異的、かつ費用対効果の高い抗体の診断検査のより良好な方法が必要である。
本発明の説明において、以下の用語が使用され、以下に示されるように定義されることが意図される。
本発明を詳細に説明する前に、本発明が、特定の処方またはプロセスパラメータに限定されるものではなく、したがって、そのようなものは当然ながら変わり得ることが理解されたい。また、本明細書で使用される専門用語が、本発明の特定の実施形態のみを説明することを目的としており、限定的であることを意図していないこともまた理解されたい。
本方法は、抗原−DNAコンジュゲートおよび抗体結合剤−DNAコンジュゲート、ならびにオリゴヌクレオチド試薬(例えば、オリゴヌクレオチドプライマーおよび/またはプローブ)または単一のアッセイで1つ以上の抗体アイソタイプを検出可能な試薬の組み合わせを使用する。本明細書に記載されるアッセイ方法は、アレルゲン、自己免疫疾患抗原、がん抗原、または病原体抗原を含むが、これらに限定されない、あらゆる型の抗原に特異的な抗体アイソタイプを検出するために使用することができる。抗体アイソタイプを検出するために使用することができる多くのアッセイ設計があり、それらは単独で、または互いに組み合わせて使用することができる。
増幅産物の存在は、定性的に決定または定量的に決定されたものを含む、任意の便利な方法によって決定され得る。場合によっては、増幅産物の存在は、例えば、増幅反応における物理的変化であって、連結産物の効率的な増幅を示す変化を通じて定性的に決定され得る。
本明細書に記載の方法によれば、試料は、標的抗体アイソタイプの存在について容易にスクリーニングされる。この方法は、単一の標的抗体アイソタイプの検出および多重分析の検出に適しており、2つ以上の異なる標的抗体アイソタイプは、試料でアッセイされる。これらの後者の多重状況では、使用され得る抗原−DNAおよび抗体結合剤−DNAコンジュゲートの異なるセットの数は、典型的には、約2〜約20以上、例えば、最大100以上、1000以上などの範囲であり、例えば、2〜50、2〜100、10〜100、50〜100、50〜200、50〜300、50〜400、50〜500などを含むが、これらに限定されない。一実施形態では、多重化アッセイは、特定の特異的にタグ化されたDNA分子の増幅が、特定の抗原に対して特異的な抗体の存在を示すように、特異的にタグ化されたDNA分子にコンジュゲートした様々な異なる抗原を用いてもよい。別の実施形態では、多重化アッセイは、特定の特異的にタグ化されたDNA分子の増幅が、抗体アイソタイプの存在を示すように、特異的にタグ化されたDNA分子にコンジュゲートした異なる標的抗体アイソタイプに特異的な様々な異なる抗体結合剤を用いてもよい。したがって、対象のアッセイでは、核酸のタグ付けおよび/または「バーコード」戦略を用いて、試料中の特定の抗原に特異的な複数の抗体アイソタイプの検出および/または定量化を可能にし得る。本明細書に記載の多重化アッセイに含めることができる、核酸バーコードで特異的にタグ付けされた異なる抗原および抗体結合剤の数は、変化してもよく、例えば、試料中に存在し得る抗原または抗体濃度のバーコードおよび物理的限界おける抗原−DNAおよび抗体結合剤−DNAコンジュゲート中のDNAの利用可能な長さによってのみ制限され得る。
本明細書に記載の方法および組成物は、試料中に存在する抗体アイソタイプの検出および/または定量化において特に有用性がある。このような検出は、様々な技術分野において様々な用途を見出すことができ、例えば、基礎科学的研究(例えば、生物医学的研究、生化学的研究、免疫学的研究、分子生物学的研究、微生物学的研究、細胞生物学的研究、遺伝学など)、医学的および/または薬物学的研究(例えば、創薬的研究、薬剤設計研究、薬剤開発研究、薬理学、毒物学、医薬品化学、前臨床研究、臨床研究、オーダーメイドまたは「精密」医療など)、医療、疫学、公衆衛生、バイオテクノロジー、畜産学、獣医学、農学、材料科学、分子検出、分子診断学などが含まれるが、これらに限定されない。
e、病原性Bacillus cereus、病原性Helicobacter pylori、病原性Campylobacterなど)を原因とするものを含む)、Pediculosis capitis(頭シラミ)(Pediculus humanus capitis)、Pediculosis corporis(カラダシラミ)(Pediculus humanus corporis)、Pediculosis pubis(毛ジラミ(Pubic lice)、カニシラミ)(Phthirus pubis)、骨盤内炎症性疾患(PID)(多発性病原体)、百日咳(百日咳(Whooping cough))(Bordetella pertussis)、ペスト(Yersinia pestis)、肺炎球菌感染症(Streptococcus pneumoniae)、ニューモシスチス肺炎(PCP)(Pneumocystis jirovecii)、肺炎(複数の病原体)、ポリオ(ポリオウイルス)、Prevotella感染症(Prevotella属)、原発性アメーバ性髄膜脳炎(PAM)(通常、Naegleria fowleri)、進行性多巣性白質脳症(JCウイルス)、Psittacosis(Chlamydophila psittaci)、Q熱(Coxiella burnetii)、狂犬病(狂犬病ウイルス)、ネズミ咬熱(Streptobacillus moniliformisもしくはSpirillum minus)、呼吸器合胞体ウイルス感染症(Respiratory syncytialウイルス(RSV))、リノスポリジウム症(Rhino sporidium seeberi)、ライノウイルス感染症(ライノウイルス)、リケッチア感染症(Rickettsia属)、リケッチア痘瘡(Rickettsia akari)、リフトバレー熱(RVF)(リフトバレー熱ウイルス)、ロッキー山発疹熱(RMSF)(Rickettsia rickettsii)、ロタウイルス感染症(ロタウイルス)、風疹(風疹ウイルス)、サルモネラ症(Salmonella属)、SARS(重症急性呼吸器症候群)(SARSコロナウイルス)、疥癬(Sarcoptes scabiei)、住血吸虫症(Schistosoma属)、敗血症(例えば、Capnocytophagaを含む複数の病原体)、細菌性赤痢(細菌性赤痢(Bacillary dysentery))(Shigella属)、帯状疱疹(帯状疱疹(Herpes zoster))(水痘帯状疱疹ウイルス(VZV))、天然痘(バリオラ(Variola))(Variola majorまたはVariola minor)、スポロトリクム症(Sporothrix schenckii)、ブドウ球菌食中毒(Staphylococcus属)、ブドウ球菌感染症(Staphylococcus属)、糞線虫症(Strongyloides stercoralis)、亜急性硬化性全脳炎(麻疹ウイルス)、梅毒(梅毒トレポネーマ)、条虫症(Taenia属)、破傷風(破傷風(Lockjaw))(Clostridium tetani)、白癬性毛瘡(白癬性毛瘡(Barber’s itch))(通常、Trichophyton属)、頭部白癬(頭皮白癬(Ringworm of the Scalp))(通常、Trichophyton tonsurans)、体部白癬(体部白癬(Ringworm of the Body))(通常Trichophyton属)、頑癬(Jock itch)(通常、Epidermophyton floccosum、Trichophyton rubrum、およびTrichophyton mentagrophytes)、手白癬(手白癬(Ringworm of the Hand))(Trichophyton rubrum)、黒癬(通常、Hortaea werneckii)、足白癬(水虫(Athlete’s foot))(通常Trichophyton属)、爪白癬(爪甲真菌症)(通常、Trichophyton属)、癜風(Pityriasis versicolor)(Malassezia属)、トキソカラ症(眼幼虫移行症(OLM))(Toxocara canisまたはToxocara cati)、トキソカラ症(Visceral Larva Migrans(VLM))(Toxocara canisまたはToxocara cati)、トラコーマ(Chlamydia trachomatis)、Trinochccliasis(Toxoplasma gondii)、旋毛虫症(Trichinella spiralis)、トリコモナス症(Trichomonas vaginalis)、鞭虫症(鞭虫感染症)(Trichuris trichiura)、結核(通常、Mycobacterium tuberculosis)、野兎病(Francisella tularensis)、腸チフス(Salmonella enterica subsp.enterica、serovar typhi)、ウレアプラズマウレアリチカム感染症(Ureaplasma urealyticum)、バレー熱(Coccidioides immitisまたはCoccidioides posadasii)、ベネズエラウマ脳炎(ベネズエラウマ脳炎ウイルス)、ベネズエラ出血熱(Guanaritoウイルス)、ウイルス性肺炎(複数のウイルス)、西ナイル熱(西ナイルウイルス)、白色砂毛(Tinea blanca)(Trichosporon beigelii)、エルシニア偽結核感染症(エルシニア偽結核)、エルシニア症(Yersinia enterocolitica)、黄熱病(黄熱ウイルス)、ジカウイルス病(ジカウイルス)、接合菌症(ケカビ目(Mucorales order)(ムコール菌症)およびハエカビ目(Entomophthorales order)(エントモフトラ症))などが含まれるが、これらに限定されない。概して、本明細書では、記載の方法に従って感染病態の検出は、1つ以上の抗原特異的抗体アイソタイプ、例えば、宿主に由来する試料に存在する、病原体由来抗原に対する宿主由来抗体を検出することによって、感染症に対する宿主免疫応答を検出することを含む。
本開示は、本明細書に記載の方法を実施するのに有用な組成物、例えば試薬、キット、およびデバイスを含む。本明細書に記載の試薬のいずれかは、抗体を検出するための方法またはキットにおいて個々に用途を見出すことができる。例えば、本開示は、記載のアッセイに有用な抗原−DNAコンジュゲートおよび抗体結合剤−DNAコンジュゲートを提供する。
以下は、本発明を実施するための特定の実施形態の例である。実施例は、例示目的のみのために提供されており、決して本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
凝集PCRによるアイソタイプ特異的抗体検出(ISAP)
ISAP法の概要
図1は、標的抗体の検出のためのISAP法を示す。抗体結合剤−DNAコンジュゲートおよび抗原−DNAコンジュゲートは、標的抗体検体を含む試料とともにインキュベートされる。二次抗体−DNAコンジュゲートは、標的抗体に結合し、次に標的抗体は、抗原−DNAコンジュゲートに結合して、二次抗体−DNAおよび抗原−DNAが互いに近接する複合体を形成する。二次抗体−DNAと抗原−DNAは近接しているため、架橋オリゴヌクレオチドの存在下で連結することができる。連結産物は、qPCRまたは任意のその他のDNA検出方法(例えば、DNAマイクロアレイ)によって検出および定量化され得る。
血漿試料の分析
ピーナッツアレルギーを有する患者からの血漿試料は、ピーナッツアレルギーを有する小児および成人における経口免疫療法(OIT)の施設内審査委員会承認臨床試験への登録の一環として得た(POISED;ClinicalTrials.gov Identifier:NCT02103270)。ピーナッツアレルギーは、ピーナッツに対する二重盲検プラセボ対照食品チャレンジに対する反応(500mg以下のピーナッツタンパク質で誘発される反応を伴う)およびピーナッツに対する陽性の皮膚プリックテスト反応(5mm以上)として定義された。
マウスの感作は、卵白アルブミン(OVA)と水酸化アルミニウム(ミョウバン)の投与、続いて、OVAの鼻腔内投与によって達成された。プロトコルは、記載されているように(Bernstein et al.(2008) Ann Allergy Asthma Immunol.100:S1−148(参照により本明細書に組み込まれる))、軽微な変更を加えて実施した。簡単に言えば、マウス(n=5/群)に、総量100μLのミョウバン2.25mg(AlumImuject;Pierce,Rockford,Ill)で乳化した20μgのOVA(グレードV;Sigma−Aldrich,St Louis,Mo)を、0日目および14日目に腹腔内に免疫した。対照マウス(n=5)にも同様に接種したが、OVAは接種しなかった。次いで、マウスに、21日目に、PBS中の200μgのOVAを含む20μLの溶液またはPBSのみで鼻腔内に接種した。体温変化は、接種後2時間連続して測定された。感作の成功は、OVA接種後の体温の著しい低下(3℃超)の検出によって定義される。血清試料は、0、7、および14日目に眼窩後部出血を介して収集された。21日目に、CO2の吸入によりマウスを殺処分し、心臓から血清試料を収集した。すべての血清試料は、使用するまで−80℃で保存した。全血試料は、血清試料と一緒に収集した。凝固を防ぐために、全血試料を、採取直後に10mM EDTAおよび1×PBSで1:1に希釈した。全血試料は、使用するまで−80℃で保存した。
BALB/c野生型マウス(n=10)、C57BL/6野生型マウス(n=10)、BALB/c−Jhノックアウトマウス(n=5)、およびBALB/c−RAGノックアウトマウス(n=5)に、ピーナッツ油(200μL、Golden Peanut Company,Dawson,Georgia)を6週間、皮膚感作した。次いで、BALB/cおよびC57BL/6マウスに、5mgのピーナッツタンパク質(以前に記載されたように脱脂ピーナッツ粉から抽出された(Byrd Mill,Ashland,Virginia)を腹腔内に接種した。体温を上記のように測定して、感作を確認した。CO2の吸入によりマウスを殺処分した後、0日目に眼窩後出血により、45日目に心臓出血により血清試料を採取した。血清試料は、使用するまで−80℃で保存した。
特異的IgE(sIgE)ELISAを記載のように行った(Bernsteinら、上記参照)簡単に言えば、OVAをELISAプレートに沈着させて、精製IgE試料およびOVA感作マウスからの血清試料から抗OVA IgEを捕捉および検出した。表面に結合したIgEの量は、二次抗マウスIgEおよびSA−HRPで処理した後の吸光度を検出することによって定量化された。ピーナッツ特異的IgEの検出のために、ピーナッツ抽出物をELISAプレートにコーティングし、抗ピーナッツIgEを上記のように検出した。
ImmunoCAP分析は、Thermo FischerのPhadiaによって実施した。
DNA配列およびプライマーは、Enable Biosciencesから提供された。配列は、増幅効率を最大化しながら、二次構造およびプライマーダイマーの形成を最小化するように最適化された。
1A:5’−CAGGTAGTAGTACGTCTGTTTCACGATGAGACTGGATGAA−3’(配列番号1)
1B:5’−TCACGGTAGCATAAGGTGCAAGATAATACTCTCGCAGCAC−3’
(配列番号2)
逆方向プライマー1:GTGCTGCGAGAGTATTATCT(配列番号3)
順方向プライマー1:CAGGTAGTAGTACGTCTGTT(配列番号4)
2A:5’−GGCCTCCTCCAATTAAAGAATCACGATGAGACTGGATGAA−3’
(配列番号5)
2B:5’−TCACGGTAGCATAAGGTGCAGTACCCAAATAACGGTTCAC−3’
(配列番号6)
逆方向プライマー2:GTGAACCGTTATTTGGGTAC(配列番号7)
順方向プライマー2:GGCCTCCTCCAATTAAAGAA(配列番号8)
3A:GGATCACTCCAACTAGACTATCACGATGAGACTGGATGAA
(配列番号9)
3B:TCACGGTAGCATAAGGTGCAGTTATATCTGCCACTGTCAC
(配列番号10)
逆方向プライマー3:GTGACAGTGGCAGATATAAC(配列番号11)
順方向プライマー3:GGATCACTCCAACTAGACTA(配列番号12)
4A:AGAGTCCACTTCCCATAATGTCACGATGAGACTGGATGAA
(配列番号13)
4B:TCACGGTAGCATAAGGTGCACGGTACTGTCAGCATAGTTC
(配列番号14)
逆方向プライマー4:GAACTATGCTGACAGTACCG(配列番号15)
順方向プライマー4:AGAGTCCACTTCCCATAATG(配列番号16)
5A:CTACGACTAGGAGATAGATGTCACGATGAGACTGGATGAA
(配列番号17)
5B:TCACGGTAGCATAAGGTGCAGTTATGTATAGTACGCTCGC
(配列番号18)
逆方向プライマー5:GCGAGCGTACTATACATAAC(配列番号19)
順方向プライマー5:CTACGACTAGGAGATAGATG(配列番号20)
架橋オリゴ:CTACCGTGATTCATCCAG(配列番号21)
OVAは、Life Technologies(#77120)から入手した。Ara−h1(#LTN−AH1−1)、Ara−h2(#RP−AH2−1)、およびAra−h3(#NA−AH3−1)は、Indoor Technologiesから購入した。アレルゲン(OVA、Ara−h1、Ara−h2、およびAra−h3)−DNAコンジュゲートは、組換えタンパク質反応緩衝液(55mMのリン酸ナトリウム、150mMの塩化ナトリウム、20mMのEDTA中の1mg/mLタンパク質、pH7.2)を再懸濁させることによって合成した。SMCC(スクシンイミジル4−(N−マレイミドメチル)シクロヘキサン−1−カルボキシレート)を、無水DMSOに溶解し、4mMの溶液の5μLを、50μLのタンパク質溶液に添加し、室温で2時間インキュベートした。チオール化DNA(IDT)を、反応緩衝液で100μMに再懸濁し、3μLを50μLの反応緩衝液に添加した。この溶液に、DTT(Life Technologies)の100mMの溶液の4μLを添加し、酸化チオールDNAを還元した。次いで、溶液を、37℃で1時間インキュベートした。7k MWCO(分子量カットオフ)ゲルマイクロスピンカラム(Life Technologies)を、反応緩衝液に平衡化した。還元されたオリゴヌクレオチドを、平衡化されたマイクロスピンカラムによって2回脱塩した。反応緩衝液で500μLの体積に希釈することによって、未反応のSMCCをアレルゲンタンパク質溶液から除去した。次いで、チオール−DNAおよびアレルゲン−SMCC溶液を混合し、4℃で一晩反応させ、次いで、30k MWCOフィルターカラム(Millipore)によって精製した。コンジュゲートの濃度は、BCAアッセイ(Life Technologies)によって決定された。コンジュゲーション効率は、前述のようにSDS−PAGEおよび銀染色によって決定された。代表的な銀染色が提供される(図4)。コンジュゲートのDNA対アレルゲン比は、UV−VIS吸収によって推定された。アレルゲン−DNAコンジュゲートは、短期間使用する場合、4°Cで保管するか、または長期間保管する場合、−80℃で分注した。
アレルゲン特異的IgEを検出するために、1fmolのアレルゲン−DNAコンジュゲートおよび抗IgEコンジュゲートを、2μLのインキュベーション緩衝液C(PBS中の、2%BSA、0.2%Triton X−100、8mMのEDTA)に再懸濁した。この溶液に、1μLの検体を添加し、次いで、37℃で30分間インキュベートした。インキュベーション後、連結混合物の117μL(20mMのTris、50mMのKCl、20mMのMgCl2、20mMのDTT、25μMのNAD、0.025U/μlのリガーゼ、架橋オリゴ100nM、0.001%のBSA、pH=7.5)を添加し、次いで、30℃で15分間インキュベートした。このインキュベーションステップ後、25μLの溶液を、10nMのプライマーを含む25μLの2×PCR Master Mix(Qiagen)に添加し、PCR(95℃で10分間、60℃で30秒間、95℃で15秒間)で13サイクル増幅した。次いで、PCR反応物を、ddH2Oで1:20に希釈し、8.5μLの希釈したPCR試料を、1.5μLのプライマー(最終濃度690nM)を含む10μLの2×qPCR Master Mix(Life Technologies)に添加した。qPCRによる分析は、Bio−Rad CFX96リアルタイムPCR検出システムで実施された。
すべてのPCRアッセイは、緩衝液Cのみのブランク(PBS中の2%BSA、0.2%Triton X−100、8mMのEDTA)とともに実行して、実行ごとの変動を修正した。各試料のCt値は、Bio−Radソフトウェアによって自動的に選択された単一閾値の蛍光値によって決定された。各試料について、閾値に対応する蛍光値を持つPCRサイクル数を、サイクル閾値(Ct)値として定義した。ΔCtは、ブランクのCt値から試料のCt値を引いた値として定義される。ΔCtの値は、PCRプレートウェルの初期アンプリコン濃度に比例する。次いで、このアンプリコン濃度はまた、標的抗体の量に比例する。
PCRによるアレルギー反応の超高感度多重検出
ここでは、統合されたPCRベースのアプローチを用いた、高感度かつ多重化可能な要素分解アレルギー診断を示す。最初に、アレルゲン特異的IgEを検出するために、新しいPCRベースの方法であるアイソタイプ特異的凝集PCR(ISAP)の開発を報する。次いで、ISAPを、単一のプラットフォームに、凝集PCR(ADAP)(Tsai et al.(2016) ACS Cent Sci 2:139−147)および近接連結アッセイ(PLA)(Fredriksson et al.(2007) Nat Methods 4:327−329)による抗体検出と組み合わせる。この多重化アッセイは、独自のDNA配列にタンパク質レベルをエンコードし、次いで、qPCRで検出することによって、総IgE、特異的IgE、特異的IgG4、および総抗アレルゲン免疫グロブリン(IgG、IgM、IgEなど)の4つの免疫学的特徴を同時に検出する。
PCRベースのアッセイによるアレルギー性免疫グロブリン応答の検出。
3つの抗体検出方法を統合して、包括的なアレルギーアッセイを作成した。
PCRベースのアッセイのコア試薬は、高品質のアレルゲン−DNAおよび抗体−DNAコンジュゲートである(Tsaiら、上記参照)。
統合されたPCRベースのアプローチによるアレルギー関連抗体の検出は、3つのステップからなる。(1)第1に、1μLの試料を、2μLのDNAコンジュゲートプローブと混合し、37℃で30分間インキュベートする。このインキュベーションステップ中に、プローブは、試料中の検体に結合させ、プローブ上のssDNAを近接させる。(2)次に、DNAリガーゼおよび短い架橋DNAを含む連結マスターミックスを添加する。プローブが標的検体によって適切にクラスター化されている場合、架橋DNAは、2つの近くのssDNAにハイブリダイズし、DNAリガーゼによる連結を引き起こす。特に、プローブ上の各ssDNAが1つのプライマー結合部位のみを有するため、プローブ自体はPCRで増幅することはできない。したがって、連結されたDNAのみが、PCR増幅に適した2つのプライマー部位を有する。(3)連結されたDNAは、PCRによってプレ増幅され、次いで、リアルタイムqPCRによって分析される。プレ増幅ステップは、qPCRステップの前にDNAのコピー数を増やすことによって、アッセイの再現性を向上させることが示されている(Tsaiら、上記参照)。
アイソタイプ特異的凝集PCR(ISAP)が特定のアイソタイプの抗体を忠実に検出するかどうかを検証するために、卵白アルブミン(OVA)タンパク質に対する高度に精製されたIgEおよびIgG抗体を得た。緩衝液で両方の抗体の連続希釈液を調製し、プローブとして抗IgE−1BおよびOVA−2Aを用いてISAPアッセイを行った。
PLA、ADAP、およびISAPを統合すると、単一のアッセイで、総IgE、総抗アレルゲン抗体、アレルゲン特異的IgEおよびIgG4を同時にモニタリングすることができる。概念実証実験として、希釈系列のIgE抗OVA、IgG抗OVA、および非特異的IgE抗体を再調製した。
次に、OVA感作マウスアレルギーモデルを用いたPCRベースのアッセイ性能を基準に従って評価を試みた(Nakae et al.(2007)J.Allergy Clin.Immunol.119:680−686)。OVA感作マウス群は、0および14日目に2回のOVA投与で感作させた。試料は、7日毎に尾出血を介して採取した。対照群のマウスにPBSビヒクルを注射し、従来どおりに試料を採取した。重要なことは、PCRベースのアプローチに対する試料タイプの互換性をさらに調査するために、各マウスからすべての時点で全血および血清の試料を採取する。
次に、PCRベースのアプローチが、単一のアッセイで複数のピーナッツ成分(Ara h1、h2、およびh3)におけるアレルギー情報を示し得ることを実証しようとした。B6およびBALBマウスの両方を、6週間連続してピーナッツ油で皮膚感作させた。血清試料を0日目および45日目に採取した。ピーナッツアレルギーの誘導の成功は、ピーナッツエキスの静脈内大量投与後のアナフィラキシーによって検証された。
最後に、PCRベースのアッセイが、臨床患者試料を用いたピーナッツアレルギーに対する免疫反応を忠実に獲得し、その結果をImmunoCAPと相関させることができることを実証しようとした。
特定のアイソタイプの抗原結合抗体を検出するために新しく開発されたPCRベースの方法であるISAPを報告する。さらに、ISAPを他のPCRベースの方法と単一のアッセイに結合する。この統合されたPCRベースのアプローチは、1つの多重化アッセイにおいて、総IgE、特異的IgE、特異的IgG4、および総抗アレルゲン抗体を検出する。
Claims (58)
- 試料中の標的抗体アイソタイプを検出する方法であって、
a)前記試料を、i)バーコードの第1の部分を含む第1のDNA分子にコンジュゲートした抗体結合剤およびii)バーコードの第2の部分を含む第2のDNA分子にコンジュゲートした抗原と接触させることであって、前記抗原が、前記試料中の前記標的抗体アイソタイプに、存在する場合、結合し、前記抗体結合剤が、前記標的抗体アイソタイプに特異的に結合して、複合体の形成をもたらす、接触させることと、
b)前記複合体中で前記第1のDNA分子を前記第2のDNA分子に接続することであって、前記バーコードの前記第1の部分および前記バーコードの前記第2の部分を接合して、完全なバーコードを形成する、接続することと、
c)前記試料中の前記標的抗体アイソタイプの存在の指標として前記完全なバーコードを検出することと、を含む、方法。 - 前記接続することが、
a)前記複合体を、架橋オリゴヌクレオチドと接触させることであって、前記架橋オリゴヌクレオチドが、前記第1のDNA分子に対して十分に相補的であり、かつハイブリダイズ可能な第1の部分と、前記第2のDNA分子に対して十分に相補的であり、かつハイブリダイズ可能な第2の部分と、を含み、前記第1のDNA分子および前記第2のDNA分子が、前記架橋オリゴヌクレオチドに同時にハイブリダイズするのに十分、前記複合体中で互いに近接している、接触させることと、
b)前記複合体中で前記第1のDNA分子を前記第2のDNA分子に連結して、前記完全なバーコードを含む連結産物を産生することと、を含む、請求項1に記載の方法。 - 前記接続することが、前記第1のDNA分子中のヌクレオチド配列の前記第2のDNA分子中の相補的ヌクレオチド配列へのハイブリダイゼーションを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記第1および第2のDNA分子の前記相補的ヌクレオチド配列が、少なくとも6ヌクレオチド長である、請求項3に記載の方法。
- ポリメラーゼを用いて、前記ハイブリダイズした第1および第2のDNA分子を伸長させて、前記完全なバーコードを含む核酸を生成することをさらに含む、請求項3に記載の方法。
- 前記ポリメラーゼが、等温条件下で使用される、請求項5に記載の方法。
- 前記標的抗体アイソタイプが、免疫グロブリンE(IgE)、免疫グロブリンM(IgM)、免疫グロブリンG(IgG)、免疫グロブリンA(IgA)、および免疫グロブリンD(IgD)からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記IgGが、IgG1、IgG2、IgG3、およびIgG4からなる群から選択される、請求項7に記載の方法。
- 前記抗体結合剤が、前記標的抗体アイソタイプに特異的に結合する、抗体、抗体模倣物、またはアプタマーを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記標的抗体アイソタイプに特異的に結合する前記抗体が、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、ナノボディ、抗体の組換え断片、Fab断片、Fab’断片、F(ab’)2断片、Fv断片、およびscFv断片からなる群から選択される、請求項9に記載の方法。
- 前記標的抗体アイソタイプに特異的に結合する前記抗体が、抗IgE抗体、抗IgM抗体、抗IgG抗体、抗IgA抗体、および抗IgD抗体からなる群から選択される、請求項9に記載の方法。
- 前記検出することが、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、等温増幅、またはマイクロアレイ分析を用いて実施される、請求項1に記載の方法。
- 前記標的抗体アイソタイプの量を定量化することをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記定量化することが、定量的PCR(qPCR)を実施することを含む、請求項13に記載の方法。
- 前記試料が、免疫障害を有する対象から得られる、請求項1に記載の方法。
- 前記免疫障害が、アレルギー、感染症、自己免疫障害、炎症性障害からなる群から選択される、請求項15に記載の方法。
- 前記感染症が、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)である、請求項16に記載の方法。
- 前記抗原が、HIV−1抗原、HIV−2抗原、HIV−1/2抗原、p16、p14、p24、p55、gpl20、gpl60、gp41、およびgp36からなる群から選択される、請求項17に記載の方法。
- 前記試料が、血液、血漿、または血清である、請求項1に記載の方法。
- 前記方法が、0.01ng/mL以上の濃度でIgEを検出することができる、請求項1に記載の方法。
- 複数の抗体結合剤−DNAコンジュゲートを前記試料に添加することをさらに含み、各抗体結合剤が、異なるバーコード配列を含むDNA分子にコンジュゲートされ、各抗体結合剤が、異なる標的抗体アイソタイプに結合することができ、前記試料中の複数の標的抗体アイソタイプの多重検出を可能にする、請求項1に記載の方法。
- 前記抗体結合剤−DNAコンジュゲートが、IgEの検出用の抗IgE二次抗体−DNAコンジュゲート、IgMの検出用の抗IgM二次抗体−DNAコンジュゲート、IgGの検出用の抗IgG二次抗体−DNAコンジュゲート、IgAの検出用の抗IgA二次抗体−DNAコンジュゲート、およびIgDの検出用の抗IgD二次抗体DNAコンジュゲートからなる群から選択される、請求項21に記載の方法。
- 前記架橋オリゴヌクレオチドが、配列番号21のヌクレオチド配列または配列番号21の配列と少なくとも95%の同一性を有するヌクレオチド配列を含み、前記架橋オリゴヌクレオチドが、前記二次抗体−DNAコンジュゲートのDNAおよび前記抗原−DNAコンジュゲートのDNAにハイブリダイズすることができる、請求項1に記載の方法。
- 前記方法が、
a)配列番号1のDNA配列を含む抗原−DNAコンジュゲート、配列番号2のDNA配列を含む抗体結合剤−DNAコンジュゲート、配列番号21のヌクレオチド配列を含む架橋オリゴヌクレオチド、配列番号3のヌクレオチド配列を含む逆方向プライマー、および配列番号4の配列を含む順方向プライマー、
b)配列番号5のDNA配列を含む抗原−DNAコンジュゲート、配列番号6のDNA配列を含む抗体結合剤−DNAコンジュゲート、配列番号21のヌクレオチド配列を含む架橋オリゴヌクレオチド、配列番号7のヌクレオチド配列を含む逆方向プライマー、および配列番号8の配列を含む順方向プライマー、
c)配列番号9のDNA配列を含む抗原−DNAコンジュゲート、配列番号10のDNA配列を含む抗体結合剤−DNAコンジュゲート、配列番号21のヌクレオチド配列を含む架橋オリゴヌクレオチド、配列番号11のヌクレオチド配列を含む逆方向プライマー、および配列番号12の配列を含む順方向プライマー、
d)配列番号13のDNA配列を含む抗原−DNAコンジュゲート、配列番号14のDNA配列を含む抗体結合剤−DNAコンジュゲート、配列番号21のヌクレオチド配列を含む架橋オリゴヌクレオチド、配列番号15のヌクレオチド配列を含む逆方向プライマー、および配列番号16の配列を含む順方向プライマー、
e)配列番号17のDNA配列を含む抗原−DNAコンジュゲート、配列番号18のDNA配列を含む抗体結合剤−DNAコンジュゲート、配列番号21のヌクレオチド配列を含む架橋オリゴヌクレオチド、配列番号19のヌクレオチド配列を含む逆方向プライマー、および配列番号20の配列を含む順方向プライマー、
f)配列番号1のDNA配列を含む抗体結合剤−DNAコンジュゲート、配列番号2のDNA配列を含む抗原−DNAコンジュゲート、配列番号21のヌクレオチド配列を含む架橋オリゴヌクレオチド、配列番号3のヌクレオチド配列を含む逆方向プライマー、および配列番号4の配列を含む順方向プライマー、
g)配列番号5のDNA配列を含む抗体結合剤−DNAコンジュゲート、配列番号6のDNA配列を含む抗原−DNAコンジュゲート、配列番号21のヌクレオチド配列を含む架橋オリゴヌクレオチド、配列番号7のヌクレオチド配列を含む逆方向プライマー、および配列番号8の配列を含む順方向プライマー、
h)配列番号9のDNA配列を含む抗体結合剤−DNAコンジュゲート、配列番号10のDNA配列を含む抗原−DNAコンジュゲート、配列番号21のヌクレオチド配列を含む架橋オリゴヌクレオチド、配列番号11のヌクレオチド配列を含む逆方向プライマー、および配列番号12の配列を含む順方向プライマー、
i)配列番号13のDNA配列を含む抗体結合剤−DNAコンジュゲート、配列番号14のDNA配列を含む抗原−DNAコンジュゲート、配列番号21のヌクレオチド配列を含む架橋オリゴヌクレオチド、配列番号15のヌクレオチド配列を含む逆方向プライマー、および配列番号16の配列を含む順方向プライマー、ならびに
j)配列番号17のDNA配列を含む抗体結合剤−DNAコンジュゲート、配列番号18のDNA配列を含む抗原−DNAコンジュゲート、配列番号21のヌクレオチド配列を含む架橋オリゴヌクレオチド、配列番号19のヌクレオチド配列を含む逆方向プライマー、および配列番号20の配列を含む順方向プライマー、からなる群から選択される少なくとも一組の試薬を用いて実施される、請求項1に記載の方法。 - 前記抗原が、アレルゲン、自己免疫疾患抗原、がん抗原、および病原体抗原からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 近接連結アッセイ(PLA)または凝集ポリメラーゼ連鎖反応(ADAP)を実施することをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 抗体アイソタイプを検出するために、少なくとも1つの抗原−DNAコンジュゲート、少なくとも1つの抗体結合剤−DNAコンジュゲート、少なくとも1つの架橋オリゴヌクレオチド、および少なくとも一対のPCRプライマーを含む、アイソタイプ特異的凝集ポリメラーゼ連鎖反応(ISAP)を実施するためのキット。
- 配列番号1、2、5、6、9、10、13、14、17、および18からなる群から選択されるDNA配列、または配列番号1、2、5、6、9、10、13、14、17、および18からなる群から選択されるDNA配列に対して少なくとも95%の同一性を有するDNA配列を含む、抗原−DNAコンジュゲート。
- 配列番号1、2、5、6、9、10、13、14、17、および18からなる群から選択されるDNA配列、または配列番号1、2、5、6、9、10、13、14、17、および18からなる群から選択されるDNA配列に対して少なくとも95%の同一性を有するDNA配列を含む、抗体結合剤−DNAコンジュゲート。
- 生体試料中の抗体を検出するための組成物であって、
a)配列番号1のDNA配列を含む抗原−DNAコンジュゲート、配列番号2のDNA配列を含む抗体結合剤−DNAコンジュゲート、配列番号21のヌクレオチド配列を含む架橋オリゴヌクレオチド、配列番号3のヌクレオチド配列を含む逆方向プライマー、および配列番号4の配列を含む順方向プライマー、
b)配列番号5のDNA配列を含む抗原−DNAコンジュゲート、配列番号6のDNA配列を含む抗体結合剤−DNAコンジュゲート、配列番号21のヌクレオチド配列を含む架橋オリゴヌクレオチド、配列番号7のヌクレオチド配列を含む逆方向プライマー、および配列番号8の配列を含む順方向プライマー、
c)配列番号9のDNA配列を含む抗原−DNAコンジュゲート、配列番号10のDNA配列を含む抗体結合剤−DNAコンジュゲート、配列番号21のヌクレオチド配列を含む架橋オリゴヌクレオチド、配列番号11のヌクレオチド配列を含む逆方向プライマー、および配列番号12の配列を含む順方向プライマー、
d)配列番号13のDNA配列を含む抗原−DNAコンジュゲート、配列番号14のDNA配列を含む抗体結合剤−DNAコンジュゲート、配列番号21のヌクレオチド配列を含む架橋オリゴヌクレオチド、配列番号15のヌクレオチド配列を含む逆方向プライマー、および配列番号16の配列を含む順方向プライマー、
e)配列番号17のDNA配列を含む抗原−DNAコンジュゲート、配列番号18のDNA配列を含む抗体結合剤−DNAコンジュゲート、配列番号21のヌクレオチド配列を含む架橋オリゴヌクレオチド、配列番号19のヌクレオチド配列を含む逆方向プライマー、および配列番号20の配列を含む順方向プライマー、
f)配列番号1のDNA配列を含む抗体結合剤−DNAコンジュゲート、配列番号2のDNA配列を含む抗原−DNAコンジュゲート、配列番号21のヌクレオチド配列を含む架橋オリゴヌクレオチド、配列番号3のヌクレオチド配列を含む逆方向プライマー、および配列番号4の配列を含む順方向プライマー、
g)配列番号5のDNA配列を含む抗体結合剤−DNAコンジュゲート、配列番号6のDNA配列を含む抗原−DNAコンジュゲート、配列番号21のヌクレオチド配列を含む架橋オリゴヌクレオチド、配列番号7のヌクレオチド配列を含む逆方向プライマー、および配列番号8の配列を含む順方向プライマー、
h)配列番号9のDNA配列を含む抗体結合剤−DNAコンジュゲート、配列番号10のDNA配列を含む抗原−DNAコンジュゲート、配列番号21のヌクレオチド配列を含む架橋オリゴヌクレオチド、配列番号11のヌクレオチド配列を含む逆方向プライマー、および配列番号12の配列を含む順方向プライマー、
i)配列番号13のDNA配列を含む抗体結合剤−DNAコンジュゲート、配列番号14のDNA配列を含む抗原−DNAコンジュゲート、配列番号21のヌクレオチド配列を含む架橋オリゴヌクレオチド、配列番号15のヌクレオチド配列を含む逆方向プライマー、および配列番号16の配列を含む順方向プライマー、ならびに
j)配列番号17のDNA配列を含む抗体結合剤−DNAコンジュゲート、配列番号18のDNA配列を含む抗原−DNAコンジュゲート、配列番号21のヌクレオチド配列を含む架橋オリゴヌクレオチド、配列番号19のヌクレオチド配列を含む逆方向プライマー、および配列番号20の配列を含む順方向プライマー、からなる群から選択される少なくとも一組の試薬を含む、組成物。 - 請求項30に記載の組成物と、抗体を検出するための取扱説明書と、を含む、キット。
- リガーゼをさらに含む、請求項31に記載のキット。
- PCRを実施するための試薬をさらに含む、請求項31に記載のキット。
- 試料中のアレルゲン抗体を検出するための方法であって、前記試料中のアレルゲン特異的IgEレベルを検出するために、少なくとも1つの抗IgE抗体−DNAコンジュゲートと組み合わせて少なくとも1つのアレルゲン−DNAコンジュゲートを用いて、アイソタイプ特異的凝集−ポリメラーゼ連鎖反応(ISAP)を実施することを含む、方法。
- アレルゲン特異的IgG4レベルを検出するために、少なくとも1つの抗免疫グロブリンG4(IgG4)抗体−DNAコンジュゲートと組み合わせて少なくとも1つのアレルゲン−DNAコンジュゲートを用いてISAPを実施することをさらに含む、請求項34に記載の方法。
- 前記試料中の総免疫グロブリンE(IgE)レベルを検出するために、少なくとも一対の抗IgE抗体−DNAコンジュゲートを用いて、近接連結アッセイ(PLA)を実施することをさらに含む、請求項34に記載の方法。
- 前記試料中の総抗アレルゲン抗体レベルを検出するために、少なくとも一対のアレルゲン−DNAコンジュゲートを用いて、凝集−ポリメラーゼ連鎖反応(ADAP)を実施することをさらに含む、請求項34に記載の方法。
- ADAPが、IgG、IgM、IgE、IgA、およびIgDの総抗アレルゲン抗体レベルを検出するために使用される、請求項37に記載の方法。
- 前記IgGが、IgG1、IgG2、IgG3、およびIgG4からなる群から選択される、請求項38に記載の方法。
- 前記試料中の総免疫グロブリンE(IgE)レベルを検出するために、少なくとも一対の抗IgE抗体−DNAコンジュゲートを用いて、近接連結アッセイ(PLA)を実施することをさらに含む、請求項37に記載の方法。
- 前記PLAの前記実施が、
a)前記少なくとも一対の抗IgE抗体−DNAコンジュゲートを前記試料に添加することであって、前記少なくとも一対の抗IgE抗体−DNAコンジュゲートが、第1の部位で前記試料中のIgEに結合する第1の抗IgE抗体−DNAコンジュゲートと、第2の部位で同じIgEに結合する第2の抗IgE抗体−DNAコンジュゲートと、を含む、添加することと、
b)前記試料をPLA架橋オリゴヌクレオチドと接触させることであって、前記PLA架橋オリゴヌクレオチドが、(i)前記第1の抗IgE抗体−DNAコンジュゲートのDNAに対して十分に相補的であり、かつハイブリダイズ可能な第1の部分と、(ii)前記第2の抗IgE抗体−DNAコンジュゲートのDNAに対して十分に相補的であり、かつハイブリダイズ可能な第2の部分と、を含み、前記第1の抗IgE抗体−DNAコンジュゲートのDNAおよび前記第2の抗IgE抗体−DNAコンジュゲートのDNAが、前記PLA架橋オリゴヌクレオチドに同時にハイブリダイズするのに十分、互いに近接している、接触させることと、
c)前記第1の抗IgE抗体−DNAコンジュゲートと前記第2の抗IgE抗体−DNAコンジュゲートを連結して、PLA連結産物を産生することと、
d)前記試料中の前記IgEの存在の指標として前記PLA連結産物を検出することと、を含む、請求項40に記載の方法。 - 前記ADAPの前記実施が、
a)前記少なくとも一対のアレルゲン−DNAコンジュゲートを前記試料に添加することであって、前記少なくとも一対のアレルゲン−DNAコンジュゲートが、第1の部位で前記試料中の抗アレルゲン抗体に結合する第1のアレルゲン−DNAコンジュゲートと、第2の部位で同じ抗アレルゲン抗体に結合する第2のアレルゲン−DNAコンジュゲートと、を含む、添加することと、
b)前記試料をADAP架橋オリゴヌクレオチドと接触させることであって、前記ADAP架橋オリゴヌクレオチドが、(i)前記第1のアレルゲン−DNAコンジュゲートのDNAに対して十分に相補的であり、かつハイブリダイズ可能な第1の部分と、(ii)前記第2のアレルゲン−DNAコンジュゲートのDNAに対して十分に相補的であり、かつハイブリダイズ可能な第2の部分と、を含み、前記第1のアレルゲン−DNAコンジュゲートのDNAおよび前記第2のアレルゲン−DNAコンジュゲートのDNAが、前記ADAP架橋オリゴヌクレオチドに同時にハイブリダイズするのに十分、互いに近接している、接触させることと、
c)前記第1のアレルゲン−DNAコンジュゲートと前記第2のアレルゲン−DNAコンジュゲートを連結して、ADAP連結産物を産生することと、
d)前記試料中の前記抗アレルゲン抗体の存在の指標として前記ADAP連結産物を検出することと、を含む、請求項41に記載の方法。 - 前記ISAPの前記実施が、
a)少なくとも1つの抗IgE抗体−DNAコンジュゲートと組み合わせて前記少なくとも1つのアレルゲン−DNAコンジュゲートを、前記試料に添加することであって、前記アレルゲン−DNAコンジュゲートに結合し、前記抗IgE抗体−DNAコンジュゲートが、前記同じアレルゲン特異的IgEに結合して、第1の複合体の形成をもたらす、添加することと、
b)前記第1の複合体を、ISAP架橋オリゴヌクレオチドと接触させることであって、前記ISAP架橋オリゴヌクレオチドが、(i)前記抗IgE抗体−DNAコンジュゲートのDNAに対して十分に相補的であり、かつハイブリダイズ可能な第1の部分と、(ii)前記アレルゲン−DNAコンジュゲートのDNAに対して十分に相補的であり、かつハイブリダイズ可能な第2の部分と、を含み、前記抗IgE抗体−DNAコンジュゲートのDNAおよび前記アレルゲン−DNAコンジュゲートのDNAが、前記ISAP架橋オリゴヌクレオチドに同時にハイブリダイズするのに十分、前記第1の複合体中で互いに近接している、接触させることと、
c)前記第1の複合体中で前記抗IgE抗体−DNAと前記アレルゲン−DNAを連結して、第1のISAP連結産物を産生することと、
d)前記試料中の前記アレルゲン特異的IgEの存在の指標として前記第1のISAP連結産物を検出することと、
e)少なくとも1つの抗IgG4抗体−DNAコンジュゲートと組み合わせて前記少なくとも1つのアレルゲン−DNAコンジュゲートを前記試料に添加することであって、前記アレルゲン−DNAコンジュゲートが、前記試料中の前記アレルゲン特異的IgG4に結合し、前記抗IgG4抗体−DNAコンジュゲートが、同じアレルゲン特異的IgG4に結合して、第2の複合体の形成をもたらす、添加することと、
f)前記第2の複合体を、ISAP架橋オリゴヌクレオチドと接触させることであって、前記ISAP架橋オリゴヌクレオチドが、(i)前記抗IgG4抗体−DNAコンジュゲートのDNAに対して十分に相補的であり、かつハイブリダイズ可能な第1の部分と、(ii)前記アレルゲン−DNAコンジュゲートのDNAに対して十分に相補的であり、かつハイブリダイズ可能な第2の部分と、を含み、前記抗IgG4抗体−DNAコンジュゲートのDNAおよび前記アレルゲン−DNAコンジュゲートのDNAが、前記ISAP架橋オリゴヌクレオチドに同時にハイブリダイズするのに十分、前記複合体中で互いに近接している、接触させることと、
g)前記第2の複合体中で前記抗IgG4抗体−DNAと前記アレルゲン−DNAを連結して、第2のISAP連結産物を産生することと、
h)前記試料中の前記アレルゲン特異的IgG4の存在の指標として前記第2のISAP連結産物を検出することと、を含む、請求項42に記載の方法。 - 前記PLA連結産物、前記ADAP連結産物、前記第1のISAP連結産物、および前記第2のISAP連結産物の前記検出が、多重ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、等温増幅、またはマイクロアレイ分析を用いて実施される、請求項43に記載の方法。
- 前記PLA連結産物、前記ADAP連結産物、前記第1のISAP連結産物、および前記第2のISAP連結産物の量を定量化することをさらに含む、請求項44に記載の方法。
- 前記定量化することが、定量的PCR(qPCR)を実施することを含む、請求項45に記載の方法。
- 前記PLAが、
a)配列番号1のDNA配列を含む第1の抗IgE抗体−DNAコンジュゲート、配列番号2のDNA配列を含む第2の抗IgE抗体−DNAコンジュゲート、配列番号21のヌクレオチド配列を含む架橋オリゴヌクレオチド、配列番号3のヌクレオチド配列を含む逆方向プライマー、および配列番号4の配列を含む順方向プライマー、
b)配列番号5のDNA配列を含む第1の抗IgE抗体−DNAコンジュゲート、配列番号6のDNA配列を含む第2の抗IgE抗体−DNAコンジュゲート、配列番号21のヌクレオチド配列を含む架橋オリゴヌクレオチド、配列番号7のヌクレオチド配列を含む逆方向プライマー、および配列番号8の配列を含む順方向プライマー、
c)配列番号9のDNA配列を含む第1の抗IgE抗体−DNAコンジュゲート、配列番号10のDNA配列を含む第2の抗IgE抗体−DNAコンジュゲート、配列番号21のヌクレオチド配列を含む架橋オリゴヌクレオチド、配列番号11のヌクレオチド配列を含む逆方向プライマー、および配列番号12の配列を含む順方向プライマー、
d)配列番号13のDNA配列を含む第1の抗IgE抗体−DNAコンジュゲート、配列番号14のDNA配列を含む第2の抗IgE抗体−DNAコンジュゲート、配列番号21のヌクレオチド配列を含む架橋オリゴヌクレオチド、配列番号15のヌクレオチド配列を含む逆方向プライマー、および配列番号16の配列を含む順方向プライマー、
e)配列番号17のDNA配列を含む第1の抗IgE抗体−DNAコンジュゲート、配列番号18のDNA配列を含む第2の抗IgE抗体−DNAコンジュゲート、配列番号21のヌクレオチド配列を含む架橋オリゴヌクレオチド、配列番号19のヌクレオチド配列を含む逆方向プライマー、および配列番号20の配列を含む順方向プライマー、
f)配列番号1のDNA配列を含む第2の抗IgE抗体−DNAコンジュゲート、配列番号2のDNA配列を含む第1の抗IgE抗体−DNAコンジュゲート、配列番号21のヌクレオチド配列を含む架橋オリゴヌクレオチド、配列番号3のヌクレオチド配列を含む逆方向プライマー、および配列番号4の配列を含む順方向プライマー、
g)配列番号5のDNA配列を含む第2の抗IgE抗体−DNAコンジュゲート、配列番号6のDNA配列を含む第1の抗IgE抗体−DNAコンジュゲート、配列番号21のヌクレオチド配列を含む架橋オリゴヌクレオチド、配列番号7のヌクレオチド配列を含む逆方向プライマー、および配列番号8の配列を含む順方向プライマー、
h)配列番号9のDNA配列を含む第2の抗IgE抗体−DNAコンジュゲート、配列番号10のDNA配列を含む第1の抗IgE抗体−DNAコンジュゲート、のヌクレオチド配列を含む架橋オリゴヌクレオチド配列番号21、配列番号11のヌクレオチド配列を含む逆方向プライマー、および配列番号12の配列を含む順方向プライマー、
i)配列番号13のDNA配列を含む第2の抗IgE抗体−DNAコンジュゲート、配列番号14のDNA配列を含む第1の抗IgE抗体−DNAコンジュゲート、配列番号21のヌクレオチド配列を含む架橋オリゴヌクレオチド、配列番号15のヌクレオチド配列を含む逆方向プライマー、および配列番号16の配列を含む順方向プライマー、ならびに
j)配列番号17のDNA配列を含む第2の抗IgE抗体−DNAコンジュゲート、配列番号18のDNA配列を含む第1の抗IgE抗体−DNAコンジュゲート、配列番号21のヌクレオチド配列を含む架橋オリゴヌクレオチド、配列番号19のヌクレオチド配列を含む逆方向プライマー、および配列番号20の配列を含む順方向プライマー、からなる群から選択される少なくとも一組の試薬を用いて実施される、請求項40に記載の方法。 - 前記ADAPが、
a)配列番号1のDNA配列を含む第1のアレルゲン−DNAコンジュゲート、配列番号2のDNA配列を含む第2のアレルゲン−DNAコンジュゲート、配列番号21のヌクレオチド配列を含む架橋オリゴヌクレオチド、配列番号3のヌクレオチド配列を含む逆方向プライマー、および配列番号4の配列を含む順方向プライマー、
b)配列番号5のDNA配列を含む第1のアレルゲン−DNAコンジュゲート、配列番号6のDNA配列を含む第2のアレルゲン−DNAコンジュゲート、配列番号21のヌクレオチド配列を含む架橋オリゴヌクレオチド、配列番号7のヌクレオチド配列を含む逆方向プライマー、および配列番号8の配列を含む順方向プライマー、
c)配列番号9のDNA配列を含む第1のアレルゲン−DNAコンジュゲート、配列番号10のDNA配列を含む第2のアレルゲン−DNAコンジュゲート、配列番号21のヌクレオチド配列を含む架橋オリゴヌクレオチド、配列番号11のヌクレオチド配列を含む逆方向プライマー、および配列番号12の配列を含む順方向プライマー、
d)配列番号13のDNA配列を含む第1のアレルゲン−DNAコンジュゲート、配列番号14のDNA配列を含む第2のアレルゲン−DNAコンジュゲート、配列番号21のヌクレオチド配列を含む架橋オリゴヌクレオチド、配列番号15のヌクレオチド配列を含む逆方向プライマー、および配列番号16の配列を含む順方向プライマー、
e)配列番号17のDNA配列を含む第1のアレルゲン−DNAコンジュゲート、配列番号18のDNA配列を含む第2のアレルゲン−DNAコンジュゲート、配列番号21のヌクレオチド配列を含む架橋オリゴヌクレオチド、配列番号19のヌクレオチド配列を含む逆方向プライマー、および配列番号20の配列を含む順方向プライマー、
f)配列番号1のDNA配列を含む第2のアレルゲン−DNAコンジュゲート、配列番号2のDNA配列を含む第1のアレルゲン−DNAコンジュゲート、配列番号21のヌクレオチド配列を含む架橋オリゴヌクレオチド、配列番号3のヌクレオチド配列を含む逆方向プライマー、および配列番号4の配列を含む順方向プライマー、
g)配列番号5のDNA配列を含む第2のアレルゲン−DNAコンジュゲート、配列番号6のDNA配列を含む第1のアレルゲン−DNAコンジュゲート、配列番号21のヌクレオチド配列を含む架橋オリゴヌクレオチド、配列番号7のヌクレオチド配列を含む逆方向プライマー、および配列番号8の配列を含む順方向プライマー、
h)配列番号9のDNA配列を含む第2のアレルゲン−DNAコンジュゲート、配列番号10のDNA配列を含む第1のアレルゲン−DNAコンジュゲート、配列番号21のヌクレオチド配列を含む架橋オリゴヌクレオチド、配列番号11のヌクレオチド配列を含む逆方向プライマー、および配列番号12の配列を含む順方向プライマー、
i)配列番号13のDNA配列を含む第2のアレルゲン−DNAコンジュゲート、配列番号14のDNA配列を含む第1のアレルゲン−DNAコンジュゲート、配列番号21のヌクレオチド配列を含む架橋オリゴヌクレオチド、配列番号15のヌクレオチド配列を含む逆方向プライマー、および配列番号16の配列を含む順方向プライマー、ならびに
j)配列番号17のDNA配列を含む第2のアレルゲン−DNAコンジュゲート、配列番号18のDNA配列を含む第1のアレルゲン−DNAコンジュゲート、配列番号21のヌクレオチド配列を含む架橋オリゴヌクレオチド、配列番号19のヌクレオチド配列を含む逆方向プライマー、および配列番号20の配列を含む順方向プライマー、からなる群から選択される少なくとも一組の試薬を用いて実施される、請求項37に記載の方法。 - 前記ISAPが、
a)配列番号1のDNA配列を含むアレルゲン−DNAコンジュゲート、配列番号2のDNA配列を含む抗IgE抗体−DNAコンジュゲート、配列番号21のヌクレオチド配列を含む架橋オリゴヌクレオチド、配列番号3のヌクレオチド配列を含む逆方向プライマー、および配列番号4の配列を含む順方向プライマー、
b)配列番号5のDNA配列を含むアレルゲン−DNAコンジュゲート、配列番号6のDNA配列を含む抗IgE抗体−DNAコンジュゲート、配列番号21のヌクレオチド配列を含む架橋オリゴヌクレオチド、配列番号7のヌクレオチド配列を含む逆方向プライマー、および配列番号8の配列を含む順方向プライマー、
c)配列番号9のDNA配列を含むアレルゲン−DNAコンジュゲート、配列番号10のDNA配列を含む抗IgE抗体−DNAコンジュゲート、配列番号21のヌクレオチド配列を含む架橋オリゴヌクレオチド、配列番号11のヌクレオチド配列を含む逆方向プライマー、および配列番号12の配列を含む順方向プライマー、
d)配列番号13のDNA配列を含むアレルゲン−DNAコンジュゲート、配列番号14のDNA配列を含む抗IgE抗体−DNAコンジュゲート、配列番号21のヌクレオチド配列を含む架橋オリゴヌクレオチド、配列番号15のヌクレオチド配列を含む逆方向プライマー、および配列番号16の配列を含む順方向プライマー、
e)配列番号17のDNA配列を含むアレルゲン−DNAコンジュゲート、配列番号18のDNA配列を含む抗IgE抗体−DNAコンジュゲート、配列番号21のヌクレオチド配列を含む架橋オリゴヌクレオチド、配列番号19のヌクレオチド配列を含む逆方向プライマーおよび配列番号20の配列を含む順方向プライマー、
f)配列番号1のDNA配列を含む抗IgE抗体−DNAコンジュゲート、配列番号2のDNA配列を含むアレルゲン−DNAコンジュゲート、配列番号21のヌクレオチド配列を含む架橋オリゴヌクレオチド、配列番号3のヌクレオチド配列を含む逆方向プライマー、および配列番号4の配列を含む順方向プライマー、
g)配列番号5のDNA配列を含む抗IgE抗体−DNAコンジュゲート、配列番号6のDNA配列を含むアレルゲン−DNAコンジュゲート、配列番号21のヌクレオチド配列を含む架橋オリゴヌクレオチド、配列番号7のヌクレオチド配列を含む逆方向プライマー、および配列番号8の配列を含む順方向プライマー、
h)配列番号9のDNA配列を含む抗IgE抗体−DNAコンジュゲート、配列番号10のDNA配列を含むアレルゲン−DNAコンジュゲート、配列番号21のヌクレオチド配列を含む架橋オリゴヌクレオチド、配列番号11のヌクレオチド配列を含む逆方向プライマー、および配列番号12の配列を含む順方向プライマー、
i)配列番号13のDNA配列を含む抗IgE抗体−DNAコンジュゲート、配列番号14のDNA配列を含むアレルゲン−DNAコンジュゲート、配列番号21のヌクレオチド配列を含む架橋オリゴヌクレオチド、配列番号15のヌクレオチド配列を含む逆方向プライマー、および配列番号16の配列を含む順方向プライマー、ならびに
j)配列番号17のDNA配列を含む抗IgE抗体−DNAコンジュゲート、配列番号18のDNA配列を含むアレルゲン−DNAコンジュゲート、配列番号21のヌクレオチド配列を含む架橋オリゴヌクレオチド、配列番号19のヌクレオチド配列を含む逆方向プライマー、および配列番号20の配列を含む順方向プライマー、からなる群から選択される少なくとも一組の試薬を用いて実施される、請求項34に記載の方法。 - a)配列番号1のDNA配列を含むアレルゲン−DNAコンジュゲート、配列番号2のDNA配列を含む抗IgG4抗体−DNAコンジュゲート、配列番号21のヌクレオチド配列を含む架橋オリゴヌクレオチド、配列番号3のヌクレオチド配列を含む逆方向プライマー、および配列番号4の配列を含む順方向プライマー、
b)配列番号5のDNA配列を含むアレルゲン−DNAコンジュゲート、配列番号6のDNA配列を含む抗IgG4抗体−DNAコンジュゲート、配列番号21のヌクレオチド配列を含む架橋オリゴヌクレオチド、配列番号7のヌクレオチド配列を含む逆方向プライマー、および配列番号8の配列を含む順方向プライマー、
c)配列番号9のDNA配列を含むアレルゲン−DNAコンジュゲート、配列番号10のDNA配列を含む抗IgG4抗体−DNAコンジュゲート、配列番号21のヌクレオチド配列を含む架橋オリゴヌクレオチド、配列番号11のヌクレオチド配列を含む逆方向プライマーおよび配列番号12の配列を含む順方向プライマー、
d)配列番号13のDNA配列を含むアレルゲン−DNAコンジュゲート、配列番号14のDNA配列を含む抗IgG4抗体−DNAコンジュゲート、配列番号21のヌクレオチド配列を含む架橋オリゴヌクレオチド、配列番号15のヌクレオチド配列を含む逆方向プライマーおよび配列番号16の配列を含む順方向プライマー、
e)配列番号17のDNA配列を含むアレルゲン−DNAコンジュゲート、配列番号18のDNA配列を含む抗IgG4抗体−DNAコンジュゲート、配列番号21のヌクレオチド配列を含む架橋オリゴヌクレオチド、配列番号19のヌクレオチド配列を含む逆方向プライマーおよび配列番号20の配列を含む順方向プライマー、
f)配列番号1のDNA配列を含む抗IgG4抗体−DNAコンジュゲート、配列番号2のDNA配列を含むアレルゲン−DNAコンジュゲート、配列番号21のヌクレオチド配列を含む架橋オリゴヌクレオチド、配列番号3のヌクレオチド配列を含む逆方向プライマー、および配列番号4の配列を含む順方向プライマー、
g)配列番号5のDNA配列を含む抗IgG4抗体−DNAコンジュゲート、配列番号6のDNA配列を含むアレルゲン−DNAコンジュゲート、配列番号21のヌクレオチド配列を含む架橋オリゴヌクレオチド、配列番号7のヌクレオチド配列を含む逆方向プライマー、および配列番号8の配列を含む順方向プライマー、
h)配列番号9のDNA配列を含む抗IgG4抗体−DNAコンジュゲート、配列番号10のDNA配列を含むアレルゲン−DNAコンジュゲート、配列番号21のヌクレオチド配列を含む架橋オリゴヌクレオチド、配列番号11のヌクレオチド配列を含む逆方向プライマー、および配列番号12の配列を含む順方向プライマー、
i)配列番号13のDNA配列を含む抗IgG4抗体−DNAコンジュゲート、配列番号14のDNA配列を含むアレルゲン−DNAコンジュゲート、配列番号21のヌクレオチド配列を含む架橋オリゴヌクレオチド、配列番号15のヌクレオチド配列を含む逆方向プライマー、および配列番号16の配列を含む順方向プライマー、ならびに
j)配列番号17のDNA配列を含む抗IgG4抗体−DNAコンジュゲート、配列番号18のDNA配列を含むアレルゲン−DNAコンジュゲート、配列番号21のヌクレオチド配列を含む架橋オリゴヌクレオチド、配列番号19のヌクレオチド配列を含む逆方向プライマー、および配列番号20の配列を含む順方向プライマー、からなる群から選択される少なくとも一組の試薬を用いてISAPを実施することをさらに含む、請求項49に記載の方法。 - 請求項40に記載の方法に従って試料中のピーナッツアレルゲン抗体を検出するための方法であって、前記ADAPの前記実施が、前記試料中の総抗Ara h1抗体レベルを検出するために、一対のAra h1−DNAコンジュゲートを用いることと、前記試料中の総抗Ara h2抗体レベルを検出するために、一対のAra h2−DNAコンジュゲートを用いることと、前記試料中の総抗Ara h3抗体レベルを検出するために、一対のAra h3−DNAコンジュゲートを用いることと、を含む、方法。
- 前記ISAPの前記実施が、前記試料中のAra h1特異的IgEレベルを検出するために、少なくとも1つの抗IgE抗体−DNAコンジュゲートと組み合わせたAra h1−DNAコンジュゲートと、前記試料中のAra h2特異的IgEレベルを検出するために、少なくとも1つの抗IgE抗体−DNAコンジュゲートと組み合わせたAra h2−DNAコンジュゲートと、前記試料中のAra h3特異的IgEレベルを検出するために、少なくとも1つの抗IgE抗体−DNAコンジュゲートと組み合わせたAra h3−DNAコンジュゲートと、を用いることを含む、請求項51に記載の方法。
- 前記ISAPの前記実施が、前記試料中のAra h1特異的IgG4レベルを検出するために、少なくとも1つの抗IgG4抗体−DNAコンジュゲートと組み合わせたAra h1−DNAコンジュゲートと、前記試料中のAra h2特異的IgG4レベルを検出するために、少なくとも1つの抗IgG4抗体−DNAコンジュゲートと組み合わせたAra h2−DNAコンジュゲートと、前記試料中のAra h3特異的IgG4レベルを検出するために、少なくとも1つの抗IgG4抗体−DNAコンジュゲートと組み合わせたAra h3−DNAコンジュゲートと、を用いることをさらに含む、請求項52に記載の方法。
- a)前記PLAが、前記試料中の総IgEレベルを検出するために、配列番号1のDNA配列を含む第1の抗IgE抗体−DNAコンジュゲート、配列番号2のDNA配列を含む第2の抗IgE抗体−DNAコンジュゲート、配列番号21のヌクレオチド配列を含む架橋オリゴヌクレオチド、配列番号3のヌクレオチド配列を含む逆方向プライマー、および配列番号4の配列を含む順方向プライマーを用いて実施され、
b)前記ADAPが、i)前記試料中の総抗Ara h1抗体レベルを検出するために、配列番号5のDNA配列を含む第1のAra h1−DNAコンジュゲート、配列番号6のDNA配列を含む第2のAra h1−DNAコンジュゲート、配列番号21のヌクレオチド配列を含む架橋オリゴヌクレオチド、配列番号7のヌクレオチド配列を含む逆方向プライマー、および配列番号8の配列を含む順方向プライマー、ii)前記試料中の総抗Ara h2抗体レベルを検出するために、配列番号9のDNA配列を含む第1のAra h2−DNAコンジュゲート、配列番号10のDNA配列を含む第2のAra h2−DNAコンジュゲート、配列番号21のヌクレオチド配列を含む架橋オリゴヌクレオチド、配列番号11のヌクレオチド配列を含む逆方向プライマー、および配列番号12の配列を含む順方向プライマー、ならびにiii)前記試料中の総抗Ara h3抗体レベルを検出するために、配列番号13のDNA配列を含む第1のAra h3−DNAコンジュゲート、配列番号14のDNA配列を含む第2のAra h3−DNAコンジュゲート、配列番号21のヌクレオチド配列を含む架橋オリゴヌクレオチド、配列番号15のヌクレオチド配列を含む逆方向プライマー、および配列番号16の配列を含む順方向プライマー、を用いて実施され、
c)前記ISAPが、i)前記試料中のAra h1特異的レベルIgEを検出するために、配列番号5のDNA配列を含むAra h1−DNAコンジュゲート、配列番号2のDNA配列を含む抗IgE抗体−DNAコンジュゲート、配列番号21のヌクレオチド配列を含む架橋オリゴヌクレオチド、配列番号3のヌクレオチド配列を含む逆方向プライマー、および配列番号8の配列を含む順方向プライマー、ii)前記試料中のAra h2特異的レベルIgEを検出するために、配列番号9のDNA配列を含むAra h2−DNAコンジュゲート、配列番号2のDNA配列を含む抗IgE抗体−DNAコンジュゲート、配列番号21のヌクレオチド配列を含む架橋オリゴヌクレオチド、配列番号3のヌクレオチド配列を含む逆方向プライマー、および配列番号12の配列を含む順方向プライマー、iii)前記試料中のAra h3特異的レベルIgEを検出するために、配列番号13のDNA配列を含むAra h3−DNAコンジュゲート、配列番号2のDNA配列を含む抗IgE抗体−DNAコンジュゲート、配列番号21のヌクレオチド配列を含む架橋オリゴヌクレオチド、配列番号3のヌクレオチド配列を含む逆方向プライマー、および配列番号16の配列を含む順方向プライマー、iv)前記試料中のAra h1特異的レベルIgG4を検出するために、配列番号5のDNA配列を含むAra h1−DNAコンジュゲート、配列番号18のDNA配列を含む抗IgG4抗体−DNAコンジュゲート、配列番号21のヌクレオチド配列を含む架橋オリゴヌクレオチド、配列番号19のヌクレオチド配列を含む逆方向プライマー、および配列番号8の配列を含む順方向プライマー、v)前記試料中のAra h2特異的IgG4レベルを検出するために、配列番号9のDNA配列を含むAra h2−DNAコンジュゲート、配列番号18のDNA配列を含む抗IgG4抗体−DNAコンジュゲート、配列番号21のヌクレオチド配列を含む架橋オリゴヌクレオチド、配列番号19のヌクレオチド配列を含む逆方向プライマー、および配列番号12の配列を含む順方向プライマー、ならびにvi)前記試料中のAra h3特異的IgG4レベルを検出するために、配列番号13のDNA配列を含むAra h3−DNAコンジュゲート、配列番号18のDNA配列を含む抗IgG4抗体−DNAコンジュゲート、配列番号21のヌクレオチド配列を含む架橋オリゴヌクレオチド、配列番号19のヌクレオチド配列を含む逆方向プライマー、および配列番号16の配列を含む順方向プライマー、を用いて実施される、請求項53に記載の方法。 - a)総IgEレベルを検出するために、配列番号1のDNA配列を含む第1の抗IgE抗体−DNAコンジュゲート、配列番号2のDNA配列を含む第2の抗IgE抗体−DNAコンジュゲート、配列番号21のヌクレオチド配列を含む架橋オリゴヌクレオチド、配列番号3のヌクレオチド配列を含む逆方向プライマー、および配列番号4の配列を含む順方向プライマーを含む、PLAを実施するための試薬と、
b)i)総抗Ara h1抗体レベルを検出するために、配列番号5のDNA配列を含む第1のAra h1−DNAコンジュゲート、配列番号6のDNA配列を含む第2のAra h1−DNAコンジュゲート、配列番号21のヌクレオチド配列を含む架橋オリゴヌクレオチド、配列番号7のヌクレオチド配列を含む逆方向プライマー、および配列番号8の配列を含む順方向プライマー、ii)総抗Ara h2抗体レベルを検出するために、配列番号9のDNA配列を含む第1のAra h2−DNAコンジュゲート、配列番号10のDNA配列を含む第2のAra h2−DNAコンジュゲート、配列番号21のヌクレオチド配列を含む架橋オリゴヌクレオチド、配列番号11のヌクレオチド配列を含む逆方向プライマー、および配列番号12の配列を含む順方向プライマー、ならびにiii)総抗Ara h3抗体レベルを検出するために、配列番号13のDNA配列を含む第1のAra h3−DNAコンジュゲート、配列番号14のDNA配列を含む第2のAra h3−DNAコンジュゲート、配列番号21のヌクレオチド配列を含む架橋オリゴヌクレオチド、配列番号15のヌクレオチド配列を含む逆方向プライマー、および配列番号16の配列を含む順方向プライマーを含む、ADAPを実施するための試薬と、
c)i)Ara h1特異的IgEレベルを検出するために、配列番号5のDNA配列を含むAra h1−DNAコンジュゲート、配列番号2のDNA配列を含む抗IgE抗体−DNAコンジュゲート、配列番号21のヌクレオチド配列を含む架橋オリゴヌクレオチド、配列番号3のヌクレオチド配列を含む逆方向プライマー、および配列番号8の配列を含む順方向プライマー、ii)Ara h2特異的IgEレベルを検出するために、配列番号9のDNA配列を含むAra h2−DNAコンジュゲート、配列番号2のDNA配列を含む抗IgE抗体−DNAコンジュゲート、配列番号21のヌクレオチド配列を含む架橋オリゴヌクレオチド、配列番号3のヌクレオチド配列を含む逆方向プライマー、および配列番号12の配列を含む順方向プライマー、iii)Ara h3特異的IgEレベルを検出するために、配列番号13のDNA配列を含むAra h3−DNAコンジュゲート、配列番号2のDNA配列を含む抗IgE抗体−DNAコンジュゲート、配列番号21のヌクレオチド配列を含む架橋オリゴヌクレオチド、配列番号3のヌクレオチド配列を含む逆方向プライマー、および配列番号16の配列を含む順方向プライマー、iv)Ara h1特異的IgG4レベルを検出するために、配列番号5のDNA配列を含むAra h1−DNAコンジュゲート、配列番号18のDNA配列を含む抗IgG4抗体−DNAコンジュゲート、配列番号21のヌクレオチド配列を含む架橋オリゴヌクレオチド、配列番号19のヌクレオチド配列を含む逆方向プライマー、および配列番号8の配列を含む順方向プライマー、v)前記試料中のAra h2特異的IgG4レベルを検出するために、配列番号9のDNA配列を含むAra h2−DNAコンジュゲート、配列番号18のDNA配列を含む抗IgG4抗体−DNAコンジュゲート、配列番号21のヌクレオチド配列を含む架橋オリゴヌクレオチド、配列番号19のヌクレオチド配列を含む逆方向プライマー、および配列番号12の配列を含む順方向プライマー、ならびにvi)Ara h3特異的IgG4レベルを検出するために、配列番号13のDNA配列を含むAra h3−DNAコンジュゲート、配列番号18のDNA配列を含む抗IgG4抗体−DNAコンジュゲート、配列番号21のヌクレオチド配列を含む架橋オリゴヌクレオチド、配列番号19のヌクレオチド配列を含む逆方向プライマー、および配列番号16の配列を含む順方向プライマーを含む、ISAPを実施するための試薬と、を含む、組成物。 - 請求項55に記載の組成物と、アレルゲン抗体を検出するための取扱説明書と、を含む、キット。
- リガーゼをさらに含む、請求項56に記載のキット。
- PCRを実施するための試薬をさらに含む、請求項56に記載のキット。
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