WO2015025866A1 - 肺がんで見出された新規融合遺伝子 - Google Patents

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隆志 河野
幸治 蔦
和基 安田
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独立行政法人国立がん研究センター
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    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/10—Screening for compounds of potential therapeutic value involving cells

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting a gene fusion that is a responsible mutation of cancer, and a cancer patient in which a substance that suppresses the expression and / or activity of a polypeptide encoded by a fusion polynucleotide generated by the gene fusion has a therapeutic effect.
  • the present invention relates to a method for identifying a subject having a cancer risk.
  • lung cancer is the leading cause of death in Japan, and there is a need for improved treatment.
  • lung cancer is the leading cause of cancer death not only in Japan but also in the world, and causes more than 1 million deaths annually.
  • Lung cancer is broadly divided into small cell lung cancer and non-small cell lung cancer, and non-small cell lung cancer is further divided into three types: lung adenocarcinoma (LADC), lung squamous cell carcinoma, and large cell cancer. .
  • LADC lung adenocarcinoma
  • lung squamous cell carcinoma lung squamous cell carcinoma
  • large cell cancer large cell cancer.
  • Non-patent Document 1 Non-patent Document 1
  • Advanced lung cancer is mainly treated with drugs, but the responsiveness to drugs varies greatly in individual cases, so a means for predicting which drugs have therapeutic effects is required. Therefore, as described above, identification of molecules that can serve as predictive indicators such as mutant genes and fusion genes has been promoted.
  • tyrosine kinase inhibitors targeting EGFR and ALK proteins have EGFR mutation and ALK fusion. It has been shown to be particularly effective in the treatment of lung adenocarcinoma.
  • a method for detecting fusion of ALK tyrosine kinase genes present in 4-5% of lung cancer was developed as a method for selecting inhibitors for inhibitors of ALK protein to tyrosine kinases. Reagents are used in clinical settings as diagnostic agents.
  • KIF5B kinesin family 5B
  • RET RET gene
  • KIF5B-RET gene fusion was shown to be a responsible mutation in carcinogenesis because it occurred mutually exclusively with known oncogene activation mutations such as EGFR mutation, KRAS mutation, and ALK fusion.
  • RET tyrosine kinase inhibitors are expected to be effective in patients with the gene fusion.
  • the present inventors have used EZR-ERBB4, KIAA1468-RET, TRIM24-BRAF, CD74-NRG1, and SLC3A2 using all transcriptome sequencing techniques. -We found that NRG1 gene fusions exist independently in lung cancer.
  • EGFR point mutation / in-frame deletion mutation EGFR point mutation, EGFR in-flame deletion mutation
  • KRAS point mutation KRAS point mutation
  • BRAF point mutation BRAF point mutation
  • HER2 in-frame insertion mutation HER2 in-flame insertion mutation
  • EML4-ALK gene fusion EML4-ALK gene fusion
  • KIF5B-RET gene fusion KIF5B-RET fusion
  • CCDC6-RET fusion CCDC6- Negative for RET gene fusion
  • CD74-ROS1 gene fusion CD74-ROS1 fusion
  • EZR-ROS1 gene fusion EZR-ROS1 gene fusion
  • SLC34A2-ROS1 gene fusion SLC34A2-ROS1 gene fusion
  • the protein produced by EZR-ERBB4 and KIAA1468-RET gene fusion is similar to the known membrane-type tyrosine kinase fusion protein (Kohno, T. et al., Nat Medicine, 2012, 18 (3), 375-377), It was presumed that dimerization without substrate and constitutive activation occurred via the coiled-coil domain.
  • the protein produced by TRIM24-BRAF gene fusion is similar to other BRAF fusion genes (Palanisamy, N. et al., Nat Medicine, 2010, 16 (7), 793-798) that have already been identified. It was presumed that constitutive activation was caused by the absence of the kinase inhibitory domain present on the N-terminal side of. Therefore, ERBB4 kinase, RET kinase, and BRAF kinase inhibitors are considered to have therapeutic effects on these gene fusion positive cancers, respectively.
  • Proteins generated by CD74-NRG1 and SLC3A2-NRG1 gene fusions are the NRG1 fusion proteins identified so far (Adelaide, J. et al., GENES, CHROMOSOMES & GANCER, 2003, 37, 333-345 and Wilson, TR et al., Cancer Cell, 2011, 20, 158-172), it was presumed to be highly expressed by fusion and to work positively on cell proliferation and survival by autocrine mechanism. Therefore, for the gene fusion-positive cancer, an antibody drug against the cell growth factor NRG1 or an antibody drug or kinase inhibitor against the HER protein group which is a receptor thereof can bring about a therapeutic effect.
  • the present inventors have conducted further research, and in cancers such as lung cancer, based on the gene fusion, a drug that targets the gene or a protein encoded by the drug has a therapeutic effect.
  • the present inventors have found that it is possible to identify a patient having a risk of cancer or a subject having a risk of cancer, and have completed the present invention.
  • fusion polynucleotide is any of the following (a) to (e): (A) EZR-ERBB4 fusion polynucleotide encoding the following polypeptide: (I) a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, (Ii) a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added, and having kinase activity, or (iii) a sequence A polypeptide comprising an amino acid sequence having 80% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by No.
  • polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4
  • polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added, and having kinase activity
  • sequence A polypeptide comprising an amino acid sequence having 80% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by No.
  • TRIM24-BRAF fusion polynucleotide encoding the following polypeptide: (I) a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6, (Ii) a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6, consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added, and having kinase activity, or (iii) a sequence A polypeptide comprising an amino acid sequence having 80% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by No.
  • CD74-NRG1 fusion polynucleotide encoding the following polypeptide: (I) a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8 or 10, (Ii) a polypeptide comprising an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8 or 10, comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added, and having an activity of enhancing intracellular signal transduction; A peptide, or (iii) a polypeptide comprising an amino acid sequence having 80% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8 or 10, and having an activity of enhancing intracellular signal transduction; and (e) SLC3A2-NRG1 fusion polynucleotide encoding the polypeptide: (I) a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 36, (Ii) a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 36, comprising
  • the fusion polynucleotide is any of the following (a) to (e): (A) (i) a polynucleotide comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, (Ii) a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide consisting of a base sequence complementary to the polynucleotide consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 and encodes a polypeptide having kinase activity, (Iii) a polynucleotide comprising a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1, consisting of a nucleotide sequence in which one or more nucleotides have been deleted, substituted or added, and encoding a polypeptide having kinase activity, Or (iv) a polynucleotide encoding a polypeptide having a sequence identity of 80% or
  • Cancer patients or cancer patients whose substances that suppress the expression and / or activity of a polypeptide encoded by a fusion polynucleotide generated by gene fusion that is a responsible mutation (driver mutation) of cancer have a therapeutic effect
  • a method for identifying a subject at risk comprising the following steps: (1) Detecting a fusion polynucleotide of any of the following (a) to (e) or a polypeptide encoded thereby in an isolated sample derived from a subject: (A) an EZR-ERBB4 fusion polynucleotide, wherein the polynucleotide comprises the whole or a part of the coiled-coil domain of EZR and the kinase domain of ERBB4 and encodes a polypeptide having kinase activity; (B) a KIAA1468-RET fusion polynucleotide,
  • a kit for detecting gene fusion that is a responsible mutation (driver mutation) for cancer comprising any of the following (A) to (C) or a combination thereof:
  • An isolated EZR-ERBB4 fusion polypeptide or fragment thereof comprising all or part of the coiled-coil domain of EZR protein and the kinase domain of ERBB4 protein and having kinase activity.
  • An isolated KIAA1468-RET fusion polypeptide or fragment thereof comprising all or part of the coiled-coil domain of KIAA1468 protein and the kinase domain of RET protein and having kinase activity.
  • An isolated TRIM24-BRAF fusion polypeptide comprising a kinase domain of BRAF protein and having kinase activity, or a fragment thereof.
  • An isolated CD74-NRG1 fusion polypeptide or fragment thereof comprising the transmembrane domain of CD74 protein and the EGF domain of NRG1 protein and having an activity of enhancing intracellular signal transduction.
  • An isolated SLC3A2-NRG1 fusion polypeptide or fragment thereof comprising the transmembrane domain of SLC3A2 protein and the EGF domain of NRG1 protein and having an activity of enhancing intracellular signal transduction.
  • a method for treating cancer wherein the expression and / or activity of a polypeptide encoded by a fusion polynucleotide generated by gene fusion that is a responsible mutation (driver mutation) of cancer by the method described in [5]
  • a method for screening a cancer therapeutic agent comprising the following steps: (1) contacting the test substance with a cell expressing the fusion polypeptide according to any one of [7] to [11]; (2) determining whether the expression and / or activity of the fusion polypeptide is suppressed; and (3) treating the substance determined to suppress the expression and / or activity of the fusion polypeptide with cancer treatment. The process of selecting as an agent.
  • the present invention it becomes possible to detect an unknown responsible mutation of a specific cancer that has been clarified for the first time by the present invention, and a cancer patient in which cancer treatment based on the presence of the responsible mutation is effective or It becomes possible to identify a subject who has a risk of cancer and to treat the cancer patient.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing an example of the domain structure of EZR-ERBB4, KIAA1468-RET, TRIM24-BRAF and CD74-NRG1 fusion proteins.
  • the down arrow indicates the fusion point.
  • Figure 2 shows the results of RT-PCR detection of each gene fusion of EZR-ERBB4, KIAA1468-RET, TRIM24-BRAF, and CD74-NRG1 variant 2 using cDNA synthesized from cancer tissue-derived RNA as a template. It is a photograph of.
  • a downward arrow indicates a gene fusion positive example. Transformation of NIH3T3 cells expressing CD74-NRG1, EZR-ERBB4, or TRIM24-BRAF cDNAs.
  • FIG. 1 (B) Photomicrograph of colony growth independent of anchorage of NIH3T3 cells induced by expression of CD74-NRG1 (C8; N6), EZR-ERBB4, or TRIM24-BRAF cDNAs. Scale bar, 100 ⁇ m. Gene fusion that leads to canceration in invasive mucinous lung adenocarcinoma. Schematic of newly identified fusion protein with wild type protein. The cutting point is indicated by an arrow. TM: transmembrane domain. The position of the predicted cleavage site in the NRG1 polypeptide is indicated by a broken line. Detection of gene fusion transcripts by RT-PCR.
  • RT-PCR product of glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase is shown below.
  • Six cases of gene fusion positive IMA (T) are shown side by side with their corresponding non-cancer lung tissue (N); the label below the gel image represents the sample ID (see Table 4).
  • CD74-NRG1 two variant forms
  • SLC3A2-NRG1, EZR-ERBB4, TRIM24-BRAF and KIAA1468-RET fusion.
  • RT-PCR products were directly sequenced. Schematic of genomic organization for NRG1, ERBB4, BRAF, and RET rearrangements.
  • Wild type and fusion including exons and untranslated regions for CD74-NRG1 (A), SLC3A2-NRG1 (B), EZR-ERBB4 (C), TRIM24-BRAF (D), and KIAA1468-RET (F) fusions
  • A CD74-NRG1
  • B SLC3A2-NRG1
  • B EZR-ERBB4
  • C TRIM24-BRAF
  • D KIAA1468-RET
  • F KIAA1468-RET
  • FISH Break-apart fluorescence in situ hybridization
  • A Genomic organization of the NRG1 gene and the position of the BAC clone used as a probe.
  • B Normal tissue.
  • C IMA with CD74-NRG1 fusion.
  • FISH revealed the separation of green fluorescence (telomere side) and orange fluorescence (centromere side) from the two probes adjacent to the translocation site. Representative histological image obtained from fusion positive IMA. Immunostaining was performed using an antibody that recognizes the polypeptide retained in the fusion protein.
  • A (Upper) IMA with NRG1 reconstruction.
  • Tumors consisted of highly cylindrical cells with fine eosin-favorable cytoplasm and varying amounts of mucin. Nuclear enlargement with fine granular chromatin and nuclear misalignment is seen (original magnification, x20).
  • (B) (Upper) IMA with ERBB4 reconstruction The tumor consisted of high columnar cells with small nuclei located at the base and mucins in the upper part of the cytoplasm (original magnification, x20).
  • There is an emphasis on the plasma membrane with cytoplasmic staining original magnification, x40.
  • ERBB4 staining in fusion-negative IMA original magnification, x40. In> 50% of cases, cytoplasmic staining without membrane enhancement was observed.
  • C (Upper) IMA with BRAF reconstruction.
  • the tumor was composed of highly cylindrical cells with condensed eosin-loving mucins. Nuclei enlargement and nuclear overlap are seen (original magnification, x20).
  • ERBB3, ERBB2, AKT, and ERK were examined in EFM-19 (reporter) cells treated with conditioned medium from H1299 cells exogenously expressing CD74-NRG1 cDNA for 30 minutes.
  • HER-TKI inhibited phosphorylation.
  • B ERBB4 activation by EZR-ERBB4 fusion.
  • Stably transduced NIH3T3 cells were serum starved for 24 hours and treated with DMSO (vehicle control) or TKI for 2 hours.
  • ERBB4 and ERK phosphorylation was suppressed by ERBB4-TKI.
  • the fusion protein was detected using an antibody that recognizes the ERBB4 polypeptide retained in the EZR-ERBB4 fusion protein.
  • BRAF activation by TRIM24-BRAF fusion BRAF activation by TRIM24-BRAF fusion.
  • Stably transduced NIH3T3 cells were serum starved for 24 hours and treated with DMSO or kinase inhibitors for 2 hours.
  • ERK phosphorylation (activation) was suppressed by sorafenib, a kinase inhibitor targeting BRAF, as well as by U0126, a MEK inhibitor.
  • the fusion protein was detected using an antibody that recognizes the BRAF polypeptide retained in the TRIM24-BRAF fusion protein.
  • NIH3T3 cells expressing DF, CD74-NRG1 (D), EZR-ERBB4 (E), or TRIM24-BRAF (F) cDNA and its suppression by kinase inhibitors.
  • Mock-, CD74-NRG1-, EZR-ERBB4-, and TRIM24-BRAF-transduced NIH3T3 cells were seeded in soft agar containing DMSO alone or kinase inhibitors. After 14 days, colonies with diameters> 100 ⁇ m were counted. The bar graph shows the mean number of colonies ⁇ S.E.M.
  • Tumor-forming ability of NIH3T3 cells expressing ERZ-ERBB4 or TRIM24-BRAF fusion cDNA Tumor growth in nude mice injected with NIH3T3 cells expressing empty vector, EZR-ERBB4 fusion, or TRIM24-BRAF fusion. Cells were resuspended in 50% Matrigel and injected into the right flank of nude mice. Tumor size was measured twice a week for 5 weeks. Data are shown as mean ⁇ S.E.M.
  • B On day 21, representative tumors were photographed. The numbers in parentheses represent the ratio of the number of mice with tumors to the number of mice that received cell injections. Pie chart showing percentage of IMA with displayed driver mutations.
  • the present inventors have identified five gene fusions as cancer responsible mutations (driver mutations) in cancer tissues, namely, EZR-ERBB4 gene fusion, KIAA1468-RET gene fusion, TRIM24- We found BRAF gene fusion, CD74-NRG1 gene fusion, and SLC3A2-NRG1 gene fusion for the first time. Based on such findings, the present invention provides a method for detecting the gene fusion, a method for identifying a cancer patient or a subject having a cancer risk that is effective for cancer treatment based on the presence of the responsible mutation, and a method for treating cancer. Also provided are cancer therapeutic agents, screening methods for cancer therapeutic agents, and the like.
  • “responsible mutation of cancer” is a term used interchangeably with driver mutation, and refers to a mutation that exists in cancer tissue and has a cancer-causing ability for cells.
  • known oncogene mutations at least EGFR point mutation / in-frame deletion mutation, KRAS point mutation, BRAF point mutation, HER2 in-frame insertion mutation, ALK-EML4 gene fusion, KIF5B-RET gene fusion, CCDC6-RET gene fusion, CD74-ROS1 gene fusion, EZR-ROS1 gene fusion and SLC34A2-ROS1 gene fusion
  • the mutations are mutually exclusive with the oncogene mutations in (2), it can be said that the mutations are responsible for cancer mutations.
  • the “fusion point” in the fusion polynucleotide means a boundary where the 5 ′ gene portion and the 3 ′ gene portion are connected, and this is a boundary between two nucleotide residues. It is a boundary.
  • the “fusion point” in the fusion polypeptide means a boundary where the N-terminal polypeptide and the C-terminal polypeptide are connected, and is this a boundary between two amino acid residues, Or, if the gene fusion occurs within one codon, it is the single amino acid residue itself encoded by that codon.
  • EZR-ERBB4 gene fusion This gene fusion is a mutation that causes the expression of a fusion protein of EZR protein and ERBB4 protein (hereinafter also referred to as EZR-ERBB4 fusion polypeptide).
  • EZR-ERBB4 fusion polypeptide a fusion protein of EZR protein and ERBB4 protein
  • human chromosome the region of 6q25 and 2q34 It is a mutation caused by a translocation (t (2; 6)) with a breakpoint inside.
  • EZR protein is a protein encoded by a gene present in 6q25 in human, and typically consists of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20 (NCBI accession number NP_001104547.1 (09-JUN-2013))
  • the EZR protein is characterized by having a coiled-coil domain (FIG. 1), and this domain is located at positions 300 to 550 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20 in humans. Corresponds to the amino acid sequence.
  • ERBB4 protein is a protein encoded by a gene present in 2q34 in human, and typically consists of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 22 (NCBI accession number NP_001036064.1 (15-JUN-2013))
  • the ERBB4 protein is characterized by having a kinase domain (FIG. 1), and corresponds to the amino acid sequence at positions 708 to 964 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 22 for humans.
  • a furin-like repeat and a transmembrane domain exist on the N-terminal side of the kinase domain.
  • the EZR-ERBB4 fusion polypeptide is a polypeptide that contains all or part of the coiled coil domain of the EZR protein and the kinase domain of the ERBB4 protein and has kinase activity.
  • the EZR-ERBB4 fusion polypeptide may contain the entire coiled coil domain of the EZR protein, or may contain a part of the coiled coil domain as long as the EZR-ERBB4 fusion polypeptide can be dimerized. Whether or not the EZR-ERBB4 fusion polypeptide is dimerized can be confirmed by a known method such as gel filtration chromatography, a combination of a crosslinking agent treatment and SDS-polyacrylamide gel electrophoresis.
  • the EZR-ERBB4 fusion polypeptide may contain the entire kinase domain of the ERBB4 protein, or may contain a part of the kinase domain as long as the EZR-ERBB4 fusion polypeptide has kinase activity.
  • the EZR-ERBB4 fusion polypeptide has“ kinase activity ”means that it has activity as an enzyme that phosphorylates tyrosine due to the kinase domain derived from ERBB4 protein.
  • the kinase activity of the EZR-ERBB4 fusion polypeptide is measured by a conventional method, and after incubation with a substrate (such as a synthetic peptide substrate) and ATP under appropriate conditions, phosphorylated tyrosine of the substrate is detected. Moreover, it can also measure using a commercially available measurement kit.
  • the EZR-ERBB4 fusion polypeptide may contain all or part of the furin-like repeat and transmembrane domain of the ERBB4 protein, but preferably does not contain it.
  • EZR-ERBB4 fusion polypeptides dimerize through the coiled-coil domain present on the N-terminal side, autophosphorylate, and constitutively activate. This is thought to contribute to
  • a polynucleotide encoding an EZR-ERBB4 fusion polypeptide (hereinafter also referred to as EZR-ERBB4 fusion polynucleotide) contains all or part of the coiled-coil domain of EZR protein and the kinase domain of ERBB4 protein and has kinase activity
  • a polynucleotide encoding a polypeptide having The EZR-ERBB4 fusion polynucleotide may be any of mRNA, cDNA and genomic DNA.
  • the EZR-ERBB4 fusion polynucleotide in the present invention can be, for example, an EZR-ERBB4 fusion polynucleotide encoding the following polypeptide: (I) a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, (Ii) a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added, and having kinase activity, or (iii) a sequence A polypeptide comprising an amino acid sequence having 80% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by No. 2 and having kinase activity.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is an amino acid sequence encoded by an EZR-ERBB4 fusion polynucleotide found in a sample derived from human cancer tissue, as shown in Examples described later.
  • the fusion point is located at Arg at position 448.
  • the “one or more amino acids” is usually 1 to 50, preferably 1 to 30, more preferably 1 to 10, even more preferably 1 to several (for example, 1 ⁇ 5, 1-4, 1-3, 1 or 2, or 1) amino acids.
  • sequence identity is preferably 85% or more, more preferably 90% or more, 95% or more, even more preferably 97% or more, 98% or more, 99% or more.
  • Amino acid sequence identity is called BLASTX or BLASTP based on the algorithm BLAST (Proc. ⁇ ⁇ ⁇ Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264-2268, 1990, Proc Natl Acad Sci USA 90: 5873, 1993) by Carlin and Arthur It can be determined using the program (Altschul SF, et al: J Mol Biol 215: 403, 1990).
  • the EZR-ERBB4 fusion polynucleotide in the present invention can be, for example, any of the following polynucleotides: (I) a polynucleotide comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, (Ii) a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide consisting of a base sequence complementary to the polynucleotide consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 and encodes a polypeptide having kinase activity, (Iii) a polynucleotide comprising a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1, consisting of a nucleotide sequence in which one or more nucleotides have been deleted, substituted or added, and encoding a polypeptide having kinase activity, Or (iv) a polynucleotide encoding a polypeptide having a sequence identity of 80% or more with
  • the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 is the base sequence of the EZR-ERBB4 fusion polynucleotide found in a sample derived from human cancer tissue, as shown in the Examples described later.
  • the fusion point is located between guanine at position 1524 and guanine at position 1525.
  • stringent conditions refers to moderately or highly stringent conditions unless otherwise specified.
  • the moderately stringent conditions can be easily designed by those skilled in the art based on, for example, the length of the target polynucleotide.
  • the basic conditions are shown in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Edition, Chapters 6-7, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001.
  • moderately stringent conditions for nitrocellulose filters are 5 ⁇ SSC, 0.5% SDS, 1.0 mM EDTA (pH 8.0) prewash conditions; about 50-50 ° C. at about 50-50 ° C.
  • the moderately stringent conditions preferably include hybridization conditions of about 50 ° C. and 6 ⁇ SSC, and may include the aforementioned washing conditions and / or washing conditions.
  • High stringent conditions can also be easily designed by those skilled in the art based on, for example, the length of the target polynucleotide.
  • High stringency conditions include higher temperatures and / or lower salt concentrations than moderately stringent conditions.
  • hybridization conditions of about 65 ° C., 0.2-6 ⁇ SSC, preferably 6 ⁇ SSC, more preferably 2 ⁇ SSC, and even more preferably 0.2 ⁇ SSC are included.
  • cleaning conditions of about 65 to 68 ° C., 0.2 ⁇ SSC, and 0.1% SDS.
  • SSPE (1 ⁇ SSPE is 0.15 in place of SSC (1 ⁇ SSC is 0.15 ⁇ M NaCl and 15 ⁇ mM sodium citrate)) as a buffer for hybridization, pre-washing and washing.
  • washing can be performed for about 15 minutes after hybridization is complete.
  • the “one or more nucleotides” usually means 1 to 50, preferably 1 to 30, more preferably 1 to 10, even more preferably 1 to several (for example, 1 ⁇ 5, 1-4, 1-3, 1 or 2, or 1) nucleotides.
  • sequence identity is preferably 85% or more, more preferably 90% or more, 95% or more, even more preferably 97% or more, 98% or more, 99% or more.
  • KIAA1468-RET gene fusion is a mutation that causes the expression of a fusion protein of KIAA1468 protein and RET protein (hereinafter also referred to as KIAA1468-RET fusion polypeptide), and is a region of 18q21 and 10q11 in the human chromosome. It is a mutation caused by a translocation (t (10; 18)) with a breakpoint inside.
  • the KIAA1468 protein is a protein encoded by a gene present in 18q21 in humans, and typically consists of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 24 (NCBI accession number NP_065905.2 (17-APR-2013))
  • the KIAA1468 protein is characterized by having a coiled-coil domain (FIG. 1), and this domain corresponds to the amino acid sequence at positions 360 to 396 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 24 in humans. .
  • the RET protein is a protein encoded by a gene present in 10q11 in humans, and typically from the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 26 (NCBI accession number NP_066124.1 (07-JULY-2013)) It is a protein.
  • the RET protein is characterized by having a kinase domain (FIG. 1), and corresponds to the amino acid sequence at positions 723 to 1012 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 26 for humans.
  • a cadherin repeat and a transmembrane domain exist on the N-terminal side of the kinase domain.
  • KIAA1468-RET fusion polypeptide is a polypeptide that contains all or part of the coiled-coil domain of KIAA1468 protein and the kinase domain of RET protein and has kinase activity.
  • the KIAA1468-RET fusion polypeptide may include the entire coiled coil domain of the KIAA1468 protein, or may include a portion of the coiled coil domain as long as the KIAA1468-RET fusion polypeptide can be dimerized. Whether or not the KIAA1468-RET fusion polypeptide is dimerized can be confirmed by a known method such as gel filtration chromatography, a combination of a crosslinking agent treatment and SDS-polyacrylamide gel electrophoresis.
  • the KIAA1468-RET fusion polypeptide may contain the entire kinase domain of the RET protein, or may contain a part of the kinase domain as long as the KIAA1468-RET fusion polypeptide has kinase activity.
  • KIAA1468-RET fusion polypeptide has “kinase activity” means that it has activity as an enzyme that phosphorylates tyrosine due to the kinase domain derived from RET protein.
  • the kinase activity of the KIAA1468-RET fusion polypeptide is measured by a conventional method, and the phosphorylated tyrosine of the substrate is usually detected after incubation with a substrate (such as a synthetic peptide substrate) and ATP under appropriate conditions. Moreover, it can also measure using a commercially available measurement kit.
  • the KIAA1468-RET fusion polypeptide may contain all or part of the cadherin repeat and transmembrane domain of the RET protein, but preferably does not contain it.
  • KIAA1468-RET fusion polynucleotides dimerize through the coiled-coil domain present on the N-terminal side, autophosphorylate, and constitutively activate. This is thought to contribute to
  • the polynucleotide encoding KIAA1468-RET fusion polypeptide contains all or part of the coiled coil domain of KIAA1468 protein and the kinase domain of RET protein and has kinase activity.
  • a polynucleotide encoding a polypeptide having The KIAA1468-RET fusion polynucleotide may be any of mRNA, cDNA and genomic DNA.
  • the KIAA1468-RET fusion polynucleotide in the present invention can be, for example, a KIAA1468-RET fusion polynucleotide encoding the following polypeptide: (I) a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, (Ii) a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added, and having kinase activity, or (iii) a sequence A polypeptide comprising an amino acid sequence having 80% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by No. 4 and having kinase activity.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 is an amino acid sequence encoded by a KIAA1468-RET fusion polynucleotide found in a sample derived from human cancer tissue, as shown in Examples described later.
  • the fusion point is located between Glu at position 540 and Glu at position 541.
  • the KIAA1468-RET fusion polynucleotide in the present invention can be, for example, any of the following polynucleotides: (I) a polynucleotide comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 3, (Ii) a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide consisting of a base sequence complementary to the polynucleotide consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 and encodes a polypeptide having kinase activity, (Iii) a polynucleotide consisting of a base sequence represented by SEQ ID NO: 3, consisting of a base sequence in which one or more nucleotides are deleted, substituted or added, and encoding a polypeptide having kinase activity, Or (iv) a polynucleotide encoding a polypeptide having a sequence identity of 80% or more with the polynucleotide
  • the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 is the base sequence of the KIAA1468-RET fusion polynucleotide found in a sample derived from human cancer tissue, as shown in Examples described later.
  • the fusion point is located between guanine at position 1835 and guanine at position 1836.
  • TRIM24-BRAF gene fusion is a mutation that causes the expression of a fusion protein of TRIM24 protein and BRAF protein (hereinafter also referred to as TRIM24-BRAF fusion polypeptide).
  • regions 7q33 and 7q34 It is a mutation caused by an inversion (inv7) with a breakpoint inside.
  • TRIM24 protein is a protein encoded by a gene present in 7q33 in human, and typically consists of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 28 (NCBI accession number NP_003843.3 (17-APR-2013))
  • the TRIM24 protein is characterized by having a RING finger domain (FIG. 1), and this domain corresponds to the amino acid sequence at positions 56 to 82 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 28 in humans. To do.
  • the BRAF protein is a protein encoded by a gene present in 7q34 in human, and typically consists of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 30 (NCBI accession number NP_004324.2 (16-JUN-2013))
  • the BRAF protein is characterized by having a kinase domain (FIG. 1), and corresponds to the amino acid sequence at positions 457 to 717 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 30 for humans.
  • Raf-like Ras-binding domain (positions 155 to 227 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 22) exists as a kinase inhibitory domain on the N-terminal side of the kinase domain .
  • TRIM24-BRAF fusion polypeptide is a polypeptide that contains the kinase domain of BRAF protein and has kinase activity.
  • the TRIM24-BRAF fusion polypeptide may or may not contain all or part of the RING finger domain of the TRIM24 protein.
  • the TRIM24-BRAF fusion polypeptide may contain the entire kinase domain of the BRAF protein, or may contain a part of the kinase domain as long as the TRIM24-BRAF fusion polypeptide has kinase activity.
  • the TRIM24-BRAF fusion polypeptide has“ kinase activity ”means that it has activity as an enzyme that phosphorylates serine or threonine due to the kinase domain derived from BRAF protein.
  • the kinase activity of the TRIM24-BRAF fusion polypeptide is measured by a conventional method, and usually, after incubation with a substrate (such as a synthetic peptide substrate) and ATP under appropriate conditions, phosphorylated serine or threonine of the substrate is detected. Moreover, it can also measure using a commercially available measurement kit.
  • the EZR-ERBB4 fusion polypeptide preferably does not contain a Raf-like Ras-binding domain.
  • TRIM24-BRAF fusion polypeptide contributes to canceration by constitutive activation by eliminating the kinase inhibitory domain present on the N-terminal side of wild-type BRAF protein I think that.
  • a polynucleotide encoding a TRIM24-BRAF fusion polypeptide is a polynucleotide encoding a polypeptide containing the kinase domain of BRAF protein and having kinase activity.
  • the TRIM24-BRAF fusion polynucleotide may be any of mRNA, cDNA and genomic DNA.
  • the TRIM24-BRAF fusion polynucleotide in the present invention can be, for example, a TRIM24-BRAF fusion polynucleotide encoding the following polypeptide: (I) a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6, (Ii) a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6, consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added, and having kinase activity, or (iii) a sequence A polypeptide comprising an amino acid sequence having 80% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by No. 6 and having kinase activity.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 is an amino acid sequence encoded by a TRIM24-BRAF fusion polynucleotide found in a sample derived from human cancer tissue, as shown in Examples described later.
  • the fusion point is located at Arg at position 294.
  • the TRIM24-BRAF fusion polynucleotide in the present invention can be, for example, any of the following polynucleotides: (I) a polynucleotide comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 5, (Ii) a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide consisting of a base sequence complementary to the polynucleotide consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 5 and encodes a polypeptide having kinase activity, (Iii) a polynucleotide consisting of a base sequence represented by SEQ ID NO: 5, consisting of a base sequence in which one or more nucleotides are deleted, substituted or added, and encoding a polypeptide having kinase activity, Or (iv) a polynucleotide encoding a polypeptide having a sequence identity of 80% or more with a polynucleot
  • the base sequence represented by SEQ ID NO: 5 is the base sequence of a TRIM24-BRAF fusion polynucleotide found in a sample derived from human cancer tissue, as shown in the Examples described later.
  • the fusion point is located between guanine at the 1096th position and guanine at the 1097th position.
  • CD74-NRG1 gene fusion is a mutation that causes the expression of a fusion protein of CD74 protein and NRG1 protein (hereinafter also referred to as CD74-NRG1 fusion polypeptide), and is a region of 5q32 and 8p12 in the human chromosome. It is a mutation caused by a translocation (t (5; 8)) with a breakpoint inside.
  • CD74 protein is a protein encoded by a gene present in 5q32 in humans, and typically consists of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 32 (NCBI accession number NP_004346.1 (29-APR-2013))
  • the CD74 protein is characterized by having a transmembrane domain (FIG. 1), and this domain corresponds to the amino acid sequence at positions 47 to 72 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 32 in the case of humans. To do.
  • NRG1 protein is a protein encoded by a gene present in 8p12 in humans, and typically from the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 34 (NCBI accession number NP_001153477.1 (07-JUL-2013)) It is a protein.
  • the NRG1 protein is characterized by having an EGF domain (FIG. 1), and corresponds to the amino acid sequence at positions 143 to 187 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 34 for humans.
  • the CD74-NRG1 fusion polypeptide is a polypeptide containing a transmembrane domain of CD74 protein and an EGF domain of NRG1 protein and having an activity of enhancing intracellular signal transduction.
  • the CD74-NRG1 fusion polypeptide may contain all or part of the transmembrane domain of the CD74 protein.
  • the CD74-NRG1 fusion polypeptide may include the entire EGF domain of the NRG1 protein, or may include a part of the EGF domain as long as the CD74-NRG1 fusion polypeptide has an activity to enhance intracellular signal transduction. May be.
  • the CD74-NRG1 fusion polypeptide “has an activity to enhance intracellular signal transduction” means that it has an activity to enhance intracellular signal transduction due to the EGF domain derived from the NRG1 protein. This activity is measured by the following method described in Wilson, T.R. et al., Cancer Cell, 2011, 20, 158-172.
  • Test substance is added to EFM-19 cells (DSMZ, No. ACC-231) cultured without serum, treated for 30 minutes, EFM-19 cells are lysed, and protein is extracted.
  • EFM-19 cells DSMZ, No. ACC-2311
  • protein is extracted.
  • the test substance has the activity to enhance intracellular signal transduction. It is determined.
  • the entire CD74-NRG1 fusion polypeptide may be used, or a fragment thereof lacking the transmembrane domain and containing the EGF domain may be used in consideration of solubility and the like.
  • the CD74-NRG1 fusion polynucleotide is expressed at a higher level than the wild-type NRG1 protein, and by autocrine mechanism, it acts positively on the enhancement of intracellular signal transduction and survival. It is thought to contribute to canceration.
  • the polynucleotide encoding CD74-NRG1 fusion polypeptide contains the transmembrane domain of CD74 protein and the EGF domain of NRG1 protein and enhances intracellular signal transduction.
  • the CD74-NRG1 fusion polynucleotide may be any of mRNA, cDNA and genomic DNA.
  • the CD74-NRG1 fusion polynucleotide in the present invention can be, for example, a CD74-NRG1 fusion polynucleotide encoding the following polypeptide: (I) a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8 or 10, (Ii) a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8 or 10, consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added, and having an activity of enhancing intracellular signal transduction; Or (iii) a polypeptide comprising an amino acid sequence having 80% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8 or 10, and having an activity of enhancing intracellular signal transduction.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8 or 10 is an amino acid sequence encoded by a CD74-NRG1 fusion polynucleotide found in a sample derived from human cancer tissue, as shown in Examples described later.
  • the fusion point is located at Ala at position 230.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 is located at Ala at position 209.
  • the CD74-NRG1 fusion polynucleotide in the present invention can be, for example, any of the following polynucleotides: (I) a polynucleotide comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 7 or 9, (Ii) has an activity of hybridizing with a polynucleotide comprising a nucleotide sequence complementary to the polynucleotide comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 7 or 9 under stringent conditions and enhancing intracellular signal transduction A polynucleotide encoding the polypeptide, (Iii) a polynucleotide comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 7 or 9, comprising one or more nucleotides deleted, substituted or added, and having an activity of enhancing intracellular signal transduction It has 80% or more sequence identity with a polynucleotide encoding a polypeptide, or (iv) a polynucleot
  • the base sequence represented by SEQ ID NO: 7 or 9 is the base sequence of the CD74-NRG1 fusion polynucleotide found in a sample derived from human cancer tissue, as shown in the Examples below.
  • the fusion point is located between 875th guanine and 876th cytosine.
  • the fusion point is located between guanine at position 812 and cytosine at position 813.
  • SLC3A2-NRG1 gene fusion This gene fusion is a mutation that causes the expression of a fusion protein of SLC3A2 and NRG1 proteins (hereinafter also referred to as SLC3A2-NRG1 fusion polypeptide).
  • SLC3A2-NRG1 fusion polypeptide In human chromosomes, 11q12.3 and 8p12 A mutation caused by a translocation (t (8; 11)) having a breakpoint in the region.
  • the SLC3A2 protein is a protein encoded by a gene present in 11q12.3 in humans, and typically an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 39 (NCBI accession number NP_001012680.1 (27-APR-2014)
  • the SLC3A2 protein is characterized by having a transmembrane domain (FIG. 4), and this domain is the amino acid sequence of positions 184 to 207 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 39 in the case of human.
  • the NRG1 protein is as described in “(4) CD74-NRG1 gene fusion” above.
  • the SLC3A2-NRG1 fusion polypeptide is a polypeptide that contains the transmembrane domain of the SLC3A2 protein and the EGF domain of the NRG1 protein and has an activity of enhancing intracellular signal transduction.
  • the SLC3A2-NRG1 fusion polypeptide may contain all or part of the transmembrane domain of the SLC3A2 protein.
  • the SLC3A2-NRG1 fusion polypeptide may contain the entire EGF domain of the NRG1 protein, or may contain a part of the EGF domain as long as the SLC3A2-NRG1 fusion polypeptide has an activity to enhance intracellular signal transduction. May be.
  • the SLC3A2-NRG1 fusion polypeptide has“ an activity to enhance intracellular signal transduction ”means that it has an activity to enhance intracellular signal transduction due to the EGF domain derived from the NRG1 protein. This activity is measured by the following method described in Wilson, T.R. et al., Cancer Cell, 2011, 20, 158-172.
  • Test substance is added to EFM-19 cells (DSMZ, No. ACC-231) cultured without serum, treated for 30 minutes, EFM-19 cells are lysed, and protein is extracted.
  • EFM-19 cells DSMZ, No. ACC-2311
  • protein is extracted.
  • the test substance has the activity to enhance intracellular signal transduction. It is determined.
  • the entire SLC3A2-NRG1 fusion polypeptide may be used, or a fragment thereof lacking the transmembrane domain and containing the EGF domain may be used in consideration of solubility and the like.
  • the SLC3A2-NRG1 fusion polynucleotide is expressed at a higher level than the wild-type NRG1 protein and works positively for the enhancement and survival of intracellular signal transduction through the autocrine mechanism. It is thought to contribute to canceration.
  • the polynucleotide encoding the SLC3A2-NRG1 fusion polypeptide contains the transmembrane domain of SLC3A2 protein and the EGF domain of NRG1 protein, and enhances intracellular signal transduction.
  • the SLC3A2-NRG1 fusion polynucleotide may be any of mRNA, cDNA, and genomic DNA.
  • the SLC3A2-NRG1 fusion polynucleotide in the present invention can be, for example, an SLC3A2-NRG1 fusion polynucleotide encoding the following polypeptide: (I) a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 36, (Ii) a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 36, comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added, and having an activity of enhancing intracellular signal transduction, Or (iii) a polypeptide comprising an amino acid sequence having 80% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 36 and having an activity of enhancing intracellular signal transduction.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 36 is an amino acid sequence encoded by an SLC3A2-NRG1 fusion polynucleotide found in a sample derived from human cancer tissue, as shown in Examples described later.
  • the fusion point is located at threonine at position 302.
  • the SLC3A2-NRG1 fusion polynucleotide in the present invention can be, for example, any of the following polynucleotides: (I) a polynucleotide comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 35, (Ii) a polypeptide that hybridizes with a polynucleotide comprising a base sequence complementary to the polynucleotide comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 35 under stringent conditions and has an activity of enhancing intracellular signal transduction A polynucleotide encoding, (Iii) a polypeptide comprising a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 35, comprising a nucleotide sequence in which one or more nucleotides are deleted, substituted or added, and having an activity of enhancing intracellular information transmission Or (iv) a polypeptide having 80% or more sequence identity with a polynucleotide comprising the nucleotide sequence represented by SEQ
  • the base sequence represented by SEQ ID NO: 35 is the base sequence of the SLC3A2-NRG1 fusion polynucleotide found in a sample derived from human cancer tissue, as shown in Examples below.
  • the fusion point is located between adenine at position 904 and cytosine at position 905.
  • the present invention provides a method for detecting the four types of gene fusions (hereinafter also referred to as the detection method of the present invention).
  • the detection method of the present invention comprises a step of detecting any of the above fusion polynucleotides or a polypeptide encoded thereby in an isolated sample derived from a subject having cancer.
  • the subject is not particularly limited as long as the subject is a mammal.
  • mammals include rodents such as mice, rats, hamsters, chipmunk, guinea pigs, rabbits, pigs, cows, goats, horses, sheep, minks, dogs, cats, humans, monkeys, cynomolgus monkeys, rhesus monkeys, marmosets, Primates such as orangutans and chimpanzees can be mentioned, and humans are preferred.
  • the subject having cancer may be not only a subject suffering from cancer but also a subject suspected of suffering from cancer or a subject having a risk of developing cancer in the future.
  • the “cancer” to which the detection method of the present invention is applied is not particularly limited as long as it can detect any of the four types of gene fusions, but is preferably lung cancer, more preferably Non-small cell lung cancer, particularly preferably lung cancer.
  • An “isolated sample” derived from a subject includes not only biological samples (eg, cells, tissues, organs, body fluids (blood, lymph, etc.), digestive fluid, sputum, alveolar / bronchial lavage fluid, urine, stool), Also included are nucleic acid extracts (genomic DNA extracts, mRNA extracts, cDNA preparations prepared from mRNA extracts, cRNA preparations, etc.) and protein extracts obtained from these biological samples.
  • a person skilled in the art can prepare genomic DNA, mRNA, cDNA or protein by selecting a known method suitable for the sample in consideration of the type and condition of the sample.
  • the sample may be subjected to formalin fixing treatment, alcohol fixing treatment, freezing treatment, or paraffin embedding treatment.
  • the “isolated sample” is preferably derived from an organ in which the cancer is present or suspected to exist, for example, small intestine, spleen, kidney, liver, stomach, lung, adrenal gland, heart, brain, Examples are those derived from the pancreas, aorta, etc., more preferably from the lung.
  • the detection of the fusion polynucleotide or the polypeptide encoded thereby can be performed using a technique known per se.
  • transcripts from genomic DNA for example, using RT-PCR, sequencing, TaqMan probe, Northern blotting, dot blotting, cDNA microarray analysis, etc. Fusion polynucleotides that are mRNA or cDNA can be detected.
  • genomic DNA is targeted, for example, detection of fusion polynucleotides that are genomic DNA using in situ hybridization (ISH), genomic PCR, sequencing, TaqMan probe, Southern blotting, genomic microarray analysis, etc. can do.
  • ISH in situ hybridization
  • the fusion polynucleotide is specific.
  • Polynucleotides that are probes designed to recognize can be used.
  • “specifically recognize a fusion polynucleotide” includes a wild-type gene derived from the fusion point of the fusion polynucleotide from the 5 ′ terminal side and the 3 ′ terminal part under stringent conditions. This refers to identifying and recognizing the fusion polynucleotide from a polynucleotide other than the fusion polynucleotide.
  • the genomic DNA to be detected is stable even under formalin fixation. From the viewpoint of high detection sensitivity, it is preferable to use in situ hybridization.
  • the biological sample described in the following (a) or (b) having a chain length of at least 15 bases as a polynucleotide that is a probe designed to specifically recognize a fusion polynucleotide By hybridizing these polynucleotides, genomic DNA (fusion polynucleotide) encoding the fusion polypeptide can be detected.
  • a probe that hybridizes to the base sequence of the 5 ′ fusion partner gene (EZR, KIAA1468, TRIM24, CD74 or SLC3A2 gene) and the 3 ′ fusion partner gene (ERBB4, RET, BRAF, or NRG1 gene)
  • B a polynucleotide that is at least one probe selected from the group consisting of probes that hybridize to the base sequence
  • b For each fusion gene, the fusion point between the 5 ′ fusion partner gene and the 3 ′ fusion partner gene A polynucleotide which is a probe that hybridizes to a nucleotide sequence containing the nucleotide sequence.
  • the EZR gene according to the present invention is typically a gene consisting of the DNA sequence from 159186773 to 159240456 in the genome sequence specified by Genbank accession number NC — 000006.11 if it is of human origin.
  • the KIAA1468 gene according to the present invention is typically a gene consisting of the DNA sequence of 59545524 to 59974355 in the genome sequence specified by Genbank accession number NC_000018.9, if it is of human origin. .
  • the TRIM24 gene according to the present invention is typically a gene consisting of the 138145079-138270333-th DNA sequence in the genome sequence specified by Genbank accession number NC — 000007.13 if it is of human origin.
  • CD74 gene according to the present invention is typically a gene consisting of the 149781200 to 149792499th DNA sequence in the genome sequence specified by Genbank accession number NC_000005.9, if it is of human origin. .
  • the SLC3A2 gene according to the present invention is typically a gene composed of the 6256612 to 62888883 DNA sequences in the genome sequence specified by Genbank accession number NC_000011.10. .
  • ERBB4 gene is typically a gene consisting of the DNA sequence from 212240442 to 213403352 in the genome sequence specified by Genbank accession number NC — 000002.11, if it is of human origin.
  • the RET gene according to the present invention is typically a gene consisting of the 43725517-43625799th DNA sequence in the genome sequence specified by Genbank accession number NC_000010.10, if it is derived from human. .
  • the BRAF gene according to the present invention is typically a gene consisting of the DNA sequence from 140433812 to 140624564 in the genome sequence specified by Genbank accession number NC_000007.13 if it is derived from human. .
  • the NRG1 gene according to the present invention is derived from human, it is typically a gene consisting of the DNA sequence of 31496820 to 32622558 in the genome sequence specified by Genbank accession number NC_000008.10. .
  • DNA sequence of a gene can change in nature (ie, non-artificially) due to its mutation or the like. Therefore, such natural mutants can also be the subject of the present invention (hereinafter the same).
  • the polynucleotide described in (a) of the present invention is the nucleotide sequence and / or 3 ′ side of the 5 ′ fusion partner gene (EZR, KIAA1468, TRIM24, CD74 or SLC3A2 gene), which is the target nucleotide sequence of the polynucleotide.
  • EZR 5 ′ fusion partner gene
  • KIAA1468, TRIM24, CD74 or SLC3A2 gene is the target nucleotide sequence of the polynucleotide.
  • Any one capable of detecting the presence of genomic DNA encoding the fusion polypeptide in the biological sample by hybridizing to the base sequence of the fusion partner gene (ERBB4, RET, BRAF or NRG1 gene) is preferable.
  • (A1) a polynucleotide that hybridizes to the base sequence in the upstream region 5 ′ from the breakpoint of the 5 ′ fusion partner gene (hereinafter also referred to as “5 ′ fusion partner gene probe 1”), and the 3 ′ fusion A combination with a polynucleotide (hereinafter also referred to as “3 ′ fusion partner gene probe 1”) that hybridizes to the base sequence in the downstream region 3 ′ from the breakpoint of the partner gene; (A2) a polynucleotide that hybridizes to the base sequence in the upstream region 5 ′ from the breakpoint of the 5 ′ fusion partner gene (hereinafter also referred to as “5 ′ fusion partner gene probe 1”), and the 5 ′ fusion A combination with a polynucleotide (hereinafter also referred to as “5 ′ fusion partner gene probe 2”) that hybridizes to the base sequence in the
  • the base sequence in the upstream region 5 ′ from the cleavage point of the gene contains all or the coiled coil domain of the EZR protein. Some code regions are included.
  • the base sequence in the downstream region 3 ′ from the cleavage point of the gene contains all or one of the kinase domains of ERBB4. Part of the code area.
  • the base sequence in the upstream region 5 ′ from the cleavage point of the gene contains all or a coiled coil domain of the KIAA1468 protein. Some code regions are included.
  • the base sequence in the downstream region 3 ′ from the cleavage point of the gene contains all or one of the RET kinase domains. Part of the code area.
  • the base sequence in the upstream region 5 ′ from the cleavage point of the gene includes, for example, the RING finger domain of TRIM24 protein All or part of the coding region.
  • the base sequence in the downstream region 3 ′ from the cleavage point of the gene contains all or one of the BRAF kinase domains. Part of the code area. Further, the base sequence in the upstream region 5 'to the gene breakpoint contains the coding region of the BRAF Raf-like Ras binding domain.
  • the base sequence in the upstream region 5 ′ from the cleavage point of the gene contains the code for the transmembrane domain of the CD74 protein. An area is included.
  • the base sequence of the downstream region 3 ′ from the cleavage point of the gene contains all or one of the EGF domains of NRG1. Part of the code area.
  • the base sequence in the upstream region 5 ′ from the cleavage point of the gene contains the code for the transmembrane domain of the SLC3A2 protein. An area is included.
  • Examples of the polynucleotide described in (a1) include combinations of the following polynucleotides (a1-1) to (a1-4): (a1-1) a combination of a polynucleotide that hybridizes to all or part of the coding region of the coiled-coil domain of EZR and a polynucleotide that hybridizes to all or part of the coding region of the kinase domain of ERBB4, (a1-2) a combination of a polynucleotide that hybridizes to all or part of the coding region of the coiled-coil domain of KIAA1468 and a polynucleotide that hybridizes to all or part of the coding region of the kinase domain of RET, (a1-3) a combination of a polynucleotide that hybridizes to all or part of the coding region of the RING finger domain of TRIM24 and a polynucleotide that hybridizes to
  • the region (target base sequence) to which the polynucleotide described in (a) used for in situ hybridization hybridizes is the 5 ′ side from the viewpoint of specificity to the target base sequence and sensitivity of detection.
  • a region within 1 million bases from the fusion point of the fusion partner gene (EZR, KIAA1468, TRIM24, CD74 or SLC3A2 gene) and the 3 ′ fusion partner gene (ERBB4, RET, BRAF or NRG1 gene) is preferable.
  • the polynucleotide described in (b) used in in situ hybridization is a fusion of a 5 ′ fusion partner gene and a 3 ′ fusion partner gene, which is a target base sequence of the polynucleotide.
  • a 5 ′ fusion partner gene and a 3 ′ fusion partner gene which is a target base sequence of the polynucleotide.
  • the polynucleotide described in (a) or (b) used for in-situ hybridization covers the entire target base sequence from the viewpoint of specificity to the target base sequence and sensitivity of detection.
  • a group consisting of a plurality of types of polynucleotides is preferable.
  • the length of the polynucleotide constituting the population is at least 15 bases, preferably 100 to 1000 bases.
  • the polynucleotide described in (a) or (b) used for in situ hybridization is preferably labeled with a fluorescent dye or the like for detection.
  • fluorescent dyes include, but are not limited to, DEAC, FITC, R6G, TexRed, and Cy5.
  • radioisotopes eg, 125 I, 131 I, 3 H, 14 C, 33 P, 32 P, etc.
  • enzymes eg, ⁇ -galactosidase, ⁇ -glucosidase, alkaline phosphatase, peroxidase
  • the polynucleotide may be labeled with a malate dehydrogenase, etc.
  • a luminescent substance eg, luminol, luminol derivative, luciferin, lucigenin, 3,3′-diaminobenzidine (DAB), etc.
  • in situ hybridization when 5 ′ fusion partner gene probe 1 and 3 ′ fusion partner gene probe 1 are used, 5 ′ fusion partner gene probe 1 and 5 ′ fusion partner gene 2 are used, or When 3 ′ fusion partner gene probe 2 and 3 ′ fusion partner gene probe 1 are used, these probes are preferably labeled with different dyes.
  • the signal for example, fluorescence
  • the genomic DNA encoding the fusion polypeptide has been detected when an overlap with the signal emitted by the label of the gene probe 1 is observed.
  • the signal emitted from the label of the 5 ′ fusion partner gene probe 1 is separated from the signal emitted from the label of the 5 ′ fusion partner gene probe 2, the signal emitted from the label of the 3 ′ fusion partner gene probe 2 and the signal 3 ′ from the signal emitted from the label of the 3 ′ fusion partner gene probe 2.
  • separation from the signal emitted by the label of the fusion partner gene probe 1 is observed, it can be determined that the genomic DNA encoding the fusion polypeptide has been detected.
  • labeling of the polynucleotide can be performed by a known technique.
  • the polynucleotide can be labeled by incorporating a substrate base labeled with a fluorescent dye or the like into the polynucleotide by a nick translation method or a random prime method.
  • conditions for hybridizing the polynucleotide according to (a) or (b) and the biological sample may vary depending on various factors such as the length of the polynucleotide.
  • conditions for stringency hybridization include 0.2 ⁇ SSC and 65 ° C.
  • conditions for low stringency hybridization include 2.0 ⁇ SSC and 50 ° C.
  • a person skilled in the art appropriately selects various conditions such as the concentration of surfactant (NP-40, etc.), the concentration of formamide, pH, etc. in addition to the salt concentration (SSC dilution ratio, etc.) and temperature.
  • SSC dilution ratio etc.
  • Examples of the method for detecting genomic DNA encoding a fusion polypeptide using the polynucleotide described in (a) or (b) include Southern blotting, Northern blotting, and dot blotting in addition to the in-situ hybridization. It is done.
  • the fusion gene is detected by hybridizing the polynucleotide described in (a) or (b) to a membrane to which a nucleic acid extract obtained from the biological sample is transferred.
  • the polynucleotide (a) When the polynucleotide (a) is used, the polynucleotide that hybridizes to the base sequence of the 5 ′ fusion partner gene and the polynucleotide that hybridizes to the base sequence of the 3 ′ fusion partner gene are developed on the membrane. When the same band is recognized, it can be determined that the genomic DNA encoding the fusion polypeptide has been detected.
  • Examples of the method for detecting genomic DNA encoding a fusion polypeptide using the polynucleotide (b) include genomic microarray analysis and DNA microarray analysis.
  • an array in which the polynucleotide (b) is immobilized on a substrate is prepared, and the genomic DNA is detected by bringing the biological sample into contact with the polynucleotide on the array.
  • the substrate is not particularly limited as long as it can immobilize oligo or polynucleotide, and examples thereof include glass plates, nylon membranes, micro beads, silicon chips, capillaries and the like.
  • the detection method of the present invention it is also preferable to detect the fusion polynucleotide using PCR.
  • a polynucleotide that is a pair of primers designed to specifically amplify a fusion polynucleotide using DNA (genomic DNA, cDNA) or RNA prepared from the biological sample as a template can be used.
  • the fusion polynucleotide can be specifically amplified means that the fusion polynucleotide is not amplified without amplifying the wild-type gene from which the 5′-end and 3′-end portions are derived from the fusion point of the fusion polynucleotide. It means that only nucleotides can be amplified, and all of the fusion polynucleotide may be amplified, or a part of the fusion polynucleotide including the fusion point may be amplified.
  • Polynucleotide which is a pair of primers” used in PCR, etc. consists of a sense primer (forward primer) and an antisense primer (reverse primer) that specifically amplify the target fusion polynucleotide.
  • the base sequence on the 5 ′ end side from the fusion point of the fusion polynucleotide is designed, and the antisense primer is designed from the base sequence on the 3 ′ end side from the fusion point of the fusion polynucleotide.
  • These primers are usually designed so that the PCR product is 5 kb or less from the viewpoint of accuracy and sensitivity of detection by PCR.
  • the design of the primer can be appropriately performed by a known method, and for example, Primer Express (registered trademark) software (Applied Biosystems) can be used.
  • the length of these polynucleotides is usually 15 bases or more (preferably 16, 17, 18, 19 or 20 bases or more, more preferably 21 bases or more), and 100 bases or less (preferably 90, 80, 70, 60, 50 or 40 bases or less, more preferably 30 bases or less).
  • a polynucleotide that is a pair of primers for a EZR-ERBB4 fusion polynucleotide, a polynucleotide comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 11 and a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 12
  • Primer set consisting of a polynucleotide consisting of, a primer consisting of a polynucleotide consisting of a base sequence represented by SEQ ID NO: 13 and a polynucleotide consisting of a base sequence represented by SEQ ID NO: 14 for a KIAA1468-RET fusion polynucleotide Set for a TRIM24-BRAF fusion polynucleotide, a primer set comprising a polynucleotide comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 15 and a polynucleotide comprising the nucleotide sequence represented by
  • sequencer for example, ABI-PRISM 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems Inc.)
  • the TaqMan probe method When detecting a fusion polynucleotide using PCR, the TaqMan probe method is used to connect the 5 ′ gene portion and the 3 ′ gene portion in-frame and / or in the fusion polynucleotide. Can be confirmed to contain a predetermined domain.
  • Examples of the probe used in the TaqMan probe method include the polynucleotides described in the above (a) or (b).
  • the probe is labeled with a reporter dye (eg, FAM, FITC, VIC, etc.) and a quencher (eg, TAMRA, Eclipse, DABCYL, MGB, etc.).
  • the primer and probe may be DNA, RNA, or DNA / RNA chimera, but is preferably DNA.
  • PNA polyamide nucleic acid, peptide nucleic acid
  • LNA registered trademark, locked nucleic acid, Bridged Nucleic acid, cross-linked nucleic acid
  • ENA registered trademark, 2'-O, 4'-C Nucleotides
  • the primers and probes may be double-stranded or single-stranded, but are preferably single-stranded.
  • the primers and probes may contain one or a plurality of nucleotide mismatches as long as they can specifically hybridize to the target sequence, and are usually 80% or more, preferably 90, relative to the complementary sequence of the target sequence. 91, 92, 93, 94% or more, more preferably 95, 96, 97, 98, 99% or more identity, most preferably 100% identity.
  • primers and probes can be synthesized according to a conventional method using a DNA / RNA automatic synthesizer based on, for example, information on the base sequence described in the present specification.
  • the fusion polynucleotide may be detected by whole transcriptome sequencing (RNA sequencing) or genome sequencing. These methods are performed according to the manufacturer's instructions using, for example, a next-generation sequencer (eg, Genome Analyzer IIx (Illumina), HiSeq Sequencer (HiSeq2000, Illumina) Genome Sequencer FLX System (Roche), etc.) Can be done.
  • a next-generation sequencer eg, Genome Analyzer IIx (Illumina), HiSeq Sequencer (HiSeq2000, Illumina) Genome Sequencer FLX System (Roche), etc.
  • a cDNA library is prepared from total RNA using a commercially available kit (eg, mRNA-Seq sample preparation kit (Illumina) etc.) according to the manufacturer's instructions, and this is used as a next-generation sequencer. This can be done by subjecting it to the sequencing used.
  • a translation product of a fusion polynucleotide that is, a fusion polynucleotide
  • the translation product can be detected using antibody array analysis or the like.
  • an antibody that specifically recognizes the fusion polypeptide is used.
  • “specifically recognize a fusion polypeptide” means a protein other than the fusion polypeptide, including wild-type proteins derived from the N-terminal side and the C-terminal side from the fusion point of the fusion polypeptide. Recognizing only the fusion polypeptide without recognizing.
  • the antibody “specifically recognizes the fusion polypeptide” used in the detection method of the present invention may be one antibody or a combination of two or more antibodies.
  • the “antibody specifically recognizing the fusion polypeptide” examples include an antibody specific to the polypeptide containing the fusion point of the fusion polypeptide (hereinafter also referred to as “fusion point-specific antibody”).
  • fusion point-specific antibody means an antibody that specifically binds to a polypeptide containing the fusion point but does not bind to a wild-type protein from which the N-terminal and C-terminal portions are derived. To do.
  • the “antibody specifically recognizing the fusion polypeptide” refers to an antibody that binds to a polypeptide consisting of the N-terminal region from the fusion point of the fusion polypeptide and a C-terminal region from the fusion point of the fusion polypeptide. Also included are combinations of antibodies that bind to the polypeptide.
  • the fusion polypeptide can be detected by performing sandwich ELISA, immunostaining, immunoprecipitation, Western blotting, etc. using these two antibodies.
  • antibodies include natural antibodies such as polyclonal antibodies and monoclonal antibodies (mAbs), chimeric antibodies that can be produced using gene recombination techniques, humanized antibodies, single chain antibodies, and binding fragments thereof. Is included, but is not limited thereto.
  • the binding fragment means a partial region of the antibody having specific binding activity, and specific examples include Fab, Fab ′, F (ab ′) 2 , Fv, and a single chain antibody.
  • the class of the antibody is not particularly limited, and may be an antibody having any isotype such as IgG, IgM, IgA, IgD, or IgE, but IgG is more preferable in consideration of ease of purification.
  • “An antibody that specifically recognizes the fusion polypeptide” can be prepared by a person skilled in the art by appropriately selecting a known method.
  • a known technique includes a polypeptide comprising a fusion point of the fusion polypeptide, a polypeptide comprising a region N-terminal from the fusion point of the fusion polypeptide, or a C-terminal side of the fusion polypeptide.
  • the animal's serum (polyclonal antibody) is recovered, the hybridoma method, the recombinant DNA method, the phage display method, etc. And a method for producing a monoclonal antibody.
  • the target protein can be directly detected by detecting the label.
  • the labeling substance is not particularly limited as long as it can bind to an antibody and can be detected.
  • peroxidase ⁇ -D-galactosidase, microperoxidase, horseradish peroxidase (HRP), fluorescein isotope
  • HRP horseradish peroxidase
  • fluorescein isotope examples include thiocyanate (FITC), rhodamine isothiocyanate (RITC), alkaline phosphatase, biotin, and radioactive substances.
  • a method for indirectly detecting the target protein using a secondary antibody, protein G or protein A to which a labeling substance is bound can also be used.
  • a fusion polynucleotide produced by gene fusion that is a responsible mutation of cancer or a polypeptide encoded thereby can be detected using the primer, probe, or antibody, or a combination thereof, Thereby, the gene fusion can be detected.
  • the present invention provides a kit for detecting a gene fusion that is a responsible mutation for cancer (hereinafter also referred to as a kit of the present invention), comprising any of the following or a combination thereof:
  • A Probe designed to specifically recognize EZR-ERBB4 fusion polynucleotide, KIAA1468-RET fusion polynucleotide, TRIM24-BRAF fusion polynucleotide, CD74-NRG1 fusion polynucleotide, or SLC3A2-NRG1 fusion polynucleotide
  • B A pair designed to specifically amplify EZR-ERBB4 fusion polynucleotide, KIAA1468-RET fusion polynucleotide, TRIM24-BRAF fusion polynucleotide, CD74-NRG1 fusion polynucleotide, or SLC3A2-NRG1 fusion polynucleotide Or
  • the kit of the present invention includes a substrate necessary for detection of a label added to the polynucleotide or antibody, a positive control (eg, EZR-ERBB4 fusion polynucleotide, KIAA1468-RET fusion polynucleotide, TRIM24 -BRAF fusion polynucleotide, CD74-NRG1 fusion polynucleotide, or SLC3A2-NRG1 fusion polynucleotide, EZR-ERBB4 fusion polypeptide, KIAA1468-RET fusion polypeptide, TRIM24-BRAF fusion polypeptide, CD74-NRG1 fusion polypeptide, or SLC3A2-NRG1 fusion polypeptide, or cells retaining these), negative controls, PCR reagents, counter-staining reagents used in in situ hybridization (DAPI, etc.), molecules necessary for antibody detection (eg, Secondary antibodies, protein
  • the detection method and detection kit of the present invention enable detection of a newly discovered gene fusion as a responsible mutation of cancer, and identify a positive example of the gene fusion as described later to enable individualized medicine. It is extremely useful in application.
  • the five gene fusions are responsible mutations in cancer, and each function as a constitutive activation of ERBB4 kinase activity, constitutive activation of RET kinase activity, constitutive activation of BRAF kinase activity, and NRG1 as a cell growth factor. It is thought that it contributes to malignant transformation of cancer, etc. by the enhancement of. Therefore, in cancer patients in which such gene fusion is detected, there is a high probability that treatment with a substance that suppresses the expression and / or activity of the polypeptide encoded by the fusion polynucleotide generated by the gene fusion is effective. .
  • the present invention relates to a cancer patient in which a substance that suppresses the expression and / or activity of a polypeptide encoded by a fusion polynucleotide generated by gene fusion that is a responsible mutation (driver mutation) of cancer has a therapeutic effect or Provided is a method for identifying a subject at risk of cancer (hereinafter also referred to as the identification method of the present invention).
  • the identification method of the present invention includes the following steps: (1) Detecting a fusion polynucleotide of any of the following (a) to (e) or a polypeptide encoded thereby in an isolated sample derived from a subject: (A) an EZR-ERBB4 fusion polynucleotide, wherein the polynucleotide comprises the whole or a part of the coiled-coil domain of EZR and the kinase domain of ERBB4 and encodes a polypeptide having kinase activity; (B) a KIAA1468-RET fusion polynucleotide, which comprises a polypeptide comprising all or part of the coiled coil domain of KIAA1468 and the kinase domain of RET and having kinase activity; (C) a TRIM24-BRAF fusion polynucleotide, which comprises a BRAF kinase domain and encodes a polypeptide having kinas
  • a cancer patient or a subject at risk for cancer is a mammal, preferably a human, who is suffering from cancer or suspected of having cancer.
  • the “cancer” to which the identification method of the present invention is applied is not particularly limited as long as it is a cancer that can detect any of the five types of gene fusions, preferably lung cancer, more preferably Non-small cell lung cancer, particularly preferably lung cancer.
  • the “therapeutic effect” is not particularly limited as long as it is an effect of cancer treatment and is beneficial to the patient.
  • the tumor reduction effect, the progression-free survival extension effect, the life extension The effect etc. are mentioned.
  • a polypeptide encoded by a fusion polynucleotide generated by gene fusion that is a responsible mutation (driver mutation) of cancer which is a target for evaluating the effectiveness of cancer treatment with respect to EZR-ERBB4 gene fusion
  • a substance that suppresses the expression and / or activity of (hereinafter also referred to as a target substance in the identification method of the present invention) is a substance that directly or indirectly inhibits the expression and / or function of an EZR-ERBB4 fusion polypeptide. If it is, it will not specifically limit.
  • Examples of substances that inhibit the expression of EZR-ERBB4 fusion polypeptide include siRNA (small interfering RNA), shRNA (short hairpin RNA), miRNA (micro RNA), antisense that suppresses expression of EZR-ERBB4 fusion polypeptide.
  • Examples thereof include nucleic acids, expression vectors capable of expressing these polynucleotides, and low molecular weight compounds.
  • substances that inhibit the function of EZR-ERBB4 fusion polypeptide include substances that inhibit ERBB4 kinase activity (for example, low molecular weight compounds), antibodies that bind to EZR-ERBB4 fusion polypeptide, and the like.
  • These substances may be substances that specifically suppress the expression and / or activity of the EZR-ERBB4 fusion polypeptide, or substances that also suppress the expression and / or activity of the wild-type ERBB4 protein. Good. Specific examples of such substances include afatinib and dacomitinib.
  • These substances can be prepared by a method known per se based on the sequence information of the EZR-ERBB4 fusion polynucleotide and / or EZR-ERBB4 fusion polypeptide disclosed in the present specification. Commercially available materials may also be used.
  • the target substance in the identification method of the present invention is not particularly limited as long as it is a substance that directly or indirectly inhibits the expression and / or function of the KIAA1468-RET fusion polypeptide.
  • substances that inhibit the expression of KIAA1468-RET fusion polypeptide include siRNA (small interfering RNA), shRNA (short hairpin RNA), miRNA (micro RNA), antisense that suppresses expression of KIAA1468-RET fusion polypeptide
  • siRNA small interfering RNA
  • shRNA short hairpin RNA
  • miRNA miRNA
  • antisense antisense that suppresses expression of KIAA1468-RET fusion polypeptide
  • examples thereof include nucleic acids, expression vectors capable of expressing these polynucleotides, and low molecular weight compounds.
  • substances that inhibit the function of KIAA1468-RET fusion polypeptide include substances that inhibit RET kinase activity (for example, low molecular weight compounds), antibodies that bind to KIAA1468-RET fusion polypeptide, and the like.
  • These substances may be substances that specifically suppress the expression and / or activity of KIAA1468-RET fusion polypeptide, or substances that also suppress the expression and / or activity of wild-type RET protein. Good. Specific examples of such substances include vandetanib, cabozantinib, sorafenib, unitinib, lenvatinib, ponatinib and the like.
  • These substances can be prepared by a method known per se based on the sequence information of the KIAA1468-RET fusion polynucleotide and / or KIAA1468-RET fusion polypeptide disclosed in the present specification. Commercially available materials may also be used.
  • These substances are effective as cancer therapeutic agents for a subject when KIAA1468-RET fusion polynucleotide or the polypeptide encoded thereby is detected in an isolated sample from a subject with cancer It is.
  • the target substance in the identification method of the present invention is not particularly limited as long as it is a substance that directly or indirectly inhibits the expression and / or function of the TRIM24-BRAF fusion polypeptide.
  • substances that inhibit the expression of TRIM24-BRAF fusion polypeptide include siRNA (smallRNAinterfering RNA), shRNA (short hairpin RNA), miRNA (micro RNA), antisense that suppresses the expression of TRIM24-BRAF fusion polypeptide
  • siRNA smallRNAinterfering RNA
  • shRNA short hairpin RNA
  • miRNA miRNA
  • antisense antisense that suppresses the expression of TRIM24-BRAF fusion polypeptide
  • examples thereof include nucleic acids, expression vectors capable of expressing these polynucleotides, and low molecular weight compounds.
  • substances that inhibit the function of TRIM24-BRAF fusion polypeptide include substances that inhibit BRAF kinase activity (for example, low molecular weight compounds), antibodies that bind to TRIM24-BRAF fusion polypeptide, and the like.
  • These substances may be substances that specifically suppress the expression and / or activity of TRIM24-BRAF fusion polypeptide, or substances that also suppress the expression and / or activity of wild-type BRAF protein. Good. Specific examples of such substances include vemurafenib and dabrafenib.
  • These substances can be prepared by a method known per se based on the sequence information of the TRIM24-BRAF fusion polynucleotide and / or TRIM24-BRAF fusion polypeptide disclosed in the present specification. Commercially available materials may also be used.
  • TRIM24-BRAF fusion polynucleotides or polypeptides encoded thereby are detected in isolated samples from subjects with cancer. It is.
  • the target substance in the identification method of the present invention is not particularly limited as long as it is a substance that directly or indirectly inhibits the expression and / or function of the CD74-NRG1 fusion polypeptide.
  • Examples of substances that inhibit the expression of CD74-NRG1 fusion polypeptide include siRNA (smallRNAinterfering RNA), shRNA (short hairpin RNA), miRNA (micro RNA), antisense that suppresses expression of CD74-NRG1 fusion polypeptide Examples thereof include nucleic acids, expression vectors capable of expressing these polynucleotides, and low molecular weight compounds.
  • substances that inhibit the function of CD74-NRG1 fusion polypeptide include substances that inhibit the activity of NRG1 to enhance intracellular signal transduction (eg, low molecular weight compounds), and antibodies that bind to CD74-NRG1 fusion polypeptide Etc.
  • These substances may be substances that specifically suppress the expression and / or activity of the CD74-NRG1 fusion polypeptide, or substances that also suppress the expression and / or activity of the wild-type NRG1 protein. Good. Specific examples of such substances include BACE protein inhibitors MK-8931 and E2609 involved in cleavage of NRG1 protein.
  • These substances can be prepared by a method known per se, based on the sequence information of the CD74-NRG1 fusion polynucleotide and / or CD74-NRG1 fusion polypeptide disclosed in the present specification. Commercially available materials may also be used.
  • the target substance in the identification method of the present invention includes HER protein expression and A substance that directly or indirectly inhibits its function is also included.
  • the HER protein group is a group of tyrosine kinase type receptors, and includes four proteins of HER1 (ErbB1), HER2 (ErbB2), HER3 (ErbB3), and HER4 (ErbB4).
  • substances that inhibit HER protein expression include siRNA (smallRNAinterfering RNA), shRNA (short hairpin RNA), miRNA (micro RNA), antisense nucleic acid, and these polynucleotides that suppress HER protein expression Expression vectors, low molecular weight compounds and the like.
  • substances that inhibit the function of the HER protein include substances that inhibit the kinase activity of the HER protein (eg, low molecular weight compounds), antibodies that bind to the HER protein, and the like.
  • substances that inhibit the kinase activity of the HER protein include substances that inhibit the kinase activity of the HER protein (eg, low molecular weight compounds), antibodies that bind to the HER protein, and the like.
  • Specific examples of such substances include rapatinib, afatinib, dacomitinib, trastuzumab and the like.
  • These substances can be prepared by a method known per se based on known sequence information and the like. Commercially available materials may also be used.
  • These substances are effective as a cancer therapeutic agent for a subject when CD74-NRG1 fusion polynucleotide or a polypeptide encoded thereby is detected in an isolated sample from a subject having cancer. It is.
  • the target substance in the identification method of the present invention is not particularly limited as long as it is a substance that directly or indirectly inhibits the expression and / or function of the SLC3A2-NRG1 fusion polypeptide.
  • substances that inhibit the expression of the SLC3A2-NRG1 fusion polypeptide include siRNA (smallRNAinterfering RNA), shRNA (short hairpin RNA), miRNA (micro RNA), and antisense that suppress the expression of the SLC3A2-NRG1 fusion polypeptide.
  • siRNA smallRNAinterfering RNA
  • shRNA short hairpin RNA
  • miRNA miRNA
  • antisense that suppress the expression of the SLC3A2-NRG1 fusion polypeptide.
  • examples thereof include nucleic acids, expression vectors capable of expressing these polynucleotides, and low molecular weight compounds.
  • substances that inhibit the function of the SLC3A2-NRG1 fusion polypeptide include, for example, substances that inhibit the activity of NRG1 to enhance intracellular signal transduction (eg, low molecular weight compounds), antibodies that bind to the SLC3A2-NRG1 fusion polypeptide Etc.
  • These substances may be substances that specifically suppress the expression and / or activity of the SLC3A2-NRG1 fusion polypeptide, or substances that also suppress the expression and / or activity of the wild-type NRG1 protein.
  • Specific examples of such substances include BACE protein inhibitors MK-8931 and E2609 involved in cleavage of NRG1 protein.
  • These substances can be prepared by a method known per se, based on the sequence information of the SLC3A2-NRG1 fusion polynucleotide and / or SLC3A2-NRG1 fusion polypeptide disclosed herein. Commercially available materials may also be used.
  • the target substance in the identification method of the present invention includes HER protein expression and A substance that directly or indirectly inhibits its function is also included. Examples of these substances include those listed above for the CD74-NRG1 gene fusion.
  • These substances can be prepared by a method known per se based on known sequence information and the like. Commercially available materials may also be used.
  • These substances are effective as a cancer therapeutic agent for a subject when an SLC3A2-NRG1 fusion polynucleotide or a polypeptide encoded thereby is detected in an isolated sample from a subject having cancer. It is.
  • Step (1) in the identification method of the present invention can be carried out in the same manner as the step included in the detection method of the present invention.
  • step (2) of the identification method of the present invention in the isolated sample derived from the subject having cancer in the step (1) (that is, a subject having cancer or a subject at risk of cancer),
  • the polypeptide encoded by is detected, it is determined that the target substance in the identification method of the present invention has a therapeutic effect in the subject, whereas the fusion polynucleotide or the polypeptide encoded thereby is not detected. In such a case, it is determined that the target substance in the identification method of the present invention is unlikely to have a therapeutic effect in the subject.
  • a positive example of gene fusion newly found as a responsible mutation for cancer is detected from cancer patients or subjects at risk of cancer, and the fusion poly- gram generated by the gene fusion is detected.
  • a substance that suppresses the expression and / or activity of a polypeptide encoded by a nucleotide is capable of identifying a cancer patient or a subject having a risk of cancer, and the present invention provides such a subject. It is useful in that it is possible to perform treatment suitable for the above.
  • the present invention is a method for treating cancer, which comprises a step of administering the substance to a subject determined to have a therapeutic effect by the identification method of the present invention (hereinafter, the present invention). Also referred to as a method of treatment).
  • the present invention further expresses the expression of the polypeptide encoded by the fusion polynucleotide generated by any of the five types of gene fusions. And / or a cancer therapeutic agent (hereinafter, also referred to as the cancer therapeutic agent of the present invention) containing a substance that suppresses the activity as an active ingredient.
  • a cancer therapeutic agent hereinafter, also referred to as the cancer therapeutic agent of the present invention
  • the cancer therapeutic agent of the present invention suppresses the expression and / or activity of a polypeptide encoded by a fusion polynucleotide generated by any of the above five gene fusions.
  • examples include substances described as substances.
  • the cancer therapeutic agent of the present invention can be prepared as a pharmaceutical composition using pharmacologically acceptable carriers, excipients, and / or other additives that are usually used for their formulation.
  • the method for administering the cancer therapeutic agent of the present invention is appropriately selected according to the type of the inhibitor, the type of cancer, etc.
  • oral, intravenous, intraperitoneal, transdermal, intramuscular, intratracheal (Aerosol), rectal, intravaginal and other dosage forms can be employed.
  • the dose of the cancer therapeutic agent of the present invention is determined depending on the activity and type of the active ingredient, the mode of administration (eg, oral or parenteral), the severity of the disease, the animal species to be administered, the drug acceptability of the subject to be administered, It can be appropriately determined in consideration of weight, age and the like.
  • the therapeutic method and cancer therapeutic agent of the present invention are useful for enabling the treatment of patients having a specific cancer responsible mutation that has not been known so far and has been clarified by the present invention.
  • the present invention provides a screening method for a cancer therapeutic agent (hereinafter also referred to as the screening method of the present invention) that has a therapeutic effect on a cancer patient having any of the four types of gene fusions.
  • the screening method of the present invention the above five fusion polypeptides (ie, EZR-ERBB4 fusion polypeptide, KIAA1468-RET fusion polypeptide, TRIM24-BRAF fusion polypeptide, CD74-NRG1 fusion polypeptide, and SLC3A2-NRG1 fusion)
  • a substance that suppresses the expression and / or activity of any of (polypeptides) can be obtained as a cancer therapeutic agent.
  • the test substance to be used in the screening method of the present invention may be any compound or composition, such as a nucleic acid (eg, nucleoside, oligonucleotide, polynucleotide), carbohydrate (eg, monosaccharide, disaccharide, Oligosaccharides, polysaccharides), lipids (eg, saturated or unsaturated linear, branched and / or cyclic fatty acids), amino acids, proteins (eg, oligopeptides, polypeptides), low molecular compounds, compound libraries, Examples include random peptide libraries, natural components (eg, components derived from microorganisms, animals and plants, marine organisms, etc.), foods, and the like.
  • a nucleic acid eg, nucleoside, oligonucleotide, polynucleotide
  • carbohydrate eg, monosaccharide, disaccharide, Oligosaccharides, polysaccharides
  • lipids
  • the screening method of the present invention may be in any form as long as it can be evaluated whether the test substance suppresses the expression and / or activity of any of the four fusion polypeptides.
  • the screening method of the present invention comprises the following steps: (1) A test substance is contacted with a cell expressing an EZR-ERBB4 fusion polypeptide, KIAA1468-RET fusion polypeptide, TRIM24-BRAF fusion polypeptide, CD74-NRG1 fusion polypeptide, or SLC3A2-NRG1 fusion polypeptide. Process; (2) determining whether the expression and / or activity of the fusion polypeptide is suppressed; and (3) treating the substance determined to suppress the expression and / or activity of the fusion polypeptide with cancer treatment. The process of selecting as an agent.
  • a test substance is brought into contact with a cell expressing any one of the five fusion polypeptides.
  • a solvent not containing a test substance for example, DMSO
  • the contact can be performed in a culture medium.
  • the medium is appropriately selected depending on the type of cells used, for example, a minimum essential medium (MEM) containing about 5 to 20% fetal calf serum, Dulbecco's modified minimum essential medium (DMEM), RPMI1640 medium, 199 medium.
  • MEM minimum essential medium
  • DMEM Dulbecco's modified minimum essential medium
  • RPMI1640 RPMI1640 medium
  • the culture conditions are also appropriately determined according to the type of cells to be used. For example, the pH of the medium is about 6 to about 8, the culture temperature is about 30 to about 40 ° C., and the culture time is about 12 to about 72 hours.
  • Examples of cells expressing any one of the five fusion polypeptides include, for example, cells derived from a cancer tissue that endogenously expresses the fusion polypeptide, cell lines derived from the cells, Examples include, but are not limited to, genetically engineered cell lines. Whether a certain cell expresses any one of the five fusion polypeptides can also be confirmed using the detection method of the present invention.
  • the cells are usually mammalian cells, preferably human cells.
  • step (2) it is determined whether the expression and / or activity of the fusion polypeptide is suppressed.
  • the expression of the fusion polypeptide can be measured by determining the mRNA level or protein level in the cell using a known analysis method such as Northern blotting, quantitative PCR, immunoblotting, ELISA, etc. .
  • the activity of the fusion polypeptide can also be measured by a known analysis method (for example, kinase activity measurement).
  • the obtained measured value is compared with the measured value in a control cell not contacted with the test substance. The comparison of measured values is preferably performed based on the presence or absence of a significant difference. If the measured value in the cell contacted with the test substance is significantly lower than that of the control, it can be determined that the test substance suppresses the expression and / or activity of the fusion polypeptide.
  • the proliferation of the cells can be used as an indicator for determination in this step.
  • the proliferation of the cells in contact with the test substance is measured.
  • the cell proliferation can be measured by a method known per se such as cell count, 3 H thymidine incorporation, BRDU method and the like.
  • the growth of the cells in contact with the test substance is compared with the growth of control cells not in contact with the test substance.
  • the comparison of the proliferation level is preferably performed based on the presence or absence of a significant difference.
  • the growth of the control cells not contacted with the test substance may be a value measured in advance or a value measured simultaneously with respect to the measurement of the growth of the cells contacted with the test substance.
  • a value measured simultaneously from the viewpoint of reproducibility is preferable. As a result of the comparison, when the growth of the cell contacted with the test substance is suppressed, it can be determined that the test substance suppresses the expression and / or activity of the fusion polypeptide.
  • step (3) the test substance determined to suppress the expression and / or activity of the fusion polypeptide in step (2) is selected as a cancer therapeutic agent.
  • the present invention provides the following isolated fusion polypeptides (hereinafter also referred to as fusion polypeptides of the present invention) or fragments thereof: (1) an isolated EZR-ERBB4 fusion polypeptide comprising all or part of the coiled-coil domain of EZR protein and the kinase domain of ERBB4 protein and having kinase activity; (2) an isolated KIAA1468-RET fusion polypeptide comprising all or part of the coiled-coil domain of KIAA1468 protein and the kinase domain of RET protein and having kinase activity; (3) an isolated TRIM24-BRAF fusion polypeptide comprising the kinase domain of BRAF protein and having kinase activity; (4) an isolated CD74-NRG1 fusion polypeptide comprising a transmembrane domain of CD74 protein and an EGF domain of NRG1 protein
  • an “isolated” substance refers to another substance (preferably a biological agent) (eg, a nucleic acid) in the environment in which the substance exists in nature (eg, within the organism's cells).
  • a nucleic acid containing a non-nucleic acid factor and a nucleic acid sequence other than the target nucleic acid in the case of a protein, such as a protein containing a non-protein factor and an amino acid sequence other than the target protein). It means what was done.
  • isolated preferably refers to 75% or more, more preferably 85% or more, even more preferably 95% or more, and most preferably 96% or more, 97% or more.
  • isolated polynucleotides and polypeptides include polynucleotides and polypeptides purified by standard purification methods, as well as chemically synthesized polynucleotides and polypeptides.
  • “Fragment” refers to a fragment of the fusion polypeptide of the present invention, comprising a continuous partial sequence including sequences upstream and downstream of the fusion point.
  • the sequence upstream of the fusion point contained in the partial sequence is one or more amino acid residues from the fusion point (for example, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 , 100 amino acid residues or more) and may include up to the N-terminus of the fusion polypeptide of the present invention.
  • the sequence downstream of the fusion point contained in the partial sequence is one or more amino acid residues from the fusion point (for example, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 , 100 amino acid residues or more) and may include up to the C-terminus of the fusion polypeptide of the present invention.
  • the length of the fragment is not particularly limited, but is usually 8 amino acid residues or more (for example, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 50, 100 amino acid residues or more).
  • the fusion polypeptide of the present invention can be, for example, the following isolated fusion polypeptide.
  • (1) Regarding the EZR-ERBB4 fusion polypeptide (I) a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, (Ii) a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added, and having kinase activity; or (iii) a sequence A polypeptide comprising an amino acid sequence having 80% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by No.
  • KIAA1468-RET fusion polypeptide (I) a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, (Ii) a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 and comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added, and having kinase activity, or (iii) a sequence A polypeptide comprising an amino acid sequence having 80% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by No.
  • TRIM24-BRAF fusion polypeptide (I) a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6, (Ii) a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6, a polypeptide consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added, and having kinase activity; or (iii) a sequence A polypeptide comprising an amino acid sequence having 80% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by No.
  • CD74-NRG1 fusion polypeptide (I) a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8 or 10, (Ii) A polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8 or 10, comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added, and has an activity of enhancing intracellular signal transduction (Iii) a polypeptide comprising an amino acid sequence having 80% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8 or 10, and having an activity of enhancing intracellular signal transduction; and (5 ) For the SLC3A2-NRG1 fusion polypeptide, (I) a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 36, (Ii) a polypeptide comprising an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 36, comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added, and having an activity of enhancing intracellular signal transduction; and (5 ) For the SLC3A
  • the present invention provides an isolated polynucleotide encoding the above-mentioned fusion polypeptide of the present invention or a fragment thereof (hereinafter also referred to as the polynucleotide of the present invention).
  • the polynucleotide of the present invention may be any of mRNA, cDNA and genomic DNA. It may be double-stranded or single-stranded.
  • a typical example of cDNA encoding the EZR-ERBB4 fusion polypeptide is a polynucleotide comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • a typical example of cDNA encoding the KIAA1468-RET fusion polypeptide is a polynucleotide comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 3.
  • a typical example of cDNA encoding the TRIM24-BRAF fusion polypeptide is a polynucleotide comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 5.
  • a typical example of cDNA encoding the CD74-NRG1 fusion polypeptide is a polynucleotide comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 7 or 9.
  • a typical example of cDNA encoding the SLC3A2-NRG1 fusion polypeptide is a polynucleotide comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 35.
  • the polynucleotide of the present invention can be produced by a method known per se.
  • it can extract from a genomic library using a well-known hybridization technique.
  • it can also prepare by amplifying using mRNA, cDNA, or genomic DNA prepared from the said cancer tissue etc.
  • PCR gene amplification technique
  • the fusion polypeptide of the present invention or a fragment thereof can also be produced by a method known per se. For example, by inserting the polynucleotide prepared as described above into an appropriate expression vector, introducing the vector into a cell-free protein synthesis system (for example, reticulocyte extract, wheat germ extract), and incubation, Further, the fusion polypeptide of the present invention can be prepared by introducing the vector into an appropriate cell (for example, E. coli, yeast, insect cell, animal cell) and culturing the obtained transformant.
  • a cell-free protein synthesis system for example, reticulocyte extract, wheat germ extract
  • the fusion polypeptide of the present invention can be prepared by introducing the vector into an appropriate cell (for example, E. coli, yeast, insect cell, animal cell) and culturing the obtained transformant.
  • the fusion polypeptide of the present invention or a fragment thereof can be used as a marker in the detection method of the present invention, and can also be used for production of an antibody against the fusion polypeptide of the present invention.
  • RNA was prepared from lung tissue collected from cancer patients.
  • RNA sequencing> A cDNA library for RNA sequencing was prepared using an mRNA-Seq sample preparation kit (Illumina) according to the manufacturer's standard protocol. Briefly, poly-A (+) RNA was purified from 2 ⁇ g of total RNA, fragmented by heating with fragmentation buffer at 94 ° C. for 5 minutes, and then used for double-stranded cDNA synthesis. The obtained double-stranded cDNA was ligated to PE adapter DNA and then amplified by PCR.
  • the library thus prepared was subjected to a 50-bp or 75-bp paired end sequence using a genome analyzer IIx sequencer (GAIIx, manufactured by Illumina) or a high-spec sequencer (HiSeq2000, manufactured by Illumina).
  • GAIIx genome analyzer IIx sequencer
  • HiSeq2000 high-spec sequencer
  • Detection of the fusion transcript was performed using the deFuse program described in McPherson, A. et al PLoS Comput Biol. 2011 May; 7 (5): e1001138. Specifically, paired end reads were aligned with a reference sequence consisting of a spliced gene sequence and an unspliced gene sequence. Next, with respect to alignments (ambiguous discordant alignments) that do not match the reference sequence, alignment was performed assuming a possible gene fusion of two genes.
  • RNA 500 ng was reverse transcribed using Superscript III reverse transcriptase (registered trademark, manufactured by Invitrogen).
  • the obtained cDNA corresponding to 10 ng of total RNA or 10 ng of genomic DNA was subjected to PCR amplification using KAPA Taq DNA polymerase (manufactured by KAPA Biosystems). The reaction was performed in a thermal cycler under the following conditions: 95 cycles at 30 ° C for 30 seconds, 60 ° C for 30 seconds, 72 ° C for 2 minutes, followed by a final extension reaction at 72 ° C for 10 minutes.
  • GPDH glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase
  • Example 1 This example describes the identification of novel fusion transcripts in lung cancer tissue.
  • RNA sequencing RNA sequencing, Meyerson, M. et al., Nat
  • RNA sequencing RNA sequencing, Meyerson, M. et al., Nat
  • 3 non-cancer lung tissues to identify new fusion transcripts that could be therapeutic targets Rev Genet, 2010, 11, 685-696.
  • RNA sequencing was analyzed, and reverse transcription (RT) -PCR product Sanger sequencing was performed. As a result, as shown in Table 2 and FIG. 1, four novel fusion gene products were identified.
  • EZR-ERBB4 is a fusion gene of EZR gene present on chromosome 6q25 and ERBB4 gene present on chromosome 2q34 generated by chromosome translocation t (2; 6).
  • KIAA1468-RET is a fusion gene of KIAA1468 gene present on chromosome 18q21 and RET gene present on chromosome 10q11 generated by chromosome translocation t (10; 18).
  • TRIM24-BRAF is a fusion gene of TRIM24 gene present on chromosome 7q33 and BRAF gene present on chromosome 7q34 generated by chromosome inversion inv7.
  • CD74-NRG1 is a fusion gene of CD74 gene present on chromosome 5q32 and NRG1 gene present on chromosome 8p12, which is generated by chromosome translocation t (5; 8).
  • EZR-ERBB4, KIAA1468-RET, and TRIM24-BRAF were each detected from one lung cancer sample.
  • variants with different break points were detected from two different lung cancer samples (variant 1 and 2).
  • Example 2 This example describes the detection by RT-PCR of the gene fusion found in Example 1.
  • PCR primers forward primer and reverse primer, respectively
  • RNA derived from cancer tissue were prepared (Table 1).
  • PCR amplification was performed using cDNA synthesized from RNA derived from cancer tissue as a template.
  • FIG. 1 An electrophoresis diagram of the PCR product is shown in FIG. Specific sample amplification was observed in some samples, and further, as a result of determining the nucleotide sequence of the PCR product, it was confirmed that a part of the fusion gene was amplified.
  • Example 1 the gene fusion found in Example 1 can be detected by examining the presence or absence of specific band amplification by RT-PCR and determining the base sequence of the PCR product.
  • Example 3 This example shows that the gene fusion found in Example 1 is likely to be a responsible mutation for lung cancer.
  • EGFR point mutation / in-frame deletion mutation (EGFR point mutation, EGFR in-flame deletion mutation) which is a responsible mutation of other known cancers in 5 cases of lung cancer in which novel gene fusion was found in Example 1 , KRAS point mutation (KRAS point mutation), BRAF point mutation (BRAF point mutation), HER2 in-frame insertion mutation (HER2 in-flame insertion mutation), EML4-ALK gene fusion (EML4-ALK fusion), KIF5B-RET gene fusion (KIF5B-RET fusion), CCDC6-RET gene fusion (CCDC6-RET fusion), CD74-ROS1 gene fusion (CD74-ROS1 fusion), EZR-ROS1 gene fusion (EZR-ROS1 fusion) and SLC34A2-ROS1 gene fusion (SLC34A2 -ROS1 fusion) was examined.
  • KRAS point mutation KRAS point mutation
  • BRAF point mutation BRAF point mutation
  • Example 4 In this example and Example 5, the results of further analysis of 90 cases included in 114 cases analyzed in Example 1 are shown.
  • RNA sequencing libraries were prepared from 1 or 2 ⁇ g of total RNA using mRNA-Seq Sample Prep Kit or TruSeq RNA Sample Prep Kit (Illumina, San Diego, CA, USA). The resulting library was subjected to paired-end sequencing of 50 or 75 bp reads with Genome Analyzer IIx (GAIIx) or HiSeq 2000 (Illumina). Fusion transcripts were detected using the TopHat-Fusion algorithm (Kim D, Salzberg SL. TopHat-Fusion: an algorithm for discovery of novel fusion transcripts. Genome Biol. 2011, 12, R72).
  • ⁇ Test of carcinogenic properties of fusion products To construct a lentiviral vector for the expression of CD74-NRG1, EZR-ERBB4 and TRIM24-BRAF fusion proteins, full-length cDNA was amplified from tumor cDNA by PCR and transferred to pLenti-6 / V5-DEST plasmid (Invitrogen) Inserted. The integrity of each insert cDNA was confirmed by Sanger sequencing. Expression of the expected size fusion product was confirmed by Western blot analysis of transiently transfected and virus infected cells (FIG. 3).
  • IMA patients comprised approximately 2% of all LADC cases who underwent surgical treatment at the National Cancer Center Central Hospital (Tokyo, Japan) from 1998 to 2013.
  • the excised tissue was fixed with 10% formalin and embedded in paraffin.
  • 4 ⁇ m serial sections were stained with hematoxylin and eosin using the Alcian blue-periodic acid Schiff method to visualize cytoplasmic mucin production.
  • Total RNA was extracted from roughly cut and snap-frozen tissue samples using TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) and the quality was measured using 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). , USA). All samples had RNA Integrity Numbers (RINs)> 6.0.
  • HRM high resolution melting
  • RNA 500 ng was reverse transcribed into cDNA using Superscript III Reverse Transcriptase (Invitrogen).
  • cDNA corresponding to 10 ng total RNA
  • 10 ng genomic DNA was subjected to PCR amplification using KAPA Taq DNA Polymerase (KAPA Biosystems, Woburn, MA, USA). The reaction was carried out in a thermal cycler under the following conditions: 95 ° C for 30 seconds, 60 ° C for 30 seconds, and 72 ° C for 2 seconds, 40 cycles, 72 ° C for 10 minutes final extension.
  • GPDH glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase
  • NIH3T3 cells were provided by Dr. Masaru Yamamoto from Okinawa Institute of Science and Technology (Okinawa, Japan).
  • NCI-H1299 cells were provided by Dr. J. D. Minna of UT Southwestern Medical Center.
  • EFM19 and 293FT cells were obtained from DSMZ (Braunschweig, Germany) and Invitrogen, respectively.
  • H1299 and EFM-19 were cultured in RPMI medium containing 10% FBS
  • NIH3T3 and 293FT were cultured in DMEM medium containing 10% FBS.
  • Lapatinib, afatinib, and sorafenib were purchased from Selleck (Houston, TX, USA).
  • U0126 was purchased from Calbiochem (San Diego, CA, USA).
  • ERBB4 Primary antibodies against ERBB4 (Catalog No. 2218-1) and primary antibodies against ERBB2 (Catalog No. 2064-1) were purchased from Epitomics (Burlingame, CA, USA). Antibodies against BRAF (Cat. No. sc-166) and ERBB3 (Cat. No. sc-285) were purchased from Santa ⁇ Cruz Biotechnology (Dallas, TX, USA). An antibody (catalog number RB-276) against the EGF-like domain of NRG1 (Wilson®TR, et al. Cancer Cell. 2011, 20, 158-72) was purchased from Thermo Scientific (Fremont, CA, USA). Antibody against phospho-ERBB4 pTyr1284 (Cat.
  • Immunohistochemistry was performed on tissue microarray sections. 4 ⁇ m thick sections were deparaffinized and heat-induced epitope activation using target activation solution 9 (Dako, Carpinteria, CA, USA) for BRAF and NRG and citrate buffer for ERBB4 (Heat-induced epitope retrieval) was performed. Slides were treated with 3% hydrogen peroxide for 20 minutes to inhibit endogenous peroxidase activity and then washed with deionized water for 2-3 minutes. Slides were then primary antibody against BRAF (1: 800, polyclonal, Sigma, St.
  • Full-length CD74-NRG1, EZR-ERBB4, and TRIM24-BRAF cDNA were obtained by PCR amplification of cDNA from each index tumor sample using KOD-PLUS Taq polymerase (Toyobo, Osaka, Japan).
  • the PCR product was digested with restriction enzymes and ligated into pLenti-6 / V5-DEST plasmid (Invitrogen). The integrity of each insert cDNA was confirmed by Sanger sequencing.
  • empty plasmids or plasmids expressing CD74-NRG1, TRIM24-BRAF or EZR-ERBB4 cDNA were transfected into 80% confluent NCI-H1299 lung cancer cells using Lipofectamine 2000 reagent did. Cells were used for the assay after 24 hours incubation in supplemented RPMI medium.
  • NIH3T3 fibroblasts were infected with empty lentivirus or lentivirus expressing CD74-NRG1, EZR-ERBB4, or TRIM24-BRAF and then blasticidin ( 4 ⁇ g / ml) for 2 weeks. Mass cultured blasticidin resistant cells were used in the assay.
  • HER2 HER3 signaling by CD74-NRG1>
  • EFM-19 breast cancer cells expressing both ERRB2 / HER2 and ERBB3 / HER3 proteins were used as reporter cells.
  • NCI-H1299 cells transiently transfected with CD74-NRG1 expression plasmid or empty (control) plasmid were washed twice with PBS and serum starved overnight by incubation in serum-free medium. The medium was collected and centrifuged at 4 ° C.
  • EMF-19 cells were incubated for 30 minutes with these conditioned media supplemented with DMSO (vehicle control) or HER-TKI. The whole cell lysate was then subjected to SDS-PAGE and immunoblotting.
  • ⁇ Soft agar assay> NIH3T3 cells infected with empty lentivirus, or CD74-NRG1, EZR-ERBB4, or TRIM24-BRAF lentivirus, upper layer of 0.3% SeaPlaque agarose (Lonza, Rockland, ME, USA) on 0.6% agarose substrate Were seeded in triplicate at 4,000 cells / well in a 24-well plate. Medium containing DMSO or tyrosine kinase inhibitor was added to the top agar and also over the 0.3% agarose layer. The cover medium was changed twice a week. After 14 days, colonies with a diameter greater than 100 ⁇ m were counted.
  • ⁇ Tumorogenicity assay in nude mice > Stable NIH3T3 cells (5 x 10 6 ) with empty vectors or vectors expressing EZR-ERBB4 or TRIM24-BRAF fusion proteins are resuspended in PBS containing 50% Matrigel (BD Biosciences, Bedford, MA, USA) It became cloudy. Cells were injected subcutaneously into the right flank of 6 week old female nu / nu mice. Tumor size was measured twice a week until the tumor size reached approximately 2 cm ⁇ 2 cm. A photo was taken on the 21st day. All studies on mice were approved by the National Cancer Center's Ethical Committee on Animal Experimentation.
  • IMAs Thirty-two IMAs, including 27 all negative and 5 KRAS mutation positive, were subjected to RNA sequencing (Table 3). Analysis of> 2 x 10 7 pair end reads obtained by RNA sequencing followed by confirmation of RT-PCR products by Sanger sequencing revealed that the four novel gene fusion transcripts (CD74-NRG1, EZR- In addition to ERBB4, TRIM24-BRAF, and KIAA1468-RET), another novel gene fusion transcript (SLC3A2-NRG1) was found. These were detected only in all negative IMA ( Figures 1 and 4-6 and Tables 1 and 4).
  • Example 5 Four new fusion genes, CD74-NRG1, SLC3A2-NRG1, EZR-ERBB4, and TRIM24-BRAF, reconstitute the gene encoding the protein kinase or receptor protein kinase ligand (NRG1 / neuregulin / herregulin). For this gene, no rearrangement that causes canceration in lung cancer has been reported so far (FIG. 7). The remaining fusion gene was a new type involving the RET oncogene; RET fusion is found in 1-2% of LADC (Drilon A, et al. Cancer Discov. 2013, 3, 630-5 Takeuchi K, et al. Nat Med.
  • CD74-NRG1, SLC3A2-NRG1, EZR-ERBB4, and KIAA1468-RET are likely caused by interchromosomal translocations, and the TRIM24-BRAF gene fusion does not sandwich the centromere ( Most likely caused by paracentric inversion (Table 4 and Figure 7).
  • fluorescence in situ hybridization (FISH) analysis of CD74-NRG1 fusion-positive tumors observed separation of the signals generated by the two probes adjacent to the NRG1 translocation site in fusion-positive tumors. (FIG. 8).
  • CD74-NRG1 and SLC3A2-NRG1 fusion protein contains the transmembrane domain of CD74 or SLC3A2 and epidermal growth factor (EGF1) of NRG1 protein (NRG1 III- ⁇ 3 form) ) -Like domain (FIGS. 1 and 4).
  • NRG1 III- ⁇ 3 protein has a cytoplasmic N-terminal region and a membrane-tethered EGF-like domain that mediates the Jackson line signal transmitted through the HER2: HER3 receptor (Falls DL. Exp Cell Res. 2003, 284, 14-30).
  • EFM-19 cells Exposure of EFM-19 cells to conditioned medium from H1299 human lung cancer cells expressing exogenous CD74-NRG1 fusion protein resulted in phosphorylation of endogenous ERBB2 / HER2 and ERBB3 / HER3 proteins. Suggests that autocrine HER2: HER3 signaling was activated by the secreted NRG1 ligand produced from the CD74-NRG1 polypeptide (FIG. 10A). The phosphorylation of ERK and AKT, mediators downstream of HER2: HER3, was also increased.
  • HER2, HER3, and ERK phosphorylation is an FDA-approved TKI that targets HER kinases, lapatinib and afatinib (Majem M and Pallares C. Clin Transl Oncol. 2013, 15, 343-57; Perez EA and Spano JP. Cancer. 2012, 118, 3014-25; Nelson V, et al. Onco Targets Ther. 2013, 6, 135-43).
  • NRG1 fusion activated HER2: HER3 signaling through a jack star line and / or autocrine mechanism.
  • the EZR-ERBB4 fusion protein contained an EZR coiled-coil domain that functions in protein dimerization, and also retained the full-length ERBB4 kinase domain (FIG. 1). Similar to the case of EZR-ROS1 fusion (Takeuchi K, et al. Nat Med. 2012, 18, 378-81), EZR-ERBB4 protein is homodimer via the coiled-coil domain of EZR. It is highly likely to cause abnormal activation of the kinase function of ERBB4.
  • the TRIM24-BRAF fusion protein retained the BRAF kinase domain, but lacked the N-terminal RAS binding domain responsible for the negative regulation of BRAF kinase. These characteristics are similar to those of ESRP1-BRAF and AGTRAP-BRAF fusions in other cancers (Palanisamy N, et al. Nat Med. 2010, 16, 793-8). Suggests that When TRIM24-BRAF cDNA was expressed exogenously in NIH3T3 cells, ERK, a mediator downstream of BRAF, was phosphorylated without serum stimulation, indicating that fusion with TRIM24 abnormally activated BRAF kinase (FIG. 10C).
  • Phosphorylation of ERK is a sodafenib (Wilhelm SM, et al. Mol Cancer Ther. 2008, 7, 3129-40), an FDA-approved drug normally approved as a RAF kinase inhibitor, and a MEK inhibitor U0126 (FIG. 10C).
  • NIH3T3 fibroblasts Exogenous expression of the cDNA of the fusion gene induces anchorage-independent growth of NIH3T3 fibroblasts, indicating the transforming activity of the fusion gene (FIGS. 10D-F). This proliferation was suppressed by the kinase inhibitor that suppressed the activation of signal transduction induced by fusion as described above.
  • NIH3T3 cells expressing cDNA of EZR-ERBB4 or TRIM24-BRAF fusion formed tumors in nude mice (FIG. 11). Therefore, it was concluded that these three fusion genes function as driver mutations in IMA development. Two hundred commonly used human lung cancer cell lines were screened, and all three of these fusion genes were negative (data not shown).
  • NRG1, ERBB4 and BRAF fusions are novel driver mutations involved in the development of IMA in the lung (FIG. 12) and may be targets for existing TKIs.
  • NRG1 was previously identified as a regulator of goblet cell formation in primary cultures of human bronchial epithelial cells (Kettle R, et al. Am J Respir Cell Mol Biol. 2010, 42, 472-81). Many are particularly noteworthy; therefore, signaling pathways mediated by NRG1 may play a role in IMA development by contributing to both cell transformation and goblet cell morphology acquisition is there.
  • a substance that suppresses the expression and / or activity of a polypeptide encoded by a fusion polynucleotide produced by detecting a gene fusion newly found as a responsible mutation for cancer and the gene fusion results in a therapeutic effect. It is possible to identify a cancer patient or a subject who is at risk for cancer, and to perform treatment suitable for such a cancer patient.
  • SEQ ID NO: 1 EZR-ERBB4 fusion polynucleotide
  • SEQ ID NO: 2 EZR-ERBB4 fusion polypeptide
  • SEQ ID NO: 3 KIAA1468-RET fusion polynucleotide
  • SEQ ID NO: 4 KIAA1468-RET fusion polypeptide
  • SEQ ID NO: 5 TRIM24-BRAF fusion polynucleotide
  • SEQ ID NO: 6 TRIM24-BRAF fusion polypeptide
  • SEQ ID NO: 7 CD74-NRG1 fusion polynucleotide (variant 1)
  • SEQ ID NO: 8 CD74-NRG1 fusion polypeptide (variant 1)
  • SEQ ID NO: 9 CD74-NRG1 fusion polynucleotide (variant 2)
  • SEQ ID NO: 10 CD74-NRG1 fusion polypeptide (variant 2)
  • SEQ ID NOs: 11 to 18 Primer sequence

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Abstract

　がんの責任変異（ドライバー変異）である遺伝子融合の検出方法であって、がんを有する被験者由来の単離された試料におけるEZR-ERBB4融合ポリヌクレオチド、KIAA1468-RET融合ポリヌクレオチド、TRIM24-BRAF融合ポリヌクレオチド、CD74-NRG1融合ポリヌクレオチド、もしくはSLC3A2-NRG1融合ポリヌクレオチドのいずれかの融合ポリヌクレオチドまたはそれによりコードされるポリペプチドを検出する工程を含む、方法。

Description

肺がんで見出された新規融合遺伝子
　本発明は、がんの責任変異である遺伝子融合の検出方法、該遺伝子融合により生じる融合ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの発現および／または活性を抑制する物質が治療効果をもたらすがんの患者またはがんのリスクを有する被験者を同定する方法などに関する。
　がんは日本における死因の第一位を占める疾病であり、その治療法の改善が求められている。特に肺がんは、日本のみならず世界においてもがん死の筆頭要因であり、年間100万人以上の死をもたらす。肺がんは大きく小細胞肺がんと非小細胞肺がんとに分けられ、さらに非小細胞肺がんは、肺腺がん（lung adenocarcinoma、LADC）、肺扁平上皮がん、大細胞がんの3種類に分けられる。これらのうち、肺腺がんは非小細胞肺がんの約50％を占め、その頻度は上昇している（非特許文献１）。
　肺腺がんに関しては、かなりの部分が、がん遺伝子の活性化によって発生することが明らかになっている。がん遺伝子の活性化においては、EGFR遺伝子（10～40％）やKRAS遺伝子（10～20％）の体細胞変異、ALK遺伝子とEML4（echinoderm microtubule-associated protein-like 4）遺伝子との融合やALK遺伝子とKIF5B遺伝子との融合等（5％）が相互排他的（mutually exclusive）に生じていることも明らかとなっている（非特許文献２～６）。
　進行した肺がんにおいては、薬剤による治療が主体となるが、個々の症例で薬剤に対する反応性が大きく異なるため、どのような薬剤が治療効果を有するかを予測する手段が求められている。そのため、前述の通り、変異遺伝子や融合遺伝子といった、その予測の指標となり得る分子の同定が進められており、例えば、EGFRやALKタンパク質を標的としたチロシンキナーゼ阻害剤はEGFR変異やALK融合を持つ肺腺がんの治療に特に有効であることが明らかになっている。さらに、肺がんの4～5％に存在するALKチロシンキナーゼ遺伝子の融合を検出する手法がALKタンパク質のチロシンキナーゼに対する阻害剤適応例の選出法として開発され、ALKチロシンキナーゼ遺伝子の融合を検出するための試薬は診断薬として臨床の場で用いられている。
　一方本発明者らは、肺腺がんの全トランスクリプトームシークエンシングにより、KIF5B（kinesin family 5B）遺伝子と受容体型チロシンキナーゼをコードするがん遺伝子であるRET遺伝子とのインフレーム融合転写産物を同定している（特許文献１及び非特許文献７）。KIF5B-RET遺伝子融合は、EGFR変異、KRAS変異、ALK融合といった公知のがん遺伝子活性化変異とは相互排他的に生じていたことから、がん化における責任変異であることが示されている。当該遺伝子融合から生じる融合タンパク質は、KIF5B部分のコイルドコイルドメインを介して基質なしに2量体化し、その結果RETキナーゼの異常な活性化が起こると考えられる。そのため、当該遺伝子融合を有する患者においては、RETチロシンキナーゼ阻害剤が有効であると期待されている。
国際公開第2013/018882号
Herbst, R. S. et al., The New England journal of medicine, 2008, 359, 1367-1380 Paez, J. G. et al., Science, 2004, 304, 1497-1500 Takeuchi, K. et al., Clin Cancer Res, 2009, 15, 3143-3149 Soda, M. et al., Nature, 2007, 448, 561-566 Janku, F. et al., Nat Rev Clin Oncol, 2010, 7, 401-414 Lovly, C. M. et al., Nat Rev Clin Oncol, 2011, 8, 68-70 Kohno, T. et al., Nat Medicine, 2012, 18(3), 375-377
　肺がんなどのがんにおける変異の同定はいまだ十分になされているとはいえず、薬剤による治療の有効性を予測する指標となりうる変異のさらなる同定が望まれているのが現状である。
　したがって本発明は、肺がんなどのがんにおいて薬剤による治療の有効性を予測する指標となりうる変異を同定すること、当該変異を検出する手段を提供すること、当該変異に基づき、当該変異を有する遺伝子またはそれにコードされるタンパク質を標的とする薬剤が治療効果をもたらすがんの患者またはがんのリスクを有する被験者を同定する手段を提供することなどを目的とする。
　本発明者らは、前記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、全トランスクリプトームシークエンシングの手法を利用して、EZR-ERBB4、KIAA1468-RET、TRIM24-BRAF、CD74-NRG1、及びSLC3A2-NRG1遺伝子融合がそれぞれ独立に肺がんに存在することを見出した。これらの遺伝子融合の陽性例は、公知の肺がん責任変異（ドライバー変異）であるEGFR点変異・インフレーム欠失変異(EGFR point mutation, EGFR in-flame deletion mutation)、KRAS点変異(KRAS point mutation)、BRAF点変異(BRAF point mutation)、HER2インフレーム挿入変異(HER2 in-flame insertion mutation)、EML4-ALK遺伝子融合(EML4-ALK fusion)、KIF5B-RET遺伝子融合(KIF5B-RET fusion)、CCDC6-RET遺伝子融合(CCDC6-RET fusion)、CD74-ROS1遺伝子融合(CD74-ROS1 fusion)、EZR-ROS1遺伝子融合(EZR-ROS1 fusion)及びSLC34A2-ROS1遺伝子融合(SLC34A2-ROS1 fusion)については陰性であり、これらの遺伝子融合ががん化における責任変異であることが明らかとなった。
　EZR-ERBB4及びKIAA1468-RET遺伝子融合によって生じるタンパク質は、公知の膜型チロシンキナーゼの融合タンパク質（Kohno, T. et al., Nat Medicine, 2012, 18(3), 375-377）と同様に、コイルドコイルドメインを介して、基質なしに2量体化して恒常活性化すると推定された。またTRIM24-BRAF遺伝子融合によって生じるタンパク質は、既に同定されていた別のBRAF融合遺伝子（Palanisamy, N. et al., Nat Medicine, 2010, 16(7), 793-798）と同様に、BRAFタンパク質のN末端側に存在するキナーゼ抑制ドメインがなくなることで、恒常活性化すると推定された。したがって、これらの遺伝子融合陽性がんに対しては、それぞれERBB4キナーゼ、RETキナーゼ、及びBRAFキナーゼの阻害薬などが治療効果をもたらすと考えられる。
　またCD74-NRG1及びSLC3A2-NRG1遺伝子融合によって生じるタンパク質は、これまでに同定されているNRG1融合タンパク質（Adelaide, J. et al., GENES, CHROMOSOMES & GANCER, 2003, 37, 333-345及びWilson, T.R. et al., Cancer Cell, 2011, 20, 158-172）と同様に、融合することで高発現し、オートクライン機構で、細胞の増殖及び生存に正に働くと推定された。したがって、当該遺伝子融合陽性がんに対しては、細胞増殖因子NRG1に対する抗体薬あるいはその受容体であるHERタンパク質群に対する抗体薬又はキナーゼ阻害薬などが治療効果をもたらし得る。
　これらのことから本発明者らは、さらに研究を重ねた結果、肺がんなどのがんにおいて、当該遺伝子融合に基づき、当該遺伝子またはそれにコードされるタンパク質を標的とする薬剤が治療効果をもたらすがんの患者またはがんのリスクを有する被験者を同定することが可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。
　即ち、本発明は以下の通りである。
［１］がんの責任変異（ドライバー変異）である遺伝子融合の検出方法であって、がんを有する被験者由来の単離された試料における下記（a）～（e）のいずれかの融合ポリヌクレオチドまたはそれによりコードされるポリペプチドを検出する工程を含む、方法：
（a）EZR-ERBB4融合ポリヌクレオチドであって、EZRのコイルドコイルドメインの全部または一部及びERBB4のキナーゼドメインを含みかつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（b）KIAA1468-RET融合ポリヌクレオチドであって、KIAA1468のコイルドコイルドメインの全部または一部及びRETのキナーゼドメインを含みかつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（c）TRIM24-BRAF融合ポリヌクレオチドであって、BRAFのキナーゼドメインを含みかつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（d）CD74-NRG1融合ポリヌクレオチドであって、CD74の膜貫通ドメイン及びNRG1のEGFドメインを含みかつ細胞内情報伝達を亢進する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；ならびに
（e）SLC3A2-NRG1融合ポリヌクレオチドであって、SLC3A2の膜貫通ドメイン及びNRG1のEGFドメインを含みかつ細胞内情報伝達を亢進する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
［２］融合ポリヌクレオチドが下記（a）～（e）のいずれかである、［１］に記載の方法：
（a）下記のポリペプチドをコードするEZR-ERBB4融合ポリヌクレオチド：
（i）配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ii）配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドにおいて、1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつキナーゼ活性を有するポリペプチド、または
（iii）配列番号2で表されるアミノ酸配列と80％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつキナーゼ活性を有するポリペプチド；
（b）下記のポリペプチドをコードするKIAA1468-RET融合ポリヌクレオチド：
（i）配列番号4で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ii）配列番号4で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドにおいて、1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつキナーゼ活性を有するポリペプチド、または
（iii）配列番号4で表されるアミノ酸配列と80％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつキナーゼ活性を有するポリペプチド；
（c）下記のポリペプチドをコードするTRIM24-BRAF融合ポリヌクレオチド：
（i）配列番号6で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ii）配列番号6で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドにおいて、1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつキナーゼ活性を有するポリペプチド、または
（iii）配列番号6で表されるアミノ酸配列と80％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつキナーゼ活性を有するポリペプチド；
（d）下記のポリペプチドをコードするCD74-NRG1融合ポリヌクレオチド：
（i）配列番号8または10で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ii）配列番号8または10で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドにおいて、1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、細胞内情報伝達を亢進する活性を有するポリペプチド、または
（iii）配列番号8または10で表されるアミノ酸配列と80％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、細胞内情報伝達を亢進する活性を有するポリペプチド；および
（e）下記のポリペプチドをコードする、SLC3A2-NRG1融合ポリヌクレオチド：
（i）配列番号36で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ii）配列番号36で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドにおいて、1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、細胞内情報伝達を亢進する活性を有するポリペプチド、または
（iii）配列番号36で表されるアミノ酸配列と80％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、細胞内情報伝達を亢進する活性を有するポリペプチド。
［３］融合ポリヌクレオチドが下記（a）～（e）のいずれかである、［１］または［２］に記載の方法：
（a）（i）配列番号1で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（ii）配列番号1で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（iii）配列番号1で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて、1若しくは複数のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または
（iv）配列番号1で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと80％以上の配列同一性を有し、かつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（b）（i）配列番号3で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（ii）配列番号3で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（iii）配列番号3で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて、1若しくは複数のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または
（iv）配列番号3で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと80％以上の配列同一性を有し、かつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（c）（i）配列番号5で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（ii）配列番号5で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（iii）配列番号5で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて、1若しくは複数のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または
（iv）配列番号5で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと80％以上の配列同一性を有し、かつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（d）（i）配列番号7または9で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（ii）配列番号7または9で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ細胞内情報伝達を亢進する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（iii）配列番号7または9で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて、1若しくは複数のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつ細胞内情報伝達を亢進する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または
（iv）配列番号7または9で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと80％以上の配列同一性を有し、かつ細胞内情報伝達を亢進する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；および
（e）（i）配列番号35で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（ii）配列番号35で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ細胞内情報伝達を亢進する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（iii）配列番号35で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて、1若しくは複数のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつ細胞内情報伝達を亢進する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または
（iv）配列番号35で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと80％以上の配列同一性を有し、かつ細胞内情報伝達を亢進する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
［４］がんが肺がんである、［１］～［３］のいずれかに記載の方法。
［５］がんの責任変異（ドライバー変異）である遺伝子融合により生じる融合ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの発現および／または活性を抑制する物質が治療効果をもたらすがんの患者またはがんのリスクを有する被験者を同定する方法であって、下記の工程を含む、方法：
（1）被験者由来の単離された試料における下記（a）～（e）のいずれかの融合ポリヌクレオチドまたはそれによりコードされるポリペプチドを検出する工程：
（a）EZR-ERBB4融合ポリヌクレオチドであって、EZRのコイルドコイルドメインの全部または一部及びERBB4のキナーゼドメインを含みかつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（b）KIAA1468-RET融合ポリヌクレオチドであって、KIAA1468のコイルドコイルドメインの全部または一部及びRETのキナーゼドメインを含みかつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（c）TRIM24-BRAF融合ポリヌクレオチドであって、BRAFのキナーゼドメインを含みかつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（d）CD74-NRG1融合ポリヌクレオチドであって、CD74の膜貫通ドメイン及びNRG1のEGFドメインを含みかつ細胞内情報伝達を亢進する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ならびに
（e）SLC3A2-NRG1融合ポリヌクレオチドであって、SLC3A2の膜貫通ドメイン及びNRG1のEGFドメインを含みかつ細胞内情報伝達を亢進する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；ならびに
（2）前記融合ポリヌクレオチドまたはそれによりコードされるポリペプチドが検出された場合に、前記ポリペプチドの発現および／または活性を抑制する物質が前記被験者において治療効果をもたらすと判定する工程。
［６］がんの責任変異（ドライバー変異）である遺伝子融合の検出用キットであって、下記（A）～（C）のいずれかまたはそれらの組合せを含む、キット：
（A）EZR-ERBB4融合ポリヌクレオチド、KIAA1468-RET融合ポリヌクレオチド、TRIM24-BRAF融合ポリヌクレオチド、CD74-NRG1融合ポリヌクレオチド、またはSLC3A2-NRG1融合ポリヌクレオチドを特異的に認識するように設計されたプローブであるポリヌクレオチド；
（B）EZR-ERBB4融合ポリヌクレオチド、KIAA1468-RET融合ポリヌクレオチド、TRIM24-BRAF融合ポリヌクレオチド、CD74-NRG1融合ポリヌクレオチド、またはSLC3A2-NRG1融合ポリヌクレオチドを特異的に増幅できるように設計された一対のプライマーであるポリヌクレオチド；あるいは
（C）EZR-ERBB4融合ポリペプチド、KIAA1468-RET融合ポリペプチド、TRIM24-BRAF融合ポリペプチド、CD74-NRG1融合ポリペプチド、またはSLC3A2-NRG1融合ポリペプチドを特異的に認識する抗体。
［７］EZRタンパク質のコイルドコイルドメインの全部または一部及びERBB4タンパク質のキナーゼドメインを含みかつキナーゼ活性を有する、単離されたEZR-ERBB4融合ポリペプチドまたはその断片。
［８］KIAA1468タンパク質のコイルドコイルドメインの全部または一部及びRETタンパク質のキナーゼドメインを含みかつキナーゼ活性を有する、単離されたKIAA1468-RET融合ポリペプチドまたはその断片。
［９］BRAFタンパク質のキナーゼドメインを含みかつキナーゼ活性を有する、単離されたTRIM24-BRAF融合ポリペプチドまたはその断片。
［１０］CD74タンパク質の膜貫通ドメイン及びNRG1タンパク質のEGFドメインを含みかつ細胞内情報伝達を亢進する活性を有する、単離されたCD74-NRG1融合ポリペプチドまたはその断片。
［１１］SLC3A2タンパク質の膜貫通ドメイン及びNRG1タンパク質のEGFドメインを含みかつ細胞内情報伝達を亢進する活性を有する、単離されたSLC3A2-NRG1融合ポリペプチドまたはその断片。
［１２］［７］～［１１］のいずれかに記載の融合ポリペプチドまたはその断片をコードするポリヌクレオチド。
［１３］がんの治療方法であって、［５］に記載の方法によりがんの責任変異（ドライバー変異）である遺伝子融合により生じる融合ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの発現および／または活性を抑制する物質が治療効果をもたらすと判定された被験者に、前記融合ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの発現および／または活性を抑制する物質を投与する工程を含む、方法。
［１４］がん治療剤のスクリーニング方法であって、下記の工程を含む、方法：
（1）［７］～［１１］のいずれかに記載の融合ポリペプチドを発現している細胞に被験物質を接触させる工程；
（2）前記融合ポリペプチドの発現および／または活性が抑制されるか否かを決定する工程；ならびに
（3）前記融合ポリペプチドの発現および／または活性を抑制すると決定された物質をがん治療剤として選択する工程。
　本発明によれば、本願発明によりはじめて明らかとなった特定のがんの未知の責任変異を検出することが可能となり、当該責任変異の存在に基づくがん治療が効果をもたらすがんの患者またはがんのリスクを有する被験者を同定すること、さらには当該がん患者を治療することが可能となる。
図１は、EZR-ERBB4、KIAA1468-RET、TRIM24-BRAF及びCD74-NRG1融合タンパク質のドメイン構造の一例を示す概略図である。下向き矢印は融合点を示す。 図２は、がん組織由来RNAから合成したcDNAを鋳型として、EZR-ERBB4、KIAA1468-RET、TRIM24-BRAF及びCD74-NRG1バリアント2の各遺伝子融合をRT-PCRにより検出した結果を示す電気泳動の写真である。下向き矢印は遺伝子融合陽性例を示す。 CD74-NRG1、EZR-ERBB4、またはTRIM24-BRAF cDNAsを発現するNIH3T3細胞の形質転換。（Ａ）一過性に形質導入したH1299細胞およびウイルス感染させたNIH3T3細胞においてウェスタンブロット解析によって検出した、遺伝子融合産物の発現。融合タンパク質に保持されているNRG1ペプチドを認識する抗体（カタログ番号: RB-276、Thermo Scientific）、融合タンパク質に保持されているERBB4ペプチドを認識する抗体（カタログ番号:2218-1、Epitomics）および融合タンパク質に保持されているBRAFペプチドを認識する抗体（カタログ番号: sc-166、Santa Cruz Biotechnology）を使用した。（Ｂ）CD74-NRG1（C8;N6）、EZR-ERBB4、またはTRIM24-BRAF cDNAsの発現によって誘導される、NIH3T3細胞の足場非依存的なコロニー増殖の顕微鏡写真。スケールバー、100μm。 浸潤性粘液性肺腺がんにおけるがん化をもたらす遺伝子融合。野生型タンパク質と新たに同定された融合タンパク質の概略図。切断点を矢印で示す。TM：膜貫通ドメイン。NRG1ポリペプチドにおける推定切断部位の位置を破線で示す。 RT-PCRによる遺伝子融合転写産物の検出。グリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）のRT-PCR産物を下に示す。遺伝子融合陽性の6例のIMA（T）を、それらの対応する非がん肺組織（N）と並べて示す；ゲル画像の下のラベルはサンプルID（表４参照）を表す。 新規融合転写産物のcDNAのサンガーシークエンシングの電気泳動図。CD74-NRG1（2つバリアントフォーム）、SLC3A2-NRG1、EZR-ERBB4、TRIM24-BRAF、およびKIAA1468-RET融合。RT-PCR産物を直接配列決定した。 NRG1、ERBB4、BRAF、およびRET再構成についてのゲノム構成の概略図。CD74-NRG1（Ａ）、SLC3A2-NRG1（Ｂ）、EZR-ERBB4（Ｃ）、TRIM24-BRAF（Ｄ）、およびKIAA1468-RET（Ｆ）融合についてのエクソンおよび非翻訳領域を含む、野生型および融合遺伝子のゲノム構成を示す図。数字は5'末端からのエクソンの番号を示し、矢印は転写の方向を示す。TRIM24およびBRAF遺伝子は、7番染色体上、逆向きで、2.2 Mbの範囲内に位置する；TRIM24-BRAF融合は、染色体の7q33-34の領域における動原体を挟まない逆位によって生じたと推測された（Ｂ）。切断点の位置を野生型遺伝子上の垂直の線で表す。 NRG1融合についてのbreak-apart蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）。（Ａ）NRG1遺伝子のゲノム構成、およびプローブとして使用したBACクローンの位置。（Ｂ）正常組織。（Ｃ）CD74-NRG1融合を有するIMA。FISHにより、転座部位に隣接する2つのプローブ由来の緑色の蛍光（テロメア側）とオレンジ色の蛍光（セントロメア側）との分離が明らかとなった。 融合陽性IMAから得た代表的な組織学的画像。融合タンパク質に保持されているポリペプチドを認識する抗体を使用して、免疫染色を実施した。（Ａ）（上段）NRG1再構成を有するIMA。腫瘍は、細かいエオシン好性細胞質および様々な量のムチンを有する高円柱状細胞から構成されていた。細かい粒状のクロマチンを伴う核の拡大および核の整列の狂いが見られる（元の倍率、×20）。（中段）CD74-NRG1融合陽性IMAにおけるNRG1染色。腺がん構成要素中に、パッチ状の粒状の細胞質の染色が見られる（元の倍率、×20）。（下段）融合陰性IMAにおけるNRG1染色（元の倍率、×20）。ほとんどの（>80%）ケースにおいて、融合陽性腫瘍の場合のような細胞質の粒状の染色が観察された。（Ｂ）(上段）ERBB4再構成を有するIMA。腫瘍は、基部に位置する小さい核を、そして細胞質の上方部分にムチンを有する高円柱状細胞から構成されていた（元の倍率、×20）。（中段）EZR-ERBB4融合陽性IMAにおけるERBB4 染色。細胞質の染色を伴う形質膜の強調が見られる（元の倍率、×40）。（下段）融合陰性IMAにおけるERBB4染色（元の倍率、×40）。>50%のケースにおいて、膜の強調を伴わない細胞質の染色が観察された。（Ｃ）(上段）BRAF再構成を有するIMA。腫瘍は、凝縮したエオシン好性ムチンを有する高円柱状細胞から構成されていた。核の拡大および核の重なりが見られる（元の倍率、×20）。（中段）TRIM24-BRAF融合陽性IMAにおけるBRAF染色。腺がん構成要素中に、拡散した強い粒状の細胞質の染色が見られる（元の倍率、×20）。（下段）融合陰性IMAにおけるBRAF染色（元の倍率、×40）。一部のケース（<10%）は、限局的な弱い細胞質の染色を示した。 遺伝子融合産物の発がん特性。Ａ、EFM-19細胞系を使用して実証されたCD74-NRG1融合によるERBB3活性化。CD74-NRG1 cDNAを外因性に発現するH1299細胞からの馴化培地で30分間処理したEFM-19（レポーター）細胞において、ERBB3、ERBB2、AKT、およびERKのリン酸化を調べた。HER-TKIによってリン酸化が抑制された。Ｂ、EZR-ERBB4融合によるERBB4活性化。安定的に形質導入したNIH3T3細胞を、24時間血清飢餓にし、DMSO（ビヒクル対照）またはTKIで2時間処理した。ERBB4およびERKのリン酸化は、ERBB4-TKIによって抑制された。EZR-ERBB4融合タンパク質に保持されているERBB4ポリペプチドを認識する抗体を使用して、当該融合タンパク質を検出した。Ｃ、TRIM24-BRAF融合によるBRAF活性化。安定的に形質導入したNIH3T3細胞を、24時間血清飢餓にし、DMSOまたはキナーゼ阻害剤で2時間処理した。ERKリン酸化（活性化）は、BRAFを標的とするキナーゼ阻害剤であるソラフェニブによって、ならびにMEK阻害剤であるU0126によって、抑制された。TRIM24-BRAF融合タンパク質に保持されているBRAFポリペプチドを認識する抗体を使用して、当該融合タンパク質を検出した。Ｄ～Ｆ、CD74-NRG1（Ｄ）、EZR-ERBB4（Ｅ）、またはTRIM24-BRAF（Ｆ）cDNAを発現するNIH3T3細胞の足場非依存的な増殖、およびキナーゼ阻害剤によるその抑制。モック-、CD74-NRG1-、EZR-ERBB4-、およびTRIM24-BRAF-形質導入NIH3T3細胞を、DMSO単独またはキナーゼ阻害剤を含むソフトアガーに播種した。14日後、直径が> 100μmのコロニーを数えた。棒グラフは、コロニー数の平均 ± S.E.M.を示す。 ERZ-ERBB4またはTRIM24-BRAF融合cDNAを発現するNIH3T3細胞の腫瘍形成能。Ａ、空ベクター、EZR-ERBB4融合、またはTRIM24-BRAF融合を発現するNIH3T3細胞を注入したヌードマウスにおける腫瘍増殖。細胞を50%マトリゲルで再懸濁し、ヌードマウスの右側腹部に注入した。腫瘍のサイズを、5週間、週2回測定した。データを平均 ±S.E.M.として示す。Ｂ、21日目に、代表的な腫瘍を写真撮影した。括弧内の数値は、細胞注入を受けたマウスの数に対する腫瘍を有するマウスの数の割合を表す。 表示されたドライバー変異を有するIMAの割合を示す円グラフ。
　後述の実施例において示す通り、本発明者らは、がん組織において、がんの責任変異（ドライバー変異）として5種の遺伝子融合、すなわちEZR-ERBB4遺伝子融合、KIAA1468-RET遺伝子融合、TRIM24-BRAF遺伝子融合、CD74-NRG1遺伝子融合、及びSLC3A2-NRG1遺伝子融合を初めて見出した。本発明はかかる知見に基づき、当該遺伝子融合の検出方法、当該責任変異の存在に基づくがん治療が効果をもたらすがんの患者またはがんのリスクを有する被験者の同定方法、がんの治療方法およびがん治療剤、がん治療剤のスクリーニング方法等を提供する。
　本発明において「がんの責任変異」とは、ドライバー変異と互換的に使用される用語であるが、がん組織に存在する変異であって、細胞に対するがん化能を有する変異をいう。典型的には、ある変異が見出されたがん組織において、既知のがん遺伝子変異（少なくとも、EGFR点変異・インフレーム欠失変異、KRAS点変異、BRAF点変異、HER2インフレーム挿入変異、ALK-EML4遺伝子融合、KIF5B-RET遺伝子融合、CCDC6-RET遺伝子融合、CD74-ROS1遺伝子融合、EZR-ROS1遺伝子融合及びSLC34A2-ROS1遺伝子融合）がいずれも存在しない場合（すなわち、当該変異が前記既知のがん遺伝子変異と相互排他的に存在する場合）、当該変異はがんの責任変異であるということができる。
＜具体的ながんの責任変異＞
　以下、各遺伝子融合について説明する。なお本明細書中、融合ポリヌクレオチドにおける「融合点」とは、5’側の遺伝子部分と3’側の遺伝子部分とが接続される境界を意味し、これは2つのヌクレオチド残基の間の境界である。また融合ポリペプチドにおける「融合点」とは、N末端側のポリペプチドとC末端側のポリペプチドとが接続される境界を意味し、これは2つのアミノ酸残基の間の境界であるか、または遺伝子融合が1つのコドン内で生じた場合には当該コドンによりコードされる1つのアミノ酸残基自体である。
（1）EZR-ERBB4遺伝子融合
　本遺伝子融合は、EZRタンパク質とERBB4タンパク質の融合タンパク質（以下、EZR-ERBB4融合ポリペプチドとも称する）の発現を生じる変異であり、ヒト染色体においては6q25および2q34の領域内に切断点を有する転座（t(2;6)）により生じる変異である。
　EZRタンパク質は、ヒトにおいては6q25に存在する遺伝子にコードされるタンパク質であり、典型的には配列番号20で表されるアミノ酸配列（NCBIアクセッション番号NP_001104547.1（09-JUN-2013）からなるタンパク質である。EZRタンパク質は、コイルドコイル（Coiled-coil）ドメインを有することを特徴としており（図１）、当該ドメインは、ヒトであれば配列番号20で表されるアミノ酸配列の300～550位のアミノ酸配列に該当する。
　ERBB4タンパク質は、ヒトにおいては2q34に存在する遺伝子にコードされるタンパク質であり、典型的には配列番号22で表されるアミノ酸配列（NCBIアクセッション番号NP_001036064.1（15-JUN-2013）からなるタンパク質である。ERBB4タンパク質は、キナーゼドメインを有することを特徴としており（図１）、ヒトであれば配列番号22で表されるアミノ酸配列の708～964位のアミノ酸配列に該当する。
　またERBB4タンパク質において、キナーゼドメインのN末端側にはフューリン様リピート（Furin-like repeat）及び膜貫通ドメイン（例えば、配列番号22で表されるアミノ酸配列の183～665位）が存在する。
　EZR-ERBB4融合ポリペプチドは、EZRタンパク質のコイルドコイルドメインの全部または一部及びERBB4タンパク質のキナーゼドメインを含みかつキナーゼ活性を有するポリペプチドである。
　EZR-ERBB4融合ポリペプチドには、EZRタンパク質のコイルドコイルドメインの全部が含まれてもよいし、EZR-ERBB4融合ポリペプチドを二量体化し得る限り、コイルドコイルドメインの一部が含まれてもよい。EZR-ERBB4融合ポリペプチドが二量体化するか否かは、ゲルろ過クロマトグラフィー、架橋剤処理とSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動の組合せなどの公知の方法により確認することができる。
　EZR-ERBB4融合ポリペプチドには、ERBB4タンパク質のキナーゼドメインの全部が含まれてもよいし、EZR-ERBB4融合ポリペプチドがキナーゼ活性を有する限り、キナーゼドメインの一部が含まれてもよい。
　EZR-ERBB4融合ポリペプチドが「キナーゼ活性を有する」とは、ERBB4タンパク質由来のキナーゼドメインに起因してチロシンをリン酸化する酵素としての活性を有することを意味する。EZR-ERBB4融合ポリペプチドのキナーゼ活性は、定法により測定され、通常、適切な条件下で基質（合成ペプチド基質など）及びATPと共にインキュベーションした後、基質のリン酸化チロシンを検出する。また市販の測定キットを用いて測定することもできる。
　EZR-ERBB4融合ポリペプチドは、ERBB4タンパク質のフューリン様リピート及び膜貫通ドメインの全部又は一部を含んでもよいが、含まないことが好ましい。
　いかなる理論にも拘束されることを望まないが、EZR-ERBB4融合ポリペプチドは、N末端側に存在するコイルドコイルドメインを介して二量体化して自己リン酸化し、恒常活性化することによりがん化に寄与すると考えられる。
　本発明において、EZR-ERBB4融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（以下、EZR-ERBB4融合ポリヌクレオチドとも称する）は、EZRタンパク質のコイルドコイルドメインの全部または一部及びERBB4タンパク質のキナーゼドメインを含みかつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。EZR-ERBB4融合ポリヌクレオチドは、mRNA、cDNAおよびゲノムDNAのいずれであってもよい。
　本発明におけるEZR-ERBB4融合ポリヌクレオチドは、例えば、下記のポリペプチドをコードするEZR-ERBB4融合ポリヌクレオチドであり得る：
（i）配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ii）配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドにおいて、1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつキナーゼ活性を有するポリペプチド、または
（iii）配列番号2で表されるアミノ酸配列と80％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつキナーゼ活性を有するポリペプチド。
　配列番号2で表されるアミノ酸配列は、後述の実施例において示すように、ヒトがん組織由来のサンプル中に見出されたEZR-ERBB4融合ポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列である。なお、配列番号2で表されるアミノ酸配列中、融合点は、448位のArgに位置する。
　上記(ii)において、「1若しくは複数のアミノ酸」とは、通常、1～50個、好ましくは1～30個、より好ましくは1～10個、さらにより好ましくは1～数個（例えば、1～5個、1～4個、1～3個、1若しくは2個、または1個）のアミノ酸を意味する。
　上記(iii)において、「80％以上の配列同一性」とは、好ましくは８５%以上、より好ましくは９０％以上、９５％以上、さらにより好ましくは９７%以上、９８％以上、９９%以上の配列同一性を意味する。アミノ酸配列の同一性は、カーリンおよびアルチュールによるアルゴリズムBLAST（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268, 1990、Proc Natl Acad Sci USA 90: 5873, 1993）に基づくBLASTXまたはBLASTPと呼ばれるプログラム（Altschul SF, et al: J Mol Biol 215: 403, 1990）を利用して決定することができる。BLASTXを用いてアミノ酸配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばscore＝50、wordlength＝3とする。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は当業者にはよく知られている（例えば、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）。
　また本発明におけるEZR-ERBB4融合ポリヌクレオチドは、例えば、下記のいずれかのポリヌクレオチドであり得る：
（i）配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（ii）配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（iii）配列番号1で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて、1若しくは複数のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または
（iv）配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと80％以上の配列同一性を有し、かつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
　配列番号１で表される塩基配列は、後述の実施例において示すように、ヒトがん組織由来のサンプル中に見出されたEZR-ERBB4融合ポリヌクレオチドの塩基配列である。配列番号１で表される塩基配列中、融合点は、1524位のグアニンと1525位のグアニンの間に位置する。
　上記(ii)において、「ストリンジェントな条件下」とは、特に記載した場合を除き、中程度または高程度にストリンジェントな条件をいう。
　中程度にストリンジェントな条件は、例えば、対象となるポリヌクレオチドの長さに基づき、当業者であれば容易に設計することができる。基本的な条件は、Sambrookら，Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第3版、第6～7章、Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001に示されている。典型的には、中程度にストリンジェントな条件は、ニトロセルロースフィルターに関し、5×SSC、0.5％SDS、1.0 mM EDTA（pH8.0）の前洗浄条件；約40～50℃での、約50％ホルムアミド、2～6×SSC（または、約42℃での、約50％ホルムアミド中のStark's solutionなどの他の同様のハイブリダイゼーション溶液）のハイブリダイゼーション条件；および約40℃～60℃、0.5～6×SSC、0.1％ SDSの洗浄条件を含む。中程度にストリンジェントな条件は、好ましくは、約50℃、6×SSCのハイブリダイゼーション条件を含み、前述の洗浄条件および／または洗浄条件を含んでいてもよい。
　高程度にストリンジェントな条件（高ストリンジェントな条件）もまた、例えば、対象となるポリヌクレオチドの長さに基づき、当業者であれば容易に設計することができる。高ストリンジェントな条件は、中程度にストリンジェントな条件よりも高い温度および／または低い塩濃度が含まれる。典型的には、約65℃、0.2～6×SSC、好ましくは6×SSC、より好ましくは2×SSC、さらに好ましくは0.2×SSCのハイブリダイゼーション条件を含む。いずれの場合も、約65～68℃、0.2×SSC、0.1％ SDSの洗浄条件を含むことが好ましい。
　いずれの場合も、ハイブリダイゼーション、前洗浄および洗浄のための緩衝液として、SSC（1×SSCは、0.15 M NaClおよび15 mM クエン酸ナトリウムである。）の代わりにSSPE（1×SSPEは、0.15 M NaCl、10 mM NaH2PO4、および1.25 mM EDTA、pH7.4である。）を代用することができる。いずれの場合も、洗浄は、ハイブリダイゼーションが完了した後、約15分間行うことができる。
　上記(iii)において、「1若しくは複数のヌクレオチド」とは、通常、1～50個、好ましくは1～30個、より好ましくは1～10個、さらにより好ましくは1～数個（例えば、1～5個、1～4個、1～3個、1若しくは2個、または1個）のヌクレオチドを意味する。
　上記(iv)において、「80％以上の配列同一性」とは、好ましくは８５%以上、より好ましくは９０％以上、９５％以上、さらにより好ましくは９７%以上、９８％以上、９９%以上の配列同一性を意味する。塩基配列の同一性は、前記アルゴリズムBLASTに基づくBLASTNと呼ばれるプログラム（Altschul SF, et al: J Mol Biol 215: 403, 1990）を利用して決定することができる。BLASTNを用いて塩基配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばscore＝100、wordlength＝12とする。
（2）KIAA1468-RET遺伝子融合
　本遺伝子融合は、KIAA1468タンパク質とRETタンパク質の融合タンパク質（以下、KIAA1468-RET融合ポリペプチドとも称する）の発現を生じる変異であり、ヒト染色体においては18q21および10q11の領域内に切断点を有する転座（t(10;18)）により生じる変異である。
　KIAA1468タンパク質は、ヒトにおいては18q21に存在する遺伝子にコードされるタンパク質であり、典型的には配列番号24で表されるアミノ酸配列（NCBIアクセッション番号NP_065905.2（17-APR-2013）からなるタンパク質である。KIAA1468タンパク質は、コイルドコイルドメインを有することを特徴としており（図１）、当該ドメインは、ヒトであれば配列番号24で表されるアミノ酸配列の360～396位のアミノ酸配列に該当する。
　RETタンパク質は、ヒトにおいては10q11に存在する遺伝子にコードされるタンパク質であり、典型的には配列番号26で表されるアミノ酸配列（NCBIアクセッション番号NP_066124.1（07-JULY-2013））からなるタンパク質である。RETタンパク質は、キナーゼドメインを有することを特徴としており（図１）、ヒトであれば配列番号26で表されるアミノ酸配列の723～1012位のアミノ酸配列に該当する。
　またRETタンパク質において、キナーゼドメインのN末端側にはカドヘリンリピート（Cadherin repeat）及び膜貫通ドメインが存在する。
　KIAA1468-RET融合ポリペプチドは、KIAA1468タンパク質のコイルドコイルドメインの全部または一部及びRETタンパク質のキナーゼドメインを含みかつキナーゼ活性を有するポリペプチドである。
　KIAA1468-RET融合ポリペプチドには、KIAA1468タンパク質のコイルドコイルドメインの全部が含まれてもよいし、KIAA1468-RET融合ポリペプチドを二量体化し得る限り、コイルドコイルドメインの一部が含まれてもよい。KIAA1468-RET融合ポリペプチドが二量体化するか否かは、ゲルろ過クロマトグラフィー、架橋剤処理とSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動の組合せなどの公知の方法により確認することができる。
　KIAA1468-RET融合ポリペプチドには、RETタンパク質のキナーゼドメインの全部が含まれてもよいし、KIAA1468-RET融合ポリペプチドがキナーゼ活性を有する限り、キナーゼドメインの一部が含まれてもよい。
　KIAA1468-RET融合ポリペプチドが「キナーゼ活性を有する」とは、RETタンパク質由来のキナーゼドメインに起因してチロシンをリン酸化する酵素としての活性を有することを意味する。KIAA1468-RET融合ポリペプチドのキナーゼ活性は、定法により測定され、通常、適切な条件下で基質（合成ペプチド基質など）及びATPと共にインキュベーションした後、基質のリン酸化チロシンを検出する。また市販の測定キットを用いて測定することもできる。
　KIAA1468-RET融合ポリペプチドは、RETタンパク質のカドヘリンリピート及び膜貫通ドメインの全部又は一部を含んでもよいが、含まないことが好ましい。
　いかなる理論にも拘束されることを望まないが、KIAA1468-RET融合ポリヌクレオチドは、N末端側に存在するコイルドコイルドメインを介して二量体化して自己リン酸化し、恒常活性化することによりがん化に寄与すると考えられる。
　本発明において、KIAA1468-RET融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（以下、KIAA1468-RET融合ポリヌクレオチドとも称する）は、KIAA1468タンパク質のコイルドコイルドメインの全部または一部及びRETタンパク質のキナーゼドメインを含みかつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。KIAA1468-RET融合ポリヌクレオチドは、mRNA、cDNAおよびゲノムDNAのいずれであってもよい。
　本発明におけるKIAA1468-RET融合ポリヌクレオチドは、例えば、下記のポリペプチドをコードするKIAA1468-RET融合ポリヌクレオチドであり得る：
（i）配列番号4で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ii）配列番号4で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドにおいて、1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつキナーゼ活性を有するポリペプチド、または
（iii）配列番号4で表されるアミノ酸配列と80％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつキナーゼ活性を有するポリペプチド。
　配列番号4で表されるアミノ酸配列は、後述の実施例において示すように、ヒトがん組織由来のサンプル中に見出されたKIAA1468-RET融合ポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列である。なお、配列番号4で表されるアミノ酸配列中、融合点は、540位のGluと541位のGluの間に位置する。
　上記(ii)における「1若しくは複数のアミノ酸」、および上記(iii)における「80％以上の配列同一性」の意味は、上記「（1）EZR-ERBB4遺伝子融合」に記載した通りである。
　また本発明におけるKIAA1468-RET融合ポリヌクレオチドは、例えば、下記のいずれかのポリヌクレオチドであり得る：
（i）配列番号3で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（ii）配列番号3で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（iii）配列番号3で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて、1若しくは複数のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または
（iv）配列番号3で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと80％以上の配列同一性を有し、かつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
　配列番号3で表される塩基配列は、後述の実施例において示すように、ヒトがん組織由来のサンプル中に見出されたKIAA1468-RET融合ポリヌクレオチドの塩基配列である。配列番号3で表される塩基配列中、融合点は、1835位のグアニンと1836位のグアニンの間に位置する。
　上記(ii)における「ストリンジェントな条件下」、上記(iii)における「1若しくは複数のヌクレオチド」、および上記(iv)における「80％以上の配列同一性」の意味は、上記「（1）EZR-ERBB4遺伝子融合」に記載した通りである。
（3）TRIM24-BRAF遺伝子融合
　本遺伝子融合は、TRIM24タンパク質とBRAFタンパク質の融合タンパク質（以下、TRIM24-BRAF融合ポリペプチドとも称する）の発現を生じる変異であり、ヒト染色体においては7q33および7q34の領域内に切断点を有する逆位（inv7）により生じる変異である。
　TRIM24タンパク質は、ヒトにおいては7q33に存在する遺伝子にコードされるタンパク質であり、典型的には配列番号28で表されるアミノ酸配列（NCBIアクセッション番号NP_003843.3（17-APR-2013）からなるタンパク質である。TRIM24タンパク質は、RINGフィンガードメインを有することを特徴としており（図１）、当該ドメインは、ヒトであれば配列番号28で表されるアミノ酸配列の56～82位のアミノ酸配列に該当する。
　BRAFタンパク質は、ヒトにおいては7q34に存在する遺伝子にコードされるタンパク質であり、典型的には配列番号30で表されるアミノ酸配列（NCBIアクセッション番号NP_004324.2（16-JUN-2013）からなるタンパク質である。BRAFタンパク質は、キナーゼドメインを有することを特徴としており（図１）、ヒトであれば配列番号30で表されるアミノ酸配列の457～717位のアミノ酸配列に該当する。
　またBRAFタンパク質において、キナーゼドメインのN末端側にはキナーゼ抑制ドメインとしてRaf様Ras結合ドメイン（Raf-like Ras-binding domain）（配列番号22で表されるアミノ酸配列の155～227位）が存在する。
　TRIM24-BRAF融合ポリペプチドは、BRAFタンパク質のキナーゼドメインを含みかつキナーゼ活性を有するポリペプチドである。
　TRIM24-BRAF融合ポリペプチドには、TRIM24タンパク質のRINGフィンガードメインの全部又は一部を含んでもよいし、含まなくてもよい。
　TRIM24-BRAF融合ポリペプチドには、BRAFタンパク質のキナーゼドメインの全部が含まれてもよいし、TRIM24-BRAF融合ポリペプチドがキナーゼ活性を有する限り、キナーゼドメインの一部が含まれてもよい。
　TRIM24-BRAF融合ポリペプチドが「キナーゼ活性を有する」とは、BRAFタンパク質由来のキナーゼドメインに起因してセリン又はスレオニンをリン酸化する酵素としての活性を有することを意味する。TRIM24-BRAF融合ポリペプチドのキナーゼ活性は、定法により測定され、通常、適切な条件下で基質（合成ペプチド基質など）及びATPと共にインキュベーションした後、基質のリン酸化セリン又はスレオニンを検出する。また市販の測定キットを用いて測定することもできる。
　EZR-ERBB4融合ポリペプチドは、Raf様Ras結合ドメイン（Raf-like Ras-binding domain）を含まないことが好ましい。
　いかなる理論にも拘束されることを望まないが、TRIM24-BRAF融合ポリペプチドは、野生型BRAFタンパク質のN末端側に存在するキナーゼ抑制ドメインがなくなることで恒常活性化することによりがん化に寄与すると考えられる。
　本発明において、TRIM24-BRAF融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（以下、TRIM24-BRAF融合ポリヌクレオチドとも称する）は、BRAFタンパク質のキナーゼドメインを含みかつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。TRIM24-BRAF融合ポリヌクレオチドは、mRNA、cDNAおよびゲノムDNAのいずれであってもよい。
　本発明におけるTRIM24-BRAF融合ポリヌクレオチドは、例えば、下記のポリペプチドをコードするTRIM24-BRAF融合ポリヌクレオチドであり得る：
（i）配列番号6で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ii）配列番号6で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドにおいて、1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつキナーゼ活性を有するポリペプチド、または
（iii）配列番号6で表されるアミノ酸配列と80％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつキナーゼ活性を有するポリペプチド。
　配列番号6で表されるアミノ酸配列は、後述の実施例において示すように、ヒトがん組織由来のサンプル中に見出されたTRIM24-BRAF融合ポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列である。なお、配列番号6で表されるアミノ酸配列中、融合点は、294位のArgに位置する。
　上記(ii)における「1若しくは複数のアミノ酸」、および上記(iii)における「80％以上の配列同一性」の意味は、上記「（1）EZR-ERBB4遺伝子融合」に記載した通りである。
　また本発明におけるTRIM24-BRAF融合ポリヌクレオチドは、例えば、下記のいずれかのポリヌクレオチドであり得る：
（i）配列番号5で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（ii）配列番号5で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（iii）配列番号5で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて、1若しくは複数のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または
（iv）配列番号5で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと80％以上の配列同一性を有し、かつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
　配列番号5で表される塩基配列は、後述の実施例において示すように、ヒトがん組織由来のサンプル中に見出されたTRIM24-BRAF融合ポリヌクレオチドの塩基配列である。配列番号5で表される塩基配列中、融合点は、1096位のグアニンと1097位のグアニンの間に位置する。
　上記(ii)における「ストリンジェントな条件下」、上記(iii)における「1若しくは複数のヌクレオチド」、および上記(iv)における「80％以上の配列同一性」の意味は、上記「（1）EZR-ERBB4遺伝子融合」に記載した通りである。
（4）CD74-NRG1遺伝子融合
　本遺伝子融合は、CD74タンパク質とNRG1タンパク質の融合タンパク質（以下、CD74-NRG1融合ポリペプチドとも称する）の発現を生じる変異であり、ヒト染色体においては5q32および8p12の領域内に切断点を有する転座（t(5;8)）により生じる変異である。
　CD74タンパク質は、ヒトにおいては5q32に存在する遺伝子にコードされるタンパク質であり、典型的には配列番号32で表されるアミノ酸配列（NCBIアクセッション番号NP_004346.1（29-APR-2013）からなるタンパク質である。CD74タンパク質は、膜貫通ドメインを有することを特徴としており（図１）、当該ドメインは、ヒトであれば配列番号32で表されるアミノ酸配列の47～72位のアミノ酸配列に該当する。
　NRG1タンパク質は、ヒトにおいては8p12に存在する遺伝子にコードされるタンパク質であり、典型的には配列番号34で表されるアミノ酸配列（NCBIアクセッション番号NP_001153477.1（07-JUL-2013））からなるタンパク質である。NRG1タンパク質は、EGFドメインを有することを特徴としており（図１）、ヒトであれば配列番号34で表されるアミノ酸配列の143～187位のアミノ酸配列に該当する。
　CD74-NRG1融合ポリペプチドは、CD74タンパク質の膜貫通ドメイン及びNRG1タンパク質のEGFドメインを含みかつ細胞内情報伝達を亢進する活性を有するポリペプチドである。
　CD74-NRG1融合ポリペプチドには、CD74タンパク質の膜貫通ドメインの全部が含まれてもよいし、一部が含まれてもよい。
　CD74-NRG1融合ポリペプチドには、NRG1タンパク質のEGFドメインの全部が含まれてもよいし、CD74-NRG1融合ポリペプチドが細胞内情報伝達を亢進する活性を有する限り、EGFドメインの一部が含まれてもよい。
　CD74-NRG1融合ポリペプチドが「細胞内情報伝達を亢進する活性を有する」とは、NRG1タンパク質由来のEGFドメインに起因して、細胞内情報伝達を亢進する活性を有することを意味する。この活性は、Wilson, T.R. et al., Cancer Cell, 2011, 20, 158-172に記載された以下の方法により測定される。
　血清を除いた状態で培養したEFM-19細胞（DSMZ, No. ACC-231）に被験物質を添加し、30分間処理したのち、EFM-19細胞を溶解し、タンパク質を抽出する。ウエスタンブロット解析により、EGFR、ERBB2、ERBB3又はERBB4のリン酸化状態を調べ、被験物質非添加の場合と比較してリン酸化が上昇した場合、被験物質が細胞内情報伝達を亢進する活性を有すると決定される。ここで被験物質としては、CD74-NRG1融合ポリペプチド全体を使用してもよいが、溶解性等を考慮して、膜貫通ドメインを欠きかつEGFドメインを含むその断片を使用してもよい。
　いかなる理論にも拘束されることを望まないが、CD74-NRG1融合ポリヌクレオチドは、野生型NRG1タンパク質よりも高発現し、オートクライン機構で、細胞内情報伝達の亢進及び生存に正に働くことにより、がん化に寄与すると考えられる。
　本発明において、CD74-NRG1融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（以下、CD74-NRG1融合ポリヌクレオチドとも称する）は、CD74タンパク質の膜貫通ドメイン及びNRG1タンパク質のEGFドメインを含みかつ細胞内情報伝達を亢進する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。CD74-NRG1融合ポリヌクレオチドは、mRNA、cDNAおよびゲノムDNAのいずれであってもよい。
　本発明におけるCD74-NRG1融合ポリヌクレオチドは、例えば、下記のポリペプチドをコードするCD74-NRG1融合ポリヌクレオチドであり得る：
（i）配列番号8または10で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ii）配列番号8または10で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドにおいて、1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ細胞内情報伝達殖を亢進する活性を有するポリペプチド、または
（iii）配列番号8または10で表されるアミノ酸配列と80％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ細胞内情報伝達を亢進する活性を有するポリペプチド。
　配列番号8または10で表されるアミノ酸配列は、後述の実施例において示すように、ヒトがん組織由来のサンプル中に見出されたCD74-NRG1融合ポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列である。なお、配列番号8で表されるアミノ酸配列中、融合点は、230位のAlaに位置する。また配列番号10で表されるアミノ酸配列中、融合点は、209位のAlaに位置する。
　上記(ii)における「1若しくは複数のアミノ酸」、および上記(iii)における「80％以上の配列同一性」の意味は、上記「（1）EZR-ERBB4遺伝子融合」に記載した通りである。
　また本発明におけるCD74-NRG1融合ポリヌクレオチドは、例えば、下記のいずれかのポリヌクレオチドであり得る：
（i）配列番号7または9で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（ii）配列番号7または9で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ細胞内情報伝達を亢進する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（iii）配列番号7または9で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて、1若しくは複数のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつ細胞内情報伝達を亢進する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または
（iv）配列番号7または9で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと80％以上の配列同一性を有し、かつ細胞内情報伝達を亢進する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
　配列番号7または9で表される塩基配列は、後述の実施例において示すように、ヒトがん組織由来のサンプル中に見出されたCD74-NRG1融合ポリヌクレオチドの塩基配列である。配列番号7で表される塩基配列中、融合点は、875位のグアニンと876位のシトシンの間に位置する。また配列番号9で表される塩基配列中、融合点は、812位のグアニンと813位のシトシンの間に位置する。
　上記(ii)における「ストリンジェントな条件下」、上記(iii)における「1若しくは複数のヌクレオチド」、および上記(iv)における「80％以上の配列同一性」の意味は、上記「（1）EZR-ERBB4遺伝子融合」に記載した通りである。
（5）SLC3A2-NRG1遺伝子融合
　本遺伝子融合は、SLC3A2タンパク質とNRG1タンパク質の融合タンパク質（以下、SLC3A2-NRG1融合ポリペプチドとも称する）の発現を生じる変異であり、ヒト染色体においては11q12.3および8p12の領域内に切断点を有する転座（t(8;11)）により生じる変異である。
　SLC3A2タンパク質は、ヒトにおいては11q12.3に存在する遺伝子にコードされるタンパク質であり、典型的には配列番号39で表されるアミノ酸配列（NCBIアクセッション番号NP_001012680.1（27-APR-2014）からなるタンパク質である。SLC3A2タンパク質は、膜貫通ドメインを有することを特徴としており（図４）、当該ドメインは、ヒトであれば配列番号39で表されるアミノ酸配列の184-207位のアミノ酸配列（http://www.hprd.org/sequence?hprd_id=01148&isoform_id=01148_3&isoform_name=Isoform_2）または184-206位のアミノ酸配列（http://asia.ensembl.org/Homo_sapiens/Transcript/ProteinSummary?g=ENSG00000168003;r=11:62623583-62656332;t=ENST00000377891#）に該当する。
　NRG1タンパク質は、上記「（4）CD74-NRG1遺伝子融合」に記載した通りである。
　SLC3A2-NRG1融合ポリペプチドは、SLC3A2タンパク質の膜貫通ドメイン及びNRG1タンパク質のEGFドメインを含みかつ細胞内情報伝達を亢進する活性を有するポリペプチドである。
　SLC3A2-NRG1融合ポリペプチドには、SLC3A2タンパク質の膜貫通ドメインの全部が含まれてもよいし、一部が含まれてもよい。
　SLC3A2-NRG1融合ポリペプチドには、NRG1タンパク質のEGFドメインの全部が含まれてもよいし、SLC3A2-NRG1融合ポリペプチドが細胞内情報伝達を亢進する活性を有する限り、EGFドメインの一部が含まれてもよい。
　SLC3A2-NRG1融合ポリペプチドが「細胞内情報伝達を亢進する活性を有する」とは、NRG1タンパク質由来のEGFドメインに起因して、細胞内情報伝達を亢進する活性を有することを意味する。この活性は、Wilson, T.R. et al., Cancer Cell, 2011, 20, 158-172に記載された以下の方法により測定される。
　血清を除いた状態で培養したEFM-19細胞（DSMZ, No. ACC-231）に被験物質を添加し、30分間処理したのち、EFM-19細胞を溶解し、タンパク質を抽出する。ウエスタンブロット解析により、EGFR、ERBB2、ERBB3又はERBB4のリン酸化状態を調べ、被験物質非添加の場合と比較してリン酸化が上昇した場合、被験物質が細胞内情報伝達を亢進する活性を有すると決定される。ここで被験物質としては、SLC3A2-NRG1融合ポリペプチド全体を使用してもよいが、溶解性等を考慮して、膜貫通ドメインを欠きかつEGFドメインを含むその断片を使用してもよい。
　いかなる理論にも拘束されることを望まないが、SLC3A2-NRG1融合ポリヌクレオチドは、野生型NRG1タンパク質よりも高発現し、オートクライン機構で、細胞内情報伝達の亢進及び生存に正に働くことにより、がん化に寄与すると考えられる。
　本発明において、SLC3A2-NRG1融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（以下、SLC3A2-NRG1融合ポリヌクレオチドとも称する）は、SLC3A2タンパク質の膜貫通ドメイン及びNRG1タンパク質のEGFドメインを含みかつ細胞内情報伝達を亢進する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。SLC3A2-NRG1融合ポリヌクレオチドは、mRNA、cDNAおよびゲノムDNAのいずれであってもよい。
　本発明におけるSLC3A2-NRG1融合ポリヌクレオチドは、例えば、下記のポリペプチドをコードするSLC3A2-NRG1融合ポリヌクレオチドであり得る：
（i）配列番号36で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ii）配列番号36で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドにおいて、1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、細胞内情報伝達を亢進する活性を有するポリペプチド、または
（iii）配列番号36で表されるアミノ酸配列と80％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、細胞内情報伝達を亢進する活性を有するポリペプチド。
　配列番号36で表されるアミノ酸配列は、後述の実施例において示すように、ヒトがん組織由来のサンプル中に見出されたSLC3A2-NRG1融合ポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列である。なお、配列番号36で表されるアミノ酸配列中、融合点は、302位のスレオニンに位置する。
　上記(ii)における「1若しくは複数のアミノ酸」、および上記(iii)における「80％以上の配列同一性」の意味は、上記「（1）EZR-ERBB4遺伝子融合」に記載した通りである。
　また本発明におけるSLC3A2-NRG1融合ポリヌクレオチドは、例えば、下記のいずれかのポリヌクレオチドであり得る：
（i）配列番号35で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（ii）配列番号35で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ細胞内情報伝達を亢進する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（iii）配列番号35で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて、1若しくは複数のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつ細胞内情報伝達を亢進する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または
（iv）配列番号35で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと80％以上の配列同一性を有し、かつ細胞内情報伝達を亢進する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
　配列番号35で表される塩基配列は、後述の実施例において示すように、ヒトがん組織由来のサンプル中に見出されたSLC3A2-NRG1融合ポリヌクレオチドの塩基配列である。配列番号35で表される塩基配列中、融合点は、904位のアデニンと905位のシトシンの間に位置する。
　上記(ii)における「ストリンジェントな条件下」、上記(iii)における「1若しくは複数のヌクレオチド」、および上記(iv)における「80％以上の配列同一性」の意味は、上記「（1）EZR-ERBB4遺伝子融合」に記載した通りである。
＜がんの責任変異（ドライバー変異）である遺伝子融合の検出方法＞
　本発明は、前記4種の遺伝子融合の検出方法（以下、本発明の検出方法とも称する）を提供する。本発明の検出方法は、がんを有する被験者由来の単離された試料における前記いずれかの融合ポリヌクレオチドまたはそれによりコードされるポリペプチドを検出する工程を含む。
　本発明の検出方法において、被験者は、哺乳動物であれば特に限定されない。哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、シマリス、モルモット等のげっ歯類、ウサギ、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ、ミンク、イヌ、ネコ、ヒト、サル、カニクイザル、アカゲザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類等を挙げることができるが、ヒトが好ましい。
　がんを有する被験者は、がんに罹患している被験者のみならず、がんに罹患している疑いのある被験者、又は将来がんになるリスクを有する被験者であってもよい。本発明の検出方法を適用する対象となる「がん」としては、前記4種の遺伝子融合のうちいずれかが検出され得るがんであれば特に限定されないが、好ましくは肺がんであり、さらに好ましくは非小細胞肺がんであり、特に好ましくは肺腺がんである。
　被験者由来の「単離された試料」は、生体試料（例えば、細胞、組織、臓器、体液（血液、リンパ液等）、消化液、喀痰、肺胞・気管支洗浄液、尿、便）のみならず、これらの生体試料から得られる核酸抽出物（ゲノムDNA抽出物、mRNA抽出物、mRNA抽出物から調製されたcDNA調製物やcRNA調製物等）やタンパク質抽出物も含む。ゲノムDNA、mRNA、cDNA又はタンパク質は、当業者であれば、前記試料の種類及び状態等を考慮し、それに適した公知の手法を選択して調製することが可能である。また、前記試料は、ホルマリン固定処理、アルコール固定処理、凍結処理又はパラフィン包埋処理が施してあるものでもよい。
　また「単離された試料」は、前記がんが存在するか又は存在すると疑われる臓器由来であることが好ましく、例えば、小腸、脾臓、腎臓、肝臓、胃、肺、副腎、心臓、脳、膵臓、大動脈等に由来するものが挙げられるが、より好ましくは肺由来である。
　本発明の検出方法において、融合ポリヌクレオチドまたはそれによりコードされるポリペプチドの検出は、自体公知の手法を用いて行なうことができる。
　ゲノムDNAからの転写産物（mRNAまたはmRNAから調製したcDNA）を対象とする場合、例えば、RT-PCR法、シークエンシング、TaqManプローブ法、ノーザンブロッティング、ドットブロット法、cDNAマイクロアレイ解析等を利用してmRNA又はcDNAである融合ポリヌクレオチドを検出することができる。
　またゲノムDNAを対象とする場合、例えば、in situハイブリダイゼーション（ISH）、ゲノムPCR法、シークエンシング、TaqManプローブ法、サザンブロッティング、ゲノムマイクロアレイ解析等を利用してゲノムDNAである融合ポリヌクレオチドを検出することができる。
　これらの手法はそれぞれ単独で利用することができるが、組み合わせて利用してもよい。例えば、前記4種の遺伝子融合は、融合ポリペプチドを発現することによりがん化に寄与すると考えられることから、ゲノムDNAである融合ポリヌクレオチドを検出する場合（例えばin situハイブリダイゼーション等による）には、転写産物またはタンパク質が生成することをさらに確認すること（例えばRT-PCR、免疫染色法等による）も好ましい。
　ハイブリダイゼーション技術（例えば、TaqManプローブ法、ノーザンブロッティング、サザンブロッティング、ドットブロット法、マイクロアレイ解析、in situハイブリダイゼーション（ISH）など）により融合ポリヌクレオチドを検出する場合には、前記融合ポリヌクレオチドを特異的に認識するように設計されたプローブであるポリヌクレオチドを使用することができる。ここで「融合ポリヌクレオチドを特異的に認識する」とは、ストリンジェントな条件で、当該融合ポリヌクレオチドの融合点から5’末端側及び3’末端側の部分が由来する野生型遺伝子を含めて当該融合ポリヌクレオチド以外のポリヌクレオチドから、当該融合ポリヌクレオチドを識別して認識することをいう。
　本発明の検出方法においては、治療又は診断の過程で得られる生体試料（生検サンプル等）は、ホルマリン固定されていることが多いため、検出対象であるゲノムＤＮＡがホルマリン固定下においても安定しており、検出感度が高いという観点から、in situハイブリダイゼーションを用いることが好適である。
　in situハイブリダイゼーションにおいては、前記生体試料に、融合ポリヌクレオチドを特異的に認識するように設計されたプローブであるポリヌクレオチドとして少なくとも１５塩基の鎖長を有する下記（ａ）または（ｂ）に記載のポリヌクレオチドをハイブリダイズさせることにより、融合ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡ（融合ポリヌクレオチド）を検出することができる。
（ａ）各融合遺伝子について、5’側融合パートナー遺伝子（ＥＺＲ、ＫＩＡＡ１４６８、ＴＲＩＭ２４、ＣＤ７４またはＳＬＣ３Ａ２遺伝子）の塩基配列にハイブリダイズするプローブ及び3’側融合パートナー遺伝子（ＥＲＢＢ４、ＲＥＴ、ＢＲＡＦまたはＮＲＧ１遺伝子）の塩基配列にハイブリダイズするプローブからなる群から選択される少なくとも一つのプローブであるポリヌクレオチド
（ｂ）各融合遺伝子について、5’側融合パートナー遺伝子と3’側融合パートナー遺伝子との融合点を含む塩基配列にハイブリダイズするプローブであるポリヌクレオチド。
　本発明にかかるＥＺＲ遺伝子は、ヒト由来のものであれば、典型的にはＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号　NC_000006.11で特定されるゲノムの配列のうち159186773から159240456番目のＤＮＡ配列からなる遺伝子である。
　また、本発明にかかるＫＩＡＡ１４６８遺伝子は、ヒト由来のものであれば、典型的にはＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号　NC_000018.9で特定されるゲノムの配列のうち59854524～59974355番目のＤＮＡ配列からなる遺伝子である。
　本発明にかかるＴＲＩＭ２４遺伝子は、ヒト由来のものであれば、典型的にはＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号　NC_000007.13で特定されるゲノムの配列のうち138145079～138270333番目のＤＮＡ配列からなる遺伝子である。
　また、本発明にかかるＣＤ７４遺伝子は、ヒト由来のものであれば、典型的にはＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号　NC_000005.9で特定されるゲノムの配列のうち149781200～149792499番目のＤＮＡ配列からなる遺伝子である。
　また、本発明にかかるＳＬＣ３Ａ２遺伝子は、ヒト由来のものであれば、典型的にはＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号　NC_000011.10で特定されるゲノムの配列のうち62856012～62888883番目のＤＮＡ配列からなる遺伝子である。
　本発明にかかるＥＲＢＢ４遺伝子は、ヒト由来のものであれば、典型的にはＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号　NC_000002.11で特定されるゲノムの配列のうち212240442～213403352番目のＤＮＡ配列からなる遺伝子である。
　また、本発明にかかるＲＥＴ遺伝子は、ヒト由来のものであれば、典型的にはＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号　NC_000010.10で特定されるゲノムの配列のうち43572517～43625799番目のＤＮＡ配列からなる遺伝子である。
　また、本発明にかかるＢＲＡＦ遺伝子は、ヒト由来のものであれば、典型的にはＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号　NC_000007.13で特定されるゲノムの配列のうち140433812から140624564番目のＤＮＡ配列からなる遺伝子である。
　また、本発明にかかるＮＲＧ１遺伝子は、ヒト由来のものであれば、典型的にはＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号　NC_000008.10で特定されるゲノムの配列のうち31496820～32622558番目のＤＮＡ配列からなる遺伝子である。
　しかしながら、遺伝子のＤＮＡ配列は、その変異等により、自然界において（すなわち、非人工的に）変化しうる。従って、このような天然の変異体も本発明の対象になりうる（以下、同様）。
　本発明の（ａ）に記載のポリヌクレオチドは、該ポリヌクレオチドの標的塩基配列である、5’側融合パートナー遺伝子（ＥＺＲ、ＫＩＡＡ１４６８、ＴＲＩＭ２４、ＣＤ７４またはＳＬＣ３Ａ２遺伝子）の塩基配列および／または3’側融合パートナー遺伝子（ＥＲＢＢ４、ＲＥＴ、ＢＲＡＦまたはＮＲＧ１遺伝子）の塩基配列にハイブリダイズすることにより、前記生体試料における融合ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡの存在を検出できるものであればよいが、好ましくは、下記（ａ１）～（ａ３）に記載のポリヌクレオチドである：
（ａ１）　5’側融合パートナー遺伝子の切断点よりも5’側の上流領域の塩基配列にハイブリダイズするポリヌクレオチド（以下、「5’融合パートナー遺伝子プローブ１」とも称する）と、3’側融合パートナー遺伝子の切断点よりも3’側の下流領域の塩基配列にハイブリダイズするポリヌクレオチド（以下、「3’融合パートナー遺伝子プローブ１」とも称する）との組み合わせ；
（ａ２）　5’側融合パートナー遺伝子の切断点よりも5’側の上流領域の塩基配列にハイブリダイズするポリヌクレオチド（以下、「5’融合パートナー遺伝子プローブ１」とも称する）と、5’側融合パートナー遺伝子の切断点よりも3’側の下流領域の塩基配列にハイブリダイズするポリヌクレオチド（以下、「5’融合パートナー遺伝子プローブ２」とも称する）との組み合わせ；
（ａ３）　3’側融合パートナー遺伝子の切断点よりも5’側の上流領域の塩基配列にハイブリダイズするポリヌクレオチド（以下、「3’融合パートナー遺伝子プローブ２」とも称する）と、3’側融合パートナー遺伝子の切断点よりも3’側の下流領域の塩基配列にハイブリダイズするポリヌクレオチド（以下、「3’融合パートナー遺伝子プローブ１」とも称する）との組み合わせ。
　上記（ａ１）～（ａ３）において、5’側融合パートナー遺伝子がEZR遺伝子である場合、当該遺伝子の切断点よりも5’側の上流領域の塩基配列には、EZRタンパク質のコイルドコイルドメインの全部または一部のコード領域が含まれる。
　上記（ａ１）～（ａ３）において、3’側融合パートナー遺伝子がERBB4遺伝子である場合、当該遺伝子の切断点よりも3’側の下流領域の塩基配列には、ERBB4のキナーゼドメインの全部または一部のコード領域が含まれる。
　上記（ａ１）～（ａ３）において、5’側融合パートナー遺伝子がKIAA1468遺伝子である場合、当該遺伝子の切断点よりも5’側の上流領域の塩基配列には、KIAA1468タンパク質のコイルドコイルドメインの全部または一部のコード領域が含まれる。
　上記（ａ１）～（ａ３）において、3’側融合パートナー遺伝子がRET遺伝子である場合、当該遺伝子の切断点よりも3’側の下流領域の塩基配列には、RETのキナーゼドメインの全部または一部のコード領域が含まれる。
　上記（ａ１）～（ａ３）において、5’側融合パートナー遺伝子がTRIM24遺伝子である場合、当該遺伝子の切断点よりも5’側の上流領域の塩基配列には、例えば、TRIM24タンパク質のRINGフィンガードメインの全部または一部のコード領域が含まれ得る。
　上記（ａ１）～（ａ３）において、3’側融合パートナー遺伝子がBRAF遺伝子である場合、当該遺伝子の切断点よりも3’側の下流領域の塩基配列には、BRAFのキナーゼドメインの全部または一部のコード領域が含まれる。また当該遺伝子の切断点よりも5’側の上流領域の塩基配列には、BRAFのRaf様Ras結合ドメインのコード領域が含まれる。
　上記（ａ１）～（ａ３）において、5’側融合パートナー遺伝子がCD74遺伝子である場合、当該遺伝子の切断点よりも5’側の上流領域の塩基配列には、CD74タンパク質の膜貫通ドメインのコード領域が含まれる。
　上記（ａ１）～（ａ３）において、3’側融合パートナー遺伝子がNRG1遺伝子である場合、当該遺伝子の切断点よりも3’側の下流領域の塩基配列には、NRG1のEGFドメインの全部または一部のコード領域が含まれる。
　上記（ａ１）～（ａ３）において、5’側融合パートナー遺伝子がSLC3A2遺伝子である場合、当該遺伝子の切断点よりも5’側の上流領域の塩基配列には、SLC3A2タンパク質の膜貫通ドメインのコード領域が含まれる。
　前記（ａ１）に記載のポリヌクレオチドとしては、例えば、以下の(a1-1)～(a1-4)のポリヌクレオチドの組み合わせが挙げられる：
(a1-1)EZRのコイルドコイルドメインの全部または一部のコード領域にハイブリダイズするポリヌクレオチドと、ERBB4のキナーゼドメインの全部または一部のコード領域にハイブリダイズするポリヌクレオチドの組み合わせ、
(a1-2)KIAA1468のコイルドコイルドメインの全部または一部のコード領域にハイブリダイズするポリヌクレオチドと、RETのキナーゼドメインの全部または一部のコード領域にハイブリダイズするポリヌクレオチドの組み合わせ、
(a1-3)TRIM24のRINGフィンガードメインの全部または一部のコード領域にハイブリダイズするポリヌクレオチドと、BRAFのキナーゼドメインの全部または一部のコード領域にハイブリダイズするポリヌクレオチドの組み合わせ、
(a1-4)CD74の膜貫通ドメインのコード領域にハイブリダイズするポリヌクレオチドと、NRG1のEGFドメインの全部または一部のコード領域にハイブリダイズするポリヌクレオチドの組み合わせ、および
(a1-5)SLC3A2の膜貫通ドメインのコード領域にハイブリダイズするポリヌクレオチドと、NRG1のEGFドメインの全部または一部のコード領域にハイブリダイズするポリヌクレオチドの組み合わせ。
　本発明において、in situハイブリダイゼーションに用いられる前記（ａ）に記載のポリヌクレオチドがハイブリダイズする領域（標的塩基配列）としては、標的塩基配列に対する特異性及び検出の感度の観点から、5’側融合パートナー遺伝子（ＥＺＲ、ＫＩＡＡ１４６８、ＴＲＩＭ２４、ＣＤ７４またはＳＬＣ３Ａ２遺伝子）と3’側融合パートナー遺伝子（ＥＲＢＢ４、ＲＥＴ、ＢＲＡＦまたはＮＲＧ１遺伝子）との融合点から１００００００塩基以内の領域であることが好ましい。
　また、本発明において、in situハイブリダイゼーションに用いられる前記（ｂ）に記載のポリヌクレオチドは、該ポリヌクレオチドの標的塩基配列である、5’側融合パートナー遺伝子と3’側融合パートナー遺伝子との融合点を含む塩基配列にハイブリダイズすることにより、前記生体試料における融合ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡの存在を検出できるものであればよいが、典型例としては、配列番号：1、3、5、7、9又は35に記載の塩基配列中の融合点を含む塩基配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドである。
　また、本発明において、in situハイブリダイゼーションに用いられる前記（ａ）または（ｂ）に記載のポリヌクレオチドは、標的塩基配列に対する特異性及び検出の感度の観点から、前記標的塩基配列全体をカバーすることのできる、複数種のポリヌクレオチドからなる集団であることが好ましい。かかる場合、該集団を構成するポリヌクレオチドの長さは少なくとも１５塩基であるが、１００～１０００塩基であることが好ましい。
　in situハイブリダイゼーションに用いられる前記（ａ）または（ｂ）に記載のポリヌクレオチドは、検出のため、蛍光色素等によって標識されていることが好ましい。かかる蛍光色素としては、例えば、ＤＥＡＣ、ＦＩＴＣ、Ｒ６Ｇ、ＴｅｘＲｅｄ、Ｃｙ５が挙げられるが、これらに制限されない。また、蛍光色素以外に放射性同位元素（例：125Ｉ、131Ｉ、3Ｈ、14Ｃ、33Ｐ、32Ｐ等）、酵素（例：β－ガラクトシダーゼ、β－グルコシダーゼ、アルカリホスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素等）、発光物質（例：ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニン、3,3’-ジアミノベンジジン（DAB）等）、によって、前記ポリヌクレオチドを標識してもよい。
　in situハイブリダイゼーションにおいて、5’側融合パートナー遺伝子プローブ１と3’側融合パートナー遺伝子プローブ１とを用いる場合、5’側融合パートナー遺伝子プローブ１と5’側融合パートナー遺伝子２とを用いる場合、または3’融合パートナー遺伝子プローブ２と3’融合パートナー遺伝子プローブ１とを用いる場合、これらプローブは互いに異なる色素にて標識されていることが好ましい。そして、このように異なる色素にて標識したプローブの組み合わせを用いてin situハイブリダイゼーションを行った場合、5’側融合パートナー遺伝子プローブ１の標識が発するシグナル（例えば、蛍光）と3’側融合パートナー遺伝子プローブ１の標識が発するシグナルとの重なりが観察された際に融合ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡを検出できたと判定することができる。一方、5’側融合パートナー遺伝子プローブ１の標識が発するシグナルと5’側融合パートナー遺伝子プローブ２の標識が発するシグナルとの分離、3’側融合パートナー遺伝子プローブ２の標識が発するシグナルと3’側融合パートナー遺伝子プローブ１の標識が発するシグナルとの分離が観察された際に融合ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡを検出できたと判定することができる。
　なお、ポリヌクレオチドの標識は、公知の手法により行うことができる。例えば、ニックトランスレーション法やランダムプライム法により、蛍光色素等によって標識された基質塩基をポリヌクレオチドに取り込ませ、該ポリヌクレオチドを標識することができる。
　in situハイブリダイゼーションにおいて、前記（ａ）または（ｂ）に記載のポリヌクレオチドと前記生体試料とをハイブリダイズさせる際の条件は、当該ポリヌクレオチドの長さ等の諸要因により変動し得るが、高ストリンジェンシーなハイブリダイズの条件として、例えば、０．２ｘＳＳＣ、６５℃という条件が挙げられ、低ストリンジェンシーなハイブリダイズの条件として、例えば、２．０ｘＳＳＣ、５０℃という条件が挙げられる。なお、当業者であれば、塩濃度（ＳＳＣの希釈率等）と温度の他、例えば、界面活性剤（ＮＰ－４０等）の濃度、ホルムアミドの濃度、ｐＨ等の諸条件を適宜選択することで、前記条件と同様のストリンジェントなハイブリダイゼーションの条件を実現することができる。
　前記（ａ）または（ｂ）に記載のポリヌクレオチドを用いて、融合ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡを検出する方法としては、前記in situハイブリダイゼーション以外に、サザンブロッティング、ノーザンブロッティング及びドットブロッティングが挙げられる。これら方法においては、前記生体試料から得られる核酸抽出物を転写したメンブレンに、前記（ａ）または（ｂ）に記載のポリヌクレオチドをハイブリダイズさせることにより、前記融合遺伝子を検出する。前記（ａ）のポリヌクレオチドを用いた場合、5’側融合パートナー遺伝子の塩基配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドと3’側融合パートナー遺伝子の塩基配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドとが、メンブレンにおいて展開された同一のバンドを認識した場合に、融合ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡを検出することができたと判定することができる。
　前記（ｂ）のポリヌクレオチドを用いて融合ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡを検出する方法としては、さらに、ゲノムマイクロアレイ解析やＤＮＡマイクロアレイ解析が挙げられる。これら方法においては、前記（ｂ）のポリヌクレオチドを基板に固定したアレイを作製し、当該アレイ上のポリヌクレオチドに前記生体試料を接触させることにより、当該ゲノムＤＮＡを検出する。基板としては、オリゴまたはポリヌクレオチドを固相化できるものであれば特に限定されず、例えばガラス板、ナイロンメンブレン、マイクロビーズ、シリコンチップ、キャピラリーなどを挙げることができる。
　本発明の検出方法においては、PCRを利用して融合ポリヌクレオチドを検出することも好ましい。
　PCRにおいては、前記生体試料から調製したDNA（ゲノムDNA、cDNA）やRNAを鋳型として融合ポリヌクレオチドを特異的に増幅できるように設計された一対のプライマーであるポリヌクレオチドを使用することができる。ここで「融合ポリヌクレオチドを特異的に増幅できる」とは、当該融合ポリヌクレオチドの融合点から5’末端側及び3’末端側の部分が由来する野生型遺伝子を増幅することなく、当該融合ポリヌクレオチドのみを増幅できることをいい、当該融合ポリヌクレオチドの全部が増幅されてもよいし、融合点を含む当該融合ポリヌクレオチドの一部が増幅されてもよい。
　PCR等で利用する「一対のプライマーであるポリヌクレオチド」は、標的となる融合ポリヌクレオチドを特異的に増幅するセンスプライマー（フォワードプライマー）とアンチセンスプライマー（リバースプライマー）とからなり、センスプライマーは当該融合ポリヌクレオチドの融合点から5’末端側の塩基配列から設計し、アンチセンスプライマーは当該融合ポリヌクレオチドの融合点から3’末端側の塩基配列から設計する。またこれらのプライマーは、PCR法による検出の精度や感度の観点から、通常PCR産物が5 kb以下になるよう設計される。プライマーの設計は、公知の手法により適宜行なうことができ、例えば、Primer Express（登録商標）ソフトウェア（Applied Biosystems）を利用することができる。これらのポリヌクレオチドの長さは、通常15塩基以上（好ましくは16、17、18、19または20塩基以上、より好ましくは21塩基以上）であり、100塩基以下（好ましくは90、80、70、60、50または40塩基以下、より好ましくは30塩基以下）である。
　「一対のプライマーであるポリヌクレオチド」の好適な例としては、EZR-ERBB4融合ポリヌクレオチドに対しては配列番号11で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと配列番号12で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとからなるプライマーセット、KIAA1468-RET融合ポリヌクレオチドに対しては配列番号13で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと配列番号14で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとからなるプライマーセット、TRIM24-BRAF融合ポリヌクレオチドに対しては配列番号15で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと配列番号16で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとからなるプライマーセット、CD74-NRG1融合ポリヌクレオチドに対しては配列番号17で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと配列番号18で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとからなるプライマーセット、そしてSLC3A2-NRG1融合ポリヌクレオチドに対しては配列番号37で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと配列番号18で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとからなるプライマーセットが挙げられる（後述の表１を参照のこと）。
　PCRを利用して融合ポリヌクレオチドを検出する場合、PCR産物を対象としてダイレクトシークエンシングを行い、融合点を含む塩基配列を決定することで、5’側の遺伝子部分と3’側の遺伝子部分とがインフレームで連結されていることおよび／または融合ポリヌクレオチド中に所定のドメインが含まれていることを確認することができる。シークエンシングは公知の手法により行うことができ、シークエンサー（例えば、ABI-PRISM 310 Genetic Analyzer（Applied Biosystems Inc.）などを）を取扱説明書に従って使用することにより、簡単に実施することができる。
　またPCRを利用して融合ポリヌクレオチドを検出する場合、TaqManプローブ法をにより、5’側の遺伝子部分と3’側の遺伝子部分とがインフレームで連結されていることおよび／または融合ポリヌクレオチド中に所定のドメインが含まれていることを確認することができる。TaqManプローブ法において使用するプローブとしては、例えば前記（ａ）または（ｂ）に記載のポリヌクレオチドが挙げられる。プローブは、レポーター色素（例えば、FAM、FITC、VIC等）とクエンチャー（例えば、TAMRA、Eclipse、DABCYL、MGBなど）で標識される。
　上記プライマー及びプローブは、DNAであってもRNAであってもよく、あるいはDNA/RNAキメラであってもよいが、好ましくはDNAである。またその一部又は全部において、PNA（polyamide nucleic acid、ペプチド核酸）、LNA（登録商標、locked nucleic acid、Bridged Nucleic Acid、架橋化核酸）、ENA（登録商標、2'-O,4'-C-Ethylene-bridged nucleic acids）、GNA（Glycerol nucleic acid、グリセロール核酸）、TNA（Threose nucleic acid、トレオース核酸）等の人工核酸によって、ヌクレオチドが置換されているものであってもよい。また上記プライマー及びプローブは、二本鎖であっても一本鎖であってもよいが、好ましくは一本鎖である。
　また上記プライマーおよびプローブは、標的配列に特異的にハイブリダイズし得る限り、1又は複数のヌクレオチドのミスマッチを含んでいてもよく、標的配列の相補配列に対して通常80％以上、好ましくは90、91、92、93、94％以上、より好ましくは95、96、97、98、99％以上の同一性を有し、最も好ましくは100％の同一性を有する。
　上記プライマー及びプローブは、例えば、本明細書に記載された塩基配列の情報に基づいて、DNA/RNA自動合成機を用いて常法に従って合成することができる。
　本発明の検出方法においては、全トランスクリプトームシークエンシング（RNAシークエンシング）またはゲノムシークエンシングにより融合ポリヌクレオチドを検出してもよい。これらの手法は、例えば、次世代シークエンサー（例えば、ゲノムアナライザーIIx（Illumina社）、ハイセックシークエンサー(HiSeq2000、イルミナ社）ゲノムシークエンサー FLX System（Roche社）など）を使用して製造者の説明書に従って行なうことができる。RNAシークエンシングは、例えば、市販のキット（例えば、mRNA-Seqサンプル調製キット（Illumina社）など）を用いて製造者の説明書に従ってトータルRNAからcDNAライブラリーを調製し、これを次世代シークエンサーを使用するシークエンシングに供することにより行なうことができる。
　本発明の検出方法において、融合ポリヌクレオチドの翻訳産物（すなわち、融合ポリヌクレオチド）を対象とする場合、例えば、免疫染色法、ウェスタンブロッティング法、RIA法、ELISA法、フローサイトメトリー法、免疫沈降法、抗体アレイ解析などを利用して当該翻訳産物を検出することができる。これらの方法においては、融合ポリペプチドを特異的に認識する抗体が用いられる。ここで「融合ポリペプチドを特異的に認識する」とは、当該融合ポリペプチドの融合点からN末端側及びC末端側の部分が由来する野生型タンパク質を含めて当該融合ポリペプチド以外のタンパク質を認識することなく、当該融合ポリペプチドのみを認識することをいう。本発明の検出方法において使用される「融合ポリペプチドを特異的に認識する」抗体は、1つの抗体であってもよいし、2つ以上の抗体の組み合わせであってもよい。
　「融合ポリペプチドを特異的に認識する抗体」としては、融合ポリペプチドの融合点を含むポリペプチドに特異的な抗体（以下、「融合点特異的抗体」とも称する）が挙げられる。ここで、「融合点特異的抗体」とは、前記融合点を含むポリペプチドに特異的に結合するが、N末端側及びC末端側の部分が由来する野生型タンパク質には結合しない抗体を意味する。
　また「融合ポリペプチドを特異的に認識する抗体」としては、融合ポリペプチドの融合点からN末端側の領域からなるポリペプチドに結合する抗体と融合ポリペプチドの融合点からC末端側の領域からなるポリペプチドに結合する抗体の組み合わせも挙げられる。これら2つの抗体を用いてサンドイッチELISA、免疫染色法、免疫沈降法、ウェスタンブロッティング法などを行なうことにより、融合ポリペプチドを検出することができる。
　本発明において、抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（mAb）等の天然型抗体、遺伝子組換え技術を用いて製造され得るキメラ抗体、ヒト化抗体、一本鎖抗体、およびこれらの結合性断片が含まれるが、これらに限定されない。結合性断片とは、特異的結合活性を有する前記抗体の一部分の領域を意味し、具体的には例えばFab、Fab’、F(ab')2、Fv、及び単鎖抗体などが挙げられる。抗体のクラスは、特に限定されず、IgG、IgM、IgA、IgDまたはIgEなどのいずれのアイソタイプを有する抗体であってもよいが、精製の容易性等を考慮するとより好ましくはIgGである。
　「融合ポリペプチドを特異的に認識する抗体」は、当業者であれば適宜公知の手法を選択して調製することができる。かかる公知の手法としては、前記融合ポリペプチドの融合点を含むポリペプチド、前記融合ポリペプチドの融合点からN末端側の領域からなるポリペプチド、または前記融合ポリペプチドの融合点からC末端側の領域からなるポリペプチドを免疫動物に接種し、該動物の免疫系を活性化させた後、該動物の血清（ポリクローナル抗体）を回収する方法や、ハイブリドーマ法、組換えDNA法、ファージディスプレイ法等のモノクローナル抗体の作製方法が挙げられる。市販の抗体を利用してもよい。また標識物質を結合させた抗体を用いれば、当該標識を検出することにより、標的蛋白質を直接検出することが可能である。標識物質としては、抗体に結合することができ、検出可能なものであれば特に制限されることはなく、例えば、ペルオキシダーゼ、β-D-ガラクトシダーゼ、マイクロペルオキシダーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP）、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）、ローダミンイソチオシアネート（RITC）、アルカリホスファターゼ、ビオチン、及び放射性物質などが挙げられる。さらに、標識物質を結合させた抗体を用いて標的タンパク質を直接検出する方法以外に、標識物質を結合させた二次抗体、プロテインGまたはプロテインA等を用いて標的タンパク質を間接的に検出する方法を利用することもできる。
＜がんの責任変異（ドライバー変異）である遺伝子融合の検出用キット＞
　以上のように、がんの責任変異である遺伝子融合により生じる融合ポリヌクレオチドまたはそれによりコードされるポリペプチドを、前記プライマー、プローブ、または抗体、あるいはそれらの組み合わせを用いて検出することができ、それにより当該遺伝子融合を検出することができる。したがって、本発明は、下記のいずれかまたはそれらの組み合わせを含む、がんの責任変異である遺伝子融合の検出用キット（以下、本発明のキットとも称する）を提供する：
（A）EZR-ERBB4融合ポリヌクレオチド、KIAA1468-RET融合ポリヌクレオチド、TRIM24-BRAF融合ポリヌクレオチド、CD74-NRG1融合ポリヌクレオチド、またはSLC3A2-NRG1融合ポリヌクレオチドを特異的に認識するように設計されたプローブであるポリヌクレオチド；
（B）EZR-ERBB4融合ポリヌクレオチド、KIAA1468-RET融合ポリヌクレオチド、TRIM24-BRAF融合ポリヌクレオチド、CD74-NRG1融合ポリヌクレオチド、またはSLC3A2-NRG1融合ポリヌクレオチドを特異的に増幅できるように設計された一対のプライマーであるポリヌクレオチド；あるいは
（C）EZR-ERBB4融合ポリペプチド、KIAA1468-RET融合ポリペプチド、TRIM24-BRAF融合ポリペプチド、CD74-NRG1融合ポリペプチド、またはSLC3A2-NRG1融合ポリペプチドを特異的に認識する抗体。
　本発明のキットには、ポリヌクレオチドや抗体に加えて、ポリヌクレオチドや抗体に付加した標識の検出に必要な基質、陽性対照（例えば、EZR-ERBB4融合ポリヌクレオチド、KIAA1468-RET融合ポリヌクレオチド、TRIM24-BRAF融合ポリヌクレオチド、CD74-NRG1融合ポリヌクレオチド、またはSLC3A2-NRG1融合ポリヌクレオチド、EZR-ERBB4融合ポリペプチド、KIAA1468-RET融合ポリペプチド、TRIM24-BRAF融合ポリペプチド、CD74-NRG1融合ポリペプチド、またはSLC3A2-NRG1融合ポリペプチド、あるいはこれらを保持する細胞等）や陰性対照、PCR用試薬、in situハイブリダイゼーション等において用いられる対比染色用試薬（DAPI等）、抗体の検出に必要な分子（例えば、二次抗体、プロテインG、プロテインA）、試料の希釈や洗浄に用いる緩衝液等を適宜組み合わせて含めることができる。本発明のキットには、使用説明書を含めることもできる。本発明のキットを使用することにより、上記本発明の検出方法を容易に実施することが可能である。
　本発明の検出方法及び検出用キットは、がんの責任変異として新たに見出した遺伝子融合の検出を可能にするものであり、後述のように当該遺伝子融合の陽性例を同定し個別化医療を適用する上で極めて有用である。
＜がんの患者またはがんのリスクを有する被験者を同定する方法＞
　前記5種の遺伝子融合は、がんの責任変異であり、それぞれERBB4キナーゼ活性の恒常活性化、RETキナーゼ活性の恒常活性化、BRAFキナーゼ活性の恒常活性化、およびNRG1の細胞増殖因子としての機能の亢進により、がんの悪性化等に寄与していると考えられる。そのため、このような遺伝子融合が検出されるがん患者においては、当該遺伝子融合により生じる融合ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの発現および／または活性を抑制する物質による治療が有効である蓋然性が高い。
　したがって、本発明は、がんの責任変異（ドライバー変異）である遺伝子融合により生じる融合ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの発現および／または活性を抑制する物質が治療効果をもたらすがんの患者またはがんのリスクを有する被験者を同定する方法（以下、本発明の同定方法とも称する）を提供する。
　本発明の同定方法は、下記の工程を含む：
（1）被験者由来の単離された試料における下記（a）～（e）のいずれかの融合ポリヌクレオチドまたはそれによりコードされるポリペプチドを検出する工程：
（a）EZR-ERBB4融合ポリヌクレオチドであって、EZRのコイルドコイルドメインの全部または一部及びERBB4のキナーゼドメインを含みかつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（b）KIAA1468-RET融合ポリヌクレオチドであって、KIAA1468のコイルドコイルドメインの全部または一部及びRETのキナーゼドメインを含みかつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（c）TRIM24-BRAF融合ポリヌクレオチドであって、BRAFのキナーゼドメインを含みかつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（d）CD74-NRG1融合ポリヌクレオチドであって、CD74の膜貫通ドメイン及びNRG1のEGFドメインを含みかつ細胞内情報伝達を亢進する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ならびに
（e）SLC3A2-NRG1融合ポリヌクレオチドであって、SLC3A2の膜貫通ドメイン及びNRG1のEGFドメインを含みかつ細胞内情報伝達を亢進する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；ならびに
（2）前記融合ポリヌクレオチドまたはそれによりコードされるポリペプチドが検出された場合に、前記ポリペプチドの発現および／または活性を抑制する物質が前記被験者において治療効果をもたらすと判定する工程。
　本発明の同定方法において、「がんの患者またはがんのリスクを有する被験者」は、がんに罹患しているか、またはがんに罹患している疑いのある哺乳動物、好ましくはヒトである。本発明の同定方法を適用する対象となる「がん」としては、前記5種の遺伝子融合のうちいずれかが検出され得るがんであれば特に限定されないが、好ましくは肺がんであり、さらに好ましくは非小細胞肺がんであり、特に好ましくは肺腺がんである。
　本発明の同定方法において、「治療効果」とは、がん治療の効果であって、患者に対する有益な効果であれば特に限定されず、例えば、腫瘍縮小効果、無増悪生存期間延長効果、延命効果などが挙げられる。
　本発明の同定方法において、EZR-ERBB4遺伝子融合に関してがん治療の有効性を評価する対象となる「がんの責任変異（ドライバー変異）である遺伝子融合により生じる融合ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの発現および／または活性を抑制する物質」（以下、本発明の同定方法における対象物質とも称する）としては、EZR-ERBB4融合ポリペプチドの発現および／またはその機能を直接または間接的に阻害する物質であれば特に限定されない。
　EZR-ERBB4融合ポリペプチドの発現を阻害する物質としては、例えば、EZR-ERBB4融合ポリペプチドの発現を抑制するsiRNA（small interfering RNA）、shRNA（short hairpin RNA）、miRNA（micro RNA)、アンチセンス核酸、これらのポリヌクレオチドを発現し得る発現ベクター、低分子化合物などが挙げられる。
　EZR-ERBB4融合ポリペプチドの機能を阻害する物質としては、例えば、ERBB4キナーゼ活性を阻害する物質（例えば、低分子化合物等）、EZR-ERBB4融合ポリペプチドに結合する抗体等が挙げられる。
　これらの物質は、EZR-ERBB4融合ポリペプチドの発現および／または活性を特異的に抑制する物質であってもよいし、野生型ERBB4タンパク質の発現および／または活性をも抑制する物質であってもよい。このような物質の具体例としては、afatinib、dacomitinib等が挙げられる。
　これらの物質は、本明細書中に開示されたEZR-ERBB4融合ポリヌクレオチドおよび／またはEZR-ERBB4融合ポリペプチドの配列情報等に基づいて、自体公知の方法により調製することができる。また市販の物質を利用してもよい。
　これらの物質は、がんを有する被験者由来の単離された試料においてEZR-ERBB4融合ポリヌクレオチドまたはそれによりコードされるポリペプチドが検出された場合に、当該被験者に対してがん治療剤として有効である。
　KIAA1468-RET遺伝子融合に関して、本発明の同定方法における対象物質としては、KIAA1468-RET融合ポリペプチドの発現および／またはその機能を直接または間接的に阻害する物質であれば特に限定されない。
　KIAA1468-RET融合ポリペプチドの発現を阻害する物質としては、例えば、KIAA1468-RET融合ポリペプチドの発現を抑制するsiRNA（small interfering RNA）、shRNA（short hairpin RNA）、miRNA（micro RNA)、アンチセンス核酸、これらのポリヌクレオチドを発現し得る発現ベクター、低分子化合物などが挙げられる。
　KIAA1468-RET融合ポリペプチドの機能を阻害する物質としては、例えば、RETキナーゼ活性を阻害する物質（例えば、低分子化合物等）、KIAA1468-RET融合ポリペプチドに結合する抗体等が挙げられる。
　これらの物質は、KIAA1468-RET融合ポリペプチドの発現および／または活性を特異的に抑制する物質であってもよいし、野生型RETタンパク質の発現および／または活性をも抑制する物質であってもよい。このような物質の具体例としては、vandetanib、cabozantinib、sorafenib、sunitinib、lenvatinib、ponatinib等が挙げられる。
　これらの物質は、本明細書中に開示されたKIAA1468-RET融合ポリヌクレオチドおよび／またはKIAA1468-RET融合ポリペプチドの配列情報等に基づいて、自体公知の方法により調製することができる。また市販の物質を利用してもよい。
　これらの物質は、がんを有する被験者由来の単離された試料においてKIAA1468-RET融合ポリヌクレオチドまたはそれによりコードされるポリペプチドが検出された場合に、当該被験者に対してがん治療剤として有効である。
　TRIM24-BRAF遺伝子融合に関して、本発明の同定方法における対象物質としては、TRIM24-BRAF融合ポリペプチドの発現および／またはその機能を直接または間接的に阻害する物質であれば特に限定されない。
　TRIM24-BRAF融合ポリペプチドの発現を阻害する物質としては、例えば、TRIM24-BRAF融合ポリペプチドの発現を抑制するsiRNA（small interfering RNA）、shRNA（short hairpin RNA）、miRNA（micro RNA)、アンチセンス核酸、これらのポリヌクレオチドを発現し得る発現ベクター、低分子化合物などが挙げられる。
　TRIM24-BRAF融合ポリペプチドの機能を阻害する物質としては、例えば、BRAFキナーゼ活性を阻害する物質（例えば、低分子化合物等）、TRIM24-BRAF融合ポリペプチドに結合する抗体等が挙げられる。
　これらの物質は、TRIM24-BRAF融合ポリペプチドの発現および／または活性を特異的に抑制する物質であってもよいし、野生型BRAFタンパク質の発現および／または活性をも抑制する物質であってもよい。このような物質の具体例としては、vemurafenib、dabrafenib等が挙げられる。
　これらの物質は、本明細書中に開示されたTRIM24-BRAF融合ポリヌクレオチドおよび／またはTRIM24-BRAF融合ポリペプチドの配列情報等に基づいて、自体公知の方法により調製することができる。また市販の物質を利用してもよい。
　これらの物質は、がんを有する被験者由来の単離された試料においてTRIM24-BRAF融合ポリヌクレオチドまたはそれによりコードされるポリペプチドが検出された場合に、当該被験者に対してがん治療剤として有効である。
　CD74-NRG1遺伝子融合に関して、本発明の同定方法における対象物質としては、CD74-NRG1融合ポリペプチドの発現および／またはその機能を直接または間接的に阻害する物質であれば特に限定されない。
　CD74-NRG1融合ポリペプチドの発現を阻害する物質としては、例えば、CD74-NRG1融合ポリペプチドの発現を抑制するsiRNA（small interfering RNA）、shRNA（short hairpin RNA）、miRNA（micro RNA)、アンチセンス核酸、これらのポリヌクレオチドを発現し得る発現ベクター、低分子化合物などが挙げられる。
　CD74-NRG1融合ポリペプチドの機能を阻害する物質としては、例えば、NRG1の細胞内情報伝達を亢進する活性を阻害する物質（例えば、低分子化合物等）、CD74-NRG1融合ポリペプチドに結合する抗体等が挙げられる。
　これらの物質は、CD74-NRG1融合ポリペプチドの発現および／または活性を特異的に抑制する物質であってもよいし、野生型NRG1タンパク質の発現および／または活性をも抑制する物質であってもよい。このような物質の具体例としては、NRG1タンパク質の切断に関与するBACEタンパク質の阻害剤MK-8931、E2609等が挙げられる。
　これらの物質は、本明細書中に開示されたCD74-NRG1融合ポリヌクレオチドおよび／またはCD74-NRG1融合ポリペプチドの配列情報等に基づいて、自体公知の方法により調製することができる。また市販の物質を利用してもよい。
　さらに、野生型NRG1タンパク質は、その受容体であるHERタンパク質群に属するタンパク質を介して細胞内情報伝達を亢進すると考えられることから、本発明の同定方法における対象物質としては、HERタンパク質の発現および／またはその機能を直接または間接的に阻害する物質も挙げられる。ここでHERタンパク質群は、チロシンキナーゼ型受容体の一群であり、HER1（ErbB1）、HER2（ErbB2）、HER3（ErbB3）、およびHER4（ErbB4）の4つのタンパク質が含まれる。
　HERタンパク質の発現を阻害する物質としては、例えば、HERタンパク質の発現を抑制するsiRNA（small interfering RNA）、shRNA（short hairpin RNA）、miRNA（micro RNA)、アンチセンス核酸、これらのポリヌクレオチドを発現し得る発現ベクター、低分子化合物などが挙げられる。
　HERタンパク質の機能を阻害する物質としては、例えば、HERタンパク質のキナーゼ活性を阻害する物質（例えば、低分子化合物等）、HERタンパク質に結合する抗体等が挙げられる。このような物質の具体例としては、rapatinib、afatinib、dacomitinib、trastuzumab等が挙げられる。
　これらの物質は、公知の配列情報等に基づいて、自体公知の方法により調製することができる。また市販の物質を利用してもよい。
　これらの物質は、がんを有する被験者由来の単離された試料においてCD74-NRG1融合ポリヌクレオチドまたはそれによりコードされるポリペプチドが検出された場合に、当該被験者に対してがん治療剤として有効である。
　SLC3A2-NRG1遺伝子融合に関して、本発明の同定方法における対象物質としては、SLC3A2-NRG1融合ポリペプチドの発現および／またはその機能を直接または間接的に阻害する物質であれば特に限定されない。
　SLC3A2-NRG1融合ポリペプチドの発現を阻害する物質としては、例えば、SLC3A2-NRG1融合ポリペプチドの発現を抑制するsiRNA（small interfering RNA）、shRNA（short hairpin RNA）、miRNA（micro RNA)、アンチセンス核酸、これらのポリヌクレオチドを発現し得る発現ベクター、低分子化合物などが挙げられる。
　SLC3A2-NRG1融合ポリペプチドの機能を阻害する物質としては、例えば、NRG1の細胞内情報伝達を亢進する活性を阻害する物質（例えば、低分子化合物等）、SLC3A2-NRG1融合ポリペプチドに結合する抗体等が挙げられる。
　これらの物質は、SLC3A2-NRG1融合ポリペプチドの発現および／または活性を特異的に抑制する物質であってもよいし、野生型NRG1タンパク質の発現および／または活性をも抑制する物質であってもよい。このような物質の具体例としては、NRG1タンパク質の切断に関与するBACEタンパク質の阻害剤MK-8931、E2609等が挙げられる。
　これらの物質は、本明細書中に開示されたSLC3A2-NRG1融合ポリヌクレオチドおよび／またはSLC3A2-NRG1融合ポリペプチドの配列情報等に基づいて、自体公知の方法により調製することができる。また市販の物質を利用してもよい。
　さらに、野生型NRG1タンパク質は、その受容体であるHERタンパク質群に属するタンパク質を介して細胞内情報伝達を亢進すると考えられることから、本発明の同定方法における対象物質としては、HERタンパク質の発現および／またはその機能を直接または間接的に阻害する物質も挙げられる。これらの物質の例としては、上記CD74-NRG1遺伝子融合に関して列挙した物質が挙げられる。
　これらの物質は、公知の配列情報等に基づいて、自体公知の方法により調製することができる。また市販の物質を利用してもよい。
　これらの物質は、がんを有する被験者由来の単離された試料においてSLC3A2-NRG1融合ポリヌクレオチドまたはそれによりコードされるポリペプチドが検出された場合に、当該被験者に対してがん治療剤として有効である。
　本発明の同定方法における工程(1)は、前記本発明の検出方法に含まれる工程と同様に実施することができる。
　本発明の同定方法における工程(2)では、工程(1)でがんを有する被験者（すなわちがんの患者またはがんのリスクを有する被験者）由来の単離された試料において融合ポリヌクレオチドまたはそれによりコードされるポリペプチドが検出された場合に、本発明の同定方法における対象物質が前記被験者において治療効果をもたらすと判定され、一方、融合ポリヌクレオチドまたはそれによりコードされるポリペプチドが検出されなかった場合には、本発明の同定方法における対象物質が前記被験者において治療効果をもたらす可能性が低いと判定される。
　本発明の同定方法によれば、がんの患者またはがんのリスクを有する被験者の中からがんの責任変異として新たに見出した遺伝子融合の陽性例を検出し、当該遺伝子融合により生じる融合ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの発現および／または活性を抑制する物質が治療効果をもたらすがんの患者またはがんのリスクを有する被験者を同定することが可能であり、本発明はそのような対象に適した治療を行うことが可能になる点で有用である。
＜がんの治療方法およびがん治療剤＞
　上記の通り、本発明の同定方法により、前記5種の遺伝子融合のいずれかにより生じる融合ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの発現および／または活性を抑制する物質が治療効果をもたらすがん患者が同定される。そのため、がん患者のうち、当該融合遺伝子を保持する患者に選択的に当該物質を投与することにより、効率的にがんの治療を行うことが可能である。従って、本発明は、がんの治療方法であって、上記本発明の同定方法により当該物質が治療効果をもたらすと判定された被験者に、当該物質を投与する工程を含む方法（以下、本発明の治療方法とも称する）を提供する。
　また、本発明の治療方法において投与される物質はがん治療剤として機能することから、本発明はさらに、前記5種の遺伝子融合のいずれかにより生じる融合ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの発現および／または活性を抑制する物質を有効成分とするがん治療剤（以下、本発明のがん治療剤とも称する）を提供する。
　本発明のがん治療剤としては、上記本発明の同定方法に関連して、前記5種の遺伝子融合のいずれかにより生じる融合ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの発現および／または活性を抑制する物質として記載した物質が挙げられる。
　本発明のがん治療剤は、それらの製剤化に通常用いられる薬理学上許容される担体、賦形剤、および／またはその他の添加剤を用いて、医薬組成物として調製することができる。
　本発明のがん治療剤の投与方法は、当該阻害剤の種類やがんの種類などに応じて適宜選択されるが、例えば、経口、静脈内、腹腔内、経皮、筋肉内、気管内（エアゾール）、直腸内、膣内等の投与形態を採用することができる。
　本発明のがん治療剤の投与量は、有効成分の活性や種類、投与様式（例、経口、非経口）、病気の重篤度、投与対象となる動物種、投与対象の薬物受容性、体重、年齢等を考慮して、適宜決定することができる。
　本発明の治療方法およびがん治療剤は、従来知られておらず本願発明により明らかとなった特定のがんの責任変異を有する患者の治療を可能にするため有用である。
＜がん治療剤のスクリーニング方法＞
　本発明は、前記4種の遺伝子融合のいずれかを有するがん患者に対して治療効果をもたらすがん治療剤のスクリーニング方法（以下、本発明のスクリーニング方法とも称する）を提供する。本発明のスクリーニング方法により、前記5種の融合ポリペプチド（すなわち、EZR-ERBB4融合ポリペプチド、KIAA1468-RET融合ポリペプチド、TRIM24-BRAF融合ポリペプチド、CD74-NRG1融合ポリペプチド、およびSLC3A2-NRG1融合ポリペプチド）のうちいずれかの発現および／または活性を抑制する物質を、がん治療剤として得ることができる。
　本発明のスクリーニング方法に供される被験物質は、いかなる化合物又は組成物であってもよく、例えば、核酸（例、ヌクレオシド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド）、糖質（例、単糖、二糖、オリゴ糖、多糖）、脂質（例、飽和又は不飽和の直鎖、分岐鎖及び／又は環を含む脂肪酸）、アミノ酸、タンパク質（例、オリゴペプチド、ポリペプチド）、低分子化合物、化合物ライブラリー、ランダムペプチドライブラリー、天然成分（例、微生物、動植物、海洋生物等由来の成分）、あるいは食品等が挙げられる。
　本発明のスクリーニング方法は、被験物質が前記4種の融合ポリペプチドのうちいずれかの発現および／または活性を抑制するか否かを評価可能である限り、いかなる形態であってもよい。典型的には、本発明のスクリーニング方法は、下記の工程を含む：
（1）EZR-ERBB4融合ポリペプチド、KIAA1468-RET融合ポリペプチド、TRIM24-BRAF融合ポリペプチド、CD74-NRG1融合ポリペプチド、またはSLC3A2-NRG1融合ポリペプチドを発現している細胞に被験物質を接触させる工程；
（2）前記融合ポリペプチドの発現および／または活性が抑制されるか否かを決定する工程；ならびに
（3）前記融合ポリペプチドの発現および／または活性を抑制すると決定された物質をがん治療剤として選択する工程。
　工程（1）では、前記5種の融合ポリペプチドのうちいずれかを発現している細胞と被験物質を接触させる。対照として、被験物質を含まない溶媒（例えば、DMSOなど）を用いることができる。当該接触は、培地中で行うことができる。培地は、用いられる細胞の種類などに応じて適宜選択されるが、例えば、約5～20％のウシ胎仔血清を含む最少必須培地（MEM）、ダルベッコ改変最少必須培地（DMEM）、RPMI1640培地、199培地などである。培養条件もまた、用いられる細胞の種類などに応じて適宜決定されるが、例えば、培地のpHは約6～約8であり、培養温度は約30～約40℃であり、培養時間は約12～約72時間である。
　前記5種の融合ポリペプチドのうちいずれかを発現している細胞としては、例えば、内在的に当該融合ポリペプチドを発現しているがん組織由来の細胞、当該細胞から誘導された細胞株、遺伝子工学的に作製された細胞株などが挙げられるが、これらに限定されない。ある細胞が前記5種の融合ポリペプチドのうちいずれかを発現しているか否かは、上記本発明の検出方法を利用して確認することもできる。また細胞は、通常哺乳動物の細胞であり、好ましくはヒトの細胞である。
　工程（2）では、前記融合ポリペプチドの発現および／または活性が抑制されるか否かが決定される。融合ポリペプチドの発現は、細胞におけるmRNAレベルまたはタンパク質レベルを公知の分析方法、例えば、ノーザンブロット法、定量的PCR法、イムノブロット法、ELISA法等を用いて決定することにより測定することができる。また融合ポリペプチドの活性も、公知の分析方法（例えば、キナーゼ活性測定など）により測定することができる。得られた測定値を被験物質と接触させない対照細胞における測定値と比較する。測定値の比較は、好ましくは有意差の有無に基づいて行われる。被験物質と接触させた細胞における測定値が対照と比較して有意に低い場合、当該被験物質が融合ポリペプチドの発現および／または活性を抑制すると決定することができる。
　あるいは、これらの融合ポリペプチドを発現している細胞は、増殖が亢進していることから、当該細胞の増殖を本工程における決定のための指標とすることができる。この場合、まず、被験物質と接触させた当該細胞の増殖を測定する。細胞増殖の測定は、セルカウント、3Hチミジンの取り込み、BRDU法等の自体公知の方法により行うことができる。次に、被験物質と接触させた当該細胞の増殖を、被験物質と接触させない対照細胞の増殖と比較する。増殖レベルの比較は、好ましくは、有意差の有無に基づいて行なわれる。被験物質と接触させない対照細胞の増殖は、被験物質と接触させた細胞の増殖の測定に対し、事前に測定した値であっても、同時に測定した値であってもよいが、実験の精度、再現性の観点から同時に測定した値であることが好ましい。比較の結果、被験物質と接触させた当該細胞の増殖が抑制された場合に、当該被験物質が融合ポリペプチドの発現および／または活性を抑制すると決定することができる。
　工程（3）では、工程（2）において融合ポリペプチドの発現および／または活性を抑制すると決定された被験物質をがん治療剤として選択する。
　以上のように、本発明のスクリーニング方法によれば、従来知られていなかったがんの責任変異を有する患者の治療に適用可能ながん治療剤を取得することが可能となる。
＜単離された融合ポリペプチドまたはその断片、およびそれらをコードするポリヌクレオチド＞
　本発明は、以下の単離された融合ポリペプチド（以下、本発明の融合ポリペプチドとも称する）またはその断片を提供する：
（1）EZRタンパク質のコイルドコイルドメインの全部または一部及びERBB4タンパク質のキナーゼドメインを含みかつキナーゼ活性を有する、単離されたEZR-ERBB4融合ポリペプチド、
（2）KIAA1468タンパク質のコイルドコイルドメインの全部または一部及びRETタンパク質のキナーゼドメインを含みかつキナーゼ活性を有する、単離されたKIAA1468-RET融合ポリペプチド、
（3）BRAFタンパク質のキナーゼドメインを含みかつキナーゼ活性を有する、単離されたTRIM24-BRAF融合ポリペプチド、
（4）CD74タンパク質の膜貫通ドメイン及びNRG1タンパク質のEGFドメインを含みかつ細胞内情報伝達を亢進する活性を有する、単離されたCD74-NRG1融合ポリペプチド、ならびに
（5）SLC3A2タンパク質の膜貫通ドメイン及びNRG1タンパク質のEGFドメインを含みかつ細胞内情報伝達を亢進する活性を有する、単離されたSLC3A2-NRG1融合ポリペプチド。
　本明細書中、「単離された」物質とは、ある物質が天然に存在する環境（例えば、生物体の細胞内）の他の物質（好ましくは、生物学的因子）（例えば、核酸である場合、核酸以外の因子および目的とする核酸以外の核酸配列を含む核酸；タンパク質である場合、タンパク質以外の因子および目的とするタンパク質以外のアミノ酸配列を含むタンパク質など）から実質的に分離または精製されたものをいう。本明細書において「単離された」とは、好ましくは７５重量％以上、より好ましくは８５重量％以上、よりさらに好ましくは９５重量％以上、そして最も好ましくは９６重量％以上、９７重量％以上、９８重量％以上、９９重量％以上、又は１００％の純度を有することを意味する。「単離された」ポリヌクレオチドおよびポリペプチドには、標準的な精製方法によって精製されたポリヌクレオチドおよびポリペプチドが含まれ、また化学的に合成したポリヌクレオチドおよびポリペプチドも含まれる。
　上記（1）～（5）中のその他の各用語の意味については、上記＜具体的ながんの責任変異＞において記載した通りである。
　「断片」とは、本発明の融合ポリペプチドの断片であって、融合点の上流および下流の配列を含む連続した部分配列からなるものをいう。当該部分配列に含まれる融合点の上流の配列は、融合点から1アミノ酸残基以上（例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100アミノ酸残基以上）を含み、本発明の融合ポリペプチドのN末端までを含みうる。当該部分配列に含まれる融合点の下流の配列は、融合点から1アミノ酸残基以上（例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100アミノ酸残基以上）を含み、本発明の融合ポリペプチドのC末端までを含みうる。断片の長さは、特に限定されないが、通常8アミノ酸残基以上（例えば、9、10、11、12、13、14、15、20、25、50、100アミノ酸残基以上）である。
　また本発明の融合ポリペプチドは、例えば下記の単離された融合ポリペプチドであり得る。
（1）EZR-ERBB4融合ポリペプチドに関して、
（i）配列番号2で表わされるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ii）配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドにおいて、1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつキナーゼ活性を有するポリペプチド、あるいは
（iii）配列番号2で表されるアミノ酸配列と80％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつキナーゼ活性を有するポリペプチド；
（2）KIAA1468-RET融合ポリペプチドに関して、
（i）配列番号4で表わされるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ii）配列番号4で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドにおいて、1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつキナーゼ活性を有するポリペプチド、あるいは
（iii）配列番号4で表されるアミノ酸配列と80％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつキナーゼ活性を有するポリペプチド；
（3）TRIM24-BRAF融合ポリペプチドに関して、
（i）配列番号6で表わされるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ii）配列番号6で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドにおいて、1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつキナーゼ活性を有するポリペプチド、あるいは
（iii）配列番号6で表されるアミノ酸配列と80％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつキナーゼ活性を有するポリペプチド；
（4）CD74-NRG1融合ポリペプチドに関して、
（i）配列番号8または10で表わされるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ii）配列番号8または10で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドにおいて、1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ細胞内情報伝達を亢進する活性を有するポリペプチド、あるいは
（iii）配列番号8または10で表されるアミノ酸配列と80％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ細胞内情報伝達を亢進する活性を有するポリペプチド；ならびに
（5）SLC3A2-NRG1融合ポリペプチドに関して、
（i）配列番号36で表わされるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ii）配列番号36で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドにおいて、1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ細胞内情報伝達を亢進する活性を有するポリペプチド、あるいは
（iii）配列番号36で表されるアミノ酸配列と80％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ細胞内情報伝達を亢進する活性を有するポリペプチド。
　上記(i)～(iii)中の各用語の意味については、上記＜具体的ながんの責任変異＞において記載した通りである。
　さらに本発明は、上記本発明の融合ポリペプチドまたはその断片をコードする単離されたポリヌクレオチド（以下、本発明のポリヌクレオチドとも称する）を提供する。本発明のポリヌクレオチドは、mRNA、cDNAおよびゲノムDNAのいずれであってもよい。また二本鎖であっても一本鎖であってもよい。
　EZR-ERBB4融合ポリペプチドをコードするcDNAの典型例は、配列番号1で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドである。
　KIAA1468-RET融合ポリペプチドをコードするcDNAの典型例は、配列番号3で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドである。
　TRIM24-BRAF融合ポリペプチドをコードするcDNAの典型例は、配列番号5で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドである。
　CD74-NRG1融合ポリペプチドをコードするcDNAの典型例は、配列番号7または9で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドである。
　SLC3A2-NRG1融合ポリペプチドをコードするcDNAの典型例は、配列番号35で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドである。
　本発明のポリヌクレオチドは、自体公知の方法により作製することができる。例えば、EZR-ERBB4融合ポリヌクレオチド、KIAA1468-RET融合ポリヌクレオチド、TRIM24-BRAF融合ポリヌクレオチド、CD74-NRG1融合ポリヌクレオチド、またはSLC3A2-NRG1融合ポリヌクレオチドを保持するがん組織等から調製したcDNAライブラリーまたはゲノムライブラリーから公知のハイブリダイゼーション技術を利用して抽出することができる。また、前記がん組織等から調製したmRNA、cDNAまたはゲノムDNAを鋳型として公知の遺伝子増幅技術（PCR）を用いて増幅することにより調製することもできる。さらに、各融合ポリヌクレオチドの5’末端側及び3’末端側の部分が由来する野生型遺伝子のcDNAを材料とし、PCR、制限酵素処理、部位特異的変異誘発（site-directed mutagenesis）法（Kramer, W. & Fritz, HJ., Methods Enzymol, 1987, 154, 350．）等の公知の遺伝子増幅技術や組換え技術を利用して調製することもできる。
　本発明の融合ポリペプチドまたはその断片も、自体公知の方法により作製することができる。例えば、上記のようにして調製したポリヌクレオチドを適当な発現ベクターに挿入し、該ベクターを無細胞タンパク質合成系（例えば、網状赤血球抽出液、小麦胚芽抽出液）に導入してインキュベーションすることにより、また該ベクターを適当な細胞（例えば、大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞）に導入し、得られた形質転換体を培養することにより、本発明の融合ポリペプチドを調製することができる。
　本発明の融合ポリペプチドまたはその断片は、本発明の検出方法等におけるマーカーとして使用することができ、また本発明の融合ポリペプチドに対する抗体の作製等にも使用することができる。
　以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
　＜サンプル＞
　がん患者から採取した肺組織からトータルRNAを調製した。
　トータルRNAは、大まかに切り分けて凍結した組織サンプルから製造者のインストラクションに従いトリゾール試薬を用いて抽出し、モデル2100 バイオアナライザー（model 2100 bioanalyzer、アジレント・テクノロジー社製）を用いて質の検定を行った。その結果、全てのサンプルが6を超えるRIN（RNA integrity number）値を示した。また、組織サンプルからは、QIAamp DNAミニキット（登録商標、キアゲン社製）を用いてゲノムDNAも抽出した。なお、この研究は、本研究に係る組織の倫理審査員会の承認を得て進められた。
　＜RNAシークエンシング＞
　RNAシークエンシングのためのcDNAライブラリーは製造者の標準プロトコールに従い、mRNA-Seqサンプル調製キット（イルミナ社製）を用いて調製した。簡潔に説明すると、2μgのトータルRNAからpoly-A(+)RNAを精製し、フラグメンテーション緩衝液で94℃、5分加熱することで断片化した後、2本鎖cDNA合成に用いた。得られた2本鎖cDNAをPEアダプターDNAにライゲ―ションした後、PCRで増幅した。このように作成したライブラリーをゲノムアナライザーIIxシークエンサー（GAIIx、イルミナ社製）、又はハイセックシークエンサー(HiSeq2000、イルミナ社製）を用いた50-bp又は75-bpのペアエンドシークエンスに供した。
　＜融合転写産物の検出＞
　融合転写産物の検出は、McPherson, A. et al PLoS Comput Biol. 2011 May;7(5):e1001138に記載されるdeFuseプログラムを用いて行った。具体的には、スプライスされた遺伝子配列とスプライスされていない遺伝子配列からなる参照配列にペアエンドリードをアライン(Align)した。次に、参照配列に一致しないアラインメント(ambiguous discordant alignments)について、可能な2遺伝子の遺伝子融合を仮定し、アラインメントを行った。そして、遺伝子融合をヌクレオチドレベルで支持するような2つの遺伝子に亘るスプリットリードを検出し、スプリットリードとそれぞれが2つの遺伝子にマップされるペアエンドリード（スパニングリード）による確証性、スパニングリード間のヌクレオチド長の整合性を考慮し、遺伝子融合の候補とした。次に、当該候補より、コードされるであろうアミノ酸構造が、タンパク質キナーゼやキナーゼが司る細胞内情報伝達経路の活性化をもたらすような遺伝子融合を抽出した。
　＜RT-PCR、ゲノムPCR、サンガーシークエンシング＞
　トータルRNA（500 ng）をスーパースクリプトIII逆転写酵素（登録商標、インビトロジェン社製）を用いて逆転写した。得られたcDNA（10 ngのトータルRNAに相当）もしくは10 ngのゲノムDNAをKAPA Taq DNAポリメラーゼ（KAPAバイオシステムス社製）を用いたPCR増幅に供した。反応は次の条件のもとサーマルサイクラー内で行った：95℃30秒、60℃30秒、72℃2分を40サイクル、その後72℃10分最終伸長反応。また、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）をコードする遺伝子をcDNA合成の効率の評価のため増幅した。さらに、PCR産物はBigDyeターミネーターキットとABI 3130xl DNAシークエンサー（アプライドバイオシステムス社製）とを用いて、両方向に塩基配列を直接決定した。なお、本研究で用いたプライマーを表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　（実施例１）
　本実施例は、肺がん組織における新規融合転写産物の同定について記載する。
　治療標的となりうる新規融合転写産物を同定するため、114例の肺腺がんと3例の非がん肺組織の全トランスクリプトームシークエンシング（RNAシークエンシング、Meyerson, M. et al., Nat Rev Genet, 2010, 11, 685-696）を行った。
　RNAシークエンシングで得られたペアエンドリードを解析し、逆転写（RT）-PCR産物のサンガーシークエンシングを行った。その結果、表２及び図１に示すように、4つの新規融合遺伝子産物が同定された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　EZR-ERBB4は、染色体転座t(2;6)により生じた、染色体6q25に存在するEZR遺伝子と染色体2q34に存在するERBB4遺伝子との融合遺伝子である。
　KIAA1468-RETは、染色体転座t(10;18)により生じた、染色体18q21に存在するKIAA1468遺伝子と染色体10q11に存在するRET遺伝子との融合遺伝子である。
　TRIM24-BRAFは、染色体逆位inv7により生じた、染色体7q33に存在するTRIM24遺伝子と染色体7q34に存在するBRAF遺伝子との融合遺伝子である。
　CD74-NRG1は、染色体転座t(5;8)により生じた、染色体5q32に存在するCD74遺伝子と染色体8p12に存在するNRG1遺伝子との融合遺伝子である。
　これらのうち、EZR-ERBB4、KIAA1468-RET及びTRIM24-BRAFは、それぞれ１例の肺がんサンプルから検出された。一方、CD74-NRG1は、異なる2例の肺がんサンプルから切断点の異なるバリアントが検出された（variant 1及び2）。
（実施例２）
　本実施例は、実施例１で見出された遺伝子融合のRT-PCRによる検出について記載する。
　各融合遺伝子について、5’側及び3’側遺伝子部分のcDNA配列に由来するPCRプライマー（それぞれフォワードプライマー及びリバースプライマー）を作製した（表１）。これらのプライマーを用いて、がん組織由来RNAから合成したcDNAを鋳型としてPCR増幅を行った。
　PCR産物の電気泳動図を図２に示す。一部の試料において特異的なバンドの増幅が認められ、さらにPCR産物の塩基配列を決定した結果、融合遺伝子の一部が増幅されたことが確認された。
　以上の結果から、RT-PCRによる特異的なバンドの増幅の有無の検査やPCR産物の塩基配列決定により、実施例１で見出された遺伝子融合を検出することができることが示された。
（実施例３）
　本実施例は、実施例１で見出された遺伝子融合が肺がんの責任変異である可能性が高いことを示す。
　実施例１において新規遺伝子融合が見出された5例の肺がんにおける、他の公知のがんの責任変異であるEGFR点変異・インフレーム欠失変異(EGFR point mutation, EGFR in-flame deletion mutation)、KRAS点変異(KRAS point mutation)、BRAF点変異(BRAF point mutation)、HER2インフレーム挿入変異(HER2 in-flame insertion mutation)、EML4-ALK遺伝子融合(EML4-ALK fusion)、KIF5B-RET遺伝子融合(KIF5B-RET fusion)、CCDC6-RET遺伝子融合(CCDC6-RET fusion)、CD74-ROS1遺伝子融合(CD74-ROS1 fusion)、EZR-ROS1遺伝子融合(EZR-ROS1 fusion)及びSLC34A2-ROS1遺伝子融合(SLC34A2-ROS1 fusion)の有無を調べた。
　その結果、前記5例の肺がんのいずれも他の公知の変異については陰性であり、4種の新規遺伝子融合と他の公知のがんの責任変異とは相互排他的な関係にあった。
　この結果から、4種の新規遺伝子融合はがんの責任変異であることが示された。
（実施例４）
　本実施例および実施例５には、実施例１において解析した114例に含まれる90例についてさらに解析を行った結果を示す。
材料と方法
＜サンプル＞
　90例のIMAは、1998年から2013年までに国立がん研究センター中央病院（東京、日本）で外科的処置を受けた原発性肺腺がんを有する連続する患者から同定した。組織学的診断は、LADCについての最新の世界保健機関の分類およびthe International Association for the Study of Lung Cancer/American Thoracic Society/European Respiratory Society（IASLC/ATS/ERS)の基準に基づいた（Travis WD, et al. J Thorac Oncol. 2011, 6, 244-85; Travis WD, Brambilla, E., Muller-Hermelink, H.K. and Harris, C.C. , editor. World Health Organization Classification of Tumors; Pathology and Genetics, Tumours of Lung, Pleura, Thymus and Heart. Lyon: IARC Press; 2004）。トータルRNAは、大まかに切り、急速凍結した（snap-frozen）組織サンプルから、TRIzol（Invitrogen、Carlsbad、CA、USA)を使用して抽出した。研究は、参加機関の治験審査委員会によって承認された。
＜RNAシークエンシング＞
　RNAシークエンシングライブラリーは、1または2μgのトータルRNAから、mRNA-Seq Sample Prep KitまたはTruSeq RNA Sample Prep Kit（Illumina、San Diego、CA、USA)を使用して調製した。得られたライブラリーを、Genome Analyzer IIx（GAIIx）またはHiSeq 2000（Illumina）による50または75 bpリードのペアエンドシークエンシングに供した。TopHat-Fusionアルゴリズム（Kim D, Salzberg SL. TopHat-Fusion: an algorithm for discovery of novel fusion transcripts. Genome Biol. 2011, 12, R72）を使用して、融合転写産物を検出した。
＜融合産物の発がん特性の試験＞
　CD74-NRG1、EZR-ERBB4およびTRIM24-BRAF融合タンパク質の発現用のレンチウイルスベクターを構築するために、全長cDNAをPCRにより腫瘍のcDNAから増幅し、pLenti-6/V5-DESTプラスミド（Invitrogen)に挿入した。各インサートcDNAの完全性を、サンガーシークエンシングにより確認した。予測されたサイズの融合産物の発現を、一過性にトランスフェクトした細胞およびウイルス感染させた細胞のウェスタンブロット解析により確認した（図３）。
＜サンプル＞
　IMA患者は、1998年から2013年までに国立がん研究センター中央病院（東京、日本）で外科的処置を受けた全てのLADC症例のおよそ2%を構成した。切除された組織は、10%ホルマリンで固定され、パラフィンに包埋されていた。4μmの連続切片をアルシアンブルー－過ヨウ素酸シッフ法を使用してヘマトキシリンおよびエオシンで染色し、細胞質のムチン産生を可視化した。トータルRNAは、大まかに切り、急速凍結した（snap-frozen）組織サンプルから、TRIzol（Invitrogen、Carlsbad、CA、USA）を使用して抽出し、その品質を2100 Bioanalyzer（Agilent Technologies、Santa Clara、CA、USA）を使用して調べた。全てのサンプルは、>6.0のRNAインテグリティーナンバー（RNA Integrity Numbers（RINs））を有していた。ゲノムDNAも、組織サンプルから、QIAamp DNA Mini kit（Qiagen、Valencia、CA、USA）を使用して抽出した。EGFR、KRAS、BRAF、およびHER2遺伝子におけるホットスポット変異を高解像度融解（HRM）法によって調べ、EML4-またはKIF5B-ALK、KIF5B-またはCCDC6-RET、およびCD74-、EZR-、またはSLC34A2-ROS1融合をRT-PCRによって調べた。詳細な方法は、以前に記載されている（Kohno T, et al. Nat Med. 2012, 18, 375-7; Yoshida A, et al. Am J Surg Pathol. 2013, 37, 554-62; Kinno T, et al. Ann Oncol. 2014, 25, 138-42）。
＜RT-PCRおよびサンガーシークエンシング＞
　トータルRNA（500 ng）を、Superscript III Reverse Transcriptase（Invitrogen）を使用してcDNAに逆転写した。cDNA（10 ngのトータルRNAに相当する）または10 ngのゲノムDNAを、KAPA Taq DNA Polymerase（KAPA Biosystems、Woburn、MA、USA）を使用するPCR増幅に供した。以下の条件下で、サーマルサイクラー内で反応を行った：95℃30秒間、60℃30秒間、および72℃2秒間を40サイクル、72℃10分間の最終伸長。グリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）をコードする遺伝子を増幅し、cDNA合成の効率を推定した。PCR産物を、BigDye Terminator kitを使用して、ABI 3130xl DNA Sequencer（Applied Biosystems、Foster City、CA、USA）上で、両方向で直接配列決定した。ここで使用したプライマーを表１に示す。
＜細胞株および試薬＞
　NIH3T3細胞は、沖縄科学技術大学院大学（沖縄、日本）の山本雅博士から提供された。NCI-H1299細胞は、UT Southwestern Medical CenterのDr. J. D. Minnaから提供された。EFM19および293FT細胞は、それぞれDSMZ（Braunschweig、Germany）およびInvitrogenから入手した。H1299およびEFM-19は、10% FBSを含むRPMI培地中で培養し、NIH3T3および293FTは、10% FBSを含むDMEM培地中で培養した。
　ラパチニブ、アファチニブ、およびソラフェニブは、Selleck（Houston、TX、USA）から購入した。U0126は、Calbiochem（San Diego、CA、USA）から購入した。
　ERBB4に対する一次抗体（カタログ番号2218-1）およびERBB2に対する一次抗体(カタログ番号2064-1）は、Epitomics（Burlingame、CA、USA）から購入した。BRAFに対する抗体（カタログ番号sc-166）およびERBB3に対する抗体（カタログ番号sc-285）は、Santa Cruz Biotechnology（Dallas、TX、USA）から購入した。NRG1のEGF様ドメイン（Wilson TR, et al. Cancer Cell. 2011, 20, 158-72）に対する抗体（カタログ番号RB-276）は、Thermo Scientific（Fremont、CA、USA）から購入した。phospho-ERBB4 pTyr1284に対する抗体（カタログ番号4757）、phospho-ERBB3 pTyr1289に対する抗体（カタログ番号4791）、phospho-ERBB2 pTyr1248に対する抗体（カタログ番号2247）、AKTに対する抗体（カタログ番号4691）、phospho-AKT pSer473に対する抗体（カタログ番号4060）、トータルERK1/2に対する抗体（カタログ番号4695）、phospho-ERK1/2 pThr202/Tyr204に対する抗体（カタログ番号4370）、およびβ-アクチンに対する抗体（カタログ番号3700）は、Cell Signaling Technology（Danvers、MA、USA）から購入した。
＜免疫組織化学＞
　免疫組織化学を、組織マイクロアレイ切片について実施した。4μmの厚さの切片を脱パラフィンし、BRAFおよびNRGについては標的賦活化溶液9（Dako、Carpinteria、CA、USA）を使用して、ERBB4についてはクエン酸バッファーを使用して、熱誘導エピトープ賦活化（heat-induced epitope retrieval）を実施した。スライドを3%過酸化水素で20分間処理して、内因性のペルオキシダーゼ活性を阻害し、その後、脱イオン水で2～3分間洗浄した。次いでスライドを、BRAFに対する一次抗体（1:800、ポリクローナル、Sigma、St. Louis、Mo、USA）、NRG1に対する一次抗体（1:500、ポリクローナル、Thermo Scientific）、またはERBB4に対する一次抗体（1:100、clone E200；Abcam、Cambridge、UK）と、室温にて1時間インキュベートした。EnVision-FLEXおよびLINKER（Dako）システムを使用して免疫反応を検出した。反応を3,3'-ジアミノベンジジンで可視化し、その後、ヘマトキシリンで対比染色した。腫瘍細胞の>10%での細胞質の染色を、BRAFおよびNRG1について陽性であるとし、膜染色をERBB4について陽性であるとした。
＜蛍光in situハイブリダイゼーション＞
　NRG1再構成を同定するために、NRG1用のbreak-apartプローブ（Chromosome Science Labo、札幌、日本；3'セントロメア側プローブとして、Spectrum Orangeで標識した、RP11-1002K11 + RP11-35D16、および5'テロメア側プローブとして、Spectrum Greenで標識した、RP11-23A12 + RP11-715M18）を使用して、ホルマリン固定し、パラフィン包埋した腫瘍について、蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）を実施した。
＜CD74-NRG1、EZR-ERBB4およびTRIM24-BRAF融合タンパク質の発現用のレンチウイルスベクターの構築＞
　KOD-PLUS Taqポリメラーゼ（Toyobo、大阪、日本）を使用して、各インデックス腫瘍サンプルからのcDNAをPCR増幅することにより、全長のCD74-NRG1、EZR-ERBB4、およびTRIM24-BRAF cDNAを得た。PCR産物を制限酵素で消化し、pLenti-6/V5-DESTプラスミド（Invitrogen）にライゲーションした。各インサートcDNAの完全性を、サンガーシークエンシングにより確認した。各発現プラスミドを、ViraPower packaging mix（Invitrogen）と共に、Lipofectamine 2000試薬（Invitrogen）を使用して293FT細胞にトランスフェクトすることにより、CD74-NRG1、EZR-ERBB4、またはTRIM24-BRAFを発現するレンチウイルスを作製した。
　一過性発現のために、空プラスミド、またはCD74-NRG1、TRIM24-BRAFもしくはEZR-ERBB4 cDNAを発現するプラスミドを、Lipofectamine 2000試薬を使用して、80%コンフルエンスのNCI-H1299肺がん細胞にトランスフェクトした。補充したRPMI培地中で24時間インキュベーションした後、細胞をアッセイに使用した。
　安定発現のために、60～70%コンフルエンスのNIH3T3線維芽細胞を空のレンチウイルス、またはCD74-NRG1、EZR-ERBB4、もしくはTRIM24-BRAFを発現するレンチウイルスで感染させ、次いで、ブラストサイジン（4μg/ml）で2週間処理した。大量培養したブラストサイジン耐性細胞をアッセイに使用した。
＜CD74-NRG1によるHER2:HER3シグナル伝達活性化＞
　CD74-NRG1 cDNAを発現する細胞がHER2:HER3細胞内シグナル伝達を活性化するNRG1リガンドを分泌するか否かを決定するために、以前に記載されているように（Wilson TR, et al. Cancer Cell. 2011, 20, 158-72）、ERRB2/HER2およびERBB3/HER3タンパク質の両方を発現するEFM-19乳がん細胞をレポーター細胞として使用した。CD74-NRG1発現プラスミドまたは空の（対照）プラスミドで一過性にトランスフェクトしたNCI-H1299細胞をPBSで2回洗浄し、無血清培地中でのインキュベーションにより一晩血清飢餓にした。培地を回収し、4℃にて5分間遠心して、細胞片を除去した。サブコンフルエントのEMF-19細胞を、DMSO（ビヒクル対照）またはHER-TKIを補充したこれらの馴化培地と30分間インキュベートした。次いで、全細胞ライセートをSDS-PAGEおよびイムノブロッティングに供した。
＜ERBB4およびBRAFキナーゼの構成的活性化およびチロシンキナーゼ阻害剤によるその阻害＞
　EZR-ERBB4もしくはTRIM24-BRAF cDNAsを発現するプラスミドまたは空のプラスミドで安定的に形質導入したNIH3T3細胞を、無血清培地中で一晩維持し、次いで、DMSO（Sigma）または示された阻害剤（DMSOに溶解させた）で2時間処理した。全細胞ライセートをイムノブロット解析に供した。
＜イムノブロッティング＞
　Complete Protease and PhosSTOP Phosphatase Inhibitor Cocktail（Roche、Mannheim、Germany）を含有するRIPAバッファー中で細胞を溶解させた。タンパク質をSDS-PAGEに供し、その後、ポリビニリデンジフルオライド膜上にイムノブロットした。膜を0.1% Tween 20および1.0% BSAを含有するTBSで1時間ブロッキングし、次いで、一次抗体で調べた。0.1% Tween 20を含有するTBSで洗浄した後、膜を西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗マウスまたは抗ウサギ二次抗体とインキュベートし、次いで、エンハンスドケミルミネッセンス試薬（Perkin Elmer、Waltham、MA、USA）で可視化した。LAS3000イメージングシステム（Quansys Biosciences,
West Logan、UT、USA）を使用して、シグナルの強度を算出した。
＜ソフトアガーアッセイ＞
　空のレンチウイルス、またはCD74-NRG1、EZR-ERBB4、もしくはTRIM24-BRAFレンチウイルスで感染させたNIH3T3細胞を、0.6%アガロースの基層上の0.3% SeaPlaqueアガロース（Lonza、Rockland、ME、USA）の上層に、24ウェルプレート中4,000細胞/ウェルで、三連で播種した。DMSOまたはチロシンキナーゼ阻害剤を含有する培地をトップアガーに加え、また0.3%アガロース層の上に加えた。カバー培地は週2回交換した。14日後に、直径が100μmよりも大きいコロニーを数えた。
＜ヌードマウスにおける腫瘍形成能アッセイ＞
　空ベクターまたはEZR-ERBB4もしくはTRIM24-BRAF融合タンパク質を発現するベクターを有する安定なNIH3T3細胞（5 × 106）を、50% マトリゲル（BD Biosciences、Bedford、MA、USA）を含むPBS中に再懸濁した。細胞を、6週齢の雌のnu/nuマウスの右側腹部に皮下注入した。腫瘍のサイズがおよそ2 cm × 2 cmに達するまで、腫瘍のサイズを週2回測定した。21日目に写真を撮影した。マウスに関する全ての研究は、国立がん研究センターの動物実験に関する倫理委員会によって承認された。
結果と考察
　KRAS変異を有する56例（62%）およびKRAS変異を有さない34例（38%）からなる90例の浸潤性粘液性腺がん（invasive mucinous adenocaricinoma（IMA））コホートを準備した。KRAS陰性の34例は、2例のBRAF変異、1例のEGFR変異、および1例EML4-ALK融合を含んでいた。残りの30例は、LADCにおける代表的なドライバー変異に関して全陰性（pan-negative）であった。
　27例の全陰性例および5例のKRAS変異陽性例を含む、32例のIMAを、RNAシークエンシングに供した（表３）。RNAシークエンシングによって得られた>2 x 107ペアエンドリードを解析し、続いてRT-PCR産物のサンガーシークエンシングによる確認を行った結果、前記4つの新規遺伝子融合転写産物（CD74-NRG1、EZR-ERBB4、TRIM24-BRAF、およびKIAA1468-RET）に加えて、もう1つの新規遺伝子融合転写産物（SLC3A2-NRG1）を見出した。これらは、全陰性のIMAのみにおいて検出された（図１、および４～６、ならびに表１および４）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　RNAシークエンシングに供さなかった残りの58例のIMAについてこれらの遺伝子融合のRT-PCRスクリーニングを行い、更に1例の全陰性例がCD74-NRG1融合を有することを明らかにした。すなわち、CD74-NRG1融合は、KRAS変異陰性IMAの34例中5例（14.7%）で検出されており、最も頻度が高かった。NRG1のCD74またはSLC3A2との融合は、34例中6例（17.6%）に存在した。5つの新規遺伝子融合は、相互排他的であり、KRAS変異陽性例においては存在しなかった（表５）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
（実施例５）
　CD74-NRG1、SLC3A2-NRG1、EZR-ERBB4、およびTRIM24-BRAFの4つの新規融合遺伝子は、タンパク質キナーゼまたは受容体タンパク質キナーゼのリガンド（NRG1/ニューレグリン/へレグリン）をコードする遺伝子の再構成を含んでおり、当該遺伝子については、肺癌においてがん化をもたらす再構成はこれまで報告されていなかった（図７）。残りの融合遺伝子は、RETがん遺伝子に関わる新規のタイプであった；RETの融合は、LADCの1～2％に見られる（Drilon A, et al. Cancer Discov. 2013, 3, 630-5; Takeuchi K, et al. Nat Med. 2012, 18, 378-81; Lipson D, et al. Nat Med. 2012, 18, 382-4; Kohno T, et al. Nat Med. 2012, 18, 375-7; Kohno T, et al. Cancer Sci. 2013, 104, 1396-400）。日本人患者からのIMAの特徴を有さない315例のLADCおよびアメリカ人患者からの144例の連続するLADCのスクリーニングにおいて、全ての腫瘍は、NRG1、BRAFおよびERBB4融合、ならびに新規RET融合の全てについて陰性であった。したがって、これらの融合は、IMAの特徴を有するLADCに特異的なドライバー変異であると考えられる。CD74-NRG1、SLC3A2-NRG1、EZR-ERBB4、およびKIAA1468-RETの4つの遺伝子融合は、染色体間転座によって引き起こされた可能性が高く、TRIM24-BRAF遺伝子融合は、動原体を挟まない（paracentric）逆位によって引き起こされた可能性が高い（表４および図７）。このことと一致して、CD74-NRG1融合陽性腫瘍の蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）解析で、融合陽性腫瘍におけるNRG1の転座部位に隣接する2つのプローブによって生成されたシグナルの分離が観察された（図８）。また、融合タンパク質に保持されているポリペプチドを認識する抗体を用いた免疫組織化学解析によって、NRG1、ERBB4、およびBRAF融合を有する腫瘍細胞において、対応するタンパク質が過剰発現していることも確認した；NRG1、ERBB4、およびBRAFタンパク質の発現は、いくつかの融合陰性例においても観察された（図９）。遺伝子融合を有するIMAは、男性患者および女性患者の両方から得られたが、NRG1融合陽性例は、女性の非喫煙者から優先的に得られた（表４）。
　CD74-NRG1およびSLC3A2-NRG1融合タンパク質（その配列は、RNAシークエンシングデータから推測した）は、CD74またはSLC3A2の膜貫通ドメインを含み、かつNRG1タンパク質（NRG1 III-β3フォーム）の上皮増殖因子（EGF）様ドメインを保持していた（図１および４）。NRG1 III-β3タンパク質は、細胞質側のN末端領域および膜に係留されたEGF様ドメインを有し、HER2:HER3受容体を介して伝達されるジャクスタクラインシグナルを仲介する（Falls DL. Exp Cell Res. 2003, 284, 14-30）。CD74またはSLC3A2の一部が野生型NRG1 III-β3の膜貫通ドメインを置き換えたことから、膜に係留されたEGF様ドメインがHER2:HER3受容体を介して伝達されるジャクスタクラインシグナルを活性化すると推測された。また、NRG1タイプIIIタンパク質について最近示唆されたように（Fleck D, et al. J Neurosci. 2013, 33, 7856-69; Dislich B and Lichtenthaler SF. Front Physiol. 2012, 3, 8）、これらの融合タンパク質の発現が、NRG1に由来する部位（EGFドメインのN末端側に位置する）における切断により、可溶性NRG1タンパク質の産生をもたらした可能性もある。外因性CD74-NRG1融合タンパク質を発現するH1299ヒト肺がん細胞からの馴化培地にEFM-19細胞をさらすことにより、内因性ERBB2/HER2およびERBB3/HER3タンパク質のリン酸化がもたらされたが、このことはCD74-NRG1ポリペプチドから生成され分泌されたNRG1リガンドによって自己分泌HER2:HER3シグナル伝達が活性化されたことを示唆する（図１０Ａ）。HER2:HER3の下流のメディエーターであるERKおよびAKTのリン酸化も増加した。HER2、HER3、およびERKのリン酸化は、HERキナーゼを標的とする、FDAに承認されたTKIであるラパチニブおよびアファチニブ（Majem M and Pallares C. Clin Transl Oncol. 2013, 15, 343-57; Perez EA and Spano JP. Cancer. 2012, 118, 3014-25; Nelson V, et al. Onco Targets Ther. 2013, 6, 135-43）によって抑制された。総合すると、これらの観察結果は、NRG1融合が、ジャクスタクラインおよび／または自己分泌のメカニズムによって、HER2:HER3シグナル伝達を活性化したことを示す。
　EZR-ERBB4融合タンパク質は、タンパク質二量体化において機能するEZRコイルドコイルドメインを含み、また全長のERBB4キナーゼドメインも保持していた（図１）。これらの特徴は、EZR-ROS1融合（Takeuchi K, et al. Nat Med. 2012, 18, 378-81）の場合と同様に、EZR-ERBB4タンパク質が、EZRのコイルドコイルドメインを介してホモ二量体を形成し、ERBB4のキナーゼ機能の異常な活性化を引き起こす可能性が高いことを示す。実際、EZR-ERBB4 cDNAをNIH3T3線維芽細胞において外因性に発現させた場合、ERBB4キナーゼ部位の活性化ループに位置するチロシン1258が血清刺激無しでリン酸化され、このことはEZRとの融合がERBB4キナーゼを異常に活性化させたことを示す（図１０Ｂ）。これと一致して、下流のメディエーターであるERKのリン酸化も増加した。ERBB4およびERKのリン酸化は、ERBB4タンパク質を阻害するラパチニブおよびアファチニブ（Majem M and Pallares C. Clin Transl Oncol. 2013, 15, 343-57; Perez EA and Spano JP. Cancer. 2012, 118, 3014-25; Nelson V, et al. Onco Targets Ther. 2013, 6, 135-43）によって抑制された。
　TRIM24-BRAF融合タンパク質は、BRAFキナーゼドメインを保持していたが、BRAFキナーゼの負の制御を担うN末端のRAS結合ドメインを欠いていた。これらの特徴は、他のがんにおけるESRP1-BRAFおよびAGTRAP-BRAF融合の場合（Palanisamy N, et al. Nat Med. 2010, 16, 793-8）と同様に、当該融合タンパク質が構成的に活性化していることを示唆する。TRIM24-BRAF cDNAをNIH3T3細胞において外因性に発現させた場合、BRAFの下流のメディエーターであるERKが血清刺激無しでリン酸化され、このことはTRIM24との融合がBRAFキナーゼを異常に活性化させたことを示す（図１０Ｃ）。ERKのリン酸化は、RAFキナーゼ阻害剤として通常認定されているFDAに承認された薬物であるソラフェニブ（Wilhelm SM, et al. Mol Cancer Ther. 2008, 7, 3129-40）、およびMEK阻害剤U0126によって抑制された（図１０Ｃ）。
　融合遺伝子のcDNAの外因性発現は、NIH3T3線維芽細胞の足場非依存的な増殖を誘導し、このことは当該融合遺伝子の形質転換活性を示す（図１０Ｄ－Ｆ）。この増殖は、上述の、融合によって誘導されたシグナル伝達の活性化を抑制したキナーゼ阻害剤によって抑制された。EZR-ERBB4またはTRIM24-BRAF融合のcDNAを発現するNIH3T3細胞は、ヌードマウスにおいて腫瘍を形成した（図１１）。したがって、これらの3つの融合遺伝子は、IMA発症においてドライバー変異として機能すると結論された。200種類の一般的に使用されているヒト肺がん細胞株をスクリーニングしたが、これら3つの融合遺伝子についてはいずれも陰性であった（データは示さない）。
　ここに示した結果は、NRG1、ERBB4およびBRAF融合が、肺におけるIMAの発症に関与する新規のドライバー変異であり（図１２）、既存のTKIの標的となる可能性があることを示唆する。NRG1は、ヒト気管支上皮細胞の初代培養において杯細胞形成のレギュレーターとして以前に同定されたことから（Kettle R, et al. Am J Respir Cell Mol Biol. 2010, 42, 472-81）、NRG1融合が多いことは特に注目すべき点である；したがって、NRG1によって仲介されるシグナル伝達経路は、細胞形質転換および杯細胞形態の獲得の両方に寄与することにより、IMA発症において役割を果たしている可能性がある。新薬の開発につながるようなごく一部の公知の異常（ALK融合およびEGFR変異）に加えて、10%を超えるIMA（11/90; 12.2%）は、既存のキナーゼ阻害剤によって標的とされる、新薬の開発につながるようなその他の異常を有していた：これらの異常は、NRG1、ERBB4、BRAFもしくはRETが関与する融合、またはBRAF変異によって代表される（表５および図１２）。したがって、ここで同定された遺伝子融合は、IMAの治療において有望な標的であるとともに、IMAの診断におけるマーカーとしても有用である。
　本発明によれば、がんの責任変異として新たに見出した遺伝子融合を検出すること、当該遺伝子融合により生じる融合ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの発現および／または活性を抑制する物質が治療効果をもたらすがんの患者またはがんのリスクを有する被験者を同定すること、さらにはそのようながんの患者に適した治療を行うことが可能となる。
配列番号１：EZR-ERBB4融合ポリヌクレオチド
配列番号2：EZR-ERBB4融合ポリペプチド
配列番号3：KIAA1468-RET融合ポリヌクレオチド
配列番号4：KIAA1468-RET融合ポリペプチド
配列番号5：TRIM24-BRAF融合ポリヌクレオチド
配列番号6：TRIM24-BRAF融合ポリペプチド
配列番号7：CD74-NRG1融合ポリヌクレオチド（バリアント1）
配列番号8：CD74-NRG1融合ポリペプチド（バリアント1）
配列番号9：CD74-NRG1融合ポリヌクレオチド（バリアント２）
配列番号10：CD74-NRG1融合ポリペプチド（バリアント２）
配列番号11～18：プライマー配列
配列番号19：EZR cDNA
配列番号20：EZRポリペプチド
配列番号21：ERBB4 cDNA
配列番号22：ERBB4ポリペプチド
配列番号23：KIAA1468 cDNA
配列番号24：KIAA1468ポリペプチド
配列番号25：RET cDNA
配列番号26：RETポリペプチド
配列番号27：TRIM24 cDNA
配列番号28：TRIM24ポリペプチド
配列番号29：BRAF cDNA
配列番号30：BRAFポリペプチド
配列番号31：CD74 cDNA
配列番号32：CD74ポリペプチド
配列番号33：NRG1 cDNA
配列番号34：NRG1ポリペプチド
配列番号35：SLC3A2-NRG1融合ポリヌクレオチド
配列番号36：SLC3A2-NRG1融合ポリペプチド
配列番号37：プライマー配列
配列番号38：SLC3A2 cDNA
配列番号39：SLC3A2ポリペプチド

Claims (14)

  1. 　がんの責任変異（ドライバー変異）である遺伝子融合の検出方法であって、がんを有する被験者由来の単離された試料における下記（a）～（e）のいずれかの融合ポリヌクレオチドまたはそれによりコードされるポリペプチドを検出する工程を含む、方法：
    （a）EZR-ERBB4融合ポリヌクレオチドであって、EZRのコイルドコイルドメインの全部または一部及びERBB4のキナーゼドメインを含みかつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
    （b）KIAA1468-RET融合ポリヌクレオチドであって、KIAA1468のコイルドコイルドメインの全部または一部及びRETのキナーゼドメインを含みかつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
    （c）TRIM24-BRAF融合ポリヌクレオチドであって、BRAFのキナーゼドメインを含みかつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
    （d）CD74-NRG1融合ポリヌクレオチドであって、CD74の膜貫通ドメイン及びNRG1のEGFドメインを含みかつ細胞内情報伝達を亢進する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；ならびに
    （e）SLC3A2-NRG1融合ポリヌクレオチドであって、SLC3A2の膜貫通ドメイン及びNRG1のEGFドメインを含みかつ細胞内情報伝達を亢進する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
  2. 　融合ポリヌクレオチドが下記（a）～（e）のいずれかである、請求項１に記載の方法：
    （a）下記のポリペプチドをコードするEZR-ERBB4融合ポリヌクレオチド：
    （i）配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
    （ii）配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドにおいて、1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつキナーゼ活性を有するポリペプチド、または
    （iii）配列番号2で表されるアミノ酸配列と80％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつキナーゼ活性を有するポリペプチド；
    （b）下記のポリペプチドをコードするKIAA1468-RET融合ポリヌクレオチド：
    （i）配列番号4で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
    （ii）配列番号4で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドにおいて、1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつキナーゼ活性を有するポリペプチド、または
    （iii）配列番号4で表されるアミノ酸配列と80％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつキナーゼ活性を有するポリペプチド；
    （c）下記のポリペプチドをコードするTRIM24-BRAF融合ポリヌクレオチド：
    （i）配列番号6で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
    （ii）配列番号6で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドにおいて、1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつキナーゼ活性を有するポリペプチド、または
    （iii）配列番号6で表されるアミノ酸配列と80％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつキナーゼ活性を有するポリペプチド；
    （d）下記のポリペプチドをコードするCD74-NRG1融合ポリヌクレオチド：
    （i）配列番号8または10で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
    （ii）配列番号8または10で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドにおいて、1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、細胞内情報伝達を亢進する活性を有するポリペプチド、または
    （iii）配列番号8または10で表されるアミノ酸配列と80％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、細胞内情報伝達を亢進する活性を有するポリペプチド；および
    （e）下記のポリペプチドをコードする、SLC3A2-NRG1融合ポリヌクレオチド：
    （i）配列番号36で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
    （ii）配列番号36で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドにおいて、1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、細胞内情報伝達を亢進する活性を有するポリペプチド、または
    （iii）配列番号36で表されるアミノ酸配列と80％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、細胞内情報伝達を亢進する活性を有するポリペプチド。
  3. 　融合ポリヌクレオチドが下記（a）～（e）のいずれかである、請求項１または２に記載の方法：
    （a）（i）配列番号1で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、
    （ii）配列番号1で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
    （iii）配列番号1で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて、1若しくは複数のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または
    （iv）配列番号1で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと80％以上の配列同一性を有し、かつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
    （b）（i）配列番号3で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、
    （ii）配列番号3で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
    （iii）配列番号3で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて、1若しくは複数のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または
    （iv）配列番号3で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと80％以上の配列同一性を有し、かつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
    （c）（i）配列番号5で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、
    （ii）配列番号5で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
    （iii）配列番号5で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて、1若しくは複数のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または
    （iv）配列番号5で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと80％以上の配列同一性を有し、かつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
    （d）（i）配列番号7または9で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、
    （ii）配列番号7または9で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ細胞内情報伝達を亢進する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
    （iii）配列番号7または9で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて、1若しくは複数のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつ細胞内情報伝達を亢進する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または
    （iv）配列番号7または9で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと80％以上の配列同一性を有し、かつ細胞内情報伝達を亢進する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；および
    （e）（i）配列番号35で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、
    （ii）配列番号35で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ細胞内情報伝達を亢進する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
    （iii）配列番号35で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて、1若しくは複数のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつ細胞内情報伝達を亢進する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または
    （iv）配列番号35で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと80％以上の配列同一性を有し、かつ細胞内情報伝達を亢進する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
  4. 　がんが肺がんである、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 　がんの責任変異（ドライバー変異）である遺伝子融合により生じる融合ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの発現および／または活性を抑制する物質が治療効果をもたらすがんの患者またはがんのリスクを有する被験者を同定する方法であって、下記の工程を含む、方法：
    （1）被験者由来の単離された試料における下記（a）～（e）のいずれかの融合ポリヌクレオチドまたはそれによりコードされるポリペプチドを検出する工程：
    （a）EZR-ERBB4融合ポリヌクレオチドであって、EZRのコイルドコイルドメインの全部または一部及びERBB4のキナーゼドメインを含みかつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
    （b）KIAA1468-RET融合ポリヌクレオチドであって、KIAA1468のコイルドコイルドメインの全部または一部及びRETのキナーゼドメインを含みかつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
    （c）TRIM24-BRAF融合ポリヌクレオチドであって、BRAFのキナーゼドメインを含みかつキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
    （d）CD74-NRG1融合ポリヌクレオチドであって、CD74の膜貫通ドメイン及びNRG1のEGFドメインを含みかつ細胞内情報伝達を亢進する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ならびに
    （e）SLC3A2-NRG1融合ポリヌクレオチドであって、SLC3A2の膜貫通ドメイン及びNRG1のEGFドメインを含みかつ細胞内情報伝達を亢進する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；ならびに
    （2）前記融合ポリヌクレオチドまたはそれによりコードされるポリペプチドが検出された場合に、前記ポリペプチドの発現および／または活性を抑制する物質が前記被験者において治療効果をもたらすと判定する工程。
  6. 　がんの責任変異（ドライバー変異）である遺伝子融合の検出用キットであって、下記（A）～（C）のいずれかまたはそれらの組合せを含む、キット：
    （A）EZR-ERBB4融合ポリヌクレオチド、KIAA1468-RET融合ポリヌクレオチド、TRIM24-BRAF融合ポリヌクレオチド、CD74-NRG1融合ポリヌクレオチド、またはSLC3A2-NRG1融合ポリヌクレオチドを特異的に認識するように設計されたプローブであるポリヌクレオチド；
    （B）EZR-ERBB4融合ポリヌクレオチド、KIAA1468-RET融合ポリヌクレオチド、TRIM24-BRAF融合ポリヌクレオチド、CD74-NRG1融合ポリヌクレオチド、またはSLC3A2-NRG1融合ポリヌクレオチドを特異的に増幅できるように設計された一対のプライマーであるポリヌクレオチド；あるいは
    （C）EZR-ERBB4融合ポリペプチド、KIAA1468-RET融合ポリペプチド、TRIM24-BRAF融合ポリペプチド、CD74-NRG1融合ポリペプチド、またはSLC3A2-NRG1融合ポリペプチドを特異的に認識する抗体。
  7. 　EZRタンパク質のコイルドコイルドメインの全部または一部及びERBB4タンパク質のキナーゼドメインを含みかつキナーゼ活性を有する、単離されたEZR-ERBB4融合ポリペプチドまたはその断片。
  8. 　KIAA1468タンパク質のコイルドコイルドメインの全部または一部及びRETタンパク質のキナーゼドメインを含みかつキナーゼ活性を有する、単離されたKIAA1468-RET融合ポリペプチドまたはその断片。
  9. 　BRAFタンパク質のキナーゼドメインを含みかつキナーゼ活性を有する、単離されたTRIM24-BRAF融合ポリペプチドまたはその断片。
  10. 　CD74タンパク質の膜貫通ドメイン及びNRG1タンパク質のEGFドメインを含みかつ細胞内情報伝達を亢進する活性を有する、単離されたCD74-NRG1融合ポリペプチドまたはその断片。
  11. 　SLC3A2タンパク質の膜貫通ドメイン及びNRG1タンパク質のEGFドメインを含みかつ細胞内情報伝達を亢進する活性を有する、単離されたSLC3A2-NRG1融合ポリペプチドまたはその断片。
  12. 　請求項７～１１のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドまたはその断片をコードするポリヌクレオチド。
  13. 　がんの治療方法であって、請求項５に記載の方法によりがんの責任変異（ドライバー変異）である遺伝子融合により生じる融合ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの発現および／または活性を抑制する物質が治療効果をもたらすと判定された被験者に、前記融合ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの発現および／または活性を抑制する物質を投与する工程を含む、方法。
  14. 　がん治療剤のスクリーニング方法であって、下記の工程を含む、方法：
    （1）請求項７～１１のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドを発現している細胞に被験物質を接触させる工程；
    （2）前記融合ポリペプチドの発現および／または活性が抑制されるか否かを決定する工程；ならびに
    （3）前記融合ポリペプチドの発現および／または活性を抑制すると決定された物質をがん治療剤として選択する工程。
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