JP3964678B2 - 36p6d5:分泌腫瘍抗原 - Google Patents
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- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Description
本出願は、1999年10月28日に出願された、米国特許仮出願番号第60/162,417号(その全体の内容が本明細書中で参考として援用される)の特典を主張する。
【0002】
(発明の分野)
本明細書中に記載される発明は、36P6D5と呼ばれる遺伝子およびそのコードされる腫瘍抗原、ならびに診断および治療方法、ならびに36P6D5遺伝子産物を発現する種々の癌の管理において有用である組成物に関する。
【0003】
(発明の背景)
癌は、冠状動脈の疾患に次ぐ、ヒトの第2の死亡原因である。世界中で、数百万のヒトが、毎年癌で死亡している。米国のみで、癌は、毎年50万をゆうに越えるヒトの死亡原因であり、140万人が毎年新たに診断されている。心臓疾患による死亡は有意に減少しているが、一般的には癌による死亡は増大している。21世紀の始めには、癌は第1の死亡原因になると予想される。
【0004】
世界中で、いくつかの癌は、主だった死亡原因として突出している。特に、肺、前立腺、乳房、結腸、膵臓、および卵巣の癌腫は、癌による死亡の主な原因を示す。これらおよび実質的に全ての他の癌腫は、共通する致死的な特徴を共有する。ごくわずかな例外をともなうが、癌腫による転移性の疾患は致命的である。さらに、当初は生存している初期の癌腫を有するこのような癌の患者についてもなお、共通する実験は、彼らの生存性が劇的に変更されることを示した。多くの癌患者は、再発の可能性または処置の失敗の自覚による強烈な不安を経験する。多くの癌患者は、処置後の身体の衰弱を経験する。多くの癌患者は、再発を経験する。
【0005】
一般的に言って、最も致命的な癌の管理における基本的な問題は、有効かつ非毒性の全身治療の欠如である。分子的医薬(その初期において、なおも非常に多い)は、これらの癌が管理される様式を、再定義することを約束する。疑いなく、癌診断および処置に対する新規な分子論的アプローチの発展を目標とする集中的な世界中での努力が存在する。例えば、真に腫瘍特異的な遺伝子およびタンパク質を同定することに大きな興味があり、これらの遺伝子およびタンパク質は、診断マーカーおよび予後マーカーならびに/または治療標的または薬剤として使用され得る。これらの領域における研究努力が推奨され、そして有用な分子的技術の利用可能性の増加が、癌に関する重要な知識の獲得を加速している。それにも関わらず、進行は、遅く、そして一般的に一様ではない。
【0006】
以下に記載されるように、前立腺癌の管理は、分子生物学が臨床における真の進行に翻訳する制限された程度の良好な例として機能する。制限された例外とももに、この状況は、上記の他の主要な癌と多少は同じである。
【0007】
世界中で、前立腺癌は、男性における4番目の最も一般的な癌である。北アメリカおよび北ヨーロッパでは、これは、最も一般的な男性の癌であり、そして男性の癌による死亡の第2の原因である。米国のみで、40,000人をゆうに超える男性が、唯一肺癌に次いで、毎年この疾患によって死亡する。これらの数の程度にもかかわらず、転移性の前立腺癌についての有効な処置はなお存在していない。外科手術による前立腺切除、放射線治療、ホルモン切除治療、および化学療法が、主な処置の形態でありつづけている。残念なことに、これらの処置は多くについては不十分であり、そしてしばしば、所望されない結果を付随する。
【0008】
診断の最前線においては、初期段階の局在化した腫瘍を正確に検出し得る前立腺の腫瘍マーカーが存在していないことが、この疾患の管理における有意な限界を残している。血清のPSAアッセイが非常に有用なツールであるが、その特異性および一般的な有用性は、以下にさらに議論されるように、いくつかの重要な局面を欠いていると広範に認識されている。ほとんどの前立腺癌は、最初に、尿道から離れた、前立腺の末梢領域に発生する。この領域内の腫瘍は、いずれの症状も起こさず、その結果、ほとんどの男性が、有意な進行が起こるまで、疾患の臨床的症状を提示しない。前立腺の転移領域への腫瘍の進行は、尿道の閉塞に導き得、従って、症状の最初の症状が生じる。しかし、これらの臨床的症状は、良性前立腺肥大(BPH)の一般的な非悪性状態と区別することができない。前立腺癌の早期の検出および診断は、現在のところ、指での直腸試験(DRE)、前立腺特異的抗原(PSA)測定、直腸横断(transrectal)超音波検査(TRUS)、および直腸横断針生検(TRNB)に依存する。現在、DREと組合せた血清PSA測定が、前立腺癌を検出および診断するために使用される主要なツールを提供する。両方は、勢力的な研究を、この疾患のより良好な診断マーカーの発見に注ぐ、この両方は、主要な制限を有する。
【0009】
同様に、前立腺癌の代表的な致命的な転移段階の出現を予測し得る利用可能なマーカーは存在しない。転移段階の診断は、現在、切開手術または腹腔鏡下骨盤リンパ節切除、全身放射性核種スキャン、骨格X線撮影、および/または骨損傷生検分析によって達成される。明らかに、より良好な画像化および他のあまり侵襲的ではない診断方法が、患者に行われる困難なこれらの手順を容易にする可能性、ならびに改善された診断の正確さおよび切開治療の選択枝を提供する。同様な問題は、どの癌が無痛性であるか、およびどの癌が攻撃的であるかを決定するための有効な予後マーカーの欠如である。例えば、PSAは、無痛性癌と攻撃的癌との間を正確には区別できない。信頼がおけるように初期段階の疾患を同定し得、転移に対する感受性を予測し得、そして腫瘍を正確に画像化し得る前立腺腫瘍マーカーが存在するまで、前立腺癌の管理は、極端に困難であり続ける。
【0010】
PSAは、現在、前立腺癌を、スクリーニングし、診断し、そしてモニターするために最も広範に使用される腫瘍マーカーである。特に、血清PSAの検出のためのいくつかの免疫アッセイが、広範に臨床に使用される。近年、血清中のPSA mRNAについての逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)アッセイが、開発された。しかし、PSAは、疾患特異的マーカーではない。なぜなら、PSAのレベルの増加は、BPHおよび前立腺炎を有する患者の大きな割合(25〜86%)で(Gaoら、1997、Prostate 31:264−281)、そして他の非悪性障害において、そしていくらかの正常な男性において検出可能であり、このマーカーの診断特異性を有意に制限する因子であるからである。例えば、4〜10ng/mlの血清PSAの上昇が、BPHにおいて観測され、そしてさらにより高い値が前立腺(特に、急性前立腺炎)において観測される。BPHは、男性において、非常に一般的な状態である。さらに、この状況を混乱させるのは、血清PSAの上昇が、DREからの疾患の任意の指標がなくとも観測され得ること、またはその逆という事実である。さらに、現在、PSAが、前立腺特異的ではないことが認識されている(Gaoら、前出、総説について)。
【0011】
PSAベースの検出の特異性を改善するように設計された種々の方法が記載され、この方法は、例えば、PSA密度および遊離PSA対複合体化PSAの比を測定することである。しかし、これらの方法論のいずれも、悪性前立腺疾患をから良性のものを再現可能なように区別することはできない。さらに、PSA診断剤は、57〜79%の感度を有し(Cupp & Osterling,1993,Mayo Clin Proc 68:297−306)、従って、疾患を有する男性の有意な集団において前立腺癌を同定することを失敗する。
【0012】
前立腺において優位に発現されるいくつかの公知のマーカーが存在し、これは、例えば、前立腺特異的膜抗原(PSM)であり、これはラットニューロペプチドと85%同一であるヒドロラーゼである(Carterら、1996、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:749;Bzdegaら、1997、J.Neurochem.69:2270)。しかし、小腸および脳におけるPSMの発現(Israeliら、1994、Cancer Res.54:1807)、ならびに脳におけるニューロペプチド異化作用における潜在的な役割は、抗PSM治療での潜在的な神経毒性の関与を生じる。再発性の前立腺癌を画像化するための、インジウム−111で標識された抗PSMモノクローナル抗体は、いくつかの可能性を示す(Sodeeら、1996、Clin Nuc Med 21:759−766)。より最近同定された前立腺癌のマーカーとしては、PCTA−1(Suら、1996、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:7252)、および前立腺幹細胞抗原(PSCA)(Reiterら、1998、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:1735)が挙げられる。新規なガレクチン(galectin)であるPCTA−1は、発現細胞の培地に大量に分泌され、そして前立腺癌についての診断血清マーカーとしての可能性を保持し得る(Suら、1996)。GPI連結細胞表面分子であるPSCAが、LAPC−4 cDNAからクローニングされ、そして正常な前立腺細胞の基底細胞において、および癌上皮おいて主に発現されるという点で独特である(Reiterら、1998)。前立腺癌のためのワクチンが、種々の抗原(PSMおよびPSAを含む)を用いて活発に探索されている。
【0013】
PSA、PSM、PCTA、およびPSCAのような以前に同定されたマーカーが前立腺癌の診断および処置についての努力を促進したが、診断および治療をさらに改善するための、前立腺癌および関連する癌についてのさらなるマーカーおよび治療標的の同定が必要とされている。
【0014】
(発明の要旨)
本発明は、36P6D5と呼ばれる、遺伝子およびタンパク質に関する。正常な個体において、36P6D5タンパク質は、膵臓において主に発現され、前立腺および小腸において、より低いレベルの発現が検出される。36P6D5はまた、いくつかのヒト癌異種移植片および前立腺癌、乳癌、卵巣癌および結腸癌由来の細胞系列において、いくつかの場合、高レベルで発現される。正常な発現と比較して、36P6D5の過剰発現は、前立腺癌リンパ節転移由来の前立腺癌異種移植片において最初に観測され、そしてSCIDマウスにおいて、脛骨内的にそして皮下的に継代される。36P6D5の極端に高いレベルの発現が、乳癌細胞系列DU4475(乳腺癌から最初に誘導された細胞系列)において検出された(Langloisら、1979、Cancer Res.39:2604)。この36P6D5遺伝子はまた、膀胱癌、腎臓癌、結腸癌および肺癌由来の腫瘍患者サンプルにおいて、いくつかの場合高レベルで発現される。
【0015】
本明細書中に提供される931bpの全長36P6D5 cDNA(配列番号1)は、2〜19のタンパク質前駆体(Genbank)およびヒト骨芽細胞(Q92520)と有意に相同な235アミノ酸のオープンリーディングフレーム(配列番号2)をコードする。推定235アミノ酸の36P6D5タンパク質はまた、N末端シグナル配列を含み、このことは、36P6D5タンパク質が分泌されることを示す。この36P6D5遺伝子は、従って、分泌された腫瘍抗原をコードし、この抗原は、36D6P5を発現する前立腺癌、乳癌、結腸癌、膵臓癌、および卵巣癌の処置に対する種々のアプローチのための診断マーカー、病期分類マーカーおよび/または予後マーカーとして有用であり得、そして/またはこの種々のアプローチのための標的として機能し得る。36P6D5タンパク質の推定分子量は、約26kDであり、そしてそのpIは、8.97である。
【0016】
発現分析は、いくつかの前立腺および他の癌細胞系列、ならびに前立腺癌の患者のサンプルおよび腫瘍異種移植片における、高レベルの36P6D5発現を立証する。膀胱癌細胞系列、結腸癌細胞系列、腎臓癌細胞系列、乳癌細胞癌系列、肺癌細胞癌系列、卵巣癌細胞系列および前立腺癌細胞系列のような癌細胞において観察される過剰発現と合わせて、正常な成人組織における36P6D5の発現プロフィールは、36P6D5が、少なくともいくつかの癌において異常に発現され、そしてこのような癌に対する有用な診断標的および/または治療標的として機能し得ることの証拠を提供する。
【0017】
本発明は、好ましくは単離された形態の、36P6D5遺伝子の全てまたは一部に対応するか、またはそれらに相補的なポリヌクレオチド、mRNA、および/またはコード配列を提供し、36P6D5タンパク質をコードするポリヌクレオチドおよびそのフラグメント、DNA、DNA/RNAハイブリッド、および36P6D5遺伝子またはmRNA配列またはその部分に相補的な、関連する分子、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド、ならびに36P6D5遺伝子、、mRNA、または36P6D5をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを含む。また、cDNAおよび36P6D5をコードする遺伝子を単離するための手段が提供される。36P6D5ポリヌクレオチドを含む組換えDNA分子、このような分子で形質転換または形質導入された細胞、および36P6D5遺伝子産物の発現のための宿主−ベクター系がまた、提供される。本発明は、さらに、36P6D5タンパク質およびそのポリペプチドフラグメントを提供する。本発明は、さらに、36P6D5タンパク質およびそのポリペプチドフラグメントに結合する抗体を提供し、この抗体には、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体、マウスおよび他の哺乳動物抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体およ完全なヒト抗体、ならびに検出可能なマーカーで標識された抗体を含む。
【0018】
本発明はさらに、種々の生物学的サンプル中の36P6D5ポリヌクレオチドおよびタンパク質の存在および状態を検出するための方法、ならびに36P6D5を発現する細胞を同定する方法を提供する。本発明の代表的な実施形態は、癌のような増殖調節不全のいくつかの形態を有するか、または有する疑いのある組織サンプルにおいて36P6D5をモニターするための方法を提供する。
【0019】
本発明はさらに、前立腺癌のような、36P6D5を発現する癌を処置するための、種々の治療組成物およびストラテジーを提供し、これには、36P6D5の転写、翻訳、プロセシングまたは機能を阻害することを目的とした治療ならびに癌ワクチンが含まれる。
【0020】
(発明の詳細な説明)
他に特に定義されていない限りは、本明細書中で使用される当該分野の全ての用語、記号、および他の科学的な専門用語は、本発明が関係している当業者によって一般的に理解されている意味を有するように意図される。いくつかの場合においては、一般的に理解されている意味を有する用語は、明確さおよび/または容易な参照のために本明細書中で定義され、そして本明細書中でのこのような定義の包含は、当該分野で一般的に理解されている意味を超える実質的な差異を示すようには決して解釈されないはずである。本明細書中に記載されるかまたは参照される技術および手順(例えば、Sambrookら、Molecular Cloning A Lanoratory Manual、第2版、(1989)編、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Herbor、N.Y.に記載されている、広範囲に利用されている分子クローニング方法論)は、一般的に十分に理解されており、そして当業者によって従来の方法論を使用して一般的に使用される。適切である場合には、商業的に入手可能なキットおよび試薬の使用を含む手順が、一般的には、製造業者によって定義されるプロトコールおよび/またはそうでなければ他に記載されているパラメーターに従って行われる。
【0021】
本明細書中で使用される場合は、用語「進行した前立腺癌」、「局所的に進行した前立腺癌」、「進行した疾患」、および「局所的に進行した疾患」は、前立腺の莢膜を通じて拡大した前立腺癌を意味し、そしてAmerican Urological Association(AUA)システムのもとでのステージCの疾患、Whitmore−JewettシステムのもとでのステージC1C2の疾患、およびTNM(腫瘍、節、転移(tumor、node、netastasis))システムのもとでのステージT3〜T4およびN+の疾患を含むように意味される。一般的には、外科手術は、局所的に進行した疾患を有する患者については推奨されず、そしてこれらの患者は、臨床的に局在化した(器官に限定された)前立腺癌を有している患者と比較して、実質的にあまり好ましくない結果を有する。局所的に進行した疾患は、前立腺の側縁を超えるしこり、あるいは前立腺の基部の上部の非対称性またはしこりの明白な証拠によって、臨床的に同定され得る。局所的に進行した前立腺癌は、現在は、腫瘍が前立腺の莢膜に侵入または浸潤するか、外科的な縁に伸びるか、あるいは精子の小包に侵入する場合には、根治的な前立腺切除後に病理学的に診断される。
【0022】
本明細書中で使用される場合は、用語「転移性の前立腺癌」および「転移性の疾患」は、局所的なリンパ節または離れた部位に拡大した前立腺癌を意味し、そしてAUAシステムのもとでのステージDの疾患、およびTNMシステムのもとでのステージT×N×M+を含むように意味される。局所的に進行した前立腺癌の症例における場合には、外科手術は、一般的には、転移性の疾患を有している患者については意図されず、そしてホルモン(アンドロゲンの切除)治療が、好ましい処置態様である。転移性の前立腺癌を有している患者は、最終的には、処置の開始の12〜18ヶ月以内のアンドロゲン治療不応性状態を発症し、そしてこれらの患者のほぼ半分がその後6ヶ月以内に死亡する。前立腺癌の転移の最も一般的な部位は骨である。前立腺癌の骨転移は、どちらかといえば、骨溶解よりもむしろ骨芽細胞について特徴的である(すなわち、正味の骨の形成を生じる)。骨転移は、脊椎においてもっとも頻繁に見出され、大腿骨、骨盤、肋骨郭、頭蓋骨、および上腕骨が続く。他の一般的な転移の部位として、リンパ節、肺、肝臓、および脳が挙げられる。転移性の前立腺癌は、代表的には、開放性のまたは腹腔鏡による骨盤のリンパ腺切除、全身の放射性核種スキャン、骨格のレントゲン撮影、および/あるいは骨の病変の生検によって、診断される。
【0023】
本明細書中で使用される場合は、用語「ポリヌクレオチド」は、少なくとも10個の塩基または塩基対の長さのヌクレオチドの多形性の形態(リボヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドのいずれか、あるいはいずれかのヌクレオチドの型の改変された形態)を意味し、そしてDNAの一本鎖および二本鎖の形態を含むように意味される。
【0024】
本明細書中で使用される場合は、用語「ポリペプチド」は、少なくとも約6個のアミノ酸のポリマーを意味する。明細書を通じて、アミノ酸についての標準的な3文字または1文字の表記が、使用される。
【0025】
本明細書中で使用される場合は、ポリヌクレオチドの状況で使用される「ハイブリダイズする(hybridize)」、「ハイブリダイズする(hybridizing)」、「ハイブリダイズする(hybridizes)」などは、従来のハイブリダイゼーション条件(好ましくは、例えば、50%のホルムアミド/6×SSC/0.1%のSDS/100μg/mlのssDNA中でのハイブリダイゼーション)をいうように意味される。ここでは、ハイブリダイゼーションの温度は37℃を超え、そして0.1×SSC/0.1%のSDS中での洗浄のための温度は55℃以上であり、そしてストリンジェントなハイブリダイゼーション条件が最も好ましい。
【0026】
ハイブリダイゼーション反応の「ストリンジェンシー」は、当業者によって容易に決定可能であり、そして一般的には、プローブの長さ、洗浄温度、および塩濃度に依存する経験的な計算である。一般的には、より長いプローブは、適切なアニーリングのためにより高い温度を必要とし、一方、より短いプローブは、より低い温度を必要とする。ハイブリダイゼーションは、一般的には、それらの融解温度以下の環境下に相補鎖が存在する場合に、変性させられたDNAが再度アニーリングする能力に依存する。プローブとハイブリダイズ可能な配列との間での所望される相同性の程度が高ければ高いほど、使用され得る相対的な温度は高くなる。結果として、より高い相対的な温度が、反応条件をよりストリンジェントにし、一方、より低い温度はあまりそうではないという結果になる。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーのさらなる詳細および説明については、Ausubelら、Current Protocols in Molecular Biology、Wiley Interscience Publishers(1995)を参照のこと。
【0027】
「ストリンジェントな条件」、または「高ストリンジェントな条件」は、本明細書中で定義される場合は、以下によって同定され得る:(1)洗浄のために低いイオン強度および高温(例えば、0.015Mの塩化ナトリウム/0.0015Mのクエン酸ナトリウム/0.1%のドデシル硫酸ナトリウム、50℃)を使用する;(2)変性剤(例えば、ホルムアミド)をハイブリダイゼーションの間に使用する(例えば、0.1%のウシの血清アルブミンを有する50%(v/v)のホルムアミド/0.1%のFicoll/0.1%のポリビニルピロリドン/750mMの塩化ナトリウム、75mMのクエン酸ナトリウムを有するpH6.5の50mMのリン酸ナトリウム緩衝液、42℃);または(3)50%のホルムアミド、5×SSC(0.75MのNaCl、0.075Mのクエン酸ナトリウム)、50mMのリン酸ナトリウム(pH6.8)、0.1%のピロリン酸ナトリウム、5×デンハルト溶液、超音波処理したサケの精子のDNA(50μg/ml)、0.1%のSDS、および10%のデキストラン硫酸を42℃で使用し、0.2×SSC(塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム)中で42℃で、そして50%のホルムアミド中で55℃で洗浄し、続いて55℃でEDTAを含有している0.1×SSCから構成される高ストリンジェンシーの洗浄が続く。
【0028】
「中程度にストリンジェントな条件」は、Sambrookら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual,New York:Cold Spring Harbor Press,1989によって記載されたように同定され得、そして洗浄溶液およびハイブリダイゼーション条件(例えば、温度、イオン強度、およびSDS)の使用を含む。これは、上記に記載されたものよりもよりストリンジェントではない。中程度にストリンジェントな条件の例は、以下を含む溶液中での37℃、一晩のインキュベーションである:20%ホルムアミド、5×SSC(150mM NaCl、15mM クエン酸三ナトリウム)、50mM リン酸ナトリウム(pH7.6)、5×Denhardt’s溶液、10% 硫酸デキストラン、および20mg/ml変性剪断サケ精子DNA、続いて約37℃〜50℃で1×SSC中でフィルターを洗浄する。当業者は、温度、イオン強度などを、因子(例えば、プローブ長など)を適応させるのに必要なように調整する方法を認識する。
【0029】
アミノ酸比較の状況において、用語「同一性」は、同一である同じ相対的位置のアミノ酸残基のパーセンテージを表現するために使用される。この状況においてはまた、用語「相同性」は、BLAST分析の保存性アミノ酸の判断基準を使用して、当該分野において一般的に理解されるように、同一であるかまたは類似であるかのいずれかである、同じ相対位置でのアミノ酸残基のパーセンテージを表現するために使用される。例えば、同一性%の値は、WU−BLAST−2(Altschulら、Methods in Enzymology,266:460−480(1996);http://blast.wustl/edu/blast/README.html)によって生成され得る。アミノ酸置換(これは、このような判断基準の下では保存性であると見なされる)に関するさらなる詳細は以下に提供される。さらなる定義が、引き続くサブセクションを通して提供される。
【0030】
(36P6D5の分子生物学および36P6D5に関する使用)
以下の実施例にさらに記載されるように、36P6D5遺伝子および36P6D5タンパク質は、多数の分析的な手段を用いて特徴付けられる。例えば、コードするヌクレオチドおよびアミノ酸配列の分析は、潜在的に関連する分子、ならびに認識可能な構造ドメイン、位相特性、および36P6D5 mRNAおよびタンパク質の構造内の他のエレメントを同定するために実行された。36P6D5 mRNA発現のノーザンブロット分析は、36P6D5メッセージを発現する正常組織および癌性組織の範囲を確立するために実施された。
【0031】
36P6D5タンパク質は、最初にシグナル配列を含む235アミノ酸前駆体に翻訳されることが予想され、これは、翻訳後プロセシングの間に切断されて、211または212アミノ酸の成熟な分泌タンパク質を生じる(図1)。36P6D5タンパク質は、推定分子量=25.9およびpI=8.97を有する。36P6D5は、細胞内である最初の28アミノ酸を有する膜関連タンパク質であることが推定される。シグナルペプチドアルゴリズムに基づいて、このタンパク質の細胞内部分は、29と30との間で切断されて、残りの分子を可溶性タンパク質として放出するようである。この36P6D5遺伝子は、通常、膵臓に主に発現されるが(図3)、いくつかのヒト癌(前立腺癌、乳癌、膵臓癌、結腸癌、肺癌、膀胱癌、腎臓癌および卵巣癌を含む)にも発現または過剰発現される(図4、6および7)。36P6D5タンパク質構造は、2つの以前に記載されたタンパク質配列(2−19タンパク質前駆体(Genbank P98173)(配列番号15)およびGS3786と指定される骨芽細胞タンパク質(Q92520)(配列番号16)に対して有意な相同性を示す(図2)。36P6D5は、推定骨芽細胞タンパク質(NP−055703.1)に、その全体の配列にわたって36%同一性で類似性を有し、aa74とaa235との間に最大の54%相同性が生じる。これはまた、タンパク質GS3786と弱く類似である。36P6D5が骨由来タンパク質に類似性を有するという事実は、LAPC4AD(IT)およびLAPC4AD(SQ)RNAを比較するSSHを用いて発見されたように、驚くべきことではない。骨芽細胞タンパク質に対するその相同性を考慮すると、36P6D5タンパク質が、骨の癌細胞(例えば、図4、6および7に示される36P5D6癌細胞)の増殖を刺激する分泌因子として機能し得る可能性はある。
【0032】
本明細書中に開示されるように、36P6D5は、そのポリヌクレオチド、ポリペプチドおよび抗ポリペプチド抗体が、癌(特に、前立腺癌)のような調節不全細胞成長と関連する状態を調べることにむく周知の診断アッセイに使用される遺伝子ファミリーに見出される特徴に類似した、特異的な特徴を示す(例えば、実施例3に記載されるように、組織発現のその非常に特異的なパターンおよび前立腺癌におけるその過剰発現の両方などを参照のこと)。このクラスの最も公知のメンバーは、PSAであり、これは、前立腺癌の存在を同定およびモニターするために長年い医療従事者によって使用されている典型的なマーカーである(例えば、Merrillら、J.Urol.163(2):503−5120(2000);Polascikら、J.Urol.Aug;162(2):293−306(1999)、およびFortierら、J.Nat.Cancer Inst.91(19):1635−1640(1999)を参照のこと)。p53およびK−rasを含む種々の他の診断マーカーがまた、この状況において使用される(例えば、Tulchinskyら、Int J Mol Med 1999 Jul;4(1)99−102およびMinimotoら、Cancer Detect Prev 2000;24(1):1−12を参照のこと)。結果として、36P6D5ポリヌクレオチドおよびポリペプチド(ならびにこれらの分子の存在を同定するために使用される、36P6D5ポリヌクレオチドプローブおよび抗36P6D5抗体)ならびにこれらの特性に関するこの開示は、当業者が、これらの分子を、例えば、癌と関連する状態を調べることにむく種々の診断アッセイにおいて使用される方法に類似した方法に使用することを可能にする。
【0033】
本明細書中に記載される36P6D5ポリヌクレオチド、ポリペプチドおよび抗体を使用する診断方法の代表的な実施形態は、PSAポリヌクレオチド、ポリペプチドおよび抗体を使用する十分に確立された診断アッセイからの方法に類似した方法である。例えば、まさにPSAポリヌクレオチドがプローブとして(例えば、ノーザン分析(例えば、Shariefら、Biochem.Mol.Biol.Int.33(3)567−74(1994)を参照のこと))およびプライマーとして(例えば、PCR分析(例えば、Okegawaら、J.Urol.163(4):1189−1190(2000)を参照のこと))、PSAの過剰発現または前立腺癌の転移をモニタリングする方法にPSA mRNAの存在および/またはレベルを観察するために使用されるように、本明細書中に記載される36P6D5ポリヌクレオチドは、同じ方法で、36P6D5過剰発現または前立腺癌およびこの遺伝子を発現する他の癌の転移を検出するために使用され得る。あるいは、まさにPSAポリペプチドがPSAに特異的な抗体(これは次いで、PSAタンパク質過剰発現(例えば、Stephanら、Urology 55(4):560−3(2000)を参照のこと)または前立腺細胞の転移(例えば、Alanenら、Pathol.Res.Pract.192(3):233−7(1996)を参照のこと)をモニタリングする方法においてPSAタンパク質の存在および/またはPSAタンパク質のレベルを観察するために使用され得る)を作製するために使用されるように、本明細書中に記載される36P6D5ポリペプチドは、前立腺細胞およびこの遺伝子を発現する他の癌細胞の36P6D5過剰発現または転移を検出する際に使用するための抗体を作製するために使用され得る。詳細には、転移は、起源の器官(例えば、膀胱、腎臓、または前立腺など)から体の異なる領域(例えば、リンパ節)への癌細胞の移動を含むので、36P6D5ポリヌクレオチドおよび/または36P6D5ポリペプチドを発現する細胞の存在に関して生物学的サンプルを調べるアッセイは、転移の証拠を提供するために使用され得、例えば、通常36P6D5を発現する細胞を含まない組織(リンパ節)由来の生物学的サンプルが36P6D5を発現する細胞を含むことが見出された場合である。あるいは、36P6D5ポリヌクレオチドおよび/またはポリペプチドは、癌の証拠を提供するために使用され得、例えば、通常36P6D5を発現しないかまたは異なるレベルで発現する生物学的サンプル中の細胞(例えば、腎臓細胞、膀胱細胞、肺細胞および前立腺細胞など)が36P6D5を発現することかまたは増加した36P6D5の発現を有することが見出された場合である。このようなアッセイにおいて、当業者は、第2の組織制限マーカー(36P6D5に加えて)(例えば、PSA、PCSAなど)(例えば、Alanenら、Pathol.Res.Pract.192(3):233−237(1996)を参照のこと)の存在に関して生物学的サンプルを試験することによって転移の補充の証拠を作製することをさらに望み得る。
【0034】
まさにPSAポリヌクレオチドフラグメントおよびポリヌクレオチド改変体が、この分子をモニタリングする方法における使用のために当業者によって使用されるように、36P6D5ポリヌクレオチドフラグメントおよびポリヌクレオチド改変体はまた、類似の様式で使用され得る。詳細には、この分子のモニタリング方法に使用される代表的なPSAポリヌクレオチドは、PSA cDNA配列のフラグメントからなるプローブまたはプライマーである。これを説明すると、PSAポリヌクレオチドをPCR増幅するために使用されるプライマーは、ポリメラーゼ連鎖反応中で機能するために全PSA配列未満を含まなくてはならない。このようなPCR反応の状況において、当業者は、概して、目的のポリヌクレオチドの異なる部分を増幅するためまたは増幅反応を最適化するためにプライマーとして使用され得る種々の異なるポリヌクレオチドフラグメントを作製する(例えば、Caetano−Anolles,G.Biotechniques 25(3):472−476,478−480(1998);Robertsonら、Methods Mol.Biol.98:121−154(1998)を参照のこと)。このようなフラグメントの有用性のさらなる例示は、実施例3に提供され、ここで、36P6D5ポリヌクレオチドフラグメントは、プローブとして使用されて、癌細胞中の36P6D5 mRNAの過剰発現を示す。さらに、医療従業者によるその使用を容易にするために、改変体ポリヌクレオチド配列が、代表的に、PCRおよびノーザンブロット分析において対応するmRNAに対するプライマーおよびプローブとして使用される(例えば、Sawaiら、Fetal Diagn.Ther.1996 Nov−Dec;11(6):407−13およびCurrent Protocols In Molecular Biology、第2版、Unit2、Frederick M.Ausubelら、編、1995を参照のこと)。ポリヌクレオチドフラグメントおよび改変体は、代表的に、これらが共通の属性または比較的高いストリンジェンシーの条件下で標的ポリヌクレオチド配列(例えば、配列番号1に示される36P6D5ポリヌクレオチド)に結合し得る特徴を有する限り、この状況において有用である。
【0035】
まさに、PSAポリペプチドフラグメントおよびポリペプチド改変体がこの分子をモニタリングする方法に使用するために当業者によって使用されるように、36P6D5ポリペプチドフラグメントおよびポリペプチド改変体はまた、類似の様式で使用され得る。詳細には、この分子のモニタリング方法に使用される代表的なPSAポリペプチドは、PSAタンパク質に特異的に結合する抗体によって認識され得るエピトープを含むPSAタンパク質のフラグメントである。抗体(例えば、抗PSA抗体)を作製するために使用されるポリペプチドフラグメントまたはポリペプチド改変体を使用するこの実施は、代表的に、広範な種々の系(例えば、従業者によって使用される融合タンパク質)を用いて当該分野内である(例えば、Current Protocols In Molecular Biology、第2版、Unit16、Frederick M.Ausubulら、編、1995を参照のこと)。この状況において、目的タンパク質中の種々のエピトープの各々は、抗体が作製される構造を提供するために機能する。代表的に、当業者は、一般的に、目的のポリペプチドの異なる部分に特異的な抗体を作製するために使用され得る種々の異なるポリペプチドフラグメントを作製する(例えば、米国特許第5,840,501号および米国特許第5,939,533号を参照のこと)。例えば、下記に議論する36P6D5の生物学的モチーフのうちの1つを含むポリペプチドを使用することが好ましくあり得る。ポリペプチドフラグメントおよび改変体は、代表的に、これらが、共通の属性または標的ポリペプチド配列に特異的な抗体を作製し得るエピトープを有する特徴(例えば、配列番号2に示される36P6D5ポリペプチド)を有する限り、本状況において有用である。
【0036】
本明細書中に示されるように、36P6D5ポリヌクレオチドおよび36P6D5ポリペプチド(ならびに、これらの分子の存在を同定するために使用される36P6D5ポリヌクレオチドプローブおよび抗36P6D5抗体)は、これらを前立腺癌診断の際に有用にする特異的な特性を示す。本明細書中に記載される特定の疾患状態(例えば、前立腺癌)の存在または発症を評価するために36P6D5遺伝子産物の存在を測定する記載される診断アッセイは、PSAを用いて好首尾になされたように、予防的な測定のための潜在的な候補物を同定する際またはさらなるモニタリングの際に特に有用である。さらに、これらの物質は、例えば、前立腺起源の転移の明確な診断がPSA単独に関する試験に基づいてなされ得ない状況(例えば、Alanenら、Pathol.Res.Pract.192(3):233−237(1996)を参照のこと)においてPSAに対して類似した特徴を有する分子に関する当該分野の要求を満たし、結果として、36P6D5ポリヌクレオチドおよび36P6D5ポリペプチド(ならびにこれらの分子の存在を同定するために使用される36P6D5ポリヌクレオチドプローブおよび抗36P6D5抗体を含む)のような物質は、前立腺起源の転移を確認するために使用されなければならない。
【0037】
最後に、診断アッセイにおけるこれらの使用に加えて、本明細書中に開示される36P6D5ポリヌクレオチドは、多数の他の特定の有用性、例えば、21q22.2−22.3中の染色体の異常と関連する発癌の表示におけるこれらの使用を有する。さらに、診断アッセイにおけるこれらの使用に加えて、本明細書中に開示される36P6D5ポリペプチドおよび36P6D5ポリヌクレオチドは、他の有用性、例えば、未知の起源の組織に関する法医学的分析におけるこれらの使用を有する(例えば、Takahama K Forensic Sci Int 1996 Jun 28;80(1−2):63−9を参照のこと)。
【0038】
以下に詳細に議論されるように、36P6D機能は、当該分野で周知である種々の技術を用いて哺乳動物細胞中で評価され得る。哺乳動物発現に関して、36P6Dは、以下を含むいくつかのベクターにクローン化され得る:pcDNA 3.1 myc−His−tag(Invtrogen)およびレトロウイルスベクターpSRαtkneo(Mullerら、1991、MCB 11:1785)。これらの発現ベクターを使用して、36P6D5は、PC−3、NIH 3T3、LNCaP、および293Tを含むいくつかの細胞株中で発現され得る。36P6D5の発現は、ノーザンブロット分析を用いてモニターされ得る。36P6D5を発現する哺乳動物細胞株は、組織培養物中の細胞増殖、アポトーシスシグナルの活性化、SCIDマウスにおける腫瘍形成、および膜浸潤培養系(MICS)(Welchら、Int.J.Cancer 43:449−457)を用いるインビボ浸潤を含むいくつかのインビトロアッセイおよびインビボアッセイにおいて試験され得る。36P6D5細胞表現型は、36P6D5発現を欠く細胞の表現型と比較され得る。
【0039】
(36P6D5ポリヌクレオチド)
本発明の一つの局面は、36P6D5遺伝子、mRNAおよび/またはコード配列(好ましくは、36P6D5タンパク質およびそのフラグメント、DNA、RNA、DNA/RNAハイブリッドならびに関連分子をコードするポリヌクレオチド、36P6D5遺伝子もしくはmRNA配列またはその一部分に相補的な、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド、ならびに36P6D5遺伝子、mRNAもしくは36P6D5をコードするポリヌクレオチド(集合的に、「36P6D5ポリヌクレオチド」)にハイブリダイズする、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを含む単離形態における)のすべてもしくは一部分に対応するか、またはそのすべてもしくは一部分に相補的なポリヌクレオチドを提供する。本明細書中で使用される場合、36P6D5遺伝子およびタンパク質は、本明細書中で具体的に記載される36P6D5遺伝子およびタンパク質、ならびに他の36P6D5タンパク質および前述の構造的に類似の改変体に対応する、遺伝子およびタンパク質を含むことが意味される。このような他の36P6D5タンパク質および改変体は、一般的に、36P6D5コード配列に高度に相同なコード配列を有し、そして好ましくは、少なくとも約50%のアミノ酸同一性、そして少なくとも約60%のアミノ酸相同性を共有し(BLAST標準を使用して)、より好ましくは、70%以上の相同性を共有する(BLAST標準を使用して)。
【0040】
36P6D5ポリヌクレオチドは、図1(配列番号1)(ここで、Tは、Uでもあり得る)に示されるようなヒト36P6D5のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド;36P6D5タンパク質の全体もしくは一部をコードするポリヌクレオチド;上記のものに対して相補的である配列;または上記のいずれかのポリヌクレオチドフラグメントを含み得る。別の実施形態は、図1(配列番号1)のヌクレオチド残基数59〜ヌクレオチド残基数763もしくは766(ここで、Tは、Uでもあり得る)に示されるような配列を有するポリヌクレオチドを含む。別の実施形態は、図1(配列番号1)のヌクレオチド残基数131〜ヌクレオチド残基数763もしくは766(ここで、Tは、Uでもあり得る)に示されるような配列を有するポリヌクレオチドを含む。別の実施形態は、配列が、American Type Culture Collection,10801 University Boulevard,Manassas,Virginia 20110−2209,USA(ATCC)に登録番号207197として1999年4月9日に寄託された、プラスミドに含まれるcDNAによってコードされる、36P6D5ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。別の実施形態は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、図1(配列番号1)に示されるヒト36P6D5 cDNAにハイブリダイズし得るポリヌクレオチドを含む。
【0041】
本明細書中で開示される本発明の代表的な実施形態は、36P6D5 mRNA配列の特定の部分を含む36P6D5ポリヌクレオチド(およびこのような配列に相補的であるもの)(例えば、このタンパク質およびそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド)を含む。例えば、本明細書中で開示される本発明の代表的な実施形態は、以下を含む:配列番号2に示される36P6D5タンパク質のおよそアミノ酸〜およそアミノ酸10をコードするポリヌクレオチド、配列番号2に示される36P6D5タンパク質のおよそアミノ酸20〜およそアミノ酸30をコードするポリヌクレオチド、配列番号2に示される36P6D5タンパク質のおよそアミノ酸30〜およそアミノ酸40をコードするポリヌクレオチド、配列番号2に示される36P6D5タンパク質のおよそアミノ酸40〜およそアミノ酸50をコードするポリヌクレオチド、配列番号2に示される36P6D5タンパク質のおよそアミノ酸50〜およそアミノ酸60をコードするポリヌクレオチド、配列番号2に示される36P6D5タンパク質のおよそアミノ酸60〜およそアミノ酸70をコードするポリヌクレオチド、配列番号2に示される36P6D5タンパク質のおよそアミノ酸70〜およそアミノ酸80をコードするポリヌクレオチド、配列番号2に示される36P6D5タンパク質のおよそアミノ酸80〜およそアミノ酸90をコードするポリヌクレオチド、および配列番号2に示される36P6D5タンパク質のおよそアミノ酸90〜およそアミノ酸100をコードするポリヌクレオチドなど。このスキームの後、36P6D5タンパク質のアミノ酸100〜235のアミノ酸配列の一部分をコードするポリヌクレオチドは、本発明の代表的な実施形態である。36P6D5タンパク質のより大きな部分をコードするポリヌクレオチドがまた意図される。例えば、配列番号2に示される36P6D5タンパク質のおよそアミノ酸1(または20、または30、または40など)〜およそアミノ酸20(または30、または40、または50など)をコードするポリヌクレオチドは、当該分野で周知の種々の技術によって生成され得る。
【0042】
36P6D5ポリヌクレオチドのさならる例示的な実施形態は、図1(配列番号1)に示される配列の、およそヌクレオチド残基数1からおよそヌクレオチド残基数250、およそヌクレオチド残基数250からおよそヌクレオチド残基数500、およびおよそヌクレオチド残基数500からおよそヌクレオチド残基数750、およびおよそヌクレオチド残基数750からおよそヌクレオチド残基数913を有するポリヌクレオチドからなる実施形態を含む。これらのポリヌクレオチドフラグメントは、図1(配列番号1)に示されるように36P6D5配列の任意の部分、例えば、図1(配列番号1)に示されるポリヌクレオチド配列内の235アミノ酸ORFを有するポリヌクレオチド(例えば、およそヌクレオチド残基数59からおよそヌクレオチド残基数763)を含み得る。
【0043】
本明細書中で開示される本発明のさらなる例示的な実施形態は、36P6D5タンパク質配列内に含まれる、1つ以上の生物学的モチーフをコードする36P6D5ポリヌクレオチドフラグメントを含む。本発明の代表的なポリヌクレオチドフラグメントは、以下の36P6D5タンパク質および36P6D5ポリペプチドを議論する文書においてより詳細に開示されるように、1つ以上の36P6D5 N−グリコシル化部位、カゼインキナーゼIIリン酸化部位、タンパク質キナーゼcリン酸化部位、アミノ酸透過酵素サインまたはn−ミリストイル化部位をコードするものが挙げられる。
【0044】
前の段落のポリヌクレオチドは、多数の異なる特異的な用途を有する。例えば、ヒト36P6D5遺伝子が染色体21q22.2−22.3にマップするので、36P6D5タンパク質の異なる領域をコードするポリヌクレオチドを使用して、種々の癌に関連しているとして同定されている染色体21(バンドq22.2−22.3)の細胞遺伝学異常を特徴付けし得る。詳細には、21q22.2−22.3中の種々の染色体の異常が、多数の異なる癌においてしばしば細胞遺伝学の異常として同定されている(例えば、Babuら、Cancer Genet Cytogenet.1989 Mar;38(1)127−9およびHoら、Blood.1996年6月15日;87(12)5218−24を参照のこと)。結果として、36P6D5タンパク質の特異的な領域をコードするポリヌクレオチドは、悪性腫瘍の表現型に寄与し得る染色体21のこの領域における細胞遺伝学異常の以前の可能性のある特異的な性質よりも、より正確に描写するために使用され得る新規のツールを提供する。この状況においては、これらのポリヌクレオチドは、より微妙でありあまり一般的ではない染色体異常を同定するために染色体のスクリーニングの感受性を拡大することへの当業者の要求を満たす(例えば、Evansら、1994、Am.J.Obstet.Gynecol.171(4):1055−1057を参照のこと)。
【0045】
あるいは、36P6D5は、前立腺癌に高度に発現されることが示されるように(例えば、図4を参照のこと)、これらのポリヌクレオチドは、正常組織 対 癌性組織において、36P6D5遺伝子産物の状態を評価する方法に使用され得る。代表的には、36P6D5タンパク質の特定の領域をコードするポリヌクレオチドが使用されて、36P6D5遺伝子産物の特定の領域(RNA結合配列を含むような領域)において、混乱状態(例えば、欠失、挿入、点変異など)の存在を評価し得る。例示的なアッセイは、RT−PCRアッセイ、ならびに一本鎖高次構造多型(SSCP)分析(例えば、Marrogiら、J.Cutan.Pathol.26(8):369−378(1999)を参照のこと)の両方を含み、これらの両方は、タンパク質の特定の領域をコードするポリヌクレオチドを利用して、タンパク質内のこれらの領域を試験する。
【0046】
本明細書中で開示される本発明の他の具体的に意図された実施形態は、ゲノムDNA、cDNA、リボザイムおよびアンチセンス分子、ならびに天然の供給源または合成由来にせよ、代替の骨格に基づくか、または代替の塩基を含む核酸分子である。例えば、アンチセンス分子は、RNA、あるいは他の分子(ペプチド核酸(PNA)または塩基対依存様式でDNAもしくはRNAに特異的に結合する非核酸分子(例えば、ホスホロチオエート誘導体)を含む)であり得る。当業者は、36P6D5ポリヌクレオチドおよび本明細書中で開示されるポリヌクレオチド配列を使用して、核酸分子のこれらのクラスを容易に獲得し得る。
【0047】
アンチセンス技術は、細胞内部に位置する標的ポリヌクレオチドに結合する外因性オリゴヌクレオチドの投与を含む。用語「アンチセンス」は、このようなオリゴヌクレオチドが、その細胞内標的(例えば、36P6D5)に相補的であるという事実をいう。例えば、Jack Cohen,OLIGODEOXYNUCLEOTIDES,Antisense Inhibitors of Gene Expression,CRC Press,1988;およびSynthesis 1:1−5(1988)を参照のこと。本発明の36P6D5アンチセンスオリゴヌクレオチドは、Sオリゴヌクレオチド(ホスホロチオエート誘導体またはS−オリゴ、Jack Cohen、前出を参照のこと)のような誘導体を含み、この誘導体は、癌細胞増殖阻害作用の増大を示す。S−オリゴ(ヌクレオシドホスホロチオエート)は、オリゴヌクレオチド(O−オリゴ)の等電子アナログであり、リン酸基の非架橋酸素原子は、硫酸原子に置換される。本発明のS−オリゴは、3H−1,2−ベンゾジチオール−3−オン−1,1−ジオキシド(これは、イオウ転移試薬である)での対応するO−オリゴの処理によって調製され得る。Iyer,R.P.ら、J.Org.Chem.55:4693−4698(1990);およびIyer,R.P.ら、J.Am.Chem.Soc.112:1253−1254(1990)(これらの開示は、本明細書中で参考として完全に援用される)を参照のこと。本発明のさらなる36P6D5アンチセンスオリゴヌクレオチドは、当該分野で公知のモルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む(例えば、Partrigeら、1996,Antisense&Nucleic Acid Drug Development 6:169−175を参照のこと)。
【0048】
本発明の36P6D5アンチセンスオリゴヌクレオチドは、代表的に、36P6D5ゲノム配列もしくは対応するmRNAの、最初の100個のN末端コドンまたは最後の100個のC末端コドンに相補的であり、そしてこれらのコドンと安定にハイブリダイズする、RNAまたはDNAであり得る。完全な相補性は必要ではないが、高い程度の相補性が好ましい。この領域に相補的なオリゴヌクレオチドの使用は、36P6D5 mRNAへの選択的ハイブリダイゼーションを可能にし、そしてタンパク質キナーゼの他の調節サブユニットを特定するmRNAへの選択的ハイブリダイゼーションを可能にしない。好ましくは、本発明の36P6D5アンチセンスオリゴヌクレオチドは、36P6D5 mRNAにハイブリダイズする配列を有するアンチセンスDNA分子の15〜30merフラグメントである。必要に応じて、36P6D5アンチセンスオリゴヌクレオチドは、36P6D5の最初の10個のN末端コドンおよび最後の10個のC末端コドンにおける領域に相補的な30merオリゴヌクレオチドである。あるいは、アンチセンス分子は、36P6D5発現の阻害において、リボザイムを利用するように改変される。L.A.CoutureおよびD.T.Stinchcomb、Trends Genet.12:510−515(1996)。
【0049】
本発明のこの局面のさらなる特定の実施形態は、プライマーおよびプライマーペアを含み、これは、本発明のポリヌクレオチドまたはその任意の特定の部分の特異的増幅、および本発明の核酸分子またはその任意の部分に選択的もしくは特異的にハイブリダイズするプローブの特異的増幅を可能にする。プローブは、検出可能なマーカー(例えば、放射性同位体、蛍光化合物、生体発光化合物、化学発光化合物、金属キレート剤または酵素のような)で標識され得る。このようなプローブおよびプライマーが、サンプルにおける36P6D5ポリヌクレオチドの存在を検出するために使用され得、そして36P6D5タンパク質を発現する細胞を検出するための手段として使用され得る。
【0050】
このようなプローブの例としては、配列番号1に示されるヒト36P6D5 cDNA配列の、すべてまたは一部分を含むポリペプチドが挙げられる。36P6D5 mRNAを特異的に増幅し得るプライマーペアの例はまた、続く実施例において記載される。当業者に理解されるように、非常に多くの異なるプライマーおよびプローブが、本明細書中に提供される配列に基づいて調製され得、そして36P6D5 mRNAを有効に増幅および/または検出するために使用され得る。
【0051】
本明細書中で使用される場合、ポリヌクレオチドは、36P6D5遺伝子ではない遺伝子に、対応するかまたは相補的である混入ポリヌクレオチド、または36P6D5遺伝子産物もしくはそのフラグメントではないポリペプチドをコードする混入ポリヌクレオチドから実質的に分離されている場合、「単離された」と言われる。当業者は、容易に核酸単離手順を利用して、単離された36P6D5ポリヌクレオチドを獲得し得る。
【0052】
本発明の36P6D5ポリヌクレオチドは、種々の目的に有用である。この目的としては、36P6D5遺伝子、mRNAまたはそのフラグメントの、増幅および/または検出のための、プローブおよびプライマーとしての使用;前立腺癌および他の癌の、診断および/または予後のための試薬としての使用;36P6D5ポリペプチドの発現を指向し得るコード配列としての使用;36P6D5遺伝子の発現および/または36P6D5転写物の翻訳を、調節または阻害するための手段としての使用;ならびに治療薬としての使用が挙げられるが、これらに限定されない。
【0053】
(36P6D5をコードする核酸分子の単離)
本明細書中に記載される36P6D5 cDNA配列は、36P6D5遺伝子産物をコードする他のポリヌクレオチドの単離、ならびに36P6D5遺伝子産物ホモログ、代わりにスプライシングされたアイソフォーム、対立遺伝子改変体、および36P6D5遺伝子産物の変異体形態をコードするポリヌクレオチドの単離を可能にする。36P6D5遺伝子をコードする全長cDNAを単離するために利用され得る種々の分子クローニング方法は、周知である(例えば、Sambrook,J.ら、1989、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、第2版、Cold Spring Harbor Press,New York;Ausubelら編、1995、Current Protocols in Molecular Biology、Wiley and Sonsを参照のこと)。例えば、λファージクローニング方法論が、市販のクローニング系を使用して慣用的に利用され得る(例えば、Lambda ZAP Express,Stratagene)。36P6D5遺伝子cDNAを含むファージクローンは、標識された36P6D5 cDNAまたはそのフラグメントを用いて調べることにより同定され得る。例えば、一つの実施形態において、36P6D5 cDNA(図1A〜1D;配列番号1)またはその一部分が、合成され、そしてプローブとして使用されて、36P6D5遺伝子に対応する重複するcDNAおよび36P6D5遺伝子に対応する全長cDNAを回収し得る。36P6D5遺伝子自体は、36P6D5 DNAプローブまたはプライマーを使用して、ゲノムDNAライブラリー、細菌人工染色体ライブラリー(BAC)、酵母人工染色体ライブラリー(YAC)などをスクリーニングすることによって単離され得る。
【0054】
(組換えDNA分子および宿主−ベクター系)
本発明はまた、36P6D5ポリヌクレオチドを含む組換えDNAまたはRNA分子(これには、当該分野において周知のファージ、プラスミド、ファージミド、コスミド、YAC、BAC、ならびに種々のウイルス性および非ウイルス性ベクターが含まれるが、これらに限定されない)、およびこのような組換えDNAまたはRNA分子で形質転換またはトランスフェクトされた細胞を提供する。本明細書中で使用される場合、組換えDNAまたはRNA分子は、インビトロでの分子操作に供されたDNAまたはRNA分子である。このような分子を生成するための方法は周知である(例えば、Sambrookら、1989(前出)を参照のこと)。
【0055】
本発明はさらに、適切な原核生物宿主細胞または真核生物宿主細胞において36P6D5ポリヌクレオチドを含む組換えDNA分子を含む、宿主−ベクター系を提供する。適切な真核生物宿主細胞の例としては、酵母細胞、植物細胞、または動物細胞(例えば、哺乳動物細胞または昆虫細胞(例えば、バキュロウイルス感染可能細胞(例えば、Sf9細胞)またはHighFive細胞))が挙げられる。適切な哺乳動物細胞の例としては、種々の前立腺癌細胞株(例えば、PrEC、LnCaPおよびTsuPr1)、他のトランスフェクト可能であるかまたは形質導入可能な前立腺細胞株、ならびに組換えタンパク質の発現のために慣用的に使用される多くの哺乳動物細胞(例えば、COS細胞、CHO細胞、293細胞、293T細胞)が挙げられる。より詳細には、36P6D5のコード配列を含むポリヌクレオチドを使用し、当該分野で慣用的に使用され、そして広く知られたかなり多数の宿主−ベクター系のいずれかを用いて、36P6D5タンパク質またはそれらのフラグメントを生成し得る。
【0056】
36P6D5タンパク質またはそれらのフラグメントの発現に適切な広範な種々の宿主−ベクター系が利用可能である(例えば、Sambrookら、1989(前出);Current Protocols in Molecular Biology、1995(前出)を参照のこと)。哺乳動物での発現に好ましいベクターとしては、pcDNA 3.1 myc−His−tag(Invitrogen)およびレトロウイルスベクターpSRαtkneo(Mullerら、1991、MCB 11:1785)が挙げられるが、これらに限定されない。これらの発現ベクターを使用して、36P6D5は、好ましくは、いくつかの前立腺癌細胞株および非前立腺癌細胞株(例えば、293、293T、rat−1、NIH3T3およびTsuPr1を含む)において発現させ得る。本発明の宿主−ベクター系は、36P6D5タンパク質またはそれらのフラグメントの産生のために有用である。このような宿主−ベクター系は、36P6D5および36P6D5変異の機能的特性を研究するために使用され得る。
【0057】
組換えヒト36P6D5タンパク質は、36P6D5をコードする構築物でトランスフェトされた哺乳動物細胞によって産生され得る。実施例に記載される例示的な実施形態において、293T細胞は、36P6D5をコードする発現プラスミドでトランスフエェクトされ得、36P6D5タンパク質は、293T細胞に発現され、そして組換え36P6D5タンパク質は、標準的な精製方法(例えば、抗36P6D5抗体を用いるアフィニティ精製)を用いて単離され得る。本明細書中で実施例にも記載される別の実施形態において、36P6D5コード配列は、レトロウイルスベクターpSRαMSVtkneoへとサグクローニングされ、そして36P6D5発現細胞株を確立するために、種々の哺乳動物細胞株(例えば、NIH 3T3細胞、TsuPr1細胞、293細胞およびrat−1細胞)を感染させるために使用される。当該分野において周知の種々の他の発現系がまた利用され得る。36P6D5コード配列にインフレームで結合したリーダーペプチドをコードする発現構築物は、分泌形態の組換え36P6D5タンパク質の生成のために利用され得る。
【0058】
36P6D5遺伝子またはそれらのフラグメントによってコードされるタンパク質は、種々の用途を有する。これには、以下が挙げられるが、これらに限定されない:抗体の産生、および36P6D5遺伝子産物に結合する、リガンドおよび他の因子および細胞構成要素を同定するための方法において。36P6D5タンパク質(例えば、36P6D5ポリヌクレオチド)またはそれらのフラグメントに対して惹起された抗体は、診断および予後アッセイ、ならびに36P6D5タンパク質の発現によって特徴付けられるヒト癌(腎臓肺癌、結腸癌、前立腺癌、脳腫瘍、膀胱癌、膵臓癌、卵巣癌、肺癌および乳癌を含むが、これに限定されない)の管理における画像化方法において有用であり得る(例えば、図4、6および7を参照)。このような抗体は、細胞内に発現され得、そしてこのような癌を有する患者の処置方法において使用され得る。36P6D5タンパク質の検出のために有用な種々の免疫学的アッセイが意図され、これには、FACS分析、種々の型のラジオイムノアッセイ、酵素結合イムノソルベント検定法(ELISA)、酵素結合免疫蛍光アッセイ(ELIFA)、免疫細胞学的方法などが挙げられるが、これらに限定されない。このような抗体は、標識され得、そして36P6D5発現細胞を検出し得る免疫学的画像化試薬として使用され得る(例えば、ラジオシンチグラフィ(radioscintigraphic)画像化方法において)。36P6D5タンパク質はまた、以下にさらに記載されるように、癌ワクチンを生成するにおいて特に有用であり得る。
【0059】
(36P6D5タンパク質)
本発明の別の局面は、36P6D5タンパク質およびそのポリペプチドフラグメントを提供する。本発明の36P6D5タンパク質としては、本明細書中で特に同定されたタンパク質、ならびに対立遺伝子改変体、保存的置換改変体およびホモログ(これらは、以下に概説される方法に従って過度な実験を伴わずに単離/生成および特徴付けされ得る)が挙げられる。異なる36P6D5タンパク質またはそのフラグメントの部分を組合せる融合タンパク質、ならびに36P6D5タンパク質および異種ポリペプチドの融合タンパク質もまた含まれる。このような36P6D5タンパク質は、集合的に、36P6D5タンパク質、本発明のタンパク質、または36P6D5という。本明細書中で使用される場合、用語「36P6D5ポリペプチド」は、少なくとも6個のアミノ酸(好ましくは、少なくとも15個のアミノ酸)のポリペプチドフラグメントまたは36P6D5タンパク質をいう。
【0060】
36P6D5タンパク質の特定の実施形態は、配列番号2に示されるようなヒト36P6D5のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。あるいは、36P6D5のタンパク質の実施形態は、配列番号2に示されるようなヒト36P6D5のアミノ酸配列における変更を有する改変ポリペプチドを含む。
【0061】
一般的に、ヒト36P6D5の天然に存在する対立遺伝子改変体は、高い程度の構造的同一性および相同性(例えば、90%以上の同一性)を共有する。代表的に、36P6D5タンパク質の対立遺伝子改変体は、本明細書中に記載される36P6D5配列内に保存的アミノ酸置換を含むか、または36P6D5ホモログにおいて対応する位置に由来するアミノ酸の置換を含む。36P6D5対立遺伝子改変体の1つのクラスは、特定の36P6D5アミノ酸配列の少なくとも小さな領域と高い程度の相同性を共有するが、この配列とは根本的な逸脱(例えば、非保存的置換、短縮化(truncation)、挿入、またはフレームシフト)をさらに含むタンパク質である。
【0062】
保存的アミノ酸置換はしばしば、タンパク質のコンフォメーションも機能も変更することなく、タンパク質中で作製され得る。このような変化としては、以下が挙げられる:任意のイソロイシン(I)、バリン(V)、およびロイシン(L)の、任意の他のこれらの疎水性アミノ酸に対する置換;グルタミン酸(E)に対するアスパラギン酸(D)、およびその逆の置換;アスパラギン(N)に対するグルタミン(Q)、およびその逆の置換;ならびに、スレオニン(T)に対するセリン(S)、およびその逆の置換。他の置換はまた、タンパク質の三次元構造における特定のアミノ酸の環境およびその役割に依存して、保存的とみなされ得る。例えば、グリシン(G)およびアラニン(A)は、しばしば交換可能であり得、アラニン(A)およびバリン(V)も同様であり得る。比較的疎水性であるメチオニン(M)はしばしば、ロイシンおよびイソロイシンと交換可能であり得、そして時としてバリンと交換可能であり得る。リシン(K)およびアルギニン(R)はしばしば、そのアミノ酸残基の重要な特徴がその電荷であり、そしてこれら2つのアミノ酸残基の異なるpKが重要でない位置において、交換可能である。さらに他の変化が、特定の状況において、「保存的」とみなされ得る。
【0063】
本明細書中に開示される本発明の実施形態は、広範な種々の当該分野で認められた36P6D5タンパク質の改変体(例えば、アミノ酸の挿入、欠失および置換を有するポリペプチド)を含む。36P6D5改変体は、当該分野において公知の方法(例えば、部位特異的変異誘発、アラニンスキャニング(alanine scanning)、およびPCR変異誘発)を使用して作製され得る。部位特異的変異誘発(Carterら、1986、Nud.Acids Res.13:4331;Zollerら、1987、Nud.Acids Res.10:6487)、カセット式変異誘発(Wellら、1985、Gene 34:315)、制限選択的変異誘発(Wellsら、1986、Philos.Trans.R.Soc.London Ser.A、317:415)または他の公知技術を、クローン化されたDNAにおいて実施し、36P6D5改変体DNAを産生し得る。走査型アミノ酸分析もまた、連続配列に沿って1以上のアミノ酸を同定するために使用され得る。とりわけ好ましい走査アミノ酸は、比較的小さい中性アミノ酸である。このようなアミノ酸としては、アラニン、グリシン、セリン、およびシステインが挙げられる。アラニンが、代表的に、この群の中で好ましい走査アミノ酸である。なぜなら、アラニンは、β炭素を越えて側鎖を排除し、そして改変体の主鎖コンフォメーションを変更する可能性が低いからである。アラニンもまた、代表的に好ましい。なぜなら、アラニンは、最も一般的なアミノ酸であるからである。さらに、埋没位置および露出位置の両方において、頻繁に見出される(Creighton、The Proteins(W.H.Freeman&Co.、NY);Chothia、1976、J.Mol.Biol.、150:1)。アラニン置換が適切な量の改変体を生じない場合には、同配体アミノ酸が使用され得る。
【0064】
本明細書中で規定される場合、36P6D5改変体は、配列番号2のアミノ酸配列を有する36P6D5タンパク質と共通した少なくとも1つのエピトープを有するという顕著な特性を有し、その結果、36P6D5改変体に特異的に結合する抗体はまた、配列番号2のアミノ酸配列を有する36P6D5タンパク質に特異的に結合する。ポリペプチドは、36P6D5タンパク質に特異的に結合する抗体によって認識され得るエピトープをもはや含まない場合、配列番号2に示されるタンパク質の改変体でなくなる。当業者は、タンパク質を認識する抗体が、種々のサイズを有するエピトープに結合し、そして約6個のアミノ酸(連続または不連続)の順序の分類は、最小のエピトープにおけるアミノ酸の代表的な数としてみなされることを理解する。例えば、Hebbesら、Mol Immunol(1989)26(9):865−73;Schwartzら、J Immunol(1985)135(4):2598−608を参照のこと。最小6個のアミノ酸エピトープ内の所定の位置に含まれ得る約20個のアミノ酸があるので、偶然に起こるこのようなエピトープのおおよその確率は、少なくとも206、すなわち6400万分の1である。36P6D5タンパク質改変体の別の特定のクラスは、配列番号2のアミノ酸配列と90%以上の同一性を共有する。36P6D5タンパク質改変体の別の特定のクラスは、以下に記載される1以上の36P6D5生物学的モチーフを含む。
【0065】
上記で考察したように、特許請求された本発明の実施形態は、配列番号2に示される36P6D5タンパク質の235未満のアミノ酸配列を含むポリペプチド(およびこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド)を含む。例えば、本明細書中に開示される本発明の代表的な実施形態は、以下が挙げられる:配列番号2に示される36P6D5タンパク質のおおよそアミノ酸1〜おおよそアミノ酸10からなるポリペプチド、配列番号2に示される36P6D5タンパク質のおおよそアミノ酸20〜おおよそアミノ酸30からなるポリペプチド、配列番号2に示される36P6D5タンパク質のおおよそアミノ酸30〜おおよそアミノ酸40からなるポリペプチド、配列番号2に示される36P6D5タンパク質のおおよそアミノ酸40〜おおよそアミノ酸50からなるポリペプチド、配列番号2に示される36P6D5タンパク質のおおよそアミノ酸50〜おおよそアミノ酸60からなるポリペプチド、配列番号2に示される36P6D5タンパク質のおおよそアミノ酸60〜おおよそアミノ酸70からなるポリペプチド、配列番号2に示される36P6D5タンパク質のおおよそアミノ酸70〜おおよそアミノ酸80からなるポリペプチド、配列番号2に示される36P6D5タンパク質のおおよそアミノ酸80〜おおよそアミノ酸90からなるポリペプチド、および配列番号2に示される36P6D5タンパク質のおおよそアミノ酸90〜おおよそアミノ酸100からなるポリペプチドなど。このスキームに従って、36P6D5タンパク質のアミノ酸100〜273のアミノ酸配列の部分からなるポリペプチドが、本発明の代表的な実施形態である。36P6D5タンパク質のより大きな部分からなるポリペプチドもまた意図される。例えば、配列番号2に示される36P6D5タンパク質のおおよそアミノ酸1(または、20もしくは30もしくは40など)〜おおよそアミノ酸20(または、30もしくは40もしくは50など)からなるポリペプチドが、当該分野において周知の種々の技術によって生成され得る。
【0066】
本明細書中に開示される本発明のさらなる例示的な実施形態は、配列番号2に示されるような36P6D5ポリペプチド配列内に含まれる1以上の生物学的モチーフのアミノ酸残基を含む36P6D5ポリペプチドを含む。1つの実施形態では、本発明の代表的ポリペプチドは、残基120〜123におけるNVTA、および/または残基208〜211におけるNHSDのような1以上の36P6D5 N−グリコシル化部位を含み得る(配列番号2)。別の実施形態では、本発明の代表的ポリペプチドは、残基43〜45におけるSIRおよび/または残基160〜162におけるSTRのような1以上の36P6D5タンパク質キナーゼCリン酸化部位を含み得る(配列番号2)。別の実施形態では、本発明の代表的ポリペプチドは、残基46〜49でSIGEおよび/または残基155〜158におけるTYDDのような1以上の36P6D5カゼインキナーゼIIリン酸化部位を含み得る(配列番号2)。別の実施形態では、本発明の代表的ポリペプチドは、残基81〜86におけるGGGRSK、残基108〜113におけるGINIAIおよび/または残基119〜124におけるGNVTATのような1以上のN−ミリストイル化部位を含み得る(配列番号2)。別の実施形態において、本発明の代表的ポリペプチドは、残基5〜36におけるアミノ酸パーミアーゼサインAGGLLKVVFVVFASLCAWYSGYLLAELIPDAPを含み得る(配列番号2)。別の実施形態において、本発明の代表的なポリペプチドは、図1に示されるシグナル配列を含み得る。なお別の実施形態において、本発明の代表的なポリペプチドは、本明細書中に記載されるプロセスによって同定される1以上の免疫原性エピトープ(例えば、図1に示されるエピトープ)を含み得る。これらの発明の関連する実施形態は、上記の異なるモチーフの組合せを含むポリペプチドを含み、好ましい実施形態は、これらのポリペプチドのモチーフまたは介在性配列のいずれかの内に、挿入、欠失または置換は含まないものである。さらに、多くのN末端および/またはC末端のいずれかのアミノ酸残基をこれらのモチーフのいずれかの側に含む実施形態が望ましくあり得る(例えば、モチーフが配置されるポリペプチド構造のより多くの部分を含むために)。代表的には、モチーフのいずれかの側のN末端および/またはC末端アミノ酸残基の数は、約5〜約50個の間のアミノ酸残基であり得る。
【0067】
このような実施形態の例示的な例としては、SIRおよび/またはSIGEおよび/またはNHSD(配列番号2)からなる群から選択される1以上のモチーフを有するポリペプチドが挙げられる。あるいは、本明細書中に開示される生物学的モチーフの他の組合せを有するポリペプチドがまた、意図される(例えば、SIRおよび他の生物学的モチーフの任意の1つ(例えば、SIGE)を有するポリペプチドまたはTYDDおよび他の生物学的モチーフの任意の1つ(例えば、GGGRSK)を有するポリペプチドなど)(配列番号2)。
【0068】
上記の1以上の36P6D5モチーフからなるポリペプチドは、上記の36P6D5モチーフが増殖調節不全に関係するという観察において、そして36P6D5が癌において過剰発現されるので、悪性の表現型の特定の特性を明らかにする際に有用である(図4、6および7)。例としてのカゼインキナーゼIIおよびタンパク質キナーゼCは、悪性の表現型の発生に関係すると知られている酵素である(例えば、Chenら、1998、Lab Invest.、78(2):165−174;Gaiddonら、1995、Endocrinology 136(10):4331−4338;Hallら、1996、Nucleic Acid Research 24(6):1119−1126;Peterzielら、1999、Oncogene 18(46):6322−6329;およびO’Brain、1998、Oncol.Rep.5(2):305−309を参照のこと)。さらに、グリコシル化とミリストイル化の両方はまた、癌および癌の進行に関連するタンパク質修飾である(例えば、Dennisら、1999、Biochim.Biophys.Acta 1473(1):21−34;Rajuら、1997、Exp.Cell Res.235(1):145−154を参照のこと)。
【0069】
以前の段落のポリペプチドは、多くの異なる特定の用途を有する。36P6D5は、種々の癌(腎臓癌、前立腺癌、膀胱癌、卵巣癌、乳癌、膵臓癌、結腸癌および肺癌を含む)の細胞株および/または患者のサンプルにおいて発現することが示されるので(例えば、図4、6および7を参照)、これらのポリペプチドは、正常組織 対 癌性組織における36P6D5遺伝子産物の状態を評価し、そして悪性の表現型を明らかにする方法において使用され得る。代表的には、36P6D5タンパク質の特定の領域をコードするポリペプチドは、36P6D5遺伝子産物の特定の領域(例えば、RNA結合モチーフを含む領域)において、摂動(例えば、欠失、挿入、点変異など)の存在を評価するために使用され得る。例示的なアッセイは、正常組織 対 癌性組織におけるこの領域の特性を評価するために、36P6D5ポリペプチド配列内に含まれる1以上の生物学的モチーフのアミノ酸残基を含む36P6D5ポリペプチドを標的化する抗体を使用し得る。あるいは、36P6D5ポリペプチド配列内に含まれる1以上の生物学的モチーフのアミノ酸残基を含む36P6D5ポリペプチドは、36P6D5のこの領域と相互作用する因子についてスクリーニングするために使用され得る。
【0070】
上で論じられるように、遺伝子暗号における重複性は、36P6D5遺伝子配列におけるバリエーションを可能とする。具体的には、当業者は、特定の宿主種による特定のコドンの優先度を認識し、そして所望の宿主に対して好ましいとして、開示された配列を適用し得る。例えば、好ましいコドン配列は、典型的に、より高頻度のコドンで置換される珍しいコドン(すなわち、所望の宿主の公知の配列において、約20%未満の使用頻度を有するコドン)を有する。特定の生物に対するコドン優先度は、例えば、以下のアドレスでインターネット上で利用可能なコドン使用頻度表を利用することによって計算され得る:http://www.dna.affrc.go.jp/〜nakamura/codon.html.。約20%未満の使用頻度を有する任意のコドンを置換することによって特定の宿主種に対して最適化されたヌクレオチド配列は、本明細書中で「コドン最適化配列」という。
【0071】
細胞宿主においてタンパク質発現を増強するためのさらなる配列修飾は、公知である。これらは、偽のポリアデニル化シグナル、エキソン/イントロンスプライス部位シグナル、トランスポゾン様反復をコードする配列および/または遺伝子発現に対して有害であり得るような他の十分に特徴付けられた配列の排除を含む。この配列のGC含量は、宿主細胞において発現される公知の遺伝子に対する参照によって計算される場合、所定の細胞宿主に対して平均のレベルに調整され得る。可能な場合、この配列はまた、予測されるヘアピン二次mRNA構造を避けるために修飾され得る。他の有用な改変は、Kozak、1989、Mol.Cell Biol.、9:5073−5080に記載されるように、オープンリーディングフレームの開始での翻訳開始コンセンサス配列の付加を含む。偽のポリアデニル化配列の排除、エキソン/イントロンスプライシングシグナルの排除、トランスポゾン様反復の排除および/またはコドン最適化に加えてのGC含量の最適化によって所定の宿主種において発現に対して最適化されたヌクレオチド配列は、本明細書中で「発現増強配列」という。
【0072】
36P6D5タンパク質は、多くの形態で、好ましくは、単離された液体で、具体化され得る。本明細書中で使用される場合、タンパク質は、物理的、機械的または化学的方法が利用され、通常36P6D5タンパク質と結合する細胞成分から36P6D5タンパク質を除去する場合、「単離」されるといわれる。当業者は、標準的な精製方法を容易に用いて、単離された36P6D5タンパク質を得ることができる。精製された36P6D5タンパク質分子は、抗体または他のリガンドメインへの36P6D5の結合を減少させるほかのタンパク質または分子が実質的にない。単離および精製の性質および程度は、意図される用途に依存する。36P6D5タンパク質の実施形態は、精製された36P6D5タンパク質および機能的な可溶性タンパク質を含む。1つの形態において、このような機能的な可溶性36P6D5タンパク質またはそれらのフラグメントは、抗体または他のリガンドメインに結合する能力を保持する。
【0073】
本発明はまた、36P6D5アミノ酸配列の生物学的に活性なフラグメントを含む36P6D5ポリペプチド(例えば、配列番号2に示されるような36P6D5に対するアミノ酸配列の部分に対応するポリペプチド)を提供する。本明細書中のこのようなポリペプチドは、36P6D5タンパク質の性質(例えば、36P6D5タンパク質に結合するエピトープに特異的に結合する抗体の生成を誘発する能力)を示す。
【0074】
36P6D5ポリペプチドは、本明細書中に開示されるヒト36P6D5タンパク質のアミノ酸配列に基づいて、当該分野において周知の、標準的なペプチド合成技術を使用して、または化学切断方法を使用して生成され得る。あるいは、組換え方法を使用して、36P6D5タンパク質のポリペプチドフラグメントをコードする核酸分子を生成し得る、この点において、本明細書中に記載される36P6D5コード核酸分子は、36P6D5タンパク質の規定のフラグメントを生成するために手段を提供する。36P6D5ポリペプチドは、ドメイン特異的抗体(例えば、36P6D5タンパク質の細胞外エピトープおよび細胞内エピトープを認識する抗体)の生成および特徴付け、36P6D5またはその特定の構造ドメインに結合する薬剤または細胞因子の同定、および種々の治療状況(癌ワクチンを含むが、これらに限定されない)において、特に有用である。
【0075】
特定の興味深い構造を含む36P6D5ポリペプチドは、例えば、以下:Chou−Fasman、Garnier−Robson、Kyte−Doolittle、Eisenberg、Karplus−SchultzまたはJameson−Wolf分析の方法を含む、当該分野で周知の種々の分析技術を使用するか、または免疫原性に基づいて、予測および/または同定され得る。このような構造を含むフラグメントは、サブユニット特異的抗36P6D5抗体の生成において、または36P6D5に結合する細胞因子の同定において、特に有用である。
【0076】
以下の実施例に記載される実施形態において、36P6D5は、C末端6×HisおよびMYCタグ(pcDNA3.1/mycHIS、Imvitrogen)またはTag5(GenHunter Corporation、Nashville TN)を有する、36P6D5をコードするCMV駆動発現ベクターのような市販の発現ベクターでトランスフェクトされた細胞(例えば、293T細胞)において、簡便に発現され得る。このTag5ベクターは、IgGK分泌シグナル(これは、トランスフェクトされた細胞において分泌36P6D5タンパク質の産生を容易にするために用いられ得る)を提供する。培養培地中の分泌されたHISタグ化PSCAは、標準的な技術を使用して、ニッケルカラムを使用して精製され得る。
【0077】
36P6D5の改変(例えば、共有結合性改変)は、本発明の範囲内に含まれる。1つの型の共有結合性改変としては、36P6D5の選択された側鎖あるいはN末端残基またはC末端残基と反応し得る有機誘導体化薬剤での、36P6D5ポリペプチドの標的化されたアミノ酸残基の反応が挙げられる。本発明の範囲内の36P6D5ポリペプチドの別の型の共有結合性改変としては、このポリペプチドのネイティブなグリコシル化パターンの変更が挙げられる。「ネイティブなグリコシル化パターンの変更」は、本明細書中の目的のために、ネイティブ配列36P6D5に見い出される1以上の糖質部分の欠失(基礎となるグリコシル化部位の除去、または化学的手段および/または酵素的手段によるグリコシル化の欠失のいずれかによって)、および/またはネイティブ配列36P6D5に存在しない、1以上のグリコシル化部位の付加を意味することが意図される。さらに、この句は、存在する種々の糖質部分の性質および割合の変更を含む、ネイティブタンパク質のグリコシル化の質的変化を含む。36P6D5の別の型の共有結合性改変としては、米国特許第4,640,835号、同第4,496,689号、同第4,301,144号、同第4,670,417号、同第4,791,192号または同第4,179,337号に示されるような様式の、種々の非タンパク質様ポリマー(例えば、ポリエチレングリコール(PEG)、ポリプロピレングリコールまたはポリオキシアルキレン)のうちの1つへの、36P6D5ポリペプチドの連結が挙げられる。
【0078】
本発明の36P6D5はまた、別の異種ポリペプチドまたはアミノ酸配列に融合された36P6D5を含むキメラ分子を形成する様式で、改変され得る。1つの実施形態において、このようなキメラ分子としては、ポリヒスチジンエピトープタグを有する36P6D5の融合体が挙げられ、このタグは、固定されたニッケルが選択的に結合し得るエピトープを提供する。このエピトープタグは、一般に、36P6D5のアミノ末端またはカルボキシル末端に配置される。代替的実施形態において、このキメラ分子は、36P6D5の免疫グロブリンまたは免疫グロブリンの特定の領域との融合体を含み得る。キメラ分子の二価形態(「免疫付着因子(immunoadhesin)」とも呼ばれる)について、このような融合体は、IgG分子のFc領域に対するものであり得る。このIg融合体は、好ましくは、Ig分子内の少なくとも1つの可変領域の代わりに、36P6D5ポリペプチドの可溶性(膜貫通ドメインを欠失または不活性化した)形態での置換を含む。特に好ましい実施形態において、免疫グロブリン融合体は、IgGI分子のヒンジ領域、CH2領域およびCH3領域、またはヒンジ領域、CH1領域、CH2領域およびCH3領域を含む。免疫グロブリン融合体の産生については、米国特許第5,428,130号(1995年6月27日公布)もまた参照のこと。
【0079】
(36P6D5抗体)
用語「抗体」は、最も広範な意味で用いられ、そして具体的には、単一の抗36P6D5モノクローナル抗体(アゴニスト、アンタゴニストおよび中和抗体を含む)およびポリエピトープ性(polyepitopic)特異性を有する抗36P6D5抗体組成物を網羅する。本明細書中で使用される場合、用語「モノクローナル抗体」(mAb)は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体をいう。すなわち、この抗体を含有する個々の集団は、少量で存在し得る、可能な天然に存在する変異体を除いて同一である。
【0080】
本発明の別の局面は、36P6D5タンパク質およびポリペプチドに結合する抗体を提供する。最も好ましい抗体は、36P6D5タンパク質に対して特異的に結合し、そして非36P6D5タンパク質およびポリペプチドに対しては結合しない(または弱く結合する)。特に意図される抗36P6D5抗体として、モノクローナルおよびポリクローナル抗体、ならびにこれらの抗体の抗原結合ドメインおよび/または1つ以上の相補性決定領域を含有しているフラグメントが挙げられる。本明細書中で使用される場合は、抗体フラグメントは、その標的(すなわち、抗原結合領域)に対して結合する免疫グロブリン分子の可変領域の少なくとも一部として定義される。
【0081】
本発明の36P6D5抗体は、前立腺癌診断アッセイおよび前立腺癌予後アッセイ、ならびに画像化法において特に有用であり得る。細胞内発現された抗体(例えば、単鎖抗体)は、36P6D5の発現が関与する癌(例えば、進行性前立腺癌および転移性前立腺癌)を処置する際に、治療的に有用であり得る。このような抗体は、36P6D5がまた、他の型の癌(例えば、前立腺癌、肝臓癌、腎臓癌、膀胱癌、卵巣癌、乳癌、膵臓癌、結腸癌および肺癌)において発現または過剰発現される限り、これらの他の癌の処置、診断および/または予後において有用であり得る。
【0082】
36P6D5抗体はまた、例えば、36P6D5タンパク質の生物学的活性を調節するかもしくは阻害することによるか、または36P6D5タンパク質もしくは36P6D5結合パートナーを発現する癌細胞を標的化するかもしくは破壊することにより、治療的に使用され得る。36P6D5は、分泌タンパク質であるので、抗体は、そのレセプターに結合する36P6D5の能力、またはそれを介してその生物学的活性を示す他のタンパク質と相互作用する36P6D5の能力をブロックするために治療的に有用であり得る。
【0083】
本発明はまた、36P6D5および変異体36P6D5のタンパク質およびポリペプチドの、検出および定量に有用な種々の免疫学的アッセイを提供する。このような方法およびアッセイは、一般に、適切には、36P6D5または変異体36P6D5タンパク質を認識および結合し得る、1以上の36P6D5抗体を含み、そして、以下を含むが、これらに限定されない当該分野で周知の種々の免疫学的アッセイ形式で行われ得る:種々の型のラジオイムノアッセイ、酵素連結免疫吸着アッセイ(ELISA)、酵素連結免疫蛍光アッセイ(ELIFA)など。さらに、36P6D5を発現する前立腺癌および他の癌を検出し得る、免疫学的画像化方法もまた、本発明によって提供され、これらには、標識した36P6D5抗体を使用するラジオシンチグラフィー画像化方法が挙げられるが、これらに限定されない。このようなアッセイは、36P6D5を発現する癌(例えば、前立腺癌細胞株、乳癌、膵臓癌細胞株、結腸癌細胞株および卵巣癌細胞株)の検出、モニタリングおよび予後において、臨床的に有用であり得る。
【0084】
36P6D5抗体はまた、36P6D5および変異体36P6D5のタンパク質およびポリペプチドの精製、ならびに36P6D5ホモログおよび関連分子の単離のための方法において使用され得る。例えば、1つの実施形態において、36P6D5タンパク質を精製する方法は、36P6D5抗体(これは、固体マトリックスに結合されている)を、36P6D5を含有する溶解産物または他の溶液と共に、この36P6D5抗体が36P6D5に結合するのを可能にする条件下でインキュベートする工程;固体マトリックスを洗浄して不純物を除去する工程;および36P6D5をその結合された抗体から溶出する工程を包含する。本発明の36P6D5抗体の他の用途としては、36P6D5タンパク質を模倣する抗イディオタイプ抗体の生成が挙げられる。
【0085】
抗体の調製のための種々の方法が、当該分野で周知である。例えば、抗体は、単離または免疫結合体化された形態の、36P6D5のタンパク質、ペプチドまたはフラグメントを使用して、適切な哺乳動物宿主を免疫することによって調製され得る(HarlowおよびLane編,1988,Antibodies:A Laboratory Manual,CSH Press;Harlow,1989,Antibodies,Cold Spring Harbor Press,NY(1989))。さらに、36P6D5の融合タンパク質(例えば、36P6D5 GST融合タンパク質)もまた使用され得る。特定の実施形態において、配列番号2のオープンリーディングフレームアミノ酸配列の全てまたはほとんどを含むGST融合タンパク質が生成され得、そして適切な抗体を生成するための免疫原として使用され得る。別の実施形態では、36P6D5ペプチドは、合成され得、そして免疫原として使用され得る。
【0086】
さらに、当該分野で公知の裸のDNA免疫化技術を(精製36P6D5タンパク質または36P6D5発現細胞を用いてかまたは用いずに)使用して、コードされる免疫原に対する免疫応答を生じさせ得る(概説については、Donnellyら,1997,Ann.Rev.Immunol.15:617〜648を参照のこと)。
【0087】
配列番号2に示されるような36P6D5のアミノ酸配列を使用して、抗体を生成するために36P6D5タンパク質の特定の領域を選択し得る。例えば、36P6D5アミノ酸配列の疎水性および親水性分析を使用して、36P6D5構造の疎水性領域を同定し得る。免疫原性構造を示す36P6D5タンパク質の領域、ならびに他の領域およびドメインは、以下のような当該分野で公知の種々の他の方法を使用して容易に同定され得る:Chou−Fasman、Garnier−Robson、Kyte−Doolittle、Eisenberg、Karplus−SchultzまたはJameson−Wolf分析。
【0088】
このことを例示して、ヒトMHCクラスI分子HLA−A2へ36P6D5タンパク質由来のペプチドの結合を推定し、そして以下の表1に示す。具体的には、36P6D5タンパク質の完全アミノ酸配列を、Bioinformatics and Molecular Analysis Section(BIMAS)ウェブサイト(http://bimas.dcrt.nih.gov/)に見出されるHLA Peptide Motif Searchアルゴリズムに入力した。このHLA Peptide Motif Searchアルゴリズムは、Ken Parker博士により開発され、HLAクラスI分子の溝、および特に、HLA−A2中の特異的なペプチド配列の結合に基づく(例えば、Falkら、Nature 351:290−6(1991);Huntら、Science 255:1261−3(1992);Parkerら、J.Immunol.149:3580−7(1992);Parkerら、J.Immunol.152:163−75(1994)を参照のこと)。このアルゴリズムは、HLA−A2ならびに他のHLAクラスI分子に対する推定される結合のための完全なタンパク質配列に由来する、8マー、9マー、および10マーのペプチドの位置決定およびランキングを可能にする。ほとんどのHLA−A2結合ペプチドが9マーであり、好ましくは、2位にロイシン(L)、そして9位にバリン(V)またはロイシン(L)を含有する(Parkerら、1992、J.Immunol.149:3580−7)。36P6D5推定結合ペプチドの結果を、以下の表1に示す。表1では、各ファミリーのメンバーについて上位10の順位の候補物が、その位置、各特定のペプチドのアミノ酸配列、および推定結合スコアと共に示される。結合スコアは、37℃(pH6.5)でのペプチド含有複合体の解離の推定半減期に対応する。最も高い結合スコアを有するペプチドは、細胞表面上のHLAクラスIへ最も密に結合しそれによりT細胞認識について最も良好な免疫原性標的を提示すると推定される。HLA−A2へのペプチドの実際の結合は、抗原プロセシング欠損細胞株T2上でのHLA−A2の発現の安定化によって評価され得る(例えば、Xueら、Prostate 30:73−8(1997)およびPeshwaら、Prostate 36:129−38(1998)を参照のこと)。特異的なペプチドの免疫原性は、樹状細胞の存在下でのCD8+脂肪障害性Tリンパ球(CTL)の刺激によってインビトロで評価され得る。
【0089】
免疫原としての使用のためのタンパク質またはポリペプチドを調製するための方法、およびキャリア(例えば、BSA、KLHまたは他のキャリアタンパク質)とのタンパク質の免疫結合体を調製するための方法は、当該分野で周知である。いくつかの状況下で、例えば、カルボジイミド試薬を使用する直接的な結合体が使用され得;他の例において、連結試薬(例えば、Pierce Chemical Co.,Rockford,ILによって供給される連結試薬)が、効果的であり得る。36P6D5免疫原の投与は一般に、当該分野で一般に理解されるように、適切な期間にわたって、適切なアジュバントの使用を伴う注射によって行われ得る。免疫スケジュールの間、抗体の力価は、抗体形成の能力(adequacy)を決定することによって理解され得る。
【0090】
36P6D5モノクローナル抗体が好ましく、そして当該分野で周知の種々の手段によって産生され得る。例えば、所望のモノクローナル抗体を分泌する不死化細胞株が、一般に公知のように、KohlerおよびMilsteinの標準的なハイブリドーマ技術、または産生性(producing)B細胞を不死化する改変を使用して調製され得る。所望の抗体を分泌する不死化細胞株は、抗原が36P6D5タンパク質または36P6D5フラグメントである免疫アッセイによってスクリーニングされる。所望の抗体を分泌する適切な不死化細胞培養物が同定される場合、これらの細胞を展開し、そしてインビトロ培養物または腹水のいずれかから抗体が産生され得る。
【0091】
抗体またはフラグメントはまた、現在の技術を使用して、組換え手順によって産生され得る。36P6D5タンパク質の所望の領域に特異的に結合する領域はまた、複数の種起源のキメラ抗体またはCDRグラフト化抗体の状況下で産生され得る。ヒト化36P6D5抗体またはヒト36P6D5抗体もまた産生され得、そして治療的状況下での使用のために好ましい。1以上の非ヒト抗体CDRを対応するヒト抗体配列と置換することによる、マウス抗体および他の非ヒト抗体をヒト化するための方法は、周知である(例えば、Jonesら、1986、Nature 321:522−525;Riechmannら、1988、Nature 332:323−327;Verhoeyenら、1988、Science 239:1534−1536を参照のこと)。Carterら、1993、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:4285、およびSimsら、1993、J.Immunol.151:2296もまた参照のこと。完全なヒトモノクローナル抗体を産生するための方法としては、ファージディスプレイ法およびトランスジェニック動物法が挙げられる(概要について、Vaughanら、1998、Nature Biotechnology 16:535−539を参照のこと)。
【0092】
完全なヒト36P6D5モノクローナル抗体は、大きいヒトIg遺伝子コンビナトリアルライブラリー(すなわち、ファージディスプレイ)を使用するクローニング技術を使用して生成され得る(Clark,M.編,1993,Protein Engineering of Antibody Molecules for Prophylactic and Therapeutic Applications in Man,Nottingham Academic、45−64頁のGriffithsおよびHoogenboom、Building an in vitro immune system:human antibodies from phage display libraries;BurtonおよびBarbas、Human Antibodies from combinatorial libraries(同書)65−82頁)。完全なヒト36P6D5モノクローナル抗体はまた、PCT特許出願WO98/24893(KucherlapatiおよびJakobovitsら、1997年12月3日公開)に記載されるように、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を含むように操作されたトランスジェニックマウスを使用して産生され得る(Jakobovits、1998、Exp.Opin.Invest.Drugs 7(4):607−614もまた参照のこと)。この方法は、ファージディスプレイ技術に必要とされるインビトロ操作を回避し、そして高親和性の真正ヒト抗体を効率的に産生する。
【0093】
36P6D5抗体の36P6D5タンパク質との反応性は、適切には、36P6D5タンパク質、36P6D5ペプチド、36P6D5発現細胞またはその抽出物を使用する、多くの周知の手段(ウエスタンブロット、免疫沈降、ELISAおよびFACS分析を含む)によって確証され得る。
【0094】
本発明の36P6D5抗体またはそのフラグメントは、選択マーカーで標識化されるか、または第2の分子に結合体化され得る。適切な検出マーカーとしては、放射性同位体、蛍光化合物、生物発光化合物、化学発光化合物、金属キレート剤または酵素が挙げられるがこれらに限定されない。36P6D5抗体に結合体化するために第2の分子は、意図された使用に従って選択され得る。例えば、治療用途については、第2分子は、毒物または治療剤であり得る。さらに、2以上の36P6D5エピトープに特異的な二特異的抗体が、当該分野で一般に公知の方法を使用して生成され得る。ホモ二量体抗体もまた、当該分野で公知の架橋技術によって生成され得る(例えば、Wolffら、1993,Cancer Res.53:2560−2565)。
【0095】
(36P6D5トランスジェニック動物)
36P6D5またはその改変形態をコードする核酸はまた、トランスジェニック動物または「ノックアウト」動物のいずれかを生成するために使用され得、これらの動物は、次いで、治療的に有用な試薬の開発およびスクリーニングにおいて有用である。トランスジェニック動物(例えば、マウスまたはラット)は、導入遺伝子を含む細胞を有する動物であり、その導入遺伝子は、その動物に、または出生前(例えば、胚段階)でその動物の祖先に導入される。導入遺伝子は、細胞のゲノム内に組み込まれるDNAであり、トランスジェニック動物は、その細胞から発生する。1つの実施形態において、36P6D5をコードするcDNAが、確立された技術に従って、36P6D5コードするゲノムDNAをクローニングするために使用され得、そしてそのゲノム配列は、36P6D5をコードするDNAを発現する細胞を含むトランスジェニック動物を生成するために使用され得る。トランスジェニック動物(特に、マウスまたはラットのような動物)を生成するための方法は、当該分野で慣用的となり、そして例えば、米国特許第4,736,866号および4,870,009号に記載される。代表的に、特定の細胞が、組織特異的エンハンサーと共に36P6D5導入遺伝子の組み込みのために標的化される。胚段階の動物の生殖系列に導入された、36P6D5をコードする1コピーの導入遺伝子を含むトランスジェニック動物を使用して、36P6D5をコードするDNAの発現の増大の効果を試験し得る。このような動物は、例えば、その過剰発現と関連する病理学的状態からの防御を付与すると考えられる試薬についての、試験動物として使用され得る。本発明のこの局面に従って、動物をその試薬で処置し、そしてこの導入遺伝子を保有する処置していない動物と比較した、その病理学的状態の発生率の減少は、その病理学的状態についての潜在的な治療的介入を示す。
【0096】
あるいは、36P6D5の非ヒトホモログを使用して、36P6D5「ノックアウト」動物を構築し得、この動物は、36P6D5をコードする内因性遺伝子とその動物の胚細胞に導入された36P6D5をコードする改変ゲノムDNAと間の相同組換えの結果として、36P6D5をコードする欠損性または改変型遺伝子を有する。例えば、36P6D5をコードするcDNAを使用して、確立された技術に従って、36P6D5をコードするゲノムDNAをクローニングし得る。36P6D5をコードするゲノムDNAの一部は、欠失され得るか、または別の遺伝子(例えば、組み込みをモニターするために使用され得る、選択マーカーをコードする遺伝子)で置換され得る。代表的に、数キロベースの変更されていない隣接DNA(5’末端および3’末端の両方)が、そのベクターに含まれる(相同組換えベクターの記載については、例えば、ThomasおよびCapecchi、1987、Cell、51:503を参照のこと)。このベクターは、胚性幹細胞株に(例えば、エレクトロポレーションによって)注入され、そして導入されたDNAが内因性のDNAと相同組換えした細胞が、選択される(例えば、Liら、Cell、1992、69:915を参照のこと)。次いで、この選択された細胞を、動物(例えば、マウスまたはラット)の胚盤胞に導入し、凝集キメラを形成させる(例えば、Bradley、Robertson編,1987(Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells:A Practical Approach、IRL,Oxford)、113−152頁を参照のこと)。次いで、キメラ性の胚を、適切な偽妊娠雌性養母動物に移植し、そしてその胚は、満期まで育成させて、「ノックアウト」動物を作製し得る。生殖細胞中に相同組換えされたDNAを有する子孫は、標準的な技術によって同定され得、そしてその子孫を用いて、全ての細胞が相同組換えDNAを含む動物を育種し得る。ノックアウト動物は、例えば、36P6D5ポリペプチドの非存在に起因する、特定の病理学的状態に対して防御する能力および病理学的状態の発生について、特徴付けられ得る。
【0097】
(36P6D5の検出のための方法)
本発明の別の局面は、36P6D5ポリヌクレオチドおよび36P6D5タンパク質ならびにそれらの改変体を検出するための方法、ならびに36P6D5を発現する細胞を同定するための方法に関する。36P6D5の発現プロフィールは、それを遺伝子座および/または転移された疾患についての潜在的な診断マーカーにする。この状況において、36P6D5遺伝子産物の状態は、進行した状態の疾患に対する感受性、進行速度および/または腫瘍の凝集性を含む、種々の因子を予測するために有用な情報を提供し得る。以下で詳細に議論されるように、患者サンプル中の36P6D5遺伝子産物の状態は、以下を含む当該分野で周知の種々のプロトコルによって分析され得る:免疫組織化学分析、インサイチュハイブリダイゼーションを含む種々のノーザンブロット技術、RT−PCR分析(例えば、レーザー捕捉微小分析サンプルに対して)、ウエスタンブロット分析および組織アレイ分析。
【0098】
より詳細には、本発明は、生物学的サンプル(例えば、血清、骨、前立腺および他の組織、尿、精液、細胞調製物など)中の36P6D5ポリヌクレオチドの検出のためのアッセイを提供する。検出可能な36P6D5ポリヌクレオチドとしては、例えば、36P6D5遺伝子またはそのフラグメント、36P6D5 mRNA、選択的スプライシング改変体36P6D5 mRNA、および36P6D5ポリヌクレオチドを含む組換えDNAもしくはRNA分子が挙げられる。36P6D5ポリヌクレオチドを増幅し、そして/または36P6D5ポリヌクレオチドの存在を検出するための多くの方法は、当該分野において周知であり、そして本発明のこの局面の実施に用いられ得る。
【0099】
1つの実施形態において、生物学的サンプル中の36P6D5 mRNAを検出するための方法は、少なくとも1つのプライマーを使用して、逆転写によってサンプルからcDNAを産生する工程;その中の36P6D5 cDNAを増幅するために、センスおよびアンチセンスのプライマーとして36P6D5ポリヌクレオチドを使用して、そのように産生されたcDNAを増幅する工程;および増幅された36P6D5 cDNAの存在を検出する工程、を包含する。必要に応じて、増幅された36P6D5 cDNAの配列が、決定され得る。別の実施形態において、生物学的サンプル中の36P6D5遺伝子を検出する方法は、サンプルからゲノムDNAを最初に単離する工程;その中の36P6D5遺伝子を増幅するために、センスおよびアンチセンスのプライマーとして36P6D5ポリヌクレオチドを使用して単離されたゲノムDNAを増幅する工程;および増幅された36P6D5遺伝子の存在を検出する工程、を包含する。任意の多くの適切なセンスプローブおよびアンチセンスプローブの組合せが、36P6D5について提供されるヌクレオチド配列(配列番号1)から設計され、そしてこの目的のために使用され得る。
【0100】
本発明はまた、他の生物学的サンプルの組織(例えば、血清、骨、前立腺、および他の組織、尿、細胞調製物など)中の36P6D5タンパク質の存在を検出するためのアッセイを提供する。36P6D5タンパク質を検出するための方法もまた、周知であり、そして例えば、免疫沈降、免疫組織化学分析、ウエスタンブロット分析、分子結合アッセイ、ELISA、ELIFAなどが挙げられる。例えば、1つの実施形態において、生物学的サンプル中の36P6D5タンパク質の存在を検出する方法は、36P6D5抗体、その36P6D5反応性フラグメント、または36P6D5抗体の抗原結合領域を含む組換えタンパク質と、サンプルとを最初に接触させる工程;次いで、それに対するサンプル中の36P6D5タンパク質の結合を検出する工程、を包含する。
【0101】
36P6D5を発現する細胞を同定するための方法もまた、提供される。1つの実施形態において、36P6D5遺伝子を発現する細胞を同定するためのアッセイは、細胞中の36P6D5 mRNAの存在を検出するための工程を包含する。細胞中の特定のmRNAを検出するための方法は、周知であり、そして例えば、相補DNAプローブを使用するハイブリダイゼーションアッセイ(例えば、標識された36P6D5リボプローブを使用するインサイチュハイブリダイゼーション、ノーザンブロットおよび関連技術)ならびに種々の核酸増幅アッセイ(例えば、36P6D5に特異的な相補プライマーを使用するRT−PCR、および例えば、分岐DNA、SISBA、TMAなどの他の増幅型検出方法)が挙げられる。あるいは、36P6D5遺伝子を発現する細胞を同定するためのアッセイは、細胞中の36P6D5Sタンパク質または細胞によって分泌された36P6D5タンパク質の存在を検出する工程を包含する。タンパク質を検出するための種々の方法が、当該分野において周知であり、そして36P6D5タンパク質および36P6D5発現細胞の検出のために用いられ得る。
【0102】
36P6D5発現分析はまた、36P6D5遺伝子発現を調節する因子を同定かつ評価するためにツールとして有用であり得る。例えば、36P6D5発現は、前立腺癌において有意にアップレギュレートされ、そして36P6D5はまた、他の癌において発現され得る。癌細胞での36P6D5発現または過剰発現を阻害し得る分子または生物学的因子の同定は、治療上の価値があり得る。このような因子は、RT−PCR、核酸ハイブリダイゼーションまたは抗体結合によって36P6D5発現を定量するスクリーニングを使用することにより、同定され得る。
【0103】
(循環性36P6D5および排出された36P6D5についてのアッセイ)
成熟36P6D5タンパク質は、ORFをコードするcDNA中のN末端シグナル配列を含有する。36P6D5は、膵臓癌、肝臓癌、膀胱癌、乳癌、結腸癌、卵巣癌、膵臓癌およびおそらく他の癌において発現される分泌タンパク質であるので、36P6D5を発現する腫瘍は、血管へ36P6D5を分泌すること、そして/または尿もしくは血清へ排出されることが予想され、ここでは、このタンパク質は、分子診断分野において周知のアッセイおよび技術を使用して、検出および定量され得る。循環性36P6D5または排出された36P6D5のレベルを検出および定量することは、36P6D5を発現する癌(これらとしては、前立腺癌、肝臓癌、膀胱願、乳癌、結腸癌、卵巣癌および膵臓癌が挙げられるが、これらに限定されない)の診断、病期分類および予後における多くの用途を有することが予想される。血清、尿、精液中のタンパク質の検出および定量のための、異なる多くの技術的なアプローチが、当該分野で周知である。
【0104】
36P6D5は、前立腺癌、肝臓癌、膀胱願、乳癌、結腸癌、卵巣癌、膵臓癌およびおそらく他の癌において発現される分泌タンパク質であるので、血液または血清中の36P6D5を検出および定量するためのアッセイは、個体における36P6D5を発現する癌の検出、診断、予後および/または病期分類のために有用であることが予想される。例えば、正常な組織における36P6D5発現は、膵臓において主に見出され(図3)、これは、前立腺および小腸において検出されるよりも低いレベルの36P6D5発現を有する。しかし、高レベルの発現は、前立腺癌由来の移植片、ならびに乳癌、結腸癌、膵臓癌および卵巣癌由来の細胞株において検出される(図4)。従って、血清36P6D5の検出は、前立腺癌、乳癌、結腸癌、卵巣癌または膵臓癌の存在の指標を提供し得る。癌の診断は、この情報および/または他の情報に基づいて為され得る。例えば、前立腺癌に関して、このような他の情報としては、血清PSA測定、DREおよび/または超音波検査が挙げられ得る。さらに、血清において検出される36P6D5のレベルは、病期分類または予後において有能な情報を提供し得る。例えば、図9および10において提示されるデータにより支持されるように、細胞集団が、支質および微小血管を介して展開および増殖する場合、より高いレベルの36P6D5が、血清において観察されると予想される。これに関連して、血清中の非常に高いレベルの36P6D5タンパク質が、より大きなおよび/またはより進行性の腫瘍を示唆し得る。
【0105】
さらに、末梢血および骨髄は、36P6D5発現を検出するためにRT−PCRを使用して、36P6D5タンパク質および/または36P6D5発現癌細胞(前立腺癌、膀胱癌、結腸癌、膵臓癌、肝臓癌および卵巣癌が挙げられるが、これらに限定されない)の存在について都合良くアッセイされ得る。RT−PCR増幅可能な36P6D5 mRNAの存在は、癌の存在の指標を提供する。末梢血中の腫瘍細胞についてのRT−PCR検出アッセイは、多くのヒト固体腫瘍の診断および管理における用途について現在評価されている。前立腺癌の分野では、これらとしては、PSAおよびPSMを発現する細胞の検出についてのRT−PCRアッセイが挙げられる(Verkaikら,1997,Urol.Res.25:373〜384;Ghosseinら,1995,J.Clin.Oncol.13:1195〜2000;Hestonら,1995,Clin.Chem.41:1687〜1688)。RT−PCRアッセイは、当該分野で周知である。
【0106】
1つの実施形態では、捕獲ELISAは、血清、尿または精液中の36P6D5を検出しそして定量するために使用される。36P6D5についての捕獲ELISAは、該して、36P6D5タンパク質の異なるエピトープを認識する少なくとも2種類の異なる型のモノクローナル抗体、または1種類の抗36P6D5モノクローナル抗体および異なる種(例えば、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ハムスターなど)由来の特異的なポリクローナル血清を含む。このアッセイでは、1種類の試薬が、捕獲(またはコーティング)抗体として作用し、そして他方が検出抗体として作用する。表2に示すように、膵臓由来の臨床的血清サンプルおよび膵臓、ならびに正常な雄のドナーを、上記および図10に記載するように捕獲ELISAを使用して、36P6D5タンパク質についてスクローニングした。PC−3−36P6D5およびDu4475細胞からの上性ならびにPC−3−neo細胞からの上清は、各々、36P6D5タンパク質検出についてポジティブコントロールおよびネガティブコントロールとして作用した。ND:検出されないか、または検出感度以下。36P6D5タンパク質を、7/10の結腸癌および6/10の膵臓癌患者において検出した。これらのうちの1つは、比較的高レベル(29.70ng/ml)を有したが、これは、1/6の正常な雄のドナーにおいてであった。関連した実施形態では、FACS分析は、36P6D5タンパク質を発現する細胞(例えば、疾患の局所部位を捕獲した細胞)および他の部位(例えば、リンパ系)へ移動した細胞の検出のために使用される。
【0107】
以下に詳細に議論されるように、36P6D5血清レベルを含む36P6D5のレベルは、36P6D5発現腫瘍の存在、程度および積極性の指標を提供するために使用され得る。記載されるように、上記36P6D5は、前立腺における、最も重要で、正確でそして臨床的に有用な生化学的マーカーであるPSAと、多くの特徴を共有する。前立腺の正常なアーキテクチャを崩壊させる任意のプロセスは、支質および微小血管へのPSAの拡散を可能にする。結果として、血清前立腺特異的抗原レベルの臨床学的に重要な増加が、前立腺癌で見られる。特に、より多くの悪性細胞および癌と関連する支質崩壊は、増加した血清前立腺特異的抗原レベルを説明する。これに関して、血清前立腺特異的抗原レベルは、臨床的段階、腫瘍容積、組織学的グレードならびに非膜穿孔および精液のベシクル浸潤と正相関する。例えば、Bostwick、D.G.Am.J.Clin.Pathol.102(4補完1):S31〜S37(1994)を参照のこと。
【0108】
36P6D5はまた、組織発現(前立腺を含む)の制限されたパターンを示す分泌分子であるので、類似分子としてPSAを使用して、悪性細胞の増加した負荷および癌において生じる支質崩壊は、血清36P6D5抗原レベルを1以上の臨床的に関連したファクター(例えば、臨床段階、腫瘍容積、組織学的グレードならびに被膜穿孔および精液ベシクル浸潤)と正相関させる。経時的な血清36P6D5測定は、さらなる情報を提供することが予想され、ここで36P6D5の増加は、進行を反映することが予想され、そして増加の速度は、積極性と相関することが予想される。同様に、血清36P6D5の減少は、より遅い増殖性腫瘍または消退型腫瘍を反映することが予想される。血清中の36P6D5の同定は、腫瘍イニシエーションまたは初期病期疾患を検出するために有用であり得る。手術または治療を受けている患者においては、血清36P6D5レベルは、処置応答および潜在的な再発をモニタリングするために有用である。
【0109】
(36P6D5およびその産物の状態のモニタリング)
個体中の36P6D5遺伝子および36P6D5遺伝子産物の状態を評価するアッセイは、この個体に由来する生物学的サンプルの増殖または腫瘍形成の可能性についての情報を提供し得る。例えば、36P6D5 mRNAが、正常前立腺組織と比較した場合に前立腺癌において高度に発現されるので、生物学的サンプル中の36P6D5 mRNA転写物またはタンパク質の相対的なレベルを評価するアッセイが、36P6D5の調節不全に関連する疾患(例えば、癌)を診断するために使用され得、そして適切な治療の選択を定義することにおいて有用な予後の情報を提供し得る。
【0110】
36P6D5は、例えば、種々の前立腺癌異種移植組織および癌細胞株、ならびに癌患者サンプルに発現されるので、36P6D5の発現状態は、形成異常な(displasic)前癌性細胞および癌性細胞の存在、段階、および位置を含む情報を決定するために、疾患の種々の段階に対する罹病性を推定するため、ならびに/または腫瘍侵略性を測定するために有用である情報を提供し得る。さらに、発現プロフィールは、これを転移疾患に関する強力な画像化試薬にする。結果として、本発明の重要な局面は、生物学的サンプル(例えば、調節不全細胞成長(例えば、癌)によって特徴付けられた病状を罹患するかまたは罹患している疑いのある個体由来のサンプル)における36P6D5の状態を試験するための、種々の分子予後方法および分子診断方法に関する。
【0111】
腫瘍形成は、細胞成長が漸進性に調節不全になり、そして細胞が正常な生理学的状態から前癌性状態、次いで癌性状態に進行する複数工程プロセスであることが知られている(例えば、Alersら、Lab Invest.77(5):437−438(1997)およびIsaacsら、Cancer Surv.2319−32(1995))。この状況において、調節不全細胞成長の証拠に関して生物学的サンプルを試験すること(例えば、前立腺癌における異常な36P6D5発現)は、癌のような病状が、治療選択がさらに限定される段階に進行する前に、このような異常な細胞生理機能の初期検出を可能にし得る。このような試験において、目的の生物学的サンプル(例えば、調節不全細胞成長を有することが疑われるサンプル)における36P6D5の状態は、例えば、対応する正常サンプル(例えば、病状がもたらされていない個体(例えば、調節不全細胞成長を有する疑いが無い個体)(あるいは別の個体)由来のサンプル)の36P6D5の状態と、目的の生物学的サンプル中の36P6D5の状態における変更に関して比較され得(正常なサンプルと比較される場合)、調節不全細胞増殖の証拠を提供する。正常サンプルのように病状がもたらされていない生物学的サンプルを用いることに加えて、mRNA発現の所定の正常レベルのような所定の標準値がまた、使用されて(例えば、Greverら、J.Comp.Neurol.1996 Dec 9;306−14および米国特許第5,837,501号を参照のこと)、36P6D5を正常 対 疑わしいサンプルにおいて比較する。
【0112】
用語「状態」は、この状況において、その当該分野で受け入れられた意味に従って使用され、そして遺伝子およびその産物の条件または状況をいう。本明細書中に詳細に記載されるように、36P6D5の状態は、当該分野で公知の多数のパラメーターによって評価され得る。代表的に、36P6D5の状態における変更は、36P6D5発現細胞の位置の変化および/または36P6D5 mRNA発現および/もしくは36P6D5タンパク質発現における増加を含む。
【0113】
代表的に、当業者は、多数のパラメーターを用いて遺伝子およびその産物の条件または状況を評価する。これらとしては、発現された遺伝子産物の位置(36P6D5発現細胞の位置を含む)ならびに発現された遺伝子産物(例えば、36P6D5 mRNA、ポリヌクレオチドおよびポリペプチド)のレベルおよび生物学的活性が挙げれるが、これらに限定されない。36P6D5の状態変更は、当該分野で周知の広範な種々の方法論によって評価され得、代表的には以下に議論されるものである。代表的に、36P6D5の状態変更は、36P6D5および/もしくは36P6D5発現細胞の位置変化、ならびに/または36P6D5 mRNA発現および/もしくは36P6D5 タンパク質発現における増加を含む。
【0114】
本明細書中に詳細に議論されるように、調節不全細胞成長と関連する状況または現象を同定するために、生物学的サンプル中の36P6D5の状態は、当業者によって使用される多数の方法によって評価され得、これには、ゲノムサザン分析(例えば、36P6D5遺伝子中の摂動を試験するために)、36P6D5 mRNAのノーザン分析および/またはPCR分析(例えば、36P6D5 mRNAのポリヌクレオチド配列または発現レベルにおける変更を試験するため)、およびウエスタン分析および/または免疫組織化学分析(例えば、ポリペプチド配列中の変更、サンプル中のポリペプチド局在における変更、36P6D5タンパク質の発現レベルの変更および/またはポリペプチド結合パートナーとの36P6D5タンパク質の結合を調べるため)が挙げられるが、これらに限定されない。検出可能な36P6D5ポリヌクレオチドとしては、例えば、36P6D5遺伝子またはそのフラグメント、36P6D5 mRNA、選択的スプライシング改変体36P6D5 mRNA、および36P6D5ポリヌクレオチドを含む組換えDNA分子もしくはRNA分子が挙げられる。
【0115】
36P6D5の発現プロフィールは、36P6D5を局所的な疾患および/または転移疾患に関する潜在的な診断マーカーにする。詳細には、36P6D5の状態は、特定の疾患の段階、進行、および/または腫瘍の積極性についての罹患性を推定するために有用な情報を提供し得る。本発明は、36P6D5の発現の状態を決定するため、ならびに36P6D5を発現する癌(例えば、前立腺癌、膀胱癌、膀胱癌、腎臓癌、卵巣癌、乳癌、膵臓癌、結腸癌、および肺癌のような癌)を診断するための、方法およびアッセイを提供する。患者のサンプル中の36P6D5の発現の状態は、当該分野で周知の多数の手段(免疫組織化学的分析、インサイチュハイブリダイゼーション、レーザー捕捉微小解剖サンプルについてのRT−PCR分析、臨床的なサンプルおよび細胞株についてのウェスタンブロット分析、ならびに組織アレイ分析を含むが、これらに限定されない)によって分析され得る。36P6D5遺伝子および遺伝子産物の状態を評価するための代表的なプロトコールは、例えば、Ausubelら編、1995、Current Protocols In Molecular Biology、Units 2(ノーザンブロッティング)、4(サザンブロッティング)、15(イムノブロッティング)、および18(PCR分析)に見出され得る。
【0116】
上記のように、生物学的サンプル中の36P6D5の状態は、多数の当該分野で周知の手順によって試験され得る。例えば、体の特定の位置から採取された生物学的サンプル中の36P6D5の状態は、36P6D5発現細胞(例えば、36P6D5 mRNAまたは36P6D5タンパク質を発現する細胞)の存在または非存在に関してサンプルを評価することによって試験され得る。この試験は、例えば、36P6D5発現細胞が、このような細胞を通常含まない生物学的サンプル(例えば、リンパ節)に見出された場合に、調節不全細胞成長の証拠を提供し得る。生物学的サンプル中の36P6D5の状態におけるこのような変更は、しばしば、調節不全細胞成長と関連する。詳細には、調節不全細胞成長の1つの指標は、起源の器官(例えば、膀胱、腎臓または前立腺)から体の異なる領域(例えば、リンパ節)への癌細胞の転移である。対照的に、調節不全細胞成長の証拠は、重要である。なぜなら、例えば、不顕性リンパ節転移は、前立腺癌を有する実質的な割合の患者において検出され得るからであり、そしてこのような転移は、疾患進行に関する公知の予言物(predictor)と関連する(例えば、J Urol 1995 Aug;154(2 Pt 1):474−8を参照のこと)。
【0117】
1つの局面においては、本発明は、調節不全細胞の増殖に関連する疾患(例えば、過形成または癌)を有していると疑われる個体に由来する試験組織サンプル中の細胞によって発現される36P6D5遺伝子産物の状態を決定すること、次いで、対応する正常なサンプル中の36P6D5遺伝子産物の状態に対して、そのように決定された状態を比較することによる、36P6D5遺伝子産物をモニタリングするための方法を提供する。正常なサンプルと比較して試験サンプル中の異常な36P6D5遺伝子産物の存在は、個体の細胞内での調節不全細胞の増殖の存在に関する指標を提供する。
【0118】
別の局面においては、本発明は、個体における癌の存在を決定することにおいて有用であるアッセイを提供する。これは、対応する正常な細胞または組織中での発現レベルと比較して、試験細胞または組織サンプル中での36P6D5 mRNAまたはタンパク質の発現における有意な増大を検出することを含む。36P6D5 mRNAの存在は、例えば、前立腺組織、腎臓組織、膀胱組織、卵巣組織、胸部組織、膵臓組織、結腸組織および肺組織を含むがこれらに限定されない組織サンプル中で評価され得る(例えば、図4、6および7を参照のこと)。任意のこれらの組織における有意な36P6D5の発現の存在は、これらの癌の出現、存在、および/または重篤度を示すために有用であり得る。なぜなら、対応する正常な組織は36P6D5 mRNAを発現しないか、またはそれをより低いレベルで発現するからである。
【0119】
関連する実施形態においては、36P6D5の発現の状態は、核酸のレベルよりもむしろタンパク質のレベルで決定され得る。例えば、このような方法またはアッセイは、試験組織サンプル中の細胞によって発現される36P6D5タンパク質のレベルを決定すること、および対応する正常なサンプル中で発現される36P6D5のレベルに対してこのように決定されたレベルを比較することを含む。1つの実施形態においては、36P6D5タンパク質の存在は、例えば、免疫組織化学的方法を使用して評価される。36P6D5抗体または36P6D5タンパク質の発現を検出し得る結合パートナーは、この目的のための当該分野で周知の種々のアッセイ形式において使用され得る。
【0120】
他の関連する実施形態においては、当業者は、挿入、欠失、置換などのこれらの分子の構造における摂動を同定するために、生物学的サンプル中の36P6D5ヌクレオチドおよびアミノ酸配列の完全性を評価し得る。このような実施形態は、ヌクレオチドおよびアミノ酸配列における摂動が、増殖の調節不全の表現型に関連している多数のタンパク質において観察されるので、有用である(例えば、Marrogiら、J.Cutan.Pathol.26(8):369−378(1999)を参照のこと)。この状況においては、ヌクレオチドおよびアミノ酸配列における摂動を観察するための広範な種々のアッセイが、当該分野で周知である。例えば、36P6D5遺伝子産物の核酸またはアミノ酸配列の大きさおよび構造が、本明細書中で議論される、ノーザン、サザン、ウェスタン、PCR、およびDNA配列決定プロトコールによって観察され得る。さらに、ヌクレオチドおよびアミノ酸配列における摂動を観察するための他の方法(例えば、一本鎖の立体構造多形性分析)が、当該分野で周知である(例えば、米国特許第5,382,510号および同第5,952,170号を参照のこと)。
【0121】
別の実施形態においては、当業者は、生物学的サンプル中の36P6D5遺伝子のメチル化の状態を試験し得る。遺伝子の5’調節領域中のCpGアイランドの異常な脱メチル化および/過剰なメチル化は、しばしば、不死化された細胞および形質転換された細胞において生じ、そして種々の遺伝子の変更された発現を生じ得る。例えば、pi−クラスのグルタチオンS−トランスフェラーゼのプロモーター過剰メチル化(正常な前立腺において発現されるが、90%より多くの前立腺の癌腫においては発現されないタンパク質)は、この遺伝子の転写を永続的にサイレントにさせるようであり、そして最も頻繁には前立腺の癌腫におけるゲノムの変更が検出される(De Marzoら、Am.J.Pathol.155(6):1985−1992(1999))。さらに、この変更は、高いグレードの前立腺の表皮内新生物(PIN)の少なくとも70%の症例において存在する(Brooksら、Cancer Epidemiol.Biomarkers Prev.、1998、7:531−536)。別の例においては、LAGE−I腫瘍特異的遺伝子(これは、正常な前立腺においては発現されないが、前立腺癌の25〜50%において発現される)の発現が、リンパ芽球細胞においてデオキシアザシチジンによって誘導され、このことは、腫瘍の発現が脱メチル化に起因することを示唆している(Letheら、1998、Int.J.Cancer 76(6):903−908)。この状況においては、遺伝子のメチル化の状態を試験するための種々のアッセイが、当該分野で周知である。例えば、当業者は、サザンハイブリダイゼーションアプローチにおいて、CpGアイランドの全体的なメチル化の状態を評価するために、メチル化されたCpG部位を含む配列を切断し得ないメチル化感受性制限酵素を利用し得る。さらに、MSP(メチル化特異的PCR)は、所定の遺伝子のCpGアイランド中に存在するCpG部位の全てのメチル化の状態を迅速にプロフィール化し得る。この手順は、亜硫酸水素ナトリウム(これは、メチル化されていない全てのシトシンをウラシルに転換する)によるDNAの最初の改変、続くメチル化されていないDNAに対してメチル化されたDNAについて特異的なプライマーを使用する増幅を含む。メチル化の干渉を含むプロトコールもまた、例えば、Current Protocols In Molecular Biology、Units 12、Frederick M.Ausubelら編、1995に見出され得る。
【0122】
遺伝子の増幅は、36P6D5の状態、21q22.2−22.3にマップされる座、種々の癌において摂動されることが示される領域を評価するさらなる方法を提供する。遺伝子の増幅は、例えば、従来のサザンブロッティング、mRNAの転写を定量するためのノーザンブロッティング(Thomas、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、77:5201−5205(1980))、ドットブロッティング(DNA分析)、またはインサイチュハイブリダイゼーション(本明細書中に提供される配列に基づいて適切に標識されたプローブを使用する)によって直接、サンプル中で測定され得る。あるいは、DNA二重鎖、RNA二重鎖、およびDNA−RNAハイブリッド二重鎖、またはDNA−タンパク質二重鎖を含む特定の二重鎖を認識し得る抗体が、使用され得る。抗体は、次いで、標識され得、そして二重鎖が表面に結合させられるアッセイが行われ得、その結果、表面上での二重鎖の形成に際して、この二重鎖に結合した抗体の存在が検出され得る。
【0123】
上記に議論される組織に加えて、生検組織または末梢血または骨髄が、前立腺、腎臓、膀胱、卵巣、乳房、膵臓、結腸および肺ガンを含むがこれに限定されないガン細胞の存在について、36P6D5の発現を検出するために、例えば、ノーザン、ドットブロットまたはRT−PCR分析を使用して簡便にアッセイされ得る(図4、6および7)。RT−PCTで増幅可能な36P6D5 mRNAの存在は、ガンの存在の指標を提供する。末梢血中の腫瘍細胞についてのRT−PCR検出アッセイは、現在は、多数のヒト固形腫瘍の診断および管理における使用のために評価されている。前立腺ガンの分野においては、これらは、PSAおよびPSMを発現する細胞の検出のためのRT−PCRアッセイを含む(Verkaikら、1997、Urol.Res.25:373−384;Ghosseinら、1995、J.Clin.Oncol.13:1195−2000;Hestonら、1995、Clin.Chem.41:1687−1688)。RT−PCTアッセイが、当該分野で周知である。
【0124】
本発明の関連する局面は、個体におけるガン発症に対する罹患性を推定することに関する。1つの実施形態においてはガンに対する罹患性を推定するための方法は、組織サンプル中の36P6D5 mRNAまたは36P6D5タンパク質を検出することを含み、その存在はガンに対する罹患性を示す。ここでは、36P6D5 mRNAの発現の存在の程度は、罹患性の程度に比例する。特定の実施形態においては、前立腺組織中での36P6D5の存在が試験され、サンプル中の36P6D5の存在は、前立腺ガンの罹患性(または前立腺腫瘍の発生または存在)の指標を提供する。別の特定の実施形態においては、組織中の36P6D5の存在が調査され、サンプル中の36P6D5の存在が、ガンの罹患性(または腫瘍の発生または存在)の指標を提供する。密接に関連する実施形態においては、当業者は、挿入、欠失、置換などのこれらの分子の構造における摂動(perturbation)を同定するために、生物学的サンプル中の36P6D5ヌクレオチドおよびアミノ酸配列の完全性を評価し得、サンプル中の36P6D5遺伝子産物中の1つ以上の摂動の存在は、ガンの罹患性の指標(または腫瘍の発生もしくは存在)を提供する。
【0125】
本発明のなお別の関連する局面は、腫瘍の積極性を測定するための方法に関する。1つの実施形態においては、腫瘍の積極性を測定するための方法は、腫瘍のサンプル中の細胞によって発現される36P6D5 mRNAまたは36P6D5タンパク質のレベルを決定すること、同じ個体から採取された対応する正常な組織または正常な組織の参照サンプル中で発現された36P6D5 mRNAまたは36P6D5タンパク質のレベルに対して、そのように決定されたレベルを比較することを含む。ここでは、正常なサンプルに対して比較した、腫瘍サンプル中での36P6D5 mRNAまたは36P6D5タンパク質の発現の程度は、積極性の程度を示す。特定の実施形態においては、前立腺腫瘍の積極性は、36P6D5が腫瘍細胞中で発現される程度を決定することによって評価される。より高い発現レベルは、より積極性のある腫瘍であることを示す。密接に関連する実施形態においては、当業者は、挿入、欠失、置換などのこれらの分子の構造における摂動を同定するために、生物学的サンプル中の36P6D5ヌクレオチドおよびアミノ酸配列の完全性を評価し得、1つ以上の摂動の存在は、より積極性の高い腫瘍を示す。
【0126】
本発明はさらに、調節不全の細胞増殖の証拠のために生物学的サンプルを検査する方法を提供する。1つの実施形態において、本発明は、生物学的サンプル中の36P6D5の状態を、対応する正常なサンプル中の36P6D5の状態と比較する工程を包含し、ここで、生物学的サンプル中の36P6D5の状態の変化は、調節不全の細胞増殖と関連する。生物学的サンプル中の36P6D5の状態は、例えば、36P6D5 mRNA発現のレベルまたは36P6D5タンパク質発現のレベルを調べることによって、評価され得る。1つの実施形態において、36P6D5の状態における変更は、36P6D5発現細胞が通常不在である組織由来の生物学的サンプル中で、36P6D5発現細胞の存在によって、36P6D5の状態の変更が同定される。
【0127】
別の局面において、本発明は、個体における癌の存在を決定する際に有用なアッセイを提供し、対応する正常な細胞または組織における発現レベルと比較した試験細胞または組織サンプル中の36P6D5 mRNAまたはタンパク質発現における有意な増加を検出する工程を包含する。36P6D5 mRNAの存在は、例えば、結腸、肺、前立腺、脾臓、膀胱、乳房、卵巣、子宮頚部、精巣、頭および首、脳、胃、骨などを含むがこれらに限定されない組織サンプル中で評価され得る。これらの組織のいずれかにおける有意な36P6D5発現の存在は、対応する正常組織が36P6D5 mRNAを発現しないかまたはより低いレベルで発現するので、別の組織に由来するこれらの癌または癌の転移の発生、存在および/または重篤度を示すために有用であり得る。
【0128】
本発明のなお別の関連する局面は、経時的に個体中の悪性腫瘍の進行を観察するための方法に関する。1つの実施形態においては、経時的に個体中の悪性腫瘍の進行を観察するための方法は、腫瘍のサンプル中の細胞によって発現される36P6D5 mRNAまたは36P6D5タンパク質のレベルを決定すること、同じ個体から種々の時点で採取された等価な組織サンプル中で発現される36P6D5 mRNAまたは36P6D5タンパク質のレベルに対して、そのように決定されたレベルを比較する工程を含む。ここでは、経時的な腫瘍サンプル中の36P6D5 mRNAまたは36P6D5タンパク質の発現の程度は、ガンの進行についての情報を提供する。特定の実施形態においては、ガンの進行は、腫瘍細胞中の36P6D5の発現が経時的に変化する程度を決定することによって評価され、より高い発現レベルは、ガンの進行を示す。密接に関連する実施形態においては、当業者は、挿入、欠失、置換などのこれらの分子の構造における摂動を同定するために、生物学的サンプル中の36P6D5ヌクレオチドおよびアミノ酸配列の完全性を評価し得、1つ以上の摂動の存在は、ガンの進行を示す。
【0129】
上記の診断アプローチは、当該分野で公知の広範な種々の予後および診断プロトコールの任意の1つと組合せられ得る。例えば、本明細書中に開示される本発明の別の実施形態は、36P6D5遺伝子および36P6D5遺伝子産物の発現(または36P6D5遺伝子および36P6D5遺伝子産物の摂動)と、組織サンプルの状態を診断および予後する手段としての悪性腫瘍に関連する因子との間の一致を観察するための方法に関する。この状況においては、悪性腫瘍に関連する広範な種々の因子(例えば、悪性腫瘍に関連する別の遺伝子の発現(PSA、PSCA、およびPSMの発現を含む))、ならびに全体的な細胞学的観察(例えば、Bockingら、1984、Anal.Quant.Cytol.6(2):74−88;Eptsein,1995、Hum.Pathol.1995、Feb;26(2):223−9;Thorsonら、1998、Mod.Pathol.11(6):543−51;Baisdenら、1999、Am.J.Surg.Pathol.23(8):918−24を参照のこと)が利用され得る。36P6D5遺伝子および36P6D5遺伝子産物の発現(または36P6D5遺伝子および36P6D5遺伝子産物中の摂動)と、悪性腫瘍に関連するさらなる因子との間の一致を観察するための方法は、例えば、一致する特定の因子のセットまたは集まりの存在が、組織サンプルの状態を診断および予後するための基準の情報を提供するので、有用である。
【0130】
代表的な実施形態においては、36P6D5遺伝子および36P6D5遺伝子産物の発現(または36P6D5遺伝子および36P6D5遺伝子産物の摂動)と、悪性腫瘍に関連する因子との間での一致を観察するための方法は、組織サンプル中の36P6D5 mRNAまたはタンパク質の過剰発現を検出すること、組織サンプル中のPSA mRNAまたはタンパク質の過剰発現を検出すること、ならびに36P6D5 mRNAまたはタンパク質と、PSA mRNAまたはタンパク質の過剰発現との間での一致を観察することを伴う。特定の実施形態においては、前立腺組織中での36P6D5およびPSAのmRNAの発現が試験される。好ましい実施形態においては、サンプル中の36P6D5とPSAのmRNAの過剰発現の一致は、前立腺ガンの指標、前立腺ガンの罹患性、または前立腺腫瘍の発生もしくは存在を提供する。
【0131】
36P6D5のmRNAまたはタンパク質の発現を検出および定量するための方法が本明細書中に記載され、そして当該分野で周知の標準的な核酸およびタンパク質の検出および定量技術を使用する。36P6D5 mRNAの検出および定量のための標準的な方法として、標識された36P6D5リボプローブを使用するインサイチュハイブリダイゼーション、ノーザンブロット、および36P6D5ポリヌクレオチドプローブを使用する関連技術、36P6D5について特異的なプライマーを使用するRT−PCR分析、および他の増幅型の検出方法(例えば、分枝DNA、SISBA、TMAなど)が挙げられる。特定の実施形態においては、以下の実施例に記載されるように、半定量的RT−PCRが、36P6D5 mRNAの発現を検出しそして定量するために使用され得る。36P6D5を増幅し得るかなり多数のプライマーが、この目的のために試用され得、これには、本明細書中で詳細に記載される種々のプライマーのセットが挙げられるがこれらに限定されない。タンパク質の検出および定量のための標準的な方法が、この目的のために使用され得る。特定の実施形態においては、野生型の36P6D5タンパク質と特異的に反応するポリクローナルまたはモノクローナル抗体が、生検組織の免疫組織化学的アッセイにおいて使用され得る。
【0132】
(36P6D5と相互作用する分子の同定)
本明細書中に開示される36P6D5タンパク質配列は、当業者が、36P6D5と相互作用するタンパク質、低分子、および他の試薬、ならびに種々の当該分野で受容されているプロトコールの任意の1つを通じて36P6D5によって活性化される経路を同定することを可能にする。例えば、当業者は、種々のいわゆる相互作用捕捉システム(「ツーハイブリッドアッセイ」とも呼ばれる)の1つを利用し得る。このようなシステムにおいては、相互作用する分子が、転写因子を再構成し、レポーター遺伝子の発現を指向し、次いでその発現がアッセイされる。代表的なシステムは、真核生物の転写活性化因子の再構成を通じてインビボでのタンパク質−タンパク質の相互作用を同定し、そしてこれは、例えば、米国特許第5,955,280号、同第5,925,523号、同第5,846,722号、および同第6,004,746号に開示されている。
【0133】
あるいは、当業者は、36P6D5タンパク質配列と相互作用する分子を、ペプチドライブラリーをスクリーニングすることによって同定し得る。このような方法においては、36P6D5のような選択されたレセプター分子に結合するペプチドが、アミノ酸のランダムなまたは制御されたコレクションをコードするライブラリーをスクリーニングすることによって同定される。ライブラリーによってコードされるペプチドは、バクテリオファージコートタンパク質の融合タンパク質として発現され、次いで、バクテリオファージ粒子が、目的のレセプターに対してスクリーニングされる。
【0134】
広範な種々の用途を有しているペプチド(例えば、治療薬または診断薬)が、期待されるリガンドまたはレセプター分子の構造についてのいかなる以前の情報をも用いることなく、同定され得る。36P6D5タンパク質配列と相互作用する分子を同定するために使用され得る代表的なペプチドライブラリおよびスクリーニング方法が、例えば、米国特許第5,723,286号および同第5,733,731号に開示されている。
【0135】
あるいは、36P6D5を発現する細胞株が、36P6D5によって媒介されるタンパク質−タンパク質相互作用を同定するために使用され得る。この可能性は、他の研究者によって示されているように、免疫沈降技術を使用して試験され得る(Hamilton BJら、Biochem.Biophys.Res.Commun.1999、261:646−51)。代表的には、36P6D5タンパク質は、抗36P6D5抗体を使用して、36P6D5を発現する前立腺ガン細胞株から免疫沈降させられ得る。あるいは、His−タグに対する抗体が、36P6D5を発現するように操作された細胞株中で使用され得る(上記のベクター)。免疫沈降させられた複合体は、ウェスタンブロッティング、タンパク質の35S−メチオニン標識、タンパク質の微小配列決定、銀染色、および二次元ゲル電気泳動のような手順によってタンパク質の会合について試験され得る。
【0136】
36P6D5と相互作用する低分子は、このようなスクリーニングアッセイの関連する実施形態を通じて同定され得る。例えば、リン酸化および脱リン酸化、二次メッセンジャーのシグナル伝達、および腫瘍形成を媒介する36P6D5の能力を妨害する分子を含む、タンパク質の機能を妨害する低分子が同定され得る。代表的な方法は、例えば、米国特許第5,928,868号に議論されており、そして少なくとも1つのリガンドが低分子であるハイブリッドリガンドを形成するための方法を含む。例示的な実施形態においては、次いで、ハイブリッドのリガンドが、第1および第2の発現ベクターを含む細胞中に順に導入される。それぞれの発現ベクターは、転写モジュールのコード配列に連結された標的のタンパク質をコードする、ハイブリッドタンパク質を発現するためのDNAを含む。細胞はさらに、レポーター遺伝子を含む。その発現は、互いに第1および第2のハイブリッドタンパク質の近位に条件付けられる。発現は、ハイブリッドのリガンドが両方のハイブリッドタンパク質上の標的部位に結合する場合にのみ、生じる事象である。レポーター遺伝子を発現するこれらの細胞が選択され、そして未知の低分子または未知のハイブリッドタンパク質が同定される。
【0137】
本発明の代表的な実施形態は、図1(配列番号2)に示される36P6D5アミノ酸配列と相互作用する分子をスクリーニングする方法から構成される。この方法は、分子の集団を36P6D5アミノ酸配列と接触させる工程、相互作用を容易にする条件下で分子の集団が36P6D5アミノ酸配列と相互作用することを可能にする工程、36P6D5アミノ酸配列と相互作用した分子の存在を決定する工程、次いで36P6D5アミノ酸配列とは相互作用していない分子を、36P6D5のアミノ酸配列と相互作用した分子から分離する工程を包含する。特定の実施形態においては、この方法はさらに、36P6D5のアミノ酸配列と相互作用する分子を精製する工程を包含する。好ましい実施形態においては、36P6D5アミノ酸配列は、ペプチドのライブラリーと接触させられる。
【0138】
(細胞性微小環境を調節するための36P6D5の使用)
種々の分泌されたタンパク質が、前立腺癌において記載されている(その多数が、腫瘍形成および進行のプロセスに関与していることが示されている)(Inoue K.Cli Cancer Res.2000;6:2104−19、Dow JK,deVee White RW.Urology.2000;55:800−6)。腫瘍進行のプロセスにおいて、癌細胞は、それらが局所的な前立腺癌の微小環境および骨微小環境の両方において増殖可能な分子を分泌および発現する。前立腺癌の独特の特徴は、腫瘍の進行のプロセスにおいて、癌細胞は骨に対して転移性となることであり、最近の研究は、骨への転移する偏好が、骨微小環境において、それらが増殖するのを可能にする分子を分泌および発現する前立腺癌の能力に基づいていることを示唆する(Koeneman KS,Yeung F,Chung LW.Prostate 1999:39:246)。この内容において、本明細書中で示されるデータ(例えば、図8および9を参照のこと)は、(1)骨に対する前立腺細胞の標的化する際、(2)骨微小環境における前立腺細胞の増殖を可能とする際、(3)前立腺癌腫瘍細胞または骨髄細胞の造骨細胞への分化を誘導する際または(4)前立腺癌細胞と骨間質との相互作用をサポートすることによって、癌細胞の増殖についての好ましい環境を創出し得る。結果として、この分子は、培地を調製するおよび/または前立腺癌細胞が転移し得る微小環境を模倣するための方法において使用され得る。
【0139】
36P6D5が前立腺および骨微小環境に通常位置する細胞と相互作用する可能性を試験するために、36P6D5タンパク質を組換えタンパク質(pTag5 36P6D5)として発現された。精製された組換え36P6D5を次いで、種々の関連細胞タイプ(前立腺上皮細胞、前立腺腫瘍細胞株、前立腺粘膜細胞、骨肉腫および骨粘膜細胞を含む)とインキュベートした。36P6D5のインタクトな細胞への結合は、FACS分析および熱量測定アッセイによって、検出される。我々の研究は、組換え36P6D5 AP−融合タンパク質は、LAPC4およびLAPC9異種移植片に由来する前立腺癌の存在下でインキュベートされる場合、それは、LAPC9およびLAPC4異種移植片細胞に結合する。36P6D5の細胞表面への結合は、AP基質におけるAPにおける熱量測定の変化を使用して検出した(図8)。対照的に、適切なコントロールとともにインキュベートされる場合、色の変換は全く観察されなかった。36P6D5に結合および反応し得る細胞集団を同定する際に、この分析は、価値のあるものである。さらに、標的細胞集団の同定およびが、36P6D5レセプターを単離および同定する方法を提供し得る。この情報は、種々の治療学的適用および低分子設計において使用され得る。
【0140】
本明細書中に示されたデータ(例えば、図8を参照のこと)を用いて、転移性細胞の微小環境と同様に癌細胞が生じる局所前立腺の微小環境を再現することによる、癌細胞表現型を調節しそして異なる段階の転移を分析する方法を使用して、それによって、新規の治療用の組成物および方法ならびに診断用の組成物および方法を当業者が評価し得る癌モデルを生成し得る。例示的方法は、36P6D5ポリペプチドが細胞に結合するようにこのペプチドをこの細胞に暴露することによりこの細胞の微小環境を調節することからなり、これによって、細胞の微小環境を調節する。この状況に関連する方法は、36P6D5ポリペプチド(例えば、抗36P6D5抗体)と相互作用してこのペプチドの細胞への結合を阻害するかまたは容易にする分子に細胞を暴露することによりこの細胞の微小環境を調節することからなり、これによって、この細胞の微小環境を調節する。特定の微小環境の生成または調節についてのこのような方法は、癌細胞(前立腺癌細胞を含む)が細胞微小環境に存在する因子に依存して差示的に調節されるという観察に基づいて種々の多様な微小環境を生成するための当該分野における必要性を満足する(例えば、Levesqueら、Endocrinology 139(5):2375−2381(1998)を参照のこと)。したがって、この微小環境において細胞により分泌されかつ細胞に結合する分子として36P6D5タンパク質を同定することは、癌の進行を生じる事象をより正確に再現および調節する状況で36P6Dを含有および/または操作するために、当業者がこの情報を使用することを可能にする。
【0141】
多くの実験を、前立腺癌細胞の増殖に対して36P6D5がどのように寄与し得るかを調査するために設計し得る。第一の典型的なセットの実験において、前立腺癌上皮細胞を、組換え36P6D5の存在下または非存在下でインキュベートし、そして十分に証明された熱量測定アッセイを使用して増殖について評価する。平行して、36P6D5を安定に発現するように操作したPC3細胞を、細胞増殖能について評価する。第二の典型的なセットの実験において、タグ化前立腺癌細胞(例えば、緑色蛍光タンパク質(GFP)を発現するように操作したPC3細胞)を、骨間質細胞の存在下で増殖する。これらの細胞を、組換え36P6D5の存在下または非存在下でインキュベートし、そして、GFPの増加を測定することによって細胞増殖について評価する。
【0142】
本明細書中に提供される開示を使用して、骨転移における36P6D5の役割を試験し得る。36P6D5が骨形成性になるように前立腺細胞を誘導するか否かを決定するために、前立腺初代細胞ならびに細胞株を、組換え精製36P6D5の存在下または非存在下で増殖し得る。次いで、細胞を、骨成熟の初期マーカーおよび後期マーカー(オステオネクチン、オステオポンチン、アルカリホスファターゼおよびオステオカルシンを含む)の発現について試験し得る。骨のような伝統的な保護的微小環境での前立腺細胞増殖を支援する増殖因子の発現を36P6D5が誘導するか否かもまた、決定し得る。PCR技術およびELISA技術を使用して、組換え精製36P6D5の存在下または非存在下での細胞増殖におけるFGF、HGF、およびIGFの発現および分泌を調査し得る。同様の実験を、骨髄細胞を使用して実施して、36P6D5が軟骨細胞前駆体の成熟骨細胞への分化を誘導するか否かを決定し得る。これらの実験は、骨における前立腺癌増殖に有利な環境の作製の支持、および治療介入についての標的の同定における、36P6D5の役割を例証する際に貴重であり得る。
【0143】
本明細書中に提供される開示を使用して、細胞−細胞相互作用における36P6D5の役割を試験し得る。間質細胞または骨細胞との前立腺細胞相互作用を増強することによる前立腺細胞の骨への漸増において、36P6D5が役割を担うことが可能である。GFP発現前立腺癌細胞を、組換え36P6D5タンパク質の存在下または非存在下で増殖し得る。GFP細胞を、種々の時間にわたって、コントロールまたは36P6D5処理した間質細胞および骨細胞とともにインキュベートし得る。非接着性細胞は除去され得、そして間質細胞および骨細胞との接着を、培養物中のGFPの量を測定することによって評価し得る。このデータは、癌細胞が生じそして癌細胞による転移部位のコロニー形成として増殖する局所前立腺の微小環境を調節する因子のインヒビターを考察する際に不可欠である。
【0144】
(治療方法および組成物)
前立腺の癌(および恐らく他の癌)において高度に発現される遺伝子としての36P6D5の同定は、このような癌の処置のための多数の治療アプローチへの道を開く。上記に議論されているように、36P6D5が癌細胞から分泌され、そしてこの様式で増殖シグナルを調節することは、可能である。転写因子としてのその潜在的な役割および前立腺癌におけるその高度な発現は、36P6D5を低分子媒介治療のための潜在的な標的にする。
【0145】
従って、36P6D5タンパク質の活性を阻害することを目的とする治療アプローチが、前立腺癌および36P6D5を発現する他の癌を罹患している患者について有用であると予想される。36P6D5タンパク質の活性を阻害することを目的とするこれらの治療アプローチは、一般的に2つのクラスに分けられる。1つのクラスは、36P6D5タンパク質とその結合パートナーまたは他のタンパク質との結合または会合を阻害するための種々の方法を含む。別のクラスは、36P6D5遺伝子の転写または36P6D5 mRNAの翻訳を阻害するための種々の方法を含む。
【0146】
(抗体に基づく治療の細胞表面の標的としての36P6D5)
36P6D5構造的特徴は、この分子が抗体に基づく治療ストラテジーについての魅力的な標的であることを示す。細胞外分子と細胞内分子との両方を標的化するための、多数の代表的な抗体ストラテジーが当該分野において公知である(例えば、相補体およびADCCにより媒介される殺傷、ならびに以下に記載するイントラボディーの使用を参照のこと)。36P6D5が種々の系列の癌細胞上で発現され、そして対応する正常な細胞上では発現されないので、36P6D5免疫反応性組成物の全身的な投与は、標的ではない器官および組織への免疫治療分子の結合によって引き起こされる毒性、非特異性、および/または非標的効果を伴わずに、良好な感受性を示すことが予想される。36P6D5のドメインと特異的に反応する抗体は、毒素もしくは治療薬との結合体として、または細胞の増殖もしくは機能を阻害し得る裸の抗体としてのいずれかで、36P6D5を発現する癌を全身的に処置するために有用であり得る。
【0147】
36P6D5抗体は、この抗体が36P6D5に結合し、そして結合パートナーとの相互作用のような機能を調節または摂動し、続いて細胞および腫瘍の増殖の阻害および/または破壊を媒介し、そして/または細胞もしくは腫瘍の増殖を阻害するように、患者中に導入され得る。このような抗体が治療効果を発揮する機構は、補体によって媒介される細胞の溶解、抗体依存性の細胞性の細胞傷害性、36P6D5の生理学的機能を調節すること、リガンド結合またはシグナル伝達経路を阻害すること、腫瘍細胞の分化を調節すること、腫瘍の血管形成因子のプロフィールを変更すること、ならびに/またはアポトーシスを誘導することによることを含み得る。36P6D5抗体は、毒性の試薬または治療薬に結合体化され得、そして36P6D5を保有している腫瘍細胞に対して直接毒性の試薬または治療薬を送達するために使用され得る。毒性の試薬の例として、カリヒマイシン(calchemicin)、マイタンシノイド(maytansinoids)、放射性同位元素(例えば、131I、イットリウム、およびビスマス)が挙げられるが、これらに限定されない。
【0148】
抗36P6D5抗体を使用する癌の免疫治療は、以下を含むがこれらに限定されない他の型の癌の処置において良好に使用されている種々のアプローチから生成される教示に従い得る:結腸癌(Arlenら、1998、Crit.Rev.Immunol.18:133−138)、多発性骨髄腫(Ozakiら、1997、Blood 90:3179−3186;Tsunenariら、1997、Blood 90:2437−2444)、胃癌(Kasprzykら、1992、Cancer Res.52:2771−2776)、B細胞リンパ腫(Funakoshiら、1996、J.Immunother.Emphasis Tumor Immunol.19:93−101)、白血病(Zhongら、1996、Leuk.Res.20:581−589)、結腸直腸癌(Mounら、1994、Cancer Res.54:6160−6166);Veldersら、1995、Cancer Res.55:4398−4403)、および乳癌(Shepardら、1991、J.Clin.Immunol.11:117−127)。いくつかの治療アプローチは、毒素に対する裸の抗体の結合体化(例えば、抗CD20抗体に対する131Iの結合体化(例えば、RituxanTM、IDEC Pharmaceuticals Corp.)を含むが、一方、他のアプローチは、抗体および他の治療薬の同時の投与(例えば、HerceptinTM(Trastuzumab)とパクリタキセル(Genentech,Inc.))を含む。前立腺癌の処置については、例えば、36P6D5抗体は、照射、化学療法、またはホルモンの除去と組合せて、投与され得る。
【0149】
36P6D5抗体治療は、全てのステージの癌について有用であり得るが、抗体治療は、進行したかまたは転移性の癌において特に適切であり得る。本発明の抗体治療を用いる処置は、以前に1回以上の化学療法を受けた患者について示され得、一方、本発明の抗体治療と化学療法または照射のレジメンとの組合せが、化学療法による処置を受けていない患者について好ましくあり得る。さらに、抗体治療は、付随する化学療法の減少した投与量の使用を可能にし得、特に、化学療法薬の毒性に寛容ではない患者について、非常に良好である。
【0150】
いくつかの癌患者については、好ましくは、腫瘍組織の免疫組織化学的な評価、定量的な36P6D5の画像化、または36P6D5の発現の存在および程度を確実に示し得る他の技術を使用して、36P6D5の発現の存在およびその発現のレベルを評価することが所望され得る。腫瘍の生検または外科的な標本の免疫組織化学的な分析が、この目的のために好ましくあり得る。腫瘍組織の免疫組織化学的分析のための方法は、当該分野で周知である。
【0151】
前立腺および他の癌を処置することにおいて有用である抗36P6D5モノクローナル抗体として、腫瘍に対する強力な免疫応答を開始し得るもの、および細胞傷害性を指向し得るものが挙げられる。これに関して、抗−36P6D5モノクローナル抗体(mAb)は、補体によって媒介される細胞の細胞傷害性または抗体依存性の細胞の細胞傷害性(ADCC)の機能(これらの両方ともが、エフェクター細胞のFcレセプター部位または補体タンパク質との相互作用のために、イムノグロブリン分子のインタクトなFc部分を必要とする)のいずれかによって、腫瘍細胞の溶解を誘発し得る。さらに、腫瘍の増殖に対して直接的な生物学的効果を発揮する抗36P6D5 mAbが、本発明の実施において有用である。このような直接的な細胞傷害性のmAbが作用し得る可能性のある機構として、細胞の増殖の阻害、細胞の分化の調節、腫瘍の血管形成因子のプロフィールの調節、およびアポトーシスの誘導が挙げられる。特定の抗−36P6D5 mAbが抗腫瘍効果を発揮する機構は、ADCC、ADMMC、補体によって媒介される細胞の溶解などを決定するように設計されたかなり多数のインビトロでのアッセイを使用して、当該分野で一般的に公知であるように評価され得る。
【0152】
マウスもしくは他の非ヒトモノクローナル抗体、またはヒト/マウスのキメラmAbの使用は、いくつかの患者において、中程度〜強力な免疫応答を誘導し得る。いくつかの例においては、これは、循環からの抗体のクリアランスおよび減少した効率を生じる。最も重篤な例においては、このような免疫応答は、腎不全を生じ得る可能性のある免疫複合体の多量の形成を導き得る。従って、本発明の治療方法の実施において使用される好ましいモノクローナル抗体は、完全なヒトまたはヒト化されたもののいずれかであり、そして高い親和性で標的の36P6D5抗原に対して特異的に結合するが、患者において低い抗原性を示すかまたは抗原性を示さないものである。
【0153】
本発明の治療方法は、単一の抗36P6D5 mAbの、ならびに種々のmAbの組合せまたは混合物の投与を意図する。このようなmAbの混合物は、それらが種々のエピトープを標的化し、種々のエフェクター機構を利用するか、または免疫エフェクター機能に依存するmAbと細胞傷害性のmAbとを直接結合するmAbを含む限りにおいて、特定の利点を有し得る。組合せ中のこのようなmAbは、相乗的治療効果を示し得る。さらに、抗36P6D5 mAbの投与は、以下を含むがこれらに限定されない他の治療薬と組合せられ得る:種々の化学療法剤、アンドロゲンブロッカー、および免疫調節因子(例えば、IL−2、GM−CSF)。抗36P6D5 mAbは、それらの「裸の」形態または結合体化していない形態で投与され得るか、あるいはそれらに対して結合体化した治療薬を有し得る。
【0154】
抗36P6D5抗体処方物は、腫瘍部位へ抗体を送達し得る任意の経路を通じて投与され得る。可能性のある有効な投与経路として、静脈内、腹腔内、筋肉内、腫瘍内、皮内などが挙げられるが、これらに限定されない。処置は一般的には、静脈内注射(IV)(代表的には、約0.1から約10mg/kg体重の範囲の用量)のような受容可能な投与経路を通じる、抗36P6D5抗体調製物の繰り返しの投与を含む。1週間あたりで10〜500mgの範囲のmAbの用量が、有効であり得、そして十分に寛容化され得る。
【0155】
転移性の乳癌の処置におけるHerceptin mAbでの臨床試験に基づいて、約4mg/kg患者体重のIVの最初の負荷用量、続く約2mg/kgIVの抗36P6D5 mAb調製物の毎週の用量が、受容可能な用量レジメンを示し得る。好ましくは、最初の負荷用量は、90分以上の注入として投与される。期間維持用量は、最初の用量が十分に寛容化される場合は、30分以上の注入として投与され得る。しかし、当業者によって理解されるように、種々の因子が、特定の症例における理想的な投与レジメンに影響を与える。このような因子として、例えば、使用されるAbまたはmAbの結合親和性および半減期、患者における36P6D5の発現の程度、循環している破棄された(shed)36P6D5抗原の程度、所望される定常状態の抗体濃度レベル、処置の頻度、ならびに本発明の処置方法と組合せて使用される化学療法剤の影響が挙げられ得る。
【0156】
必要に応じて、患者は、最も有効な投与レジメンおよび関連する因子の決定を補助するために、血清中の循環している破棄された36P6D5抗原のレベルについて評価されるべきである。このような評価はまた、治療を通じて目的のものをモニタリングするために使用され得、そして他のパラメーター(例えば、前立腺癌治療における血清PSAレベル)を評価することと組合せて治療的成功を計測するために有用であり得る。
【0157】
(36P6D5タンパク質機能の阻害)
本発明は、36P6D5のその結合パートナーもしくはリガンドに対する結合または他のタンパク質との会合を阻害する種々の方法および組成物、ならびに36P6D5機能を阻害するための方法を含む。
【0158】
(細胞内抗体を用いる36P6D5の阻害)
1つのアプローチにおいて、36P6D5に特異的に結合する単鎖抗体をコードする組換えベクターが、遺伝子導入技術を通じて36P6D5を発現する細胞中に導入され得る。ここでは、コードされる単鎖の抗36P6D5抗体は、細胞内で発現され、36P6D5タンパク質に結合し、そしてそれによってその機能を阻害する。このような細胞内単鎖抗体を操作するための方法は、周知である。このような細胞内抗体はまた、「イントラボディー(intrabodies)」としても公知であり、細胞内の特定の部分に対して特異的に標的化され得、それによって処置の阻害活性が集められる場所にわたって制御を提供する。この技術は、当該分野で良好に適用されている(概要については、RichardsonおよびMarasco、1995、TIBTECH、第13巻)。イントラボディーは、他の豊富な細胞表面レセプターの発現を実質的に排除することが示されている。例えば、Richardsonら、1995、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:3137−3141;Beerliら、1994、J.Biol.Chem.289:23931−23936;Deshaneら、1994、Gene Ther.1:332−337を参照のこと。
【0159】
単鎖抗体は、可撓性のリンカーポリペプチドによって連結された重鎖および軽鎖の可変ドメインを含み、そして単一のポリペプチドとして発現される。必要に応じて、単鎖抗体が、軽鎖の定常領域に対して連結された単鎖の可変領域フラグメントとして発現され得る。周知の細胞内輸送シグナルが、所望される細胞内部分に対して発現されたイントラボディーを正確に標的化するために、このような単鎖抗体をコードする組換えのポリヌクレオチドベクター中に操作され得る。例えば、小胞体(ER)に対して標的化されたイントラボディーは、リーダーペプチドを、そして必要に応じて、KDELアミノ酸モチーフのようなC末端のER保持シグナルを取り込むように操作され得る。核内で活性を発揮するように意図されたイントラボディーは、核局在化シグナルを含むように操作され得る。脂質部分は、血漿膜の細胞質ゾル側にイントラボディーを鎖でつなぐように、イントラボディーに対して連結され得る。イントラボディーはまた、細胞質ゾル中で機能を発揮するように標的化され得る。例えば、細胞質ゾルのイントラボディーは、細胞質ゾル中の因子を隔離するために使用され得、それによってそれらを、それらの天然の細胞性の目的地に対して輸送されることから妨げる。
【0160】
1つの実施形態においては、イントラボディーは、核において36P6D5を捕獲し、これによって核におけるその活性を防止するために使用され得る。核標的化シグナルは、所望の標的化を達成するために、このような36P6D5イントラボディーに操作され得る。このような36P6D5イントラボディーは、特定の36P6D5ドメインに特異的に結合するよう設計され得る。別の実施形態において、36P6D5タンパク質に特異的に結合する細胞質ゾルイントラボディーが、36P6D5が核への接近を得ることを防止するために使用され得、これによって36P6D5がいかなる生物学的活性を核において及ぼすことをも防止し得る(例えば、36P6D5が他の因子と転写複合体を形成することを防止し得る)。
【0161】
このような特定の腫瘍細胞についてこのようなイントラボディーの発現を特異的に指向するために、イントラボディーの転写が、適切な腫瘍特異的プロモーターおよび/またはエンハンサーの調節制御下に配置され得る。前立腺について特異的なイントラボディーの発現を標的化するために、例えば、PSAプロモーターおよび/またはプロモーター/エンハンサーが利用され得る(例えば、米国特許第5,919,652号を参照のこと)。
【0162】
(組換えタンパク質での36P6D5の阻害)
別のアプローチにおいては、36P6D5に結合し得、それによって36P6D5がその結合パートナー(単数または複数)に対して会合/結合すること、または他のタンパク質(単数または複数)と会合することを妨げ得る、組換え分子が、36P6D5機能を阻害するために使用される。このような組換え分子は、例えば、36P6D5特異的抗体分子の反応性の部分(単数または複数)を含み得る。特定の実施形態においては、36P6D5結合パートナーの36P6D5結合ドメインが、ヒトのIgG(例えば、ヒトのIgG1)のFc部分に対して連結された2つの36P6D5リガンド結合ドメインを含有している二量体の融合タンパク質中に操作され得る。このようなIgG部分は、例えば、CH2およびCH3ドメイン、ならびにヒンジ領域を含み得るが、CH1ドメインは含まない。このような二量体の融合タンパク質は、可溶性の形態で、36P6D5の発現に関連している癌(前立腺、膀胱、卵巣、乳房、膵臓、結腸、および肺の癌を含むがこれらに限定されない)を罹患している患者に対して投与され得る。ここでは、二量体の融合タンパク質は36P6D5に特異的に結合し、それによって結合パートナーとの36P6D5の相互作用をブロックする。このような二量体の融合タンパク質はさらに、公知の抗体連結技術を使用して多量体のタンパク質へと結合させられ得る。
【0163】
(36P6D5の転写または翻訳の阻害)
別のクラスの治療アプローチにおいては、本発明は、36P6D5遺伝子の転写を阻害するための種々の方法および組成物を提供する。同様に、本発明はまた、タンパク質への36P6D5 mRNAの翻訳を阻害するための方法および組成物を提供する。
【0164】
1つのアプローチにおいては、36P6D5遺伝子の転写を阻害する方法は、36P6D5遺伝子を36P6D5アンチセンスポリヌクレオチドと接触させることを含む。別のアプローチにおいては、36P6D5 mRNAの翻訳を阻害する方法は、アンチセンスポリヌクレオチドと36P6D5 mRNAを接触させることを含む。別のアプローチにおいては、36P6D5特異的リボザイムが、36P6D5メッセージを切断するために使用され得、それによって翻訳が阻害される。このようなアンチセンスおよびリボザイムに基づく方法はまた、36P6D5遺伝子の調節領域(例えば、36P6D5の開始部位、プロモーターおよび/またはエンハンサーエレメント)に対して指向され得る。同様に、36P6D5遺伝子の転写因子を阻害し得るタンパク質が、36P6D5 mRNAの転写を阻害するために使用され得る。上記の方法において有用である種々のポリヌクレオチドおよび組成物が、上記に記載されている。別のアプローチにおいては、36P6D5遺伝子の翻訳を、モルホリノアンチセンス技術を使用して阻害し得る。転写および翻訳を阻害するためのアンチセンスおよびリボザイム分子の使用は当該分野で周知である。
【0165】
36P6D5転写活性を妨害することを通じて36P6D5の転写を阻害する他の因子もまた、36P6D5を発現する癌の処置のために有用であり得る。同様に、36P6D5のプロセシングを妨害し得る因子が、36P6D5を発現する癌の処置に有用であり得る。このような因子を利用する癌の処置方法もまた、本発明の範囲内である。
【0166】
(治療ストラテジーについての一般的な考察)
遺伝子導入および遺伝子治療技術が、36P6D5を合成する腫瘍細胞に対して治療用のポリヌクレオチド分子(すなわち、アンチセンス、リボザイム、イントラボディーをコードするポリヌクレオチド、および他の36P6D5阻害分子)を送達するために使用され得る。多数の遺伝子治療アプローチが当該分野で公知である。36P6D5アンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム、36P6D5の転写を妨害し得る因子などをコードする組換えベクターが、このような遺伝子治療アプローチを使用して腫瘍細胞を標的化するために送達され得る。
【0167】
上記の治療アプローチは、広範な種々の化学療法または放射線治療レジメの任意の1つと組合せられ得る。これらの治療アプローチもまた、化学療法の減少した投与量および/またはより少ない頻度の投与の使用を、特に、化学療法剤の毒性を十分に寛容化しない患者において可能にし得る。
【0168】
特定の組成物(例えば、アンチセンス、リボザイム、イントラボディー)の抗腫瘍活性、またはこのような組成物の組合せが、種々のインビトロおよびインビボでのアッセイ系を使用して評価され得る。治療能力を評価するためのインビトロでのアッセイとして、細胞増殖アッセイ、軟質寒天アッセイ、および腫瘍促進活性を示す他のアッセイ、治療組成物が結合パートナーに対する36P6D5の結合を阻害する程度を決定し得る結合アッセイなどが挙げられる。
【0169】
インビボでは、36P6D5治療組成物の効果は、適切な動物モデルにおいて評価され得る。例えば、異種の前立腺癌のモデル(ここでは、ヒトの前立腺癌の移植片または継代された異種移植片組織が、免疫和解された動物(例えば、ヌードマウスまたはSCIDマウス)中に導入される)が、前立腺癌に対する関係において適切であり、そして記載されている(Kleinら、1997、Nature Medicine 3:402−408)。例えば、1998年4月23日に公開された、PCT特許出願第WO98/16628号、Sawyersらは、初代の腫瘍の発達、微小な転移、および後期の疾患の特徴である骨芽細胞の転移の形成を要約し得るヒトの前立腺癌の種々の異種移植片モデルを記載している。効率は、腫瘍形成、腫瘍の退行、または転移などの阻害を測定するアッセイを使用して推定され得る。以下の実施例をもまた参照のこと。
【0170】
アポトーシスの促進を定量するインビボアッセイもまた、可能性のある治療組成物を評価することにおいて有用であり得る。1つの実施形態においては、治療組成物で処置された生存しているマウスに由来する異種移植片が、アポトーシス性の病巣の存在について試験され、そして処置されていないコントロールの異種移植片を保有しているマウスに対して比較され得る。アポトーシス性の病巣が処置されたマウスの腫瘍中で見出される程度は、組成物の治療効率の指標を提供する。
【0171】
上記の方法の実施において使用される治療用組成物は、所望される送達方法のための適切なキャリアを含有している薬学的組成物中に処方され得る。適切なキャリアとして、治療組成物とともに混合された場合に、治療組成物の抗腫瘍機能を保持し、そして患者の免疫系と反応しない任意の材料が挙げられる。例として、滅菌のリン酸緩衝化生理食塩水、静菌水などのような、任意の多数の標準的な薬学的キャリアなどが挙げられるがこれらに限定されない(一般的には、Remington’s Pharmaceutical Sciences 第16版、A.Osal.編、1980を参照のこと)。
【0172】
治療用処方物は可溶化され得、そして、腫瘍部位に治療用組成物を送達し得る任意の経路を通じて投与され得る。可能性のある有効な投与経路として、静脈内、非経口、腹腔内、筋肉内、腫瘍内、皮内、器官内、正常位などが挙げられるが、これらに限定されない。静脈内注射のための好ましい処方物は、保存された静菌水、滅菌の保存されていない水、および/または0.9%の注射のための滅菌の塩化ナトリウム(USP)を含有しているポリビニルクロライドもしくはポリエチレンバッグ中に稀釈された溶液中の治療用組成物を含む。治療用タンパク質調製物は、凍結乾燥され得、そして滅菌の散剤として、好ましくは、減圧下で保存され、次いで、注射の前に、例えば、ベンジルアルコール保存料を含有している静菌水中でまたは滅菌水中で再構成され得る。
【0173】
以下の方法を使用する癌の処置のための投与量および投与プロトコールは、方法および標的の癌によって変化し、そして、当該分野で示されている多数の他の因子に一般に依存する。
【0174】
(癌ワクチン)
上記のように、36P6D5の発現プロフィールは、これが進行および転移した前立腺癌において高度に発現されることを示す。この発現パターンは、癌−精巣(CT)抗原またはMAGEを暗示し、これらは、黒色腫および他の癌にてアップレギュレートされる、精巣特異的遺伝子である(Van den EyndeおよびBoon、Int J Clin Lab Res.27:81〜86、1997)。癌におけるその組織特異的発現および高レベル発現に起因して、MAGEは、癌ワクチンについての標的として現在調査されている(Durrant、Anticancer Drugs 8:727〜733、1997;Reynoldsら、Int J Cancer 72:972〜976、1997)。
【0175】
本発明はさらに、36P6D5タンパク質またはそのフラグメントを含む癌ワクチン、およびDNAベースのワクチンを提供する。36P6D5の発現を考慮すると、癌ワクチンは、非標的組織に対して非特異的効果を生成することなく、36P6D5を発現している癌の特異的な予防および/または処置に効果的であることが予期される。抗癌療法での使用について、液性免疫および細胞媒介性免疫を生成するワクチンにおける腫瘍抗原の使用は、当該分野で周知であり、そしてヒトPSMAおよびげっ歯類PAP免疫原を使用して、前立腺癌に使用されている(Hodgeら、1995,Int.J.Cancer 63:231〜237;Fongら、1997、J.Immunol.159:3113〜3117)。このような方法は、36P6D5タンパク質もしくはそのフラグメント、または36P6D5をコードする核酸分子、および36P6D5免疫原を発現し、かつ適切に提示し得る組換えベクターを用いることによって容易に実施され得る。代表的な技術の例示的な例としては、免疫応答(例えば、体液応答)を哺乳動物において生じさせる方法が挙げられ、この方法は、この哺乳動物の免疫系を、免疫反応性エピトープ(例えば、配列番号2に示す36P6D5タンパク質のエピトープ)に曝露する工程を包含し、その結果、この哺乳動物は、免疫応答を生じ、この応答は、そのエピトープが発生したことに特異的である(例えば、このエピトープを特異的に認識する抗体)。
【0176】
例えば、ウイルス遺伝子送達システムは、36P6D5をコードする核酸分子を送達するために使用され得る。本発明のこの局面の実施において使用され得る種々のウイルス遺伝子送達システムとして、以下が挙げられるがこれらに限定されない:ワクシニア、鶏痘、カナリアポックス、アデノウイルス、インフルエンザ、ポリオウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、およびシンドビスウイルス(Restifo、1996,Curr.Opin.Immunol.8:658−663)。非ウイルス送達システムもまた、抗腫瘍応答を誘導するために患者に(例えば、筋肉内で)導入される36P6D5タンパク質またはそのフラグメントをコードする裸のNDAを使用することによって使用され得る。1つの実施形態においては、全長のヒトの36P6D5 cDNAが使用され得る。別の実施形態においては、特異的細胞毒性のTリンパ球(CTL)エピトープをコードする36P6D5核酸分子が使用され得る、CTLエピトープは、特定されたHLA対立遺伝子に最適に結合し得る36P6D5タンパク質中のペプチドを同定するための、特異的なアルゴリズム(例えば、Epimer、Brown University)を使用して決定され得る。
【0177】
種々のエキソビボのストラテジーもまた、使用され得る。1つのアプローチは、患者の免疫システムに対して36P6D5抗原を提示するための樹状細胞の使用を含む。樹状細胞は、MHCクラスIおよびII、B7同時刺激因子、ならびにIL−12を発現し、そして従って、高度に特殊化された抗原提示細胞である。前立腺ガンにおいては、前立腺特異的膜抗原(PSMA)のペプチドでパルスされた自己由来の樹状細胞が、前立腺ガンの患者の免疫システムを刺激するためのPhase Iの臨床試験において使用される(Tjoaら、1996、Prostate 28:65−69;Murphyら、1996、Prostate 29:371−380)。樹状細胞は、MHCクラスIおよびII分子の状況においてT細胞に対して36P6D5ペプチドを提示するために使用され得る。1つの実施形態においては、自己由来の樹状細胞が、MHC分子に結合し得る36P6D5ペプチドでパルスされる。別の実施形態においては、樹状細胞が、完全な36P6D5タンパク質でパルスされる。なお別の実施形態は、以下のような当該分野で公知の種々の実行ベクターを使用して樹状細胞中の36P6D5遺伝子の過剰発現を操作することを含む:アデノウイルス(Arthurら、1997、Cancer Gene Ther.4:17−25)、レトロウイルス(Hendersonら、1996、Cancer Res.56:3763−3770)、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス、DNAトランスフェクション(Ribasら、1997、Cancer Res.57:2865−2869)、および腫瘍に由来するRNAトランスフェクション(Ashleyら、1997、J.Exp.Med.186:1177−1182)。36P6D5を発現する細胞もまた、GM−CSFのような免疫調節因子を発現するように操作され得、そして免疫化試薬として使用され得る。
【0178】
抗イディオタイプ抗36P6D5抗体もまた、36P6D5タンパク質を発現する細胞に対して免疫応答を誘導するためのワクチンつとして、抗ガン治療において使用され得る。詳細には、抗イディオタイプ抗体の生成は当該分野で周知であり、そして36P6D5タンパク質上のエピトープを模倣する抗イディオタイプ抗36P6D5抗体を作成するように容易に適合させられ得る(例えば、Wagnerら、1997、Hybridoma 16:33−40;Foonら、1995、J Clin Invest 96:334−342;Herlynら、1996、Cancer Immunol Immunother 43:65−76を参照のこと)。このような抗イディオタイプ抗体は、ガンのワクチンストラテジーにおいて使用され得る。
【0179】
遺伝子による免疫化方法が、36P6D5を発現するガン細胞に対して指向された予防的または治療的な体液性および細胞性の免疫応答を作成するために使用され得る。36P6D5タンパク質/免疫原をコードするDNA、および適切な調節配列を含有している構築物が、個体の筋肉または皮膚中に直接注射され得る。その結果、筋肉または皮膚の細胞は、構築物を取りこみ、そしてコードされる36P6D5タンパク質/免疫原を発現する。36P6D5タンパク質免疫原の発現は、骨癌、結腸癌、膵臓癌、前立腺癌、腎臓癌、膀胱癌、および卵巣癌対する予防的または治療的な体液性および細胞性の免疫の作成を生じる。当該分野で公知の種々の予防的および治療的な遺伝子による免疫化技術が、使用され得る(概説については、インターネットアドレスwww.genweb.comで公開されている情報および参考文献を参照のこと)。
【0180】
(診断組成物およびキット)
上記に記載されているかまたは示唆されている診断用および治療用の適用における使用については、キットがまた本発明によって提供される。このようなキットは、閉じられた制限の中に、1つ以上の容器手段(例えば、バイアル、チューブなど)を受容させられる仕切られたキャリア手段を含み得る。それぞれの容器手段は、この方法において使用される別々のエレメントの1つを含有している。例えば、1つの容器手段は、検出可能な標識であるかまたは検出可能に標識され得るプローブを含み得る。このようなプローブは、それぞれ36P6D5タンパク質または36P6D5遺伝子またはメッセージについて特異的な抗体またはポリヌクレオチドであり得る。キットが標的の核酸を検出するために核酸のハイブリダイゼーションを利用する場合には、キットはまた、標的の核酸配列の増幅のためのヌクレオチド(単数または複数)を含有している容器、および/あるいはレポーター手段(例えば、レポーター分子(例えば、酵素標識、蛍光標識、または放射性同位元素標識)に対して結合させられたビオチン結合タンパク質(例えば、アビジンまたはストレプトアビジン))を含有している容器を有し得る。
【0181】
本発明のキットは、代表的には、上記に記載されている容器、および商業的にそして使用者の視点から所望される材料(緩衝液、稀釈液、フィルター、針、シリンジ、および使用のための説明書を有するパッケージ挿入物を含む)を含有している1つ以上の他の容器を含む。組成物が特異的な治療または非治療的な適用のために使用されることを示す標識は、容器上に存在し得、そしてまた、上記に記載されているようなインビボまたはインビトロでのいずれかの使用のための指針を示し得る。
【0182】
従って、本発明はまた、36P6D5関連分子を含有する診断組成物を提供する。このような分子は、本明細書中で記載される様々な36P6D5ポリヌクレオチド、プライマー、プローブ、タンパク質、フラグメント、抗体を含む。診断組成物に含まれる分子は、必要に応じて、検出可能なマーカーで標識され得る。36P6D5診断組成物は、適切な緩衝液、希釈剤および必要に応じて他の成分をさらに含み得る。
【0183】
(実施例)
本発明の種々の局面がさらに記載され、そして以下のいくつかの実施例の方法によって説明される。これらの全てが、本発明の範囲を制限するようには意図されない。
【0184】
(実施例1:36P6D5遺伝子のcDNAフラグメントのSSHによって生成された単離物)
(材料および方法)
(LACP異種移植片:)
LACP異種移植片を、Dr.Charles Sawyers(UCLA)から入手し、そして記載されているように作成した(Kleinら、1997、Nature Med.3:402−408)。アンドロゲン依存性のLACP−4異種移植片(LAPC−4 AD)を、雄性のSCIDマウスにおいて皮下増殖させ、そしてレシピエントの雄性においてかなりの量の小さい組織として継代した。LAPC−4 AD異種移植片を、脛骨内で増殖した。皮下で増殖したLAPC−4 AD異種移植片腫瘍組織を、1〜2mm3の切片に切断し、同時にこの組織を1×Iscoves培地に入れ、切断組織を、次いで、1.3Krpmで4分間遠心分離し、上清を10mlの氷冷した1×Iscoves培地に再懸濁し、そして1.3Krpmで4分間遠心分離した。次いで、ペレットを、1%プロナーゼEと共に1×Iscovesに再懸濁し、そして穏やかに撹拌しながら、室温で20分間インキュベートし、続いて2〜4分間氷上でインキュベートした。濾液を1.3Krmpで4分間遠心分離し、このプロナーゼを、10mlのIscovesに再懸濁して再度遠心分離することによって吸引したペレットから除去した。次いで、細胞の凝集物を、PrEGM培地に入れ、そして一晩増殖した。次いで、この細胞を収集し、濾過し、2×RPMIで洗浄し、そして計数した。約50,000個の細胞を等容量の氷冷Matrigelと氷上で混合し、そして27ゲージ針でSCIDマウスの近位脛骨幹端に外科的に注射した。10〜12週間後、骨髄中で増殖しているLAPC−4腫瘍を回収した。
【0185】
(細胞株:)
ヒトの細胞株(例えば、HeLa)を、ATCCから入手し、そして5%のウシの胎児の血清を有しているDMEM中で維持した。
【0186】
(RNAの単離:)
腫瘍組織および細胞株を、Trizol試薬(Life Technologies,Gibco BRL)中で、10ml/g組織または10ml/108個の細胞を使用して、全RNAを単離するためにホモジナイズした。ポリA RNAを、QuiagenのOligotex mRNA Mini and Midiキットを使用して全RNAから精製した。全mRNAを、分光光度分析(O.D.260/280nm)によって定量し、そしてゲル電気泳動によって分析した。
【0187】
(オリゴヌクレオチド:)
以下のHPLC精製したオリゴヌクレオチドを使用した。
【0188】
DPNCDN(cDNA合成プライマー)
【0189】
【化1】
(抑制サブトラクティブハイブリダイゼーション:)
抑制サブトラクティブハイブリダイゼーション(SSH)を、前立腺癌において差次的に発現され得る遺伝子に対応するcDNAを同定するために使用した。このSSH反応は、2つの異なる環境(すなわち、皮下(「LAPC−4 AD SQ」)および脛骨内(「LAPC−4 AD IT」)の増殖環境)において増殖するLAPC−4 AD異種移植片由来のcDNAを使用した。ここで、このLAPC−4 AD IT異種移植片は、「テスター」cDNAの供給源として使用され、一方、LAPC−4 AD SQ異種移植片は、「ドライバー」cDNAの供給源として使用された。
【0190】
テスターcDNAおよびドライバーcDNAに対応している二本鎖のcDNAを、上記に記載するように、異種移植片組織から単離した2μgのポリ(A)+RNAから、CLONTECHのPCR−Select cDNA Subtraction Kitおよび1ngのオリゴヌクレオチドDPNCDNをプライマーとして使用して、合成した。第1鎖および第2鎖の合成を、キットの使用者のマニュアルプロトコール(CLONTECH Protocol No.PT1117−1、Catalog No.K1804−1)に記載されているように行った。得られたcDNAを、DpnIIで3時間、37℃で消化した。消化したcDNAを、フェノール/クロロホルム(1:1)で抽出し、そしてエタノール沈殿させた。
【0191】
ドライバーcDNAを、ヒトの細胞株HeLa、293、A431、Colo205、およびマウスの肝臓に由来するDpn II消化したcDNAを合わせることによって生成した。テスターcDNAを、関連の異種移植片供給源(上記を参照のこと)由来の1μlのDpn IIで消化したcDNA(400ng)を、5μlの水中に稀釈することによって生成した。次いで、稀釈したcDNA(2μl、160ng)を、2μlのアダプター1およびアダプター2(10μM)に対して、別々の連結反応において、10μlの全容量中で16℃で一晩、400uのT4 DNAリガーゼ(CLONTECH)を使用して連結させた。連結を、1μlの0.2MのEDTAおよび72℃で5分間の加熱を用いて停止させた。
【0192】
最初のハイブリダイゼーションを、1.5μl(600ng)のドライバーcDNAを、1.5μg(20ng)のアダプター1およびアダプター2を連結させたテスターcDNAを含有している2つのそれぞれのチューブに添加することによって行った。4μlの最終容量中で、サンプルにミネラルオイルを重層し、MJ Researchサーマルサイクラー中で98℃で1.5分間変性させ、次いで68℃で8時間ハイブリダイズさせた。次いで、2つのハイブリダイゼーションを、さらなる1μlの新しい変性ドライバーcDNAとともに混合し、そして68℃で一晩ハイブリダイズさせた。次いで、第2回目のハイブリダイゼーションを、20mMの200μlのHepes(pH8.3)、50mMのNaCl、0.2mMのEDTA中に稀釈し、70℃で7分間加熱し、そして−20℃で保存した。
【0193】
(SSHによって生成した遺伝子フラグメントのPCR増幅、クローニング、および配列決定)
SSH反応によって得られた遺伝子フラグメントを増幅するために、2回のPCR増幅を行った。最初のPCR反応においては、1μlの稀釈した最終のハイブリダイゼーション混合物を、25μlの最終容量中の1μlのPCRプライマー1(10μM)、0.5μlのdNTP混合物(10μM)、2.5μlの10×反応緩衝液(CLONTECH)、および0.5μlの50×Advantage cDNAポリメラーゼMix(CLONTECH)に対して、添加した。PCR1を、以下の条件を使用して行った:75℃で5分間、94℃で25秒間、次いで27サイクルの、94℃で10秒間、66℃で30秒間、72℃で1.5分間。5個の別々の最初のPCR反応を、それぞれの実験について行った。生成物をプールし、そして水で1:10に稀釈した。第2回目のPCR反応については、プールしそして稀釈した最初のPCR反応物を、プライマーNP1およびNP2(10μM)をPCRプライマー1の代わりに使用したことをのぞいて、PCR1について使用したものと同じ反応混合物に対して添加した。PCR2を、10〜12サイクルの、94℃で10秒、68℃で30秒、72℃で1.5分を使用して行った。PCR産物を、2%のアガロースゲル電気始動を使用して分析した。
【0194】
PCR産物を、T/Aベクタークローニングキット(Invitrogen)を使用してpCR2.1中に挿入した。形質転換したE.coliを、青色/白色選択およびアンピシリン選択に供した。白色のコロニーを採取し、そして96ウェルプレート中に並べ、そして液体培養物中で一晩増殖させた。挿入物を同定するために、PCR増幅を、1mlの細菌培養物について、PCR1の条件、ならびにプライマーとしてNP1およびNP2を使用して行った。PCR産物を、2%のアガロースゲル電気始動を使用して分析した。
【0195】
細菌クローンを、96ウェル形式で20%のグリセロール中に保存した。プラスミドDNAを調製し、配列決定し、そしてGenBank、dBest、およびNCI−CGAPデータベースの核酸相同性検索に供した。
【0196】
(RT−PCR発現分析:)
第1鎖のcDNAを、1μgのmRNAからオリゴ(dT)12〜18プライミングを用いて、Gibco−BRL Superscript Preamplification systemを使用して作製した。製造業者のプロトコールを使用し得、そしてこのプロトコールは、逆転写酵素を用いた42℃で50分間のインキュベーション、続く20分間の37℃でのRNase H処理を含んだ。反応の完了後、容量を、較正の前に水を用いて200μlに増大させた。16個の異なる正常なヒトの組織に由来する第1鎖のcDNAを、Clontechから入手した。
【0197】
複数の組織に由来する第1鎖のcDNAの較正を、β−アクチンを増幅するためのプライマー5’atatcgccgcgctcgtcgtcgacaa3’(配列番号11)および5’agccacacgcagctcattgtagaagg3’(配列番号12)を使用することによって、行った。第1鎖のcDNA(5μl)を、0.4μMのプライマー、0.2μMの各dNTP、1×PCR緩衝液(Clontech、10mMのTris−HCL、1.5mMのMgCl2、50mMのKCl、pH8.3)、および1×Klentaq DNAポリメラーゼ(Clontech)を含有している全容量50μl中で増幅させた。5μlのPCR反応物を、18、20、および22サイクルで取り出し、そしてアガロースゲル電気泳動に使用した。PCRを、MJ Researchサーマルサイクラーを使用して、以下の条件下で行った:最初の変性は、94℃で15秒間、続いて、18、20、および22サイクルの、94℃で15秒、65℃で2分、72℃で5秒。72℃での最後の伸張を、2分間行った。アガロースゲル電気泳動後、複数の組織からの283bpのβ−アクチンバンドのバンド強度を、目視検査によって比較した。第1鎖のcDNAについての稀釈係数を、22回のPCRサイクルの後の全ての組織中で等量のβ−アクチンのバンド強度を生じるように計算した。3回の較正が、22回のPCRサイクルの後に全ての組織中で等しいバンド強度を達成するために必要であった。
【0198】
36P6D5遺伝子の発現レベルを決定するために、5μlの較正した第1鎖のcDNAを、以下のプライマーの対を使用する25、30、および35サイクルの増幅を使用するPCRによって分析した:
【0199】
【化2】
半定量的な発現分析を、明るいバンド強度を生じるサイクル数でのPCR産物を比較することによって達成した。
【0200】
(結果)
材料および方法(上記)に記載するSSH実験は、多数の候補遺伝子フラグメントクローン(SSHクローン)の単離を導いた。全ての候補のクローンを配列決定し、そして、対応する遺伝子の正体についての情報を提供するため、および異なる発現について特定の遺伝子を分析するための指針を補助するために、主要な一般的な遺伝子およびESTデータベース中の全ての配列に対する相同性分析に供した。一般的には、任意の検索されるデータベース中のいずれの公知の配列遺伝子フラグメントに対しても相同性を有さず、従って、新規の遺伝子を提示すると考えられる遺伝子フラグメント、ならびに以前に配列決定された発現される配列タグ(EST)に対して相同性を示す遺伝子フラグメントを、RT−PCRおよび/またはノーザン分析による異なる発現の分析に供した。
【0201】
約427bpを含有しているSSHクローンの1つは、いずれの公知の遺伝子に対して相同性を示さず、そして36P6D5と命名された。RT−PCRの最初の発現分析は、他のサンプルと比較して、LAPC−4 AD(IT)および正常な前立腺において最高の発現を示した。従って、このクローンは、以下の図2に示す36P6D5をコードする全長のcDNAフラグメントを示す。
【0202】
(実施例2)
(36P6D5遺伝子をコードする全長cDNAの単離)
423bpの単離した36P6D5遺伝子フラグメントを、ヒト前立腺cDNAライブラリにおける36P6D5の全長cDNAを同定するためのプローブとして使用した。これにより、931bpのcDNA、36P6D5−GTC4(これは、2つの以前に報告された配列、2〜19タンパク質前駆体(Genbank P98173)およびGS3786(Q92520)と称されるヒト骨芽細胞に対して有意な相同性を有する235アミノ酸ORFをコードする)を単離した。
【0203】
クローン36P6D5−GTC4 cDNAのヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を図1に示す。コードされたアミノ酸配列は、N末端シグナル配列を示し、これにより分泌されるタンパク質が(PSORTプログラムを使用して)予測される。2〜19タンパク質前駆体および骨芽細胞タンパク質GS3786との36P6D5タンパク質のアミノ酸配列アライアメントを図2に示す。
【0204】
(実施例3)
(36P6D5遺伝子発現のノーザンブロッド分析)
正常ヒト組織中での36P6D5 mRNAの発現を、最初に、全部で16個の異なる正常ヒト組織を含有している、2つの複数の組織ブロット(Clontech;Palo Alto,California)のノーザンブロッティングによって、プローブとして標識した36P6D5 cDNAを使用して、分析した。RNAサンプルを、β−アクチンプローブを用いて定量的に較正した。この分析の結果を図3に示し、そしてこの結果は、試験した16この組織内で、36P6D5遺伝子は膵臓において優勢に発現され、前立腺および小腸において非常に低いレベルで発現されることが検出されたことを示す。
【0205】
さらに、ヒト眼組織および細胞株における36P6D5発現を分析するために、LAPC−4ヒト前立腺癌異種移植片由来のRNAおよび非前立腺癌細胞株のパネル由来のRNAを、36P6D5 cDNAをプローブとして使用するノーザンブロットによって分析した。全てのRNAサンプルを、エチジウムブロマイド染色、続く標識したβ−アクチンプローブを用いる分析によって定量的に較正した。この分析の結果を図4に示し、正常な前立腺と比較して全ての場合において、高レベルで皮下および脛骨内で増殖するLAPC−4前立腺癌異種移植片における36P6D5発現を示す。さらに、有意な発現は、いくつかの非前立腺癌細胞株(膵臓癌細胞(Capan−1)、結腸癌細胞(CaCo−2、Colo−205)、乳癌細胞(CAMA−1,DU4475)、および卵巣癌細胞(SW626、CAOV−3、OV1063)を含む)において検出され、いくつかの場合において高レベルで検出された。特に、最高レベルの発現は、乳癌細胞株DU4475において検出された。
【0206】
(実施例4)
(組換え36P6D5の産生および精製)
36P6D5タンパク質の細胞成分局在化の分析のような多数の状況において使用するための組換え36P6D5を提示するために、部分または全長cDNAを、カルボキシル末端において6Hisタグを提供する発現ベクターのような様々な発現ベクター(例えば、pCDNA 3.1 myc−his、InVitrogen)のうちの任意の1つにクローン化し得る。
【0207】
典型的な実施形態において、36P6D5タンパク質の高レベルな発現を駆動するために、36P6D5 cDNAコードアミノ酸30〜235(マイナスN末端シグナル配列)を、提供されたアルカリホスファターゼ(AP)cDNA配列と共に、およびこれに融合することなく、pAPTag5哺乳動物分泌ベクター(GenHunter)にクローン化した。このベクターは、精製および検出のためのC末端6×HisおよびMYCタグ、ならびに分泌を駆動するN末端Igリーダー配列を提供する。pAPTag5−36P6D5またはpTag5−36P6D5(APに融合しない)のいずれかを安定に発現する293T細胞は、これらの細胞株由来の条件付き培地の抗Hisウエスタンブロットによって可視化されるように、精製のための組換えタンパク質の供給源として働く(図5)。条件付き培地中に存在するHISタグ化36P6D5タンパク質は、以下の方法を使用して精製される。条件付き培地を5〜10倍に濃縮し、そして同時に、10kd MWカットオフ膜を用いて、アミコン(amicon)限外濾過装置を使用して、緩衝液を、500mM NaClおよび20mM イミダゾールを含むリン酸緩衝液(pH8.0)(緩衝液A)に交換した。この調製物は、0.1〜0.5mlのニッケル金属親和性樹脂(Ni−NTA、Qiagen)に結合したバッチであり、緩衝液Aで広範に洗浄される。次いで、HISタグ化SGP−28/CRISP−3タンパク質を、300mM NaClを含有するリン酸緩衝液(pH 6.3)中の0〜400mMの勾配のイミダゾールで溶出し、次いで、PBSで広範に透析した。精製したタンパク質は、次いで、増殖アッセイのため、リガンド結合研究のため、または抗体試薬を精製するための免疫原として使用し得る。
【0208】
典型的な構築物のさらなる実施形態は以下に提供される。
【0209】
(pcDNA3.1/MycHis構築物)
哺乳動物細胞中で36P6D5を発現させるために、705bp(235アミノ酸)の36P6D5 ORFを、pcDNA3.1/MycHis Version A(Invirtogen,Carlsbad,CA)にクローン化した。タンパク質の発現は、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーターから駆動される。組換えタンパク質は、C末端に融合されたmycおよび6個のヒスチジンを有する。pcDNA3.1/MycHisベクターはまた、エピソームの複製のためのSV40起点およびラージT抗原を発現する細胞株中での単純なベクターレスキューとともに、mRNAの安定性を増強するために、ウシの成長ホルモン(BGH)ポリアデニル化シグナルおよび転写終結配列を含む。ネオマイシン耐性遺伝子は、タンパク質およびアンピシリン耐性遺伝子を発現する哺乳動物細胞の選択を可能にし、そしてColE1起点は、E.coli中でのプラスミドの選択および維持を可能にする。
【0210】
(pAPtag)
シグナル配列(アミノ酸30〜235)を有さない36P6D5タンパク質を、pAPtag−5(GenHunter Corp.Nashville,TN)にクローン化した。この構築物は、IgGKシグナル配列をN末端に融合しつつ、36P6D5タンパク質のC末端でアルカリホスファターゼ融合を生成する。得られる組換え36P6D5タンパク質は、トランスフェクトされた哺乳動物細胞の培地に分泌するために最適化され、そして36P6D5タンパク質と相互作用するリガンドまたはレセプターのようなタンパク質を同定するために使用され得る。タンパク質発現は、CMVプロモーターから駆動され、そして組換えタンパク質はまた、アルカリホスファターゼのC末端に融合したmycおよび6個のヒスチジンを含み得る。Zeosin耐性遺伝子によって、このタンパク質を発現する哺乳動物細胞の選択が可能となり、そしてアンピシリン耐性遺伝子によって、E.coliにおけるプラスミドの選択が可能となる。
【0211】
(ptag5)
シグナル配列(アミノ酸30〜235)を有さない36P6D5タンパク質をまた、pTag−5にクローン化した。このベクターは、pAPTagに類似しているが、アルカリホスファターゼ融合を有さない。
【0212】
(pSRa構築物)
構成的に36P6D5を発現する哺乳動物細胞株を作製するために、705bp(235アミノ酸)のORFをpSRα構築物中にクローン化した。両栄養性およびエコトロピックなレトロウイルスを、pSRα構築物の293T−10A1パッケージング株中へのトランスフェクション、またはpSRαとヘルパープラスミド(j−)の293細胞中への同時トランスフェクションによって、それぞれ作製する。レトロウイルスを、種々の哺乳動物細胞株を感染させるために使用し得、それによってクローン化した遺伝子である36P6D5の宿主細胞株中への組込みを生じる。タンパク質の発現は、長末端反復(LTR)から駆動される。ネオマイシン耐性遺伝子は、タンパク質およびアンピシリン耐性遺伝子を発現する哺乳動物細胞の選択を可能にし、そしてColE1起点は、E.coli中でのプラスミドの選択および維持を可能にする。抗FLAG抗体を使用する検出を可能にするためにC末端にFLAGタグを融合させたさらなるpSRα構築物を作製した。FLAGヌクレオチド配列をORFの3’末端のクローニングプライマーに付加した。
【0213】
さらなるpSRa構築物は、全長の36P6D5タンパク質のN末端およびC末端の両方のGFPおよびmyc/6His融合タンパク質を産生するために作製され得る。
【0214】
(実施例5)
(バキュロウイルス系での組換え36P6D5の産生)
バキュロウイルス発現系で組換え36P6D5タンパク質を作製するために、36P6D5 cDNAを、バキュロウイルス転移ベクターpBlueBac 4.5 (Invitrogen)中にクローン化する。このベクターは、N末端にHisタグを提供する。詳細には、pBlueBac−36P6D5を、組換えバキュロウイルスを作製するために、SF9(Spodoptera frugiperda)昆虫細胞中に、ヘルパープラスミドpBac−N−Blue(Invitrogen)とともに同時トランスフェクトする(詳細については、Invitrogenの説明マニュアルを参照のこと)。次いで、バキュロウイルスを、細胞上清から回収し、そしてプラークアッセイによって精製する。
【0215】
次いで、組換え36P6D5タンパク質を、精製したバキュロウイルスでのHighFive昆虫細胞(Invitrogen)の感染によって作製する。組換え36P6D5タンパク質を、抗36P6D5特異的抗体を使用して検出し得る。36P6D5タンパク質を精製し得、そして種々の細胞に基づくアッセイにおいて、または36P6D5について特異的なポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を作製するための免疫原として使用し得る。
【0216】
(実施例6)
(36P6D5ポリクローナル抗体の生成)
36P6D5に対するポリクローナル血清を作製するために、SGP−28/CRISP−3タンパク質配列のアミノ酸163〜177(MVTYDDGSTRLNNDA)(配列番号12)に対応するペプチドを合成し、キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)に結合し、そして以下のようにウサギを免疫するために使用した。このウサギを、最初に、完全フロイントアジュバント中で混合した200μgのペプチド−KLHを用いて免疫した。次いで、このウサギに、不完全フロイントアジュバント中の200μgのペプチド−KLHを2週間ごとに注射した。各免疫の約7〜10日後に、採血を行った。ELISAおよびウエスタンブロット分析を使用して、それぞれ、免疫ペプチドおよび36P6D5タンパク質に対するウサギ血清の特異性および力価を決定した。Affigel15(BioRad)に対して共有結合させた36P6D5ペプチド(MVTYDDGSTRLNNDA)(配列番号2のアミノ酸163〜177)から構成したアフィニティーマトリクスに、免疫したウサギ由来の粗血清を通過させることによって、アフィニティー精製した36P6D5ポリクローナル抗体を調製した。このマトリクスをPBSで大規模に洗浄した後、36P6D5ペプチドに対して特異的な抗体を、低いpHのグリシン緩衝液(0.1M、pH 2.5)で溶出し、直ちに中和し、そして大規模にPBSに対して透析した。
【0217】
このウサギポリクローナル抗体を36P6D5タンパク質との反応性について試験するために、pAPTag5−36P6D5発現ベクターまたはPTag5−36P6D5発現ベクターでトランスフェクトした293T細胞の馴化培地に対してウエスタンブロット分析を行った。アフィニティー精製したウサギ抗36P6D5 pAb(1μg/ml)は、293T細胞から分泌される両方の形態の組換え36P6D5タンパク質を認識する(図5)。
【0218】
(実施例7)
(36P6D5モノクローナル抗体の生成)
36P6D5モノクローナル抗体を生成するために、精製した293T発現HISタグ化36P6D5タンパク質を使用して、Balb/Cマウスを免疫する。Balb Cマウスに、完全フロイントアジュバント中で混合した36P6D5タンパク質50μgを最初に腹腔内に免疫する。続いて、マウスを、不完全フロイントアジュバント中で混合した36P6D5タンパク質50μgで、2週間毎に、合計3回免疫する。免疫したマウス由来の血清の、全長36P6D5タンパク質に対する反応性を、免疫原を使用するELISAによって、および36P6D5タンパク質を発現する細胞由来の馴化培地を使用するウエスタンブロットによってモニタリングする。最大の反応性を示すマウスを3週間休ませ、そして最後に、PBS中の融合タンパク質を注射し、次いで、4日後に屠殺する。次いで、この屠殺したマウスの脾臓を収集し、標準的な手順(HarlowおよびLane、1998)を使用して、SPO/2骨髄腫細胞または他の適切な骨髄腫融合パートナーに融合する。HAT選択の後の増殖ウェル由来の上清を、ELISAおよびウエスタンブロットによってスクリーニングして、36P6D5特異的抗体産生クローンを同定する。
【0219】
36P6D5モノクローナル抗体の結合親和性は、標準的な技術を使用して決定し得る。親和性の測定値は、エピトープ結合に対する抗体の強度を数量化し、そしてどの36P6D5モノクローナル抗体が診断的用途または治療的用途のために好ましいかを定義するのを助けるために使用し得る。BIAcoreシステム(Uppsala、Sweden)は、結合親和性を決定するための好ましい方法である。BIAcoreシステムは、表面プラスモン共鳴(SPR、Welford K.1991,Opt.Quant.Elect.23:1;MortonおよびMyszka,1998,Methods in Enzymology 295:268)を使用して、リアルタイムで生体分子の相互作用をモニタリングする。BIAcore分析は、都合良く、会合速度定数、解離速度定数、平衡解離定数、および親和性定数を導く。
【0220】
36P6D5モノクローナル抗体を生成するための典型的な方法の特定の例示において、精製した293T発現HISタグ化36P6D5タンパク質を使用して、3匹の雌性Balb Cマウスを免疫した。最初に、Balb Cマウスを、Ribiアジュバント中で混合した36P6D5タンパク質50μgで腹腔内(IP)で免疫し、そしてさらに二回、2週間間隔で、Ribiアジュバント中の36P6D5タンパク質25μgを腹腔内でブーストした。三回目のブーストの後、続いて、マウスを、PBS中のタンパク質25μgで、腹腔内に免疫した。4回目の免疫の後の試験採血のELISA分析は、この免疫原に対して免疫したマウスの各々について、少なくとも2×106の力価を示した。免疫されたマウス由来の血清は、前立腺癌(LAPC4異種移植片)、結腸癌(Colo 205、CaCo−2)、乳癌(DU4475)、および膵臓癌(Capan−1)由来の細胞株を含む様々な癌細胞株由来の細胞溶解物および馴化培地中の内因性36P6D5タンパク質を特異的に認識する(図9)。さらに、この血清から精製したポリクローナル抗体を使用して、PC−3−36P6D5細胞株およびDU4475細胞株の上清、ならびに臨床学的血清サンプル中の36P6D5タンパク質を特異的に検出する捕捉ELISAを開発した(表2)。抗36P6D5ハイブリドーマの生成のために、マウスに、25μgの36P6D5を腹腔内に最後にブーストし、3日後に屠殺し、そして脾臓細胞を収集し、そして標準的な手順を使用して骨髄腫パートナーに融合する(HarlowおよびLane,1988)。融合ハイブリドーマ増殖ウェル由来の上清を、ELISAおよびウエスタンブロットによってスクリーニングして、36P6D5特異的抗体産生クローンを同定する。
【0221】
これらの抗体を使用して、36P6D5タンパク質は、結腸癌、膵臓癌、および乳癌由来の細胞株を含むいくつかの細胞株において、ならびに前立腺癌異種移植片において検出された(図9)。さらに、36P6D5タンパク質は、このタンパク質を内因的に発現する細胞の馴化培地において検出され、このことは、このタンパク質が分泌タンパク質であり、そして診断血清マーカーとして働き得ることを示す。実際に、高感度の捕捉ELISAを使用して(図10)、36P6D5タンパク質は、7/10の結腸癌サンプル、および6/10の膵臓癌サンプルにおいて検出されたが、正常な雄性サンプルにおいては1/6しか検出されなかった(表2)。これらの結果は、36P6D5が、結腸癌および膵臓癌、ならびに前立腺癌および乳癌組織由来の癌を含む他の癌の診断標的、およびおそらく治療標的として働き得るという証拠を提供する。
【0222】
(実施例8)
(可能性のあるシグナル伝達経路の同定)
36P6D5が細胞中の公知のシグナル伝達経路を直接または間接的に活性化するかどうかを決定するために、ルシフェラーゼ(luc)に基づく転写レポーターアッセイを、36P6D5を発現する細胞中で行う。これらの転写レポーターは、十分に特徴付けられたシグナル伝達経路の下流に存在する公知の転写因子についてのコンセンサスな結合部位を含む。レポーターおよびそれらの会合する転写因子の例、シグナル伝達経路、および活性化の刺激を以下に列挙する。
【0223】
1.NFkB−luc、NFkB/Rel;Ik−キナーゼ/SAPK;増殖/アポトーシス/ストレス
2.SRE−luc、SRF/TCF/ELK1;MAPK/SAPK;増殖/分化
3.AP−1−luc、FOS/JUN;MAPK/SAPK/PKC;増殖/アポトーシス/ストレス
4.ARE−luc、アンドロゲンレセプター;ステロイド/MAPK;増殖/分化/アポトーシス
5.p53−luc、p53;SAPK;増殖/分化/アポトーシス
6.CRE−luc、CREB/ATF2;PKA/p38;増殖/アポトーシス/ストレス
36P6D5によって媒介される効果を、mRNAの発現を示す細胞(例えば、図4に示される36P65D発現細胞)中でアッセイし得る。ルシフェラーゼレポータープラスミドを、脂質によって媒介されるトランスフェクション(TFX−50、Promega)によって導入し得る。ルシフェラーゼ活性(相対的な転写活性の指標)を、ルシフェリン基質との細胞の抽出物のインキュベーションによって測定し、そして反応物の発光を、ルミノメーターでモニターする。
【0224】
(実施例9)
(36P65D機能のインビトロアッセイ)
癌における36P65Dの発現プロフィールは、この遺伝子が腫瘍開始、進行および/または維持における機能的役割を示唆する。36P65Dは、骨における前立腺癌細胞の増殖を刺激する分泌因子として機能し得る。増殖シグナルを活性化することに関与するレセプターとして機能する可能性がある。36P65D機能を、インビトロアプローチを用いて哺乳動物細胞中で評価し得る。哺乳動物発現について、36P65Dを、pcDNA 3.1 myc−His−タグおよびレトロウイルスベクターpSRαtkneo(Mullerら、1991、MCB 11:1785)を含む多くの適切なベクター中にクローン化し得る。このような発現ベクターを用い、例えば、36P65Dを、PC−3、NIH3T3、LNCaPおよび293Tを含むいくつかの癌細胞株で発現し得る。36P65Dの発現を、抗−36P65D抗体を用いてモニターし得る。
【0225】
36P65Dを発現する哺乳動物細胞株を、いくつかのインビトロアッセイおよびインビボアッセイで試験し得、このアッセイには、組織培養中の細胞増殖、アポトーシスシグナルの活性化、SCIDマウスにおける一次および転移性の腫瘍形成、および膜侵襲培養系(MICS)を用いるインビトロ侵襲(Welchら、Int.J.Cancer 43:449−457)が含まれる。36P65D細胞表現型を、36P65Dの発現を欠く細胞の表現型と比較する。
【0226】
36P65Dを発現する細胞株はまた、マトリゲルでコートされた多孔性膜チャンバ(Becton Dickinson)を通る細胞の通過を測定することにより、侵襲特性および遊走特性の変化についてアッセイされ得る。向かい合う側への膜を通る細胞の通過を、カルセイン−Am(Molecular Probes)を負荷したインジケーター(indicator)細胞を用いる蛍光アッセイ(Becton Dickinson Technical Bulletin #428)を用いてモニターする。分析される細胞株は、親および36P65Dを過剰発現する、PC3細胞、3T3細胞ならびにLNCaP細胞を含む。36P65Dが化学誘引物質の性質を有するか否かをアッセイするために、親のインジケーター細胞を、コントロール培地と比較して36P65D馴化培地の勾配に向かっての多孔性膜を通る通過についてモニターする。このアッセイはまた、候補の癌治療組成物による36P65Dで誘導される効果の特異的中和を定性および定量するために用い得る。細胞をまた、外的に添加した精製36P65Dタンパク質の存在下および非存在下において、増殖の変化、接着性の変化、および侵襲性の変化についてモニタリングし得る。
【0227】
別の機能的アッセイにおいて、36P65Dを安定に発現する細胞は、軟寒天においてコロニーを形成するそれらの能力について分析され得る。これらの実験において、36P65Dの形質転換能力を評価するために、このような手順に使用される細胞(例えば、NIH−3T3細胞)をトランスフェクトして、36P65Dまたはneoまたは活性化Ras(それぞれ、試験遺伝子、陰性コントロールおよび陽性コントロールとして)を安定に発現させ得る。典型的に、実験は二連で行い、そしてアッセイは、細胞プレーティングの約4週間後に評価する。実験的な観察が、36P65Dは陰性コントロール(例えば、neo)と比較してコロニー形成の増加を誘導することを示す場合、このような結果は、36P65Dが有意な形質転換能力を有することを示す。
【0228】
別の機能アッセイにおいて、親細胞および36P65Dを発現する細胞を、cAMPの細胞質蓄積を誘導するそれらの能力について比較し得る。代表的な実施形態において、LAPC異種移植片(または、293T細胞のような任意の種々の細胞)のような細胞を、36P5D5に曝露させ得、そして/または空のpcDNA4 HIS MAXベクターまたはpcDNA4 HIS MAX 36P5D5でトランスフェクトし得る。代表的には、細胞を、1% ウシ胎仔血清(FBS)中で一晩飢餓させ、そして培地のみ、あるいは分泌分子または10%FBSの存在下でインキュベートする。次いで、細胞を溶解し、そして製造業者の推奨(Linco Research,St Charles,MI)に従う、酵素連結イムノアッセイ(EIA)によってcAMP含量について分析する。
【0229】
多くの遺伝子は、cAMPシグナル伝達経路を活性化することによって腫瘍形成機能において役割を果たすものとして同定された。代表的に、リガンドの非存在下では、シグナル伝達分子は、通常、不活性状態にある。リガンドの結合または過剰発現に際して、このような分子は、活性形態を獲得し、そしてGタンパク質と複合体化する。この相互作用は、Gタンパク質サブユニットの解離およびアデニル酸シクラーゼの活性化を生じ、これが、cAMP蓄積を生じる(Birnbaumer L,Cell 1992、71:1069)。cAMPの増強された産生は、いくつかの下流のシグナル伝達経路の活性化を生じ、これらの経路は、このような分子の効果を調節する。36P6D5によって接触されたかまたは36P6D5でトランスフェクトされた細胞が、FBSに応答してcAMPの蓄積を導くことの実証は、36P65Dが、これらの条件下でシグナル伝達分子として機能することを示す。
【0230】
(実施例10)
(36P6D5腫瘍増殖促進についてのインビボアッセイ)
腫瘍細胞増殖に対する36P6D5タンパク質の効果を、腫瘍保有マウスにおける遺伝子過剰発現によって、インビボで評価し得る。例えば、SCIDマウスに、tkNeo空ベクターまたは36P65Dを含む1×106の多くの前立腺癌細胞株、乳癌細胞株、結腸細胞株、膵臓細胞株および卵巣細胞株を、各側腹部にSQ注射し得る。以下の少なくとも2つのストラテジーが使用され得る:(1)LTRプロモーターの調節下での構成的36P65D発現、および(2)誘導性ベクター系(例えば、エクジソン、tetなど)の制御下での調節された発現。次いで、腫瘍容積を、触知可能な腫瘍の出現時に、そしてその後、経時的にモニターして、36P6D5発現細胞が、より速い速度で増殖するか否かを決定する。さらに、マウスに、1×105の同じ細胞を同所移植し得、36P6D5が、標的組織(例えば、前立腺)における局所増殖に対する効果、または特に肺、リンパ節、肝臓、骨髄などに転移するそれらの細胞の能力に対する効果を、有するか否かを決定する。前立腺癌と比べて、骨髄腫瘍の形成および増殖に対する36P6D5の効果は、実施例1に記載のように、前立腺腫瘍細胞を脛骨内に注射することによって評価され得る。
【0231】
このアッセイはまた、例えば、36P6D5抗体、36P6D5アンチセンス分子およびリボザイムのような候補治療組成物の、36P6D5阻害効果を決定するために有用である。
【0232】
(実施例11)
(36P6D5タンパク質相互作用のインビトロアッセイ)
36P6D5を発現する細胞株をまた使用して、36P6D5によって媒介されるタンパク質−タンパク質相互作用を同定し得る。36P6D5が、細胞に結合する分泌分子であるという観察(図8を参照のこと)は、この分子が、細胞表面上で他のタンパク質と相互作用するという証拠を提供する。この相互作用は、他者によって示されるような免疫沈降技術(Hamilton BJら、Biochem.Biophys.Res.Commun.1999,261:646−51)を使用して試験され得る。36P6D5タンパク質は、36P6D5発現前立腺癌細胞株から免疫沈降され得、そしてウエスタンブロッティングによってタンパク質会合について試験され得る。タンパク質相互作用はまた、Shnyrevaら(Shnyreva Mら、J Biol Chem.2000.19;275;15498−503)に記載されるような、酵母ツーハイブリッド系によって研究され得る。これらのアッセイはまた、36P6D5機能に対する、潜在的な癌治療剤の効果を分析するために使用され得る。
【0233】
36P6D5機能に対する36P6D5 ORF内に含まれる種々のドメインの寄与を決定するために、36P6D5変異体を、1以上のドメインを欠失することにより生成し得る。変異体36P6D5タンパク質を発現する細胞株を、増殖、浸潤、移動、転写活性化およびタンパク質−タンパク質相互作用における変化について評価し得る。
【0234】
(実施例12)
(36P6D5の染色体局在)
36P6D5の染色体局在を、GeneBridge4放射線照射ハイブリッドパネル(Walterら、1994、Nat.Genetics 7:22)(Research Genetics,Huntsville A1)を使用して決定した。以下のPCRプライマーを、36P6D5を局在化するために使用した:
【0235】
【化3】
この93個の放射線照射ハイブリッドパネルDNAについての得られたマッピングベクターは以下であった:
【0236】
【化4】
インターネットアドレスhttp://www−genome.wi.mit.edu/cgi−bin/contig/rhmapper.plに見い出され得るこのマッピングプログラムは、36P6D5を、染色体21p22.2〜22.3にマッピングする。
【0237】
(実施例13)
(ヒト癌における36P6D5タンパク質の発現の検出)
図9に示されるように、癌細胞のサブセットは、36P6D5タンパク質を発現しそして分泌する。以下由来の癌を提示する種々の癌細胞株(前立腺組織(LAPC4異種移植片)、結腸組織(Colo 205、CaCo−1)、乳房組織(Du4475)および膵臓組織(Capan−1))、ならびに36P6D5タンパク質を過剰発現するよう操作されたPC3前立腺癌細胞からの、馴化培地および/または細胞溶解物を、抗36P6D5マウスpAbを使用するウエスタンブロット分析に供した。手短に言うと、細胞(約25μgの総タンパク質)および馴化培地(25μlのきれいな(neat)、0.22μM 濾過培地)を、SDS−PAGEサンプル緩衝液中に可溶化し、そして10〜20% SDS−PAGEゲル上で分離し、ニトロセルロースに転写した。ブロットを、Tris緩衝化生理食塩水(TBS)+3% 脱脂乳中でブロックし、次いで、精製36P6D5タンパク質で免疫した、1:1,000希釈(TBS+0.15% Tween−20+1% ミルク中)のマウス由来の血清でプローブした。次いで、ブロットを洗浄し、1:4,000希釈の抗マウスIgG−HRP結合体化二次抗体と共にインキュベートした。洗浄後、抗36P6D5免疫反応性のバンドを発色させ、そして増強化学ルミネセンスによって可視化し、そしてオートラジオグラフィーフィルムに露光した。内因性36P6D5タンパク質を表す、特異的抗36P6D5免疫反応性のバンドを、矢印で示し、これは、約35kDと40kDとの間に泳動される。アミノ酸配列から計算した36P6D5の分子量は、26kDであり、これは、内因性36P6D5タンパク質が、翻訳後修飾される(おそらく、グリコシル化によって)ことを示唆する。これらの結果は、36P6D5が、前立腺、結腸、乳房、膵臓および潜在的に他のヒト癌についての、診断的および治療的標的として有用であり得ることを実証する。
【0238】
図10に示されるように、高感度かつ特異的な捕捉ELISAは、ヒト癌細胞株の上清において36P6D5タンパク質を検出する。捕捉ELISAを、捕捉Abとして、プロテインGで精製したマウス抗36P6D5 pAb、および検出Abとして、同じpAbのビオチン化形態を使用して発色させた。手短には、1μgの精製マウス抗36P6D5 pAbを使用して、ELISAプレートのウェルをコートした。3% ミルクを含有するPBSでのブロッキング後、PC3−neo、PC3−36P6D5またはDU4475細胞のいずれかからの50μlの馴化培地、または組織培養培地中に添加した種々の量の精製Tag5−36P6D5タンパク質を、ウェルに添加し、そして室温で2時間インキュベートした。ウェルを、PBS+0.05% Tween−20(PBS−T)で4回洗浄し、そしてPBSで1回洗浄した。次いで、ウェルを、PBS−T+1% ミルク(TBS−TM、50μl/ウェル)中の3μg/mlのビオチン化抗36P6D5 pAbと共に1時間インキュベートし、そして上記のように洗浄した。次いで、ウェルを、TBS−TM中の50μlの1:8,000希釈のアビジン−HRP複合体(NeutraliteTM、Southern Biotechnology,Inc)と共に、1時間インキュベートした。洗浄後、次いで、ウェルを、200μlのTMB基質の添加によって発色させた。この反応を、50μlの1M H2SO4の添加によって停止し、そしてウェルの吸光度を、450nMで読み取った。Tag5−36P6D5タンパク質を使用して作成した標準曲線、ならびに36P6D5を過剰発現するPC−3細胞由来の上清中に存在する36P6D5およびDu4475乳癌細胞によって分泌される内因性36P6D5タンパク質の特異的検出および定量を示す。
【0239】
図11はまた、ヒト癌における36P6D5発現を示す。図11(ヒト癌における36P6D5の発現を検出するための代表的方法)に示されるように、結腸、乳房および腎臓の癌組織由来の細胞溶解物(Ca)、ならびにそれらの正常な対応する隣接組織(N)を、抗36P6D5マウスモノクローナル抗体を使用するウェスタン分析に供した。手短に言うと、細胞(約25μgの総タンパク質)を、SDS−PAGEサンプル緩衝液中に可溶化し、そして10〜20% SDS−PAGEゲル上で分離し、ニトロセルロースに転写した。ブロットを、Tris緩衝化生理食塩水(TBS)+3% 脱脂乳中でブロックし、次いで、2μg/ml(TBS+0.15% Tween−20+1% ミルク中)の、精製抗36P6D5抗体でプローブした。次いで、ブロットを洗浄し、1:4,000希釈の抗マウスIgG−HRP結合体化二次抗体と共にインキュベートした。洗浄後、抗36P6D5免疫反応性のバンドを発色させ、そして増強化学ルミネセンスによって可視化し、そしてオートラジオグラフィーフィルムに露光した。特異的な抗36P6D5免疫反応性のバンドは、モノマー形態の36P6D5タンパク質(これは、約35kDと40kDとの間に泳動される)およびマルチマー形態の36P6D5タンパク質(これは、約90kDと120kDとの間に泳動される)を表す。これらの結果は、36P6D5が、結腸、乳房、腎臓および潜在的に他のヒト癌についての、診断的および治療的標的として有用であり得ることを実証する。
【0240】
本出願を通じて、種々の刊行物が括弧内に参照されている。これらの刊行物の開示は、それらの全体が本明細書に参考として援用されている。
【0241】
本発明は、本明細書に開示される実施形態により範囲を限定されるべきではない。これらの実施形態は、本発明の個々の局面の単なる例示として意図され、そして機能的に等価であるすべてのものが、本発明の範囲内にある。本明細書に記載のモデルおよび方法に加えて、本発明のモデルおよび方法に対する種々の改変が、上記の記述および教示から当業者に明らかとなり、そして本発明の範囲内にあることが同様に意図される。このような改変またはその他の実施の形態は、本発明の真の範囲および趣旨から逸脱することなく実施され得る。
【0242】
(表)
(表1:ヒトMHCクラスI分子HLA−A2への36P6D5タンパク質由来のペプチドの予測される結合)
【0243】
【表1】
(表2:36P6D5は癌患者由来の血清サンプルにおいて検出される)
【0244】
【表2】
膵臓癌患者および正常男性ドナー由来の臨床血清サンプルを、図10に記載されるように、捕捉ELISAを使用して36P6D5タンパク質についてスクリーニングした。PC−3−36P6D5およびDu4475細胞、ならびにPC−3−neo由来の上清は、それぞれ、36P6D5タンパク質検出についての、ポジティブコントロールおよびネガティブコントロールとして機能した。ND;非検出または検出感度未満。36P6D5タンパク質は、10人中7人の結腸癌患者および10人中6人の膵臓癌患者(そのうちの1人は、比較的高いレベル(29.70ng/ml)を有した)において検出されたが、正常男性ドナーでは、6人中1人しか検出されなかった。
【図面の簡単な説明】
【図1】 図1A〜1Bは、36P6D5 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号1)および推定されるアミノ酸配列(配列番号2)である。開始メチオニンおよびコンセンサスKozak配列が太字で示され、そして推定N末端シグナル配列に下線が引かれている。
【図2】 図2A〜2Bは、2〜19のタンパク質前駆体(2A)(配列番号15)およびGS3786タンパク質(骨芽細胞タンパク質)(2B)(配列番号16)を有する36P6D5 ORFのアミノ酸整列である。配列%同一性が図に示される。
【図3】 図3は、種々の正常な組織におけるヒト36P6D5発現のノーザンブロット分析を示し、これは、膵臓における優位な発現および前立腺および小腸における低い程度の発現を示す。
【図4】 図4A〜4Bは、前立腺癌移植片および種々の他のヒト癌細胞系列のパネルにおけるヒト36P6D5 mRNAのノーザンブロット分析を示す。
【図5】 図5A〜5Bは、トランスフェクトされた263T移細胞のからの36P6D5タンパク質の分泌および抗36P6D5ポリクローナル抗体出の検出を示す。239T細胞は、一過的に、pCDNA 3.1 MYC/HIS 36P6D5、pTag5 36P6D5のいずれかで、一過的にトランスフェクトされ、ここで、36P6D5の天然のシグナル配列が、免疫グロブリンシグナル配列またはpAPTag5 36P6D5(これは、36P6D5よおびアルカリホスファターゼからなる融合タンパク質をコードする)(また、Igシグナル配列を含む)で置換される。馴化培地または全細胞溶解物が、ウサギ抗His pAb(Santa Cruz、Biotechnology,Inc.,1:2,500の希釈、左側のパネル)またはアフィニティ精製されたウサギ抗36P6D5 pAb(1ug/ml、右側のパネル)を用いるウエスタンブロッティングに供した。抗Hisおよび抗36P6D5 pAbの活性バンドが、抗ウサギHRP結合体化二次抗体を含むブロットのインキュベーション、続く増強された化学発光検出によって可視化された。
【図6】 図6は、癌患者の腫瘍における36P6D5の発現を示す。膀胱癌、腎臓癌、結腸癌、および肺癌の患者の腫瘍における36P6D5 mRNA発現のRT−PCR分析。
【図7】 図7は、膀胱癌およびそれらの一致する正常な組織における36P6D5発現を、ノーザンブロット分析によって試験したことを示す。この図について、10μgの総RNAを各サンプルに充填した。36P6D5発現の過剰発現を、試験した4つ癌(レーン3、5、7および8)のうちの3つで検出した。正常な個体から単離された膀胱組織において、発現は見られなかった(レーン1)。
【図8】 図8は、LAPC9 ADへの36P6D5の結合を示す。LAPC9 ADの異種移植片細胞の単一細胞懸濁液を、6ウェルプレートに一晩接着させた。この細胞を、コントロールまたは36P6D5−APの存在下でインキュベートした。アルカリホスファターゼ(phosphate)基質であるBM purpleを検出のために使用した。
【図9】 図9A〜9Bは、ヒト癌細胞が、36P6D5タンパク質を発現し、そして分泌することを示す。前立腺組織(LAPC4 異種移植片)、結腸組織(Colo 205、CaCo−1)、乳房組織(Du4475)、および膵臓組織(Capan−1)由来の癌、ならびに36P6D5タンパク質を過剰発現するように操作されたPC3前立腺癌細胞を代表する種々の癌細胞系列からの馴化培地および/細胞溶解物を、抗36P6D5マウスpAbを使用するウエスタン分析に供した。内因性36P6D5タンパク質を表す特異的抗36P6D5免疫反応性バンドが、矢印で示され、そしてほぼ35kDと40kDの間に移動する。アミノ酸配列から計算された36P6D5の分子量は、26kDであり、これは、内因性36P6D5タンパク質が、おそらくグリコシル化によって翻訳後に改変されたことを示唆する。
【図10】 図10は、敏感で特異的な捕獲ELISAが、ヒト癌細胞系列の上清において36P6D5を検出することを示す。捕獲ELISAは、プロテインG精製マウス抗36P6D5 pAbを捕獲Abとして、そしてビオチン化形態の同じpAbを検出Abとして使用して開発された。Tag5−36P6D5タンパク質を使用して作製された標準曲線が示され、そしてPC−3−Neoトランスフェクトされた細胞(O.D.=0.023、36P6D5タンパク質濃度(ng/ml)=N.D.)、36P6D5を過剰発現するPC−3細胞(O.D.=0.186、36P6D5タンパク質濃度(ng/ml)=1.48)、Du4475乳癌細胞によって分泌された内因性36P6D5タンパク質(O.D.=0.085、36P6D5タンパク質濃度(ng/ml)=0.50)由来の上清荷存在する36P6D5の特異的検出および定量が示される。
【図11】 図11A〜11Bは、ヒト癌における36P6D5の検出を示す。結腸癌組織、乳癌組織および腎臓癌組織からの細胞溶解物(Ca)、ならびにそれらの隣接する正常な組織からの細胞溶解物(N)を、抗36P6D抗体を使用するウエスタンブロットに供した。特異的抗36P6D5免疫反応性バンドは、36P6D5タンパク質のモノマー形態(これは、ほぼ35kDと40kDとの間に移動する)、およびこのタンパク質のマルチマー形態を(これは、ほぼ90kDと120kDとの間に移動する)を表す。
【配列表】
Claims (16)
- 個体における膀胱、結腸、腎臓、乳房、肺、卵巣、または前立腺の癌の存在を検出するためのキットであって、該個体由来の試験組織サンプル中の細胞により発現される36P6D5タンパク質の発現レベルを決定するための手段を備え、該36P6D5タンパク質は、配列番号2に示されるアミノ酸配列からなり、該試験サンプル中の36P6D5タンパク質の発現レベルは、対応する正常サンプル中の36P6D5タンパク質の発現レベルと比較される、キット。
- 前記細胞により発現される36P6D5タンパク質の発現レベルを決定するための手段が、36P6D5タンパク質に特異的に結合する抗体を含む、請求項1に記載のキット。
- 前記抗体が、ポリクローナル抗体を含む、請求項2に記載のキット。
- 前記抗体が、モノクローナル抗体を含む、請求項2に記載のキット。
- 個体における膀胱、結腸、腎臓、乳房、肺、卵巣、または前立腺の腫瘍形成に関連する細胞成長の調節不全をモニタリングするためのキットであって、該個体由来の試験組織サンプル中の細胞により発現される36P6D5のmRNAまたはタンパク質の発現レベルを決定するための手段を備え、該36P6D5のmRNAまたはタンパク質は、配列番号1に示される核酸配列によってコードされ、該試験サンプル中の36P6D5のmRNAまたはタンパク質の発現レベルは、対応する正常サンプル中の36P6D5のmRNAまたはタンパク質の発現レベルと比較される、キット。
- 膀胱、結腸、腎臓、乳房、肺、卵巣、または前立腺の腫瘍形成に関連する細胞成長の調節不全について生物学的サンプルを試験する方法であって、
該生物学的サンプル中における配列番号1に示される核酸配列によってコードされる36P6D5のmRNAまたはタンパク質の発現レベルを、対応する正常サンプル中の36P6D5のmRNAまたはタンパク質の発現レベルと比較する工程
を包含する、方法。 - 前記生物学的サンプル中の36P6D5のmRNAまたはタンパク質の発現レベルが、36P6D5 mRNA発現のレベルまたは36P6D5タンパク質発現のレベルを試験することにより評価される、請求項6に記載の方法。
- 個体における膀胱、結腸、腎臓、乳房、肺、卵巣、または前立腺の癌の存在を診断するためのキットであって:
該個体から得られた試験サンプル中で発現された36P6D5 mRNAの発現レベルを決定するための手段
を備え、該36P6D5 mRNAは、配列番号1において示される核酸配列によってコードされ、該試験サンプル中の36P6D5のmRNAの発現レベルは、対応する正常サンプル中の36P6D5のmRNAの発現レベルと比較される、キット。 - 個体における膀胱、結腸、腎臓、乳房、肺、卵巣、または前立腺の癌の存在を診断するためのキットであって:
該個体から得られた試験サンプル中で発現された36P6D5タンパク質の発現レベルを決定するための手段
を備え、該36P6D5タンパク質は、配列番号2において示されるアミノ酸配列からなり、該試験サンプル中の36P6D5タンパク質の発現レベルは、対応する正常サンプル中の36P6D5タンパク質の発現レベルと比較される、キット。 - 前記癌が、前立腺癌または結腸癌であり、そして前記試験サンプルが、前立腺組織、結腸組織、リンパ組織、血清、血液または精液からなる群から選択される、請求項9に記載のキット。
- 前記試験サンプル中で発現された36P6D5タンパク質の発現レベルを決定するための手段が、36P6D5タンパク質に特異的に結合する抗体を含む、請求項9に記載のキット。
- 前記抗体が、ポリクローナル抗体を含む、請求項11に記載のキット。
- 前記抗体が、モノクローナル抗体を含む、請求項11に記載のキット。
- 前記癌が、膀胱癌または前立腺癌である、請求項1、8、または9のうちのいずれか1項に記載のキット。
- 前記腫瘍形成に関連する細胞成長の調節不全が、膀胱または前立腺の腫瘍形成に関連する細胞成長の調節不全である、請求項5に記載のキット。
- 前記腫瘍形成に関連する細胞成長の調節不全が、膀胱または前立腺の腫瘍形成に関連する細胞成長の調節不全である、請求項6に記載の方法。
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