JP2003507042A - ヒト前立腺癌において発現されるｃ型レクチン膜貫通抗原およびその使用 - Google Patents

ヒト前立腺癌において発現されるｃ型レクチン膜貫通抗原およびその使用

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Abstract

(57)【要約】 前立腺癌において高度に過剰発現される新規な遺伝子（ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮと命名）が、記載される。そしてその遺伝子にコードされるタンパク質が、記載される。正常なヒト組織におけるＰＣ−ＬＥＣＴＩＮは、精巣に制限される。しかし、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮは、前立腺癌において高度に発現される。結果的に、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮは、前立腺癌についての診断標的を提供し、そして／またはＰＣ−ＬＥＣＴＩＮは、前立腺癌についての治療標的を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本出願は、米国仮特許出願第６０／１４８，９３５号（１９９９年８月１２日
出願）に対して優先権を主張し、この仮出願の全体が本明細書において参考とし
て援用される。
【０００２】 （発明の分野） 本明細書に記載される発明は、新規な遺伝子およびそのコードされたタンパク
質であってＰＣ−ＬＥＣＴＩＮと呼ばれるもの、およびＰＣ−ＬＥＣＴＩＮを発
現する種々の癌（特に、前立腺癌）の管理において有用である診断および治療の
方法および組成物に関する。
【０００３】 （発明の背景） 癌は、冠状動脈疾患に次いで２番目の、ヒトの死の主たる原因である。世界中
で何百万の人々が毎年癌で死ぬ。米国のみに限っては、癌は、毎年５０万人を優
に超える人々の死を引き起こし、１４０万程の新たな症例が毎年診断されている
。心臓疾患からの死が有意に減少してきている一方、癌による死は、概して上昇
傾向にある。次の世紀の初期には、癌は、死の主たる原因になることが予想され
る。
【０００４】 世界中で、いくつかの癌が主たる死の原因として突出している。特に、肺癌、
前立腺癌、乳癌、結腸癌、膵臓癌、および卵巣癌は、癌による死の主な原因の代
表である。これらおよび実質的に全ての他の癌は、共通の致死的特徴を共有する
。非常に数少ない例外はあるが、癌に由来する転移性の疾患は、致死的である。
さらに、最初にそれらの原発性の癌を生き延びた癌患者についてさえも、それら
の生存は劇的に変更されることは、一般的な経験が示している。多くの癌患者は
、再発または処置の失敗の可能性を知っていることによりかき立てられる強力な
不安を経験する。多くの癌患者は、処置後に身体的な衰弱を経験する。多くの癌
患者は、再発を経験する。
【０００５】 世界中で、前立腺癌は、男性において４番目に最も蔓延している癌である。こ
れは、北アメリカおよび北ヨーロッパにおいて、これまでに最も一般的な男性の
癌であり、そして男性における癌による死の第２位のリーディングケースである
。合衆国単独において、４０，０００人を優に超える男性が、毎年この疾患によ
り死亡しており、肺癌に続く２番目である。これらの数字の大きさにも関わらず
、転移性の前立腺癌のための効果的な処置はいまだにない。外科的な前立腺切除
、放射線療法、ホルモン切除治療、および化学療法は、主たる治療態様であり続
けている。不運にも、これらの処置は、多くの人にとって効果が無く、そしてし
ばしば所望でない結果に関連している。
【０００６】 診断の領域において、初期段階局在化腫瘍を正確に検出し得る前立腺癌マーカ
ーの欠如は、この疾患の管理を依然として有意に制限するものである。血清ＰＳ
Ａアッセイは、非常に有用な道具であったが、その特異性および一般的な有用性
は、広汎に、いくつかの重要な局面における欠如としてみなされている。
【０００７】 前立腺癌のさらなる特異的なマーカーを同定するにおける進展は、マウスにお
けるその疾患の異なる段階を再び捕捉し得る前立腺癌異種移植片の生成によって
改善されている。ＬＡＰＣ（Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｅｓ Ｐｒｏｓｔａｔｅ Ｃａ
ｎｃｅｒ）異種移植片は、重篤な組み合わせ免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスにおけ
る継代を生存した前立腺癌異種移植片であり、そして疾患の進行（アンドロゲン
依存性からアンドロゲン非依存性への転移および転移病変の発症を含む）を模倣
する能力を示している（Ｋｌｅｉｎら、１９９７，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．３：４０２
）。より最近に同定された前立腺癌マーカーには、ＰＣＴＡ−１（Ｓｕら、１９
９６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：７２５２）、前
立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）（Ｒｅｉｔｅｒら、１９９８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ
．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：１７３５）、およびＳＴＥＡＰ（Ｈｕｂｅ
ｒｔら、１９９９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６：１
４５２３）が含まれる。
【０００８】 以前に同定されたマーカー（例えば、ＰＳＡ、ＰＳＭ、ＰＣＴＡ、およびＰＳ
ＣＡ）は、前立腺癌を診断および処置する努力を促進してきた一方、診断および
治療をさらに改善するために、前立腺癌および関連する癌についてのさらなるマ
ーカーおよび治療標的を同定する必要性が存在する。
【０００９】 （発明の要旨） 本発明は、一般に、ヒト前立腺癌において発現される新規な膜貫通抗原（ＰＣ
−ＬＥＣＴＩＮと命名する）に関する。ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ抗原は、Ｃ型レクチ
ンタンパク質のメンバーであるハムスターライリン（ｌａｙｉｌｉｎ）（Ｂｏｒ
ｏｗｓｋｙおよびＨｙｎｅｓ，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１４３：４２９−４２
、１９９８）に構造的に関連する。しかし、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮは、ライリンに
見出される機能的タリン会合ドメインを含有せず、それゆえ、異なるかまたは改
変された機能を有するようである。ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮの構造的特徴により、そ
れは、細胞外Ｎ−末端および細胞内Ｃ末端を有する１ａ型膜貫通タンパク質とし
て同定される。さらに、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ遺伝子産物は、Ｎ末端シグナル配列
を含有する。ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮタンパク質の膜貫通位相幾何学はまた、実験的
に確立されている。
【００１０】 正常ヒト組織におけるＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ遺伝子発現の分布は、正常精巣に高
度に制限されている。ヒト前立腺癌において、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ遺伝子は、高
度に過剰発現される。なぜなら、検出可能なこの遺伝子の発現が正常前立腺にお
いて生じるからである。したがって、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ遺伝子は、前立腺癌抗
原をコードし、これは、診断および／または予防マーカーとして有用であり、お
よび／または種々の治療アプローチ（例えば、抗体、ワクチン、および低分子治
療）のための優れた標的として作用し得る。
【００１１】 機能的に、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮは、侵襲、接着、マーカー移動に関与し得る。
ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ抗原は、レクチンのように、糖部分に結合し、治療的アプロ
ーチのためのさらなる可能性を開く。１つのアプローチにおいて、糖質分子は、
ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ生物学的活性を阻害するために使用され得る。精巣の免疫寛
容組織（血液精巣関門が存在する）に限定されたＰＣ−ＬＥＣＴＩＮの発現は、
免疫学的治療ストラテジーおよびその他のＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ特異的治療ストラ
テジー（例えば、糖質阻害）のネガティブなバックグラウンド効果が最少である
ことを示唆する。高レベルの発現が前立腺癌において観察された場合、ＰＣ−Ｌ
ＥＣＴＩＮはまた、他のヒト癌において発現されることが可能であり、その限り
において、同様にそのような他の癌の診断および／または予防マーカーとして有
用であり得、および／またはこのような他の癌の処置のための腫瘍抗原標的とし
て機能し得る。ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮはまた、いくつかの公知のレセプター（Ｌ−
セレクチンを含む）において観察されているように、リガンドの結合または活性
化後に血清中に流出し得（総説については、Ｔｅｄｄｅｒら、１９９１，Ａｍ．
Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５：３０５−３０６を参照の
こと）、それにより血清の検出および関連する診断法に対する可能性を開く。Ｐ
Ｃ−ＬＥＣＴＩＮのバックグラウンドレベルは、血液精巣関門、および他の正常
組織での発現の不在に鑑みて、低いかまたは存在しないことが予想され、これは
、血清中でのＰＣ−ＬＥＣＴＩＮの検出が、腫瘍の存在と特異的に相関すること
を示唆する。
【００１２】 本発明は、好ましくは、単離された形態の、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ遺伝子、ｍＲ
ＮＡ、および／またはコード配列の全てまたは一部に対応するかまたはそれに相
補的であるポリヌクレオチド（ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮタンパク質をコードするポリ
ヌクレオチド、そのフラグメント、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッ
ド、および関連する分子、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ遺伝子またはｍＲＮＡ配列または
その一部に相補的なポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド、ならびにＰＣ
−ＬＥＣＴＩＮ遺伝子、ｍＲＮＡ、またはＰＣ−ＬＥＣＴＩＮコードポリヌクレ
オチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを含む
）を提供する。ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮをコードするｃＤＮＡおよび遺伝子を単離す
るための手段もまた提供される。ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮポリヌクレオチドを含有す
る組換えＤＮＡ分子、このような分子で形質転換された細胞または形質導入され
た細胞、ならびにＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ遺伝子産物の発現のための宿主ベクター系
もまた提供される。
【００１３】 本発明はさらに、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮタンパク質およびそのポリペプチドフラ
グメント、ならびにＰＣ−ＬＥＣＴＩＮタンパク質およびそのポリペプチドフラ
グメントに結合する抗体を提供する。本発明の抗体には、ポリクローナル抗体お
よびモノクローナル抗体、ネズミおよびその他の哺乳動物抗体、キメラ抗体、ヒ
ト化抗体および完全にヒトの抗体、検出可能なマーカーで標識された抗体、放射
性核種、トキシン、その他の治療組成物に結合体化された抗体が含まれる。
【００１４】 本発明はさらに、種々の生物学的サンプル中のＰＣ−ＬＥＣＴＩＮポリヌクレ
オチドおよびタンパク質の存在を検出するための方法、ならびにＰＣ−ＬＥＣＴ
ＩＮを発現する細胞を同定するための方法を提供する。本発明はさらに、前立腺
癌を処置するための種々の治療組成物およびストラテジー（特に、抗体、ワクチ
ン、および低分子治療を含む）を提供する。
【００１５】 （発明の詳細な説明） 本発明は、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮと命名された新規な膜貫通抗原を提供する。こ
れは、前立腺癌において過剰発現され、そしてタンパク質のＣ型レクチンファミ
リーのメンバーである。正常成体組織における発現は、精巣に限定される。発現
は、前立腺癌異種移植片において見出され、アンドロゲン依存性前立腺癌異種移
植片においてより高レベルであり、そしてアンドロゲン依存性異種移植片におい
てより低レベルである。この発現パターンは、前立腺癌におけるＰＣ−ＬＥＣＴ
ＩＮ発現が、アンドロゲンの存在に依存していることを示唆する。ＰＣ−ＬＥＣ
ＴＩＮはまた、レクチンコンカナバリンＡに観察されるものと類似の糖質結合特
異性を示す。
【００１６】 そうでないと規定されない限り、本明細書に使用される当該分野の全ての用語
、表記法、およびその他の化学的用語法は、本発明が属する分野の当業者によっ
て一般に理解される意味を有することが意図される。いくつかの場合には、一般
的に理解される意味を有する用語は、明確さおよび／または容易な参照のために
本明細書において定義され、そしてそのような定義を本明細書に含ませることは
、当該分野で一般に理解されるものに対する実質的な差異を表すものと必ずしも
解釈されべきではない。本明細書において記載されそして参照される技術および
手順は、一般に、十分に理解されており、そして当業者によって従来の方法（例
えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ 第２版（１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．に記載される広汎に利用される分子クローニング法）を
使用して一般に利用される。適切であれば、市販されるキットおよび試薬の使用
を含む手順は、そうでないと注記されない限り、一般に、製造業者によって規定
されるプロトコルおよび／またはパラメータに従って行われる。
【００１７】 本明細書中で使用される場合、用語「進行した前立腺癌」、「局所的に進行し
た前立腺癌」、「進行した疾患」、および「局所的に進行した疾患」は、前立腺
嚢（ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｐｓｕｌｅ）を通して拡張した前立腺癌を意味し、
そしてアメリカ泌尿器科協会（ＡＵＡ）システムにおけるＣ段階の疾患、Ｗｈｉ
ｔｍｏｒｅ−ＪｅｗｅｔｔシステムにおいてＣ１−Ｃ２段階の疾患、およびＴＮ
Ｍ（腫瘍、結節、転移）システムにおいてＴ３−Ｔ４段階およびＮ＋の疾患を含
むことを意味する。一般に、外科は、局所的に進行した疾患を有する患者にとっ
て推奨されておらず、そしてこれらの患者は、臨床的に局在化した（器官に限定
された）前立腺癌を有する患者と比較して実質的により有利でない結果を有する
。局所的に進行した疾患は、前立腺の側縁を超えての誘導または前立腺のベース
を超えての非対称もしくは誘導の明白な証拠によって臨床的に同定される。局所
的に進行した前立腺癌は、腫瘍が前立腺嚢を侵襲または貫通し、外科的余地に拡
張するか、または精嚢を侵襲した場合、現在、過激な前立腺削除後に病理学的に
診断される。
【００１８】 本発明において使用される場合、用語「転移性前立腺癌」および「転移性疾患
」は、領域性のリンパ節または離れた部位に広がっている前立腺癌を意味し、そ
してＡＵＡシステム下でのＤ段階の疾患およびＴＮＭシステム下でのＴｘＮｘＭ
＋段階を含むことを意味する。局所的に進行した前立腺癌の場合と同様に、外科
手術は、一般的に、転移性疾患を有する患者のために指示されておらず、そして
体液性（アンドロゲン切除）治療は、好ましい処置態様である。転移性の前立腺
癌を有する患者は、最終的には、処置の開始後１２〜１８ヶ月内にアンドロゲン
抵抗性の状態を発症し、そしてこれらの患者の約半分がその後６ヶ月以内に死亡
する。前立腺癌転移についての最も一般的な部位は、骨である。前立腺癌の骨転
移は、全てを考慮して、特徴的には、溶骨性であるというよりむしろ造骨細胞的
である（正味の骨形成を生じる）。骨転移は、脊椎において最も頻繁に見出され
、続いて大腿、骨盤、胸郭、頭蓋骨、および上腕骨である。転移についての他の
一般的な部位には、リンパ節、肺、肝臓、および脳が含まれる。転移性前立腺癌
は、代表的には、オープンまたは腹腔鏡検査胎盤リンパ節切除、全身放射核種ス
キャン、骨格ラジオグラフィー、および／または骨病変生検によって診断される
。
【００１９】 本明細書において使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」は、リボヌクレ
オチドもしくはデオキシリボヌクレオチドのいずれかまたはいずれかの型のヌク
レオチドの改変された形態の、少なくとも１０塩基または塩基対長のヌクレオチ
ドのポリマー形態を意味し、そしてＤＮＡの一本鎖および二本鎖の形態を含むこ
とを意味する。
【００２０】 本明細書において使用される場合、用語「ポリペプチド」は、少なくとも１０
個のアミノ酸のポリマーを意味する。本明細書の全体を通じて、アミノ酸につい
ての標準的な３文字または１文字標記が使用される。
【００２１】 本明細書で使用される場合、ポリヌクレオチドの状況で使用される用語「ハイ
ブリダイズ（ｈｙｂｒｉｄｉｚｅ）」、「ハイブリダイズする（ｈｙｂｒｉｄｉ
ｚｉｎｇ）」、「ハイブリダイズする（ｈｙｂｒｉｄｉｚｅｓ）」などは、従来
のハイブリダイゼーション条件、好ましくは、例えば、５０％ホルミルアミド／
６×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ／１００μｇ／ｍｌ ｓｓＤＮＡ中でのハイブリダ
イゼーション（ここで、ハイブリダイゼーションの温度は、３７℃を超え、そし
て０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳにおける洗浄についての温
度は５５℃を超える）、そして最も好ましくは、ストリンジェントなハイブリダ
イゼーション条件をいうことを意味する。
【００２２】 ハイブリダイゼーション反応の「ストリンジェンシー」は、当業者によって容
易に決定可能であり、そして一般に、プローブ長、洗浄温度、および塩濃度に依
存する経験的な計算である。一般に、より長いプローブは、適切なアニーリング
のためにより高い温度を必要とする一方、より短いプローブは、より低い温度を
必要とする。ハイブリダイゼーションは、一般に、相補的な鎖が、溶融温度より
低い環境に存在する場合、再アニーリングする変性したＤＮＡの能力に依存する
。プローブとハイブリダイズ可能な配列との間の所望の相同性の程度が高いほど
、使用され得る相対的な温度は高くなる。結果として、より高い相対的温度は、
よりストリンジェントな反応条件を作成する傾向がある一方、より低い温度はそ
のような傾向は少ない。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーのさ
らなる詳細および説明については、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏ
ｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ Ｉｎ
ｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９９５）を参照のこと。 本明細書中に規定される場合、「ストリンジェントな条件」または「高ストリ
ンジェンシー条件」は、以下の条件によって同定され得る：（１）洗浄のために
低いイオン強度および高い温度を使用する条件（例えば、０．０１５Ｍ 塩化ナ
トリウム／０．００１５Ｍ クエン酸ナトリウム／０．１％ドデシル硫酸ナトリ
ウム、５０℃）；（２）ハイブリダイゼーションの間に変性剤（例えば、ホルム
アミド）を使用する条件（例えば、５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミドおよび０．１
％ウシ血清アルブミン／０．１％Ｆｉｃｏｌｌ／０．１％ポリビニルピロリドン
／５０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ６．５）および７５０ｍＭ 塩化
ナトリウム、７５ｍＭ クエン酸ナトリウム、４２℃）；または（３）５０％ホ
ルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５Ｍ ＮａＣｌ、０．０７５Ｍ クエン酸ナト
リウム）、５０ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ ６．８）、０．１％ピロリン酸
ナトリウム、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ溶液、超音波処理したサケ精子ＤＮＡ（
５０μｇ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳ、および１０％硫酸デキストラン、４２℃、
さらに以下の洗浄工程、４２℃において０．２×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエ
ン酸ナトリウム）および５０％ホルムアミド、５５℃、続いて、高ストリンジェ
ンシー洗浄（ＥＤＴＡを含む０．１×ＳＳＣからなる、５５℃）を使用する条件
。
【００２３】 「中程度にストリンジェントな条件」は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，１９８９によ
って記載されたように同定され得、そして洗浄溶液およびハイブリダイゼーショ
ン条件（例えば、温度、イオン強度、およびＳＤＳ）の使用を含む。これは、上
記に記載されたものよりもよりストリンジェントではない。中程度にストリンジ
ェントな条件の例は、以下を含む溶液中での３７℃、一晩のインキュベーション
である：２０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭ
クエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×Ｄ
ｅｎｈａｒｄｔ’ｓ溶液、１０％ 硫酸デキストラン、および２０ｍｇ／ｍｌ変
性剪断サケ精子ＤＮＡ、続いて約３７℃〜５０℃で１×ＳＳＣ中でフィルターを
洗浄する。当業者は、温度、イオン強度などを、因子（例えば、プローブ長など
）を適応させるのに必要なように調整する方法を認識する。
【００２４】 アミノ酸比較の状況において、用語「同一性」は、同一である同じ相対的位置
のアミノ酸残基のパーセンテージを表現するために使用される。この状況におい
てはまた、用語「相同性」は、ＢＬＡＳＴ分析の保存性アミノ酸の判断基準を使
用して、当該分野において一般的に理解されるように、同一であるかまたは類似
であるかのいずれかである、同じ相対位置でのアミノ酸残基のパーセンテージを
表現するために使用される。例えば、同一性％の値は、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２（
Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２６６：
４６０−４８０（１９９６）；ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｗｕｓｔｌ／ｅｄｕ
／ｂｌａｓｔ／ＲＥＡＤＭＥ．ｈｔｍｌ）によって生成され得る。アミノ酸置換
（これは、このような判断基準の下では保存性であると見なされる）に関するさ
らなる詳細は以下に提供される。
【００２５】 さらなる定義が、引き続くサブセクションを通して提供される。
【００２６】 （ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮポリヌクレオチド） 本発明の一つの局面は、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ遺伝子、ｍＲＮＡおよび／または
コード配列（好ましくは、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮタンパク質およびそのフラグメン
ト、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドならびに関連分子をコードす
るポリヌクレオチド、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ遺伝子もしくはｍＲＮＡ配列またはそ
の一部分に相補的な、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド、ならびにＰ
Ｃ−ＬＥＣＴＩＮ遺伝子、ｍＲＮＡもしくはＰＣ−ＬＥＣＴＩＮをコードするポ
リヌクレオチド（集合的に、「ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮポリヌクレオチド」）にハイ
ブリダイズする、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを含む単離形態に
おける）のすべてもしくは一部分に対応するか、またはそのすべてもしくは一部
分に相補的なポリヌクレオチドを提供する。本明細書中で使用される場合、ＰＣ
−ＬＥＣＴＩＮ遺伝子およびタンパク質は、本明細書中で具体的に記載されるＰ
Ｃ−ＬＥＣＴＩＮ遺伝子およびタンパク質、ならびに他のＰＣ−ＬＥＣＴＩＮタ
ンパク質および前述の構造的に類似の改変体に対応する、遺伝子およびタンパク
質を含むことが意味される。このような他のＰＣ−ＬＥＣＴＩＮタンパク質およ
び改変体は、一般的に、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮコード配列に高度に相同なコード配
列を有し、そして好ましくは、少なくとも約５０％のアミノ酸同一性、そして少
なくとも約６０％のアミノ酸相同性を共有し（ＢＬＡＳＴ標準を使用して）、よ
り好ましくは、７０％以上の相同性を共有する（ＢＬＡＳＴ標準を使用して）。
【００２７】 ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮポリヌクレオチドの１つの実施形態は、図１Ａ〜１Ｄ（配
列番号１）に示される配列を有するＰＣ−ＬＥＣＴＩＮポリヌクレオチドである
。ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮポリヌクレオチドは、図１Ａ〜１Ｄ（配列番号１）に示さ
れるようなヒトＰＣ−ＬＥＣＴＩＮのヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチ
ド（ここで、Ｔはまた、Ｕであり得る）；ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮタンパク質のすべ
てまたは一部分をコードするポリヌクレオチド；前述のポリヌクレオチドに相補
的な配列；あるいは前述のうちのいずれかのポリヌクレオチドフラグメントを含
み得る。別の実施形態は、図１Ａ〜１Ｄ（配列番号１）に示されるような、ヌク
レオチド残基番号３８０〜ヌクレオチド残基番号１２０１の配列、ヌクレオチド
残基番号４４３〜ヌクレオチド残基番号１０１８、またはヌクレオチド残基番号
４４３〜ヌクレオチド残基番号１２０１の配列を有するポリヌクレオチドを含み
、ここで、Ｔはまた、Ｕであり得る。別の実施形態は、配列が、Ａｍｅｒｉｃａ
ｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに登録番号２０７１５２
として１９９９年３月１０日に寄託された、プラスミドｐ５８Ｐ１Ｄ１２−２に
含まれるｃＤＮＡによってコードされる、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮポリペプチドをコ
ードするポリヌクレオチドを含む。別の実施形態は、ストリンジェントなハイブ
リダイゼーション条件下で、図１Ａ〜１Ｄ（配列番号１）に示されるヒトＰＣ−
ＬＥＣＴＩＮ ｃＤＮＡ、またはそのポリヌクレオチドフラグメントにハイブリ
ダイズし得るポリヌクレオチドを含む。
【００２８】 本明細書中で開示される本発明の代表的な実施形態は、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ
ｍＲＮＡ配列の特定の一部分をコードするＰＣ−ＬＥＣＴＩＮポリヌクレオチド
（例えば、タンパク質およびそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド）
を含む。例えば、本明細書中で開示される本発明の代表的な実施形態は、以下を
含む：図１Ａ〜１Ｄ（配列番号２）に示されるＰＣ−ＬＥＣＴＩＮタンパク質の
およそアミノ酸１〜およそアミノ酸１０をコードするポリヌクレオチド、図１Ａ
〜１Ｄ（配列番号２）に示されるＰＣ−ＬＥＣＴＩＮタンパク質のおよそアミノ
酸２０〜およそアミノ酸３０をコードするポリヌクレオチド、図１Ａ〜１Ｄ（配
列番号２）に示されるＰＣ−ＬＥＣＴＩＮタンパク質のおよそアミノ酸３０〜お
よそアミノ酸４０をコードするポリヌクレオチド、図１Ａ〜１Ｄ（配列番号２）
に示されるＰＣ−ＬＥＣＴＩＮタンパク質のおよそアミノ酸４０〜およそアミノ
酸５０をコードするポリヌクレオチド、図１Ａ〜１Ｄ（配列番号２）に示される
ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮタンパク質のおよそアミノ酸５０〜およそアミノ酸６０をコ
ードするポリヌクレオチド、図１Ａ〜１Ｄ（配列番号２）に示されるＰＣ−ＬＥ
ＣＴＩＮタンパク質のおよそアミノ酸６０〜およそアミノ酸７０をコードするポ
リヌクレオチド、図１Ａ〜１Ｄ（配列番号２）に示されるＰＣ−ＬＥＣＴＩＮタ
ンパク質のおよそアミノ酸７０〜およそアミノ酸８０をコードするポリヌクレオ
チド、図１Ａ〜１Ｄ（配列番号２）に示されるＰＣ−ＬＥＣＴＩＮタンパク質の
およそアミノ酸８０〜およそアミノ酸９０をコードするポリヌクレオチド、およ
び図１Ａ〜１Ｄ（配列番号２）に示されるＰＣ−ＬＥＣＴＩＮタンパク質のおよ
そアミノ酸９０〜およそアミノ酸１００をコードするポリヌクレオチドなど。こ
のスキームの後、図１Ａ〜１Ｄ（配列番号２）に示されるＰＣ−ＬＥＣＴＩＮタ
ンパク質のアミノ酸１００〜２７３のアミノ酸配列の一部分をコードするポリヌ
クレオチド（少なくとも１０アミノ酸の）は、本発明の代表的な実施形態である
。ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮタンパク質のより大きな部分をコードするポリヌクレオチ
ドがまた意図される。例えば、図１Ａ〜１Ｄ（配列番号２）に示されるＰＣ−Ｌ
ＥＣＴＩＮタンパク質のおよそアミノ酸１（または２０、または３０、または４
０など）〜およそアミノ酸２０（または３０、または４０、または５０など）を
コードするポリヌクレオチドは、当該分野で周知の種々の技術によって生成され
得る。
【００２９】 本明細書中で開示される本発明のさらなる例示的な実施形態は、ＰＣ−ＬＥＣ
ＴＩＮタンパク質配列内に含まれる、１つ以上の生物学的モチーフをコードする
ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮポリヌクレオチドフラグメントを含む。１つの実施形態にお
いて、本発明の代表的なポリヌクレオチドフラグメントは、ハムスターレイリン
（ｌａｙｉｌｉｎ）との相同性を示すＰＣ−ＬＥＣＴＩＮの１つ以上の領域をコ
ードし得る。本発明の別の実施形態において、代表的なポリヌクレオチドフラグ
メントは、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮタンパク質およびポリペプチドを議論する以の本
文において非常に詳細に開示されるように、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ Ｃ型レクチン
ドメインまたは膜貫通ドメインの１つ以上をコードし得る。本発明のさらに別の
実施形態において、代表的なポリヌクレオチドフラグメントは、１つ以上のＰＣ
−ＬＥＣＴＩＮ選択的スプライシング改変体に独特である配列をコードし得る。
【００３０】 前述の段落のポリヌクレオチドは、多くの異なる特定の使用を有する。ＰＣ−
ＬＥＣＴＩＮは、前立腺癌において過剰発現されることが示されるので、これら
のポリヌクレオチドは、正常な組織対癌性組織におけるＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ遺伝
子産物の状態を評価する方法において使用され得る。代表的には、ＰＣ−ＬＥＣ
ＴＩＮタンパク質の特定の領域をコードするポリヌクレオチドが使用されて、Ｐ
Ｃ−ＬＥＣＴＩＮ遺伝子産物の特定の領域（膜貫通ドメインを含むような領域）
において、混乱状態（例えば、欠失、挿入、点変異など）の存在を評価し得る。
例示的なアッセイは、ＲＴ−ＰＣＲアッセイ、ならびに一本鎖高次構造多型（Ｓ
ＳＣＰ）分析（例えば、Ｍａｒｒｏｇｉら、Ｊ．Ｃｕｔａｎ．Ｐａｔｈｏｌ．２
６（８）：３６９−３７８（１９９９）を参照のこと）の両方を含み、これらの
両方は、タンパク質の特定の領域をコードするポリヌクレオチドを利用して、タ
ンパク質内のこれらの領域を試験する。
【００３１】 本明細書中で開示される本発明の他の具体的に意図された実施形態は、ゲノム
ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、リボザイムおよびアンチセンス分子、ならびに天然の供給源
または合成由来にせよ、代替の骨格に基づくか、または代替の塩基を含む核酸分
子である。例えば、アンチセンス分子は、ＲＮＡ、あるいは他の分子（ペプチド
核酸（ＰＮＡ）または塩基対依存様式でＤＮＡもしくはＲＮＡに特異的に結合す
る非核酸分子（例えば、ホスホロチオエート誘導体）を含む）であり得る。当業
者は、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮポリヌクレオチドおよび本明細書中で開示されるポリ
ヌクレオチド配列を使用して、核酸分子のこれらのクラスを容易に獲得し得る。
【００３２】 アンチセンス技術は、細胞内部に位置する標的ポリヌクレオチドに結合する外
因性オリゴヌクレオチドの投与を必然的に伴う。用語「アンチセンス」は、この
ようなオリゴヌクレオチドが、その細胞内標的（例えば、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ）
に相補的であるという事実をいう。例えば、Ｊａｃｋ Ｃｏｈｅｎ，ＯＬＩＧＯ
ＤＥＯＸＹＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥＳ，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ
ｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，１９８９；
およびＳｙｎｔｈｅｓｉｓ １：１−５（１９８８）を参照のこと。本発明のＰ
Ｃ−ＬＥＣＴＩＮアンチセンスオリゴヌクレオチドは、Ｓオリゴヌクレオチド（
ホスホロチオエート誘導体またはＳ−オリゴ、Ｊａｃｋ Ｃｏｈｅｎ、前出を参
照のこと）のような誘導体を含み、この誘導体は、癌細胞増殖阻害作用の増大を
示す。Ｓ−オリゴ（ヌクレオシドホスホロチオエート）は、オリゴヌクレオチド
（Ｏ−オリゴ）の等電子アナログであり、リン酸基の非架橋酸素原子は、硫酸原
子に置換される。本発明のＳ−オリゴは、３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３
−オン−１，１−ジオキシド（これは、硫酸転移試薬である）での対応するＯ−
オリゴの処理によって調製され得る。Ｉｙｅｒ，Ｒ．Ｐ．ら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈ
ｅｍ．５５：４６９３−４６９８（１９９０）；およびＩｙｅｒ，Ｒ．Ｐ．ら、
Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１２：１２５３−１２５４（１９９０）（これ
らの開示は、本明細書中で参考として完全に援用される）を参照のこと。本発明
のさらなるＰＣ−ＬＥＣＴＩＮアンチセンスオリゴヌクレオチドは、当該分野で
公知のモルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む（Ｐａｒｔｒｉｇｅら
、１９９６，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ＆Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅ
ｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ６：１６９−１７５を参照のこと）。
【００３３】 本発明のＰＣ−ＬＥＣＴＩＮアンチセンスオリゴヌクレオチドは、代表的に、
ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮゲノムもしくは対応するｍＲＮＡの、最初の１００個のＮ末
端コドンまたは最後の１００個のＣ末端コドンに相補的であり、そしてこれらの
コドンと安定にハイブリダイズする、ＲＮＡまたはＤＮＡであり得る。完全な相
補性は必要ではないが、高い程度の相補性が好ましい。この領域に相補的なオリ
ゴヌクレオチドの使用は、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ ｍＲＮＡへの選択的ハイブリダ
イゼーションを可能にし、そしてタンパク質キナーゼの他の調節サブユニットを
特定するｍＲＮＡへの選択的ハイブリダイゼーションを可能にしない。好ましく
は、本発明のＰＣ−ＬＥＣＴＩＮアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＰＣ−Ｌ
ＥＣＴＩＮ ｍＲＮＡにハイブリダイズする配列を有するアンチセンスＤＮＡ分
子の１５〜３０ｍｅｒフラグメントである。必要に応じて、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮの最初の１０個のＮ末
端コドンおよび最後の１０個のＣ末端コドンにおける領域に相補的な３０ｍｅｒ
オリゴヌクレオチドである。あるいは、アンチセンス分子は、ＰＣ−ＬＥＣＴＩ
Ｎ発現の阻害において、リボザイムを利用するように改変される。Ｌ．Ａ．Ｃｏ
ｕｔｕｒｅおよびＤ．Ｔ．Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ；Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ
１２：５１０−５１５（１９９６）。
【００３４】 本発明のこの局面のさらなる特定の実施形態は、プライマーおよびプライマー
ペアを含み、これは、本発明のポリヌクレオチドまたはその任意の特定の部分の
特異的増幅、および本発明の核酸分子またはその任意の部分に選択的もしくは特
異的にハイブリダイズするプローブの特異的増幅を可能にする。プローブは、検
出可能なマーカー（例えば、放射性同位体、蛍光化合物、生体発光化合物、化学
発光化合物、金属キレート剤または酵素のような）で標識され得る。このような
プローブおよびプライマーが、サンプルにおけるＰＣ−ＬＥＣＴＩＮポリヌクレ
オチドの存在を検出するために使用され得、そしてＰＣ−ＬＥＣＴＩＮタンパク
質を発現する細胞を検出するための手段として使用され得る。
【００３５】 このようなプローブの例としては、図１Ａ〜１Ｄ（配列番号１）に示されるヒ
トＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ ｃＤＮＡ配列の、すべてまたは一部分を含むポリペプチ
ドが挙げられる。ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ ｍＲＮＡを特異的に増幅し得るプライマ
ーペアの例はまた、続く実施例において記載される。当業者に理解されるように
、非常に多くの異なるプライマーおよびプローブが、本明細書中に提供される配
列に基づいて調製され得、そしてＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ ｍＲＮＡを有効に増幅お
よび／または検出するために使用され得る。
【００３６】 本明細書中で使用される場合、ポリヌクレオチドは、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ遺伝
子ではない遺伝子に、対応するかまたは相補的である混入ポリヌクレオチド、ま
たはＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ遺伝子産物もしくはそのフラグメントではないポリペプ
チドをコードする混入ポリヌクレオチドから実質的に分離されている場合、「単
離された」と言われる。当業者は、容易に核酸単離手順を利用して、単離された
ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮポリヌクレオチドを獲得し得る。
【００３７】 本発明のＰＣ−ＬＥＣＴＩＮポリヌクレオチドは、種々の目的に有用である。
この目的としては、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ遺伝子、ｍＲＮＡまたはそのフラグメン
トの、増幅および／または検出のための、プローブおよびプライマーとしての使
用；前立腺癌および他の癌の、診断および／または予後のための試薬としての使
用；前立腺細胞へのカルシウムの侵入を特異的に阻害する分子を同定するための
手段としての使用；ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮポリペプチドの発現を指向し得るコード
配列としての使用；ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ遺伝子の発現および／またはＰＣ−ＬＥ
ＣＴＩＮ転写物の翻訳を、調節または阻害するための手段としての使用；ならび
に治療薬としての使用が挙げられるが、これらに限定されない。 （ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮの分子的特徴および生化学的特徴） 以下の実施例においてさらに記載されるように、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ遺伝子お
よびタンパク質は、種々の方法で特徴付けられてきた。例えば、ヌクレオチドコ
ード配列およびアミノ酸配列の分析は、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ配列内の保存された
構造的要素、位相幾何学的特徴、および潜在的に関連する分子を同定するために
行われた。ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ ｍＲＮＡ発現のＰＴ−ＰＣＲおよびノーザンブ
ロット分析は、種々のＰＣ−ＬＥＣＴＩＮメッセージを発現する正常な組織およ
び癌組織の範囲を確立するために行われた。実験的にトランスフェクトした細胞
におけるＰＣ−ＬＥＣＴＩＮタンパク質発現のウエスタンブロット分析は、細胞
表面局在化を決定するために行われた。
【００３８】 ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮタンパク質は、「ライリン（ｌａｙｉｌｉｎ）」と称され
るハムスタータンパク質（これは、次いでＣ型レクチンと相同性を共有する（Ｂ
ｒｏｗｓｋｙおよびＨｙｎｅｓ，Ｊ．Ｃ ＩＩ Ｂｉｏｌ：１４３：４２９−４
２，１９９８））に対して相同性を有する、約２５２アミノ酸の１ａ型膜貫通細
胞表面タンパク質（前駆体タンパク質を含む２７３アミノ酸のシグナル配列とし
て最初に発現される）である。ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮはまた、身体壁損傷後にＳａ
ｒｃｏｐｈａｇａ ｐｅｒｅｇｒｉｎａ幼生の血リンパから最初に精製されたガ
ラクトース結合タンパク質のレクチンドメイン（Ｓａｒｃｏｐｈａｇａレクチン
という）に対して相同性を示し（Ｋｏｍａｎｏら、９８０，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．２５５：２９１９−２９２４）、続いてクローン化された（Ｔａｋａｈａ
ｓｈｉら、１８８５，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２２：１２２２８−１２２３３
；Ｋｏｂａｙａｓｈｉら、１９８９，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈ
ｙｓｉｃａ Ａｃｔａ ００９：２４４−２５０）。ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮタンパ
ク質の細胞表面位置は、以下の実施例の節においてさらに記載されるように、実
験的に確認された。
【００３９】 ヒトＰＣ−ＬＥＣＴＩＮのｃＤＮＡヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列
は、図１Ａ〜Ｄ（配列番号１、２）に示される。ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ抗原のアミ
ノ酸配列（配列番号２）とハムスターライリンの報告された配列（配列番号３）
との整列を、図２に示す。ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮは、ハムスターライリンと近接し
た相同性を有する（２６５残基の重複にわたって、約４４．９％同一）が、ライ
リンタンパク質に対して提案された重要な機能ドメインにおいては著しく異なる
。詳細には、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮタンパク質は、ライリン構造において見出され
た約１０アミノ酸配列を有さず、この配列は、ライリンタンパク質の細胞膜のひ
だ（ｒｕｆｆｕｌｅ）における細胞骨格タンパク質タリンとの結合に関与すると
考えられているドメインを表す（ＢｏｒｏｗｓｋｙおよびＨｙｎｅｓ，Ｊ．Ｃｅ
ｌｌ Ｂｉｏｌ：１４３：４２９−４２，１９９８；Ｃｒｉｔｈｌｅｙら、Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ Ｓｏｃ Ｓｙｍｐ ６５：７９−９９，１９９９）。遺伝子レベル
では、２５５０ｐｂのＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ ｃＤＮＡとハムスターライリンｃＤ
ＮＡの１７４７ｂｐのｃＤＮＡとの整列は、５９１ｂｐの領域にわたって相同性
を示す。ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ領域の残りは、ライリンと著しく異なり、これは細
胞外ドメインのｃ末端の半分および全細胞質ドメインのアミノ酸配列における違
いを示す。このことは、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮおよびライリンは、レクチンのサブ
ファミリーに関連し、おそらく構成するが、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮは、ライリンの
ヒト形態ではなさそうであるということを示唆する。
【００４０】 タリンとのライリンの結合は、細胞運動性において機能すると仮定される。Ｐ
Ｃ−ＬＥＣＴＩＮ構造におけるタリン結合ドメインの非存在は、ライリンと同じ
様式でＰＣ−ＬＥＣＴＩＮがタリンまたは細胞骨格と相互作用し得ないというこ
とを示唆する。タリン結合ドメインの非存在に加えて、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ構造
は、ライリン構造に対する挿入された配列ストレッチおよび欠失した配列ストレ
ッチを含む。ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ発現プロフィールはまた、報告されたライリン
の発現プロフィールと異なる。ライリンは、複数のマウス組織（例えば、卵巣、
肺、脾臓、心臓、肝臓、膀胱、リンパ節、乳腺、脳、甲状腺および腎臓）および
細胞株において発現されることが報告され、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮは、正常なヒト
組織の中でも精巣に非常に特異的であるようであり、そして前立腺癌において上
方制御される。このことは、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮが、前立腺癌および潜在的に他
の癌において、転移および侵襲における細胞接着分子として機能し得ることを示
唆する。ライリンおよび他のＣ型レクチンとの構造的関係が与えられると、ＰＣ
−ＬＥＣＴＩＮは、確認されたように、糖質部分に結合すると予想される。従っ
て、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ活性を妨げるための、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ結合糖質分子
を用いる治療戦略は、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮを発現する癌の処置において治療的に
有用であり得る。
【００４１】 ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ発現は、ＲＴ−ＰＣＲおよびノーザンブロット分析の両方
によって決定されるように、正常なヒト組織において、本質的に精巣特異的であ
る。癌においては、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ ｍＲＮＡは、ＳＣＩＤマウスにおいて
増殖されたヒト前立腺腫瘍異種移植片において過剰発現され、そしてある場合に
おいては、非常に高レベルの発現が見られる。従って、前立腺癌におけるその細
胞表面局在化およびその高レベルの発現を与えられると、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮは
、前立腺癌の処置のための優れた治療標的の顕著な特徴のすべてを有する。これ
らの同じ理由のために、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮはまた、特に診断画像化と関連して
、理想的な診断マーカーを示し得る。さらに、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ発現が疾患の
進行とともに、および／または非常に攻撃的な腫瘍の発生とともに増加する。こ
の点で、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮの非常に高レベルの発現が検出されたＬＡＰＣ−９
前立腺腫瘍異種移植片は、前立腺癌の非常に攻撃的な骨芽細胞の骨転移により誘
導された。
【００４２】 （ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮをコードする核酸分子の単離） 本明細書中に記載されるＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ ｃＤＮＡ配列は、ＰＣ−ＬＥＣ
ＴＩＮ遺伝子産物をコードする他のポリヌクレオチドの単離、ならびにＰＣ−Ｌ
ＥＣＴＩＮ遺伝子産物ホモログ、選択的にスプライシングされたアイソフォーム
、対立遺伝子改変体、およびＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ遺伝子産物の変異体形態をコー
ドするポリヌクレオチドの単離を可能にする。ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ遺伝子をコー
ドする全長ｃＤＮＡを単離するために利用され得る種々の分子クローニング方法
は、周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃ
ｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版、Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９；Ｃｕ
ｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ
．Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，１９９５を参照のこと
）。例えば、λファージクローニング方法論が、市販のクローニング系を使用し
て慣用的に利用され得る（例えば、Ｌａｍｂｄａ ＺＡＰ Ｅｘｐｒｅｓｓ，Ｓ
ｔｒａｔａｇｅｎｅ）。ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ遺伝子ｃＤＮＡを含むファージクロ
ーンは、標識されたＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ ｃＤＮＡまたはそのフラグメントを用
いて調べることにより同定され得る。例えば、一つの実施形態において、ＰＣ−
ＬＥＣＴＩＮ ｃＤＮＡ（図１Ａ〜１Ｄ；配列番号１）またはその一部分が、合
成され、そしてプローブとして使用されて、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ遺伝子に対応す
る重複するｃＤＮＡおよびＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ遺伝子に対応する全長ｃＤＮＡを
回収し得る。ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ遺伝子自体は、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ ＤＮＡプ
ローブまたはプライマーを使用して、ゲノムＤＮＡライブラリー、細菌人工染色
体ライブラリー（ＢＡＣ）、酵母人工染色体ライブラリー（ＹＡＣ）などをスク
リーニングすることによって単離され得る。
【００４３】 （組換えＤＮＡ分子および宿主−ベクター系） 本発明はまた、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮポリヌクレオチドを含む組換えＤＮＡまた
はＲＮＡ分子（これには、当該分野において周知のファージ、プラスミド、ファ
ージミド、コスミド、ＹＡＣ、ＢＡＣ、ならびに種々のウイルス性および非ウイ
ルス性ベクターが含まれるが、これらに限定されない）、およびこのような組換
えＤＮＡまたはＲＮＡ分子で形質転換またはトランスフェクトされた細胞を提供
する。本明細書中で使用される場合、組換えＤＮＡまたはＲＮＡ分子は、インビ
トロでの分子操作に供されたＤＮＡまたはＲＮＡ分子である。このような分子を
生成するための方法は周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９（前
出）を参照のこと）。
【００４４】 本発明はさらに、適切な原核生物宿主細胞または真核生物宿主細胞においてＰ
Ｃ−ＬＥＣＴＩＮポリヌクレオチドを含む組換えＤＮＡ分子を含む、宿主−ベク
ター系を提供する。適切な真核生物宿主細胞の例としては、酵母細胞、植物細胞
、または動物細胞（例えば、哺乳動物細胞または昆虫細胞（例えば、バキュロウ
イルス感染可能細胞（例えば、Ｓｆ９細胞）））が挙げられる。適切な哺乳動物
細胞の例としては、種々の前立腺癌細胞株（例えば、ＬｎＣａＰ、ＰＣ３、ＤＵ
１４５、ＬＡＰＣ４、ＴｓｕＰｒ１、他のトランスフェクト可能であるかまたは
形質導入可能な前立腺細胞株）、ならびに組換えタンパク質の発現のために慣用
的に使用される多くの哺乳動物細胞（例えば、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、２９３
細胞、２９３Ｔ細胞）が挙げられる。より詳細には、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮのコー
ド配列を含むポリヌクレオチドを使用し、当該分野で慣用的に使用され、そして
広く知られたかなり多数の宿主−ベクター系を用いて、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮタン
パク質またはそれらのフラグメントを生成し得る。
【００４５】 ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮタンパク質またはそれらのフラグメントの発現に適切な広
範な種々の宿主−ベクター系が利用可能である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、
１９８９（前出）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１９９５（前出）を参照のこと）。哺乳動物での発現
に好ましいベクターとしては、ｐｃＤＮＡ ３．１ ｍｙｃ−Ｈｉｓ−ｔａｇ（
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびレトロウイルスベクターｐＳＲαｔｋｎｅｏ（Ｍ
ｕｌｌｅｒら、１９９１、ＭＣＢ １１：１７８５）が挙げられるが、これらに
限定されない。これらの発現ベクターを使用して、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮは、好ま
しくは、いくつかの前立腺癌細胞株および非前立腺癌細胞株（例えば、２９３、
２９３Ｔ、ｒａｔ−１、ＮＩＨ３Ｔ３、ＰＣ３、ＬＮＣａＰおよびＴｓｕＰｒ１
を含む）において発現させ得る。本発明の宿主−ベクター系は、ＰＣ−ＬＥＣＴ
ＩＮタンパク質またはそれらのフラグメントの産生のために有用である。このよ
うな宿主−ベクター系は、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮおよびＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ変異の
機能的特性を研究するために使用され得る。
【００４６】 ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ遺伝子またはそれらのフラグメントによってコードされる
タンパク質は、種々の用途を有する。これには、以下が挙げられるが、これらに
限定されない：抗体の産生、およびＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ遺伝子産物に結合する、
リガンドおよび他の因子および細胞構成要素を同定するための方法において。Ｐ
Ｃ−ＬＥＣＴＩＮタンパク質またはそれらのフラグメントに対して惹起された抗
体は、診断および予後アッセイにおいて、画像化方法（特に、癌画像化方法を含
む）において、そしてＰＣ−ＬＥＣＴＩＮタンパク質の発現によって特徴付けら
れるヒト癌（前立腺の癌を含むが、これに限定されない）の管理における治療方
法において有用であり得る。ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮタンパク質の検出のために有用
な種々の免疫学的アッセイが意図され、これには、種々の型のラジオイムノアッ
セイ、酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）、酵素結合免疫蛍光アッ
セイ（ＥＬＩＦＡ）、免疫細胞学的方法などが挙げられるが、これらに限定され
ない。このような抗体は、標識され得、そして前立腺細胞を検出し得る免疫学的
画像化試薬として使用され得る（例えば、ラジオシンチグラフィ（ｒａｄｉｏｓ
ｃｉｎｔｉｇｒａｐｈｉｃ）画像化方法において）。ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮタンパ
ク質はまた、以下にさらに記載されるように、癌ワクチンを生成するにおいて特
に有用であり得る。
【００４７】 （ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮタンパク質） 本発明の別の局面は、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮタンパク質およびそのポリペプチド
フラグメントを提供する。本発明のＰＣ−ＬＥＣＴＩＮタンパク質としては、本
明細書中で特に同定されたタンパク質、ならびに対立遺伝子改変体、保存的置換
改変体およびホモログ（このような改変体およびホモログが以下に概説される方
法に従って過度な実験を伴わずに単離／生成および特徴付けされ得る限り）が挙
げられる。異なるＰＣ−ＬＥＣＴＩＮタンパク質またはそのフラグメントの部分
を組合せる融合タンパク質、ならびにＰＣ−ＬＥＣＴＩＮタンパク質および異種
ポリペプチドの融合タンパク質もまた含まれる。このようなＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ
タンパク質は、集合的に、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮタンパク質、本発明のタンパク質
、またはＰＣ−ＬＥＣＴＩＮという。本明細書中で使用される場合、用語「ＰＣ
−ＬＥＣＴＩＮポリペプチド」は、少なくとも１０個のアミノ酸（好ましくは、
少なくとも１５個のアミノ酸）のポリペプチドフラグメントまたはＰＣ−ＬＥＣ
ＴＩＮタンパク質をいう。
【００４８】 ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮタンパク質の特定の実施形態は、図１Ａ〜Ｄ（配列番号２
）に示されるようなヒトＰＣ−ＬＥＣＴＩＮのアミノ酸配列（そこに示されるよ
うに、アミノ酸残基番号１〜おおよそアミノ酸残基番号２７３）を有するポリペ
プチドを含む。ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮタンパク質の別の特定の実施形態は、図１Ａ
〜Ｄ（配列番号２）に示されるようなヒトＰＣ−ＬＥＣＴＩＮのアミノ酸配列（
そこに示されるように、おおよそアミノ酸残基番号２２からおおよそアミノ酸残
基番号２７３）を有するポリペプチドを含む。ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮフラグメント
の特定の実施形態は、ＷＩＧＦＴＹＫＴＡ、ＡＴＧＥＨＱＡＦＴ、ＦＧＮＣＶＲ
ＥＬＱＡ、ＮＣＶＥＬＱＡＳＡ、およびＤＮＨＧＦＧＮＣＶ（それぞれ、配列番
号６〜１０）からなる群より選択されるペプチド、またはＧＬＷＲＮＧＤＧＱＴ
ＳＧＡＣ（配列番号２５）、ＧＧＰＹＬＹＱＷＮＤＤＲＣＮＭ（配列番号２６）
、ＥＡＲＬＡＣＥＳＥＧＧＶＬＬ（配列番号２７）、およびＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ
の細胞外ドメイン（配列番号２のアミノ酸２２〜２１３）からなる群より選択さ
れるペプチドを含む。他の特定の実施形態は、Ｃ型レクチンドメインおよび／ま
たは図１Ａ〜Ｄ（配列番号２）で同定される膜貫通ドメインのうちの１つまたは
両方を含む。
【００４９】 一般的に、ヒトＰＣ−ＬＥＣＴＩＮの天然に存在する対立遺伝子改変体は、高
い程度の構造的同一性および相同性（例えば、９０％以上の同一性）を共有する
。代表的に、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮタンパク質の対立遺伝子改変体は、本明細書中
に記載されるＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ配列内に保存的アミノ酸置換を含むか、または
ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮホモログにおいて対応する位置に由来するアミノ酸の置換を
含む。ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ対立遺伝子改変体の１つのクラスは、特定のＰＣ−Ｌ
ＥＣＴＩＮアミノ酸配列の少なくとも小さな領域と高い程度の相同性を共有する
が、この配列とは根本的な背反（例えば、非保存的置換、短縮化（ｔｒｕｎｃａ
ｔｉｏｎ）、挿入、またはフレームシフト）をさらに含むタンパク質である。
【００５０】 保存的アミノ酸置換はしばしば、タンパク質のコンフォメーションも機能も変
更することなく、タンパク質中で作製され得る。このような変化としては、以下
が挙げられる：任意のイソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、およびロイシン（Ｌ
）の、任意の他のこれらの疎水性アミノ酸についての置換；グルタミン酸（Ｅ）
に対するアスパラギン酸（Ｄ）、およびその逆の置換；アスパラギン（Ｎ）に対
するグルタミン（Ｑ）、およびその逆の置換；ならびに、スレオニン（Ｔ）に対
するセリン（Ｓ）、およびその逆の置換。他の置換はまた、タンパク質の三次元
構造における特定のアミノ酸の環境およびその役割に依存して、保存的とみなさ
れ得る。例えば、グリシン（Ｇ）およびアラニン（Ａ）は、しばしば交換可能で
あり得、アラニン（Ａ）およびバリン（Ｖ）も同様であり得る。比較的疎水性で
あるメチオニン（Ｍ）はしばしば、ロイシンおよびイソロイシンと交換可能であ
り得、そして時としてバリンと交換可能であり得る。リシン（Ｋ）およびアルギ
ニン（Ｒ）はしばしば、そのアミノ酸残基の重要な特徴がその電荷であり、そし
てこれら２つのアミノ酸残基の異なるｐＫが重要でない位置において、交換可能
である。さらに他の変化が、特定の状況において、「保存的」とみなされ得る。
【００５１】 ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ（改変体を含む）は、図１（配列番号２）のアミノ酸配列
を有するＰＣ−ＬＥＣＴＩＮタンパク質と共通の少なくとも１つのエピトープを
含み、その結果、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮタンパク質に特異的に結合する抗体はまた
、図１（配列番号２）のアミノ酸配列を有するＰＣ−ＬＥＣＴＩＮタンパク質に
特異的に結合する。ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮタンパク質改変体の１つのクラスは、図
１（配列番号２）のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を共有する。ＰＣ−ＬＥ
ＣＴＩＮタンパク質改変体のより特定のクラスは、Ｃ型レクチンドメインを含む
。好ましいＰＣ−ＬＥＣＴＩＮタンパク質改変体は、糖質部分と、特に高マンノ
ース残基および／またはＮ−アセチルグルコサミンに対して特異的に結合し得る
。
【００５２】 ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮタンパク質は、多くの形態、好ましくは単離された形態で
具体化され得る。本明細書中で使用される場合、このタンパク質と正常に関連す
る細胞構成成分からＰＣ−ＬＥＣＴＩＮタンパク質を取り出すために、物理的方
法、機械的方法または化学的方法が使用される場合、タンパク質は「単離された
」という。当業者は、単離されたＰＣ−ＬＥＣＴＩＮを得るために、標準的な精
製方法を容易に使用し得る。精製されたＰＣ−ＬＥＣＴＩＮタンパク質分子は、
抗体または他のリガンドへのＰＣ−ＬＥＣＴＩＮの結合を損なう他のタンパク質
または分子を実質的に含まない。単離および精製の性質および程度は、意図され
る用途に依存する。ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮタンパク質の実施形態は、精製されたＰ
Ｃ−ＬＥＣＴＩＮおよび機能的な可溶性ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮタンパク質を含む。
１つの形態においては、このような機能的な可溶性ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮタンパク
質またはそのフラグメントは、抗体または他のリガンドに結合する能力を保持す
る。
【００５３】 本発明はまた、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮアミノ酸配列の生物学的に活性なフラグメ
ントを含むＰＣ−ＬＥＣＴＩＮポリペプチド（例えば、図１Ａ〜Ｄ（配列番号２
）に示されるようなＰＣ−ＬＥＣＴＩＮのアミノ酸配列の部分に対応するポリペ
プチド）を提供する。本発明のこのようなポリペプチドは、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ
タンパク質の特性（例えば、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮタンパク質に関連するエピトー
プに特異的に結合する抗体の産生を誘発する能力）を示す。
【００５４】 本明細書中に開示される本発明の実施形態は、広範な種々の当該分野で認めら
れたＰＣ−ＬＥＣＴＩＮタンパク質の改変体（例えば、アミノ酸の挿入、欠失お
よび置換を有するポリペプチド）を含む。ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ改変体は、当該分
野において公知の方法（例えば、部位特異的変異誘発、アラニンスキャニング（
ａｌａｎｉｎｅ ｓｃａｎｎｉｎｇ）、およびＰＣＲ変異誘発）を使用して作製
され得る。部位特異的変異誘発［Ｃａｒｔｅｒら、Ｎｕｄ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ
．１３：４３３１（１９８６）；Ｚｏｌｌｅｒら、Ｎｕｄ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ
．１０：６４８７（１９８７）］、カセット式変異誘発［Ｗｅｌｌら、Ｇｅｎｅ
３４：３１５（１９８５）］、制限選択的変異誘発［Ｗｅｌｌｓら、Ｐｈｉｌ
ｏｓ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄｏｎ ＳｅｒＡ ３１７：４１５（１
９８６）］または他の公知技術を、クローン化されたＤＮＡにおいて実施し、Ｐ
Ｃ−ＬＥＣＴＩＮ改変体ＤＮＡを産生し得る。走査型アミノ酸分析もまた、連続
配列に沿って１以上のアミノ酸を同定するために使用され得る。とりわけ好まし
い走査アミノ酸は、比較的小さい中性アミノ酸である。このようなアミノ酸とし
ては、アラニン、グリシン、セリン、およびシステインが挙げられる。アラニン
が、代表的に、この群の中で好ましい走査アミノ酸である。なぜなら、アラニン
は、β炭素を越えて側鎖を排除し、そして改変体の主鎖コンフォメーションを変
更する可能性が低いからである。アラニンもまた、代表的に好ましい。なぜなら
、アラニンは、最も一般的なアミノ酸であるからである。さらに、埋没位置およ
び露出位置の両方において、頻繁に見出される［Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｔｈｅ
Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．、ＮＹ）；Ｃｈｏｔｈｉａ
、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５０：１（１９７６）］。アラニン置換が適切な量
の改変体を生じない場合には、同配体アミノ酸が使用され得る。
【００５５】 上記で考察したように、特許請求された本発明の実施形態は、図１Ａ〜１Ｄ（
配列番号２）に示されるＰＣ−ＬＥＣＴＩＮタンパク質の２７３未満のアミノ酸
配列を含むポリペプチドを含む。例えば、本明細書中に開示される本発明の代表
的な実施形態は、以下が挙げられる：図１Ａ〜１Ｄ（配列番号２）に示されるＰ
Ｃ−ＬＥＣＴＩＮタンパク質の約アミノ酸１個〜約アミノ酸１０個からなるポリ
ペプチド、図１Ａ〜１Ｄ（配列番号２）に示されるＰＣ−ＬＥＣＴＩＮタンパク
質の約アミノ酸２０個〜約アミノ酸３０個からなるポリペプチド、図１Ａ〜１Ｄ
（配列番号２）に示されるＰＣ−ＬＥＣＴＩＮタンパク質の約アミノ酸３０個〜
約アミノ酸４０個からなるポリペプチド、図１Ａ〜１Ｄ（配列番号２）に示され
るＰＣ−ＬＥＣＴＩＮタンパク質の約アミノ酸４０個〜約アミノ酸５０個からな
るポリペプチド、図１Ａ〜１Ｄ（配列番号２）に示されるＰＣ−ＬＥＣＴＩＮタ
ンパク質の約アミノ酸５０個〜約アミノ酸６０個からなるポリペプチド、図１Ａ
〜１Ｄ（配列番号２）に示されるＰＣ−ＬＥＣＴＩＮタンパク質の約アミノ酸６
０個〜約アミノ酸７０個からなるポリペプチド、図１Ａ〜１Ｄ（配列番号２）に
示されるＰＣ−ＬＥＣＴＩＮタンパク質の約アミノ酸７０個〜約アミノ酸８０個
からなるポリペプチド、図１Ａ〜１Ｄ（配列番号２）に示されるＰＣ−ＬＥＣＴ
ＩＮタンパク質の約アミノ酸８０個〜約アミノ酸９０個からなるポリペプチド、
および図１Ａ〜１Ｄ（配列番号２）に示されるＰＣ−ＬＥＣＴＩＮタンパク質の
約アミノ酸９０個〜約アミノ酸１００個からなるポリペプチドなど。このスキー
ムに従って、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮタンパク質のアミノ酸１００〜２７３のアミノ
酸配列の部分からなるポリペプチドが、本発明の代表的な実施形態である。ＰＣ
−ＬＥＣＴＩＮタンパク質のより大きな部分からなるポリペプチドもまた意図さ
れる。例えば、図１Ａ〜１Ｄ（配列番号２）に示されるＰＣ−ＬＥＣＴＩＮタン
パク質の約アミノ酸１（または、２０もしくは３０もしくは４０など）個〜約ア
ミノ酸２０（または、３０もしくは４０もしくは５０など）個からなるポリペプ
チドが、当該分野において周知の種々の技術によって生成され得る。
【００５６】 本明細書中に開示される本発明のさらなる例示的な実施形態は、図１Ａ（配列
番号２）に示されるようなＰＣ−ＬＥＣＴＩＮポリペプチド配列内に含まれる１
以上の生物学的モチーフのアミノ酸残基を含むＰＣ−ＬＥＣＴＩＮポリペプチド
を含む。１つの実施形態では、本発明の代表的ポリペプチドは、図１Ａ〜１Ｄ（
配列番号２）で同定されるハムスターライリン、および／または１以上の膜貫通
領域もしくはＣ型レクチンドメインに対して相同性を示すＰＣ−ＬＥＣＴＩＮの
１以上の領域を含み得る。別の実施形態では、本発明の代表的ポリペプチドは、
残基８６〜８９（図１に示される最初のアミノ酸残基から番号付ける）でＮＬＴ
Ｋ（配列番号３３）、および／または残基２５５〜２５８におけるＮＱＳＴ（配
列番号３４）のような１以上のＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ Ｎ−グリコシル化部位を含
み得る。別の実施形態では、本発明の代表的ポリペプチドは、残基２６６〜２６
９におけるＲＫＥＳ（配列番号３５）のような１以上のＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ ｃ
ＡＭＰ／ｃＧＭＰ依存性タンパク質キナーゼリン酸化部位を含み得る。別の実施
形態では、本発明の代表的ポリペプチドは、残基４９〜５１におけるＳＳＲ、残
基１４１〜１４３におけるＳＥＫ、残基２６４〜２６６におけるＳＴＲ、および
／または残基２６４〜２６７におけるＴＲＫのような１以上のＰＣ−ＬＥＣＴＩ
Ｎタンパク質キナーゼＣリン酸化部位を含み得る。別の実施形態では、本発明の
代表的ポリペプチドは、残基５３〜５６でＳＦＱＥ（配列番号３６）、残基９５
〜９８におけるＳＤＧＤ（配列番号３７）、残基２６５〜２６８におけるＴＲＫ
Ｅ（配列番号３８）、および／または残基２６９〜２７２におけるＳＧＭＥ（配
列番号３９）のような１以上のＰＣ−ＬＥＣＴＩＮカゼインキナーゼＩＩリン酸
化部位を含み得る。別の実施形態では、本発明の代表的ポリペプチドは、残基２
７〜３２におけるＧＱＫＶＣＦ（配列番号４０）、残基６６〜７１におけるＧＶ
ＬＬＳＬ（配列番号７１）、残基９１〜９６におけるＧＴＧＩＳＤ（配列番号４
２）、残基９３〜９８におけるＧＩＳＤＧＤ（配列番号４３）、残基１０２〜１
０７におけるＧＬＷＲＮＧ（配列番号４４）、残基１０９〜１１４におけるＧＱ
ＴＳＧＡ（配列番号４５）、残基１４０〜１４５におけるＧＳＥＫＣＶ（配列番
号４６）、および／または残基２１２〜２１７におけるＧＩＩＰＮＬ（配列番号
４７）のような１以上のＮ−ミリストイル化部位を含み得る。これらの本発明の
関連した実施形態としては、上記で考察された異なるモチーフの組合せを含むポ
リペプチドが挙げられ、好ましい実施形態は、これらのポリペプチドのモチーフ
または介在配列のいずれにも、挿入も欠失も置換も含んでいないポリペプチドで
ある。
【００５７】 ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮポリペプチドは、本明細書中に開示されるヒトＰＣ−ＬＥ
ＣＴＩＮタンパク質のアミノ酸配列に基づいて、当該分野において周知の、標準
的なペプチド合成技術または化学切断方法を使用して生成され得る。あるいは、
組換え方法を使用して、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮタンパク質のポリペプチドフラグメ
ントをコードする核酸分子を生成し得る、この点において、本明細書中に記載さ
れるＰＣ−ＬＥＣＴＩＮコード核酸分子は、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮタンパク質の規
定のフラグメントを生成するために手段を提供する。ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮポリペ
プチドは、ドメイン特異的抗体（例えば、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮタンパク質の細胞
外エピトープおよび細胞内エピトープを認識する抗体）の生成および特徴付け、
ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮまたはその特定の構造ドメインに結合する薬剤または細胞因
子の同定、および種々の治療状況（癌ワクチンを含むが、これらに限定されない
）において、特に有用である。特定の興味深い構造を含むＰＣ−ＬＥＣＴＩＮポ
リペプチドは、例えば、以下：Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ、Ｇａｒｎｉｅｒ−Ｒｏ
ｂｓｏｎ、Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ、Ｋａｒｐｌｕ
ｓ−ＳｃｈｕｌｔｚまたはＪａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ分析の方法を含む、当該分
野で周知の種々の分析技術を使用するか、または免疫原性に基づいて、予測およ
び／または同定され得る。このような構造を含むフラグメントは、サブユニット
特異的抗ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ抗体の生成、またはＰＣ−ＬＥＣＴＩＮに結合する
細胞因子の同定において、特に有用である。
【００５８】 以下の実施例に記載される特定の実施形態において、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮの分
泌形態は、Ｃ末端６×ＨｉｓおよびＭＹＣタグを含む、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮをコ
ードするＣＭＶ駆動発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３．１／ｍｙｃＨＩＳ、Ｉｍｖｉ
ｔｒｏｇｅｎ））でトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞において、簡便に発現
され得る。培養培地中の分泌されたＨＩＳタグ化ＰＳＣＡは、標準的な技術を使
用して、ニッケルカラムを使用して精製され得る。あるいは、ＡＰ−タグ系が使
用され得る（実施例７を参照のこと）。
【００５９】 ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮの改変（例えば、共有結合性改変）は、本発明の範囲内に
含まれる。１つの型の共有結合性改変としては、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮの選択され
た側鎖あるいはＮ末端残基またはＣ末端残基と反応し得る有機誘導体化薬剤での
、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮポリペプチドの標的化されたアミノ酸残基の反応が挙げら
れる。本発明の範囲内のＰＣ−ＬＥＣＴＩＮポリペプチドの別の型の共有結合性
改変としては、このポリペプチドのネイティブなグリコシル化パターンの変更が
挙げられる。「ネイティブなグリコシル化パターンの変更」は、本明細書中の目
的のために、ネイティブ配列ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮに見い出される１以上の糖質部
分の欠失（基礎となるグリコシル化部位の除去、または化学的手段および／また
は酵素的手段によるグリコシル化の欠失のいずれかによって）、および／または
ネイティブ配列ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮに存在しない、１以上のグリコシル化部位の
付加を意味することが意図される。さらに、この句は、存在する種々の糖質部分
の性質および割合の変更を含む、ネイティブタンパク質のグリコシル化の質的変
化を含む。ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮの別の型の共有結合性改変としては、米国特許第
４，６４０，８３５号、同第４，４９６，６８９号、同第４，３０１，１４４号
、同第４，６７０，４１７号、同第４，７９１，１９２号または同第４，１７９
，３３７号に示されるような様式の、種々の非タンパク質様ポリマー（例えば、
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコールまたはポリオキ
シアルキレン）のうちの１つへの、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮポリペプチドの連結が挙
げられる。 本発明のＰＣ−ＬＥＣＴＩＮはまた、別の異種ポリペプチドまたはアミノ酸配
列に融合されたＰＣ−ＬＥＣＴＩＮを含むキメラ分子を形成する様式で、改変さ
れ得る。１つの実施形態において、このようなキメラ分子としては、ポリヒスチ
ジンエピトープタグを有するＰＣ−ＬＥＣＴＩＮの融合体が挙げられ、このタグ
は、固定されたニッケルが選択的に結合し得るエピトープを提供する。このエピ
トープタグは、一般に、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮのアミノ末端またはカルボキシル末
端に配置される。代替的実施形態において、このキメラ分子は、ＰＣ−ＬＥＣＴ
ＩＮの免疫グロブリンまたは免疫グロブリンの特定の領域との融合体を含み得る
。キメラ分子の二価形態（「免疫付着因子（ｉｍｍｕｎｏａｄｈｅｓｉｎ）」と
も呼ばれる）について、このような融合体は、ＩｇＧ分子のＦｃ領域に対するも
のであり得る。このＩｇ融合体は、好ましくは、Ｉｇ分子内の少なくとも１つの
可変領域の代わりに、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮポリペプチドの可溶性（膜貫通ドメイ
ンを欠失または不活性化した）形態での置換を含む。特に好ましい実施形態にお
いて、免疫グロブリン融合体は、ＩｇＧＩ分子のヒンジ領域、ＣＨ２領域および
ＣＨ３領域、またはヒンジ領域、ＣＨ１領域、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域を含
む。免疫グロブリン融合体の産生については、米国特許第５，４２８，１３０号
（１９９５年６月２７日公布）もまた参照のこと。
【００６０】 （ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ抗体） 本発明の別の局面は、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮタンパク質およびポリペプチドに結
合する抗体を提供する。最も好ましい抗体は、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮタンパク質に
選択的に結合し、そして非ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮタンパク質およびポリペプチドに
結合しない（または、弱く結合する）。特に意図される抗ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ抗
体としては、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体、ならびにこれらの
抗体の抗原結合ドメインおよび／または１以上の相補性決定領域を含むフラグメ
ントが挙げられる。本明細書中で使用される場合、抗体フラグメントは、その標
的に結合する免疫グロブリン分子の可変領域（すなわち、抗原結合領域）の少な
くとも一部として定義される。
【００６１】 いくつかの適用のために、特定のＰＣ−ＬＥＣＴＩＮタンパク質および／また
は特定の構造ドメイン内のエピトープと特異的に反応する抗体を産生することが
所望され得る。例えば、癌治療および画像診断の目的に有用である好ましい抗体
は、癌細胞において発現されるようなＰＣ−ＬＥＣＴＩＮタンパク質の細胞外領
域におけるエピトープと反応する抗体である。このような抗体は、免疫原として
、本明細書中に記載されたＰＣ−ＬＥＣＴＩＮを使用することによってかまたは
予想されるその細胞外ドメインから誘導されるペプチドを使用することによって
産生され得る。これに関連して、図１に示されるＰＣ−ＬＥＣＴＩＮタンパク質
配列を参照すると、膜貫通ドメインに関するアミノ末端配列中の領域は、細胞外
特異的ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ抗体を産生および選択するために、適切な免疫原およ
びスクリーニング薬剤を設計するために使用する場合に選択され得る。
【００６２】 本発明のＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ抗体は、前立腺癌の治療戦略、診断アッセイおよ
び予後アッセイ、ならびに画像化方法において特に有用であり得る。同様に、こ
のような抗体は、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮが他の型の癌でもまた発現または過剰発現
される限り、他の癌の処置、診断および／または予後に有用であり得る。本発明
はまた、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮおよび変異体ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮのタンパク質およ
びポリペプチドの、検出および定量に有用な種々の免疫学的アッセイを提供する
。このようなアッセイは、一般に、適切には、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮまたは変異体
ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮタンパク質を認識および結合し得る、１以上のＰＣ−ＬＥＣ
ＴＩＮ抗体を含み、そして、以下を含むが、これらに限定されない当該分野で周
知の種々の免疫学的アッセイ形式で行われ得る：種々の型のラジオイムノアッセ
イ、酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、酵素連結免疫蛍光アッセイ（Ｅ
ＬＩＦＡ）など。さらに、前立腺癌を検出し得る、免疫学的画像化方法もまた、
本発明によって提供され、これらには、標識したＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ抗体を使用
するラジオシンチグラフィー画像化方法が挙げられるが、これらに限定されない
。このようなアッセイは、前立腺癌の検出、モニタリングおよび予後において、
臨床的に有用であり得る。
【００６３】 ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ抗体はまた、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮおよび変異体ＰＣ−ＬＥ
ＣＴＩＮのタンパク質およびポリペプチドの精製、ならびにＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ
ホモログおよび関連分子の単離のための方法において使用され得る。例えば、１
つの実施形態において、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮタンパク質を精製する方法は、ＰＣ
−ＬＥＣＴＩＮ抗体（これは、固体マトリックスに結合されている）を、ＰＣ−
ＬＥＣＴＩＮを含有する溶解物または他の溶液と共に、このＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ
抗体がＰＣ−ＬＥＣＴＩＮに結合するのを可能にする条件下でインキュベートす
る工程；固体マトリックスを洗浄して不純物を除去する工程；およびＰＣ−ＬＥ
ＣＴＩＮをその結合された抗体から溶出する工程を包含する。本発明のＰＣ−Ｌ
ＥＣＴＩＮ抗体の他の用途としては、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮタンパク質を模倣する
抗イディオタイプ抗体の生成が挙げられる。
【００６４】 ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ抗体はまた、例えば、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮタンパク質の生
物学的な活性を調節もしくは阻害することによって、またはＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ
タンパク質を発現する前立腺癌細胞を標的もしくは破壊することによることによ
って治療学的に使用され得る。前立腺癌および他の癌の抗体治療は、以下の別々
の小段落により具体的に記載されている。
【００６５】 抗体の調製のための種々の方法が、当該分野で周知である。例えば、抗体は、
単離または免疫結合体化された形態の、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮのタンパク質、ペプ
チドまたはフラグメントを使用して、適切な哺乳動物宿主を免疫することによっ
て調製され得る（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕ
ａｌ，ＣＳＨ Ｐｒｅｓｓ編、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９８８）；Ｈａ
ｒｌｏｗ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐ
ｒｅｓｓ，ＮＹ（１９８９））。タンパク質免疫原の例としては、組換えＰＣ−
ＬＥＣＴＩＮ（バキュロウイル系、哺乳動物系などにおいて発現される）、ＰＣ
−ＬＥＣＴＩＮ細胞外ドメイン、ＡＰ−タグ化ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮなどが挙げら
れる。さらに、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮの融合タンパク質（例えば、ＰＣ−ＬＥＣＴ
ＩＮ ＧＳＴ融合タンパク質）もまた使用され得る。特定の実施形態において、
図１Ａ〜１Ｄ（配列番号２）のオープンリーディングフレームアミノ酸配列の全
てまたはほとんどを含むＧＳＴ融合タンパク質が生成され得、そして適切な抗体
を生成するための免疫原として使用され得る。ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮを発現または
過剰発現する細胞が使用され得る。同様に、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮを発現するため
に操作される任意の細胞が、使用され得る。このような戦略により、結果として
、内因性ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮを認識する増強した能力を有する、モノクローナル
抗体の産物が得られ得る。別の有用な免疫原は、ヒツジの赤血球の原形質膜に結
合するＰＣ−ＬＥＣＴＩＮペプチドを含む。
【００６６】 図１Ａ〜１Ｄ（配列番号２）に示されるようなＰＣ−ＬＥＣＴＩＮのアミノ酸
配列を使用して、抗体を生成するためにＰＣ−ＬＥＣＴＩＮタンパク質の特定の
領域を選択し得る。例えば、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮアミノ酸配列の疎水性および親
水性分析を使用して、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ構造の疎水性領域を同定し得る。免疫
原性構造を示すＰＣ−ＬＥＣＴＩＮタンパク質の領域、ならびに他の領域および
ドメインは、以下のような当該分野で公知の種々の他の方法を使用して容易に同
定され得る：Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ、Ｇａｒｎｉｅｒ−Ｒｏｂｓｏｎ、Ｋｙｔ
ｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ、Ｋａｒｐｌｕｓ−Ｓｃｈｕｌｔ
ｚまたはＪａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ分析。ＨＬＡ−Ａ２（例えば、ＷＩＧＦＴＹ
ＫＴＡ（配列番号６）、ＡＴＧＥＨＱＡＦＴ（配列番号７）、ＦＧＮＣＶＥＬＱ
Ａ（配列番号８）、ＮＣＶＥＬＱＡＳＡ（配列番号９）、およびＤＮＨＧＦＧＮ
ＣＶ（配列番号１０））と結合すると予想されるＰＣ−ＬＥＣＴＩＮのペプチド
は、抗体の産生のために選択され得る。以下の実施例に記載されるように、免疫
原性は、ペプチドであるＧＬＷＲＮＧＤＧＱＴＳＧＡＣ（配列番号２５）、ＧＧ
ＰＹＬＹＱＷＮＤＤＲＣＮＭ（配列番号２６）、ＥＡＲＬＡＣＥＳＥＧＧＶＬＬ
（配列番号２７）、およびＰＣ−ＬＥＣＴＩＮの細胞外ドメイン（配列番号２の
アミノ酸２２−２１３）を用いて証明され、これは、それぞれウサギおよびマウ
スを使用するポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を産生するために使
用された。
【００６７】 免疫原としての使用のためのタンパク質またはポリペプチドを調製するための
方法、およびキャリア（例えば、ＢＳＡ、ＫＬＨまたは他のキャリアタンパク質
）とのタンパク質の免疫結合体を調製するための方法は、当該分野で周知である
。いくつかの状況下で、例えば、カルボジイミド試薬を使用する直接的な結合体
化が使用され得；他の例において、連結試薬（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍ
ｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬによって供給される連結試薬）が、
効果的であり得る。ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ免疫原の投与は一般に、当該分野で一般
に理解されるように、適切な期間にわたって、適切なアジュバントの使用を伴う
注射によって行われ得る。免疫スケジュールの間、抗体の力価は、抗体形成の能
力（ａｄｅｑｕａｃｙ）を決定することによって理解され得る。
【００６８】 ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮモノクローナル抗体が好ましく、そして当該分野で周知の
種々の手段によって産生され得る。例えば、所望のモノクローナル抗体を分泌す
る不死化細胞株が、一般に公知のように、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ
の標準的なハイブリドーマ技術、または産生性（ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ）Ｂ細胞を
不死化する改変を使用して調製され得る。所望の抗体を分泌する不死化細胞株は
、抗原がＰＣ−ＬＥＣＴＩＮタンパク質またはＰＣ−ＬＥＣＴＩＮフラグメント
である免疫アッセイによってスクリーニングされる。所望の抗体を分泌する適切
な不死化細胞培養物が同定される場合、これらの細胞を拡大し、そしてインビト
ロ培養物または腹水のいずれかから抗体が産生され得る。
【００６９】 抗体またはフラグメントはまた、現在の技術を使用する、組換え手順によって
産生され得る。ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮタンパク質の所望の領域に特異的に結合する
領域はまた、複数の種起源のキメラ抗体またはＣＤＲ移植化（ｇｒａｆｔｅｄ）
抗体の状況下で産生され得る。ヒト化ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ抗体またはヒトＰＣ−
ＬＥＣＴＩＮ抗体もまた産生され得、そして治療的状況下での使用のために好ま
しい。１以上の非ヒト抗体ＣＤＲを対応するヒト抗体配列と置換することによる
、マウス抗体および他の非ヒト抗体をヒト化するための方法は、周知である（例
えば、Ｊｏｎｅｓら、１９８６、Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２−５２５；Ｒｉ
ｅｃｈｍａｎｎら、１９８８、Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−３２７；Ｖｅｒ
ｈｏｅｙｅｎら、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４−１５３６を参
照のこと）。Ｃａｒｔｅｒら、１９９３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ ８９：４２８５、およびＳｉｍｓら、１９９３、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．１５１：２２９６もまた参照のこと。完全なヒトモノクローナル抗体を産生
するための方法としては、ファージディスプレイ法およびトランスジェニック動
物法が挙げられる（概要について、Ｖａｕｇｈａｎら、１９９８、Ｎａｔｕｒｅ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １６：５３５−５３９を参照のこと）。
【００７０】 完全なヒトＰＣ−ＬＥＣＴＩＮモノクローナル抗体は、大きいヒトＩｇ遺伝子
コンビナトリアルライブラリー（すなわち、ファージディスプレイ）を使用する
クローニング技術を使用して生成され得る（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒ
ｉｎｇ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｐｈｙ
ｌａｃｔｉｃ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（
Ｍａｎ．Ｃｌａｒｋ，Ｍ．編）、Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ Ａｃａｄｅｍｉｃ、４
５−６４頁（１９９３）のＧｒｉｆｆｉｔｈｓおよびＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍ、Ｂ
ｕｉｌｄｉｎｇ ａｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ：ｈｕ
ｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｒｏｍ ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｌｉ
ｂｒａｒｉｅｓ；ＢｕｒｔｏｎおよびＢａｒｂａｓ、Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏ
ｄｉｅｓ ｆｒｏｍ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ（同書
）６５−８２頁）。完全なヒトＰＣ−ＬＥＣＴＩＮモノクローナル抗体はまた、
ＰＣＴ特許出願ＷＯ９８／２４８９３（ＫｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉおよびＪａｋ
ｏｂｏｖｉｔｓら、１９９７年１２月３日提出）に記載されるように、ヒト免疫
グロブリン遺伝子座を含むように操作されたトランスジェニックマウスを使用し
て産生され得る（Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ、１９９８、Ｅｘｐ．Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖ
ｅｓｔ．Ｄｒｕｇｓ ７（４）：６０７−６１４もまた参照のこと）。この方法
は、ファージディスプレイ技術に必要とされるインビトロ操作を回避し、そして
高親和性の真正ヒト抗体を効率的に産生する。
【００７１】 ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ抗体のＰＣ−ＬＥＣＴＩＮタンパク質との反応性は、適切
には、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮタンパク質、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮペプチド、ＰＣ−Ｌ
ＥＣＴＩＮ発現細胞またはその抽出物を使用する、多くの周知の手段（ウエスタ
ンブロット、免疫沈降、ＥＬＩＳＡおよびＦＡＣＳ分析を含む）によって確証さ
れ得る。
【００７２】 本発明のＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ抗体またはそのフラグメントは、検出可能なマー
カーで標識され得るか、または第２の分子（例えば、細胞傷害性薬剤）に結合体
化され、そして第２の分子をＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ陽性細胞に標的するために使用
され得る（Ｖｉｔｅｔｔａ，Ｅ．Ｓ．ら、１９９３、Ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎ
ｔｈｅｒａｐｙ，ｉｎ ＤｅＶｉｔａ，Ｊｒ．，Ｖ．Ｔ．ら編、Ｃａｎｃｅｒ：
Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，
第４版，Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｏｉｎｃｏｔｔ Ｃｏ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ
，２６２４−２６３６）。細胞毒性薬剤の例としては、以下が挙げられが、これ
らに限定されない：リシン、リシンＡ鎖、ドキソルビシン、ダウノルビシン、タ
キソール、エチジウムブロマイド、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド（
ｔｅｎｏｐｏｓｉｄｅ）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ジヒ
ドロキシアントラセンジオン、アクチノマイシン、ジフテリア毒素、プセウドモ
ナス体外毒素（ＰＥ）Ａ、ＰＥ４０、アブリン、アブリンＡ鎖、モデシン（ｍｏ
ｄｅｃｃｉｎ）Ａ鎖、α−サルシン（ｓａｒｃｉｎ）、ジェロニン（ｇｅｌｏｎ
ｉｎ）、マイトゲリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、リトストリクトシン（ｒｅｔ
ｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）、フェノマイシン、エノマイシン、クリシン（ｃｕｒｉ
ｃｉｎ）、クロチン（ｃｒｏｔｉｎ）、カリケアマイシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍ
ｉｃｉｎ、サパオナリア（ｓａｐａｏｎａｒｉａ）薬用インヒビター、グルココ
ルチコイド、および他の化学療法剤、ならびに放射性同位体（例えば、212Ｂｉ
、131Ｉ、131Ｉｎ、90Ｙ、および186Ｒｅ）。適切な検出可能なマーカーとして
は、放射性同位体、蛍光化合物、生体発光化合物、化学発光化合物、金属キレー
ト剤または酵素が挙げられるが、これらに限定されない。抗体はまた、プロドラ
ックをその活性形態に変換し得る、抗癌プロドラック活性酵素に結合され得る。
例えば、米国特許第４，９７５，２８７号を参照のこと。
【００７３】 さらに、２以上のＰＣ−ＬＥＣＴＩＮエピトープに特異的な二特異的抗体が、
当該分野で一般に公知の方法を使用して生成され得る。さらに、抗体効果機能は
、癌細胞上でのＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ抗体の治療効果を増強するために改変され得
る。例えば、システイン残基は、Ｆｃ領域に操作され得、鎖間のジスルフィド結
合の形成、内在化、ＡＤＣＣおよび／または補体媒介細胞死の能力を増強し得る
ホモダイマーの産生を可能にする（例えば、Ｃａｒｏｎら、１９９２、Ｊ，Ｅｘ
ｐ．Ｍｅｄ．１７６：１１９１−１１９５，Ｓｈｏｐｅｓ，１９９２，Ｊ．Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ．１４８：２９１８−２９２２を参照のこと）。ホモダイマー性の抗
体もまた、当該分野で公知の架橋技術によって生成され得る（例えば、Ｗｏｌｆ
ｆら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３：２５６０−２５６５）。
【００７４】 （ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮトランスジェニック動物） ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮまたはその改変形態をコードする核酸はまた、トランスジ
ェニック動物または「ノックアウト」動物のいずれかを生成するために使用され
得、これらの動物は、次いで、治療的に有用な試薬の開発およびスクリーニング
において有用である。トランスジェニック動物（例えば、マウスまたはラット）
は、導入遺伝子を含む細胞を有する動物であり、その導入遺伝子は、その動物に
、または出生前（例えば、胚段階）でその動物の祖先に導入される。導入遺伝子
は、細胞のゲノム内に組み込まれるＤＮＡであり、トランスジェニック動物は、
その細胞から発生する。１つの実施形態において、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮをコード
するｃＤＮＡが、確立された技術に従って、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮコードするゲノ
ムＤＮＡをクローニングするために使用され得、そしてそのゲノム配列は、ＰＣ
−ＬＥＣＴＩＮをコードするＤＮＡを発現する細胞を含むトランスジェニック動
物を生成するために使用され得る。
【００７５】 トランスジェニック動物（特に、マウスまたはラットのような動物）を生成す
るための方法は、当該分野で慣用的となり、そして例えば、米国特許第４，７３
６，８６６号および４，８７０，００９号に記載される。代表的に、特定の細胞
が、組織特異的エンハンサーと共にＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ導入遺伝子の組み込みの
ために標的化される。胚段階の動物の生殖系列に導入された、ＰＣ−ＬＥＣＴＩ
Ｎをコードする１コピーの導入遺伝子を含むトランスジェニック動物を使用して
、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮをコードするＤＮＡの発現の増大の効果を試験し得る。こ
のような動物は、例えば、その過剰発現と関連する病理学的状態からの防御を付
与することが考えられる試薬についての、試験動物として使用され得る。本発明
のこの局面に従って、動物をその試薬で処置し、そしてこの導入遺伝子を保有す
る処置していない動物と比較した、その病理学的状態の発生率の減少は、その病
理学的状態についての潜在的な治療的介入を示す。
【００７６】 あるいは、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮの非ヒトホモログを使用して、ＰＣ−ＬＥＣＴ
ＩＮ「ノックアウト」動物を構築し得、この動物は、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮをコー
ドする内因性遺伝子とその動物の胚細胞に導入されたＰＣ−ＬＥＣＴＩＮをコー
ドする改変ゲノムＤＮＡと間の相同組換えの結果として、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮを
コードする欠損性または改変型遺伝子を有する。例えば、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮを
コードするｃＤＮＡを使用して、確立された技術に従って、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ
をコードするゲノムＤＮＡをクローニングし得る。ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮをコード
するゲノムＤＮＡの一部は、欠失され得るか、または別の遺伝子（例えば、組み
込みをモニターするために使用され得る、選択マーカーをコードする遺伝子）で
置換され得る。
【００７７】 代表的に、数キロベースの変更されていない隣接ＤＮＡ（５’末端および３’
末端の両方）が、そのベクターに含まれる（相同組換えベクターの記載について
は、例えば、ＴｈｏｍａｓおよびＣａｐｅｃｃｈｉ、１９８７、Ｃｅｌｌ、５１
：５０３を参照のこと）。このベクターは、胚性幹細胞株に（例えば、エレクト
ロポレーションによって）導入され、そして導入されたＤＮＡが内因性のＤＮＡ
と相同組換えした細胞が、選択される（例えば、Ｌｉら、Ｃｅｌｌ、１９９２、
６９：９１５を参照のこと）。次いで、この選択された細胞を、動物（例えば、
マウスまたはラット）の胚盤胞に導入し、凝集キメラを形成させる（例えば、Ｂ
ｒａｄｌｅｙ、Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ａｎｄ Ｅｍｂｒｙｏｎｉ
ｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｅ．
Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ編（ＩＲＬ，Ｏｘｆｏｒｄ、１９８７）、１１３−１５
２頁を参照のこと）。
【００７８】 次いで、キメラ性の胚を、適切な偽妊娠雌性養母動物に移植し、そしてその胚
は、満期まで育成させて、「ノックアウト」動物を作製し得る。生殖細胞中に相
同組換えされたＤＮＡを有する子孫は、標準的な技術によって同定され得、そし
てその子孫を用いて、全ての細胞が相同組換えＤＮＡを含む動物を育種し得る。
ノックアウト動物は、例えば、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮポリペプチドの非存在に起因
する、特定の病理学的状態に対して防御する能力および病理学的状態の発生につ
いて、特徴付けられ得る。
【００７９】 （ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮの検出のための方法） 本発明の別の局面は、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮポリヌクレオチドおよびＰＣ−ＬＥ
ＣＴＩＮタンパク質ならびにそれらの改変体を検出するための方法、ならびにＰ
Ｃ−ＬＥＣＴＩＮを発現する細胞を同定するための方法に関する。ＰＣ−ＬＥＣ
ＴＩＮは、前立腺癌のリンパ節転移および骨転移に由来するＬＡＰＣ異種移植片
において発現されるようであり、そしてＰＣ−ＬＥＣＴＩＮの発現プロフィール
は、それを転移された疾患についての潜在的な診断マーカーにする。この状況に
おいて、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ遺伝子産物の状態は、進行した状態の疾患に対する
感受性、進行速度および／または腫瘍の凝集性を含む、種々の因子を予測するた
めに有用な情報を提供し得る。以下で詳細に議論されるように、患者サンプル中
のＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ遺伝子産物の状態は、以下を含む当該分野で周知の種々の
プロトコルによって分析され得る：免疫組織化学分析、インサイチュハイブリダ
イゼーションを含む種々のノーザンブロット技術、ＲＴ−ＰＣＲ分析（例えば、
レーザー捕捉微小分析サンプルに対して）、ウエスタンブロット分析および組織
アレイ分析。
【００８０】 より詳細には、本発明は、生物学的サンプル（例えば、血清、骨、前立腺およ
び他の組織、尿、精液、細胞調製物など）中のＰＣ−ＬＥＣＴＩＮポリヌクレオ
チドの検出のためのアッセイを提供する。検出可能なＰＣ−ＬＥＣＴＩＮポリヌ
クレオチドとしては、例えば、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ遺伝子またはそのフラグメン
ト、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ ｍＲＮＡ、選択的スプライシング改変体ＰＣ−ＬＥＣ
ＴＩＮ ｍＲＮＡ、およびＰＣ−ＬＥＣＴＩＮポリヌクレオチドを含む組換えＤ
ＮＡもしくはＲＮＡ分子が挙げられる。ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮポリヌクレオチドを
増幅し、そして／またはＰＣ−ＬＥＣＴＩＮポリヌクレオチドの存在を検出する
ための多くの方法は、当該分野において周知であり、そして本発明のこの局面の
実施に用いられ得る。
【００８１】 １つの実施形態において、生物学的サンプル中のＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ ｍＲＮ
Ａを検出するための方法は、少なくとも１つのプライマーを使用して、逆転写に
よってサンプルからｃＤＮＡを産生する工程；その中のＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ ｃ
ＤＮＡを増幅するために、センスおよびアンチセンスのプライマーとしてＰＣ−
ＬＥＣＴＩＮポリヌクレオチドを使用して、そのように産生されたｃＤＮＡを増
幅する工程；および増幅されたＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ ｃＤＮＡの存在を検出する
工程、を包含する。必要に応じて、増幅されたＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ ｃＤＮＡの
配列が、決定され得る。別の実施形態において、生物学的サンプル中のＰＣ−Ｌ
ＥＣＴＩＮ遺伝子を検出する方法は、サンプルからゲノムＤＮＡを最初に単離す
る工程；その中のＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ遺伝子を増幅するために、センスおよびア
ンチセンスのプライマーとしてＰＣ−ＬＥＣＴＩＮポリヌクレオチドを使用して
単離されたゲノムＤＮＡを増幅する工程；および増幅されたＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ
遺伝子の存在を検出する工程、を包含する。任意の多くの適切なセンスプローブ
およびアンチセンスプローブの組合せが、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮについて提供され
るヌクレオチド配列（図１Ａ〜１Ｄ；配列番号１）から設計され、そしてこの目
的のために使用され得る。
【００８２】 本発明はまた、他の生物学的サンプルの組織（例えば、血清、骨、前立腺、お
よび他の組織、尿、細胞調製物など）中のＰＣ−ＬＥＣＴＩＮタンパク質の存在
を検出するためのアッセイを提供する。ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮタンパク質を検出す
るための方法もまた、周知であり、そして例えば、免疫沈降、免疫組織化学分析
、ウエスタンブロット分析、分子結合アッセイ、ＥＬＩＳＡ、ＥＬＩＦＡなどが
挙げられる。例えば、１つの実施形態において、生物学的サンプル中のＰＣ−Ｌ
ＥＣＴＩＮタンパク質の存在を検出する方法は、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ抗体、その
ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ反応性フラグメント、またはＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ抗体の抗原
結合領域を含む組換えタンパク質と、サンプルとを最初に接触させる工程；なら
びに次いで、それに対するサンプル中のＰＣ−ＬＥＣＴＩＮタンパク質の結合を
検出する工程、を包含する。
【００８３】 ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮを発現する細胞を同定するための方法もまた、提供される
。１つの実施形態において、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ遺伝子を発現する細胞を同定す
るためのアッセイは、細胞中のＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ ｍＲＮＡの存在を検出する
ための工程を包含する。細胞中の特定のｍＲＮＡを検出するための方法は、周知
であり、そして例えば、相補ＤＮＡプローブを使用するハイブリダイゼーション
アッセイ（例えば、標識されたＰＣ−ＬＥＣＴＩＮリボプローブを使用するイン
サイチュハイブリダイゼーション、ノーザンブロットおよび関連技術）ならびに
種々の核酸増幅アッセイ（例えば、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮに特異的な相補プライマ
ーを使用するＲＴ−ＰＣＲ、および例えば、分岐ＤＮＡ、ＳＩＳＢＡ、ＴＭＡな
どの他の増幅型検出方法）が挙げられる。あるいは、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ遺伝子
を発現する細胞を同定するためのアッセイは、細胞中のＰＣ−ＬＥＣＴＩＮＳタ
ンパク質または細胞によって分泌されたＰＣ−ＬＥＣＴＩＮタンパク質の存在を
検出する工程を包含する。タンパク質を検出するための種々の方法が、当該分野
において周知であり、そしてＰＣ−ＬＥＣＴＩＮタンパク質およびＰＣ−ＬＥＣ
ＴＩＮ発現細胞の検出のために用いられ得る。
【００８４】 ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ発現分析はまた、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ遺伝子発現を調節す
る薬剤を同定かつ評価するためにツールとして有用であり得る。例えば、ＰＣ−
ＬＥＣＴＩＮ発現は、正常な精巣および前立腺癌に限定され、そしてＰＣ−ＬＥ
ＣＴＩＮはまた、他の癌において発現され得る。癌細胞でのＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ
発現または過剰発現を阻害し得る分子または生物学的薬剤の同定は、治療上の価
値があり得る。このような薬剤は、ＲＴ−ＰＣＲ、核酸ハイブリダイゼーション
または抗体結合によってＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ発現を定量するスクリーニングを使
用して、同定され得る。
【００８５】 （ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮおよびその産物の状態のモニタリング） 個体におけるＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ遺伝子およびＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ遺伝子産物
の状態を評価するアッセイは、この個体に由来する生物学的サンプルの増殖また
は腫瘍能力に関する情報を提供し得る。例えば、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ ｍＲＮＡ
は、正常組織に比べて前立腺癌においてかなり多く発現されるので、生物学的サ
ンプル中のＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ ｍＲＮＡ転写物またはタンパク質の相対レベル
を評価するアッセイは、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ調節不全と関連する疾患（例えば、
癌）を診断するために使用され得、そして適切な治療オプションを規定するに有
用である予後情報を提供し得る。同様に、生物学的サンプルにおけるＰＣ−ＬＥ
ＣＴＩＮヌクレオチドおよびアミノ配列の完全性を評価するアッセイもまた、こ
の状況において使用され得る。
【００８６】 ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ ｍＲＮＡが前立腺癌においてかなり多く発現され、そし
て正常組織においてほとんど発現されないという知見は、この遺伝子が細胞増殖
の調節不全に関連するという証拠を提供し、それによってこの遺伝子およびその
産物を、当業者がＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ調節不全に関連する疾患を有することが疑
われる個体由来の生物学的サンプルを評価するために使用し得る標的として同定
する。別の例において、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮの発現が精巣に限定されるので、転
移の指標としてＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ発現を検出するために、他の組織から採取し
た生物学的サンプルを評価し得る。この状況において、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ遺伝
子およびその産物の発現状態の評価は、組織サンプルに潜在的な疾患に関する情
報を得るために使用され得る。この状況における用語「発現状態」は、遺伝子お
よびその産物の発現、機能および調節（例えば、ｍＲＮＡ発現レベル、発現され
た遺伝子産物（例えば、核酸およびアミノ酸配列）の完全性、ならびにこれらの
分子に対する転写改変および翻訳改変）に関与する種々の因子を広範にいうため
に使用される。
【００８７】 ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮの発現状態は、特定の疾患の状態、進行および／または腫
瘍攻撃性に対する感受性を推定するために有用な情報を提供し得る。本発明は、
ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ発現状態を決定し、そしてＰＣ−ＬＥＣＴＩＮを発現する癌
（例えば、前立腺癌、乳癌、膀胱癌、肺癌、骨の癌、結腸癌、膵臓癌、精巣癌、
子宮頸部癌および卵巣癌）を診断するための方法およびアッセイを提供する。特
定のサンプルにおけるＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ発現状態は、当該分野で周知の多数の
手段（免疫組織化学的分析、インサイチュハイブリダイゼーション、レーザ捕捉
マイクロ精査（ｍｉｃｒｏ−ｄｅｓｓｅｃｔｅｄ）サンプルに対するＲＴ−ＰＣ
Ｒ分析、臨床サンプルおよび細胞株のウエスタンブロット分析、ならびに組織ア
レイ分析が挙げられるがこれらに限定されない）によって分析され得る。ＰＣ−
ＬＥＣＴＩＮ遺伝子および遺伝子産物の発現状態を評価するための代表的なプロ
トコルは、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｕｎｉｔｓ ２［Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎ
ｇ］，４［Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ］，１５［Ｉｍｍｕｎｏｂｌｏ
ｔｔｉｎｇ］および１８［ＰＣＲ Ａｎａｌｙｓｉｓ］，Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ
Ｍ．Ａｕｓｕｂｕｌら（編）（１９９５）に見出され得る。 １つの局面において、本発明は、細胞増殖の調節不全と関連する疾患（例えば
、過形成または癌）を有すると疑われる個体に由来する試験組織サンプル中の細
胞によって発現されるＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ遺伝子産物の状態を決定して、次いで
そのように決定された状態を、対応する正常サンプル中のＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ遺
伝子産物の状態に対して比較することによってＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ遺伝子産物を
モニタリングするための方法であって、正常サンプルと比較して試験サンプルに
おける異常なＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ遺伝子産物の存在は、この個体の細胞において
細胞増殖の調節不全の存在を指標を提供する、方法を提供する。
【００８８】 別の局面において、本発明は、個体における癌の存在の決定に有用なアッセイ
を提供する。このアッセイは、対応する正常細胞または組織における発現レベル
と比べて、試験細胞サンプルまたは組織サンプルにおけるＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ
ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現における有意な増加を検出する工程を包含する
。ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ ｍＲＮＡの存在は、例えば、組織サンプル（結腸、肺、
前立腺、膵臓、膀胱、乳房、卵巣、頸部、精巣、頭部および首、脳、胃、骨など
が挙げられるが、これらに限定されない）において評価され得る。任意のこれら
の組織におけるＰＣ−ＬＥＣＴＩＮの有意な発現の存在は、これらの癌の発生、
存在および／または重篤度、または別の組織に由来する癌の転移を示すために有
用であり得る。なぜなら、対応する正常組織は、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ ｍＲＮＡ
を発現しないか、またはこれを低レベルで発現するからである。
【００８９】 関連する実施形態において、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ発現状態は、核酸レベルでは
なくタンパク質レベルで決定され得る。例えば、このような方法またはアッセイ
は、試験組織サンプル中の細胞によって発現されるＰＣ−ＬＥＣＴＩＮタンパク
質のレベルを決定する工程、およびそのように決定されたレベルを、対応する正
常サンプルにおいて発現されるＰＣ−ＬＥＣＴＩＮのレベルに対して比較する工
程を包含する。１つの実施形態において、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮタンパク質の存在
は、例えば、免疫組織化学方法を使用して評価される。ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮタン
パク質発現を検出し得るＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ抗体または結合パートナーが、この
目的のために、当該分野で周知の種々のアッセイ形式で使用され得る。
【００９０】 他の関連する局面において、これらの分子の構造における混乱（ｐｅｒｔｕｒ
ｂａｔｉｏｎ）（例えば、挿入、欠失、置換など）を同定するために、生物学的
サンプル中のＰＣ−ＬＥＣＴＩＮヌクレオチドおよびアミノ酸配列の完全性を評
価し得る。このような実施形態は、有用である。なぜなら、ヌクレオチドおよび
アミノ酸配列における混乱は、増殖調節不全の表現型と関連する多くのタンパク
質で観察されるからである（例えば、Ｍａｒｒｏｇｉら、Ｊ．Ｃｕｔａｎ．Ｐａ
ｔｈｏｌ．２６（８）：３６９〜３７８（１９９９）を参照のこと）。この状況
において、ヌクレオチドおよびアミノ酸配列における混乱を観察するための広範
な種々のアッセイが、当該分野において周知である。例えば、ＰＣ−ＬＥＣＴＩ
Ｎ遺伝子産物の核酸配列またはアミノ酸配列のサイズおよび構造は、本明細書中
で議論されるノーザン、サザン、ウエスタン、ＰＣＲおよびＤＮＡ配列決定プロ
トコルによって観察され得る。さらに、ヌクレオチドおよびアミノ酸配列におけ
る混乱を観察するための他の方法（例えば、一本鎖高次構造多型分析）が、当該
分野で周知である（例えば、米国特許第５，３８２，５１０号および同第５，９
５２，１７０号を参照のこと）。
【００９１】 別の実施形態において、生物学的サンプル中のＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ遺伝子のメ
チル化状態を試験し得る。遺伝子の５’調節領域におけるＣｐＧ島の異常な脱メ
チル化および／または過メチル化（ｈｙｐｅｒｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）はしば
しば、不死化され形質転換された細胞において生じ、そして様々な遺伝子の改変
された発現を生じ得る。例えば、パイクラスのグルタチオンＳ−トランスフェラ
ーゼ（正常な前立腺において発現されるが、前立腺癌の９０％より多くでは発現
されないタンパク質）のプロモーターの過メチル化は、この遺伝子の転写を永久
的に止めるようであり、前立腺癌において最も頻繁に検出されるゲノム変化であ
る（Ｄｅ Ｍａｒｚｏら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５５（６）：１９８５〜
１９９２（１９９９））。さらに、この変化は、高度な前立腺上皮新形成（ＰＩ
Ｎ）の少なくとも７０％の場合に存在する（Ｂｒｏｏｋｓら、Ｃａｎｃｅｒ Ｅ
ｐｉｄｅｍｉｏｌ．Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ Ｐｒｅｖ．，１９９８，７：５３１
〜５３６）。
【００９２】 別の例において、ＬＡＧＥ−Ｉ腫瘍特異的遺伝子（これは、正常な前立腺にお
いて発現しないが、２５〜５０％の前立腺癌において発現する）の発現は、リン
パ芽球腫細胞中のデオキシアザシチジンによって引き起こされ、このことは腫瘍
発現が脱メチル化に起因することを示唆している（Ｌｅｔｈｅら、１９９８，Ｉ
ｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ７６（６）：９０３〜９０８）。この状況において、
遺伝子のメチル化状態を試験するための様々なアッセイが、当該分野で周知であ
る。例えば、サザンハイブリダイゼーションアプローチにおいて、ＣｐＧ島の全
メチル化状態を評価するために、メチル化ＣｐＧ部位を含む配列を切断し得ない
メチル化感受性制限酵素を使用し得る。
【００９３】 さらに、ＭＳＰ（メチル化特異的ＰＣＲ）は、所定の遺伝子のＣｐＧ島に存在
する全てのＣｐＧ部位のメチル化状態を迅速にプロフィールし得る。この手順は
、重亜硫酸ナトリウムによるＤＮＡの最初の改変（これは、全てのメチル化され
ていないシトシンをウラシルに変換する）、続いてメチル化されたＤＮＡ対メチ
ル化されていないＤＮＡに対して特異的なプライマーを使用する増幅を包含する
。メチル化の妨害を包含するプロトコルはまた、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃ
ｏｌｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｕｎｉｔｓ １２，Ｆｒ
ｅｄｅｒｉｃｋ Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９９５の実施例に見出され得る。
【００９４】 別の関連する実施形態において、本発明は、個体における癌の存在の決定に有
用なアッセイを提供する。このアッセイは、対応する正常細胞または組織におけ
る発現レベルに対して、試験細胞サンプルまたは組織サンプル中に発現されるＰ
Ｃ−ＬＥＣＴＩＮ選択的スプライシング改変体における有意な変化を検出する工
程を包含する。ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ選択的スプライシング改変体のモニタリング
は、有用である。なぜなら、タンパク質の選択的スプライシングの変化は、癌の
進行を引き起こす一連の事象における段階の１つとして示唆されるからである（
例えば、Ｇａｒｓｔｅｎｓら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １５（２５０：３０５９〜３
０６５（１９９７）を参照のこと）。
【００９５】 遺伝子増幅は、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮの状態を評価するさらなる方法を提供する
。遺伝子増幅は、サンプルにおいて、例えば、本明細書中に提供される配列に基
づいて、適切な標識プローブを使用して、従来のサザンブロッティング、ｍＲＮ
Ａの転写を定量するノーザンブロッティング［Ｔｈｏｍａｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：５２０１〜５２０５（１９８０）］、ド
ットブロッティング（ＤＮＡ分析）、またはインサイチュハイブリダイゼーショ
ンによって直接的に測定され得る。あるいは、特定の二重鎖（例えば、ＤＮＡ二
重鎖、ＲＮＡ二重鎖、およびＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二重鎖またはＤＮＡ−
タンパク質二重鎖を含む）を認識し得る抗体が、用いられ得る。次いで、この抗
体が、標識され得、そしてアッセイ（ここで二重鎖が表面に結合され、その結果
、この表面上での二重鎖の形成により、二重鎖に結合した抗体の存在が検出され
得る）が、行われ得る。
【００９６】 上記で議論される組織に加えて、末梢血が、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ発現を検出す
るためにＲＴ−ＰＣＲを使用して、癌細胞（前立腺癌を含むがこれに限定されな
い）の存在について従来通りにアッセイされ得る。ＲＴ−ＰＣＲにより増幅可能
なＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ ｍＲＮＡの存在は、癌の存在の指標を提供する。末梢血
中の腫瘍細胞についてのＲＴ−ＰＣＲ検出アッセイは、多数のヒト固形腫瘍の診
断および管理における使用について現在評価されている。前立腺癌の分野におい
て、これらは、ＰＳＡおよびＰＳＭを発現する細胞の検出のためのＲＴ−ＰＣＲ
アッセイを含む（Ｖｅｒｋａｉｋら、１９９７、Ｕｒｏｌ．Ｒｅｓ．２５：３７
３〜３８４：Ｇｈｏｓｓｅｉｎら，１９９５，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１３
：１１９５〜２０００；Ｈｅｓｔｏｎら，１９９５，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４１
：１６８７〜１６８８）。ＲＴ−ＰＣＲアッセイは、当該分野で周知である。
【００９７】 本発明の関連する局面は、個体における癌の発症の感受性の推定に関する。１
つの実施形態において、癌に対する感受性を推定するための方法は、組織サンプ
ル中のＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ ｍＲＮＡまたはＰＣ−ＬＥＣＴＩＮタンパク質を検
出する工程であって、その存在が、癌に対する感受性を示し、ここで存在するＰ
Ｃ−ＬＥＣＴＩＮ ｍＲＮＡ発現の程度が感受性の程度に比例する、工程を提供
する。特定の実施形態において、前立腺組織中のＰＣ−ＬＥＣＴＩＮの存在が、
試験され、ここでこのサンプル中のＰＣ−ＬＥＣＴＩＮの存在は、前立腺癌の感
受性（または前立腺腫瘍の発生もしくは存在）の指標を提供する。密接に関連す
る実施形態において、これらの分子の構造における混乱（例えば、挿入、欠失、
置換など）を同定するために、生物学的サンプルにおけるＰＣ−ＬＥＣＴＩＮヌ
クレオチドおよびアミノ酸配列の完全性を評価し得、ここでサンプル中のＰＣ−
ＬＥＣＴＩＮ遺伝子産物における１以上の混乱の存在が、癌の感受性（または前
立腺腫瘍の発生もしくは存在）の指標を提供する。
【００９８】 本発明のなお別の関連する局面は、腫瘍攻撃性を測定するための方法に関する
。１つの実施形態において、腫瘍の攻撃性を測定するための方法は、腫瘍サンプ
ル中の細胞によって発現されるＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ ｍＲＮＡまたはＰＣ−ＬＥ
ＣＴＩＮタンパク質のレベルを決定する工程、そのように決定されたレベルを、
同じ個体から採取された対応する正常組織または正常組織参照サンプル中に発現
されるＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ ｍＲＮＡまたはＰＣ−ＬＥＣＴＩＮタンパク質のレ
ベルに対して比較する工程であって、ここで正常サンプルに対する腫瘍サンプル
におけるＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ ｍＲＮＡまたはＰＣ−ＬＥＣＴＩＮタンパク質発
現の程度が、攻撃性の程度を示す、工程を包含する。特定の実施形態において、
前立腺腫瘍の攻撃性は、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮが腫瘍細胞中に発現される程度を決
定することによって評価され、ここでより高い発現レベルは、より攻撃性の腫瘍
を示す。密接に関連する実施形態において、これらの分子の構造における混乱（
例えば、挿入、欠失、置換など）を同定するために、生物学的サンプルにおける
ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮヌクレオチドおよびアミノ酸配列の完全性を評価し得、ここ
で１以上の混乱の存在は、より攻撃性の腫瘍を示す。
【００９９】 本発明のなお別の関連する局面は、個体の悪性疾患の進行を経時的に観察する
ための方法に関する。１つの実施形態において、個体における悪性疾患の進行を
経時的に観察するための方法は、腫瘍サンプル中の細胞によって発現されるＰＣ
−ＬＥＣＴＩＮ ｍＲＮＡまたはＰＣ−ＬＥＣＴＩＮタンパク質のレベルを決定
する工程、そのように決定されたレベルを、同じ個体から異なる時間に採取され
た等価な組織サンプル中に発現されるＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ ｍＲＮＡまたはＰＣ
−ＬＥＣＴＩＮタンパク質のレベルに対して比較する工程であって、ここで腫瘍
サンプルにおける経時的なＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ ｍＲＮＡまたはＰＣ−ＬＥＣＴ
ＩＮタンパク質発現の程度が、癌の進行に関する情報を提供する、工程を包含す
る。特定の実施形態において、癌の進行は、腫瘍細胞におけるＰＣ−ＬＥＣＴＩ
Ｎ発現が経時的に変化する程度を決定することによって評価され、ここでより高
い発現レベルは、癌の進行を示す。密接に関連する実施形態において、これらの
分子の構造における混乱（例えば、挿入、欠失、置換など）を同定するために、
生物学的サンプル中のＰＣ−ＬＥＣＴＩＮヌクレオチドおよびアミノ酸配列の完
全性を評価し得、ここで１以上の混乱の存在は、癌の進行を示す。
【０１００】 上記の診断アプローチは、当該分野で公知の種々の予後プロトコルおよび診断
プロトコルのいずれか１つと組み合わされ得る。例えば、本明細書中に開示され
る本発明の別の実施形態は、組織サンプルの状態を診断し、かつ予後を判定する
手段として、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ遺伝子およびＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ遺伝子産物の
発現（またはＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ遺伝子およびＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ遺伝子産物に
おける混乱）と、悪性疾患に関連する因子との間の一致を観察するための方法に
関する。この状況において、悪性疾患に関連する広範な種々の因子（例えば、そ
うでなければ悪性疾患と関連する遺伝子の発現（ＰＳＡ、ＰＳＣＡおよびＰＳＭ
発現を含む））および肉眼的細胞学的観察（例えば、Ｂｏｃｋｉｎｇら，Ａｎａ
ｌ Ｑｕａｎｔ Ｃｙｔｏｌ．６（２）：７４〜８８（１９８４）；Ｅｐｔｓｅ
ｉｎ，Ｈｕｍ Ｐａｔｈｏｌ．１９９５年２月；２６（２）２２３〜９（１９９
５）；Ｔｈｏｒｓｏｎら，Ｍｏｄ Ｐａｔｈｏｌ．１９９８；１１（６）：５４
３〜５１；Ｂａｉｓｄｅｎら，Ａｍ．Ｊ．Ｓｕｒｇ Ｐａｔｈｏｌ．２３（８）
：９１８〜２４（１９９９）を参照のこと）が、利用され得る。ＰＣ−ＬＥＣＴ
ＩＮ遺伝子およびＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ遺伝子産物の発現（またはＰＣ−ＬＥＣＴ
ＩＮ遺伝子およびＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ遺伝子産物における混乱）と、悪性疾患に
関連するさらなる因子との間の一致を観察するための方法が、有用である。なぜ
なら、例えば、一致する一連のまたは一群の特定の因子の存在は、組織サンプル
の状態を診断し、かつ予後を判定するために重要な情報を提供するからである。
【０１０１】 代表的な実施形態において、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ遺伝子およびＰＣ−ＬＥＣＴ
ＩＮ遺伝子産物の発現（またはＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ遺伝子およびＰＣ−ＬＥＣＴ
ＩＮ遺伝子産物における混乱）と、悪性疾患に関連する因子との間の一致を観察
するための方法は、組織サンプルにおいて、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ ｍＲＮＡまた
はタンパク質の過剰発現を検出する工程、組織サンプルにおいてＰＳＡ ｍＲＮ
Ａまたはタンパク質の過剰発現を検出する工程、ならびにＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ
ｍＲＮＡまたはタンパク質の過剰発現とＰＳＡ ｍＲＮＡまたはタンパク質の過
剰発現との一致を観察する工程を包含する。特定の実施形態において、前立腺組
織におけるＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ ｍＲＮＡおよびＰＳＡ ｍＲＮＡの発現が、試
験される。好ましい実施形態において、サンプルにおけるＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ
ｍＲＮＡ過剰発現とＰＳＡ ｍＲＮＡ過剰発現との一致は、前立腺癌、前立腺癌
感受性、または前立腺腫瘍の発生もしくは存在の指標を提供する。
【０１０２】 ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現を検出および定量する
ための方法が、本明細書中に開示され、そして標準的な核酸およびタンパク質の
検出技術および定量技術の使用が、当該分野において周知である。ＰＣ−ＬＥＣ
ＴＩＮ ｍＲＮＡの検出および定量のための標準的な方法としては、標識された
ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮリボプローブを使用するインサイチュハイブリダイゼーショ
ン、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮポリヌクレオチドプローブを使用するノーザンブロット
および関連する技術、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮに特異的なプライマーを使用するＲＴ
−ＰＣＲ分析、ならびに他の増幅型検出方法（例えば、分岐ＤＮＡ、ＳＩＳＢＡ
、ＴＭＡなど）が挙げられる。特定の実施形態において、半定量的ＲＴ−ＰＣＲ
が、以下の実施例に記載されるように、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ ｍＲＮＡ発現を検
出および定量するために使用され得る。ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮを増幅し得る任意の
数のプライマー（本明細書中に詳細に記載される種々のプライマーセットを含む
がこれらに限定されない）が、この目的のために使用され得る。タンパク質の検
出および定量のための標準的な方法が、この目的のために使用され得る。特定の
実施形態において、野生型ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮタンパク質と特異的に反応するポ
リクローナル抗体またはモノクローナル抗体が、生検組織の免疫組織化学的アッ
セイにおいて使用され得る。
【０１０３】 （ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮと相互作用する分子の同定） 本明細書中に開示されるＰＣ−ＬＥＣＴＩＮタンパク質配列により、当業者は
、種々の当該分野で受け入れられるプロトコルのいずれか１つを通じて、この配
列と相互作用する分子を同定し得る。例えば、種々のいわゆる相互作用捕捉系（
「ツーハイブリッドアッセイ」ともいわれる）のうちの１つを利用し得る。この
ような系において、相互作用する分子は、転写因子およびレポーター遺伝子の直
接的な発現を再構成し、次いで、その発現をアッセイする。代表的な系は、真核
生物転写アクチベーターの再構成を通じて、インビボでタンパク質間相互作用を
同定し、そして例えば、米国特許第５，９５５，２８０号、同第５，９２５，５
２３号、同第５，８４６，７２２号および同第６，００４，７４６号に開示され
ている。
【０１０４】 あるいは、ペプチドライブラリーをスクリーニングすることによって、ＰＣ−
ＬＥＣＴＩＮタンパク質配列と相互作用する分子を同定し得る。このような方法
において、選択されたレセプター分子（例えば、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ）に結合す
るペプチドが、アミノ酸の無作為または制御された収集物をコードするライブラ
リーをスクリーニングすることによって同定される。このライブラリーによって
コードされるペプチドは、バクテリオファージコートタンパク質の融合タンパク
質として発現され、次いで、バクテリオファージ粒子が、目的のレセプターに対
してスクリーニングされる。それによって、広範な種々の使用（例えば、治療用
試薬または診断用試薬）を有するペプチドが、予期されるリガンド分子またはレ
セプター分子の構造に関する任意の予備情報を必要することなく同定され得る。
ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮタンパク質配列と相互作用する分子を同定するために使用さ
れ得る代表的なペプチドライブラリーおよびスクリーニング方法が、例えば、米
国特許第５，７２３，２８６号および同第５，７７３，７３１号に開示されてい
る。
【０１０５】 あるいは、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮを発現する細胞株が、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮによ
って媒介されるタンパク質間相互作用を同定するために使用され得る。この可能
性は、他の研究者によって示されるような免疫沈降技術（Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｂ
Ｊら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９９９，２
６１：６４６〜５１）を使用して試験され得る。代表的には、ＰＣ−ＬＥＣＴＩ
Ｎタンパク質は、抗ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ抗体を使用して、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮを
発現している前立腺癌細胞株から免疫沈降され得る。あるいは、Ｈｉｓタグに対
する抗体が、（例えば、上記のベクターを使用して）ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮを発現
するように操作された細胞株において使用され得る。免疫沈降した複合体は、ウ
エスタンブロッティング、タンパク質の35Ｓ−メチオニン標識、タンパク質微量
配列決定、銀染色および２次元ゲル電気泳動のような手順によってタンパク質の
結合に対して試験され得る。
【０１０６】 このようなスクリーニングアッセイの関連する実施形態としては、ＰＣ−ＬＥ
ＣＴＩＮと相互作用する低分子を同定するための方法が挙げられる。代表的な方
法は、例えば、米国特許第５，９２８，８６８号に議論されており、そして少な
くとも１つのリガンドが低分子であるハイブリッドリガンドを形成するための方
法が挙げられる。例示的な実施形態において、このハイブリッドリガンドは、細
胞中に導入され、次いでこの細胞は、第１および第２の発現ベクターを含む。各
発現ベクターは、転写モジュールについてのコード配列に連結された標的タンパ
ク質をコードするハイブリッドタンパク質を発現するためのＤＮＡを含む。各細
胞は、レポーター遺伝子をさらに含み、その発現は、第１および第２のハイブリ
ッドタンパク質の互いに対する近接性の条件下に置かれており、ハイブリッドリ
ガンドが、両方のハイブリッドタンパク質上の標的部位に結合する場合のみに、
事象が生じる。レポーター遺伝子を発現するそれらの細胞が選択され、そして未
知の低分子または未知のハイブリッドタンパク質が、同定される。
【０１０７】 本発明の代表的な実施形態は、図１Ａ〜１Ｄ（配列番号２）に示されるＰＣ−
ＬＥＣＴＩＮアミノ酸配列と相互作用する分子についてスクリーニングする方法
からなる。この方法は、分子集団とＰＣ−ＬＥＣＴＩＮアミノ酸配列とを接触さ
せる工程、相互作用を促進する条件下で、分子集団とＰＣ−ＬＥＣＴＩＮアミノ
酸配列とを相互作用させる工程、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮアミノ酸配列と相互作用す
る分子の存在を決定する工程、次いでＰＣ−ＬＥＣＴＩＮアミノ酸配列と相互作
用する分子からＰＣ−ＬＥＣＴＩＮアミノ酸配列と相互作用しない分子を分離す
る工程を包含する。特定の実施形態において、この方法はさらに、ＰＣ−ＬＥＣ
ＴＩＮアミノ酸配列と相互作用する分子を精製する工程を包含する。好ましい実
施形態において、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮアミノ酸配列は、ペプチドのライブラリー
と接触される。
【０１０８】 （治療方法および組成物） ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮの前立腺腫瘍関連タンパク質としての同定は、このような
癌の処置に対する多くの治療アプローチを開放する。上記で議論されるように、
ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮは、糖部分に結合し、そして侵撃、接着または転移に関与し
得る。さらに、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮな、治療のために標的とされ得る細胞表面上
にエピトープを提示する。
【０１０９】 ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮの発現プロフィールは、ＭＡＧＥ、ＰＳＡ、およびＰＭＳ
Ａを暗示し、ＭＡＧＥ、ＰＳＡ、およびＰＭＳＡは、黒色腫および他の癌にてア
ップレギュレートされる、組織特異的遺伝子である（Ｖａｎ ｄｅ Ｅｙｎｄｅ
およびＢｏｏｎ、Ｉｎｔ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｌａｂ Ｒｅｓ．２７：８１〜８６、
１９９７）。癌におけるその組織特異的発現および高レベル発現に起因して、こ
れらの分子は、癌ワクチンについての標的として現在調査されている（Ｄｕｒｒ
ａｎｔ、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇｓ ８：７２７〜７３３、１９９７；
Ｒｅｙｎｏｌｄｓら、Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ７２：９７２〜９７６、１９
９７）。ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮの発現パターンは、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮが同様に、
前立腺癌および他の癌に対する癌ワクチンアプローチのための潜在的標的である
という証拠を提供する。なぜなら、その発現が最も正常な組織に限定されるから
である。潜在的レセプターとしてのその構造的特徴もまた、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ
が、低分子標的であり得ること、ならびに抗体に基づく治療ストラテジーのため
の標的であり得ることの証拠を提供する。この治療ストラテジーは、分子のカル
シウム輸送機能を阻害するかまたはＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ分子自体を標的化するよ
うに設計され得る。
【０１１０】 従って、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮの細胞外部分を標的とする治療アプローチまたは
ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮタンパク質の活性を阻害することを目指す治療アプローチが
、前立腺癌、精巣癌、およびＰＣ−ＬＥＣＴＩＮを発現する他の癌に罹患する患
者に有用であることが予期される。ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮタンパク質の活性を阻害
することを目指す治療アプローチは、一般的に、２つの種類に分類される。１つ
の種類は、その結合パートナーまたは他のタンパク質との、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ
タンパク質の結合または会合を阻害するための、種々の方法を包含する。別の種
類は、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ遺伝子の転写またはＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ ｍＲＮＡの
翻訳を阻害するための、種々の方法を包含する。
【０１１１】 （抗体に基づく治療のための細胞表面標的としてのＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ） ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮの構造的特徴は、この分子がおそらく細胞表面抗原である
ことを示し、抗体に基づく治療ストラテジーのための魅力的な標的を提供する。
ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮは最も正常な細胞では発現されず、癌細胞にて発現されるの
で、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ免疫反応性組成物の全身投与は、非標的器官および非標
的組織へのその免疫治療分子の結合により引き起こされる、毒性効果、非特異的
効果および／または非標的効果のない、良好な感受性を示すことが予期される。
ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮの細胞外ドメインと特異的に反応性である抗体は、毒素また
は治療薬剤との結合体、あるいは細胞の増殖または機能を阻害し得る裸の抗体の
いずれかとして、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮを発現する癌を全身的に処置するために有
用であり得る。
【０１１２】 ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ抗体は、癌細胞上のＰＣ−ＬＥＣＴＩＮにその抗体が結合
しかつ細胞および腫瘍の破壊を媒介し、かつ／または細胞もしくは腫瘍の増殖を
阻害するように、患者に導入され得る。このような抗体が治療効果を発揮する機
構は、補体媒介性細胞溶解、抗体依存性細胞性細胞傷害、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮの
生理学的機能を調節すること、リガンド結合またはシグナル伝達経路を阻害する
こと、腫瘍細胞分化を調節すること、腫瘍脈管形成因子プロフィールを変化させ
ること、および／またはアポトーシスを誘導することを包含し得る。ＰＣ−ＬＥ
ＣＴＩＮ抗体は、毒性薬剤または治療薬剤に結合され得、そしてＰＣ−ＬＥＣＴ
ＩＮを保有する腫瘍細胞に直接その毒性薬剤または治療薬剤を送達するために使
用され得る。毒性薬剤の例としては、カルケマイシン（ｃａｌｃｈｅｍｉｃｉｎ
）、マイタンシノイド（ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｉｄ）、放射性同位体（例えば、 131 Ｉ、イットリウム、およびビスマス）が挙げられるが、これらに限定されな
い。
【０１１３】 抗ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ抗体を使用する癌免疫治療法は、以下を含むがこれらに
限定されない、他の型の癌の処置にて首尾良く使用されている種々のアプローチ
から生じる技術に従い得る：結腸癌（Ａｒｌｅｎら、１９９８、Ｃｒｉｔ．Ｒｅ
ｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８：１３３〜１３８）、多発性骨髄腫（Ｏｚａｋｉら、
１９９７、Ｂｌｏｏｄ ９０：３１７９〜３１８６；Ｔｓｕｎｅｎａｒｉら、１
９９７、Ｂｌｏｏｄ ９０：２４３７〜２４４４）、胃癌（Ｋａｓｐｒｚｙｋら
、１９９２、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５２：２７７１〜２７７６）、Ｂ細胞リン
パ腫（Ｆｕｎａｋｏｓｈｉら、１９９６、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．Ｅｍｐｈ
ａｓｉｓ Ｔｕｍｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９：９０３〜１０１）、白血病（Ｚ
ｈｏｎｇら、１９９６、Ｌｅｕｋ．Ｒｅｓ．２０：５８１〜５８９）、結腸直腸
癌（Ｍｏｕｎら、１９９４、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５４：６１６０〜６１６６
；Ｖｅｌｄｅｒｓら、１９９５、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５５：４３９８〜４４
０３）、および乳癌（Ｓｈｅｐａｒｄら、１９９１、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ．１１：１１７〜１２７）。いくつかの治療アプローチは、毒素への裸の抗
体の結合（例えば、抗ＣＤ２０抗体への131Ｉの結合（例えば、ＲｉｔｕｘａｎT M 、ＩＤＥＣ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｃｏｒｐ．）を含むが、一方
他のアプローチは、抗体と他の治療薬剤との（例えば、ＨｅｒｃｅｐｔｉｎTM（
トラスツズマブ（ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）とパクリタキセル（Ｇｅｎｅｎｔｅ
ｃｈ，Ｉｎｃ．）との）同時投与を含む。前立腺癌の処置のために、例えば、Ｐ
Ｃ−ＬＥＣＴＩＮ抗体が、照射、化学療法またはホルモン切除と組み合わせて、
投与され得る。
【０１１４】 ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ抗体治療は癌のすべての病期について有用であり得るが、
抗体治療は、進行性または転移性の癌にて特に適切であり得る。本発明の抗体療
法での処置は、以前に１つ以上の化学療法を受けている患者に示され得、一方、
化学療法レジメンまたは照射レジメンと本発明の抗体療法を組み合わせることが
、化学療法処置を受けていない患者に好ましくあり得る。さらに、抗体療法は、
減少した投薬量の同時化学療法の使用を、特に、非常に十分にはその化学療法薬
剤の毒性を許容しない患者にとって、可能にし得る。 好ましくは、腫瘍組織の免疫組織化学的評価、定量的ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ画像
化、またはＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ発現の存在および程度を確かに示し得る他の技術
を使用して、何人かの癌患者がＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ発現の存在およびレベルにつ
いて評価されることは、好ましくあり得る。腫瘍生検または外科的生検の免疫組
織化学分析が、この目的に好ましくあり得る。腫瘍組織の免疫組織化学的分析の
ための方法が、当該分野で周知である。
【０１１５】 前立腺癌および他の癌を処置する際に有用な抗ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮモノクロー
ナル抗体としては、その腫瘍に対する強力な免疫応答を示し得る抗体、および直
接細胞傷害性であり得る抗体が挙げられる。これに関して、抗ＰＣ−ＬＥＣＴＩ
Ｎモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、補体媒介性細胞傷害または抗体依存性細胞
傷害（ＡＤＣＣ）のいずれかの機構によって、腫瘍細胞溶解を惹起し得、これら
の機構の両方が、エフェクター細胞Ｆｃレセプター部位または補体タンパク質と
の相互作用のために、その免疫グロブリン分子のインタクトなＦｃ部分を必要と
する。さらに、腫瘍増殖に対する直接の生物学的効果を発揮する抗ＰＣ−ＬＥＣ
ＴＩＮ ｍＡｂが、本発明の実施にて有用である。このような直接細胞傷害性の
モノクローナル抗体が作用し得る可能な機構としては、細胞増殖の阻害、細胞分
化の調節、腫瘍脈管形成因子プロフィールの調節、およびアポトーシスの誘導が
、挙げられる。特定の抗ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ ｍＡｂが抗腫瘍効果を発揮する機
構は、当該分野で一般的に知られているように、ＡＤＣＣ、ＡＳＭＣＣ、補体媒
介性細胞溶解などを決定するように設計されたかなり多数のインビトロアッセイ
を使用して、評価され得る。
【０１１６】 マウスまたは他の非ヒトのモノクローナル抗体の使用、あるいはヒト／マウス
キメラ ｍＡｂ抗体の使用が、何人かの患者で、中程度から強力な免疫応答を誘
導し得る。いくつかの場合において、これは、循環からの抗体のクリアランスお
よび減少した効力をもたらす。最も深刻な場合において、このような免疫応答は
、潜在的に腎不全を引き起こし得る、免疫複合体の広範な形成をもたらし得る。
従って、本発明の治療法の実施にて使用される好ましいモノクローナル抗体は、
高い親和性で標的ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ抗原に特異的に結合するが、患者において
低い抗原性を示すかまたは全く抗原性を示さない、完全にヒトであるかまたはヒ
ト化されているかのいずれかである抗体である。
【０１１７】 本発明の治療法は、単一の抗ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ ｍＡｂ抗体の投与、ならび
に異なるｍＡｂ抗体の組み合わせまたはカクテルの投与を意図する。このような
ｍＡｂカクテルは、それらが、異なるエピトープを標的とするｍＡｂを含むか、
異なるエフェクター機構を使用するか、または免疫エフェクター機能性に依存す
るｍＡｂと直接細胞傷害性ｍＡｂを組み合わせるのと同じ程度だけ、特定の利点
を有し得る。組み合わせたこのようなｍＡｂは、相乗的治療効果を示し得る。さ
らに、抗ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ ｍＡｂの投与は、種々の化学療法薬剤、アンドロ
ゲン遮断薬、および免疫モジュレーター（例えば、ＩＬ−２、ＧＭ−ＣＳＦ）を
含むがこれらに限定されない、他の治療薬剤と組合され得る。抗ＰＣ−ＬＥＣＴ
ＩＮ ｍＡｂは、その「裸」の形態または非結合形態で投与され得るし、または
それらに結合した治療薬剤を有し得る。
【０１１８】 抗ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ抗体処方物は、腫瘍部位にその抗体を送達し得る任意の
経路を介して投与され得る。投与の潜在的に有効な経路としては、静脈内経路、
腹腔内経路、筋肉内経路、腫瘍内経路、皮内経路などが挙げられるが、これらに
限定されない。処置は一般的に、受容可能な投与経路（例えば、静脈注射（ＩＶ
））を介する、代表的には約０．１〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の用量での、
抗ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ抗体調製物の反復投与を包含する。１０〜５００ｍｇ ｍ
Ａｂ／週の範囲の用量が、効果的であり得かつ十分に許容され得る。
【０１１９】 転移性乳癌の処置においてＨｅｒｃｅｐｔｉｎ ｍＡｂを用いる臨床実験に基
づいて、初回負荷量約４ｍｇ／ｋｇ患者の体重のＩＶに続いての、毎週の用量約
２ｍｇ／ｋｇの抗ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ ｍＡｂ調製物のＩＶが、受容可能な投薬
レジメンを示し得る。好ましくは、この初回負荷量が、９０分以上注入として投
与される。周期的維持用量は、３０分以上の注入として投与され得るが、ただし
、その初回量が十分に許容された場合に限る。しかし、当業者が理解するように
、種々の因子が、特定の場合における初回量レジメンに影響する。このような因
子としては、例えば、使用される抗体（Ａｂ）またはモノクローナル抗体（ｍＡ
ｂ）の結合親和性および半減期、患者におけるＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ発現の程度、
循環する落ちた（ｓｈｅｄ）ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ抗原の程度、所望される安定状
態の抗体濃度レベル、処置の頻度、ならびに本発明の処置方法と組み合わせて使
用される化学療法薬剤の影響が、挙げられ得る。
【０１２０】 必要に応じて、患者は、最も有効な投薬レジメンおよび関連因子の決定を補助
するために、血清中の循環する落ちたＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ抗原のレベルについて
評価されるべきである。このような評価はまた、治療を通じモニターする目的の
ために使用され得、そして他のパラメーター（例えば、前立腺癌治療における血
清ＰＳＡレベル）を評価することと組み合わせて、治療の成功を判断するために
有用であり得る。
【０１２１】 （ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮタンパク質機能の阻害） 本発明は、その結合パートナーまたはリガンドへのＰＣ−ＬＥＣＴＩＮの結合
あるいは他のタンパク質とのＰＣ−ＬＥＣＴＩＮの会合を阻害するための、種々
の方法および組成物、ならびにＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ機能を阻害するための方法を
包含する。
【０１２２】 （細胞内抗体を用いるＰＣ−ＬＥＣＴＩＮの阻害） １つのアプローチにおいて、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮに特異的に結合する単鎖抗体
をコードする組換えベクターが、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮを発現する細胞中へと遺伝
子移入技術を介して導入され得、その遺伝子移入技術において、そのコードされ
る単鎖抗ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ抗体が細胞内発現され、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮタンパ
ク質に結合し、そしてそれによりＰＣ−ＬＥＣＴＩＮタンパク質の機能を阻害す
る。このような細胞内単鎖抗体を操作するための方法は、周知である。このよう
な細胞内抗体（「内部抗体（ｉｎｔｒａｂｏｄｙ）」としても公知）は、その細
胞内の特定の区画に特異的に標的化され得、その処置の阻害活性が焦点を合わせ
る制御を提供する。この技術は、当該分野で首尾良く適用されている（概説とし
て、ＲｉｃｈａｒｄｓｏｎおよびＭａｒａｓｃｏ、１９９５、ＴＩＢＴＥＣＨ、
第１３巻を参照のこと）。内部抗体は、他に豊富な細胞表面レセプターの発現を
事実上除去することが示されている。例えば、Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎら、１９９
５、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：３１３７〜３１４
１；Ｂｅｅｒｌｉら、１９９４、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８９：２３９３１
〜２３９３６；Ｄｅｓｈａｎｅら、１９９４、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１：３３２
〜３３７を参照のこと。
【０１２３】 単鎖抗体は、可撓性のリンカーポリペプチドにより結合された、重鎖および軽
鎖の可変ドメインを含み、そして単一のポリペプチドとして発現される。必要に
応じて、単鎖抗体は、その軽鎖定常領域に結合された単鎖可変領域フラグメント
として発現され得る。周知の細胞内輸送シグナルが、発現される内部抗体を所望
の細胞内区画に正確に標的化するために、このような単鎖抗体をコードする組換
えポリヌクレオチドベクター中に操作され得る。例えば、小胞体（ＥＲ）に標的
化された内部抗体は、リーダーペプチドを組み込むように、そして必要に応じて
Ｃ末端ＥＲ保持シグナル（例えば、ＫＤＥＬアミノ酸モチーフ）を組み込むよう
に、操作され得る。核において活性を発揮することが意図される内部抗体は、核
局在化シグナルを含むように操作され得る。脂質部分が、原形質膜の細胞質ゾル
側に内部抗体をつなぐために、その内部抗体に結合され得る。内部抗体はまた、
細胞質ゾルにおいて機能を発揮するように標的化され得る。例えば、細胞質内部
抗体が、細胞質ゾル内に因子を隔離し、それによりそれらの因子がその天然での
細胞での終着点に輸送されることを防ぐために、使用され得る。
【０１２４】 １つの実施形態では、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ内部抗体は、特定のＰＣ−ＬＥＣＴ
ＩＮドメインに特異的に結合するように設計される。例えば、ＰＣ−ＬＥＣＴＩ
Ｎタンパク質に特異的に結合する細胞質ゾル内部抗体は、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮが
核へアクセスすることを防ぎ、それによりＰＣ−ＬＥＣＴＩＮが核内で任意の生
物学的活性を及ぼすのを防ぐ（例えば、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮが他の因子と転写複
合体を形成するのを防ぐ）ために使用され得る。
【０１２５】 このような内部抗体の発現を特定の腫瘍細胞に特異的に向けるために、その内
部抗体の転写が、適切な腫瘍特異的プロモーターおよび／またはプロモーターの
調節制御下に配置され得る。前立腺に特異的に内部抗体発現を標的化するために
、例えば、ＰＳＡプロモーターおよび／またはプロモーター／エンハンサーが、
利用され得る（例えば、米国特許第５，９１９，６５２号を参照のこと）。
【０１２６】 （組換えタンパク質を用いるＰＣ−ＬＥＣＴＩＮの阻害） 別のアプローチにおいて、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮに結合し得、それによりＰＣ−
ＬＥＣＴＩＮがその結合パートナーに接近／結合することまたは他のタンパク質
と会合することを妨げ得る、組換え分子が、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ機能を阻害する
ために使用される。このような組換え分子は、例えば、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ特異
的抗体分子の反応性部分を含み得る。特定の実施形態において、ＰＣ−ＬＥＣＴ
ＩＮ結合パートナーのＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ結合ドメインが、ヒトＩｇＧ（例えば
、ヒトＩｇＧ１）のＦｃ部分に連結された２つのＰＣ−ＬＥＣＴＩＮリガンド結
合ドメインを含む、二量体融合タンパク質へと操作され得る。このようなＩｇＧ
部分は、例えば、ＧH２ドメインおよびＧH３ドメインならびにヒンジ領域を含み
得るが、ＧH１ドメインは含まないかもしれない。このような二量体融合タンパ
ク質は、可溶性形態で、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮの発現と関係する癌（前立腺癌、乳
癌、膀胱癌、肺癌、骨癌、大腸癌、膵臓癌、精巣癌、子宮頸部癌および卵巣癌が
挙げられるがこれらに限定されない）に罹患する患者に投与され得、ここでこの
二量体タンパク質はＰＣ−ＬＥＣＴＩＮに特異的に結合し、それにより結合パー
トナーとのＰＣ−ＬＥＣＴＩＮの相互作用をブロックする。このような二量体融
合タンパク質は、公知の抗体連結技術を使用してさらに組み合わされて、多量体
タンパク質にされ得る。
【０１２７】 （ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮの転写または翻訳の阻害） 別の種類の治療アプローチにおいて、本発明は、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ遺伝子の
転写を阻害するための、種々の方法および組成物を提供する。同様に、本発明は
また、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ ｍＲＮＡからタンパク質への翻訳を阻害するための
、方法および組成物も提供する。
【０１２８】 １つのアプローチにおいて、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ遺伝子の転写を阻害する方法
は、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ遺伝子をＰＣ−ＬＥＣＴＩＮアンチセンスポリヌクレオ
チドと接触させる工程を包含する。別のアプローチにおいて、ＰＣ−ＬＥＣＴＩ
Ｎ ｍＲＮＡの翻訳を阻害する方法は、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ ｍＲＮＡをアンチ
センスポリヌクレオチドと接触させる工程を包含する。別のアプローチにおいて
、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ特異的リボザイムが、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮメッセージを切
断し、それにより翻訳を阻害するために使用され得る。このようなアンチセンス
に基づく方法およびリボザイムに基づく方法はまた、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ遺伝子
の調節領域（例えば、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮプロモーターエレメントおよび／また
はエンハンサーエレメント）に関し得る。同様に、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ遺伝子転
写因子を阻害し得るタンパク質が、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ ｍＲＮＡ転写を阻害す
るために使用され得る。上述の方法において有用な種々のポリヌクレオチドおよ
び組成物が、上記に記載されている。転写および翻訳を阻害するためのアンチセ
ンス分子およびリボザイム分子の使用は、当該分野で周知である。
【０１２９】 ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ転写活性化を妨害することを介してＰＣ−ＬＥＣＴＩＮの
転写を阻害する他の因子もまた、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮを発現する癌の処置に有用
であり得る。同様に、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮのプロセシングを妨害し得る因子は、
ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮを発現する癌の処置に有用であり得る。このような因子を利
用する癌の処置方法もまた、本発明の範囲内にある。
【０１３０】 （治療ストラテジーについての一般的な考慮） 遺伝子移入および遺伝子治療の技術は、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮを合成している腫
瘍細胞に、治療用ポリヌクレオチド分子（すなわち、アンチセンス、リボザイム
、内部抗体をコードするポリヌクレオチドおよび他のＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ阻害分
子）を送達するために使用され得る。多数の遺伝子治療アプローチが、当該分野
で公知である。ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮアンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム
、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ転写を妨害し得る因子などをコードする組換えベクターは
、このような遺伝子治療アプローチを使用して標的腫瘍細胞に送達され得る。
【０１３１】 上記の治療アプローチは、広範な種々の化学療法または放射線療法のレジメン
のいずれか１つと組み合わされ得る。これらの治療アプローチはまた、特に、化
学療法剤の毒性に十分に寛容ではない患者において、化学療法の投薬量の減少、
および／またはより頻度の少ない投与の使用を可能にし得る。
【０１３２】 特定の組成物（例えば、アンチセンス、リボザイム、内部抗体）、またはこの
ような組成物の組合せの抗腫瘍活性は、種々のインビトロおよびインビボアッセ
イ系を使用して評価され得る。治療の可能性を評価するためのインビトロアッセ
イとしては、細胞増殖アッセイ、軟質ゲルアッセイおよび腫瘍促進活性を示す他
のアッセイ、治療用組成物が結合パートナーへのＰＣ−ＬＥＣＴＩＮの結合を阻
害する程度を決定し得る結合アッセイなどが挙げられる。
【０１３３】 インビボでは、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ治療用組成物の効果は、適切な動物モデル
において評価され得る。例えば、外因性前立腺癌モデル（ここで、ヒト前立腺癌
外植片または継代された異種移植組織が、免疫無防備動物（例えば、ヌードマウ
スまたはＳＣＩＤマウス）に導入される）は、前立腺癌に関して適切であり、そ
して記載されている（Ｋｌｅｉｎら、１９９７，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎ
ｅ ３：４０２〜４０８）。例えば、ＰＣＴ特許出願ＷＯ９８／１６６２８，Ｓ
ａｗｙｅｒｓら（１９９８年４月２３日公開）は、原発性腫瘍の発生、微小転移
、および後期段階疾患の特徴である骨芽細胞性転移の形成を要約し得る、ヒト前
立腺癌の種々の異種移植モデルを記載している。効力は、腫瘍形成、腫瘍後退ま
たは転移などの阻害を測定するアッセイを使用して推定され得る。以下の実施例
もまた参照のこと。
【０１３４】 アポトーシスの促進を和らげる（ｑｕａｌｉｆｙ）インビボアッセイもまた、
潜在的な治療用組成物の評価において有用であり得る。１つの実施形態において
、治療用組成物で処置された保有マウス由来の異種移植片は、アポトーシス病巣
の存在について試験され得、そして未処置のコントロール異種移殖片保有マウス
に比較され得る。アポトーシス病巣が処置マウスの腫瘍に見出される程度は、こ
の組成物の治療効力の指標を提供する。
【０１３５】 前述の方法の実施において使用される治療用組成物は、所望の送達方法に適切
なキャリアを含む薬学的組成物中に処方され得る。適切なキャリアとしては、治
療用組成物と組み合わされる場合に、治療用組成物の抗腫瘍機能を保持し、かつ
患者の免疫系と非反応性である、任意の物質が挙げられる。例としては、任意の
多数の標準的な薬学的キャリア（例えば、滅菌リン酸緩衝化生理食塩水溶液、静
菌水など）が挙げられるがこれらに限定されない（一般には、Ｒｅｍｉｎｇｔｏ
ｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（第１６版），Ａ．
Ｏｓａｌ．編，１９８０を参照のこと）。
【０１３６】 治療用処方物は、可溶化され得、そして腫瘍部位に治療用組成物を送達させ得
る任意の経路を通じて投与され得る。潜在的に効果的な投与経路としては、静脈
内、非経口、腹腔内、筋肉内、腫瘍内、皮内、器官内、眼内などが挙げられるが
これらに限定されない。静脈内注射に好ましい処方物は、保存された静菌水、滅
菌非保存水の溶液における治療用組成物を含み、そして／または注射用０．９％
滅菌塩化ナトリウム（ＵＳＰ）を含むポリビニルクロリドまたはポリエチレンバ
ッグに希釈される。治療用タンパク質調製物は、凍結乾燥され得、そして滅菌粉
末として、好ましくは減圧下で貯蔵され得、次いで注射する前に、例えば、ベン
ジルアルコール保存剤を含む静菌水中に、または滅菌水中に再構成され得る。
【０１３７】 前述の方法を使用する癌の処置についての投薬量および投与プロトコルは、方
法および標的の癌とともに変化し、そして一般に、当該分野で理解される多数の
他の因子に依存する。
【０１３８】 （癌ワクチン） 本発明はさらに、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮタンパク質またはそのフラグメントを含
む癌ワクチン、およびＤＮＡベースのワクチンを提供する。ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ
の腫瘍により制限される発現を考慮すると、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ癌ワクチンは、
非標的組織に対して非特異的効果を生成することなく、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮを発
現している癌の特異的な予防および／または処置に効果的であることが予期され
る。抗癌療法での使用について、液性免疫および細胞媒介性免疫を生成するワク
チンにおける腫瘍抗原の使用は、当該分野で周知であり、そしてヒトＰＳＭＡお
よびげっ歯類ＰＡＰ免疫原を使用して、前立腺癌に使用されている（Ｈｏｄｇｅ
ら、１９９５，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ６３：２３１〜２３７；Ｆｏｎｇら
、１９９７、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：３１１３〜３１１７）。このような
方法は、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮタンパク質もしくはそのフラグメント、またはＰＣ
−ＬＥＣＴＩＮをコードする核酸分子、およびＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ免疫原を発現
し、かつ適切に提示し得る組換えベクターを用いることによって容易に実施され
得る。
【０１３９】 例えば、ウイルス遺伝子送達系は、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮをコードする核酸分子
を送達するために用いられ得る。本発明のこの局面の実施において使用され得る
種々のウイルス遺伝子送達系は、以下を包含するが、これらに限定されない：ワ
クシニアウイルス、鶏痘ウイルス、カナリア痘ウイルス、アデノウイルス、イン
フルエンザウイルス、ポリオウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、
およびシンドビスウイルス（Ｒｅｓｔｉｆｏ、１９９６、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．
Ｉｍｍｕｎｏｌ．８：６５８−６６３）。非ウイルス送達系もまた、抗腫瘍応答
を誘導するために患者に導入される（例えば筋内で）、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮタン
パク質またはそのフラグメントをコードする裸のＤＮＡを用いることにより用い
られ得る。１つの実施形態では、全長ヒトＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ ｃＤＮＡが用い
られ得る。
【０１４０】 １つの実施形態では、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ癌ワクチンは、図１Ａ〜Ｄ（ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：２）に示されるＰＣ−ＬＥＣＴＩＮアミノ酸配列内の免疫原性ペ
プチドの同一性に基づく。以下の実施例でさらに議論するように、ＰＣ−ＬＥＣ
ＴＩＮの特定の部分は、Ｔ細胞またはＢ細胞の応答を増加させることが示されて
いる。ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮの細胞外ドメイン（図１Ａ〜Ｄ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ
：２）のアミノ酸２２〜２１３）は、モノクローナル抗体の産生のためのマウス
における免疫応答を生じさせるために使用され；そしてこのドメイン内のペプチ
ド（ＧＬＷＲＮＧＤＧＱＴＳＧＡＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５））、（ＧＧＰ
ＹＬＹＱＷＮＤＤＲＣＮＭ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６））、（ＥＡＲＬＡＣＥ
ＳＥＧＧＶＬＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７））は、ポリクローナル抗体の産生
のために、ウサギにおける免疫応答を生じさせるために使用されてきた。従って
、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮのこれらの特定の部分およびこれらの部分をコードするポ
リヌクレオチドは、癌ワクチンの生成のために選択され得る。
【０１４１】 別の実施形態では、特定の細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）エピトープをコー
ドするＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ核酸分子が用いられ得る。ＣＴＬエピトープは、特定
化されたＨＬＡ対立遺伝子に最適に結合し得る、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮタンパク質
内のペプチドを同定するための特定のアルゴリズム（例えば、Ｅｐｉｍｅｒ、Ｂ
ｒｏｗｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）を用いて決定され得る。１つの適切なアルゴ
リズムは、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ａｎ
ａｌｙｓｉｓ Ｓｅｃｔｉｏｎ（ＢＩＭＡＳ）ウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｂ
ｉｍａｓ．ｄｃｒｔ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）において利用可能であるＨＬＡ Ｐｅ
ｐｔｉｄｅ Ｍｏｔｉｆ Ｓｅａｒｃｈアルゴリズムである。このアルゴリズム
は、ＨＬＡクラスＩ分子そして具体的にはＨＬＡ−Ａ２の溝における特定のペプ
チド配列の結合に基づく（Ｆｌａｋら、１９９１、Ｎａｔｕｒｅ ３５１；２９
０−６；Ｈｕｎｔら、１９９２、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５：１２６１−３；Ｐａ
ｒｋｅｒら、１９９２、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：３５８０−７；Ｐａｒｋ
ｅｒら、１９９４、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：１６３−７５）。ＨＬＡ Ｐ
ｅｐｔｉｄｅ Ｍｏｔｉｆ Ｓｅａｒｃｈアルゴリズムは、ＨＬＡ−Ａ２および
他のクラスＩ分子への推定される結合について、完全タンパク質配列からの８マ
ー、９マーおよび１０マーのペプチドの配置および順位を可能にする。ほとんど
のＨＬＡ−Ａ２結合ペプチドは、９マーであり、好適には、２位でロイシンを含
み、そして９位でバリンまたはロイシンを含む（Ｐａｒｋｅｒら、１９９２、Ｊ
．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：３５８０−７）。
【０１４２】 以下の実施例で議論されるように、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮについての推定結合ペ
プチドは、ＷＩＧＦＴＹＫＴＡ、ＡＴＧＥＨＱＡＦＴ、ＦＧＮＣＶＥＬＱＡ、Ｎ
ＣＶＥＬＱＡＳＡおよびＤＮＨＧＦＧＮＣＶ（それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：
６〜１０）を含む。ＨＬＡ−Ａ２へのペプチドの実際の結合は、抗原プロセシン
グ欠損細胞株Ｔ２上のＨＬＡ−Ａ２発現の安定化により評価され得る（Ｘｕｅら
、１９９７、Ｐｒｏｓｔａｔｅ ３０：７３−８；Ｐｅｓｈｗａら、１９９８、Ｐ
ｒｏｓｔａｔｅ ３６：１２９−３８）。特定のペプチドの免疫現性は、樹状細
胞の存在下でのＣＤ８＋ＣＴＬの刺激によりインビトロで評価され得る（Ｘｕｅ
ら；Ｐｅｓｈｗａら、前出）。
【０１４３】 種々のエキソビボストラテジーが、用いられ得る。１つのアプローチは、患者
の免疫系にＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ抗原を呈示するための樹状細胞の使用を包含する
。樹状細胞は、ＭＨＣクラスＩおよびＩＩ、Ｂ７副刺激因子（ｃｏ−ｓｔｉｍｕ
ｌａｔｏｒ）、およびＩＬ−１２を発現し、そして従って高度に特化された抗原
提示細胞である。前立腺癌では、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）のペプチドで
パルスされた自己樹状細胞が、第Ｉ相臨床試験において、前立腺癌患者の免疫系
を刺激するために使用されている（Ｔｊｏａら、１９９６、Ｐｒｏｓｔａｔｅ
２８：６５−６９；Ｍｕｒｐｈｙら、１９９６、Ｐｒｏｓｔａｔｅ ２９：３７
１−３８０）。樹状細胞は、ＭＨＣクラスＩ分子およびクラスＩＩ分子の関連に
おいてＴ細胞に対してＰＣ−ＬＥＣＴＩＮペプチドを提示するために使用され得
る。１つの実施形態では、自己樹状細胞は、ＭＨＣ分子に結合し得るＰＣ−ＬＥ
ＣＴＩＮペプチドでパルスされる。別の実施形態では、樹状細胞は、完全ＰＣ−
ＬＥＣＴＩＮタンパク質でパルスされる。さらに別の実施形態は、当該分野で公
知の種々の実行ベクター（例えば、アデノウイルス（Ａｒｔｈｕｒら、１９９７
、Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．４：１７−２５）、レトロウイルス（Ｈ
ｅｎｄｅｒｓｏｎら、１９９６、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５６：３７６３−３７
７０）、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス、ＤＮＡトランスフェクション（
Ｒｉｂａｓら、１９９７、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５７：２８６５−２８６９）
、および腫瘍由来ＲＮＡトランスフェクション（Ａｓｈｌｅｙら、１９９７、Ｊ
．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８６：１１７７−１１８２））を用いて樹状細胞における
ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ遺伝子の過剰発現を操作することを含む。ＰＣ−ＬＥＣＴＩ
Ｎを発現する細胞は、免疫調節因子（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ）を発現するように
操作され得、そして免疫剤として使用され得る。
【０１４４】 抗イディオタイプ抗ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ抗体もまた、抗癌療法において、ＰＣ
−ＬＥＣＴＩＮタンパク質を発現する細胞に対する免疫応答を惹起するためのワ
クチンとして使用され得る。詳細には、抗イディオタイプ抗体の生成は、当該分
野で周知であり、そしてＰＣ−ＬＥＣＴＩＮタンパク質上のエピトープを模倣す
る抗イディオタイプ抗ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ抗体を生成するように容易に適合され
得る（例えば、Ｗａｇｎｅｒら、１９９７、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ １６：３３−
４０；Ｆｏｏｎら、１９９５、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ９６：３３４−３
４２；Ｈｅｒｌｙｎら、１９９６、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎ
ｏｔｈｅｒ ４３：６５−７６を参照のこと）。このような抗イディオタイプ抗
体は、癌ワクチンストラテジーにおいて使用され得る。
【０１４５】 遺伝子免疫法は、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮを発現する癌細胞に対する予防的または
治療的な体液性免疫応答および細胞性免疫応答を生成するために使用され得る。
ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮタンパク質／免疫原をコードするＤＮＡおよび適切な調節配
列を含む構築物は、個体の筋肉または皮膚に直接的に注射され得、それにより、
筋肉または皮膚の細胞が、この構築物を取り込み、そしてコードされたＰＣ−Ｌ
ＥＣＴＩＮタンパク質／免疫原を発現する。ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮタンパク質免疫
原の発現は、前立腺癌、乳癌、膀胱癌、肺癌、骨癌、大腸癌、膵臓癌、精巣癌、
子宮頸部癌および卵巣癌に対する予防的または治療的な体液性免疫および細胞性
免疫の生成を生じる。当該分野で公知の種々の予防的および治療的遺伝子免疫技
術が使用され得る（検討のために、インターネットアドレスｗｗｗ．ｇｅｎｗｅ
ｂ．ｃｏｍで公開されている情報および参考文献を参照のこと）。
【０１４６】 （キット） 上記で記載または示唆された診断適用および治療適用における使用のために、
本発明によって、キットもまた提供される。このようなキットは、１つ以上のコ
ンテナ手段（例えば、バイアル、チューブなど）を厳重に閉じ込めて受容するよ
うに区画化されるキャリア手段を備え得る。コンテナ手段のそれぞれは、本方法
において、使用されるべき別々の要素の１つを含む。例えば、コンテナ手段の１
つは、検出可能に標識された、または検出可能に標識され得るプローブを含み得
る。このようなプローブは、それぞれＰＣ−ＬＥＣＴＩＮタンパク質もしくはＰ
Ｃ−ＬＥＣＴＩＮ遺伝子またはメッセージに特異的な抗体またはポリヌクレオチ
ドであり得る。キットが、標的核酸配列を検出するために核酸ハイブリダイゼー
ションを利用する場合、キットはまた、標的核酸配列の増幅用のヌクレオチドを
含むコンテナ、および／またはレポーター分子（例えば、酵素標識、蛍光標識、
または放射性同位体標識）に結合されるレポーター手段（例えば、ビオチン結合
タンパク質（例えば、アビジンまたはストレプトアビジン）を含むコンテナを有
し得る。
【０１４７】 本発明のキットは、代表的には、上記コンテナ、および使用説明書と共に、市
販および使用者の観点で所望の材料（緩衝液、希釈剤、フィルター、ニードル、
シリンジ、およびパッケージ挿入物を含む）を含む１つ以上の他のコンテナを含
む。表示は、組成物が、特定の治療または非治療適用について使用されることを
示し、そしてまたインビボまたはインビトロのいずれかの使用（例えば、上記の
使用）についての説明を示し得るために、コンテナ上に存在し得る。
【０１４８】 ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ ｃＤＮＡは、ブダペスト条約の下でアメリカンタイプカ
ルチャーコレクション（ＡＴＣＣ；１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖ
ｄ．Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ ２０１１０−２２０９ ＵＳＡ）に、プラスミド
ｐ５８Ｐ１Ｄ１２−２として１９９９年３月１０日に寄託され、そしてＡＴＣＣ
受託番号２０７１５２で承認されている。 （実施例） 本発明の種々の局面を、以下に続くいくつかの例によってさらに記載および例
示する。これらはいずれも、本発明の範囲の制限を意図するものではない。
【０１４９】 （実施例１：ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ遺伝子のｃＤＮＡフラグメントのＳＳＨ生成
単離） （材料および方法） （ＬＡＰＣ異種移植片） ＬＡＰＣ異種移植片を、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｓａｗｙｅｒｓ博士（ＵＣＬＡ）か
ら入手し、記載のように生成した（Ｋｌｅｉｎら、１９９７、Ｎａｔｕｒｅ Ｍ
ｅｄ．３：４０２−４０８；Ｃｒａｆｔら、１９９９、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．
５９：５０３０−５０３６）。アンドロゲン依存性ＬＡＰＣ−４異種移植片およ
びアンドロゲン非依存性ＬＡＰＣ−４異種移植片（それぞれＬＡＰＣ−４ ＡＤ
およびＡＩ）ならびにアンドロゲン依存性ＬＡＰＣ−９異種移植片およびアンド
ロゲン非依存性ＬＡＣＰ−９異種移植片（それぞれＬＡＣＰ−９ ＡＤおよびＡ
Ｉ）をそれぞれインタクトな雄ＳＣＩＤマウスまたは雄去勢マウスにおいて増殖
させ、そしてレシピエント雄に小組織塊として継代させた。ＬＡＰＣ−４ ＡＩ
異種移植片は、ＬＡＰＣ−４ ＡＤ腫瘍から誘導し、ＬＡＰＣ−９ ＡＩ異種移
植片は、ＬＡＰＣ−９ ＡＤ腫瘍から誘導した。ＡＩ異種移植片を生成するため
に、ＬＡＰＣ ＡＤ腫瘍を有する雄マウスを去勢し、そして２〜３ヶ月間飼育し
た。ＬＡＰＣ腫瘍が再増殖した後、この腫瘍を採集し、そして去勢雄ＳＣＩＤマ
ウスにおいてまたは雌ＳＣＩＤマウスにおいて継代させた。
【０１５０】 （細胞株） ヒト細胞株（例えば、ＨｅＬａ）を、ＡＴＣＣから入手し、そして１０％ウシ
胎児血清を有するＤＭＥＭ中で維持した。
【０１５１】 （ＲＮＡ単離） 腫瘍組織および細胞株を、１０ｍｌ／ｇ組織または１０ｍｌ／１０8細胞を用
いてＴｒｉｚｏｌ試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｉｂｃｏ Ｂ
ＲＬ）においてホモジナイズし、総ＲＮＡを単離した。ポリＡ ＲＮＡを、Ｑｉ
ａｇｅｎ’ｓ Ｏｌｉｇｏｔｅｘ ｍＲＮＡ ＭｉｎｉキットおよびＭｉｄｉキ
ットを用いて総ＲＮＡから精製した。総ＲＮＡおよびｍＲＮＡを、分光光度計分
析（Ｏ．Ｄ． ２６０／２８０ｎｍ）によって定量し、そしてゲル電気泳動によ
って分析した。
【０１５２】 （オリゴヌクレオチド） 以下のＨＰＬＣ精製オリゴヌクレオチドを使用した。
【０１５３】
【化１】 （抑制サブトラクティブ（ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｕｂｔｒａｃｔｉｖｅ
）ハイブリダイゼーション） 抑制サブトラクティブハイブリダイゼーション（ＳＳＨ）を使用して、アンド
ロゲン非依存性癌と比較して、アンドロゲン依存性前立腺癌でアップレギュレー
トされ得る遺伝子に対応するｃＤＮＡを同定した。
【０１５４】 ＬＡＰＣ−９ ＡＤ異種移植片（テスター）およびＬＡＰＣ−９ ＡＩ組織（
ドライバー）に対応する二本鎖ｃＤＮＡを、ＣＬＯＮＴＥＣＨのＰＣＲ−Ｓｅｌ
ｅｃｔ ｃＤＮＡ Ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔおよびプライマーとして１
ｎｇのオリゴヌクレオチドＤＰＮＣＤＮを使用して、上記のように、異種移植片
組織から単離された２μｇのポリ（Ａ）’ＲＮＡから合成した。第一鎖および第
二鎖合成を、キットの使用者マニュアルプロトコル（ＣＬＯＮＴＥＣＨプロトコ
ール番号ＰＴ１１１７−１、カタログ番号Ｋ１８０４−１）に記載のように実施
した。得られたｃＤＮＡをＤｐｎＩＩで３７℃で３時間消化した。消化したｃＤ
ＮＡをフェノール／クロロホルム（１：１）で抽出し、そしてエタノール沈殿し
た。
【０１５５】 ドライバー（ｄｉｒｉｖｅｒ）ｃＤＮＡ（ＬＡＰＣ−９ＡＩ）を、１：１比で
、ＤｐｎＩＩ消化ＬＡＰＣ−９ＡＩ ｃＤＮＡを、ＢＰＨ組織、およびヒト細胞
株ＨｅＬａ、２９３、Ａ４３１、Ｃｏｌｏ ２０５、およびマウス肝臓由来の消
化ｃＤＮＡの混合物と組み合わせることにより生成し、マウス遺伝子が、テスタ
ーｃＤＮＡ（ＬＡＣＤ−９ ＡＤ）から差し引きされることを確実にした。
【０１５６】 テスター（ｔｅｓｔｅｒ）ｃＤＮＡ（ＬＡＰＣ−９ ＡＤ）を、５μｌの水中
に１μｌのＤｐｎＩＩ消化ＬＡＰＣ−９ ＡＤ ｃＤＮＡ（４００ｎｇ）を希釈
することにより生成した。次いで、希釈したｃＤＮＡ（２μｌ、１６０ｎｇ）を
、総容量１０μｌで１６℃で一晩、４００ｕのＴ４ ＤＮＡリガーゼ（ＣＬＯＮ
ＴＥＣＨ）を用いて、別の連結反応中で、２μｌのアダプター１およびアダプタ
ー２（１０μＭ）に連結した。連結を、１μｌの０．２Ｍ ＥＤＴＡで、そして
７２℃で５分間加熱して終結させた。
【０１５７】 第一のハイブリダイゼーションは、１．５μｌ（６００ｎｇ）のドライバーｃ
ＤＮＡを、１．５μｌ（２０ｎｇ）のアダプター１連結のおよびアダプター２連
結のテスターｃＤＮＡを含む２つの各チューブに添加することにより実施した。
４μｌの最終容量で、サンプルに鉱油を重層し、ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ サー
マルサイクラー中で、９８℃で１．５分間変性し、次いで、６８℃で８時間ハイ
ブリダイズさせた。次いで、２つのハイブリダイゼーションを、さらなる１μｌ
の新鮮な変性ドライバーｃＤＮＡと一緒に混合し、そして６８℃で一晩ハイブリ
ダイズさせた。次いで、第二のハイブリダイゼーションを、２００μｌの２０ｍ
Ｍ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ８．３、５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ中で
希釈し、７０℃で７分間加熱し、そして−２０℃で貯蔵した。
【０１５８】 （ＳＳＨから生成した遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅、クローニング、およ
び配列決定） ＳＳＨ反応から生じる遺伝子フラグメントを増幅するために、２つのＰＣＲ増
幅を行った。第一のＰＣＲ反応において、１μｌの希釈最終ハイブリダイゼーシ
ョン混合物を、最終容量２５μｌの１μｌのＰＣＲプライマー１（１０μＭ）、
０．５μｌ ｄＮＴＰ混合物（１０μＭ）、２．５μｌの１０×反応緩衝液（Ｃ
ＬＯＮＴＥＣＨ）、および０．５μｌの５０×Ａｄｖａｎｔａｇｅ ｃＤＮＡ
ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｍｉｘ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）に添加した。ＰＣＲ１を、
以下の条件を用いて実施した：７５℃で５分、９４℃で２５秒、次いで２７サイ
クルの９４℃で１０秒、６６℃で３０秒、７２℃で１．５分。５つの別の第一の
ＰＣＲ反応を各実験について行った。産物をプールし、そして水で１：１０に希
釈した。第二のＰＣＲ反応については、プールし、そして希釈した第一のＰＣＲ
反応物からの１μｌを、プライマーＮＰ１およびＮＰ２（１０μＭ）をＰＣＲプ
ライマー１の代わりに使用したことを除き、ＰＣＲ１について用いたものと同じ
反応混合物に添加した。ＰＣＲ２を、１０〜１２サイクルの９４℃で１０秒、６
８℃で３０秒、７２℃で１．５分を用いて実施した。ＰＣＲ産物を、２％アガロ
ースゲル電気泳動を用いて分析した。
【０１５９】 ＰＣＲ産物を、Ｔ／Ａベクタークローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
を用いてｐＣＲ２．１に挿入した。形質転換Ｅ．ｃｏｌｉを青／白およびアンピ
シリン選択に供した。白色コロニーを釣り上げ、９６ウェルプレート中に並べ、
そして液体培養中で一晩増殖させた。挿入物を同定するために、ＰＣＲ増幅をＰ
ＣＲ１の条件ならびにプライマーとしてＮＰ１およびＮＰ２を用いて１ｍｌの細
菌培養物において実施した。ＰＣＲ産物を２％アガロースゲル電気泳動を用いて
分析した。
【０１６０】 ９６ウェルフォーマットで２０％グリセロール中に細菌クローンを貯蔵した。
プラスミドＤＮＡを調製し、配列決定し、そしてＧｅｎＢａｎｋ、ｄＢｅｓｔ、
およびＮＣＩ−ＣＧＡＰデータベースの核酸相同性検索に供した。
【０１６１】 （ＲＴ−ＰＣＲ発現分析） 第一鎖ｃＤＮＡを、Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ Ｐｒｅａ
ｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎシステムを用いるオリゴ（ｄＴ）１２〜１８プライミ
ングによって１μｇのｍＲＮＡから生成した。製造者プロトコルを使用し、そし
てこれは、４２℃で５０分間の逆転写酵素とのインキュベーション、続いて３７
℃で２０分間のＲＮＡｓｅ Ｈ処理を包含した。反応を完了した後、この容積を
、標準化の前に水で２００μｌに増大させた。１６の異なる正常ヒト組織からの
第一鎖ｃＤＮＡを、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから入手した。
【０１６２】 複数の組織からの第一鎖ｃＤＮＡの標準化を、プライマー５’ａｔａｔｃｇｃ
ｃｇｃｇｃｔｃｇｔｃｇｔｃｇａｃａａ３’（配列番号１９）および５’ａｇｃ
ｃａｃａｃｇｃａｇｃｔｃａｔｔｇｔａｇａａｇｇ３’（配列番号２０）を用い
てβアクチンを増幅することにより実施した。第一鎖ｃＤＮＡ（５μｌ）を、０
．４μＭプライマー、０．２μＭ各ｄＮＴＰ、１×ＰＣＲ緩衝液（Ｃｌｏｎｔｅ
ｃｈ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2、５０ｍＭ ＫＣ
ｌ、ｐＨ８．３）、および１×Ｋｌｅｎｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｃｌｏｎ
ｔｅｃｈ）を含む総容量５０μｌで増幅した。１８サイクル、２０サイクルおよ
び２２サイクルで、５μｌのＰＣＲ反応物を取り出し、そしてアガロース電気泳
動のために使用した。ＰＣＲを、以下の条件下で、ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈサー
マルサイクラーを用いて実施した：初期変性は９４℃で１５秒間であり、続いて
１８サイクル、２０サイクル、および２２サイクルの９４℃で１５、６５℃で２
分、７２℃で５秒。７２℃での最終伸長を２分間行った。アガロースゲル電気泳
動後、複数の組織からの２８３ｂｐのβアクチンバンドのバンド強度を可視検査
によって比較した。２２サイクルのＰＣＲ後に全ての組織において等しいβアク
チンバンド強度を生じるように、第一鎖ｃＤＮＡの希釈因数を算定した。２２サ
イクルのＰＣＲ後に全ての組織において等しいバンド強度を達成するには、３ラ
ウンドの標準化が必要であった。
【０１６３】 ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ遺伝子の発現レベルを決定するために、５μｌの標準化さ
れた第一鎖ｃＤＮＡを、以下のプライマー対を用いる２５、３０、および３５サ
イクルの増幅を用いるＰＣＲによって分析した。これらプライマーは、（ＭＩＴ
；詳細については、ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕを参照のこと
）の補助により設計した（それぞれ、配列番号２１および２２）：
【０１６４】
【化２】 半定量発現分析を、軽度のバンド強度を与えるサイクル数でＰＣＲ産物を比較
することにより達成した。 （結果） いくつかのＳＳＨ実験を上記の材料および方法に記載されるとおりに行い、そ
して多数の候補遺伝子フラグメントクローンの単離がもたらされた。すべての候
補クローンを配列決定し、そして主要な公の遺伝子およびＥＳＴのデータベース
におけるすべての配列に対して相同性分析を行って、対応する遺伝子の同一性に
ついての情報を提供し、そして示差的発現のための特定の遺伝子を分析するため
の決定をガイドすることを支援した。一般に、検索した任意のデータベースにお
ける任意の公知配列に何ら相同性を有せず、従って新規遺伝子をあらわすと考え
られる遺伝子フラグメント、およびこれまでに配列決定された発現配列タグ（Ｅ
ＳＴ）に対して相同性を示す遺伝子フラグメントを、ＲＴ−ＰＣＲおよび／また
はノーザン分析による示差的発現分析にかけた。
【０１６５】 ｃＤＮＡクローンの１つの５８Ｐ１Ｄ１２と呼ばれるものは、４２７ｂｐ長で
あり、そしてブタ筋肉に由来するＥＳＴに対して弱い相同性、およびＣ型レクチ
ンに対して相同性を有する細胞表面分子であるハムスターライリン（ｌａｙｉｌ
ｉｎ）に対して顕著な相同性を示した。ＳＳＨフラグメントは、１２９アミノ酸
のＯＲＦを含んでおり、これはライリンに対して有意な相同性を示した。このフ
ラグメントのＯＲＦは、ライリンの中央領域に対応し、そして膜貫通ドメインを
含む。続いて、５８Ｐ１Ｄ１２遺伝子をコードする全長ｃＤＮＡをこのｃＤＮＡ
を用いて単離し、そして構造分析し（実施例２、下記）、そしてＰＣ−ＬＥＣＴ
ＩＮと再命名した。
【０１６６】 ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ ＳＳＨクローンに由来するプライマーを用いたＲＴ−Ｐ
ＣＲによるディファレンシャル発現分析は、５８Ｐ１Ｄ１２／ＰＣ−ＬＥＣＴＩ
Ｎ遺伝子が、試験した正常精巣および前立腺腫瘍外植片において本質的に発現さ
れることを示した（図３）。より高いサイクルの増幅（すなわち、３０より多い
）では、より低いレベルの発現が、前立腺、脾臓および胎盤において検出された
。全長ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ ｃＤＮＡをプローブとして用いたノーザンブロット
分析（図３を参照のこと、下記）により、正常精巣およびＬＡＰＣ９ ＡＤ Ｒ
ＮＡにおいてのみ１．８ｋｂおよび３．０ｋｂの転写物の発現が示された（図４
）、より低い発現レベルが、ＬＡＰＣ−４ＡＤ、ＬＡＰＣ−４ＡＩおよびＬＡＰ
Ｃ−９ ＡＩにおいて検出される。
【０１６７】 （実施例２：全長ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮコードｃＤＮＡの
単離） ４２７ｂｐの５８ＰｌＤ１２／ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ遺伝子フラグメント（実施
例１）を用いてＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ遺伝子をコードする、３０のさらなるｃＤＮ
Ａを単離した。ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮに対する全長ｃＤＮＡを、ＬＡＰＣ−９ Ａ
Ｄライブラリーから単離した。ｃＤＮＡ（クローン２）は、２５５１０ｂｐ長で
あり、そして２７４アミノ酸のＯＲＦをコードするＯＲＦの分析により、Ｎ末端
のシグナル配列および膜貫通ドメインが同定され、これは、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ
が１ａ型膜貫通タンパク質であり、Ｎ末端が外側にあり、そしてＣ末端は細胞質
内にあることを示す。全長ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ ｃＤＮＡは、Ａｍｅｒｉｃａｎ
Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（「ＡＴＣＣ」） （Ｍａ
ｎｎａｓｓａｓ，ＶＡ）に、プラスミドｐ５８ＰｌＤ１２−２に１９９９年３月
１０日にＡＴＣＣ受託番号２０７１５２として寄託された。その中にあるＰＣ−
ＬＥＣＴＩＮ ｃＤＮＡクローンは、ＥｃｏＲＩＩＸｂａＩ ２連の消化（５’
末端にはＥｃｏＲＩ、３’末端にはＸｂａＩ）を用いてそこから切り出され得る
。
【０１６８】 ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ配列とハムスターライリンとのアミノ酸整列により、ライ
リンとの関係が示された（図２Ａ）。しかし、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮは、タリン関
連ドメインを示さず、このことは、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮがライリンと同じ様式で
細胞骨格と相互作用しないことを示唆する。他の構造的相違もまた、明白である
（図２Ａ）。２５５０ｂｐのＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ ｃＤＮＡと１７４７ｂｐのハ
ムスターライリンｃＤＮＡｃＤＮＡとの整列により、５９１ｂｐ領域に亘る相同
性が示された（図２Ｂ）。ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮの残りの領域は、ライリンとは顕
著に異なり、このことは、細胞外ドメインのＣ末端の半分および細胞質ドメイン
全体のアミノ酸配列における相違を反映する。このことは、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ
およびライリンが関連し、そしてレクチンのサブファミリーをおそらく構成する
ものの、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮがヒト形態のライリンではないようであることを示
唆する。
【０１６９】 （実施例３：ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ遺伝子発現分析） 正常ヒト組織におけるＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ ｍＲＮＡ発現の初期の分析は、Ｃ
ｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）から得られた
２つの多重組織ブロットをノーザンブロットすることによって行った。このブロ
ットは、標識されたＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ ｃＤＮＡをプローブとして用いた合計
１６の正常ヒト組織を含む。発現は、正常精巣にのみ検出された。これらのノー
ザンブロットにより、およそ１．８ｋｂおよび３．０ｋｂの２つの転写物が示さ
れた。
【０１７０】 この初期の分析は、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮプローブを用いて５０の正常ヒト組織
（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ，； Ｈｕｍａｎ Ｍａｓ
ｔｅｒ ＢｌｏｔTM）のＲＮＡドットブロットマトリクスを分析した。この結果
は、精巣および胎児脾臓においてのみ強力なＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ発現を示す（図
１４）。より低いレベルの発現は、唾液腺および胎児腎臓において検出された。
以下においては発現は検出されなかった：脳、扁桃、尾状核、小脳、大脳皮質、
前葉、海馬、延髄、後頭葉、被核、黒質、側頭葉、視床、視床下部核、脊髄、心
臓、動脈、骨格筋、結腸、膀胱、子宮、前立腺、胃、卵巣、膵臓、下垂体腺、副
腎、甲状腺、乳腺、腎臓、肝臓、小腸、脾臓、胸腺、末梢白血球、リンパ節、骨
髄、盲腸、肺、気管、胎盤、胎児脳、胎児心臓、胎児肝臓、胎児胸腺、胎児肺。
【０１７１】 ヒト前立腺癌組織におけるＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ発現を分析するために、ヒト前
立腺癌外植片由来のＲＮＡもまた分析した。すべてのＲＮＡサンプルを、エチジ
ウムブロミド染色および続いて標識されたβアクチンプローブでの分析により定
量的に正規化した。この結果（図４Ｃ）は、特にＬＡＰＣ−９ ＡＤ外植片にお
いて高レベルのＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ発現を示し、より低いが有意なレベルの発現
が残りの外植片において検出された。
【０１７２】 ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ ＳＳＨフラグメントプローブを用いたノーザンブロット
分析は、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮがマウス骨内で皮下（ｓｃ；図５；レーン２）また
は脛骨内（ｉｔ；図５；レーン１）のいずれかで増殖することを示す。ＰＣ−Ｌ
ＥＣＴＩＮ発現がアンドロゲンの存在に依存するかどうかを調べるために、ＬＡ
ＰＣ−９ ＡＤ腫瘍を雄性ＳＣＩＤマウスにおいて成長させた。このマウスを去
勢し、そして腫瘍を２８日後に採取した。２８日後に去勢した雄性マウスの腫瘍
におけるＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ発現を、インタクトの雄性マウスの腫瘍における発
現と比較した。この結果は、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ発現が去勢した雄性からの腫瘍
が劇的に減少することを示す（図６）。コントロールとして、公知のアンドロゲ
ンにより調節される遺伝子ＴＭＰＲＳＳ２（ＷＯ９９／６２９４２を参照のこと
）の発現もまた、去勢後に下方調節されることが示された（図６）。これらのデ
ータは、前立腺腫瘍におけるＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ発現がアンドロゲンの存在に依
存することを示す。
【０１７３】 さらに、ＲＴ−ＰＣＲを用いて患者由来の癌を含む種々の組織におけるＰＣ−
ＬＥＣＴＩＮの発現を分析した。第一の鎖のｃＤＮＡを、１ｇのｍＲＮＡから、
オリゴ（ｄＴ）１２−１８プライミングを用い、Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ Ｓｕｐｅ
ｒｓｃｒｉｐｔ Ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ系を使用して作製した。製
造者のプロトコールが用いられ得、そしてこれは、４２℃で逆転写酵素と５０分
間インキュベーション、続いて２０分間に亘り３７℃でのＲＮＡｓｅ処理を包含
する。反応を完了した後、その容量を水で２００μｌにまで増加させた後正規化
した。第一の鎖のｃＤＮＡを、目的の種々の組織から調製した。正規化は、アク
チンおよびＧＡＰＤＨに対するプライマーを用いたＰＣＲにより行った。半定量
的ＰＣＲを、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮに対するプライマーを用いて行った。
【０１７４】 （実施例４：ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮタンパク質の生化学的特徴づけ） ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮタンパク質を最初に特徴付けるため、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ
ｃＤＮＡを、６Ｈｉｓタグをカルボキシ末端含むｐｃＤＮＡ３．１ ｍｙｃ−
Ｈｉｓ−プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローニングし、２９３Ｔ細
胞中にトランスフェクトし、そして生の細胞から除外される水溶性ビオチン化試
薬で標識する。ビオチン化細胞表面タンパク質を、ストレプトアビジン−ｓｅｐ
ｈａｒｏｓｅでアフィニティー精製し、そしてトランスフェクトした２９３Ｔ細
胞中のＰＣ−ＬＥＣＴＩＮの抗Ｈｉｓ抗体でプローブした（図７）。ＰＣ−ＬＥ
ＣＴＩＮタンパク質は、非ビオチン化のトランスフェクトされた細胞からのスト
レプトアビジン沈降物中には検出されなかった（図７）。
【０１７５】 （実施例５：哺乳動物系における組換えＰＣ−ＬＥＣＴＩＮタンパク質の発現
） 哺乳動物発現のために、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ ｃＤＮＡをｐｃＤＮＡ３．１
Ｍｙｃ−Ｈｉｓ−ｔａｇ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、およびレトロウイルス発現
ベクターｐＳＲαｔｋｎｅｏ（Ｍｕｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．、１９９１、ＭＣＢ
１１：１７８５）を含む、いくつかのベクター中に中にクローニングし得る。
これらの発現ベクターを用いて、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮを、ＰＣ−３、ＮＩＨ ３
Ｔ３、マウスＬ細胞線維芽細胞および２９３Ｔを含む、いくつかの細胞株中に発
現させ得る。
【０１７６】 ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮタンパク質をコードする組換えレトロウイルスを、ヒト２
９３Ｔ細胞（Ｐｅａｒ ｅｔ ａｌ．１９９３、ＰＮＡＳ ９０：８３９２−８
３９６）中に作製し、そしてこれを用いてＮＩＨ ３Ｔ３細胞に感染させ、これ
を、２週間にわたりＧ４１８中で選択して安定株を生成した。ＰＣ−ＬＥＣＴＩ
Ｎの発現は、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ ｃＤＮＡプローブを用いてノーザンブロット
を行うことによって確認した。
【０１７７】 ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮを発現する哺乳動物細胞株を、インビトロおよびインビボ
のいくつかのアッセイ（組織培養における細胞増殖、アポトーシスシグナルの活
性化、ＳＣＩＤマウスにおける腫瘍形成、および膜侵入培養系（ＭＩＣＳ）を用
いたインビトロ侵入を含む）において用いた。
【０１７８】 （実施例６：バキュロウイルス系における組換えＰＣ−ＬＥＣＴＩＮの生成） バキュロウイルス発現系において組換えＰＣ−ＬＥＣＴＩＮタンパク質を生成
するために、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ ｃＤＮＡをバキュロウイルス移入ベクターｐ
ＢｌｕｅＢａｃ４．５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローニングした。このベ
クターは、Ｎ末端にＨｉｓタグを提供する。具体的には、ｐＢｌｕｅＢａｃ−−
ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮを、ヘルパープラスミドｐＢａｃ−Ｎ−Ｂｌｕｅ（Ｉｎｖｉ
ｔｒｏｇｅｎ）とともにＳＦ９（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ
）昆虫細胞中へ同時トランスフェクトして、組換えバキュロウイルスを生成した
（詳細はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ指示マニュアルを参照のこと）。ついで、バキュ
ロウイルスを細胞上清から収集し、そしてプラークアッセイにより精製した。
【０１７９】 次いで、組換えＰＣ−ＬＥＣＴＩＮタンパク質を、精製されたバキュロウイル
スでのＨｉｇｈＦｉｖｅ昆虫細胞（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）の感染により作製し
た。組換えＰＣ−ＬＥＣＴＩＮタンパク質を、抗ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ抗体を用い
て検出し得る。ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮタンパク質が精製され得、種々の細胞ベース
のアッセイにおいて使用され得るか、または免疫原として使用されて、ＰＣ−Ｌ
ＥＣＴＩｎに対して特異的なポリクローナルまたはモノクローナルの抗体を精製
し得る。
【０１８０】 （実施例７：分泌された組換えＰＣ−ＬＥＣＴＩＮアルカリホスファターゼ融
合タンパク質の生成） ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮと相互作用するタンパク質の同定により、機能の割り当て
の補助となり得、そして前立腺癌についての新規治療標的および診断マーカーを
同定し得る。アルカリホスファターゼ−ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ融合タンパク質の構
築を用いて、ＰＣ−ＬＥＴＣＩＮと相互作用するタンパク質を検出および同定し
得、他方でモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体の生成のための免疫原
を生成し得る。
【０１８１】 ＧｅｎＨｕｎｔｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｎａｓｈｖｉｌｌｅ、ＴＮ，
ｃａｔ＃Ｑ２０２）からのＡＰ−ＴＡＧ系を利用して、その融合タンパク質を作
製し得、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ結合を検出し得る。シグナル配列のないＰＣ−ＬＥ
ＣＴＩＮ ｃＤＮＡ（配列番号１Ａ〜Ｄ；配列番号１）をｐＡＰｔａｇ−５（Ｇ
ｅｎＨｕｎｔｅｒ Ｃｏｒｐ．Ｎａｓｈｖｉｌｌｅ、ＴＮ）中にクローニングし
た。以下に示すＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ．ＨｉｎｄＩＩＩおよびＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ
．ＢａｍＨＩプライマーを用いて、プラスミドテンプレートであるＰＣ−ＬＥＣ
ＴＩＮクローン２から、アミノ酸２２から２１３までのＰＣ−ＬＥＣＴＩＮオー
プンリーディングフレームを増幅した。このＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩ消
化されたＰＣＲ産物を、ＩｇＧＫシグナル配列、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ ＯＲＦお
よびアルカリホスファターゼをすべてインフレームに保持しながらＨｉｎｄＩＩ
ＩおよびＢｇｌＩＩ消化したｐＡＰｔａｇ−５へと連結した。このＰＣ−ＬＥＣ
ＴＩＮ−ＡＰ融合タンパク質は、アルカリホスファターゼのカルボキシ末端にお
いてｍｙｃ／Ｈｉｓタグに沿った分泌を促進するためにＩｇＧＫシグナル配列を
含む。 ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮＨＩＮＤＩＩＩ プライマー（配列番号２３）： ＧＴＧＴＡＡＧＣＴＴＣＣＣＧＣＣＧＣＧＴＧＧＴＣＡＧＣＧＧＣ ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ． ＢＡＭＨＩ プライマー（配列番号２４）： ＣＡＣＡＧＧＡＴＣＣＴＡＴＡＣＣＴＧＣＴＴＣＡＧＴＡＡＣ。 このＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ−ＡＰ融合タンパク質構築物を、２９３Ｔ細胞をトラ
ンスフェクトするために使用し、そして培養培地中へ分泌される融合タンパク質
の存在を、抗アルカリホスファターゼ抗体および抗ＨＩＳ抗体を使用するウェス
タンブロット分析によってモニターした。この分析の結果は、図８に示され、こ
れは、馴化培地中でのトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞の約１００ｋＤａ融
合タンパク質の検出を示す。
【０１８２】 アミノ酸２２〜２１３もまた、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｈｏＩを含む
プライマーを用いるＰＣＲを使用して、ｐＡＰＴａｇ−５ベクター中にクローニ
ングして、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ細胞外ドメインのＮ末端にＩｇＧＫシグナル配列
融合およびＣ末端にｍｙｃ／Ｈｉｓタグを生成した。この構築物は、上記５８Ｐ
１Ｄ１２ｐＡＰｔａｇと類似するが、ＡＰ融合を含まない。
【０１８３】 ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ（アミノ酸１〜２７３）のコード配列全体を、ｐＳＲａに
クローニングした。ＯＲＦならびに制限部位ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩをコード
するプライマーは、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮクローン２（ｐＢＫ．ＣＭＶ）からイン
サートを増幅した。このインサートを、ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩの両方での消
化の後、ｐＳＲａに連結した。この構築物を使用して、ウイルスを生成し、そし
てＰＣ−ＬＥＣＴＩＮタンパク質を安定に発現する細胞株を生成した。
【０１８４】 ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ（アミノ酸１〜２７３）のコード配列全体を、ｐｃＤＮＡ
３．１／ｍｙｃ−ＨＩＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした。ＯＲＦ
および制限部位ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩをコードするプライマーは、ＰＣ−Ｌ
ＥＣＴＩＮクローン２（ｐＢＫ．ＣＭＶ）からインサートを増幅した。このイン
サートを、ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩの両方での消化の後、ｐｃＤＮＡ３．１／
ｍｙｃ−ＨＩＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に連結した。ウェスタンブロット分析
により、２９３Ｔ細胞をこの構築物でトランスフェクトした場合の、ＰＣ−ＬＥ
ＣＴＩＮタンパク質の発現を確認した。
【０１８５】 （実施例８：ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ結合パートナーの検出およびクローニング） ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮは、結合パートナータンパク質と相互作用し得るレクチン
Ｃ型ドメインを含む、膜貫通タンパク質である。ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮレセプター
結合を検出するために、いくつかの細胞株、組織、ならびに糖タンパク質（例え
ば、ヒトＩｇＧもしくはマウスＩｇＧ、ウシＲＮアーゼ、オボアルブミン、ヒト
トランスフェリン、フェチュイン（ｆｅｔｕｉｎ）グリコホリン、シアログリコ
ホリン）でコートされたプレートを、ＣｈｅｎｇおよびＦｌａｎａｇａｎ、１９
９４、Ｃｅｌｌ ７９：１５７〜１６８における手順を使用して、ＰＣ−ＬＥＣ
ＴＩＮ−ＡＰ融合タンパク質とともインキュベートする。その細胞を洗浄しそし
てＡＰ基質ＢＣＩＰ（脱リン酸化の際に不溶性青色沈殿を形成する）を添加した
後、細胞表面レセプターへのＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ結合を、青に染まっている細胞
を探すために顕微鏡を使用して、検出し得る。スクリーニングし得る細胞株とし
ては、ＬＮＣａＰ、ＰＣ−３、ＤＵ１４５、ＴＳＵＰＲ、ＰＲＥＣ、ＬＡＰＣ４
、２９３Ｔ、ＮＩＨ３Ｔ３および他の癌細胞株が挙げられる。ＬＡＰＣ異種移植
片、前立腺組織および前立腺癌のような組織もまたスクリーニングし得る。一旦
、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ−ＡＰ細胞表面結合が観察されると、平衡解離速度定数を
、結合相互作用の強度を評価するために算出し得る。さらに、細胞あたりの細胞
表面レセプターの数を決定し得る。次いで、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮの最高の結合能
力を有する細胞株または組織を使用して、レセプターをクローニングし得る。特
定の等部分へのＰＣ−ＬＥＣＴＩＮの結合を、低濃度の特定の関連単糖による結
合阻害を示すことによって確認し得る。
【０１８６】 Ｔａｒｔａｇｉｌａら、１９９５、Ｃｅｌｌ ８３：１２６３１２７１、Ｃｈ
ｅｎｇおよびＦｌａｎａｇａｎなどに記載される戦略のような、発現クローニン
グ戦略を使用して、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮについてのレセプターをクローニングし
得る。１つのアプローチにおいて、発現ライブラリーを、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮー
ＡＰ結合を示す細胞から構築する。このライブラリーを、約１０００クローンの
プールとして作製し、そして同胞選択（ｓｉｂ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）手順によ
りスクリーニングする。各プール由来のＤＮＡによるＣＯＳ細胞の一過性トラン
スフェクション、およびその後のＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ−ＡＰ結合、洗浄および染
色を用いたＡＰ活性についてのスクリーニングによって、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮを
結合する細胞および結果的なＰＣ−ＬＥＣＴＩＮレセプターの発現を同定する。
連続する回のプール部分分割およびスクリーニングの後、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ−
ＡＰに結合する単コロニーを同定する。
【０１８７】 あるいは、発現ライブラリーを、標準的技術（Ｓｔｏｎｅ Ｊ．、Ｃｕｒｒｅ
ｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９
９７）：２０．３．１−２０．３．９）を使用して、ファージ中に生成する。膜
リフトを、実施例６に従ってＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ−ＡＰ融合タンパク質を使用し
てプロービングし、そしてＢＣＩＰアルカリホスファターゼアッセイを検出に使
用する。ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ−ＡＰを結合しかつ青色沈殿を生成するプラークを
選択し、そしてそのレセプターについての遺伝子を含むプラスミドを切り出す。
このアプローチの重要な利点は、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮと相互作用する細胞質タン
パク質または分泌タンパク質もまた同定することである。
【０１８８】 （実施例９：ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ細胞外ドメインの発現および精製） ２９３Ｔ細胞を、Ｃ末端６×ＨｉｓタグとともにＰＣ−ＬＥＣＴＩＮの細胞外
ドメイン（アミノ酸２２〜２１３）をコードするＴａｇ５分泌発現ベクターでト
ランスフェクトした。次いで、安定な細胞株を、ゼオシン選択により生成した。
この細胞株を、２９３ ＳＦＭＩＩ無血清培地（Ｇｉｂｃｏ）中でスピナー（ｓ
ｐｉｎｎｅｒ）培養にて増殖させ、そして馴化培地を精製用に収集した。馴化培
地を濃縮し、そして緩衝液を結合緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐ
Ｈ８．０）、５００ｍＭ ＮａＣｌ、および１０ｍＭイミダゾール）に交換し、
そしてＮｉ−ＮＴＡアガロース（Ｑｉａｇｅｎ）を使用する固定化金属アフィニ
ティークロマトグラフィーに供した。出発馴化培地、フロースルー、および溶出
した精製物質を、１０〜２０％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で泳動し、そして銀染
色した（図９Ａ）か、またはニトロセルロースにトランスファーして抗Ｈｉｓポ
リクローナル抗体（ｐＡｂ）を使用するウェスタンブロットに供した（図９Ｂ）
。
【０１８９】 （実施例１０：ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮに対するポリクローナル抗体およびモノク
ローナル抗体） ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮに対するポリクローナル抗体を生成するために、３つの異
なるペプチドを、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮの細胞外ドメインに対して作製した。この
ペプチド配列は、以下である： ＧＬＷＲＮＧＤＧＱＴＳＧＡＣ（１４マー、配列番号２５）、 ＧＧＰＹＬＹＱＷＮＤＤＲＣＮＭ（１５マー、配列番号２６）、および ＥＡＲＬＡＣＥＳＥＧＧＶＬＬ（１４マー、配列番号２７）。
【０１９０】 これらのペプチドを、ＫＬＨ（キーホールリンペットヘモシアニン）に結合し
、そしてウサギを免疫するために使用した。これらのウサギ由来の血清を、細胞
溶解物のウェスタンブロッティングおよび全細胞に対するＦＡＣＳを使用して、
ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮタンパク質に対する反応性について試験した（下記実施例１
１を参照のこと）。力価を、そのペプチドに対するＥＬＩＳＡおよびＰＣ−ＬＥ
ＣＴＩＮ ｃＤＮＡを発現する組換え細胞株を使用するウェスタンブロットによ
って、モニターした。続く実験を、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮタンパク質のアミノ酸２
０４〜２１７（ＧＬＷＲＮＧＤＧＱＴＳＧＡＣ（配列番号２５））から生成した
抗体を用いて実施した。
【０１９１】 モノクローナル抗体を生成するために、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮの細胞外ドメイン
を有効に発現させ、そして上記実施例９に記載されるようなＴｇ５ ＰＣ−ＬＥ
ＣＴＩＮ分泌ベクターを発現する２９３Ｔ細胞の馴化培地から精製した。この精
製したタンパク質を、ＢａｌｂＣマウスを免疫するために使用した。マウスに、
完全フロイントアジュバント中のタンパク質５０μｇを最初に腹腔内注射し、そ
して３週間後に、不完全フロイントアジュバント中のタンパク質５０μｇでブー
ストした。次いで、２週間免疫スケジュールでブーストを続け、そして免疫した
マウス血清の力価を、標的としてＴａｇ５ ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮを使用するＥＬ
ＩＳＡ、ならびに細胞株および組織溶解物のウェスタンブロット分析による特異
性によって、モニターした。
【０１９２】 （実施例１１：組換え細胞株および精巣におけるＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ発現） 免疫したマウスの血清を使用して、組換え細胞株および正常な精巣の細胞溶解
物を使用する、ウェスタンブロットおよび免疫沈降によって、ＰＣ−ＬＥＣＴＩ
Ｎ発現を分析した。さらに、Ｒａｔ１−ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ細胞の細胞表面上の
ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ発現を、その免疫したマウスの血清を使用するフローサイト
メトリーによって分析した。
【０１９３】 ｎｅｏコントロールウイルスまたはＰＣ−ＬＥＣＴＩＮをコードするウイルス
のいずれかに安定に感染したＲａｔ１細胞を、ＲＩＰＡ緩衝液（２５ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００
、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ ＳＤＳ、２ｍＭ ＥＤＴＡ
、１００μｇ／ｍｌ ＰＭＳＦ、および２μＭロイペプチン）中に溶解した。次
いで、溶解物２００μｇを、精製Ｔａｇ５−ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮタンパク質で免
疫したマウス由来の血清を用いる免疫沈降に供した。手短かに言えば、血清３μ
ｌを、溶解物（１ｍｌ中２００μｇタンパク質）とともにインキュベートし、そ
して４℃で一晩インキュベートした。次いで、ＲＩＰＡ緩衝液中のプロテインＧ
ビーズの５０％スラリー５０μｌを添加し、そして室温で１時間、さらにインキ
ュベートした。免疫沈降物を、ＲＩＰＡ緩衝液で４回洗浄し、そして３×ＳＤＳ
−ＰＡＧＥサンプル緩衝液４０μｌ中に溶解し、そして１００℃で加熱した。可
溶化した免疫沈降物２５μｌまたは示したＲＩＰＡ溶解物２５μｇを、１０〜２
０％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離し、そしてニトロセルロースにトランスフ
ァーした。
【０１９４】 次いで、ウェスタンブロット分析を、アフィニティー精製したウサギ抗ＰＣ−
ＬＥＣＴＩＮペプチドポリクローナル抗体（ｐＡｂ）（２μｇ／ｍｌ、図１０Ａ
）を用いてか、または０．１５％ Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＴｒｉｓ緩衝化生理
食塩水（ＴＢＳ−Ｔ、ｐＨ７．５）および１％脱脂乳中に希釈した免疫したマウ
スの血清の１：１０００希釈物を用いて（図１０Ｂ）のいずれかで実行した。ブ
ロットを、血清とともに室温で２時間インキュベートし、次いで、ＴＢＳ−Ｔで
３回洗浄した。次いで、免疫反応性バンドを、抗ウサギＩｇまたは抗マウスＩｇ
Ｇ ＨＲＰ結合体化二次抗体（Ａｂ）のいずれかとのインキュベーションにより
発色させ、そして、増強化学発光基質（ＥＣＬ、Ａｍｅｒｓｈａｍ）とのインキ
ュベーションおよびオートラジオグラフフィルムへの曝露により可視化した。
【０１９５】 ｐＣＤＮＡ３．１ Ｍｙｃ／Ｈｉｓ ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮまたは空のベクター
のいずれかで一過性トランスフェクトした２９３Ｔ細胞の細胞溶解物、およびｎ
ｅｏコントロールまたはＰＣ−ＬＥＣＴＩＮレトロウイルスのいずれかに安定に
感染したＲａｔ１細胞の細胞溶解物、および正常な精巣の細胞溶解物を、ＳＤＳ
−ＰＡＧＥにより分離し、そしてニトロセルロースにトランスファーした。次い
で、ウェスタン分析を上記のように実行した。結果を、図１１に示す。矢印で示
すのは、全長ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮを示す４７ｋＤバンド、４０ｋＤ細胞外ドメイ
ン、および５５ｋＤ Ｍｙｃ／Ｈｉｓタグ化タンパク質である。
【０１９６】 Ｔａｇ５ ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮで免疫したマウスの血清によるＲａｔ１細胞上
のＰＣ−ＬＥＣＴＩＮの細胞表面認識を、フローサイトメトリーにより分析した
。Ｒａｔ１−ｎｅｏ細胞またはＲａｔ１−ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ細胞（５×１０5
）を、１％ ＦＢＳおよび０．００２％ ＮａＮ３を含むＰＢＳ（フロー緩衝液
）中のＴａｇ５ ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮで免疫したマウスの血清の１：２０００希
釈物とともに氷上で１時間インキュベートした。細胞を、氷冷フロー緩衝液で２
回洗浄し、次いで抗マウスＩｇＧ−ＦＩＴＣ結合体の１：２０００希釈物ととも
に氷上で３０分間インキュベートした。細胞を、フロー緩衝液で２回洗浄し、そ
して１％パラホルムアルデヒドを含むＰＢＳ中に再懸濁した。次いで、各サンプ
ル由来の３，０００個の細胞を、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮの細胞表面染色についてフ
ローサイトメトリーにより分析した。結果を図１２に示す。
【０１９７】 ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮの細胞表面発現を、ホルマリン固定しパラフィン包埋した
細胞ペレットの免疫組織化学分析を使用してさらに分析した。ＰＣ−ＬＥＣＴＩ
Ｎでトランスフェクトした２９３Ｔ細胞を、７．５μｇ／ｍｌのウサギポリクロ
ーナル抗体（ＳＨＩＥＲ ＩＩ前処理）で標識した。ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮの細胞
表面発現を、図１３に示すように検出した。この抗体は、親２９３Ｔ細胞を染色
しなかった。
【０１９８】 （実施例１２：ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮの糖質結合特異性） ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮを、馴化培地から精製したＰＣ−ＬＥＣＴＩＮのＴａｇ５
細胞外ドメインを使用する９６ウェルマイクロアッセイを使用して、糖質結合
特異性について分析した。精製タンパク質調製物上の種々の糖質部分にＰＣ−Ｌ
ＥＣＴＩＮが結合する能力の分析は、高マンノース残基ならびにＮ−アセチルグ
ルコサミンについての特異性を示す。この特異性は、レクチン コンカナバリン
Ａについて観察される特異性と同様である。
【０１９９】 ９６ウェルマイクロタイタープレートのウェルを、ＰＢＳ中１μｇ／ウェルの
適切な糖タンパク質でコートし、そして３７℃で一晩インキュベートする。この
ウェルを、１×Ｔｒｉｓ緩衝化生理食塩水（ＴＢＳ）で１回洗浄し、次いでＰＢ
Ｓ中３％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）で１時間、揺らしながらブロックした。このウェ
ルを、緩衝液コントロール、あるいは２ｍＭ ＣａＣｌ2を補充した１×ＴＢＳ
中の５０ｎｇのＰＣ−ＬＥＣＴＩＮまたは５０ｎｇのコンカナバリンＡ（Ｃｏｎ
Ａ）のいずれかとともにインキュベートした。次いで、このプレートを、室温で
２時間、揺らしながらインキュベートした。次いで、このプレートを、ＴＢＳ、
２ｍＭ ＣａＣｌ2、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０で３回洗浄し、そしてＴＢ
Ｓ、２ｍＭ ＣａＣｌ2で１回洗浄した。次いで、このウェルを、室温で１時間
、各々ＴＢＳ、２ｍＭ ＣａＣｌ2＋１％ ＢＳＡ中で１／１０００に希釈した
、抗Ｈｉｓ６ウサギポリクローナル抗体（ｐＡｂ）（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂ
ｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）（ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ検出のため）または抗ＣｏＡ
ウサギポリクローナル抗体（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（Ｃｏ
ｎＡ検出のため）のいずれかとともにインキュベートした。このウェルを、上記
のように洗浄した。次いで、このウェルを、ＴＢＳ、２ｍＭ ＣａＣｌ2＋１％
ＢＳＡで１／３，０００に希釈した抗ウサギＩｇ ＨＲＰ結合体とともにイン
キュベートした。このウェルをまた洗浄し、次いで、製造業者の指針に従って、
ＴＭＢ ＥＬＩＳＡ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）を使用して発色し、そしてその光学
密度を、４５０ｎＭにて測定した。データが、表１に示され、このデータは、２
連決定の平均値を示す。
【０２００】 （表１．ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ糖質結合特異性）
【０２０１】
【表１】 −：試験せず ＣｏｎＡ：コンカナバリンＡ １：Ｃ−７９１３カルボキシエチルチオエチル２−アセトアミド−２−デオキ
シ−４−ｏ−Ｂ−ｓ−ガラクトピラノシル−ｂ−ｄ−グルコピラノシドＢＳＡ ＧｌｃＮＡｃ：Ｎ−アセチルグルコサミン ＧａｌＮＡｃ：Ｎ−アセチルガラクトサミン ＧａｌＢ１：ガラクトースβ １結合。
【０２０２】 （実施例１３：ＨＬＡ−Ａ２へのＰＣ−ＬＥＣＴＩＮペプチドの推定結合） ヒトＭＨＣクラスＩ分子ＨＬＡ−Ａ２に結合すると推定されるＰＣ−ＬＥＣＴ
ＩＮペプチドを同定するために、５８Ｐ１Ｄ１２（ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ）−Ｆ３
Ｃ４ファミリーメンバータンパク質の完全アミノ酸を、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔ
ｉｃｓ ａｎｄ Ｍｌｅｃｕｌａｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｅｃｔｉｏｎ（ＢＩ
ＭＡＳ）ウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｍａｓ．ｄｃｒｔ．ｎｉｈ．ｇｏｖ
／）中に見出されるＨＬＡ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｍｏｔｉｆ Ｓｅａｒｃｈアルゴ
リズムに入力した。５８Ｐ１Ｄ１２−Ｆ３Ｃ４推定結合ペプチドの結果を、表２
に示す。トップ５にランクする候補を、その位置、各特定のペプチドのアミノ酸
配列、および推定結合スコアとともに示す。この結合スコアは、３７℃、ｐＨ６
．５におけるそのペプチドを含む複合体の解離の推定半減期に対応する。最高の
結合スコアを有するペプチドは、細胞表面上のＨＬＡクラスＩに最も緊密に結合
しており、従って、Ｔ細胞認識についての最良の免疫原性標的を示すと推定され
る。ＨＬＡ−Ａ２へのペプチドの実際の結合は、抗原プロセッシング欠損細胞株
Ｔ２上でのＨＬＡ−Ａ２発現の安定性により評価し得る（Ｘｕｅら、１９９７、
Ｐｒｏｓｔａｔｅ ３０：７３〜８；Ｐｅｓｈｗａら、１９９８、Ｐｒｏｓｔａ
ｔｅ ３６：１２９〜３８）。特定のペプチドの免疫原性を、樹状細胞の存在下
でのＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の刺激によって、インビトロで評
価し得る（Ｘｕｅら、１９９７、Ｐｒｏｓｔａｔｅ ３０：７３〜８；Ｐｅｓｈ
ｗａら、１９９８、Ｐｒｏｓｔａｔｅ ３６：１２９〜３８）。
【０２０３】 （表２．推定ペプチド結合スコア）
【０２０４】
【表２】 （実施例１４：潜在的なシグナル伝達経路の同定） ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮが細胞中の既知のシグナル伝達経路を直接的または間接的
に活性化するか否かを決定するために、ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）を基礎にした
転写レポーターアッセイを、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮを発現する細胞中で実施する。
これらの転写レポーターは、良く特徴付けられたシグナル伝達経路の下流にある
、既知の転写因子のためのコンセンサス結合部位を含む。これらのレポーターお
よびそれらの関連転写因子、シグナル伝達経路、および活性化刺激物の例を、以
下に列挙する。 １．ＮＦκＢ−ｌｕｃ、ＮＦκＢ／Ｒｅｌ；Ｉｋ−キナーゼ／ＳＡＰＫ；成長／
アポトーシス／ストレス ２．ＳＲＥ−ｌｕｃ、ＳＲＦ／ＴＣＦ／ＥＬＫ１；ＭＡＰＫ／ＳＡＰＫ；成長／
分化 ３．ＡＰ−１−ｌｕｃ、ＦＯＳ／ＪＵＮ；ＭＡＰＫ／ＳＡＰＫ／ＰＫＣ；成長／
アポトーシス／ストレス ４．ＡＲＥ−ｌｕｃ、アンドロゲンレセプター；ステロイド類／ＭＡＰＫ；成長
／分化／アポトーシス ５．ｐ５３−ｌｕｃ、ｐ５３；ＳＡＰＫ；成長／分化／アポトーシス ６．ＣＲＥ−ｌｕｃ、ＣＲＥＢ／ＡＴＦ２；ＰＫＡ／ｐ３８；成長／アポトーシ
ス／ストレス。
【０２０５】 ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ媒介効果を、ｍＲＮＡ発現を示す細胞中でアッセイし得る
。ルシフェラーゼレポータープラスミドを、脂質媒介トランスフェクション（Ｔ
ＦＸ−５０、Ｐｒｏｍｅｇａ）により導入し得る。ルシフェラーゼ活性（相対的
転写活性の指標）を、ルシフェリン基質との細胞抽出物のインキュベーションに
より測定し、そして反応の化学発光がルミノメーター中でモニターする。
【０２０６】 （実施例１５：ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ機能のインビトロアッセイ） 前立腺癌におけるＰＣ−ＬＥＣＴＩＮの発現は、この遺伝子が腫瘍進行および
／または腫瘍開始において機能的役割を有するという証拠を提供する。ＰＣ−Ｌ
ＥＣＴＩＮが、増殖シグナルを活性化することに関与するレセプターとして機能
する可能性がある。ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ機能を、インビトロアプローチを用いて
哺乳動物細胞中で評価し得る。哺乳動物発現には、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮを、ｐｃ
ＤＮＡ ３．１ ｍｙｃ−Ｈｉｓ−タグおよびレトロウイルスベクターｐＳＲα
ｔｋｎｅｏ（Ｍｕｌｌｅｒら、１９９１、ＭＣＢ １１：１７８５）を含む多く
の適切なベクター中にクローン化し得る。このような発現ベクターを用い、ＰＣ
−ＬＥＣＴＩＮを、ＰＣ−３、ＮＩＨ３Ｔ３、ＬＮＣａＰおよび２９３Ｔを含む
いくつかの細胞株で発現し得る。ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮの発現を、抗−ＰＣ−ＬＥ
ＣＴＩＮ抗体およびノザンブロット分析を用いてモニターし得る。
【０２０７】 ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮを発現する哺乳動物細胞株を、いくつかのインビトロアッ
セイおよびインビボアッセイで試験し得、このアッセイには、組織培養中の細胞
増殖，アポトーシスシグナルの活性化、ＳＣＩＤマウスにおける腫瘍形成、およ
び膜侵襲培養系を用いるインビトロ侵襲（ＭＩＣＳ；Ｗｅｌｃｈら、Ｉｎｔ．Ｊ
．Ｃａｎｃｅｒ ４３：４４９−４５７）が含まれる。ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ細胞
表現型を、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮの発現を欠く細胞の表現型と比較する。
【０２０８】 ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮを発現する細胞株はまた、マトリゲルでコートされた多孔
性膜チャンバ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を通る細胞の通過を測定す
ることにより、侵襲特性および遊走特性の改変についてアッセイし得る。向かい
合う側への膜を通る細胞の通過を、カルセイン−Ａｍ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐ
ｒｏｂｅｓ）を負荷したインジケーター（ｉｎｄｉｃａｔｏｒ）細胞を用いる蛍
光アッセイ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｂｕｌ
ｌｅｔｉｎ ＃４２８）を用いてモニターする。分析される細胞株は、親および
ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮを過剰発現する、ＰＣ３細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞ならびにＬ
ＮＣａＰ細胞を含む。ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ発現細胞が化学誘引物質の性質を有す
るか否かを決定するために、インジケーター細胞を、コントロール培地に比較し
てＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ馴化培地の勾配に向かっての多孔性膜を通る通過について
モニターする。このアッセイはまた、候補の癌治療組成物によるＰＣ−ＬＥＣＴ
ＩＮで誘導される効果の特異的中和を定性および定量するために用い得る。
【０２０９】 ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮの機能は、上記の種々の機能的アッセイ（例えば、成長、
侵襲および移動）と連結された抗アンチセンスＲＮＡ技術を用いて評価し得る。
アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドを、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ発現細胞中に導
入し得、それによってＰＣ−ＬＥＣＴＩＮの発現を防ぐ。コントロール細胞およ
びアンチセンス含有細胞を、増殖、侵襲、遊走、アポトーシスおよび転写能力に
ついて分析し得る。ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ発現の損失の局所効果および全身効果を
評価し得る。
【０２１０】 （実施例１６：ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ腫瘍成長促進についてのインビボアッセイ
） 腫瘍細胞増殖に対するＰＣ−ＬＥＣＴＩＮタンパク質の影響を、腫瘍をもつマ
ウス中の遺伝子過剰発現によりインビボで評価し得る。例えば、ＳＣＩＤマウス
に、各脇腹上に、ｔｋＮｅｏ空ベクターまたはＰＣ−ＬＥＣＴＩＮを含む、ＰＣ
３、ＴＳＵＰＲ１、またはＤＵ１４５細胞のいずれか１×１０6を皮下注射し得
る。少なくとも以下の２つの戦略を用い得る：（１）ポリオーマウイルス、鶏痘
ウイルス（１９８９年７月５日に公開されたＵＫ２，２１１，５０４）、アデノ
ウイルス（例えば、アデノウイルス２）、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウ
イルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスおよびシミ
アンウイルス４０（ＳＶ４０）のようなウイルスのゲノムから得られた構成的プ
ロモーター、または異種哺乳動物プロモーター（例えばアクチンプロモーターま
たは免疫グロブリンプロモーター（このようなプロモーターが宿主細胞系と適合
するという条件で）から得られた構成的プロモーターのような、プロモーターの
調節下での構成的ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ発現、および（２）（このようなプロモー
ターが宿主細胞系と適合するという条件で）ｅｃｄｙｓｏｎｅ、ｔｅｔなどのよ
うな、誘導性ベクター系の制御下の調節発現。次いで、腫瘍容積を、触知可能な
腫瘍の出現時にモニターし、そして、経時的に、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ発現細胞が
、より速い速度で成長するか否か、およびＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ発現細胞により生
成される腫瘍が、改変された攻撃性の特徴（例えば、増大した転移、血管形成、
化学的治療薬物に対して減少した応答性）を示すか否かを測定する。さらに、マ
ウスに、１×１０5の同じ細胞を同所移植し得、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮが、前立腺
における局所成長に対する影響、または特に肺、リンパ節、および骨髄に転移す
る細胞の能力に対する影響を、有するか否かを決定する。
【０２１１】 このアッセイはまた、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ内部抗体（ｉｎｔｒａｂｏｄｙ）、
ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮアンチセンス分子およびリボザイムのような、候補治療組成
物のＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ阻害効果を決定するために有用である。
【０２１２】 （実施例１７：細胞下（ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ）画分中のＰＣ−ＬＥＣＴＩ
Ｎ発現のウェスタン分析） ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮの配列分析は、２つのＣ型レクチンドメインおよび膜貫通
ドメインの存在を示した。ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮの細胞位置は、細胞生物学で広く
用いられる細胞下分画技法を用いて評価し得る（Ｓｔｏｒｒｉｅ Ｂら、Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９９０；１８２：２０３−２５）。前立腺細胞株
を、核画分、細胞質ゾル画分および膜画分に分離し得る。異なる画分中のＰＣ−
ＬＥＣＴＩＮ発現を、ウェスタンブロッティング技法を用いて試験し得る。
【０２１３】 あるいは、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮの細胞下局在化を決定するために、２９３Ｔ細
胞を、ＨＩＳタグ化ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮをコードする発現ベクター（ＰＣＤＮＡ
３．１ ＭＹＣ／ＨＩＳ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でトランスフェクトし得る
。このトランスフェクトされた細胞を収集し、そして先に記載のように（Ｐｅｍ
ｂｅｒｔｏｎ、Ｐ．Ａ．ら、１９９７、Ｊ ｏｆ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ ａｎｄ Ｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４５：１６９７−１７０６）、差次
的細胞下分画プロトコルに供し得る。このプロトコルは、細胞を、核、重い膜（
リソソーム、ペルオキシソーム、およびミトコンドリア）、軽い膜（原形質膜お
よび小胞体）、および可溶性タンパク質について濃縮された画分に分割する。
【０２１４】 本出願を通じて、種々の刊行物が参照されている。これらの刊行物の開示は、
それらの全体が本明細書に参考として援用されている。
【０２１５】 本発明は、本明細書に開示される実施形態により範囲を限定されるべきではな
い。これら実施形態は、本発明の個々の局面の単なる例示として意図され、そし
て機能的に等価であるすべてのものが、本発明の範囲内にある。本明細書に記載
のモデルおよび方法に加えて、本発明のモデルおよび方法に対する種々の改変が
、上記の記述および教示から当業者に明らかとなり、そして本発明の範囲内にあ
ることが同様に意図される。このような改変またはその他の実施の形態は、本発
明の真の範囲および趣旨から逸脱することなく実施され得る。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ遺伝子をコードする全長ｃＤＮＡのヌクレオチド（配列番
号１）および推定アミノ酸（配列番号２）の配列。開始メチオニンおよび推定Ｋ
ｏｚａｋ配列は、太字で示し、Ｎ末端シグナル配列は、四角で囲んで示し、Ｃ型
レクチンドメインは、四角で囲んで影を付し、膜貫通ドメインには下線を付した
。
【図２Ａ】 ヒトＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ遺伝子のアミノ酸配列（配列番号２）の、ハムスター
ライリンの報告された配列（配列番号３；ＢｏｒｏｗｓｋｙおよびＨｙｎｅｓ、
Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ：１４３：４２−４２，１９９８）とのアラインメント
。
【図２Ｂ】 ヒトＰＣ−ＬＥＣＴＩＮのｃＤＮＡ（配列番号４）のハムスターライリン（配
列番号５；ＢｏｒｏｗｓｋｙおよびＨｙｎｅｓ、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ：１４
３：４２−４２，１９９８）の報告されたｃＤＮＡ配列とのヌクレオチド配列ア
ラインメント（ＢＣＭ Ｓｅａｒｃｈ ＬａｕｎｃｈｅｒからのＬＡＬＩＧＮを
使用）。
【図２Ｃ】 ヒトＰＣ−ＬＥＣＴＩＮのｃＤＮＡ（配列番号４）のハムスターライリン（配
列番号５；ＢｏｒｏｗｓｋｙおよびＨｙｎｅｓ、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ：１４
３：４２−４２，１９９８）の報告されたｃＤＮＡ配列とのヌクレオチド配列ア
ラインメント（ＢＣＭ Ｓｅａｒｃｈ ＬａｕｎｃｈｅｒからのＬＡＬＩＧＮを
使用）。
【図３Ａ】 前立腺癌異種移植片、正常前立腺、ならびに他の組織および細胞株におけるＰ
Ｃ−ＬＥＣＴＩＮ遺伝子発現のＲＴ−ＰＣＲ分析。前立腺癌異種移植片における
発現を示す。レーン１は脳である；レーン２は前立腺である；レーン３はＬＡＰ
Ｃ−４ ＡＤである；レーン４はＬＡＰＣ−４ ＡＩである；レーン５はＬＡＰ
Ｃ−９ ＡＤである；レーン６はＬＡＰＣ−９ ＡＩである；レーン７はＨｅＬ
ａ細胞である；そしてレーン８はネガティブコントロールである。
【図３Ｂ】 種々の組織におけるＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ遺伝子発現のＲＴ−ＰＣＲ分析。３０
サイクルでの胎盤における低レベルの発現を示す。レーン１は脳である；レーン
２は心臓である；レーン３は腎臓である；レーン４は肝臓である；レーン５は肺
である；レーン６は膵臓である；レーン７は胎盤である；そしてレーン８は骨格
筋である。
【図３Ｃ】 正常前立腺およびその他の組織におけるＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ遺伝子発現のＲＴ
−ＰＣＲ分析。増幅の２５サイクルでの正常精巣のみにおける発現および３０サ
イクルでの前立腺および脾臓における低レベルの発現を示す。レーン１は結腸で
ある；レーン２は卵巣である；レーン３は白血球である；レーン４は前立腺であ
る；レーン５は小腸である；レーン６は脾臓である；レーン７は精巣である；そ
してレーン８は胸腺である。
【図４Ａ】 種々の正常ヒト組織におけるＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ発現のノーザンブロット分析
。これらの正常組織においてＰＣ−ＬＥＣＴＩＮの発現がないことを示す。レー
ン１は心臓である；レーン２は脳である；レーン３は胎盤である；レーン４は肺
である；レーン５は肝臓である；レーン６は骨格筋である；レーン７は腎臓であ
る；そしてレーン８は膵臓である。
【図４Ｂ】 種々の正常ヒト組織におけるＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ発現のノーザンブロット分析
。正常組織におけるＰＣ−ＬＥＣＴＩＮの精巣特異的発現を示す。レーン１は脾
臓である；レーン２は胸腺である；レーン３は前立腺である；レーン４は精巣で
ある；レーン５は卵巣である；レーン６は小腸である；レーン７は結腸である；
そしてレーン８は白血球である。
【図４Ｃ】 前立腺癌異種移植片におけるＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ発現のノーザンブロット分析
。全ての前立腺癌異種移植片において高レベルの発現を示し、進行した転移前立
腺癌異種移植片ＬＡＰＣ−９ ＡＤにおいて極めて高レベルの発現を示す。レー
ン１はＬＡＰＣ−４ ＡＤである；レーン２はＬＡＰＣ−４ ＡＩである；レー
ン３はＬＡＰＣ−９ ＡＤである；そしてレーン４はＬＡＰＣ−９ ＡＩである
。
【図５】 ＳＳＨフラグメントプローブを使用しての前立腺癌異種移植片におけるＰＣ−
ＬＥＣＴＩＮのノーザンブロット分析。結果は、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮが、マウス
の骨内において皮下（ｓｃ）または脛骨内（ｉｔ）のいずれかで増殖させた腫瘍
において高度に発現されていることを示す。レーン１〜３はＬＡＰＧ−９ ＡＤ
ｓｃである；レーン４〜６はＬＡＰＣ−９ＡＤｉｔである。
【図６】 去勢後２８日の雄（レーン２）の腫瘍におけるＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ／５８Ｐ１
Ｄ１２のノーザンブロット発現分析を、インタクトな雄（レーン１）の腫瘍にお
ける発現と比較した。発現は、去勢した雄由来の腫瘍において劇的に減少した。
コントロールとして、公知のアンドロゲン調節遺伝子、ＴＭＰＲＳＳ２の発現も
また、去勢後にダウンレギュレートされていることを示した。これらのデータは
、前立腺腫瘍におけるＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ発現が、アンドロゲンの存在に依存し
ていることを示唆する。
【図７】 ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ抗原の細胞表面局在化。抗Ｈｉｓモノクローナル抗体を使
用して、６Ｈｉｓタグ化ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ（レーン２）をコードするｃＤＮＡ
を含有するベクターでトランスフェクトしたストレプトアビジンセファロース精
製した細胞表面ビオチン化２９３Ｔ細胞の現像したウエスタンブロットの写真で
ある。ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮタンパク質は、同じベクター（レーン１）でトランス
フェクトした非ビオチン化細胞由来のストレプトアビジン沈降物において検出さ
れなかった。分子量マーカーは、キロダルトン（ｋＤ）で示す。
【図８Ａ】 馴化培地において抗ＨＩＳ抗体は分泌した組換えＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ／５８Ｐ
１Ｄ１２−ＡＰ融合タンパク質を認識することを示すウエスタンブロット。レー
ンには、培地取り替え後４時間で回収したＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ／５８Ｐ１Ｄ１２
−ＡＰでトランスフェクトした非改変２９３Ｔ細胞または２９３Ｔ細胞由来の２
０μｌの馴化培地が含まれる。
【図８Ｂ】 抗アルカリホスファターゼ抗体もまた、馴化培地中に分泌された組換えＰＣ−
ＬＥＣＴＩＮ／５８Ｐ１Ｄ１２−ＡＰ融合タンパク質を認識することを示すウエ
スタンブロット。レーンは、図８Ａに示されるように、培地取り替え後４時間で
回収したＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ／５８Ｐ１Ｄ１２−ＡＰでトランスフェクトした非
改変２９３Ｔ細胞または２９３Ｔ細胞由来の２０μｌの馴化培地を含有する。
【図９】 （図９Ａ）ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮの細胞外ドメインの発現および精製。２９３Ｔ
細胞を、Ｃ末端６×Ｈｉｓタグを有するＰＣ−ＬＥＣＴＩＮの細胞外ドメインを
コードするＴａｇ５分泌発現ベクターでトランスフェクトした。馴化培地を、Ｎ
ｉ−ＮＴＡアガロース（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、固定化金属アフィニティー
クロマトグラフィーに供した。出発馴化培地、フロースルー、および溶出した精
製材料を、１０〜２０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルおよび銀染色上で泳動した。（
図９Ｂ）図９Ａについて記載されたようにトランスフェクトした２９３Ｔ細胞由
来の馴化培地を、１０〜２０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上にて泳動し、そしてニ
トロセルロースに移し、そして抗ＨｉｓｐＡｂを使用してウエスタンブロットに
供した。
【図１０Ａ】 Ｒａｔ１−ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ細胞由来のＰＣ−ＬＥＣＴＩＮの免疫沈降。ｎ
ｅｏコントロールウイルスまたはＰＣ−ＬＥＣＴＩＮをコードするウイルスのい
ずれかに安定に感染したＲａｔ１細胞を、精製したＴａｇ５−ＰＣ−ＬＥＣＴＩ
Ｎタンパク質で精製したマウス由来の血清により免疫沈降に供した。ウエスタン
ブロット分析を、アフィニティー精製ウサギ抗ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮペプチドｐＡ
ｂを使用して行った。
【図１０Ｂ】 ウエスタンブロット分析が１：１０００希釈の免疫化マウス血清で行われたこ
とを除き、図１０Ａに記載されるようなＲａｔ１−ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ細胞由来
のＰＣ−ＬＥＣＴＩＮの免疫沈降。
【図１１】 組換え細胞株および精巣におけるＰＣ−ＬＥＣＴＩＮの発現。ｐＣＤＮＡ３．
１Ｍｙｃ／Ｈｉｓ ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮまたは空のベクターのいずれかで一過的
にトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞の細胞溶解物およびｎｅｏコントロール
もしくはＰＣ−ＬＥＣＴＩＮレトロウイルスのいずれかに安定に感染したＲａｔ
１細胞の細胞溶解物および正常精巣の細胞溶解物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって
分離し、そしてウエスタンブロット分析のためにニトロセルロースに移した。矢
印で示したのは、全長ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮを表す４７ｋＤのバンド、４０ｋＤの
細胞外ドメイン、および５５ｋＤのＭｙｃ／Ｈｉｓタグ化タンパク質である。
【図１２】 フローサイトメトリーを使用したＲａｔ１細胞上でのＴａｇ５ ＰＣ−ＬＥＣ
ＴＩＮ免疫化マウス血清でのＰＣ−ＬＥＣＴＩＮの細胞表面認識。Ｒａｔ１−ｎ
ｅｏ（空白部分）またはＲａｔ１−ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ細胞（５×１０5；影を
付した部分）のいずれかを、１：２０００希釈のＴａｇ５ ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ
免疫化マウス血清とともにインキュベートした。各サンプルからの３，０００個
の細胞を、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮの細胞表面染色についてフローサイトメトリーに
よって分析した。事象の数は、相対的な蛍光の関数としてプロットされる。
【図１３】 ウサギポリクローナル抗体で標識したＰＣ−ＬＥＣＴＩＮトランスフェクト２
９３Ｔ細胞の免疫組織化学分析。これは、ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮの細胞表面発現を
示す。抗体は、親２９３Ｔ細胞を染色しない。
【図１４】 多組織ＲＮＡドットブロット（５０サンプル）を使用して分析したＰＣ−ＬＥ
ＣＴＩＮの発現。結果は、精巣中での５８Ｐ１Ｄ１２のみの有意な発現を示す。
より低い発現もまた、唾液腺、胎児腎臓、および胎児脾臓において検出された。
そのブロットもまた、その他の領域において外来性のシグナルを示し、それらは
特異的シグナルの列および行の間にあるから、非特異的であるようである。位置
は、以下の組織を表す：Ａ１脳；Ａ２扁桃体；Ａ３尾状核；Ａ４小脳；Ａ５大脳
皮質；Ａ６前頭葉；Ａ７海馬；Ａ８延髄；Ｂ１後頭葉；Ｂ２被殻；Ｂ３黒質；Ｂ
４側頭葉；Ｂ５視床；Ｂ６視床下核；Ｂ７脊髄；Ｃ１心臓；Ｃ２大動脈；Ｃ３骨
格筋；Ｃ４結腸；Ｃ５膀胱；Ｃ６子宮；Ｃ７前立腺；Ｃ８胃；Ｄ１精巣；Ｄ２卵
巣；Ｄ３膵臓；Ｄ４下垂体；Ｄ５副腎；Ｄ６甲状腺；Ｄ７唾液腺；Ｄ８乳腺；Ｅ
１腎臓；Ｅ２肝臓；Ｅ３小腸；Ｅ４脾臓；Ｅ５胸腺；Ｅ６末梢白血球；Ｅ７リン
パ節；Ｅ８骨髄；Ｆ１虫垂；Ｆ２肺；Ｆ３気管；Ｆ４胎盤；Ｇ１胎児脳；Ｇ２胎
児心臓；Ｇ３胎児腎臓；Ｇ４胎児肝臓；Ｇ５胎児脾臓；Ｇ６胎児胸腺；Ｇ７胎児
肺。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 39/395 Ａ６１Ｋ 48/00 ４Ｃ０８５ 48/00 Ａ６１Ｐ 35/00 ４Ｃ０８６ Ａ６１Ｐ 35/00 Ｃ０７Ｋ 14/47 ４Ｃ０８７ Ｃ０７Ｋ 14/47 16/18 ４Ｈ０４５ 16/18 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/19 1/19 1/21 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 5/10 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｑ 1/02 21/08 1/68 Ａ Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 1/68 Ｍ Ｇ０１Ｎ 33/53 33/566 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/566 5/00 Ａ Ｂ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ， ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ジャコボヴィツ， アヤ アメリカ合衆国 カリフォルニア 90210， ビバリー ヒルズ， ハットン ドライ ブ 3135 (72)発明者 ライタノ， アーサー ビー． アメリカ合衆国 カリフォルニア 90064， ロス アンゼルス， クシュドン アベ ニュー 10807 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA21 CA04 CA06 DA02 EA02 EA04 FA02 FA10 GA11 HA17 4B063 QA01 QQ43 QR32 QR55 QS34 4B064 AG02 AG27 CA10 CA19 CC24 DA01 DA14 4B065 AA90X AA99Y AB01 AC14 BA02 CA24 CA25 CA44 4C084 AA02 AA06 AA07 AA13 BA35 CA53 CA56 DA31 MA17 MA66 NA14 ZB261 4C085 AA03 AA14 BB01 BB11 CC05 DD22 DD23 DD61 EE01 4C086 AA01 AA02 AA03 EA16 MA04 MA66 NA14 ZB26 4C087 AA01 AA02 AA03 BB64 BB65 BC83 MA66 NA14 ZB26 4H045 AA10 AA11 AA30 BA10 CA41 DA01 DA75 EA22 EA28 EA51 FA74

Claims (39)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮポリペプチドをコードするポリヌクレオ
    チドであって、該ポリヌクレオチドが以下からなる群より選択される、ポリヌク
    レオチド： （ａ）配列番号１に示される配列を有するポリヌクレオチドであって、ＴがＵ
    でもあり得る、ポリヌクレオチド； （ｂ）配列番号１に示される配列のヌクレオチド残基番号２０１〜ヌクレオチ
    ド残基番号２３７８を有するポリヌクレオチドであって、ＴがＵでもあり得る、
    ポリヌクレオチド； （ｃ）ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであっ
    て、該ポリペプチドの配列が、アメリカンタイプカルチャーコレクションに受託
    番号２０７１５２として寄託されたｐ５８Ｐ１Ｄ１２−２と称されるプラスミド
    に含まれるｃＤＮＡによりコードされる、ポリヌクレオチド； （ｄ）配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するＰＣ−ＬＥＣＴＩＮタンパ
    ク質をコードするポリヌクレオチド；および （ｅ）（ａ）〜（ｄ）のいずれか１つのポリヌクレオチドに十分相補的なポリ
    ヌクレオチド。
  2. 【請求項２】 配列番号２に示されるアミノ酸配列に対してその長さ全体に
    わたり少なくとも９０％同一であるポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチ
    ド。
  3. 【請求項３】 請求項１に記載のポリヌクレオチドのフラグメントであって
    、以下を含む、ポリヌクレオチド： （ａ）配列番号１に示される配列の、ヌクレオチド残基番号４４３〜ヌクレオ
    チド残基番号１０１８、ヌクレオチド残基番号４４３〜ヌクレオチド残基番号１
    ２０１、ヌクレオチド残基番号５０９〜ヌクレオチド残基番号５６２、ヌクレオ
    チド残基番号８７２〜ヌクレオチド残基番号９１３、またはヌクレオチド残基番
    号１０１９〜ヌクレオチド残基番号１０８７を有する、ポリヌクレオチド； （ｂ）長さが少なくとも２０ヌクレオチド塩基である（ａ）のポリヌクレオチ
    ドのフラグメントである、ポリヌクレオチド；あるいは （ｃ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下で
    選択的にハイブリダイズする、ポリヌクレオチド。
  4. 【請求項４】 ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮポリペプチドをコードするポリヌクレオ
    チドであって、該ポリペプチドは以下からなる群より選択されるアミノ酸配列を
    含む、ポリヌクレオチド：ＮＬＴＫ（配列番号３３）、ＮＱＳＴ（配列番号３４
    ）、ＲＫＥＳ（配列番号３５）、ＳＳＲ、ＳＥＫ、ＳＴＲ、ＴＲＫ、ＳＦＱＥ（
    配列番号３６）、ＳＤＧＤ（配列番号３７）、ＴＲＫＥ（配列番号３８）、ＳＧ
    ＭＥ（配列番号３９）、ＧＱＫＶＣＦ（配列番号４０）、ＧＶＬＬＳＬ（配列番
    号７１）、ＧＴＧＩＳＤ（配列番号４２）、ＧＩＳＤＧＤ（配列番号４３）、Ｇ
    ＬＷＲＮＧ（配列番号４４）、ＧＱＴＳＧＡ（配列番号４５）、ＧＳＥＫＣＶ（
    配列番号４６）、ＧＩＩＰＮＬ（配列番号４７）、ＧＬＷＲＮＧＤＧＱＴＳＧＡ
    Ｃ（配列番号２５）、ＧＧＰＹＬＹＱＷＮＤＤＲＣＮＭ（配列番号２６）、ＥＡ
    ＲＬＡＣＥＳＥＧＧＶＬＬ（配列番号２７）、ＷＩＧＦＴＹＫＴＡ（配列番号６
    ）、ＡＴＧＥＨＱＡＦＴ（配列番号７）、ＦＧＮＣＶＥＬＱＡ（配列番号８）、
    ＮＣＶＥＬＱＡＳＡ（配列番号９）、およびＤＮＨＧＦＧＮＣＶ（配列番号１０
    ）。
  5. 【請求項５】 検出可能なマーカーで標識されている、請求項１〜４のいず
    れか１項に記載のポリヌクレオチド。
  6. 【請求項６】 請求項１〜４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含
    む、組換え発現ベクター。
  7. 【請求項７】 請求項６に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
  8. 【請求項８】 ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮポリペプチドを生成するためのプロセス
    であって、請求項７に記載の宿主細胞を該ポリペプチドの生成に十分な条件下で
    培養する工程を包含する、プロセス。
  9. 【請求項９】 前記のように生成された前記ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮポリペプチ
    ドを回収する工程をさらに包含する、請求項８に記載のプロセス。
  10. 【請求項１０】 請求項８に記載のプロセスにより生成された、ＰＣ−ＬＥ
    ＣＴＩＮポリペプチド。
  11. 【請求項１１】 請求項１〜４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドに
    よりコードされるＰＣ−ＬＥＣＴＩＮポリペプチド。
  12. 【請求項１２】 請求項１１に記載のポリペプチドのうちの少なくとも１５
    個連続するアミノ酸を含む、ポリペプチド。
  13. 【請求項１３】 請求項１０〜１２のいずれか１項に記載のＰＣ−ＬＥＣＴ
    ＩＮポリペプチドに特異的に結合する、抗体またはそのフラグメント。
  14. 【請求項１４】 モノクローナルである、請求項１３に記載の抗体またはそ
    のフラグメント。
  15. 【請求項１５】 請求項１４に記載のモノクローナル抗体の抗原結合領域を
    含む、組換えタンパク質
  16. 【請求項１６】 検出可能なマーカーで標識されている、請求項１３もしく
    は１４に記載の抗体またはそのフラグメント、あるいは請求項１５に記載の組換
    えタンパク質。
  17. 【請求項１７】 請求項１６に記載の抗体またはそのフラグメントあるいは
    組換えタンパク質であって、前記検出可能なマーカーが、放射性同位体、蛍光化
    合物、生体発光化合物、化学発光化合物、金属キレート剤および酵素からなる群
    より選択される、抗体またはそのフラグメントあるいは組換えタンパク質。
  18. 【請求項１８】 Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）2フラグメント、Ｆｖ
    フラグメントまたはｓＦｖフラグメントである、請求項１３に記載の抗体フラグ
    メント。
  19. 【請求項１９】 ヒト抗体である、請求項１３〜１８のいずれか１項に記載
    の抗体またはそのフラグメント。
  20. 【請求項２０】 毒素または治療薬剤に結合体化されている、請求項１３〜
    １８のいずれか１項に記載の抗体またはそのフラグメント。
  21. 【請求項２１】 マウス抗原結合領域残基およびヒト抗体残基を含む、請求
    項１３〜１６のいずれか１項に記載の抗体。
  22. 【請求項２２】 請求項１４に記載のモノクローナル抗体を生成する、トラ
    ンスジェニック動物。
  23. 【請求項２３】 請求項１４に記載のモノクローナル抗体を生成する、ハイ
    ブリドーマ。
  24. 【請求項２４】 請求項１４に記載のモノクローナル抗体の重鎖の可変ドメ
    インおよび軽鎖の可変ドメインを含む、単鎖モノクローナル抗体。
  25. 【請求項２５】 請求項２４に記載の単鎖モノクローナル抗体をコードする
    ポリヌクレオチドを含む、ベクター。
  26. 【請求項２６】 生物学的サンプルにおけるＰＣ−ＬＥＣＴＩＮタンパク質
    の存在を検出するためのアッセイであって、該アッセイは、該サンプルと、請求
    項１６または１７に記載の抗体またはそのフラグメントあるいは組換えタンパク
    質とを接触させる工程、および該抗体またはそのフラグメントあるいは組換えタ
    ンパク質への、該サンプルにおけるＰＣ−ＬＥＣＴＩＮタンパク質の結合を検出
    する工程、を包含する、アッセイ。
  27. 【請求項２７】 生物学的サンプルにおけるＰＣ−ＬＥＣＴＩＮポリヌクレ
    オチドの存在を検出するためのアッセイであって、該アッセイは、以下の工程： （ａ）該サンプルと、請求項１に記載のポリヌクレオチドに特異的にハイブリ
    ダイズするポリヌクレオチドプローブとを接触させる工程；および （ｂ）該プローブと該サンプル中のＰＣ−ＬＥＣＴＩＮポリヌクレオチドとの
    該ハイブリダイゼーションにより形成されたハイブリダイゼーション複合体の存
    在を検出する工程であって、該ハイブリダイゼーション複合体の存在が該サンプ
    ル内のＰＣ−ＬＥＣＴＩＮポリヌクレオチドの存在を示す、工程、 を包含する、アッセイ。
  28. 【請求項２８】 生物学的サンプルにおけるＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ ｍＲＮＡ
    の存在を検出するためのアッセイであって、該アッセイは、以下： （ａ）少なくとも１つのプライマーを用いて逆転写することにより、該サンプ
    ルからｃＤＮＡを生成する工程； （ｂ）該サンプル中でＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ ｃＤＮＡを増幅するためのセンス
    プライマーおよびアンチセンスプライマーとしてＰＣ−ＬＥＣＴＩＮポリヌクレ
    オチドを使用して、上記のように生成した該ｃＤＮＡを増幅する工程； （ｃ）該増幅したＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ ｃＤＮＡの存在を検出する工程、 を包含し、 該センスプローブおよびアンチセンスプローブとして使用される該ＰＣ−ＬＥＣ
    ＴＩＮポリヌクレオチドが、アメリカンタイプカルチャーコレクションに受託番
    号２０７１５２として寄託されたプラスミドｐ５８Ｐ１Ｄ１２−２内に含まれる
    ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ ｃＤＮＡを増幅し得る、アッセイ。
  29. 【請求項２９】 ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮタンパク質を発現する癌の存在を検出
    する方法であって、該方法は、個体由来の試験組織サンプル中の細胞により発現
    されたＰＣ−ＬＥＣＴＩＮタンパク質のレベルを決定する工程、および上記のよ
    うに決定されたレベルを、対応する正常サンプルにおいて発現されたＰＣ−ＬＥ
    ＣＴＩＮのレベルと比較する工程を包含し、該試験サンプルにおける、該正常サ
    ンプルに対して上昇したＰＣ−ＬＥＣＴＩＮタンパク質の存在が、該個体におけ
    るこのような癌の存在の指標を提供する、方法。
  30. 【請求項３０】 ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ遺伝子産物をモニターする方法であっ
    て、該方法は、個体由来の試験組織サンプル中の細胞により発現されたＰＣ−Ｌ
    ＥＣＴＩＮ遺伝子産物の状態を決定する工程、および上記のように決定された該
    状態を、対応する正常サンプルにおけるＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ遺伝子産物の状態と
    比較する工程を包含し、該試験サンプルにおける、該正常サンプルに対して異常
    なＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ遺伝子産物の存在が該個体内の細胞増殖の調節不全の指標
    を提供する、方法。
  31. 【請求項３１】 個体における癌の存在を診断するためのデータを提供する
    方法であって、該方法は、以下の工程： （ａ）該個体から得られた試験サンプルにおいて発現されたＰＣ−ＬＥＣＴＩ
    Ｎ ｍＲＮＡのレベルを決定する工程；および （ｂ）上記のように決定されたレベルを、既知の比較用正常組織サンプルにお
    いて発現されたＰＣ−ＬＥＣＴＩＮ ｍＲＮＡのレベルと比較する工程、 を包含し、該試験サンプルにおける、該正常組織サンプルに対して上昇したＰＣ
    −ＬＥＣＴＩＮ ｍＲＮＡ発現の存在が癌の存在の指標を提供する、方法。
  32. 【請求項３２】 個体における癌の存在を診断するためのデータを提供する
    方法であって、該方法は、以下の工程： （ａ）該個体から得られた試験サンプルにおいて発現されたＰＣ−ＬＥＣＴＩ
    Ｎタンパク質のレベルを決定する工程；および （ｂ）上記のように決定されたレベルを、既知の比較用正常組織サンプルにお
    いて発現されたＰＣ−ＬＥＣＴＩＮタンパク質のレベルと比較する工程、 を包含し、該試験サンプルにおける、該正常組織サンプルに対して上昇したＰＣ
    −ＬＥＣＴＩＮタンパク質の存在が癌の存在の指標を提供する、方法。
  33. 【請求項３３】 請求項３１または３２に記載の方法であって、前記癌が前
    立腺癌であり、そして前記試験組織サンプルおよび正常組織サンプルが、前立腺
    組織、骨組織、リンパ組織、血清、血液および精液からなる群より選択される、
    方法。
  34. 【請求項３４】 ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮを発現する癌に罹患した患者を処置す
    るための組成物の調製のための、請求項２５のベクターの使用、請求項１に記載
    のポリヌクレオチドに相補的なアンチセンスポリヌクレオチドの使用、請求項１
    に記載のポリヌクレオチドを切断し得るリボザイムの使用、または請求項１３〜
    ２１のうちのいずれか１項に記載の抗体もしくはそのフラグメントの使用。
  35. 【請求項３５】 ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮを発現する癌を処置するための組成物
    の調製のための、請求項１０もしくは１１に記載のＰＣ−ＬＥＣＴＩＮポリペプ
    チドまたはその免疫原性部分の使用。
  36. 【請求項３６】 請求項３４または３５に記載の使用であって、前記癌が、
    前立腺癌、乳癌、膀胱癌、肺癌、骨の癌、結腸癌、膵臓癌、精巣癌、子宮頸部癌
    および卵巣癌からなる群より選択される、使用。
  37. 【請求項３７】 薬学的組成物であって、 請求項１０もしくは１１に記載のＰＣ−ＬＥＣＴＩＮポリペプチドまたはその
    免疫原性部分、請求項２５に記載のベクター、請求項１に記載のポリヌクレオチ
    ドに相補的なアンチセンスポリヌクレオチド、請求項１に記載のポリヌクレオチ
    ドを切断し得るリボザイム、あるいは請求項１３〜２０のうちのいずれか１項に
    記載の抗体またはそのフラグメント を含む、薬学的組成物。
  38. 【請求項３８】 ＰＣ−ＬＥＣＴＩＮを発現する癌の処置のためのワクチン
    組成物であって、請求項１０もしくは１１に記載のＰＣ−ＬＥＣＴＩＮポリペプ
    チドの免疫原性部分を含有する、ワクチン組成物。
  39. 【請求項３９】 請求項３７に記載の薬学的組成物または請求項３８に記載
    のワクチン組成物であって、生理学的に受容可能なキャリアをさらに含有する、
    組成物。
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