CN1379819A - 具有催化活性的重组memapsin蛋白酶及其应用方法 - Google Patents

具有催化活性的重组memapsin蛋白酶及其应用方法 Download PDF

Info

Publication number
CN1379819A
CN1379819A CN00810930A CN00810930A CN1379819A CN 1379819 A CN1379819 A CN 1379819A CN 00810930 A CN00810930 A CN 00810930A CN 00810930 A CN00810930 A CN 00810930A CN 1379819 A CN1379819 A CN 1379819A
Authority
CN
China
Prior art keywords
proteolytic enzyme
inhibitor
substrate
ala
leu
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN00810930A
Other languages
English (en)
Inventor
乔丹·J·N·唐
林欣丽
杰拉尔德·科埃尔施
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Oklahoma Medical Research Foundation
Original Assignee
Oklahoma Medical Research Foundation
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Oklahoma Medical Research Foundation filed Critical Oklahoma Medical Research Foundation
Publication of CN1379819A publication Critical patent/CN1379819A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/10—Tetrapeptides
    • C07K5/1021—Tetrapeptides with the first amino acid being acidic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
    • C07K1/113—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure
    • C07K1/1136—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure by reversible modification of the secondary, tertiary or quarternary structure, e.g. using denaturating or stabilising agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06008—Dipeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/06017—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/06026—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 0 or 1 carbon atom, i.e. Gly or Ala
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06008—Dipeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/06017—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/06034—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 2 to 4 carbon atoms
    • C07K5/06043—Leu-amino acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/08—Tripeptides
    • C07K5/0802—Tripeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/0804—Tripeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/0806—Tripeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 0 or 1 carbon atoms, i.e. Gly, Ala
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6478—Aspartic endopeptidases (3.4.23)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2299/00—Coordinates from 3D structures of peptides, e.g. proteins or enzymes
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A90/00—Technologies having an indirect contribution to adaptation to climate change
    • Y02A90/10—Information and communication technologies [ICT] supporting adaptation to climate change, e.g. for weather forecasting or climate simulation

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

生产提纯的有催化活性的重组memapsin 2蛋白酶(以下简译为M2蛋白酶)的方法已被开发。有催化活性的酶的底物及其取代位点(subsite)的特异性也已被确定。底物和取代位点的特异性信息被用于设计天然M2蛋白酶底物类似物,其可抑制M2蛋白酶功能。此底物类似物是以显示出与M2蛋白酶天然肽底物相关肽的序列为基础的。底物类似物至少包含一个不能被M2蛋白酶剪切的类似的酰胺键。包括在关键氨基酸残基位点上的等配物的两种底物类似物的合成过程已被发现,底物类似物(OMR99－1和OM99－2)已被合成。OM99－2是以八肽[谷氨酸－缬氨酸－天冬酰胺－亮氨酸－丙氨酸－丙氨酸－谷氨酸－苯丙氨酸(序列鉴定号:28)]为基础的,用一过渡状态的等配物羟乙烯基代替了亮氨酸－丙氨酸肽键(图1)。OM99－2的抑制常数相对于重组前M2蛋白酶为1.6×109M。与此抑制物密切关联的M2蛋白酶的晶体学被用于鉴定蛋白质的三维结构以及结合的各种残基的重要性。此信息可被本领域的技术人员应用于使用商业上可得到的软件程序和有机化学及酶学通晓的技术设计新的抑制剂,设计新的M2蛋白酶的抑制剂,也可应用于诊断学以及治疗和(或)预防阿尔茨海默氏症。

Description

具有催化活性的重组MEMAPSIN蛋白酶及其应用方法
本发明的技术背景
本发明表达有催化活性的M2蛋白酶(β-分泌酶)及其在设计和筛选用于阿尔茨海默氏症的治疗和(或)预防的特异性抑制剂方面的应用。
阿尔茨海默氏症(AD)是大脑退行性病变，它是于1907年在检查出一个病人识别能力急剧减退并发展为痴呆之后由AliosAlzheimer首次描述的。[阿尔茨海默氏症早期的故事，Bick等人编辑(Raven出版社，纽约1987)]。它是上了年纪的人痴呆的主要原因。AD患者增进记忆丧失和智力功能的问题，其可发展到不能进行正常人的活动。随着智力的丧失，患者显示出人格的变化、对社会不适当的行为和精神分裂症[认识阿尔茨海默氏症及其相关疾病指南，Joem编辑(纽约大学出版社，纽约，1987年)]。AD对于患者及他们的家庭都是一场灾难，因为对于这样不可避免的神经退行性变还没有有效的缓解或预防性的治疗。
AD与在皮质、海马、脑下脚、海马回和扁桃体的神经斑块有关，其直径可达200μm。神经斑块的主要成分是淀粉样蛋白，它可被刚果红染色[Fisher(1983)；Kelly Microbiol.科学1(9)：214-219(1984)]。被刚果红染色的淀粉样斑块在明亮的视野中是细胞外粉红色或锈色，其在偏振光下为双折射的。斑块由多肽纤维组成，常常存在于血管周围，其减少了对脑中各种神经元的血液供应。
例如遗传素因、感染因子、毒素、金属和头部损伤等各种各样的因素都可被看作AD神经疾病的可能机制。有效的证据极有力地表明，存在AD遗传素因的独特类型。首先，分子分析提供了在某些受AD疾病侵害的家庭淀粉样前蛋白(APP)基因突变的证据[Goate等人，《自然》349：704-706(1991)；Murrell等人，《科学》254：97-99(1991)；Chartier-Harlin等人，《自然》353：844-846(1991)；Mullan等人，《自然遗传学》1：345-347(1992)]。另外的明显的早发病类型的基因位于14号染色体和1号染色体上[Rogaev等人，《自然》376：775-778(1995)；Levy-Lahad等人，《科学》269：973-977(1995)；Sherrington等人，《自然》375：754-760(1995)]。与AD有关的其它位点在19号染色体上，其编码载脂蛋白E的变异类型[Corder，《科学》261：921-923(1993)]。
淀粉样蛋白斑块在AD患者和存活至40岁的唐氏综合症病人大量存在。在年过30岁以上的唐氏综合症患者中，唐氏综合症的APP的过渡表达可被认识为AD发生的可能起因[Rumble等人，《新英格兰医学杂志》320：1446-1452(1989)；Mann等人，《老年神经生物学》10：397-399(1989)]。斑块也存在于正常的衰老的脑中，虽然其数量较少。这些斑块主要由淀粉样蛋白β肽组成(Aβ；有时在文献中也被称为β-淀粉样蛋白肽或β肽)[GlennerWong，《生物化学和生物生理学研究》120：885-890(1984)]，它也是脑血管淀粉样蛋白沉积物的主要蛋白质成分。淀粉样蛋白是丝状物质，其以β褶状薄片排列。Aβ是近43个氨基酸组成的疏水肽。
它的氨基酸序列的鉴定导致克隆APP cDNA[Kang等人，《自然》：325：733-735(1987)；Goldgaber等人，《科学》235：877-880(1987)；Robakis等人，《自然科学学会会刊》84：4190-4194(1987)；Tanzi等人，《自然》331：528-530(1988)]和基因组的APP DNA[Lemaire等人，《核酸研究》17：517-522(1989)；Yoshikai等人《基因》87：257-263(1990)]。有些类型的APP cDNA已被鉴定，其包含有数量最多的三种类型：APP695、APP751和APP770。这些类型是通过交替剪接由单独的前体RNA产生的。基因的全长多于175kb，有18个外显子[Yoshikai等人，(1990)]。APP包含细胞外区域、跨膜区域和细胞质区域。Aβ由恰好在疏水的跨膜区域外面的近28个氨基酸和此跨膜区域的15个残基组成。Aβ正常情况在脑中和例如心脏、肾脏和脾脏的其它组织中发现。但是，Aβ沉积物通常只有在脑中才会大量发现。
Van Broeckhaven等人，《科学》248：1120-1122(1990)，证明了在两个荷兰家族中APP基因与遗传性的有淀粉样变的大脑出血(HCHWA-D)紧密相关。在两个荷兰患者中发现了APP编码区域的点突变使之得到了确认[Levy等人《科学》248：1124-1128(1990)]。此突变在Aβ的22位置(APP695的618位置或APP770的693位置)以谷氨酰胺代替了谷氨酸。除此之外，通过突变导致在蛋白质全长的717位置上的氨基酸替代[Goate等人(1991)；Murrell等人(1991)；Chartier-Harlin等人(1991)]，某些家族从遗传上倾向患阿尔茨海默氏症，这种情况也被称为家族阿尔茨海默氏症(FAD)。这些突变在家族内与疾病是相互分离的，在晚发病的AD家族中不存在这些突变。在氨基酸717的突变增加产生了从APP中Aβ的Aβ1-42类型[Suzuki等人，《科学》264：1336-1340(1994)]。另一个突变类型包含蛋白质全长中670和671位置上氨基酸的变化[Mullan等人，(1992)]。这个氨基酸670和671的突变增加了从APP中Aβ的总量的产生[Citron等人，《自然》360：622-674(1992)].
在活体内，APP在三个位点被加工处理。证据提出，在β-分泌酶位点上由与金属蛋白酶相关膜的剪切是一生理活动。此位点位于离开质膜腔面的APP 12残基。β-分泌酶离质膜腔面28残基位点和β-分泌酶跨膜区域位点的剪切导致产生40/42-残基β-淀粉样蛋白肽(Aβ)，在脑中它的产生数量的提高和积累的增加是阿尔茨海默氏症发病机制的中心活动[参看Selkoe.D.J.《自然》399：23-31(1999)]。Presenilin 1，是在人脑中发现的另外的膜蛋白，在APPβ-分泌酶位点可控制水解，其被假定本身就有所负责的蛋白酶[Wolfe.M.S.等人，《自然》398：513-517(1999)]。Presenilin 1作为单链分子表达，它由蛋白酶——Presenilinase处理，需要防止它快速降解[Thinakaran.G.等人，《神经元》17：181-190(1996)和Podlisny.M.B.等人，《神经生物学》3：325-37(1997)]。Presenilin 1的特性还不得而知。在活体内，β-分泌酶位点的处理加工被认为在Aβ产生上是速率有限的一步[Sinha.S.& Lieberburg.1，《自然科学会会刊》，USA，96：11049-11053(1999)]，因而也是强有力的治疗学的目标。
设计能有效减少淀粉样斑块形成的抑制剂依赖于在剪切APP获得42氨基酸肽——Aβ的Aβ1-42类型中起关键作用的酶的鉴定。虽然有几种酶已被鉴定，但还没有可能生产有活性的酶。没有有活性的酶，就不能确认底物的特异性和测定底物的特异性，也不能测定其动力学和关键有活性位点残基，而所有这些对于设计抑制剂都是最基本的。
M2蛋白酶显示出其为β-分泌酶，它是涉及在人脑中从β-淀粉样前蛋白产生β-淀粉样蛋白肽的关键性蛋白酶[参看Selkoe.D.j.《自然》399：23-31(1999)]。现在普遍认为β-淀粉样肽在人脑中的蓄积是阿尔茨海默氏症的主要病因。专门设计的对M2蛋白酶的抑制剂可抑制或减缓β-淀粉样蛋白的形成和阿尔茨海默氏症病情的进展。
M2蛋白酶属于天冬氨酸蛋白酶类。它在氨基酸序列上与其它真核生物天冬氨酸蛋白酶类似，包含有这类专有的特征序列。这些结构的相似性可以预见M2蛋白酶与其它真核生物天冬氨酸蛋白酶有着共同的催化机制[Davies.D.R.，《生物生理化学年刊》19：189(1990)]。对天冬氨酸酶类最成功的抑制剂是这些酶类过渡状态的仿制品。这些抑制剂具有象底物一样的结构，在羰基碳和酰胺氮之间被剪切的平面肽键由两个四面体的原子{例如：羟乙烯[-CH(OH)-CH2-]}所替代，它最初是在抑胃肽的结构中被发现(Marciniszyn等人，1976)。
但是，对医疗用途更可取的是具有小分子的抑制剂，它能通过血脑屏障并且可以被容易地合成。也期望抑制剂的制造费用相对便宜并可以口服。筛选符合这些性质的成千化合物将需要付出巨大的努力。为了合理地设计M2蛋白酶抑制剂用以治疗阿尔茨海默氏症，了解M2蛋白酶的三维结构特别是了解抑制剂在此蛋白酶有活性位点的结合方式就将是非常重要了。
因而本发明的一个重要目的是提供提纯的具有活性的重组M2蛋白酶以及它的底物、取代位点的特异性和关键的有活性的位点残基。
本发明的进一步的目的提供M2蛋白酶抑制剂的合成物和合成方法。
本发明的更进一步目的是提供这样的合成物，其可与M2蛋白酶或它的底物相互作用以抑制能通过血脑屏障(BBB)的M2蛋白酶的剪切。
因此，本发明的目的是提供一些方法，用来合理设计和筛选抑制M2蛋白酶的化合物。
本发明的概述
生产提纯的有催化活性的重组M2蛋白酶的方法已获得开发。有催化活性酶的底物和取代位点的特异性也已被测定。有活性的酶和对其催化活性的测定在此酶抑制剂的筛选文库中是有用的。
底物和取代位点特异性信息被用于设计天然M2蛋白酶底物的底物类似物，其可抑制M2蛋白酶的功能。底物类似物依据肽序列，其显示出与M2蛋白酶天然肽底物相关。底物类似物至少包含一个类似的酰胺键(肽键)，它不能被M2蛋白酶剪切。包括在关键氨基酸残基位点等配物的两种底物类似物的合成过程已被开发，底物类似物(OMR99-1和OM99-2)也被合成。OMR99-2是以八肽[谷氨酸-缬氨酸-天冬酰胺-亮氨酸-丙氨酸-丙氨酸-谷氨酸-苯丙氨酸(序列鉴定号：28)]为基础的，用一过渡状态的等配物羟乙烯基代替了亮氨酸-丙氨酸肽键。OM99-2的抑制常数相对于重组前M2蛋白酶为1.6×109M。与此抑制物密切关联的M2蛋白酶的晶体学被用于测定蛋白质的三维结构以及结合的各种残基的重要性。
此信息可被本领域的技术人员应用于使用商业上可得到的软件程序和有机化学及酶学通晓的技术设计新的抑制剂。例如，为了增强抑制效力，抑制剂侧链可被修饰产生较强的相互作用[通过氢键、疏水相互作用、电荷相互作用和(或)范德瓦尔斯力相互作用]。根据此类型的信息，有微小相互作用的残基可以从新的抑制剂设计中去除，以便减轻抑制剂的分子重量。酶中没有结构障碍的侧链可以十字交叉连接，固定于有效的抑制剂的构造中。此结构类型也能设计肽的替代物，它可以有效地占据M2蛋白酶的结合位点，产生较好的药学性质。
实例演示了有催化活性的酶的产生、抑制剂的设计和合成以及如何获得其晶体结构。因此，实例也演示了在此描述的方法和物质可用于其它抑制剂和设计抑制剂的化合物筛选库。由于其通过对β-分泌酶(M2蛋白酶)在剪切APP中作用的调解，这些抑制剂可应用于预防和(或)治疗阿尔茨海默氏症。
示图的简要描述
图1描绘载体pET-lla-memapsin2-T1和pET-lla-memapsin2-T2的质粒结构。显示出T7启动子、载体(T7蛋白质)的氨基酸序列和memapsin2 T1和T2结构的始端和末端。构建前体memapsin2-T1在制备结晶蛋白质中用到，其包含从载体pET-lla衍生出的残基1v-15v。残基1p-48p被推定为前体肽。残基1-393与成熟的蛋白酶区域和C-终端扩展相适应。M2蛋白酶(memapsin 2)的残基计数是从胃蛋白酶排成直线的N终端位置开始的(图3)。
图2A的图表显示在不同pH情况下由M2pd合成肽swAPP的水解起始速率(见表1)。图2B的图表显示由M2pd肽底物水解的稳定状态活动的相关Kcat/Km值。
图3A和3B是M2蛋白酶抑制剂(OM99-2和OM99-1)的化学结构。
图4A是表示由OM99-1对重组M2蛋白酶抑制的图表。图4B是表示由OM99-2对重组M2蛋白酶抑制的图表。
图5A-E是重组M2蛋白酶-OM99-2络合物的晶体图象。
图6是M2蛋白酶区域与结合的OM99-2晶体结构的立体观。M2蛋白酶的多肽骨架呈现出带状。除了在C-叶嵌入的环(标出的A到G，见图2)是品红色和C终端扩展部分是绿色的外，N-叶和C-叶分别是蓝色和黄色的。在各个叶之间抑制剂的界限显示出红色。
图7是M2蛋白酶和胃蛋白酶三维结构立体观的对照图。由于表面嵌入了环状构型和螺旋构型以及C-终端扩展部分，前者的分子表面显著较大。人类M2蛋白酶链的示踪是深蓝色的，而人类胃蛋白酶是灰色的。浅蓝色的球状代表完全相同的残基，它们在局部拓扑上是同等的。二硫化键在M2蛋白酶中显示出红色，在胃蛋白酶中显示出橘黄色。C终端扩展部分是绿色的。
图8的图解显示出OM99-2和M2蛋白酶区域之间的相互作用。S3′和S4′取代位点没有确定。
图9是抑制剂OM99-2(橘黄色)和M2蛋白酶(浅蓝色)之间相互作用的立体显示。氮原子和氧原子分别用蓝色和红色标出。氢键以黄色的点状虚线表示出来。包含结合的取代位点的M2蛋白酶残基也包括在内。OM99-2的残基P4、P3、P2、P1和P1′(在图8指定)在扩展的构造中。抑制剂链于残基P2′处转向，此残基在这个位置有明显的扭结。P3′和P4′的骨架指引抑制剂离开有活性的位点。
图10是于根据当前晶体结构设计针对M2蛋白酶的新抑制剂中，在P3缬氨酸和P1亮氨酸侧链之间交叉连接的图解。在P2和P1′位置的R和R′表示氨基酸侧链。为了清晰抑制剂的其它结构成分忽略。
图11是在根据当前晶体结构设计针对M2蛋白酶的新抑制剂中，在P4谷氨酸和P2天冬酰胺侧链之间交联的图解。在P3位置的R表示氨基酸侧链。为了清晰抑制剂的其它结构成分忽略。
图12是根据当前晶体结构，新M2蛋白酶抑制剂在P1′取代位点侧链的设计图解。箭头表示在M2蛋白酶和抑制剂之间可能的相互作用。为了清晰抑制剂的其它结构成分忽略。
图13是通过添加A原子和B原子在抑制剂结构中两个有六原子的环的设计图解。环的形成涉及P1-亮氨酸侧链和P1、P2、和P3附近的肽骨架。新的键以点状虚线表示。甲基可被加在P1-亮氨酸的β-碳原子上。为了清晰抑制剂的其它结构成分忽略。
本发明的详细叙述I.制备有催化活性的重组M2蛋白酶
M2蛋白酶的克隆和表达
如例1所述，M2蛋白酶被克隆，预见的氨基酸(序列鉴定号2)序列被测定。cDNA由片段装配。核苷酸及推断的蛋白质序列分别在序列鉴定号1和2中显示。蛋白质与天冬氨酸蛋白酶2(ASP2)相同，其在EP 0 855 444 A中由Smith Kline Beecham有所叙述(药物学，1998年7月29日出版)，以后又有Sinha等人[《自然》402：537-540，(1999年12月)]和Vassar等人[《科学》286：735-741(1999年10月22日)]报告。
前体M2蛋白酶是其它人类天冬氨酸蛋白酶的类似物。依据其直线排列，前体M2蛋白酶包含前体区域、天冬氨酸蛋白酶区域和C-端点附近的跨膜区域。C-端点区域超过80个残基长。有活性的酶是M2蛋白酶，它的前体酶是前体M2蛋白酶。
有催化活性酶的重折叠
为了测定底物的特异性和设计抑制剂，必须表达有催化活性的重组酶。包含跨膜区域的蛋白酶都不得而知。跨膜区域的存在使这些蛋白质重组体的表达更缺少预见性，也更困难。跨膜区域常常需要迁移，以致可能发生蛋白质的分泌。但是，跨膜区域的迁移可改变蛋白质的结构和(或)功能。
开始的假定是：在不存在跨膜区域的情况下，作为与其它天冬氨酸蛋白酶类似物的M2蛋白酶的区域是独立折叠的，在缺少C-终端跨膜区域的情况下也将保持蛋白酶的活性。跨膜区域似乎作为膜的锚。由于活性位点不在跨膜区域以及其活性不需要膜锚，M2蛋白酶以两种不同的长度在大肠杆菌中表达，正如在例3中所叙述的，二者都没有跨膜区域，也都是提纯的。培养被转染细菌的过程、诱导重组蛋白质合成以及回收和清洗包含重组蛋白质的包埋体，正如Lin等人所叙述的那样，是最基本的。但是，重折叠不是简单的事情。两种不同的重折叠方法都可以产生令人满意的结果。在两种方法中，将蛋白质都溶于强变性/还原溶液中，例如8M尿素/100mMβ-巯基乙醇。蛋白质被重折叠的速率及其在什么溶液中，对其活性是关键的。在一种方法中，蛋白质溶解于8M尿素/100mM β-巯基乙醇，然后被快速地稀释于20倍体积的酸碱度为pH 9的20mM-氨丁三醇中，然后用1M盐酸缓慢地调解到pH 8。在进行提纯之前，将重折叠溶液保持在4℃ 24-48小时。在第二种方法中，等体积的20mM氨丁三醇，0.5mM被氧化的/1.25被还原的谷胱甘肽(pH 9)被加入到于8M尿素/10mM β-巯基乙醇中的被快速搅拌的前体M2蛋白酶中。此过程每间隔一小时重复三次以上。产生的溶液再在足够容量的20mM尿素基质中透析，以使最终的尿素浓度为0.4M。加入1M盐酸，使溶液的pH缓慢地调节为8。
重折叠蛋白质进一步用柱状层析法提纯，根据分子重量用盐梯度排除和(或)洗脱，在还原和非还原状态下，用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析法分析。2.M2蛋白酶的底物特异性和酶动力学
底物特异性
如例2中所述，M2蛋白酶的组织分布已被确定。M2蛋白酶于脑中的存在已表明它可以水解β-淀粉样前蛋白(APP)。以下叙述表明，M2蛋白酶符合β-分泌酶的所有标准。
M2蛋白酶的三维结构模型如同类型I的完整的膜蛋白。此模型提出，它的球形的蛋白酶单位在从膜表面20-30残基的距离范围内，可水解膜锚多肽。作为脑中的跨膜蛋白质，APP是潜在的底物，它的分泌酶的位点(位于从质膜表面约28个残基位置)在M2蛋白酶蛋白水解的范围内。
从此位点(SEVKM/DAEFR)(序列鉴定号：4)衍生的合成肽是在β-分泌酶位点(由/标出)由M2pd蛋白酶(包含从Ala-8P到Ala326的修饰M2蛋白酶)水解的。第二个肽(SEVKM/DAEFR)(序列鉴定号：5)是从APP β-分泌酶位点衍生的，包含有瑞典突变[Mullan.M.等人《自然遗传学》2：340-342(1992)]，众所周知，其可以提高在细胞中的α-β产生水平[Citron.M.等人《自然》260：672-674(1992)]，此肽可被有更高催化效率的M2pd水解。两种底物都在pH4.0时最适剪切。从Presenilin 1(SVNM/AEGD)(序列鉴定号：6)加工位点衍生的肽也可以以效力较小的动力学参量被M2pd剪切。从APPγ-分泌酶位点(KGGVVIATVIVK)(序列鉴定号：7)衍生的肽不被M2pd剪切。胃酶抑素A低水平地抑制M2pd(约IC50，约0.3mM)。动力学参量表明，Presenilinl(Kcat0.67s-1；Km，15.2mM；Kcat/Km，43.8s-1M-1)和天然APP(Kcat/Km，39.9s-1M-1)肽都不是象瑞典APP肽(Kcat 2.45s-1，Km，1mM；Kcat/Km，2450s-1M-1)那样为良好的底物。
为了确定M2蛋白酶在哺乳动物细胞中是否具有APPβ-分泌酶功能，M2蛋白酶在HeLa细胞中得到短暂的表达[Lin.X.等人，FASEBJ.7：1070-1080(1993)]，用35S-Met进行代谢脉冲标记，然后用抗APP抗体进行免疫沉淀反应，用来在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺电泳和成象之后对APP产生的片段显影。从脉冲追踪的条件培养基(2小时)中获得的免疫沉淀反应的APPNβ-片段(97kD带)的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺电泳模型显示出，APP被M2蛋白酶剪切了。实施只用APP转染的控制和用加入Bafilomycin A1的APP和M2蛋白酶的共转染的控制。正如以上讨论的，APP-βC片段(12kD)的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺电泳模型是从如上所谈的相同实验的条件培养基的免疫沉淀反应中获得的。实施了只用APP转染的控制；用APP和M2蛋白酶的共转染的控制；用APP和带有BafilomycinA1的M2蛋白酶的共转染的控制；用瑞典APP的转染的控制和用瑞典APP和M2蛋白酶的共转染的控制。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺电泳凝胶也被用来M2免疫沉淀反应的蛋白酶(70kD)、转染细胞的M2蛋白酶、长时间胶片曝光后的未被转染的HeLa细胞和从HEK293细胞得到的内源M2蛋白酶。APP片段(100kDβN-片段和95kDβN-片段)的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺电泳模型在用对不同APP区域特异的抗体的免疫沉淀反应之后从条件培养基中重新获得表明，M2蛋白酶剪切APP。
在细胞溶胞产物中，表达APP与M2蛋白酶的细胞于条件培养基中产生了97kD APPβN-片段(从N-终端到β-分泌酶的位点)在细胞溶胞产物中产生12kDβC-片段(从β-分泌酶的位点到C-终端)。控制只用APP的转染产生了少量的可探测的βN-片段，没有βC-片段。已知其可提高溶酶体/核内体泡囊内pH值及显示出通过β-分泌酶[Knops.J.等人，《生物化学杂志》270：2419-2422(1995)]可抑制APP剪切的Bafilomycin A1使在共转染细胞中的APPβN-片段和βC-片段都不能产生。单独用瑞典APP转染的细胞在细胞溶胞产物中不能产生βC-片段带，但是瑞典APP和M2蛋白酶的共转染可以产生。此瑞典βC-片段带比野生型的APP强度更大。A97-kDβN-带在条件培养基中也可见到，但是其强度与野生型APP的转染大约相等。
这些结果表明，在象核内体这样的酸性小区域内，M2蛋白酶加工APP的β-分泌酶位点。为了使被转染的M2蛋白酶基因表达的确立，将脉冲标记的细胞溶解并用抗M2抗体进行免疫沉淀。在用M2蛋白酶基因转染的细胞中可见A70kD M2蛋白酶带，其与从已知的表达β-分泌酶的HEK 293细胞得到的主要带具有相同的移动性。[Citron.M.等人，《自然》260：672-674(1992)]。在长时间胶片曝光后，在未转染的HeLa细胞中，也可见M2蛋白酶的非常微弱的带，表明内源性M2蛋白酶的很低的水平，没有M2转染，它不足以产生βN-或βC-片段。在α-β肽中特异识别残基1-17的α-β1-17抗体被用于确认正确的β分泌酶位点的剪切。在用APP和M2蛋白酶转染的细胞中，应用抗体识别存在于两个片段的APP的N-终端区域，两个βN-和βN-片段都是可见的。抗体Aβ1-17识别由在未转染细胞中内源性β-分泌酶产生的βN-片段。但是，此抗体不能识别已知存在于APP和M2蛋白酶共转染细胞中的βN-片段。这些观察证实，βN-片段是由M2蛋白酶切割的β-分泌酶位点的产物，M2蛋白酶去除了α-β1-17的识别表位。
由M2蛋白酶对APP的加工预示两种蛋白质在细胞内于同一地点。共表达APP和M2蛋白酶的HeLa细胞被指向APP和M2蛋白酶的抗体感染，用100×物镜通过CSLM可见其同时存在。共存在区域显现黄色。
用同焦点的显微镜对APP和M2蛋白酶观察的免疫检测揭示出在加添的扫描中他们的同一位置。两种蛋白质的分布与它们在溶酶体/核内体小区的位置是一致的。
在特异性研究中发现，在活化后温育16小时期间，M2pd剪切它的前体肽(2位点)和蛋白酶部分(2位点)。除了上述的三种肽以外，M2pd也剪切被氧化的牛胰岛素B链和合成肽Nch。天然的蛋白质不被M2pd剪切。
数据表明，人类M2蛋白酶完全符合剪切β-淀粉样前蛋白(APP)的β-分泌酶的所有标准：(a)M2蛋白酶和APP都是存在于人脑中的膜蛋白并在哺乳动物细胞中处于同一位置。(b)M2蛋白酶特异剪切在细胞中合成肽和APP的β-分泌酶的位点。(c)M2蛋白酶优先于野生型APP从瑞典APP剪切β-分泌酶位点。(d)在细胞中M2蛋白酶活动和bafilomycin A1对由M2蛋白酶加工APP的抑制的酸度pH最适值是与β-分泌酶剪切发生在酸性囊泡中的先前观察是一致的[Knops.J.等人，《生物化学杂志》270：2419-2422(1995)]。在酸性溶液中重组前体M2蛋白酶活性的自发呈现说明，在细胞内酶原可由它自己在象核内体一样的酸性囊泡中产生活性。2.抑制剂的设计和合成
M2蛋白酶的底物类似物的设计
五种人类天冬氨酸蛋白酶有类似的氨基酸序列和类似的三维结构。在活性位点有两个天冬氨酸残基，每个残基都在有标记的天冬氨酸蛋白酶特征序列[天冬氨酸-苏氨酸/丝氨酸-甘氨酸-(序列鉴定号：8)]中发现。在天冬氨酸蛋白酶中，一般有两个类似物区域，依据三维结构底物结合位点位于这两区域之间。天冬氨酸蛋白酶的底物结合位点一般可识别八个氨基酸残基。在被天冬氨酸蛋白酶剪切的酰胺键的每一侧，一般有四个残基。
每个氨基酸典型的侧链都和底物与天冬氨酸蛋白酶相互作用的特异性有关。每个底物残基的侧链被酶的一些区域识别，其统称为取代位点。一般公认的蛋白酶取代位点的名称和它们相应的底物残基表示如下，在此双斜线代表剪切键的位置。蛋白酶的取代位点S4 S3 S2 S1 S1′ S2′ S3′ S4′底物的残基      P4 P3  P2 P1//P1′ P2′ P3′ P4′
当存在天冬氨酸蛋白酶底物识别的一个总特征序列时，每个蛋白酶有非常不同的底物特异性和特异性的范围。一旦知道了天冬氨酸蛋白酶的特异性，依据其特异性可以设计抑制剂，它与天冬氨酸蛋白酶的相互作用以防止天然底物被有效剪切。一些天冬氨酸蛋白酶有可适应许多不同的在每个成功水解的取代位点残基的特异性。胃蛋白酶和组织蛋白酶D有这种类型的特异性，被说成有宽阔的底物特异性。象在高血压蛋白原酶中，仅仅有很少的残基在取代位点可被识别，此天冬氨酸蛋白酶被说成为具有严格的或狭窄的特异性。
关于天冬氨酸蛋白酶特异性的信息可被应用于设计专一的抑制剂，在其中优选的残基位于特异的取代位点以及被剪切的肽键由过渡状态的类似物代替。这样的类似物被称为过渡状态的等配物。天冬氨酸蛋白酶通过水解机制剪切酰胺键。这个反应机制涉及由氢氧化物离子攻击氨基酸的β-碳原子。通过被剪切的键在附着于β-碳原子的其它原子上，很可能发生了质子化。如果β-碳原子是不充分亲电子的或附着在被剪切键的原子是不充分亲核的，此键将不被水解机制剪切。存在有不模拟过渡状态但也不能水解的类似物，但过渡状态等配物特异模拟过渡状态并且也不能水解。
过渡状态理论表明，过渡状态是指为了使酶有最高的亲和力，酶催化的中间反应。底物的过渡状态结构而不是基础状态结构将对它的特定酶有最高的亲和力。酰胺键水解的过渡状态是四面体的，而基础状态结构是平面的。天冬氨酸蛋白酶的典型过渡状态等配物是-CH(OH)-CH2-，其首先由等人(1976)在胃酶抑素中发现。过渡状态类似物原则被成功地应用于对人类免疫缺陷病毒蛋白酶(一种天冬氨酸蛋白酶)的抑制剂药物。这些许多已被广泛地在医疗中应用。关于抑制剂的结构、特异性和类型的信息可以在下列资料中找到：Tang，《酸性蛋白酶、结构、功能及其生物学》，Adv.inExptl.Med.Biol.vol.95(Plenum Press.NY 1997)；Kostka，《天冬氨酸蛋白酶和它们的抑制剂》，(Walter de Gruyter.Berlin 1985)；Dunn，《天冬氨酸蛋白酶的结构和功能》Adv.in Exptl.Med.Biol.306(Plenum Press.NY 1991)；Takahashi，《天冬氨酸蛋白酶、结构、功能、生物学、生物医学的含义》Adv.in Exptl.Med.Biol.362(PlenumPress，NY 1995)；James，《天冬氨酸蛋白酶、逆转录病毒酶和细胞酶》Adv.in Exptl.Med.Biol.436(Plenum Press，NY 1988)。
底物类似物一般的总式子为：X-L4-P4-L3-P3-L2-P2-L1-P1-L0-P1′-L1′-P2′-L2′-P3′-L3′-P4′L4′-Y。底物类似物的成分是小肽分子类似物。它们的基本结构是从肽序列衍生的，这些是通过结构/功能的研究而确定的。已经明了，PX表示的位置代表了与由-L0-所表示的剪切位点有关的底物特异性的位置。由LX表示的成分的位置代表了每个底物特异性位置PX之间的连接区域。
在M2蛋白酶的天然底物中，一个PX-LX对代表被剪切的肽的单个氨基酸。在提出的总式中，式子中的每个PX部分指α-碳原子以及每个PX部分的侧链功能基团是氨基酸。这样，对于丙氨酸的PX-LX对的PX部分代表了HC-CH3。代表一般成分中的PX部分的总式是-R1CR3-。
一般讲，R1可以是CH3(丙氨酸侧链)、CH(CH3)2(缬氨酸侧链)、CH2CH(CH3)2(亮氨酸侧链)、(CH3)CH(CH2CH3)(异亮氨酸侧链)、CH2(吲哚)(色氨酸侧链)、CH2(苯)(苯丙氨酸侧链)、CH2CH2SCH3(甲硫氨酸侧链)、H(甘氨酸侧链)、CH2OH(丝氨酸侧链)、CHOHCH3(苏氨酸侧链)、CH2(苯酚)(酪氨酸侧链)、CH2SH(半胱氨酸侧链)、CH2CH2CONH2(谷氨酰胺)、CH2CONH2(天冬酰胺侧链)、CH2CH2CH2CH2NH2(赖氨酸侧链)、CH2CH2CH2NHC(NH)(NH2)(精氨酸侧链)、CH2(咪唑)(组氨酸侧链)、CH2COOH(天冬氨酸侧链)、CH2CH2COOH(谷氨酸侧链)以及这些功能上天然和非天然的衍生物或合成替代物。
最优的选择是：R3为单个的H。但是，一般讲，R3可以是可被结合于M2蛋白酶上的烯基、炔基、烯氧基和炔氧基基团。可优选的是，烯基、炔基、烯氧基和炔氧基基团有2-40个碳原子，更可优选的是，有2-20、2-10或2-3个碳原子及其功能上天然和非天然的衍生物或合成替代物。
PX-LX对的LX部分代表将PX区域连接在一起的原子。在天然底物中，LX代表附着在氨基部分的β-碳原子，此部分是在链上的下一个氨基酸。这样，LX由-CO-NH-代表。LX的总式被R2代表。一般讲，R2可以是CO-NH(酰胺)、CH(OH)(CH2)(羟基乙烯)、CH(OH)CH(OH)(二羟基乙烯)CH(OH)CH2NH(羟基乙烯胺)、PO(OH)CH2(phosphinate)、CH2NH(还原酰胺)。已经明了，可能比一个L-多的与底物类似物一样长的等配物起抑制天冬氨酸蛋白酶功能的作用。
不是等配物的LS或是酰胺键或是不能水解的酰胺键的模仿键。
X和Y代表不典型涉及由天冬氨酸蛋白酶识别位点识别的分子，但其与识别互不干扰。可优选的是：这些分子抗底物类似物的降解。可优选的例子为通过不能水解的键偶联于底物类似物上的氨基酸。其它可优选的化合物是加帽剂。还有其它可优选的化合物是可用于底物类似物(例如，生物素)提纯的化合物。
在此惯用的，烷基指被取代的或未被取代的直链的、分支的或环状的烷基基团；烷氧基指被取代的或未被取代的直链的、分支的或环状的烷氧基。可优选的是，烷基和烷氧基基团有1-40个碳原子；更可优选的是，1-20个碳原子；1-10个碳原子或1-3个碳原子。
在此惯用的，烯基指可替代的或不替代的，直链的或分支的烯基基团；炔基指被取代的或未被取代的直链或分支的炔基基团；烯氧基指被取代的或未被取代的直链的或分支的烯氧基；炔氧基指被取代的或未被取代的直链或分支的炔氧基。可优选的是，烯基、炔基、烯氧基和炔氧基基团有2-40个碳原子，更优选的是2-20个、2-10个或2-3个碳原子。
在此惯用的，烷芳基指有芳香基替代物的烷基基团；芳烷基指有烷基替代物的芳香基基团；杂环烷基指有烷基替代物的杂环基团；烷基杂环指有杂环替代物的烷基基团。
烷基、烯基、炔基、烷氧基、烯氧基和炔氧基基团的替代物可以是卤素、氰基、氨基、硫代基、羧基、酯、醚、硫醚、carboxamide、羟基或氢硫基。并且，这些基团可适当地有一个或多个杂原子(例如，O、NH或S)替代的亚甲基基团。
若干不同底物已被测定和分析，M2蛋白酶的剪切规律也已被确定。被分析底物的结果在表1中提供，从此结果确定的规则概述如下：
(1)M2蛋白酶底物主要的特异性位点取代位点P1′，这意味着M2蛋白酶底物特异性的最重要的决定因素是氨基酸S1′。P1′必须包含小侧链以便M2蛋白酶识别底物。优选的实施方案是这样的底物类似物，其上P1′位点的R1是H(甘氨酸侧链)、CH3(丙氨酸侧链)、CH2OH(丝氨酸侧链)或CH2OOH(天冬氨酸侧链)。优选的实施方案还有，R1在结构上小于CH3(丙氨酸侧链)或CH2OH(丝氨酸侧链)。
(2)在P4、P3、P2、P1、P2′、P3′和P4′的位置没有专一的序列要求。每个位点可容纳任何其它的在第三条规则中遇到的那样长的奇特氨基酸残基。
(3)余留的七个位置P4、P3、P2、P1、P2′、P3′和P4′中最少有两个有由疏水残基组成的R1。在余留的七个位置P4、P3、P2、P1、P2′、P3′和P4′中，最少有三个疏水残基是优选的。包含有疏水基团位置的优选的R1基团是CH3(丙氨酸侧链)、CH(CH3)2(缬氨酸侧链)、CH2CH(CH3)2(亮氨酸侧链)、(CH3)CH(CH2CH3)(异亮氨酸侧链)、CH2(吲哚)(色氨酸侧链)、CH2(苯)(苯丙氨酸侧链)、CH2CH2SCH3(甲硫氨酸侧链)、CH2(苯酚)(酪氨酸侧链)。更可优选的是，疏水基团是大的疏水基团。包含有大的疏水基团的优选的R1S是CH(CH3)2(缬氨酸侧链)、CH2CH(CH3)2(亮氨酸侧链)、(CH3)CH(CH2CH3)(异亮氨酸侧链)、CH2(吲哚)(色氨酸侧链)、CH2(苯)(苯丙氨酸侧链)、CH2CH2SCH3(甲硫氨酸侧链)、CH2(苯酚)(酪氨酸侧链)。最优选的是有疏水R1——CH(CH3)2(缬氨酸侧链)、CH2CH(CH3)2(亮氨酸侧链)、CH2(苯)(苯丙氨酸侧链)、CH2CH2SCH3(甲硫氨酸侧链)或CH2(苯酚)(酪氨酸侧链)。
(4)在八个P4、P3、P2、P1、P1′、P2′、P3′和P4′位置上的R1位置上，都可能没有脯氨酸侧链。
(5)不是所有的取代位点在类似物中都由P代表。例如，底物类似物可能有X-P2-L1-P1-L0-P1′-L1′-P2′-L2′-P3′-L3′-Y或它可能有X-L1-P1-L0-P1′-L1′-P2′-L2′-P3′-L3′-P4′-L4′-Y。
优选的底物类似物是具有表1所表明序列的类似物，在P1和P1′之间没有能水解的类似物。
制造抑制剂的组合化学过程
组合化学过程包括但不局限于所有的离析方法，其可离析不论是能结合于小分子还是其他大分子上的分子。蛋白质、寡核苷酸和多糖都是大分子的例子。例如，具有特定功能的(催化的或配位结合的)寡核苷酸分子可被从任意寡核苷酸复杂的混合物中离析出来，其被称为“体外遗传学”(Szostak，TIBS 19：89，1992)。它合成一个具有随机的和规定序列以及对象的大分子库，例如，在100μg的一个100核苷酸RNA中大约1015个体的序列的复杂混合物里，去选择和浓缩的过程。通过重复循环进行亲和层析法和结合于柱上配位子的分子的聚合酶链反应扩增，Ellington和Szostak(1990)估计，在以这样方式折叠的1010RNA分子中有一个结合于小分子染色剂上。有这样配位结合行为的DNA分子也被离析(Ellington和Szostak，1992；Bock等人，1992)。
对于小的有机分子、蛋白质和肽以及本领域技术所知的其它分子也存在用于相似目的的技术。无论依据小的合成分子、寡核苷酸、蛋白质或是肽，筛选一组合乎需要活性的分子被广泛地称为组合化学过程。
有许多离析或具有新生活性的或具有修饰活性的蛋白质的方法。例如，噬菌体展示库已被应用了许多年。离析有特定功能蛋白质的优选方法曾被Roberts和Szostak描述[Roberts.R.W.和Szostak.J.W.《自然科学学会期刊》USA，94(23)12997-302(1997)]。另外的设计离析肽的组合方法的优选方法被Cohen等人描述。[Cohen.B.A.等人，《自然科学学会期刊》USA95(24)：14272-7(1998)]此方法利用了修饰的双杂交技术。酵母菌双杂交系统用于检测和分析蛋白质(蛋白质的相互作用)。在酵母菌最初描述的双杂交系统是效力大的分子遗传学技术，用来鉴定对兴趣蛋白质特异的新调节分子[Fields和Song，《自然》340：245-6(1989)]。Cohen等人修正了这项技术使合成或设计的肽序列之间的相互作用可以被鉴定，其结合了一个选择的分子。这个类型技术的好处是，可以做细胞内环境的选择。此方法利用了附着于酸性活性区域的肽分子库。例如，选择的肽，M2蛋白酶的细胞外部分是附着于转录活性蛋白(如，Gal4)的DNA结合区域。用此类型系统进行双杂交技术，结合于M2蛋白酶的细胞外部分的分子可被鉴定。
小分子库的筛选
除了这些专门的技术之外，在众所周知的此领域技术的方法论，结合各种小分子或联合库，可用来离析及定性与所需靶目标，或是M2蛋白酶或是它的底物结合或与相互作用的分子。这些化合物相关的结合亲和力可被比较，用众所周知的本领域技术的竞争性或非竞争性结合的研究，最适的抑制剂可被鉴定。优选的竞争性抑制剂是不能水解的M2蛋白酶类似物。另外的将引起变构象的重新排列，其将阻止M2蛋白酶的正常功能和正确折叠。
计算机辅助合理的药物设计
离析抑制剂的另外途径是通过合理的设计。这是通过结构信息和计算机模型获得的。计算机模型技术使得所选择的分子的三维原子结构和将与分子相互作用的新化合物的合理设计成为可视的。三维结构典型上依靠X射线结晶学分析数据或是所选择分子的核磁共振影象。分子动力学需要力场数据。计算机图象系统能够预测新化合物如何连接靶分子以及实验处理化合物的结构和靶分子以完善结合特异性。例如，Inouye和他的共事者用核磁共振光谱学能获得保留TSHK催化位点独特的亚域的截断的TSHK(跨膜感受器组氨酸激酶)N-终端片段的结构信息。依据核磁共振研究，他们能鉴定潜在的TSHK抑制剂(美国专利号：6077682，Inouye)。另一个好例子是依据用高分辨率X射线晶体学获得钙调磷酸酶活性位点结合小区和附属FKBP12/FK506结合小区测定的钙调磷酸酶/FKBP12/FK506络合物的三维结构(美国专利号：5978740，Armistead)。用掌握的此信息，研究者可以很好地明了，天然配位子或底物与它们相应受体或酶的结合小区的联系，以及能够设计和制造有效的抑制物。
当在分子或化合物之一或两者中造成小的改变时，对分子--化合物相互作用的预测需要分子力学软件和计算能力强大的计算机，其通常在分子设计程序和用户之间的用户容易掌握使用的菜单驱动界面连接。分子模型系统的实例是CHARMm和QUANTA程序。CHARMm完成能量的最小化和分子动力学功能。QUANTA完成建构、图解模型和分子结构分析。QUANTA可以进行相互作用的建构、模型化、可视化和分子相互之间的行为分析。
许多文章对药物与特异蛋白质之间的相互作用的计算机模型有所评论，例如，Rotivinen等人，1998 97：159-166；Ripka，《新科学家》54-57(1988年6月16日)；Mckinaly和Rossmann，1989《药物毒理学年度回顾》29：111-122；Perry和Davies，QSAR：《在药物设计中定量结构活动关系》，189-193(1989)；Lewis和Dean，1989Proc.R.Soc.Lond.236：125-140和141-162；以及《关于对核酸成分的模型酶》，Askew等人1989《美国化学学会杂志》111：1082-1090。其它的可筛选和图解描述化学药品的计算机程序可以从BioDesigh.Inc.、Pasadena.CA.、Allelix.Inc.、Mississauga.Ontario.Canada和Hypercube.Inc.Cambridge.Ontario.等公司获得。
虽然上述内容可用于参考设计和产生可改变结合的化合物，其也能筛选已知的包括天然产品或合成化学物的化合物以及包括蛋白质的生物活性物质，用于改变底物结合或酶的活性的化合物。
库的筛选
底物类似物的设计和合理药物的设计依据活性位点与靶的知识，也利用一些计算机软件程序，这些软件程序可创造酶和它的底物的细节结构以及在单独情况下或有抑制物存在的情况下它们之间相互作用的方式。这些技术随着已掌握的X射线结晶学数据而得到有效的提高。抑制剂也可通过现存的抑制催化活性酶的化合物的筛选库获得。与在同M2蛋白酶相关的文献中的报告形成对照，在此叙述的酶具有与天然产生的酶相类似的活性，其提供了鉴定抑制内生性活性的化合物的方法。这些有潜力的抑制剂用高度的物料通过量测定被有代表性地鉴定，在这样的测定中，酶、底物(优选染色体基因底物)和潜在的抑制剂(通常在一系列浓度范围内筛选)被混合以及底物的剪切范围也被鉴定。潜在有用的抑制剂是那些减少剪切量的。3.诊断和治疗方法
抑制剂可被用于诊断、治疗和(或)预防阿尔茨海默氏症和与此相关的病情，例如，四十二氨基酸肽剪切产物水平的提高和在淀粉样斑块中肽的累积。
诊断应用
底物类似物可用作专门结合于M2蛋白酶或M2蛋白酶类似物的试剂，也用于帮助M2蛋白酶离析、提纯或在实例中所叙述的特性。抑制剂和提纯的重组酶可被用于筛选那些在遗传上更易于发生阿尔茨海默氏症的个体。
治疗应用
重组人类M2蛋白酶剪切有LVNM/AEGD序列(序列鉴定号：9)的底物。此序列是在活体内人类presenilins加工位点序列。presenilin 1和presenilin 2都是完整的膜蛋白。它们被蛋白酶剪切加工，以此从未加工的类型中去除N终端序列。一旦被加工，presenilin形成一个双链的杂二聚体[Capell等人，《生物化学杂志》273：3205(1998)；Thinakaran等人，Neurobiol.Dis.4：438(1998)；Yu等人，Newrosci Lett.2254(3)：125-8(1998)]与未被加工的presenilins相比，它们是稳定的。未被加工的presenilins很快被降解[Thinakaran等人，《生物化学杂志》272：28415(1997)；Steiner等人《生物化学杂志》273：32322(1998)]。现已知道，presenilin控制活体内β分泌酶的活动，分泌酶转而剪切淀粉样前蛋白(APP)，其导致形成α-β42。已经知道α-β42在脑细胞中的累积是引起阿尔茨海默氏症的主要原因(参看Selkoe，1998)。因而presenilin的活动促进了阿尔茨海默氏症的进展。这个报道是通过观察到缺少presenilin基因α-β42肽的产生就降低而得出的[De Strooper等人《自然》391：387(1998)]。由于未加工的presenilin会很快降解，经过加工的杂二聚体的presenilin一定是导致阿尔茨海默氏症的α-β42累积的主因。由M2蛋白酶对presenilin的加工会增加α-β42的产生，因而进一步加剧了阿尔茨海默氏症。因此，经过血脑屏障的M2蛋白酶抑制剂可用于减低阿尔茨海默氏症发生的可能性或减缓由α-β42的沉淀调节的阿尔茨海默氏症的加剧。由于M2蛋白酶在β-剪切位点剪切APP，阻碍在β-剪切位点剪切APP将防止形成α-β42。
疫苗
具有催化活性的M2蛋白酶或包括由有两个催化的天冬氨酸残基存在限定的活性位点的片段和底物结合裂开的片段可被用于诱导对M2蛋白酶的免疫反应。给予少量的M2蛋白酶用药，可有效地激发阻断抗体，阻断抗体即能阻碍在脑中自然发生的M2蛋白酶底物剪切的抗体。未修饰的疫苗可被用于预防和治疗阿尔茨海默氏症。对疫苗的反应可以受到它的成分(例如，包含的佐剂、从重组酶生产而来的病毒蛋白。)和用药方式(用药量、用药部位、用药次数等。)的影响。由于已经清楚，为了被激活，酶必须适当地折叠，抗体要被激发，其对内源性M2蛋白酶是有活性的。对内源性酶有效的抗体极少发生对抗没有被适当重折叠的酶。
药学上能接受的载体
抑制剂典型上是口服或注射。优选的方法为口服。可替代的其它方式为通过肺、黏膜或皮肤途径给予。抑制剂常常与药学上能接受的载体结合一起被服用。药学载体在本领域技术上是众所周知的。典型上依据服用方式来选择适合的载体。药学成分也可以包括一个或多个活性成分(例如，抗微生物剂、消炎剂或止痛剂)。
制备非消化道的药剂或注射剂包括无菌的水剂或非水剂溶液、悬浮液和乳剂。非水溶剂的例子是1，2-丙二醇、聚乙二醇、如橄榄油的蔬菜油和如乙基油酸盐的能注射的有机酯。水性载体包括水、酒精水溶液、乳剂或包括含盐和缓冲介质的悬浮液。优选的非消化道的载体包括氯化钠溶液、林格右旋糖、右旋糖和氯化钠、乳酸盐林格注射液或不易挥发的油。静脉内的载体包括液剂、营养再生剂和电解液再生剂(例如，依据右旋糖的那些)。
典型的(包含用于口、肺、鼻、阴道或直肠的黏膜表面)给药形式可包括软膏、洗剂、乳油膏、凝胶、滴剂、栓剂、喷雾剂、液剂和粉剂。这些用药形式是众所周知的。例如，若干肺的用药方式已被开发，典型的是用喷射干燥物形成有颗粒的粉末，这些颗粒的空气动力学直径在一至三微米之间，其由药物或由与聚合物和(或)表面活性剂结合的药物组成。
口服给药包括粉剂或粒剂、在水中或非水介质中的悬浮液或溶液、胶囊剂、粉末剂或片剂。增稠剂、调味剂、稀释剂、乳化剂、分散剂或结合剂也可能是需要的。
在此叙述的肽也可以作为药学上能接受的加酸基或碱基的盐给予服用，这些盐可通过与无机酸(例如，盐酸、氢溴酸、高氯酸、硝酸、硫氢酸、硫酸和磷酸)和有机酸(例如，甲酸、乙酸、丙酸、乙醇酸、乳酸、丙酮酸、乙二酸、丙二酸、丁二酸、马来酸和富马酸)反应或通过与无机碱(氢氧化钠、氢氧化铵、氢氧化钾)和有机碱(一价、二价、三烷基和芳香基胺以及替代的乙醇胺)反应形成。
剂量
剂量依赖于所治疗病情的严重性和反应性，但一般为每日一或多次，疗程从几天持续到几月，直到护理医师确定其不再有益了。有普通医术的人可以决定合适的剂量、服药的方法和重复率。
剂量的幅度可大到足够产生所需要的效果，其中M2蛋白酶为引起媒介的紊乱症状得到缓解(典型特点是，淀粉样斑块的大小减小，数量减少或在大小或数量上不再增加)，或者其中α-β42肽的剪切减少。在出现相反指征情况下，剂量可由个人医师调节。
通过参考下列非限定的实例，可进一步了解本发明。
        实例1    M2蛋白酶的克隆1.前体M2蛋白酶的克隆和核苷酸序列
人类天冬氨酸蛋白酶新序列类似物可在下列于EST IMAGE数据库中的记载中找到：AA 136368妊娠子宫ATCC 947471AA207232神经上皮ATCC214526以及R55398人类乳腺ATCC392689。相应的细菌品系：包含有EST序列的#947471、#214526和#392689是从ATCC(Rockville，MD)获得的。从ATCC获得的这些克隆序列进一步证实，它们包含有与已知的人类天冬氨酸蛋白酶不完全相同的序列。这些克隆的完整序列组装成约80％的前体M2蛋白酶cDNA。用下列方法获得这些克隆的全长cDNA。
为双链cDNA的人类胰腺Marathon-Ready cDNA(Clontech)是通过逆转录和加入引物获得的，从人类组织mRNA第二条链的合成用于聚合酶链式反应扩大的模板。结合体引物(AP1)和含结合体引物组群(AP2)被用于5′-和3′-RACE PCR。对M2蛋白酶cDNA的聚合酶链式反应5′-区域，引物AP1和NHASPR1被用到。cDNA 3′-端的引物是NHASPF2和AP1。cDNA的中间被引物NHASPF1和NHASPR2扩增。引物的序列如下：NHASPF1：GGTAAGCATCCCCCATGGCCCCAACGTC(序列鉴定号：10)、NHASPR1：GACGTTGGGGCCATGGGGGATGCTTACC(序列鉴定号：11)、NHASPF2：ACGTTGTCTTTGATCGGGCCCGAAAACGAATTGG(序列鉴定号：12)、NHASPR2：CCAATTCGTTTTCGGGCCCGATCAAAGACAACG(序列鉴定号：13)、AP1：CCATCCTAATACGACTCACTATAGGGC(序列鉴定号：14)和AP2：ACTCACTATAGGGCTCGAGCGGC(序列鉴定号：15)。
M2蛋白酶也是从包含有lambda-gt10和lambda-gt11载体的人类胰腺库(快速筛选人类cDNA库名簿)中克隆的。载体中的引物GT10 FWD、GT10 REV、GT11 FWD和GT11 REV被用作外引物。所用引物的序列是：GT10 FWD：CTTTTGAGCAAGTTCAGCCTGGTTAA(序列鉴定号：16)、GT10 REV：GAGGTGGCTTATGAGTTTCTTCCAGGTA(序列鉴定号：17)、GT11 FWD：TGGCGACGACTCCTGGAGCCCG(序列鉴定号：18)、GT11 REV：TGACACCAGACCAACTGGTAATGG(序列鉴定号：19)。
除此之外，M2蛋白酶cDNA直接从人类胰腺lambda-gt10和lambda-gt11库中被扩大。引物的序列是：PASPN1：catatgGCGGGAGTGCTGCCTGCCCAC(序列鉴定号：20)和NHASPC1ggatccTCACTTCAGCAGGGAGATGTCATCAGCAAAGT(序列鉴定号：21)。
扩增的M2蛋白酶片段被克隆成中间的聚合酶链式反应载体(Invitrogen)以及被排序。
从片段、核苷酸装配的cDNA及其推断出的蛋白质序列在序列鉴定号1和序列鉴定号2中显示。
前体M2蛋白酶是其它人类天冬氨酸蛋白酶的类似物。依据其排列，前体M2蛋白酶包含一前体区域和一天冬氨酸蛋白酶区域以及一C-终端附近的跨膜区域。有活性的酶是M2蛋白酶，它的前体酶是前体M2蛋白酶。
         实例2    M2蛋白酶在人类组织中的分布
从Clontech获得的多数组织cDNA模板用于M2蛋白酶cDNA的0.82kb片段的聚合酶链式反应扩增的模板。用于M2蛋白酶的引物是NHASPF1和NHASPR2。包含M2蛋白酶或M2蛋白酶片段的组织获得扩增的聚合酶链式反应产物。扩增产物的量表明，M2蛋白酶从最多到最少存在于下列器官中：胰腺、脑、肺、肾脏、肝脏、胎盘和心脏。M2蛋白酶也存在于脾、前列腺、睾丸、卵巢、小肠和结肠细胞中。
      实例3  前体M2蛋白酶cDNA在大肠杆菌中的表达，
             前体M2蛋白酶的重拆叠及其提纯
前体M2蛋白酶是聚合酶链式反应扩增的，被克隆为pET11载体的BamH1位点。获得的载体表达具有从Ala-8p到Ala326序列的前体M2蛋白酶。图1显示了两个表达载体[pET11-M2蛋白酶-T1(从T1以后)和pET11-M2蛋白酶-T2(从T2以后)]的结构。在两个载体中，表达的重组蛋白质的N-终端15残基是从表达载体衍生的。前体M2蛋白酶残基在残基Ala-16开始。两个重组前体M2s蛋白酶有不同的C-终端长度。在Thr-454的克隆T1端和在Ala-419的克隆T2端。T1结构包含从T2结构的C终端的延伸，但不表达任何预见的跨膜区域。
重组蛋白质的表达和包含体的复原
T1和T2表达载体被独立转染到大肠杆菌品系BL21(DE3)中。培养转染细菌、诱导重组蛋白质合成的过程以及含有重组蛋白质的包含体的复原和清洗的过程是如前面所述的最基本的。(Lin等人，1994)。
三个不同的重折叠方法产生了满意的结果。
(i)快速稀释方法
在含OD280nm＝5的8M尿素/100mM β-巯基乙醇中的前体M2蛋白酶快速稀释为20容积的20mM-氨丁三醇(pH9.0)。用1M盐酸将溶液缓慢地调节为pH8.0。然后在提纯处理前，将重折叠溶液保持于4°下24-48小时。
(ii)逆透析方法
等体积的20mM氨丁三醇、0.5mM氧化的/1.25mM还原谷胱甘肽(pH9.0)被加入到快速搅拌的在OD280mm＝5的8M尿素/10mMβ-巯基乙醇中的前体M2蛋白酶中。此过程间隔一小时重复三次以上。产生的溶液再在足够容积的20mM氨丁三醇基中透析以使最后的尿素浓度为0.4M。然后用1M盐酸将溶液的PH缓缓地调节到8.0。
(iii)重折叠的优选方法
包含体溶解于8M尿素、0.1M氨丁三醇、1mM甘氨酸、1mMEDTA、100mMβ-巯基乙醇(pH10.0)中。包含体的OD280用8M尿素溶液(无β-巯基乙醇)调节到5.0。最后的溶液包含有下列还原剂：10mMβ-巯基乙醇、10mM DTT(Dithiothreitol)、1mM还原谷胱甘肽和0.1M氧化谷胱甘肽。溶液的最后pH是10.0。
将以上溶液快速稀释于20mM氨丁三醇基的20容积，pH被调节到9.0，产生的溶液保持在4℃中16小时。将溶液与室温平衡6小时，并将pH调节到8.5。将溶液再置于4℃中18小时。
将溶液再与室温平衡6小时并将pH调节到8.0。将溶液再置于4℃中4-7天。
对于获得有酶活性的能用于M2蛋白酶取代位点特异性研究的制备物，对于分析M2蛋白酶抑制剂的抑制能力，对于用随机结构库或现存的化合物库筛选抑制剂，对于生产用于M2蛋白酶结构晶体学研究的晶体和对于生产M2蛋白酶的单克隆或多克隆抗体，重折叠的过程都是关键的。
重组前体M2蛋白酶-T2的提纯
重折叠物质用超滤法浓缩，并在SEPHACRYLTMS-300柱上分离，与20mM氨丁三醇、盐酸、0.4M尿素(pH8.0)平衡。从S-300柱的重折叠峰值(第二次峰值)可进一步用FPLCRESOURCE-QTM柱提纯，其与20mM氨丁三醇-盐酸、0.4M尿素平衡(pH8.0)。酶从有氯化钠线性梯度的柱上洗脱。从S-300的重折叠的峰值在进一步提纯前也可被活化。为了活化，将片段与等体积的0.2M乙酸钠、70％甘油(pH4.0)混合。混合物在22℃ontract温育18小时，然后在20倍体积的20mM双氨丁三醇、0.4M尿素(pH6.0)中透析两次。经过透析的物质再进一步在FPLCRESOURCE-QTM柱上提纯，与20双氨丁三醇、0.4M尿素(pH6.0)平衡。酶用氯化钠线性梯度洗脱。
在还原和非还原状态下对S-300片段进行的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶泳表明，前体M2蛋白酶在非还原状态下首先以很高分子重量带(比约42kD大)洗脱。这也表明，由于二硫化物通过蛋白质的连接，在这些片段中蛋白质是不能适当折叠的。随后的片段包含预见的前体M2蛋白酶-T2(约42kDa)的蛋白质。在这些片段中获得的前体酶也具有自动催化活性的蛋白水解活性。这些片段被集中一起，在FPLCRESOURCETM柱进行层析，用氯化钠线性梯度洗脱。一些片段在非还原状态下用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶泳分析。分析显示，片段6和片段7包含大部分活性蛋白质，这与包含活性蛋白质的第一次FPLC峰值是一致的。主要峰值是成双的，形成了肩峰，用同样的RESOURCETMQ柱进行重复的提纯，其可呈现。此主肩峰等同于在这样状况下以不同构象存在的活性前体M2蛋白酶。
实例4  量组M2蛋白酶的蛋白水解活性和剪切位点的优选
为了确定M2蛋白酶的特异性，围绕蛋白水解剪切位点的氨基酸序列被确定。为了引起自动催化剪切，重组前体M2蛋白酶-T1在室温下在0.1M乙酸钠(pH4.0)中温育16小时。用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳对产物进行分析。与小于前体M2蛋白酶的分子量相应的几个带可被观察。电泳带有经过PVDF膜的印记。四条带被挑选出，并在蛋白质序列测定仪中测定N-终端的序列。这些带的N-终端序列确立了在前体M2蛋白酶蛋白水解剪切位点的位置。
除此之外，牛胰岛素氧化β-链和两个不同的合成肽用作M2蛋白酶底物以确定其它水解位点的范围。这些反应在0.1M乙酸钠(pH4.0)中由自动激活前体M2蛋白酶进行，其然后与肽在一起温育。水解产物在逆相C-18柱上进行高效液相层析，通过电喷雾质谱仪测定洗脱剂峰值以确定片段的分子量。在氧化胰岛素β-链(表1)上的两个水解位点被鉴定。从肽NCH-γ的三个水解位点被鉴定。在合成肽PS1-γ的一个剪切位点被发现，其序列(LVNMAEGD)(序列鉴定号：9)是从人类presenilin 1的β-加工位点衍生的(表1)。
             表1：M2蛋白酶的底物特异性
位点# 底物 P4  P3  P2  P1  P1  P2  P3  P4
    1 前体M2蛋白酶 R  G  S  M  A  G  V  L  aa 12-18 of SEQ IDNo.3
    2 G  T  Q  H  G  I  R  L  aa 23-30 of SEQ IDNo.3
    3 S  S  N  F  A  V  G  A   aa98-105 of SEQ IDNo.3
    4 G  L  A  Y  A  E  I  A  aa 183-190 of SEQID No.3
    56 氧化的胰岛素β链 H  L  C  G  S  H  L  V  C^是磺基丙氨酸：SEQ ID No.22SEQ ID No.23
C  G  E  R  G  F  F  Y
    7 合成肽  V  G  S  G  V 在肽中剪切的三个位点VGSGVLLSRK(SEQ IDNo.30)SEQ ID No.24SEQ ID No.25SEQ ID No.26
    8  V  G  S  G  V  L  L
    9 G  V  L  L  S  R  K
    10     肽 L  V  N  M  A  E  G  D     SEQ ID No.9
实例5  前体M2蛋白酶的激活作用和酶的动力学
在0.1M乙酸钠(pH4.0)于22℃温育16小时自动催化地使前体M2pd蛋白酶转化为M2pd蛋白酶。最初的水解测试，两种合成肽被分开在0.1M乙酸钠(pH4.0)中与前体M2pd蛋白酶温育2-18小时不同的时间范围。温育的样本进行LC/MS以鉴定其水解产物。为了动力学研究，鉴定的高效液相层析(Beckman System Gold)产物峰值被合并计入测定的数量。Presenilin 1与瑞典APP肽的Km和Kcat值(见表1)由稳定状态的动力学测量。APP肽的个体Km和Kcat值可不被标准的方法精确地测量，因此它的Kcat/Km值由以Presenilin 1肽为对照的混合底物的竞争性水解来测量。[Fersht.A.，《酶结构和机制》，第二版，W.H.Freeman和Company，纽约(1985)]。
在图2A和图2B中显示了其结果。前体M2pd蛋白酶(pH4.0)向较小片段的转化由十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶泳来显示。在前体M2pd蛋白酶和转化酶之间迁移的不同是两种物质混合的证据。图2A是通过在不同pH的M2pd蛋白酶合成的肽swAPP(见表1)的水解起始速率的图解。图2B是M2pd蛋白酶肽底物水解的稳定状态下的相关Kcat/Km值的图解。
             实例6在哺乳动物细胞中的表达
方法
PM2cDNA在载体pSecTagA的位点被克隆EcoRV(Invitrogen)。人类APP cDNA被从人类胎盘8-gt11库的聚合酶链式反应扩大(Clontech)以及在pSecTagA的Nhe I和Xba I位点被克隆。转染HeLa细胞和对T7-碱基表达的痘苗病毒感染的过程基本与Lin.X，FASEBJ.7：1070-1080(1993)所述相同。
在0.5毫升脱血清/脱甲硫氨酸介质中，转染细胞被用200微Ci35S甲硫氨酸和半胱氨酸进行代谢标记(Tranlabel；ICN)30分钟，用1ml介质轻轻冲洗，用2ml DMEM/10％/FCS替换。为了阻止泡囊酸化，Bafilomycin A1被诱导于介质中[Perez.R.G.等人，《生物化学杂志》271：9100-9170(1996)]。在不同的时间点(追踪)，介质被去掉，细胞被收集并溶解于包含有10mM碘乙酰胺10：M TPCK，10：M TLCK和2 microg/ml亮肽素的50mM氨丁三醇、0.3M氯化钠、5mM乙底酸、1％去利通(Triton)X-100(pH7.4)中。细胞溶解的上清液(14000×g)和介质被免疫吸附于结合在蛋白质G琼脂糖(Sigma)上的抗体。抗APP N-端区域抗体(Chemicon)被用于APP的βN-端的复原，抗-α-β1-17抗体(Chemicon，识别α-β的N-端17残基)被用于复原12片段。抗体的前者仅识别变性蛋白，因此在免疫吸附之前，将介质在2mM dithiothrietol 0.1％十二烷基硫酸钠中于55℃温育30分钟。在加入抗APP N-端区域之前将样本冷却并用等量的细胞溶解缓冲液稀释。冲洗珠状物并用负荷缓冲器洗脱，进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶泳(NOVEXTM)，用放射自显影或磷光显影(分子动力学)在以扩增法增加的凝胶上显示出来。βN-片段的免疫检测通过反印迹方法以及用抗-α-β1-17和化学发光底物(Amersham)在PVDF膜上完成。
结果
将在4--培养皿室载玻片中的用APP或M2蛋白酶转染的HL细胞用丙酮固定10分钟并在于PBS的0.2％去利通X-100中通透6分钟。为了使M2蛋白酶集中，多克隆山羊抗前体M2pd蛋白酶抗体在DEAE琼脂糖6B上提纯，并相对于固定于Affigel(BioRed)重组前体M2pd蛋白酶的亲和力提纯。按照制造者的原始记录，提纯的抗前体M2pd抗体被结合于Alexa568(分子探针)。将固定的细胞与1∶100的抗体稀释液置于包含01％BSA的PBS中过夜并用PBS冲洗四次。两种抗体可被用于APP。抗体Aβ1-17(如上述)和其可识别-紧随分泌酶剪切位点的头26个残基的抗体Aβ17-42(Chemicon)。经过4 PBS冲洗后，将细胞与配合于1∶200稀释液的抗鼠异硫氢酸荧光素一起保持过夜。将细胞置于延长的抗褪色剂(分子探针)中制成载片，并在Leica TCS同焦激光扫描显微镜中显示。
             实例7：OM99-1和OM99-2的设计和合成
依据M2蛋白酶特异性研究的结果，可以预测，在P1和P1′位置上的有效残基可能是亮氨酸和丙氨酸。后来从特异性的数据中确定，P1′位置优选的小残基是如丙氨酸和丝氨酸那样的。但是，结晶结构(在以下实例9中确定)表明，这个位点可容纳许多大残基。已经证明，M2蛋白酶的P1′是有着最严格特异性需要的位置，在此位置，如丙氨酸、丝氨酸和天冬氨酸那样的小侧链的残基是优选的。对于P1′挑选丙氨酸主要是因为它的疏水性超过丝氨酸，天冬氨酸有利于透过血脑屏障，这是设计治疗阿尔茨海默氏症的M2蛋白酶抑制剂药物所需要的。因而在设计抑制剂时，在亮氨酸和丙氨酸之间放置了过渡状态类似等配物(以亮氨酸*丙氨酸表示，在此*代表过渡状态等配物，-CH(OH)-CH2-)以及取代位点P4、P3、P2、P2′、P3′和P4′全部被淀粉样蛋白瑞典突变分泌酶位点序列所占据。抑制剂OM99-1和OM99-2的结构在下面和在图3A与图3B中分别表示：
OM99-1：缬氨酸-天冬酰胺-亮氨酸*丙氨酸-丙氨酸-谷氨酸-苯丙氨酸                             (序列鉴定号：27)
OM99-2：谷氨酸-缬氨酸-天冬酰胺-亮氨酸*丙氨酸-丙氨酸-谷氨酸-苯丙氨酸                      (序列鉴定号：28)
亮氨酸*丙氨酸二肽等配物是以下列方法合成的：
作为M2蛋白酶抑制剂的亮氨酸-丙氨酸二肽等配物是从L-亮氨酸制备的。如图1中所示，L-亮氨酸经过在有10％氢氧化钠情况下在二乙醚中用BOC2O处理12小时，作为它的BOC衍生物2被保护起来。经过用异丁基氯甲酸(chcloroformate)和N-甲基哌啶处理后再用以N，O-二甲基羟胺处理生成的混合酐，B-亮氨酸转化为Weinreb酰胺3(Nahm和Weinreb、Tetrahedron Letters 1981、32，3815)。在二乙醚中3与氢化锂铝的还原作用提供了醛4。醛4与从经过丙炔酸乙酯(ethyl propiolate)和二异丙酰胺锂处理衍生的丙炔酸锂的反应以42％的离析量提供了炔属醇5，其为不能分离的非对映体混合物(5∶8∶1)[Fray，Kaye和Kleinman，<有机化学杂志>1986，51，4828-33]。通过Pd/BaSO4催化氢化5后，接着将产生的γ羟基酯用在甲苯中的催化量的醋酸回流进行酸催化内酯化，产生73％产量的γ内酯6和7。通过用在作为洗脱液的己烷中的40％的乙酸乙酯做硅胶层析，异构物被分离。通过用甲基碘化物进行7的立体选择性烷基化作用将甲基引入到C-2上(图2)。这样，在-78°用在四氢呋喃中的hexamethyldisilazide锂(2.2当量)30分钟产生内酯7的双价阴离子以及在-78℃用甲基碘化物(1.1当量)进行烷基化30分钟，随后用丙炔酸(5当量)猝灭，以此提供了需要的烷基化的内酯8(76％的获得量)，同时有少量(小于5％)的相应的差向异构体[Ghosh和Fidanze，1998<有机化学杂志>1998，63，6146-54]。用作为溶剂系统的乙酸乙酯和己烷的混合物(3∶1)通过硅胶层析柱将差向异构的cis-内酯去掉。依据广泛的1H-核磁共振NOE实验搞清了烷基化内酯8的立体化学排列。含水的氢氧化锂促进了内酯8的水解，随后在二甲基甲酰胺中的咪唑和二甲基氨基吡啶存在的情况下，用叔丁二甲基甲硅烷基氯保护γ羟基基团，以此在规范地综合加工和层析之后以90％的量提供了酸9。通过在0℃下用在二氯甲烷中的三氟醋酸处理1小时，BOC基团的选择性的排除是有效的。产生的胺盐再于具有含水碳酸氢钠情况下与在二噁烷中的商用(Aldrich，Milwaukee)Fmoc-琥珀酰亚胺衍生物反应，在层析后以65％的获得量提供Fmoc-保护的L*A等配物10。被保护的等配物10被用于随机序列抑制物库的制备。实验过程
N-(叔丁氧羰基)-L-亮氨酸(2)
将80mL 10％氢氧化钠加入到于140mL二乙醚中的L-亮氨酸的10g(76.2mmol)上清液中。在所有固体物溶解后，在反应混合物中加入20mL(87.1mmol)的BOC2O。在23℃下，搅拌获得的反应混合物12小时。这段时间之后，层次分开，在0℃下小心仔细地将1N水溶盐酸加入到含水层使其酸化到pH1。产生的混合物用乙酸乙酯(3×100mL)提取。有机层结合，将其用盐水冲洗并用无水硫酸钠干燥。溶剂在减少压力情况下被除去并提供了标题所示的产物，此产物不需进一步提纯(获97％的量)直接被用于下一步的反应。1H核磁共振(400MHz CDCl3)δ4.89(broad d，1H，J＝8.3Hz)、4.31(m、1H)、1.74-1.49(m、3H)、1.44(s.9H)、0.95(d、6H，J＝6.5Hz)。
N-(叔丁氧羰基)-L-亮氨酸-N′-甲氧基-N′-甲基酰胺(3)
在0℃，氮气环境下的干二氯甲烷(25mL)中的N、O-二甲羟胺氢氯化物搅拌溶液(5.52g，566mmol)，并一滴一滴地加入甲基哌啶(6.9mL、56.6mmol)。于0℃下搅拌生成的混合物30分钟。于氮气环境下，在分离品瓶中，N-(叔丁氧羰基)-L-亮氨酸(1)(11.9g、51.4mmol)溶于THF(45mL)和二氯甲烷(180mL)中。生成的溶液冷却到-20℃。将1-甲基哌啶(6.9mL、56.6mmol)加入到此溶液中，随后加入异丁基氯甲酸(7.3mL、56.6mmol)。在-20℃下，搅拌生成的混合物5分钟并将N、O-二甲基羟胺上面液体加入其中。将反应混合物保持在-20℃中30分钟，然后再加温至23℃。用水猝灭反应，层次分离开。含水层用二氯甲烷提取(3×100mL)。结合的有机层用10％柠檬酸、饱和的重碳酸钠和盐水冲洗。有机层经过脱水硫酸钠干燥并在减少的压力下浓缩。用急骤硅凝胶层析(25％乙酸乙酯/己烷)将剩余物提纯，得到了为浅黄色油的标题所示的化合物3(13.8g，97％)。1H核磁共振(400MHz、CDCl3)δ5.06(broad d，1H，J＝9.1Hz)，4.70(m、1H)，3.82(s，3H)、3.13(s，3H)，1.70(m、1H)，1.46-1.36(m、2H)1.41(s，9H)，0.93(dd、6H、J＝6.5，14.2Hz)。
N-N-(叔丁氧羰基)-L-亮氨酸(4)
于-40℃，氮气环境下，在干二乙醚(60mL)中搅拌的氢化锂铝(770mg，20.3mmol)上清液中加入在二乙醚(20mL)中的N-(叔丁氧羰基)-L-亮氨酸-N′-甲氧基-N′-甲基酰胺(5.05g、18.4mmol)。搅拌生成的反应混合物30分钟。这段时间以后，用10％的硫酸氢钠溶液(30mL)猝灭反应。将获得的反应混合物加温至23℃并在此温度下搅拌30分钟。过滤生成的溶液，用两份二乙醚冲洗过滤的饼状物。用饱和的重碳酸钠、盐水冲洗结合的有机层并经过脱水硫酸镁干燥。在减压下溶剂的蒸发提供了为浅黄色油的标题所示的醛4(3.14g)。不经进一步提纯，生成的醛立即就可应用。1H核磁共振(400MHz，CDCl3)δ9.5(s，1H)，4.9(s，1H)，4.2(broadm，1H)，1.8-1.6(m，2H)，1.44(s，9H)，1.49-1.39(m，1H)，0.96(dd，6H.J＝2.7，6.5Hz).
乙基(4S，5S)-和(4R，5R)-5-[(叔丁氧羰基)氨基]-4-羟基-7-＝-2-＝(5)
于0℃，氮气环境情况下，在搅拌的于干THF(60mL)中的二异丙胺溶液(1.1mL，7.9mmol)内，一滴一滴地加入n-BuLi(1.6M在己烷中、4.95mL、7.9mmol)。在0℃下，搅拌生成的溶液5分钟，加温至23℃再搅拌15分钟。将混合物冷却至-78℃，再在5分钟以上的时间内，一滴一滴地加入于THF(2mL)中的乙基丙炔酸盐(ethylpropiolate)(801μL)。将混合物搅拌30分钟，然后加入于8mL干THF中的N-Boc-L-leucinal 4(1.55g，7.2mmol)。于-78℃下搅拌生成的混合物1小时。这段时间之后，用在THF(20mL)中的醋酸(5mL)猝灭反应。将反应混合物加温至23℃加入盐水溶液。层次分开，用饱和的重碳酸钠冲洗有机层并经过硫酸钠干燥。在减压下溶剂的蒸发产生了剩余物，其经过急骤硅凝胶层析的提纯提供了炔属醇5(0.96g，42％)的混合物(3∶1)。1H核磁共振(300 MHz、CDCl3)δ4.64(d，1H，J＝9.0Hz)，4.44(broad s，1H)，4.18(m，2H)，3.76(m、1H)，1.63(m，1H)、1.43-1.31(m，2H)，1.39(s、9H)，1.29-1.18(m、3H)0.89(m，6H)。
(5S、1S)-5-[(叔丁氧羰基)氨基-3-甲丁基]-二氢化呋喃-2(3H)-1(7)
在搅拌的于乙酸乙酯(20mL)中的的上面的炔属醇混合物(1.73g，5.5mmol)溶液内加入5％Pd/硫酸钡(1g)。生成的混合物在50psi被氢化1.5小时。这段时间后，催化剂通过寅式盐塞被过滤掉，滤液在减压下被浓缩。将剩余物溶于甲苯(20mL)和醋酸(100μL)中。反应混合物被回流6小时。这段时间之后，将反应冷却至23℃，溶剂蒸发后产生剩余物，将其经过急骤硅凝胶层析(40％二乙醚/己烷)提纯生成(5S、1S′)-γ-内酯7(0.94g，62.8)和(5R、1S′)-γ-内酯6(0.16g，10.7％)。内酯7：1H核磁共振(400MHZ，CDCl3)δ4.50-4.44(m，2H)，3.84-3.82(m，1H)，2.50(t，2H，J＝7.8Hz)，2.22-2.10(m，2H)，1.64-1.31(m，3H)，1.41(s，9H)，0.91(dd，6H，J＝2.2，6.7Hz)；13C核磁共振(75MHz，CDClδ177.2，156.0，82.5，79.8，51.0，42.2，28.6，28.2，24.7，24.2，23.0，21.9。
(3R、5S、1S)-5-[(叔丁氧羰基)氨基-3-甲丁基]-3-甲基二氢化呋喃-2(3H)-1(8)
在搅拌的于-78℃，氮气环境下的在干THF(8mL)内的内酯7溶液(451.8mg，1.67mmol)中，加入锂六甲二硅氨烷(3.67mL，1.0M于THF中)超过3分钟的时间。在-78℃下搅拌生成的混合物30分钟，产生烯醇锂。这段时间之后，一滴一滴地加入Mel(228μL)，在-78℃下搅拌生成的混合物20分钟。用饱和的含水氯化铵溶液猝灭反应并加温至23℃。反应混合物在减压下被浓缩，用乙酸乙酯(3×100mL)提取剩余物。用盐水冲洗结合的有机层并经过无水硫酸钠干燥。溶剂蒸发后提供的剩余物再由硅凝胶层析(15％乙酸乙酯/己烷)提纯，产生了为无定形固体的烷基化内酯8(0.36g，76％)。1H核磁共振(300MHz，CDCl3)δ4.43(broadt，1H，J＝6.3Hz)，4.33(d，1H，J＝9.6HZ)，3.78(m，1H)，2.26(m，1H)，2.35(m，1H)，1.86(m，1H)，1.63-1.24(m，3H)，1.37(s，9H)，1.21(d，3H，J＝7.5Hz)，0.87(dd，6H，J＝2.6，6.7Hz；13C核磁共振(MHZ，CDCl3)δ180.4，156.0，80.3，79.8，51.6，41.9，34.3，32.5，28.3，24.7，23.0，21.8，16.6。(2R、4S、5S)-5-[(叔丁氧羰基)氨基]-4-[(叔丁二甲基甲硅烷基)氧基]-2、7-二甲基辛酸(9)在搅拌的于THF(2mL)内的内酯8(0.33g、1.17mmol)中加入1N含水氢氧化锂溶液(5.8mL)。将生成的混合物在23℃下搅拌10小时。这段时间后，在减压下将反应混合物浓缩，再将存留的含水剩余物冷却到0℃并用25％柠檬酸溶液酸化至pH4。用乙酸乙酯(3×50mL)提取生成的酸性溶液。用盐水冲洗结合的有机层，经过硫酸钠干燥并浓缩产生相应的为白色泡沫的羟基酸(330mg)。不用进一步提纯，此羟基酸被直接用于下一步反应。
将咪唑(1.59g、23.34mmol)和叔丁二甲基氯硅烷(1.76g、11.67mmol)加入到于无水DMF中的上面的羟基酸(330mg、1.1mmol)中。在23℃下搅拌生成的混合物24小时。这段时间之后，加入MeOH(4mL)并搅拌混合物1小时。用25％柠檬酸(20mL)稀释混合物并用乙酸乙酯(3×20mL)提取。用水、盐水冲洗结合的提取物并经过无水硫酸钠干燥。溶剂蒸发后产生粘滞的油，其经过急骤硅凝胶层析(35％乙酸乙酯/己烷)提纯，生成了甲硅烷基防护酸9(0.44g，90％)。IR(neat)3300-3000(broad)，2955，2932，2859，1711cm-1；1H核磁共振(400MHz，DMSO-d6，343K)δ6.20(broad s，1H)，3.68(m，1H)，3.51(broad s，1H)，2.49-2.42(m，1H)，1.83(t，1H，J＝10.1Hz)，1.56(m，1H)，1.37(s，9H)，1.28-1.12(m，3H)，1.08(d，3H，J＝7.1Hz)，0.87(d，3H，J＝6.1Hz)0.86(s，9H)，0.82(d，3H，J＝6.5Hz)，0.084(s，3H)，0.052(s，3H)。
(2R、4S、5S)-5-[(芴甲基氧羰基)氨基]-4-[(叔丁氧羰基)氨基]-4-[(叔丁二甲基甲硅烷基)氧基]-2、7-dimethyloctanoik acid(10)
在0℃下搅拌的于二氯甲烷(2mL)中的酸9(0.17g、0.41mmol)溶液中加入三氟乙酸(500μL)。在0℃下搅拌生成的混合物1小时并将另外部分的(500μL)三氟乙酸加入到反应混合物中。再搅拌混合物30分钟，反应的进展由TLC监测。这段时间之后，在水浴温度不超过5℃并减压的情况下，小心仔细地除去溶剂。将剩余物溶解于二噁烷(3mL)和于5mL水内的碳酸氢钠(300mg)中。将在5mL二噁烷中的Fmoc-琥珀酰胺(166.5mg、0.49mmol)加入到此溶液中。于23℃搅拌生成的混合物8小时。用水(5mL)稀释混合物并用25％的含水柠檬酸将其酸化至pH4。用乙酸乙酯(3×50mL)提取酸性溶液。用盐水冲洗结合的提取物，经过硫酸钠干燥并在减压下浓缩生成了粘稠的油状剩余物。由急骤硅凝胶层析将剩余物提纯，生成为白色泡沫的Fmoc-防护酸10(137mg，61％)。1H核磁共振(400MHz，DMSO-d6，343K)δ7.84(d，3H，J＝7.4Hz)，7.66(d，2H，J＝8Hz)，7.39(t，2H，J＝7.4Hz)，7.29(m，2H)，6.8(s，1H)，4.29-4.19(m，3H)，3.74-3.59(m，2H)，2.49(m，1H)，1.88(m，1H)，1.58(m，1H)，1.31-1.17(m，3H)，1.10(d，3H，J＝7.1Hz)，0.88(s，9H)，0.82(d，6H，J＝6.2Hz)，0.089(s，3H)，0.057(s，3H)。
OM99-1和OM99-2的合成是用固体状肽合成程序来完成的，其中在第四步，亮氨酸*丙氨酸结合。通过逆相高效液相层析提纯合成的抑制剂并用质谱仪确定它们的结构。
实例8  OM99-1和OM99-2对M2蛋白酶的抑制作用
正如上述，无论有OM99-1还是有OM99-2加入，酶的活性是被测量的。如图5A所示OM99-1抑制重组M2蛋白酶。计算的Ki是3×10-8M。所用的底物是合成的荧光基因(fluorogenic)肽底物。用同样的荧光基因底物测量OM99-2对重组M2蛋白酶的抑制。如图5B所示，Ki值被测定为9.58＝10-9M。
此结果表明，预测的底物的特异性是准确的，依据预测的特异性可以设计抑制剂。
由于M2蛋白酶抑制剂必须透过血脑屏障(BBB)，在P1和P1′的残基是非常重要的。在P1′的丙氨酸的选择使之容易透过血脑屏障。丙氨酸侧链的类似物也起了作用。例如，除丙氨酸甲基侧链之外，取代的甲基基团和象甲基或乙基基团同样大小的基团也可取代丙氨酸侧链。在P1的亮氨酸也可被类似大小的基团取代或用亮氨酸侧链上的取代物取代。为了透过血脑屏障需要使抑制剂较小。因此，一种可以用OM99-1作为始点并丢弃外部的取代位点P4、P3、P3′和P4′。留下的结构天冬酰胺-亮氨酸*丙氨酸-丙氨酸(序列鉴定号：29)进一步用取代物改进为紧密结合的M2蛋白酶抑制剂，其也可以透过血脑屏障。
实例9与专门设计的抑制剂OM99-2络合的人类M2蛋白酶
      的蛋白酶区域的晶体学和X射线衍射的研究
与OM99-2络合的重组人类M2蛋白酶的晶体学情况和初步的X射线衍射数据被确定。
重组M2蛋白酶的生产
如例3所述，约50mg重组M2蛋白酶被提纯。为了最适的晶体生长，M2蛋白酶必须高度提纯。从载体pET11a-M2pd，M2蛋白酶被过度表达。此M2蛋白酶是酶原区域，其包括前体和到C-端延伸部分末端的催化区域，但不包括跨膜和细胞内区域。载体被转染到大肠杆菌BL21(DE3)中并平铺在包含有50mg/liter氨苄青霉素的ZB琼脂上。挑选单克隆体接种在100ml包含5mg氨苄青霉素的液体ZB中，在30℃下培养18小时，以220 RPM振荡。将大约15ml等份的过夜培养物接种于包含50mg氨苄青霉素的每升LB中。培养物于37℃成长，以180 RPM振荡，直到获得近0.8的600nm的最适密度。此时，通过在每升培养物中添加119mg异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，表达被诱导。诱导后继续温育3小时。
细菌被采集起来并被悬浮于50mM氨丁三醇、150mM氯化钠(pH7.5)(TN缓冲液)，以及通过与6mg溶菌酶一起保持30分钟后被溶解，随后在-20℃下被冷冻18小时。融化溶解产物并将其置于1mM氯化镁中，然后边搅拌边加入1000 Kunitz units的脱氧核糖核酸酶，保持30分钟。用包含0.1％的三硝基甲苯X-100(TNT缓冲液)的TN使容积膨胀至500ml。并搅拌溶解产物30分钟。用离心方法使包含M2蛋白酶(多于90％)的不溶包含体形成小丸状，用TNT重悬浮液冲洗并搅拌1-2小时。随后用TNT另外冲洗三次，将M2蛋白酶包含体溶解于40ml的8M尿素、1mMEDTA、1mM甘氨酸、100mM氨丁三醇碱基和100mM β-巯基乙醇(8M尿素缓冲液)中。在280nm测量光学密度，用8M尿素缓冲液膨胀的体积最终达到接近0.5的O.D.，加入足够量的β-巯基乙醇达到10mM总量，以及10mM二硫苏糖醇、1mM还原谷胱甘肽和0.1mM氧化谷胱甘肽。溶液的pH调节到10.0或更高，将其分成每个200ml的四个可分量。将每200ml快速稀释于4升20mM氨丁三醇碱基中，随之快速搅拌。立即用1M盐酸将pH调节到9.0，并将其储存于4℃下过夜。第二天早晨将稀释的M2蛋白酶溶液维持在室温下4-6小时，随之将pH调节到8.5并将烧瓶放置在4℃的房间内。下一天重复同样的过程，将pH调节到8.0。
将M2蛋白酶溶液放置于4℃下2-3周。用超滤(Millipore)和搅拌细胞(Amicon)方法将约16升的总体积浓缩至40mls，并在预先平衡到4°的转动体中以30分钟140000×g离心。重新获得的离心上清夜被用于以0.4M尿素、20mM氨丁三醇-盐酸(pH80)平衡的2.5×100cm的S-300柱上，并用同样的缓冲液以30ml/小时洗脱。M2蛋白酶的活性部分被收集，并进一步用1ml Resource-Q(Pharmacia)柱以快速液相层析提纯。将样本过滤并用于Resource-Q柱上，其以0.4M尿素、50mM氨丁三醇-盐酸(pH8.0)平衡。在相同的缓冲液中，用0-1M氯化钠的梯度以2ml/min经30ml洗脱样本。包含M2蛋白酶的洗脱液表现接近收集用于浓度为5mg/ml结晶过程的0.4M氯化钠。
在结晶前蛋白质的氨基终端序列分别在残基28p和30p显示出两个序列起点。很明显，在制备期间通过未确定的蛋白水解活性重组前体M2蛋白酶的前肽被剪切了。
折叠的前体酶到成熟酶——M2蛋白酶的激活作用如上所述实施，即于22℃下在0.1M乙酸钠(pH4.0)中温育16小时。被激活的酶进一步在Resource-Q阴离子交换柱上用阴离子交换柱层析法提纯。酶的纯度用十二烷基硫酸钠凝胶电泳显示。在提纯的每一步中，酶的特异活性如上所述被测定以便确定酶的活性。
OM99-2的初步结晶
对与以过渡状态抑制剂OM99-2(Ki＝10nM)为基础的底物络合的提纯的M2蛋白酶进行晶体实验。OM99-2等同于在S1和S1′(亮氨酸-丙氨酸)之间的肽键用过渡状态的等配物羟基乙烯取代的八个氨基酸残基(包括在序列EVNLAAEF中的取代位点S4、S3、S2、S1、S1′、S2′、S3′和S4′)。将提纯的M2蛋白酶浓缩并与10倍超摩尔量的抑制剂混合。将混合物在室温下温育2-3小时，使抑制剂的结合尽可能完善。于20℃用悬滴蒸汽扩散步骤进行结晶实验。用各种结晶条件进行系统的搜寻得以找到M2蛋白酶/OM99-2抑制剂络合物的最适结晶条件。第一步用从Hampton Research购买的稀疏基质结晶筛选器(Sparse Matrix Crystallization Screen Kits)进行目标为覆盖大范围潜在条件的粗筛选。蛋白质的浓缩和温度被作为另外的变量。生成有希望的(微小的)结晶的条件随后被用于最优化的起始点，使用用细栅的pH、沉淀剂浓度等)。
于30％PEG8000、0.1M二甲胂酸钠和pH6.4的条件下获得M蛋白酶与抑制剂络合物的结晶。溶解结晶的十二烷基硫酸钠凝胶电泳证实，结晶的内含物为M2蛋白酶。为在Raxis IV影象板上数据的收集，将几个单独的结晶(大小约0.3mm×0.2mm×0.1mm)从结晶簇上仔细地去除。此结果显示，结晶衍射至2.6埃。图6中表示典型的蛋白质衍射型式。X-射线图象的显示与综合Denzo软件被用于显现和指示衍射的数据。Denzo证明，初级的正交晶晶格有最高度的对称性和极低的变形指数。单位细胞参数被测定为：a＝89.1埃、b＝96.6埃、c＝134.1埃、α＝β＝γ＝90°。每一结晶不对称单位有二M2蛋白酶/OM99-2络合物，结晶的Vm是2.9埃的立方/Da。衍射的消失意味着间隔基团为P212121。
现在的结晶衍射达到2.6埃，从这些数据获得的结晶结构有潜力得到原子解析等，可以推断出原子的三维位置以及抑制剂和M2蛋白酶的化学键。由于M2蛋白酶序列是其它哺乳动物天冬氨酸蛋白酶(例如，胃蛋白酶或组织蛋白酶D)的类似物，可以预测，M2蛋白酶的三维结构是与它们的结构类似的(但不是相同)。因此，在测定从当前晶体获得的衍射数据中的X-射线结构方面，很可能用已知的天冬氨酸蛋白酶晶体结构作为搜寻模型以分子替换方法获得结晶相的解析。
进一步的结晶研究
将浓缩的的M2蛋白酶与10倍过量摩尔的抑制剂混合。将混合物在室温下温育2-3小时，以使抑制剂的结合最完善，然后用离心方法用0.2微米滤器澄清。将M2蛋白酶与抑制剂络合物的晶体用等体积的酶抑制剂和完好溶液通过悬滴蒸汽扩散方法在20℃下生长。在两周的时间，于0.1M二甲胂酸钠(pH7.4)、0.2M硫酸铵和22.5％PEG8000中，获得适合衍射研究质量的晶体。晶体的典型大小约为0.4×0.4×0.2mm3。
用Rigaku X-射线发生器于Raxis-IV影象板上测量衍射数据，并由HKL程序包处理[Z.Otwinowski，W.Minor，《酶学方法》276：307(1997)]。用25％PEG8000的冷冻防护液、20％甘油、0.1M二甲胂酸钠(pH6.6)和0.2M硫酸铵处理大小约0.4×0.4×0.2mm3的单个晶体，然后用液氮急速冷却至约-180℃以便收集数据。衍射被观察到最少为1.9埃。结晶的形式为每晶体学不对称单位有二M2蛋白酶/OM99-2络合物和56％溶剂内含物的间隔基团P21。
用AmoRe，CCP4程序包有15.0-3.5埃范围的数据情况下进行分子置换。[Navaza，j.，Acta Crystallog.Sect.A.50，157(1994)]。胃蛋白酶——有22％序列同一性的人类天冬氨酸蛋白酶用作搜寻模型(PDB id 1 psn)。旋光和翻译搜寻，接着通过刚性体精练，确定了最高的解析和在不对称单位中两个分子的位置。初始的解析有22％的相关系数和0.51的R-因子。用程序CNS进行精炼[Brunger等人，Acta Crystallogr.Sect.D，54，905(1998)]。在精练前随机选择10％的反射用于Rfree探测[Bruger.A.T.，X-PLOR Version 3.1：《X-射线晶体学和核磁共振的系统》，Yale University Press，New Haven.CT(1992)]。分子图解纲要[Jones，T.A.等人，《以电子密度图建立蛋白质模型的改良方法和在这些模型中错误的定位》Acta Crystallogr.Sect.A47，110(1991)]用于图的展示和模型的建立。从初始的胃蛋白酶模型，相应的氨基酸残基被改变为按照序列排列的M2蛋白酶的残基。侧链构象是由初始的电子密度图和rotomer库决定的。用分子动力学和CNS的能最小化功能精炼此模型[Bruger，A.T.等人，ActaCrystallogr.Sect.D，554905(1998)]。第一循环精炼使Rworking下降至41％并使Rfree下降至45％。在此阶段，在略图上的电子密度清晰地显示在活性位点裂口的抑制剂的构型。在随后的对晶体精炼和图的相称的反复重述中，M2蛋白酶在链的示踪的独一无二的结构特征、次级结构、嵌入、缺失和扩展(与搜寻模型比较)被鉴定和被建造。抑制剂的制造适应电子密度。
正如在以3∑水平勾画的|Fo|-|Fc|＝图中，约440个溶剂分子被逐步加入到结构上。无结晶学对称限定和平均被用于精炼和模型建造的早期阶段。大量溶剂和双折射的总B因子的校正被应用于整个精炼过程中。最后的结构被程序PROCHECK Laskowski，R.A.等人，J.Appl.Crystallog.26，283(1993)等证实，其显示了95％的残基位于最适合的Ramachandran标绘区域。所有的主链和侧链参数符合规范标准或比其更好。最后的Rworking和Rfree＝分别为18％和22％。精炼的统计值于表2中列出。
              表2数据汇集和精炼统计值A数据统计值间隔基团                                     P21单位细胞[a，b和c in(埃)]                     53.7，85.9，109.2
    [α，β和γin degrees]               90.0，101.4，90.0分辨(埃)                                     25.0-1.9被观察的反射数目                             144164独特的反射数目                               69056Rmerge a                                    0.061(0.25)完成数据(％)[25.0-1.9埃]                     90.0(68.5)<I/σ(I)>                                    13.7(3.0)B精炼统计值Rworking b                                    0.186Rfree b                                      0.228从理想值的RMS偏差键长(埃)                                     0.014键的角度(Deg)                                1.7水分子数目                                   445平均B-因子(埃的平方)蛋白质                                       28.5溶剂                                         32.2
aRmerge＝∑hkl∑i|Ihkl，i-<Ihkl>|/∑hkl<Ihkl>，在此Ihkl，i是ith测量的密度，<Ihkl>是Ihkl所有测量的称重的方法
bRworking(free)＝∑|Fo|-|Fc|/∑|Fo|，在此Fo和Fc是观察和计算的结构因子。圆括号中的数字是与最高分辨shell(2.00-1.9埃)相应的数字。以Fo/σ(Fo)＞＝0.0的反射被包括于精炼和R因子的计算中。
M2蛋白酶的晶体结构
M2蛋白酶的二叶结构(图7)是有球形核保守折叠的天冬氨酸蛋白酶[Tang，J.，等人，《自然》271：618-612(1978)]的特征。底物结合的裂开处(在此处抑制剂与其结合)(图7)位于两叶之间。在N-(残基1-180)和C-(残基181-385)叶(图7)(它们共享有全部2.3埃rms偏差用4埃cutoff的61个能附加原子)之间有伪双折叠对称。对胃蛋白酶相应的数目是67个原子和2.2埃。活性位点Asp32和Asp228以及围绕氢键的网状结构位于裂开处的中心(图7)并被典型的活性位点构象保存[Davies，D.R.Annu.Rev.Biophys.Chem.19：189(1990)]。但是，活性位点羧基不在共同平面，它的度数(50°)超过前面观察到的那些。
与胃蛋白酶相比N-叶的构象基本上是保守的(Sielecki等人，1990)。最重要的结构区别是在C-叶的嵌入和C-端扩展。以螺旋形和环形的四个嵌入(图7)位于临近的分子表面。包含有四个酸性残基的嵌入F在分子上是最带有负电荷的表面。与胃蛋白酶比较，这些嵌入体一起大大扩大了M2蛋白酶分子的界限(图8)。这些表面结构的变化在M2蛋白酶与其它细胞表面成分的结合上可以起到作用。嵌入体B和E位于分子的其它侧面(图7)。后者包含β链，其与C-端扩展的部分G配对。一个六残基的缺失发生在329位置，此位置于对着活性位点裂口对面瓣的环上，这样导致生成明显更易受影响的裂口。大部分C-端扩展(残基359-393)是高度有序的结构。残基369-376形成了有7个结合293-299链的氢键的β结构，而残基378-383形成了螺旋状(图7和8)。M2蛋白酶独有的两个二硫化物对(残基155/359和217/382)使两个扩展区域的末端固定C-叶。此C-端扩展比以前观察的长许多，在构象上也不相同。[Cutfield，S.M.等人，《结构》3：1261(1995)；Abad-Zapatero，C.等人，《蛋白质科学》5：640(1996)；Symersky，J.等人，《生物化学》36：12700(1997)；Yang，J.等人，Acta Crystallogr.D55，625(1999)]。在电子密度图上没有见到最后八个残基，它们可能在球形催化区域和膜锚区域之间形成连接主干。
在21个推定的前体残基中，只有最后六个(43p-48p)是在电子密度图上可见的。其余的可能是移动的。在哺乳动物细胞培养物中表达的前体M蛋白酶在谷氨酸(Glu33p)上的N-端位置。但是，存在于残基43p-44p的精氨酸-精氨酸序列是前体蛋白(例如，前凝乳酶)加工的频率信号[Corvol，P.等人，《高血压》5：13-9(1983)]。由此剪切衍生的重组M2蛋白酶具有完全的活性。残基28p-42p的移动性提示，它们不是成熟M2蛋白酶结构的一部分。
M2蛋白酶与OM99-2的相互作用
在活性位点裂口处八个残基抑制剂OM99-2的结合与其它天冬氨酸蛋白酶抑制剂络合物共有一些结构特征[Davies，D.R.，Annu.Rev.Biophys.Chem.19，189(1990)；Bailey和Cooper，(1994)；Dealwis等人，(1994)]。这些包括，在连接于过渡状态等配物羟基的两个活性位点天冬氨酸之间的四个氢键、瓣(残基69-75)对抑制剂中央部分的覆盖和连接于抑制剂骨架的十个氢键(图9)。除了连接于甘氨酸(Gly11)和酪氨酸(Tyr198)的氢键是M2蛋白酶所独特的之外，在天冬氨酸蛋白酶中，后者的大部分是高度保守的[Davies，D.R.Annu.Rev.Biophys.Chem.19，189(1990)；Bailey和Cooper，(1994)；Dealwis等人，(1994)]。这些观察阐明了，通过其成为底物肽骨架的M2蛋白酶过渡状态模板的方式以及催化机制与其它天冬氨酸蛋白酶是类似的。但是，这些共同的特征在设计有着高度选择性的特异性M2蛋白酶抑制剂中，不是决定性的因素。
对设计抑制剂药物重要的观察是，同个别抑制剂侧链(图9)联系的M2蛋白酶的残基与其它天冬氨酸蛋白酶有很大的区别。这些侧链的联系对于设计有高度选择性的紧密结合的抑制剂是重要的。OM99-2的五个N-端残基具有扩展的构象，除了P1′丙氨酸例外，所有的与在活性位点裂口处(图9)的酶残基都具有清晰确定的联系(在抑制剂侧链4埃内)。
蛋白酶S4取代位点大部分是疏水的并对溶剂是开放的。抑制剂P4谷氨酸侧链的位置是由结合于甘氨酸(Gly11)、P2天冬酰胺(图9)以及附近的精氨酸(Arg235)和精氨酸(Arg307)侧链的氢键确定的，这解释了为什么OM99-2没有此残基会引起Ki的10倍增加。同样，蛋白酶S2取代位点也是比较疏水和对溶剂开放的。抑制剂P2天冬酰胺侧链具有结合于P4谷氨酸和精氨酸(Arg235)的氢键。比较小的S2残基丝氨酸(Ser325)和丝氨酸(Ser327)在胃蛋白酶分别为谷氨酰胺和甲硫氨酸)可以适合于大于天冬酰胺的侧链。由于缺失胃蛋白酶螺旋hH2，包含大部分疏水残基的的M2蛋白酶S1和S3取代位点具有与胃蛋白酶非常不同的构象[Dealwis等人，(1994)]。P3缬氨酸和P1亮氨酸的抑制剂侧链互相紧密包在一起，与酶具有坚固的疏水联系(图9)，特别是P3与酪氨酸(Tyr71)和苯丙氨酸(Phe108)相互作用。在天然APPβ-分泌酶位点，P2和P1残基分别是赖氨酸和甲硫氨酸。瑞典突变APP在这些位置分别是天冬酰胺和亮氨酸，致使生成比天然APP和由Mullan，M.等人[Nat.Genet.2，340(1992)]描述的阿尔茨海默氏症(AD)的早期发作的Kcat/Km增加60倍。当前的结构提示，抑制剂P2赖氨酸将其正电荷置于与丢失结合于精氨酸(Arg235)的氢键的精氨酸(Arg235)不适宜的相互作用的位置上，而与在此位点的亮氨酸(图10)相比较，P1甲硫氨酸与M2蛋白酶有不太适宜的联系。由于同于APP中一样，在此位置的P1′丙氨酸和天冬氨酸可能被与精氨酸(Arg228)的相互作用所容纳，可以见到与M2蛋白酶无紧密联系。
抑制剂链的方向转向P2′及其使P3′和P4′朝向蛋白质表面(图10)。结果，P2′丙氨酸的侧链位置从规则的扩展构象偏离。P3′谷氨酸和P4′苯丙氨酸的侧链都指向这些分子表面，它们与蛋白酶有不太重要的相互作用(图10)。比较高的B-因子(谷氨酸为58.2埃的平方，苯丙氨酸为75.6埃的平方)和不太确定的电子密度提示，与高血压蛋白原酶抑制剂(CH-66)络合物(Dealwis等人，1994)中的S3′和S4′取代位点的确定的结构对照，这两个残基的移动性较强。这些高血压蛋白原酶取代位点(在胃蛋白酶数目中的残基292-297)的局部等同区域在M2蛋白酶中缺失。这些观察提示，OM99-2的三个C-端残基的构象可能是M2蛋白酶的功能特征，可能是导致长蛋白底物离开活性位点裂口的途径。
             实例10    应用晶体结构设计抑制剂
药物学可接受的抑制剂药物一般大小限于800道尔顿以下。至于M2蛋白酶，由于需要药物透过血脑屏障，此要求甚至更严格[Kearney和Aweeka，(1999)]。在当前的模型中，从P4到P2′很好确定的取代位点的结构为合理地设计这样的药物提供了足够的模板区域。正如在此晶体结构中揭示的那样，独特的抑制剂侧链与酶的相应取代位点的空间关系允许在这些位置的每一个位置设计新的抑制剂结构。使取代位点P2′、P3′和P4′的独特构象具体用于M2蛋白酶抑制剂的选择也成为可能。依据当前晶体结构设计的抑制剂实例在下列内容叙述。
实例A：由于P3缬氨酸和P1亮氨酸侧链互相包在一起，在它们之间没有酶结构，它们交叉连接的侧链增加了抑制剂与M2蛋白酶的结合强度。这是因为，在与酶结合时，与它们非交叉连接的相似物相比，交叉连接的抑制剂在自由的和束缚的类型之间具有较小的熵不同[Khan，A.R.等人，《生物化学》37：16839(1998)]。交叉连接的侧链可能的结构在图11中显示。
实例B：同样的情况也存在于P4谷氨酸和P2天冬酰胺之间。当前的晶体结构显示，这些侧链已经由氢键相互结合，这样在它们之间的交叉连接也衍出处如实例A描述的结合的有利之处。交叉连接的结构在图12中显示。
实例C：依据当前的晶体结构，P1′丙氨酸侧链可被延伸以附加新的疏水的范德华力和H-键相互作用。这样设计的例子在图13中显示。
实例D：依据当前晶体结构，在P1、P2和P3区域的多肽骨架和P1-亮氨酸侧链可通过加上两个原子被桥接到环上(在图14的A和B)。甲基基团也可被加到P1亮氨酸的β-碳原子上。(图14)。
        序列表<110>俄克拉荷马州医学研究基金会<120>具有催化活性的重组MEMAPSIN蛋白酶及其应用方法<130>OMRF 179 PCT<140>尚未指定<141>2000-06-27<150>60/141，363<151>1999-06-28<150>60/168，060<151>1999-11-30<150>60/177，836<151>2000-01-25<150>60/178，368<151>2000-01-27<150>60/210，292<151>2000-06-08<160>31<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>3252<212>DNA<213>Homo sapiens<400>1gcgggagtgc tgcctgccca cggcacccag cacggcatcc ggctgcccct gcgcagcggc 60ctggggggcg cccccctggg gctgcggctg ccccgggaga ccgacgaaga gcccgaggag 120cccggccgga ggggcagctt tgtggagatg gtggacaacc tgaggggcaa gtcggggcag 180ggctactacg tggagatgac cgtgggcagc cccccgcaga cgctcaacat cctggtggat 240acaggcagca gtaactttgc agtgggtgct gccccccacc ccttcctgca tcgctactac 300cagaggcagc tgtccagcac ataccgggac ctccggaagg gtgtgtatgt gccctacacc 360cagggcaagt gggaagggga gctgggcacc gacctggtaa gcatccccca tggccccaac 420gtcactgtgc gtgccaacat tgctgccatc actgaatcag acaagttctt catcaacggc 480tccaactggg aaggcatcct ggggctggcc tatgctgaga ttgccaggcc tgacgactcc 540ctggagcctt tctttgactc tctggtaaag cagacccacg ttcccaacct cttctccctg 600cagctttgtg gtgctggctt ccccctcaac cagtctgaag tgctggcctc tgtcggaggg 660agcatgatca ttggaggtat cgaccactcg ctgtacacag gcagtctctg gtatacaccc 720atccggcggg agtggtatta tgaggtgatc attgtgcggg tggagatcaa tggacaggat 780ctgaaaatgg actgcaagga gtacaactat gacaagagca ttgtggacag tggcaccacc 840aaccttcgtt tgcccaagaa agtgtttgaa gctgcagtca aatccatcaa ggcagcctcc 900tccacggaga agttccctga tggtttctgg ctaggagagc agctggtgtg ctggcaagca 960ggcaccaccc cttggaacat tttcccagtc atctcactct acctaatggg tgaggttacc 1020aaccagtcct tccgcatcac catccttccg cagcaatacc tgcggccagt ggaagatgtg 1080gccacgtccc aagacgactg ttacaagttt gccatctcac agtcatccac gggcactgtt 1140atgggagctg ttatcatgga gggcttctac gttgtctttg atcgggcccg aaaacgaatt 1200ggctttgctg tcagcgcttg ccatgtgcac gatgagttca ggacggcagc ggtggaaggc 1260ccttttgtca ccttggacat ggaagactgt ggctacaaca ttccacagac agatgagtca 1320accctcatga ccatagccta tgtcatggct gccatctgcg ccctcttcat gctgccactc 1380tgcctcatgg tgtgtcagtg gcgctgcctc cgctgcctgc gccagcagca tgatgacttt 1440gctgatgaca tctccctgct gaagtgagga ggcccatggg cagaagatag agattcccct 1500ggaccacacc tccgtggttc actttggtca caagtaggag acacagatgg cacctgtggc 1560cagagcacct caggaccctc cccacccacc aaatgcctct gccttgatgg agaaggaaaa 1620ggctggcaag gtgggttcca gggactgtac ctgtaggaaa cagaaaagag aagaaagaag 1680cactctgctg gcgggaatac tcttggtcac ctcaaattta agtcgggaaa ttctgctgct 1740tgaaacttca gccctgaacc tttgtccacc attcctttaa attctccaac ccaaagtatt 1800cttcttttct tagtttcaga agtactggca tcacacgcag gttaccttgg cgtgtgtccc 1860tgtggtaccc tggcagagaa gagaccaagc ttgtttccct gctggccaaa gtcagtagga 1920gaggatgcac agtttgctat ttgctttaga gacagggact gtataaacaa gcctaacatt 1980ggtgcaaaga ttgcctcttg aattaaaaaa aaactagatt gactatttat acaaatgggg 2040gcggctggaa agaggagaag gagagggagt acaaagacag ggaatagtgg gatcaaagct 2100aggaaaggca gaaacacaac cactcaccag tcctagtttt agacctcatc tccaagatag 2160catcccatct cagaagatgg gtgttgtttt caatgttttc ttttctgtgg ttgcagcctg 2220accaaaagtg agatgggaag ggcttatcta gccaaagagc tcttttttag ctctcttaaa 2280tgaagtgccc actaagaagt tccacttaac acatgaattt ctgccatatt aatttcattg 2340tctctatctg aaccaccctt tattctacat atgataggca gcactgaaat atcctaaccc 2400cctaagctcc aggtgccctg tgggagagca actggactat agcagggctg ggctctgtct 2460tcctggtcat aggctcactc tttcccccaa atcttcctct ggagctttgc agccaaggtg 2520ctaaaaggaa taggtaggag acctcttcta tctaatcctt aaaagcataa tgttgaacat 2580tcattcaaca gctgatgccc tataacccct gcctggattt cttcctatta ggctataaga 2640agtagcaaga tctttacata attcagagtg gtttcattgc cttcctaccc tctctaatgg 2700cccctccatt tatttgacta aagcatcrca cagtggcact agcattatac caagagtatg 2760agaaatacag tgctttatgg ctctaacatt actgccttca gtatcaaggc tgcctggaga 2820aaggatggca gcctcagggc ttccttatgt cctccaccac aagagctcct tgatgaaggt 2880catctttttc ccctatcctg ttcttcccct ccccgctcct aatggtacgt gggtacccag 2940gctggttctt gggctaggta gtggggacca agttcattac ctccctatca gttctagcat 3000agtaaactac ggtaccagtg ttagtgggaa gagctgggtt ttcctagtat acccactgca 3060tcctactcct acctggtcaa cccgctgctt ccaggtatgg gacctgctaa gtgtggaatt 3120acctgataag ggagagggaa atacaaggag ggcctctggt gttcctggcc tcagccagct 3180gcccmcaagc cataaaccaa taaamcaaga atactgagtc taaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3240aaaaaaaaaa aa                                                     3252<210>2<211>488<212>PRT<213>Homo sapiens<220><223>提纯的Memapsin 2<220><223>氨基酸28-48是剩余的推定前体肽残基<220><223>氨基酸58-61，78，80，82-83，116，118-121，
156，166，174，246，274，276，278-281，283，和
376-377是与OM99-2抑制剂接触的残基<220><223>氨基酸54-57，61-68，73-80，86-89，109-111，
113-118，123-134，143-154，165-168，198-202，和
220-224是N-lobeβ链<220><223>氨基酸184-191和210-217 are N-lobe螺旋体<220><223>氨基酸237-240，247-249，251-256，259-260，
273-275，282-285，316-318，331-336，342-348，
354-357，366-370，372-375，380-383，390-395，
400-405，和418-420是C-lobeβ链<220><223>氨基酸286-299，307-310，350-353，384-387，
和427-431是C-lobeβ链<400>2Ala Gly Val Leu Pro Ala His Gly Thr Gln His Gly Ile Arg Leu Pro1                   5                      10                  15Leu Arg Ser Gly Leu Gly Gly Ala Pro Leu Gly Leu Arg Leu Pro Arg
           20                      25                    30Glu Thr Asp Glu Glu Pro Glu Glu Pro Gly Arg Arg Gly Ser Phe Val
      35                      40                     45Glu Met Val Asp Asn Leu Arg Gly Lys Ser Gly Gln Gly Tyr Tyr Val
 50                      55                    60Glu Met Thr Val Gly Ser Pro Pro Gln Thr Leu Asn Ile Leu Val Asp65                      70                    75                  80Thr Gly Ser Ser Asn Phe Ala Val Gly Ala Ala Pro His Pro Phe Leu
                85                      90                  95His Arg Tyr Tyr Gln Arg Gln Leu Ser Ser Thr Tyr Arg Asp Leu Arg
          100                     105                    110Lys Gly Val Tyr Val Pro Tyr Thr Gln Gly Lys Trp Glu Gly Glu Leu
      115                     120                    125Gly Thr Asp Leu Val Ser Ile Pro His Gly Pro Asn Val Thr Val Arg
130                      135                    140Ala Asn Ile Ala Ala Ile Thr Glu Ser Asp Lys Phe Phe Ile Asn Gly145                     150                     155                160Ser Asn Trp Glu Gly Ile Leu Gly Leu Ala Tyr Ala Glu Ile Ala Arg
                165                     170                 175Pro Asp Asp Ser Leu Glu Pro Phe Phe Asp Ser Leu Val Lys Gln Thr
          180                    185                    190His Val Pro Asn Leu Phe Ser Leu Gln Leu Cys Gly Ala Gly Phe Pro
      195                     200                 205Leu Asn Gln Ser Glu Val Leu Ala Ser Val Gly Gly Ser Met Ile Ile
210                     215                    220Gly Gly Ile Asp His Ser Leu Tyr Thr Gly Ser Leu Trp Tyr Thr Pro225                     230                    235                  240Ile Arg Arg Glu Trp Tyr Tyr Glu Val Ile Ile Val Arg Val Glu Ile
               245                    250                255Asn Gly Gln Asp Leu Lys Met Asp Cys Lys Glu Tyr Asn Tyr Asp Lys
        260                   265                     270Ser Ile Val Asp Ser Gly Thr Thr Asn Leu Arg Leu Pro Lys Lys Val
   275                    280                       285Phe Glu Ala Ala Val Lys Ser Ile Lys Ala Ala Ser Ser Thr Glu Lys
290                 295                         300Phe Pro Asp Gly Phe Trp Leu Gly Glu Gln Leu Val Cys Trp Gln Ala305               310                          315                 320Gly Thr Thr Pro Trp Asn Ile Phe Pro Val Ile Ser Leu Tyr Leu Met
          325                         330                 335Gly Glu Val Thr Asn Gln Ser Phe Arg Ile Thr Ile Leu Pro Gln Gln
        340                     345                     350Tyr Leu Arg Pro Val Glu Asp Val Ala Thr Ser Gln Asp Asp Cys Tyr
    355                     360                     365Lys Phe Ala Ile Ser Gln Ser Ser Thr Gly Thr Val Met Gly Ala Val
370                     375                     380Ile Met Glu Gly Phe Tyr Val Val Phe Asp Arg Ala Arg Lys Arg Ile385                     390                     395                400Gly Phe Ala Val Ser Ala Cys His Val His Asp Glu Phe Arg Thr Ala
                405                     410                 415Ala Val Glu Gly Pro Phe Val Thr Leu Asp Met Glu Asp Cys Gly Tyr
            420                     425                 430Asn Ile Pro Gln Thr Asp Glu Ser Thr Leu Met Thr Ile Ala Tyr Val
        435                     440                 445Met Ala Ala Ile Cys Ala Leu Phe Met Leu Pro Leu Cys Leu Met Val
    450                     455                 460Cys Gln Trp Arg Cys Leu Arg Cys Leu Arg Gln Gln His Asp Asp Phe465                         470                 475                480Ala Asp Asp Ile Ser Leu Leu Lys
                485<210>3<211>503<212>PRT<213>Homo sapiens<220><223>前体-memapsin 2<220><223>氨基酸1-15是载体衍生残基<220><223>氨基酸16-64是推定的前体肽<220><223>氨基酸1-13是T7启动子<220><223>氨基酸16-456是前体-memapsin 2-T1<220><223>氨基酸16-421是前体memapsin 2-T2<400>3Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg Gly Ser Met Ala1                   5                  10                    15Gly Val Leu Pro Ala His Gly Thr Gln His Gly Ile Arg Leu Pro Leu
             20                  25                      30Arg Ser Gly Leu Gly Gly Ala Pro Leu Gly Leu Arg Leu Pro Arg Glu
      35                      40                       45Thr Asp Glu Glu Pro Glu Glu Pro Gly Arg Arg Gly Ser Phe Val Glu
  50                     55                      60Met Val Asp Asn Leu Arg Gly Lys Ser Gly Gln Gly Tyr Tyr Val Glu65                    70                      75                  80Met Thr Val Gly Ser Pro Pro Gln Thr Leu Asn Ile Leu Val Asp Thr
              85                       90                   95Gly Ser Ser Asn Phe Ala Val Gly Ala Ala Pro His Pro Phe Leu His
          100                     105                    110Arg Tyr Tyr Gln Arg Gln Leu Ser Ser Thr Tyr Arg Asp Leu Arg Lys
      115                   120                     125Gly Val Tyr Val Pro Tyr Thr Gln Gly Lys Trp Glu Gly Glu Leu Gly
130                      135                     140Thr Asp Leu Val Ser Ile Pro His Gly Pro Asn Val Thr Val Arg Ala145                       150                   155                 160Asn Ile Ala Ala Ile Thr Glu Ser Asp Lys Phe Phe Ile Asn Gly Ser
                165                     170                  175Asn Trp Glu Gly Ile Leu Gly Leu Ala Tyr Ala Glu Ile Ala Arg Pro
          180                     185                     190Asp Asp Ser Leu Glu Pro Phe Phe Asp Ser Leu Val Lys Gln Thr His
    195                     200                     205Val Pro Asn Leu Phe Ser Leu Gln Leu Cys Gly Ala Gly Phe Pro Leu
210                     215                     220Asn Gln Ser Glu Val Leu Ala Ser Val Gly Gly Ser Met Ile Ile Gly225                     230                     235                 240Gly Ile Asp His Ser Leu Tyr Thr Gly Ser Leu Trp Tyr Thr Pro Ile
                245                     250                  255Arg Arg Glu Trp Tyr Tyr Glu Val Ile Ile Val Arg Val Glu Ile Asn
            260                      265                  270Gly Gln Asp Leu Lys Met Asp Cys Lys Glu Tyr Asn Tyr Asp Lys Ser
        275                     280                 285Ile Val Asp Ser Gly Thr Thr Asn Leu Arg Leu Pro Lys Lys Val Phe
    290                     295                 300Glu Ala Ala Val Lys Ser Ile Lys Ala Ala Ser Ser Thr Glu Lys Phe305                       310                   315                  320Pro Asp Gly Phe Trp Leu Gly Glu Gln Leu Val Cys Trp Gln Ala Gly
                  325                   330                 335Thr Thr Pro Trp Asn Ile Phe Pro Val Ile Ser Leu Tyr Leu Met Gly
          340                       345                 350Glu Val Thr Asn Gln Ser Phe Arg Ile Thr Ile Leu Pro Gln Gln Tyr
    355                         360                 365Leu Arg Pro Val Glu Asp Val Ala Thr Ser Gln Asp Asp Cys Tyr Lys370                     375                     380Phe Ala Ile Ser Gln Ser Ser Thr Gly Thr Val Met Gly Ala Val Ile385                     390                     395                400Met Glu Gly Phe Tyr Val Val Phe Asp Arg Ala Arg Lys Arg Ile Gly
                405                 410                     415Phe Ala Val Ser Ala Cys His Val His Asp Glu Phe Arg Thr Ala Ala
            420                 425                     430Val Glu Gly Pro Phe Val Thr Leu Asp Met Glu Asp Cys Gly Tyr Asn
        435                 440                   445Ile Pro Gln Thr Asp Glu Ser Thr Leu Met Thr Ile Ala Tyr Val Met
 450                      455                      460Ala Ala Ile Cys Ala Leu Phe Met Leu Pro Leu Cys Leu Met Val Cys465                     470                   475                  480Gln Trp Arg Cys Leu Arg Cys Leu Arg Gln Gln His Asp Asp Phe Ala
              485                   490                   495Asp Asp Ile Ser Leu Leu Lys
          500<210>4<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物<400>4Ser Glu Val Lys Met Asp Ala Glu Phe Arg1                   5                 10<210>5<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成的肽<400>5Ser Glu Val Asn Leu Asp Ala Glu Phe Arg1                   5                10<210>6<211>8<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成的肽<400>6Ser Val Asn Met Ala Glu Gly Asp1                   5<210>7<211>12<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成的肽<400>7Lys Gly Gly Val Val Ile Ala Thr Val Ile Val Lys1                   5                       10<210>8<211>4<212>PRT<213>Homo sapiens<400>8Asp Thr Ser Gly1<210>9<211>8<212>PRT<213>Homo sapiens<400>9Leu Val Asn Met Ala Glu Gly Asp1                   5<210>10<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物<400>10ggtaagcatc ccccatggcc ccaacgtc                                          28<210>11<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物<400>11gacgttgggg ccatggggga tgcttacc                                          28<210>12<211>34<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物<400>12acgttgtctt tgatcgggcc cgaaaacgaa ttgg                                    34<210>13<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物<400>13ccaattcgtt ttcgggcccg atcaaagaca acg                                      33<210>14<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物<400>14ccatcctaat acgactcact atagggc                                            27<210>15<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物<400>15actcactata                   gggctcgagc                     ggc23<210>16<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物<400>16cttttgagca agttcagcct ggttaa                                                 26<210>17<211>31<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物<400>17gaggtggctt atgagtattt cttccagggt a                                         31<210>18<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物<400>18tggcgacgac tcctggagcc cg                                               22<210>19<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物<400>19tgacaccaga ccaactggta atgg                                             24<210>20<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物<400>20catatggcgg gagtgctgcc tgcccac                                           27<210>21<211>38<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物<400>21ggatcctcac ttcagcaggg agatgtcatc agcaaagt                              38<210>22<211>8<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：氧化的胰岛素B-链<220><223>Xaa在3位点表示半胱磺酸<400>22His Leu Xaa Gly Ser His Leu Val1                   5<210>23<211>8<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：氧化的胰岛素B-链<220><223>Xaa在1位点表示半胱磺酸<400>23Xaa Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr1                  5<210>24<211>5<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成的肽<400>24Val Gly Ser Gly Val1                 5<210>25<211>7<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成的肽<400>25Val Gly Ser Gly Val Leu Leu1                   5<210>26<211>7<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成的肽<400>26Gly Val Leu Leu Ser Arg Lys1                   5<210>27<211>7<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：抑制剂<400>27Val Asn Leu Ala Ala Glu Phe1                  5<210>28<211>8<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：抑制剂<400>28Glu Val Asn Leu Ala Ala Glu Phe1                   5<210>29<211>4<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成的肽<400>29Asn Leu Ala Ala1<210>30<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成的肽<400>30Val Gly Ser Gly Val Leu Leu Ser Arg Lys1                   5                 10<210>31<211>326<212>PRT<213>Homo sapiens<220><223>氨基酸2-5，6-9，13-20，25-32，65-67，69-74，
79-87，89-91，99-106，119-122，150-154，164-167，
180-183，191-194，196-199，201-204，210-214，
221-223，258-262，265-269，和275-278是β链<220><223>氨基酸281-284，286-288，298-301，310-315，
和319-324是β链<220><223>氨基酸48-51，111-114，136-142，225-234，
249-254，271-274，和303-306是螺旋体<220><223>氨基酸12-13，30，32，34-35，73-77，111，117，
120，189，213，215，217-220，287，289，291，298，
和300是与胃酶抑素接触的残基。<220><223>胃蛋白酶<400>31Val Asp Glu Gln Pro Leu Glu Asn Tyr Leu Asp Met Glu Tyr Phe Gly1                   5                  10                     15Thr Ile Gly Ile Gly Thr Pro Ala Gln Asp Phe Thr Val Val Phe Asp
             20                  25                        30Thr Gly Ser Ser Asn Leu Trp Val Pro Ser Val Tyr Cys Ser Ser Leu
      35                       40                      45Ala Cys Thr Asn His Asn Arg Phe Asn Pro Glu Asp Ser Ser Thr Tyr
   50                    55                    60Gln Ser Thr Ser Glu Thr Val Ser Ile Thr Tyr Gly Thr Gly Ser Met65                      70                      75                   80Thr Gly Ile Leu Gly Tyr Asp Thr Val Gln Val Gly Gly Ile Ser Asp
                 85                     90                     95Thr Asn Gln Ile Phe Gly Leu Ser Glu Thr Glu Pro Gly Ser Phe Leu
         100                      105                    110Tyr Tyr Ala Pro Phe Asp Gly Ile Leu Gly Leu Ala Tyr Pro Ser Ile
     115                      120                     125Ser Ser Ser Gly Ala Thr Pro Val Phe Asp Asn Ile Trp Asn Gln Gly
  130                     135                      140Leu Val Ser Gln Asp Leu Phe Ser Val Tyr Leu Ser Ala Asp Asp Gln145                   150                    155                     160Ser Gly Ser Val Val Ile Phe Gly Gly Ile Asp Ser Ser Tyr Tyr Thr
                165                     170                 175Gly Ser Leu Asn Trp Val Pro Val Thr Val Glu Gly Tyr Trp Gln Ile
            180                      185                190Thr Val Asp Ser Ile Thr Met Asn Gly Glu Ala Ile Ala Cys Ala Glu
        195                     200                 205Gly Cys Gln Ala Ile Val Asp Thr Gly Thr Ser Leu Leu Thr Gly Pro
    210                     215                 220Thr Ser Pro Ile Ala Asn Ile Gln Ser Asp Ile Gly Ala Ser Glu Asn225                       230                   235                 240Ser Asp Gly Asp Met Val Val Ser Cys Ser Ala Ile Ser Ser Leu Pro
                   245                  250                  255Asp Ile Val Phe Thr Ile Asn Gly Val Gln Tyr Pro Val Pro Pro Ser
              260                  265                    270Ala Tyr Ile Leu Gln Ser Glu Gly Ser Cys Ile Ser Gly Phe Gln Gly
      275                     280                      285Met Asn Leu Pro Thr Glu Ser Gly Glu Leu Trp Ile Leu Gly Asp Val
290                    295                      300Phe Ile Arg Gln Tyr Phe Thr Val Phe Asp Arg Ala Asn Asn Gln Val305                     310                     315                 320Gly Leu Ala Pro Val Ala
              325

Claims (33)

1.一种提纯的重组有催化活性的memapsin 2(M2蛋白酶)。
2.根据权利要求1所述的memapsin 2(M2蛋白酶)，具有序列鉴定号2的氨基酸序列或存在于其类似物种类中的序列。
3.根据权利要求2所述的源于人类的memapsin 2(M2蛋白酶)，具有序列鉴定号2的氨基酸序列。
4.根据权利要求1所述的memapsin 2(M2蛋白酶)，不包括跨膜区域。
5.根据权利要求1所述的memapsin 2(M2蛋白酶)，在细菌中得到表达。
6.根据权利要求1所述的memapsin 2(M2蛋白酶)，分别在pH4.0下以少于或等于39.9s-1M-1和少于或等于Kcat2.45s-1，Km，1mM，Kcat/KM 2450s-1M-1的Kcat/Km剪切SEVKM/DAEFR(序列鉴定号：4)和SEVNL/DAEFR(序列鉴定号：5)。
7.一种生产有催化活性的重组M2蛋白酶的方法，其包括在它离解然后又缓慢将酶重新折叠为有催化活性的类型的情况下重组M2蛋白酶的重折叠。
8.根据权利要求7所述的方法，其中M2蛋白酶首先溶解在包括一个或更多pH大于8.0的还原剂中的8M尿素溶液中。
9.根据权利要求8所述的方法，其中M2蛋白酶然后稀释于如20mM-氨丁三醇(pH9.0)的含水缓冲液中，用1M HCl将pH缓慢调节到大约8，在提纯加工之前将溶液维持在低温中约24-48小时。
10.根据权利要求8所述的方法，其中将M2蛋白酶与如包含氧化和还原的谷胱甘肽的20mM-氨丁三醇的pH9.0的含水缓冲液快速混合，经重复处理，尿素浓缩减少至约0.4M并将溶液的pH缓慢调节到8.0。
11.根据权利要求8所述的方法，其中将M2蛋白酶溶解于8MpH10.0的尿素中，然后快速将其稀释于如20mM pH9.0的氨丁三醇碱基的含水缓冲液中，在低温下保持几小时，在室温下保持几小时，再在逐渐降低的pH下重复处理。
12.一种离析M2蛋白酶剪切抑制剂的方法，其中包括：分别加入一个或多个有催化活性重组M2蛋白酶在pH4.0下以少于或等于39.9s-1M-1和少于或等于Kcat2.45s-1，Km，1mM；Kcat/KM 2450s-1M-1的Kcat/Km剪切SEVKM/DAEFR(序列鉴定号：4)和SEVNL/DAEFR(序列鉴定号：5)的有潜力的抑制剂和M2蛋白酶的底物，并通过抑制剂筛选底物减少的剪切。
13.根据权利要求12所述的方法，其中抑制剂在小合成分子库中。
14.根据权利要求12所述的方法，其中抑制剂是从由蛋白质和肽组成的基团中选择的化合物。
15.根据权利要求12所述的方法，其中重组M2蛋白酶在遗传工程加工的细胞中表达并且将抑制剂和底物加入到细胞中。
16.根据权利要求15所述的方法，其中抑制剂是阻止或减少有催化活性的M2蛋白酶表达的寡核苷酸。
17.根据权利要求14所述的方法，其中化合物是M2蛋白酶活性位点的等配物，此活性位点是由存在两个有催化作用的天冬氨酸残基和底物结合裂口所确定的。
18.根据权利要求12所述的方法，进而包括对最大限度减少由M2蛋白酶对底物剪切的抑制剂的鉴定。
19.一种设计或获得有催化活性的M2蛋白酶的抑制剂的方法，此方法包括依据与M2蛋白酶结晶的相适或表2的参数制作抑制剂模型。
20.根据权利要求19所述的方法，包括用计算机程序建造已确定其与M2蛋白酶活性位点结合的化合物的模型，此活性位点是由存在两个有催化作用的天冬氨酸残基和底物结合裂口所确定的。
21.根据权利要求19所述的方法包括用计算机程序设计结合于M2蛋白酶活性位点的化合物，此活性位点是由存在两个有催化作用的天冬氨酸残基和底物结合裂口所确定的。
22.根据权利要求19所述的方法进而包括筛选与活性位点结合的化合物用以抑制M2蛋白酶的催化活动，所提到的活性位点是由存在两个有催化作用的天冬氨酸残基和底物结合裂口所确定的。
23.包括有化合物结合特性和化学结构的数据基础，此化合物是通过依据与M2蛋白酶结晶的相适或表2的参数制作抑制剂模型来设计和筛选的。
24.包括给病人服药来治疗或预防阿尔茨海默氏症的方法，因而需要一种与M2蛋白酶活性位点结合的M2蛋白酶抑制剂，所提到的活性位点是由存在两个有催化作用的天冬氨酸残基和底物结合裂口所确定的。
25.根据权利要求24所述的方法，其中抑制剂有少于或等于10-7M的Ki。
26.根据权利要求24所述的方法，其中抑制剂是从由蛋白质、肽、寡核苷酸和小合成分子组成的基团中选取的。
27.根据权利要求24所述的方法，其中抑制剂是依据与M2蛋白酶结晶的相适或表2的参数制作模型。
28.一种结晶M2蛋白酶，其包括由存在两个有催化作用的天冬氨酸残基和底物结合裂口所确定的活性位点。
29.根据权利要求28所述的M2蛋白酶不包括跨膜和(或)细胞内区域。
30.根据权利要求28所述的M2蛋白酶有表2中所确定的参数。
31.根据权利要求28所述的M2蛋白酶有最少3.5埃或更少的衍射。
32.根据权利要求31所述的M2蛋白酶有最少2埃或更少的衍射。
33.一种治疗或预防阿尔茨海默氏症的方法，包括给需要的个体免疫接种有催化活性的M2蛋白酶分别在pH4.0下以少于或等于39.9s-1M-1和少于或等于Kcat2.45s-1，Km，1mM；Kcat/KM2450s-1M-1的Kcat/Km剪切SEVKM/DAEFR(序列鉴定号：4)和SEVNL/DAEFR(序列鉴定号：5)，从而诱导有效量的抗体以减少内源M2蛋白酶的剪切。
CN00810930A 1999-06-28 2000-06-27 具有催化活性的重组memapsin蛋白酶及其应用方法 Pending CN1379819A (zh)

Applications Claiming Priority (10)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US14136399P 1999-06-28 1999-06-28
US60/141,363 1999-06-28
US16806099P 1999-11-30 1999-11-30
US60/168,060 1999-11-30
US17783600P 2000-01-25 2000-01-25
US60/177,836 2000-01-25
US17836800P 2000-01-27 2000-01-27
US60/178,368 2000-01-27
US21029200P 2000-06-08 2000-06-08
US60/210,292 2000-06-08

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN1379819A true CN1379819A (zh) 2002-11-13

Family

ID=27538142

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN00810930A Pending CN1379819A (zh) 1999-06-28 2000-06-27 具有催化活性的重组memapsin蛋白酶及其应用方法

Country Status (9)

Country Link
US (7) US6545127B1 (zh)
EP (2) EP1194449B1 (zh)
JP (2) JP4484410B2 (zh)
CN (1) CN1379819A (zh)
AT (1) ATE482233T1 (zh)
AU (2) AU5771500A (zh)
CA (2) CA2374346C (zh)
DE (1) DE60045005D1 (zh)
WO (2) WO2001000665A2 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108588040A (zh) * 2018-06-08 2018-09-28 中国医学科学院病原生物学研究所 重组MtMetRS、其晶体及它们在制备抗结核药物中的应用

Families Citing this family (106)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9701684D0 (en) 1997-01-28 1997-03-19 Smithkline Beecham Plc Novel compounds
DK1115874T3 (da) 1998-09-24 2009-04-20 Pharmacia & Upjohn Co Llc Alzheimer's sygdom-sekretase
US6699671B1 (en) 1998-09-24 2004-03-02 Pharmacia & Upjohn Company Alzheimer's disease secretase, APP substrates therefor, and uses therefor
US6844148B1 (en) 1998-09-24 2005-01-18 Pharmacia & Upjohn Company Alzheimer's disease secretase, APP substrates therefor, and uses therefor
US20040234976A1 (en) * 1998-09-24 2004-11-25 Gurney Mark E. Alzheimer's disease secretase, app substrates therefor, and uses therefor
US7115410B1 (en) 1999-02-10 2006-10-03 Elan Pharmaceuticals, Inc. β-secretase enzyme compositions and methods
US7456007B1 (en) 1998-12-31 2008-11-25 Elan Pharmaceuticals, Inc. β-secretase enzyme compositions and methods
CN1390232A (zh) 1999-02-10 2003-01-08 艾兰制药公司 人β分泌酶、抑制剂、其组合物和用途
JP4484410B2 (ja) * 1999-06-28 2010-06-16 オクラホマ メディカル リサーチ ファウンデーション メマプシン２のインヒビターおよびその使用
US20090162883A1 (en) * 1999-09-23 2009-06-25 Pharmacia & Upjohn Company Alzheimer's Disease Secretase, APP Substrates Thereof, and Uses Thereof
GB9924957D0 (en) * 1999-10-21 1999-12-22 Smithkline Beecham Plc Novel treatment
GB9925136D0 (en) * 1999-10-22 1999-12-22 Smithkline Beecham Plc Novel treatment
US7514408B1 (en) 1999-12-02 2009-04-07 Elan Pharmaceuticals, Inc. β-secretase enzyme compositions and methods
EP1254108A1 (en) * 2000-01-24 2002-11-06 MERCK SHARP &amp; DOHME LTD. Gamma-secretase inhibitors
ES2287044T3 (es) 2000-01-25 2007-12-16 Oklahoma Medical Research Foundation Procedimiento universal para el replegamiento de proteinas recombinantes.
ES2275675T3 (es) 2000-03-23 2007-06-16 Elan Pharmaceuticals, Inc. Compuestos y metodos para tratar la enfermedad de alzheimer.
EP1666452A2 (en) 2000-06-30 2006-06-07 Elan Pharmaceuticals, Inc. Compounds to treat Alzheimer's disease
JP2004504018A (ja) * 2000-07-19 2004-02-12 ファルマシア・アンド・アップジョン・カンパニー β−セレクターゼ活性の基質およびアッセイ
US7630838B2 (en) * 2000-09-22 2009-12-08 American Home Products Corporation Method for identifying agents that interact with beta-site APP cleaving enzyme (BACE)
US7806980B2 (en) * 2000-12-23 2010-10-05 Elan Pharmaceuticals, Inc. Method for crystallizing human beta secretase in complex with an inhibitor
US7601528B1 (en) 2000-12-23 2009-10-13 Elan Pharmaceuticals, Inc. Crystallization and structure determination of glycosylated human beta secretase, an enzyme implicated in alzheimer's disease
US7217556B1 (en) 2000-12-23 2007-05-15 Pfizer Inc Crystallization and structure determination of glycosylated human beta secretase, an enzyme implicated in Alzheimer's disease
US20040121947A1 (en) * 2000-12-28 2004-06-24 Oklahoma Medical Research Foundation Compounds which inhibit beta-secretase activity and methods of use thereof
EP1233021A3 (en) * 2001-02-20 2002-11-20 Pfizer Products Inc. An inhibitor of Beta amyloid cleavage enzyme
EP1377664A2 (en) * 2001-02-23 2004-01-07 DSM IP Assets B.V. Genes encoding proteolytic enzymes from aspargilli
US7384773B1 (en) 2001-05-10 2008-06-10 Pfizer Inc Crystal of HIV protease-cleaved human beta secretase and method for crystallization thereof
US7524668B1 (en) 2001-05-10 2009-04-28 Elan Pharmaceuticals, Inc. Crystal of human beta secretase having monoclinic space group symmetry C2 and methods for crystallization thereof
US7196163B2 (en) 2001-05-22 2007-03-27 Merk & Co., Inc. Assays using amyloid precursor proteins with modified β-secretase cleavage sites to monitor β-secretase activity
US7074901B2 (en) 2001-05-25 2006-07-11 Serono Genetics Institute S.A. Isolated human vCOL16A1 polypeptide and fragments thereof
CA2450557A1 (en) * 2001-06-11 2002-12-19 Michel Maillard Substituted aminoalcohols useful in treatment of alzheimer's disease
WO2003012089A2 (en) * 2001-07-26 2003-02-13 Astex Technology Ltd Crystal structure of beta-site app cleaving enzyme (bace) and use thereof
US7186539B1 (en) 2001-08-31 2007-03-06 Pharmacia & Upjohn Company Method for refolding enzymes
AU2002359301B2 (en) 2001-10-23 2008-07-03 Comentis, Inc. Beta-secretase inhibitors and methods of use
US20060234944A1 (en) * 2001-10-23 2006-10-19 Oklahoma Medical Reseach Foundation Beta-secretase inhibitors and methods of use
AU2002351009A1 (en) * 2001-11-06 2003-05-19 Decode Genetics Ehf. Nucleic acids encoding proteases
CH698246B1 (de) * 2001-12-20 2009-06-30 Hoffmann La Roche Test zur Identifizierung von Inhibitoren von Beta-Sekretasen.
AU2003213252A1 (en) 2002-02-21 2003-09-09 Pharmacia And Upjohn Company Modified bace
EP1481679B1 (en) 2002-03-01 2010-08-25 Takeda Pharmaceutical Company Limited Antidepressant
US7442537B1 (en) 2002-05-10 2008-10-28 Elan Pharmaceuticals, Inc. Crystals of unliganded beta secretase and/or beta secretase-like proteins and the use thereof
WO2003099202A2 (en) 2002-05-17 2003-12-04 Merck & Co., Inc. Beta-secretase inhibitors
US7166454B1 (en) 2002-05-24 2007-01-23 Schering Corporation Codon-optimized β-secretase and methods of refolding and processing
US6746303B2 (en) 2002-05-31 2004-06-08 Mattel, Inc. Flexible toy figure with wire armature
EP1527170A2 (en) * 2002-07-26 2005-05-04 Astex Technology Limited Crystal structure of beta-site app-cleaving enzyme (bace) mutants and uses thereof
US20050074456A1 (en) * 2002-12-04 2005-04-07 Marcus Ballinger Constructs for homogenously processed preparations of beta site APP-cleaving enzyme
WO2004062625A2 (en) 2003-01-07 2004-07-29 Merck & Co., Inc. Macrocyclic beta-secretase inhibitors for treatment of alzheimer's disease
US7482136B2 (en) 2003-05-02 2009-01-27 Elan Pharmaceuticals, Inc. Glycosylation variants of BACE
US7291620B2 (en) 2003-06-30 2007-11-06 Merck + Co., Inc. N-alkyl phenylcarboxamide beta-secretase inhibitors for the treatment of Alzheimer's disease
CN1909897A (zh) 2003-07-01 2007-02-07 默克公司 用于治疗阿尔茨海默病的苯基羧化物β－分泌酶抑制剂
US7829597B2 (en) 2003-10-03 2010-11-09 Merck, Sharp & Dohme, Inc. Benzylether and benzylamino beta-secretase inhibitors for the treatment of alzheimer's disease
FR2860796B1 (fr) * 2003-10-14 2006-02-10 Centre Nat Rech Scient Procede de dissociation de la molecule d'hemoglobine extracellulaire d'arenicola marina, chaines proteiques constituant ladite molecule et sequences nucleotidiques codant pour lesdites chaines proteiques
US7763609B2 (en) 2003-12-15 2010-07-27 Schering Corporation Heterocyclic aspartyl protease inhibitors
US20060019368A1 (en) * 2004-07-20 2006-01-26 Marcus Ballinger Constructs for homogenously processed preparations of beta site APP-cleaving enzyme
EP1841455A1 (en) * 2005-01-24 2007-10-10 Amgen Inc. Humanized anti-amyloid antibody
EP2457901A1 (en) * 2005-03-14 2012-05-30 High Point Pharmaceuticals, LLC Benzazole derivatives, compositions, and methods of use as B-secretase inhibitors
CA2603404A1 (en) 2005-03-30 2006-10-05 Boehringer Ingelheim International Gmbh Substituted 1,2-ethylendiamines, medicaments comprising said compound; their use and their method of manufacture
US20070092517A1 (en) * 2005-08-10 2007-04-26 Oklahoma Medical Research Foundation Truncated memapsin 2 compositions and treatments
EP1923388A4 (en) 2005-08-12 2011-03-09 Takeda Pharmaceutical BRAIN / NERVE CELL PROTECTION AND THERAPEUTIC FOR SLEEP DISORDERS
JP5030781B2 (ja) 2005-09-05 2012-09-19 良明 木曽 βセクレターゼ阻害剤
WO2007081534A2 (en) * 2005-12-22 2007-07-19 Pfizer Products Inc Method of producing catalytically active bace2 enzymes
TW200815349A (en) 2006-06-22 2008-04-01 Astrazeneca Ab New compounds
US8344002B2 (en) 2007-06-22 2013-01-01 Yoshiaki Kiso Compound having β-secretase inhibitory activity
JP5450407B2 (ja) 2007-07-06 2014-03-26 ベーリンガー インゲルハイム インターナショナル ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング 置換アミノ−キナゾリノン、前記化合物を含む薬物、それらの使用及び製造方法
US8299267B2 (en) * 2007-09-24 2012-10-30 Comentis, Inc. (3-hydroxy-4-amino-butan-2-yl) -3- (2-thiazol-2-yl-pyrrolidine-1-carbonyl) benzamide derivatives and related compounds as beta-secretase inhibitors for treating
WO2009085200A2 (en) 2007-12-21 2009-07-09 Amgen Inc. Anti-amyloid antibodies and uses thereof
EP2303926A1 (en) 2008-06-20 2011-04-06 Oklahoma Medical Research Foundation Immunogenic memapsin 2 -secretase peptides and methods of use
TW201020244A (en) 2008-11-14 2010-06-01 Astrazeneca Ab New compounds
EP2281824A1 (en) 2009-08-07 2011-02-09 Noscira, S.A. Furan-imidazolone derivatives, for the treatment of cognitive, neurodegenerative or neuronal diseases or disorders
US8956859B1 (en) 2010-08-13 2015-02-17 Aviex Technologies Llc Compositions and methods for determining successful immunization by one or more vaccines
EP3176184B1 (en) 2010-11-10 2020-02-19 F. Hoffmann-La Roche AG Anti-bace1 antibodies for neural disease immunotherapy
WO2012069428A1 (en) 2010-11-22 2012-05-31 Noscira, S.A. Bipyridine sulfonamide derivatives for the treatment of neurodegenerative diseases or conditions
PT2763979T (pt) 2011-10-07 2019-04-12 Takeda Pharmaceuticals Co Compostos de 1-arilcarbonil-4-oxi-piperidina úteis para o tratamento de doenças neurodegenerativas
WO2013181202A2 (en) 2012-05-30 2013-12-05 Astellas Pharma Inc. Chromane compounds
JP6249952B2 (ja) 2012-10-16 2017-12-20 武田薬品工業株式会社 複素環化合物
ES2695350T3 (es) 2012-12-11 2019-01-03 Takeda Pharmaceuticals Co Compuesto heterocíclico
WO2014163162A1 (ja) 2013-04-04 2014-10-09 武田薬品工業株式会社 複素環化合物
US9598398B2 (en) 2013-04-04 2017-03-21 Takeda Pharmaceutical Company Limited Heterocyclic compound
EP3152198B1 (en) 2014-06-09 2019-02-27 Takeda Pharmaceutical Company Limited Radiolabeled compounds
CN107250158B (zh) 2014-11-19 2022-03-25 基因泰克公司 抗转铁蛋白受体/抗bace1多特异性抗体和使用方法
JP6859259B2 (ja) 2014-11-19 2021-04-14 ジェネンテック， インコーポレイテッド ＢＡＣＥｌに対する抗体及び神経疾患免疫療法のためのその使用
WO2017040808A1 (en) * 2015-09-03 2017-03-09 Contact Effect, Inc. Management of tenant locations in multi-tenant environments
AU2017215021B2 (en) 2016-02-04 2020-07-23 Takeda Pharmaceutical Company Limited Substituted piperidine compound and use thereof
US9919021B2 (en) * 2016-04-15 2018-03-20 Ibet—Instituto De Biologia Experimental E Tecnológica Brain permeant peptidomimetic beta-secretase 1 inhibitors for the treatment or prophylaxis of neurological disorders or conditions
WO2018164192A1 (ja) 2017-03-08 2018-09-13 武田薬品工業株式会社 置換ピロリジン化合物およびその用途
JP6957598B2 (ja) 2017-03-08 2021-11-02 武田薬品工業株式会社 置換ピロリジン化合物およびその用途
JP7114594B2 (ja) 2017-07-28 2022-08-08 武田薬品工業株式会社 複素環化合物
EP3663281B1 (en) 2017-08-03 2022-12-28 Takeda Pharmaceutical Company Limited Heterocyclic compound and application thereof
SG11202000831XA (en) 2017-08-03 2020-02-27 Takeda Pharmaceuticals Co Heterocyclic compound and use thereof
BR112020018238A2 (pt) 2018-03-28 2020-12-29 Takeda Pharmaceutical Company Limited Compostos heterocíclicos e uso dos mesmos
EP3816153B1 (en) 2018-06-29 2023-10-18 Takeda Pharmaceutical Company Limited Heterocyclic compound and use thereof
WO2020004536A1 (ja) 2018-06-29 2020-01-02 武田薬品工業株式会社 複素環化合物およびその用途
US12071434B2 (en) 2018-12-12 2024-08-27 Takeda Pharmaceutical Company Limited Heterocyclic compound
EP3896060B1 (en) 2018-12-12 2023-08-16 Takeda Pharmaceutical Company Limited Heterocyclic compound
WO2020153414A1 (ja) 2019-01-24 2020-07-30 武田薬品工業株式会社 複素環化合物及びその用途
US20230040770A1 (en) 2019-01-31 2023-02-09 Takeda Pharmaceutical Company Limited Heterocyclic compound and use thereof
MX2022003017A (es) 2019-09-13 2022-06-14 Takeda Pharmaceuticals Co Uso de un agonista del receptor de orexina 2 para tratamiento de somnolencia excesiva.
CN114980892A (zh) 2019-09-13 2022-08-30 武田药品工业株式会社 用于治疗发作性睡病的tak-925
JP2021080177A (ja) 2019-11-14 2021-05-27 武田薬品工業株式会社 複素環化合物及びその用途
CN115003670A (zh) 2019-11-27 2022-09-02 武田药品工业株式会社 杂环化合物
JP2021183586A (ja) 2020-05-22 2021-12-02 武田薬品工業株式会社 複素環化合物
JP2021183587A (ja) 2020-05-22 2021-12-02 武田薬品工業株式会社 複素環化合物
WO2022190060A1 (en) 2021-03-12 2022-09-15 Takeda Pharmaceutical Company Limited An orexin 2 receptor agonist for the treatment of an orexin-mediated disease or disorder
WO2023090268A1 (ja) 2021-11-17 2023-05-25 武田薬品工業株式会社 細胞の製造方法
WO2023199091A1 (en) 2022-04-12 2023-10-19 Takeda Pharmaceutical Company Limited Heterocyclic compound
US11987586B1 (en) 2022-10-31 2024-05-21 Takeda Pharmaceutical Company Limited Pyrrolo[1,2-c]imidazole derivatives as orexin type 2 receptor agonists
WO2024116086A1 (en) 2022-11-30 2024-06-06 Takeda Pharmaceutical Company Limited Heterocyclic compound and use thereof
US20240309016A1 (en) 2023-03-16 2024-09-19 Takeda Pharmaceutical Company Limited Macrocyclic heterocycle compounds and use thereof

Family Cites Families (104)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US81634A (en) * 1868-09-01 Improved kailway-switch
US55459A (en) * 1866-06-12 Improvement in artificial legs
US72050A (en) * 1867-12-10 Improvement in horse hiy-foeks
US111365A (en) * 1871-01-31 Improvement in combined rocking sofas and bedsteads
US159991A (en) * 1875-02-16 Improvement in shoe-tips
US4235871A (en) * 1978-02-24 1980-11-25 Papahadjopoulos Demetrios P Method of encapsulating biologically active materials in lipid vesicles
US4235877A (en) * 1979-06-27 1980-11-25 Merck & Co., Inc. Liposome particle containing viral or bacterial antigenic subunit
US4391904A (en) * 1979-12-26 1983-07-05 Syva Company Test strip kits in immunoassays and compositions therein
US4501728A (en) * 1983-01-06 1985-02-26 Technology Unlimited, Inc. Masking of liposomes from RES recognition
US5019369A (en) * 1984-10-22 1991-05-28 Vestar, Inc. Method of targeting tumors in humans
US4945050A (en) * 1984-11-13 1990-07-31 Cornell Research Foundation, Inc. Method for transporting substances into living cells and tissues and apparatus therefor
US5036006A (en) * 1984-11-13 1991-07-30 Cornell Research Foundation, Inc. Method for transporting substances into living cells and tissues and apparatus therefor
US4797368A (en) * 1985-03-15 1989-01-10 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Adeno-associated virus as eukaryotic expression vector
US5139941A (en) * 1985-10-31 1992-08-18 University Of Florida Research Foundation, Inc. AAV transduction vectors
US4946778A (en) * 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US4837028A (en) * 1986-12-24 1989-06-06 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US5219740A (en) * 1987-02-13 1993-06-15 Fred Hutchinson Cancer Research Center Retroviral gene transfer into diploid fibroblasts for gene therapy
US5132405A (en) * 1987-05-21 1992-07-21 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic antibody binding sites
US4985544A (en) 1987-08-04 1991-01-15 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for renaturing fish growth hormone
DE10399032I1 (de) 1987-08-28 2004-01-29 Health Research Inc Rekombinante Viren.
US5591624A (en) * 1988-03-21 1997-01-07 Chiron Viagene, Inc. Retroviral packaging cell lines
US4923967A (en) * 1988-09-26 1990-05-08 Eli Lilly And Company Purification and refolding of recombinant proteins
GB8823869D0 (en) * 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
US5703055A (en) * 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
EP0845537A1 (en) 1989-08-18 1998-06-03 Chiron Corporation Recombinant retroviruses delivering vector constructs to target cells
US5221607A (en) 1989-09-18 1993-06-22 Scios Nova Inc. Assays and reagents for amyloid deposition
US5286634A (en) * 1989-09-28 1994-02-15 Stadler Joan K Synergistic method for host cell transformation
DK0452457T3 (da) 1989-11-03 1998-03-02 Univ Vanderbilt Fremgangsmåde til in vivo fjernelse af funktionelle fremmede gener
FR2658432B1 (fr) 1990-02-22 1994-07-01 Medgenix Group Sa Microspheres pour la liberation controlee des substances hydrosolubles et procede de preparation.
US5279833A (en) * 1990-04-04 1994-01-18 Yale University Liposomal transfection of nucleic acids into animal cells
US5235043A (en) * 1990-04-06 1993-08-10 Synergen, Inc. Production of biologically active, recombinant members of the ngf/bdnf family of neurotrophic proteins
US5204253A (en) * 1990-05-29 1993-04-20 E. I. Du Pont De Nemours And Company Method and apparatus for introducing biological substances into living cells
US5308854A (en) * 1990-06-18 1994-05-03 Merck & Co., Inc. Inhibitors of HIV reverse transcriptase
US5252463A (en) 1990-06-22 1993-10-12 The Du Pont Merck Pharmaceutical Company Clipsin, a chymotrypsin-like protease and method of using same
WO1992001070A1 (en) 1990-07-09 1992-01-23 The United States Of America, As Represented By The Secretary, U.S. Department Of Commerce High efficiency packaging of mutant adeno-associated virus using amber suppressions
MY109299A (en) 1990-08-15 1996-12-31 Virogenetics Corp Recombinant pox virus encoding flaviviral structural proteins
US5200339A (en) 1990-08-17 1993-04-06 Abraham Carmela R Proteases causing abnormal degradation of amyloid β-protein precursor
US5661016A (en) * 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
ATE158021T1 (de) * 1990-08-29 1997-09-15 Genpharm Int Produktion und nützung nicht-menschliche transgentiere zur produktion heterologe antikörper
US5633425A (en) * 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5625126A (en) * 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5545806A (en) * 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5192668A (en) * 1990-10-11 1993-03-09 Merck & Co., Inc. Synthesis of protease inhibitor
US5187074A (en) * 1990-10-11 1993-02-16 Merck & Co., Inc. Method of hydroxylation with ATCC 55086
US5173414A (en) * 1990-10-30 1992-12-22 Applied Immune Sciences, Inc. Production of recombinant adeno-associated virus vectors
ES2197145T3 (es) 1991-08-20 2004-01-01 The Government Of The Usa As Represented By The Secretary Of The Deptm. Of Health And Human Services Transferencia de genes mediada por adenovirus al gastrointestinal.
WO1993008184A1 (en) * 1991-10-23 1993-04-29 Merck & Co., Inc. Hiv protease inhibitors
US5413999A (en) * 1991-11-08 1995-05-09 Merck & Co., Inc. HIV protease inhibitors useful for the treatment of AIDS
IL105793A0 (en) 1992-05-28 1993-09-22 Lilly Co Eli Protease and related dna compounds
US5587308A (en) 1992-06-02 1996-12-24 The United States Of America As Represented By The Department Of Health & Human Services Modified adeno-associated virus vector capable of expression from a novel promoter
EP0646178A1 (en) 1992-06-04 1995-04-05 The Regents Of The University Of California expression cassette with regularoty regions functional in the mammmlian host
US5519021A (en) * 1992-08-07 1996-05-21 Merck & Co., Inc. Benzoxazinones as inhibitors of HIV reverse transcriptase
CA2163129A1 (en) 1993-05-17 1994-11-24 Flossie Wong-Staal Ribozyme gene therapy for hiv infection and aids
US5804566A (en) * 1993-08-26 1998-09-08 The Regents Of The University Of California Methods and devices for immunizing a host through administration of naked polynucleotides with encode allergenic peptides
US5679647A (en) * 1993-08-26 1997-10-21 The Regents Of The University Of California Methods and devices for immunizing a host against tumor-associated antigens through administration of naked polynucleotides which encode tumor-associated antigenic peptides
US6015686A (en) * 1993-09-15 2000-01-18 Chiron Viagene, Inc. Eukaryotic layered vector initiation systems
AU7973994A (en) * 1993-10-13 1995-05-04 Merck & Co., Inc. Combination therapy for hiv infection
US5739118A (en) * 1994-04-01 1998-04-14 Apollon, Inc. Compositions and methods for delivery of genetic material
US5476874A (en) * 1994-06-22 1995-12-19 Merck & Co., Inc. New HIV protease inhibitors
US5736524A (en) * 1994-11-14 1998-04-07 Merck & Co.,. Inc. Polynucleotide tuberculosis vaccine
US5986054A (en) 1995-04-28 1999-11-16 The Hospital For Sick Children, Hsc Research And Development Limited Partnership Genetic sequences and proteins related to alzheimer's disease
US5922687A (en) * 1995-05-04 1999-07-13 Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Intracellular delivery of nucleic acids using pressure
WO1996040885A2 (en) * 1995-06-07 1996-12-19 Athena Neurosciences, Inc. β-SECRETASE, ANTIBODIES TO β-SECRETASE, AND ASSAYS FOR DETECTING β-SECRETASE INHIBITION
US5744346A (en) 1995-06-07 1998-04-28 Athena Neurosciences, Inc. β-secretase
US6329163B1 (en) 1995-06-07 2001-12-11 Elan Pharmaceuticals, Inc. Assays for detecting β-secretase inhibition
US6221645B1 (en) * 1995-06-07 2001-04-24 Elan Pharmaceuticals, Inc. β-secretase antibody
US5978740A (en) 1995-08-09 1999-11-02 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Molecules comprising a calcineurin-like binding pocket and encoded data storage medium capable of graphically displaying them
WO1997027296A1 (en) 1996-01-26 1997-07-31 Hsc Research And Development Limited Partnership Nucleic acids and proteins related to alzheimer's disease, and uses therefor
US5846978A (en) * 1996-05-02 1998-12-08 Merck & Co., Inc. HIV protease inhibitors useful for the treatment of AIDS
EP0812916A3 (en) 1996-06-14 1998-12-09 Smithkline Beecham Corporation Cathepsin k gene
DE19641180A1 (de) 1996-09-24 1998-03-26 Schering Ag Verfahren zur Darstellung von APP-Sekretase Modulation und deren Verwendung als Mittel zur Behandlung der Alzheimer'schen Erkrankung
WO1998015828A1 (en) 1996-10-07 1998-04-16 Scios Inc. Method to identify direct inhibitors of the beta-amyloid forming enzyme gamma-secretase
WO1998021589A1 (en) 1996-11-15 1998-05-22 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Screening for modulators of amyloid processing
US6207710B1 (en) * 1996-11-22 2001-03-27 Elan Pharmaceuticals, Inc. Compounds for inhibiting β-amyloid peptide release and/or its synthesis
AU1684097A (en) 1996-12-11 1998-07-03 Athena Neurosciences, Inc. Beta-secretase isolated from human 293 cells
GB9701684D0 (en) * 1997-01-28 1997-03-19 Smithkline Beecham Plc Novel compounds
US6077682A (en) 1998-03-19 2000-06-20 University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey Methods of identifying inhibitors of sensor histidine kinases through rational drug design
WO1999051752A1 (fr) 1998-03-31 1999-10-14 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha LIGNEE CELLULAIRE N'EXPRIMANT PAS UNE ACTIVITE DE β-SECRETASE
EP1084240A1 (fr) 1998-06-05 2001-03-21 Aventis Pharma S.A. Polypeptides possedant une activite de type beta-secretase
US20040234976A1 (en) * 1998-09-24 2004-11-25 Gurney Mark E. Alzheimer's disease secretase, app substrates therefor, and uses therefor
DK1115874T3 (da) 1998-09-24 2009-04-20 Pharmacia & Upjohn Co Llc Alzheimer's sygdom-sekretase
US6699671B1 (en) * 1998-09-24 2004-03-02 Pharmacia & Upjohn Company Alzheimer's disease secretase, APP substrates therefor, and uses therefor
US6844148B1 (en) * 1998-09-24 2005-01-18 Pharmacia & Upjohn Company Alzheimer's disease secretase, APP substrates therefor, and uses therefor
US6313268B1 (en) 1998-10-16 2001-11-06 Vivian Y. H. Hook Secretases related to Alzheimer's dementia
US6245884B1 (en) 1998-10-16 2001-06-12 Vivian Y. H. Hook Secretases related to alzheimer's dementia
US7115410B1 (en) * 1999-02-10 2006-10-03 Elan Pharmaceuticals, Inc. β-secretase enzyme compositions and methods
CN1390232A (zh) 1999-02-10 2003-01-08 艾兰制药公司 人β分泌酶、抑制剂、其组合物和用途
AU3770800A (en) * 1999-03-26 2000-10-16 Amgen, Inc. Beta secretase genes and polypeptides
AU5619400A (en) 1999-06-15 2001-01-02 Elan Pharmaceuticals, Inc. Statine-derived tetrapeptide inhibitors of beta-secretase
JP4484410B2 (ja) 1999-06-28 2010-06-16 オクラホマ メディカル リサーチ ファウンデーション メマプシン２のインヒビターおよびその使用
EP1496124A1 (en) 1999-06-28 2005-01-12 Oklahoma Medical Research Foundation Catalytically active recombinant memapsin and methods of use thereof
WO2001023533A2 (en) 1999-09-23 2001-04-05 Pharmacia & Upjohn Company Alzheimer's disease secretase, app substrates therefor, and uses therefor
US6361975B1 (en) * 1999-11-16 2002-03-26 Smithkline Beecham Corporation Mouse aspartic secretase-2(mASP-2)
US6291223B1 (en) * 1999-11-23 2001-09-18 Smithkline Beecham Corporation Mouse aspartic secretase-1 (mASP1)
ES2287044T3 (es) * 2000-01-25 2007-12-16 Oklahoma Medical Research Foundation Procedimiento universal para el replegamiento de proteinas recombinantes.
ES2275675T3 (es) 2000-03-23 2007-06-16 Elan Pharmaceuticals, Inc. Compuestos y metodos para tratar la enfermedad de alzheimer.
US6713276B2 (en) * 2000-06-28 2004-03-30 Scios, Inc. Modulation of Aβ levels by β-secretase BACE2
EP1319179B1 (en) 2000-07-19 2008-03-05 Genisphere Inc. Methods for detecting and assaying nucleic acid sequences
WO2002014264A2 (en) 2000-08-11 2002-02-21 The Brigham And Women's Hospital, Inc. (hydroxyethyl)ureas as inhibitors of alzheimer's beta-amyloid production
US7630838B2 (en) * 2000-09-22 2009-12-08 American Home Products Corporation Method for identifying agents that interact with beta-site APP cleaving enzyme (BACE)
WO2002047466A2 (en) 2000-10-27 2002-06-20 The Johns Hopkins University School Of Medicine Beta-secretase transgenic organisms, anti-beta-secretase antibodies, and methods of use thereof
US20040121947A1 (en) 2000-12-28 2004-06-24 Oklahoma Medical Research Foundation Compounds which inhibit beta-secretase activity and methods of use thereof
AU2002239727C1 (en) 2000-12-28 2005-12-22 Oklahoma Medical Research Foundation Inhibitors of memapsin 2 and use thereof
US20070092517A1 (en) 2005-08-10 2007-04-26 Oklahoma Medical Research Foundation Truncated memapsin 2 compositions and treatments

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108588040A (zh) * 2018-06-08 2018-09-28 中国医学科学院病原生物学研究所 重组MtMetRS、其晶体及它们在制备抗结核药物中的应用

Also Published As

Publication number Publication date
JP2003506322A (ja) 2003-02-18
US20020115600A1 (en) 2002-08-22
US6545127B1 (en) 2003-04-08
WO2001000663A3 (en) 2001-10-04
US7244708B2 (en) 2007-07-17
US20080021196A1 (en) 2008-01-24
CA2374610A1 (en) 2001-01-04
WO2001000665A3 (en) 2001-09-27
JP5138851B2 (ja) 2013-02-06
CA2374346A1 (en) 2001-01-04
US20040167075A1 (en) 2004-08-26
EP1194449B1 (en) 2010-09-22
DE60045005D1 (de) 2010-11-04
CA2374346C (en) 2010-06-22
US7829669B2 (en) 2010-11-09
WO2001000663A2 (en) 2001-01-04
AU5771500A (en) 2001-01-31
EP1194449A2 (en) 2002-04-10
EP1196609A2 (en) 2002-04-17
WO2001000665A2 (en) 2001-01-04
JP2003503072A (ja) 2003-01-28
US7678760B2 (en) 2010-03-16
WO2001000665A9 (en) 2002-07-25
ATE482233T1 (de) 2010-10-15
US20080112946A1 (en) 2008-05-15
AU5773500A (en) 2001-01-31
JP4484410B2 (ja) 2010-06-16
US20040220079A1 (en) 2004-11-04
US20020164760A1 (en) 2002-11-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN1379819A (zh) 具有催化活性的重组memapsin蛋白酶及其应用方法
Abad‐Zapatero et al. Structure of a secreted aspartic protease from C. albicans complexed with a potent inhibitor: implications for the design of antifungal agents
CN1159196A (zh) 白介素-1β转化酶抑制剂
JP2009100766A (ja) メマプシン２のインヒビターおよびその使用
CN1372566A (zh) 抗细小核糖核酸病毒的化合物和组合物,它们的药物用途,及其合成原料
AU2002239727A1 (en) Inhibitors of memapsin 2 and use thereof
CN86100721A (zh) 为人类脂皮质激素多肽编码的脱氧核糖核酸顺序，含有它的重组脱氧核糖核酸分子及制造该多肽的方法
US20020049303A1 (en) Catalytically active recombinant memapsin and methods of use thereof
CN1106001A (zh) 乳醇衍生物及其制备方法和用途
CN1196086A (zh) 釉质基质相关多肽
EP1496124A1 (en) Catalytically active recombinant memapsin and methods of use thereof
AU2004202059A1 (en) Catalytically active recombinant memapsin and methods of use thereof
AU2004202058A1 (en) Inhibitors of memapsin 2 and use thereof
CN100590132C (zh) Memapsin2的抑制剂及其用法
Lavallée Antipain and its analogues, natural product inhibitors of Cathepsin K isolated from Streptomyces
JP2000505457A (ja) アポペインの結晶構造及びその使用
CN1225015A (zh) aPL免疫反应性肽、其缀合物以及aPL抗体介导的疾病的治疗方法
CN1296971A (zh) 一种新的多肽——huntingtin蛋白相互作用蛋白65和编码这种多肽的多核苷酸
Oliver et al. Crystallographic Investigations of Subtilisin BPN’Mutants Engineered for Studying Thermal Stability
CN1485335A (zh) 一种多肽——胚胎发育蛋白65和编码这种多肽的多核苷酸
CN1301752A (zh) 一种新的多肽——plp蛋白10和编码这种多肽的多核苷酸
CN1328031A (zh) 一种新的多肽——人钴氨素结合蛋白10.45和编码这种多肽的多核苷酸

Legal Events

Date Code Title Description
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C06 Publication
PB01 Publication
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication