JP2003506322A - メマプシン2のインヒビターおよびその使用 - Google Patents
メマプシン2のインヒビターおよびその使用Info
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Abstract
Description
ラギン酸プロテアーゼであるメマプシン2(Memapsin 2)(ベータ−
セクレターゼ)の特異的インヒビターの設計および合成分野に関する。
者の1人を調べたアリオス・アルツハイマー(Alios Alzheimer
)によって1907年に最初に記載された脳の変性障害である(The ear
ly story of Alzheimer’s Disease, Bic
kら編(Raven Press, New York 1987))。ADは
、高齢者の痴呆の主な原因である。AD患者は、記憶力低下、および正常な個体
のように機能することができない程度にまで進行する知的機能に関して、深刻な
問題を有する。知的能力の低下により、患者は、性格の変化、社会的にふさわし
くない行動、および精神分裂病の様相を呈する(A Guide to the
Understanding of Alzheimer’s Diseas
e and Related Disorders, Jorm編(New Y
ork University Press, New York 1987)
)。この不可避な神経変性に対する有効な待期的または予防的治療法がないため
、ADは罹患者およびその家族にとって大きな悲劇である。
もなる神経炎性斑(neuritic plaque)に関係している。神経炎
性斑の主な構成要素の1つはアミロイドであり、これは、コンゴ レッド(Cong
o Red)によって染色される(Fisher (1983); Kelly M
icrobiol. Sci. 1(9):214−219(1984))。コ
ンゴ レッドによって染色されたアミロイド斑は、細胞外であり、明視野におい
てピンク色または赤色であり、および偏光中では複屈折する。この斑は、ポリペ
プチド筋原線維から構成され、しばしば血管周辺に存在し、脳内の様々なニュー
ロンへの血液供給を減少させる。
AD神経細胞障害の可能なメカニズムとして提唱されてきた。有力な証拠は、A
Dの遺伝的素因には異なるタイプが存在することを強力に裏付けている。まず、
分子分析により、AD患者のいるある家族においてアミロイド前駆体タンパク質
(APP)遺伝子における突然変異の証拠が得られた(Goateら,Natu
re 349:704−706(1991); Murrellら,Scien
ce 254:97−99(1991); Chartier−Harlinら
,Nature 353:844−846(1991); Mullanら,N
ature Genet. 1:345−347(1992))。早期発症AD
の優性形態の更なる遺伝子は第14染色体および第1染色体上に存在する(Ro
gaevら,Nature 376:775−778(1995);Levy−
Lahadら,Science 269:973−977(1995);She
rringtonら,Nature 375:754−760(1995))。
ADに関係する他の遺伝子座は、第19染色体上にあり、アポリポタンパク質E
の異型をコードする(Corder, Science 261:921−92
3(1993))。
いて豊富に存在する。ダウン症におけるAPPの過剰発現は、30歳を超えたダ
ウン症患者におけるADの発生の原因となりうることが認識されている(Rum
bleら,New England J. Med. 320:1446−14
52(1989));Mannら,Neurobiol. Aging 10:
397−399(1989))。また斑は、数は少ないが、正常な高齢者の脳内
にも存在する。これらの斑は主に、脳血管のアミロイド沈着物の中の主要なタン
パク質成分でもあるアミロイドβペプチド(Aβ;文献中においてβ−アミロイ
ドペプチドまたはβペプチドと呼ばれることもある)(GlennerおよびW
ong,Biochem. Biophys. Res. Comm. 120
:885:890(1984))で構成されている。アミロイドは、β−プリー
ツシート状に配列される線維状物質である。Aβは、最長で43アミノ酸を含む
疎水性ペプチドである。
angら,Nature 325:733−735(1987); Goldg
aberら,Science 235:877−880(1987); Rob
akisら,Proc. Natl. Acad. Sci. 84:4190
−4194(1987); Tanziら,Nature 331:528:5
30(1988)およびゲノムAPP DNA(Lemaireら,Nucl.
Acids Res. 17:517:522(1989); Yoshik
aiら,Gene 87, 257−263(1990))。APP cDNA
の多くの形態が同定されており、そのうち最も豊富な3つの形態は、APP69
5、APP751およびAPP770である。これらの形態は、単一の前駆体R
NAからの選択的スプライシングによって発生する。この遺伝子は18個のエキ
ソンを有する175kbを超える大きさである(Yoshikaiら, (19
90))。APPは、細胞外ドメイン、膜貫通領域および細胞質ドメインを含む
。Aβは、疎水性膜貫通ドメインのすぐ外側の最長で28個のアミノ酸と、最長
で15残基からなるこの膜貫通ドメインとで構成される。Aβは通常、脳および
他の組織(例えば心臓、腎臓および脾臓など)の中に見られる。しかしAβ沈着
物は、通常は脳内のみに豊富に見られる。
122(1990)は、APP遺伝子が2組のオランダ人家族におけるアミロイ
ド症を伴う遺伝性脳出血(hereditary cerebral hemo
rrhage with amyloidosis,HCHWA−D)と強く関
連していることを示した。これは、2人のオランダ人患者におけるAPPコード
領域の中の点突然変異の発見によって確認された(Levyら,Science
248:1124−1128(1990))。この突然変異は、Aβの22番
目(APP695の618番目、またはAPP770の693番目)のグルタミ
ン酸をグルタミンに置き換えたものであった。さらに、ある家族は、全長タンパ
ク質の717番目にアミノ酸置換をもたらす突然変異により、アルツハイマー病
に遺伝的にかかり易い(家族性アルツハイマー病(FAD)とも呼ばれる症状)
(Goateら,(1991);Murrellら(1991);Charti
er−Harlinら(1991))。これらの突然変異は、その家族において
病気と一致分離し(co‐segregate)、後期発症ADを有する家族に
おいては存在しない。717番目のアミノ酸におけるこの突然変異は、APPか
らのAβのAβ1-42形態の産生量を増加させる(Suzukiら,Scienc
e 264:1336−1340(1994))。他の突然変異形態は、全長タ
ンパク質の670番目および671番目のアミノ酸における変化を含む(Mul
lanら,(1992))。670番目および671番目のアミノ酸のこの突然
変異により、APPからの総Aβ産生量が増加する(Citronら,Natu
re 360:622−674(1992))。
膜会合メタロプロテアーゼによるβ−セクレターゼ部位での開裂が生理現象であ
ることを示唆している。この部位は原形質膜の内腔表面から離れたAPP12残
基の中に位置している。β−セクレターゼ部位(原形質膜の内腔表面から28残
基)とβ−セクレターゼ部位(膜貫通領域内)の切断により、40/42−残基
β−アミロイドペプチド(Aβ)が生成される。脳内におけるその産生および蓄
積量の上昇は、アルツハイマー病の病的発生過程における中心的な事象である(
概説についてはSelkoe,D.J.Nature 399:23−31(1
999)を参照されたい)。ヒト脳内に見られる他の膜タンパク質であるプレセ
ニリン1(Presenilin 1)は、APP(βセクレターゼ部位)での
加水分解を制御し、それ自体が原因プロテアーゼであると考えられていた(Wo
lfe,M.S.ら,Nature 398:513−517(1999))。
プレセニリン1は一本鎖分子として発現され、その急速な分解を防ぐためには、
プロテアーゼ(プレセニリナーゼ(presenilinase))によるその
プロセッシングが必要である(Thinakaran,G.ら,Neuron
17:181−190(1996)およびPodlisny,M.B.ら,Ne
urobiol.Dis.3:325−37(1997))。プレセニリナーゼ
の正体は不明である。β‐セクレターゼ部位のin vivoプロセッシングは
、Aβ産生における律速段階であると考えられており(Sinha,S.& L
ieberburg,I.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,
96:11049−11053(1999))、よって、有力な治療標的である
。
切断して42アミノ酸ペプチド(AβのAβ1-42形態)を生じるのに不可欠な酵
素の同定にかかっている。幾つかの酵素は同定されたが、活性酵素を産生するこ
とは不可能であった。活性酵素無しでは、基質特異性を確認することも、基質特
異性を決定することも、速度論や重要な活性部位残基を決定することもできない
(これらは全てインヒビターの設計に必須である)。
ベータ−アミロイドペプチドの産生に関与する重要なプロテアーゼである、ベー
タ−セクレターゼであることが分かった(概説についてはSelkoe,D.J
.Nature 399:23−31(1999)を参照されたい)。現在では
、ヒト脳内におけるベータ−アミロイドペプチドの蓄積がアルツハイマー病の主
な原因であることは、一般的に受け入れられている。ヒトメマプシン2に対して
特異的に設計されるインヒビターは、ベータ−アミロイドペプチドの形成および
アルツハイマー病の進行を阻害または減少させるものでなければならない。
ン2は、他の真核生物のアスパラギン酸プロテアーゼと相同なアミノ酸配列を有
し、このファミリーに独特なモチーフを含む。これらの構造的類似性は、メマプ
シン2および他の真核生物のアスパラギン酸プロテアーゼが共通の触媒機構を共
有することを暗示している(Davies,D.R.,Annu.Rev.Bi
ophys.Chem.19,189(1990))。アスパラギン酸プロテア
ーゼの最も優秀なインヒビターは、これらの酵素の遷移状態の模倣体(mimics)
である。これらのインヒビターは、カルボニル基の炭素とアミド基の窒素との間
の開裂された平面構造ペプチド結合が2つの四面体原子(tetrahedra
l atom)(例えばヒドロキシエチレン[−CH(OH)−CH2 −])に
置きかえられた基質様構造(もとはペプスタチンの構造において発見された(M
arciniszynら,1976))を有する。
きる小分子インヒビターとすることが好ましい。また、インヒビターは比較的製
造コストが安価であり、経口投与することができるものであることが望ましい。
これらの特性について数千もの化合物をスクリーニングするには、膨大な労力が
必要である。アルツハイマー病を治療するためのメマプシン2インヒビターを合
理的に設計するためには、メマプシン2の三次元構造、特にこのプロテアーゼの
活性部位におけるインヒビターの結合様式を知ることが重要である。
、その基質およびサブサイト特異性、ならびに重要な活性部位残基を提供するこ
とである。
よび方法を提供することである。
プシン2による切断を阻害する組成物であって、血液脳関門(BBB)を通過す
ることができる組成物を提供することである。
びスクリーニングのための手段を提供することである。
な該酵素の基質およびサブサイト特異性を決定した。活性酵素および触媒活性に
ついてのアッセイは、該酵素のインヒビターについてライブラリーをスクリーニ
ングする際に有用である。
とができる天然メマプシン2基質の基質アナログを設計した。この基質アナログ
は、メマプシン2の天然ペプチド基質に関係することが判明したペプチド配列に
基づく。この基質アナログは、メマプシン2により切断されえないアミド(ペプ
チド)結合の少なくとも1つのアナログを含む。重要なアミノ酸残基からなる部
位に等配電子体(isostere)を含む2つの基質アナログを合成する方法を開発し
、基質アナログOMR99−1およびOM99−2を合成した。OM99−2は
、オクタペプチドGlu−Val−Asn−Leu−Ala−Ala−Glu−
Phe(配列番号28)に基づき、Leu−Alaペプチド結合が遷移状態の等
配電子体であるヒドロキシエチレン基によって置換されたものである。OM99
−2の阻害定数は組換えプロメマプシン2に対して1.6×10-9Mである。こ
のインヒビターに結合したメマプシン2の結晶学を用いて、該タンパク質の三次
元構造、ならびに結合における様々な残基の重要性を決定した。
ム、ならびに有機化学および酵素学の分野で良く知られている新しいインヒビタ
ーの設計技法を用いて、新しいインヒビターを設計することができる。例えば、
インヒビターの側鎖は、阻害力を強化するために、(水素結合、疎水性相互作用
、電荷相互作用、および/またはファン−デル−ワールス相互作用を介した)よ
り強力な相互作用をもたらすように修飾することができる。このタイプの情報に
基づいて、相互作用の小さな残基を新しいインヒビター設計から排除して、イン
ヒビターの分子量を小さくしてもよい。該酵素から構造的障害を受けない側鎖を
架橋して、効果的なインヒビターの立体配座を閉じ込めることができる。またこ
のタイプの構造は、メマプシン2の結合部位を効率的に埋めつつより良い医薬的
特性を生み出すペプチド代用薬の設計を可能とする。
びに結晶構造がどのように得られたかを示す。したがって、実施例は、化合物の
ライブラリーを他のインヒビターについてスクリーニングするため、およびイン
ヒビターを設計するために、本明細書中に記載される方法および物質をどのよう
に用いるのかを示す。これらのインヒビターは、APPの切断におけるベータ−
セクレターゼメマプシン2の作用により媒介される、アルツハイマー病の予防お
よび/または治療法において有用である。
ド配列(配列番号:1)及び予測アミノ酸配列(配列番号:2)が決定された。
cDNAは、断片から構築した。ヌクレオチド配列及び推定タンパク質配列は、
それぞれ配列番号:1及び2に示されている。タンパク質は、SmithKli
ne Beecham PharmaceuticalsによるEP08554
44A(1998年7月29日公開)に記載され、後にSinhaら,Natu
re 402,537−540(1999年12月)及びVassarら,Sc
ience 286,735−741(1999年10月22日)により報告さ
れたアスパラギン酸プロテイナーゼ2(ASP2)と同一である。
ラインメントによると、プロメマプシン2は、pro領域、アスパラギン酸プロ
テアーゼ領域、及びC末端近傍の膜貫通領域を含有する。C末端ドメインは、8
0残基超の長さである。活性酵素はメマプシン2であり、そのプロ酵素がプロメ
マプシン2である。
換え酵素を発現させる必要がある。膜貫通ドメインを含有するプロテアーゼは他
には知られていない。膜貫通ドメインの存在は、これらのタンパク質の組み換え
発現を、より予測しにくく、より困難なものにする。タンパク質の分泌が起こる
ためには、膜貫通領域の除去が必要である場合が多い。しかしながら、膜貫通領
域の除去は、タンパク質の構造及び/又は機能を改変させる場合が多い。
、膜貫通ドメインの非存在下でも独立にフォールディングされ、C末端膜貫通領
域の非存在下でもプロテアーゼ活性を保持しているであろうというものであった
。膜貫通領域は膜アンカーとして機能すると考えられる。活性部位は膜貫通領域
には存在せず、活性は膜への固定を必要としないため、実施例3に記載のように
して、大腸菌において、いずれも膜貫通領域を含まない2つの異なる長さのメマ
プシン2を発現させ、精製した。トランスフェクトされた細菌の培養、組換えタ
ンパク質の合成の誘導、並びに組換えタンパク質を含有する封入体の回収及び洗
浄のための手法は、Linら(1994)により記載されたものと本質的に同様
である。しかしながら、リフォールディングは、単純ではなかった。2つの異な
るリフォールディング法はいずれも、満足のゆく結果を生じた。いずれの方法に
おいても、8M尿素/100mM β−メルカプトエタノールのような強力な変
性/還元溶液にタンパク質を溶解させた。タンパク質がリフォールディングされ
る速度及び溶液の種類が、活性にとって重要であった。一方の方法においては、
タンパク質を、8M尿素/100mM β−メルカプトエタノールに溶解させ、
次いで20容量の20mMトリス(pH9.0)で迅速に希釈し、次いで1M
HClにより徐々にpH8へと調整した。次いで、リフォールディング用溶液を
4℃で24〜48時間維持した後、精製へと進んだ。第2の方法においては、等
容量の20mMトリス、0.5mM酸化型/1.25mM還元型グルタチオン(
pH9.0)を、急速に撹拌されたプロメマプシン2を含む8M尿素/100m
M β−メルカプトエタノールへと添加する。その過程を1時間間隔でさらに3
回繰り返す。次いで、最終尿素濃度が0.4Mとなるよう、得られた溶液を十分
な容量の20mMトリス塩基に対して透析する。次いで、溶液のpHを、1M
HClにより徐々に8.0へと調整する。
クロマトグラフィ、及び/又は塩勾配を使用した溶出によりさらに精製し、還元
条件下及び非還元条件下でのSDS−PAGE分析により分析する。
るメマプシン2(M2)の存在は、該メマプシン2の存在がβ−アミロイド前駆
体タンパク質(APP)を加水分解するかもしれないことを示した。下記のよう
に、詳細な酵素的及び細胞的な研究により、M2がβ−セクレターゼとしての基
準に全て合致することが証明された。
、その球状プロテアーゼ単位が、膜表面から20〜30残基の範囲の距離で、膜
に固定されたポリペプチドを加水分解しうることを示唆した。脳の膜貫通タンパ
ク質として、APPは、可能性のある基質であり、原形質膜表面から約28残基
に位置した、そのベータ−セクレターゼ部位は、M2によるタンパク質分解の範
囲内である。
)は、ベータ−セクレターゼ部位(/により示されている)において、M2pd(
Ala-8P からAla326 までのアミノ酸を含む改変M2)により加水分解され
た。APPベータ−セクレターゼ部位に由来し、かつ細胞におけるアルファ−ベ
ータ産生のレベルを上昇させることが既知(Citron,M.et al.,
Nature 260:672−674(1992))である「スウェーデン型
変異(Swedish mutation)」(Mullan,M.et al
.,Nature Genet.2:340−342(1992))を含む第2
のペプチド(SEVNL/DAEFR)(配列番号:5)は、より高い触媒効率
でM2pdにより加水分解された。両基質は、pH4.0において最適に分解され
た。プレセニリン1のプロセシング部位に由来するペプチド(SVNM/AEG
D)(配列番号:6)も、比較的低効率の反応速度論パラメータでM2pdにより
加水分解された。APPガンマ−セクレターゼ部位に由来するペプチド(KGG
VVIATVIVK)(配列番号:7)は、M2pdにより加水分解されなかった
。ペプスタチンAによりM2pdをわずかに阻害した(およそのIC50は約0.3
mM)。反応速度論的パラメータは、プレセニリン1(kcat 、0.67s-1;
Km 、15.2mM;kcat /Km 、43.8s-1M-1)と天然APPペプチド
(kcat /Km 、39.9s-1M-1)との両方が、スウェーデン型APPペプチ
ド(kcat 、2.45s-1;Km 、1mM;Kcat /Km 、2450s-1M-1)
ほど優れた基質ではないことを示す。
か否かを決定するため、メマプシン2をHeLa細胞において一過性発現させ(
Lin,X.,et al.,FASEB J.7:1070−1080(19
93))、35S−Metで代謝的にパルス標識し、次いでSDS−ポリアクリル
アミド電気泳動及びイメージングの後、APPより生成した断片の可視化のため
、抗APP抗体により免疫沈降させた。パルスチェイス実験の順化培地(2h)
からの免疫沈降されたAPP Nβ−断片(97kDバンド)のSDS−PAG
Eパターンは、APPがM2により分解されたことを示した。APP単独でトラ
ンスフェクトされた対照、及びバフィロマイシンA1が添加されたAPPとM2
とによる共トランスフェクトを、実施した。APP βC−断片(12kD)の
SDS−PAGEパターンは、前記と同じ実験の順化培地から免疫沈降させた。
APP単独でトランスフェクトされた対照、APPとM2とによる共トランスフ
ェクト、バフィロマイシンA1を用いたAPPとM2とによる共トランスフェク
ト、スウェーデン型APPのトランスフェクション、並びにスウェーデンAPP
とM2とによる共トランスフェクションを実施した。免疫沈降されたM2(70
kD)、M2トランスフェクト細胞、長時間のフィルム感光後の非トランスフェ
クトHeLa細胞、及びHEK293細胞由来の内因性M2のSDS−PAGE
ゲルも泳動させた。異なるAPP領域に特異的な抗体を使用した免疫沈降後に順
化培地から回収されたAPP断片(100kDのベータN−断片及び95kDの
ベータN−断片)のSDS−PAGEパターンは、メマプシン2がAPPを切断
することを示した。
タN−断片(N末端からベータ−セクレターゼ部位まで)を産生し、細胞溶解物
中に12kDのベータC−断片(ベータ−セクレターゼ部位からC末端まで)を
産生した。APP単独でトランスフェクトされた対照は、ほとんど検出不可能な
ベータN−断片を産生し、ベータC−断片は産生しなかった。リソソーム/エン
ドソームの小胞内pHを上昇させることが既知であり、かつベータ−セクレター
ゼによるAPP分解を阻害することが示されているバフィロマイシンA1(Kn
ops,J.et al.,J.Biol.Chem.270:2419−24
22(1995))は、共トランスフェクト細胞におけるベータNとベータCと
の両方のAPP断片の産生を消失させた。スウェーデン型APP単独でトランス
フェクトされた細胞は、細胞溶解物中にベータC−断片バンドを産生しなかった
が、スウェーデン型APPとM2との共トランスフェクションは産生した。この
スウェーデン型ベータC−断片バンドは、野生型APPのバンドよりも強かった
。97kDのベータN−バンドも順化培地中に見られるが、その強さは野生型A
PPトランスフェクションとほぼ同等である。
て、APPのベータ−セクレターゼ部位をプロセシングすることを示している。
トランスフェクトされたM2遺伝子の発現を確立するため、パルス標識された細
胞を溶解させ、抗M2抗体により免疫沈降させた。M2遺伝子でトランスフェク
トされた細胞においては、ベータ−セクレターゼを発現することが既知のHEK
293細胞(Citron,M.et al.,Nature 260:672
−674(1992))由来の主要なバンドと同一の移動度を有する70kDの
M2バンドが見られた。また、非トランスフェクトHeLa細胞において、長い
フィルム感光の後、M2の極めて希薄なバンドが見られ、このことから、M2ト
ランスフェクションなしではベータN−断片及びベータC−断片を産生するには
不十分である極めて低いレベルの内因性M2を示した。アルファ−ベータペプチ
ドの残基1〜17を特異的に認識する抗体アルファ−ベータ1-17を用い、正確な
ベータ−セクレターゼ部位切断を確認した。APPとM2とによりトランスフェ
クトされた細胞においては、両断片に存在するAPPのN末端領域を認識する抗
体を使用して、ベータN−断片とベータN−断片との両方が可視である。抗体A
ベータ1-17は、非トランスフェクト細胞において内因性ベータ−セクレターゼに
より産生されたベータN−断片を認識する。しかしながら、この抗体は、APP
とM2とにより共トランスフェクトされた細胞に存在することが既知のベータN
−断片を認識することはできなかった。これらの観察は、ベータN−断片が、M
2によるベータ−セクレターゼ部位切断の産物であり、それがアルファ−ベータ 1-17 の認識エピトープを消失させたことを追認した。
れる。APPとM2とを共発現するHeLa細胞を、APP及びM2に対する抗
体で染色し、100×対物レンズを使用してCSLMにより同時に可視化した。
共存の領域は、黄色で出現した。
インポーズスキャンにおいて、それらの共存を明らかにした。両タンパク質の分
布は、リソソーム/エンドソームコンパートメントにおけるそれらの存在と一致
する。
そのproペプチド(2部位)及びプロテアーゼ部分(2部位)を切断すること
が見出された(表1)。前記の3つのペプチドの他に、M2pdも酸化型ウシイン
スリンB鎖及び合成ペプチドNchを切断した。天然タンパク質は、M2pdによ
り切断されなかった。
ベータ−セクレターゼとしての基準を全て満たすことを示している。(a)M2
及びAPPは、いずれも、ヒト脳に存在する膜タンパク質であり、哺乳動物細胞
において共存している。(b)M2は、合成ペプチド及び細胞内APPのベータ
−セクレターゼ部位を特異的に切断する。(c)M2は、野生型APPよりもス
ウェーデン型APPに由来するベータ−セクレターゼ部位を優先的に切断する。
(d)M2活性に酸性pHが最適であること、及び細胞中においてM2によるA
PPプロセシングがバフィロマイシンA1により阻害されることは、ベータ−セ
クレターゼによる切断が酸性小胞において起こるという以前の観察(Knops
,J.et al.,J.Biol.Chem.270:2419−2422(
1995))と一致する。酸性溶液中の組換えプロM2の活性の自然発生は、細
胞内で、このチモーゲンが自らエンドソームのような酸性小胞において活性を生
成させうることを示唆する。
、かつ類似した三次構造を有している。活性部位には2個のアスパラギン酸残基
が存在し、各残基は特徴的なアスパラギン酸プロテアーゼ配列モチーフAsp−
Thr/Ser−Gly−(配列番号:8)の内に見出される。一般に、アスパ
ラギン酸プロテアーゼには2つの相同ドメインがあり、三次構造において、基質
結合部位はこれら2つのドメインの間に位置する。アスパラギン酸プロテアーゼ
の基質結合部位は、一般に、8個のアミノ酸残基を認識する。一般に、アスパラ
ギン酸プロテアーゼにより切断されるアミド結合の両側に4個の残基が存在する
。
用の特異性に関与する。各基質残基の側鎖は、集合的にサブサイトと呼ばれる酵
素の領域により認識される。プロテアーゼサブサイトのための一般に認められて
いる記号、及びそれらの対応する基質残基を以下に示す。なお、ダブルスラッシ
ュは結合切断の位置を表す。
が、各プロテアーゼは極めて異なる基質特異性及び特異性の広さを有する。アス
パラギン酸プロテアーゼの特異性が既知となれば、その特異性に基づき、天然基
質が効率的に切断されるのを防止する様式で、アスパラギン酸プロテアーゼと相
互作用するインヒビターを設計することができる。いくつかのアスパラギン酸プ
ロテアーゼは、加水分解の成功のため、サブサイトのそれぞれにおいて多くの異
なる残基を適応させうるような特異性を有する。ペプシン及びカテプシンDは、
この型の特異性を有し、「広域」基質特異性を有すると言われる。レニンの場合
など、あるサブサイトにおいて極少数の残基のみが認識されうる場合には、その
アスパラギン酸プロテアーゼは、厳密な、又は狭い特異性を有すると言われる。
ましい残基が位置しており、かつ分解されるペプチド結合が遷移状態アナログに
置換されている特異的インヒビターを設計するために使用されうる。これらのア
ナログは、遷移状態等配電子体と呼ばれる。アスパラギン酸プロテアーゼは、加
水分解メカニズムによりアミド結合を切断する。この反応メカニズムは、アミノ
酸のβ−炭素に対する水酸化物イオンによる攻撃を含む。切断対象である結合を
介してβ−炭素に付いた他の原子にはプロトン化が起こらなければならない。β
−炭素の求電子性が不十分であるか、又は切断対象の結合に付いた原子の求核性
が不十分である場合には、その結合は加水分解メカニズムによって切断されない
であろう。遷移状態を模倣しないが、加水分解できないアナログも存在するが、
遷移状態等配電子体は、遷移状態を特異的に模倣し、かつ加水分解できない。
する反応の遷移状態中間体であることを示す。特定の酵素に対して最も高い親和
性を有するのは、基質の定常状態構造ではなく遷移状態構造である。アミド結合
の加水分解の遷移状態は、四面体であるが、定常状態構造は、平面である。アス
パラギン酸プロテアーゼの典型的な遷移状態等配電子体は、Marcinisz
ynら(1976)により、ペプスタチンにおいて最初に発見されたように、−
CH(OH)−CH2 −である。遷移状態アナログ原理は、アスパラギン酸プロ
テアーゼであるヒト免疫不全ウイルスプロテアーゼのためのインヒビター薬物に
適用され成功を収めている。これらの多くは、現在、臨床使用されている。イン
ヒビターの構造、特異性、及び型に関する情報は、Tang,Acid Pro
teases,Structure,Function and Biolog
y,Adv.in Exptl.Med.Biol.第95巻(Plenum
Press,NY 1977);Kostka,Aspartic Prote
inases and their Inhibitors(Walter d
e Gruyter,Berlin 1985);Dunn,Structur
e and Funcitons of the Aspartic Pro
teinases,Adv.in Exptl.Med.Biol.306(P
lenum Press,NY 1991);Takahashi,Aspar
tic Proteases,Structure,Funciton,Bio
logy,Biomedical Implications,Adv.in
Exptl.Med.Biol.362(Plenum Press,NY 1
995);及びJames,Aspartic Proteinases,Re
troviral and Cellular Enzymes,Adv.in
Exptl.Med.Biol.436(Plenum Press,NY
1998)に見出される。
P2 −L1 −P1 −L0 −P1 ' −L1 ' −P2 ' −L2 ' −P3 ' −L3 ' −
P4 ' −L4 ' −Yである。基質アナログの構成は、小ペプチド分子のアナログ
である。それらの基本構造は、構造/機能研究により決定されたペプチド配列に
由来する。Px により表される位置は、−L0 −により表される切断部位からの
相対的な基質特異性位置を表すことが理解される。Lx により表される組成の位
置は、各基質特異性位置Px の間の連結領域を表す。
一アミノ酸を表すであろう。本一般式において、式の各Px 部分は、アミノ酸で
あろうもののα−炭素及び側鎖官能基をいう。従って、アラニンのPx −Lx 対
のPx 部分はHC−CH3 を表す。一般的な組成のPx 部分を表す一般式は、−
R1 CR3 −である。
)、CH2 CH(CH3 )2 (ロイシンの側鎖)、(CH3 )CH(CH2 CH 3 )(イソロイシンの側鎖)、CH2 (インドール)(トリプトファンの側鎖)
、CH2 (ベンゼン)(フェニルアラニンの側鎖)、CH2 CH2 SCH3 (メ
チオニンの側鎖)、H(グリシンの側鎖)、CH2 OH(セリンの側鎖)、CH
OHCH3 (トレオニンの側鎖)、CH2 (フェノール)(チロシンの側鎖)、
CH2 SH(システインの側鎖)、CH2 CH2 OHNH2 (グルタミンの側鎖
)、CH2 CONH2 (アスパラギンの側鎖)、CH2 CH2 CH2 CH2 NH 2 (リジンの側鎖)、CH2 CH2 CH2 NHC(NH)(NH2 )(アルギニ
ンの側鎖)、CH2 (イミダゾール)(ヒスチジンの側鎖)、CH2 COOH(
アスパラギン酸の側鎖)、CH2 CH2 COOH(グルタミン酸の側鎖)、並び
にこれらの機能的な天然及び非天然の誘導体又は合成代用物(substitu
tion)である。
プシン2との結合を可能にする基であるアルケニル、アルキナル(alkyna
l)、アルケニルオキシ、及びアルキニルオキシ基でありうる。好ましくは、ア
ルケニル基、アルキニル基、アルケニルオキシ基、及びアルキニルオキシ基は、
2〜40個の炭素を有し、より好ましくは2〜20個の炭素、2〜10個の炭素
、又は2〜3個の炭素を有し、これらの機能的な天然及び非天然の誘導体又は合
成代用物でありうる。
質において、Lx は、鎖内の次のアミノ酸であろうもののアミノ部分と付いたβ
−炭素を表す。従って、Lx は、−CO−NH−により表されるであろう。Lx の一般式は、R2 により表される。一般に、R2 は、CO−HN(アミド)、C
H(OH)(CH2 )(ヒドロキシエチレン)、CH(OH)CH(OH)(ジ
ヒドロキシエチレン)、CH(OH)CH2 NH(ヒドロキシエチルアミン)、
PO(OH)CH2 (ホスフィネート)、CH2 NH(還元アミド)でありうる
。基質アナログがアスパラギン酸プロテアーゼ機能を阻害するよう機能するので
あれば、複数個のLが等配電子体でありうることが理解される。
体(mimetic)のいずれかでありうる。
関与せず、認識を妨害しない分子を表す。これらの分子は:基質アナログの分解
に対する抵抗性を与えることが好ましい。好ましい例は、加水分解できない結合
を介して基質アナログとカップリングしたアミノ酸であろう。その他の好ましい
化合物は、キャッピング剤(capping agent)であろう。さらに他
の好ましい化合物は、基質アナログの精製において使用されうるビオチンなどの
化合物であろう。
、分岐状、又は環状のアルキル基をいい、アルコキシル(alkoxyl)とは
、置換又は非置換の直鎖状、分岐状、又は環状のアルコキシをいう。好ましくは
、アルキル基及びアルコキシ基は、1〜40個の炭素を有し、より好ましくは1
〜20個の炭素、1〜10個の炭素、又は1〜3個の炭素を有する。
状又は分岐状のアルケニル基をいい、アルキニルとは、置換又は非置換の直鎖状
又は分岐状のアルキニル基をいい、アルケニルオキシとは、置換又は非置換の直
鎖状又は分岐状のアルケニルオキシをいい、アルキニルオキシとは、置換又は非
置換の直鎖状又は分岐状のアルキニルオキシをいう。好ましくは、アルケニル基
、アルキニル基、アルケニルオキシ基、及びアルキニルオキシ基は、2〜40個
の炭素を有し、より好ましくは2〜20個の炭素、2〜10個の炭素、又は2〜
3個の炭素を有する。
アリール置換基を有するアルキル基をいい、アラルキルとは、アルキル置換基を
有するアリール基をいい、複素環−アルキルとはアルキル置換基を有する複素環
基をいい、アルキル−複素環とは複素環置換基を有するアルキル基をいう。
基、及びアルキニルオキシ基の置換基は、ハロゲン、シアノ、アミノ、チオ、カ
ルボキシ、エステル、エーテル、チオエーテル、カルボキシアミド、ヒドロキシ
、又はメルカプトでありうる。さらに、前記官能基は、所望によりO、NH、又
はSなどのヘテロ原子と置換されたメチレン基を1個以上有していてもよい。
た。分析された基質の結果は表1に示されており、これらの結果から決定された
法則は以下のように要約される。 (1)メマプシン2基質の第1の特異性部位は、サブサイト部位P1 ' である。
これは、メマプシン2における基質特異性のための最も重要な決定基がアミノ酸
S1' であることを意味している。メマプシン2が基質を認識するためには、P 1 ' は小さい側鎖を含まなければならない。好ましい態様は、P1 ' 位のR1 が
H(グリシンの側鎖)、CH3 (アラニンの側鎖)、CH2 OH(セリンの側鎖
)、又はCH2 OOH(アスパラギン酸の側鎖)である基質アナログである。C
H3 (アラニンの側鎖)又はCH2 OH(セリンの側鎖)よりも構造的に小さい
R1を有する態様も、好ましい。 (2)P4 位、P3 位、P2 位、P1 位、P2 ' 位、P3 ' 位、及びP4 ' 位に
おける特異的配列要件はない。各部位は、第3法則が満たされるのであれば、任
意の他の単独アミノ酸を適合させうる。 (3)残りの7個の位置P4 、P3 、P2 、P1 、P2 ' 、P3 ' 、及びP4 '
のうちの少なくとも2個は、疎水性残基から構成されたR1 を有していなければ
ならない。残りの7個の位置P4 、P3 、P2 、P1 、P2 ' 、P3 ' 、及びP 4 ' には、少なくとも3個の疎水性残基が存在することが好ましい。疎水性基を
含む位置のための好ましいR1 基は、CH3 (アラニンの側鎖)、CH(CH3 )2 (バリンの側鎖)、CH2 CH(CH3 )2 (ロイシンの側鎖)、(CH3 )CH(CH2 CH3 )(イソロイシンの側鎖)、CH2 (インドール)(トリ
プトファンの側鎖)、CH2 (ベンゼン)(フェニルアラニンの側鎖)、CH2 CH2 SCH3 (メチオニンの側鎖)、CH2 (フェノール)(チロシンの側鎖
)である。疎水性基は大きい疎水性基であることが、より好ましい。大きい疎水
性基を含む好ましいR1 は、CH(CH3 )2 (バリンの側鎖)、CH2 CH(
CH3 )2 (ロイシンの側鎖)、(CH3 )CH(CH2 CH3 )(イソロイシ
ンの側鎖)、CH2 (インドール)(トリプトファンの側鎖)、CH2 (ベンゼ
ン)(フェニルアラニンの側鎖)、CH2 CH2 SCH3 (メチオニンの側鎖)
、CH2 (フェノール)(チロシンの側鎖)である。疎水性R1 を有する位置は
、CH(CH3 )2 (バリンの側鎖)、CH2 CH(CH3 )2 (ロイシンの側
鎖)、CH2 (ベンゼン)(フェニルアラニンの側鎖)、CH2 CH2 SCH3 (メチオニンの側鎖)、又はCH2 (フェノール)(チロシンの側鎖)であるこ
とが、最も好ましい。 (4)8個の位置P4 、P3 、P2 、P1 、P1 ' 、P2 ' 、P3 ' 、及びP4 ' は、いずれも、R1位にプロリン側鎖を有していてはならない。 (5)全てのサブサイトがアナログ中に表されたPを有している必要はない。例
えば、基質アナログは、X−P2 −L1 −P1 −L0 −P1 ' −L1 ' −P2 '
−L2 ' −P3 ' −L3 ' −Yを有してもよく、X−L1 −P1 −L0 −P1 '
−L1 ' −P2 ' −L2 ' −P3 ' −L3 ' −P4 ' −L4 ' −Yを有してもよ
い。
有する、表1に開示された配列を有するアナログである。
大分子のいずれかと結合することができる分子を単離するための全ての方法が挙
げられる。タンパク質、オリゴヌクレオチド、及び多糖が、巨大分子の例である
。例えば、所定の機能、触媒又はリガンド結合を有するオリゴヌクレオチド分子
が、「インビトロ遺伝学」と呼ばれるものにおいて、ランダムオリゴヌクレオチ
ドの複雑な混合物から単離されうる(Szostak,TIBS 19:89,
1992)。ランダムな及び決められた配列を保持する大きな分子プールを合成
し、その複雑な混合物、例えば、100μgの100ヌクレオチドRNAにおけ
る約1015個の各配列を、何らかの選択及び濃縮の過程に供する。Elling
ton and Szostak(1990)は、カラム上のリガンドと結合し
た分子のアフィニティクロマトグラフィ及びPCR増幅の繰り返しサイクルによ
り、1010個のRNA分子のうちの1個が小分子色素と結合するようフォールデ
ィングされることを推定した。かかるリガンド結合挙動を有するDNA分子も、
同様に単離されている(Ellington and Szostak,199
2;Bock et al,1992)。
のための、類似した目標を目的とした技術が存在する。小さい合成分子のライブ
ラリー、オリゴヌクレオチドのライブラリー、タンパク質のライブラリー又はペ
プチドのライブラリーに基づくのであろうとなかろうとも、所望の活性に関して
分子セットをスクリーニングすることを、広義に、コンビナトリアルケミストリ
ーという。
するための多数の方法が存在する。例えば、ファージディスプレイライブラリー
は、長年にわたり使用されている。一定の機能を有するタンパク質を単離するた
めの好ましい方法は、Roberts及びSzostak(Roberts R
.W.and Szostak J.W.Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA,94(23)12997−302(1997))により記載されて
いる。ペプチドを単離するために設計されたもう1つの好ましいコンビナトリア
ル法は、Cohenら(Cohen B.A.,et al.,Proc.Na
tl.Acad.Sci.USA,95(24):14272−7(1998)
)に記載されている。この方法は、修飾されたツーハイブリッド技術を利用する
。酵母ツーハイブリッド系は、タンパク質−タンパク質相互作用の検出及び分析
のため有用である。酵母サッカロミセス セレビシエ(Saccharomyc
es cerevisiae)において最初に記載されたツーハイブリッド系は
、目的のタンパク質に特異的な新規制御分子を同定するための強力な分子遺伝学
的技術である(Fields and Song,Nature 340:24
5−6(1989))。Cohenらは、選択された分子と結合する合成ペプチ
ド又は工作ペプチドの配列間の新規相互作用を同定することができるよう、この
技術を修飾した。この型の技術の利点は、選択が細胞内環境において実施される
点である。その方法は、酸性活性化ドメインと接着するペプチド分子のライブラ
リーを利用する。選択されたペプチド、例えばメマプシン2の細胞外部分を、G
al4のような転写活性化タンパク質のDNA結合ドメインと接着させる。この
型の系においてツーハイブリッド技術を実施することにより、メマプシン2の細
胞外部分と結合する分子が同定されうる。
リアルライブラリーと組み合わされた、当業者に周知の方法を、所望の標的、メ
マプシン2又はその基質のいずれかと結合するか、又は相互作用する分子を単離
し特徴決定するために使用することができる。これらの化合物の相対的な結合親
和性を比較し、当業者に周知の競合的又は非競合的な結合研究を使用して最適な
インヒビターを同定することができる。好ましい競合的インヒビターは、メマプ
シン2の非加水分解性のアナログである。もう1つは、メマプシン2が正確に機
能すること又はフォールディングされることを防止するアロステリックな再編成
を引き起こす。
る。これは、構造情報及びコンピュータモデリングにより達成される。コンピュ
ータモデリング技術は、選択された分子の三次元的原子構造の可視化、及び分子
と相互作用するであろう新化合物の合理的設計を可能にする。三次元構築物は、
典型的には、選択された分子のx線結晶解析又はNMRイメージングからのデー
タに依存する。分子動力学は、力場データを必要とする。コンピュータグラフィ
ックスシステムは、新化合物が標的分子とどのように関連しているかの予測を可
能にし、結合特異性を完全化するための化合物及び標的分子の構造の実験的操作
を可能にする。例えば、NMR分光法を使用して、Inouyeらは、TSHK
(膜貫通センサーヒスチジンキナーゼ(transmembrane sens
or histidine kinases))の触媒部位の各サブドメインの
構造を保持しているN末端短縮TSHK断片の構造情報を得ることができた。N
MR研究に基づき、彼らは、可能性のあるTSHKインヒビターを同定すること
ができた(Inouyeの米国特許第6,077,682号)。もう1つの好例
は、カルシニュリン活性部位結合ポケット及び補助的FKBP12/FK506
結合ポケットの両方の形状及び構造を得るため、高分解能X線結晶学を使用して
決定されたカルシニュリン/FKBP12/FK506複合体の三次元構造に基
づく(Armisteadの米国特許第5,978,740号)。この情報を入
手すれば、研究者は、天然のリガンド又は基質とそれらの対応する受容体又は酵
素の結合ポケットとの会合をよく理解することができ、従って効率的なインヒビ
ターを設計し作製することができる。
分子設計プログラムとユーザーとの間のユーザーフレンドリーなメニュー選択方
式のインターフェースと通常接続された、分子力学ソフトウェア及び計算集中コ
ンピュータ(computationally intensive comp
uters)を必要とする。分子モデリングシステムの例は、CHARMm及び
QUANTAプログラム(Polygen Corporation,Walt
ham,MA)である。CHARMmは、エネルギー最小化及び分子動力学のフ
ァンクションを実行する。QUANTAは、分子構造の構築、グラフィックモデ
リング、及び分析を実行する。QUANTAは、相互対話式の分子挙動の構築、
修飾、可視化、及び分析を可能にする。
utica Fennica 97,159−166;Ripka,New S
cientist 54−57(1988年6月16日);McKinaly
and Rossmann,1989 Annu.Rev.Pharmacol
.Toxiciol.29,111−122;Perry and Davie
s,OSAR;Quantitative Structure−Activi
ty Relationships in Drug Design 189−
193頁(Alan R.Liss,Inc.1989);Lewis and
Dean,1989 Proc.R.Soc.Lond.236,125−1
40及び141−162のような多数の論文が、特異的タンパク質と相互作用す
る薬物のコンピュータモデリングを概説しており、核酸成分のためのモデル酵素
に関してはAskew,et al.,1989 J.Am.Chem.Soc
.111,1082−1090が概説している。化学物質をスクリーニングし図
形的に描写するその他のコンピュータプログラムは、BioDesign,In
c.(Pasadena,CA.,Allelix,Inc,Mississa
uga,Ontario,Canada)及びHypercube,Inc.(
Cambridge,Ontario)のような会社から入手可能である。
生成物又は合成化学物質を含む既知の化合物、及びタンパク質を含む生物学的活
性を有する材料のライブラリーを、基質結合活性又は酵素活性を改変させる化合
物に関して、スクリーニングすることもできる。
ており、酵素及びその基質の詳細な構造、並びに単独で、又はインヒビターの存
在下でそれらが相互作用する様式を作出するコンピュータソフトウェアプログラ
ムを利用する。これらの技術は、x線結晶解析データを入手することにより大き
く増強される。インヒビターは、触媒活性を有する酵素を阻害する化合物に関し
て、既存の化合物のライブラリーをスクリーニングすることによっても得られる
。メマプシン2に関する文献における報告とは対照的に、本明細書に記載の酵素
は、天然に産生された酵素と類似した活性を有し、内因性活性を阻害する化合物
を同定するための手段を提供する。これらの可能性のあるインヒビターは、典型
的には、酵素、基質(好ましくは、発色性基質)、及び可能性のあるインヒビタ
ー(通常、一連の濃度においてスクリーニングされる)が混合されたハイスルー
プットアッセイを使用して同定され、基質の分解の程度が決定される。有用であ
る可能性のあるインヒビターは、分解の量を減少させるものである。
におけるペプチドの蓄積のような、アルツハイマー病、及びそれと関連した状態
の診断及び治療及び/又は予防において使用されうる。
ログと特異的に結合し、メマプシン2の単離及び精製又は特徴決定を補助するた
めの試薬として使用されうる。インヒビター及び精製された組換え酵素は、遺伝
学的にアルツハイマー病を発症する傾向が高い個体のスクリーニングにおいて使
用されうる。
る基質を分解する。この配列は、ヒトプレセニリンのインビボプロセシング部位
の配列である。プレセニリン1及びプレセニリン2は、いずれも、内在性膜タン
パク質である。それらは、未プロセシング型からN末端配列を除去するプロテア
ーゼ分解によりプロセシングされる。プロセシングされた後、プレセニリンは、
未プロセシングのプレセニリンと比較して安定な2本鎖のヘテロ二量体を形成す
る(Capell et al.,J.Biol.Chem.273,3205
(1998);Thinakaran et al.,Neurobiol.D
is.4,438(1998);Yu et al.,Neurosci Le
tt.2:254(3);125−8(1998))。未プロセシングのプレセ
ニリンは、迅速に崩壊する(Thinakaran et al.,J.Bio
l.Chem.272,28415(1997);Steiner et al
.,J.Biol.Chem.273,32322(1998))。プレセニリ
ンは、ベータ−セクレターゼのインビボ活性を調節し、ベータ−セクレターゼは
、アミロイド前駆体タンパク質(APP)を分解し、アルファ−ベータ42の形
成をもたらすことが知られている。脳細胞におけるアルファ−ベータ42の蓄積
は、アルツハイマー病の主因であることが知られている(概説については、Se
lkoe,1998を参照のこと)。従って、プレセニリンの活性は、アルツハ
イマー病の進行を増強する。これは、プレセニリン遺伝子の非存在下では、アル
ファ−ベータ42ペプチドの産生が低下するという観察(De Stroope
r et al.,Nature 391,387(1998))により支持さ
れる。未プロセシングのプレセニリンは迅速に崩壊するため、プロセシングされ
たヘテロ二量体プレセニリンが、アルツハイマー病へと至るアルファ−ベータ4
2の蓄積の原因であるはずである。メマプシン2によるプレセニリンのプロセシ
ングは、アルファ−ベータ42の産生を増強し、従ってアルツハイマー病の進行
をさらに増強する。従って、血液脳関門を通過するメマプシン2インヒビターは
、アルファ−ベータ42の沈積により媒介されるアルツハイマー病の発症の確率
を減少させるか、又はその進行を遅延させるために使用されうる。メマプシン2
はベータ分解部位でAPPを分解するため、ベータ分解部位におけるAPP分解
の防止により、アルファ−ベータ42の増大が防止されるであろう。
質結合間隙の存在により定義される活性部位を含むその断片は、メマプシン2に
対する免疫応答を誘導するために使用されうる。メマプシン2は、ブロッキング
抗体、即ち脳におけるメマプシン2の天然に存在する基質の分解を防止する抗体
を誘発するために有効な量で投与される。未修飾のワクチンは、アルツハイマー
病の予防及び治療において有用でありうる。ワクチンに対する応答は、アジュバ
ントの包含、組換え酵素の産生からのウイルスタンパク質のような組成、及び/
又は投与方式(量、投与部位、投与頻度等)に影響されうる。酵素は活性である
ためには適切にフォールディングされていなければならないことは明らかである
ため、内因性メマプシン2に対して活性な抗体が誘発されるはずである。内因性
酵素に対して有効である抗体は、適切にリフォールディングされていない酵素に
対しては産生される可能性が低い。
好ましい。又は、肺、粘膜、又は経皮的な経路による送達のための、その他の製
剤が使用されうる。インヒビターは、通常、製薬学的に許容される担体と組み合
わせて投与されよう。製薬学的担体は、当業者に既知である。適当な担体は、典
型的には、投与の様式に基づき選択されよう。医薬組成物は、抗微生物剤、抗炎
症剤、及び鎮痛剤のような活性成分を1個以上含んでいてもよい。
溶液、懸濁液、及び乳濁液が含まれる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコー
ル、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物油、及びオレイン酸エチ
ルのような注射可能な有機エステルである。水性担体には、生理食塩水及び緩衝
媒質を含む、水、アルコール性/水性溶液、乳濁液、又は懸濁液が含まれる。好
ましい非経口用賦形剤には、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース(R
inger’s dextrose)、デキストロース、及び塩化ナトリウム、
乳酸化リンゲル(lactated Ringer’s)、又は固定油が含まれ
る。静脈内賦形剤には、流体、及び栄養補給剤、及び(リンゲルデキストロース
に基づくもののような)電解質補給剤が含まれる。
ための製剤には、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、滴下剤、坐剤、スプレー
、液体、及び粉末が含まれる。これらの適用のための製剤は既知である。例えば
、典型的には、1〜3ミクロンの空気力学的直径を有する粒子を有する粉末を製
剤化するための噴霧乾燥を使用して、薬物、又は重合体及び/もしくは界面活性
剤と組み合わされた薬物からなる多数の肺製剤が、開発されている。
溶液、カプセル、サチェット、又は錠剤が含まれる。濃化剤、香料、希釈剤、乳
化剤、分散補助剤、又は結合剤が望ましい場合もある。
オシアン酸、硫酸、及びリン酸のような無機酸、並びにギ酸、酢酸、プロピオン
酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイ
ン酸、及びフマル酸のような有機酸との反応、又は水酸化ナトリウム、水酸化ア
ンモニウム、水酸化カリウムのような無機塩基、及びモノアルキルアミン、ジア
ルキルアミン、トリアルキルアミン、アリールアミン、及び置換されたエタノー
ルアミンのような有機塩基との反応により形成される、製薬学的に許容される酸
付加塩又は塩基付加塩としても投与されうる。
あり、治療コースは数日から数ヶ月、又は医師がさらなる利益は得られないであ
ろうと決定するまで継続されよう。当業者であれば、最適な用量、投薬方法、及
び反復速度を決定することができる。
には、老人斑のサイズ及び/又は数の減少、又はサイズもしくは量の増加の停止
により特徴付けられる)、又はアルファ−ベータ42ペプチドの分解が減少する
、所望の効果を生じるために十分な大きさのものである。用量は、反対適応(c
ounterindications)の場合には、各医師により調整されうる
。
あろう。
酸プロテアーゼに相同な新規の配列が見い出された。AA136368妊婦子宮
由来ATCC947471、AA207232神経上皮由来ATCC21452
6、およびR55398ヒト乳房由来ATCC392689。これらに対応する
バクテリア菌株で、EST配列を含む#947471、#214526および#
392689をATCC(メリーランド州のロックビル(Rockville,
MD))から入手した。ATCCから入手したこれらのクローンの配列を決定
したところ、既知のヒトアスパラギン酸プロテアーゼとは一致しない配列を含ん
でいることが確認された。これらのクローンの全配列をまとめたところ、約80
%のプレプロ−M2 cDNAになった。以下の方法を用いて、これらのクロー
ンの全長cDNAを得た。
hon−Ready cDNA)(クローンテック社(Clonetech))
は、ヒト組織に由来するmRNAの逆転写、プライマー付加、および第二鎖合成
によって得られた二本鎖DNAであるが、これをPCR増幅用の鋳型として用い
た。アダプタープライマー(AP1)およびネスティドアダプタープライマー(
AP2)を5' −および3' −RACE PCRに用いた。メマプシン2cDN
Aの5' −領域のPCRには、AP1およびNHASPR1というプライマーを
用いた。cDNAの3' 末端に対するプライマーは、NHASPF2およびAP
1である。cDNAの中央は、NHASPF1プライマーおよびNHASPR2
プライマーによって増幅された。プライマーの配列は以下の通りである。 NHASPF1: (配列番号:10)、 NHASPR1: (配列番号:11)、 NHASPF2: (配列番号:12)、 NHASPR2: (配列番号:13)、 AP1: (配列番号:14)、および AP2: (配列番号:15)。
ているヒト膵臓ライブラリー(クイックスクリーニングヒトcDNAライブラリ
ーパネル(Quick−Screen Human cDNA Library
Panel))からクローニングされた。ベクター由来のプライマー、GT1
0FWD、GT10REV、GT11FWD、およびGT11REVを外部プラ
イマーとして使用した。用いたプライマーの配列は、 GT10FWD: (配列番号:16)、 GT10REV: (配列番号:17)、 GT11FWD: (配列番号:18)、 GT11REV: (配列番号:19)であった。
1ライブラリーから直接増幅した。プライマーの配列は、 PASPN1: (配列番号:20)、および NHASPC1: (配列番号:21)であった。
Invitrogen))にクローニングし、シーケンスした。
質配列を配列番号:1と配列番号:2に示す。
ラインメントによれば、プロメマプシン2は、pro領域、アスパラギン酸プロ
テアーゼ領域、およびC−末端側に膜貫通領域を持っている。この活性型酵素は
、メマプシン2であり、そのプロ酵素はプロメマプシン2である。
NAの0.82 kbの断片をPCR増幅するための鋳型として用いた。メマプ
シン2用に使用したプライマーはNHASPF1およびNHASPR2であった
。メマプシン2またはメマプシン2の断片を含む組織から増幅されたPCR産物
が得られた。増幅産物の量から、メマプシン2は、以下の組織に多い順に存在し
ていることが示された。膵臓、脳、肺、腎臓、肝臓、胎盤、および心臓。また、
メマプシン2は、脾臓細胞、前立腺細胞、精巣細胞、卵巣細胞、小腸細胞および
結腸細胞にも存在している。
、プロメマプシン2のリフォールディングと精製 プロメマプシン2をPCR増幅して、pET11aベクターのBamHI部位
にクローニングした。得られたベクターは、Ala−8pからAla326まで
の配列をもつプロメマプシン2を発現する。図1に2種類の発現ベクターpET
11−メマプシン2−T1(以下T1)とpET11−メマプシン2−T2(以
下T2)の構造を示す。いずれのベクターにおいても、発現された組換えタンパ
ク質のN−末端側の15残基は、発現ベクターに由来するものである。プロメマ
プシン2の残基は、残基Ala−16から開始する。2種類の組換えプロメマプ
シン2は、C−末端側の長さが異なっている。クローンT1はThr−454で
終わっており、クローンT2はAla−419で終わっている。T1構築物はT
2構築物よりも長いC−末端を持っているが、予想される膜貫通ドメインを全く
発現しない。
ンスフェクトした。トランスフェクトされた細菌を培養する方法、組換えタンパ
ク質の合成誘導、および組換えタンパク質を含む封入体の回収と洗浄は、本質的
には、既述した通りである(Linら、1994)。
のプロメマプシン2を、20倍容量の20mM−トリス、pH9.0に直ちに希
釈した。この溶液を1M HClでゆっくりとpH8に調整した。そして、精製
に移る前にリフォールディング用溶液を24時間4℃に置いた。
ルタチオン、pH 9.0を、8 M尿素/10 mMベータ−メルカプトエタ
ノールに入れたOD280nm =5のプロメマプシン2を激しく撹拌したものに加え
る。この処理を1時間置きにさらに3回繰り返す。そして、得られた溶液を十分
な量の20 mMトリス塩基に対して透析して、尿素の最終濃度を0.4 Mと
した。次に、この溶液のpHを、1 M HClによってゆっくりと8.0に調
整する。
DTA、100 mMベータ−メルカプトエタノール、pH10.0に溶解させ
る。封入体のOD280 値を、ベータ−メルカプトエタノールを含まない8 M尿
素溶液で5.0に調整する。最終溶液には、以下の還元剤を入れる。 10 mMベータ−メルカプトエタノール、10 mM DTT(ジチオスレ
イトール)、1 mM還元型グルタチオン、および0.1 M酸化型グルタチオ
ン。溶液の最終pHは10.0である。
を9.0に調整し、得られた溶液を16時間4℃に置く。この溶液を、6時間で
室温まで平衡化させ、pHを8.5に調整する。溶液を再び4℃に戻して18時
間置く。
液を再び4℃に戻して4日から7日置く。
ヒビターの阻害能力を解析するため、無作為構造物ライブラリーまたは既存の化
合物ライブラリーコレクションのいずれかを用いてインヒビターをスクリーニン
グするため、M2の構造を結晶学的に研究するための結晶を製造するため、およ
びM2のモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を製造するために使用す
ることのできる、酵素活性のある調製物を得るために非常に重要である。
酸、0.4M尿素、pH 8.0で平衡化させたセファクリル(SEPHACR
YLTM)S−300カラム上で分離する。S−300カラムからのリフォールデ
ィング物ピーク(2番目のピーク)は、20 mMトリス塩酸、0.4M尿素、
pH 8.0で平衡化したFPLCリソース−Q(FPLC RESOURCE
−Q TM )カラムでさらに精製することができる。NaClの直線的勾配によっ
て、酵素をカラムから溶出させる。S−300からのリフォールディング物ピー
クは、さらなる精製を行なう前に活性化することもできる。活性化するためには
、画分を等量の0.2 M酢酸ナトリウム、70%グリセロール、pH 4.0
と混合する。この混合液は、22℃で18時間インキュベートしてから、20倍
容量の20 mM−ビス−トリス(Bis−Tris)、0.4 M尿素、pH
6.0に対し2回透析する。そして、透析された材料を、20 mM−ビス−
トリス、0.4 M尿素、pH 6.0で平衡化したFPLCリソース−Q(F
PLC RESOURCE−Q TM )カラム上でさら精製する。酵素をNaCl
の直線的勾配によって溶出させる。
ところ、プロメマプシン2は、非還元条件下で、まず、非常に高分子量のバンド
(約42 kDよりも大きい)として溶出することを示した。このことは、タン
パク質のジスルフィド架橋によって、このタンパク質が、これらの分画では正し
くフォールディングされないことを示している。その後の画分は、予想されたプ
ロメマプシン2−T2のサイズ(約42 kDa)のタンパク質を含んでいる。
これらの画分で得られたプロ酵素は、自己触媒による活性化を行なうためのタン
パク質分解活性ももつ。これらの画分をプールして、FPLCリソース(FPL
C RESOURCE TM )カラムでクロマトグラフィーを行ない、NaClの
直線的勾配によって溶出した。いくつかの画分は、非還元条件下でSDS−PA
GEを用いて解析した。この解析によって、画分6および7が活性タンパク質の
大部分を含んでいることが明らかになり、このことは、活性タンパク質を含む1
番目のFPLCピークと一致していた。主要ピークは、ショルダーピークと一緒
になっており、これは、同じリソースQ(RESOURCE TM Q)カラムで精
製を繰り返しても出現した。主要なショルダーピークは、これらの条件下で異な
ったコンフォメーションで存在する活性プロメマプシン2であることが確認され
た。
配列を決定した。自己触媒切断を生じさせるため、組換えプロメマプシン2−T
1を0.1 M酢酸ナトリウム、pH 4.0に入れ室温で16時間インキュベ
ートした。この産物をSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて解析し
た。プロ−メマプシン2の分子量よりも小さい分子量に相当するバンドがいくつ
か観察された。電気泳動によるバンドをPVDF膜上にトランスブロットした。
4本のバンドを選んで、タンパク質シークエンサーでN−末側配列を決定した。
これらのバンドのN−末側配列によって、プロメマプシン2上のタンパク質切断
部位の位置を確認した。
ン2に対する基質として用いて、他の加水分解部位の範囲を決定した。これらの
反応は、0.1 M酢酸ナトリウム、pH 4.0中で自己活性化したプロメマ
プシン2を、次いでペプチドとインキュベートすることによって行なった。加水
分解産物を逆相C−18カラム上でHPLCを行ない、断片の分子量を測定する
ために、溶出ピークをエレクトロスプレー質量解析にかけた。酸化型インシュリ
ンB−鎖については2つの加水分解部位を同定した(表1)。ペプチドNCH−
ガンマからは3個の加水分解部位が同定された。合成ペプチドPS1−ガンマに
は1個の切断部位が見られ、その配列(LVNMAEGD)(配列番号:9)は
、ヒトプレセニリン1のβ−プロセッシング部位に由来するものである(表1)
。
ートしたところ、自己触媒によってプロ−M2pdがM2pdに変換した。まず、加
水分解試験を行うために2種類の合成ペプチドを別々にプロ−M2pdとともに0
.1 M酢酸ナトリウム、pH 4.0の中で時間を変えて2時間から18時間
インキュベートした。インキュベートした試料について、加水分解産物を同定す
るためにLC/MSを行なった。反応速度論研究のため、同定済みのHPLC(
ベックマン・システムゴールド(Beckman System Gold)産
物のピークを定量するためにまとめた。プレセニリン1およびスウェーデン型A
PPペプチド(表1)についてのKm 値とkcat 値を定常状態の反応速度論によ
って測定した。APPペプチドの各Km 値とkcat 値は、常法によっては正確に
測定することができなかったため、プレセニリン1ペプチドに対する混合基質の
競合的加水分解によって、そのkcat /Km 値を測定した(Fersht, A
.「酵素の構造と作用(Enzyme Structre and Mecha
nism)」第2版、ニューヨークのダブリュ・エイチ・フリーマン・アンド・
カンパニー社(W. H. Freeman and Compnany, N
ew York)(1985))。
への変換をSDS−ポリアクリルアミド電気泳動によって示した。プロ−M2pd と変換された酵素で移動度が異なることは、この2つを混同したものにおいて明
らかである。図2Aは、さまざまなpHにおける、M2pdによる合成ペプチドs
wAPP(表1参照)の加水分解初速度を示すグラフである。図2Bは、M2pd によるペプチド基質の加水分解の定常状態における反応速度論に関する相対的k cat /Km 値を示すグラフである。
itrogen))のEcoRV部位にクローニングした。ヒト胎盤8−gt1
1ライブラリー(クローンテック社(Clontech))からヒトAPP c
DNAをPCR増幅し、pSecTagAのNheI部位とXbaI部位にクロ
ーニングした。T7による発現を行わせるためのヒーラ(HeLa)細胞への形
質転換およびワクシニアウイルス感染を行うための方法は、Lin, X.,
FASEB J. 7:1070−1080 (1993)に記載されている方
法と実質的に同一である。
おいて、200マイクロCi35Sメチオニンおよびシステイン(トランスラベル
(TransLabel); ICN)によって30分間代謝標識し、1 ml
の培地で洗浄し、2 mlのDMEM/10%FCSで置き換えた。小胞の酸性
化を防止するために、バフィロマイシン(Bafilomycin)A1を培地
に加えた(Perez, R. G.ら、J. Biol. Chem. 27
1:9100−9107 (1996))。さまざまな時点(追跡)で培地を取
り出し、細胞を回収して、10mMヨードアセトアミド、10:M TPCK、
10:M TLCK、および2マイクログラム/mlのロイペプチンを含む50
mMトリス、0.3 M NaCl、5 mM EDTA、1%トリトンX−
100、pH 7.4中で溶菌した。溶菌液の上清(14,000×g)および
培地を、プロテインGセファロース(シグマ社(Sigma))に結合した抗体
上に免疫吸着させた。抗APP N−末端ドメイン抗体(ケミコン社(Chem
icon))を用いてAPPのベータN−断片を回収し、抗アルファ−ベータ1- 17 抗体(ケミコン社(Chemicon))、アルファ−ベータのN−末端側1
7残基を認識する)を用いて12 kDaのβC−断片を回収した。前者の抗体
は、変性したタンパク質しか認識しなかったため、免疫吸着させる前に、まず、
培地を2 mMジチオスレイトール、0.1% SDSの中で30分間55℃で
インキュベートした。試料を冷却し、抗APP N−末端ドメイン(ケミコン社
(Chemicon))を加える前に等量の細胞溶解用バッファーで希釈した。
ビーズを洗浄し、泳動用バッファーで溶出し、SDS−PAGE(ノベックス(
NOVEXTM))を行ない、アンプリファイ(Amplify)(アマーシャム
社(Amersham))によって増感されたゲルのオートラジオグラムまたは
ホスフォールイメージング(phosphorimaging)(モレキュラー
・ダイナミクス社(Molecular Dynamics))によって可視化
した。PVDF膜へのトランスブロット、および抗アルファ−ベータ1-17および
化学発光基質(アマーシャム社(Amersham))を用いる検出法によりベ
ータN−末側断片の免疫検出を行なった。
クトされたHeLa細胞をアセトンで10分間固定し、PBS中0.2%トリト
ンX−100(Triton X−100)の中で6分間透過化処理を行なった
。M2を局在化させるために、ヤギ抗−プロ−M2pdポリクローナル抗体をDE
AE−セファロース6B上で精製し、アフィゲル(Affigel)(バイオラ
ド社(BioRad))上に固定化した組換えプロ−M2pdに対するアフィニテ
ィー精製を行なった。製造業者のプロトコールに従って、精製した抗−プロ−M
2pd抗体をAlexa568(モレキュラー・プローブ社(Molecular
Probe))に結合させた。固定化した細胞を、0.1% BSA入りPB
Sで1:100に希釈した抗体とともに一晩インキュベートしてから、PBSで
4回洗浄した。APPについては、2種類の抗体を用いた。抗体Aβ1-17(上記
)、およびベータ−セクレターゼ切断部位に続く最初の26残基を認識する抗体
Aβ17-42 (ケミコン社(Chemicon))。PBSで4回洗った後、1:
200の希釈率で細胞を抗マウスFITC結合体とともに一晩インキュベートし
た。プロロング(Prolong)抗フェード(anti−fade)試薬(モ
レキュラー・プローブ社(Molecular Probe))中で細胞をマウ
ントし、ライカ(Leica)TCS共焦点レーザー走査型顕微鏡上で可視化し
た。
た残基はLeuとAlaであろうと推定された。そして、特異性データから、P
1' は、AlaやSerなどの小さな残基の方を好むと測定されたが、結晶構造
(以下の実施例9で決定された)からは、この部位はもっと大きな残基を収容で
きることが示される。メマプシン2のP1' は、Ala、SerおよびAspな
ど、小さな側鎖をもつ残基が選択されるという、最も厳格な特異性条件をもつ位
置であることが実証された。アルツハイマー病を治療するためのメマプシン2イ
ンヒビター薬物を設計するための条件である、血液脳関門を通過する上では、A
laの方がSerやAspよりも疎水性があって好適であるため、P1' には主
にAlaが選択された。このため、LeuとAlaの間で遷移状態アナログ等配
電子体(Leu*Alaと表示する。ここで、*は遷移状態にある等配電子体、
−CH(OH)−CH2 −を意味する)が置かれるようにインヒビターを設計し
、サブサイトP4、P3、P2、P2' 、P3' およびP4' は、ベータ−アミ
ロイドタンパク質のスウェーデン型変異のベータ−セクレターゼ部位配列を充填
した。インヒビターOM99−1およびOM99−2の構造を、以下、および図
3Aと3Bにそれぞれ示す。 OM99−1: (配列番号:27) OM99−2: (配列番号:28)
ンから調製した。スキーム1に示すように、L−ロイシンをジエチルエーテル中
10% NaOH存在下でBOC2 Oで12時間処理することによって、そのB
OC誘導体2として保護した。そして、クロロギ酸イソブチルおよびN−メチル
ピペリジンで処理した後、得られた混合無水物をN,O−ジメチルヒドロキシア
ミンで処理することによって、Boc−ロイシン2をウエインレブアミド3(W
einreb amide 3)に変換した(NahmとWeinreb、Te
trahedron Letters 1981, 32, 3815)。 ジエチルエーテルに入れたリチウムアルミニウム水素化物によって3を還元した
ところアルデヒド4がえられた。エチルプロピオラート(ethyl propiolate)と
リチウムジイソプロピルアミドの処理から生じるリチウムプロピオラート(lith
ium propiolate)とアルデヒド4を反応させると、42%の単離収率でジアステ
レオマーの分離不可能な混合物(5.8:1)としてアセチレンアルコール5が
生成された(Fray, KayeおよびKeinman, J. Org.
Chem. 1986, 51, 4828−33)。Pd/BaSO4 上で5
の触媒的な水素化を行ない、得られたガンマ−ヒドロキシエステルの酸触媒作用
によるラクトン化を、還流しているトルエン中で触媒量の酢酸を用いて行ない、
73%の収率でガンマ−ラクトン6および7を得た。これらの異性体は、溶離剤
であるヘキサン中40%酢酸エチルを用いて、シリカゲルクロマトグラフィーに
よって分離した。7をヨウ化メチルによって立体選択的にアルキル化することに
よって、C−2位へのメチル基の付加を行なった(スキーム2)。 このように、テトラヒドロフラン中−78℃でリチウムヘキサメチルジシラジド
(lithium hexamethyldisilazide)(2.2当量
)(30分)によってラクトン7の2価アニオンを生成し、−78℃で30分間
ヨウ化メチルによってアルキル化した後、プロピオン酸(5当量)で急冷したと
ころ、少量(5%未満)の対応エピマーとともに所望のアルキル化ラクトン8が
提供された(収率76%)(GhoshとFidanze, 1998 J.
Org. Chem. 1998, 63, 6146−54)。溶媒系として
酢酸エチルおよびヘキサンの混合液(3:1)を用いた、シリカゲルに対するカ
ラムクロマトグラフィーによって、エピマーのシス−ラクトンを除去した。アル
キル化ラクトン8の立体化学的な配分は、広範な1 H−NMR NOE実験に基
づいて行われた。水性リチウム水酸化物は、ラクトン8の加水分解を促進し、そ
の後、ジメチルホルムアミド中、イミダゾールとジメチルアミノピリジン存在下
、tert−ブチルジメチルシリル(tert−butyldimethyls
ilyl)塩化物によってガンマ位のヒドロキシル基が保護され、常法による精
密操作とクロマトグラフィーの後に90%の収率で酸9が生じた。ジクロロメタ
ンに入れたトリフルオロ酢酸によって0℃で1時間処理することによってBOC
基の選択的な除去を行なった。次に、得られたアミン塩を、水性NaHCO3 存
在下ジオキサンの中で市販の(ミルウォーキーのアルドリッチ社(Aldric
h, Milwaukee))Fmoc−スクシニミド誘導体と反応させたとこ
ろ、クロマトグラフィーの後、65%の収率でFmoc−保護されたL*A等配
電子体10が得られた。保護された等配電子体10は、無作為配列インヒビター
ライブラリーの調製に使用した。
シンの懸濁液に80 mLの10%NaOHを加えた。全ての固体を溶解した後
、20 mL(87.1 mmol)のBOC2 Oを反応混合物に加えた。得ら
れた反応混合物を23℃で12時間撹拌した。この時間経過後、層を分離して、
1NのHCl水溶液を0℃で慎重に加えて、水層をpH 1になるまで酸性化し
た。得られた混合液を酢酸エチル(3×100 mL)で抽出した。有機層をま
とめ、鹹水で洗浄してから、無水Na2 SO4 の上で乾燥させた。減圧下で溶剤
を除去して、表題の産物を得、さらなる精製を行なうことなく次の反応に直接用
いた(収率97%)。1H NMR (400 MHz, CDCl3) ( 4.89 (broad d, 1 H, J = 8.
3 Hz), 4.31 (m, 1 H), 1.74 - 1.49 (m, 3 H), 1.44 (s, 9 H), 0.95 (d, 6 H,
J = 6.5 Hz).
−メチルアミド(3) 0℃のN2 雰囲気下で無水ジクロロメタン(25 mL)に入れたN,O−ジ
メチルヒドロキシアミン塩酸塩(5.52 g, 56.6 mmol)の撹拌
溶液に、メチルピペリジン(6.9 mL, 56.6 mmol)を一滴ずつ
加えた。得られた混合液を0℃で30分間撹拌した。別のフラスコの中で、N−
(tert−ブチルオキシカルボニル)−L−ロイシン(1)(11.9 g,
51.4 mmol)を、N2 雰囲気下でTHF(45 mL)とジクロロメ
タン(180 mL)の混合液に溶解した。得られた溶液を−20℃に冷却した
。この溶液に1−メチルピペリジン(6.9 mL, 56.6 mmol)を
加えてから、クロロギ酸イソブチル(7.3 mL, 56.6 mmol)を
加えた。得られた混合液を−20℃で5分間撹拌して、これに上記N,O−ジメ
チルヒドロキシアミン溶液を加えた。反応混合液を30分間−20℃に保った後
、23℃まで温めた。反応液を水で急冷して層分離させた。水層をジクロロメタ
ン(3×100 mL)で抽出した。一緒にした有機層を10%クエン酸、飽和
重炭酸ナトリウムおよび鹹水で洗浄した。有機層を無水Na2 SO4 で乾燥させ
、減圧下で濃縮した。残留物をフラッシュ・シリカゲルクロマトグラフィー(2
5%酢酸エチル/ヘキサン)で精製して、表記化合物3を黄白色のオイルとして
回収した(13.8 g, 97%)。1H NMR (400 MHz, CDCl3) ( 5.06 (broa
d d, 1 H, J = 9.1 Hz), 4.70 (m, 1 H), 3.82 (s, 3 H), 3.13 (s, 3 H), 1.70
(m, 1 H), 1.46 - 1.36 (m, 2 H) 1.41 (s, 9 H), 0.93 (dd, 6 H, J = 6.5, 1
4.2 Hz).
リチウムアルミニウム水素化物(770 mg, 20.3 mmol)の撹拌
懸濁液に、ジエチルエーテル(20 mL)に入れたN−tert−ブトキシカ
ルボニル−L−ロイシン−N' −メトキシ−N' −メチルアミド(5.05 g
, 18.4 mmol)を加えた。得られた反応混合液を30分間撹拌した。
この時間経過後、反応液を10% NaHSO4 溶液(30 mL)で急冷した
。次に、得られた反応混合液を23℃まで温め、この温度で30分間撹拌した。
得られた溶液を濾過し、濾過ケーキを二部のジエチルエーテルで洗浄した。まと
めた有機層を飽和重炭酸ナトリウム、鹹水で洗浄してから、無水MgSO4 の上
で乾燥させた。減圧下で溶剤を蒸発させると、表題のアルデヒド4(3.41
g)が黄白色のオイルとして得られた。得られたアルデヒドは、それ以上精製す
ることなく直ちに使用した。1H NMR (400 MHz, CDCl3) ( 9.5 (s, 1 H), 4.9 (s
, 1 H), 4.2 (broad m, 1 H), 1.8 - 1.6 (m, 2 H), 1.44 (s, 9 H), 1.49 - 1.
39 (m, 1 H), 0.96 (dd, 6 H, J = 2.7, 6.5 Hz).
ルボニル)アミノ]−4−ヒドロキシ−7−メチロクト(methyloct)
−2−イノエート(ynoate)(5)
ンの撹拌溶液(1.1 mL, 7.9 mmol)に、n−BuLi(ヘキサ
ン中1.6 M, 4.95 mL, 7.9 mmol)を一滴ずつ加えた。
得られた溶液を0℃で5分間撹拌してから、23℃に温めて15分間撹拌した。
この混合液を−78℃に冷却して、THF(2 mL)に入れたエチルプロピオ
ラート(801 μL)を5分間にわたって一滴ずつ加えた。この混合液を30
分間撹拌した後、8 mLの無水THFに入ったN−Boc−L−ロイシナール
4(1.55 g, 7.2 mmol)を加えた。得られた混合液を−78℃
で1時間撹拌した。この時間経過後、反応液をTHF(20 mL)に入れた酢
酸(5 mL)で急冷した。反応混合液を23℃まで温め、鹹水溶液を加えた。
層を分離させて、有機層を飽和重炭酸ナトリウムで洗浄し、Na2 SO4 上で乾
燥させた。溶剤を減圧下で蒸発させて残留物を得、それをフラッシュ・シリカゲ
ルクロマトグラフィー(15%酢酸エチル/ヘキサン)で精製すると、アセチレ
ンアルコール5の混合物(3:1)が得られた(0.96g、42%)。1H NMR
(300 MHz, CDCl3) ( 4.64 (d, 1 H, J = 9.0 Hz), 4.44 (broad s, 1 H), 4.18
(m, 2 H), 3.76 (m, 1 H), 1.63 (m, 1 H), 1.43 - 1.31 (m, 2 H), 1.39 (s,
9 H), 1.29 - 1.18 (m, 3 H), 0.89 (m, 6 H).
−3’−メチルブチル]−ジヒドロフラン−2(3H)−オン(7) 酢酸エチル(20mL)に入れた上記アセチレンアルコールの混合物(1.7
3 g, 5.5mmol)の撹拌溶液に5% Pd/BaSO4 (1g)を加
えた。得られた混合液は、50 psiで1.5時間水素化した。この時間経過
後、セライト(Celite)の詰め物で触媒を濾過して除き、濾液を減圧下で
濃縮した。残留物をトルエン(20mL)と酢酸(100μL)に溶解した。反
応混合液を6時間還流した。この時間経過後、反応液を23℃に冷却し、溶剤を
蒸発させると残留物が得られたので、これをフラッシュ・シリカゲルクロマトグ
ラフィー(40%ジエチルエーテル/ヘキサン)で精製すると、(5S,1S'
)−ガンマ−ラクトン7(0.94g, 62.8および(5R,1S' )−ガ
ンマ−ラクトン6(0.16g, 10.7%)が得られた。1H NMR (400 MHz,
CDCl3) ( 4.50 - 4.44 (m, 2 H), 3.84 - 3.82 (m, 1 H), 2.50 (t, 2 H, J =
7.8 Hz), 2.22 - 2.10 (m, 2 H), 1.64 - 1.31 (m, 3 H), 1.41 (s, 9 H), 0.91
(dd, 6 H, J = 2.2, 6.7 Hz); 13C NMR (75 MHz, CDCl3) ( 177.2, 156.0, 82.
5, 79.8, 51.0, 42.2, 28.6, 28.2, 24.7, 24.2, 23.0, 21.9.
ミノ]−3' −メチルブチル]−3−メチルジヒドロフラン−2(3H)−オン
(8) −78℃でN2 雰囲気下、無水THF(8 mL)中のラクトン7の撹拌溶液
(451.8 mg, 1.67 mmol)にリチウムヘキサメチルジシラザ
ン(disilazane)(THF中、3.67 mL, 1.0 M)を3
分間にわたって加えた。得られた混合液を−78℃で30分間撹拌して、リチウ
ムエノラートを生成させた。この時間経過後、Mel(228μL)を一滴ずつ
加えて、得られた混合液を−78℃で20分間撹拌した。この反応液を飽和NH 4 Cl水溶液で急冷し、23℃まで温めた。この反応混合液を減圧下で濃縮し、
残留物を酢酸エチル(3×100 mL)で抽出した。まとめた有機層を鹹水で
洗浄してから、無水Na2 SO4 の上で乾燥させた。溶剤を蒸発させると、シリ
カゲルクロマトグラフィー(15%酢酸エチル/ヘキサン)で精製されて、アモ
ルファス固体としてアルキル化ラクトン8(0.36 g, 76%)を提供す
る残留物が生成された。1H NMR (300 MHz, CDCl3) ( 4.43 (broad t, 1 H, J =
6.3 Hz), 4.33 (d, 1 H, J = 9.6 Hz), 3.78 (m, 1 H), 2.62 (m, 1 H), 2.35 (
m, 1 H), 1.86 (m, 1 H), 1.63 - 1.24 (m, 3 H), 1.37 (s, 9 H), 1.21 (d, 3
H, J = 7.5 Hz), 0.87 (dd, 6 H, J = 2.6, 6.7 Hz); 13C NMR (75 MHz, CDCl3)
( 180.4, 156.0, 80.3, 79.8, 51.6, 41.9, 34.3, 32.5, 28.3, 24.7, 23.0, 2
1.8, 16.6.
−[(tert−ブチルジメチルシリル)オキシ]−2,7−ジメチルオクタン
酸(9) THF(2 mL)中のラクトン8の撹拌溶液(0.33 g, 1.17
mmol)に1N LiOHの水溶液(5.8 mL)を加えた。得られた混合
液を23℃で10時間撹拌した。この時間経過後、この反応混合液を減圧下で濃
縮し、残った水性残留物を0℃に冷却してから、25%クエン酸溶液でpH 4
まで酸性化した。得られた酸性溶液を酢酸エチル(3×50 mL)で抽出した
。まとめた有機層を鹹水で洗浄してから、Na2 SO4 の上で乾燥して濃縮し、
対応するヒドロキシ酸(330 mg)を白色の泡として回収した。このヒドロ
キシ酸をさらに精製することなく、そのまま次の反応に用いた。
ミダゾール(1.59 g, 23.34 mmol)とブチルジメチルクロロ
シラン(1.76 g, 11.67 mmol)を加えた。得られた混合液を
23℃で24時間撹拌した。この時間経過後、MeOH(4 mL)を加えて、
混合液を1時間撹拌した。この混合液を25%クエン酸(20 mL)で希釈し
、酢酸エチル(3×20 mL)で抽出した。抽出物をまとめたものを水、鹹水
で洗浄してから、無水Na2 SO4 の上で乾燥した。溶剤を蒸発させると、粘性
のあるオイルが得られ、それをシリカゲル(35%酢酸エチル/ヘキサン)上で
フラッシュクロマトグラフィーによって精製すると、シリル(silyl)保護
された酸9(0.44 g, 90%)が生成した。IR (neat) 3300-3000 (bro
ad) 2955, 2932,2859,1711cm-1; 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6, 343 K) delta 6.2
0 (broad s, 1 H), 3.68 (m, 1 H), 3.51 (broad s, 1 H), 2.49 - 2.42 (m, 1
H), 1.83 (t, 1 H, J = 10.1 Hz), 1.56 (m, 1 H), 1.37 (s, 9 H), 1.28 - 1.1
2 (m, 3 H), 1.08 (d, 3 H, J = 7.1 Hz), 0.87 (d, 3 H, J = 6.1 Hz) 0.86 (s
, 9 H), 0.82 (d, 3 H, J = 6.5 Hz), 0.084 (s, 3 H), 0.052 (s, 3 H).
ノ]−4−[(tert−ブチルジメチルシリル)オキシ]−2,7−ジメチル
オクタン酸(10) ジクロロメタン(2 mL)中の酸9溶液(0.17 g, 0.41 mm
ol)に、0℃でトリフルオロ酢酸(500μL)を加えた。得られた混合液を
0℃で1時間撹拌し、さらにこの混合液にトリフルオロ酢酸を一部(500μL
)加えた。混合液をさらに30分間撹拌して、反応の進行をTLCでモニターし
た。この時間経過後、水浴の温度が5℃を超えないようにして、減圧下で溶剤を
慎重に除去した。残留物を5 mLのH2 O中のジオキサン(3mL)とNaH
CO3 (300 mg)に溶解した。この溶液に5 mLのジオキサンに入れた
Fmocスクシニミド(166.5 mg, 0.49 mmol)を加えた。
得られた混合液を23℃で8時間攪拌した。次に、この混合液をH2 O(5 m
L)で希釈し、25%水性クエン酸でpH 4に酸性化した。この酸性溶液を酢
酸エチル(3×50 mL)で抽出した。抽出物をまとめたものを鹹水で洗浄し
てから、Na2 SO4 の上で乾燥し、減圧下で濃縮して、粘性のあるオイル残留
物を得た。残留物をシリカゲルによるフラッシュ・クロマトグラフィーで精製し
たところ、Fmoc保護された酸10(137 mg, 61%)が白色の泡と
なって生じた。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6, 343 K) ( 7.84 (d, 2 H, J = 7.4 H
z), 7.66 (d, 2 H, J = 8 Hz), 7.39 (t, 2 H, J = 7.4 Hz), 7.29 (m, 2 H), 6
.8 (s, 1 H), 4.29 - 4.19 (m, 3 H), 3.74 - 3.59 (m, 2 H), 2.49 (m, 1 H),
1.88 (m, 1 H), 1.58 (m, 1 H), 1.31 - 1.17 (m, 3 H), 1.10 (d, 3 H, J = 7.
1 Hz), 0.88 (s, 9 H), 0.82 (d, 6 H, J = 6.2 Hz), 0.089 (s, 3 H), 0.057 (
s, 3 H).
state peptide synthesis)によってOM99−1とO
M99−2の合成を行なった。合成されたインヒビターを逆相HPLCによって
精製し、質量分析法によってそれらの構造を確認した。
を測定した。OM99−1は、図5Aに示された通り、組換えメマプシン2を阻
害した。計算されたKiは3×10-8Mである。用いられた基質は蛍光発生性合
成ペプチド基質であった。同じ蛍光発生性基質を用いて組換えメマプシン2に対
するOM99−2の阻害を測定した。Ki値は、図5Bに示すように、9.58
×10-9Mであると判定された。
た特異性に基づいてインヒビターを設計できることを実証している。
P1およびP1' における残基が非常に重要である。P1' にAlaを選択する
と、BBBの通過が容易になる。Ala側鎖のアナログも有効であろう。例えば
、Alaのメチル側鎖以外に、置換されたメチル基、およびメチル基やエチル基
とほぼ同じ大きさの基でAlaの側鎖を置換することができる。P1におけるL
euも、同じような大きさの基、またはLeuの側鎖上の置換によって置き換え
ることができる。BBBを通過するには、インヒビターを小さくすることが望ま
しい。したがって、OM99−1を出発点として、外側のサブサイトP4,P3
、P3' およびP4' を切り捨てることができる。そして、強固に結合するM2
インヒビターでBBBを通過することもできるものを置換することによって、A
sn−Leu*Ala−Ala(配列番号:29)という保持された構造はさら
に改善される。
シン2のプロテアーゼドメインの結晶化およびX線回折研究 OM99−2と複合体化した組換えヒトメマプシン2の結晶化の条件および予
備的X線回折データを測定した。
最適な結晶成長を得るためには、メマプシン2を高度に精製する必要がある。p
ET11a−M2pdベクターからメマプシン2を過剰発現させた。このメマプ
シン2は、C末端側の伸長部分の末端までに前駆体ドメインおよび触媒ドメイン
を含むが、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを含まない酵素原ドメインであ
る。このベクターを大腸菌BL21(DE3)に形質転換して、50 mg/リ
ットルのアンピシリンを含むZBアガー上に植菌した。シングルコロニーを選び
出して、5 mgのアンピシリンを含む100 mlの液体ZBに接種し、22
0 RPMで振とうしながら30℃で18時間培養した。一晩培養した培養液か
ら約15 mlの当量液を用いて、50 mgのアンピシリンを含むLB各1リ
ットルに植菌した。180 RPMで振とうしながら37℃で培養菌を光学濃度
が600 nmでほぼ0.8になるまで増殖させた。この時点で、各1リットル
の培養液に119 mgのIPTGを加えることによって発現を誘導した。誘導
後さらに3時間インキュベーションを続けた。
(TNバッファー)に懸濁し、6 mgのリゾチームと30分間インキュベート
して溶菌した後、−20℃で18時間凍結した。溶菌液を融解して、撹拌しなが
ら、1 mM MgCl2 、その後1000 KunitzユニットのDNAs
eを加えて、30分間インキュベートした。0.1%のTriton X−10
0を含むTN(TNTバッファー)によって容量を500 mlに増加させた。
90%よりも多量のメマプシン2タンパク質を含む不溶性の封入体を遠心分離し
てペレットにし、1〜2時間撹拌しながらTNTで再懸濁して洗浄した。さらに
3回TNTで洗浄した後、40 mlの8 M尿素、1 mM EDTA、1
mMグリシン、100 mMトリス塩基、100 mM β−メルカプトエタノ
ール(8 M尿素バッファー)にメマプシン2の封入体を溶かした。280 n
mにおける光学濃度を測定し、最終O.D.がほぼ0.5になるように、全部で
10 mMとなるように十分な量のβ−メルカプトエタノール加え、また、10 mM DTT、1 mM還元型グルタチオン、および0.1 mM酸化型グル
タチオンを加えつつ、8 M尿素緩衝液を用いて容量を増加させた。溶液のpH
を10.0以上になるように調整してから、各200 mlの当量液4つに分け
た。各200 mlを迅速に撹拌しながら、4リットルの20 mMトリス塩基
で直ちに希釈した。1 M HClでpHをすぐに9.0に調整してから、4℃
で一晩保存した。翌朝、希釈したメマプシン2溶液を室温に4〜6時間維持した
後、pHを8.5に調整してから、該フラスコを4℃の部屋に置き換えた。翌日
、pHを8.0に調整しながら同じ手順を行なった。
illipore))およびスター−セル(stir−cells)(アミコン
社(Amicon))を用いて、全量で約16リットルを40 mlまで濃縮し
、予め4℃に平衡化させておいたローターの中で140,000×gで30分間
遠心分離した。回収した上清を、0.4 M尿素、20 mMトリス塩酸、pH
8.0で平衡した2.5×100 cmのS−300カラムにアプライして、
同じ緩衝液によって30 ml/時で溶出を行なった。メマプシン2の活性画分
を集めて、1 mlのリソース−Q(ファルマシア社(Pharmacia))
カラムを用いたFPLCでさらに精製した。試料を濾過し、0.4 M尿素、5
0 mMトリス塩酸、pH 8.0で平衡化したリソース−Qカラムにアプライ
した。試料を同一緩衝液中0〜1 M NaClの勾配によって、2 ml/分
で30 mlを超えるまで溶出した。メマプシン2を含む溶出液は、ほぼ0.4
M NaCl付近に出現したので、結晶化処理のためにほぼ5 mg/mlの
濃度でプールした。
8pと30pの残基で開始する2種類の配列を示した。明らかに、組換えプロメ
マプシン2の前駆ペプチドは、未確認のタンパク質分解活性によって調製を行っ
ている間に切断された。
化は、上記したようにして、すなわち、0.1 Mの酢酸ナトリウムpH 4.
0中、22℃で16時間インキュベートして実施した。リソース−Q陰イオン交
換カラムによる陰イオン交換カラムクロマトグラフィーを用いて、活性化された
酵素をさらに精製した。酵素の純度は、SDS−ゲル電気泳動によって明らかに
した。酵素の活性を確認するため、精製の各工程で上記したようにして酵素の比
活性を測定した。
99−2と複合体になっている精製メマプシン2について結晶実験を行なった。
OM99−2は、S1とS1' (L−A)の間のペプチド結合が、遷移状態の等
配電子体であるヒドロキシエチレンによって置換されている8個のアミノ酸残基
(EVNLAAEFという配列中にサブサイトS4、S3、S2、S1 S1'
、S2' 、S3' 、およびS4' を含む)に相当する。精製したM2を濃縮して
、10倍過剰モル量のインヒビターと混合した。この混合液を室温で2〜3時間
インキュベートして、インヒビターの結合を最適化した。水滴蒸気拡散法(ha
nging drop vapor diffusion procedure
)を用いて20℃で結晶化実験を行なった。メマプシン2/OM99−2インヒ
ビター複合体の最適な結晶化条件を見つけるために、さまざまな結晶化条件を用
いた体系的な調査を行なった。第一段階では、可能な条件範囲を広くカバーする
ことを目指して、ハンプトンリサーチ社(Hampton Research)
から購入したスパースマトリクス結晶化スクリーニングキット(Sparse
Matrix Crystallization Kits)を用いて大まか
なスクリーニングを行なった。タンパク質濃度と温度を付加的な変数として用い
た。続いて、pH、沈殿剤濃度などの細密なグリッドを用いて、有望な(微小)
結晶を生じた条件を最適化の出発点として用いた。
te)、pH 6.4でメマプシン−インヒビター複合体の結晶が得られた。溶
解した結晶のSDSゲル電気泳動によって、結晶の内容がメマプシン2であるこ
とを確認した。Raxis IV画像プレート上でデータ収集するために、いく
つかの単結晶(約0.3 mm×0.2 mm×0.1 mmのサイズをもつ)
を塊から注意深く取り出した。これらの結果は、結晶が2.6Åまで回折するこ
とを示していた。典型的なタンパク質の回折パターンを図6に示す。X線画像の
可視化および統合用ソフトウエア−Denzoを用いて可視化し、回折データを
指標化した。Denzoによって、原始的な斜方晶格子が、偏向度指数が有意に
低く、最も高い対称性をもつことを確認した。単位格子パラメータは、α=89
.1Å,b=96.6Å,c=134.1Å,α=β=γ=90°であると測定
された。結晶学的な非対称単位当たり2個のメマプシン2/OM99−2複合体
が存在し、結晶のVm値は2.9Å3 /Daである。回折の消滅によって、空間
群はP21 21 21 であることを示唆していた。
造は、原子的な解決、すなわち、原子の三次元的配置を明らかにする可能性があ
り、インビボおよびメマプシン2における化学結合を導き出すことができるかも
しれない。メマプシン2の配列は、例えば、ペプシンまたはカテプシンDなど、
哺乳動物の他のアスパラギン酸プロテアーゼに相同性があるため、メマプシン2
の三次構造は、それらの構造物に類似(同一ではないが)していると予想される
。したがって、本結晶から得られた回折データからX線構造を決定するときには
、アスパラギン酸プロテアーゼの既知の結晶構造を検索モデルとして用いる分子
置換法から位相の解が得られる可能性が高い。
液を室温で2〜3時間インキュベートして、インヒビター結合を最適化してから
、0.2ミクロンのフィルターによって、遠心分離を用いて清澄化した。同量の
酵素−インヒビターおよび充分量の溶液を用いた水滴蒸気拡散法によって、メマ
プシン2−インヒビター複合体の結晶を20℃で成長させた。回折実験に適した
品質の結晶が、0.1 Mカコダイレート(cacodylate)ナトリウム
、pH 7.4、0.2 M (NH4 )2 SO4 、および22.5%PEG8
000において2週間で得られた。結晶の一般的な大きさは約0.4×0.4×
0.2 mm3 であった。
画像プレート上で測定し、HKLプログラムパッケージによって処理した[Z.
Otwinowski、W. Minor, Methods Enzymo
l. 276, 307 (1997)]。大きさが約0.4×0.4×0.2
mm3 の単一結晶を、25%PEG8000、20%グリセロール、0.1
Mカコダイレートナトリウム、pH 6.6、および0.2M (NH4 )2 S
O4 からなる凍結防止液で処理してから、データを集めるため、液体窒素によっ
て瞬時に−180℃まで冷却した。回折は1.9Å以上で観察された。結晶形は
、空間群P21 に属し、結晶学的な非対称ユニット当たり2個のメマプシン2/
OM99−2複合体をもち、溶剤含量が56%であった。
J.,Acta Crystallog. Sect. A. 50, 157
(1994)]を使用し、15.0〜3.5Åの範囲にあるデータを用いて行
なった。22%の配列同一性を有するヒトアスパラギン酸プロテアーゼであるペ
プシンを検索モデル(PDB id 1psn)として使用した。ローテーショ
ンおよびトランスレーション検索を行なった後、リジッドボディーリファインメ
ント(rigid body refinement)を行なって、最上解(t
op solution)を確認し、両方の分子を非対称ユニット内に位置づけ
た。最初の解は、相関係数が22%で、R−ファクターが0.51であった。プ
ログラムCNSを用いて修正を行なった[Brungerら、Acta Cry
stallgr. Sect. D, 54, 905 (1998)]。Rfr ee モニタリングに対するリファインメントを行なう前に、10%の反射を無作為
に選択した[Bruger, A.T., X−PLORバージョン3.1:X
線結晶学およびNMRのための装置(A system for X−ray
Crystallography and NMR)、コネチカット州ニューヘ
ブン(New Heaven, CT)のイェール大学出版(Yale Uni
versity Press)(1992)]。マップを表示し、モデルを構築
するために分子グラフプログラム(molecular graphic pr
ogram)[Jones, T.A.ら、電子密度マップにおけるタンパク質
モデルを構築するための改良法、およびこれらのモデルにおける誤差の位置(I
mproved methods for building protein
models in electron density maps and
location of errors in these models)
、Acta Crystallogr. Sect. A 47, 110 (
1991)]を用いた。配列アラインメントに従って、最初のペプシンモデルか
ら、対応するアミノ酸残基をメマプシン2のアミノ酸残基に変えた。最初の電子
密度マップおよびロトマー(rotomer)ライブラリーによって側鎖のコン
フォメーションを決定した。分子の動態およびCNSのエネルギー最小化作用に
よってこのモデルを修正した[Bruger,ATら、Acta Crysta
llgr. Sect. D, 54, 905 (1998)]。最初のサイ
クルの修正では、Rworking が41%、Rfreeが45%となった。この段階では
、オミットマップ(omit map)における電子密度は、活性部位の間隙に
おけるインヒビターコンフィギュレーションを明らかに示していた。鎖トレーシ
ング、二次構造、挿入、欠失、および伸長(検索モデルと比較して)において、
メマプシン2に独特な構造的な特徴を同定して、さらに、結晶学的なリファイン
メントとマップへのフィッティングを繰り返した。インヒビターを対応する電子
密度の中に構築した。
た構造体に約440個の溶媒分子を徐々に加えた。非結晶学的な対称限定および
平均化法をリファインメントおよびモデル構築の初期の段階で用いた。リファイ
ンメントを行なっている間、大量の溶媒と異方性全Bファクター補正を適用した
。Laskowski, R.A.ら、J. Appl. Crystallo
g. 26, 283 (1993)のPROCHECKプログラムによって最
終構造物を確認したところ、95%の残基がラマチャンドラン(Ramacha
ndran)プロットの最も好適な領域に位置づけられている。主鎖および側鎖
のパラメータはすべて、標準的な基準の範囲内にあるか、それよりも優れている
。最終的なRworking とRfreeは、それぞれ18%と22%である。リファイン
メントの統計値は表2に挙げてある。
定値すべての重みづけをした平均値である。 、ここで、F0 およびFcは、測定され計算された構造因子である。かっこ内の
数字は、最高の解像構造(resolution shell)(2.00〜1
.9Å)に対して対応する数である。 による反射は、リファインメントとRファクターの計算の中に含まれる。
されたフォールディングをもつアスパラギン酸プロテアーゼの特徴である(Ta
ng, J.,ら、Nature 271, 618−621 (1978))
。基質結合間隙は、インヒビターが結合するところである(図7)が、2つのロ
ーブ(lobes)の間にある。N−末側ローブ(1〜180位の残基)およびC−
末側ローブ(181〜385位の残基)の間にある(図7)疑似二重対称体は、
4Åカットオフを用いると、全体で2.3Årmsの偏差で61個の重ね合わせ
可能な原子を共有する。ペプシンでこれらに相当する数字は67個の原子および
2.2Åである。活性部位のAsp32とAsp228 、および周囲の水素結合ネッ
トワークは、間隙の中央に位置し(図7)、一般的な活性部位のコンフォメーシ
ョンによって保存されている(Davies, D.R.,Annu. Rev
. Biophys. Chem. 19, 189 (1990))。しかし
、活性部位にあるカルボキシル基は、同一平面上にはなく、その角度(50°)
は以前に測定されたものを上回っている。
されている(Sieleckiら、1990)。もっとも重要な構造上の違いは
、C−末側ローブにおける挿入とC末端の伸長である。ヘリックスおよびループ
にある4つの挿入(図7)は、隣接する分子表面上にある。挿入Fは、4個の酸
性残基を有しているが、この分子上で最も負に荷電した表面である。まとめると
、これらの挿入によって、ペプシンと比較すると、メマプシン2の分子の境界線
が有意に広がったのである(図8)。これらの表面の構造変化は、メマプシン2
が他の細胞表面成分と結合するときに機能するのかもしれない。挿入BおよびE
は、分子の別の側面上にある(図7)。後者は、C末端から伸長したGの一部と
対合するベータ鎖を有している。活性部位間隙の反対面上のフラップに面してい
るループ上の329位のところで6残基の欠失が起きていて、外見上、より結合
しやすい間隙ができている。C末端伸長の大部分(359〜393位の残基)は
非常に秩序正しい構造になっている。369〜376位の残基は、鎖293〜2
99位に対する7個の水素結合によってベータ構造を形成し、一方、378〜3
83位の残基は、ヘリックスを形成している(図7および8)。メマプシン2に
独特な2個のジスルフィド対(155/359位および217/382位の残基
)は、伸長した領域の両端をC−末側ローブに固定化している。このC末端伸長
は、以前観察されたものよりもずっと長く、コンフォメーションからして異なっ
ている[Cutfield, S. M.ら、Structure 3, 12
61 (1995);Abad−Zapatero, C.ら、Protein
Sci. 5, 640 (1996); Symersky, J.ら、B
iochemistry 36, 12700 (1997);Yang, J
.ら、Acta Crystallogr. D 55, 625 (1999
)]。最後の8残基(386〜393位)は電子密度マップでは見られず、それ
らは、球形の触媒ドメインと膜アンカードメインの間で結合用ステムを形成する
のかもしれない。
マップで可視化することができる。残りは、移動する可能性が高い。哺乳動物培
養細胞中で発現したプロメマプシンはGlu33p がN末側位置である。しかし、
残基43p〜44pに存在するArg−Arg配列は、例えば、プロレニン(p
rorenin)(Corvol, P.ら、Hypertension 5.
13−9 (1983))におけるように、プロタンパク質プロセッシングの
ための頻出シグナルである。この切断に由来する組換えメマプシン2は完全に活
性をもつ。残基28p〜42pの移動性は、これらが成熟メマプシン2の構造の
一部でないことを示唆している。
のアスパラギン酸プロテアーゼ−インヒビター複合体といくつか共通の構造的な
特徴を有する〔Davies, D.R., Annu. Rev. Biophys. Chem. 19,189(1990);Baile
yとCooper,(1994);Dealwisら,(1994)〕。これらには、遷移状態にある等配電子
体のヒドロキシル基に対する、活性部位にある2つのアスパラギン酸の間におけ
る4個の水素結合、インヒビターの中央部分をフラップ(69〜75位の残基)
で覆うこと、およびインヒビターの骨格に対する10個の水素結合が含まれる(
図9)。後者の大部分はアスパラギン酸プロテアーゼの中で高度に保存されてい
る〔Davies, D.R., Annu. Rev. Biophys. Chem. 19,189(1990);BaileyとCooper,
(1994);Dealwisら,(1994)〕。ただし、Gly11およびTyr198 への水素結合
はメマプシン2に固有のものである。これらの観察結果は、基質ペプチドの骨格
に対するメマプシン2の遷移状態にある鋳型、および触媒の機序が、他のアスパ
ラギン酸プロテアーゼと同様になる方法を具体的に示している。しかしながら、
これらの共通の特徴は、高度な選択性をもつ特定のメマプシン2インヒビターを
設計する上で決定的な要因ではない。
接触しているメマプシン2の残基(図9)は、他のアスパラギン酸プロテアーゼ
の残基とは全く異なっているということである。これら側鎖の接触は、高い選択
性をもって固く結合するインヒビターを設計する上で重要である。OM99−2
の5個のN末端残基は、引き延ばされた形のコンフォメーションになっているが
、P1 ' Ala以外はすべて、活性部位の間隙にある酵素残基と、明らかに限定
された(インヒビターの側鎖の4Å以内で)接触をもつ(図9)。
して開いている。インヒビターのP4 Gluの側鎖位置は、Gly11およびP2 Asn(図9)、および近傍にあるArg235 およびArg307 の側鎖への水素
結合によって規定されるが、このことが、OM99−2からこの残基をなくすと
Ki値が10倍増加する理由を説明している。同様に、プロテアーゼのS2 サブ
サイトは、比較的親水性が高く、溶媒に対して開いている。インヒビターのP2 Asn側鎖は、P4 GluとArg235 に水素結合している。比較的小さなS2 である残基Ser325 とSer327 (ペプシンではそれぞれGlnおよびMet
)は、Asnよりも大きな側鎖に適合することができる。メマプシン2のS1 お
よびS3 サブサイトは、大部分が疎水性残基からできているが、ペプシンのヘリ
クスhH2が欠失しているために、ペプシンとは非常に異なったコンフォメーショ
ンをもっている〔Dealwisら、(1994)〕。インヒビターの側鎖であ
るP3 ValおよびP1 Leuは、互いに対して密接に折り畳まれており、この
酵素と実質的に疎水性結合しており(図9)、特に、P3 は、Tyr71およびP
he108 と相互作用する。未変性のAPPのベータ−セクレターゼ部位において
、P2 およびP1 残基はそれぞれLysおよびMetである。スウェーデン型変
異APPは、これらの位置にそれぞれAsnおよびLeuをもち、その結果、k cat /Km 値が未変性のAPPの値よりも60倍増加し、Mullan, M.
ら[Nat. Genet. 2, 340(1992)]が記載した早期AD
発病がもたらされた。この構造は、インヒビターのP2 Lysがその正の電荷を
Arg235 との好ましからざる相互作用に投入して、Arg235 との水素結合を
失う一方で、P1 Metは、ロイシンがこの部位でもつ接触よりも好ましからざ
る接触をメマプシン2との間でもつことを示唆している(図10)。メマプシン
2との密接な接触は、P1'Alaでは見られないので、この位置にあるアスパラ
ギン酸は、APPにおけると同じように、Arg228 と相互作用することによっ
て居場所を確保する可能性がある。
パク質の表面に導く(図10)。その結果、P2'Alaの側鎖位置が、通常の伸
長型のコンフォメーションよりずれる。P3'GluおよびP4'Pheの側鎖は両
方とも、プロテアーゼとの重要な相互作用をほとんどすることなく分子表面に向
かわされる(図10)。比較的高いB−ファクター(Gluについては58.2
Å2 、Pheについては75.6Å2 )と、十分には定義されていない電子密度
は、これら2つの残基が、レニン(renin)インヒビター(CH−66)複
合体(Dealwisら、1994)中のS3'およびS4'サブサイトの特定され
た構造とは対照的に比較的可動的であることを示唆している。これらのレニンサ
ブサイトとトポロジー的に同等の領域(ペプシンの残基番号では292〜297
位)は、メマプシン2では欠失している。これらの観察結果は、OM99−2の
3個のC末端残基のコンフォメーションがメマプシン2の機能的な特徴であり、
活性部位間隙から長いタンパク質基質を導きだす方法であるかもしれないことを
示唆している。
さいというサイズ限定が付されている。メマプシン2インヒビターの場合、薬物
が血液脳関門を通過しなければならないために、この要件はさらに厳格であろう
[KearneyとAweeka、(1999)]。今回のモデルでは、P4 か
らP2'までを使用する十分に定義されたサブサイト構造によって、このような薬
物を合理的に設計するための十分な鋳型領域が提供される。この結晶構造から明
らかであるように、それぞれのインヒビターの側鎖と、それに対応する酵素のサ
ブサイトとの空間的な関係によって、これらの位置それぞれにおいて、新しいイ
ンヒビター構造物の設計が可能である。サブサイトP2'、P3'およびP4'のユニ
ークなコンフォメーションをメマプシン2インヒビターの選択性の中に取り込む
ことも可能である。今回の結晶構造に基づいたインヒビター設計の実例を以下に
示す。
いて、その間に酵素構造がないため、これらの側鎖を架橋すれば、インヒビター
のメマプシン2に対する結合強度を高めることができよう。これは、酵素に結合
するときに、架橋したインヒビターは架橋していない同じものよりも遊離型と結
合型の間にエントロピーの違いがでにくいであろう[Khan, A.R.ら、
Biochemistry 37, 16839 (1998)]。架橋した側
鎖の取りうる構造には、図11に示すものが含まれる。
造は、これらの側鎖がすでに互いに水素結合しているので、これらの間を架橋し
ても、実施例Aに記載したような結合利益が派生するだろう。架橋した構造物に
は、図12に示すものなどがある。
およびH−結合による相互作用を付加するため、P1’Ala側鎖を延長させる
ことができる。このような設計の一例が図13の略図に含まれている。
のポリペプチド骨格、およびP1−Leuの側鎖を2個の原子を付加することに
よって橋架けして環にすることができる(図14のAおよびB)。また、メチル
基をP1−Leuのベータ位炭素に付加することもできる(図14)。
−メマプシン2−T2のプラスミド構築物を示す。T7プロモーター、該ベクタ
ー由来のアミノ酸配列(T7タンパク質)(配列番号:3)およびメマプシン2
T1およびT2構築物の始点および終点を示す。構築物プロメマプシン2−T
1は、結晶化用のタンパク質の調製に用いた。これは、ベクターpET−11a
に由来する残基1v〜15vを含む。残基1p〜48pは推定プロペプチドであ
る。残基1〜393は成熟プロテアーゼドメインおよびC末端伸長に対応する。
メマプシン2の残基のナンバリングはアラインメントを行ったペプシンのN末端
位置で始まる(図3)。
)の加水分解の初速度を示すグラフである。図2Bは、M2pdによるペプチド基
質の加水分解の定常状態の速度論についての相対的なkcat /Km 値を示すグラ
フである。
9−1の化学構造である。
。図4Bは、OM99−2による組換えメマプシン2の阻害を示すグラフである
。
ある。
造の立体図である。メマプシン2のポリペプチド骨格をリボン図で示す。N‐ロ
ーブおよびC−ローブは、それぞれ青および黄色である。ただし例外として、C
−ローブ中の挿入ループ(A〜Gで示す、図2参照)はマゼンタであり、C末端
伸長は緑色である。これらのローブの間のインヒビター結合は赤で示す。
。前者の分子表面は、表面ループならびにヘリックスの挿入およびC末端伸長に
より、かなり大きいものとなっている。ヒトメマプシン2の鎖のトレースは濃い
青色であり、ヒトペプシンの場合はグレーである。淡い青色のボールは、トポロ
ジー同等である同じ残基を示す。ジスルフィド結合は、メマプシン2の場合は赤
で、およびペプシンの場合はオレンジで示す。C末端伸長は緑色である。
す概略図である。S3 ’およびS4 ’サブサイトは規定されていない。
との相互作用を示す立体図である。窒素原子および酸素原子はそれぞれ青色およ
び赤色でマークされている。水素結合は黄色の破線で示される。結合サブサイト
を含むメマプシン2残基が含まれる。OM99−2の残基P4 、P3 、P2 、P 1 およびP1 ’(図8中で規定)は、より広い範囲の立体配座の中にある。イン
ヒビター鎖は残基P2’で折り返しており、この位置で目立ったキンク(kink)
を形成する。P3 ’およびP4 ’の骨格により、該インヒビターは活性部位から
はみ出ている。
におけるP3 Val側鎖とP1 Leu側鎖との間の架橋を示す概略図である
。位置P2 およびP1 ’のRおよびR’は、アミノ酸側鎖を示す。明瞭に示すた
め、インヒビターの他の構造的要素は省いてある。
におけるP4 Glu側鎖とP2 Asn側鎖との間の架橋を示す図である。位置P 3 のRは、アミノ酸側鎖を示す。明瞭に示すため、インヒビターの他の構造的要
素は省いてある。
サブサイトにある側鎖の設計を示す概略図である。矢印はメマプシン2とインヒ
ビターとの間で起こりうる相互作用を示す。明瞭に示すため、インヒビターの他
の構造的要素は省いてある。
6員環の設計を示す概略図である。環形成は、P1 、P2 およびP3 付近のペプ
チド骨格のP1 −Leu側鎖を含む。新しい結合は破線で示す。P1 −Leuの
β炭素にメチル基を加えることができる。明瞭に示すため、インヒビターの他の
構造的要素は省いてある。
Claims (23)
- 【請求項1】 2つの触媒性アスパラギン酸残基および基質結合間隙の存在
により規定されるメマプシン2活性部位に結合する触媒的に活性なメマプシン2
のインヒビター。 - 【請求項2】 メマプシン2の活性部位の等配電子体を含んでなる請求項1
記載のインヒビター。 - 【請求項3】 一般式 (式中、Pxは−L0−により示される切断部位と比較した基質特異性位置を示
し、Lxは各基質特異性位置Px間の連結領域を示し、ならびにL0 は非加水分
解性の結合であり、P1’は−R1 CR3 −であり、R1 はCH2 OH(セリン
の側鎖)より小さな基であり、少なくとも2つの他のP位置が疎水性基である)
を有する分子を含んでなる請求項2記載のインヒビター。 - 【請求項4】 OM99−1である請求項3記載のインヒビター。
- 【請求項5】 OM99−2である請求項3記載のインヒビター。
- 【請求項6】 図11の構造を有する請求項3記載のインヒビター。
- 【請求項7】 図12の構造を有する請求項3記載のインヒビター。
- 【請求項8】 図13の構造を有する請求項3記載のインヒビター。
- 【請求項9】 図14の構造を有する請求項3記載のインヒビター。
- 【請求項10】 10-7M以下のKi を有する請求項1記載のインヒビター
。 - 【請求項11】 OM−99−2に結合した場合に表2のパラメータにより
特徴づけられる結晶化酵素に結合する請求項1記載のインヒビター。 - 【請求項12】 10-6M以下のKi を有する請求項11記載のインヒビタ
ー。 - 【請求項13】 2nM以下のKi を有する請求項11記載のインヒビター
。 - 【請求項14】 1nM以下のKi を有する請求項13記載のインヒビター
。 - 【請求項15】 メマプシン2のアミノ酸18〜379位の側鎖および骨格
の原子について0.5Å以下の根平均二乗(root mean square)偏差を有する請
求項11記載のインヒビター。 - 【請求項16】 血液脳関門に対し透過可能な請求項1記載のインヒビター
。 - 【請求項17】 生理学的条件下でメマプシン2による切断をブロックする
請求項1記載のインヒビター。 - 【請求項18】 非アミノ酸小分子である請求項1記載のインヒビター。
- 【請求項19】 800ダルトン未満の分子量を有する請求項18記載のイ
ンヒビター。 - 【請求項20】 Leu*Alaジペプチド等配電子体の合成方法。
- 【請求項21】 10-7M以下のKi を有するか、またはOM−99−2に
結合した場合に表2のパラメータにより特徴づけられる結晶化酵素に結合するメ
マプシン2のインヒビターの有効量を個体に投与する工程を含む、アルツハイマ
ー病の発症または進行の可能性を減少させるための患者の治療方法。 - 【請求項22】 インヒビターを経口的に投与する請求項21記載の方法。
- 【請求項23】 インヒビターがAPPの切断をブロックする請求項21記
載の方法。
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