CN1225015A

CN1225015A - aPL免疫反应性肽、其缀合物以及aPL抗体介导的疾病的治疗方法

Info

Publication number: CN1225015A
Application number: CN 97196260
Authority: CN
Inventors: E·J·维多利亚; D·M·马奎斯; D·S·琼斯; L·于
Original assignee: La Jolla Pharmaceutical Co
Current assignee: La Jolla Pharmaceutical Co
Priority date: 1996-06-06
Filing date: 1997-06-06
Publication date: 1999-08-04

Abstract

本文公开了(a)特异性结合B细胞(aPL表位与其结合)的aPL类似物。无T细胞表位的优化类似物作为治疗aPL抗体介导的疾病的缀合物是有用的。本文提供了作为新的非免疫性效价平台分子和接头的、包含aPL类似物和非免疫性效价平台分子的缀合物。本文也公开了制备和鉴别所说的类似物的方法、利用所说的类似物的治疗方法、制备所说的类似物的缀合物的方法和组合物以及aPL抗体的诊断免疫测定法。

Description

aPL免疫反应性肽、其缀合物以及 aPL抗体介导的疾病的治疗方法

相互参照的申请

本申请是1996年6月6日申请的美国系列号08/660,092的部分继续申请，美国系列号08/660,092是1995年6月7日申请的美国系列号08/482,651的部分继续申请。

发明所属技术领域

本发明属于免疫学领域，同时涉及用于治疗和诊断抗磷脂(aPL)抗体介导的疾病的组合物与方法。更具体地说，本发明涉及化学限定的非免疫原性效价平台分子和aPL结合表位的免疫专一的类似物的缀合物以及用于产生这些缀合物的方法和组合物。优化的类似物缺乏T细胞表位。此外，本发明涉及用于检测生物样品中抗磷脂抗体的存在和测定其总量的诊断测定方法。本发明也涉及用随机肽文库鉴别aPL结合表位的免疫专一的类似物的方法。

发明背景

抗磷脂抗体发生在自身免疫疾病(如全身红斑狼疮症(SLE)和抗磷脂抗体综合症(APS))中并与感染和药物疗法有关。APS的特性为具有如动脉或静脉血栓、血小板减少和流产之类的一种或多种临床特征。APS可能是原发的，或者它可能与其它病症相联系(主要是SLE)。(《磷脂结合抗体》(Harris等编辑，CRC出版社，Boca Raton,FL,1991)；McNeil等，免疫学进展，49卷，193-281页(Austen等编辑，学院出版社，圣地亚哥，CA,1991))。大约30-40％的SLE患者有aPL，而50％的带aPL抗体的病人却缺乏SLE。这50％的病人可能患有其它的自身免疫风湿疾病或各种各样的病症，或者它们可能已经接受了药物(特别是氯丙嗪)治疗。在对70位(26位男性和44位女性)原发性APS(PAPS)(但无证据表明有SLE)的患者进行的一项研究中，观察到下列特征：患深静脉血栓症(DVT)的有31位；得动脉闭塞(特别是中风或者瞬时局部缺血)的有31位；患心肌梗塞的有15位；患习惯性流产(fetal loss)的有24位；患血小板减少症(TCP)的有32位；Coomb氏测验呈阳性的有10位；患Evans氏综合症的有7位；32位有抗核抗体(ANA)，但其中29位不到1∶160；大约24位有抗线粒体抗体(AMA)(McNeil等，同上)。在所有中风患者中估测只有大约5％的变化，aPL抗体被认为是一个重要的作用因子。

如那些在VDRL试验中检测到的瞬时aPL抗体，发生在许多感染期间。大约30％的有永久aPL抗体的病人得过血栓病。aPL抗体的存在可在SLE患者群(他们表现出包括血栓症、TCP和流产等的一种或多种临床特征的综合症)内定义一组病人。在SLE中得这种综合症的危险总体来说大约是25％；当aPL抗体存在时危险性增加到40％，而当它们不存在时危险性减少至15％。因为aPL抗体被认为是针对原生质膜中的磷脂的，所以人们假设它们可能通过干扰在细胞(如血小板或内皮细胞)的磷脂膜上发生的止血过程而在体内产生直接致病作用。在PAPS患者中，aPL抗体看来是存在的唯一危险因子这一事实进一步证明了这些抗体有直接致病作用通过用人抗心磷脂抗体免疫小鼠诱导PAPS是迄今证明aPL抗体是直接病原性的最好证据(Bakimer等，1992,J.Clin.Invest.89:1558-1563；Blank等，1991，美国国家科学院院报，88:3069-3073)。

在临床环境中的aPL抗体测量仍然不完善。一套市售的标准抗血清(APL诊断公司，Louisville,KY)可产生标准曲线以用于比较在各种实验室中进行的测定。然而，关于确切的GPL和MPL,IgG和IgM抗磷脂抗体的各自测量单位，对所给血清的等级分类和分为高、中、低滴定率的GPL和MPL的级别，在这些实验室获得的结果间有很多的不一致性。市售的试剂盒在分配给市售标准的值上变化很大(Reber等(1995)，血栓形成和止血剂，73:444-452)。尽管有这些局限性，但一般都认为：为在APS、PAPS和其它aPL抗体介导的疾病(包括周期性中风和习惯性流产)中的抗体所识别的表位位于β₂-GPI的第5区中，并且在β₂-GPI与心磷脂结合后暴露给抗体。

现在人们一般接受：aPL抗体识别由β₂-糖蛋白Ⅰ(β₂-GPI)和带负电磷脂(例如心磷脂)构成的抗原复合体(McNeil等(1990)，美国国家科学院院报，87:4120-4124；Galli等(1990),Lancet I；1544-1547)(下文称为“aPL免疫原”)。β₂-GPI是所发现的游离的较小血浆糖蛋白并与脂蛋白脂类(其中它也叫作载脂蛋白H(apo H))相联系。它由被称作Sushi的5个独立折叠域或者与其它蛋白质中的类似域相似的短的共有重复域构成。已报道β₂-GPI在结合磷脂上经历了抗原的和构象的变化(Wagenkneckt等(1993)，血栓形成和止血剂，69:361-365；Jones等(1992)，第5届抗磷脂抗体国际学术讨论会论文集(摘要S5))。第5域包含脂类结合和aPL抗体结合的假定位点(Hunt J.和S.Krilis(1994)，免疫学杂志，152:653-659：Lauer等(1993)，免疫学，80:22-28)。aPL的病理机制是未知的(McNeil等，同上)。大多数解释援引内皮细胞功能或者血小板介入作用(Haselaar等(1990)，血栓形成和止血剂，63:169-173)。这些解释提出：在血管内皮细胞伤害或者血小板激活后，阴离子磷脂向原生质暴露表面的暴露或跨双层迁移可能会导致β₂-GPI结合和引发aPL抗体形成。

aPL抗体可能通过减少前列环素形成(Vermylen,J.和J.Arnout(1992)，临床实验室医学杂志，120:10-12)，通过直接干扰凝结蛋白质的作用，或者通过封阻抑制内在血液凝固途径、血小板凝血原酶活性、和腺苷二磷酸(ADP)介导的血小板聚集的β₂-GPI的能力(Arvieux等(1993)，血栓形成和止血剂，60:336-341)而直接起原血栓形成作用

在搜索铅化合物的药物化学中的一种主要的新工具已引起提供巨大的分子多样性的组合文库的出现。分子多样性可以从化学合成或生物系统中产生(Scott.,J.K.[合理的药物设计](CRC出版社，Weiner,D.B.和W.V.Williams编辑，Boca,Raton,FL.,1994)；Moos等(1993)，药物化学年报，28:315-324)。通过在丝状噬菌体的表面显示随机肽，人们已经创造了包含用临床显著的抗体来进行检测的数以亿计的克隆的表位文库(Scott,J.K.和G.P.Smith(1990)，科学，249:286-390；Cesareni,G.(1992)FEBS Lett.307:66-70)。通过把随机化的寡核苷酸序列(通常是pⅢ基因，该基因编码每个噬菌体表面上的单一肽序列)结合到噬菌体基因组中来制备这样的噬菌体文库。在亲和纯化和扩增的顺序循环之后，使结合抗体的那些噬菌体在大肠杆菌中增殖并通过测序病毒脱氧核糖核酸(DNA)的相应编码区鉴别结合肽。在大多数情况下，随后的研究将涉及相应的合成肽(在建立它们结合抗体的能力之后)。基于噬菌体的文库已用来模仿不连续的表位(Luzzago等(1993)，基因，128:51-57；BaLass等(1993)，美国国家科学院院报，90:10638-10642)。基于肽的药物的潜在的血浆不稳定性已经成功地通过N-末端封阻或者正确的使用氨基酸类似物得到克服(Powell,M.F.(1993)，药物化学年报，28:285-293)。

对显示高效价aPL抗体的患者，现在无可选择的免疫专一的疗法。在许多情况下，已经证明用药(如阿斯匹林、甾类化合物和华法林)在很大程度上不充分([磷脂-结合抗体](Harris等编辑，CRC出版社，Boca Raton,FL,1991)；McNeil等，同上)。合成的模拟肽(其特征是(ⅰ)不能激活T细胞但(ⅱ)保持结合免疫B细胞的能力)用于以抗原特异性方式耐受B细胞。这项技术公开在共有的、共同未决的美国专利申请系列号08/118,055(于1993年9月8日申请)和美国专利号5,268,454中，这些申请和专利以其整体与本文一并参考。如以上引用的申请和专利所公开的，B细胞耐受力限制了缀合到多价的、稳定的、非免疫原性效价平台上的肽的施用，从而通过B细胞无变应性或在交联表面免疫球蛋白后的克隆缺失来消除抗体的产生。

虽然aPL抗体识别的靶表位的确切分子性质是未知的，然而利用得自表位文库的肽将使成功的耐受原得以构建。用于与人类全身红斑狼疮有关的肾炎的治疗的B细胞耐受原也已经在共有的美国专利5,276,013和5,162,515中公开，它们以其整体与本文一并参考。

发明描述

本发明在于发现了一种利用随机肽噬菌体文库的、用于鉴别在患有PAPS、APS和其它aPL抗体介导的疾病(如周期性中风和习惯性流产)的患者中为aPL抗体所识别的关键表位的类似物的方法。

因此，本发明的一个方面是用于筛选随机肽噬菌体文库以便鉴别充分模拟由aPL抗体识别的表位的肽序列的一种改进方法。该方法包括以下步骤：(a)利用从本领域已知的那些方法修改的方法来生物淘选(biopanning)所说的文库；(b)通过(ⅰ)在涂布有结合到蛋白质G的aPL抗体的微量板孔中培养噬菌体，(ⅱ)洗涤微量板孔以移去未结合的噬菌体，(ⅲ)洗脱结合的噬菌体，以及(ⅳ)用洗脱的噬菌体感染微生物(如大肠杆菌)，并通过在琼脂上进行平板接种来计算被感染过的微生物的数量，通过微量淘选(micropanning)由步骤(a)筛选得到的噬菌体来除去结合很弱的噬菌体；(c)通过(ⅰ)用aPL抗体涂布微量板孔，(ⅱ)在所涂布的孔中培养为(b)中微量淘选所鉴别的最强结合的克隆，并洗掉未结合的噬菌体，(ⅲ)在比色ELISA测定中利用酶缀合的山羊抗噬菌体抗体计算结合至抗体上的噬菌体的数量，通过噬菌体俘获ELISA的评价确定在(b)中回收的最强结合克隆；如果鉴别到若干相同强结合的克隆，则附加一步(d)在最强结合噬菌体俘获ELISA克隆上进行噬菌体ELISA。

在这一点上，本发明包括用于鉴别特异性结合aPL抗体(分离自患有aPL抗体介导的疾病的患者)之表位的类似物的方法，该方法包括：(a)制备噬菌体随机肽文库；(b)筛选所说的具有aPL抗体的文库，以鉴别aPL模拟表位，其中所说的筛选包括：(ⅰ)通过生物淘选筛选所说的文库；(ⅱ)通过微量淘选筛选经(ⅰ)中的生物淘选分离的噬菌体；以及(ⅲ)通过免疫测定鉴别在(ⅱ)中回收的包含aPL抗体高亲和性结合肽的噬菌体。

本发明也包括一种生物淘选噬菌体随机肽文库以鉴别和分离结合到aPL抗体上的肽的方法，该方法包括：(a)使亲和纯化的aPL抗体与携带随机肽插入片段的噬菌体反应；(b)回收携带有结合到aPL抗体上的随机肽插入片段的噬菌体；(c)用在(b)中回收的噬菌体感染微生物；和(d)在包含抗生素的培养基中培养感染过的微生物以分离噬菌体。

本发明还包括一种微量淘选噬菌体随机肽文库以鉴别和分离具有与aPL抗体的高结合亲和性的肽的方法，该方法包括：(a)通过生物淘选分离携带随机肽插入片段的噬菌体；(b)在涂布有结合到蛋白质G上的aPL抗体的微量板孔中培养步骤(a)中回收的噬菌体；(c)洗涤微量板孔，除去未结合的噬菌体；(d)洗脱结合的噬菌体；(e)用在(d)中回收的噬菌体感染微生物；和(f)在包含抗生素的培养基中培养感染过的微生物以分离噬菌体。

本发明也包括上述的方法，其中免疫测定是噬菌体俘获ELISA，该方法包括：(a)在涂布有aPL抗体的微量板孔中，培养通过微量淘选分离的携带随机肽插入片段的噬菌体；(b)洗掉未结合的噬菌体；(c)在孔中温育酶标记的抗噬菌体抗体；(d)洗掉未结合的酶标记的抗噬菌体抗体；(e)添加比色底物；和(f)测量底物的吸收率，以鉴别高温(high-t)亲和性结合噬菌体。

本发明也包括上述的方法，并且还包括进行附加的高亲和性结合噬菌体的噬菌体俘获ELISA测定，该方法包括：(a)在微量板孔上涂布上相同数量的噬菌体；(b)在孔中培养aPL抗体；(c)洗掉未结合抗体；(e)用结合的aPL抗体与酶标记的抗aPL抗体一起培养；(f)洗掉未结合的酶标记的抗aPL抗体；(g)将比色底物添加至孔中；(h)测量底物的吸收率，以测量噬菌体的相对结合亲和性。

本发明也包括以上所述的方法，其中所说的免疫测定是一种菌落印迹免疫测定，该方法包括：(a)在包含琼脂的培养基顶上的硝酸纤维素膜上培养受到携带随机肽插入片段的噬菌体感染的微生物；(b)通过在包含琼脂的培养基顶上的第二个硝酸纤维素膜上印迹微生物来复制转移(a)中培养的微生物；(c)培养转移的微生物；(d)裂解所说的微生物；(e)用溶菌酶消化微生物；(f)用明胶溶液封阻膜；(g)将aPL抗体与膜一起培养；(h)洗掉未结合的aPL抗体；(i)将硝酸纤维素膜与酶标记的抗aPL抗体一起培养；(j)洗掉未结合的酶标记的抗aPL抗体；(k)添加比色底物；和(l)测量底物的吸收率以鉴别高亲和性结合的噬菌体。

本发明也包括一种用于测定和分级亲和结合特征表位的方法，所说的表位特异性结合分离自患有aPL抗体介导的疾病的患者的aPL抗体，该方法包括：(a)用心磷脂涂布微量滴定板的孔；(b)添加成年牛或人血清作为β₂-GPI源以结合心磷脂并阻止与平板的孔的非特异性结合；(c)温育单体类似物溶液和高效价的aPL抗体一段预定的时间；(d)向微量滴定板孔中添加aPL抗体/类似物混合物并温育一段预定的时间；(e)洗涤孔以洗掉未结合的aPL抗体；(f)将与标记(例如，酶)缀合的抗人类IgG添加到平板孔中，培养一段预定的时间；(g)洗涤孔以洗掉未结合的抗人类IgG缀合物；(h)添加标记的缀合物的底物，进行底物/标记反应一段预定的时间；(i)测量底物/标记反应的最终-产物以定量结合至孔上的aPL抗体的量；(j)计算aPL抗体结合的抑制作用(如果有的话)百分比，以确定类似物对aPL抗体的亲和性。

本发明的另一方面包括测定结合到aPL抗体上的肽的解离常数的荧光极化肽结合测定。这一测定检测肽与aPL抗体的直接结合。

本发明也包括一种用于确定aPL抗体在得自怀疑患有aPL抗体介导的疾病的患者的体液中的存在的诊断免疫测定法，该测定法包括使特异性结合aPL抗体的表位的类似物与体液样品接触，以及利用本领域所熟知的方法来确定aPL抗体是否在体液中存在，如果存在，则定量在液体中存在的aPL抗体的量。一个这样的免疫测定法包括：(a)用特异性结合aPL抗体的表位的类似物涂布在微量滴定板的孔上；(b)洗涤孔以洗掉未结合的类似物；(c)将体液试验样品添加至孔中，并温育一段预定的时间；(d)洗涤孔以除去未结合的试验样品；(e)将与标记缀合的抗人IgG添加到平板孔中，温育一段预定的时间；(f)洗涤孔以洗掉未结合的抗人IgG缀合物；(g)添加标记的缀合物的底物，并进行底物/标记反应一段预定的时间；(h)测量底物/标记反应的最终产物，以确定抗aPL抗体在试验样品中的存在。本发明也包括一种如上所述的诊断免疫测定法(其中的免疫测定是定量的)。

噬菌体ELISA测定包括：(ⅰ)在微量滴定板的孔上涂布上相同量的不同克隆，随后(ⅱ)通过在孔中添加抗体并用酶标记抗人IgG缀合物发展该反应来鉴别最强地结合aPL抗体的肽插入片段。具有与aPL抗体的高结合亲和性(正如由噬菌体ELISA、菌落印迹或噬菌体俘获ELISA所测量的)的噬菌体所显示的随机肽表示aPL特定的表位的类似物。然后合成这些肽并用竞争测定法按结合强度分级。

本发明的另一个方面是特异性结合到B细胞(aPL表位结合到其上)上的aPL抗体结合类似物。优化的类似物缺乏T细胞表位。

此外，本发明的另一个方面是引发耐受aPL免疫原的特定B细胞的组合物，该组合物包含非免疫原性效价平台分子和aPL抗体结合类似物的缀合物，所说的抗体结合类似物(a)特异性结合B细胞(aPL免疫原结合于其上)和(b)缺乏T细胞表位。

附图简要说明

图1显示在市售的aPL抗体标准的ELISA测定中鱼明胶取代成年牛血清废除了所有抗心磷脂(ACA)活性。这一结果支持了McNeil等(同上)和Galli等(同上)的研究结果(涉及β₂-糖蛋白Ⅰ(β₂-GPI)在定义ACA的靶表位中的重要性)。

图2显示树脂结合类似物5AI2免疫专一地结合到亲和纯化的IgG(命名为ACA-6501)上。

图3说明通过利用ACA-6626筛选得到的aPL抗体结合类似物结合aPL抗血清但不结合正常的血清。

图4也说明ACA 6501/5AI2类似物免疫专一地结合ACA-6501抗血清，并与ACA-6626进行交叉反应。

图4和5说明，当通过利用本发明范围之内的方法筛选得到的ACA6501/5AI2和ACA 6626/4D3 aPL抗体结合类似物优选地与筛选抗体结合时，检测到明显程度的交叉反应。

图6说明用于计算ACA-6501aPL抗体的GPL值的方法。

图7显示与GPL标准血清相比的亲和性分离的ACA-6501活性。

图8说明在通过第四次生物淘选分离得到的克隆的序列多样性方面的明显下降。

图9说明在用ACA-6635的噬菌体俘获ELISA中三个克隆(3AI2、3B3和3A5)显示出很强的免疫专一的信号，而所试验的所有克隆与正常的IgG都无反应。

图10显示在用ACA-6501的噬菌体ELISA中七个克隆显示出强的信号。

图11显示利用ACA-6501用肽5AI2、CB2和3B10得到的竞争结合ELISA的结果。0.16μg的肽5AI2对ACA-6501aPL抗体与四价肽ACA6501/3B10(结合至聚苯乙烯微量板孔上)的结合产生50％的抑制作用，而需要0.08μg CB2和0.54μg 3B10来产生50％的抑制作用。

图12说明修饰的ACA-6641/3G3类似物的竞争活性。

图13说明在用ACA-6501 aPL抗体的竞争性结合ELISA中肽139、142和143的50％抑制值分别是6.9、0.7和0.9μg。

图14说明在肽3B10中的3、9位和3与9两个位上取代α-Me-Pro的效应。与“天然”肽相比，在9位的α-Me-Pro的取代使肽的活性增加了四倍。

图15显示肽6641/3G3(LJP 688)与九种亲和纯化的ACA抗体高度进行交叉反应。

图16和17显示在脾细胞(得自用LJP 685-KLH免疫处理过的小鼠)分别用100、20和4μM的LJP 685-MTU-DABA-PEG缀合物(化合物36)和LJP 685-ATU-MTU-AHAB-TEG缀合物(化合物35)培养2小时后，利用该脾细胞在108M下在抗685抗体ABC方面的剂量依赖性的减弱。

图18显示最靠近上述肽925的九种结构的质心的核磁共振结构，并且是肽925分子形状的合理的表示。

图19把肽925(在如3G3的图的底部标记)的结构与肽5A12的结构相比较。两种肽在肽序列中大约相同的位置都有转角。

图20A和20B说明aPL类似物的药效基团已初步鉴定为小疏水基团和带正电的基团。如图20A所示的肽925的偕二甲基和氨基基团初步鉴定为这个肽的药效基团。在图20A中说明了限制药效基团到一些支架上的碳氢化合物接头的长度以及分开这些接头连到支架上的位点的距离。

图21说明通过稀释6501血清由6501衍生的肽对β₂-GPI的抑制作用。

图22显示CB2^*-F的ACA-6701滴定：FITCGPCILLARDRCG。

图23显示CB2^*-F的ACA-6501滴定：FITCGPCILLARDRCG。

图24显示CB2^*-F的完全的ACA-6501滴定：FITCGPCILLARDRCG。

图25显示利用1.04当量的CB2^*对来源于ACA-6701的CB2^*-F的置换。

图26显示利用CB2^*以置换来源于ACA6701的CB2^*-F的cFP滴定。

图27显示利用3B10以置换来源于ACA6701的CB2^*-F的cFP滴定。

图28显示(LJP685)4/MTU-AHAB-TEG缀合物的耐受活性的剂量效应。

图29显示(LJP685)4/MTU-DABA-TEG缀合物的耐受活性的剂量效应。

图30显示在体外模型中检验的(LJP685)4/MTU-DABA-TEG缀合物的耐受活性的剂量效应。

图31显示在体外模型中检验的(LJP685)4/MTU-DABA-TEG缀合物的耐受活性的剂量效应。

图32显示比较各种施用途径和剂量范围的(LJP685)4/MTU-AHAB-TEG缀合物的耐受效应。

实施发明的方法A．定义

本文中所用的术语“aPL抗体”指特异性地结合介导疾病的β₂-GPI的任何抗体。

如本文中所用的，术语“B细胞无反应性”指需要T细胞辅助来产生和分泌抗体的那些B细胞的不反应性，包括(但不限制于)未成熟和/或成熟B细胞的无性系缺失和/或B细胞无能力产生抗体。

“不反应性”指在对免疫原的体液反应方面的治疗上有效性的降低。数量上的减弱(如通过抗体产率减少而测得的)至少是50％，优选地至少是75％，最优选为100％。

“抗体”指具有T细胞依赖性的那些抗体。

如本文中所用的，术语“免疫原”是指能引起体液免疫反应的实体(包含aPL抗体)。免疫原有B细胞表位和T细胞表位。在aPL抗体介导的病理学中涉及的aPL免疫原可能是外部的(对个体来说是外源的)免疫原(如药物)，包括对个体来说是外源的天然生物物质(如治疗蛋白质、肽和抗体以及类似物)或者自身免疫原(自免疫原)(如与抗体介导的超凝固性(中风)有关的那些自免疫原)。

免疫原的“类似物”术语指一种分子，该分子(a)特异性地结合到与免疫原特异性地结合的抗体，(b)缺乏T细胞表位。尽管类似物通常是免疫原的片段或者衍生物，并由此具有与免疫原相同的化学类别(例如，免疫原是多肽而类似物也是多肽)，但化学相似不是必要的。因此，只要类似物具有以上(a)和(b)的功能特征，则它可以具有与免疫原不同的化学类别(如免疫原是碳水化合物而类似物是多肽)。类似物可能是肽、碳水化合物、脂类、脂多糖、核酸或其他生化体。另外，免疫原和类似物的化学结构都不需限定于本发明的目的。

免疫原的“类似物”术语也包括术语“模拟表位”。术语“模拟表位”指一种通过竞争阻止抗体结合免疫原的分子。因为它特异性结合上述抗体，所以人们认为模拟表位模仿了免疫原的抗原决定簇。

如本文所使用的，“效价平台分子”指包含有利于一系列免疫原的类似物的连接的位点的非免疫原性分子。

“非免疫原性”用来描述效价平台分子，同时指当对个体自身施用药物时效价平台分子本质上不引起免疫反应。

如本文所使用的，“个体”指哺乳动物物种中的一员，并且包括人类、灵长类、小鼠和家畜(如牛和羊)、运动动物(如马)和宠物(如狗和猫)。

如本文所使用的，“药效基团”指在aPL类似物与抗体靶的结合中涉及到的主要基团的三维取向和化学性质。B.aPL抗体结合类似物的鉴别

aPL抗体结合类似物可以通过筛选侯选分子来确定它们是否(a)特异性结合到aPL抗体上，以及(b)缺乏T细胞表位。与aPL抗体的特异性结合可以用常规的免疫测定法(如下列实施例提到的ELISA法)来测定，同时T细胞表位的存在与否也可由该实施例中描述的常规T细胞活性测定法确定。在这一点上，“特异性地结合”到血清抗体(抗免疫原的)上的类似物显示其合理的亲和性，例如10⁷M^-1。T细胞表位的存在与否也可利用在08/118,055系列号中所公开的氚化胸苷掺入测定法来测定。T细胞表位的存在也能通过利用本领域已知的方法测量源于T细胞的淋巴激活素的分泌来测定。一般认为在以上背景下不能引起胸苷的统计学上明显的掺入的类似物缺乏T细胞表位。应该认识到胸苷掺入的量可以随着免疫原变化。典型的刺激指数大约低于2-3，更常见的是大约1-2(表明缺乏T细胞表位)。C．缀合物的制备

将aPL抗体结合类似物偶联到非免疫原性效价平台分子上以制备本发明的缀合物。优选的效价平台分子是生物上稳定的(即它们显示出一种从几小时到几天到几个月的活体内排泄半寿期以赋予治疗功效)，并优选包含限定组合物的一条合成单链。它们通常具有在大约200至200,000的范围内的分子量，通常为大约200至20,000。在本发明范围内的效价平台分子的例子是如聚乙二醇(PEG)、聚-D-赖氨酸、聚乙烯醇和聚乙烯吡咯烷酮的聚合物。优选的聚合物基于具有大约200至大约8,000分子量的聚乙二醇(PEGs)。

其它适合用于本发明的效价平台分子是化学限定的、非多聚的效价平台分子，这些分子公开在共有的、共同未决的美国专利申请系列号08/152,506(申请于1993年11月15日)中，该申请以其整体与本文一并参考。特别优选的同类的化学限定的适合用于本发明的效价平台分子是衍生的2,2’-亚乙基二氧基二乙胺(EDDA)和三甘醇(TEG)。

附加的适合的效价平台分子包括四氨基苯、七氨基β环化糊精、四氨基季戊四醇、1,4,8,11-四氮杂环十四烷(Cyclam)和1,4,7,10-四氮杂环十二烷(Cyclen)。

aPL抗体结合类似物与效价平台分子的缀合可以以许多方式实现，典型地包括一种或多种交联剂以及在类似物和效价平台分子上的官能团。

多肽类似物包含氨基酸的侧链部分，这些侧链部分含有如氨基、羧基或者巯基(作为偶联类似物到载体上的位点)的官能团。如果类似物还没有这些基团，那么可以将有这样的官能团的残基添加到类似物上。这些残基可以用固相合成技术或者重组技术掺入，这两种技术在肽合成领域中都是已知的。在碳水化合物或者脂类类似物的情况下，功能性氨基和巯基可用常规化学方法掺入其中。例如，伯氨基可以通过在氰基硼氢化钠存在下与1,2-亚乙基二胺反应来掺入，而巯基则可以通过半胱胺二盐酸盐的反应以及随后的利用标准二硫化物还原剂的还原反应引入其中。如果不具有适合的官能团，那么可以用一种类似的方式产生包含官能团的效价平台分子。

可变长度的亲水接头对把肽或者其它生物活性分子与效价平台分子相连接来说是有用的。适合的接头包括乙二醇的线性低聚物或者聚合物。这样的接头包括具有R¹S(CH₂CH₂O)_nCH₂CH₂O(CH₂)_mCO₂R₂分子式的接头，其中n=0-200,m=1或2,R¹=H或如三苯甲基的保护基团，R²=H或烷基或芳基(例如4-硝基苯基酯)。这些接头对于把包含硫醇反应基团(如卤乙酰、马来酰亚胺等)的分子(通过硫醚)连接到含有的氨基的第二分子(通过酰胺键)上是有用的。这些接头在连接顺序上是灵活的，即硫醚可以首先或者最后形成。

通常配制缀合物供注射施用(例如腹膜内注射、静脉注射、皮下注射、肌肉注射等)。因此，典型地是将它们与药学上可接受的载体(如盐水、林格氏溶液、右旋糖溶液等等)混合。缀合物通常占制剂重量的大约0.01％至10％。以“治疗有效的量”对个体施用的缀合物，“治疗有效的量”即该施用量足以使B细胞对所涉及的免疫原无反应性并实现所说的抗体介导的病症的预防、改善或消除。特定的剂量方案(即剂量、用药时间和重复)取决于具体的个体以及该个体的病史。通常，每周施用一次大约1μg至100mg缀合物/kg体重的剂量，优选为大约100μg至10mg/kg体重。其他合适的用药方案的频度为例如每日一次或者每周3剂，或者每周1剂，或者每2周至4周1剂，或者每月1剂，或者按照个体或者疾病状态利用频度较低的方案。可能需要重复施用(通常按照B细胞周转率确定施用时间)以达到和/或者保持体液无反应性状态。如果检测到抗体效价上的增加，那么这样的重复施用将典型地包括每30至60天(或者更短时间)大约1μg到10mg/kg体重(或者更高剂量)。另外，缀合物的持续不断的释放配方可以指示一些病态。用于实现持续释放的各种配方和仪器是本领域所已知的。

抗辅助T细胞的治疗可与施用缀合物一道进行。这样的治疗通常使用抑制T细胞的药剂(如甾类化合物或者环孢菌素)。D．aPL抗体的抗原的特性

本发明者在aPL抗体上的初步研究与分析被这些抗体所识别的抗原位点的特性的出版物相吻合。最初人们认为这些抗体很象那些在VDRL试验中检测到的抗体一样可识别心磷脂分子。如图1所示，在抗心磷脂抗体(ACA)固相ELISA中，以鱼明胶取代成年牛血清基本上废除了按照ACA标准购得的抗体制剂的所有ACA活性。这一发现表明ACA抗体识别在血清蛋白质上的决定簇(如由McNeil等，同上和Galli等，同上所提出的)而非心磷脂本身。这些作者显示这个蛋白质是β₂-GPI，因此术语“ACA”或者“抗心磷脂抗体”实际是用词不当，但是今天仍然用来指这些抗体。

大多数自身免疫的、IgG aPL抗体识别在β₂-GPI分子上的决定簇。这些表位仅仅在它与心磷脂(新表位)结合时才形成或者暴露在β₂-GPI上。另外，在β₂-GPI上的表位可以存在于每个β₂-GPI分子的单个拷贝之中，并且可以有较低的对aPL抗体的亲和性。只有通过这些位点之两个在邻近β₂-GPI分子上的排列(由它们与心磷脂的结合)，才能实现保持抗体-抗原相互作用的足够亲合力。

在本发明(模拟天然B₂-GPI的表位)范围之内通过aPL类似物的核磁共振(NMR)分析得到了对β₂-GPI表位结构的更深入了解。例如，与aPL抗体进行高度交叉反应的两种肽aPL类似物的核磁共振溶液结构的比较显示：在肽序列(参见图18和19)中，两种肽在大约相同的位置都有转角。E．ACA ELISA

与临床样品的GPL得分关连的大规模检验和研究抗体与β₂-GPI的层析纯化的必要性导致开发了一种性能上与市售的试剂盒近乎一致的并且与发现具有最佳可再现性(Reber等，同上)的设计相似的aPL抗体的ELISA测定法。一种改进的ACA ELISA也已经完成，其中在缺少心磷脂(首先加至微量板孔中)的情况下直接结合至特定的微量平板上的β₂-GPI用来直接结合aPL IgG。(参见Roubey等(1996)，关节炎和风湿病：39:1606-1607；R.A.S.Roubey(1996)，关节炎和风湿病，39:1444-1454)。F．aPL抗体的免疫亲合纯化

为了分离aPL抗体，将多层状、包含心磷脂的分散体(脂质体；也包含胆甾醇和三十二烷基磷酸酯)与aPL血浆(或者血清)一起温育。这些脂质体是通过离心从血清中沉淀得到的。在洗涤后，由2％辛基葡糖苷去垢剂破坏上述脂质体混合物，并将其用于蛋白质A-琼脂糖柱。接着充分洗涤以便首先除去脂类，然后除去非IgG组分，用弱酸把IgG aPL抗体从蛋白质A中洗脱下来，中和、缓冲交换并在ACA ELISA中测验该抗体。这一方法产生富含高达10,000倍的aPL抗体，如利用兔IgG抗人β₂-GPI抗血清的Western印迹法所示，其对β₂-GPI没有任何污染。通过在固相β₂-GPI上的亲和纯化的抗体的层析来完成一个附加的亲和纯化步骤。推荐上述第二个亲和纯化步骤作为新发现的结果，该新发现是关于直接结合到β₂-GPI上的aPL抗体的更大临床关联的。它也用来进一步确保最终制备物无污染，尤其是β₂-GPI。G．丝状噬菌体随机肽文库的构建

在p-Ⅲ蛋白质上构建十一个不同的fUSE 5丝状噬菌体随机肽文库(每个噬菌体含5个具有肽的p-Ⅲ拷贝)。这些文库为模拟表位的发现提供了大量的形状和结构。4个文库(指定为“x”文库)具有肽插入片段(长度分别为8、10、12和15个残基)，并在氨基和羧基末端两侧连有脯氨酸残基。这些脯氨酸残基的作用在于破坏任何对二级结构的贡献(可能从天然P-Ⅲ蛋白质产生)并使插入片段进入溶剂。“y’”文库包含长度为6、7、8、9、11和13个氨基酸的半胱氨酸结合的插入片段。除了缺乏6和8个氨基酸的插入片段外，“y”文库与“y’”文库相同。“y”和“y”文库的这些肽插入片段在氨基和羧基末端侧连半胱氨酸残基从而形成环状的、更稳固的结构。由于类似于以上的“x”文库的理由，在这些半胱氨酸残基的外部掺入脯氨酸残基。“x”、“y’”和“y”文库定位在天然p-Ⅲ蛋白质的氨基末端的5个残基上。“z”文库包含定位于p-Ⅲ蛋白质的氨基末端上的随机的8个氨基酸插入片段，并且不包含任何侧翼脯氨酸或者半胱氨酸残基。“x”、“y’”和“z”文库的组合代表了十一个不同的文库，其中每个有大约一亿个不同的肽插入片段。

利用标准的分子生物学技术通过掺入合适长度(适合于产生所需长度的、插入fUSE的p-Ⅲ基因中的插入片段)的随机寡核苷酸序列来构建这些文库。在fUSE 5 DNA的限制性核酸内切酶消化之后，加入过量的激酶寡核苷酸(作为缺口双链体提供)并连接。将DNA电穿孔进入大肠杆菌，并通过在包含四环素的培养基中培养来选择插入片段。从上清液中分离这种培养物的噬菌体(包含肽插入片段)，并在缓冲液中洗涤和再悬浮。典型地，文库在每mL8×10¹²转导单位下显示有7×10⁸个独立克隆。H．噬菌体筛选方法

筛选噬菌体显示肽文库的本质在于将几十亿潜在的候选噬菌体减少到相对较少的具有显著性质的噬菌体的能力。原来的筛选方案由Scott,J.K.和G.P.Smith(1990)(科学，249:315-324)推荐，该方案经过大的改动而修改为有利于选择各种aPL抗体的最好表位。设计这些方法使选择更加严格，当筛选进行直到达到某一点时，其中有用数量的代表最好序列的克隆可以得到全面的研究。对一些抗体，文库看来似乎没有可以结合很紧的序列，如果用高度严格的方法筛选，则不存在特异性的克隆。在另一方面，所说的文库经常产生代表上述抗原的良好类似物的许多克隆，同时有必要使用高度严格的方法来鉴别最好的表位。由于这一原因，开发了不同严格程度的测定法，以便从表位文库筛选中鉴别最好的表位。在这里按逐渐增加的严格程度的顺序列出测定法；生物淘选＜微量淘选＜噬菌体俘获ELISA＜噬菌体ELISA=菌落印迹=肽ELISA。

(ⅰ)生物淘选

“生物淘选”描述这样的技术，其中使亲和纯化的aPL抗体和携带随机肽插入片段的噬菌体混合，而后抗体-特异性回收俘获结合的噬菌体。噬菌体赋予大肠杆菌(在包含四环素的培养基中培养然后分离的)以四环素抗性。多轮生物淘选增加了样品中免疫专一的噬菌体的数量。噬菌体总是在3至5轮选择后得到回收，但是可以仅代表对选择的抗体以低亲和性非特异性结合的序列。用于进一步评价这些噬菌体的方法(微量淘选)是需要的。

(ⅱ)微量淘选

噬菌体与aPL抗体的结合的相对强度的估计可以通过“微量淘选”来进行。微量淘选是在3轮或更多轮生物淘选后进行的并使用与生物淘选方法相同的抗体。该方法包括稀释来自生物淘选的最后一轮的噬菌体，通过微量淘选对50或更多个这样的克隆进行分析。通过使每个克隆生长到相似的密度，并在预先涂布有常量抗体的微量滴定孔中在最适的单一浓度下培养稀释的噬菌体来完成微量淘选。噬菌体的最适的单一浓度是最有可能揭示最宽范围的微量淘选得分(从0到4+)并因此使得在测验的克隆中间有最大差别的那一浓度。它是基于6个随机选择的克隆的微量淘选行为，其中的得分是在由系列稀释获得的几个噬菌体浓度之每一个下确定的。在与抗体一起培养之后，洗掉未结合的噬菌体，并将结合噬菌体的量用作为噬菌体插入片段对抗体的亲和性的指示。结合噬菌体的量是由弱酸洗脱随后中和并以大肠杆菌感染来确定的。通过将该微生物平板接种在含四环素的琼脂平板上，然后确定每个克隆所达到的菌落密度，来定量感染的大肠杆菌的数量。

(ⅲ)噬菌体俘获ELISA

开发噬菌体俘获ELISA试验以提供一种中等水平测定来在比较低的严格程度的微量淘选测定和高的严格程度的噬菌体或肽ELISA测定之间的间隙搭桥。初步的研究显示通过微量淘选(但是没有通过噬菌体ELISA或者肽ELISA)一些抗体制剂给出太多阳性克隆。以下所描述的噬菌体ELISA的限制是：只有p-Ⅲ的五个拷贝位于每个噬菌体中，即使将大量噬菌体涂布在孔上，也只有插入片段的极少拷贝被体现，并且检测需要抗体对插入片段有十分高的亲和性。通过噬菌体俘获ELISA，信号扩增许多倍从而有利于低亲和性的检测以及上述抗体与上述插入片段之间的稳定的相互作用。

噬菌体俘获ELISA包括下列步骤。在微量滴定孔上涂布aPL抗体，并如在微量淘选测定中添加噬菌体克隆。洗掉未结合的噬菌体，利用酶缀合的山羊抗血清(结合噬菌体的大多数外壳蛋白)来定量结合噬菌体的量。使利用噬菌体俘获ELISA筛选得到的噬菌体与许多aPL抗体反应，并在随后进行的ELISA测定中提供强信号。这一中等水平的灵敏性使得肽合成更为有效率，因为极少微量淘选阳性的噬菌体是噬菌体俘获ELISA阳性的。结果是，由阳性的噬菌体俘获ELISA噬菌体合成的肽一般是免疫反应性的。

(ⅳ)噬菌体ELISA

这种选择噬菌体的方法要求插入片段十分紧地结合筛选的抗体。将噬菌体直接涂布在微量滴定板的孔上并与筛选的抗体一起培养。随后洗掉未结合的抗体，添加抗人IgG碱性磷酸酶缀合物以结合任何结合到噬菌体上的aPL抗体。然后按照本领域已知的方法通过在孔中加入比色底物(其将与碱性磷酸酶反应)来检测APL抗体。

(ⅴ)菌落印迹

该测定方法使得可以大规模地菌落筛选由生物淘选噬菌体感染的大肠杆菌。这一方法可替代噬菌体ELISA来鉴别免疫反应的克隆，并且显示出类似的灵敏性水平而不需要在试验前培养单独的噬菌体克隆。在这种测定中，将受到来源于一轮生物淘选的噬菌体感染的大肠杆菌涂布在一个大直径的硝酸纤维素(NC)膜上并且在含四环素的琼脂平板的表面上培养一夜(Barbas等(1991)，美国国家科学院院报，88:7978-7982)。每个菌落从含有相同序列的噬菌体的感染产生。利用这种NC“主培养基”在NC上制得若干复制转移印迹，并且使这些印迹得以在琼脂平板的表面上生长。在印迹上的噬菌体感染的菌落的化学和酶促破坏后，可以用一般用于Western印迹法的技术(即用染色或者免疫印迹)来探测噬菌体。被封阻的印迹可与筛选的aPL抗体一起培养。在洗掉未结合的抗体后，添加抗人IgG辣根过氧化物酶缀合物以结合任何结合到噬菌体上的aPL抗体。比色底物的添加使得人们可以定位在主平板中的离散菌落，该菌落代表可被克隆供进一步研究的免疫专一的噬菌体。

(ⅵ)肽ELISA

在用上述测定方法确定最佳反应的噬菌体的肽插入序列的DNA测序之后，利用本领域所熟知的标准Fmoc肽化学制备相应的肽。对于肽ELISA测定，可以制得上述肽，例如制成分支四价分子(即每个分子有插入片段的四个拷贝)。这样的分子可以涂布在微量滴定板的孔上，并且仍然使表位向溶液暴露从而使之得以与抗体结合。以类似于用于多抗原肽类(MAPS)的方法(Posnett等(1988)，生物化学杂志，263:1719-1725)，通过掺入赖氨酸作为头两个偶联的分支点来合成四价肽。将由甘氨酸-丝氨酸-甘氨酸-丝氨酸组成的间隔添加在赖氨酸之后的每个臂上，然后添加插入片段(包括在噬菌体中所发现的构架氨基酸，在羧基末端的脯氨酸-甘氨酸，和在氨基末端的丙氨酸-甘氨酸脯氨酸)。利用标准Fmoc方法将所有利用这种合成的氨基酸一次加入一个。

这些肽由ELISA测定，即通过把这些肽涂布在微量滴定的孔上，然后以一种标准的ELISA格式测定它们与aPL抗体的反应性。实际上，肽通常很强地结合在原来的筛选抗体上，同时显示与其它aPL抗体的一定的交叉反应性。包括非aPL抗体的对照以除去非特异性结合肽类。

(ⅶ)竞争性结合肽ELISA

一旦ELISA阳性的肽类得到鉴别，就有必要定量它们相应的对aPL抗体的结合亲和性，同时通过肽竞争ELISA测定来确定是否两肽结合在给定的病人血清中的相同的抗体群。在这种测定中，各种单体肽与涂布在微量滴定板上的四价肽竞争。为完成测定，利用标准Fmoc化学将要评价的肽合成为单体(即没有在四价肽的合成中所用的赖氨酸分支)。然后将单体肽纯化，并且以已知浓度溶解。在微量滴定板的孔中涂布已知结合到aPL抗体上的四价肽。系列稀释的单体肽与恒定量稀释的aPL抗体一起温育。通过滴定抗四价肽的抗体和在滴定率曲线的下斜部分上选择稀释度来预先确定aPL抗体的稀释度。在温育抗体和单体肽一小时后，将抗体/肽溶液添加到微量滴定孔中并进行标准的比色ELISA。通过绘制每个孔的比色读数的散点图来测定减弱aPL抗体与四价肽的结合的每个单体肽的浓度。50％的抑制点用来测量单体肽的结合的相对强度。

这一测定方法的一个变化是利用涂布有人类β₂-糖蛋白Ⅰ/心磷脂(β₂-GPI/CL)(而不是四价肽)的微量滴定板，并检验单体肽封阻aPL抗体与在β₂-GPICL上的表位的结合的能力。在这种测定中，在最适浓度下的IgG耗尽的人类血清用作β₂-GPI的来源。用类似于利用四价肽作为平板底物的测定法，将若干浓度的单体肽与最适浓度的aPL抗体一起温育。在aPL/肽于(β₂-GPI/CL)平板上温育后，在四价测定的半最大吸收率处确定抗体结合和50％抑制所需的肽浓度。

这一测定的另一个变化检验单体肽封阻aPL抗体与β₂-GPI(直接涂布在Nunc Maxisorp微量滴定平板的孔上的)的结合的能力。在这一变化中，省略心磷脂的利用而代之以鱼明胶，所利用的稀释剂和封阻剂是无脂牛奶/Tween。

(ⅷ)荧光极化肽结合测定

这一测定检测到肽与aPL抗体的直接结合。由于aPL抗体结合到β₂-GPI(抗原)上，因此ELISA竞争性抑制测定能够显示由于结合到β₂-GPI上而致的抑制作用以及由于肽结合到aPL抗体上而致的抑制作用。因为需要与抗体的结合以便起作为耐受原的作用，因此重要的是确立肽能够直接结合到aPL抗体上。这一测定用来测量结合到两种aPL抗体(ACA-6501和ACA-6701)上的肽的解离常数。而ELISA测定对于高流通量筛选来说是有用的，因为它需要比荧光极化测定少的抗体，然而，ELISA阳性的肽应该由荧光极化测定来进一步评价以确定它们是否能直接与aPL抗体结合。

(ⅸ)以取代和缺失合成来评价氨基酸对结合的贡献

耐受诱导所需表位应该尽可能与许多aPL抗体有强的相互作用并且不包含任何不必要的残基。为了推导一个表位的最小构造，制造了每种肽的类似物；该类似物(ⅰ)缺乏所给定的残基，例如缺失在羧基和/或氨基末端的构架残基，或者(ⅱ)其中的氨基酸的取代已进行而又不同于在表位文库筛选中发现的序列。这些氨基酸取代可以是天然的，例如异亮氨酸取代亮氨酸，或者非天然的，例如α-甲基脯氨酸取代脯氨酸。然后由肽竞争ELISA测定这些缺失和/或取代的效果。

(ⅹ)通过β₂-GPI第5域的诱变来分组aPL血清特异性作为一般有效的耐受原，它必须结合在大多数患者中的aPL抗体的主要部分上。重要的是确定来自不同的患者的几个抗体是否结合β₂-GPI(其他人已提出其含有靶表位)的84个氨基酸第5域内的相同残基。如果几个抗体结合相同残基，则可以构建来源于肽结构数据中的单个模拟表位，它将与所有抗体进行反应。在另一方面，如果抗体结合不同的残基，则每个抗体需要单一耐受原。进行定点诱变来鉴别aPL抗体结合中所涉及的关键残基是否存在于β₂-GPI的第5域中。测定所产生的突变体β₂-GPI与几个aPL抗体的反应性。结果是不确定的。包含β₂-GPI的第5域和谷胱甘肽S转移酶(GST)的融合蛋白质得自A.Steinkasserer，并在大肠杆菌中表达(Steinkasserer等(1992),FEBS Lett.313:193-197)。这一融合蛋白成功地取代了在ACA ELISA中的天然β₂-GPI。用标准的定点诱变来进行氨基酸的取代。I．合成的aPL表位的分离

来自具有151 GPL得分(高滴度)并有周期性中风、流产、狼疮、和三大血管瓣替代的历史的患者的抗体ACA-6501在心磷脂脂质体上进行免疫亲和纯化。利用xy、xyz、xy’z和特殊的pro/cys结合的7-mer文库(其中基于以前的筛选，将精氨酸固定在第七个位置)，该抗体用于四个分开的噬菌体文库筛选。如表1所示，在(从140个试验中)微量淘选的噬菌体中得到36种序列。这些序列显得十分同源，并且在位置6和7的保守DR残基是非常明显的。共有的序列是CLLLAPDRC。尽管有这样的同源性，但只有7个噬菌体(见表2)在噬菌体ELISA比色检验之后为阳性。用亲和纯化的ACA-6626(来自有高的但比ACA-6501的低的滴度的病人)筛选xy’z噬菌体产生五种为噬菌体ELISA所试验的单一序列。没有一种序列是显色阳性的，但是当用化学发光底物进行ELISA免疫缀合时，两种序列是阳性的。与ACA-6626联系的序列基序似乎是相互联系的但是不同于用ACA-6501所看到的序列基序(见表3)。两个抗体优选在开放的前结合序列上的Cys结合的(可能是环化的和受约束的)表位。

表1ACA-6501噬菌体文库序列克隆序列克隆序列xy文库2101 CNILVLDRCxyz文库5AI2 CLILAPDRC 3C10 CILLAKNRC2D7 CLLLAPDRC 3C5 CIVLVPDRC3B6 CLVLALDRC 2F4 CLVIALDRC3E4 CLFVALDRC 5B1 CWFRSQSSC3E7 CILLAHDRC 3E1I CSPILRGNC2H1 CIILAPGRC 3E8 CHKFFWLTCxy’z文库2A10 CTILAPDRC 2D12 CLVLAADRC2G12 CLLITPDRC 3B10 CLLLAPDRC2G11 CLLITHDRC 3F2 CFFHFDHSC2F10 CNILVLDRC 2D3 CPLHTHHTC2E3 CPLITHDRC常规(X)₆R文库G11 CTILTPDRC 1A4 CNLLALDRC2H5 CTILTPDRC 2H6 CNLLAIDRC2H2 CTILTLDRC 1C3 CLLLAIDRC2H10 CTLLTPDRC 1D10 CTIITQDRC2E10 CIQLTPDRC 2H4 CNIITRDRC1B7 CHLLTPDRC 2G12 CILHAAHRC2H1 CLILTPDRC 1A9 CSSKSYWRC2H12 CSILAPDRCxy’z文库，菌落印迹筛选测定CB2 CILLARDRC 表2ACA-6501比色ELISA阳性的噬菌体克隆序列克隆序列5A12 CLILAPDRC 3B6 CLVLALDRC2H1 CLILTPDRC 2G11 CTILTPDRC3B10 CLLLAPDRC^* 3E7 CILLAHDRC2H2 CTILTLDRC^*对应于共有或平均序列表3ACA-6626 xy’z噬菌体文库序列克隆序列克隆序列4B11 CGNAADARC 4G7 CTNLTDSRC4D3 CTNWADPRC 4A2 CGNPTDVRC4C7 CGNLADPRC

按照本文描述的方法，ACA-6644是用来筛选混合的p-Ⅲ噬菌体文库的另一个高滴定的aPL抗体。发现以下序列；

ACA-6644/CBe GILLNEFA

ACA-6644/CBd GILTIDNL

ACA-6644/CBf GILALDYV

这些序列都来自组分“z”表位文库，其在N-末端缺乏噬菌体构架残基。当合成为肽时，这些序列与几种ACA血清(包括ACA-6644和ACA-6501)发生免疫反应。分析揭示这些序列与以前用ACA-6501获得的序列有出乎意料的同源性，如表4所示。表4ACA-6644/CBd GILTIDNLACA-6501/2H2 CTILTLDRCACA-6644/CBf GILALDYVACA-6501/2F10 CNILVLDRCACA-6644/CBc GILLNEFAACA-6501/1D10 CTILTODRC

来源于由这两种aPL抗体筛选的两个十分不同的源文库的趋同序列的同源性表明这些序列可以模仿天然靶抗原中的主要区域(可能是优势免疫的)。

用ACA-6701对P-Ⅲ文库的筛选产生出有高度的内部同源性的两种单一序列，但是不同于以前以其它aPL抗体获得的其它序列。序列如下所示：

ACA-6701/3B1LSDPGYVRNIFH

ACA-6701/3E1LTDPRYTRDISNFTD

作为树脂结合肽类，该序列与亲本血清(ACA-6701)有强免疫反应性，但是与其它aPL抗体有最小的交叉反应性。

用亲和纯化的ACA抗体对随机的pⅢ噬菌体文库进行继续筛选，结果发现一种肽，该肽显示出与抗最初试验的肽的所有九种亲和纯化的ACA抗体有明显的交叉反应性。这种肽和其它四种肽的性能显示在表5中。所有五种肽的肽序列紧接着列在该表之后。利用本文所述的CL/β₂-GPI平板利用竞争结合肽ACA ELISA来检验所有肽。表5肽单体对AffACA的抑制百分率

肽 6626 6638 6641 6644 6701 7004 7005 6903 6501

Ave.6641/3G3 100 100 93 100 100 100 95 100 86

971mg/mL6501/3B10 76 87 52 55 51 87 47 69 60

651mg/mL6626/4C7 88 96 45 45 69 99 54 77 39

681mg/mL6701/3B1 43 65 43 37 96 72 23 51 41

521mg/mL6644/CBf 37 60 28 18 22 54 57 43 37

39200μg/mL

肽序列ACA-6641/3G3 AGPCLGVLGKLCPGACA-6501/3B10 AGPCLLLAPDRCPGACA-6626/4C7 AGPDNIADPRCPGACA-6701/3B1 AGPLSDPGYVRNIFHPGACA-6644/CBf GILALDYVGG

尔后的检验测得：这种肽(具有AGP-CLGVLGKLC-PG(LJP 688)序列的ACA-6641/3G3)是与一些ACA抗血清交叉反应的。通过截短、系统性氨基酸取代以及非二硫化物环化研究进行这种肽的化学优化。

从随机噬菌体文库筛选中选择的几个肽的基序如下所列。表6ACA抗体噬菌体插入序列6501 CLLLAPDRC(3B10)6626 CTNWADPRC6641 CLGVLGKLC(3G3)6644 GILALDYV6701 LTDPRYTRDISNFTD6707 CAHPDWDRCJ．aPL有关的肽与亲和纯化的IgG aPL抗体的免疫反应性

在最近开发的用于组合合成肽文库的固相支持体上合成噬菌体序列(用亲和纯化的ACA-6501获得的并发现呈噬菌体ELISA阳性的)。这种支持体是一种Rapp树脂，有高的肽密度并在第一个氨基酸偶联前使用亲水聚乙二醇间隔区。该合成产生树脂结合的肽，该肽十分适合用于抗体结合研究。如图2所示，肽5A12(序列CLILAPDRC)明显地优于一种无关的对照肽，但不显著地结合正常的IgG。测验其它的噬菌体ELISA阳性肽类获得了类似结果。在实验中显示，通过免疫结合显色反应检测到树脂肽结合的亲和纯化的aPL抗体。K.aPL血清抗体与合成肽的反应性

利用血清可使树脂结合肽类免疫专一地结合aPL的发现显著提高了测验aPL抗体的能力。如图3所示，来自用ACA-6626筛选的肽结合aPL抗血清但没有显示出与正常血清的显著结合。图3也说明了ACA-6501-5A12肽与aPL血清的免疫专一结合行为。在数据中是零的正常血清与肽5A12的结合没有显示。L．合成肽与不是文库筛选抗体来源的aPL抗血清的交叉反应性

选择两个肽用于aPL血清测定，一个(5A12)代表ACA-6501筛选而另一个(4D3)代表ACA-6626筛选。如图4和5中所示，其中的每个肽都与筛选抗体的亲本血清优先作出反应。然而，特别是在ACA-6501和ACA-6626之间可检测到明显程度的交叉反应性。用5A12树脂结合肽对19个患者血清(低或没有GPL得分)和13个病理血清(GPL得分从中到高)的研究表明：13个病理样品中的8个有可检测到的肽结合而19个对照样品中只有2个显出低的肽结合。这些结果证明在中风病人护理方面合成肽对诊断或者预诊的测定来说是有用的。

如在上述第一部分指明的，对一个合成肽(6641/3G3)进行抗几种高滴度的ACA抗血清的试验。发现这种肽似乎与所测验的大多数ACA抗血清有交叉反应(如图14中所说明的)。在1.8mg/mL完全抑制(＞80％)下6641/3G3显示出与10种ACA抗体之10种的剂量依赖性交叉反应性，并且似乎对ACA抗体是专一的，如下表7所示。表7利用心磷脂/β₂-GPI涂布的平板的AGP-CLGVLGKLC-PG(LJP 688)ACA

血清的交叉反应性数据ACA血清Nr IC50,mg/mL，对于肽LJP688[1]6501RS,RFL 0.899 1.1[2]6626RS 1.09[3]6635RS 1[4]6638RS 0.81[5]6641RS 0.89,0.51[6]6644RS 0.76[7]6701RS 1.07[8]6903RS 0.8[9]7004RFL 0.67[10]7005RFL 0.75平均数±标准差 0.86±0.16RS=周期性中风RFL=习惯性流产M．新的合成肽方法

经aPL文库筛选的新的侯选序列的鉴别需要试验新的合成肽的抗体结合作用。对于已知肽取代的Rapp树脂，利用放射性标记的aPL IgG可以实行定量的结合研究(如饱和结合分析和平衡测量)。

肽合成使得可以通过选择性合成对模拟表位进行分子详细分析。这包括以增强抗体结合为目标来修饰沿链的每个氨基酸。选择性合成揭示每个氨基酸在序列中的相对重要性。如果必要，可以设计在特殊残基位置的选择性的取代以便保持B细胞反应性而废除在T细胞测定中发现的任何T细胞增殖反应性。

对肽6641/3G3(LJP)进行一些分析。分析包括在N-末端和C-末端截短，二硫化物取代，丙氨酸和甘氨酸对位置2到8的氨基酸的取代，在2、4、5和8位置上的分支脂族氨基酸的取代，影响肽的构象的氨基酸的取代(包括α-甲基氨基酸的取代)，位置7中的碱性氨基酸的取代，位置2至9中的D-氨基酸的取代，以及在1至9位置上的N-α-甲基氨基酸的取代。这些结果如表9所示。这些取代和平截的结构/活性关系如表8所示。

表8肽3G3的优化3/28/96 总肽 144位置号截短分析 -2-1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 A B 用ACA 6501

150μgmL sd

1 A G P C L G V L G K L C P G 850

2 G P C L G V L G K L C P G 180

3 P C L G V L G K L C P G 420

4 C L G V L G K L C P G 460

5 A G P C L G V L G K L C G 450

6 C L G V L G K L C 10 #906(LJP 690)二硫化物替代

1 C L G V L G K L C 110 #952=100

2 H L G V L G K L C 46

3 C L G V L G K L H 92

4 H L G V L G K L H 80丙氨酸扫描

1 C A G V L G K L C 200 #952=80

2 C L A V L G K L C 170

3 C L G A L G K L C 260

4 C L G V A G K L C inf

5 C L G V L A K L C 40

6 C L G V L G A L C inf

7 C L G V L G K A C 360甘氨酸扫描

1 C G G V L G K L C 310 #952=120

2 C L G G L G K L C inf

3 C L G V G G K L C inf

4 C L G V L G G L C inf

5 C L G V L G K G C 500序列优化支链脂族氨基酸

1 C I G V L G K L C 60 #910=40

2 C V G V L G K L C 130

3 C M G V L G K L C

4 C Cy G V L G K L C

5 C FL G V L G K L C

6 C mL G V L G K L C

7 C Iv G V L G K L C

8 C L G L L G K L C

9 C L G I L G K L C

10 C L G M L G K L C

11 C L G Cy L G K L C

12 C L G tL L G K L C

13 C L G mL L G K L C

14 C L G lv L G K L C

15 C L G V I G K L C

16 C L G V V G K L C

17 C L G V M G K L

18 C L G V Cy G K L C

19 C L G V tL G K L C

20 C L G V mL G K L C

21 C L G V Iv G K L C

22 C L G V L G K I C

23 C L G V L G K V C

24 C L G V L G K M C

25 C L G V L G K C C

26 C L G V L G K tL C

27 C L G V L G K mL C

28 C L G V L G K lv C构象扫描氨基酸

1 C L P v L G K L C

2 C L mP V L G K L C

3 C L mA V L G K L C

4 C L cG V L G K L C

5 C L G V L P K L C

6 C L G V L mP K L C

7 C L G V L mA K L C

8 C L G V L cG K L C

9 C L dA V L G K L C

10 C L G V L dA K L C

11 C P G V L G K L C 160 #952=100

12 C L P V L G K L C 340 (扫描)

13 C L G P L G K L C 180

14 C L G V P G K L C inf

15 C L G V L P K L C 350

16 C L G V L G P L C 160

17 C L G V L G K P C 550

18 C pG G V L G K L C 130 #910=40

19 C L PG V L G k L C 70

20 C L G pG L G K L C 70

21 C L G V pG G K L C 35

22 C L G V L pG K L C 30 #910=5

23 C L G V L G pG L C 230

24 C L G V L G k pG C 80αMe AA 25 C aiB G v L G K L C 370 #910=40

26 C L aiB V L G k L C 80

27 C L G aiB L G K L C 110

28 C L G V aiB G K L C inf

29 C L G V L aiB K L C 110

30 C L G V L G aiB L C 460

31 C L G V L G K aiB C ＞470碱性氨基酸

1 C L G V L G R L C 160 #952-120

2 C L G V L G Or L C 40 910=60

3 C L G V L G mK L C

D-氨基酸(小写字母d)1 dP C L G V L G K L C 120 #952=1002 C dL G V L G K L C 180 #952=303 C L G dV L G K L C 260 #952=304 C L G V dL G K L C 230 #952-305 C L G V L G dK L C 170 #952=506 C L G V L G K dL C 140 #952= 307 C dL G dV L G K L C8 C dV G dV L G k L C9 C dL G dL L G K L C10 C L G dV dL G K L C 50 #952=3011 C L G dL dV G K L C12 C L G dV dV G K L C13 C L G dL dL G K L C14 C L G V dL G dK L C15 C L G V dK G dL L C16 C L G V cL G dL L C17 C L G V dK G dK L C18 C L G V L G dK dL C 150 #952=5019 C L G V L G dL dK C20 C L G V L G dK dK C21 C L G V L G dL dL C 140 #952=3022 C L G V L dA K L C 140 #952=50

C L G V L G K L dC

N-Me氨基酸(nAA)1 nC L G V L G K L C2 C L G V L G K L C3 C L nG V L G K L C 70 #952=504 C L G nV L G K L C 2205 C L G V nL G K L C 1806 C L G V L nG K L C 5507 C F G V L G nK L C8 C L G V L G K nL C 240 #952=509 C L G V L G K L nC其它1 C L G V L G K L C ATU-Y 300#952=502 Y ATU C L G V L G K L C 1703 C L G V L G K L C TGR树脂 5004 C L G V L G K L C dCTGR树脂 6205 dC L G V L G K L C C6 cC L G V L G K L C dCTGR树脂硫醚单一检测1 Hc L G V L A K L C2 Hc G V L A K L C3 Hc L V L A K L C4 Hc L G L A K L C5 Hc L G V A K L C6 Hc L G V L K L C7 Hc L G V L A L C8 Hc L G V L A K C收缩最小化1 Hc V L A K L C2 Hc L A K L C3 Hc L A K C支链的1 Hc L G V L G K L Pc2 Hc L G V L G K L dPe3 Pc L G V L G K L Hc4 dPe L G V L G K L Hc5 dPe L G V L G K L dPeD氨基酸1 dHc L G V L G K L C2 dHc L G V L G K L dC3 Hc L G V L G K L dC脱氨基1 By L G V L G K L Hc 脱氨基

HHTE2 By L G V L G K L C 脱氨基

HCTE3 Pp L G V L G K L Hc 脱氨基

CHTE4 Pp L G V L G K L C 脱氨基

CHTE

缩写词

Hc…………高半胱氨酸Cy…………环己基丙氨酸cL…………叔亮氨酸MT…………α-甲基亮氨酸IV…………α-甲基，α-氨基丁酸MP…………α-甲基脯氨酸mA…………α-甲基丙氨酸aiB ………氨基异丁酸pG…………苯基甘氨酸cG…………环丙基甘氨酸dA…………D-丙氨酸dP…………D-脯氨酸dL…………D-亮氨酸dV…………D-缬氨酸dK…………D-赖氨酸nC…………Nα-甲基半胱氨酸nL…………Nα-甲基亮氨酸nG…………N甲基甘氨酸nV…………Nα-甲基缬氨酸nK…………Nα-甲基赖氨酸mK…………Nε-甲基赖氨酸Pe…………青霉胺

缩写词
缩写词	By……………丁酰Pp……………丙酰Or……………鸟氨酸

表9交叉反应的ACA表位的结构/活性关系结构相对活性AGPCLGVLGKLCPG(3G3) (LJP 688) 100CLGVLGKLC (LJP 690) 3.5CLGVLAKLC 1.8CLGVLpGKLC 1.4CLG_dV_dLGKLC 5.9HCLGVLGKLC (硫醚) 1.6SLGVLGKLS 00CLGVAGKLC 00CLGVLGALC 00N．利用α-甲基氨基酸取代和非天然的氨基酸来提高肽的免疫反应性并赋与其抗蛋白酶攻击的抗性

脯氨酸残基有一种特殊的重要性，这是因为它们对多肽的链构象的影响。它们经常出现在球状蛋白的表面上的转角处。在本发明的噬菌体表位文库中，所有随机肽插入片段侧连边界脯氨酸。此外，用ACA-6501发现的大多数模拟表位有第三个脯氨酸，根据基于计算机的预测，该脯氨酸很有可能作为β-转角的一部分存在。β-转角模拟物能用来提高小肽中的转角构象的稳定性。这样的模拟物是(S)-α-甲基脯氨酸(α-MePro)，这是一种除稳定转角构象外还赋予抗蛋白酶降解的抗性的脯氨酸类似物。对于所设计的在血浆中起作用的潜在药物，蛋白酶抗性是一种所需的性质。肽ACA-6501/3B10 AGPCLLLAPDRCPG(斜体部分为插入片段)是一种共有肽。基于与其他35个同源序列的比较，它具有的序列特性是在每个位置有最有优势的残基。由于其代表性特征，可对该序列进行一些系统的修饰和缺失，而后通过aPL抗体结合来评价它的活性。最重要的发现之一是发现在3和9位置上的脯氨酸对于活性来说是重要的。脯氨酸-3来自噬菌体构架而不是随机插入片段的一部分。最明显的影响是通过由α-MePro在9位置取代脯氨酸来获得的。这个取代导致在免疫活性方面提高6倍。

在肽6641/3G3上进行的α-甲基和N^α-甲基氨基酸的取代的研究结果如上表8所示。

除二十种天然存在的氨基酸以及它们的同源类似物(homoanalog)和正类似物(noranalog)之外，其它几类α-氨基酸也可以用于本发明。这些其它类α-氨基酸的例子包括d-氨基酸、N^α-烷基氨基酸、α-烷基氨基酸、环氨基酸、嵌合氨基酸以及混杂的氨基酸。这些非天然的氨基酸已经广泛地用来修饰生物活性的多肽以提高抗蛋白酶解降解作用的抗性和/或传递构象限制以改善生物活性(Hruby等，(1990)，生物化学杂志，268:249-262；Hruby和Bonner(1995)在分子生物学中的方法，35:201-240)。

最普通的N^α-烷基氨基酸是N^α-甲基氨基酸，如N^α-甲基半胱氨酸(nC)、N^α-甲基甘氨酸(nG)、N^α-甲基亮氨酸(nL)、N^α-甲基赖氨酸(nK)以及N^α-甲基缬氨酸(nV)。α-烷基氨基酸的例子包括α-甲基丙氨酸(niA)、α-氨基异丁酸(aiB)、α-甲基脯氨酸(mP)、α-甲基亮氨酸(mL)、α-甲基缬氨酸(mV)、α-甲基α-氨基丁酸(tv)、二乙基甘氨酸(deG)、二苯基甘氨酸(dpG)以及二环己基甘氨酸(dcG)(Balararn(1992)，纯化学和应用化学，64:1061-1066；Toniolo等(1993)，生物聚合物，33:1061-1072；Hinds等(1991),Med Chem.34:1777-1789)。

环氨基酸的例子包括1-氨基-1-环丙烷羧酸(cG)、1-氨基-1-环戊烷羧酸(Ac5 c)、1-氨基-1-环己烷羧酸(Ac6c)、氨基茚满羧酸(ind)、四氢异喹啉羧酸(Tic)以及2-哌啶酸(Pip)(C.Toniolo(1990)Int’l.J.Peptide Protein Res.35:287-300；Burgess等(1995)J.Am.Chem.Soc.117:3808-3819)。嵌合的氨基酸的例子包括青霉胺(Pc)、半胱氨酸与缬氨酸的混合物、4R-和4S-巯基脯氨酸(Mpt)、高胱氨酸和脯氨酸以及4R-和4S-羟基脯氨酸(hyP)的混合物、以及高丝氨酸和脯氨酸的混合物。混杂的α氨基酸的例子包括如鸟氨酸(Or)、N^ε-甲基赖氨酸(mK)、4-吡啶基丙氨酸(pyA)、4-哌啶子基丙氨酸(piA)以及4-氨基苯基丙氨酸的碱性氨基酸类似物；如瓜氨酸(Cit)以及3-羟基缬氨酸的酸性氨基酸类似物；如1-萘基丙氨酸(1-Nal)、2-萘基丙氨酸(2-Nal)、苯基甘氨酸(pG)、3,3-二苯基丙氨酸(dpA)、3-(2-噻吩基)丙氨酸(TE)以及卤苯基丙氨酸(例如2-氟苯丙氨酸和4-氯苯丙氨酸)的芳香族氨基酸类似物；如叔丁基甘氨酸(即叔亮氨酸(tL))、2-氨基丁酸(Abu)、环己基丙氨酸(Cy)、4-四氢吡喃基丙氨酸(tpA)、3,3-二环己基丙氨酸(dcA)以及3.4-脱氢脯氨酸的疏水氨基酸类似物。

除了α-氨基酸，其它如β-氨基酸也可用于本发明。这些其它氨基酸的例子包括2-氨基苯甲酸(Abz)、β-氨基丙酸(β-Apr)、γ-氨基丁酸(γ-Abu)以及6-氨基己酸(ε-Ahx)。在环硫醚肽的合成中，如4-氯丁酸(By)和3-氯丙酸(Pp)的羧酸也已用作为在N-末端上的第一个残基。O．环硫醚类似物的制备

可以进一步修饰由本发明方法鉴别的模拟肽从而使其包含硫醚取代物。环二硫化物类似物变为环硫醚类似物的修饰将延长该类似物缀合物的血浆半寿期，因此需要低剂量。环硫醚类似物也消除了二硫键交换的问题，这种交换经常随环二硫化物多肽发生。此外，环硫醚类似物也可以干扰MHCⅡ类向T细胞的呈递，因此有利于无反应性的诱导。最后，环硫醚类似物在用于产生效价平台分子缀合物的硫醇依赖性缀合反应方面是有用的。

按照在共有的共同未决的专利申请(代理号252312006600)(以其整体与本文一并参考)中描述的方法，制得四种环硫醚类似物。利用Rink^TM酰胺4-甲基二苯甲氨基树脂或者MBHA树脂制备6641/3G3的全长度肽类似物，将其转化成氯肽，并从固相支持体上切割下来，然后环化该类似物。参见以下的硫醚反应方案。适合的环硫醚类似物包括以下显示的类似物。

另外，也可按照以下反应方案制备硫醚类似物。

环硫醚反应方案2下列类似物表示按照环硫醚反应方案2制得的类似物。

测定例证性的环硫醚类似物抗ACA抗体ACA-6501和ACA-6701的活性。结果如下表10所示。表10IC₅₀值(μg/0.1 mL)硫醚 ACA-6501 ACA-6701CCTE,LJP 698 11.0 5.0HCTE,LJP 699 4.6 3.0CHTE,LJP 702 9.2 3.2HHTE,LJP 703 8.0 3.6LJP 690 10.0 4.0CTE A 0.08CTE B 0.5CTE C 0.9CTE D 3.2CTE E 6.3

HCTE类似物LJP 699，优于参考肽LJP 690,LJP 690是LJP 688(即AGPCLGVLGKLCPG)的截短形式，即CLGVLGKLC。

本文引用的所有文章、文档、专利和专利申请以其整体与本文一并参考。下列实施例旨在进一步说明本发明和它的独特性。这些实施例无意以任何方式限制本发明的范围。实施例实施例1:血清6501中的抗心磷脂抗体(ACA)的测定

以每孔30μL乙醇用50μg心磷脂(西格马化学公司，圣路易斯，MO)涂布Immulon I微量滴定板(Dynatech实验室，Inc.,Chantilly,VA)的偶数孔。使平板在4℃下干燥一夜，并在室温(RT)下在磷酸盐缓冲盐水(ABS/PBS)中用200μL 10％的成年牛血清(ABS)(Irvine科学公司，SantaAna,CA)封阻2小时。在加入10μL aPL标准和试验血清ACA-6501之前，用Tris-缓冲盐水(TBS)将平板洗涤5次。按照制造厂商的说明重建该aPL标准(APL诊断公司，Louisville,KY)，并用10％ABS-PBS将其稀释至1∶50。将试验血清ACA-6501用10％的ABS-PBS稀释成连续稀释液(从1∶50到1∶2,000)，将其加到选择的重复孔中并在室温下温育2小时。将平板用TBS和100μL的1∶1,000的山羊抗人IgG/碱性磷酸酶缀合物(Zymed，南旧金山，CA，目录号62,8422)洗涤5次，加入10％ABS-PBS并在室温下温育1小时。将平板用TBS再洗涤5次并通过添加100μL酚酞脱单磷酸(PPMP)底物溶液(西格马，目录号P-5758)进行测定，该溶液是从0.13M PPMP和7.8M 2-氨基-2-甲基-1-丙醇的储备溶液制备的(在用去离子水稀释到1∶26之后，用HCl将其pH值调到10.15)。在大约30分钟之后，在每孔中加入50μL的0.2 M磷酸二钠(Mallinckrodt，分析试剂)来终止反应。在微量平板自动读数仪(Bio-Tek仪器，Winooski,VT,EL311型)中在550 nm处读其光密度。从偶数孔的光密度中减去奇数对照孔(空白，没有心磷脂(CL))的光密度。用Graph Pad Prizm软件(graph Pad软件公司，圣地亚哥，CA)将aPL标准的吸收率读数制成散点图从而形成GPL(IgG磷脂)标准曲线。依据GPL标准曲线用稀释的6501试验血清吸收率读数来计算GPL得分。

在改进的ACA ELISA中，Nunc Maxisorp微量滴定平板在室温下温育1小时后涂布100μL/mL β₂-GPI(用PBS制得)。接着这一步骤，在室温下用PBS(包含2％无脂牛奶和0.4％(w/v)Tween 80)封阻微量平板2小时。除了利用无脂牛奶/Tween作为稀释剂和封阻剂外，直接涂布有β₂-GPI的Nunc微量平板可用于ACA IgG结合研究，如以前描述的Dynatech微量平板(在β₂-GPI加入之前首先在其上涂布一层心磷脂)的ACA IgG结合研究。实施例2：来自血清6501的抗心磷脂抗体(ACA)纯化

在25 ml圆底烧瓶(Kontes Scientific Co.,Vineland,N.J.)中，用Rotavap(Buchi，瑞士)将1.2ml抗心磷脂(西格玛化学公司，圣路易斯，MO,#C-1649),0.464ml胆固醇(西格玛Diag.，圣路易斯，MO.,#965-25),0.088ml 5mg三十二烷基磷酸酯(西格玛化学公司，圣路易斯，MO,D-2631)(在每mL氯仿中)的混合物干燥约5分钟。在除去溶剂后，添加2ml 0.96％(wt./vol.)的NaCl(J.T.Baker,Inc..Phillipsburg,NJ,Baker分析试剂)，并在Vortex Genie Mixer(科学工业，公司，Bohemia,NY)中混合1分钟。于37℃下将脂质体悬液温育1小时。同时，于8℃下在Sorvall RT 6000离心机(杜邦公司Wilmington,DE)中在600Xg下离心血清6501 10分钟。将4ml上清液置于含有1ml制备的脂质体悬液的25ml圆底烧瓶中，于4℃下在中等速度搅拌下在有轨摇床TektatorV(Scientific Products，McGraw Park,IL)上温育混合物48小时，在37℃温育另外的2小时。加入20 ml冷的TBS，将混合物转移到50ml聚碳酸酯离心管(Nalge Co.,Rochester,NY)中，于4℃下在27,000Xg下离心15分钟(在SS-34回转装置中的RC3离心机(Sorvall-DupontWilmington,DE)中)。用RC3离心机以25ml冷的0.96％NaCl洗涤沉淀3次。将沉淀溶解在1ml 2％(wt/vol)(在TBS中)的正-辛基-对-D-葡糖吡喃糖苷(Calbiochem,La Jolla,CA)的溶液中，并用于0.6ml蛋白质A/交联琼脂糖(Repligen公司，Cambridge,MA)柱，该柱已以15倍柱床体积的1M乙酸预洗涤过，并用15倍柱床体积的TBS平衡过。用40倍柱床体积的2％辛基葡糖吡喃糖苷洗涤抗体-蛋白质A/琼脂糖柱，以除去脂质，接着用TBS充分洗涤，直到洗脱物在280nm的光密度接近基线。结合的抗体用1M乙酸洗脱。收集1ml组分，每一组分立即用0.34ml 3M Tris(Bio-Rad，电泳级试剂)中和，并保持在冰浴上。在分光光度计(Hewlett-Packard,8452A Diode Array分光光度计，Palo Alto,CA)中在280nm处测定各组分的光密度。合并含有抗体的组分，按制造者的方案在Centricon-30浓缩器(Amicon Division,W.R.Grace & Co.,Beverly,MA)中浓缩和用TBS洗涤4次。通过读取浓缩试样在280nm的光密度确定从4ml血清6501产生纯化的抗体的最终产率，其中1mg=1.34 OD₂₈₀。所获得的平均产率是从4ml血清6501中得到750μg抗体。试验纯化的抗体的ACA活性，并由Laemmli SDS-PAGE检查其纯度。利用市售的纯化的β₂-GPI(Perimmune,Rockville,MD)，按照制造厂商的说明，利用CNBr活化的琼脂糖(Pharmacia,Inc.,Piscataway,NJ)或者Affi-Gel10(BioRad,Richmond,CA)，制备包含β₂-GPI的亲和性吸附剂。在包含β₂-GPI亲和性吸附剂的1mL凝胶柱中，加入高达100μg的脂质体纯化的aPL IgG(在1mL TBS中)。在1小时之后，用缓冲液广泛地洗涤柱以便置换污染物和不结合β₂-GPI的任何IgG。用1M HOAc置换结合β₂-GPI的IgG，并用Tris(如上所述)中和该组分。集中、浓缩包含IgG的组分，并使之进行如前所述的缓冲交换。实施例3:P-Ⅲ文库载体制剂的构建

fUSE 5(Scott,J.K.和G.Smith，同上)用作构建p-Ⅲ文库的载体，利用Holmes,D.S.和M.Quigley(1981)(Anal.Biochem.144:193)的方法的修改方法来产生双链复制型(RF)。简言之，在剧烈振荡下，于37℃下在含有20毫克/mL四环素的2YT培养基(Difco Labs,Ann Arbor,MI)中培养大肠杆菌K802(包含fUSE5)的800ml培养物18小时。通过离心来收集细胞，并将其重悬浮于75ml STET中。STET由在50mM Tris/HClpH8.0中的8％蔗糖、50mM EDTA组成，并含有0.5％Triton X-100。加入10mg/mL溶菌酶(在STET中)至最终浓度为1mg/mL。在室温下在5分钟后，将三个等分试样置于沸水浴(偶尔振荡)中3.5分钟。在18000Xg下离心粘性浆状物30分钟，将等体积的异丙醇添加到上清液中。将溶液冷却至-20℃，通过离心收集核酸。按照Sambrook等(分子克隆；实验室手册，冷泉港实验室出版社，冷泉港，NY，第二版，1989)描述的方法由CsC1梯度分离RF。随机插入片段的按比例分配

由Cwirla等(1990，美国国家科学院院报，87:6378-6382)描述的＂缺口双螺旋＂法产生用于插入的DNA。在这一方法中，中间含有简并区的寡核苷酸被寡核苷酸每一端的短的恒定区所包围。使两个较短的互补的寡核苷酸退火以形成＂缺口双螺旋＂，该＂缺口双螺旋＂具有互补于由用于消化载体的限制性内切核酸酶产生的粘性末端的突出端。在这种情况下，较长的简并寡核苷酸具有序列： 5’GGGCTGGACCC(NNK)xCCGGGGGCTGCTG 3’，其中N=A或C或G或T，K=G或T,x是随机区中的密码子数量。EpiGS2被设计成简并寡核苷酸的5’末端的碱基对，并具有序列5’GGGTCCAGCCCCGT 3′。类似地EpiGS3被设计成退火到简并寡核苷酸的3’末端，并具有序列5’CAGCCCCCGG 3’。当正确退火时，三种寡核苷酸形成＂缺口双螺旋＂，当其插入到用Sfil消化的fUSE 5中时，其恢复具有接近5’末端的随机插入片段的p-Ⅲ读框。

以上所描述的寡核苷酸是通过从聚丙烯酰胺凝胶上的切除来制备的。1纳摩尔的EpiGS2、EpiGS3和50皮摩尔的简并寡核苷酸分别在66微升体积中用激酶处理。然后集中三种寡核苷酸，添加NaCl至50 mM，并将混合物加热至65℃并保持5分钟，其后缓慢冷却至室温。将退火的寡核苷酸在冰上冷却，并直接用于与fUSE 5的连接反应。连接反应物由10微克fUSE 5 DNA(用Sfil完全消化的)、30μL＂缺口双螺旋＂溶液和1000 U的T4连接酶组成(在450微升总体积中)。于16℃下温育连接物18小时。然后用苯酚-氯仿提取混合物，用乙醇沉淀，并将沉淀溶解在20μL水中。产生和扩增文库

经电穿孔(Dower等(1988)，核酸研究，16:6127-6145)将连接的DNA引入大肠杆菌中。将冷冻的电感受态MC1061细胞(0.1mL)在冷的2mm透明小容器中与连接的DNA(4μL)混合，用BTX电穿孔装置(BTX公司，San Diego,CA)施加2.5kV、5.2 mS脉冲。紧接着脉冲之后，加入1 mL SOC(一种细胞生长培养基，参见Dower等，同上)。进行5种不同的电穿孔，收集产物并在37℃培养1小时。此时，移走样品并稀释以测定产生的克隆的总数。用包含20微克/毫升四环素的1升2YT(1.6％蛋白胨，140,1％酵母膏，和0.5％NaCl,Difco,Labs,Ann Arbor,MI)稀释混合物的平衡溶液，并于37℃下在275 rpm振荡下培养18小时。通过2次PEG/NaCl沉淀和在1.2mL TBS(包含0.02％叠氮化钠)中悬浮来纯化噬菌体。由在269nm的吸收率来估计颗粒数量。通过将10μL稀释的噬菌体与10微升饥饿的大肠杆菌混合来测定噬菌体的滴度。实施例4：筛选具有aPL抗体的P-Ⅲ文库

在硅氧烷化的1.4mL微量离心聚丙烯管中，于室温下将亲和纯化的ACA-6501(affACA-6501,10μg；7μL 1.44mg/mL储备溶液)温育2小时，其中该微量离心聚丙烯管含有来源于x、y和z文库(epi^XYZ)[分别11μL+8.5μL+2μL；总体积=21.5μL,～10¹⁰个克隆]的集中的噬菌体以及有0.5％牛血清白蛋白(BSA)的最终体积为100μL的TBS(pH 7.4)。在这一温育期间，进行制备新鲜的饥饿大肠杆菌菌株K-91的最后步骤。用50mL聚丙烯管在1000Xg下于室温下将在37℃下在250rpm振荡下在2YT培养基中新鲜生长约5小时的大肠杆菌悬液离心10分钟。将20 mL 80mMNaCl添加到紧密的大肠杆菌沉淀上，并在100rpm下于37℃下温育45分钟。在以上离心后，将饥饿的大肠杆菌沉淀悬浮在1mL 50mM磷酸铵/80mM NaCl中，而后用于噬菌体扩增。将蛋白质G-琼脂糖珠用TBS/BSA洗涤2次，用TBS/0.5％Tween-20洗涤2次，并以在TBS/Tween中的50％悬液储备在4℃下。

然后将200μL蛋白质G-琼脂糖珠悬液添加到ACA-650l/噬菌体混合物中，在室温下继续温育1小时。此时，急冷混合物，用冷的TBS/Tween洗涤3次，通过在冷的房间离心来收集沉淀。将洗涤过的珠转移到新的用TBS/BSA和TBS/Tween预洗涤的离心管中，以阻止非特异性粘附。在用TBS/Tween额外洗涤3小时后，通过在室温下搅动用300μL 0.2N HCl/甘氨酸、pH2.1洗脱具有噬菌体(携带结合的ACA-6501)的珠10分钟。以16,000Xg离心后，收集酸性洗脱物上清液，将另外的100μL洗脱液添加到珠沉淀上，重复这一操作。10分钟后，收集(～400μL)包含噬菌体的洗脱物(代表未扩增的第一轮噬菌体)，并将其置于无菌的17×100mm聚丙烯细胞培养管中，向该管中添加50μL 0.5M NaCl，接着用2.5M Tris碱(通常～25-35μL)进行pH中和。立即加入等体积的饥饿的大肠杆菌悬液，然后在37℃下在100rpm下培养10分钟。接着将混合物转移至250mL无菌培养瓶(含有具有20μg/mL四环素(Tet)的25mL 2YT)中，在37℃下在250rpm下培养一夜。

为了分离从过夜培养物扩增的噬菌体，用聚碳酸酯试管在12,000×g下将悬浮液离心10分钟。弃去沉淀。在70℃下加热在聚丙烯管中的上清液30分钟后，再次用聚碳酸酯管离心，保存上清液。向上清液中加入1/4体积的20％(w/v)分子量为8000(PEG 8000)的聚乙二醇，以沉淀噬菌体。通过倒转100次来混合溶液，然后在4℃下温育2小时。于40℃下在35,000Xg下离心30分钟后，将含有噬菌体的沉淀重悬于～0.5mL TBS/BSA中，并转移至1.4mL离心管中。在16,000xg下在微量离心机中离心1分钟后，将上清液转移至清洁的试管中，标记第一轮扩增的噬菌体。

在第二、三和四轮生物淘选期间，在100微升终体积中将三轮的75μL扩增的噬菌体与7μL affACA-6501一起温育。对第五轮噬菌体，首先以1∶1000稀释affACA-6501，然后如其它轮所述处理。如第一轮所述进行所有其它的后续步骤。将生物淘选第五轮的噬菌体点滴(spot-titered)在2YT/Tet平板上，以测定噬菌体浓度。点滴扩增的噬菌体需要利用TBS/BSA或2YT培养基的1×10⁶初始的噬菌体稀释度。对每一轮，在37℃下将10μL稀释的噬菌体与40μL饥饿的大肠杆菌一起无振荡培养10分钟。在加入950μL2YT/稀释的Tet(0.2μg/mL)后，于37℃下在250rpm振荡下将混合物培养30-45分钟。利用含有20μg/mL Tet的琼脂板，将10μL纯的和稀释(1∶10,1∶100和1∶1000)的噬菌体溶液试样点滴在2YT/稀释Tet上。微量淘选

用蛋白质G涂布Immulon 2型平板。用0.1M NaHCO₃以10μg/mL制备蛋白质G，以每孔100μL添加到微量滴定板的孔中，于4℃下温育一夜。在从平板弃去过量的蛋白质G溶液后，于室温下在搅拌下在振动平台上用250-300μL 2YT封阻每孔1小时。将Tris缓冲的盐水(pH 7.4/0.5％Tween 20(TBS/Tween))与自动平板洗涤仪一起使用，以便用200μL洗涤每孔4次。用2YT将100μL affACA-6501(或对照的正常IgG)稀释成2.5μg/mL，并将其添加到洗涤的孔中。在旋转平台上于室温下温育接近1小时后，把平板转移至冷室回转装置(rotator)中。

微量淘选所试验的噬菌体得自由生物淘选产生的琼脂板。用无菌牙签将每个待试克隆转移至圆底96孔微量滴定板(Corning,Corning,NY)的不同孔(每孔含有250μL 2YT/Tet)中，并在37℃下培养一夜。克隆的命名基于筛选的抗体，起始点的生物淘选轮次以及克隆在过夜培养板上的位置，例如ACA-6501/3B10指这样一种克隆，其是在第三轮中通过ACA-6501从位于微量滴定板上的命名为B10的孔中分离得到的。在过夜培养后，利用微量滴定板夹持装置于室温下在1300Xg下离心噬菌体培养物10分钟。上清液构成＂纯的＂噬菌体的源。

起始微量淘选限制在6个克隆，这些克隆用以1∶10到1∶10⁶的系数扩展的稀释度来试验。从这些试点克隆产生的结果用来说明合适的单一稀释度(对各轮的源平板中的克隆其产生可分级的结果)。将代表培养的从生物淘选的第三、第四和第五轮随机选择的克隆的平板用2YT在微量滴定板中以每孔250μL的终体积从“纯的”溶液稀释成1∶100,000。将代表所需稀释度的最后平板的100μL添加到含有蛋白质G结合的ACA-6501和如上所述制备的正常IgG的平板上。在水平的回转装置上于4℃下进行稀释噬菌体与aPL抗体或对照IgG的温育。在自动平板洗涤仪中用TBS/Tween洗涤9次后，用20μL 0.2 N HCl-甘氨酸/0.1％BSA,pH2.2洗脱IgG-结合的噬菌体。在室温下继续温育洗脱物10分钟，在此期间，制备每孔含有20μL新鲜饥饿大肠杆菌的新的Corning微量滴定板，并冷却。将140μL 29mM Tris添加到含有噬菌体洗脱物的平板上，以中和pH，接着将20μL噬菌体悬液从各孔转移到含有饥饿的大肠杆菌的平板的相应的孔中。在37℃下培养10分钟后，加入200μL 2YT/稀释Tet，在37℃下进行另外的30分钟培养。用多道吸移管将各孔的10μL培养液点滴在大的2YT/Tet琼脂板上，而保留原来的8×12孔格式和最后微量滴定板的方向。在使斑点干燥30分钟后，将平板在37℃下温育。第二天，用0到4+来半定量计分菌落，0表示＜10个菌落；+/-,10-20个；1+,20-50个；2+,50-70％铺满；3+,70-90％铺满；4+代表＞90％铺满菌落。在以1∶10⁵稀释度[代表81个第三轮、6个第四轮、7个第五轮克隆]来进行测定的94个克隆中，6个克隆具有0的微量淘选得分，3个得分为1+,14个得分为2+,62个得分为3+,9个得分为4+。通过如以下所描述的G-跟踪DNA测序来进行得自代表生物淘选的第二到第五轮的平板的随机克隆的测定。结果显示第四轮生物淘选的序列差异明显地下降(参见图8)，因此，第二平板用1∶3×10⁵稀释度的噬菌体来微量淘选，此时包含较早(第二)轮的克隆。试验总共94个克隆，包括在1×10⁵稀释度下具有高分的29个克隆[26个来源于第三轮，1个来源于第四轮，2个来源于第五轮]以及以前还没有试验的第二轮的65个克隆。在1∶3×10⁵稀释度下试验的94个克隆中，26个得分为0,11个得分为+/-,10个得分为1+,13个得分为2+,34个得分为3+,0个得分为4+。G-跟踪DNA测序

从在37℃下过夜培养的培养物中分离得到单链病毒DNA。为了制备培养物，用来源于以前生长的微量滴定板培养物的扩散平板的单个噬菌体来接种2YT/Tet(以在试管中的2mL或者在微量滴定板圆底孔中的250μL)。按照Smith,G.P.和J.K.Scott(＂丝状噬菌体上显示的肽和蛋白质文库＂(1993)，酶学方法，217:228-257)(有关试管中的培养物)描述的方法以及Haas,S.J.和G.P.Smith G.P.(＂从丝状噬菌体快速测序DNA＂(1993)生物技术，15:422-431)(有关微量滴定板中的噬菌体)描述的方法，通过培养物上清液的20％PEG/2.5 M NaCl沉淀来进行纯化噬菌体，以及通过苯酚-氯仿抽提或碱变性来进行分离或释放病毒粒子DNA。按照Smith和Scottt(同上)(有关试管培养物噬菌体DNA)描述的方法以及Haas和Smith(同上)(有关微量滴定板上噬菌体DNA)描述的方法，利用市售的测序试剂盒(U.S.Biochemical/Amersharn,Arlington Heights,IL)实施Sanger等(＂用链终止抑制剂的DNA测序＂(1970)，美国国家科学院院报，74:5463-5467)的双脱氧核苷酸链终止DNA测序技术。通过仅利用ddCTP终止混合物，在7％聚丙烯酰胺/脲测序凝胶上电泳之后获得G跟踪或由单碱基(G)给出的序列格式，并且为放射自显影所显示。而后进行标准的凝胶电泳和放射自显影过程(Sambrook等，同上)。

G-跟踪的76个克隆(来源于ACA-6501文库筛选的、得自在噬菌体稀释度1∶1×10⁵下试验的微筛选平板的)揭示出11个独特的序列，而得自在噬菌体稀释度1∶3×10⁵下试验的第二微筛选平板的64个克隆显示出30个独特的序列。将利用所有4个双脱氧核苷酸三磷酸的常规DNA测序用于具有最高微量淘选得分和独特的序列的噬菌体克隆，结果产生如表1所示的xyz文库的12个序列。噬菌体俘获ELISA

将克隆ACA-6635/3A12、3B3、3C8、3A5、3C9和3B7以3mL培养物培养。将亲和纯化的ACA-6635在磷酸盐缓冲盐水(pH7.2)中稀释到2.5μg/mL，向Immulon-2微量滴定板的孔中加入100μL。2小时后，在无振荡的自动平板洗涤器中用TBS/Tween洗涤平板3次。然后在每孔中用溶解在PBS中的150μL 0.1％BSA(无球蛋白)封阻此平板。在4℃下放置1小时后，将此平板如上所述洗涤3次。以17,000×g将每一种噬菌体培养物离心3分钟后，在0.1％BSA/PBS中以1∶10稀释每一种上清液，并在涂上一层亲和纯化的ACA-6635的每个孔中加入100μL，在4℃下温育2小时。然后如上所述用TBS/Tween洗涤平板。在0.1％BSA/PBS中以1∶5,000稀释辣根过氧化物酶-缀合的绵羊IgG抗-M13噬菌体抗体(Pharmacia公司，Piscataway,NJ)，并向每个孔中加入100μL。在4℃下温育1小时后，如上所述将此平板洗涤4次。将按照缀合物厂商的指导制备的100μL底物加入到每个孔中。19分钟后，在自动微量平板吸收率读数仪(Biotek,Winooski,VT)上测定每孔在405 nm处的吸收率。选择来源于的ACA-6635噬菌体文库筛选的试验的7个克隆，这是因为它们的高微量淘选得分和阴性噬菌体ELISA得分(参见下文)。如图9所示，所试验的7个克隆中有3个(3A12、3B3和3A5)在噬菌体俘获ELISA中显示出很强的免疫专一性信号。噬菌体ELISA

由上述以亲和纯化的ACA-6501在几个噬菌体文库筛选物中分离的35个克隆来制备3mL培养物，并以一个缺乏肽插入片段的fUSE 2噬菌体克隆作为对照。在以17,000×g离心3分钟后，将100μL的各种噬菌体上清液(以吸收率为基础调至-2×10¹¹粒子/毫升)加入到微量滴定板的孔(Falcon,Becton-Dickinson Labware,Lincoln Park,NY)中，并在40℃下过夜温育。用TBS7.4洗涤4次后，在室温下用125μL的0.5％BSA/TBS将此平板封阻1小时。经TBS再洗涤4次后，将100μL原来在TBS/BSA中稀释至2.5μg/mL的affACA-6501加入到每个孔中，在37℃下温育1小时。再洗涤4次后，将在TBS/0.5％Tween中以1∶1000稀释的100μL抗人IgG加入到每个孔中。在室温下放置1小时后，加入酶底物，并温育2小时。然后加入50μL 0.2M Na₂HPO₄以终止反应，在自动平板吸收率读数仪上在550 nm处测量吸收率。如图10所示，7个克隆在用ACA-6501的噬菌体ELISA中具有明显的信号：5A12、3B6、3E7、3B10(和2D7具有相同的序列)、2G11、2H1和2H2。这些克隆的序列如表2所示。肽-ELISA

在标准方案中，用pH 9.5的碳酸盐缓冲液将溶解在二甲基甲酰胺中的四体肽储备溶液稀释1000倍，即稀释为10μg/mL。每孔涂布有100μL的稀释肽的微量滴定板在40℃下放置一夜，然后用缓冲白蛋白封阻。在室温下将涂布有肽的微量滴定板与不同稀释浓度(以1∶50开始)的aPL血清一起温育1-2小时。洗涤后，按照标准的ELISA方法使用酶-缀合的抗人IgG确定结合肽的人IgG的存在。竞争性结合肽-ELISA

(A)除用作空白对照的3个孔外，在每个ImmulonⅡ平板(Dynatech实验室公司，Chantilly VA)的孔中涂上一层含有溶解在50 mM碳酸钠(pH9.5，含有35 mM碳酸氢钠)(Fisher Scientific,Pittsburgh,PA，试剂等级)中的10μg四价肽ACA6501/3B10，在室温下放置至少1小时。然后，将此液体从孔中除去，向每个孔(包括空白孔)中加入用于封阻的200μL的溶解在TBS中的0.5％(wt/vol)BAS(Sigma化学药品，St.Louis,MO,#A7638)，将其在室温下温育至少1小时。将4个1.5毫升的离心管标记为1-4号。在第一个离心管(Brinkman Instruments,Westbury,NY)中混合下列试剂：30μL的5％ BSA；284μL TBS；8 μL大约400-500μg/mL的单体肽(ACA-5A12或-CB2或-3B10或混杂的-3B10作为阴性对照)TBS溶液的储备溶液；8.2μL 1∶10稀释的血清6501的0.5％BSA-TBS溶液。在第二个离心管中混合下列试剂；30μL的5％BSA；290μLTBS；2μL大约400-500μg/mL的单体肽(ACA-5A12或-CB2或-3B10或混杂的-3B10作为阴性对照)TBS溶液的储备溶液；8.2μL 1∶10稀释的血清6501的0.5％BSA-TBS溶液。在第三个离心管中混合下列试剂；30μL的5％BSA；287μL大约400-500μg/mL的单体肽(5A12或-CB2或-3B10或混杂的-3B10作为对照)的1∶10稀释液；8.2μL原来以1∶10稀释的ACA-6501血清的0.5％BSA-TBS溶液。在第四个Eppendorf离心管中混合下列试剂；60μL 5％BSA；584μL TBS和16.5μL的1∶10稀释的血清6501的0.5％BSA-TBS溶液。用TBS将封阻的平板洗涤5次。将第一个离心管的溶液加入到3个孔中，每孔100μL。将相同数量的第二、第三和第四离心管的溶液也加入到三重孔中。将第四个离心管中的100μL溶液加入到微量滴定板的三个封阻的空白孔的每一个中。在室温下将此平板在40rpm的有轨振荡器(American Dade,Miami,FL,RotatorⅤ)中温育1小时，然后用TBS洗涤5次。加入溶解在0.5％BSA-TBS中的100μL 1∶1000稀释的山羊抗人IgG/碱性磷酸酯酶缀合物(Zymed，南旧金山，CA，产品号62-8422)溶液，并在室温下温育1小时。然后用TBS洗涤此平板5次，如实施例1所述通过加入100μL PPMP稀释的底物溶液进行测定。20分钟后，通过向每孔中加入50μL的0.2M Na₂HPO₄(Mallinckrodt,St.Louis,MO.，试剂等级)终止反应。在微量平板读数仪(Bio-Tek仪器，Winoosli,VT,EL 311型)上以550nm测定光密度。将550nm下的光密度对每孔中的肽量在Graph Pad Prizm(Graph Pad软件公司，San Diego,CA)上作图。从此图计算血清6501与四价3B10结合的50％抑制作用所需的肽量。

(B)以30μL/孔的量将Immulon I^96孔平底的聚苯乙烯微量滴定板(Dynatech实验室公司，Chantilly,VA)涂布上心磷脂(CL,50μg；Sigma化学药品公司，St.Louis,MO)的乙醇溶液。两个对照孔中只含有30μL的乙醇。4℃下，过夜蒸发后，室温下将每个孔用200μL 5％(w/v)鱼明胶的PBS溶液封阻2小时。然后用TBS洗涤5次涂布有CL的封阻的平板，并向每个孔中加入β₂-GPI作为100μL的2.3％(v/v，在PBS中)IgG耗尽的人血清(Sigma化学药品公司，St.Louis,MO)，并在室温下温育2小时。

在温育过程中，使用Eppendorf离心管，将数量可变化的6种肽的每一种与22μL ACA6501血清混合(所说的血清是用溶解在1∶1 TBS/PBS中的3％鱼明胶稀释(最终为1∶400的稀释液)的，最终体积为220μL。具体地，在#1管中混合181.3μL的3％鱼明胶/TBS-PBS溶液、16.7μL的肽储备溶液以及22μL的ACA6501血清(在3％鱼明胶/TBS-PBS溶液中稀释40倍)。对于肽#951(二丝氨酸非环化的阴性控制)，#952(大量的LJP 690)和硫醚CCTE-3G3、CHTE-3G3、HCTE-3G3和HHTE-3G3，储备溶液的浓度变化范围为450-800μg/mL。在2号管中加入下列物质；148μL的鱼明胶/TBS-PBS,50μL的肽储备溶液+22μL 40倍稀释的ACA6501血清。3号管含有48μL的鱼明胶/TBS-PBS,50μL的肽储备溶液+22μL 40倍稀释的ACA6501血清。4号对照管中含有396μL的鱼明胶/TBS-PBS和44μL 40倍稀释的ACA6501血清(不含肽)。在室温下将每一个管温育大约1小时。

用TBS洗涤CL/β₂-GPI微量滴定板5次，将100μL Eppendorf1、2、3、4号管中的含有抗体-肽(或者没有肽混合物)的溶液重复加入到这些孔中。将100μL的管4的溶液重复加入到不含心磷脂的对照孔中。室温下将此平板在40 rpm的轨道振荡器(American Scientific,RotatorⅤ)中温育1小时，然后用TBS洗涤5次。加入溶解在0.5％BSA-TBS中的100μL 1∶1000稀释的山羊抗人IgG/碱性磷酸酯酶缀合物(Zymed，产品号62-8422)溶液。室温下温育1小时后，再用TBS洗涤此平板5次，通过加入100μLPPMP溶液(7.8g酚肽一磷酸+69.5g 2-氨基-2-甲基-1-丙醇的100mL水储备溶液，用水以1∶26稀释)进行酶比色测定。21分钟后，通过向每孔中加入50μL的0.2 M Na₂HPO₄(Mallinckrodt)来终止反应。在微量平板读数仪(Bio-Tek仪器，Winooski,VT,EL 311型)上在550nm处测定吸收率。将吸收率对加入的肽量在Graph Pad Prism(Graph Pad软件公司)上作图。从此图的与最大吸收率一半的交叉点的肽加入量来计算50％抑制ACA6501结合(IC₅₀)的肽量。

(C)在Nunc Maxisorp^96孔平底微量滴定平板上以100μL/孔(在PBS中)涂布一层纯化的人P2-糖蛋白I(Perlmmune,Rockville,MD)。两个对照孔只接收100μL PBS。在室温下温育两小时之后，除去液体。在室温下用200μL/孔的包含2％(w/v)无脂干牛奶(Carnation,Glendale,CA)和0.4％(w/v)Tween 80(Calbiochem,San Diego,CA)的PBS封阻涂布的平板2小时。封阻液也用作为稀释剂。

在温育的第二小时期间，利用Eppendorf微量离心管，使可变量的四个检验肽之每一个与22μL ACA-6501血清(以220μL的终体积用样品稀释剂稀释的)混合。具体地说，在管1中，加入188μL的样品稀释剂、10μL的肽储备溶液(2mg-4mg/mL稀释剂)、以及22μL的用样品稀释剂稀释为1∶35的ACA-6501血清。在管2中，加入158μL的样品稀释剂、40μL的肽储备溶液、以及22μL的1∶35稀释的ACA-6501血清。管3包含38μL样品稀释剂、160μL肽储备溶液以及22μL的1∶35稀释的ACA-6501血清。对照管(管94)包含396μL样品稀释剂和44μL的1∶3.5稀释的ACA-6501血清(没有肽)。在室温下温育每管大约1小时。

用TBS洗涤β₂-GPI微量平板5次，并加入100μL的包含在Eppendorf管1、2、3和4中的混合物至微量平板的重复孔中。将管4的100μL内含物加入到没有涂布β₂-GPI的重复对照孔中。在室温下温育平板1小时，用TBS洗涤5次，并加入100μL的用样品稀释剂缓冲液稀释为1∶1000的山羊抗人IgG/A-P缀合物(Zymed，产品号62-8422)。在室温下温育1小时后，用TBS再洗涤平板5次，并通过加入100μL PPMP溶液(在100 mL水储备液中的用水稀释为1∶26的7.8g酚酞一磷酸和69.5g 2-氨基-2-甲基-1-丙醇)来进行比色酶检测。在22分钟之后，通过每孔加入50μL的0.2M Na₂HPO₄(Mallinckrodt)来停止反应。用微量平板读数仪(Boi-Tek仪器，EL 311型)读取A550 nm。将吸光度与加入的肽量点绘在Graph PadPrism(Graph Pad Software公司)上，如图21所示。从图上在最大之一半的吸光度与加入的肽量的相交点处，计算50％抑制ACA-6501结合的肽量(IC-50)。实施例5：肽3B10的截短实验和所形成的肽的竞争ELISA结果

在室温下以每孔100μL的四体ACA-6501/3B10肽(为10μg/mL的碳酸盐缓冲液(pH 9.6,15mM Na₂CO/35mM NaHCO₃))溶液)涂布微量滴定板(96孔、平底的聚苯乙烯，Immulon-2,Dynatech实验室公司，Chantilly,VA)。从孔中除去液体后，在室温下用200μL的0.5％(wt/vol)BSA(无球蛋白，产品号A7638,Sigma化学药品公司，St.Louis,MO)的TBS溶液封阻每孔1小时。此平板左边的三重孔没有涂布四价的肽，目的是作为空白对照孔。

在封阻期间，将每一种可溶的待测的单体肽装入三个试管(Eppendorf小试管，Brinkmann仪器，Westbury,NY)中，每个管中含有30μL 5％BSA/TBS、8.2μL ACA-6501血清(用0.5％BSA/TBS以1∶10稀释)+体积可变的肽/TBS储备物、必要量的TBS，使最终体积为330μL。330μL体积足以产生3个100μL的每一种肽浓缩物的样品，这些样品用于检测其封阻ACA-6501与四价肽涂布的平板的结合能力。对于肽139(其氨基末端是截短的，并缺乏正常试验的构架ala-gly)，此储备溶液的浓度为大约340-400μg/mL TBS，除去19μL、75μL和292μL等分溶液以便制备三种肽浓度的管。对于肽142(只是没有N-末端ala)和肽143(没有截短)，储备溶液的浓度为大约400-500μg/mL TBS。从每一种储备物溶液中除去1μL、4μL和16μL的等分溶液以制备每种肽的三种浓度的管。对于肽单体对照管(没有肽)，制备最终体积为660μL的管，其包含60μL 5％BSA、16.5μL的ACA-6501的1∶10稀释液和583.5μL的TBS(即与330μL的管具有相同的最终浓度(0.5％BSA和1∶400的ACA-6501血清)，但是体积是它的两倍，不含肽)。

封阻温育后，将用四价肽涂布的平板用TBS洗涤5次。将每一个330μL的以不同浓度含有肽139、142和143的管中的100μL溶液加入到涂布的三重孔中。将不含肽的660μL的对照管中的三份100μL等分溶液分别加入到涂布的孔中，另外三份100μL的等分溶液分别加入到未涂布的空白孔中。在室温下将此平板在40转/分钟的旋转有轨振荡器(Rotator V,American Dade,Miami,FL)中温育1小时，然后用TBS洗涤5次。向微量滴定板每孔中加入溶解在BSA-TBS中的100μL 1∶1000稀释的山羊抗人IgG/碱性磷酸酯酶缀合物(产品号62-8422,Zymed,South SanFrancisco,CA)溶液。在室温下温育1小时后，然后再用TBS洗涤此平板5次。向每孔中加入100μL新制备的稀释PPMP底物溶液后可产生颜色。PPMP的稀释溶液(酚肽一磷酸，产品号P-5758,Sigma化学药品公司，St.Louis,MO)是通过以1∶26用水稀释PPMP储备溶液(0.13MPPMP、7.8M氨基-2-甲基-1-丙醇(用HCl将其pH调至10.15))制备的。30分钟后，通过向每孔中加入50μL的0.2M Na₂HPO₄(试剂级，Mallinckrodt,St.Louis,MO)终止反应。在微量平板读数仪(Bio-Tek仪器，Winooski,VT,EL 311型)上以550nm测定吸收率，将吸收率对每孔加入的肽量在Graph Pad Prizm(Graph Pad软件公司，San Diego,CA)上作图。如图11所示，划出的基线相当于在没有单体肽竞争抑制作用时的结合反应最大值的一半。50％的抑制值如图12所示。所得的结果表明N-末端Ala的缺失没有负作用，而Gly的再缺失则增加了获得50％抑制作用所必需的浓度大约8倍。实施例6:3B10中的α-甲基脯氨酸取代及所产生的ELISAs

使用实施例5描述的方法试验肽ACA-6501/3B10和其类似物(其中3和9位上的脯氨酸由α-Me-Pro代替)。使用四体肽3B10涂布的微量滴定板和ACA-6501血清在竞争结合ELISA中检验作为可溶单体肽的肽3B10，726(在3位上αMe-Pro被取代)，727(在9位上αMe-Pro被取代)，和728(在3和9位上αMe-Pro被取代)。

如实施例5所述将微量滴定板用四体肽3B10涂上一层。对于所试验的4种肽的每一种，在管中制备3种浓度的肽。这12个管的最终浓度为0.5％BSA/TBS、以1∶400最终稀释的ACA-6501血清，终体积为330μL。所有的肽储备溶液为400-500μL/mL TBS。向含有30μL 5％BSA/TBS和8.2μL ACA-6501血清(用0.5％BSA/TBS以1∶10稀释)的管中，加入4种肽储备溶液的每一种的1μL、4μL和16μL的等分溶液，另外加入合适体积的TBS，使最终体积为330μL。如实施例5所述，制备最终体积为660μL的不含竞争肽的对照管。

四价肽涂布的平板的温育封阻后，如实施例5的描述试验来源于四种肽的各种肽浓度管中的三份100μL等份样品、以及来源于不包含肽的对照管和空白对照中的等份样品。如实施例5的描述实施微量滴定板ELISA方法和进行数据处理。如图13所示，肽727(其中在9位置上的α-Me-Pro被取代)与未修饰的肽3B10或带有改变的脯氨酸的类似物(肽728)相比具有明显提高的活性。肽726(其在3位发生取代)由于这种取代而失去了活性。实施例7：利用6626抗体的筛选的简要描述和相应的序列

通过亲和纯化从上述的8mL ACA-6626血浆中分离亲和纯化的ACA-6626(AffACA-6626)。将AffACA-6626(10μg)与含有全部的p-Ⅲ感受态的一组文库(最终体积为100μL)(如上文用于ACA-6501生物淘选的描述)的表位xy’z噬菌体文库一起温育。在三轮生物淘选之后，通过微量淘选检验从第二轮和第三轮中随机选择的噬菌体。只有几个克隆在1∶1000稀释度下具有微弱的免疫阳性。对另外的第四轮进行生物淘选。94个第四轮克隆的微量淘选显示出43个免疫阳性，有些在高达1∶100000稀释度下表现出免疫阳性。如上文用于ACA-6501的描述所进行的43个免疫阳性克隆的G-示踪DNA测序表明5个单一序列。在常规的四碱基DNA测序后，获得了表3的翻译氨基酸序列。实施例8：对患者6644的ACA特异的序列的鉴定

使用与实施例4类似的方法通过患者6644的ACA亲和纯化的抗体筛选epi^xy’z噬菌体显示文库。在肽合成前使用上述的菌落印迹分析作为最后的鉴定步骤。在原来硝酸纤维素膜上接种大约150个菌落，并对其进行测定。以1μg/mL的浓度使用患者6644的抗体。在此筛选中，在硝酸纤维素膜上平板接种和测定的150个菌落中，只有四个具有较强的阳性，2个表现出微弱的阳性。此筛选中选择出的6个阳性噬菌体的插入片段的测序表明所有这些插入片段都来自具有游离氨基末端(epi^z)的8-mer文库。

Gly-Ile-Leu-Ala-Leu-Asp-Tyr-Val-Gly-Gly(3个插入片段)

Gly-Ile Leu-Thr-Ile-Asp-Asn-Leu-Gly-Gly(1个插入片段)

Gly-Ile-Leu-Leu-Asn-Glu-Phe-Ala-Gly-Gly(2个插入片段)实施例9：利用ACA-6641的噬菌体文库筛选的概述

从取自患者6641的4mL血浆中分离AffACA-6641。如上所述将AffACA-6641(10μg)与一组p-Ⅲ噬菌体文库(最终体积为100μL)一起温育。在四轮生物淘选之后，通过微量淘选检验第三轮和第四轮中的45个克隆。在45个克隆中有23个是阴性的。第三轮噬菌体产生得分为4+的两个克隆、得分为3+的两个克隆、得分为2+的两个克隆。在第四轮中一个克隆得分为4+，一个克隆得分为3+,3个克隆得分为2+。G-示踪的DNA测序显示出6个单一序列。只有一个克隆(3G3)在噬菌体俘获ELISA中显示出较强的阳性。四个碱基的DNA测序得到下列翻译的肽序列：CLGVLGKLC。实施例10：肽与非免疫原性多价载体的缀合

如共有共同未决美国专利申请08/118,055(1993年9月8日申请)、08/152,506(1993年11月15号申请)和美国专利5,268,454、5,276,013和5,162,515(其全部内容本文一并参考)中所述，已经开发出用于产生B细胞耐受原的一些四价平台。结合通过表位文库的aPL抗体筛选选择的候选肽，并检验它的免疫化学行为(如抗体结合)的改变。

按照下面的方案合成带有胺基团的非免疫原性多价平台。平台上的胺-肽上的羧基

化合物2：将溶解在50mL纯EtOH和35mL环己烯中的8.0g(5.7mmol)化合物1溶液放置在氮气中，加入500mg 10％Pd/碳。将混合物搅拌回流2小时。冷却时经Celite过滤，浓缩得到油状的5.0g化合物2。¹H NMR(50/50CDCl₃/CD₃OD)d1.21(m,8H),1.49(m,8H).1.62(m,8H),2.19(t,J=7.4Hz,8H),2.67(t,J=7.4 Hz,8H),3.36(bd s,16H),3.67(s,4H),3.71(m,4H)；4.21(m,4H)。带有游离羧基的保护肽(PHN-肽-CO₂H)

在Wang(对烷氧基苄基)树脂上利用FMOC化学经标准固相方法合成肽，其中使用三氟乙酸(TFA)稳定保护基团(在羧基上的苄基酯或环己基酯和在氨基上的苄氧羰基(CBZ))。将氨基酸残基顺序地加入到氨基末端。利用TFA从树脂上取出肽，以便提供在羧基末端具有一个游离羧基的肽，所有其它的羧基和氨基都被封阻。通过反相HPLC纯化保护的肽。肽-平台缀合物4

把保护的肽(0.3mmol)溶解在1mL的二甲基甲酰胺(DMF)中，向溶液中加入0.3mmol二异丙基碳化二亚胺、0.3mmol 1-羟基苯并三唑水合物(HOBT)。将此溶液加入到含有0.025mmol四氨基平台、化合物2(1mLDMF溶液)的溶液。加入后真空除去DMF以产生粗制的完全保护的缀合物3。在0℃下用氢氟酸(HF)在茴香醚存在下处理缀合物3产生缀合物4。

通过制备型反相HPLC进行纯化。

下列的方案显示出肽的氨基连接到平台的羧基上。平台上的羧基-配体上的胺

将琥珀酐(1.0g,10mmol)加入到溶解在20mL1/1二噁烷/水中的861mg(1.0mmol)的化合物2和252mg(3.0mmol)的NaHCO₃溶液中，将混合物在室温下搅拌16小时。用1N HCl将混合物酸化，并将其浓缩。通过硅胶层析纯化此浓缩物，产生化合物5。带有游离胺的保护的肽(H₂N-肽-CONH₂)

使用TFA稳定保护基团(在羧基上的苄基酯或环己基酯和在氨基上的CBZ)在酰胺树脂上经标准的固相方法合成肽，这样，从此树脂上切割后产生羧基末端的酰胺，使用标准的FMOC化学向氨基末端顺序加入氨基酸残基。使用三氟乙酸从树脂上除去此肽以产生带有游离胺接头的保护的肽。经反相HPLC纯化此保护的肽。肽-平台缀合物7

制备溶解在1mL的DMF中的0.05mmol带有游离胺的保护肽(H₂N-肽-CONH₂)、0.1mmol二异丙乙基胺、0.01mmol的化合物5溶液。加入BOP试剂(苯并三唑-1-基氧-三(二甲基氨基)鏻六氟磷酸盐)(0.1mmol)，搅拌混合物直到经分析型HPLC确定反应完全。0℃下在茴香醚存在时通过HF处理除去肽保护基团，得到除去肽保护基因的缀合物7。经制备型反相HPLC纯化化合物7。

下列方案表明如何将巯基接头与肽的氨基末端连接，接下来将肽胺头与四溴乙酰化的平台连接产生化合物13。平台上的卤乙酰和肽上的巯基三苯基乙醇

化合物9

将浓硫酸(100μL)添加到4.48g(17.2mmol)三苯甲醇和1.62g(15.3mmol,1.3mL)3-巯基丙酸在35mL EtOAc中的60℃溶液中。在60℃将混合物搅拌10分钟，使其冷却至室温(RT)，置于冰上1小时。通过过滤收集所形成的白色固体，给出4.52g(75％)化合物9。化合物10

将二环己基碳化二亚胺(DCC)(2.41g,11.7mmol)添加到2.72g(7.8mmol)化合物9和1.08g(7.8mmol)对硝基苯酚在41mL CH₂Cl₂中的0℃溶液中。将混合物搅拌16小时，使其到达RT。过滤混合物以除去N,N-二环己基脲(DCU)，浓缩滤液。从己烷/二氯甲烷结晶残渣，产生3.17 g(86％)淡黄色结晶状的化合物10。化合物11-具有连接的巯基丙酰接头的环状硫醚肽

将环状硫醚肽(一种二硫化物环化肽类似物，其中一个硫原子被一个CH₂取代)和碳酸氢钠在水和二噁烷中的溶液用对硝基苯酯10处理。如果肽含有赖氨酸，则其必须进行合适的封阻。将所形成的稀释肽用三氟乙酸处理，产生硫醇接头修饰的肽11。化合物13-环状硫醚肽和溴乙酰化平台的缀合物

向0.10mmol硫醇修饰肽11在100mM硼酸钠(pH9)中的He吹洗的溶液加入0.025溴乙酰化平台12(在9/1 MeOH/H₂O中的40mg/mL溶液)。在N₂氛围下搅拌溶液，直到由HPLC证实缀合完全。通过反相HPLC纯化缀合物。实施例12:LJP 685的合成

γ-溴代-N-BOC-α-氨基丁酸叔丁酯，化合物14:

在40mL干THF中的4.03g(13.3mmol)N-BOC-谷氨酸-α-叔丁酯和1.61mL(1.48g,14.6mmol)N-甲基吗啉在N₂氛围下冷却至15℃。将氯甲酸异丁酯(1.73mL,1.82g,13.3mmol)逐滴加入到混合物中。将混合物搅拌10分钟，加入2.03g(16.0mmol)N-羟基-2-巯基吡啶在8mL THF中的溶液，接着加入2.23mL(1.62g,16.0mmol)Et₃N。将混合物用箔包裹以避光，使其在室温下搅拌1小时。过滤混合物，在旋转蒸发器上浓缩滤液，小心尽量不暴露于光下。将浓缩物溶解在20mL BrCCl₃中，将溶液冷却至-70℃。将固体置于真空中，然后用N₂清洗，使其达到室温，置于20℃的水浴中，在近距离内从上方用500W太阳灯照射5分钟。在旋转蒸发器上浓缩混合物，经硅胶色谱纯化(40mm×150mm，甲苯用作洗脱液直到UV活性物完全洗脱，2％EtOAc/甲苯(500mL),5％EtOAc/甲苯(500 mL)。再纯化不纯的组分。合并TLC(Rf 0.23,5％EtOAc/甲苯)纯化的组分，浓缩，产生3.23g(72％)蜡状固体状化合物14。N-BOC-甘氨酰脯氨酸-4-硝基苯酯，化合物15：

将3.0g(11.6mmol)N-BOC-甘氨酰脯氨酸和1.93g(13.9mmol)4-硝基苯酚在82mL干THF中的溶液冷却至0℃，加入3.34g(16.2mmol)DCC。将混合物在0℃下搅拌1小时，移去冰浴。将混合物在室温下搅拌16小时。将HOAc(579μL)加入到混合物中搅拌30分钟。将混合物保持在冰箱中30分钟，在真空下过滤。浓缩滤液，经硅胶色谱(18×150mm柱床，2.5％EtOAc/97.5％CH₂Cl₂/1％HOAc)纯化。通过在旋转蒸发器上从二噁烷环浓缩几次除去微量的乙酸。用3/1己烷/Et₂O研磨浓缩物，经过滤收集所形成的白色固体，产生4.1g(90％)白色固体状化合物15。TLC Rf0.09,40/60/1 EtOAc/己烷/HOAc；¹H NMR(CDCl₃)(1.09-2.55(m,4H),1.48(s,9H),3.47-3.77(m,2H),4.05(m,2H),4.74(m,1H),5.45(bd s,1H),7.35(d,2H),8.30(d,2H)。N-FMOC-S-叔丁基硫代半胱氨酸酰胺(thiocysteineamide)，化合物16：

将5.0g(11.6mmol)FMOC-S-叔丁基硫代半胱氨酸和1.33g(11.6mmol)N-羟基琥珀酰亚胺在115mL THF中的溶液冷却至0℃。向溶液中加入3.58g(17.37mmol)DCC，在0℃搅拌混合物1小时，加入1.6g(NH₄)HCO₃在50mL水中的42.9mL溶液。将混合物搅拌4.5小时，使冰浴逐渐温热至室温，在旋转蒸发器上浓缩，以除去THF，产生具有白色固体的水相。将混合物与200mL CH₂Cl₂一起搅拌，直到大多数固体溶解，然后与100mL 1N HCl溶液一起振荡。用100mL饱和NaHCO₃溶液洗涤CH₂Cl₂层。干燥(Na₂SO₄)并过滤。在热的平板上使滤液沸腾，从300mLCH₂Cl₂/己烷结晶，产生4.36g(87％)白色固体状化合物16；mp127-129℃；TLC Rf 0.29,95/5/1 CH₂Cl₂/CH₃CN/MeOH,¹H NMR(CDCl₃)δ1.36(s,9H)；3.06-3.24(m,2H),4.25(t,1H),4.55(m,3H),5.56(bd s,1H),5.70(bd s,1H),6.23(bd s,1H)；¹³C NMR(CDCl₃)29.8,41.9,47.1,48.5,54.2,67.2,120.0,125.0,127.1,127.8,141.3,143.6,156.1,172.2.分析，计算值：C,61.4％；H,6.1％；N,6.5％。实测值：C,61.5％；H,6.0％；N,6.5％。化合物17：

将水(16.9mL)添加到在33.8mL二噁烷中的2.91g(6.75mmol)化合物16中，用氮气吹洗溶液5-10分钟。将混合物保持在氮氛围下，加入1.13g(13.5mmol)NaHCO₃，接着加入1.77mL(1.44g,7.09mmol)PBu₃。在室温下搅拌混合物1小时，在1×100mL 1N HCl和2×100mLCH₂Cl₂之间分配。合并CH₂Cl₂层，浓缩，将所形成的白色固体部分溶解在33.8mL二噁烷中。加入水(9mL)，用氮气清洗混合物5-10分钟。将混合物保持在氮氛围下，加入2.17g(16.9mmol)K₂CO₃，接着加入2.63 g(8.1mmol)化合物14。将混合物搅拌16小时，在1×100mL 1N HCl和2×100mL 10％MeOH/CH₂Cl₂之间分配。合并CH₂Cl₂层，用硫酸钠干燥，过滤并浓缩成半固体残渣。经硅胶色谱(1/3 CH₃CN/CH₂Cl₂)纯化，产生3.2g(80％)化合物17白色固体；TLC Rf0.27,1/3 CH₃CN/CH₂Cl₂。通过从己烷/EtOAc重结晶进行分析样品的进一步纯化；mp104-106.5℃；¹HNMR(CDCl₃)δ1.47(s,9H),1.49(s,9H),1.96(m,1H),2.11(m,1H),2.69(m,2H),2.88(m,1H),3.03(m,1H),4.29(t,1H),4.36(m,2H),4.50(m,2H),5.21(m,1H),5.49(m,1H),5.81(m,1H),6.54(m,1H),7.34(t,2H),7.42(t,2H),7.61(d,2H),7.80(d,2H)；¹³C NMR(MeOH)δ26.1,26.7,28.2,28.7,34.8,54.8,55.7,68.1,80.5,82.7,120.9,126.3,128.2,128.8,142.6,145.2,160.0,162.7,173.4,175.8。C₃₁H₄₁N₃O₇S分析，计算值：C,62.08；H,6.89；N,7.01：实测值：C,62.23；H,7.12；N,7.39。化合物18：

将20/1/1 TFA/H₂O/巯基乙醇(23.2mL)溶液加入到1.27g(2.11mmol)化合物17中。在室温下搅拌混合物1小时，浓缩至约3mL体积。添加50mL乙醚以沉淀产物。用两份更多的乙醚洗涤所形成的固体，并在真空下干燥，产生812mg固体。将该固体悬浮在10.6mL二噁烷和10.6mL H₂O中。将NaHCO₃(355mg,4.22mmol)添加到混合物中，接着添加1.33g(3.38mmol)化合物15在10.5mL二噁烷的溶液中。在室温下搅拌混合物20小时，在100mL 1N HCl和3×100mL CH₂Cl₂中分配。干燥合并的CH₂Cl₂层(Na₂SO₄)，过滤并浓缩。经硅胶色谱纯化(35×150mm；梯级梯度，5/95/1 MeOH/CH₂Cl₂/HOAc(1L)到10/95/1)。浓缩纯的组分，与乙醚一起研磨残渣，产生881mg(60％)化合物18；TLC Rf 0.59,10/90/1MeOH(CH₂Cl₂/HOAc；mp 116-117.5℃；¹H NMR(CDCl₃)δ1.41(s,9H),2.00(m,2H),2.18(m,2H),2.56(m,1H),2.69(m,1H),2.85(m,2H),3.49(m,2H),3.62(m,2H),3.85(m,2H),4.08(m,1H)；4.12(m,1H),4.22(t,1H),4.38(m,1H),4.49(m,2H),4.61(m,2H),7.78(d,bd s,1H),6.12(bd s,1H),6.43(bds,1H),7.35(d,2H),7.40(d,2H),7.61(d,2H),7.78(d,2H)；¹³C NMR(CDCl₃)δ25.3,27.8,28.6,29.4,32.6,35.1,44.1,46.9,47.3,52.2,53.9,61.2,67.8,80.8,120.8,125.7,128.2,129.0,142.0,144.5,157.6,157.8,170.6,181.2,182.9,183.1。C₃₄H₄₃N₅O₉S分析，计算值：C,58.52；H,6.21:N,10.03。实测值：C,58.38,11,6.17；N,10.20。

N-FMOC-L-丙氨酰-L-2-甲基脯氨酸，化合物19:

将2-甲基脯氨酸(Seebach等(1983)美国化学会杂志，105:5390-5398)(1.00g；4.76 mmol),4.00g(47.6mmol)NaHCO₃和31mg(0.23mmol)HOBT在6.9mL DMF中的溶液冷却至0℃，加入3.18g(6.66mmol)N-FMOC-L-丙氨酸。在0℃搅拌反应物1小时，然后在室温下搅拌18小时。将混合物在50mL EtOAc和3×50mL 1N HCl中分配，干燥EtOAc层(MgSO₄)，过滤并浓缩。经硅胶色谱(梯级梯度45/55/1 EtOAc/己烷/HOAc到47/53/1 EtOAc/己烷/HOAc到50/50/1 EtOAc/己烷/HOAc)纯化，产生1.72g(86％)化合物19白色固体。将产物从二噁烷浓缩几次，以除去微量的乙酸；mp 59-60℃；¹H NMR(CDCl₃)δ1.39(d,3H),1.93(m,2H),2.06(m,2H),3.78(m,2H),4.22(m,1H),4.40(d,2H),4.56(m,1H),5.09(t,1H),5.69(d,1H),7.32(t,2H),7.42(t,2H),7.62(d,2H),7.78(d,2H)；¹³C NMR(CDCl₃)δ17.8,21.8,23.8,37.9,47.1,48.5,65.9,67.0,120.0,125.1,127.1,127.7,141.3,144.1,155.6,172.9,175.1。N-FMOC-L-亮氨酰-HMPB-MBHA树脂：

制备N-FMOC-L-亮氨酸在22.5mL CH₂Cl₂中的溶液和几滴DMF，冷却至0℃。向溶液中加入1.71mL(1.38g,10.9mmol)二异丙基碳化二亚胺(DIC)，在0℃下搅拌混合物20分钟。将混合物浓缩成油状，同时，将足够量的DMF(约3mL)加入到2.5g(0.87mmol/g,2.18mmol)HMPB-MBHA树脂(Nova Biochem)上，以溶胀树脂。将浓缩的油状物溶解于少量DMF(约1mL)中，并添加到溶胀的树脂上，接着加入溶解在约1mLDMF中的266mg(2.18mmol)DMAP溶液。轻轻摇动混合物1小时，洗涤(2XDMF,2XMeOH,2XDMF,2XMeOH)。将树脂在真空下干燥，产生2.77g(85％)，取代由Geisen试验测得为0.540mmol/g。具有在天冬氨酸上的叔丁酯和在精氨酸上的Pmc基以及具有硫醚插入片段的N-FMOC-线性肽，化合物20：

在N-FMOC-L-亮氨酰-HMPB-MBHA树脂上经标准FMOC合成法制备该肽。除了化合物18的偶联步骤外，在各偶联步骤中使用三当量的氨基酸，HOBT和(DIC)。两当量的化合物18与三当量的HOBT和二异丙基碳化二亚胺一起使用。利用10μL溴酚蓝指示剂监测各步反应。也用茚三酮试验(在100℃加热2分钟，用1滴吡啶和1滴在EtOH中的5％茚三酮和1滴在EtOH中的80％苯酚，液滴变蓝)估计反应的完成情况。这样，将1.13mg(0.613mmol)树脂用于制备所说的肽。在最后的偶联步骤后，通过用1％三氟乙酸在CH₂Cl₂中的溶液处理2分钟完成从树脂上裂解。2分钟后，减压过滤到30mL 10％吡啶在MeOH中的溶液中。重复这一操作10次。合并经HPLC(C18，梯度，60/40/0.1 CH₃CN/H₂O/TFA到90/10/0.1CH₃CN/H₂O/TFA,210nm,1mL/min,4.6mm×250mm柱)正实含有肽的滤液并浓缩。将浓缩物溶解在40mL 10％HOAc溶液中，经HPLC纯化，产生0.528g(49％)肽20。将肽20转化成环状肽21(除去FMOC基，环化和除去保护基)：

将99μL DBU在10mL CH₃CN中的溶液(5mL)添加到96mg(0.052mmol)肽20中。搅拌溶液1小时，浓缩成残渣。将该残渣与2×10mL Et₂O一起研磨，产生白色固体。将该固体溶解在100mL CH₃CN和312μL(0.312mmol)0.1M二苯基磷酰基叠氮化物(DPPA)在CH₃CN中的溶液中。将混合物搅拌20小时，并在旋转蒸发器上浓缩。将该残渣与2×50mL Et₂O一起研磨，白色的不透明残渣用5mL 92/3/2/3 TFA/茴香醚/EDT/Me₂S处理1小时。通过将混合物加入到在50mL聚丙烯离心管中的40mL Et₂O中沉淀产物。将沉淀冷却至0℃，在2000rpm下离心5分钟。倾析上清液，用Et₂O洗涤沉淀并再离心。干燥沉淀并溶解在4mL 50/50 CH₃CN/H₂O中。用36mL H₂O/0.1％TFA稀释混合物，经HPLC(1＂C18柱，梯度，10/90/0.1 CH₃CN/H₂O/TFA到35/65/0.1 CH₃CN/H₂O/TFA,230nm)纯化。冷冻干燥经HPLC证实的纯化的组分，产生52 mg(90％)化合物21。实施例13:LJP 685缀合物的合成

用3-三苯甲基巯基丙酸PNP酯处理LJP 685(也称为化合物21)，将产生的产物脱三苯甲基化，产生化合物22，具有游离硫醇接头的肽。过量化合物22与效价平台分子12的反应产生四价的缀合物25。用较长的接头，化合物33(参见以下反应方案)处理化合物21，接着脱三苯甲基产生化合物24。化合物24与效价平台分子12反应产生四缀合物26。通过HPLC，两种缀合反应看来非常清楚。将MTU接头连接到LJP685上，合成化合物24：

向15mg(0.013mmol)化合物21中加入160μL 29.5mg化合物23的溶液和17.5μL在0.5mL DMF中的二异丙基乙胺的溶液。将混合物搅拌2小时，并从Et₂O中沉淀。干燥沉淀并溶解在650μL1/1/0.056/0.040TFA/CH₂C1₂/苯硫酚/Me₂S溶液中，使溶液静置1小时。从Et₂O沉淀，产生粗化合物24，经HPLC(C₁₈,15-45％CH₃CN/H₂O,0.1％TFA)纯化。将含有纯化的产物的组分冷干，产生8.6mg化合物24白色固体。LJP 685-MTU-AHAB-TEG，化合物26:

向8.6mg(6.3×10^-6mol)化合物24在630μL He吹洗的pH8.5 200mM硼酸盐缓冲液中的溶液中加入40μL 40mg/mL化合物12在9/1MeOH/H₂O中的溶液，搅拌混合物24小时，加入1mL 10％HOAc/H₂O溶液，经HPLC(C₁₈，梯度25-55％CH₃CN/H₂O,0.1％TFA)纯化混合物，产生8.3mg化合物26(LJP 685-MTU-AHAB-TEG)。实施例14：展开延伸的SH接头

从化合物27制备硫代苯甲酸酯，化合物28。将化合物28部分转化成化合物29。经乙醇解除去硫代苯甲酸酯，将形成的硫醇三苯甲基化。然后水解乙基醚，产生化合物29。从化合物29制备硝基苯基磷酸(PNP)酯，化合物30。通过用叠氮化钠处理化合物27并还原成胺制备氨基十一烷酸乙基酯，化合物31，用化合物30使胺31酰基化，产生化合物32。通过用氢氧化钠处理进行化合物32的水解，产生游离的羧酸。用对硝基苯酚缩合中间体羧酸，产生对硝基苯基(PNP)酯，化合物33。将接头33连接到肽上，除去三苯甲基，产生化合物34，其用于产生MTU-ATU-AHAB-TEG缀合物。

实施例15：合成(LJP685)4/MTU-ATU-AHAB-TEG缀合物，化合物35

如下所示制备四价缀合物35。将具有连接的接头的肽(化合物34)溶解在He吹洗的(pH8.5)200mM硼酸盐缓冲液中，向混合物中加入0.3mol当量的平台化合物12。将混合物搅拌1小时，经HPLC纯化产物。

实施例16：合成(LJP685)4/DABA-PEG缀合物，化合物36

用在8.5硼酸盐缓冲液中的化合物24处理IA-DABA-PEG产生缀合物36。

实施例17：T细胞活化测定

在96孔圆底平板中监测肽-刺激T细胞对三苯甲基化胸腺嘧啶核苷的摄取。将消耗淋巴结细胞(小鼠)或分离的外围血淋巴细胞(人)的单-细胞悬液5×10⁵以每孔150μL终体积与1和30μg之间的肽混合，在5％二氧化碳中于37℃下培养5天。培养结束时加入1微居里标记的胸腺嘧啶核苷，并培养另外的15-24小时。将收获的细胞收集在滤器上，由液态闪烁光谱测定法计数。实施例18：耐受性的体外诱导

8组(每组包含5只C57B1/6只小鼠)用10μg/小鼠在明矾上的LJP685-KLH缀合物加作为佐剂的百日咳巴尔通氏体(B.pertussis)疫苗致敏。在3周之后，收获脾并制备单细胞悬液，用平衡盐溶液洗涤3次，以等同于1个脾/1.5mL培养基的浓度重悬于完全RPMI-1640培养基中。将细胞悬液分成2.5mL/培养皿的等分试样，在37℃以100μM、20μM和4μM浓度与(LJP685)₄-DABA-PEG(化合物36)和(LJP685)₄-TEG(化合物35)一起培养2小时。一组细胞在没有耐受原存在下培养，作为阳性对照。然后用大体积的平衡盐溶液洗涤细胞，并重悬于2.5mL平衡盐溶液中。接着将细胞注射进650R放射同系(syngeneic)受体小鼠，使得所有来源于给定处理组的细胞平等地分成5组受体。用10μg盐水中的LJP 685-KLH腹膜内加强免疫包括阳性对照在内的所有受体小鼠。在加强免疫后七天，对小鼠放血，其血清用于试验抗LJP 685抗体的存在。用两种缀合物处理产生如图16和图17所示的抗LJP 685抗体的明显剂量依赖性降低，其是通过如Iverson,G.M.，在试验免疫学手册，第二卷，细胞免疫学中的＂体内过继免疫反应测定＂(Weir,D.M.,ed.,Blackwell科学出版社，Pale Alto,CA,1986)中所描述的抗原结合能力(ABC)测定的。实施例19:5A12、CB2和3G3肽的NMR溶液结构分析

对利用以上实施例中所描述的方法从噬菌体文库筛选分离的两种肽进行NMR分析。原来的肽在倒数第二位有脯氨酸，而这一氨基酸被除去，因为二维(2D)双量子滤过相关光谱学(DQF-COSY)NMR数据表明两个在这一位置上的不同于顺式和反式异构体的结构。除去脯氨酸给出具有结合ACA抗体的在50-100nM范围内的K’_D和在DQF-COSY谱指纹区中预期数目的峰的肽。所形成的环状肽是5A12(GPCLILAPDRCG)和CB2(GPCILLARDRCG)。所述肽之间的主要区别是8位上脯氨酸取代精氨酸，其导致CB2(与5A12是刚性更强的肽是一致的)的1D¹H NMR谱中少得多的分散。精氨酸取代也产生pKa值所反映的离子化天冬氨酰基羧基的0.55kcal/mol稳定化。在更加规则的5A12肽上进行结构分析。尽管重氢交换和温度系数数据显示没有氢键合的证据，但核欧沃毫斯效应(NOE)、旋转欧沃毫斯效应(ROE)和连接数据是与一个结构一致的。距离几何学计算给出50个结构的家族。15个最好的具有2.1±0.2埃的所有原子的平均根平均平方偏差(RMSD)。我们确定,所说的肽具有椭圆形，在分子相对的端、二硫化物和脯氨酸8(其是顺式的)处有转角。在骨架LIL区中也有结。最后，羧基末端甘氨酸是非常易变的，因为其是具有阳性内残基NOE的仅有的残基。这代表有关肽(其模仿在β₂-GPI上的ACA表位)的所确定的第一结构信息。

与距离几何学计算相联系的NMR数据用来确定肽925(CLGVLAKLC)、具有在肽925的6位丙氨酸取代甘氨酸的截短的肽3G3(AGPCLGVLGKLCPG)的三维结构。于25℃pH3.8下在水中测定肽925的结构。计算了全部9个结构，所有的均与NMR数据一致。当每一结构与质心比较时，所有非氢原子的RMSD是2.45±0.36埃。图18显示最接近质心的结构，因此是肽925分子形状的合理的代表。图19将肽925的结构(在图的底部标记为3G3)与肽5A12的结构进行了比较。在肽序列中两种肽大约在相同的位置具有转角。

肽的药效基团已被暂时鉴定为小的疏基团和带正电荷的基团。肽925的偕二甲基和氨基已被暂时鉴定为这一肽的药效基团，如图20所示。限制药效基团在某些支架上的碳氢化合物接头具有图20限定的长度，这些接头连接到支架上的位点由限定的距离分开。最后，限定两种接头相对取向的两面角被确定为22°。

实施例20:TEG氨基甲酸酯接头的合成

2-[2-(2-叔-丁基硫代乙氧基)乙氧基]乙醇，化合物38:

在2-[2-(2-氯代乙氧基)乙氧基]乙醇(11.0g,65.24mmol)和叔丁基硫醇(7.35mL,65.23mmol)的混合物(在冰浴中冷却)中缓慢加入1,8-二氮杂二环[5.40]十一-7-碳烯(DBU,9.75mL,65.23mmol)。将反应混合物温暖至室温，并且搅拌一夜。然后用乙酸乙酯稀释这一混合物，并过滤之。在用乙酸乙酯洗脱过的过滤柱上纯化滤液中的粗产物以给出淡黄色油(14.4g,64.6mmol,99％):¹H NMR(300Mhz,CDCl₃):d 3.73(brs,2H),3.69-3.60(m,8H,2.75(t,J=7.4,2H),2.62(brs,1H),1.32(s,9H)；¹³C NMR(75 Mhz,CDCl₃):d 72.47,71.08,70.33,70.27,61.71,42.09,30.95,27.87；MS(ESI):m/e(M+1)C₁₀H₂₃O₃S的计算值：223，观测值：223。2-[2-(2-叔-丁基硫代乙氧基)乙氧基]乙基对硝基苯基碳酸酯，化合物39:

在化合物38(2.0g,8.98mmol)和对硝基苯酚氯甲酸酯(1.81g,8.98mmol)的溶液(在5mL干THF中，在冰浴中冷却)中缓慢加入在1mL干THF中的无水吡啶(0.73mL,8.98mmol)。立即形成白色沉淀。在室温下搅拌15分钟之后，用10mL乙醚稀释反应混合物，并过滤之。浓缩滤液并将其直接用于肽合成而无须进一步纯化。实施例21：四价平台IA/DABA/ATEG 46的合成双-N-(叔-丁氧基碳酰)-二氨基苯甲酸，化合物40：

在3,5-二氨基苯甲酸(2.5g,16.4mmol)和NaHCO₃(2.76g,32.9mmol)的溶液(在44.5mL水和22.5mL MeOH中)中缓慢加入在5.5mLMeOH中的二叔丁基重碳酸酯溶液(7.18g,32.9mmol)，并在室温下搅拌该混合物24小时。将混合物冷却至0℃，并加入6.53g柠檬酸，然后用EtOAc提取混合物。干燥(MgSO₄)合并的EtOAc层，过滤之，并浓缩之。将残余物溶解在40mL Et₂O中，并通过Celite过滤溶液。用两份各40mL的HCl提取该Et₂O层。干燥(MgSO₄)、过滤和浓缩该Et₂O层从而给出3.81g(66％)的化合物40(为泡沫状的粉红色固体)。化合物40的N-羟基琥珀酰亚胺基酯，化合物41：

在化合物40(3.8g,10.8mmol)和N-羟基琥珀酰亚胺(1.24g,10.8mmol)的溶液(在55mL EtOAc中，已冷却至0℃)中，加入二环乙基碳化二亚胺(3.34g,16.2mmol)，并在使所产生的混合物升至室温的过程中将其搅拌18小时。在混合物中加入0.55mL乙酸。搅拌混合物30分钟，并将其放置在冷冻器中冻结2小时。过滤混合物以除去固体，并浓缩滤液以给出5.80g的粉红色的泡沫状固体。硅胶色谱(60/40/1己烷/EtOAc/HOAc)的纯化给出4.30g(89％)的化合物41(为淡粉红色固体)。单-N-(叔丁氧基碳酰)-乙二胺，化合物42：

将1.5g(25.0mmol)乙二胺溶液(在15mL CH₂Cl₂中)冷却至0℃，并在该混合物中缓慢加入1.82g(8.33mmol)的二叔丁基重碳酸酯溶液。在室温下搅拌该混合物18小时并过滤之，然后浓缩滤液。硅胶色谱(90/10/1CH₂Cl₂/MeOH/HOAc)的纯化给出0.98g(67％)的化合物42(为油状物)。双-N-(叔丁氧基碳酰)-氨基-TEG，化合物43：

在750mg(4.25mmol)化合物42和345μL(337mg,4.25mmol)吡啶的溶液(在6mL CH₂Cl₂中)中，加入445μL(559mg,2.02mmol)三甘醇二氯甲酸酯。搅拌该化合物3.5小时，并在35mL CH₂Cl₂和35mL 1N HCl之间分配该混合物。用水洗涤CH₂Cl₂层，干燥(NaSO₄)、过滤并浓缩之，从而给出1.14g的直接用于下一步的粗化合物43。二氨基-TEG双三氟乙酸盐，化合物44：

将300mg(0.57mmol)的化合物43溶解于3.5g CH₂Cl₂中，并加入3.5mL三氟乙酸。在室温下搅拌混合物3小时，并浓缩溶液以给出398mg的直接用于下一步的粗化合物44。化合物45：

在398mg粗化合物44(估计为316mg,0.57mmol)和193mg(2.30mmol)NaHCO₃的溶液中，加入在6mL二噁烷中的化合物41(567mg)的溶液。搅拌混合物3小时，并用1N HCl酸化之，并且在20mL 1N HCL和30mL EtOAc之间分配之。用饱和NaHCO₃溶液洗涤合并的EtOAc层，干燥(MgSO₄)、过滤并浓缩之以给出490mg(86％)的粗化合物45(为白色的泡沫状固体)。硅胶色谱(EtOAc)的纯化给出276mg(48％)的化合物45(为白色的泡沫状固体)。IA/DABA/ATEG，化合物46：

制备100 mg(0.1mmol)的化合物45溶液，并加入1mL三氯乙酸，同时在室温下搅拌混合物1小时。在真空下浓缩混合物。用Et₂O研制残余物，并在真空下干燥之以给出一种白色的晶状固体。用1mL DMF溶解该固体，加入104μL(77mg,0.6 mmol)二异丙基乙胺，将混合物冷却至0℃，并加入212mg(0.6mmol)的碘乙酸酐。移去冰浴，并在室温下搅拌该混合物2小时。将混合物冷却至0℃，用1N H₂SO₄酸化之，并在10ml 1N H₂SO₄和6×20mL部分的8/2 CH₂Cl₂/MeOH之间分配之。干燥(MgSO₄)、过滤并浓缩合并的有机层以给出330 mg的橙色油状物。制备HPLC(25cm×22.4mM C₁₈，梯度：30％B至40％B 0-40分钟。A=H₂O/0.1％TFA。B=CH₃CN/0.1％TFA,12 mL/分钟)的纯化给出19mg的化合物46(为白色固体)。

实施例22：四价平台BA/PABA/DT/TEG,51的合成N-(叔丁氧基碳酰)PABA，化合物47：

制备3.0g(21.9mmol)的在60mL水中的对氨基苯甲酸溶液。缓慢加入Na₂CO₃(2.16g,25.7mmol)，随后加入30mL MeOH。当所有固体都溶解时，加入4.77g(21.9mmol)二叔丁基重碳酸酯(在10mL MeOH中)，并在室温下搅拌18小时。在上述混合物中加入4.92g(25.6mmol)柠檬酸，并将所产生的混浊的混合物分配在200mL水和200mL EtOAc之间。用200mL 0.1N HCl和200mL水连续洗涤EtOAc层，干燥(Na₂SO₄)、过滤并浓缩之从而产生3.0g(58％)的化合物47(为白色固体)。N-(叔丁氧基碳酰)PABA N-羟基琥珀酰亚胺基酯，化合物48：

在2.0g(8.43mmol)化合物47和0.97g(8.43mmol)N-羟基琥珀酰亚胺的0℃溶液(在50mL EtOAc中)中，加入DCC(2.61g,12.6mmol)。移去冰浴，在室温下搅拌混合物16小时，并加入0.5mL乙酸。搅拌混合物附加的30分钟，在冷冻器中放置1.5小时，过滤并浓缩之从而给出3.75g粗化合物48。硅胶层析(50/50己烷/EtOAc)的纯化给出2.53g(90％)的化合物48(为白色固体)。化合物49：

在485μL的二亚乙基三胺溶液(在30μL CH₂Cl₂中，已在冰浴中冷却)中，滴加入3.00g(8.97mmol)的化合物48(在50mL CH₂Cl₂中)，历时30分钟。在5-7℃下搅拌混合物30分钟，然后在室温下搅拌16小时。用200mL水将牛奶状混合物放置在分液漏斗中，用3M NaOH溶液将水层的pH值调整至10，并用200mL 4/1 CH₃Cl/MeOH提取该混合物。干燥(Na₂SO₄)有机层，并浓缩之从而给出0.971g(40％)的化合物49，该化合物纯得足以用于以下步骤。用六份各100mL的4/1 CH₃Cl/MeOH提取含水层。合并有机层，干燥(Na₂SO₄)并浓缩之从而给出另一个1.08g(44％)的化合物49，该化合物需要进一步纯化。由硅胶色谱(梯度，80/20-70/30CH₃Cl/MeOH)实现进一步纯化。化合物50：

在855mg(1.58mmol)化合物49和275μL(1.mmol)二异丙基乙胺的0℃溶液(在13mL THF中)中，加入135μL(0.66mmol)三甘醇双氯甲酸酯溶液(在0.3mL THF中)。当移去冰浴时，混浊的混合物变清。再加入70μL二异丙基乙胺以便保持碱性pH。在室温下搅拌混合物共3小时，并将其分配在25mL水和25mL EtOAc之间.用第二份25mL的EtOAc提取含水层，并干燥(Na₂CO₃)、过滤和浓缩合并的EtOAc层，从而给出0.986 g的粗化合物50。硅胶色谱(80/4/16 CH₃Cl/二噁烷/异丙醇)的纯化给出516 mg(61％)的化合物50(为一种白色固体)。制备BA/PABA/DT/TEG，化合物51：

将化合物50(487mg,8.79mmol)溶解在9mL CH₂Cl₂和5mL三氟乙酸中。搅拌混合物1.5小时并浓缩之。用7ml Et₂O研制残余物，并将其溶解在5mL MeOH和1mL 48％HBr溶液中。浓缩混合物并将其放置在真空下直到干燥。将所产生的HBr盐溶解在10mL水中，并加入191mg(2.27mmol)NaHCO₃。将591mg(2.27mmol)的溴乙酸酐溶液(在10mL二噁烷中)加入至混合物中。再用2mL二噁烷来冲洗。需要时加入更多的NaHCO₃以保持碱性pH。在室温搅拌混合物2小时，并用1N H₂SO₄酸化之。用3×25mL EtOAc提取混合物。干燥(Na₂SO₄)合并的EtOAc层，过滤并浓缩之，从而给出773mg的油状物。由硅胶色谱(梯度，90/10-85/15CH₃Cl/MeOH)实现纯化，从而给出401mg(77％)的化合物51(为一种白色固体)。

实施例23：四价平台BMP/TEG,55的合成二甲基-5-羟基异邻苯二甲酸酯，化合物52：

将2.00g(11mmol)5-羟基异邻苯二甲酸和0.5mL浓盐酸的溶液(在30mL MeOH中)回流5小时。浓缩混合物，并将所产生的残余物溶解在100mL EtOAC中。用两份各50mL的5％NaHCO₃溶液和两份各50mL的NaCl溶液连续洗涤上述EtOAc溶液，干燥(Na₂CO₃)、过滤并浓缩之，从而给出2.09g(90％)的化合物52(为一种白色结晶固体)。化合物53：

在500mg(2.38mmol)化合物52和395mg(2.86mmol)K₂CO₃的悬浮液(在11mL CH₃CN中)中，加入546mg(1.19mmol)三甘醇二甲苯磺酸酯并在N₂下回流该混合物16小时。浓缩混合物，并将残余物溶解在25mLCHCl₃中，然后用25mL水和25mL饱和NaCl溶液洗涤之。干燥(Na₂SO₄)、过滤并浓缩CHCl₃层。硅胶色谱(梯度，50/50己烷/EtOAc-100％EtoAc)的纯化给出93 mg(41％)的化合物53。化合物54：

1.82mL(1.82mmol)1M LiBHEt₃溶液滴加入混合物时，在N₂气氛下搅拌在4mL THF中的93mg(0.18mmol)化合物53的悬浮液。获得一种清亮的溶液，该溶液搅拌了18小时，搅拌的同时加入10％HOAc水溶液直到pH呈酸性。在真空下浓缩混合物，并将残余物溶解在10mL水中。用3×10mL部分的EtOAc提取混合物，并干燥(Na₂SO₄)、过滤和浓缩合并的EtOAc层。由硅胶色谱(梯度，90/10-85/15 CH₃Cl/MeOH)实现纯化，从而给出20mg(27％)的化合物54(为一种白色固体)。化合物55：

在20mg(0.048mmol)化合物54的悬浮液(在5mL Et₂O和1mL THF中)中，加入9.6μL(0.1mmol)PBr₃。搅拌混合物3小时，并将其分配在水和EtOAc之间。干燥(Na₂SO₄)EtOAc层，过滤和浓缩之，并由硅胶色谱(CH₃Cl/MeOH)纯化残余物，从而提供了化合物55。实施例24：四价平台BA/PIZ/IDA/TEG,60的合成化合物56：

在1.02g(4.37mmol)N-(叔-丁氧基碳酰)-亚氨基二乙酸(该化合物5在美国专利5,552,391，“化学限定的非聚合价平台分子及其缀合物”中)和1.01g(8.75mmol)N-羟基琥珀酰亚胺的溶液(在50mL的干THF中，冷却至0℃)中，加入2.26g(10.94mmol)二环己基碳化二亚胺。在缓慢温暖至室温的过程中，搅拌混合物16小时。并在混合物中加入2.22g(10.1mmol)单-CBZ-哌嗪(在25mL THF中)，随后加入1.22mL(887mg,8.75mmol)Et₃N。在室温下搅拌混合物7小时，并过滤之。浓缩滤液，并将残余物溶解在125mL EtOAc中，同时与2×125mL部分的1N HCl和125mL的饱和NaHCO₃溶液一起振荡，干燥(MgSO₄)、过滤并浓缩所得产物，从而给出2.39 g的粘性固体。硅胶层析(95/5；CH₂Cl₂/MeOH)的纯化给出1.85g(66％)的化合物56。化合物57：

在1.74g(2.74mmol)化合物56的溶液(在10mL CH₂Cl₂中)中，加入10mL三氟乙酸，并在室温下搅拌混合物3小时。浓缩混合物，并将残余物溶解在5mL CH₂Cl₂中。将混合物冷却至0℃并加入100mL饱和NaHCO₃。然后用四份各100mL的CH₂Cl₂提取混合物。合并CH₂Cl₂层，干燥(MgSO₄)、过滤并浓缩之，从而给出1.46g(99％)的化合物57(为一种粘性吸湿固体)，其直接用于下一步。化合物58：

在0.7g(1.3mmol)化合物57和226μL(168mg,1.30mmol)二异丙基乙胺的0℃溶液中，加入127μL三甘醇双氯甲酸酯溶液(在4 mL CH₂Cl₂中)，并在室温下搅拌混合物3小时。将混合物分配在80mL CH₂Cl₂和80mL 1N HCl之间。用两份各80mL的水洗涤CH₂Cl₂层，干燥(MgSO₄)、过滤并浓缩之，从而给出736 mg(93％)的化合物58(为结晶固体)。化合物60：

将化合物58(61mg,0.48mmol)溶解在3mL 30％HBr/HOAc中，并在室温下搅拌所产生的混合物1小时，其时加入5mL Et₂O。在冰箱中放置混合物1小时并离心之。用Et₂O洗涤所产生的沉淀并干燥之，从而给出四氢溴化物盐59，该化合物被溶解在1mL水中。在混合物中加入49mg(0.58mmol)NaHCO₃和3mL二噁烷。如果需要的话，加入更多的NaHCO₃以产生碱性混合物。将混合物冷却至0℃，并加入748mg(2.89mmol)溴乙酸酐。搅拌混合物2小时，并将其分配在20mL 1N H₂SO₄和20mL 80/20CH₂Cl₂/MeOH之间。干燥(Na₂SO₄)有机层，过滤并浓缩之，从而给出粗化合物60，该化合物由硅胶色谱(CH₂Cl₂/MeOH)纯化以给出化合物60。

实施例25：四价平台四-BAIPIZ/PMA,63的合成化合物61：

在640mg(2.52mmol)1,2,4,5-苯四酸和1.16g(10.1mmol)N-羟基琥珀酰亚胺的0℃溶液(在50mL THF中)中，加入2.6g(12.6mmol)二环己基碳化二亚胺，并将混合物升至室温，其时搅拌16小时。在混合物中加入2.5g(11.3mmol)单-CBZ-哌嗪的溶液(在25mL THF中)，其后加入1.4mL(1.02g,10.1mmol)Et₃N。过滤混合物，并浓缩滤液。将残余物分配在100mL EtOAc和2×100mL 1N HCL之间，并用100mL饱和NaHCO₃、100mL水、100mL饱和NaHCO₃洗涤EtOAc层，干燥(MgSO₄)、过滤并浓缩之。由硅胶色谱(97.5/2.5 CH₂Cl₂/MeOH)实现纯化以给出1.78g(66％)的化合物61(为白色结晶固体)。化合物63：

以本质上与上述把58转化成60相似的方法(在实施例23中)将化合物61转变成化合物63，利用硅胶色谱实现纯化。实施例26：四价平台BA/PIZ/IDA/HB/TEG,68的合成化合物64：

在725mg(4.36mmol)4-羟基苯甲酸乙酯和723mg(5.23mmol)K₂CO₃的溶液中，加入三甘醇二甲苯磺酸酯(1.0g,2.18mmol)，并回流该混合物16小时。浓缩该混合物，并将残余物分配在20mL水和3×20mLEt₂O之间，用2×40mL饱和NaHCO₃溶液、40mL饱和NaCl溶液洗涤合并的有机层。用Et₂O洗涤含水层，干燥(MgSO₄)合并的Et₂O层，过滤并浓缩之。硅胶色谱(70/30己烷/EtOAc)的纯化给出902 mg(93％)的化合物64(为结晶固体)。化合物65：

将化合物64溶解在包含2.2当量LiOH的丙酮中，并搅拌混合物3小时(直到为TLC所证明的完全溶解)。以乙酸酸化混合物并浓缩之，并且由硅胶色谱纯化残余物以给出化合物65。化合物66：

以与实施例23中的制备化合物56的同样的方法制备化合物66。用化合物65代替N-BOC-亚氨基二乙酸，并用化合物57代替单-CBZ-哌嗪。利用硅胶层析实现纯化。化合物68：

以本质上与实施例23所描述的把化合物58转化成化合物60相同的方法，将化合物66转化成化合物68。利用硅胶层析实现纯化。

实施例27：四价平台BA/PIZ/HIP/TEG,72的合成化合物69：

以本质上与实施例25所描述的水解化合物64相同的方法(例外情况是利用4.4当量的LiOH)，用LiOH水解化合物53。化合物70：

以本质上与实施例24所描述的把1,2,4,5-苯四酸转化成化合物61相同的方法(例外情况是利用化合物69代替1,2,4,5-苯四酸)，将四酸(化合物69)转化成化合物70。化合物72：

以本质上与实施例23所描述的把化合物58转化成化合物60相同的方法，将化合物70转化成化合物72。利用硅胶色谱实现纯化。

实施例28：因乙酰化的四价化合物的缀合物的合成

(LJP685)4/MTU/A/DABA/ATEG缀合物，化合物73的合成：

在He吹洗的pH 8.5 200mM硼酸盐缓冲液中，制备21mg(15.5μmol)化合物24的溶液。在该溶液中加入包含3.25mg(2.6μmol)IA/DABA/ATEG(化合物46，溶解在396μL MeOH中)的第二种溶液。形成沉淀，并加入1mL MeOH以溶解所有固体。在室温下搅拌混合物18小时，并加入6mL 9/1水/HOAc。以50mL水/CH₃CN稀释混合物，并将其装载在HPLC制备柱上。由制备HPLC(25cm×22.4mm C₁₈。梯度：35％B-40％B 0-40分钟。A=水/0.1％TFA,B=CH₃CN/0.1％TFA,12mL/分钟)实现纯化以提供10.8mg(67％)的化合物73(在冷冻干燥之后为固体)。

合成(LJP685)₄/MTU缀合物，化合物74、75、76、77和78：

利用与上述用于合成(通过用适当平台化合物替代平台化合物46)化合物73相同的反应条件，分别由化合物51、60、63、68和72制备这些缀合物。制备物可以是LJP685或者其它有关肽。

实施例29：合成四价平台55缀合物，缀合物79,(LJP685)₄/MP/TEG：

在DMF中制备四当量化合物24和五当量Cs₂C₃的溶液。在混合物中加入一当量BMP/TEG，平台化合物55，并搅拌1小时。以80/20/10水/CH₃CN/HOAc稀释混合物，并将其装载在制备HPLC柱上。由制备HPLC(C₁₈,A=H₂O/0.1％TFA,B=CH₃CN/0.1％TFA)实现纯化以在冷冻干燥之后给出化合物79。制备物可以是LJP685或者其它有关肽。

实施例30：合成缀合物四价平台四-BMB，缀合物80,(LJP685)₄/MTU/

四-MB：

在DMF中制备四当量化合物24和五当量Cs₂C₃的溶液。在混合物中加入一当量四-溴甲基苯，然后将其搅拌1小时。以80/20/10水/CH₃CN/HOAc稀释混合物，并将其装载在制备HPLC柱上。由制备HPLC(C₁₈,A=H₂O/0.1％TFA,B=CH₃CN/0.1％TFA)实现纯化以在冷冻干燥之后给出化合物80。制备物可以是LJP685或者其它有关肽。

实施例30:FITC-GPCILLARDRCG(CB2^*)的荧光极化肽结合测定合成

在室温下搅拌环状二硫化物肽GPCILLARDRCG(20.0mg,14.4μmol)和荧光素异硫氰酸酯(FITC)(5.6mg,14.4μmol)的溶液(在20mLACN/水中，包含20 mg碳酸钠(Na₂CO₃,pH约为10.5)。由分析HPLC监控反应。在消耗荧光标记试剂之后，在以10mL/分钟洗脱的制备HPLC(具有30至50％B的线性梯度，历时40分钟，其中A是在水中的0.1％(v/v)TFA,B是在CAN中的0.085％(v/v)TFA)上纯化粗产物。在冻干之后获得一种亮黄色的FITC肽粉末(3.7mg,15％产率)：MS(ESI):m/e(M+1)对于C₇₃H₁₀₂N₁₉O₂₀S₃的计算值为1661，观测值为1661。直接结合荧光极化结合测定(dbFP)

该方法描述在PanVera应用指南(1994,PanVera公司)中。简言之，以抗体(ACA 6501或者6701)滴定痕量荧光素异硫氰酸酯(FITC)标记的肽(CB2^*-F)，并将样品的极化与抗体浓度绘制成图。用Pan Vera Beacon仪器测量极化。该数据适应于公式1。公式1

Y = \frac{[P_{L}^{*} (K_{D} / R) + P_{H}]}{K_{D} / R + 1.0}

其中Y是Y轴值(毫极化单位，mP),R是抗体受体的总浓度，P_L是游离FITC标记的肽(F)的极化，P_H是与R复合的F(FR)的极化，K_D是F(来源与FR复合体)的离解常数(对偶结合常数)。为使这些公式有效，F＜＜R必须是真的。对于分别与ACA-6701和ACA-6501抗体结合的CB2^*-F，这一滴定分别显示在图22和23中。如图23所示，用ACA-6501没有获得完全的滴定，但是显示在图24中的以前的滴定给出241nM的K_D。通过加入稍比抗体6701多的CB2^*(GPCILLARDRCG)以从6701中置换出CB2^*-F，测得CB2^*-F的离解速度常数为K_off=0.0184秒^-1(其对应于t_1/2=38秒)。假如K_D为256nM，那么这对应于离解速度常数为K_on=3.6×10⁴M^-1秒^-1(在校正为抗体双价之后)。因此，结合到ACA-6701上的CB2^*-F只受这两个分子的共同扩散作用限制。竞争荧光极化测定(cFP)

上述的dbFP测定提供了FITC标记的肽的结合常数，并需要约为0.5mg的纯化的抗体。cFP测定提供了缺乏FITC基团的肽的结合常数，并且它只消耗很少的抗体(大约10μg)。cFP测定由在Pan Vera应用指南(1994,PanVera公司)中报道的测定方法修改得到，因此它消耗少50倍的抗体。简言之，将抗体(ACA-6701)与痕量FITC标记的肽(CB2^*-F)混合，用足够时间使之达到平衡。对于ACA6701和CB2^*-F，这需要1小时。然后在管中加入逐渐增加浓度的所检验的未标记的肽(CB2^*或者3B10)。在每一次加入之后，用足够时间(大约15分钟)使之达到平衡，并读取mP值。虽然需要选择6701和CB2^*-F(F)的浓度以便达到F＜＜R，但是R的浓度只需要高到足以使所测量的极化(P_H)明显比P_L高(参见图22)。这一△(mP)值应该是20或者更多个mP单位以确保获得可靠的结果。公式2 △(mP)=P_H-P₁

当加入未标记的(无FITC的)肽(I)以抑制F与R的结合时，Y从它的最大值P_H降至平顶值P_L，这与公式1一致。对于分别为CB2^*和3B10所置换的来源于ACA-6701的CB2^*-F，这些滴定分别显示在图26和27中。得到描述这一滴定的公式，其如下所示：公式3

Y = \frac{P_{H}^{'} + P_{L}^{*} (I / K_{1}^{'})}{I / K_{L}^{'} + 1.0}

其中，P_L如同公式中的P_L一样，I是未标记的肽竞争剂的浓度，K₁’是该肽的表观离解常数。通过将cFP滴定数据代入上述公式得到这些参数的值。

I的真实离解常数得自公式4。公式4 K₁=K₁’/(1.0+R/K_D)其中，R和K_D如公式1所定义。R/K_D利用公式5得自P_H’(来源于公式3)以及P_H和P_L(来源于公式1)的值。公式5 R/K_D=(P_H’-P_L)/(P_H-p_H’)

一般来说，一旦由公式1所定义的滴定得到标准曲线，那么公式5就可用来确定aPL抗体浓度。因此。除为确定K₁提供一种手段外，这一方法还提供了使所有aPL抗体储备液浓度标准化的一种手段以及分析(每个cFP测定在整个时间只利用5-10μg抗体)它们的结合活性/稳定性的一种手段。

由dbFP和cEP确定的离解常数肽抗体序列 K_D ^a或K_ICB2^*-F 6501 FITC- 482nM^a

GPCILLARDRCGCB2^*-F 6701 FITC- 512nM^a

GPCILLARDRCGCB2^* 6701 GPCILLARDRCG 35nM3B10 6701 AGPCLLLAPDRCPG 313nM^aK_D值已乘以2以校正由公式1确定的在二价抗体中没有乘以因子的K_D值。

结果表明：CB2^*-F与两种极为不同的aPL抗体ACA-6501和ACA-6701进行交叉反应，并以相等的高亲和性与两种抗体结合。FITC基团的除去使CB2^*与ACA-6701的结合能力提高14倍。有关肽3B10与ACA-6701的结合能力比CR2^*与ACA-6701的结合能力少9倍。而这一结果可能是因为在3B10上的附加的构架残余物所致，也可能是由于在CB2^*中的位置8的由脯氨酸对精氨酸的取代所致。5A12(一种类似于3B10的肽)的NMR结构的以前研究表明：位于转角位置的这一脯氨酸给出结构刚性。CB2是更具柔性的肽，它在此位置上有精氨酸。如同CB2一样的更具柔性的肽能够具有更强的交叉反应，因为它更容易调整它的形状以适合一个给定的抗体结合位点。在结合亲和性方面的药物刚性的含义已在Koehler等(251页，在药物设计中的分子模拟指导手册，学院出版社，N.Cohen编辑，1996)中讨论。实施例31：肽缀合物的耐受活性

两种含相同肽的不同缀合物，检验其体内诱导抗原特异性耐受性的能力。简言之，用连结于免疫原性载体匙孔血蓝蛋白(KLH)的肽免疫接种小鼠，以便产生肽特异性记忆B细胞。三周后，利用不同剂量的检验缀合物处理每组小鼠(每组5只)，其中一组小鼠不进行缀合物处理作为对照。五天后，以连结于KLH的肽加强免疫所有小鼠(包括对照组在内)，七天后，对所有小鼠取血样并利用一种改进的Farr测定来检测它们的血清的抗肽抗体。根据由G.M Iverson(“体内过继免疫反应的测定”，第Ⅱ卷，第67章，实验免疫学手册，Blackwell科学出版社，Weir等编辑，第4版，牛津大学，1986)所描述的方法计算每一个体血清样品的抗原结合量(ABC)。这些值随后用于确定一组中所有个体的平均值和标准差。

当缀合物之一引起耐受性时，另一种缀合物在检验的剂量范围之内并不抑制抗肽抗体。这一差别的最可能解释是后一种缀合物具有短的体内半寿期。为解决这一问题，使用在体内诱导耐受性并由此取消对半寿期的考虑的一种系统，并把细胞转移至扩散受体上。简言之，收获用连结于KLH的肽致敏的小鼠的脾细胞，并在37℃下在完全RPMI-1640培养基中用不同剂量的检验缀合物温育该脾细胞2小时。一组细胞不用耐受原培养，作为阳性对照。洗涤细胞，将其转移到扩散的同系受体上，并用连结于KLH的肽加强免疫。七天后，对所有小鼠取血样并化验其血清的抗肽抗体。当在体外模型中检验时，在体内模型中检验时不引起任何可检测耐受性的缀合物的确引起耐受性。这一结果支持了缀合物之间的差别是由于缀合物具有短的半寿期的假定。为了直接验证这一假说，在一延长的时段内通过植入渗透泵连续地施用缀合物。结果清楚地表明：这一缀合物引起耐受性，这发生在通过持续释放来施用的情况下而不是在以大丸剂施用的情况下，如图32所示。用体内模型检验(LJP685)4/MTU-AHAB-TEG的耐受活性

在明矾加作为佐剂的百日咳上用LJP-685-KLH致敏小鼠。三周后，用-定范围剂量的(LJP685)4/MTU-AHAB-TEG缀合物处理小鼠。不用缀合物处理的一组小鼠作为对照组。五天后，以10μg的LJP685-KLH加强免疫所有小鼠(包括对照组在内)，七天后，取小鼠血样。利用改进的上述Farr测定法来分析它们的血清的抗LJP685抗体。显示在图28中的结果表明：利用(LJP685)₄/MTU-AHAB-TEG缀合物的处理(在1至50 nmoles的剂量范围内)对抗LJP685反应没有任何可检测的效应。用体内模型检验(LJP685)₄/MTU-DABA-TEG的耐受性诱导

在明矾加百日咳上用LJP 685-KLH致敏小鼠。三周后，用5、10或者50 nmoles的(LJP685)₄/MTU-DABA-TEG缀合物处理小鼠。其中一组不用缀合物处理，作为对照组。五天后，以10μg的LJP685-KLH加强免疫所有小鼠(包括对照组在内)，七天后，取小鼠血样。利用改进的Farr测定法分析它们的血清的抗LJP685抗体。显示在图29中的结果表明：(LJP685)₄/MTU-DABA-TEG缀合物在体内模型中以5 nmoles的ED₅₀诱导耐受性。用体外模型检验(LJP685)₄/MTU-AHAB-TEG的耐受性诱导

收获用LJP685-KLH致敏3周的小鼠的脾细胞，在37℃下在完全RPMI-1640培养基中用4、20或者100μM的(LJP685)₄/MTU-AHAB-TEG缀合物培养该脾细胞2小时。其中一组不用耐受原培养，作为对照组。洗涤细胞，将其转移到扩散受体上，并以10μg的LJP685-KLH加强免疫。七天后，取小鼠血样，并利用改进的Farr测定法分析它们的血清的抗LJP685抗体。显示在图30中的结果清楚地表明：(LJP685)₄/MTU-AHAB-TEG缀合物可以引起耐受性，当其在体内模型中检验时达到IC₅₀＜4μM。用体外模型检验(LJP685)₄/MTU-AHAB-TEG的耐受性诱导

收获用LJP685-KLH致敏3周的小鼠的脾细胞，在37℃下在完全RPMI-1640培养基中用0.4、1.3或者4μM的(LJP685)₄/MTU-AHAB-TEG缀合物培养该脾细胞2小时。其中一组不用耐受原培养，作为对照组。洗涤细胞，将其转移到扩散受体上，并以10μg的LJP685-KLH加强免疫。七天后，取小鼠血样，并利用改进的Farr测定法分析它们的血清的抗LJP685抗体。显示在图31中的结果清楚地表明：(LJP685)₄/MTU-AHAB-TEG缀合物可以引起耐受性，当其在体内模型中检验时达到IC₅₀＜4μM。利用连续输送泵体内检验(LJP685)₄/MTU-AHAB-TEG缀合物的耐受性诱导

小鼠在明矾加百日咳上用LJP685-KLH致敏。三周后，将小鼠分成5组，每组五只小鼠。在第一天，一组用盐水丸剂处理，另一组用包含50 nmole(LJP685)₄/MTU-AHAB-TEG缀合物的丸剂处理。余下的三组用渗透泵植入。在一组中，泵用盐水充满，并以1μL/小时的速度释放3天。余下的两组接收装满(LJP685)₄/MTU-AHAB-TEG缀合物(50nmole)的泵。一组接收以1μL/小时的速度释放三天的泵，其它组接收以0.5μL/小时的速度释放七天的泵。在第5天，以外科手术移去释放三天的泵。在第七天，以10μg的LJP685-KLH加强免疫所有小鼠(包括对照组)。在第10天，以外科手术移去释放七天的泵。在第14天，取所有小鼠血样。利用改进的Farr测定法分析它们的血清的抗LJP685抗体。结果显示在图32中。用体内模型检验(LJP-肽)4/MTU-BMP-TEG缀合物的耐受性诱导

在明矾加百日咳上用LJP685-KLH致敏小鼠。三周后，用(LJP-肽)4/MTU-BMP-TEG缀合物处理小鼠，其中一组不用缀合物处理作为对照组。五天后，以10μg的肽-KLH加强免疫所有小鼠(包括对照组)，七天后，取小鼠血样。利用改进的Farr测定法加强免疫它们的血清的抗肽抗体。结果表明：在体内模型中，(LJP-肽)₄/MTU-BMP-TEG缀合物以等于或大于(LJP685)₄/MTU-AHAB-TEG缀合物的效力诱导耐受性。

Claims

1．一种aPL类似物，其特异性结合到B细胞上，aPL表位结合到所说的B细胞上。

2．权利要求1的类似物，其中所说的类似物缺少T细胞表位。

3．权利要求1的类似物，其中所说的类似物是肽。

4．权利要求3的类似物，其中所说的肽包括序列CLILAPDRC、CLILTPDRC、CLLLAPDRC、CTILTLDRC、CLVLALDRC、CTILTPDRC、CILLAHDRC、CGNAADARC、CTNWADPRC、CGNIADPRC、CTNLTDSRC、CGNPTDVRC、GILLNEFA、GILTIDNL、GILNALDYV、LSDPGYVRNIFH或LTDPRYTRDISNFTD。

5．权利要求3的肽类似物，其中所说的肽包括序列AGPCLGVLGKLCPG、GPCLGVLGKLCPG、PCLGVLGKLCPG、CLGVLGKLCPG、AGPCLGVLGKLCG、CLGVLGKLC、GPCILLARDRCG或AGPILLATDTCPG。

6．权利要求3的类似物，其中所说的肽含有至少一个脯氨酸，并且其中α-甲基脯氨酸取代了至少一个所说的脯氨酸。

7．权利要求3的类似物，其中D-氨基酸取代了至少一个L-氨基酸。

8．权利要求3的类似物，其中所说的肽是被二硫键环化的。

9．权利要求8的类似物，其中硫醚键取代了二硫键。

10．权利要求3的类似物，其中所说的肽包含至少一个亮氨酸，并且其中异亮氨酸取代了至少一个所说的亮氨酸。

11．一种诱导特异性B细胞耐受aPL免疫原的组合物，该组合物包含非免疫原性效价平台分子和aPL抗体结合类似物，所说的抗体结合类似物(a)特异性结合aPL免疫原结合于其上的B细胞和(b)缺少免疫原的T细胞表位。

12．权利要求11的组合物，其中所说的aPL抗体结合类似物是包含以下序列的肽：CLILAPDRC、CLILTPDRC、CLLLAPDRC、CTILTLDRC、CLVLALDRC、CTILTPDRC、CILLAHDRC、CGNAADARC、CTNWADPRC、CGNIADPRC、CTNLTDSRC、CGNPTDVRC、GILLNEFA、GILTIDNL、GILNALDYV、LSDPGYVRNIFH或LTDPRYTRDISNFTD。

13．权利要求11的组合物，其中所说的aPL抗体结合类似物是包含以下序列的肽：AGPCLGVLGKLCPG、GPCLGVLGKLCPG、PCLGVLGKLCPG、CLGVLGKLCPG、AGPCLGVLGKLCG、CLGVLGKLC、GPCILLARDRCG或5AGPILLARDRCPG。

14．权利要求11的组合物，其中所说的aPL抗体结合类似物是按照权利要求6的类似物。

15．权利要求11的组合物，其中所说的aPL抗体结合类似物是按照权利要求7的类似物。

16．权利要求11的组合物，其中所说的aPL抗体结合类似物是按照权利要求8的类似物。

17．权利要求11的组合物，其中所说的aPL抗体结合类似物是按照权利要求9的类似物。

18．权利要求11的组合物，其中所说的aPL抗体结合类似物是按照权利要求10的类似物。

19．权利要求11的组合物，其中所说的非免疫原性效价平台分子包括三甘醇。

20．权利要求19的组合物，其中所说的效价平台分子包括AHAB-TEG。

21．权利要求19的组合物，其中所说的效价平台分子包括化合物46,A-DABA-ATEG。

22．权利要求19的组合物，其中所说的效价平台分子包括化合物51,A-PABA-DT-TEG。

23．权利要求19的组合物，其中所说的效价平台分子化合物55,MP-TEG。

24．权利要求19的组合物，其中所说的效价平台分子包括化合物60,A-PIZ-IDA-TEG。

25．权利要求19的组合物，其中所说的效价平台分子包括化合物68,A-PIZ-IDA-HB-TEG。

26．权利要求19的组合物，其中所说的效价平台分子包括化合物72,A-PIZ-MP-TEG。

27．权利要求11的组合物，其中所说的非免疫原性效价平台分子包括聚乙二醇。

28．权利要求28的组合物，其中所说的效价平台分子包括DABA-PEG。

29．权利要求11的组合物，其中所说的非免疫原性效价平台分子包括四氨基苯。

30．权利要求11的组合物，其中所说的非免疫原性效价平台分子包括七氨基β-环糊精。

31．权利要求11的组合物，其中所说的非免疫原性效价平台分子包括四氨基季戊四醇。

32．权利要求11的组合物，其中所说的非免疫原性效价平台分子包括1,4,8,11-四氮杂环十四烷(Cyclam)。

33．权利要求11的组合物，其中所说的非免疫原性效价平台分子包括1,4,7,10-四氮杂环十二烷(Cyclen)。

34．权利要求11的组合物，其中所说的非免疫原性效价平台分子包括化合物63，四-A-PIZ-PMA。

35．权利要求11的组合物，其中所说的非免疫原性效价平台分子包括化合物55,MP-TEG。

36．权利要求11的组合物，其中所说的缀合物得自四-BMB。

37．一种非免疫原性效价平台分子，其包括AHAB-TEG。

38．一种非免疫原性效价平台分子，其包括化合物46,IA-DABA-ATEG。

39．一种非免疫原性效价平台分子，其包括化合物51,BA-PABA-DT-TEG。

40．一种非免疫原性效价平台分子，其包括化合物55,BMP-TEG。

41．一种非免疫原性效价平台分子，其包括化合物60,BA-PIZ-IDA-TEG。

42．一种非免疫原性效价平台分子，其包括化合物68,BA-PIZ-IDA-HB-TEG。

43．一种非免疫原性效价平台分子，其包括化合物72,BA-PIZ-HIP-TEG。

44．一种非免疫原性效价平台分子，其包括化合物63，四-BA-PIZ-PMA。

45．一种治疗患有aPL抗体介导的疾病的患者的方法，其包括给其所需个体施用有效量的权利要求11组合物。

46．权利要求45的方法，其中所说的aPL抗体介导的疾病是中风。

47．权利要求45的方法，其中所说的aPL抗体介导的疾病是流产。

48．权利要求45的方法，其中所说的aPL抗体介导的疾病是抗磷脂抗体综合症(APS)。

49．权利要求45的方法，其中所说的aPL抗体介导的疾病是原发性抗磷脂抗体综合症(PAPS)。

50．权利要求45的方法，其中所说的aPL抗体介导的疾病是血栓形成。

51．一种用于鉴别特异性地与自患有aPL抗体介导的疾病的人体分离得到的aPL抗体结合的表位之类似物的方法，该方法包括：

(a)制备噬菌体随机肽文库；

(b)筛选所说的具有aPL抗体的文库，以鉴别aPL模拟肽，其中所说的筛选包括：

(ⅰ)通过生物淘选筛选所说的文库；

(ⅱ)通过微量淘选进一步筛选在(ⅰ)中的由生物淘选分离得到的噬菌体；以及

(ⅲ)通过免疫测定鉴别包含在(ⅱ)中回收的aPL抗体高亲和性结合肽的噬菌体。

52．一种生物淘选噬菌体随机肽文库以鉴别和分离结合到aPL抗体上的肽的方法，该方法包括：

(a)使亲和纯化的aPL抗体与携带随机肽插入片段的噬菌体反应；

(b)回收携带有结合到aPL抗体上的随机肽插入片段的噬菌体；

(c)用在(b)中回收的噬菌体感染微生物；以及

(d)在包含抗生素的培养基中培养感染过的微生物以分离噬菌体。

53．一种微量淘选噬菌体随机肽文库以鉴别和分离对aPL抗体有高结合亲和性的肽的方法，该方法包括：

(a)通过生物淘选分离携带随机肽插入片段的噬菌体；

(b)在涂布有结合到蛋白质G上的aPL抗体的微量板孔中培养在步骤(a)中回收的噬菌体；

(c)洗涤微量板孔，以除去未结合的噬菌体，

(d)洗脱结合的噬菌体；和

(e)用在(d)中回收的噬菌体感染微生物；以及

(f)在包含抗生素的培养基中培养感染过的微生物以分离噬菌体。

54．权利要求51的方法，其中所说的免疫测定是噬菌体俘获ELISA，其包括：

(a)在涂布有aPL抗体的微量板孔中培养经微量淘选分离的携带随机肽插入片段的噬菌体；

(b)洗掉未结合的噬菌体；

(c)在孔中温育标记的抗噬菌体抗体；

(d)洗掉未结合的标记的抗噬菌体抗体；

(e)添加标记底物；以及

(f)测量底物的信号发展以鉴别高亲和性结合的噬菌体。

55．权利要求54的方法，其中所说的标记是酶。

56．权利要求的54的方法，其中所说的底物是比色的。

57．权利要求54的方法，该方法还包括进行高亲和性结合噬菌体的附加的噬菌体俘获ELISA测定，其包括：

(a)在微量板孔上涂布上相同数量的噬菌体；

(b)在孔中温育aPL抗体；

(c)洗掉未结合的抗体；

(e)将结合的aPL抗体与标记的抗aPL抗体一起温育；

(f)洗掉未结合的标记的抗-aPL抗体；

(g)将底物添加至孔中；以及

(h)测量底物的信号发展以测量噬菌体的相对结合亲和性。

58．权利要求57的方法，其中所说的标记是酶。

59．权利要求57的方法，其中所说的底物是比色的。

60．权利要求51的方法，其中所说的免疫测定是菌落印迹免疫测定，其包括：

(a)在包含琼脂的培养基顶部的膜上培养受携带随机肽插入片段的噬菌体感染的微生物；

(b)通过在包含琼脂的培养基顶部的膜上印迹微生物来重复转移在(a)中培养的微生物；

(c)培养转移的微生物；

(d)裂解所说的微生物；

(e)消化所说的微生物；

(f)封阻上述膜；

(g)将上述膜与aPL抗体一起温育；

(h)洗掉未结合的aPL抗体；

(i)将标记的抗-aPL抗体与上述膜一起温育；

(j)洗掉未结合的标记的抗-aPL抗体；

(k)添加底物；以及

(l)测量底物的信号发展以鉴别高亲和性结合的噬菌体。

61．权利要求60的方法，其中所说的膜是硝酸纤维素。

62．权利要求60的方法，其中所说的微生物用溶菌酶消化。

63．权利要求60的方法，其中所说的封阻液是明胶。

64．权利要求60的方法，其中所说的标记是酶。

65．权利要求60的方法，其中所说的底物是比色的。

66．一种用于测定和分级亲和结合特征表位的方法，所说的表位特异性结合分离自患有aPL抗体介导的疾病的患者的aPL抗体，该方法包括：

(a)用心磷脂涂布微量滴定板的孔；

(b)添加成年牛或人类血清，其作为结合到心磷脂上的β₂-GPI源，并阻止非特异性结合到平板的孔上；

(c)温育单体类似物和高滴度aPL抗体溶液一段预定的时间；

(d)向微量滴定板孔中添加aPL抗体/类似物混合物并温育一段预定的时间；

(e)洗涤孔以洗掉未结合的aPL抗体；

(f)将与标记缀合的抗人IgG添加到平板孔中，温育一段预定的时间；

(g)洗涤孔以洗掉未结合的抗人IgG缀合物；

(h)添加标记的缀合物的底物，将底物/标记反应进行一段预定的时间；

(i)测量底物/标记反应的最终-产物，并定量结合至孔上的aPL抗体的量；

(j)计算aPL抗体结合的抑制(如果有的话)百分比，以确定类似物对aPL抗体的亲和性。

67．权利要求66的方法，其中所说的缀合物是用酶标记的。

68．权利要求66的方法，其中所说的底物是比色的。

69．一种用于确定体液中aPL抗体存在的诊断免疫测定法，上述体液得自怀疑患有aPL抗体介导的的疾病的患者，该测定法包括

(a)将特异性结合aPL抗体的表位类似物与体液样品接触，

(b)检测与上述类似物结合的aPL抗体。

70．权利要求69的免疫测定法，其中所说的免疫测定法包括：

(a)将特异性结合aPL抗体的表位的类似物涂布在微量滴定板的孔上；

(b)洗涤孔以洗掉未结合的类似物；

(c)将一种体液试验样品添加至孔中，并温育一段预定的时间；

(d)洗涤孔以除去未结合的试验样品；

(e)将与标记缀合的抗人IgG添加到平板孔中，温育一段预定的时间；

(f)洗涤孔以洗掉未结合的抗人IgG缀合物；

(g)添加标记的缀合物的底物，并将底物/标记反应进行一段预定的时间；

(h)测量底物/标记反应的最终-产物，以确定抗-aPL抗体在试验样品中的存在。

71．权利要求70的免疫测定法，其中所说的标记是酶，并且所说的底物是比色的。

72．用于将肽或其它生物活性分子与效价平台分子连接起来的具有下式的亲水接头；

R¹S(CH₂CH₂O)_nCH₂CH₂O(CH₂)_mCO₂R²其中n=0-200；m=0-10；R¹=H或如三苯甲基的保护基；R²=H或烷基或如4-硝基苯基酯的芳基。

73．权利要求72的接头，其中m=0或2。

74．权利要求11的缀合物，其中所说的aPL类似物通过包含巯基的部分与非免疫性效价平台分子结合。