JP2002508386A - 導電性金属含有核酸 - Google Patents

導電性金属含有核酸

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、電子ソースに電気的に結合された金属含有核酸二重鎖を具備する導電性ポリマーを提供する。導電性金属含有核酸二重鎖を製造する方法が提供され、その方法は２価金属カチオンの存在下において、塩基性条件にさらすことを具備する。導電性金属含有核酸二重鎖の使用方法が提供され、その使用方法は遺伝子解析方法、分子スクリーニング方法およびそのような分子の抗体を創出する免疫学的方法を含む。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の技術分野】
本発明の技術分野は、導電性ポリマー、特にＤＮＡのような導電性核酸、並び
にそのような化合物を生産および使用する方法の分野である。
【０００２】
【発明の背景】
高分子導電体が知られている。例えば、天然に存在する幾つかのたんぱく質は
、光合成および呼吸のような基本的な生物学上のプロセスにおいて、電子移動を
促進する。一般的に、そのような系における電子移動は、ポリマー上で１つの原
子を隣につなぐ道（即ち、分子軌道）に沿って、量子力学上の電子の「トンネリ
ング」の結果として起こると理解されている。
【０００３】 ＤＮＡの重なった芳香族塩基は、電子移動のための「π軌道」として作用し得
ることが提案されてきた（Dandlikerら、1997年；Hallら、1996年；Arkinら、19
96年）。この提案は、相補的な二重鎖における塩基の重なり合い配置が芳香族窒
素塩基のπ軌道の共役電子を並置し、塩基対の重なり合いに沿った量子力学的上
のトンネリングを促進するという理論に基づいている。幾つかの実験はこの効果
が実在するという見解を支持している、一方、別の実験ではその効果は限られる
か、または存在しないという逆の証拠を与えている。
【０００４】 例えば、光誘発電子移動が１５塩基対ＤＮＡ二重鎖の片方の末端につないだ２
つの金属インターカレーターとの間で起こるという実験が報告されている（Murp
hyら、1993年）。他方では、ＤＮＡヘアピンでの距離依存性電子移動の動力学分
析により、ＤＮＡは導電性に乏しく、電子の伝導体としてたんぱく質よりも、幾
分効果的であるに過ぎないことが示されている（Lewisら、1997年、Taubes、199
7年）。
【０００５】 それぞれ、1997年1月7日、1998年1月6日、1998年6月23日、1998年7月12日およ
び1998年10月20日にMeadeらに発行された米国特許No.5,591,578;5,705,348;5,77
0,369;5,780,234および5,824,473（本文で、参照文献欄に記載）は、核酸バック
ボーンに沿って電子移動部位で共有結合的に修飾された核酸を開示している。Me
adeらはそのような修飾は、核酸が電子移動を効果的に仲介するために必要であ ることを教示している。
【０００６】 核酸二重鎖に沿ってπ軌道に仲介された導電性の理論は、前提として、そのよ
うな導電性は、重なり合った塩基対を伴う安定した二重鎖を必要とすることを示
唆している。核酸、特にＤＮＡへの金属イオンの結合の二重鎖安定性への効果は
、ほぼ４０年に亘って亘って、広く研究されてきた。一般的に、主にリン酸バッ
クボーンへ結合するカチオンが二重鎖の立体配置を安定化させるのに対し、塩基
へ結合するカチオンは、二重鎖を変性させる傾向にある。これらの効果は、熱変
性プロファイル（Ｔｍ測定）により、容易に実証される。この種の実験は、リン
酸バックボーンと相互作用しやすい、Ｎａ+のような殆どの１価のカチオンが二 重鎖を安定化させることを示す。この効果は、１価のカチオン濃度の１０倍増加
につき、Ｔｍはおよそ１２℃増加する（MarmurおよびDoty、1962年）という所見
に反映される。Ａｇ+は一般的原理の例外であり、窒素塩基に固く結合して二重 鎖を不安定化させ、それゆえ、二重鎖のＴｍを減少させる（GuayおよびBeaucham
p、1979年）。同様に、多価イオン、特に、ポリアミンは、リン酸バックボーン と相互作用して二重鎖を非常に効果的に安定化させる。
【０００７】 ２価の金属カチオンにについては、一連のイオン：Ｍｇ2+、Ｃｏ2+、Ｎｉ2+、
Ｍｎ2+、Ｚｎ2+、Ｃｄ2+、Ｃｕ2+を、ＤＮＡ不安定化の増加させる順で書くこと
ができる（Eichorn、1962年；EichornおよびShin、1968年）。そのスペクトル一
端において、Ｍｇ2+はすべての条件でＴｍを増加させ、その他端では、高濃度の
Ｃｕ2+が室温で二重鎖の完全な変性を十分引き起こすであろう（EichornおよびS
hin、1968年）。この一連のカチオンはまた、塩基に結合する２価のカチオンの 能力と相関がある（Hodgson、1977年；SwaminathanおよびSundaralingham、1979
年）。
【０００８】 カチオンはまた、幾つかの他の核酸における構造的転位および不均化の促進に
関係する。以前にＺｎ2+と幾つかの他の２価金属イオンは８を超えるｐＨで二重
鎖ＤＮＡに結合し、立体配置変化を引き起こすことが報告されている（Leeら、1
993年）。得られた亜鉛と結合している構造の予備的な特徴づけによって、それ は２つの平行でない二重鎖を維持するが、正常な「Ｂ」ＤＮＡとは異なること：
それは臭化エチジウムと結合せず、また化学量論的量のＺｎ2+添加によりＡ-Ｔ およびＧ-Ｃの両塩基対のイミノプロトンを失うようにみえ、「Ｂ」ＤＮＡより も１回転につき含まれる塩基対が約５％少ないことが示された。
【０００９】
【発明の概要】
本発明は、導電性金属含有核酸（ＣＭ-ＣＮＡ）に電気的に結合された電子ソ ースを具備する電子伝導体を提供する。電子シンクもまた、ＣＭ-ＣＮＡと電気 的に結合される。ＣＭ-ＣＮＡは第一の核酸鎖および第二の核酸鎖を含む。第一 および第二の核酸鎖はバックボーン（バックボーンは、以下に議論されるように
、ＤＮＡもしくはＲＮＡ、または代わりの構造のように、リン酸ジエステルによ
って作られる）によって共有結合された複数の窒素含有芳香族塩基を含む。第一
の核酸鎖の窒素含有芳香族塩基は、水素結合により第二の核酸鎖の窒素含有芳香
族塩基に結合される。第一および第二の核酸鎖の窒素含有塩基はＣＭ-ＣＮＡの 長さに沿って、重なり合い配置において水素結合された塩基対を形成する。水素
結合された塩基対の少なくともいくつか、好ましくはそれぞれが芳香族窒素含有
塩基の１つの窒素原子に配位したキレート化された２価金属カチオンを含む。
【００１０】 ＣＭ-ＣＮＡに電気的に結合した電子ソースは、導電性金属含有核酸二重鎖へ 電子を供給することのできる電子供与分子である。同様に、電子シンクは、ＣＭ
-ＣＮＡから電子を受け取ることができる電子受容分子である。電子供与分子は フルオレセインのような蛍光分子である。同様に、電子受容分子はローダミンの
ような蛍光分子である。本発明の様々な態様において、幾つかの分子は電子供与
体および電子受容体の両方として作用することが認識されている。
【００１１】 ＣＭ-ＣＮＡはデオキシリボ核酸から製造され、それは、金属含有ＤＮＡ（“ Ｍ-ＤＮＡ”）をともに生産する。核酸の窒素含有芳香族塩基は、自然に存在す る塩基：アデニン、チミン、グアニおよびシトシンである。
【００１２】 様々な態様において、ＣＭ-ＣＮＡを製造するために用いられる２価金属カチ オンは、Ｚｎ2+、Ｃｏ2+またはＮｉ2+である。２価金属カチオンの中には、ＣＭ
-ＣＮＡを製造しないものもあり、本発明は、特定の２価金属カチオンがＣＭ-Ｃ
ＮＡを製造する働きをするかどうかを決定するための簡単な分析を提供する。
【００１３】 ２価金属カチオンは、ＣＭ-ＣＮＡの芳香族窒素含有塩基のイミンプロトンと 置換される。ある態様において、２価金属カチオンは、チミンのＮ３位イミンプ
ロトンと置換えられ、またはグアニンのＮ１位窒素原子のイミンプロトンと置換
される。
【００１４】 本発明は、導電性金属含有核酸二重鎖を製造する方法を提供する。核酸二重鎖
は導電性含金属核酸二重鎖を形成するのに効果な条件下で、２価金属カチオン存
在下において、塩基性状態にさらされる。電子ソースおよび電子シンクは、導電
性含金属核酸二重鎖と電気的に結合され、これはこれまで議論された様々な態様
をとる。
【００１５】 本発明は第一および第二の核酸鎖から導電性金属含有核酸二重鎖の形成を検出
する方法を提供する。第一および第二の鎖が相補的であれば、核酸鎖は、相補的
な鎖をハイブリダイゼーションさせるような条件下で混合され、導電性金属含有
核酸二重鎖を形成するのに効果的な条件下で、２価金属カチオンの存在下におい
て塩基性条件にさらされる。電子ソースは導電性金属含有核酸二重鎖に電気的に
結合される。それから、ＣＭ-ＣＮＡが形成されたかどうかを決定するために、 電子ソースと導電性金属含有核酸二重鎖間での電子の伝導性が試験される。ＣＭ
-ＣＮＡはこれまでに議論されたように、様々な態様をとる。
【００１６】 本発明のＣＭ-ＣＮＡは電子を運搬するのに用いられる。それらはまた、動物 の抗体を増加させるために用いられ、ＣＭ-ＣＮＡの抗体を生産する。後者は幾 つかの態様およびある条件下で、ＣＭ-ＣＮＡがヌクレアーゼ耐性であるという 知見を利用している。
【００１７】
【発明の詳細な記述】
本発明は核酸二重鎖に電気的に結合された電子ソースを具備するＣＭ−ＣＮＡ
を提供し、ここで、重なり合った芳香族窒素含有塩基対の少なくともいくつかは
、２価金属カチオンとキレート化する。そのような態様において、金属含有核酸
二重鎖は、電子供与体から電子を受け取る電子受容体として作用する。本発明の
この側面でのある態様において、ＤＮＡ二重鎖のイミンプロトンは、Ｚｎ2+、Ｃ
ｏ2+、またはＮｉ2+で置換される。例えば、金属含有ＤＮＡ二重鎖は、共有結合
により、それぞれフルオレセインまたはローダミンのような電子供与体分子また
は電子シンクに電気的に結合される。
【００１８】 ある側面において、本発明は、核酸二重鎖をＣＭ−ＣＮＡへの変換する方法を
与える。核酸二重鎖は、核酸の芳香族窒素塩基によって、２価金属イオンがキレ
ート化するように、十分な濃度の適切な２価金属イオン存在下において、十分な
塩基で処理される。そのような処理は、塩基対の芳香族窒素含有塩基の窒素原子
へ配位した２価金属カチオンを含む修飾された二重鎖を生産するのに十分な時間
で実行される。
【００１９】 ある態様においては、Ｂ−ＤＮＡのようなＤＮＡのＭ−ＤＮＡへの変換の条件
は、２価金属イオン（0.1mMＺｎ2+、0.2mMＣｏ2+、または0.2mMＮｉ2+）を含む ｐＨ 8.5以上の溶液に、ＤＮＡをさらすことを具備する。Ｍ−ＤＮＡを形成する
のに必要な条件は、用いられる金属イオンまたはイオン種、および核酸の種類に
依存して様々である。この技術分野の当業者は、適切な条件を決定するために、
ｐＨ、核酸濃度、金属イオン濃度および核酸濃度に対する金属イオン濃度比のよ
うなパラメーターを変化させて、決まりきった実験が行われるということを認識
している。幾つかの態様においては、8以上のｐＨが要求され、適した金属イオ ンに対する核酸比は、約１：１．５から約１：２．０である。
【００２０】 ＭＣ−ＣＮＡは、電気的に電子ソースまたは電子シンクに結合される。例えば
、電子供与分子および受容分子はそれぞれ、電子ソースおよび電子シンクとして
作用する。いずれかの態様において、電子供与体および電子受容体は溶液中にあ
り、ＣＭ−ＣＮＡと一時的に相互作用するか、または、電極のような固体担体の
形態にある。
【００２１】 ＣＭ−ＣＮＡが結合した固相担体は、電子ソース、電子シンクまたはその両者
として働く。例えば、ＣＭ−ＣＮＡの固定列は、1996年にLockhartら（“752特 許”本文で、参照文献欄に記載）に発行された米国特許No.5,556,752の記載に従
って調製される。そのような固定列は、そこに記載されるようにして用いられ、
ハイブリダイゼーションを検出するために、必要に応じて修飾される。本発明に
従えば、固定プローブへの目的とする核酸のハイブリダイゼーションの工程に続
いて、またはこれと同時に、ここで記載されるように、２価金属カチオンの存在
下の塩基性条件下で、得られた二重鎖をＭＣ−ＣＮＡへ変換する工程が行われる
。これもまた「752特許」に記載されるように、得られたＭＣ−ＣＮＡ二重鎖の 導電性が固定相の表面で検出できるように、「752特許」に記載されるように、 そのような系に電子供与体および受容体を与えてもよい。そのような系は、本発
明の一側面である導電体としてのＭＣ−ＣＮＡの使用を含むことが認識されるで
あろう。
【００２２】 ＣＭ−ＤＮＡの形成は、様々な核酸相互作用を分析するために用いられる。例
えば、本発明の方法を用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して、標
的とする塩基配列の増幅が分析される。そのような分析の一側面において、１つ
のＰＣＲプライマーが電子供与部位に供給され、他のＰＣＲプライマーが電子受
容部位に供給される。本発明のこの側面に従い、ＰＣＲ増幅サイクルに続いて、
反応混合液は、ＣＭ−ＣＮＡの形成を促進する２価金属カチオンの存在下で、塩
基性条件にさらされる。もし、ＰＣＲ増幅がうまくいけばＣＭ−ＣＮＡが形成さ
れ、ここで議論されるように、電子供与体および受容体の間の特徴的な導電性の
結果として検出されるであろう。増幅が失敗であれば、プライマー上の電子移動
部位は電気的に結合されないまま残るであろう。幾つかの態様において、この方
法は、増幅サイクルに続いて、ＰＣＲ反応混合液からＰＣＲプライマーを離す必
要なく増幅の検出ができる点で有利である。本発明のこの側面に従えば、ＣＭ−
ＣＮＡを形成する２価金属カチオンの存在下において増幅反応混合液を塩基性条
件にさらす指示書とともに、電子供与体および電子受容体を有するＰＣＲプライ
マーを具備したキットが提供され得る。そのような適切な指示書を伴うキットは
、ここで議論される本発明の他の側面に関しても提供され得る。
【００２３】 核酸の連結反応もまた、本発明の方法を用いて分析してもよい。この場合、成
功した連結反応はＣＭ-ＣＮＡ形成により検出される。そのような系においては 、連結される核酸二重鎖の１つが電子供給部位に供給され、一方、連結される他
の核酸二重鎖が電子受容部位に供給される。連結反応およびこれに続くＭＣ−Ｃ
ＮＡの形成は電気的に電子移動部位と結合し、適切な条件下で成功した連結反応
を示すシグナルを生じる。連結されるべき核酸に電子供与体および電子受容体を
結合し、ＣＭ−ＣＮＡを形成するための２価金属カチオン存在下で塩基性条件下
に連結反応混合液をさらす説明書をとともに、電子供与体ラベルおよび電子受容
体ラベルを具備した、そのような反応のためのキットが提供され得る。
【００２４】 本発明のある態様においては、Ｂ−ＤＮＡをＭ−ＤＮＡへ変換させるために条
件が適合される。本発明の一側面において、Ｍ−ＤＮＡは十分な量のＺｎ2+、Ｃ
ｏ2+、またはＮｉ2+（ある態様において、好ましくは核酸濃度が約0.1mM未満の 濃度であるとすれば、約0.1mM）の存在下で、8以上のｐＨで形成される。そのよ
うな態様において、Ｍｇ2+またはＣａ2+は、Ｍ−ＤＮＡを生成するようには働か
ない（Leeら、1993年）。広範な種類の細菌性ＤＮＡおよび合成ＤＮＡは、これ らの条件下で、Ｍ−ＤＮＡへと不均化する。幾つかの態様においては、Ｍ−ＤＮ
Ａ形成過程は、ｐＨの低下、および／またはＥＤＴＡの添加により、反転される
。幾つかの態様において、Ｎｉ−Ｍ−ＤＮＡは、約7を超えるｐＨで「Ｂ」ＤＮ Ａへ変換されるためにＥＤＴＡを必要とする。幾つかの態様においては、ポリ[d
(AT)]はそのような条件下で、Ｍ−ＤＮＡへ変換しない。Ｂ−ＤＮＡと異なり、 エチジウムはＭ−ＤＮＡのある態様に結合せず、この特性は、Ｍ−ＤＮＡの形成
をモニターするのに用いる素早く敏感な“エチジウム蛍光分析”（Leeら、1993 年）の基礎を形成する。
【００２５】 Ｍ−ＤＮＡは素早くＢ−ＤＮＡに変換される。それゆえ、その技術分野でよく
知られるように、切断や接着のようなＤＮＡ操作および様々な構造（２、３の手
段での結合のような）の自己アッセンブリーのため有用な技術が、塩基配列を形
成しているＭ−ＤＮＡとともに用いられる（LilleyおよびClegg、1993年；Seema
nおよびKallenbach、1994年）。さらに、ＣＭ−ＣＮＡへの塩基配列特異的なた んぱく質の結合が、Ｍ−ＤＮＡの導電性を妨害するいくつかの態様において、見
せかけの電気スイッチや抵抗器のように操作される。
【００２６】 本発明の一側面は、特異的な突然変異を検出する方法のような遺伝子分析にお
ける特別な塩基配列を検出する方法を与える。本発明のそのような側面において
、図６に示したように、分析される核酸（野生型または突然変異体として示され
る）は、フルオレセイン（“Ｆ”で示される）のような電子供与体でラベルした
一方のプライマーおよびローダミン（“Ｒ”と示される）のような電子受容体で
ラベルした他方のプライマーを用いて、ＰＣＲにより、増幅される。増幅に続い
て、増幅された塩基配列の性質に応じて、核酸は増幅された塩基配列を切断し、
または、切断しない制限酵素で処理される。例えば、制限酵素は、ある遺伝子の
１つの対立遺伝子のみ切断し、他の対立遺伝子または非野生型塩基配列は切断さ
れない（図６に示してある。ここで、ＸとＹは突然変異塩基対を表す。）。制限
酵素処理に続いて、増幅した塩基配列はＣＭ−ＣＮＡ形成に適した条件にさらさ
れ、例えば、増幅されたＤＮＡ二重鎖はＭ−ＤＮＡへ変換される。それから、サ
ンプルの蛍光が測定される。もし図６の突然変異遺伝子のように、増幅された二
重鎖がプライマー間の領域に広がっているのであれば、それから、増幅された核
酸の蛍光がＣＭ−ＣＮＡに沿った電子移動によって抑制されるであろう。もし、
他方で、図６の野生型遺伝子のように、増幅された二重鎖が制限酵素により切断
されるならば、電子供与体の蛍光は抑制されないであろう。常染色体性劣性突然
変異を伴う個体からのサンプルの分析の場合にそうであるように、塩基配列の半
分がＣＭ−ＣＮＡを形成し、半分が形成しないサンプルは中間的である。本発明
のこの側面に従った塩基配列分析は自動様式で行われる。例えば、一つの側面に
おいて、この方法は、電気泳動または他のより多くの時間を消費する工程の必要
とせずに、比較的に短い時間で特定のサンプルに関する多量の情報を得るために
、同時にそのような反応を実行するための多くの反応ウエルを用い、それぞれの
ウエルには、別々のプライマーまたは別々の制限酵素のような別々の試薬が含め
られ。
【００２７】 別の側面において、本発明は、サンプル中の核酸結合部位の存在をモニターす
るためのセンサーを与える。本発明のこの側面でにおける一つの態様において、
図７に示すように、ＣＭ−ＣＮＡを形成することができる核酸二重鎖が、電子シ
ンクおよびフェロセンのような電子供与体との間に結合され、核酸はＣＭ−ＣＮ
Ａの形成を容易にする条件下で、サンプルにさらされ、核酸への結合部位が核酸
の伝導性の変化によって検出される。例えば、ＤＮＡ結合性分子は、そのような
条件下で、Ｍ−ＤＮＡをＢ−ＤＮＡに逆変換し、それによって、核酸へ結合した
蛍光性電子供体のＣＭ−ＣＮＡを媒介された消光を妨害または減少させる。ある
態様において、核酸は、図７の金電極10のような電極（例えば、Braunら、Natur
e,391:775-778、1998年に記載されるように、本文で参照文献欄に記載、）に結 合され、次いで、電極はサンプルにさらされる間にＣＭ−ＣＮＡの導電性を測定
するために用いられる。いくつかの態様においては、例えば、そのような伝導導
電性測定はサイクリックボルタンメトリー（図７にＣＶとして、示される）を活
用する。ＣＭ−ＣＮＡの導電性における様々な検出を含むそのような分析は、本
発明の様々な態様において、核酸と、小分子、三重鎖形成オリゴヌクレオチドお
よびＤＮＡ結合性たんぱく質のような広範囲の他の部位との間の相互作用を検出
するために用いられる。
【００２８】 いくつかの態様において、以下に続くそれぞれ、1997年1月7日、1998年1月6日
、1998年6月23日、1998年7月14日および1998年10月20日に、発行された、Meade らの米国特許No.5,591,578;5,705,348;5,770,369;5,780,234および5,824,473（ 本文で、参照文献欄に記載、）に記載されるように、ＭＣ−ＣＮＡの導電性は、
電子移動部位をもった核酸の修飾により高められる。
【００２９】 本発明の内容において、「導電性」とは電子を伝導できることを意味する。本
発明に従えば、電子ソースは、原子または分子導電体のような、電子を供給する
ことができる何れかの化合物または物質である。同様に、電子シンク（または受
容体）とは、電子を受け取ることができるような何れかの化合物または混合物で
ある。核酸二重鎖は、核酸分子のハイブリダイゼーションした鎖を具備する。核
酸の一本鎖は、バックボーンにより共有結合された、少なくとも２つのヌクレオ
チドを具備する。バックボーンは、ＤＮＡまたはＲＮＡにおけるように、多量体
のホスホジエステル結合から成る。或いは、他のバックボーン構造は金属イオン
とキレートし、電子を伝導することができる重なり合い配置において芳香族窒素
含有塩基を適切に配列するのに効果的である。例えば、ホスホラミド、ホスホロ
チオエイト、ホスホロジチオエイト、Ｏ−メチルホスホロアミダイトまたはペプ
チド核酸結合はそのようなバックボーンを形成するのに効果的である。同様に、
本発明に従って、バックボーンの他の構成要素は様々であり、デオキシリボース
部位、リボース部位、またはそれらの組み合わせを含んでいてもよい。もし、Ｒ
ＮＡが用いられるならば、この技術分野での当業者は、条件が、ＲＮＡが塩基性
溶液で不安定であるという事実を相殺するように条件を適合させなければならず
、ＲＮＡのＣＭ−ＣＮＡの変換がＲＮＡの加水分解を回避する修飾された反応条
件を要求するということを認識するであろう。本発明の一側面において、窒素含
有芳香族塩基は、自然のままのＤＮＡおよびＲＮＡに存在するアデニン、チミン
、シトシン、グアニンまたはウラシルが好ましい。しかしながら、この技術分野
における当業者は、代わりの窒素含有芳香族塩基を利用してもよく、それらは導
電性金属含有核酸二重鎖を生産するために２価金属イオンとキレート化すること
ができ、芳香族窒素含有塩基の窒素原子に配位され、重なり合うのが好ましいこ
とを理解するであろう。本発明の分子構造におけるこれらの多様性に従って、代
わりの２価金属イオンを利用してもよく、これもまた導電性金属含有核酸二重鎖
形成における本発明の分子の他の置換基に関与するそのようなイオンの能力に依
存する。この出願は、第３者が本発明の分子構造の機能的代用および多様性をル
ーチンに認識できるように、そのような二重鎖の創製についても分析を詳述する
。従って、本発明の様々な態様がここで例示されるが、他の応用や変更を本発明
の範囲内で行ってもよい。以下の実施例は、本発明の代替可能な態様の例示にす
ぎず、その範囲において包括的なものではなく、また限定的なものでもない。
【００３０】
【実施例】
実施例１：ＭＣ−ＣＮＡの導電性 ＭＣ−ＣＮＡの導電性は、二重鎖の反対の端にフルオレセイン（電子供与体）
およびローダミン（電子受容体）を伴ったＤＮＡの20塩基対の二重鎖を調製する
ことによって研究された。そのような結合方法は、以下で参照する、1995年、Ke
ssler、およびHauglandに開示されている。フルオレセインおよびローダミンは 異なる波長で蛍光を示し、そのため、電子供与体の蛍光と電子受容体の蛍光と区
別することができる。Ｂ−ＤＮＡを与える条件（ＥＤＴＡ存在下、約8.0未満の ｐＨ）下、フルオレセイン電子供与体の蛍光は部分的に抑制され、ローダミンの
蛍光は部分的に強められる。これは、いくつかの異なった研究（Cheung,H.C.199
1年、およびClegg,R.M.、1992年）でよく証明されている直通の空間電子移動（ フォルスター(Forster)共鳴エネルギー移動またはＦＲＥＴ）の例と思われる。 ＦＲＥＴの抑制は分子に沿った双極子−双極子相互作用（電子伝導性ではない）
によると理解され、非常に距離依存的である（６乗の関係で、分子間距離に伴っ
て、減少させる効果：１／ｒ6）；２０塩基対二重鎖のために測定される２５％ の抑制の値はこの二重鎖の長さの予想されるＦＲＥＴ作用に従っている（Clegg 、1992年）。図３ａに示したように、長い間、光にさらされることによるいくら
かの損失はあるものの、蛍光強度はｐＨ 9で相対的に安定である。
【００３１】 ＤＮＡ(pH 9)へのＺｎ2+(1mM)の添加において、蛍光強度は１時間を超えると 、95％以上抑制される。この抑制の増加の割合は、これらの条件下で、Ｍ−ＤＮ
Ａの形成の知られた割合を反映する（Leeら、1993年）。4,000秒後、過剰のＥＤ
ＴＡ(2mM)の添加によるＢ−ＤＮＡの再形成で、抑制が素早く逆転した。これら の結果は表１に要約されている。
【００３２】 対照基準として、フルオレセインラベルした20量体二重鎖は、正常なＢ−ＤＮ
Ａについてこれまで記載された効果と同様に、光にさらすことによる強度におい
て小さな減少のみ示される（図３ａ）。同様に、１つがフルオレセインでラベル
され、もう一方がローダミンでラベルされた２つの二重鎖の混合物は、Ｂ−ＤＮ
ＡまたはＭ−ＤＮＡのどちらかと同様に最小の抑制を示す。（表１参照） フルオレセインの蛍光寿命を測定するために、一方の末端にフルオレセインを
、他方の末端にローダミンを有する20量体オリゴヌクレオチドへ結合し、フルオ
レセインはレーザー光のピコ秒のパルスのレーザー光で照射され、それから、励
起したフルオレセインの蛍光の減衰が数ナノ秒間続く。普通は（Ｂ−ＤＮＡの場
合のように）、減衰のｔ1/2は約３ナノ秒である。これまで記載されたように、 Ｍ−ＤＮＡのＺｎ2+型への変換では、ｔ1/2は約0.3ナノ秒まで下がる。この非常
に速い減衰は、Ｍ−ＤＮＡによる電子伝導性と矛盾しない。
【００３３】 Ｍ−ＤＮＡのＺｎ2+異性体における電子移動が54塩基対（この54量体は推定で
150Åを超える長さ）の長い二重鎖で研究された。この54量体はまた、塩基配列 の中央にＤ−部位結合性たんぱく質の認識する部位を含む（Roeslerら、1992年 ）。図３ｂに示したように、54量体における金属イオン非存在下において、抑制
は見られず、これは、ＦＲＥＴがないために発蛍光団がよく分離されているため
であるかもしれない。しかしながら、Ｍ−ＤＮＡ形成に適切な条件下(1mM Ｚｎ2 + 、pH 9において)、Ｚｎ2+の添加で、蛍光強度は素早く初期値の25％まで下がり
、54量体の長さを制圧する効果的な導電性を表している。 Ｄ−部位結合性たんぱく質の存在下においては、Ｍ−ＤＮＡ形成に適した条件
下で、54量体の蛍光強度はかろうじてゆっくりと下がった。しかしながら、エチ
ジウム蛍光分析（Leeら、1993年）から判断すると、大多数の54量体ＤＮＡは、 Ｍ−ＤＮＡ（エチジウムを結合しない）の形成の状態にある。これは、Ｄ−部位
結合性たんぱく質が54量体Ｍ−ＤＮＡ二重鎖に沿って電子が流れるのを妨害して
いることを表している。対照基準のように、Ｄ−部位結合性たんぱく質は、20量
体（これは、Ｄ−部位結合塩基配列をもたない：表１参照）の抑制には効果がな
い。3000秒においてＤ−部位結合性たんぱく質：54量体Ｍ−ＤＮＡ複合体へプロ
テアーゼを添加することにより、たんぱく質は切断され、蛍光強度は下がり始め
、最後には初期蛍光強度値の最小25％にまで達した。この実験は、ＣＭ−ＣＮＡ
および導電性二重鎖を崩壊することができるＤＮＡ−結合性たんぱく質を具備す
る生物反応的電気的スイッチの単なる一例である。そのようなスイッチはまた、
２つの互換性のある状態、導電性および非導電性を有する、電子記憶原理に類似
している。
【００３４】
【表１】
【００３５】 Ｍ−ＤＮＡへの変換は、20mM ＮａＢＯ3緩衝液、pH 9.0で行われた。蛍光分析
は20mM トリス pH 8.0で行われた。他の条件は、以下に示す通りであった：20℃
において、10mM ＮａＣｌ、および適切な場合には1mM Ｚｎ2+または0.2mM Ｃｏ2 + または0.2mM Ｎｉ2+または2mM ＥＴＤＡ。490nmで励起し、520nmで光放出が測 定された。蛍光強度は、Ｚｎ2+の存在下または非存在下のどちらかにおけるFl-2
0量体二重鎖の蛍光強度について正規化され、3,000秒後に測定された。
【００３６】 塩基配列および命名：オリゴヌクレオチドは、例えば、ＤＮＡ塩基配列で用い
られるような標準的な結合方法および概念を用いて、フルオレセイン(Fl)または
ローダミン(Rh)で5’ラベルされた。フルオレセイン20量体は以下の通りであっ た：配列番号１:Fl-5’-d(GTCACGATGGCCCAGTAGTT)。ローダミン20量体は以下の 通りであった：配列番号２:Rh-5’-d(AACTACTGGGCCATCGTGAC)。同様のラベルさ れていない塩基配列が、Fl-20量体二重鎖を生産するために用いられた。Fl-54量
体は以下の通りであった：配列番号３:Fl-5’-d(GCTATGATCCAAAGGCCGGCCCCTTACG TCAGAG GCGAGCCTCCAGGTCCAGCT)(Ｄ−部位にはアンダーラインを引いた)。Rh-54量
体は以下の通りであった：配列番号４:Rh-5’-d(AGCTGGACCTGGAGGCTCGCCTCTGACG
TAAGGGGCCGGCCTTTGGATCATAGC)。同様のラベルされていない塩基配列が、Fl-54量
体二重鎖を生産するために用いられた。
【００３７】 この実施例は、このＭ−ＤＮＡ場合において、核酸二重鎖を導電性金属含有核
酸二重鎖へ変換する方法を表している。フルオレセイン上で励起された電子は、
ローダミンに向かってＭ−ＤＮＡを下って素早く伝導され、Ｍ−ＤＮＡに沿った
素早い効果的な電子移動を表している。Ｍ−ＤＮＡのＣｏ2+およびＮｉ2+異性体
は、ローダミン受容体非存在下でさえ、95％を超えるほどのフルオレセイン抑制
を示す（表１）。これは、Ｍ−ＤＮＡはそれ自身が電子受容体として作用できる
ことを示す。
【００３８】 実施例２：Ｍ−ＤＮＡの物理的性質 直線状、または共有結合的に閉じた環状型のＭ−ＤＮＡのアガロースゲル中にお
ける移動度は、Ｂ−ＤＮＡの移動度よりもほんのわずかに小さい（Ｍ−ＤＮＡを
生産するために、本発明に従った処理は、ＤＮＡの濃縮または集合を引き起こす
にはおよばないことを示す）。ＮＭＲ研究は、Ｔ(pKa 9.9)およびＧ(pKa 9.4) のイミノプロトンがＭ−ＤＮＡ中に存在しないことを示し、イミノプロトンはこ
のＭ−ＤＮＡ２価金属カチオンにより置換されていることを意味している。Ｍ−
ＤＮＡ形成を通じてのプロトン放出はこの現象を示している。図１に示すように
、Ｍ−ＤＮＡは約0.7mM ＮｉＣｌ2で形成され始める（エチジウム蛍光分析で判 断されるように）。プロトンの付随した放出が見られ、それによりＫＯＨがpH 8
.5に維持するために加えらる。1.8mM ＮｉＣｌ2でＭ−ＤＮＡ形成はほとんど完 了し、複合体は沈殿し始める。これは、Ｍ−ＤＮＡ形成を通じて、塩基対ごとに
Ｎｉ2+原子について１つのプロトンが放出されることを示唆している。Ｍ−ＤＮ
ＡのＺｎ2+およびＣｏ2+異性体はまた、その形成の際にプロトンを放出し、複合
体の沈殿はＮｉ2+よりも低い濃度の２価金属イオンでおこる。これらの結果は、
塩基対のＴのＮ３位およびＧのＮ１位に配位している金属イオンと矛盾がない。
【００３９】 これらの観察に基づいて、Ｍ−ＤＮＡの推定構造は図２に示されるようにモデ
ル化される。このモデルは、本発明の一側面に関係する実験結果を反映しており
、本発明をそのような推定構造に限定するものではない。モデルは、本発明の決
まりきった変化を実行する際、やはり第３者に役立つ。この推定構造において、
Ａ−ＴおよびＧ−Ｃ塩基対は同形であり、それは、安定な二重鎖核酸構造の一般
的な特徴である（Paleck、1991年）。Watson-Crick塩基対と比べて、２Åのイミ
ノ Ｎ−金属結合での金属イオンの挿入（SwaminathanおよびSundralingham、197
9年；DeMeeester、1973年；McGallおよびTaylor、1973年）は、これはマイナー な溝を広げるために塩基を20°〜30°回転させることを必要とする。１つの水素
結合は両方の塩基対に保持され、金属イオンの除去に際して二重鎖を変性するこ
となく正常なＢ−ＤＮＡの素早い再形成を容易にすることができる。金属イオン
の配位の幾何学は、いくつかの態様において、第４のリガンドを提供し、溶媒を
伴ったゆがんだ四角い平面である。Ｍ−ＤＮＡのＣｏ2+およびＮｉ2+異性体のＵ
Ｖ−Ｖｉｓスペクトルは、それぞれ、20および60 mol-1cm-1のεで明らかなピー
クを有し、これは、この幾何学と一致する観測（Lever、1988年）である。この Ｍ−ＤＮＡ二重鎖の推定モデルにおいて、金属イオンは、らせん構造内に埋没し
、ｄ−π結合が金属イオン上下の芳香族塩基との間で生じる。推定モデル二重鎖
は、顕著でないＣＤスペクトルと一致して、Ｂ型の二重鎖類のゆがんだメンバー
と考えられる。平均的に、モデルの金属−金属距離は４Åである。
【００４０】 実施例３：Ｍ−ＤＮＡのヌクレアーゼ耐性 Ｍ−ＤＮＡのヌクレアーゼ耐性は、図４に示されるように、ＤＮａｓｅＩの存
在下での、時間の関数として、残留している二重鎖Ｍ−ＤＮＡの量を分析するこ
とにより確証された。ＤＮＡの量はエチジウム蛍光分析（Ｍ−ＤＮＡがすばやく
Ｂ−ＤＮＡに反転する条件下、すなわち、分析の目的でエチジウムがＤＮＡと結
合することができるように、ＥＤＴＡ存在下のpH 8で）により分析した。この消
化は、37℃、10mM トリス塩酸、pH 7.4、5mM ＭｇＣｌ2、1mM ＮｉＣｌ2、1mg/m
lゼラチン、および0.2g/ml ＤＮａｓｅＩで行われた。Ｍ−ＤＮＡのＮｉ2+型は 、消化緩衝液に加える前に、pH 9で分析のために再形成され、Ｂ−ＤＮＡは直接
消化緩衝液へ加えられた。図はＢ−ＤＮＡが、約10分のうちに消化されるのに対
して、Ｍ−ＤＮＡはヌクレアーゼ消化に対して耐性であることを示している。こ
の結果はまた、Ｍ−ＤＮＡのＮｉ2+型が生理的なｐＨで安定であり、ＤＮＡ免疫
感作（ここで、ＤＮＡワクチンは抗原たんぱく質を発現する）またはアンチセン
ス適用（ここで、注射されたＭ−ＤＮＡは遺伝子の発現を抑制する）のような、
イン ビボでの生理的応答を仲介するためのＮｉ−Ｍ−ＤＮＡの使用を容易にす ることを示している。
【００４１】 実施例４：Ｍ−ＤＮＡの抗原性 Ｂ−ＤＮＡは、一般的に抗原性ではない。しかしながら、ヌクレアーゼ耐性で
ある合成または修飾された核酸は、ある条件下において、抗体応答を創出するこ
とができる（BraunおよびLee、1988年）。
【００４２】 Ｍ−ＤＮＡの抗原性を試験するために、Balb/Cマウスは、メチル化ウシ血清ア
ルブミン(Me-BSA)存在および非存在で、ニッケル含有Ｍ−ＤＮＡ10μgを用いて1
0日置きに３回免疫感作された。最初の注射は完全フロイントアジュバンドと共 に、次の注射は不完全フロイントと共に行った。最後の注射から３日間後、血液
を尾から絞り取り、その血清を本技術分野で知られる方法（BraunおよびLee、19
88年）を用いて、ＳＰＩＲＡ分析により、ポリ塩化ビニル板を覆ったニッケルＭ
−ＤＮＡを用いて、Ｍ−ＤＮＡ抗体の存在について試験した。
【００４３】 図５に示されるように、この結果は、Ｍ−ＤＮＡ（Me-BSA存在および非存在）
で免疫感作されたマウスは、約1:1000希釈以下において、Ｍ−ＤＮＡへの抗体力
価を示すことを表している。免疫感作されてないマウスの対照基準血清は、Ｍ−
ＤＮＡの抗体を有さない。免疫反応を引き出すＭ−ＤＮＡの能力は、Ｍ−ＤＮＡ
がヌクレアーゼ耐性であるという見解と一致している（BraunおよびLee、1988年
参照）。従って、幾つかの態様において、Ｍ−ＤＮＡは、例えば、それぞれ、19
97年10月21日、1998年9月8日および1998年11月3日に、Carsonらに発行された米 国特許No.5,679,647、5,804,566または5,830,877で開示される方法において、寄
主に免疫を与えるために役立つ（本文で、参照文献欄に記載）。
【００４４】
【表２】
【００４５】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 Ｍ−ＤＮＡ形成におけるプロトンの放出を示す図。ＮｉＣｌ2を添加し、プロ トンが放出され、pH 8.5を維持するために、ＫＯＨが加えられた（左軸）。それ
ぞれ、添加後、エチジウム蛍光分析（Leeら、1993年）によってＭ−ＤＮＡの形 成を評価するために、10μlを取り出した（右軸）。1.1mMの仔ウシ胸腺ＤＮＡの
塩基対を用いて、10mL容量中で実験を行った。ＤＮＡを水で透析し、３０ゲージ
の針で５回、剪断変形させた。矢印（ａ）はＭ−ＤＮＡ形成が開始する推定点を
示している。この遅れの部分はＤＮＡ濃度に比例し（データは示していない）、
最初にらせんの外側に金属イオンが結合することによるかもしれない。矢印（ｂ
）はＨ+ 1.1mMが放出される点を示し、この点を超えて、Ｍ−ＤＮＡの沈殿が観 察された。
【図２】 Ｇ-ＣおよびＡ-Ｔ塩基対を示すＭ−ＤＮＡの推定構造を示す図。推定水素結合
およびＺｎ2+とその配位している基との相互作用が点線で示されている。
【図３】 Ｍ−ＤＮＡの形成を通じて、フルオレセインラベルしたオリゴヌクレオチドの
蛍光を示す図。（20量体および54量体塩基配列に関しては、表１参照）（ａ）20
量体二重鎖におけるＺｎ2+の効果。(i)Ｚｎ2+非存在下でのFl-20量体二重鎖；(i
i)Ｚｎ2+存在下でのFl-20量体二重鎖；(iii)Ｚｎ2+非存在下でのFl-20量体二重 鎖-Rh；(iv)Ｚｎ2+存在下でのFl-20量体二重鎖-Rh；(v) Ｍ−ＤＮＡの形成後、 ＥＤＴＡを添加、（ｂ）54量体二重鎖におけるＺｎ2+の効果。(i)Ｚｎ2+存在下 でのＤ−部位結合性たんぱく質(1μg/ml)（その部位は、54量体二重鎖の中心に 位置する）を伴うFl-54量体二重鎖重鎖-Rh；(ii)3,000秒後、プロテアーゼＫ(50
μg/ml)を添加；(iii)Ｚｎ2+存在下でのFl-54量体-Rh二重鎖。実験は、10mM Ｎ ａＣｌおよび適切な場合には1mM Ｚｎ2+存在下において、20℃において20mM Ｎ ａＢＯ3緩衝液、pH9.0中で行われた。蛍光強度は、Ｚｎ2+非存在下または存在下
のどちらかにおけるFl-20量体二重鎖の蛍光強度について正規化された。
【図４】 Ｍ−ＤＮＡのヌクレアーゼ耐性を示す図。時間の関数として、残留している二
重鎖ＤＮＡの量をエチジウム蛍光分析で分析した（Ｍ−ＤＮＡがすばやくＢ−Ｄ
ＮＡに反転する条件下：pH8.0、0.1mM ＥＤＴＡ、ＤＮＡにエチジウムが結合す ることができるように）。消化は10mM トリス−塩酸、pH 7.4、5mM ＭｇＣｌ2、
1mM ＮｉＣｌ2、1mg/ml ゼラチン、および0.2g/ml ＤＮａｓｅＩ中、３７℃で行
われた。Ｍ−ＤＮＡのＮｉ2+型は、消化緩衝液にそれを加える前に、pH 9で分析
のために再形成され、Ｂ−ＤＮＡは消化緩衝液に直接加えられた。図は、Ｂ−Ｄ
ＮＡが約10分間のうちに消化される対して、Ｍ−ＤＮＡがヌクレアーゼ消化に対
して耐性であることを示している。この結果はまた、Ｍ−ＤＮＡのＮｉ2+型は生
理的なpHで安定であり、ＤＮＡ免疫感作（ここで、ＤＮＡ「ワクチン」は抗原た
んぱく質を発現する）またはアンチセンス適用（ここで、注射されたＭ−ＤＮＡ
は相補的な遺伝子の発現を抑制する）のような、イン ビボでの生理的応答を仲 介するためのＮｉ2+−Ｍ−ＤＮＡの使用を容易にすることを示している。
【図５】 Ｍ−ＤＮＡが抗原性であることを示す図。Balb/Cマウスは、メチル化ウシ血清
アルブミン（Me-BSA）存在下および非存在下で、ニッケル含有Ｍ−ＤＮＡ 10μg
を用いて１０日置きに３回免疫感作された。最初の注射は完全フロイントアジュ
バントとともに、次の注射は不完全フロイントアジュバントとともに行った。最
後の注射から３日間後、血液を尾から絞り取り、その血清を本技術分野で知られ
る方法(BraunおよびLee、1988年)を用いて、ＳＰＩＲＡ分析により、ポリ塩化ビ
ニル板を覆ったニッケルＭ−ＤＮＡを用いて、Ｍ−ＤＮＡ抗体の存在について試
験した。
【図６】 塩基配列分析方法を具備する本発明の側面を示す図説。ここで、図でフルオレ
セインとして「Ｆ」で示される電子供与体および図でローダミンとして「Ｒ」で
示される電子受容体との間で形成されるＭ−ＤＮＡ二重鎖における導電性の存在
または非存在に基づいて、制限酵素により切断されやすいある塩基配列は、され
にくい別の塩基配列と区別される。
【図７】 電極10に結合され、Ｍ−ＤＮＡを形成するために適した条件下にさらされた核酸
を示す図説。ここで、ＤＮＡ結合剤の非存在および存在下の両方で、サイクリッ
クボルタメントリーによりＣＭ−ＣＮＡの導電性について、測定が行われた。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１２年１月５日（２０００．１．５）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４４
【補正方法】変更
【補正内容】
【００４４】
【表２】
【表３】
【表４】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ， ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，Ｌ Ｔ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ， ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，Ｕ Ａ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 リー、ジェレミー・エス カナダ国 エス７エヌ・５イー５、サスカ チワン、サスカトーン、ユニバーシティ・ オブ・サスカチワン、デパートメント・オ ブ・バイオケミストリー、ヘルス・サイエ ンシイズ・ビルディング、ルーム・エー３ Ｆターム(参考） 4B063 QA01 QQ42 QQ52 QR14 QR32 QR42 QR50 QR62 QR66 QS25 QS34 QX02 QX04 4C057 NN10

Claims (58)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 導電性金属含有核酸二重鎖に電気的に結合した電子ソースを
    具備する電子伝導体であって、前記導電性金属含有核酸は第一および第二の核酸
    鎖を具備し、これら第一および第二の核酸鎖はバックボーンにより共有結合され
    た複数の窒素含有芳香族塩基を具備し、前記第一の核酸鎖の窒素含有芳香族塩基
    は前記第二の核酸鎖の窒素含有芳香族塩基に水素結合により結合され、前記第一
    および第二の核酸鎖上の窒素含有芳香族塩基は、前記導電性金属含有核酸二重鎖
    の長さに沿って、重なり合い配置において水素結合された塩基対を形成し、該水
    素結合された塩基対は、芳香族窒素含有芳香族塩基の１つにおいて窒素原子に配
    位したキレート化された２価金属カチオンを具備する電子伝導体。
  2. 【請求項２】 請求項１に記載の電子伝導体であって、さらに、前記導電性
    金属含有核酸二重鎖に電気的に結合した電子シンクを具備する電子伝導体。
  3. 【請求項３】 請求項１または２に記載の電子伝導体であって、前記電子ソ
    ースが、前記導電性金属含有核酸二重鎖へ電子を与えることができる電子供与分
    子である電子伝導体。
  4. 【請求項４】 請求項２または３に記載の電子伝導体であって、前記電子シ
    ンクが、前記導電性金属含有核酸二重鎖から電子を受け取ることができる電子受
    容分子である電子伝導体。
  5. 【請求項５】 請求項３に記載の電子伝導体であって、前記電子供与分子が
    蛍光分子である電子伝導体。
  6. 【請求項６】 請求項４に記載の電子伝導体であって、前記電子受容分子が
    蛍光分子である電子伝導体。
  7. 【請求項７】 請求項５に記載の電子伝導体であって、前記電子供与分子が
    フルオレセインである電子伝導体。
  8. 【請求項８】 請求項６に記載の電子伝導体であって、前記電子受容分子が
    ローダミンである電子伝導体。
  9. 【請求項９】 請求項１〜８の何れか１項に記載の電子伝導体であって、前
    記第一および第二の核酸鎖がデオキシリボ核酸であり、前記窒素含有芳香族塩基
    はアデニン、チミン、グアニンおよびシトシンから成る郡から選択される電子伝
    導体。
  10. 【請求項１０】 請求項１〜９の何れか１項に記載の電子伝導体であって、
    前記２価金属カチオンがＺｎ2+、Ｃｏ2+およびＮｉ2+から成る郡から選択される
    電子伝導体。
  11. 【請求項１１】 請求項１〜１０の何れか１項に記載の電子伝導体であって
    、前記２価金属カチオンが、前記窒素含有芳香族塩基のイミンプロトンと置換さ
    れ、前記窒素含有芳香族塩基はチミンおよびグアニンから成る郡から選択される
    電子伝導体。
  12. 【請求項１２】 請求項１〜１１の何れか１項に記載の電子伝導体であって
    、前記窒素含有芳香族塩基の少なくとも１つがＮ３窒素原子を有するチミンであ
    り、前記２価金属カチオンが該Ｎ３窒素原子によって配位される電子伝導体。
  13. 【請求項１３】 請求項１〜１２の何れか１項に記載の電子伝導体であって
    、前記窒素含有芳香族塩基の少なくとも１つがＮ１窒素原子を有するグアニンで
    あり、前記２価金属カチオンが該Ｎ１窒素原子によって配位される電子伝導体。
  14. 【請求項１４】 導電性金属含有核酸二重鎖を調製する方法であって、 ａ）第一および第二の核酸鎖を具備する核酸二重鎖を供給する工程であって、前
    記第一および第二の核酸鎖はバックボーンに共有結合された複数の窒素含有芳香
    族塩基を具備し、前記第一の核酸鎖の窒素含有芳香族塩基は前記第二の核酸鎖の
    窒素含有芳香族塩基に水素結合的に結合され、前記第一および第二の核酸鎖の窒
    素含有芳香族塩基は、核酸二重鎖の長さに沿って、重なり合い配置において水素
    結合された塩基対を形成している工程と、 ｂ）前記導電性金属含有核酸二重鎖を形成するのに効果的な条件下で、２価金属
    カチオンの存在下において、塩基性溶液に核酸二重鎖をさらす工程であって、前
    記導電性金属含有核酸二重鎖の水素結合された塩基対は、芳香族窒素含有芳香族
    塩基の１つにおいて窒素原子に配位したキレート化された２価金属カチオンを具
    備する工程と、 ｃ）前記導電性金属含有核酸二重鎖に電気的に結合した電子ソースを供給する工
    程とを具備する方法。
  15. 【請求項１５】 請求項１４に記載の方法であって、さらに、前記導電性金
    属含有核酸二重鎖に電気的に結合した電子シンクを与える工程を具備した方法。
  16. 【請求項１６】 請求項１４または１５に記載の方法であって、前記核酸二
    重鎖がアデニン、チミン、グアニンおよびシトシンから成る郡から選択される窒
    素含有芳香族塩基を具備するデオキシリボ核酸である方法。
  17. 【請求項１７】 請求項１４、１５または１６に記載の方法であって、前記
    導電性金属含有核酸二重鎖を形成するのに効果的な条件が、前記核酸二重鎖にお
    ける窒素含有芳香族塩基のイミンプロトンを前記２価金属カチオンに置換するの
    に効果的である方法。
  18. 【請求項１８】 請求項１４〜１７の何れか１項に記載の方法であって、前
    記２価金属カチオンが、Ｚｎ2+、Ｃｏ2+およびＮｉ2+から成る郡から選択される
    方法。
  19. 【請求項１９】 請求項１４〜１８の何れか１項に記載の方法であって、前
    記塩基性溶液がpH 8.5またはそれを超える方法。
  20. 【請求項２０】 請求項１４〜１９の何れか１項に記載の方法であって、前
    記電子ソースが前記導電性金属含有核酸二重鎖に電子を与えることができる電子
    供与分子である方法。
  21. 【請求項２１】 請求項１５〜２０の何れか１項に記載の方法であって、前
    記電子シンクが前記導電性金属含有核酸二重鎖から電子を受け取ることができる
    電子受容分子である方法。
  22. 【請求項２２】 請求項２０に記載の方法であって、前記電子供与分子が蛍
    光分子である方法。
  23. 【請求項２３】 請求項２１に記載の方法であって、前記電子受容分子が蛍
    光分子である方法。
  24. 【請求項２４】 請求項２０に記載の方法であって、前記電子供与分子がフ
    ルオレセインである方法。
  25. 【請求項２５】 請求項２２に記載の方法であって、前記電子受容分子がロ
    ーダミンである方法。
  26. 【請求項２６】 導電性金属含有核酸二重鎖の形成を検出する方法であって
    、 ａ）第一の核酸鎖を準備する工程と、 ｂ）第二の核酸鎖を準備する工程と、 ｃ）相補的な核酸鎖をハイブリダイゼーションさせる条件下で、前記第一の核酸
    鎖を前記第二の核酸鎖と混合する工程と、 ｄ）前記第一および第二の核酸鎖が相補的であるならば、導電性金属含有核酸二
    重鎖の形成に適した条件下で、２価金属カチオンの存在下において、塩基性溶液
    に前記第一および第二の核酸鎖をさらす工程と、 ｅ）前記導電性核酸二重鎖に電気的に結合された電子ソースを供給する工程と、 ｆ）前記電子ソースからの電子の伝導性を分析する工程とを具備する方法。
  27. 【請求項２７】 請求項２６に記載の方法であって、前記導電性金属含有核
    酸二重鎖に電気的に結合した電子シンクを供給することを具備する方法。
  28. 【請求項２８】 請求項２６または２７に記載の方法であって、前記第一お
    よび第二の核酸鎖がアデニン、チミン、グアニンおよびシトシンから成る郡から
    選択される窒素含有芳香族塩基を具備するデオキシリボ核酸である方法。
  29. 【請求項２９】 請求項２６、２７または２８に記載の方法であって、前記
    ２価金属カチオンが、Ｚｎ2+、Ｃｏ2+およびＮｉ2+から成る郡から選択される方
    法。
  30. 【請求項３０】 請求項２６〜２９の何れか１項に記載の方法であって、前
    記塩基性溶液がpH 8.5またはそれを超える方法。
  31. 【請求項３１】 請求項２６〜２９の何れか１項に記載の方法であって、前
    記電子ソースが前記導電性金属含有核酸二重鎖に電子を供給することができる電
    子供与分子である方法。
  32. 【請求項３２】 請求項２７〜３１の何れか１項に記載の方法であって、前
    記電子シンクが前記導電性金属含有核酸二重鎖から電子を受け取ることができる
    電子受容分子である方法。
  33. 【請求項３３】 請求項３１に記載の方法であって、前記電子供与分子が蛍
    光分子である方法。
  34. 【請求項３４】 請求項３２に記載の方法であって、前記電子受容分子が蛍
    光分子である方法。
  35. 【請求項３５】 請求項３３に記載の方法であって、前記電子供与分子がフ
    ルオレセインである方法。
  36. 【請求項３６】 請求項３４に記載の方法であって、前記電子受容分子がロ
    ーダミンである方法。
  37. 【請求項３７】 請求項２６〜３６の何れか１項に記載の方法であって、前
    記導電性金属含有核酸二重鎖形成に適した条件が、前記核酸二重鎖における窒素
    含有芳香族塩基のイミンプロトンを前記２価金属カチオンに置換するのに効果的
    である方法。
  38. 【請求項３８】 請求項２７〜３７の何れか１項に記載の方法であって、前
    記電子ソースが第一の核酸鎖への共有結合により、前記導電性金属含有核酸二重
    鎖に電気的に結合し、前記電子シンクが第二の核酸鎖への共有結合により、前記
    導電性金属含有核酸二重鎖に電気的に結合する方法。
  39. 【請求項３９】 請求項１４〜２５の何れか１項に記載の方法により調製さ
    れる導電性金属含有核酸二重鎖。
  40. 【請求項４０】 電子を運搬するための導電性金属含有核酸二重鎖の使用で
    あって、前記導電性金属含有核酸二重鎖は、第一の核酸鎖および第二の核酸鎖を
    具備し、これら第一および第二の核酸鎖はバックボーンに共有結合された複数の
    窒素含有芳香族塩基を具備し、前記第一の核酸鎖の窒素含有芳香族塩基は、前記
    第二の核酸鎖の窒素含有芳香族塩基に水素結合により結合し、前記第一および第
    二の核酸鎖上の窒素含有芳香族塩基は、前記導電性金属含有核酸二重鎖の長さに
    沿って、重なり合い配列において水素結合された塩基対を形成し、該水素結合さ
    れた塩基対は、芳香族窒素含有芳香族塩基の１つにおいて、窒素原子と配位した
    キレート化された２価金属カチオンを具備する使用。
  41. 【請求項４１】 請求項４０に記載の導電性金属含有核酸二重鎖の使用であ
    って、前記導電性金属含有核酸はデオキシリボ核酸を具備する使用。
  42. 【請求項４２】 請求項４０または４１に記載の導電性金属含有核酸二重鎖
    の使用であって、前記窒素含有芳香族塩基がアデニン、チミン、グアニンおよび
    シトシンから成る郡から選択される使用。
  43. 【請求項４３】 請求項４０〜４２の何れか１項に記載の導電性金属含有核
    酸二重鎖の使用であって、前記２価金属カチオンが、Ｚｎ2+、Ｃｏ2+およびＮｉ 2+ から成る郡から選択される使用。
  44. 【請求項４４】 請求項４０〜４３の何れか１項に記載の導電性金属含有核
    酸二重鎖の使用であって、さらに、前記導電性金属含有核酸が、前記導電性核酸
    二重鎖に電気的に結合した電子ソースを具備する使用。
  45. 【請求項４５】 請求項４０〜４４の何れか１項に記載の導電性金属含有核
    酸二重鎖の使用であって、さらに、前記導電性金属含有核酸が、前記導電性金属
    含有核酸二重鎖に電気的に結合した電子シンクを具備する使用。
  46. 【請求項４６】 請求項４４に記載の導電性金属含有核酸二重鎖の使用であ
    って、前記電子ソースが、前記導電性金属含有核酸二重鎖に電子を供給すること
    ができる電子供給分子である使用。
  47. 【請求項４７】 請求項４５に記載の導電性金属含有核酸二重鎖の使用であ
    って、前記電子シンクが、前記導電性金属含有核酸二重鎖から電子を受け取るこ
    とができる電子受容分子である使用。
  48. 【請求項４８】 請求項４６に記載の導電性金属含有核酸二重鎖の使用であ
    って、前記電子供給分子が蛍光分子である使用。
  49. 【請求項４９】 請求項４７に記載の導電性金属含有核酸二重鎖の使用であ
    って、前記電子受容分子が蛍光分子である使用。
  50. 【請求項５０】 請求項４８に記載の導電性金属含有核酸二重鎖の使用であ
    って、前記電子供給分子がフルオレセインである使用。
  51. 【請求項５１】 請求項４９に記載の導電性金属含有核酸二重鎖の使用であ
    って、前記電子受容分子がローダミンである使用。
  52. 【請求項５２】 請求項４０〜５１の何れか１項に記載の導電性金属含有核
    酸二重鎖の使用であって、前記２価金属カチオンが前記窒素含有芳香族塩基のイ
    ミンプロトンと置換される使用。
  53. 【請求項５３】 請求項４０〜５１の何れか１項に記載の導電性金属含有核
    酸二重鎖の使用であって、前記芳香族窒素含有芳香族塩基の少なくとも１つがＮ
    ３窒素原子を有するチミンであり、前記２価金属カチオンが該Ｎ３窒素原子によ
    って配位される電子伝導体。
  54. 【請求項５４】 請求項４０〜５１の何れか１項に記載の導電性金属含有核
    酸二重鎖の使用であって、前記芳香族窒素含有芳香族塩基の少なくとも１つがＮ
    １窒素原子を有するグアニンであり、前記２価金属カチオンが該Ｎ１窒素原子に
    よって配位される電子伝導体。
  55. 【請求項５５】 動物における抗体を増加させるための導電性金属含有核酸
    二重鎖の使用であって、前記導電性金属含有核酸二重鎖は、第一の核酸鎖および
    第二の核酸鎖を具備し、これら第一および第二の核酸鎖はバックボーンに共有結
    合された複数の窒素含有芳香族塩基を具備し、前記第一の核酸鎖の窒素含有芳香
    族塩基は、前記第二の核酸鎖の窒素含有芳香族塩基に水素結合により結合し、前
    記第一および第二の核酸鎖上の窒素含有芳香族塩基は、前記導電性金属含有核酸
    二重鎖の長さに沿って、重なり合い配置において水素結合された塩基対を形成し
    、該水素結合された塩基対は、芳香族窒素含有芳香族塩基の１つにおいて、窒素
    原子と配位したキレート化された２価金属カチオンを具備する使用。
  56. 【請求項５６】 導電性金属含有核酸二重鎖への抗体であって、前記導電性
    金属含有核酸二重鎖は、第一の核酸鎖および第二の核酸鎖を具備し、これら第一
    および第二の核酸鎖はバックボーンに共有結合された複数の窒素含有芳香族塩基
    を具備し、前記第一の核酸鎖の窒素含有芳香族塩基は、前記第二の核酸鎖の窒素
    含有芳香族塩基に水素結合により結合し、前記第一および第二の核酸鎖上の窒素
    含有芳香族塩基は、前記導電性性金属含有核酸二重鎖の長さに沿って、重なり合
    い配置において水素結合された塩基対を形成し、該水素結合された塩基対は、芳
    香族窒素含有芳香族塩基の１つにおいて、窒素原子と配位したキレート化された
    ２価金属カチオンを具備する抗体。
  57. 【請求項５７】 核酸領域の増幅を検出する方法であって、 ａ）前記核酸領域の第一の末端へハイブリゼーションしうる第一の増幅プライマ
    ーを準備する工程と、 ｂ）前記核酸領域の第二の末端へハイブリゼーションしうる第二の増幅プライマ
    ーを準備する工程と、 ｃ）前記核酸領域を増幅させるために前記第一および第二の増幅プライマー間で
    核酸領域のポリメラーゼ鎖反応による増幅を行うための条件を提供する工程と、 ｄ）導電性金属含有核酸二重鎖形成に適した条件下において、前記２価金属カチ
    オンの存在下で、増幅された核酸領域を塩基性溶液にさらす工程と、 ｅ）導電金属含有核酸二重鎖に電気的に結合された電子ソースを提供する工程と
    、 ｆ）前記電子ソースからの電子の伝導性を分析する工程とを具備する方法。
  58. 【請求項５８】 請求項５７に記載の核酸領域の増幅を検出する方法であっ
    て、さらに、前記核酸領域が制限酵素に認識される部位を含んでいるときには、
    増幅された核酸を制限酵素による核酸領域の消化に適した条件にさらすことによ
    って、制限酵素に対する感受性について核酸領域を試験する工程とを具備する方
    法。
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