CN106794263A - 具有抗原和作为佐剂的白细胞介素‑21的疫苗 - Google Patents

Abstract

本文公开包含抗原和IL‑21的疫苗。本文还公开用于增加受试者中的免疫应答的方法。所述方法可包括向有需要的所述受试者施用所述疫苗。

Description

具有抗原和作为佐剂的白细胞介素-21的疫苗

相关申请的引证

本申请要求2014年10月1日提交的美国临时申请号62/058,304的优先权，所述临时申请以引用方式并入本文。

技术领域

本发明涉及包含抗原和IL-21的疫苗以及施用所述疫苗的方法。

背景技术

疫苗用于刺激个体的免疫应答，以提供针对特定疾病的保护和/或对特定疾病的治疗。一些疫苗包含诱导免疫应答的抗原。一些抗原引起强免疫应答，而其他抗原引起弱免疫应答。通过在疫苗中包含佐剂可以加强对抗原的弱免疫应答。佐剂以很多不同形式出现，例如铝盐、油乳剂、细菌或其他病原体的无菌成分、细胞因子等。

细胞因子是由影响其他细胞行为的细胞形成的蛋白质，并且与很多佐剂不同的是它们可以调节特异性免疫应答。一种所述细胞因子是白细胞介素-21(IL-21)，其对淋巴和骨髓群体以及上皮细胞施加作用，调节先天和适应性免疫应答。已显示IL-21有助于几种CD4+T细胞亚群的功能性分化，以促进CD8+T细胞的增殖和功能应答，并在B细胞免疫球蛋白应答的发展中发挥作用。IL-21由CD8+T细胞群体以及CD4+T细胞群体(包括滤泡辅助T(TFH)细胞、17型辅助T(Th17)细胞和天然杀伤T(NKT)细胞)产生。

还以许多不同方式(例如，注射、口服等)将疫苗施用到许多不同的组织(例如，肌内、皮内等)中。然而，并非所有的递送方法都是等效的。一些递送方法允许在个体群体内的更大顺从性，而其他递送方法可影响疫苗的免疫原性和/或安全性。因此，在本领域中仍然需要开发安全的和更有效的佐剂，所述佐剂增加抗原应答而与抗原的身份(identity)和施用途径无关。

发明内容

本发明涉及包含抗原和IL-21的疫苗。IL-21可由选自由以下组成的组的核苷酸序列编码：与如SEQ ID NO:3中所列出的核苷酸序列具有至少约95％同一性的核苷酸序列，以及如SEQ ID NO:3中所列出的核苷酸序列。IL-21可由如SEQ ID NO:3所列出的核苷酸序列编码。

抗原可由第一核酸编码，并且IL-21可由第二核酸编码。第二核酸还可包含表达载体。疫苗还可包含与以上抗原具有相同编码核酸序列的抗原肽，以及与以上IL-21具有相同编码核酸序列的IL-21肽。

抗原可选自由以下组成的组：人乳头瘤病毒(HPV)抗原、人免疫缺陷病毒(HIV)抗原、流感抗原、恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)抗原、艰难梭菌(C.difficle)抗原以及其片段。HPV抗原可选自由以下组成的组：HPV16E6抗原、HPV16E7抗原以及其组合。HIV抗原可选自由以下组成的组：Env A、Env B、Env C、Env D、B Nef-Rev、Gag以及其任何组合。流感抗原可选自由以下组成的组：H1HA、H2HA、H3HA、H5HA、BHA抗原以及其任何组合。恶性疟原虫抗原可以包括环子孢子(CS)抗原。艰难梭菌抗原可选自由以下组成的组：毒素A、毒素B以及其组合。

疫苗可还包含药学上可接受的赋形剂。

本发明还涉及用于增加有需要的受试者中的免疫应答的方法。所述方法可包括施用包含抗原和IL-21的疫苗。IL-21可由选自由以下组成的组的核苷酸序列编码：与如SEQID NO:3中所列出的核苷酸序列具有至少约95％同一性的核苷酸序列，以及如SEQ ID NO:3中所列出的核苷酸序列。IL-21可由如SEQ ID NO:3中所列出的核苷酸序列编码。

施用疫苗可包括电穿孔。增加受试者中的免疫应答可包括增加受试者中的细胞免疫应答、体液免疫应答或细胞免疫应答和体液免疫应答两者。

本发明还涉及包含选自由以下组成的组的一种或多种核苷酸序列的核酸分子：SEQ ID NO:3，以及与SEQ ID NO:3 95％或更大相同的核苷酸序列。核酸分子可以是质粒。

附图说明

图1示出质粒pVAX-mIL-21Opt的图，所述质粒包含编码小鼠IL-21的优化核酸。

图2示出IL-21在来自转染HEK 293T细胞的上清液中的表达。

图3示出使用B细胞ELISpot测定通过肌内途径用编码来自艰难梭菌的毒素A和毒素B抗原的质粒免疫的小鼠中的体液免疫应答。

图4示出使用ELISA测定通过肌内途径免疫的小鼠中的体液免疫应答。

图5示出使用干扰素γELISpot测定通过肌内途径用编码来自HIV的EnvA和EnvC抗原的质粒免疫的小鼠中的细胞免疫应答。

图6示出使用ELISA测定通过肌内途径用编码来自HIV的EnvA和EnvC抗原的质粒免疫的小鼠中的体液免疫应答。

具体实施方式

本发明涉及疫苗，所述疫苗可以通过使用IL-21作为佐剂来用于增加受试者的对抗原的免疫应答。IL-21为单链、T细胞来源的细胞因子。

在一些情况下，IL-21可以用作通用的佐剂，因为与包含单独抗原的疫苗相比，在受试者中引发较高的免疫应答。IL-21还可以增加病毒抗原和细菌抗原的免疫应答，所述病毒抗原和细菌抗原分别例如HIV抗原和艰难梭菌抗原。IL-21还可与抗原呈DNA/肽组合形式，所述形式是相对于单独用抗原的DNA或肽免疫应答更大的核酸/肽组合。在一些情况下，如通过增加的干扰素-γ(IFN-γ)产生所证明，IL-21还可以增加肌肉组织和皮肤组织中的免疫应答。

1.定义

除非另外定义，否则本文所用的全部技术和科学术语都具有本领域的普通技术人员通常理解的相同含义。当发生冲突时，以本文件(包括定义)为准。虽然在本发明的实践或测试中可以使用与本文所描述的那些方法和材料类似或等效的方法和材料，但以下描述了优选的方法和材料。本文提及的所有公布、专利申请、专利以及其他参考文献以其全文以引用的方式并入本文。本文公开的材料、方法和实施例仅是示例性的，并不意图为限制性的。

如本文所用，术语“包含(comprise)”、“包括(include)”、“具有(having)”、“具有(has)”、“可以(can)”、“含有(contain)”以及其变化形式意图是不排除另外行为或结构的可能性的开放式连接词、术语、或词语。除非上下文另外清楚地说明，否则单数形式“一个/种(a)”、“一个/种(an)”以及“所述(the)”包括复数引用。本公开还涵盖“包括本文所呈现的实施方案或要素”、“由本文所呈现的实施方案或要素组成”以及“主要由本文所呈现的实施方案或要素组成”的其他实施方案，无论是否明确地提出。

如本文所用的“佐剂”意指添加至本文所描述的疫苗中以增强抗原的免疫原性的任何分子。

如本文所用的“编码序列”或“编码核酸”意指包含编码蛋白质的核苷酸序列的核酸(RNA或DNA分子)。所述编码序列可以进一步包括可操作地连接至调控元件的起始信号和终止信号，所述调控元件包括能够在施用核酸的个体或哺乳动物的细胞中指导表达的启动子和多聚腺苷酸化信号。

如本文所用的“互补序列”或“互补的”意指核酸分子的核苷酸或核苷酸类似物之间的沃森-克里克(Watson-Crick)(例如，A-T/U和C-G)或Hoogsteen碱基配对。

如本文可互换使用的“电穿孔”、“电-透化作用”或“电动增强”(“EP”)意指使用跨膜电场脉冲来诱导在生物膜中的微观途径(孔隙)；它们的存在允许生物分子如质粒、寡核苷酸、siRNA、药物、离子以及水从细胞膜的一侧流动到另一侧。

如本文所用的“片段”或“免疫原性片段”意指编码能够在哺乳动物中引发和/或增加免疫应答的多肽的核酸序列或其部分。所述片段可以是选自编码下文所述的蛋白质片段的各种核苷酸序列的至少一种的DNA片段。片段可以包含至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％的一种或多种以下所列出的核酸序列。在一些实施方案中，片段可以包含以下所列出的核酸序列中的至少一种的至少20个核苷酸或更多、至少30个核苷酸或更多、至少40个核苷酸或更多、至少50个核苷酸或更多、至少60个核苷酸或更多、至少70个核苷酸或更多、至少80个核苷酸或更多、至少90个核苷酸或更多、至少100个核苷酸或更多、至少150个核苷酸或更多、至少200个核苷酸或更多、至少250个核苷酸或更多、至少300个核苷酸或更多、至少350个核苷酸或更多、至少400个核苷酸或更多、至少450个核苷酸或更多、至少500个核苷酸或更多、至少550个核苷酸或更多、至少600个核苷酸或更多、至少650个核苷酸或更多、至少700个核苷酸或更多、至少750个核苷酸或更多、至少800个核苷酸或更多、至少850个核苷酸或更多、至少900个核苷酸或更多、至少950个核苷酸或更多或至少1000个核苷酸或更多。

如本文所用的片段或免疫原性片段还意指能够在哺乳动物中引发和/或增加免疫应答的多肽序列或其部分。片段可以是选自以下所列出的各种氨基酸序列中的至少一种的多肽片段。片段可以包含至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％的一种或多种以下所列出的蛋白质。在一些实施方案中，片段可以包含以下所列出的蛋白质中的至少一种的至少20个氨基酸或更多、至少30个氨基酸或更多、至少40个氨基酸或更多、至少50个氨基酸或更多、至少60个氨基酸或更多、至少70个氨基酸或更多、至少80个氨基酸或更多、至少90个氨基酸或更多、至少100个氨基酸或更多、至少110个氨基酸或更多、至少120个氨基酸或更多、至少130个氨基酸或更多、至少140个氨基酸或更多、至少150个氨基酸或更多、至少160个氨基酸或更多、至少170个氨基酸或更多、至少180个氨基酸或更多、至少190个氨基酸或更多、至少200个氨基酸或更多、至少210个氨基酸或更多、至少220个氨基酸或更多、至少230个氨基酸或更多或至少240个氨基酸或更多。

如本文所用的“基因构建体”或“构建体”是指包含编码蛋白质的核苷酸序列的DNA或RNA分子。所述编码序列包含可操作地连接至调控元件的起始信号和终止信号，所述调控元件包括能够在施用核酸分子的个体的细胞中指导表达的启动子和多聚腺苷酸化信号。如本文所用，术语“可表达的形式”是指含有必要调控元件的基因构建体或构建体，所述必要调控元件可操作地连接至编码蛋白质的编码序列，使得当所述基因构建体存在于个体的细胞中时，编码序列将被表达。

如本文在两种或更多种核酸或多肽序列的背景下所使用的术语“相同的”或“同一性”意指序列具有指定百分比的在指定区上相同的残基。可以通过以下来计算所述百分比：最佳地比对两个序列、在指定区域比较两个序列、确定在两个序列中相同的残基的位置的数量以产生匹配位置的数量、以匹配位置的数量除以在指定区域内的位置的总数量，并且将结果乘以100以产生序列同一性的百分比。在两个序列具有不同长度或比对产生一个或多个交错末端并且比较的指定区仅包含单个序列的情况下，单个序列的残基包括于计算的分母而不是分子中。当比较DNA和RNA时，胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)可以被认为是等同的。同一性可以手动地或者通过使用计算机序列算法如BLAST或者BLAST 2.0来执行。

如本文所用的“免疫应答”意指响应于抗原的引入而产生的宿主的免疫系统(例如，哺乳动物的免疫系统)的活化。免疫应答可以呈细胞应答或体液免疫应答或两者兼有的形式。

如本文所用的“核酸”或“寡核苷酸”或“多核苷酸”意指共价连接在一起的至少两个核苷酸。单链的描述还定义了互补链的序列。因此，核酸还涵盖了所描述的单链的互补链。核酸的很多变体可以被用于与给定的核酸相同的目的。因此，核酸还涵盖了基本上相同的核酸和其互补体。单链提供可以在严格杂交条件下与靶序列杂交的探针。因此，核酸还涵盖了在严格杂交条件下杂交的探针。

核酸可以是单链的或者双链的或可以含有双链或者单链序列两者的部分。所述核酸可以是DNA、基因组和cDNA两者、RNA或杂合体，其中所述核酸可以含有脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的组合，以及包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌啉、肌苷、黄嘌呤次黄嘌呤、异胞嘧啶以及异鸟嘌呤的碱基的组合。核酸可以通过化学合成方法或者通过重组方法来获得。

如本文所用的“可操作地连接”意指基因的表达是在空间上与之连接的启动子的控制下进行的。在其控制下，启动子可以被定位在基因的5'(上游)或者3'(下游)。启动子与基因之间的距离可以与所述启动子与启动子的来源基因之间的距离大约相同。如本领域所已知，这个距离的变化可以在没有失去启动子功能的情况下进行调整。

如本文所用的“肽”、“蛋白质”或“多肽”可以意指氨基酸的连接序列，并且可以是天然的、合成的、或天然与合成的修饰或组合。

如本文所用的“启动子”意指合成的或自然来源的分子，所述分子能够赋予、活化或增强细胞中的核酸的表达。启动子可包含一个或多个特定的转录调控序列以便进一步增强表达和/或改变其空间的表达和/或时间的表达。启动子还可以包含远端增强子或阻遏元件，它们可以位于从转录的起始点开始的差不多几千对碱基对处。启动子可以从包括病毒、细菌、真菌、植物、昆虫以及动物的来源中获得。启动子可以调控基因组分相对于其中发生表达的细胞、组织或器官或相对于发生表达所处的发育阶段或响应于外部刺激(如生理应激、病原体、金属离子或诱导剂)而组成型地或差异性地表达。启动子的代表性实例包括噬菌体T7启动子、噬菌体T3启动子、SP6启动子、乳糖操纵子-启动子、tac启动子、SV40后期启动子、SV40早期启动子、RSV-LTR启动子、CMV IE启动子、SV40早期启动子或者SV40后期启动子以及CMV IE启动子。

“信号肽”和“前导序列”在本文可互换使用，并且是指可以连接在本文所列出的蛋白或氨基酸序列的氨基末端的氨基酸序列。信号肽/前导序列通常指示蛋白质的位置。本文所用的信号肽/前导序列优选地促进蛋白质从产生其的细胞中分泌。信号肽/前导序列常常从蛋白质的剩余部分裂解，所述蛋白质在从细胞分泌后经常被称为成熟蛋白质。信号肽/前导序列连接在蛋白质的氨基末端。

如本文所用的“受试者”可以意指想要或需要用本文所描述的疫苗进行免疫的哺乳动物。哺乳动物可以是人、黑猩猩、狗、猫、马、牛、小鼠或大鼠。

如本文所用的“严格杂交条件”可意指在其下第一核酸序列(例如，探针)将与第二核酸序列(例如，靶标)如在核酸的复杂混合物中杂交的条件。严格条件是序列依赖性的并且在不同情况下有所不同。严格条件可经选择比限定离子强度pH下特定序列的热熔点(T_m)低约5-10℃。T_m可以是在所述温度下处于平衡时50％互补于靶标的探针杂交于靶标序列(因为靶标序列过量存在，所以在T_m下，在平衡时50％的探针被占据)的温度(在限定的离子强度、pH以及核酸浓度下)。严格条件可以是这样的条件，其中在pH 7.0至8.3下盐浓度低于约1.0M钠离子，如约0.01-1.0M钠离子浓度(或其他盐)并且温度为至少约30℃(对于短探针，例如约10-50个核苷酸)和至少约60℃(对于长探针，例如大于约50个核苷酸)。还可以通过加入去稳定剂如甲酰胺来实现严格条件。对于选择性或特异性杂交，阳性信号可为背景杂交的至少2至10倍。示例性严格杂交条件包括以下：50％甲酰胺、5x SSC以及1％SDS、在42℃下孵育，或者5x SSC、1％SDS、在65℃下孵育、在65℃下用0.2x SSC和0.1％SDS洗涤。

如本文所用的“基本上互补”意指第一序列在8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或更多个核苷酸的区域上与第二序列的互补序列至少60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同，或者意指两个序列在严格杂交条件下进行杂交。

如本文所用的“大致上相同的”可以意指第一氨基酸序列和第二氨基酸序列在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100或更多个氨基酸的区域上至少60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。大致上相同的还可以意指第一核酸序列和第二核酸序列在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100或更多个核苷酸的区域上至少60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。

如本文所用的“治疗(Treatment)”或“治疗(Treating)”可以意指通过预防、抑制、阻遏的手段保护动物免于疾病或完全消除疾病。预防疾病涉及在疾病发作之前向动物施用本发明的疫苗。抑制疾病涉及在疾病诱发之后但在其临床出现之前向动物施用本发明的疫苗。阻遏疾病涉及在疾病的临床出现之后向动物施用本发明的疫苗。

如关于核酸在本文中使用的“变体”意指(i)参考核苷酸序列的一部分或片段；(ii)参考核苷酸序列或其部分的互补序列；(iii)与参考核酸或其互补序列大致相同的核酸；或(iv)在严格条件下与参考核酸、其互补序列或与其大致相同的序列杂交的核酸。

变体可以进一步定义为通过氨基酸的插入、缺失、或保守性取代而在氨基酸序列上有所不同、但保留至少一种生物活性的肽或多肽。“生物活性”的代表性实例包括被特异性抗体结合或促进免疫应答的能力。变体还意指具有与参考蛋白质基本上相同的氨基酸序列的蛋白质，所述参考蛋白质具有保留至少一种生物活性的氨基酸序列。氨基酸的保守性取代，即以相似特性(例如，亲水性、带电区域的程度和分布)的不同氨基酸来替换氨基酸，在本领域中被认为通常涉及微小变化。这些微小变化可部分地通过考虑氨基酸的亲水指数来鉴定，如本领域中所理解的。Kyte等，J.Mol.Biol.157:105-132(1982)。所述氨基酸的亲疏水性指数是基于其疏水性和电荷的考虑。本领域已知的是相似的亲疏水性指数的氨基酸可以被取代并仍然保留蛋白质功能。在一个方面，亲疏水性指数为±2的氨基酸被取代。氨基酸的亲水性还可以被用来揭示会产生保留生物功能的蛋白质的取代。在肽的情形下考虑氨基酸的亲水性允许计算所述肽最大的局部平均亲水性，这是已经被报道来与抗原性和免疫原性良好关联的有用测量。如本领域中所理解，用亲水性值相似的氨基酸进行取代可产生保留生物活性(例如免疫原性)的肽。可用亲水性值处在±2范围内的氨基酸进行取代。氨基酸的亲疏水性指数和亲水性值两者都受所述氨基酸的特定侧链影响。与所述观察一致的是，与生物功能相容的氨基酸取代被理解为取决于这些氨基酸相对的相似性，并且特别是那些氨基酸的侧链，如通过疏水性、亲水性、电荷、大小以及其他特性所揭示的。

变体可以是在全基因序列或其片段的全长上大致相同的核酸序列。核酸序列可在基因序列或其片段的全长上80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。变体可以是在氨基酸序列或其片段的全长上大致相同的氨基酸序列。氨基酸序列可在氨基酸序列或其片段的全长上80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同

如本文所用的“载体”意指含有复制起点的核酸序列。载体可以是病毒载体、噬菌体、细菌人工染色体或酵母人工染色体。载体可以是DNA或RNA载体。载体可以是自我复制的染色体外载体，并优选地是DNA质粒。载体可以含有或包括一个或多个异源核酸序列。

对于本文数值范围的叙述来说，明确地涵盖具有相同精确度的介于其间的每个中间数字。例如，对于6-9的范围来说，除6和9之外，还涵盖数字7和8，并且对于范围6.0-7.0来说，明确地涵盖数字6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9和7.0。

2.疫苗

本文提供包含抗原和佐剂的疫苗。疫苗可以在受试者中增加抗原呈递和对抗原的总免疫应答。抗原和佐剂的组合比仅包含抗原的疫苗更有效地诱导免疫系统。当施用于不同组织(如肌肉和皮肤)时，疫苗可以进一步诱导免疫应答。

本发明的疫苗可以具有有效疫苗所要求的特征，如为安全的，以使得疫苗本身不会引起疾病或死亡；保护免受由暴露于活的病原体(如病毒或细菌)引起的疾病；诱导中和抗体来预防细胞的感染；诱导针对细胞内病原体的保护性T细胞；以及提供施用容易性、很少副作用、生物稳定性以及每剂量的低成本。通过如以下所论述组合抗原和佐剂，疫苗可实现这些特征中的一些或全部。

a.佐剂

疫苗可以包含如下论述的佐剂和抗原。佐剂可以是核酸序列、氨基酸序列或其组合。所述核酸序列可以是DNA、RNA、cDNA、其变体、其片段或其组合。核酸序列还可以包含编码通过肽键连接至佐剂的接头序列或标签序列的另外序列。氨基酸序列可以是蛋白质、肽、其变体、其片段或其组合。

(1)IL-21

佐剂可以是白细胞介素-21(IL-21)。IL-21是对包括自然杀伤(NK)细胞和细胞毒性T细胞(CD8+T细胞)的B和T细胞亚群具有强效作用的单链、T细胞来源的细胞因子。慢性感染的动物模型表明IL-21在T细胞活性和病毒复制控制中以及在患有慢性病毒感染如HIV的患者中的关键作用。已经报道IL-21关键性地改善细胞毒性CD8T细胞应答。还已经表明IL-21帮助B细胞增殖和分化。

类似于IL-12，IL-21可以刺激IFN-γ产生。IL-12可以活化初始T细胞以诱导IFN-γ产生，而IL-21可以作用于记忆T细胞以诱导IFN-γ产生。与不包含IL-21的疫苗相比，在疫苗中包含IL-21可以至少约1.5倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约8倍以及至少约10倍地诱导IFN-γ的产生。与不包含IL-23的疫苗相比，在疫苗中包含IL-21可以至少约2倍地诱导IFN-γ的产生。与不包含IL-21的疫苗相比，在疫苗中包含IL-21可以至少约3倍地诱导IFN-γ的产生。

IL-21可以增加或增强受试者的对抗原的免疫应答。在以下更详细地描述抗原。在一些情况下，IL-21可以使对抗原的免疫应答增加约75％至约200％。或者，IL-21可以使对抗原的免疫应答增加约90％至约130％。在另一些可替代实施方案中，IL-21可以使对抗原的免疫应答增加约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％、101％、102％、103％、104％、105％、106％、107％、108％、109％、110％、111％，112％、113％、114％、115％、116％、117％、118％、119％、120％、121％、122％、123％、124％、125％、126％、127％、128％、129％或130％。

在其他实施方案中，当对有需要的受试者施用本文所述的疫苗时，IL-21可以使对抗原的免疫应答增加或加强至少约1.5倍、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍或至少约10倍。

编码IL-21的核酸可来自任何数量的生物体，例如，小鼠(小家鼠(Mus musculus))和人(智人(Homo sapiens))。可以关于密码子使用和对应RNA转录物对编码IL-21的核酸进行优化。可以针对表达对编码IL-21的核酸进行密码子和RNA优化。在一些实施方案中，编码IL-21的核酸可包含Kozak序列(例如，GCC ACC)以提高翻译的效率。编码IL-21的核酸可包含多个终止密码子(例如，TGA TGA)以提高翻译终止的效率。编码IL-21的核酸还可包括编码IgE前导序列的核苷酸序列。IgE前导序列在核酸中可以位于IL-21的5’。在一些实施方案中，编码IL-21的核酸不含或不含有编码IgE前导序列的核苷酸序列。在其他实施方案中，编码IL-21的核酸可包括编码HA标签的核苷酸序列(SEQ ID NO:9)。在另一些实施方案中，编码IL-21的核酸不含或不含有编码HA标签的核苷酸序列。

小鼠IL-21可以是优化的核酸序列SEQ ID NO：1，其编码SEQ ID NO:2。在一些实施方案中，小鼠IL-21可以是在SEQ ID NO:1中所列出的核酸序列的全长上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核酸序列。在其他实施方案中，小鼠IL-21可以是编码在SEQ ID NO:2中所列出的氨基酸序列的全长上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的核酸序列。小鼠IL-21可以是在SEQ ID NO:2中所列出的氨基酸序列的全长上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

人IL-21可以是优化的核酸序列SEQ ID NO:3，其编码SEQ ID NO:4。在一些实施方案中，人IL-21可以是在SEQ ID NO:3中所列出的核酸序列的全长上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核酸序列。在其他实施方案中，人IL-21可以是编码在SEQID NO:4中所列出的氨基酸序列的全长上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的核酸序列。人IL-21可以是在SEQ ID NO:4中所列出的氨基酸序列的全长上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

一些实施方案涉及SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:3的片段。片段可包含至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:3。在一些实施方案中，片段可以包括编码前导序列的序列，所述前导序列例如免疫球蛋白前导序列，如IgE前导序列。在一些实施方案中，片段不含编码前导序列的编码序列。

可提供具有与SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:3的片段具有同一性的核苷酸序列的核酸的片段。所述片段可包含至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的与SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:3具有95％或更大同一性的核酸。一些实施方案涉及与本文的IL-21核酸序列的片段具有96％或更大同一性的片段。一些实施方案涉及与本文的IL-21核酸序列的片段具有97％或更大同一性的片段。一些实施方案涉及与本文的IL-21核酸序列的片段具有98％或更大同一性的片段。一些实施方案涉及与本文的IL-21核酸序列的片段具有99％或更大同一性的片段。在一些实施方案中，片段包括编码前导序列的序列，所述前导序列例如免疫球蛋白前导序列，如IgE前导序列。在一些实施方案中，片段不含编码前导序列的编码序列。

可提供SEQ ID NO:2和/或SEQ ID NO:4的片段。片段可包含至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的SEQ ID NO:2和/或SEQ ID NO:4。在一些实施方案中，片段包含前导序列，例如，免疫球蛋白前导序列，如IgE前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列。

可提供具有与SEQ ID NO:2和/或SEQ ID NO:4的片段具有同一性的氨基酸序列的蛋白质的片段。所述片段可包含至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的与SEQ ID NO:2和/或SEQ ID NO:4具有95％或更大同一性的蛋白质。一些实施方案涉及与本文的IL-21蛋白序列的片段具有96％或更大同一性的片段。一些实施方案涉及与本文的IL-21蛋白序列的片段具有97％或更大同一性的片段。一些实施方案涉及与本文的IL-21蛋白序列的片段具有98％或更大同一性的片段。一些实施方案涉及与本文的IL-21蛋白序列的片段具有99％或更大同一性的片段。在一些实施方案中，片段包含前导序列，例如，免疫球蛋白前导序列，如IgE前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列。

b.抗原

疫苗可以包含如以上所论述的抗原或其片段或变体和佐剂。抗原可以是在受试者中诱导免疫应答的任何物质。纯化的抗原通常其自身不是强免疫原性的，并且因此如上所述与佐剂组合。当与佐剂组合时可以加强或增加由抗原诱导的免疫应答。所述免疫应答可以是体液免疫应答和/或细胞免疫应答。在一些实施方案中，佐剂和抗原的组合可以加强或增加受试者的细胞免疫应答。在其他实施方案中，佐剂和抗原的组合可以增强或增加受试者的体液免疫应答。

抗原可以是核酸序列、氨基酸序列或其组合。所述核酸序列可以是DNA、RNA、cDNA、其变体、其片段或其组合。核酸序列还可以包含编码通过肽键连接至抗原的接头序列或标签序列的另外序列。氨基酸序列可以是蛋白质、肽、其变体、其片段或其组合。

抗原可以含于来自任何数量的有机体(例如，病毒、寄生虫、细菌、真菌或哺乳动物)的蛋白质、核酸，或其片段、其变体或其组合中。抗原可以与自身免疫疾病、过敏或哮喘相关。在其他实施方案中，抗原可以与癌症、疱疹、流感、乙型肝炎、丙型肝炎、人乳头瘤病毒(HPV)或人免疫缺陷病毒(HIV)相关。如下所述，疫苗的抗原可以选自由以下组成的组：HIV抗原、艰难梭菌抗原及其片段。HIV抗原可以选自由以下组成的组：Env A、Env B、Env C、EnvD、B Nef-Rev、Gag以及其任何组合。

一些抗原可以诱导强免疫应答。其他抗原可以诱导弱免疫应答。当如上所述与佐剂组合时，抗原可以引起更大的免疫应答。

(1)病毒抗原

抗原可以是病毒抗原，或其片段或其变体。病毒抗原可来自一种病毒，所述病毒来自以下家族之一：腺病毒科(Adenoviridae)、沙粒病毒科(Arenaviridae)、布尼亚病毒科(Bunyaviridae)、杯状病毒科(Caliciviridae)、冠状病毒科(Coronaviridae)、丝状病毒科(Filoviridae)、噬肝DNA病毒科(Hepadnaviridae)、疱疹病毒科(Herpesviridae)、正粘病毒科(Orthomyxoviridae)、乳多空病毒科(Papovaviridae)、副粘病毒科(Paramyxoviridae)、细小病毒科(Parvoviridae)、小RNA病毒科(Picornaviridae)、痘病毒科(Poxviridae)、呼肠病毒科(Reoviridae)、逆转录病毒科(Retroviridae)、弹状病毒科(Rhabdoviridae)或披膜病毒科(Togaviridae)。病毒抗原可以来自乳头瘤病毒，例如人乳头瘤病毒(HPV)、人免疫缺陷病毒(HIV)、脊髓灰质炎病毒、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、天花病毒(重型天花和轻型天花)、痘苗病毒、流感病毒、鼻病毒、登革热病毒、马脑炎病毒、风疹病毒、黄热病病毒、诺沃克病毒(Norwalk virus)、甲型肝炎病毒、人T-细胞白血病病毒(HTLV-I)、多毛细胞白血病病毒(HTLV-II)、加州脑炎病毒、汉坦病毒(Hantavirus)(出血热)、狂犬病病毒、埃博拉热病毒(Ebola fever virus)、马尔堡病毒(Marburgvirus)、麻疹病毒、腮腺炎病毒、呼吸道合胞体病毒(RSV)、单纯性疱疹1(口腔疱疹)、单纯性疱疹2(生殖器疱疹)、带状疱疹(水痘-带状疱疹，也称为水痘)、巨细胞病毒(CMV)(例如，人CMV)、爱泼斯坦-巴尔病毒(Epstein-Barr virus)(EBV)、黄病毒、口蹄疫病毒、基孔肯亚病毒(chikungunya virus)、拉沙病毒(lassa virus)、沙粒病毒或致癌病毒。

(a)肝炎抗原

IL-21可以与肝炎病毒抗原(即，肝炎抗原)或其片段或其变体联合或组合。肝炎抗原可以是来自甲型肝炎病毒(HAV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、丁型肝炎病毒(HDV)和/或戊型肝炎病毒(HEV)的抗原或免疫原。在一些实施方案中，肝炎抗原可以是编码来自HAV、HBV、HCV、HDV和HEV的一种或多种抗原的异源核酸分子(如质粒)。肝炎抗原可以是全长蛋白质的全长或免疫原性片段。

肝炎抗原可以包含共有序列和/或用于改善表达的一种或多种修饰。包括密码子优化、RNA优化和添加高效免疫球蛋白前导序列以增加构建体的免疫原性的基因修饰可以包括在经过修饰的共有序列中。共有肝炎抗原可包含信号肽，如免疫球蛋白信号肽(如IgE或IgG信号肽)，并且在一些实施方案中，可包含HA标签。可以设计免疫原，以引起比相应密码子优化的免疫原更强并且更广泛的细胞免疫应答。

肝炎抗原可以是来自HAV的抗原。肝炎抗原可以是HAV衣壳蛋白、HAV非结构蛋白、其片段、其变体或其组合。

肝炎抗原可以是来自HCV的抗原。肝炎抗原可以是HCV核衣壳蛋白(即，核心蛋白)、HCV包膜蛋白(例如，E1和E2)、HCV非结构蛋白(例如，NS1、NS2、NS3、NS4a、NS4b、NS5a和NS5b)、其片段、其变体或其组合。

肝炎抗原可以是来自HDV的抗原。肝炎抗原可以是HDVδ抗原、其片段或其变体。

肝炎抗原可以是来自HEV的抗原。肝炎抗原可以是HEV衣壳蛋白、其片段或其变体。

肝炎抗原可以是来自HBV的抗原。肝炎抗原可以是HBV核心蛋白、HBV表面蛋白、HBVDNA聚合酶、由基因X编码的HBV蛋白、其片段、其变体或其组合。肝炎抗原可以是HBV基因型A核心蛋白、HBV基因型B核心蛋白、HBV基因型C核心蛋白、HBV基因型D核心蛋白、HBV基因型E核心蛋白、HBV基因型F核心蛋白、HBV基因型G核心蛋白、HBV基因型H核心蛋白、HBV基因型A表面蛋白、HBV基因型B表面蛋白、HBV基因型C表面蛋白、HBV基因型D表面蛋白、HBV基因型E表面蛋白、HBV基因型F表面蛋白、HBV基因型G表面蛋白、HBV基因型H表面蛋白、其片段、其变体或其组合。肝炎抗原可以是共有HBV核心蛋白或共有HBV表面蛋白。

在一些实施方案中，肝炎抗原可以是HBV基因型A共有核心DNA序列构建体、连接至HBV基因型A核心蛋白的共有序列的IgE前导序列，或HBV基因型A共有核心蛋白序列。

在其他实施方案中，肝炎抗原可以是HBV基因型B共有核心DNA序列构建体、连接至HBV基因型B核心蛋白的共有序列的IgE前导序列，或HBV基因型B共有核心蛋白序列。

在另一些实施方案中，肝炎抗原可以是HBV基因型C共有核心DNA序列构建体、连接至HBV基因型C核心蛋白的共有序列的IgE前导序列，或HBV基因型C共有核心蛋白序列。

在一些实施方案中，肝炎抗原可以是HBV基因型D共有核心DNA序列构建体、连接至HBV基因型D核心蛋白的共有序列的IgE前导序列，或HBV基因型D共有核心蛋白序列。

在其他实施方案中，肝炎抗原可以是HBV基因型E共有核心DNA序列构建体、连接至HBV基因型E核心蛋白的共有序列的IgE前导序列，或HBV基因型E共有核心蛋白序列。

在一些实施方案中，肝炎抗原可以是HBV基因型F共有核心DNA序列构建体、连接至HBV基因型F核心蛋白的共有序列的IgE前导序列，或HBV基因型F共有核心蛋白序列。

在其他实施方案中，肝炎抗原可以是HBV基因型G共有核心DNA序列构建体、连接至HBV基因型G核心蛋白的共有序列的IgE前导序列，或HBV基因型G共有核心蛋白序列。

在一些实施方案中，肝炎抗原可以是HBV基因型H共有核心DNA序列构建体、连接至HBV基因型H核心蛋白的共有序列的IgE前导序列，或HBV基因型H共有核心蛋白序列。

在另一些实施方案中，肝炎抗原可以是HBV基因型A共有表面DNA序列构建体、连接至HBV基因型A表面蛋白的共有序列的IgE前导序列，或HBV基因型A共有表面蛋白序列。

在一些实施方案中，肝炎抗原可以是HBV基因型B共有表面DNA序列构建体、连接至HBV基因型B表面蛋白的共有序列的IgE前导序列，或HBV基因型B共有表面蛋白序列。

在其他实施方案中，肝炎抗原可以是HBV基因型C共有表面DNA序列构建体、连接至HBV基因型C表面蛋白的共有序列的IgE前导序列，或HBV基因型C共有表面蛋白序列。

在另一些实施方案中，肝炎抗原可以是HBV基因型D共有表面DNA序列构建体、连接至HBV基因型D表面蛋白的共有序列的IgE前导序列，或HBV基因型D共有表面蛋白序列。

在一些实施方案中，肝炎抗原可以是HBV基因型E共有表面DNA序列构建体、连接至HBV基因型E表面蛋白的共有序列的IgE前导序列，或HBV基因型E共有表面蛋白序列。

在其他实施方案中，肝炎抗原可以是HBV基因型F共有表面DNA序列构建体、连接至HBV基因型F表面蛋白的共有序列的IgE前导序列，或HBV基因型F共有表面蛋白序列。

在另一些实施方案中，肝炎抗原可以是HBV基因型G共有表面DNA序列构建体、连接至HBV基因型G表面蛋白的共有序列的IgE前导序列，或HBV基因型G共有表面蛋白序列。

在其他实施方案中，肝炎抗原可以是HBV基因型H共有表面DNA序列构建体、连接至HBV基因型H表面蛋白的共有序列的IgE前导序列，或HBV基因型H共有表面蛋白序列。

(b)人乳头瘤病毒(HPV)抗原

IL-21可以与人乳头瘤病毒(HPV)抗原或其片段或其变体联合或组合。HPV抗原可以来自引起宫颈癌、直肠癌和/或其他癌症的16型、18型、31型、33型、35型、45型、52型和58型HPV。HPV抗原可以来自引起生殖器疣并且已知为头颈癌原因的6型和11型HPV。

HPV抗原可以是来自每种HPV类型的HPV E6或E7域。例如，对于16型HPV(HPV16)，HPV16抗原可以包括HPV16E6抗原、HPV16E7抗原、其片段、其变体或其组合。类似地，HPV抗原可以是HPV 6E6和/或E7、HPV 11E6和/或E7、HPV 18E6和/或E7、HPV 31E6和/或E7、HPV 33E6和/或E7、HPV 52E6和/或E7或者HPV 58E6和/或E7、其片段、变体或组合。

(c)RSV抗原

IL-21还可以与RSV抗原或其片段或其变体联合或组合。RSV抗原可以是人RSV融合蛋白(本文中还称为“RSV F”、“RSV F蛋白”和“F蛋白”)或其片段或变体。人RSV融合蛋白在A亚型RSV与B亚型RSV之间可以是保守的。RSV抗原可以是来自RSV长链(GenBankAAX23994.1)的RSV F蛋白或其片段或变体。RSV抗原可以是来自RSV A2链(GenBankAAB59858.1)的RSV F蛋白或其片段或变体。RSV抗原可以是RSV F蛋白或其片段或变体的单体、二聚体或三聚体。RSV抗原可以是共有RSV F氨基酸序列或其片段或变体。RSV抗原可以是编码RSV F氨基酸序列或其片段或变体的优化核酸。

RSV F的融合后形式在经过免疫的动物中引起高滴度中和抗体，并且保护动物免于RSV激发。本发明在所要求的疫苗中利用这种免疫应答。根据本发明，RSV F蛋白可以呈融合前形式或融合后形式。

RSV抗原还可以是人RSV附着糖蛋白(本文中还称为“RSV G”、“RSV G蛋白”和“G蛋白”)或其片段或变体。人RSV G蛋白在A亚型RSV与B亚型RSV之间有所不同。抗原可以是来自RSV长链(GenBank AAX23993)的RSV G蛋白或其片段或变体。RSV抗原可以是来自以下的RSVG蛋白：B亚型RSV分离物H5601、B亚型RSV分离物H1068、B亚型RSV分离物H5598、B亚型RSV分离物H1123或其片段或变体。RSV抗原可以是共有RSV G氨基酸序列或其片段或变体。RSV抗原可以是编码RSV G氨基酸序列或其片段或变体的优化核酸。

在其他实施方案中，RSV抗原可以是人RSV非结构蛋白1(“NS1蛋白”)或其片段或变体。例如，RSV抗原可以是来自RSV长链(GenBank AAX23987.1)的RSV NS1蛋白或其片段或变体。RSV抗原还可以是人RSV非结构蛋白2(“NS2蛋白”)或其片段或变体。例如，RSV抗原可以是来自RSV长链(GenBank AAX23988.1)的RSV NS2蛋白或其片段或变体。RSV抗原还可以是人RSV核衣壳(“N”)蛋白或其片段或变体。例如，RSV抗原可以是来自RSV长链(GenBankAAX23989.1)的RSV N蛋白或其片段或变体。RSV抗原可以是人RSV磷蛋白(“P”)蛋白或其片段或变体。例如，RSV抗原可以是来自RSV长链(GenBank AAX23990.1)的RSV P蛋白或其片段或变体。RSV抗原还可以是人RSV基质蛋白(“M”)蛋白或其片段或变体。RSV抗原可以是来自RSV长链(GenBank AAX23991.1)的RSV M蛋白或其片段或变体。

在另一些实施方案中，RSV抗原可以是人RSV小疏水(“SH”)蛋白或其片段或变体。例如，RSV抗原可以是来自RSV长链(GenBank AAX23992.1)的RSV SH蛋白或其片段或变体。RSV抗原还可以是人RSV基质蛋白2-1(“M2-1”)蛋白或其片段或变体。例如，RSV抗原可以是来自RSV长链(GenBank AAX23995.1)的RSV M2-1蛋白或其片段或变体。RSV抗原还可以是人RSV基质蛋白2-2(“M2-2”)蛋白或其片段或变体。例如，RSV抗原可以是来自RSV长链(GenBank AAX23997.1)的RSV M2-2蛋白或其片段或变体。RSV抗原可以是RSV聚合酶L(“L”)蛋白或其片段或变体。例如，RSV抗原可以是来自RSV长链(GenBank AAX23996.1)的RSV L蛋白或其片段或变体。

在另外的实施方案中，RSV抗原可以具有NS1、NS2、N、P、M、SH、M2-1、M2-2或L蛋白的共有氨基酸序列。RSV抗原可以是人RSV蛋白或重组抗原，如由人RSV基因组编码的蛋白质中的任一种。

在其他实施方案中，RSV抗原可以是但不限于：来自RSV长链的RSV F蛋白、来自RSV长链的RSV G蛋白、共有RSV G氨基酸序列、编码RSV G氨基酸序列的优化氨基酸、RSV长链的人RSV基因组、共有RSV F氨基酸序列、编码RSV F氨基酸序列的优化氨基酸、来自RSV长链的RSV NS1蛋白、来自RSV长链的RSV NS2蛋白、来自RSV长链的RSV N蛋白、来自RSV长链的RSVP蛋白、来自RSV长链的RSV M蛋白、来自RSV长链的RSV SH蛋白、来自RSV长链的RSV M2-1蛋白、来自RSV长链的RSV M2-2蛋白、来自RSV长链的RSV L蛋白、来自B亚型RSV分离物H5601的RSV G蛋白、来自B亚型RSV分离物H1068的RSV G蛋白、来自B亚型RSV分离物H5598的RSV G蛋白、来自B亚型RSV分离物H1123的RSV G蛋白，或其片段或其变体。

(d)流感抗原

IL-21可以与流感抗原或其片段或其变体联合或组合。流感抗原是能够在哺乳动物中引起针对一种或多种流感血清型的免疫应答的那些流感抗原。抗原可以包含全长翻译产物HA0、亚单位HA1、亚单位HA2、其变体、其片段或其组合。流感血凝素抗原可以是源自多种甲型流感血清型H1株的共有序列、源自多种甲型流感血清型H2株的共有序列、含有源自不同组的多种甲型流感血清型H1株的两个不同的共有序列的部分的杂交序列或源自多种乙型流感株的共有序列。流感血凝素抗原可以来自乙型流感。

流感抗原还可以含有至少一种抗原表位，所述抗原表位可以有效对抗特定流感免疫原，针对所述流感免疫原的免疫应答可以被诱导。抗原可以提供存在于完整流感病毒中的免疫原性位点和表位的全部谱系。抗原可以是可以源自血凝素抗原序列的共有血凝素抗原序列，所述血凝素抗原序列来自一种血清型的多种甲型流感病毒株，如血清型H1或血清型H2的多种甲型流感病毒株。抗原可以是可以通过组合两个不同的共有血凝素抗原序列或其部分获得的杂交共有血凝素抗原序列。两个不同的共有血凝素抗原序列各自可以源自不同组的一种血清型的多种甲型流感病毒株，如血清型H1的多种甲型流感病毒株。抗原可以是可以源自血凝素抗原序列的共有血凝素抗原序列，所述血凝素抗原序列来自多种乙型流感病毒株。

在一些实施方案中，流感抗原可以是H1HA、H2HA、H3HA、H5HA或BHA抗原。或者，流感抗原可以是包含共有H1氨基酸序列或共有H2氨基酸序列的共有血凝素抗原。共有血凝素抗原可以是包含两个不同的共有H1序列的部分的合成杂交共有H1序列，所述两个不同的共有H1序列各自源自来自另一者的不同组的序列。为合成杂交共有H1蛋白的共有HA抗原的实例是包含U2氨基酸序列的蛋白质。共有血凝素抗原可以是源自来自乙型流感株的血凝素序列的共有血凝素蛋白，如包含共有BHA氨基酸序列的蛋白质。

共有血凝素抗原可还包含一种或多种另外的氨基酸序列元件。共有血凝素抗原可进一步在其N末端上包含IgE或IgG前导氨基酸序列。共有血凝素抗原可还包含免疫原性标签，所述免疫原性标签是可以通过可容易获得的抗体进行检测的独特免疫原性表位。所述免疫原性标签的实例是可以连接在共有血凝素C末端上的9个氨基酸的流感HA标签。在一些实施方案中，共有血凝素抗原可进一步在其N末端上包含IgE或IgG前导氨基酸序列并且在其C末端上包含HA标签。

共有血凝素抗原可以是由共有流感氨基酸序列或其片段和变体组成的共有血凝素蛋白。共有血凝素抗原可以是包含非流感蛋白质序列和流感蛋白质序列或其片段和变体的共有血凝素蛋白。

共有H1蛋白的实例包括可由共有H1氨基酸序列组成的那些共有H1蛋白或还包含另外元件(如IgE前导序列或HA标签、或IgE前导序列和HA标签二者)的那些共有H1蛋白。

共有H2蛋白的实例包括可由共有H2氨基酸序列组成的那些共有H2蛋白或还包含IgE前导序列或HA标签、或IgE前导序列和HA标签二者的那些共有H2蛋白。

杂交共有H1蛋白的实例包括可由共有U2氨基酸序列组成的那些杂交共有H1蛋白或还包含IgE前导序列或HA标签、或IgE前导序列和HA标签二者的那些杂交共有H1蛋白。

杂交共有乙型流感血凝素蛋白的实例包括可以由共有BHA氨基酸序列组成的那些杂交共有乙型流感血凝素蛋白或它可以包含IgE前导序列或HA标签，或IgE前导序列和HA标签二者。

共有血凝素蛋白可以由共有血凝素核酸、其变体或其片段编码。与可以是源自来自不同株和变体的多种不同的血凝素序列的共有序列的共有血凝素蛋白不同，共有血凝素核酸是指编码共有蛋白质序列的核酸序列，并且所使用的编码序列可以不同于用于编码共有血凝素蛋白序列所源自的多个不同的血凝素序列中的特定氨基酸序列的那些编码序列。共有核酸序列可以是密码子优化的和/或RNA优化的。共有血凝素核酸序列可包含位于5’非翻译区域中的Kozak序列。共有血凝素核酸序列可包含编码前导序列的核酸序列。N末端前导序列的编码序列是血凝素编码序列的5’。N末端前导子可以促进分泌。N末端前导子可以是IgE前导子或IgG前导子。共有血凝素核酸序列可以包含编码免疫原性标签的核酸序列。免疫原性标签可以位于蛋白质的C末端上并且编码它的序列是共有HA编码序列的3’。免疫原性标签提供独特表位，存在针对所述表位的可容易获得的抗体，以使得可以在测定中使用所述抗体来检测和证实蛋白质的表达。免疫原性标签可以是位于蛋白质的C末端处的HA标签。

(e)人免疫缺陷病毒(HIV)抗原

IL-21可以与HIV抗原或其片段或其变体联合或组合。HIV抗原可以包括经过修饰的免疫原共有序列。包括密码子优化、RNA优化和添加高效免疫球蛋白前导序列以增加构建体的免疫原性的基因修饰可以包括在经过修饰的共有序列中。可以设计新型免疫原，以引发比相应密码子优化的免疫原更强并且更广泛的细胞免疫应答。

在一些实施方案中，HIV抗原可以是A亚型共有包膜DNA序列构建体、连接至A亚型包膜蛋白的共有序列的IgE前导序列，或A亚型共有包膜蛋白序列。

在其他实施方案中，HIV抗原可以是B亚型共有包膜DNA序列构建体、连接至B亚型包膜蛋白的共有序列的IgE前导序列，或B亚型共有包膜蛋白序列

在另一些实施方案中，HIV抗原可以是C亚型共有包膜DNA序列构建体、连接至C亚型包膜蛋白的共有序列的IgE前导序列，或C亚型共有包膜蛋白序列。

在另外的实施方案中，HIV抗原可以是D亚型共有包膜DNA序列构建体、连接至D亚型包膜蛋白的共有序列的IgE前导序列，或D亚型共有包膜蛋白序列。

在一些实施方案中，HIV抗原可以是B亚型Nef-Rev共有包膜DNA序列构建体、连接至B亚型Nef-Rev蛋白的共有序列的IgE前导序列，或B亚型Nef-Rev共有蛋白序列

在其他实施方案中，HIV抗原可以是A、B、C和D亚型DNA序列构建体的Gag共有DNA序列、连接至Gag共有A、B、C和D亚型蛋白的共有序列的IgE前导序列，或共有Gag A、B、C和D亚型蛋白序列。

在另一些实施方案中，HIV抗原可以是MPol DNA序列或MPol蛋白序列。HIV抗原可以是Env A、Env B、Env C、Env D、B Nef-Rev、Gag以及其任何组合的核酸或氨基酸序列。

(2)寄生虫抗原

抗原可以是寄生虫抗原或其片段或变体。寄生虫可以是原生动物、蠕虫或外寄生物。蠕虫(即，肠虫(worm))可以是扁形虫(例如，吸虫和绦虫)、棘头虫或蛔虫(例如，蛲虫)。外寄生物可以是虱子、跳蚤、壁虱和螨虫。

寄生虫可以是引起以下疾病的任何寄生虫：棘阿米巴角膜炎、阿米巴病(Amoebiasis)、蛔虫病、巴贝西虫病(Babesiosis)、小袋虫病、浣熊蛔虫病、恰加斯病、华支睾吸虫病、锥蝇属病(Cochliomyia)、隐孢子虫病、裂头绦虫病、龙线虫病(Dracunculiasis)、包虫病、象皮病、蛲虫病、片吸虫病、姜片虫病、丝虫病、贾第鞭毛虫病、颚口线虫病、膜壳绦虫病、等孢子球虫病、片山热(Katayama fever)、利什曼病(Leishmaniasis)、莱姆病(Lyme disease)、疟疾、后殖吸虫病、蝇蛆病、盘尾丝虫病、虱病、疥疮、血吸虫病、昏睡症、类圆线虫病、绦虫病、弓蛔虫病、弓形虫病、旋毛虫病以及鞭虫病。

寄生虫可以是棘阿米巴(Acanthamoeba)、异尖线虫、人蛔虫、肤蝇、结肠小袋虫、臭虫、多节绦虫亚纲(绦虫)、恙螨、螺旋蝇蛆、溶组织内阿米巴、肝片吸虫、兰伯贾第虫(Giardia lamblia)、钩虫、利什曼虫(Leishmania)、锯齿舌形虫、肝吸虫、罗阿丝虫(Loaloa)、并殖吸虫属-肺吸虫、蛲虫、恶性疟原虫、血吸虫、粪类圆线虫、螨虫、绦虫、刚地弓形虫、锥体虫、鞭虫或吴策线虫(Wuchereria bancrofti)。

(a)疟疾抗原

IL-21可以与疟疾抗原(即，PF抗原或PF免疫原)或其片段或其变体联合或组合。抗原可以来自引起疟疾的寄生虫。引起疟疾的寄生虫可以是恶性疟原虫。恶性疟原虫抗原可以包括环子孢子(CS)抗原。

在一些实施方案中，疟疾抗原可以是编码恶性疟原虫免疫原CS、LSA1、TRAP、CelTOS和Ama1中的一个或多个的核酸分子(如质粒)。免疫原可以是全长蛋白质的全长或免疫原性片段。免疫原可包含共有序列和/或用于改善表达的修饰。

在其他实施方案中，疟疾抗原可以是从GenBank数据库中的所有全长恶性疟原虫TRAP/SSP2序列(总共28个序列)设计的TRAP(也称为SSP2)的共有序列。共有TRAP免疫原(即，ConTRAP免疫原)可包含信号肽(如免疫球蛋白信号肽，如IgE或IgG信号肽)，并且在一些实施方案中，可包含HA标签。

在另一些实施方案中，疟疾抗原可以是CelTOS，其也称为Ag2并且是高度保守的疟原虫抗原。共有CelTOS抗原(即，ConCelTOS免疫原)可包含信号肽(如免疫球蛋白信号肽，如IgE或IgG信号肽)，并且在一些实施方案中，可包含HA标签。

在另外的实施方案中，疟疾抗原可以是Ama1，其为高度保守的疟原虫抗原。疟疾抗原还可以是Ama1(即，ConAmaI免疫原)的共有序列，其在一些情况下包含信号肽(如免疫球蛋白信号肽，如IgE或IgG信号肽)，并且在一些实施方案中，可包含HA标签。

在一些实施方案中，疟疾抗原可以是共有CS抗原(即，共有CS免疫原)，其在一些情况下包含信号肽(如免疫球蛋白信号肽，如IgE或IgG信号肽)，并且在一些实施方案中，可包含HA标签。

在其他实施方案中，疟疾抗原可以是包含本文所述的两种或更多种PF蛋白的组合的融合蛋白。例如，融合蛋白可包含直接彼此相邻地连接或者间隔子以之间具有间隔子或一个或多个氨基酸连接的共有CS免疫原、ConLSA1免疫原、ConTRAP免疫原、ConCelTOS免疫原和ConAma1免疫原中的两种或更多种。在一些实施方案中，融合蛋白包含两个PF免疫原。在一些实施方案中，融合蛋白包含三个PF免疫原。在一些实施方案中，融合蛋白包含四个PF免疫原。在一些实施方案中，融合蛋白包含五个PF免疫原。

具有两个共有PF免疫原的融合蛋白可包含：CS和LSA1、CS和TRAP、CS和CelTOS、CS和Ama1、LSA1和TRAP、LSA1和CelTOS、LSA1和Ama1、TRAP和CelTOS、TRAP和Ama1；或者CelTOS和Ama1。具有三个共有PF免疫原的融合蛋白可包含：CS、LSA1和TRAP；CS、LSA1和CelTOS；CS、LSA1和Ama1；LSA1、TRAP和CelTOS；LSA1、TRAP和Ama1；或者TRAP、CelTOS和Ama1。具有四个共有PF免疫原的融合蛋白可包含：CS、LSA1、TRAP以及CelTOS；CS、LSA1、TRAP以及Ama1；CS、LSA1、CelTOS以及Ama1；CS、TRAP、CelTOS以及Ama1；或者LSA1、TRAP、CelTOS以及Ama1。具有五个共有PF免疫原的融合蛋白可包含CS或CS-alt、LSA1、TRAP、CelTOS以及Ama1。

在一些实施方案中，融合蛋白包含连接至N末端的信号肽。在一些实施方案中，融合蛋白包含连接至每个共有PF免疫原的N末端的多个信号肽。在一些实施方案中，间隔子可包含在融合蛋白的PF免疫原之间。在一些实施方案中，融合蛋白的PF免疫原之间的间隔子可以是蛋白水解裂解位点。在一些实施方案中，间隔子可以是由在意图向其施用疫苗和/或摄取疫苗的细胞内发现的蛋白酶识别的蛋白水解裂解位点。在一些实施方案中，间隔子可包含在融合蛋白的PF免疫原之间，其中间隔子是由在意图向其施用疫苗和/或摄取疫苗的细胞内发现的蛋白酶识别的蛋白水解裂解位点，并且融合蛋白包含连接至每个共有PF免疫原的N末端的多个信号肽，以使得在裂解时，每个共有PF免疫原的信号肽使相应共有PF免疫原转移至细胞外。

(3)细菌抗原

抗原可以是细菌抗原或其片段或变体。细菌可以来自以下门中的任一种：酸杆菌门、放线菌门、产水菌门、拟杆菌门、Caldiserica门、衣原体门、绿菌门、绿弯菌门、产金菌门、蓝藻菌门、脱铁杆菌门、异常球菌-栖热菌门、网团菌门、Elusimicrobia门、纤维杆菌门、厚壁菌门、梭杆菌门、芽单胞菌门、黏胶球形菌门、硝化螺旋菌门、浮霉菌门、变形菌门、螺旋菌门、互养菌门、无壁菌门、热脱硫杆菌门、热袍菌门以及疣微菌门。

细菌可以是革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌。细菌可以是好氧细菌或厌氧细菌。细菌可以是自氧细菌或异氧细菌。细菌可以是嗜温菌、嗜中性菌、嗜极菌、嗜酸菌、嗜碱菌、嗜热菌、嗜冷菌、嗜盐菌或嗜高渗菌。

细菌可以是炭疽细菌、耐抗生素细菌、致病细菌、食物中毒细菌、传染性细菌、沙门氏菌属(Salmonella)细菌、葡萄球菌属细菌、链球菌属细菌或破伤风细菌。细菌可以是分枝杆菌(mycobacteria)、破伤风梭菌(Clostridium tetani)、鼠疫杆菌(Yersinia pestis)、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus)(MRSA)或者艰难梭菌(Clostridium difficile)。

(a)结核分支杆菌抗原

IL-21可以与结核分支杆菌抗原(即，TB抗原或TB免疫原)或其片段或其变体联合或组合。TB抗原可以来自TB抗原的Ag85家族，例如Ag85A和Ag85B。TB抗原可以来自TB抗原的Esx家族，例如EsxA、EsxB、EsxC、EsxD、EsxE、EsxF、EsxH、EsxO、EsxQ、EsxR、EsxS、EsxT、EsxU、EsxV以及EsxW。

在一些实施方案中，TB抗原可以是编码来自Ag85家族和Esx家族的一种或多种结核分支杆菌免疫原的异源核酸分子(如质粒)。免疫原可以是全长蛋白质的全长或免疫原性片段。免疫原可包含共有序列和/或用于改善表达的修饰。共有免疫原可包含信号肽(如免疫球蛋白信号肽，如IgE或IgG信号肽)，并且在一些实施方案中，可包含HA标签。

(b)艰难梭菌抗原

IL-21可以与艰难梭菌抗原(即，CD抗原或CD免疫原)或其片段或其变体联合或组合。CD抗原可以是毒素A或毒素B。在一些实施方案中，CD抗原可以是编码毒素A、毒素B或毒素A和毒素B两者的异源核酸分子，如质粒。CD抗原可以是全长蛋白质或全长蛋白质的免疫原性片段。CD抗原可包含共有序列和/或用于改善表达的修饰。CD抗原可包含信号肽，如免疫球蛋白信号肽(例如，IgE或IgG信号肽)，并且在一些实施方案中，可包含HA标签。

(4)真菌抗原

抗原可以是真菌抗原或其片段或变体。真菌可以是曲霉菌属(Aspergillusspecies)、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)、假丝酵母(Candida yeasts)(例如，白色念珠菌(Candida albicans))、球孢子菌属(Coccidioides)、新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、格特隐球菌(Cryptococcus gattii)、皮肤真菌(dermatophyte)、镰刀菌属(Fusarium species)、荚膜组织胞浆菌(Histoplasmacapsulatum)、毛霉菌亚门(Mucoromycotina)、耶氏肺孢子菌(Pneumocystis jirovecii)、申克孢子丝菌(Sporothrix schenckii)、明脐菌属(Exserohilum)或者枝孢菌属(Cladosporium)。

c.载体

疫苗可以包含一种或多种载体，所述载体包含一个或多个编码抗原的异源核酸和佐剂。一种或多种载体可以能够表达抗原和佐剂。一种或多种载体可以是表达构建体，所述表达构建体通常是用于将特定基因引入靶细胞中的质粒。一旦表达载体位于细胞内部，那么通过细胞转录和翻译机器核糖体复合物产生由基因编码的蛋白质。质粒经常经过工程改造以含有调控序列，所述调控序列充当增强子和启动子区域，并且导致表达载体上携带的基因的有效转录。本发明的载体表达大量稳定的信使RNA，和因此形成的蛋白质。

载体可具有表达信号(如强启动子、强终止密码子)、启动子与克隆基因之间的距离的调节以及转录终止序列和PTIS(可移动翻译起始序列)的插入。

(1)表达载体

载体可以是环状质粒或线性核酸。环状质粒和线性核酸能够指导适当的受试者细胞中的特定异源核苷酸序列的表达。载体可以具有可操作地连接至编码抗原的核苷酸序列或编码佐剂的核苷酸序列的启动子，这些核苷酸序列可以可操作地连接至终止信号。载体还可以含有核苷酸序列的正确翻译所需的序列。包含目标核苷酸序列的载体可以是嵌合的，这意味着至少一种其组分相对于至少一种它的其他组分是异源的。表达盒中的核苷酸序列的表达可在组成型启动子或诱导型启动子的控制下，所述启动子仅在宿主细胞暴露于一些特定外部刺激时起始转录。在多细胞有机体的情况下，启动子还可以是对特定组织或器官或发育阶段特异性的。

(2)环状载体和线性载体

载体可以是环状质粒，所述环状质粒可通过整合至细胞基因组中来转化靶细胞或存在于染色体外(例如，具有复制起点的自主复制质粒)。

载体可以是pVAX、pcDNA3.0或provax，或能够表达编码抗原或佐剂的异源DNA并且使细胞能将序列翻译成由免疫系统识别的抗原或者佐剂的任何其他表达载体。

本文还提供能够经由电穿孔有效地递送至受试者并且表达一种或多种所需的抗原或者一种或多种所需的佐剂的线性核酸疫苗和/或线性表达盒(“LEC”)。LEC可以是没有任何磷酸主链的任何线性DNA。DNA可编码一种或多种抗原和/或一种或多种佐剂。LEC可包含启动子、内含子、终止密码子和/或多腺苷酸化信号。抗原或佐剂的表达可由启动子控制。LEC可不包含任何抗生素抗性基因和/或磷酸主链。LEC可不包含与所需的抗原基因表达或所需的佐剂表达不相关的其他核酸序列。

LEC可源自能够线性化的任何质粒。质粒可能够表达抗原和/或佐剂。质粒可以是pNP(Puerto Rico/34)或pM2(New Caledonia/99)。质粒可以是WLV009、pVAX、pcDNA3.0或provax，或者能够表达编码抗原或编码佐剂的DNA并且使细胞能将序列翻译成由免疫系统识别的抗原或者佐剂的任何其他表达载体。

LEC可以是pcrM2。LEC可以是pcrNP。pcrNP和pcrMR可以分别源自pNP(PuertoRico/34)和pM2(New Caledonia/99)。

(3)启动子、内含子、终止密码子和多腺苷酸化信号

载体可具有启动子。启动子可以是能够驱动基因表达并且调控所分离核酸的表达的任何启动子。所述启动子是经由DNA依赖性RNA聚合酶转录所需的顺式作用序列元件，所述顺式作用序列元件转录本文所描述的抗原序列或佐剂序列。用于指导异源核酸表达的启动子的选择取决于具体应用。在载体中，启动子可定位在距离转录起始点与其天然环境中距离转录起始位点大约相同的位置上。然而，可容许所述距离的变化而不损失启动子功能。

启动子可以可操作地连接至编码抗原以及转录物的有效多腺苷酸化、核糖体结合位点和翻译终止所需的信号的核酸序列。启动子可以可操作地连接至编码佐剂和转录物的高效多腺苷酸化、核糖体结合位点和翻译终止所需的信号的核酸序列。

启动子可以是CMV启动子、SV40早期启动子、SV40晚期启动子、金属硫蛋白启动子、鼠乳腺肿瘤病毒启动子、劳斯(Rous)肉瘤病毒启动子、多角体蛋白启动子，或对于真核细胞中的表达显示有效的另一种启动子。

载体可包含增强子和具有功能性剪接供体和受体位点的内含子。载体可含有位于结构基因下游的转录终止区来提供有效终止。可从与启动子序列相同的基因获得或可从不同的基因获得终止区。

d.赋形剂和疫苗的其他组分

疫苗可还包含药学上可接受的赋形剂。药学上可接受的赋形剂可以是功能性分子，如媒介物、除IL-21之外的佐剂、载体或稀释剂。所述药学上可接受的赋形剂可以是转染促进剂，其可包括表面活性剂如免疫刺激复合物(ISCOMS)、费氏(Freunds)不完全佐剂、LPS类似物(包括单磷酰酯A)、胞壁肽、苯醌类似物、囊泡如角鲨烯和角鲨烯、透明质酸、脂质、脂质体、钙离子、病毒蛋白质、聚阴离子、聚阳离子或纳米粒子或其他已知的转染促进剂。

转染促进剂可以是聚阴离子、聚阳离子(包括聚-L-谷氨酸盐(LGS))或脂质。转染促进剂可以是聚-L-谷氨酸盐，并且聚-L-谷氨酸盐可以小于6mg/ml的浓度存在于疫苗中。转染促进剂还可包括表面活性剂，如免疫刺激复合物(ISCOMS)、弗氏不完全佐剂、LPS类似物(包括单磷酰脂质A)、胞壁酰肽、醌类似物以及囊泡(如角鲨烯和角鲨烯)。透明质酸还可结合基因构建体施用而使用。DNA质粒疫苗还可包含转染促进剂，如脂质、脂质体(包括卵磷脂脂质体或本领域已知的其他脂质体，如DNA-脂质体混合物(参见例如W09324640))、钙离子、病毒蛋白、聚阴离子、聚阳离子或纳米颗粒，或其他已知的转染促进剂。疫苗中的转染剂的浓度小于4mg/ml、小于2mg/ml、小于1mg/ml、小于0.750mg/ml、小于0.500mg/ml、小于0.250mg/ml、小于0.100mg/ml、小于0.050mg/ml或小于0.010mg/ml。

药学上可接受的赋形剂可以是除IL-21之外的佐剂。另外的佐剂可以是在替代性质粒中表达的或在疫苗中作为蛋白质与以上质粒组合递送的其他基因。佐剂可选自由以下各项组成的组：α-干扰素(IFN-α)、β-干扰素(IFN-β)、γ-干扰素、血小板衍生的生长因子(PDGF)、TNFα、TNFβ、GM-CSF、表皮生长因子(EGF)、皮肤T细胞虏获趋化因子(CTACK)、上皮胸腺表达趋化因子(TECK)、粘膜相关上皮趋化因子(MEC)、IL-12、IL-15、MHC、CD80、CD86(包括信号序列缺失的IL-15并且任选地包括来自IgE的信号肽)。佐剂可以是IL-12、IL-15、IL-28、CTACK、TECK、血小板衍生的生长因子(PDGF)、TNFα、TNFβ、GM-CSF、表皮生长因子(EGF)、IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、IL-18或其组合。

可用作除了IL-21之外的佐剂的其他基因包括编码以下的那些基因：MCP-1、MIP-la、MIP-1p、IL-8、RANTES、L-选择素(L-selectin)、P-选择素、E-选择素、CD34、GlyCAM-1、MadCAM-1、LFA-1、VLA-1、Mac-1、pl50.95、PECAM、ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、CD2、LFA-3、M-CSF、G-CSF、IL-4、IL-18的突变形式、CD40、CD40L、血管生长因子、成纤维细胞生长因子、IL-7、神经生长因子、血管内皮生长因子、Fas、TNF受体、Flt、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2、DR6、半胱天冬酶(Caspase)ICE、Fos、c-jun、Sp-1、Ap-1、Ap-2、p38、p65Re1、MyD88、IRAK、TRAF6、IkB、不活化NIK、SAP K、SAP-1、JNK、干扰素应答基因、NFkB、Bax、TRAIL、TRAILrec、TRAILrecDRC5、TRAIL-R3、TRAIL-R4、RANK、RANK配体、Ox40、Ox40配体、NKG2D、MICA、MICB、NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2E、NKG2F、TAP1、TAP2及其功能片段。

疫苗可还包含如1994年4月1日提交的美国序列号021,579中所描述的基因疫苗促进剂，所述专利文献以引用的方式全部并入。

可以根据待使用的施用方式来配制疫苗。可注射的疫苗药物组合物可以是无菌、不含热原并且不含微粒的。可以使用等渗制剂或溶液。用于等渗性的添加剂可以包括氯化钠、右旋糖、甘露醇、山梨醇和乳糖。疫苗可以包含血管收缩剂。等渗溶液可以包括磷酸盐缓冲盐水。疫苗可以还包含稳定剂(包括明胶和白蛋白)。稳定剂可以允许制剂在室温或环境温度下稳定持续延长的时间段，所述稳定剂包括LGS或聚阳离子或聚阴离子。

3.接种疫苗的方法

本发明还涉及通过不同的疫苗施用途径来增加受试者中的免疫应答的方法。增加免疫应答可用于治疗和/或预防受试者的疾病。

所述方法可以包括向受试者施用本文所公开的疫苗。与仅施用抗原的受试者相比，施用疫苗的受试者具有增加或加强的免疫应答。在一些实施方案中，施用疫苗的受试者中的免疫应答可以增加约18％至约650％。或者，施用疫苗的受试者中的免疫应答可以增加约45％至约260％。在另一些替代实施方案中，施用疫苗的受试者中的免疫应答可以增加约93％至约130％。

在其他实施方案中，所施用的疫苗可以使受试者中的免疫应答增加或增强至少约1.5倍、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、或至少约10倍。

疫苗剂量可以是在1μg至10mg之间的活性组分/kg体重/时间，并且可以是20μg至10mg组分/kg体重/时间。可以每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或31天施用疫苗。用于有效治疗的疫苗剂量的数目可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。

a.施用

所述疫苗可根据药物领域中的技术人员熟知的标准技术来配制。这类组合物可通过医学领域技术人员熟知的技术以考虑到如具体受试者的年龄、性别、体重和条件及施用途径的剂量来施用。受试者可以是哺乳动物，如人、马、牛、猪、绵羊、猫、狗、大鼠或小鼠。

可以预防性地或治疗性地施用疫苗。在预防性施用中，可以足以诱导免疫应答的量施用疫苗。在治疗性应用中，以足以引起治疗效果的量向有需要的受试者施用疫苗。将足够实现此目标的量定义为“治疗有效剂量”。对于这种用途有效的量取决于(例如)所施用的疫苗方案的具体组成、施用方式、疾病的阶段和严重程度、患者的总体健康状况以及处方医师的判断。

可以通过如文献中所描述的本领域熟知的方法来施用疫苗，所述文献如下：Donnelly等(Ann.Rev.Immunol.15:617-648(1997))；Felgner等(美国专利号5,580,859，1996年12月3日发布)；Felgner(美国专利号5,703,055，1997年12月30日发布)；以及Carson等(美国专利号5,679,647，1997年10月21日发布)，所有所述文献的内容以引用的方式整体并入本文。可以(例如)使用疫苗枪将疫苗的DNA与可以施用至个体的颗粒或珠粒进行复合。本领域的技术人员将知道药学上可接受的载体(包括生理学上可接受的化合物)的选择取决于(例如)表达载体的施用途径。

可以经由多种途径来递送疫苗。典型的递送途径包括肠胃外施用，例如，皮内、肌内或皮下递送。其他途径包括口服施用、鼻内和阴道内途径。特别是对于疫苗的DNA，疫苗可以递送到个体组织的间质空间(Felgner等，美国专利号5,580,859和5,703,055，所有所述专利的内容以引用方式整体并入本文)。还可以将疫苗施用至肌肉，或可以经由皮内或皮下注射或经皮(如通过离子电渗疗法)施用。还可以采用疫苗的表皮施用。表皮施用可以涉及机械地或化学地刺激表皮的最外层，以刺激对刺激物的免疫应答(Carson等，美国专利号5,679,647，所述专利的内容以引用的方式整体并入本文)。

还可以配制疫苗，用于经由鼻通道施用。适合用于经鼻施用的制剂(其中载体是固体)可以包括具有(例如)在约10微米至约500微米范围中的颗粒大小的粗糙粉末，所述粗糙粉末以其中采用鼻吸的方式来施用，即，通过鼻道从靠近鼻子的粉末的容器中快速吸入。制剂可以是鼻用喷雾剂、滴鼻剂或通过喷雾器进行气雾剂施用。制剂可以包含疫苗的水性溶液或油性溶液。

疫苗可以是液体制剂，如混悬剂、糖浆或酏剂。疫苗还可以是用于肠胃外、皮下、皮内、肌内或静脉内施用(例如，可注射施用)的制剂，如无菌混悬剂或乳剂。

疫苗可以掺入脂质体、微球或其他聚合物基体中(Felgner等，美国专利号5,703,055；Gregoriadis，Liposome Technology,第I卷至第III卷(第2版，1993)，所述文献的内容以引用方式整体并入本文)。脂质体可以由磷脂或其他脂质组成，并且可以是制造和施用相对简单的无毒的、生理学上可接受的和可代谢的载体。

可以经由电穿孔，(如)通过美国专利号7,664,545中所描述的方法来施用疫苗，所述专利的内容以引用的方式并入本文。电穿孔可以通过美国专利号6,302,874、5,676,646、6,241,701、6,233,482、6,216,034、6,208,893、6,192,270、6,181,964、6,150,148、6,120,493、6,096,020、6,068,650和5,702,359中所描述的方法和/或装置来进行，所述专利的内容以引用的方式整体并入本文。可经由微创设备来进行电穿孔。

微创电穿孔设备(“MID”)可以是用于将以上所描述的疫苗和相关流体注射至身体组织中的装置。所述设备可包括中空针、DNA盒和流体递送部件，其中所述设备适于在使用中致动流体递送部件，以便在将针插入身体组织中的过程中同时(例如，自动地)将DNA注射至所述身体组织中。这具有以下优点：在插入针的同时逐渐注射DNA和相关流体的能力导致通过身体组织的流体的更均匀分布。由于注射的DNA分布在较大面积上，可减少注射过程中经受的疼痛。

MID可在不使用针的情况下将疫苗注射至组织中。MID可将疫苗作为小的流或射流以使得疫苗穿透组织的表面并且进入下层组织和/或肌肉的力进行注射。小的流或射流之后的力可由压缩气体(如在几分之一秒内通过微小孔的二氧化碳)的膨胀提供。微创性电穿孔装置及其使用方法的实例描述于公布的美国专利申请号20080234655；美国专利号6,520,950；美国专利号7,171,264；美国专利号6,208,893；美国专利号6,009,347；美国专利号6,120,493；美国专利号7,245,963；美国专利号7,328,064；和美国专利号6,763,264中，所述专利各自的内容以引用的方式并入本文。

MID可包括产生无痛地穿透组织的液体的高速射流的注射器。这类无针注射器可商购获得。本文可以使用的无针注射器的实例包括美国专利号3,805,783、4,447,223、5,505,697和4,342,310中所描述的那些，每个所述专利的内容以引用的方式并入本文。

可以使用无针注射器将呈适用于直接或间接电转运形式的所需的疫苗引入(例如注射)至待治疗的组织中，通常通过将组织表面与注射器接触，以便以足以导致疫苗渗透至组织中的力致动药剂射流的递送。例如，如果待治疗的组织是粘膜、皮肤或肌肉，那么将药剂朝向粘膜或皮肤表面以足以导致药剂渗透穿过角质层并且进入真皮层中或分别进入下层组织和肌肉中的力进行喷射。

无针注射器非常适合于将疫苗递送至所有类型的组织，特别是递送至皮肤和粘膜。在一些实施方案中，无针注射器可以用于将含有疫苗的液体推送至表面并且进入受试者的皮肤或粘膜中。可以使用本发明的方法治疗的各种类型的组织的代表性实例包括胰腺、喉、鼻咽、下咽部、口咽、唇、咽、肺、心脏、肾、肌肉、乳房、结肠、前列腺、胸腺、睾丸、皮肤、粘膜组织、卵巢、血管或其任何组合。

MID可具有将组织电穿孔的针电极。通过在多电极阵列(例如设置成矩形或正方形图案)中的多对电极之间脉冲来提供优于在一对电极之间脉冲的结果的改良的结果。例如于题为“Needle Electrodes for Mediated Delivery of Drugs and Genes”的美国专利号5,702,359中公开针阵列，其中可在治疗性处理过程中对多对针产生脉冲。在所述应用中(其以引用的方式并入本文，如同其全文陈述一样)，针安置在环形阵列中，但具有连接器和转换装置，从而实现相对对的针电极之间的脉冲。可使用用于将重组表达载体递送至细胞的一对针电极。这种设备和系统在美国专利号6,763,264中进行描述，所述专利的内容以引用的方式并入本文。或者，可使用单针设备，所述设备允许DNA注射和使用类似于正常注射针的单针电穿孔并且施加比通过目前所使用设备递送的电压低的电压的脉冲，从而减少患者经受的电感觉。

MID可包括一个或多个电极阵列。阵列可包括具有相同直径或不同直径的两个或多个针。针可均匀或不均匀地间隔开。针可介于0.005英寸与0.03英寸之间、0.01英寸与0.025英寸之间，或0.015英寸与0.020英寸之间。针的直径可以是0.0175英寸。针可间隔开0.5mm、1.0mm、1.5mm、2.0mm、2.5mm、3.0mm、3.5mm、4.0mm或更多。

MID可由脉冲发生器和在单个步骤中递送疫苗和电穿孔脉冲的两个或更多个针疫苗注射器组成。脉冲发生器可允许经由闪存卡操作的个人计算机灵活地编程脉冲和注射参数，以及电穿孔和患者数据的全面记录和储存。脉冲发生器可在短的时间段期间递送多种伏特脉冲。例如，脉冲发生器可递送100ms持续时间的三个15伏特脉冲。所述MID的实例是Inovio Biomedical Corporation的Elgen 1000系统，所述系统在美国专利号7,328,064中进行描述，所述专利的内容以引用的方式并入本文。

MID可以是CELLECTRA(Inovio Pharmaceuticals，Blue Bell PA)设备和系统，其是便于将大分子(如DNA)引入身体或植物中选定组织的细胞中的模块化电极系统。模块化电极系统可包括多个针电极、皮下针、提供从可编程恒流脉冲控制器至多个针电极的导电链路的电连接器，以及电源。操作者可以抓住固定在支撑结构上的多个针电极并将它们坚固地插入到身体或植物中所选定的组织中。然后经由皮下针将大分子递送到选定组织中。启动可编程的恒定电流脉冲控制器，并将恒定电流电脉冲施加到多个针电极中。所施加的恒流电脉冲促进将大分子引入多个电极之间的细胞中。由于细胞的过度加热造成的细胞死亡通过借助于恒流脉冲限制组织中的功率消耗而得以最小化。Cellectra设备和系统在美国专利号7,245,963中进行描述，所述专利的内容以引用的方式并入本文。

MID可以是Elgen 1000系统(Inovio Pharmaceuticals)。Elgen 1000系统可包括提供中空针的设备；和流体递送部件，其中装置适于在使用中致动流体递送部件，以便在将针插入身体组织中的过程中同时(例如，自动地)将流体(本文所描述的疫苗)注射至所述身体组织中。优点是：在插入针的同时逐渐注射流体的能力导致通过身体组织的流体的更均匀分布。还据信，由于注射的流体的体积分布在较大面积上，减少了在注射过程中经受的疼痛。

此外，流体的自动注射有助于所注射流体的实际剂量的自动监测和配准。可以根据需要出于文件编制目的通过控制单元来储存这一数据。

应理解，注射速率可以是线性或非线性的，并且可在已经将针插入穿过待治疗的受试者的皮肤之后并且在将所述针进一步插入身体组织中时进行注射。

可通过本发明的装置将流体注射至其中的适合组织包括肿瘤组织、皮肤或肝组织，但也可以是肌肉组织。

装置还包括用于引导针插入身体组织中的针插入部件。通过针插入的速率来控制流体注射的速率。这具有以下优点：既可以控制针插入，又可以控制流体的注射，以使得可以根据需要使插入速率与注射速率相匹配。它还使装置更易于用户操作。如果需要，可以提供用于将针自动地插入身体组织中的部件。

用户可以选择何时开始流体的注射。然而，理想地，在针的尖端到达肌肉组织时开始注射，并且装置可包括用于感测针何时插入至足以开始注射流体的深度的部件。这意味着当针达到所需深度(其将通常是肌肉组织开始处的深度)时，可以提示以自动地开始流体的注射。肌肉组织开始处的深度可以(例如)采用为预设针插入深度(如4mm的值)，所述深度将被认为是对于针穿过皮肤层来说是足够的。

感测部件可包括超声探针。感测部件可包括用于感测阻抗或电阻的变化的部件。在这种情况下，部件可不如此记录针在身体组织中的深度，而将相反适于随着针从不同类型的身体组织移动至肌肉中来感测阻抗或电阻的变化。这些替代方案中的任一个提供相对准确和简单地操作的感测可开始注射的部件。可以根据需要进一步记录针的插入深度，并且所述深度可以用于控制流体的注射，以使得根据正被记录的针的插入深度来确定待注射的流体的体积。

装置可还包括：用于支撑针的底座和用于在其中接纳底座的壳体，其中底座可相对于壳体移动，以使得当底座相对于壳体处于第一后方位置时，针缩回壳体内，并且当底座在壳体内处于第二前方位置时，针延伸出壳体外。由于壳体可以在患者的皮肤上对准，并且然后可以通过相对于底座移动壳体来将针插入患者的皮肤中，所以这对于用户来说是有利的。

如上所述，希望实现流体注射的受控速率，以使得在将针插入皮肤中时，流体在针的长度上均匀分布。流体递送部件可包括适于以受控速率注射流体的活塞驱动部件。可以(例如)通过伺服马达来激活活塞驱动部件。然而，可通过在轴向方向上相对于壳体移动的底座来致动活塞驱动部件。应理解，可以提供用于流体递送的替代装置。因此，(例如)可以提供可以被挤压用于以受控或非受控速率流体递送的的封闭容器来代替注射管和活塞系统。

以上所描述的装置可以用于任何类型的注射。然而，设想到它在电穿孔的领域中尤其有用，并且因此它可还包括用于向针施加电压的部件。这允许针不仅用于注射，而且还用作电穿孔过程中的电极。这一点是尤其有利的，因为它意味着电场被施加至与所注射的流体相同的面积上。传统上电穿孔存在很难准确地将电极与之前注射的流体对准的问题，并且因此用户倾向于在较大的面积上注射大于所要求的体积的流体，并且在较高的面积上施加电场，以试图确保所注射的物质与电场之间的重叠。使用本发明，可减少所注射流体的体积和所施加电场的大小，同时实现电场与流体之间的良好配合。

本发明具有多个方面，所述方面通过以下非限制性实施例说明。

3.实施例

实施例1

IL-21的表达

构建编码IL-21基因的质粒(即pVAX-mIL-21Opt)以表达IL-21(图1)。在插入质粒中之前，对IL-21的DNA序列进行密码子和RNA优化。

将质粒转染到HEK 293T细胞中以确认IL-21的表达。通过ELISA分析细胞上清液。结果显示，IL-21在HEK 293T细胞中表达(图2)。

实施例2

IL-21增加IGG和IGA血清滴度

当通过肌内途径施用疫苗时，将小鼠用作模型系统来确定IL-21是否可以起到作为佐剂的作用。疫苗包含由各自的质粒编码的来自艰难梭菌的毒素A和毒素B抗原以及IL-21。

具体地说，用质粒pVAX-mIL-21Opt(图1和上文实施例1中所述)和如上所述编码来自艰难梭菌的毒素A和毒素B抗原的质粒免疫一组小鼠。仅用编码毒素A和毒素B抗原的质粒免疫第二组小鼠。仅用空对照质粒pVAX免疫第三组小鼠。通过使用电穿孔的肌内途径免疫小鼠。接着在免疫动物的血液中分析循环的抗原特异性IgG和IgA抗体分泌细胞，以确定IL-21佐剂的影响。

如图4的上图所示，与用单独抗原进行的免疫相比，IL-21佐剂增加血清抗毒素AIgG的总量，在IL-21组中看到在1:2000稀释度下的强劲滴度，而在仅接受抗原的组没有看到。当分析血清IgA时，注意到包含IL-21佐剂产生在1:2000稀释度下滴定出的可检测水平的抗原特异性IgA，而用单独抗原进行的免疫在初试动物中未显示任何强劲信号(图4下图)。

以上数据显示：当通过肌内途径施用时，IL-21具有用作佐剂能力，因为IL-21增强了对来自艰难梭菌的毒素A和毒素B抗原的体液免疫应答。以上数据还表明，IL-21能够用作细菌抗原的佐剂。

实施例3

IL-21增加对HIV抗原的细胞和体液免疫应答

IL-21佐剂还与编码来自HIV的EnvA和EnvC抗原的质粒组合施用。在疫苗中包含IL-21增强了对EnvC的细胞免疫应答和体液免疫应答。疫苗包含来自HIV的EnvA和EnvC抗原以及IL-21。EnvA抗原、EnvC抗原和IL-21由单独质粒编码。

具体地，EnvA抗原是由SEQ ID NO:5中所列出的核苷酸序列编码的共有蛋白质(SEQ ID NO:6)。将SEQ ID NO:5中所列出的这种核苷酸序列掺入质粒中。

EnvC抗原是由SEQ ID NO:7中所列出的核苷酸序列编码的共有蛋白质(SEQ IDNO:8)。将SEQ ID NO:7中所列出的这种核苷酸序列掺入质粒中。

具体地说，用质粒pVAX-mIL-21Opt(图1和上文实施例1中所述)和如上所述编码EnvA和EnvC抗原的质粒免疫一组小鼠。仅用编码EnvA和EnvC抗原的质粒免疫第二组小鼠。仅用空对照质粒pVAX免疫第三组小鼠。通过使用电穿孔的肌内途径免疫小鼠。使用干扰素γELISpot测定来检验免疫组小鼠中的细胞免疫应答。

如图5所示，与单独的抗原相比，用IL-21进行的免疫使对EnvC抗原的细胞免疫应答增加大于2倍。因此，这些数据表明，IL-21能够在肌肉组织中用作佐剂，因为IL-21增强了对EnvA和EnvC抗原的细胞免疫应答。

在通过针对EnvA蛋白的ELISA进行第三免疫之后，在免疫动物的血清中测量抗体应答(图6)。在1:400稀释度下，HIV EnvA/C的平均O.D.为大约0.6，而IL-21佐剂组的平均O.D.读数为1.0。

综合来看，这些数据表明当包含在DNA疫苗中时，IL-21发挥出呈以下形式的新型佐剂活性：抗体分泌细胞的频率增加、所产生IgG的量和类别转换、IgA产生量的增加和IFN-γ分泌增加。

应理解先前详细描述和随附实施例仅是说明性的，并且不应视为对本发明的范围的限制，所述范围仅由随附权利要求和它们的等效物限定。

所公开的实施方案的各种改变和改进对本领域技术人员是显而易见的。在不偏离其本质和范围的前提下，可进行与包括但不限于本发明的化学结构、取代基、衍生物、中间体、合成、组合物、制剂和/或使用方法有关的此类改变和改进。

序列表

<110> 宾夕法尼亚大学理事会

艾诺奥医药品有限公司

大卫·B·韦纳

马修·P·莫罗

<120> 具有白细胞介素-21作为佐剂的疫苗

<130> 206108-0032-00-WO.604750/UPVG0052

<150> US 62/058,304

<151> 2014-10-01

<160> 9

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 495

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 化学合成的

<400> 1

atggactgga cctggatcct gttcctggtc gccgcagcca caagggtgca cagcgagagg 60

accctggtct gcctggtggt gatcttcctg ggcaccgtgg cccacaagag cagcccccag 120

ggccccgaca ggctgctgat caggctgagg cacctgatcg acatcgtgga gcagctgaag 180

atctacgaga acgacctgga ccccgagctg ctctccgccc ctcaagacgt gaagggccac 240

tgcgagcacg ccgccttcgc ctgcttccag aaggccaagc tgaagcccag caaccccggc 300

aacaacaaga ccttcatcat cgacctggtg gcccagctga gaagaaggct gcccgccaga 360

aggggcggca agaagcagaa acacatcgcc aagtgcccca gctgcgacag ctacgagaag 420

aggaccccca aggaatttct ggagaggctg aagtggctgc tgcagaagat gattcaccag 480

cacctgagct gatga 495

<210> 2

<211> 163

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 化学合成的

<400> 2

Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val

1 5 10 15

His Ser Glu Arg Thr Leu Val Cys Leu Val Val Ile Phe Leu Gly Thr

20 25 30

Val Ala His Lys Ser Ser Pro Gln Gly Pro Asp Arg Leu Leu Ile Arg

35 40 45

Leu Arg His Leu Ile Asp Ile Val Glu Gln Leu Lys Ile Tyr Glu Asn

50 55 60

Asp Leu Asp Pro Glu Leu Leu Ser Ala Pro Gln Asp Val Lys Gly His

65 70 75 80

Cys Glu His Ala Ala Phe Ala Cys Phe Gln Lys Ala Lys Leu Lys Pro

85 90 95

Ser Asn Pro Gly Asn Asn Lys Thr Phe Ile Ile Asp Leu Val Ala Gln

100 105 110

Leu Arg Arg Arg Leu Pro Ala Arg Arg Gly Gly Lys Lys Gln Lys His

115 120 125

Ile Ala Lys Cys Pro Ser Cys Asp Ser Tyr Glu Lys Arg Thr Pro Lys

130 135 140

Glu Phe Leu Glu Arg Leu Lys Trp Leu Leu Gln Lys Met Ile His Gln

145 150 155 160

His Leu Ser

<210> 3

<211> 537

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 化学合成的

<400> 3

atggactgga cttggattct gtttctggtc gcagcagcaa ctagagtgca ttcacgcagc 60

agccctggga acatggagag gattgtcatc tgcctgatgg tgattttcct gggcacactg 120

gtccacaaga gctcctctca gggacaggac aggcatatga tcaggatgcg acagctgatc 180

gacatcgtgg atcagctgaa gaactacgtg aacgacctgg tcccagagtt tctgcctgca 240

ccagaggatg tcgaaactaa ctgcgaatgg agtgccttct catgtttcca gaaggcacag 300

ctgaagtccg ctaacaccgg aaacaatgag cgaatcatca acgtgagcat taagaaactg 360

aagcgaaagc cccctagtac caatgctggc cggagacaga agcacagact gacatgccct 420

agctgtgatt cctacgaaaa gaaaccaccc aaggagttcc tggaacgctt taaaagcctg 480

ctgcagaaaa tgattcacca gcacctgtct tccagaaccc acggctcaga ggattca 537

<210> 4

<211> 179

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 化学合成的

<400> 4

Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val

1 5 10 15

His Ser Arg Ser Ser Pro Gly Asn Met Glu Arg Ile Val Ile Cys Leu

20 25 30

Met Val Ile Phe Leu Gly Thr Leu Val His Lys Ser Ser Ser Gln Gly

35 40 45

Gln Asp Arg His Met Ile Arg Met Arg Gln Leu Ile Asp Ile Val Asp

50 55 60

Gln Leu Lys Asn Tyr Val Asn Asp Leu Val Pro Glu Phe Leu Pro Ala

65 70 75 80

Pro Glu Asp Val Glu Thr Asn Cys Glu Trp Ser Ala Phe Ser Cys Phe

85 90 95

Gln Lys Ala Gln Leu Lys Ser Ala Asn Thr Gly Asn Asn Glu Arg Ile

100 105 110

Ile Asn Val Ser Ile Lys Lys Leu Lys Arg Lys Pro Pro Ser Thr Asn

115 120 125

Ala Gly Arg Arg Gln Lys His Arg Leu Thr Cys Pro Ser Cys Asp Ser

130 135 140

Tyr Glu Lys Lys Pro Pro Lys Glu Phe Leu Glu Arg Phe Lys Ser Leu

145 150 155 160

Leu Gln Lys Met Ile His Gln His Leu Ser Ser Arg Thr His Gly Ser

165 170 175

Glu Asp Ser

<210> 5

<211> 2142

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 化学合成的

<400> 5

ggatccatgg actggacctg gattctgttc ctggtggccg ccgccaccag agtgcacagc 60

agagtgatgg gcatccagcg gaattgccag cacctgtgga gatggggcac catgatcctg 120

ggcatgatca tcatctgctc tgccgccgag aacctgtggg tgaccgtgta ctacggcgtg 180

cctgtgtgga aggacgccga gaccaccctg ttctgcgcca gcgacgccaa ggcctacgat 240

accgaagtgc acaatgtgtg ggccacccac gcctgcgtgc ctaccgatcc caacccccag 300

gagatcaacc tggagaacgt gaccgaggag ttcaacatgt ggaagaacaa catggtggag 360

cagatgcaca ccgacatcat cagcctgtgg gaccagagcc tgaagccttg cgtgaagctg 420

acccctctgt gcgtgaccct gaactgcagc aacgtgaacg tgaccaccaa catcatgaag 480

ggcgagatca agaactgcag cttcaacatg accaccgagc tgcgggacaa gaagcagaaa 540

gtgtacagcc tgttctacaa gctggacgtg gtgcagatca acaagagcaa cagcagcagc 600

cagtaccggc tgatcaactg caacaccagc gccatcaccc aggcctgccc caaagtgagc 660

ttcgagccca tccccatcca ctactgcgcc cctgccggct tcgccatcct gaagtgcaag 720

gacaaggagt ttaacggcac cggcccctgc aagaatgtga gcaccgtgca gtgcacccac 780

ggcatcaagc ccgtggtgtc cacccagctg ctgctgaacg gcagcctggc cgaggaggaa 840

gtgatgatcc ggagcgagaa catcaccaac aacgccaaga acatcatcgt gcagctgacc 900

aagcccgtga agatcaattg cacccggccc aacaacaaca cccggaagag catcagaatc 960

ggccctggcc aggccttcta cgccaccggc gacatcatcg gcgatatcag gcaggcccac 1020

tgcaatgtga gccggaccga gtggaacgag accctgcaga aagtggccaa gcagctgcgg 1080

aagtacttca acaacaagac catcatcttc accaacagca gcggcggcag actgagaatc 1140

accacccaca gcttcaattg tggcggcgag ttcttctact gcaatacctc cggcctgttc 1200

aacagcacct ggaacggcaa cggcaccaag aagaagaaca gcaccgagag caacgacacc 1260

atcaccctgc cctgccggat caagcagatc atcaatatgt ggcagagggt gggccaggcc 1320

atgtacgccc ctcccatcca gggcgtgatc agatgcgaga gcaacatcac cggcctgctg 1380

ctgaccagag atggcggcga caacaacagc aagaacgaga ccttcagacc tggcggcgga 1440

gacatgaggg acaactggcg gagcgagctg tacaagtaca aagtggtgaa gatcgagccc 1500

ctgggcgtgg cccccaccaa ggccaagaga agagtggtgg agcgggagaa gagagctgtg 1560

ggcatcggcg ccgtgttcct gggcttcctg ggagccgccg gaagcaccat gggagccgcc 1620

agcatcaccc tgaccgtgca ggccagacag ctgctgagcg gcattgtgca gcagcagagc 1680

aacctgctga gagccatcga ggcccagcag cacctgctga agctgacagt gtggggcatc 1740

aaacagctgc aggcccgcgt gctggccgtg gagagatacc tgaaggacca gcagctgctg 1800

ggcatctggg gctgcagcgg caagctgatc tgcaccacca acgtgccctg gaatagcagc 1860

tggagcaaca agagccagag cgagatctgg gacaacatga cctggctgca gtgggacaag 1920

gagatcagca actacaccga tatcatctac aacctgatcg aggagagcca gaaccagcag 1980

gagaagaacg agcaggatct gctggccctg gacaagtggg ccaacctgtg gaactggttc 2040

gacatcagca actggctgtg gtacatcaag atcttcatca tgattgtggg cggcctgatc 2100

ggcctgagaa tcgtgttcgc cgtgctgtct gtgtgactcg ag 2142

<210> 6

<211> 709

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 化学合成的

<400> 6

Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val

1 5 10 15

His Ser Arg Val Met Gly Ile Gln Arg Asn Cys Gln His Leu Trp Arg

20 25 30

Trp Gly Thr Met Ile Leu Gly Met Ile Ile Ile Cys Ser Ala Ala Glu

35 40 45

Asn Leu Trp Val Thr Val Tyr Tyr Gly Val Pro Val Trp Lys Asp Ala

50 55 60

Glu Thr Thr Leu Phe Cys Ala Ser Asp Ala Lys Ala Tyr Asp Thr Glu

65 70 75 80

Val His Asn Val Trp Ala Thr His Ala Cys Val Pro Thr Asp Pro Asn

85 90 95

Pro Gln Glu Ile Asn Leu Glu Asn Val Thr Glu Glu Phe Asn Met Trp

100 105 110

Lys Asn Asn Met Val Glu Gln Met His Thr Asp Ile Ile Ser Leu Trp

115 120 125

Asp Gln Ser Leu Lys Pro Cys Val Lys Leu Thr Pro Leu Cys Val Thr

130 135 140

Leu Asn Cys Ser Asn Val Asn Val Thr Thr Asn Ile Met Lys Gly Glu

145 150 155 160

Ile Lys Asn Cys Ser Phe Asn Met Thr Thr Glu Leu Arg Asp Lys Lys

165 170 175

Gln Lys Val Tyr Ser Leu Phe Tyr Lys Leu Asp Val Val Gln Ile Asn

180 185 190

Lys Ser Asn Ser Ser Ser Gln Tyr Arg Leu Ile Asn Cys Asn Thr Ser

195 200 205

Ala Ile Thr Gln Ala Cys Pro Lys Val Ser Phe Glu Pro Ile Pro Ile

210 215 220

His Tyr Cys Ala Pro Ala Gly Phe Ala Ile Leu Lys Cys Lys Asp Lys

225 230 235 240

Glu Phe Asn Gly Thr Gly Pro Cys Lys Asn Val Ser Thr Val Gln Cys

245 250 255

Thr His Gly Ile Lys Pro Val Val Ser Thr Gln Leu Leu Leu Asn Gly

260 265 270

Ser Leu Ala Glu Glu Glu Val Met Ile Arg Ser Glu Asn Ile Thr Asn

275 280 285

Asn Ala Lys Asn Ile Ile Val Gln Leu Thr Lys Pro Val Lys Ile Asn

290 295 300

Cys Thr Arg Pro Asn Asn Asn Thr Arg Lys Ser Ile Arg Ile Gly Pro

305 310 315 320

Gly Gln Ala Phe Tyr Ala Thr Gly Asp Ile Ile Gly Asp Ile Arg Gln

325 330 335

Ala His Cys Asn Val Ser Arg Thr Glu Trp Asn Glu Thr Leu Gln Lys

340 345 350

Val Ala Lys Gln Leu Arg Lys Tyr Phe Asn Asn Lys Thr Ile Ile Phe

355 360 365

Thr Asn Ser Ser Gly Gly Arg Leu Arg Ile Thr Thr His Ser Phe Asn

370 375 380

Cys Gly Gly Glu Phe Phe Tyr Cys Asn Thr Ser Gly Leu Phe Asn Ser

385 390 395 400

Thr Trp Asn Gly Asn Gly Thr Lys Lys Lys Asn Ser Thr Glu Ser Asn

405 410 415

Asp Thr Ile Thr Leu Pro Cys Arg Ile Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp

420 425 430

Gln Arg Val Gly Gln Ala Met Tyr Ala Pro Pro Ile Gln Gly Val Ile

435 440 445

Arg Cys Glu Ser Asn Ile Thr Gly Leu Leu Leu Thr Arg Asp Gly Gly

450 455 460

Asp Asn Asn Ser Lys Asn Glu Thr Phe Arg Pro Gly Gly Gly Asp Met

465 470 475 480

Arg Asp Asn Trp Arg Ser Glu Leu Tyr Lys Tyr Lys Val Val Lys Ile

485 490 495

Glu Pro Leu Gly Val Ala Pro Thr Lys Ala Lys Arg Arg Val Val Glu

500 505 510

Arg Glu Lys Arg Ala Val Gly Ile Gly Ala Val Phe Leu Gly Phe Leu

515 520 525

Gly Ala Ala Gly Ser Thr Met Gly Ala Ala Ser Ile Thr Leu Thr Val

530 535 540

Gln Ala Arg Gln Leu Leu Ser Gly Ile Val Gln Gln Gln Ser Asn Leu

545 550 555 560

Leu Arg Ala Ile Glu Ala Gln Gln His Leu Leu Lys Leu Thr Val Trp

565 570 575

Gly Ile Lys Gln Leu Gln Ala Arg Val Leu Ala Val Glu Arg Tyr Leu

580 585 590

Lys Asp Gln Gln Leu Leu Gly Ile Trp Gly Cys Ser Gly Lys Leu Ile

595 600 605

Cys Thr Thr Asn Val Pro Trp Asn Ser Ser Trp Ser Asn Lys Ser Gln

610 615 620

Ser Glu Ile Trp Asp Asn Met Thr Trp Leu Gln Trp Asp Lys Glu Ile

625 630 635 640

Ser Asn Tyr Thr Asp Ile Ile Tyr Asn Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn

645 650 655

Gln Gln Glu Lys Asn Glu Gln Asp Leu Leu Ala Leu Asp Lys Trp Ala

660 665 670

Asn Leu Trp Asn Trp Phe Asp Ile Ser Asn Trp Leu Trp Tyr Ile Lys

675 680 685

Ile Phe Ile Met Ile Val Gly Gly Leu Ile Gly Leu Arg Ile Val Phe

690 695 700

Ala Val Leu Ser Val

705

<210> 7

<211> 2140

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 化学合成的

<400> 7

ggatccgcca ccatggattg gacctggatt ctgttcctgg tggccgccgc cacaagagtg 60

cacagcagag tgcggggcat cctgagaaat tgccagcagt ggtggatctg gggcattctg 120

gggttctgga tgctgatgat ctgcaacgtg atgggcaacc tgtgggtgac cgtgtactac 180

ggcgtgcctg tgtggaagga ggccaagacc accctgttct gtgccagcga tgccaaggcc 240

tacgagaccg aggtgcacaa tgtgtgggcc acccacgcct gtgtgcccac cgatcccaac 300

cctcaggaga tggtgctgga gaacgtgacc gagaacttca acatgtggaa gaacgacatg 360

gtggaccaga tgcacgagga catcatcagc ctgtgggacc agagcctgaa gccttgcgtg 420

aagctgaccc ctctgtgcgt gaccctgaac tgccggaaca acgtgaacaa caacaacacc 480

atgaaggagg agatcaagaa ctgcagcttc aacatcacca ccgagctgcg ggacaagaag 540

cagaaggtgt acgccctgtt ctaccggctg gacatcgtgc ccctgaacga gaagaacaac 600

agcaacgact accggctgat caactgcaac accagcgcca tcacccaggc ctgtcccaag 660

gtgtccttcg accccatccc catccactat tgtgcccctg ccggctacgc catcctgaag 720

tgcaacaaca agaccttcaa cggcaccggc ccctgcaata atgtgagcac cgtgcagtgt 780

acccacggca tcaagcctgt ggtgtccacc cagctgctgc tgaatggcag cctggccgag 840

gaggagatta tcatccggag cgagaacctg accaacaacg ccaagaccat cattgtgcac 900

ctgaatgaga gcgtggagat cgtgtgtacc cggcccaaca acaatacccg gaagagcatc 960

agaatcggcc ctggccagac cttttacgcc accggcgaca tcatcggcga tatcaggcag 1020

gcccactgca atatcagcga ggagaagtgg aacaagaccc tgcagcgggt gtccgagaag 1080

ctgaaggagc acttccccaa taagaccatc aagttcgccc ctagcagcgg cggcagactg 1140

gagatcacca cccacagctt caactgcagg ggcgagttct tctactgcaa taccagcaag 1200

ctgttcaaca gcacctacat gcccaacagc accaacaata ccaacaccac catcaccctg 1260

ccctgccgga tcaagcagat catcaatatg tggcaggaag tgggcagagc catgtacgcc 1320

cctcccatcg agggcaacat cacctgcaag tccaacatca ccggcctgct gctgacaaga 1380

gatggcggca agaacgacac caatgacacc gagaccttca gacctggcgg cggagacatg 1440

agggacaact ggcggagcga gctgtacaag tacaaggtgg tggagatcaa gcctctgggc 1500

gtggccccta ccaaggccaa gaggagagtg gtggagaggg agaagagagc cgtgggcatc 1560

ggcgccgtgt ttctgggctt tctgggagcc gccggatcta caatgggagc cgccagcatc 1620

acactgaccg tgcaggccag acagctgctg agcggcatcg tgcagcagca gagcaatctg 1680

ctgagagcca tcgaggccca gcagcacatg ctgcagctga cagtgtgggg catcaagcag 1740

ctgcagacca gagtgctggc catcgagcgc tacctgaagg atcagcagct gctgggcatc 1800

tggggctgta gcggcaagct gatctgtacc accgccgtgc cttggaatag cagctggagc 1860

aacaagagcc aggaggacat ctgggacaac atgacctgga tgcagtggga ccgggagatc 1920

agcaactaca ccgacaccat ctacaggctg ctggaggaca gccagaacca gcaggagaag 1980

aacgagaagg acctgctggc cctggacagc tggaagaacc tgtggaactg gttcgacatc 2040

accaactggc tgtggtacat caagatcttc atcatgattg tgggcggcct gatcggcctg 2100

agaatcatct tcgccgtgct gagcatctga tagcggccgc 2140

<210> 8

<211> 705

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 化学合成的

<400> 8

Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val

1 5 10 15

His Ser Arg Val Arg Gly Ile Leu Arg Asn Cys Gln Gln Trp Trp Ile

20 25 30

Trp Gly Ile Leu Gly Phe Trp Met Leu Met Ile Cys Asn Val Met Gly

35 40 45

Asn Leu Trp Val Thr Val Tyr Tyr Gly Val Pro Val Trp Lys Glu Ala

50 55 60

Lys Thr Thr Leu Phe Cys Ala Ser Asp Ala Lys Ala Tyr Glu Thr Glu

65 70 75 80

Val His Asn Val Trp Ala Thr His Ala Cys Val Pro Thr Asp Pro Asn

85 90 95

Pro Gln Glu Met Val Leu Glu Asn Val Thr Glu Asn Phe Asn Met Trp

100 105 110

Lys Asn Asp Met Val Asp Gln Met His Glu Asp Ile Ile Ser Leu Trp

115 120 125

Asp Gln Ser Leu Lys Pro Cys Val Lys Leu Thr Pro Leu Cys Val Thr

130 135 140

Leu Asn Cys Arg Asn Asn Val Asn Asn Asn Asn Thr Met Lys Glu Glu

145 150 155 160

Ile Lys Asn Cys Ser Phe Asn Ile Thr Thr Glu Leu Arg Asp Lys Lys

165 170 175

Gln Lys Val Tyr Ala Leu Phe Tyr Arg Leu Asp Ile Val Pro Leu Asn

180 185 190

Glu Lys Asn Asn Ser Asn Asp Tyr Arg Leu Ile Asn Cys Asn Thr Ser

195 200 205

Ala Ile Thr Gln Ala Cys Pro Lys Val Ser Phe Asp Pro Ile Pro Ile

210 215 220

His Tyr Cys Ala Pro Ala Gly Tyr Ala Ile Leu Lys Cys Asn Asn Lys

225 230 235 240

Thr Phe Asn Gly Thr Gly Pro Cys Asn Asn Val Ser Thr Val Gln Cys

245 250 255

Thr His Gly Ile Lys Pro Val Val Ser Thr Gln Leu Leu Leu Asn Gly

260 265 270

Ser Leu Ala Glu Glu Glu Ile Ile Ile Arg Ser Glu Asn Leu Thr Asn

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Ile Ile Val His Leu Asn Glu Ser Val Glu Ile Val

290 295 300

Cys Thr Arg Pro Asn Asn Asn Thr Arg Lys Ser Ile Arg Ile Gly Pro

305 310 315 320

Gly Gln Thr Phe Tyr Ala Thr Gly Asp Ile Ile Gly Asp Ile Arg Gln

325 330 335

Ala His Cys Asn Ile Ser Glu Glu Lys Trp Asn Lys Thr Leu Gln Arg

340 345 350

Val Ser Glu Lys Leu Lys Glu His Phe Pro Asn Lys Thr Ile Lys Phe

355 360 365

Ala Pro Ser Ser Gly Gly Arg Leu Glu Ile Thr Thr His Ser Phe Asn

370 375 380

Cys Arg Gly Glu Phe Phe Tyr Cys Asn Thr Ser Lys Leu Phe Asn Ser

385 390 395 400

Thr Tyr Met Pro Asn Ser Thr Asn Asn Thr Asn Thr Thr Ile Thr Leu

405 410 415

Pro Cys Arg Ile Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Glu Val Gly Arg

420 425 430

Ala Met Tyr Ala Pro Pro Ile Glu Gly Asn Ile Thr Cys Lys Ser Asn

435 440 445

Ile Thr Gly Leu Leu Leu Thr Arg Asp Gly Gly Lys Asn Asp Thr Asn

450 455 460

Asp Thr Glu Thr Phe Arg Pro Gly Gly Gly Asp Met Arg Asp Asn Trp

465 470 475 480

Arg Ser Glu Leu Tyr Lys Tyr Lys Val Val Glu Ile Lys Pro Leu Gly

485 490 495

Val Ala Pro Thr Lys Ala Lys Arg Arg Val Val Glu Arg Glu Lys Arg

500 505 510

Ala Val Gly Ile Gly Ala Val Phe Leu Gly Phe Leu Gly Ala Ala Gly

515 520 525

Ser Thr Met Gly Ala Ala Ser Ile Thr Leu Thr Val Gln Ala Arg Gln

530 535 540

Leu Leu Ser Gly Ile Val Gln Gln Gln Ser Asn Leu Leu Arg Ala Ile

545 550 555 560

Glu Ala Gln Gln His Met Leu Gln Leu Thr Val Trp Gly Ile Lys Gln

565 570 575

Leu Gln Thr Arg Val Leu Ala Ile Glu Arg Tyr Leu Lys Asp Gln Gln

580 585 590

Leu Leu Gly Ile Trp Gly Cys Ser Gly Lys Leu Ile Cys Thr Thr Ala

595 600 605

Val Pro Trp Asn Ser Ser Trp Ser Asn Lys Ser Gln Glu Asp Ile Trp

610 615 620

Asp Asn Met Thr Trp Met Gln Trp Asp Arg Glu Ile Ser Asn Tyr Thr

625 630 635 640

Asp Thr Ile Tyr Arg Leu Leu Glu Asp Ser Gln Asn Gln Gln Glu Lys

645 650 655

Asn Glu Lys Asp Leu Leu Ala Leu Asp Ser Trp Lys Asn Leu Trp Asn

660 665 670

Trp Phe Asp Ile Thr Asn Trp Leu Trp Tyr Ile Lys Ile Phe Ile Met

675 680 685

Ile Val Gly Gly Leu Ile Gly Leu Arg Ile Ile Phe Ala Val Leu Ser

690 695 700

Ile

705

<210> 9

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 化学合成的

<400> 9

Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala

1 5

Claims (18)

1.一种疫苗，其包含抗原和IL-21。

2.如权利要求1所述的疫苗，其中IL-21由选自由以下组成的组的核苷酸序列编码：与SEQ ID NO:3中所列出的核苷酸序列具有至少约95％同一性的核苷酸序列，以及SEQ IDNO:3中所列出的核苷酸序列。

3.如权利要求2所述的疫苗，其中IL-21由SEQ ID NO:3中所列出的所述核苷酸序列编码。

4.如权利要求1所述的疫苗，其中所述抗原由第一核酸编码，并且IL-21由第二核酸编码。

5.如权利要求4所述的疫苗，还包含具有与权利要求4所述的抗原相同的编码核酸序列的抗原肽，以及具有与权利要求4所述的IL-21相同的编码核酸序列的IL-21肽。

6.如权利要求4所述的疫苗，其中所述第二核酸还包含表达载体。

7.如权利要求1所述的疫苗，其中所述抗原选自由以下组成的组：人乳头瘤病毒(HPV)抗原、人免疫缺陷病毒(HIV)抗原、流感抗原、恶性疟原虫抗原、艰难梭菌抗原以及其片段。

8.如权利要求7所述的疫苗，其中所述HPV抗原选自由以下组成的组：HPV16E6抗原、HPV16E7抗原以及其组合。

9.如权利要求7所述的疫苗，其中所述HIV抗原选自由以下组成的组：Env A、Env B、EnvC、Env D、B Nef-Rev、Gag以及其任何组合。

10.如权利要求7所述的疫苗，其中所述流感抗原选自由以下组成的组：H1HA、H2HA、H3HA、H5HA、BHA抗原以及其任何组合。

11.如权利要求7所述的疫苗，其中所述恶性疟原虫抗原包括环子孢子(CS)抗原。

12.如权利要求7所述的疫苗，其中所述艰难梭菌抗原选自由以下组成的组：毒素A、毒素B以及其组合。

13.如权利要求1所述的疫苗，还包含药学上可接受的赋形剂。

14.一种用于增加有需要的受试者中的免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用权利要求1或2所述的疫苗。

15.如权利要求14所述的方法，其中施用所述疫苗包括电穿孔。

16.如权利要求14所述的方法，其中增加所述受试者中的所述免疫应答包括增加受试者中的细胞免疫应答、体液免疫应答或细胞免疫应答和体液免疫应答两者。

17.一种核酸分子，其包含选自由以下组成的组的一种或多种核苷酸序列：SEQ ID NO:3，以及与SEQ ID NO:3 95％或更大相同的核苷酸序列。

18.如权利要求17所述的核酸分子，其中所述核酸分子是质粒。