CN107427567A - 检查点抑制剂和疫苗组合物及其用于免疫疗法的用途 - Google Patents

Abstract

本文中公开了包含抗原和检查点抑制剂的疫苗。本文中还公开了用于增强受试者中的免疫应答的方法。所述方法可以包括向有此需要的受试者施用所述疫苗。

Description

检查点抑制剂和疫苗组合物及其用于免疫疗法的用途

技术领域

本发明涉及与检查点抑制剂抗体组合的疫苗，及此类组合用于免疫疗法的用途。

背景技术

疫苗用于刺激个体中的免疫应答以提供针对特定疾病的保护和/或对特定疾病的治疗。一些疫苗包括诱导免疫应答的抗原。一些抗原引起强烈的免疫应答，而其它抗原引起弱的免疫应答。可以通过在疫苗中包含佐剂来增强对抗原的弱免疫应答。佐剂以许多不同的形式出现，例如铝盐、油乳剂、细菌或其它病原体的无菌成分、细胞因子等。

程序性细胞死亡蛋白1，也称为PD-1，是一种288个氨基酸的细胞表面蛋白质分子，其在人体中是由PDCD1基因编码的。该蛋白质在pro-B细胞中表达，并被认为在其分化中发挥作用。PD1是268个氨基酸的I型膜蛋白和T细胞调节物的延伸CD28/CTLA-4家族的成员。蛋白质的结构包括胞外IgV结构域，随后是跨膜区和胞内尾部。胞内尾部含有位于基于免疫受体酪氨酸的抑制基序和基于免疫受体酪氨酸的转换基序中的两个磷酸化位点，这表明PD-1负调节TCR信号。

PD-1具有两种配体，即PD-L1和PD-L2，它们是B7家族的成员。PD-L1蛋白响应LPS和GM-CSF处理而在巨噬细胞和树突细胞(DC)上上调，并且在TCR和B细胞受体信号传导时在T细胞和B细胞上上调，而在静息小鼠中，PD-L1mRNA可以在心脏、肺、胸腺、脾脏和肾脏中检测到。PD-L1在用IFN-γ处理时在几乎所有的鼠肿瘤细胞系中表达，包括PA1骨髓瘤、P815肥大细胞瘤和B16黑素瘤。PD-L2表达更受限制，并且主要由DC和少数肿瘤系表达。

有研究表明PD-1及其配体负调节免疫应答。已经显示PD-1敲除小鼠分别在C57BL/6和BALB/c背景上形成狼疮样肾小球性肾炎和扩张型心肌病。在体外，用PD-L1-Ig处理经抗CD3刺激的T细胞导致T细胞增殖和IFN-γ分泌减少。似乎PD-L1的上调可能使癌症逃避宿主免疫系统。PD-L1表达已经显示与上皮内CD8+ T淋巴细胞计数反相关，表明肿瘤细胞上的PD-L1可以抑制抗肿瘤CD8+ T细胞。

LAG3和TIM3是施加抑制功能的T淋巴细胞表面上许多受体分子中的一些。

T细胞免疫球蛋白结构域和粘蛋白结构域3(TIM-3；也称为HAVCR2)是由HAVCR2基因编码的人蛋白质。TIM-3是由产生IFNγ的CD4Th1和CD8细胞毒性T细胞的活化T细胞表达的蛋白质表面受体。它的配体是半乳凝素-9，其在肿瘤微环境中大量表达，诱导细胞死亡和CD4和CD8T细胞的T细胞耗竭。Tim-3作为肿瘤或病毒诱导的免疫抑制中关键的免疫检查点的证据来自下述证明，即Tim-3表达性CD8T细胞是临床前模型中CD8T细胞的最为受抑制或功能失调的群体。

淋巴细胞活化基因3(Lag-3，也称为CD223)是Ig超家族的成员，其仅在结合MHC-II分子的活化且耐受化的T细胞上表达，并且已知其转导抑制性信号。与效应或记忆T细胞相比，LAG-3在耗尽的T细胞上显著上调。LAG-3通过抑制T细胞受体诱导的钙通量负调节T细胞扩增，从而控制T细胞记忆库的大小。研究表明，在癌症的背景下，LAG3在TIL上上调，并且LAG-3的阻断可以增强抗肿瘤T细胞免疫应答。在引起CD8T细胞耗竭的病毒性慢性模型中LAG-3的阻断可以激发CD8T细胞应答。

总的来说，这些上述蛋白质以及其它抑制性受体，如CTLA-4，是在实验模型和人两者中的慢性免疫病况，如慢性病毒感染和癌症中发生的CD8T细胞耗竭中的重要参与者。PD1-1、CTLA-4、TIM-3和LAG-3的这些已知特征和功能使其成为疫苗背景中免疫调节的有吸引力的靶标。

疫苗也以许多不同的方式(例如，注射、口服等)向许多不同的组织(例如，肌肉内、鼻等)施用。然而，并不是所有的递送方法都是相等的。一些递送方法允许在个体群体内更大的顺从性，而其它递送方法可影响疫苗的免疫原性和/或安全性。

因此，仍然需要使用与检查点抑制剂，特别是TIM-3和LAG-3组合的合成抗原来形成更有效的免疫疗法。此外，仍然需要改进的治疗方法来改善由检查点抑制剂和合成抗原的组合产生的免疫应答。

发明内容

本发明的方面包括用于在有此需要的受试者中增强针对抗原的免疫应答的组合物，其包含与合成抗原或其生物学功能片段或变体组合的TIM-3抗体或LAG-3抗体，所述合成抗原能够在受试者中产生免疫应答。

合成抗原可以是编码抗原的分离的DNA。

优选地，合成抗原可以选自由以下组成的组：hTERT、前列腺、WT1、酪氨酸酶、NYES01、PRAME、MAGE、CMV、疱疹、HIV、HPV、HCV、HBV、流感、RSV、恶性疟原虫和艰难梭菌。

本文中提供的组合物还可以包含药学上可接受的赋形剂。

本发明的方面还包括用于通过向受试者施用本文中提供的任何组合物在有此需要的受试者中提高免疫应答的方法。提高免疫应答的方法还可以包括电穿孔步骤。

本发明的其它方面包括与抗原组合施用检查点抑制剂以增强抗原的免疫应答的方法，其中在抗原的初始和加强施用后递送检查点抑制剂。

附图说明

图1提供了显示通过与抗PDL1抗体和HPV疫苗的综合疗法诱导的T细胞应答增加30％的图。

图2提供了描绘用PD1处理的小鼠表达总IFNγ的总hTERT特异性CD8+ T细胞的图表。左侧图表显示细胞因子IFNγ和TNFα双重释放的hTERT特异性CD3+CD8+ T细胞的百分比。实验独立进行至少两次，数据表示每组四只小鼠的平均值±SEM。

图3提供了描绘用TIM3处理的小鼠表达总IFNγ的总hTERT特异性CD8+ T细胞的图表。左侧图表显示表现出细胞因子IFNγ和TNFα双重释放的hTERT特异性CD3+CD8+ T细胞的百分比。实验独立进行至少两次，并且数据表示每组四只小鼠的平均值±SEM。

图4提供了描绘用LAG3处理的小鼠的表达总IFNγ的总hTERT特异性CD8+ T细胞的图表。左侧图表显示表现出细胞因子IFNγ和TNFα双重释放的hTERT特异性CD3+CD8+ T细胞的百分比。实验独立进行至少两次，并且数据表示每组四只小鼠的平均值±SEM。

图5提供了用于早期递送mAb检查点的流式细胞计量术结果。(A)显示了图表，其描绘了在初始免疫后立即用或不用PD1、TIM3和LAG3处理的小鼠的表达总IFNγ的hTERT特异性CD8T细胞。(B)显示了图表，其显示了在加强免疫后立即用或不用PD1、TIM3和LAG3处理的小鼠的表达总IFNγ的hTERT特异性CD8T细胞。

图6提供了用于晚期递送mAb检查点的流式细胞计量术结果。(A)显示了图表，其描绘了在初始免疫后立即用或不用PD1、TIM3和LAG3处理的小鼠的表达总IFNγ的hTERT特异性CD8T细胞。(B)显示了图表，其描绘了在加强免疫接种后立即用或不用PD1、TIM3和LAG3处理的小鼠的表达总IFNγ的hTERT特异性CD8T细胞。

具体实施方式

本发明涉及疫苗，其可用于通过将疫苗(在许多情况下为合成抗原)与检查点抑制剂，特别是PD1、PDL1、TIM-3和LAG-3抗体组合来增加或增强免疫应答，即产生更有效的免疫应答。在一些情况下，抗体，特别是TIM-3抗体和LAG-3抗体可以与抗原组合施用；而在其它情况下，抗体，特别是TIM-3抗体和LAG-3抗体可以与疫苗的抗原分开施用。在某些情况下，抗体，特别是TIM-3抗体和LAG-3抗体，包含编码此类抗体的DNA序列，所述抗体至少包括免疫球蛋白的可变区。

与不包括检查点抑制剂的疫苗相比，本发明的疫苗可以通过提高CD8⁺ T细胞应答在受试者中提高对抗原的免疫应答。这种增加的CD8⁺ T细胞应答具有细胞溶解活性并分泌抗病毒细胞因子干扰素-γ(IFN-γ)。

本发明的方面包括用于在有此需要的受试者中增强对抗原的免疫应答的组合物，其包含与能够在受试者中产生免疫应答的合成抗原组合的TIM-3抗体或LAG-3抗体，或其生物功能片段或变体。

合成抗原可以是编码抗原的分离的DNA。

优选地，合成抗原可以选自由以下组成的组：hTERT、前列腺、WT1、酪氨酸酶、NYES01、PRAME、MAGE、CMV、疱疹、HIV、HPV、HCV、HBV、流感、RSV、恶性疟原虫和艰难梭菌。

HPV抗原可以是选自由以下组成的组的亚型的E6和E7结构域：HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV52和HPV58，及其组合。

HIV抗原可以选自由以下组成的组：Env A、Env B、Env C、Env D、B Nef-Rev和Gag，及其组合。

流感抗原可以选自由以下组成的组：H1 HA、H2 HA、H3 HA、H5HA、BHA抗原及其任何组合。

恶性疟原虫抗原包括环子孢子(CS)抗原。

艰难梭菌抗原可以选自由以下组成的组：毒素A和毒素B，及其组合。

HCV抗原可以选自由以下组成的组：E1、E2、NS3、NS4a、NS4b、NS5a和NS5b，及其组合。

HBV抗原可以选自由以下组成的组：表面抗原A型、表面抗原B型、表面抗原C型、表面抗原D型、表面抗原E型、表面抗原F型、表面抗原G型、表面抗原H型和核心抗原，及其组合。

RSV抗原可以选自由以下组成的组：F、G、NS1、NS2、N、M、M2-1、M2-2、P、SH和L蛋白，及其组合。

合成抗原可以是hTERT、WT1抗原、酪氨酸酶、NYES01或PRAME。

前列腺抗原可以选自由以下组成的组：PSA、PSMA、STEAP、PSCA和PAP，及其组合。

本文中提供的组合物还可以包括药学上可接受的赋形剂。

本发明的方面还包括用于通过向受试者施用本文中提供的任何组合物在有此需要的受试者中提高免疫应答的方法。提高免疫应答的方法还可以包括电穿孔步骤。

1.定义

除非另有定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的相同的含义。在冲突的情况下，应当以本文件(包括定义)为准。优选的方法和材料如下所述，尽管与本文所述的方法和材料相似或等同的方法和材料可用于本发明的实践或测试中。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献通过引用整体并入本文。本文公开的材料、方法和实例仅是说明性的而不是限制性的。

如本文中使用，术语“包括”、“包含”、“具有”、“可以”、“含有”及其变体旨在是开放式过渡性短语、术语或词语，其不排除额外行为或结构的可能性。除非上下文另有明确规定，单数形式“一个”、“一种”和“所述/该”包括复数指示物。本公开还涉及“包括本文呈现的实施方案或元件”，“由本文呈现的实施方案或元件组成”和“基本上由本文呈现的实施方案或元件组成”的其它实施方案，无论明确阐述与否。

如本文中使用，“佐剂”是指加入到本文所述的疫苗中以增强抗原的免疫原性的任何分子，特别是指检查点抑制剂抗体。

如本文中使用，“检查点抑制剂”是指阻断免疫检查点的抑制剂或分子，如癌症免疫疗法领域中通常所理解。更常见，检查点抑制剂是阻断这些免疫检查点，例如PD1(在T细胞上)到其配体PDL1(在树突细胞上)的抗体。已知的检查点抑制剂的一些实例包括伊匹单抗(ipilimumab)、派姆单抗(pembrolizumab)、纳武单抗(nivolumab)、pidilizumab等。

如本文中使用，术语“编码序列”或“编码核酸”是指包含编码蛋白质的核苷酸序列的核酸(RNA或DNA分子)。编码序列还可以包括可操作地连接到调控元件的启动和终止信号，所述调控元件包括启动子和多腺苷酸化信号，其能够指导施用核酸的个体或哺乳动物的细胞中的表达。

如本文中使用，术语“互补序列”或“互补”指可以进行核酸分子的核苷酸或核苷酸类似物之间的沃森-克里克(例如A-T/U和C-G)或Hoogsteen碱基配对的核酸。

“电穿孔”、“电透化”或“电动力学增强”(“EP”)如本文中可互换使用，是指使用跨膜电场脉冲诱导生物膜中的微观通路(孔)；它们的存在允许生物分子，如质粒、寡核苷酸、siRNA、药物，离子和水从细胞膜的一侧通过到另一侧。

如本文中使用，“片段”或“免疫原性片段”指编码能够在哺乳动物中引发免疫应答的多肽的核酸序列或其部分。片段可以是选自编码下文列出的蛋白质片段的多种核苷酸序列中的至少一种的DNA片段。片段可以包含下文列出的一种或多种核酸序列的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％。在一些实施方案中，片段可以包含下文列出的至少一种核酸序列的至少20个核苷酸或更多、至少30个核苷酸或更多、至少40个核苷酸或更多、至少50个核苷酸或更多、至少60个核苷酸或更多、至少70个核苷酸或更多、至少80个核苷酸或更多、至少90个核苷酸或更多、至少100个核苷酸或更多、至少150个核苷酸或更多、至少200个核苷酸或更多、至少250个核苷酸或更多、至少300个核苷酸或更多、至少350个核苷酸或更多、至少400个核苷酸或更多、至少450个核苷酸或更多、至少500个核苷酸或更多、至少550个核苷酸或更多、至少600个核苷酸或更多、至少650个核苷酸或更多、至少700个核苷酸或更多、至少750个核苷酸或更多、至少800个核苷酸或更多、至少850个核苷酸或更多、至少900个核苷酸或更多、至少950个核苷酸或更多或至少1000个核苷酸或更多。

如本文中使用，片段或免疫原性片段还指能够在哺乳动物中引发免疫应答的多肽序列或其部分。片段可以是选自下文列出的多种蛋白质片段中的至少一种的多肽片段。片段可以包含下文列出的一种或多种蛋白质的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％。在一些实施方案中，片段可以包含下文列出的至少一种蛋白质的至少20个氨基酸或更多、至少30个氨基酸或更多、至少40个氨基酸或更多、至少50个氨基酸或更多、至少60个氨基酸或更多、至少70个氨基酸或更多、至少80个氨基酸或更多、至少90个氨基酸或更多、至少100个氨基酸或更多、至少110个氨基酸或更多、至少120个氨基酸或更多、至少130个氨基酸或更多、至少140个氨基酸或更多、至少150个氨基酸或更多、至少160个氨基酸或更多、至少170个氨基酸或更多、至少180个氨基酸或更多、至少190个氨基酸或更多、至少200个氨基酸或更多、至少210个氨基酸或更多、至少220个氨基酸或更多、至少230个氨基酸或更多或至少240个氨基酸或更多。

如本文中使用，“遗传构建体”是指包含编码蛋白质的核苷酸序列的DNA或RNA分子。编码序列包括与能够指导施用核酸分子的个体的细胞中的表达的调控元件可操作地连接的起始和终止信号，所述调控元件包括启动子和多聚腺苷酸化信号。如本文中使用，术语“可表达形式”是指基因构建体，基因构建体含有与编码蛋白质的编码序列可操作连接的必需调控元件，使得当存在于个体的细胞中时编码序列将被表达。

如本文中使用，“相同”或“同一性”在两个或更多个核酸或多肽序列的情况下是指该序列具有指定百分比的在指定区域上相同的残基。可以通过如下计算百分比：最佳比对两个序列，在指定区域上比较两个序列，确定两个序列中出现相同残基的位置数，以产生匹配位置数，将匹配位置数除以指定区域中的位置总数，并将结果乘以100，以产生序列同一性的百分比。在两个序列具有不同长度或者比对产生一个或多个交错末端并且比较的指定区域仅包含单个序列的情况下，单个序列的残基包括在分母中而不是计算的分子。当比较DNA和RNA时，可以认为胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)是等效的。可以手动进行或者通过使用计算机序列算法，如BLAST或BLAST 2.0进行同一性。

如本文中使用，“免疫应答”是指响应于引入抗原，宿主的免疫系统(例如哺乳动物的免疫系统)的活化。免疫应答可以是细胞或体液应答的形式或两者。

如本文中使用，“核酸”或“寡核苷酸”或“多核苷酸”是指共价连接在一起的至少两个核苷酸。单链的描述也定义了互补链的序列。因此，核酸还包括所描绘的单链的互补链。核酸的许多变体可以与给定核酸用于相同的目的。因此，核酸还包括基本上相同的核酸及其互补序列。单链提供可以在严格杂交条件下与目标序列杂交的探针。因此，核酸还包括在严格杂交条件下杂交的探针。

核酸可以是单链或双链的，或者可以含有双链和单链序列两者的部分。核酸可以是DNA、基因组和cDNA两者、RNA或杂交物，其中核酸可以含有脱氧核糖核酸和核糖核苷酸的组合，以及包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、肌苷、黄嘌呤次黄嘌呤、异胞嘧啶和异鸟嘌呤的碱基的组合。核酸可以通过化学合成方法或重组方法获得。

如本文中使用，“可操作地连接”是指基因的表达处于与其空间连接的启动子的控制下。启动子可以位于其控制的基因的5'(上游)或3'(下游)。启动子和基因之间的距离可以与在启动子来源的基因中该启动子与其控制的基因之间的距离大致相同。如本领域已知的，可以调节该距离的变化而不损失启动子功能。

如本文中使用，“肽”、“蛋白质”或“多肽”可以指氨基酸的连接序列，并且可以是天然的、合成的或天然和合成的修饰或组合。

如本文中使用，“启动子”是指能够赋予、激活或增强细胞中核酸表达的合成或天然衍生的分子。启动子可以包含一个或多个特异性转录调节序列，以进一步增强表达和/或改变其空间表达和/或时间表达。启动子还可以包含远端增强子或阻遏物元件，其可以位于距转录起始位点多达数千个碱基对。启动子可以源自包括病毒、细菌、真菌、植物、昆虫和动物的来源。启动子相对于表达发生的细胞、组织或器官，或者相对于表达发生所处的发育阶段或响应于外部刺激诸如生理应激、病原体、金属离子或诱导剂，可组成型地或差异地调控基因组件的表达。启动子的代表性实例包括噬菌体T7启动子、噬菌体T3启动子、SP6启动子、lac操纵子-启动子、tac启动子、SV40晚期启动子、SV40早期启动子、RSV-LTR启动子、CMV IE启动子、SV40早期启动子或SV40晚期启动子和CMV IE启动子。

“信号肽”和“前导序列”在本文中可互换使用，是指可以在合成抗原的氨基末端连接的氨基酸序列，包括本文中引用的一些实例。信号肽/前导序列通常指导蛋白质定位。本文使用的信号肽/前导序列优选促进蛋白质从其所产生的细胞的分泌。当从细胞分泌时，信号肽/前导序列通常从蛋白质的其余部分(通常称为成熟蛋白质)中切割出来。信号肽/前导序列在蛋白质的N末端连接。

如本文中使用，“受试者”可以指希望或需要用本文所述的疫苗免疫的哺乳动物。哺乳动物可以是人、黑猩猩、狗、猫、马、牛、猪、鸡、小鼠或大鼠。

如本文中使用，“基本上相同”可以指第一和第二氨基酸序列在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100或更多个氨基酸的区域上是至少60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。基本上相同也可以指第一核酸序列和第二核酸序列在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100或更多个核苷酸的区域上是至少60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。

如本文中使用，“治疗”或“处理”可以指通过预防、抑制、阻抑或完全消除疾病来保护动物免受疾病。预防该疾病涉及在疾病发作前对动物施用本发明的疫苗。抑制该疾病涉及在诱导疾病之后但在其临床表现之前对动物施用本发明的疫苗。抑制该疾病涉及在临床出现疾病之后对动物施用本发明的疫苗。

本文中关于核酸使用的“变体”是指(i)参考核苷酸序列的部分或片段；(ii)参考核苷酸序列或其部分的互补序列；(iii)与参考核酸或其互补序列基本上相同的核酸；或(iv)在严格条件下与参考核酸、其互补序列或与其基本上相同的序列杂交的核酸。

变体可以进一步定义为通过氨基酸的插入、缺失或保守取代而在氨基酸序列上不同但保留至少一种生物活性的肽或多肽。“生物活性”的代表性实例包括由特异性抗体结合或促进免疫应答的能力。变体还可以指具有与参考蛋白质基本上相同的氨基酸序列，且具有保留至少一种生物学活性的氨基酸序列的蛋白质。氨基酸的保守取代，即用具有相似性质(例如，亲水性、带电区域的程度和分布)的不同氨基酸替换氨基酸在本领域中认为通常涉及微小变化。这些微小变化可以部分地通过考虑氨基酸的亲水指数来鉴定，如本领域所理解的。Kyte等人，J.Mol.Biol.157:105-132(1982)。氨基酸的亲水指数是基于其疏水性和电荷的考虑。本领域已知，相似的亲水指数的氨基酸可以进行取代并仍保留蛋白质功能。一方面，具有±2的亲水指数的氨基酸被取代。氨基酸的亲水性也可用于揭示导致保留生物功能的蛋白质的取代。在肽的上下文中考虑氨基酸的亲水性允许计算该肽的最大局部平均亲水性，这是已报道与抗原性和免疫原性良好相关的有用测量。具有相似亲水性值的氨基酸的取代可导致保留生物活性，例如免疫原性的肽，如本领域所理解的。可以用具有亲水性值在彼此的±2之内的氨基酸进行取代。氨基酸的疏水性指数和亲水性值两者均受该氨基酸的特定侧链的影响。与该观察一致，理解与生物功能相容的氨基酸取代取决于氨基酸特别是那些氨基酸的侧链的相对相似性，如由疏水性、亲水性、电荷、大小和其它特性揭示。

变体可以是在全基因序列或其片段的全长上基本相同的核酸序列。核酸序列可以是在基因序列的全长或其片段上80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。变体可以是在氨基酸序列的全长或其片段上基本相同的氨基酸序列。氨基酸序列可以是在氨基酸序列的全长或其片段上80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。

如本文中使用，“载体”是指含有复制起点的核酸序列。载体可以是病毒载体、噬菌体、细菌人工染色体或酵母人工染色体。载体可以是DNA或RNA载体。载体可以是自体复制的染色体外载体，优选是DNA质粒。

对于本文中的数值范围的叙述，明确地考虑具有相同精确度的介于其间的数字。例如，对于6-9的范围，除了6和9之外，还考虑了数字7和8，并且对于范围6.0-7.0，明确考虑数字6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9和7.0。

2.疫苗

本文提供了包含抗原和检查点抑制剂，优选检查点抑制剂抗体的疫苗。抗体优选为PD1抗体、PDL1抗体、TIM-3抗体和/或LAG-3抗体。组合可以是单一制剂或者可以分开并按顺序施用(首先抗原，然后检查点抑制剂，或首先检查点抑制剂，然后抗原)。疫苗可以增加抗原呈递和受试者中对抗原的总体免疫应答。抗原与检查点抑制剂的组合比包含单独的抗原的疫苗更有效地诱导免疫系统。这种更有效的免疫应答在治疗和/或预防任何疾病，特别是癌症、病原体或病毒中提供提高的功效。

疫苗的抗原和检查点抑制剂，优选是PD1抗体、PDL1抗体、TIM-3抗体和/或LAG-3抗体可一起施用或分开施用于有此需要的受试者。在某些情况下，检查点抑制剂可以与疫苗的抗原分开施用。

在一些实施方案中，可以在向受试者施用抗原之前或之后至少1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、24小时、36小时、48小时、60小时、72小时、84小时或96小时施用检查点抑制剂。在其它实施方案中，可以在向受试者施用抗原之前或之后至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、60天或90天施用PD1抗体或PDL1抗体。

在其它实施方案中，可以在向受试者施用抗原之前或之后至少1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周、13周、14周或15周施用检查点抑制剂。在其它实施方案中，可以在向受试者施用抗原之前或之后约12小时至约15周、约12小时至约10周、约12小时至约5周、约12小时至约1周、约12小时至约60小时、约12小时至约48小时、约24小时至约15周、约60小时至约15周、约96小时至约15周、约1天至约15周、约5天至约15周、约10天至约15周、约15天至约15周、约20天至约15周、约25天至约15周、约30天至约15周、约1周至约15周、约5周至约15周或约10周至约15周施用PD1抗体或PDL1抗体。

本发明的疫苗可以具有有效疫苗所需的特征，如为安全的，因此疫苗本身不会引起疾病或死亡；防止因暴露于活病原体(如病毒或细菌)而导致的疾病；诱导中和抗体以预防细胞感染；诱导针对细胞内病原体的保护性T细胞；并且提供施用方便性、很少的副作用、生物稳定性和每剂量低成本。疫苗可以通过将抗原与检查点抑制剂，优选如下讨论的PD1抗体、PDL1抗体、TIM-3抗体和/或LAG-3抗体组合来实现这些特征中的一些或全部。

疫苗可以进一步修饰抗原内的表位呈递，以比仅包含抗原的疫苗诱导更大的针对抗原的免疫应答。当施用于不同组织如肌肉或皮肤时，疫苗可以进一步诱导免疫应答。

a.检查点抑制剂

检查点抑制剂可以是各种免疫检查点的任何拮抗剂，并且优选是阻断免疫检查点的抗体。抗体可以是包括Fab、单克隆或多克隆的蛋白质。抗体也可以是编码和可表达功能性抗体的DNA表达构建体。疫苗还可以包含TIM-3抗体或LAG-3抗体。抗体可以是由至少编码免疫球蛋白的可变区的DNA序列组成的合成抗体。可以通过鉴定或筛选上述抗体来产生这种抗体，所述抗体与上述抗原反应或结合。鉴定或筛选抗体的方法可以使用本领域技术人员已知的方法中的抗原来鉴定或筛选抗体。这样的方法可以包括但不限于从文库(例如，噬菌体展示)中选择抗体并免疫动物，然后分离和/或纯化抗体。参见例如Rajan,S.和Sidhu,S.,Methods in Enzymology,第502卷,第一章“Simplified Synthetic AntibodyLibraries(2012)中可用的方法，其全部内容并入本文。

TIM-3和LAG-3抗体也可以与其它检查点抑制剂抗体(还包括PD1、PDL1、CTLA4、CD40等)组合。检查点抑制剂可以是已知的产品，如例如纳武单抗、派姆单抗、pidilizumab、BMS-936559(参见ClinicalTrials.gov Identifier NCT02028403)、MPDL3280A(Roche,参见ClinicalTrials.gov Identifier NCT02008227)、MDX1105-01(Bristol Myers Squibb,参见ClinicalTrials.gov Identifier NCT00729664)、MEDI4736(MedImmune，参见ClinicalTrials.gov Identifier NCT01693562)和MK-3475(Merck，参见ClinicalTrials.gov Identifier NCT02129556)。

合成抗体(DNA形式)

抗体可以由编码如下元件的核酸序列(cDNA)编码：

抗体可以包括重链多肽和轻链多肽。重链多肽可以包括可变重链(VH)区和/或至少一个恒定重链(CH)区。至少一个恒定重链区可以包括恒定重链区1(CH1)、恒定重链区2(CH2)和恒定重链区3(CH3)和/或铰链区。

在一些实施方案中，重链多肽可以包括VH区和CH1区。在其它实施方案中，重链多肽可以包括VH区、CH1区、铰链区、CH2区和CH3区。

重链多肽可以包括互补决定区(“CDR”)组。CDR组可以包含VH区的三个高变区。从重链多肽的N末端起，这些CDR分别表示为“CDR1”、“CDR2”和“CDR3”。重链多肽的CDR1、CDR2和CDR3可以有助于抗原的结合或识别。

轻链多肽可以包括可变轻链(VL)区和/或恒定轻链(CL)区。轻链多肽可以包括互补决定区(“CDR”)组。CDR组可以包含VL区域的三个高变区。从轻链多肽的N末端起，这些CDR分别表示为“CDR1”、“CDR2”和“CDR3”。轻链多肽的CDR1、CDR2和CDR3可以有助于抗原的结合或识别。

抗体可以包含分别插入重链和轻链框架(“FR”)组之间的重链和轻链互补决定区(“CDR”)组，所述框架组对CDR提供支持并限定CDR相对于彼此的空间关系。CDR组可以包含重链或轻链V区的三个高变区。从重链或轻链的N末端起，这些区分别表示为“CDR1”、“CDR2”和“CDR3”。因此，抗原结合位点可以包括6个CDR，其包含来自重链和轻链V区的每一个的CDR组。

抗体可以是免疫球蛋白(Ig)。Ig可以是例如IgA、IgM、IgD、IgE和IgG。免疫球蛋白可以包括重链多肽和轻链多肽。免疫球蛋白的重链多肽可以包括VH区、CH1区、铰链区、CH2区和CH3区。免疫球蛋白的轻链多肽可以包括VL区和CL区。

此外，蛋白水解酶木瓜蛋白酶优先切割IgG分子以产生几个片段，其中两个(F(ab)片段)各自包含包含完整抗原结合位点的共价异二聚体。酶胃蛋白酶能够切割IgG分子以提供几个片段，包括包含两个抗原结合位点的F(ab')₂片段。因此，抗体可以是Fab或F(ab')₂。Fab可以包括重链多肽和轻链多肽。Fab的重链多肽可以包括VH区和CH1区。Fab的轻链可以包括VL区和CL区。

抗体可以是多克隆或单克隆抗体。抗体可以是嵌合抗体、单链抗体、亲和力成熟抗体、人抗体、人源化抗体或完全人抗体。人源化抗体可以是结合期望抗原的来自非人物种的抗体，其具有来自非人物种的一个或多个互补决定区(CDR)和来自人免疫球蛋白分子的框架区。

b.抗原

疫苗还可以包含抗原或其片段或变体。抗原可以是在受试者中诱导免疫应答的任何物质。抗原可以是核酸序列、氨基酸序列或其组合。核酸序列可以是DNA、RNA、cDNA、其变体、其片段或其组合。核酸序列还可以包括编码通过肽键与抗原连接的接头或标签序列的其它序列。氨基酸序列可以是蛋白质、肽、其变体、其片段或其组合。

抗原可以包含在来自任何数量的生物体，例如病毒、寄生物、细菌、真菌或者哺乳动物的蛋白质、核酸或其片段，或其变体，或其组合中。抗原可以与自身免疫性疾病、变态反应或哮喘相关。在其它实施方案中，抗原可与癌症、疱疹、流感、乙型肝炎、丙型肝炎、人乳头状瘤病毒(HPV)或人免疫缺陷病毒(HIV)相关。优选地，抗原可以与流感或HIV相关。

一些抗原可以诱导强的免疫应答。其它抗原可以诱导弱的免疫应答。当与如上所述的PD1抗体或PDL1抗体组合时，抗原可以引发更高的免疫应答。

(1)病毒抗原

抗原可以是病毒抗原或其片段或其变体。病毒抗原可以来自以下科中的一个的病毒：腺病毒科、沙粒病毒科、布尼亚病毒科、杯状病毒科、冠状病毒科、纤丝病毒科、嗜肝DNA病毒科、疱疹病毒科、正粘病毒科、乳多空病毒科、副粘病毒科、细小病毒科、小核糖核酸病毒科、痘病毒科、呼肠孤病毒科、逆转录病毒科、弹状病毒科或披膜病毒科。病毒抗原可以来自乳头状瘤病毒例如人乳头瘤病毒(HPV)、人免疫缺陷病毒(HIV)、脊髓灰质炎病毒、肝炎病毒例如甲型肝炎病毒(HAV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、丁型肝炎病毒(HDV)和戊型肝炎病毒(HEV)、天花病毒(重型和轻型天花)、痘苗病毒、流感病毒、鼻病毒、登革热病毒、马脑炎病毒、风疹病毒、黄热病毒、诺瓦克病毒、甲型肝炎病毒、人T细胞白血病病毒(HTLV-I)、毛细胞白血病病毒(HTLV-II)、加州脑炎病毒、汉坦病毒(出血热)、狂犬病病毒、埃博拉病毒、马尔堡病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、单纯疱疹1(口腔疱疹)、单纯疱疹2(生殖器疱疹)、带状疱疹(水痘带状疱疹，又称水痘)、巨细胞病毒(CMV)例如人CMV、埃-巴二氏病毒(EBV)、黄病毒、口蹄疫病毒、屈曲病毒、拉沙病毒、沙粒病毒或致癌病毒。

(a)肝炎抗原

检查点抑制剂可以与肝炎病毒抗原(即肝炎抗原)或其片段或其变体结合或组合。肝炎抗原可以是来自甲型肝炎病毒(HAV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、丁型肝炎病毒(HDV)和/或戊型肝炎病毒(HEV)的抗原或免疫原。在一些实施方案中，肝炎抗原可以是编码来自HAV、HBV、HCV、HDV和HEV的一种或多种抗原的核酸分子，如质粒。肝炎抗原可以是全长蛋白的全长或免疫原性片段。

肝炎抗原可以包含共有序列和/或用于改善表达的修饰。在修饰的共有序列中可以包括遗传修饰，包括密码子优化、RNA优化和添加高效免疫球蛋白前导序列以增加构建体的免疫原性。共有肝炎抗原可以包含信号肽，如免疫球蛋白信号肽，如IgE或IgG信号肽，并且在一些实施方案中，可以包含HA标签。免疫原可以设计为引发比相应的密码子优化的免疫原更强和更广泛的细胞免疫应答。

肝炎抗原可以是来自HAV的抗原。肝炎抗原可以是HAV衣壳蛋白、HAV非结构蛋白、其片段、其变体或其组合。

肝炎抗原可以是来自HCV的抗原。肝炎抗原可以是HCV核衣壳蛋白(即核心蛋白)、HCV包膜蛋白(例如E1和E2)、HCV非结构蛋白(例如NS1、NS2、NS3、NS4a、NS4b、NS5a和NS5b)、其片段、其变体或其组合。

肝炎抗原可以是来自HDV的抗原。肝炎抗原可以是HDVδ抗原、其片段或其变体。

肝炎抗原可以是来自HEV的抗原。肝炎抗原可以是HEV衣壳蛋白、其片段或其变体。

肝炎抗原可以是HBV的抗原。肝炎抗原可以是HBV核心蛋白、HBV表面蛋白、HBV DNA聚合酶、由基因X编码的HBV蛋白、其片段、其变体或其组合。肝炎抗原可以是HBV A基因型核心蛋白、HBV B基因型核心蛋白、HBV C基因型核心蛋白、HBV D基因型核心蛋白、HBV E基因型核心蛋白、HBV F基因型核心蛋白、HBV G基因型核心蛋白、HBV H基因型核心蛋白、HBV A基因型表面蛋白、HBV B基因型表面蛋白、HBV C基因型表面蛋白、HBV D基因型表面蛋白、HBV E基因型表面蛋白、HBV F基因型表面蛋白、HBV G基因型表面蛋白、HBV H基因型表面蛋白、其片段、其变体或其组合。肝炎抗原可以是共有HBV核心蛋白，或共有HBV表面蛋白。

在一些实施方案中，肝炎抗原可以是HBV A基因型共有核心DNA序列构建体，与HBVA基因型核心蛋白的共有序列连接的IgE前导序列或HBV A基因型共有核心蛋白质序列。

在其它实施方案中，肝炎抗原可以是HBV B基因型共有核心DNA序列构建体，与HBVB基因型核心蛋白的共有序列连接的IgE前导序列，或HBV B基因型共有核心蛋白序列。

在其它实施方案中，肝炎抗原可以是HBV C基因型共有核心DNA序列构建体，与HBVC基因型核心蛋白的共有序列连接的IgE前导序列或HBV C基因型共有核心蛋白序列。

在一些实施方案中，肝炎抗原可以是HBV D基因型共有核心DNA序列构建体，与HBVD基因型核心蛋白的共有序列连接的IgE前导序列或HBV D基因型共有核心蛋白序列。

在一些实施方案中，肝炎病毒可以是HBV E基因型共有核心DNA序列构建体、与HBVE基因型核心蛋白的共有序列连接的IgE前导序列或HBV E基因型共有核心蛋白序列。

在其它实施方案中，肝炎抗原可以是HBV F基因型共有核心DNA序列构建体、与HBVF基因型核心蛋白的共有序列连接的IgE前导序列或HBV F基因型共有核心蛋白序列。

在其它实施方案中，肝炎抗原可以是HBV G基因型共有核心DNA序列构建体、与HBVG基因型核心蛋白的共有序列连接的IgE前导序列或HBV G基因型共有核心蛋白序列。

在一些实施方案中，肝炎病毒可以是HBV H基因型共有核心DNA序列构建体、与HBVH基因型核心蛋白的共有序列连接的IgE前导序列或HBV H基因型共有核心蛋白序列。

在其它实施方案中，肝炎抗原可以是HBV A基因型共有表面DNA序列构建体、与HBVA基因型表面蛋白的共有序列连接的IgE前导序列或HBV A基因型共有表面蛋白序列。

在一些实施方案中，肝炎病毒可以是HBV B基因型共有表面DNA序列构建体、与HBVB基因型表面蛋白的共有序列连接的IgE前导序列或HBV B基因型共有表面蛋白序列。

在其它实施方案中，肝炎抗原可以是HBV C基因型共有表面DNA序列构建体、与HBVC基因型表面蛋白的共有序列连接的IgE前导序列或HBV C基因型共有表面蛋白序列。

在其它实施方案中，肝炎抗原可以是HBV D基因型共有表面DNA序列构建体、与HBVD基因型表面蛋白的共有序列连接的IgE前导序列或HBV D基因型共有表面蛋白序列。

在一些实施方案中，肝炎病毒可以是HBV E基因型共有表面DNA序列构建体、与HBVE基因型表面蛋白的共有序列连接的IgE前导序列或HBV E基因型共有表面蛋白序列。

在其它实施方案中，肝炎抗原可以是HBV F基因型共有表面DNA序列构建体、与HBVF基因型表面蛋白的共有序列连接的IgE前导序列或HBV F基因型共有表面蛋白序列。

在其它实施方案中，肝炎抗原可以是HBV G基因型共有表面DNA序列构建体、与HBVG基因型表面蛋白的共有序列连接的IgE前导序列或HBV G基因型共有表面蛋白序列。

在其它实施方案中，肝炎抗原可以是HBV H基因型共有表面DNA序列构建体、与HBVH基因型表面蛋白的共有序列连接的IgE前导序列或HBV H基因型共有表面蛋白序列。

(b)人乳头状瘤病毒(HPV)抗原

检查点抑制剂可以与人乳头状瘤病毒(HPV)抗原或其片段或其变体结合或组合。HPV抗原可以来自引起宫颈癌、直肠癌和/或其它癌症的HPV 16、18、31、33、35、45、52和58型。HPV抗原可以来自HPV 6型和11型，其引起生殖器疣，并且已知是头颈癌的起因。

HPV抗原可以是来自每种HPV类型的HPV E6或E7结构域。例如，对于HPV16型(HPV16)，HPV16抗原可以包括HPV16E6抗原、HPV16E7抗原、其片段、变体或组合。类似地，HPV抗原可以是HPV 6E6和/或E7、HPV 11E6和/或E7、HPV 18E6和/或E7、HPV 31E6和/或E7、HPV33E6和/或E7、HPV 52E6和/或E7或HPV 58E6和/或E7、其片段、变体或组合。

(c)RSV抗原

检查点抑制剂也可以与RSV抗原或其片段或其变体结合或组合。RSV抗原可以是人RSV融合蛋白(在本文中又称为“RSV F”、“RSV F蛋白”和“F蛋白”)或其片段或变体。人RSV融合蛋白在RSV A和B亚型之间是保守的。RSV抗体可以是来自RSV Long株(GenBankAAX23994.1)的RSV F蛋白或其片段或变体。RSV抗原可以是来自RSV A2株(GenBankAAB59858.1)的RSV F蛋白或其片段或变体。RSV抗原可以是RSV F蛋白或其片段或变体的单体、二聚体或三聚体。RSV抗原可以是优化的氨基酸RSV F氨基酸序列或其片段或变体。

RSV F的融合后形式在免疫的动物中引发高滴度的中和抗体并且保护动物免于RSV攻击。本发明利用要求保护的疫苗中的此免疫应答。根据本发明，RSV F蛋白可以为融合前形式或融合后形式。

RSV抗原也可以是人RSV附着糖蛋白(在本文中也称为“RSV G”、“RSV G蛋白”和“G蛋白”)或其片段或变体。人RSV G蛋白在RSV A和B亚型之间不同。抗原可以是来自RSV Long株(GenBank AAX23993)的RSV G蛋白或其片段或变体。RSV抗原可以是来自以下的RSV G蛋白：RSV B亚型分离株H5601、RSV B亚型分离株H1068、RSV B亚型分离株H5598、RSV B亚型分离株H1123或其片段或变体。RSV抗原可以是优化的氨基酸RSV G氨基酸序列或其片段或变体。

在其它实施方案中，RSV抗原可以是人RSV非结构蛋白1(“NS1蛋白”)或其片段或变体。例如，RSV抗原可以是来自RSV Long株(GenBank AAX23987.1)的RSV NS1蛋白或其片段或变体。RSV抗原人也可以是RSV非结构蛋白2(“NS2蛋白”)或其片段或变体。例如，RSV抗原可以是来自RSV Long株(GenBank AAX23988.1)的RSVNS2蛋白或其片段或变体。RSV抗原可以进一步是人RSV核壳体(“N”)蛋白或其片段或变体。例如，RSV抗原可以是来自RSV Long株(GenBank AAX23989.1)的RSV N蛋白或其片段或变体。RSV抗原可以是人RSV磷蛋白(“P”)蛋白或其片段或变体。例如，RSV抗原可以是来自RSV Long株(GenBank AAX23990.1)的RSV P蛋白或其片段或变体。RSV抗原也可以是人RSV基质蛋白(“M”)蛋白或其片段或变体。例如，RSV抗原可以是来自RSV Long株(GenBankAAX23991.1)的RSV M蛋白或其片段或变体。

在其它实施方案中，RSV抗原可以是人RSV小疏水性(“SH”)蛋白或其片段或变体。例如，RSV抗原可以是来自RSV Long株(GenBank AAX23992.1)的RSV SH蛋白或其片段或变体。RSV抗原也可以是人RSV基质蛋白2-1(“M2-1”)蛋白或其片段或变体。例如，RSV抗原可以是来自RSV Long株(GenBank AAX23995.1)的RSV M2-1蛋白或其片段或变体。RSV抗原可以进一步是人RSV基质蛋白2-2(“M2-2”)蛋白或其片段或变体。例如，RSV抗原可以是来自RSVLong株(GenBank AAX23997.1)的RSV M2-2蛋白或其片段或变体。RSV抗原人可以是RSV聚合酶L(“L”)蛋白或其片段或变体。例如，RSV抗原可以是来自RSV Long株(GenBankAAX23996.1)的RSV L蛋白或其片段或变体。

在其它实施方案中，RSV抗原可以具有NS1、NS2、N、P、M、SH、M2-1、M2-2或L蛋白的优化的氨基酸序列。RSV抗原可以是人RSV蛋白或重组抗原，如由人RSV基因组编码的蛋白质中的任一种。

在其它实施方案中，RSV抗原可以是但不限于来自RSV Long株的RSV F蛋白、来自RSV Long株的RSV G蛋白、优化的氨基酸RSV G氨基酸序列、RSV Long株的人RSV基因组、优化的氨基酸RSV F氨基酸序列、来自RSV Long株的RSV NS1蛋白、来自RSV Long株的RSV NS2蛋白、来自RSV Long株的RSV N蛋白、来自RSV Long株的RSV P蛋白、来自RSV Long株的RSVM蛋白、来自RSV Long株的RSV SH蛋白、来自RSV Long株的RSV M2-1蛋白、来自RSV Long株的RSV M2-2蛋白、来自RSV Long株的RSV L蛋白、来自RSV B亚型分离株H5601的RSV G蛋白、来自RSV B亚型分离株H1068的RSV G蛋白、来自RSV B亚型分离株H5598的RSV G蛋白、来自RSV B亚型分离株H1123的RSV G蛋白或其片段或其变体。

(d)流感抗原

检查点抑制剂可以与流感抗原或其片段或其变体结合或组合。流感抗原是那些能够在哺乳动物中针对一种或多种流感血清型引发免疫应答的抗原。抗原可以包含全长翻译产物HA0、亚基HA1、亚基HA2、其变体、其片段或其组合。流感血凝素抗原可以是源自甲型流感血清型H1的多个病毒株的共有序列、源自甲型流感血清型H2的多个病毒株的共有序列、含有源自不同组的甲型流感血清型H1的多个病毒株的两种不同共有序列的部分的杂交序列或源自乙型流感的多个病毒株的共有序列。流感血凝素抗原可来自乙型流感。

流感抗原还可以含有至少一种抗原性表位，该抗原性表位可以有效地抵抗能诱导免疫应答的特定流感免疫原。抗原可以提供存在于完整流感病毒中的免疫原性位点和表位的整个库。抗原可以是可以源自一种血清型的多个甲型流感病毒株的血凝素抗原序列的共有血凝素抗原序列，如多个甲型流感血清型H1或血清型H2病毒株。抗原可以是可以从组合两种不同的共有血凝素抗原序列或其部分衍生的杂交共有血凝素抗原序列。两种不同的共有血凝素抗原序列中的每一种可以源自一种血清型的多个甲型流感病毒株的不同组，如多种甲型流感血清型H1病毒株。抗原可以是可源自多个乙型流感病毒株的血凝素抗原序列的共有血凝素抗原序列。

在一些实施方案中，流感抗原可以是H1 HA、H2 HA、H3 HA、H5 HA或BHA抗原。或者，流感抗原可以是包含共有H1氨基酸序列或共有H2氨基酸序列的共有血凝素抗原。共有血凝素抗原可以是包含两个不同共有H1序列的部分的合成杂交共有H1序列，其各自源自彼此不同的序列组。作为合成杂交共有H1蛋白的共有HA抗原的实例是包含U2氨基酸序列的蛋白质。共有血凝素抗原可以是源自乙型流感病毒株的血凝素序列的共有血凝素蛋白，如包含共有BHA氨基酸序列的蛋白质。

共有血凝素抗原可以进一步包含一个或多个另外的氨基酸序列元件。共有血凝素抗原可以在其N-末端进一步包含IgE或IgG前导氨基酸序列。共有血凝素抗原可进一步包含免疫原性标签，其是可以通过易获得的抗体检测的独特的免疫原性表位。这种免疫原性标签的实例是可以在共有血凝素C末端连接的9个氨基酸的流感HA标签。在一些实施方案中，共有血凝素抗原还可以在其N-末端包含IgE或IgG前导氨基酸序列和在其C末端包含HA标签。

共有血凝素抗原可以是由共有流感氨基酸序列或其片段和变体组成的共有血凝素蛋白。共有血凝素抗原可以是包含非流感蛋白序列和流感蛋白序列或其片段和变体的共有血凝素蛋白。

共有H1蛋白的实例包括可以由共有H1氨基酸序列组成的那些，或者还包含另外的元件如IgE前导序列或HA标签或者IgE前导序列和HA标签两者的那些。

共有H2蛋白的实例包括可以由共有H2氨基酸序列组成的那些，或者还包含IgE前导序列或HA标签或者IgE前导序列和HA标签两者的那些。

杂交共有H1蛋白的实例包括可以由共有U2氨基酸序列组成的那些或进一步包含IgE前导序列或HA标签或IgE前导序列和HA标签两者的那些。

杂交共有乙型流感血凝素蛋白的实例包括可由共有BHA氨基酸序列组成的那些，或者它可以包含IgE前导序列，或HA标签，或IgE前导序列和HA标签两者。

共有血凝素蛋白可由共有血凝素核酸、其变体或其片段编码。与可以是源自不同株和变体的多种不同血凝素序列的共有序列的共有血凝素蛋白不同，共有血凝素核酸是指编码共有蛋白质序列的核酸序列，并且所使用的编码序列可不同于用于编码共有血凝素蛋白序列所源自的多个不同血凝素序列中特定氨基酸序列的那些。共有核酸序列可以是密码子优化的和/或RNA优化的。共有血凝素核酸序列可以包含5'非翻译区中的Kozak序列。共有血凝素核酸序列可以包含编码前导序列的核酸序列。N末端前导序列的编码序列是血凝素编码序列的5'。N末端前导序列可以促进分泌。N末端的前导序列可以是IgE前导序列或IgG前导序列。共有血凝素核酸序列可以包含编码免疫原性标签的核酸序列。免疫原性标签可以在蛋白质的C末端，而编码它的序列是HA编码序列的3'。免疫原性标签提供了独特的表位，对于所述表位存在易于获得的抗体，使得这些抗体可用于检测和确认蛋白质表达的测定中。免疫原性标签可以是蛋白质C末端的H标签。

(e)人免疫缺陷病毒(HIV)抗原

检查点抑制剂可以与HIV抗原或其片段或其变体结合或组合。HIV抗原可以包括用于免疫原的修饰的共有序列。在修饰的共有序列中可以包括遗传修饰，包括密码子优化、RNA优化和添加高效免疫球蛋白前导序列以增加构建体的免疫原性。可以设计新颖的免疫原来引发比相应的密码子优化的免疫原更强和更广泛的细胞免疫应答。

在一些实施方案中，HIV抗原可以是A亚型共有包膜DNA序列构建体、与A亚型包膜蛋白的共有序列连接的IgE前导序列或A亚型共有包膜蛋白序列。

在其它实施方案中，HIV抗原可以是B亚型共有包膜DNA序列构建体、与B亚型包膜蛋白的共有序列连接的IgE前导序列或B亚型共有包膜蛋白序列。

在其它实施方案中，HIV抗原可以是C亚型共有包膜DNA序列构建体、与C亚型包膜蛋白的共有序列连接的IgE前导序列或C亚型共有包膜蛋白序列。

在另外的实施方案中，HIV抗原可以是D亚型共有包膜DNA序列构建体、与D亚型包膜蛋白的共有序列连接的IgE前导序列或D亚型共有包膜蛋白序列。

在一些实施方案中，HIV抗原可以是B亚型Nef-Rev共有包膜DNA序列构建体、与B亚型Nef-Rev蛋白的共有序列连接的IgE前导序列或B亚型Nef-Rev共有蛋白序列。

在其它实施方案中，HIV抗原可以是A、B、C和D亚型DNA序列构建体的Gag共有DNA序列、与Gag共有A、B、C和D亚型蛋白的共有序列连接的IgE前导序列或共有Gag A、B、C和D亚型蛋白序列。

在其它实施方案中，HIV抗原可以是MPol DNA序列或MPol蛋白序列。HIV抗原可以是Env A、Env B、Env C、Env D、B Nef-Rev、Gag或其任何组合的核酸或氨基酸序列。

(f)疱疹抗原，包括HCMV、HSV1、HSV2、CEHV1和VZV

疱疹抗原包含免疫原性蛋白，包括gB、gM、gN、gH、gL、gO、gE、gI、gK、gC、gD、UL128、UL130、UL-131A、UL-83(pp65)，无论来自HCMV、HSV1、HSV2、CeHV1或VZV。在一些实施方案中，抗原可以是HSV1-gH、HSV1-gL、HSV1-gC、HSV1-gD、HSV2-gH、HSV2-gL、HSV2-gC、HSV2-gD、VZV-gH、VZV-gL、VZV-gM、VZV-gN、CeHV1-gH、CeHV1-gL、CeHV1-gC、CeHV1-gD、VZV-gE或VZV-gI。

(2)寄生物抗原

抗原可以是寄生物抗原或其片段或变体。寄生物可以是原生动物、蠕虫或外寄生物。肠虫(即蠕虫)可以是扁虫(例如吸虫和绦虫)、棘头虫或线虫(round worm)(例如蛲虫)。外寄生物可以是虱、跳蚤、扁虱和螨。

寄生物可以是引起以下疾病的任何寄生物：棘阿米巴角膜炎(Acanthamoebakeratitis)、阿米巴病(Amoebiasis)、蛔虫病(Ascariasis)、巴贝虫病(Babesiosis)、小袋虫病(Balantidiasis)、浣熊蛔虫病(Baylisascariasis)、查加斯病(Chagas disease)、华支睾吸虫病(Clonorchiasis)、锥蝇属(Cochliomyia)、隐孢子虫病(Cryptosporidiosis)、裂头绦虫病(Diphyllobothriasis)、龙线虫病(Dracunculiasis)、棘球蚴病(Echinococcosis)、象皮病(Elephantiasis)、蛲虫病(Enterobiasis)、片吸虫病(Fascioliasis)、姜片虫病(Fasciolopsiasis)、丝虫病(Filariasis)、贾第虫病(Giardiasis)、颚口线虫病(Gnathostomiasis)、膜壳绦虫病(Hymenolepiasis)、等孢子球虫病(Isosporiasis)、钉螺热(Katayama fever)、利什曼病(Leishmaniasis)、莱姆病(Lymedisease)、疟疾(Malaria)、后殖吸虫病(Metagonimiasis)、蝇蛆病(Myiasis)、盘尾丝虫病(Onchocerciasis)、虱病(Pediculosis)、疥疮(Scabies)、血吸虫病(Schistosomiasis)、昏睡病(Sleeping sickness)、类圆线虫病(Strongyloidiasis)、绦虫病(Taeniasis)、弓蛔虫病(Toxocariasis)、弓形虫病(Toxoplasmosis)、旋毛虫病(Trichinosis)和鞭虫病(Trichuriasis)。

寄生物可以是棘阿米巴属(Acanthamoeba)、异尖属(Anisakis)、蛔虫(Ascarislumbricoides)、肤蝇(Botfly)、大肠纤毛虫(Balantidium coli)、臭虫(Bedbug)、多节绦虫亚纲(绦虫(tapeworm))、恙螨(Chiggers)、螺旋锥蝇(Cochliomyia hominivorax)、溶组织内阿米巴(Entamoeba histolytica)、肝片吸虫(Fasciola hepatica)、兰伯贾第虫(Giardia lamblia)、钩虫、利什曼原虫属(Leishmania)、锯齿舌形虫(Linguatulaserrata)、肝吸虫(Liver fluke)、罗阿丝虫(Loa loa)、并殖吸虫属-肺吸虫(Paragonimus-lung fluke)、蛲虫(Pinworm)、恶性疟原虫、血吸虫属(Schistosoma)、粪类圆线虫(Strongyloides stercoralis)、螨、绦虫、鼠弓形虫(Toxoplasma gondii)、锥虫属(Trypanosoma)、鞭虫或班氏吴策线虫(Wuchereria bancrofti)。

(a)疟疾抗原

检查点抑制剂可以与疟疾抗原(即PF抗原或PF免疫原)或其片段或其变体结合或组合。抗原可以来自引起疟疾的寄生虫。引起疟疾的寄生虫可以是恶性疟原虫。恶性疟原虫抗原可以包括环子孢子(CS)抗原。

在一些实施方案中，疟疾抗原可以是核酸分子，如编码恶性疟原虫免疫原CS；LSA1；TRAP；CelTOS；和Ama1的一种或多种的质粒。免疫原可以是全长蛋白的全长或免疫原性片段。免疫原包括用于改善表达的共有序列和/或修饰。

在其它实施方案中，疟疾抗原可以是由GenBank数据库中所有全长恶性疟原虫TRAP/SSP2序列(共28个序列)编译而设计的TRAP共有序列，其也称为SSP2。共有TRAP免疫原(即，ConTRAP免疫原)可以包含信号肽，如免疫球蛋白信号肽，如IgE或IgG信号肽，并且在一些实施方案中可以包含HA标签。

在其它实施方案中，疟疾抗原可以是CelTOS，其也称为Ag2，并且是高度保守的疟原虫属抗原。共有CelTOS抗原(即，ConCelTOS免疫原)可以包含信号肽，如免疫球蛋白信号肽，如IgE或IgG信号肽，并且在一些实施方案中，可以包含HA标签。

在另外的实施方案中，疟疾抗原可以是Ama1，其是高度保守的疟原虫属抗原。疟疾抗原也可以是Ama1(即ConAmaI免疫原)的共有序列，其在一些情况下包括信号肽，诸如免疫球蛋白信号肽，如IgE或IgG信号肽，并且在一些实施方案中可包含HA标签。

在一些实施方案中，疟疾抗原可以是共有CS抗原(即共有CS免疫原)，其在一些情况下包含信号肽，如免疫球蛋白信号肽，如IgE或IgG信号肽，并且在一些实施方案中可包含HA标签。

在其它实施方案中，疟疾抗原可以是融合蛋白，其包含本文中列出的两种或更多种PF蛋白的组合。例如，融合蛋白可以包含彼此相邻直接连接或用其间的间隔物或一个或多个氨基酸连接的共有CS免疫原、ConLSA1免疫原、ConTRAP免疫原、ConCelTOS免疫原和ConAma1免疫原中的两种或更多种。在一些实施方案中，融合蛋白包含两个PF免疫原；在一些实施方案中，融合蛋白包含三个PF免疫原，在一些实施方案中，融合蛋白包含四个PF免疫原，并且在一些实施方案中，融合蛋白包含五个PF免疫原。具有两个共有PF免疫原的融合蛋白可以包含：CS和LSA1；CS和TRAP；CS和CelTOS；CS和Ama1；LSA1和TRAP；LSA1和CelTOS；LSA1和Ama1；TRAP和CelTOS；TRAP和Ama1；或CelTOS和Ama1。具有三个共有PF免疫原的融合蛋白可以包含：CS、LSA1和TRAP；CS、LSA1和CelTOS；CS、LSA1和Ama1；LSA1、TRAP和CelTOS；LSA1、TRAP和Ama1；或TRAP、CelTOS和Ama1。具有四个共有PF免疫原的融合蛋白可以包含：CS、LSA1、TRAP和CelTOS；CS、LSA1、TRAP和Ama1；CS、LSA1、CelTOS和Ama1；CS、TRAP、CelTOS和Ama1；或LSA1、TRAP、CelTOS和Ama1。具有五个共有PF免疫原的融合蛋白可以包含CS或CS-alt、LSA1、TRAP、CelTOS和Ama1。

在一些实施方案中，融合蛋白包含与N末端连接的信号肽。在一些实施方案中，融合蛋白包含与每个共有PF免疫原的N末端连接的多个信号肽。在一些实施方案中，间隔物可以包含在融合蛋白的PF免疫原之间。在一些实施方案中，融合蛋白的PF免疫原之间的间隔物可以是蛋白水解切割位点。在一些实施方案中，间隔物可以是由意图施用或摄取疫苗的细胞中发现的蛋白酶识别的蛋白水解切割位点。在一些实施方案中，间隔物可以包含在融合蛋白的PF免疫原之间，其中所述间隔物是由意图施用和/或摄取疫苗的细胞中发现的蛋白酶识别的蛋白水解切割位点，并且融合蛋白包含与每个共有PF免疫原的N末端连接的多个信号肽，使得在切割时，每个共有PF免疫原的信号肽将共有PF免疫原移位到细胞外。

(3)细菌抗原

抗原可以是细菌抗原或其片段或变体。该细菌可以来自以下任何一种门：酸杆菌门(Acidobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、产水菌门(Aquificae)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、嗜热丝菌门(Caldiserica)、衣原体门(Chlamydiae)、绿菌门(Chlorobi)、绿弯菌门(Chloroflexi)、产金菌门(Chrysiogenetes)、蓝细菌门(Cyanobacteria)、脱铁杆菌门(Deferribacteres)、异常球菌属-栖热菌属(Deinococcus-Thermus)、网团菌门(Dictyoglomi)、迷踪菌门(Elusimicrobia)、纤维杆菌门(Fibrobacteres)、厚壁菌门(Firmicutes)、梭杆菌门(Fusobacteria)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)、黏胶球形菌门(Lentisphaerae)、硝化螺旋菌门(Nitrospira)、浮霉菌门(Planctomycetes)、蛋白菌门(Proteobacteria)、螺旋体门(Spirochaetes)、互养菌门(Synergistetes)、软壁菌门(Tenericutes)、热脱硫杆菌门(Thermodesulfobacteria)、热袍菌门(Thermotogae)和疣微菌门(Verrucomicrobia)。

细菌可以是革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌。细菌可以是好氧细菌或厌氧细菌。细菌可以是自养细菌或异养细菌。细菌可以是嗜常温菌、嗜中性菌、嗜极菌、嗜酸细胞、嗜碱细胞、嗜热菌、嗜冷菌、嗜盐菌或嗜高渗菌。

细菌可以是炭疽细菌、抗生素抗性细菌、致病细菌、食物中毒细菌、感染性细菌、沙门氏菌属细菌、葡萄球菌属细菌、链球菌属细菌或破伤风细菌。细菌可以是分枝杆菌、破伤风杆菌、鼠疫杆菌、炭疽杆菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)或艰难梭菌。细菌可以是结核分枝杆菌。

(a)结核分枝杆菌抗原

检查点抑制剂可以与结核分枝杆菌抗原(即TB抗原或TB免疫原)或其片段或其变体结合或组合。TB抗原可以来自TB抗原的Ag85家族，例如Ag85A和Ag85B。TB抗原可以来自TB抗原的Esx家族，例如EsxA、EsxB、EsxC、EsxD、EsxE、EsxF、EsxH、EsxO、EsxQ、EsxR、EsxS、EsxT、EsxU、EsxV和EsxW。

在一些实施方案中，TB抗原可以是核酸分子，如编码来自Ag85家族和Esx家族的一种或多种结核分枝杆菌免疫原的质粒。免疫原可以是全长蛋白质的全长或免疫原性片段。免疫原可以包含用于改善表达的共有序列和/或修饰。共有免疫原可以包含信号肽，如免疫球蛋白信号肽，如IgE或IgG信号肽，并且在一些实施方案中，可以包含HA标签。

(4)真菌抗原

抗原可以是真菌抗原或其片段或变体。真菌可以是曲霉属(Aspergillus)物种、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)、假丝酵母属(Candida)酵母(例如白色念珠菌(Candida albicans))、球孢子菌属(Coccidioides)、新型隐球菌(Cryptococcusneoformans)、加特隐球酵母(Cryptococcus gattii)、皮肤癣菌、镰孢菌属(Fusarium)物种、夹膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)、毛霉菌亚门(Mucoromy cotina)、杰氏肺囊虫(Pneumocystis jirovecii)、申克氏孢子丝菌(Sporothrix schenckii)、明脐菌属(Exserohilum)或分枝孢子菌属(Cladosporium)。

(5)癌症标志物

标志物是与某些癌细胞相比存在或上调的已知蛋白质。通过以破坏对自身的耐受性的方式产生代表这种标志物的抗原的方法，可以产生癌症疫苗。这种癌症疫苗可以包括检查点抑制剂以增强免疫应答。以下是一些癌症抗原：

a.hTERT

hTERT是人端粒酶逆转录酶，其在端粒末端合成TTAGGG标签，以防止由于染色体缩短引起的细胞死亡。具有异常高表达的hTERT的过度增殖细胞可以通过免疫疗法靶向。最近的研究表明，用hTERT基因转染的树突细胞中的hTERT表达可以诱导CD8+细胞毒性T细胞，并以抗原特异性方式引发CD4+T细胞。

hTERT可以在本文所述的载体中施用，并且在各种疫苗接种日程表(包括下面实施例中的日程表)中与检查点抑制剂组合。

b.前列腺抗原

以下是能够在哺乳动物中针对前列腺抗原引发免疫应答的抗原。共有抗原可以包含使得它们作为针对前列腺癌细胞的免疫原特别有效的表位。共有前列腺抗原可以包含全长翻译产物、其变体、其片段或其组合。

前列腺抗原可以包括以下一种或多种：PSA抗原、PSMA抗原、STEAP抗原、PSCA抗原、前列腺酸磷酸酶(PAP)抗原和其它已知的前列腺癌标志物。蛋白质可以包含与前列腺抗原同源的序列、前列腺抗原的片段和具有与前列腺抗原片段同源的序列的蛋白质。

前列腺抗原可以在本文所述的载体中施用，并且在各种疫苗接种日程表(包括下面实施例中的日程表)中与检查点抑制剂组合。

c.WT1

抗原可以是维尔姆斯瘤(Wilm’s tumor)抑制基因1(WT1)、其片段、其变体或其组合。WT1是在N末端含有富含脯氨酸/谷氨酰胺的DNA结合结构域并且在C末端含有四个锌指基序的转录因子。WT1在泌尿生殖系统的正常发育中起作用，并与许多因子相互作用，例如已知的肿瘤抑制因子p53和丝氨酸蛋白酶HtrA2，其在用细胞毒性药物治疗后在多个位点切割WT1。

WT1的突变可导致肿瘤或癌症形成，例如维尔姆斯瘤或表达WT1的肿瘤。在转移到其它组织之前，例如但不限于肝组织、尿道系统组织、淋巴组织和肺组织，维尔姆斯瘤通常在一个或两个肾中形成。因此，可以认为维尔姆斯瘤是转移性肿瘤。维尔姆斯瘤通常在较幼小的儿童(例如小于5岁龄)中并且以散发性和遗传性两种形式发生。因此，该疫苗可用于治疗患有维尔姆斯瘤的受试者。该疫苗也可用于治疗患有表达WT1的癌症或肿瘤的受试者以预防受试者中这些肿瘤的发展。WT1抗原可以与天然的“正常”WT1基因不同，从而提供针对表达WT1抗原的肿瘤的疗法或预防。蛋白质可以包含与WT1抗原同源的序列、WT1抗原的片段和具有与WT1抗原片段同源的序列的蛋白质。

WT1抗原可以在本文所述的载体中施用，并且在各种疫苗接种日程表(包括下面实施例中的日程表)中与检查点抑制剂组合。

d.酪氨酸酶抗原

抗原酪氨酸酶(Tyr)抗原是通过如下进行免疫介导的清除的重要靶标：诱导(1)经由B细胞应答的体液免疫产生阻断单核细胞化学引诱物蛋白-1(MCP-1)产生的抗体，从而延缓髓源性抑制细胞(MDSC)并且抑制肿瘤生长；(2)增加细胞毒性T淋巴细胞，如CD8⁺(CTL)以攻击和杀死肿瘤细胞；(3)增加T辅助细胞应答；(4)并且增加经由IFN-γ和TFN-α的炎性应答，或优选全部上述项。

酪氨酸酶是可以在植物和动物组织中发现的含铜的酶。酪氨酸酶通过酚如酪氨酸的氧化催化黑色素和其它色素的产生。在黑素瘤中，酪氨酸酶可以不受调节，导致黑色素合成增加。酪氨酸酶也是患有黑素瘤的受试者中的细胞毒性T细胞识别的靶标。因此，酪氨酸酶可以是与黑素瘤相关的抗原。

抗原可以包含使其作为可以诱导抗Tyr免疫应答的免疫原特别有效的蛋白质表位。Tyr抗原可以包含全长翻译产物、其变体、其片段或其组合。

Tyr抗原可以包含共有蛋白。Tyr抗原诱导抗原特异性T细胞和高效价抗体应答，两者都系统性针对所有癌症和肿瘤相关细胞。因此，通过包含Tyr共有抗原的疫苗提供针对肿瘤形成的保护性免疫应答。因此，任何用户都可以设计本发明的疫苗以包括Tyr抗原，从而提供对肿瘤形成、肿瘤转移和肿瘤生长的广泛免疫。蛋白质可以包含与Tyr抗原同源的序列、Tyr抗原的片段和具有与Tyr抗原的片段同源的序列的蛋白质。

Tyr抗原可以在本文所述的载体中施用，并且在各种疫苗接种日程表(包括下面实施例中的日程表)中与检查点抑制剂组合。

e.NYES01

NY-ESO-1是在各种癌症中表达的癌症-睾丸抗原，其中它可以诱导细胞和体液免疫两者。基因表达研究已经显示NY-ESO-1、CTAG1B的基因在髓样和圆细胞脂肪肉瘤中的上调。蛋白质可以包含与NYES01抗原同源的序列、NYES01抗原的片段和具有与NYES01抗原片段同源的序列的蛋白质。

NYES01抗原可以在本文所述的载体中施用，并且在各种疫苗接种日程表(包括下面实施例中的日程表)中与检查点抑制剂组合。

f.PRAME

在肿瘤中优先表达的黑素瘤抗原(PRAME抗原)是人中由PRAME基因编码的蛋白质。该基因编码主要在人黑素瘤中表达并被细胞溶解性T淋巴细胞识别的抗原。它在睾丸除外的正常组织中不表达。基因也在急性白血病中表达。对该基因已经观察到编码相同蛋白质的5个可变剪接的转录物变体。蛋白质可以包含与PRAME抗原同源的序列、PRAME抗原的片段和与PRAME抗原片段同源的序列的蛋白质。

PRAME抗原可以在本文所述的载体中施用，并且在各种疫苗接种日程表(包括下面实施例中的日程表)中与检查点抑制剂组合。

g.MAGE

MAGE代表黑素瘤相关抗原，特别是黑素瘤相关抗原4(MAGEA4)。MAGE-A4在雄性生殖细胞和各种组织学类型的肿瘤细胞，如胃肠、食管和肺癌中表达。MAGE-A4结合癌蛋白Gankyrin。该MAGE-A4特异性结合由其C-末端介导。研究已表明外源性MAGE-A4可以部分在体外抑制Gankyrin过表达细胞的不依赖于粘附的生长，并且抑制裸鼠中从这些细胞形成迁移肿瘤。这种抑制取决于MAGE-A4和Gankyrin之间的结合，表明Gankyrin和MAGE-A4之间的相互作用抑制Gankyrin介导的致癌作用。肿瘤组织中MAGE表达可能不是肿瘤发生的原因，而是肿瘤发生的结果，并且MAGE基因通过靶向早期肿瘤细胞进行破坏而参与免疫过程。

黑素瘤相关抗原4蛋白(MAGEA4)可参与胚胎发育和肿瘤转化和/或进展。MAGEA4通常在睾丸和胎盘中表达。然而，MAGEA4可以在许多不同类型的肿瘤中表达，例如黑素瘤、头颈鳞状细胞癌、肺癌和乳腺癌。因此，MAGEA4可以是与各种肿瘤相关的抗原。

MAGEA4抗原可以诱导抗原特异性T细胞和/或高滴度抗体应答，从而诱导或引发针对表达抗原的癌症或肿瘤或针对表达抗原的癌症或肿瘤反应性的免疫应答。在一些实施方案中，诱导或引发的免疫应答可以是细胞免疫应答、体液免疫应答或细胞和体液免疫应答两者。在一些实施方案中，诱导或引发的细胞免疫应答可以包括干扰素-γ(IFN-γ)和/或肿瘤坏死因子α(TNF-α)的诱导或分泌。在其它实施方案中，诱导或引发的免疫应答可以减少或抑制一种或多种促进表达抗原的肿瘤或癌症生长的免疫抑制因子，例如但不限于下调MHC呈递的因子、上调抗原特异性调节性T细胞(Tregs)的因子、PD-L1、FasL、细胞因子如IL-10和TFG-β、肿瘤相关巨噬细胞、肿瘤相关成纤维细胞。

MAGEA4抗原可以包含蛋白质表位，所述蛋白质表位使其作为可以诱导抗MAGEA4免疫应答的免疫原特别有效。MAGEA4抗原可以包含全长翻译产物、其变体、其片段或其组合。MAGEA4抗原可以包含共有蛋白。

可以针对密码子选择和相应的RNA转录物优化编码共有MAGEA4抗原的核酸序列。编码共有MAGEA4抗原的核酸可以是经优化以进行表达的密码子和RNA。在一些实施方案中，编码共有MAGEA4抗原的核酸序列可以包括Kozak序列(例如，GCC ACC)以提高翻译效率。编码共有MAGEA4抗原的核酸可以包括多个终止密码子(例如，TGA TGA)以提高翻译终止的效率。

MAGE抗原可以在本文所述的载体中施用，并且在各种疫苗接种日程表(包括下面实施例中的日程表)中与检查点抑制剂组合。

c.载体

疫苗可以包含一种或多种载体，其包括编码抗原和PD1抗体或PDL1抗体的核酸。一种或多种载体可以能够表达抗原和PD1抗体或PDL1抗体。载体可以具有含有复制起点的核酸序列。载体可以是质粒、噬菌体、细菌人工染色体或酵母人工染色体。载体可以是自身复制的染色体外载体或者整合到宿主基因组中的载体。

一种或多种载体可以是表达构建体，其通常是用于将特定基因导入靶细胞中的质粒。一旦表达载体在细胞内，由该基因编码的蛋白质由细胞转录和翻译机制核糖体复合物产生。质粒经常工程化改造成含有调节序列，其作为增强子和启动子区起作用，并导致表达载体上携带的基因的有效转录。本发明的载体表达大量稳定的信使RNA，因此表达大量的蛋白质。

载体可以具有表达信号，如强启动子、强终止密码子，启动子和克隆基因之间的距离的调整，以及转录终止序列和PTIS的插入(可移动的翻译起始序列)。

(1)表达载体

载体可以是环状质粒或线性核酸。环状质粒和线性核酸能够指导特定核苷酸序列在合适的受试细胞中的表达。载体可以具有可操作地连接到编码抗原的核苷酸序列或编码佐剂的核苷酸序列的启动子，所述核苷酸序列可以可操作地连接到终止信号。载体还可以含有正确翻译核苷酸序列所需的序列。包含感兴趣的核苷酸序列的载体可以是嵌合的，这意味着至少一种它的组件相对于至少一种它的其它组件是异源的。表达盒中核苷酸序列的表达可以在组成型启动子或诱导型启动子的控制下，所述诱导型启动子只有当宿主细胞暴露于某种特定的外部刺激时才启动转录。在多细胞生物体的情况下，启动子也可以对特定的组织或器官或发育阶段是特异性的。

(2)环状载体和线性载体

载体可以是环状质粒，其可以通过整合到细胞基因组中或存在于染色体外(例如具有复制起点的自主复制质粒)转化靶细胞。

载体可以是pVAX、pcDNA3.0或provax，或能够表达DNA的任何其它表达载体，所述DNA编码抗原或佐剂并使细胞能够将序列翻译成由免疫系统识别的抗原或佐剂。

本文还提供了线性核酸疫苗或线性表达盒(“LEC”)，其能够通过电穿孔和表达一种或多种期望抗原或一种或多种期望佐剂而有效地递送至受试者。LEC可以是没有任何磷酸酯骨架的任何线性DNA。DNA可以编码一种或多种抗原或一种或多种佐剂。LEC可以含有启动子、内含子、终止密码子和/或聚腺苷酸化信号。抗原或佐剂的表达可以由启动子控制。LEC可以不含任何抗生素抗性基因和/或磷酸骨架。LEC可以不含与期望的抗原基因表达或期望的佐剂表达无关的其它核酸序列。

LEC可以源自能够被线性化的任何质粒。质粒可以能够表达抗原或PD1抗体或PDL1抗体。质粒可以能够表达PD1抗体或PDL1抗体。质粒可以是pNP(Puerto Rico/34)或pM2(NewCaledonia/99)。质粒可以是WLV009、pVAX、pcDNA3.0或provax，或能够表达DNA的任何其它表达载体，所述DNA编码抗原或佐剂并使细胞能够将序列翻译成由免疫系统识别的抗原或佐剂。

LEC可以是pcrM2。LEC可以是pcrNP。pcrNP和pcrMR可以分别源自pNP(PuertoRico/34)和pM2(New Caledonia/99)。

(3)启动子、内含子、终止密码子和多聚腺苷酸化信号

载体可以具有启动子。启动子可以是能够驱动基因表达并调节分离的核酸表达的任何启动子。这样的启动子是通过DNA依赖性RNA聚合酶对于转录所需要的顺式作用序列元件，其转录抗原序列或本文所述的佐剂序列。用于指导异源核酸表达的启动子的选择取决于具体应用。启动子可以定位在距离载体中的转录起始与其在其自然背景中距离转录起始位点大约相同的距离的位置上。然而，可以在不损失启动子功能的情况下容许该距离的变化。

启动子可以可操作地连接到编码抗原的核酸序列和转录物的有效聚腺苷酸化、核糖体结合位点和翻译终止所需要的信号。启动子可以可操作地连接到编码佐剂的核酸序列和转录物的有效聚腺苷酸化、核糖体结合位点和翻译终止所需要的信号。

启动子可以是CMV启动子、SV40早期启动子、SV40晚期启动子、金属硫蛋白启动子、鼠乳腺肿瘤病毒启动子、劳斯肉瘤病毒启动子、多角体蛋白启动子或其它显示对于在真核细胞中表达有效的启动子。

载体可以包括增强子和具有功能性剪接供体和受体位点的内含子。载体可以包含结构基因下游的转录终止区域以提供有效的终止。终止区域可以从与启动子序列相同的基因获得，或者可以从不同的基因获得。

d.赋形剂和疫苗的其它组分

疫苗还可以包含药学上可接受的赋形剂。药学上可接受的赋形剂可以是功能性分子，如媒介物、除PD1抗体或PDL1抗体以外的佐剂、载体或稀释剂。药学上可接受的赋形剂可以是转染促进剂，其可以包括表面活性剂，如免疫刺激复合物(ISCOMS)、弗氏不完全佐剂、包含单磷酰脂质A的LPS类似物、胞壁酰肽、醌类似物、囊泡如鲨烯和鲨烯、透明质酸、脂质、脂质体、钙离子、病毒蛋白、聚阴离子、聚阳离子或纳米颗粒，或其它已知的转染促进剂。

转染促进剂是聚阴离子、聚阳离子，包括聚-L-谷氨酸(LGS)或脂质。转染促进剂是聚-L-谷氨酸，并且聚-L-谷氨酸可以以小于6mg/ml的浓度存在于疫苗中。转染促进剂还可以包括表面活性剂如免疫刺激复合物(ISCOMS)、弗氏不完全佐剂、包括单磷酰脂质A的LPS类似物、胞壁酰肽、醌类似物和囊泡如鲨烯和鲨烯，以及透明质酸也可以与遗传构建体联合施用。DNA质粒疫苗还可以包括转染促进剂如脂质、脂质体，包括卵磷脂脂质体或本领域已知的其它脂质体，作为DNA-脂质体混合物(参见例如WO9324640)、钙离子、病毒蛋白、聚阴离子、聚阳离子或纳米颗粒，或其它已知的转染促进剂。转染促进剂是聚阴离子、聚阳离子，包括聚-L-谷氨酸(LGS)或脂质。疫苗中转染剂的浓度小于4mg/ml、小于2mg/ml、小于1mg/ml、小于0.750mg/ml、小于0.500mg/ml、小于0.250mg/ml、小于0.100mg/ml、小于0.050mg/ml或小于0.010mg/ml。

除PD1抗体或PDL1抗体外，药学上可接受的赋形剂可以是佐剂。另外的佐剂可以是在替代质粒中表达的其它基因，或者作为蛋白质与疫苗中的上述质粒组合递送。佐剂可以选自α-干扰素(IFN-α)、β-干扰素(IFN-β)、γ-干扰素、血小板源性生长因子(PDGF)、TNFα、TNFβ、GM-CSF、表皮生长因子(EGF)、皮肤T细胞吸引趋化因子(CTACK)、上皮胸腺表达趋化因子(TECK)、粘膜相关上皮趋化因子(MEC)、IL-12、IL-15、MHC、CD80、CD86，包括IL-15，其信号序列被删除并且任选地包括来自IgE的信号肽。佐剂可以IL-12、IL-15、IL-28、CTACK、TECK、血小板源性生长因子(PDGF)、TNFα、TNFβ、GM-CSF、上皮生长因子(EGF)、IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、IL-18或其组合。

除了PD1抗体或PDL1抗体外可以用作佐剂的其它基因包括编码以下的基因：MCP-1、MIP-la、MIP-1p、IL-8、RANTES、L-选择蛋白、P-选择蛋白、E-选择蛋白、CD34、GlyCAM-1、MadCAM-1、LFA-1、VLA-1、Mac-1、pl50.95、PECAM、ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、CD2、LFA-3、M-CSF、G-CSF、IL-4、IL-18的突变形式、CD40、CD40L、血管生长因子、成纤维细胞生长因子、IL-7、IL-22、神经生长因子、血管内皮生长因子、Fas、TNF受体、Flt、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2、DR6、胱天蛋白酶ICE、Fos、c-jun、Sp-1、Ap-1、Ap-2、p38、p65Rel、MyD88、IRAK、TRAF6、IkB、无活性NIK、SAP K、SAP-1、JNK、干扰素响应基因、NFkB、Bax、TRAIL、TRAILrec、TRAILrecDRC5、TRAIL-R3、TRAIL-R4、RANK、RANK LIGAND、Ox40、Ox40 LIGAND、NKG2D、MICA、MICB、NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2E、NKG2F、TAP1、TAP2及其功能性片段。

疫苗可以进一步包含如1994年4月1日提交的美国序列号021,579中所述的基因疫苗促进剂，其通过引用完全并入本文。

疫苗可以根据使用的施用方式配制。可注射疫苗药物组合物可以是无菌的、无热原的和无颗粒的。可以使用等张制剂或溶液。等渗性添加剂可包括氯化钠、葡萄糖、甘露糖醇、山梨糖醇和乳糖。疫苗可以包含血管收缩剂。等张溶液可以包括磷酸盐缓冲盐水。疫苗可以进一步包含稳定剂，包括明胶和白蛋白。稳定剂可以允许制剂在室温或环境温度下稳定延长的时间段，包括LGS或聚阳离子或聚阴离子。

3.疫苗接种方法

本发明还涉及提高受试者中的免疫应答的方法。提高免疫应答可以用于治疗和/或预防受试者中的疾病。方法可以包括向受试者施用本文中公开的疫苗。与仅施用抗原的受试者相比，施用疫苗的受试者可以具有升高或加强的免疫应答。在一些实施方案中，可以将免疫应答提高约0.5倍至约15倍、约0.5倍至约10倍或约0.5倍至约8倍。或者，可以将施用疫苗的受试者中的免疫应答提高至少约0.5倍、至少约1.0倍、至少约1.5倍、至少约2.0倍、至少约2.5倍、至少约3.0倍、至少约3.5倍、至少约4.0倍、至少约4.5倍、至少约5.0倍、至少约5.5倍、至少约6.0倍、至少约6.5倍、至少约7.0倍、至少约7.5倍、至少约8.0倍、至少约8.5倍、至少约9.0倍、至少约9.5倍、至少约10.0倍、至少约10.5倍、至少约11.0倍、至少约11.5倍、至少约12.0倍、至少约12.5倍、至少约13.0倍、至少约13.5倍、至少约14.0倍、至少约14.5倍或至少约15.0倍。

在其它备选的实施方案中，可以将施用疫苗的受试者中的免疫应答提高约50％至约1500％、约50％至约1000％或约50％至约800％。在其它实施方案中，可以将施用疫苗的受试者中的免疫应答提高至少约50％、至少约100％、至少约150％、至少约200％、至少约250％、至少约300％、至少约350％、至少约400％、至少约450％、至少约500％、至少约550％、至少约600％、至少约650％、至少约700％、至少约750％、至少约800％、至少约850％、至少约900％、至少约950％、至少约1000％、至少约1050％、至少约1100％、至少约1150％、至少约1200％、至少约1250％、至少约1300％、至少约1350％、至少约1450％或至少约1500％。

疫苗剂量可以介于1μg至10mg活性组分/kg体重/次之间，并且可以是20μg至10mg组分/kg体重/次。可以每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或31天施用疫苗一次。有效治疗的疫苗剂量的数目可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。

a.施用

疫苗可以根据制药领域技术人员熟知的标准技术配制。考虑到特定受试者的年龄、性别、体重和状况以及施用途径等因素，可以以医学领域技术人员熟知的剂量和技术施用这些组合物。受试者可以是哺乳动物，如人、马、牛、猪、绵羊、猫、狗、大鼠或小鼠。

疫苗可以预防性或治疗性施用。在预防性施用中，可以以足以诱导免疫应答的量施用疫苗。在治疗性应用中，疫苗以足以引发治疗效果的量向有此需要的受试者施用。足以实现这点的量定义为“治疗有效剂量”。对这种使用有效的量将取决于例如所施用的疫苗方案的特定组成、施用方式、疾病的阶段和严重性、患者的一般健康状况以及处方医师的判断。

疫苗可以通过本领域熟知的方法施用，如Donnelly等人(Ann.Rev.Immunol.15:617-648(1997))；Felgner等人(1996年12月3日公告的美国专利号5,580,859)；Felgner(1997年12月30日公告的美国专利号5,703,055)；和Carson等人(1997年10月21日公告的美国专利号5,679,647)中所述，其全部内容通过引用整体并入本文。疫苗的DNA可以与可以施用于个体的颗粒或珠复合，例如使用疫苗枪。本领域技术人员将知道，药学上可接受的载体(包括生理可接受的化合物)的选择取决于例如表达载体的施用途径。

疫苗可以通过各种途径递送。典型的递送途径包括肠胃外施用，例如皮内、肌内或皮下递送。其它途径包括口服施用、鼻内和阴道内途径。对于特别是疫苗的DNA，可以将疫苗递送到个体组织的间质空间(Felgner等人，美国专利号5,580,859和5,703,055，其全部内容通过引用完整并入本文)。疫苗也可以施用于肌肉，或者可以通过皮内或皮下注射或透皮施用，例如通过电离子透入疗法。还可以使用疫苗的表皮施用。表皮施用可涉及机械或化学刺激表皮的最外层以刺激对刺激物的免疫应答(Carson等人，美国专利号5,679,647，其内容通过引用整体并入本文)。

疫苗也可以配制成通过鼻道施用。适用于经鼻施用的制剂(其中载体是固体)可以包括具有例如约10至约500微米范围内的粒度的粗粉末，其采用嗅剂的方式施用，即，通过从靠近鼻的粉末的容器中经由鼻道快速吸入。制剂可以是鼻喷雾剂、滴鼻剂或通过雾化器的气溶胶施用。制剂可以包括疫苗的水性或油性溶液。

疫苗可以是液体制剂，如悬浮液、糖浆剂或酏剂。疫苗也可以是用于胃肠外、皮下、皮内、肌内或静脉内施用(例如，可注射施用)的制剂，如无菌悬浮液或乳液。

该疫苗可以掺入脂质体、微球或其它聚合物基质中(Felgner等人，美国专利号5,703,055；Gregoriadis，Liposome Technology，Vols.Ito III(第2版1993))，其内容通过引用完整并入本文)。脂质体可以由磷脂或其它脂质组成，并且可以是无毒的、生理可接受的和可代谢的载体，其制备和施用相对简单。

疫苗可以通过电穿孔来施用，例如通过美国专利号7,664,545中所述的方法，其内容通过引用并入本文。电穿孔可以通过美国专利号6,302,874；5,676,646；6,241,701；6,233,482；6,216,034；6,208,893；6,192,270；6,181,964；6,150,148；6,120,493；6,096,020；6,068,650；和5,702,359中描述的方法和/或设备进行，其内容通过引用整体并入本文。电穿孔可以通过微创装置进行。

微创电穿孔装置(“MID”)可以是用于将上述疫苗和相关流体注射入体组织的设备。该装置可以包括中空针、DNA盒和流体递送构件，其中装置适合于致动使用中的流体递送构件，以便在将针插入身体组织期间同时(例如，自动)将DNA注入到所述身体组织中。这具有以下优点：在插入针时逐渐注射DNA和相关液体的能力导致流体通过身体组织的更均匀分布。由于注射的DNA在较大面积上的分布，注射期间经历的疼痛可以降低。

MID可以不使用针将疫苗注射到组织中。MID可以用下述的力以小的流或射流注射疫苗，使得疫苗刺穿组织的表面并进入下面的组织和/或肌肉。小流或射流背后的力可以通过在几分之一秒内通过微孔口膨胀压缩气体，如二氧化碳来提供。微创电穿孔装置和其使用方法的实例记载于公开的美国专利申请号20080234655；美国专利号6,520,950；美国专利号7,171,264；美国专利号6,208,893；美国专利号6,009,347；美国专利号6,120,493；美国专利号7,245,963；美国专利号7,328,064；和美国专利号6,763,264，其各自的内容通过引用并入本文。

MID可以包括注射器，其产生无痛刺穿组织的高速液体喷射。这种无针注射器可商购。可用于本文的无针注射器的实例包括美国专利号3,805,783；4,447,223；5,505,697；和4,342,310中描述的那些，其各自的内容通过引用并入本文。

可以使用无针注射器将适合于直接或间接电转运的形式的期望的疫苗引入(例如，注射)待治疗的组织中，通常通过使组织表面与注射器接触，以便致动药剂喷射的递送，具有足够的力使疫苗穿透组织。例如，如果要治疗的组织是粘膜、皮肤或肌肉，则该药剂以足够的力向粘膜或皮肤表面投射，以使该药剂穿透角质层并进入真皮层，或分别进入下面的组织和肌肉。

无针注射器非常适合于将疫苗递送到所有类型的组织，特别是皮肤和粘膜。在一些实施方案中，无针注射器可以用于将含有疫苗的液体推进到表面并进入受试者的皮肤或粘膜。可以使用本发明方法治疗的各种类型的组织的代表性实例包括胰腺、喉、鼻咽、下咽、口咽、唇、咽喉、肺、心脏、肾脏、肌肉、乳腺、结肠、前列腺、胸腺、睾丸、皮肤、粘膜组织、卵巢、血管或其任何组合。

MID可以具有电穿孔组织的针电极。通过在多电极阵列中的多对电极之间的脉冲，例如以矩形或正方形的方式设置，提供了比一对电极之间的脉冲的结果改善的结果。例如，在题为"Needle Electrodes for Mediated Delivery of Drugs and Genes"的美国专利号5,702,359中公开了针阵列，其中在治疗处理期间可以对多对针施加脉冲。在该申请(其通过引用并入本文，如同完全阐述一样)中，针布置成环状阵列，但是具有连接器和开关设备，其能够在相对的针电极对之间脉冲。可以使用用于将重组表达载体递送到细胞的一对针电极。在美国专利号6,763,264中描述了这种装置和系统，其内容通过引用并入本文。或者，可以使用单针装置，其允许用类似于正常注射针的单针注射DNA和电穿孔，并且施加比目前使用的装置递送的那些电压低的电压的脉冲，从而减少患者经历的电感觉。

MID可以包括一个或多个电极阵列。阵列可以包括两个或更多个相同直径或不同直径的针。针可以均匀地或不均匀地间隔开。针可以在0.005英寸和0.03英寸之间，在0.01英寸和0.025英寸之间；或0.015英寸至0.020英寸之间。针的直径可以为0.0175英寸。针可以是0.5mm、1.0mm、1.5mm、2.0mm、2.5mm、3.0mm、3.5mm、4.0mm或更多间隔开。

MID可以由脉冲发生器和两个或更多个针疫苗注射器组成，所述针疫苗注射器在单个步骤中递送疫苗和电穿孔脉冲。脉冲发生器可以允许经由闪存卡操作的个人计算机的脉冲和注射参数的灵活编程，以及电穿孔和患者数据的全面记录和存储。脉冲发生器可以在短时间段内递送各种伏特脉冲。例如，脉冲发生器可以递送持续时间100ms的三个15伏脉冲。这样的MID的一个实例是在美国专利号7,328,064(其内容通过引用并入本文)中描述的Inovio Biomedical Corporation的Elgen 1000系统。

MID可以是CELLECTRA(Inovio Pharmaceuticals，Plymouth Meeting，PA)装置和系统，其是模块电极系统，其有助于将大分子如DNA引入身体或植物中的选定组织的细胞中。模块电极系统可以包括多个针电极；皮下注射针；电连接器，其提供从可编程恒定电流脉冲控制器到多个针电极的导电连接；和电源。操作者可以抓住安装在支撑结构上的多个针电极并将其牢固地插入到身体或植物中的选定组织中。然后，将大分子经由皮下注射针递送入选定的组织中。可编程恒定电流脉冲控制器被激活，并且对多个针电极施加恒定电流电脉冲。施加的恒定电流电脉冲有助于将大分子引入多个电极之间的细胞中。由于通过恒定电流脉冲限制组织中的功率消耗，使由于细胞过热引起的细胞死亡最小化。Cellectra装置和系统在美国专利No.7,245,963中描述，其内容通过引用并入本文。

MID可以是Elgen 1000系统(Inovio Pharmaceuticals)。Elgen 1000系统可以包括提供空心针的装置；和流体递送构件，其中设备适合于致动使用中的流体递送构件，以便在将针插入所述身体组织期间同时(例如自动)将所描述的疫苗注射到身体组织中。优点是在插入针时逐渐注射流体的能力导致流体通过身体组织的更均匀分布。还认为由于注射的流体在更大面积上的体积分布，注射期间经历的疼痛减少。

此外，流体的自动注射有助于自动监测和登记注射的流体的实际剂量。如果期望的话，该数据可以由控制单元存储用于记录目的。

应当理解，注射速率可以是线性的或非线性的，并且注射可以在针已被插入待治疗的受试者的皮肤后并且当它们进一步插入身体组织中时进行。

可以通过本发明的设备向其中注射流体的合适的组织包括肿瘤组织、皮肤或肝组织，但可以是肌肉组织。

该设备还包括用于引导针插入身体组织中的针插入构件。流体注射速率由针插入速率控制。这具有以下优点：可以控制针插入和流体的注射，使得插入速率可以根据需要与注射速率相匹配。它还使得设备对于用户更易于操作。如果期望的话，可以提供用于将针自动插入身体组织的构件。

用户可以选择何时开始注射流体。然而，理想地，当针的尖端已经到达肌肉组织时开始注射，并且该设备可以包括当针已被插入足够的深度以便开始注射流体时用于感测的构件。这意味着当针已经达到期望的深度(通常是肌肉组织开始处的深度)时，可以提示自动开始流体的注射。例如，肌肉组织开始处的深度可以被认为是预定的针插入深度，如4mm的值，这将被认为足以使针穿过皮肤层。

感测构件可以包括超声波探头。感测构件可以包括用于感测阻抗或电阻变化的构件。在这种情况下，构件可以本身不记录针在身体组织中的深度，而是当针从不同类型的身体组织移动到肌肉中时适合于感测阻抗或电阻的变化。这些备选之任一提供了感测可以开始注射的相对准确和操作简单的构件。如果期望的话，可以进一步记录针的插入深度，并且可以用于控制流体的注射，使得在记录针插入的深度时确定待注射的流体的体积。

该设备还可以包括：用于支撑针的基部；以及用于在其中容纳基部的壳体，其中基部相对于所述壳体可移动，使得当基部相对于所述壳体处于第一向后位置时所述针在所述壳体内缩回，并且当基部在壳体内为第二向前位置时针延伸出壳体。这对于用户来说是有利的，因为壳体可以排列在患者的皮肤上，然后可以通过相对于基部移动壳体将针插入患者的皮肤。

如上所述，期望实现流体注射的受控速率，使得当插入皮肤时，流体在针的长度上均匀地分布。流体递送构件可以包括适合于以受控速率注射流体的活塞驱动构件。活塞驱动构件可以例如由伺服电机启动。然而，活塞驱动构件可以由基部致动，所述基部相对于壳体在轴向方向上移动。应当理解，可以提供用于流体递送的替代构件。因此，例如，可以在注射器和活塞系统的位置提供密闭容器，所述容器可以被挤压，从而以受控或非控制速率进行流体递送。

上述设备可用于任何类型的注射。然而，设想在电穿孔领域中特别有用，因此其还可以包括向针施加电压的构件。这使得针不仅可用于注射，而且可用作电穿孔期间的电极。这是特别有利的，因为这意味着将电场施加到与注射的流体的区域相同的区域。传统上电穿孔的问题在于，非常难以将电极与预先注射的流体精确对齐，因此用户倾向于注射比在较大面积上的需要更大体积的流体，并且在更高的面积上施加电场以试图保证注射物质和电场之间的重叠。使用本发明，可以减少注射的流体体积和施加的电场的大小两者，同时实现电场和流体之间的良好拟合。

本发明具有多个方面，由以下非限制性实施例说明。

4.实施例

实施例1

以三个单独的组将小鼠以两周间隔免疫两次：仅载体pVAX、仅DNA疫苗(HPV)和DNA疫苗(HPV)与mAb PDL1组合。对于组合，从第一次免疫后10天开始递送mAb PD1L，然后每三天递送一次，直到在最后一次免疫后8天处死小鼠。如图1中的条形图所示，显示由用抗PDL1抗体的综合疗法诱导的T细胞应答的30％增加。

PDL1mAb可以产生或可以商业获得，例如CD274(B7-H1，PD-L1)大鼠抗小鼠mAb(克隆10F.9G2)、PE-缀合物(Life Technologies)。

实施例2

mAb

PDL1、PD1、TIM-3和LAG-3mAb可以产生或者可以商业获得，例如分别为CD274(B7-H1，PD-L1)大鼠抗小鼠mAb(克隆10F.9G2)、PE-缀合物(Life Technologies或Bio X细胞)、大鼠抗小鼠PD-1(克隆RMP1-14或J43)、大鼠抗小鼠TIM-3(克隆RMT3-23；Bio XCell)、大鼠抗小鼠LAG-3(克隆C9B7W；BIO X细胞)。

小鼠免疫

在有或没有PD1、TIM3和LAG3 mAb的递送的情况下用25μghTERT构建体将C57BL/6小鼠(n＝4)免疫三次，免疫之间有两周间隔。

免疫组

组II-hTERT

组III–hTERT+PD1

组IV–hTERT+TIM3

组V–hTERT+LAG3

在用hTERT第二次免疫后3天递送mAb中的每一种。

图2-4中的图中表示的数据显示加强免疫后免疫检查点的阻断增加了抗PD-1、抗TIM3和抗LAG3抗体的免疫应答。用免疫检测点抑制剂DNA免疫后诱导hTERT特异性CD8+ T细胞的增强的IFNγ产生：通过ICS和流式细胞计量术在最后一次免疫后一周测量对hTERT抗原的细胞因子回忆应答。右图图形描绘了用PD1(图2)、TIM3(图3)和LAG3(图4)处理的小鼠的表达总IFNγ的总hTERT特异性CD8+ T细胞。左图图形显示了表现出细胞因子IFNγ和TNFα双重释放的hTERT特异性CD3+CD8+ T细胞的百分比(图2中的PD1，图3中的TIM3和图4中的LAG3)。实验独立进行至少两次，并且数据表示每组4只小鼠的平均值±SEM。

结果显示了，令人惊讶的是，抗TIM3和抗LAG3抗体在受试者中产生显著更高的免疫应答增加。

实施例3

相对于疫苗接种的检查点抑制剂递送的时机

初始免疫后检查点抑制剂的递送。

(A)早期递送：

在有或没有PD1、TIM3和LAG3mAb中任一者的递送的情况下用25μg hTERT构建体将C57BL/6小鼠(n＝3-4)免疫两次，免疫之间有两周间隔。检查点抑制剂的初始mAb递送在第10天(D10)，然后是D13、D16和D19。

(B)晚期递送

在有或没有PD1、TIM3和LAG3mAb中任一者的递送的情况下以三周间隔用25ughTERT构建体将C57BL/6小鼠(n＝4)免疫三次。最初的mAb递送是在第二次免疫后3天，然后每三天施用一次，直至处死。

阻断免疫检查点抑制剂的递送是时间敏感的。在早期递送mAb比对晚期递送mAb检查点期间通过流式细胞计量术在最终免疫后一周测量对hTERT抗原的IFNγ特异性回忆应答。图5中的图形代表描述在初始免疫后立即用或不用PD1、TIM3和LAG3处理的小鼠的表达总IFNγ的hTERT特异性CD8T细胞的结果。图6中的图形描述在加强免疫后立即用或不用PD1、TIM3和LAG3处理的小鼠的表达总IFNγ的hTERT特异性CD8T细胞。因此，数据显示了当与显示较慢的抗原特异性免疫的早期递送相比时，晚期递送在通过检查点抑制剂驱动抗原特异性T细胞扩增中产生令人惊讶的结果。

Claims (23)

1.一种用于在有此需要的受试者中增强针对抗原的免疫应答的组合物，所述组合物包含：

a)TIM-3抗体或LAG-3抗体，和

b)能够在所述受试者中产生免疫应答的合成抗原，或其生物学功能片段或变体。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述合成抗原是编码所述抗原的分离的DNA。

3.根据权利要求2所述的组合物，其中所述合成抗原选自由以下组成的组：hTERT、前列腺、WT1、酪氨酸酶、NYES01、PRAME、MAGE、CMV、疱疹、HIV、HPV、HCV、HBV、流感、RSV、恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)和艰难梭菌(C.difficle)。

4.根据权利要求3所述的组合物，其中HPV抗原是选自由以下组成的组的亚型的E6和E7结构域：HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV52和HPV58、以及它们的组合。

5.根据权利要求3所述的组合物，其中HIV抗原选自由以下组成的组：Env A、Env B、EnvC、Env D、B Nef-Rev和Gag、以及它们的组合。

6.根据权利要求3所述的组合物，其中流感抗原选自由以下组成的组：H1HA、H2HA、H3HA、H5HA、BHA抗原及它们的任何组合。

7.根据权利要求3所述的组合物，其中恶性疟原虫抗原包括环子孢子(CS)抗原。

8.根据权利要求3所述的组合物，其中艰难梭菌抗原选自由以下组成的组：毒素A和毒素B及它们的组合。

9.根据权利要求3所述的组合物，其中HCV抗原选自由以下组成的组：E1、E2、NS3、NS4a、NS4b、NS5a和NS5b、以及它们的组合。

10.根据权利要求3所述的组合物，其中HBV抗原选自由以下组成的组：表面抗原A型、表面抗原B型、表面抗原C型、表面抗原D型、表面抗原E型、表面抗原F型、表面抗原G型、表面抗原H型和核心抗原及它们的组合。

11.根据权利要求3所述的组合物，其中RSV抗原选自由以下组成的组：F、G、NS1、NS2、N、M、M2-1、M2-2、P、SH和L蛋白及它们的组合。

12.根据权利要求3所述的组合物，其中所述合成抗原是hTERT。

13.根据权利要求3所述的组合物，其中前列腺抗原选自由以下组成的组：PSA、PSMA、STEAP、PSCA和PAP及它们的组合。

14.根据权利要求3所述的组合物，其中所述合成抗原是WT1抗原。

15.根据权利要求3所述的组合物，其中所述合成抗原是酪氨酸酶。

16.根据权利要求3所述的组合物，其中所述合成抗原是NYES01。

17.根据权利要求3所述的组合物，其中所述合成抗原是PRAME。

18.根据权利要求1所述的组合物，进一步包含药学上可接受的赋形剂。

19.一种用于在有此需要的受试者中提高免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据权利要求1-18中任一项所述的组合物。

20.根据权利要求19所述的方法，其中施用所述组合物包括电穿孔步骤。

21.一种通过施用合成抗原和检查点抑制剂的组合在有此需要的受试者中提高免疫应答的方法，其中施用步骤包括：

向所述受试者施用合成抗原的初始疫苗接种和加强疫苗接种，以及

在所述加强疫苗接种后，向所述受试者施用检查点抑制剂。

22.根据权利要求21所述的方法，进一步包括向所述受试者进一步施用所述合成抗原的后续加强疫苗接种的步骤。

23.根据权利要求22所述的方法，其中任何施用步骤包括将电穿孔递送到施用部位。